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Ji Doucha,
Frantiek Straka,
Karel Lvansk
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Abstract
Flue gas generated by combustion of natural gas in a boiler was used for outdoor
cultivation of Chlorella sp. in a 55 m2 culture area photobioreactor. A 6 mm thick layer of
algal suspension continuously running down the inclined lanes of the bioreactor at 50 cm
s1 was exposed to sunlight. Flue gas containing 68% by volume of CO2 substituted for
more costly pure CO2 as a source of carbon for autotrophic growth of algae. The degree of
CO2 mitigation (flue gas decarbonization) in the algal suspension was 1050% and
decreased with increasing flue gas injection rate into the culture. A dissolved CO2 partial
pressure (pCO2) higher than 0.1 kPa was maintained in the suspension at the end of the 50
m long culture area in order to prevent limitation of algal growth by CO2. NO X and CO
gases (up to 45 mg m3 NO X and 3 mg m3 CO in flue gas) had no negative influence on
the growth of the alga. On summer days the following daily net productivities of algae [g
(dry weight) m2] were attained in comparative parallel cultures: flue gas = 19.422.8; pure
CO2 = 19.122.6. Net utilization () of the photosynthetically active radiant (PAR) energy
was: flue gas = 5.586.94%; pure CO2 = 5.496.88%. The mass balance of CO2 obtained
for the flue gas stream and for the algal suspension was included in a mathematical model,
which permitted the calculation of optimum flue gas injection rate into the photobioreactor,
dependent on the time course of irradiance and culture temperature. It was estimated that
about 50% of flue gas decarbonization can be attained in the photobioreactor and 4.4 kg of
CO2 is needed for production of 1 kg (dry weight) algal biomass. A scheme of a combined
process of farm unit size is proposed; this includes anaerobic digestion of organic
agricultural wastes, production and combustion of biogas, and utilization of flue gas for
production of microalgal biomass, which could be used in animal feeds. A preliminary
quantitative assessment of the microalgae production is presented.
Tris
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Tris
Otros nombres
Frmula
semidesarrollada
(HOCH2)3CNH2
Identificadores
77-86-1[1]
Nmero CAS
Propiedades fsicas
Estado de agregacin
Slido cristalino
Apariencia
Polvo blanco
Masa molar
121,14 g/mol
Punto de fusin
448 K (175 C)
Punto de ebullicin
492 K (219 C)
Peligrosidad
Frases R
36, 37, 38
Frases S
26-36
Riesgos
External MSDS
Irritante
Piel
ndice
[ocultar]
1 Caractersticas tamponantes
2 Sntesis
3 Usos
4 Referencias
La investigacin identific los tres elementos fundamentales de un primer beso ganador: Buen
aliento, poca o nada de lengua, y asertividad. Si quieres que quede rendida a tus pies toma su
rostro con tus manos y dale un suave y profundo beso.
Resumen
El cultivo de microalgas de inters econmico en condiciones no axnicas puede ser
utilizado para acuicultura y tratamiento de aguas residuales; mientras que el cultivo
axnico es utilizado para la extraccin de productos comerciales. Sin embargo, el
comportamiento de las microalgas axnicas puede variar con respecto a las cultivadas
en condiciones no axnicas. El objetivo de este estudio es evaluar la respuesta de la
microalga Chlorella sorokiniana en funcin del pH (5, 6, 7, 8 y 9), temperatura (25,
30, 37, 40 y 42C) y salinidad (15, 25 y 35 ppm) en cultivos no axnicos y axnicos.
Todos los bioensayos se realizaron con fotoperodo 12:12h, 98mol.quanta.m-2.s-1,
28C. Los cultivos no axnicos con medio ALGAL por triplicado se mantuvieron en
volumen de 250ml, en matraces de 500ml de capacidad. Mientras que, los cultivos
axnicos por cinco rplicas se realizaron en tubos de ensayo con volumen de 15ml, en
condiciones autotrficas, mixotrficas y heterotrficas con medio organotrfico. En
cultivos no axnicos, la microalga fue ms sensible a la salinidad, temperatura y pH
<5, con un crecimiento ptimo a 30C y pH 7-8 en medio no salino. En cambio, en
condiciones axnicas, la microalga fue capaz de crecer hasta 42C, 35 ppm de
salinidad, a partir de pH 3 alcanzando mayor crecimiento a pH 7-8, entre 0 y 25 ppm y
a 37C en mixotrofa. La sntesis de clorofila fue mayor en cultivos no axnicos. Estos
resultados sugieren que la respuesta de C. sorokiniana, al pH, temperatura y salinidad
puede ser modulada por la flora bacteriana asociada.
Palabras clave: Chlorella sorokiniana, pH, salinidad, temperatura, axnico, no
axnico.
Response of the microalga Chlorella sorokiniana to pH, salinity and
temperature in axenic and non axenic conditions
Abstract
Microalgal culture in non axenic conditions can be used as food source for aquaculture
species, wastewater treatment and in axenic conditions for the extraction of valuable
chemicals. However, the response of the microalgae in axenics conditions can be
modulated with respect to non axenic conditions. The aim of this study was to test the
response of the microalga Chlorella sorokiniana in function of pH (5, 6, 7, 8 and 9),
temperature (25, 30, 37, 40 and 42C) and salinity (15, 25 and 35 ppm) in non-axenic
and axenic cultures. All bioassays were carried out with photoperiod 12:12h,
98mol.quanta.m-2.s-1, 28C. Non-axenic cultures in ALGAL medium and by triplicate
were maintained at volume of 250ml in flasks with 500ml in capacity. Whereas, axenic
cultures by fire replicas were carried out in test tubes with volume of 15ml in
autotrophic, mixotrophic and heterotrophic conditions with organotrophic and ALGAL
medium. In non-axenic cultures, the microalga was more sensible to salinity,
temperature and pH below 5, with optimal growth at 30C and pH 7-8 in non saline
medium. Instead, in axenic conditions, the microalga was able to grow up to 42C, pH
above 3 and salinity up to 35 ppm in mixotrophy, reaching the highest growth at pH 78, between 0 and 25 ppm and 37C. Chlorophyll synthesis was older in non axenic
cultures. These results suggest that the response of C. sorokiniana, to pH, temperature
and salinity can be modulated by associated bacterial flora.
Key words: Chlorella sorokiniana, pH, salinity, temperature, axenic, non-axenic.
Recibido el 24-4-2002
Aceptado el 22-7-2004
Introduccin
La variacin de las condiciones de cultivo, tales como el tipo y concentracin de
nutrientes, temperatura, pH, intensidad luminosa, fotoperodo, rgimen de cosecha de
cultivos discontinuos, continuos o semicontinuos, manipulacin gentica, entre otros
(15, 27 y 37) ha contribuido a establecer sistemas dirigidos hacia la obtencin de
biomasa microalgal (17 y 18). La respuesta de las microalgas al pH vara ampliamente,
debido a que este factor determina la solubilidad del dixido de carbono y de los
minerales en los cultivos e influye directa o indirectamente en su metabolismo (28, 32
y 38). La temperatura no solo afecta las reacciones celulares, sino tambin los
requerimientos nutricionales y la composicin de la biomasa, as como la solubilidad de
los gases en el agua (1, 14, 24, 37, 38 y 40).
Los cultivos masivos de microalgas se obtienen tpicamente de manera fotoautotrfica,
bien sea por el uso de estanques abiertos y luz natural o por una variacin de sistemas
ms intensivos. Sin embargo, se presentan alternativas de produccin de biomasa
microalgal, tanto en condiciones mixotrficas como heterotrficas. Es decir, cuando
son capaces de asimilar fuente de carbono orgnica exhibiendo un crecimiento
organotrfico (26, 27 y 35).
Los cultivos mixotrficos producen una elevada cantidad de biomasa comparada a la
autotrofa y heterotrofa y ello se debe posiblemente al efecto energtico de la luz y del
sustrato orgnico (19, 25, 28 y 36). Mientras que los cultivos heterotrficos, desde una
perspectiva de ingeniera tienen ventajas sobre los sistemas fotosintticos ya que se
logra obtener protenas, carbohidratos, lpidos, entre otros, a un menor costo, por
prescindir de la iluminacin (10 y 43).
Cuando las microalgas estn asociadas a bacterias en la naturaleza (no axnicas), se
ejerce una interaccin que puede ser beneficiosa para ambos; de tal manera que la
microalga es capaz de asimilar productos de la actividad bacteriana en el medio. As
mismo, la flora microbiana asociada est implicada en la regulacin de parmetros
fisiolgicos como pH, temperatura y salinidad. En cambio, en condiciones axnicas, las
microalgas no llegan a alcanzar un crecimiento ptimo, por carecer de la flora
microbiana asociada; la cual le aportar factores esenciales para estimular el
crecimiento (7 y 10).
Chlorella sorokiniana
Densidad celular
168,2701,43
0,2200,01
154,5201,11
192,4606,46
344,6833,45
352,3451,47
Clorofila
1,580,04
ND
0,330,01
1,590,01
1,600,01
1,400,05
Carotenoides
0,370,04
ND
0,060,01
0,270,01
0,170,01
0,190,02
Chlo/caro
4,17
ND
5,35
5,88
9,41
7,37
ciertos sustratos orgnicos en el medio de cultivo, vare en funcin del pH, lo cual
puede influir en el crecimiento.
Final
1,1
3,4
5,8
6,4
7,8
8,2
Relacin clorofila/carotenoides
Autotrofa
Mixotrofa
Heterotrofa
ND
ND
ND
ND
1,61
1,05
1,25
1,85
1,06
1,36
1,95
1,10
1,47
1,96
1,11
1,53
2,05
1,41
9,6
1,53
1,95
1,46
Figura 4. Influencia de la salinidad (ppm) sobre el crecimiento (x106 cel.ml1) de la microalga Chlorella sorokiniana en cultivos axnicos y no axnicos.
Asimismo, la salinidad produjo un incremento del contenido celular de clorofila y
carotenoides totales, en condiciones no axnicas. Los valores ms altos se alcanzaron
a 25 y 35 ppm con relacin a los cultivos no salinos (figura 5). Probablemente la
mayor talla celular producto de una baja velocidad de crecimiento de la microalga con
la salinidad, estuvo relacionada con la acumulacin de metabolitos y por lo tanto, el
contenido celular de clorofila y carotenoides fue superior a los encontrados en las
clulas no expuestas a medio salino. La microalga acumul 20 y 24 veces ms clorofila
y carotenoides en medio dulceacucola, respecto a las cultivadas a 35 ppm en
mixotrofa. Sin embargo, cuando creci en oscuridad slo produjo 1,8 y 1,6 veces ms
clorofila y carotenoides respectivamente, comparadas con las mantenidas a 35 ppm
(figura 5).
Mixotrofa
Heterotrofa
0
15
25
35
1,41
1,43
1,11
1,00
1,44
1,40
1,29
NC
1,60
1,30
1,25
NC
No axnico
autotrfico
4,71
5,30
3,05
1,04
Conclusiones
La respuesta de la microalga Chlorella sorokiniana al pH, salinidad y temperatura,
vari en funcin de la presencia o ausencia de su flora bacteriana acompaante. En
condiciones no axnicas slo fue capaz de crecer satisfactoriamente a pH entre 6 y 9,
optimizar su densidad celular a 30C y crecer en ausencia de salinidad.
En condiciones axnicas cambi su respuesta de tolerancia a pH cidos; a
temperaturas de hasta 42C y de salinidades de 25 ppm.
Este comportamiento sugiere que la respuesta fisiolgica de la microalga ante el
ambiente natural, fue modificada cuando eximi la relacin con sus bacterias
asociadas. Adems, la mixotrofa demostr ser la condicin ms adecuada que
favoreci el crecimiento de la microalga frente a cambios ambientales.
Por lo tanto, esta microalga autctona, bajo condiciones axnicas presenta un gran
potencial biotecnolgico por su capacidad de crecimiento en cultivos mixotrficos y
heterotrficos en presencia de nutrientes orgnicos y a un intervalo de pH muy amplio.
Esto puede servir como alternativa a la condicin autotrfica de crecimiento para la
produccin de biomasa a elevadas temperaturas, con lo cual puede inducirse la
produccin de enzimas, de protenas o de compuestos con actividad biolgica con fines
farmacolgicos.
Agradecimientos
Los autores agradecen al FONACIT por el apoyo financiero atravs del proyecto S12000000786.
Literatura citada
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University Press Espaa.
[ Links ]
Tris
+
Actico
+
EDTA
Tris
Es
el
nombre
comn
de tris(hidroximetil)aminometa
no. Se trata de un compuesto
muy utilizado en el laboratorio
para
preparar
disoluciones
tampn; el grupo cido-base que
ejerce el tamponamiento es el
amino. Se comercializa en sus
formas bsica ("Tris base") y
cida
("Tris
hidrocloruro"),
aunque la primera es la de uso
ms
comn.
Un
tampn
denominado
"Tris-HCl"
se
prepara con Tris base a la
concentracin indicada y con el
HCl necesario para ajustar el pH
al valor indicado.
En la electroforesis, es el
agente tamponante que mantiene
el pH.
(HOCH2)3C-NH2
Mr 121 g/mol
EDTA
Acrnimo
de EthyleneDiamine TetraAcetic
acid, cido etilendiaminotetraactico (a veces
AEDT en espaol). En sus formas desprotonadas
(2 y 4), es un conocido agente quelante de cationes
divalentes, en especial Ca2+ y Mg2+.
Dado que el Mg2+ es un cofactor requerido por la
mayora de nucleasas, su secuestro por el EDTA
evita la degradacin del DNA durante la preparacin
y la electroforesis.
Azul de bromofenol
Xileno-cianol
Bromuro de etidio
Lo que tardes en leer y probar este artculo es lo que se tarda en leer un libro como este con un
mtodo de lectura rpida.
Conceptos bsicos
1- Debes reducir el tiempo que tus ojos pasan en cada lnea.
No tienes que leer de una sola pasada. El truco se basa en hacer
pequeos saltos dentro de cada lnea. Cada uno de esos saltos son
como pequeas fotografas que recogen el mximo contenido en el
mnimo tiempo posible. Estos saltos durarn entre un cuarto de
segundo y medio segundo y son la clave de la lectura rpida.
2- Debes eliminar el hbito de volver a leer lo que acabas de
leer.
Gastar el tiempo en leer una y otra vez algo que ya se ha ledo hace
que pierdas un 30% de tu tiempo de lectura. La principal razn es
que pensamos en demasiadas cosas mientras leemos y eso en
parte se debe a leer demasiado despacio.
3- Debes entrenar a tus ojos para usar la visin perifrica
horizontal y para aumentar el nmero de palabras que se ven
por salto.
Sin entrenamiento la visin predominante es la visin central que
reduce en un 50% el nmero de palabras que pueden leerse en
cada salto visual.
Primer paso
limitacin
Conociendo
nuestra
Luis R. Martnez-Crdova1, Alfredo Campaa-Torres2, Marcel MartinezPorchas3 Jos A. Lpez-Elas1 & Celia O. Garca-Sifuentes3
1
Correspondencia a:
INTRODUCTION
One of the aquaculture resources that are mainly fed during nursery and larval phases
of cultured fish and crustacean is the zooplankton; moreover, recent reports propose
the use of natural feed in pre-grow and/or grow-out phases of shrimp culture (Jory,
2000; Campaa-Torres et al., 2009, 2010).
Nonetheless, the production of natural food such as microalgae and zooplankton
species is commonly accompanied by high economical investments, often attributed to
the high cost of culturing mediums used for the production of microalgae; additionally,
these mediums are highly specialized and sometimes difficult to obtain in local
markets. Furthermore, such microalgae is used to produce Artemia larvae, which are
also expensive and sometimes scarce (Lin et al., 2009; Gonzlez et al, 2010). It is
therefore necessary to study alternative strategies aimed at decreasing costs without
affecting the production. For instance, some efforts have been made in order to find
alternative mediums for microalgae culture; also, different organisms such as
copepods, rotifers and cladocerans have been proposed to replace Artemia (St0ttrup,
2000; Voltolina & Lopez-Elas, 2002; Martin et al., 2006; Campaa-Torres et al., 2009;
Farhadian et al., 2009). From these experiments, some promising results have
emerged.
Although several experiments have been performed in order to analyze the effect of
different media on the productive response and proximate composition of microalgae,
most of those studies do not include the subsequent effect of such microalgae on the
productive response of zooplankton species (Wikfors, 1986; Fidalgo et al, 1998;
Toyub et al., 2007). The quantity, but also the quality of the zooplankton consumed by
fish or crustacean, may have an impact on their productive response. Gusmo &
McKinnon (2009) demonstrated that the production and nutritional composition of
copepods was related to the type of feed they consumed.
The calanoid copepod Acartia sp., can be used as an alternative natural food for
diverse aquacultural species, since these organisms can be massively produced in
laboratory and have demonstrated to be widely consumed by aquatic species
(Schipp et al., 1999); additionally, they can be found in commercial laboratories
and/or a wide diversity of ecosystems. St0ttrup (2000) remarked the great potential of
copepods as live feed in marine aquaculture. Micro-algae such as Chaetoceros
muelleri has been widely used in aquaculture due to their rapid growth rate, resistance
to adverse conditions and nutritional quality; in particular, it has been used to
feed Acartia sp. (Gusmo & McKinnon, 2009).
The aim of this study was to analyze the effect of two alternative media on the
productive response and proximate composition of microalgae C. muelleri, and the
subsequent effect of such microalgae on the productive response and proximate
composition of the copepod Acartia sp.
where was considered as the growth rate, B0 microalgae density (cells mL-1) at the
beginning, Bn microalgae density at any time, and tn-t0 the period of microalgae
culture since inoculation. The generation
was estimated after filtration with a 0.2 membrane average pore and dried in an
oven (70C) until constant weight.
To analyze microalgae proximate composition (protein, lipid, carbohydrate and ash),
samples were filtered using fiberglass filters (47 mm; Whatman Maidstone UK)
previously dried. The protein content was measured following the methodology
described by Lowry et al. (1951), and modified by Lpez-Elas & Voltolina (1993). The
carbohydrate concentration was estimated by the "phenol-sulfuric acid" method
reported by Dubois et al. (1956). The lipid content was calculated by a colorimetric
method described by Pande et al. (1963) and modified by Bustillos-Hurtado & LpezElas (1994). Ash was estimated by incineration at 550C (AOAC 1995). Thereafter,
the percentage of the organic fraction was calculated for microalgae from each
treatment.
Experiment 2- copepod culture
Microalgae cultured in the different media (control, Agr-F and Aq-F) were thereafter
used to culture the copepod Acartia sp. for 15 days. The experimental design was
similar to that for microalgae, with four repetitions per treatment; the experimental
units consisted on 10-L tanks provided with constant aeration ( 6 mg L-1),
temperature 28C, salinity 35 psu and pH 8.0-8.3. The copepod cultures were initiated
with 2400 organisms per experimental unit, and a microalgae density of 3.0 x 10 4 cells
mL-1 was maintained within each tank; the microalgae density was estimated and
readjusted twice a day (06:00 and 18:00 h) for each experimental unit.
At the end of the culture, copepods were harvested with a net (70 mesh screen [212
]), and copepod density, nauplii-adult ratio and fecundity index were estimated;
subsamples (10 x 20 mL) were collected from each unit and counted by stereoscopic
microscopy (40x) (Del Valls et al, 1996). Fecundity index was estimated following the
methodology proposed by Ramrez-Sevillaet al. (1991), considering the number of
eggs and the female number.
The proximate composition on dry basis (DB) of copepods was estimated only for those
adult organisms; a special net (50 mesh screen [300 ]) was used to separate adult
copepods. Protein, carbohydrate, lipid and ash content of copepods were estimated by
using the standard methods of the Association of Official Analytical Chemists (AOAC).
Statistical analysis
Production parameters of microalgae and copepods were analyzed by a one-way
ANOVA and a posteriori comparison test (Tukey). If data did not comply with normality
(Shapiro-Wilk) and homoscedastic (Bartlett) tests, a non-parametric test was used
(Kruskall-Wallis). Proximate composition of microalgae and copepods was analyzed by
a chi-square test. A level of = 0.05 was considered significant.
RESULTS
The culture mediums had an effect on the productive response of microalgae (Table 2).
Growth rate was 19% higher in microalgae cultured with Agr-F compared to those
cultured in Aq-F; however, such difference was not reflected in the generation time,
which was lower than Aq-F (24.7 vs 27.9 h) but not statistically different. The
increases in cellular concentration and biomass are shown in Fig. 1. The highest final
cellular concentration was achieved in Agr-F (3.75 x 106 cells mL-1), followed by control
(2.94) and Aq-F (2.28) respectively. The highest biomass was also found in Agr-F
(0.34 g L-1), while no differences were observed among Aq-F (0.25 g L-1) and the
control (0.26 g L-1) (Table 2).
The carbohydrate level was significantly higher (> 21%) in microalgae cultured in AgrF and Aq-F compared to those cultured in the control (< 19%), (Table 3). In the case
of protein level, microalgae from the control had ~3% more protein content, compared
to both treatments. No statistical differences were observed among treatments for lipid
or ash content (Table 3). The same tendencies were observed for protein, lipid and
carbohydrate proportion when the organic fraction was considered (Fig. 2).
DISCUSSION
Microalgae cultured in the agricultural fertilizer (Agr-F) had a similar productive
response to that observed in the control; both results, were similar to those reported
as successful for C. muelleri using conventional mediums (Medina-Reyna & CorderoEsquivel, 1998). Pacheco-Vega et al. (2010) cultured C. muelleri in different mediums,
not finding any significant difference in growth response among those microalgae
cultured in F/2 and those produced in a medium based on an agricultural fertilizer;
moreover, the biomass and cells production with Agr-F was higher than that reported
by Becerra-Drame et al. (2010) using an alternative system to increase their
productions of C. muelleri cultured outdoor. These results may be explained by the
slight decrease in generation time of Agr-F, which indicates that these microalgae
duplicate their cell number in less time. Thus, the agricultural fertilizer seems to be an
adequate alternative to replace the conventional mediums. Microalgae cultured in the
aquacultural fertilizer (Aq-F) had poorest lower productive response; however, the
results were within the range reported for commercial laboratories specialized on
shrimp larvae production (Lpez-Elas et al, 2003). In particular, Aq-F had the same
efficiency than the conventional F/2 media, in terms of biomass, which support the use
of Aq-F as a reliable strategy for microalgae production.
The proximate composition of diatoms varies widely, because they are affected by
several factors. However, the results of the three treatments were similar (except for
protein) to those reported by Medina-Reyna & Cordero-Esquivel (1998) for C.
muelleri cultured in Guillard F/2 medium (carbohydrate 28.7%, lipid 21.3%, protein
30.2% and ash 44.8%) at seven days of culture. The higher protein content observed
in microalgae cultured with the conventional medium (control) may be associated to
the higher content of total nitrogen in F/2 (12.4 g L-1) prepared medium, compared to
that of the agricultural and aquacultural fertilizers ( 10 g L-1). For carbohydrate
concentration, Pacheco-Vega et al. (2010) reported a slight increase in
carbohydrate content of microalgae cultured with an agricultural fertilizer, compared to
those cultured in F/2, which was a similar response than the observed in this
experiment. Valenzuela-Espinoza et al. (2002) explained that factors influencing the
carbon fixation of microalgae may result in modifications of their carbohydrate content;
however, specific studies have to be done to elucidate if the mediums used affected
the carbon fixation of C. muelleri.
The microalgae cultured in different media, had a subsequent effect on the productive
response and proximate composition of copepods. The copepod production in terms of
ind L-1, was lower than that reported in other experiments (Hernndez-Molejn &
Alvarez-Lajonchre, 2003), probably because a mixture of microalgae species are
commonly used to feed the copepods, in order to have a more complete nutrient
profile, whereas in this experiment, a single microalgae species was used. Knuckey et
al. (2005) observed that copepods (Acartia sinjiensis) feed with mono-algal diets had a
lower level of development; herein, diets containing a mixture of different microalgae
may have a more complete aminoacid and lipid profile than mono-algal diets.
Despite the productive responses of microalgae cultured in the conventional medium
(F/2) and Agr-F were statistically similar, the lower productive response of copepods
was achieved when they were fed on control microalgae; thus, the high protein
content, was not reflected in high copepod production; it is possible that amino acid,
fatty acid and sugar profiles from control microalgae were not adequate for culturing
copepods. Contrarily, Agr-F and Aq-F mi-croalgae had a positive effect on the
REFERENCES
Becerra-Drame, M., J.A. Lpez-Elas & L.R. Martnez-Crdova. 2010. An alternative
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concepts are reviewed, including those involved with adequate use of light energy
(light/dark cycles, light path and reactor geometry) as well as those based in physiological
concepts (oxygen photoinhibition, high cell density cultures, ultra high density cultures,
heterotrophy and mixotrophy). A brief account of the current applications of new
photobioreactors in fine chemicals production and possible uses in environmental
biotechnology is made.
Resumo
Durante a dcada passada se tem usado mltiplos desenhos de foto bio reatores para o
cultivo de organismos foto autotrficos microscpicos como microalgas e cianobactrias.
Os avanos no desenho destes sistemas tem permitido melhorar notavelmente a densidade
celular, a produtividade e por isto a economia dos cultivos para distintos fins. Neste
trabalho se revisam diferentes aspectos do desenho de foto bio reatores, tanto aqueles que
implicam o aproveitamento adequado da energia luminosa (ciclos luz-escurido, trajetria
da luz e geometria de foto bio reatores) como os baseados em conceitos fisiolgicos (foto
inibio por oxignio, cultivos de alta densidade celular, ultra-alta densidade celular,
heterotrofia e mixotrofia). Apresentam-se as principais aplicaes dos diferentes desenhos,
na produo de compostos de alto valor agregado e seu uso potencial na biotecnologia
ambiental.
PALABRAS CLAVES / Biotecnologa / Cianobacterias / Fotobiorreactores /
Microalgas /
Recibido: 20/03/2003. Aceptado: 29/07/2003
En la dcada de 1950 se postul por primera vez que el empleo de luz solar y agua marina,
para obtener cultivos masivos de microalgas ricas en protena de alta calidad, podra ser una
buena alternativa para obtener alimento para el ser humano (Becker, 1994). Durante los
aos 60 y 70, diversos grupos de investigacin tanto de pases desarrollados como en vas
de desarrollo, dedicaron esfuerzos a intentar lograr rendimientos de biomasa que pudieran
equipararse a los obtenidos con microorganismos no auttrofos (principalmente levaduras).
En el transcurso de los aos se pudieron diversificar las reas donde las microalgas
eucariotas (Vilchez et al., 1997) y cianobacterias (Morales et al., 2002; Prosperi, 2000)
cultivadas masivamente tienen aplicaciones prometedoras, especialmente en la produccin
de compuestos qumicos "finos" y combustibles, en el tratamiento de aguas residuales,
como intercambiadores inicos y biofertilizantes, para la obtencin de compuestos
teraputicos o aplicados a la teraputica, y como alimento de consumo humano o animal.
Sin embargo, la productividad terica estimada de 100 toneladas anuales por hectrea de
cultivos microalgales (Richmond, 2000), no pudo ser alcanzada ni siquiera en los
laboratorios de investigacin, sino hasta principios de la dcada de los 90. Una limitante
para lograr los estimados tericos se debi a que el sistema en carrusel, que inicialmente
fue el mejor sistema para desarrollar cultivos en masa por su facilidad de construccin y
operacin, paradjicamente result inapropiado como punto de partida para el desarrollo de
sistemas de cultivo de alta productividad (Richmond, 2000). El cultivo intensivo de
microalgas ha sido posible en gran medida gracias al desarrollo de nuevos diseos de
fotobiorreactores. A continuacin se revisan los avances que han tenido lugar en este
campo, principalmente durante la ltima dcada.
Existen dos diseos bsicos para la produccin de microorganismos fotoautotrficos
(Grobbelaar, 2000), los sistemas abiertos en los que el cultivo est expuesto a la atmsfera
y los sistemas cerrados, comnmente denominados fotobiorreactores, en los que el cultivo
tiene poco o ningn contacto con la atmsfera. La mayora de los sistemas de produccin
industrial de biomasa de microalgas construidos antes de los aos 90 fueron esencialmente
sistemas abiertos tipo carrusel (Figura 1), que permiten alcanzar densidades celulares de
hasta 0,7g de clulas (base seca) por litro. Estos sistemas, constituidos por canales poco
profundos (nivel de agua de 15-20cm) en forma de circuito cerrado, en los que el medio de
cultivo es impulsado mediante paletas rotatorias, generalmente requieren de grandes reas
de terreno (500-5000m2), pero tienen como ventaja el bajo costo de produccin de biomasa
algal en algunas zonas geogrficas especficas. Sin embargo, el perfeccionamiento de esta
tecnologa hace tiempo lleg a su lmite, restringiendo as el desarrollo de la biotecnologa
de microalgas. La baja densidad celular origina varios inconvenientes, incluyendo baja
productividad, fcil contaminacin, costosa recuperacin del producto de medios diluidos y
dificultad para el control de la temperatura. Estos inconvenientes estimularon el desarrollo
de fotobiorreactores construidos con materiales transparentes como vidrio y policarbonato,
entre otros materiales. Los primeros fotobiorreactores fueron propuestos por Pirt et al.,
(1983), Gudin y Chaumont (1983), y Torzillo et al., (1986). En la ltima dcada los
fotobiorreactores tubulares y de placas planas (Figura 1) han recibido, entre otros, mucha
atencin, ya que permiten establecer cultivos de alta densidad celular, 3 o ms veces en
comparacin con los sistemas convencionales de carrusel. Esto tiene ventajas como 1)
facilidad para cosechar la biomasa, 2) mantenimiento del cultivo sin contaminacin, 3)
mejor control de las condiciones de cultivo y 4) menor inversin de capital en el
fotobiorreactor. Este ltimo factor es un elemento importante en el costo de produccin de
productos derivados de microalgas.
La curva dosis-respuesta describe lo que sucede cuando la luz es el factor limitante y todas
las clulas reciben la misma cantidad de energa luminosa, como sucede en una capa celular
delgada o en cultivos de muy baja densidad celular. Sin embargo, estos conceptos aunque
generales no describen la realidad en la gran mayora de los cultivos que se desarrollan en
el laboratorio o a gran escala, en especial si se trata de cultivos de alta densidad celular
(>3g/l; Javanmardian y Palsson, 1991). Bajo ciertas condiciones, los cultivos con mayor
densidad celular, son capaces de utilizar la luz incidente con mayor eficiencia en
comparacin con cultivos convencionales diluidos. Por ejemplo, en cultivos de Spirulina en
los que se optimiza cuidadosamente la densidad celular, no se observa una disminucin
significativa de la eficiencia al aumentar la intensidad de la luz incidente. Es decir, la
fotoinhibicin puede no presentarse an en cultivos expuestos a intensidades de luz
elevadas. Esto en gran medida se debe a una dilucin de la luz, como resultado del
autosombreado, ms marcado entre las clulas conforme aumenta la densidad celular. Un
exceso de luz a una densidad de 1,8g/l, puede resultar ptimo para un cultivo a 16g/l en el
cual cada clula recibe una porcin menor de la luz incidente (Hu et al., 1996a). Siempre
que la densidad celular aumenta con relacin a la luz incidente, el cultivo no alcanza a
saturarse por completo. Entonces, la inhibicin del crecimiento por un exceso de luz
(fotoinhibicin) implica en esencia que la densidad celular no se ajusta a la intensidad de la
fuente de luz. Slo en estos casos se puede apreciar una disminucin significativa de la
eficiencia al aumentar la intensidad de iluminacin. La omisin de estos conceptos condujo
a que el diseo de sistemas comerciales frecuentemente se basara slo en los clculos de
profundidades para evitar la digestin anaerobia del cultivo y en los clculos de potencia de
las paletas rotatorias para imprimir movimiento al cultivo, hasta el lmite de esfuerzo de
corte tolerado por la microalga en cuestin (Ogbonna y Tanaka, 2000).
Diseo de Fotobiorreactores Basado en Conceptos sobre Distribucin de Luz
En cultivos de microorganismos fotoauttrofos en los que otros factores no son limitantes,
la disponibilidad de luz determina la intensidad a la que se realiza la fotosntesis y, como
consecuencia, determina tambin la velocidad de crecimiento (). Sin embargo, en todos
Los parmetros que pueden considerarse como bsicos para describir la disponibilidad de
energa bajo una iluminacin intermitente son dos, la relacin de los periodos luz/oscuridad
(L/O) y la frecuencia de los ciclos L/O. Estos, junto con la intensidad de la luz y la
trayectoria de la luz en el reactor, que se describir ms adelante, establecen en gran
medida el rgimen de iluminacin, el cual es un indicador de la disponibilidad de luz para
una clula individual (Fernndez et al., 2002). Para asegurar la mxima actividad
fotosinttica y la mejor utilizacin de la luz incidente, se requiere de un rgimen de
iluminacin ptimo. No obstante, a pesar de su importancia, ste no puede determinarse
cuantitativamente, razn por la cual es comn usar los parmetros citados antes para
caracterizar la incidencia de luz en los fotobiorreactores.
Trayectoria de la luz
La trayectoria de la luz es la distancia transversal que debe recorrer un fotn para pasar a
travs de un fotobiorreactor (Richmond, 1996), concepto que se ilustra en laFigura 3. Su
magnitud es determinada por diferentes medidas en los diferentes tipos de reactores. As, la
trayectoria de la luz es determinada por la profundidad de lquido en un reactor de tipo
carrusel, por la separacin entre las placas en un reactor de placas (horizontal o vertical) o
por el dimetro del tubo en un reactor tubular. Incrementar la trayectoria de la luz implica
reducir el volumen iluminado en relacin al volumen no iluminado en el fotobiorreactor,
debido a que el autosombreado entre las clulas slo permite a la luz penetrar una corta
distancia dentro del cultivo. En consecuencia, un incremento de la trayectoria de la luz
reduce tanto la frecuencia promedio con la que las clulas son expuestas a la luz, como la
relacin de los periodos L/O (Grobbelaar, 1994; Ogbonna y Tanaka, 1998). Por el
contrario, una trayectoria pequea de la luz aumenta la relacin de volmenes
iluminado/obscuro, permitiendo as periodos L/O mayores, una mayor frecuencia con la
que las clulas son expuestas en promedio a la luz y por ende un mejor rgimen de
iluminacin. En reactores tubulares de dimetro pequeo (1-3cm) se pueden lograr ciclos
de alta frecuencia de L/O, que contribuyen a obtener una alta productividad. Lo anterior ha
sido verificado en cultivos de Spirulina platensis y de diversas especies de microalgas,
tanto en reactores tubulares horizontales como en reactores planos verticales e inclinados.
Hu et al. (1996a) han reportado que al reducir la trayectoria de la luz se obtiene un aumento
significativo de la densidad celular ptima y de la velocidad especfica de crecimiento. En
un fotobiorreactor de plano inclinado estos autores observaron adems que con una
trayectoria de la luz de 10,4cm, la productividad fue slo 6% de la obtenida en otro reactor
con una trayectoria de la luz de 1,3cm. En fotobiorreactores tubulares, se han reportado
resultados similares al reducir la trayectoria de la luz. Richmond et al. (1993) usando un
nuevo diseo de reactor tubular horizontal reportaron un aumento de 77% en la
productividad volumtrica cuando el dimetro del tubo disminuy de 5 a 2,8cm. La
productividad en este ltimo caso fue 640% superior a la obtenida en un sistema
convencional de carrusel con 15cm de profundidad. Las rutas luminosas que mejores
resultados han dado en diferentes fotobiorreactores estn entre 2,6 y 3,0cm; sin embargo, en
cultivos de alta densidad celular, una trayectoria de la luz de 1cm aumenta la probabilidad
de que las clulas en promedio estn expuestas a un rgimen de iluminacin ptimo
(Javanmardian y Palsson, 1991). En virtud de lo anterior, actualmente no es recomendable
utilizar rutas luminosas de ms de 10cm en ningn tipo de biorreactor.
Otros Factores Importantes en el Diseo de Fotobiorreactores
Debido a que una condicin necesaria para el xito comercial de una biotecnologa es tener
una productividad alta y consistente, los diferentes tipos de fotobiorreactores se comparan
con frecuencia en base a su productividad por unidad de volumen de reactor (g de
biomasa/m3da), a su productividad por unidad de rea ocupada de reactor (g/m2da) y a
la productividad por rea iluminada de reactor (g/m2da), siendo la primera la ms
utilizada. En un cultivo continuo la productividad volumtrica (Pv) es proporcional a la
velocidad especfica de crecimiento y a la concentracin celular x (Pv= x). As, para
lograr una alta productividad se deben mantener altas densidades celulares, pero sin que la
velocidad de crecimiento disminuya significativamente, por ejemplo debido a un mayor
sombreado entre clulas. La factibilidad de esto depende, como ya se discuti, de un
suministro adecuado de luz a las clulas, pero adems se requiere alinear cuidadosamente
las condiciones ambientales en el reactor con las necesidades de la cepa seleccionada.
Independientemente de la configuracin del fotobiorreactor se deben considerar adems de
los factores ya discutidos que afectan el suministro de luz, otros fundamentales como el
mezclado, el autosombreado entre las clulas, el suministro de nutrientes (incluyendo CO2),
el control de la temperatura y la remocin del O2 producido fotosintticamente. Algunos
requerimientos del cultivo como lo son el suministro de nutrientes y el control de la
temperatura, son relativamente fciles de cubrir (Morita et al., 2002), pero otros como el
suministro de luz, adems de ser crtico, es difcil de controlar. En especial la consideracin
cuidadosa del mezclado, el autosombreado y la remocin del O2 es importante para lograr
altas productividades.
A continuacin se discuten los efectos del mezclado y de la densidad celular, que son
factores que juegan tambin un papel crucial en el rgimen de iluminacin y que de
ninguna manera pueden considerarse menos importantes que la trayectoria de la luz o que
la intensidad de luz.
Importancia del Mezclado en Fotobiorreactores
El mezclado favorece el intercambio gaseoso, evita la sedimentacin de clulas, la
formacin de gradientes de condiciones ambientales y de concentracin de nutrientes, pero
su funcin principal es permitir que todas las clulas puedan acceder a las zonas iluminadas
en un fotobiorreactor (Ogbonna y Tanaka, 2000; Ugwu et al., 2002). El mezclado puede
inducirse de muy diversas formas; sin embargo, los sistemas basados en la aireacin del
cultivo con aire comprimido (columnas burbujeadas o airlift), se usan comnmente por su
sencillez y porque pueden disearse para inducir un esfuerzo de corte pequeo que no cause
dao mecnico a las clulas (Richmond et al., 1993; Snchez et al., 2000).
El tiempo que las clulas permanecen en zonas iluminadas y la frecuencia con la que son
iluminadas (frecuencia de los ciclos L/O) dependen de la trayectoria de la luz, pero al
mismo tiempo dependen del mezclado del medio de cultivo (Grobbelaar, 1994). En un
mismo fotobiorreactor es posible establecer diferentes condiciones de mezclado para
manipular el rgimen de iluminacin y as la tasa de fotosntesis. Richmond (1996) ha
reportado que la eficiencia fotosinttica disminuye al aumentar la intensidad luminosa en
cultivos de baja densidad celular con una aireacin de 0,6l de aire/l-min. En cambio, a una
densidad celular ptima y una aireacin de 4,2l/l-min, las eficiencias fueron similares a
pesar de aumentar la intensidad de luz en un factor de 4. Adicionalmente, al aumentar la
aireacin de 0,6 a 4,2l/l-min la productividad aument al doble. En cultivos de alta
densidad celular en los que se utilizan niveles de iluminacin como los que se presentan
tpicamente al medioda, con frecuencia se reportan aumentos de la productividad al
aumentar la intensidad de mezclado. Por ello, para lograr una alta productividad y un
aprovechamiento ptimo de la luz, Richmond (1996) recomienda una iluminacin intensa
(medioda), el uso de reactores con una trayectoria de la luz pequea, y un mezclado
vigoroso hasta donde lo permita la fragilidad de las clulas. Por otra parte, Grobbelaar
(1994, 2000) determin experimentalmente la contribucin de los ciclos L/O y de la
transferencia de nutrientes, y concluy que los dos componentes del mezclado actan
sinrgicamente sobre la productividad. Una frecuencia alta o mediana de ciclos L/O ayuda
a evitar la fotoinhibicin, an a niveles elevados de iluminacin, debido a que las clulas no
estn expuestas permanentemente a la luz (Grobbelaar, 1994). La tasa de fotosntesis y la
productividad de los cultivos aument al aumentar la frecuencia de los ciclos L/O en el
productividad a densidades celulares por encima de 3g/l. Altas densidades celulares solo
son posibles mediante una combinacin de alta intensidad de luz, una trayectoria de la luz
pequea (1-5cm) y un mezclado vigoroso inducido por burbujas de aire (Javanmardian y
Palsson, 1991). Hu et al. (1996b) midieron la relacin entre las fluorescencias variable y
mxima de la clorofila, que es un indicador de la integridad de los fotosistemas. En clulas
mantenidas a varias densidades celulares encontraron que la cantidad de energa luminosa
que para clulas en cultivos de menor densidad celular es sumamente txica, para las de
cultivos de mayor densidad es ptima.
Una dificultad adicional de los cultivos a altas densidades celulares es que las microalgas
secretan sustancias autoinhibitorias (Richmond, 2000). En consecuencia, la produccin
microalgal a alta densidad celular requiere de una solucin prctica al problema de la
acumulacin de estas substancias. El desarrollo tanto de cultivos de ADC como de UADC
fue posible gracias a los avances ya descritos en materia de fotobiorreactores, pero
adicionalmente a la inclusin de etapas de ultrafiltracin o filtracin en lote o
semicontinuas que permitieron la eliminacin de sustancias autoinhibitorias y la adicin de
medio fresco. Concentraciones de hasta 80g/l se han obtenido en reactores verticales con
una trayectoria de la luz pequea, una agitacin vigorosa y con remocin de substancias
autoinhibitorias. Hasta ahora la remocin de estas substancias ha sido semicontinua y
externa al fotobiorreactor en cultivos de UADC. Recientemente se han utilizado
membranas de ultrafiltracin sumergidas en el medio de cultivo, para la recuperacin
continua del pigmento marenina producido por una diatomea (Rossignol et al., 2000), idea
que podra ser de inters para el desarrollo de otras tecnologas en las que la ultrafiltracin
continua sea deseable.
Para lograr cultivos de UADC se han utilizado diversas geometras de fotobiorreactores y
fuentes de iluminacin, tales como reactores planos verticales con lmparas fluorescentes
de luz blanca (Hu et al., 1998), reactores iluminados cuasi-internamente por diodos (Lee y
Palsson, 1994), reactores iluminados internamente mediante fibra ptica (Javanmardian y
Palsson, 1991), y reactores planos inclinados con iluminacin solar mantenidos en
exteriores (Hu et al., 1996b). Una comparacin de los rendimientos logrados en diferentes
sistemas se presenta en la Tabla I.
CULTIVO DE
MICROALGAS
martes, 26 de marzo de 2013
AISLAMIENTO
Es necesario el aislamiento de una unidad algal y la colocacin de la misma en un medio
de cultivo adecuado para su multipliacin, a fin de establecer un cultivo unialgal
(monoespecfico). El trmino unidad se refiere a cualquier clula, colonia, filamento,
pieza o parte del talo y cuerpo reproductivo. Un cultivo unialgal establecido es necesario
para preparar un cultivo axnico.
Rayado en Agar
Este mtodo brinda mayor facilidad para aislar algas de tamao igual o menor a 10 m de
dimetro. Tambin produce cultivos axnicos
a) Prepare cajas de Petri (vidrio o plstico) de 100 x 15 mm, conteniendo medio de cultivo
solidificado con 1 a 1,5% de agar.
b) Coloque dos gotas de coleccin natural cerca de la periferia en el medio solidificado.
Con el asa de platino (punta esterilizada sumergida en alcohol y quemada), bajo criterio
de asepsia, rayar en paralelo la muestra de la coleccin en el agar.
c) Cubra el plato, inviertalo e incubar de 4 a 8 dias bajo adecuada condicin de
crecimiento.
d) Pasado este tiempo observar directamente en el estereomicroscopio el rayado y
seleccione las colonias deseadas que estn libres de otros organismos.
e) Remueva las colonias seleccionadas usando una pipeta Pasteur estirada estril o el
asa de platino y colquelas en una gota de medio de cultivo estril sobre un cubreobjeto.
En un microscopio compuesto observe las unidades de algas deseadas y que sean de la
misma especie.
f) Repita el procedimiento de rayado de una sola zona, constatar y nuevamente incubar
para que se formen las colonias. Este segundo rayado reduce la contaminacin por
bacterias y asegura agrupaciones de unidades algales de la misma especie.