Revista V902 Final-1sulfonaciongrasa

Editorial
Pasar de la teora a la aplicacin prctica a fin de derivar los

beneficios del conocimiento nuevo es el reto en la mayora de las
ciencias. En el escenario actual de cambio global, este reto toca a
aquellos campos aparentemente distantes de la actividad econ-
mica y los mercados, como la ecologa y las ciencias ambientales.
Sin embargo la sociedad espera que la economa y la ecologa,
de la mano, delineen una salida hacia la aplicacin prctica de
mecanismos viables, para promover la conservacin y la valora-
cin adecuada de los servicios que proveen los ecosistemas. Se
trata de ligar el conocimiento de los sistemas biolgicos y de los
sociales a fin de proyectar los servicios de los ecosistemas, para
muchos de los cuales no existen mercados.
En esta nueva edicin de la Revista CORPOICA, Ciencia y
Tecnologa Agropecuaria presentamos a nuestros lectores artcu-
los originales que abordan desde distintas perspectivas, la tem-
tica de los servicios de los ecosistemas: la diversidad gentica
y su rol en la produccin sostenible, la dinmica natural en la
circulacin de nutrientes en los ecosistemas nativos, y el aporte
de la vegetacin natural como hbitat para diversos gremios de
insectos. En su artculo Importancia de los recursos genticos
de la agrobiodiversidad en el desarrollo de sistemas de produc-
cin sostenibles, Lobo. M. argumenta que la riqueza gentica
de los ecosistemas est representada no solamente por las enti-
dades genticas que contienen, sino tambin por la diversidad
de procesos biolgicos. Estos influencian la resiliencia de los
ecosistemas y su capacidad de proveer servicios, asociada a una
menor vulnerabilidad, mayor adaptacin local y estabilidad de
la produccin. Para nuestros sistemas tropicales, persisten pre-
guntas fundamentales acerca de los mecanismos que operan en
la adaptacin durante la domesticacin y la seleccin natural.
En el artculo Incidencia de los mrgenes de vegetacin
sobre el control biolgico natural de Spodoptera frugiperda (J. E.
Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en cultivos de arroz Vilaseca
y colaboradores describen observaciones realizadas sobre las
poblaciones de S. frugiperda y de sus enemigos naturales (parasi-
toides y depredadores), y su relacin aparente con la presencia
de bosques y plantaciones de palma cerca a los campos de arroz.
El estudio demuestra el potencial que tienen los bosques nativos
de contribuir a la reduccin del impacto de las plagas agrcolas, y
resalta al mismo tiempo la fragilidad de las relaciones que existen
entre los mltiples componentes de estos ecosistemas. La capa-
cidad del bosque o de las plantaciones para proveer un hbitat
adecuado a los gremios insectiles y otros organismos benficos
es disminuida, incluso por leves intervenciones en su entorno;
sin embargo, mucha informacin de tipo cuantitativo sobre estos
fenmenos an est por obtenerse experimentalmente.
Algunos procesos asociados al ciclaje de nutrientes se exploran
en el artculo Produccin y descomposicin de la hojarasca en
bosques nativos y de Leucaena sp., en Codazzi, Cesar, de Bonilla
y colaboradores. Los autores ilustran el rol de factores ambien-
tales y del suelo que contribuyen a la transferencia de nutrientes
en bosques nativos y en sistemas establecidos con Leucaena sp. El
ciclaje de nutrientes es un fenmeno al cual se atribuyen grandes
Moving from theory to practical application in order to
perceive the benefits of new knowledge is the challenge for
most sciences. Given the current global change scenario, this
challenge may concern some fields apparently distant from
economics and the market, such as ecology and environmental
sciences. Society, however, expects that working together,
ecology and economics will bring about ways to implement
viable mechanisms that promote conservation, and proper
valorization of ecosystem services. The goal is to integrate
knowledge on biological and social systems in order to foster
ecosystem services for most of which, no markets exist.
In this new edition of Revista CORPOICA, Ciencia y
Tecnologa Agropecuaria we deliver original articles offering
different perspectives of ecosystem services: genetic diversity
and its role in sustainable agricultural production, natural
dynamics of nutrient cycling in native ecosystems, and
contributions of natural forests or plantations as habitat
for diverse insect groups. In the article Agrobiodiversity
relevance, at genetic resources level, for the development
of sustainable production systems, Lobo M., argues that
richness in genetic resources of ecosystems not only indicates
abundance of genetic entities, but also a wealth of unique
biological processes. These processes relate to levels of
resilience and capacity to provide ecosystem services that are
associated with reduced vulnerability, greater local adaptation
and stability on production functions. Fundamental questions
remain to be elucidated regarding the mechanisms behind
adaptation, during domestication and natural selection in
tropical ecosystems.
In their article Incidence of the margins on the natural
biological control of Spodoptera frugiperda (J. E. Smith)
(Lepidoptera: Noctuidae) in rice crops Vilaseca et al., describe
observations on populations of S. frugiperda and its natural
enemies (parasitoids and predators), as influenced by native
forests or oil palm plantations at the edge of rice fields. This
study shows the potential benefits of natural vegetation or
plantations in reducing the impact of agricultural pests. The
report also indicates that relationships among the multiple
components of these ecosystems are very fragile. The capacity
of natural forests or plantations, to provide high quality
habitat for beneficial insects and other organisms can be
affected, even by very short and mild interventions; yet,
quantitative information on this matter remains to be obtained
experimentally.
Nutrient cycling-related processes are explored by
Bonilla et al., in their article Leaf litter production and
decomposition of native forest and Leucaena sp. systems in
Codazzi, Cesar. The paper describes how climate and soil
factors contribute to nutrient transfer in native forests as
well as in Leucaena sp. agroforestry systems. Nutrient cycling
is a benefit of paramount importance to most ecosystems,
noticeably forests and plantations. A complex network of
relationships among multiple components (substrata, weather,
2008 Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
beneficios de los ecosistemas, especialmente bosques y plan-
taciones. Una red de relaciones entre mltiples componentes
(sustratos, clima, macrofauna, microflora, etc.) se presume que
opera para llevar a cabo estos procesos; sin embargo hacen falta
grandes esfuerzos que permitan cuantificar esas relaciones. Las
comunidades microbianas por ejemplo, son relevantes a dichos
procesos, pero es necesario conocer su composicin y cuantificar
su funcin, para poder interpretar y predecir- su contribucin a
los servicios de los ecosistemas.
Jairo Antonio Osorio, Ph.D.
Director
Revista Corpoica - Ciencia y Tecnologa Agropecuaria
macrofauna, microflora) is responsible for these processes;
however, more research efforts are still needed to quantify
those relationships. Microbial communities for instance, are
relevant to those processes; their composition and function
have to be determined in order to interpret -and predict- their
contribution to ecosystem services.
Jairo Antonio Osorio, Ph.D.
Director
Revista Corpoica - Ciencia y Tecnologa Agropecuaria
ISSN 0122-8706 Volumen 9 - No. 2 julio - diciembre, 2008
La Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria se encuentra referenciada e indexada internacionalmente en AGRIS (http://www.fao.org/agris) y en las bases de datos de
CABI: CAB Abstracts, CAB Full databases y CAB Health (http://www.cabi.org) y forma parte del ndice Publindex de Colciencias en la categora "B". La versin electrnica de la revista
puede consultarse en texto completo en http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/Revistas/Revistas.asp
Contents Contenido
Editorial
Plant ecophysiology
Leaf litter production and decomposition of
native forest and Leucaena sp. systems in
Codazzi, Cesar
Nursery growth and development of
commercial oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) in
Tumaco, Colombia
Plant genetics & biodiversity
Agrobiodiversity relevance, at genetic resources
level, for the development of sustainable
production systems
Evaluation of SCAR molecular markers to
determine sex in papaya plants
(Carica papaya L.)
Cryoconservation of buds of potatos
microtubers Solanum tuberosum ssp. andigena
by means of drying tissues
Plant health & crop protection
Incidence of the margins on the natural
biological control of Spodoptera frugiperda (J.
E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) in rice crops
Coccidologa. El estudio de insectos escama
(Hemiptera: Sternorrhyncha: Coccoidea)
Animal health
Yersinia pseudotuberculosis detection in
feces of guinea pigs (Cavia porcellus) using
microbiological and molecular methods
Comparison of three methods for the
cryopreservation of Leptospira strains in Liquid
Nitrogen
Agroenergy
Sulfonation of methyl esters derived
from palm oil
Kinetic study of methyl esters sulfonation
derived from palm stearin
Aims and scope, Editorial policies
and Authors guidelines
Measurement units, abbreviations and symbols
Subscription form
1-2 Editorial
Ecosiologa vegetal
5-11 Produccin y descomposicin de la hojarasca en bosques nativos y de Leucaena sp.,
en Codazzi, Cesar
Ruth Bonilla, Belisario Roncallo, Jos Jimeno, Tatiana Garca
12-18 Crecimiento en vivero de materiales comerciales de palma aceitera (Elaeis guineensis
Jacq.) en Tumaco, Colombia
Rafael Reyes Cuesta, Nubia Rodrguez Hernndez, Eduardo Pea Rojas, Silvio Bastidas Prez
Gentica vegetal y biodiversidad
19-30 Importancia de los recursos genticos de la agrobiodiversidad en el desarrollo de
sistemas de produccin sostenibles
Mario Lobo A.
31-36 Evaluacin de marcadores moleculares tipo SCAR para determinar sexo en plantas de
papaya (Carica papaya L.)
Erika Snchez-Betancourt, Vctor Manuel Nez Zarantes
37-44 Crioconservacin de yemas de microtubrculos de papa Solanum tuberosum ssp.
andigena mediante desecado de tejidos
ngela Liliana Rivera Caldern, Ral Ivn Valbuena Benavides, Rigoberto Hidalgo
Hidalgo, Jos Dlmer Moreno Mendoza
Sanidad vegetal y proteccin de cultivos
45-54 Incidencia de los mrgenes sobre el control biolgico natural de Spodoptera frugiperda
(J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en cultivos de arroz
Carlos Javier Vilaseca, Luis Guillermo Baptiste, Aristbulo Lpez-vila
55-61 Coccidology. The study of scale insects (Hemiptera: Sternorrhyncha: Coccoidea)
Takumasa Kondo, Penny J. Gullan, Douglas J. Williams
Sanidad animal
62-71 Deteccin de Yersinia pseudotuberculosis en heces de cuyes (Cavia porcellus)
utilizando una metodologa microbiolgica y una molecular
Hugo Alexander Jaramillo Torres, Roco Esperanza Patio Burbano, Jos Luis Rodrguez
Bautista
72-76 Comparacin de tres tratamientos para la crioconservacin de serovares de Leptospira
en nitrgeno lquido
Ligia Denise Torres Higuera, Diego Ortiz Ortega, Jos Luis Rodrguez Bautista, Roco
Esperanza Patio Burbano
Agroenerga
77-87 Sulfonacin de steres metlicos derivados del aceite de palma
Jess Alfonso Torres Ortega, Oscar Yesid Surez Palacios, Paulo Csar Narvez Rincn,
Francisco Jos Snchez Castellanos
88-95 Estudio cintico de la sulfonacin de steres metlicos derivados de la estearina de
palma
Jess Alfonso Torres Ortega, Luis Alejandro Daz Aldana, Francisco Jos Snchez
Castellanos
96 Objetivos y alcance, Poltica editorial e Instrucciones a los autores
99 Unidades de medida, abreviaturas y smbolos
103 Formato de suscripcin
Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa Agropecuaria (2008) 9(2), 5-11
ART CULO CI ENT FI CO
Ruth Bonilla
1
, Belisario Roncallo
2
,
Jos Jimeno
3
, Tatiana Garca
4
Leaf litter production and
decomposition of native forest and
Leucaena sp. systems in Codazzi, Cesar
AB S T RACT
Indiscriminate forest logging is associated
with soil erosion processes, due, among other
factors, to the interruption of the recycling
process. By this mechanism, plant species,
individually or in community, can contribute
with the nutrient return to agroecosystems.
The purpose of this research was to evaluate
the leaf liter production and decomposition
and to determine the factors involved.
Leaf litter production and decomposition,
identification and quantification of soil
organisms were done. The relationship
between environmental factors and leaf fall
was analyzed by the Pearson correlation
coefficient. For leaf decomposition, regression
analysis was performed. Estimated leaf litter
production was 16.7 and 13.2 t/ha/yr in a
tropical dry secondary and a Leucaena sp.
system, respectively. At the forest system
no significant correlation was found for
temperature, humidity and precipitation with
leaf liter, but a significant correlation was
found for wind. The greater component of
the necromass was due to leaf, corresponding
to 62.2% and 73.5% in the forest and the
Leucaena sp. system respectively. The highest
density of organism was found at the dry
forest, increased during the wet season in both
systems and decreased with soil depth. High
decomposition rates were registered in both
systems and followed an exponential model.
The highest rate was recorded at the Leucaena
sp. system with 7.8 x 10
5
t/ha/yr.
Keywords: Forest litter, biota, mass, soil
organisms, soil nutrient.
Produccin y descomposicin de la
hojarasca en bosques nativos y de Leucaena sp.,
en Codazzi, Cesar
RE S UME N
La tala indiscriminada de los bosques se asocia con procesos erosivos de los suelos debido,
entre otros factores, a la interrupcin del proceso de ciclaje de nutrientes. Por este meca-
nismo, las especies vegetales individualmente o en comunidad pueden contribuir con el
retorno de nutrientes a los agroecosistemas. El objetivo del presente trabajo fue evaluar
el comportamiento de la produccin y descomposicin de la hojarasca, y determinar los
factores involucrados en estos procesos. Se determin la produccin, descomposicin de
hojarasca, identificacin y cuantificacin de organismos del suelo. La relacin entre facto-
res ambientales y cada de hojarasca se analiz mediante el coeficiente de correlacin de
Pearson; para la descomposicin foliar se realizaron anlisis de regresin. La produccin
estimada de hojarasca fue de 16,7 y 13,2 t/ha/ao en el relicto de bosque seco y sistema basa-
do en Leucaena sp., respectivamente. En el bosque no fue significativa la correlacin entre
los factores temperatura, humedad relativa y precipitacin con la produccin de hojarasca;
s se present correlacin significativa con el factor viento. El mayor componente de necro-
masa estuvo representado por las hojas, con valores de 62,2% en el bosque nativo y 73,5%
en el sistema basado en Leucaena sp. En el bosque nativo se encontr la mayor densidad de
organismos; sta aument en la poca de lluvias en ambos sistemas y disminuy a mayor
profundidad del suelo. Se registraron altas tasas de descomposicin en los sistemas eva-
luados y las curvas de descomposicin presentaron un modelo de tipo exponencial; la tasa
ms alta se registr en el sistema basado en Leucaena sp. (7,8 x 10
-5
t/ha/ao).
Palabras clave: hojarasca forestal, biota, masa, organismos del suelo, nutrientes del suelo.
ECOF I SI OLOG A
VEGETAL
Radicado: 1 de octubre de 2008
Aceptado: 9 de diciembre de 2008
1
Biloga Ph.D. Investigadora principal. Laboratorio
de Microbiologa de Suelos, Centro de Biotecnologa
y Bioindustria (CBB), Corpoica, C.I. Tibaitat,
Mosquera, Cundinamarca. rbonilla@corpoica.org.co
2
Mdico veterinario, M.Sc Investigador principal.
Corpoica, Estacin Experimental Motilonia, Codazzi,
Cesar. broncallo@corpoica.org.co
3
Bilogo, Universidad Pedaggica y Tecnolgica de
Tunja, Tunja, Boyac.
4
Biloga, Universidad Pedaggica y Tecnolgicade
Tunja, Tunja, Boyac.
I NT RODUCCI N
La tala indiscriminada de los bosques,
y el manejo inadecuado de los suelos y de
los agroqumicos han conducido al dete-
rioro edfico en sus caractersticas fsicas,
qumicas y biolgicas, causando prdida
de la productividad y competitividad de
los sistemas agropecuarios.
La cada de la hojarasca representa
el mayor proceso de transferencia de
nutrientes de las partes areas de la planta
hacia el suelo (Vitousek et al., 1994, citado
por Schlatter et al., 2006). La hojarasca que
cae al suelo forma un estrato orgnico
conocido como mantillo, el cual cubre
el suelo y lo protege de los cambios de
temperatura y de humedad, y tambin
permite que retornen elementos nutriti-
vos en una cantidad importante (Schlatter
et al., 2003; Schlatter et al., 2006). Los resi-
duos vegetales depositados (hojas, ramas,
flores y frutos) son una fuente valiosa de
materia orgnica que despus de sufrir
procesos de descomposicin liberan ele-
mentos nutritivos que se incorporan al
suelo para ser nuevamente utilizados por
las plantas (Bradford, 2002, citado por
Laossi et al., 2008).
La produccin de nueva biomasa unida
a las velocidades de descomposicin y
transferencia de los elementos nutritivos
depende en gran parte de las condiciones
edafolgicas, climatolgicas, de la biota
y calidad de los nutrientes presentes en
la hojarasca; disponer de esta informa-
cin es necesario para generar un manejo
racional de los recursos naturales que
garantice mayor eficiencia y sostenibili-
dad de los agroecosistemas.
En este sentido, el presente trabajo
tuvo como objetivo identificar y evaluar el
comportamiento de la produccin y des-
composicin de la hojarasca en un relicto
de bosque seco tropical y en un sistema
basado en acacia forrajera (Leucaena sp.), y
determinar los factores que inciden direc-
tamente en cada proceso.
MAT E RI AL E S Y M T ODOS
El estudio se realiz en la estacin experi-
mental Motilonia ubicada en el municipio
Agustn Codazzi (Cesar). Tuvo una dura-
cin de ocho meses, entre diciembre de
2000 y julio de 2001, y comprendi una
poca seca y una de lluvia.
6
Produccin y descomposicin de la hojarasca en bosques nativos y de Leucaena sp., en Codazzi, Cesar
sp., aplicando la siguiente metodologa:
Inicialmente se identificaron y clasifica-
ron las especies vegetales presentes en
el relicto de bosque con el propsito de
determinar su contribucin individual
en la produccin de hojarasca. El proceso
de descomposicin de hojarasca se eva-
lu utilizando el mtodo propuesto por
Anderson e Ingram (1989), consistente
en estimar la prdida de peso seco de
la hojarasca en relacin con el peso seco
inicial. En cada tratamiento se utilizaron
tres repeticiones (parcelas) y dentro de
cada parcela se colocaron al azar 16 bolsas
para un total de 48 bolsas por tratamiento;
cada bolsa contena 15 gramos de peso
seco de material foliar y mensualmente
se retir para procesamiento una muestra
por cada parcela, es decir, tres bolsas de
cada tratamiento.
Para observar la participacin de los
organismos en la descomposicin y trans-
formacin del material vegetal se aplica-
ron dos tratamientos: bolsas con poros
de malla de 1 mm sin orificios, y bolsas
con poro de malla de 1 mm con agujeros
de 10 mm ubicados en la cara superior,
segn mtodo propuesto por Hernndez
y Murcia (1992).
Organismos del suelo
Para la determinacin de la macrofauna se
utiliz el mtodo propuesto por Anderson e
Ingram (1989), consistente en la realizacin
de tres calicatas (25 x 25 x 30 cm) en cada
sitio de muestreo, haciendo extraccin de
la edafofauna manualmente en cada perfil
del suelo evaluado (Mantillo, 0-10, 10-20
y 20-30 cm); los artrpodos colectados en
campo se preservaron en alcohol al 70% y
las lombrices en formol al 10%. La determi-
nacin taxonmica se realiz en la catego-
ra Orden segn claves taxonmicas.
Anlisis estadstico
Se utiliz un diseo de bloques al azar
con dos tratamientos y tres repeticiones
por tratamiento. Se aplic el coeficiente de
correlacin de Pearson (r) para encontrar
el grado de relacin entre los fenmenos
ambientales y la cada de hojarasca.
Para la descomposicin foliar se reali-
zaron anlisis de regresin entre la varia-
ble dependiente tiempo y la independien-
te peso, mediante la ecuacin:
Figura 1. Relicto de bosque seco tropical
Para realizar el estudio de produccin y
descomposicin de hojarasca se establecie-
ron los siguientes tratamientos: 1) relicto
de bosque seco tropical poco intervenido
(figura 1); y 2) sistema basado en Leucaena
sp. (figura 2). En cada tratamiento se dis-
puso de una extensin de 2700 m
2
con par-
celas experimentales de 900 m
2
de rea.
Factores climticos
La informacin climtica (precipitacin,
temperatura, velocidad del viento y
humedad relativa) se tom diariamen-
te en la estacin meteorolgica de la
Estacin Experimental Motilonia, desde
diciembre de 2000 hasta julio de 2001.
Suelos
Las muestras de suelo se tomaron a 20
cm de profundidad. Se analiz una mues-
tra compuesta, conformada por cinco
submuestras por cada tratamiento, esto
debido a que la topografa es uniforme.
La textura y las caractersticas qumicas
de los suelos se procesaron segn meto-
dologa descrita en el Manual de anlisis
de suelos, plantas y aguas para riego
(ICA, 1989).
Produccin de hojarasca
Para colectar el material cado de los
rboles se ubicaron al azar 10 colectores
construidos con fibra sinttica y alambre
dulce, en un rea de coleccin de 0,2 m
2
,
colocados a una altura de 70 cm del suelo,
en parcelas de 30 x 30 m en los diferentes
sitios de muestreo. Se colocaron en total 30
colectores en cada sistema, y cada 15 das
se retir el material para su posterior pro-
cesamiento (Anderson e Ingram, 1989).
Descomposicin de la hojarasca
La descomposicin de la hojarasca se
estudi en el relicto de bosque seco tro-
pical y en el sistema basado en Leucaena
Figura 2. Sistema basado en Leucaena sp.
7
Y
(x) =
X
0
e
-k * t
, donde:
Y
(x)
=

peso remanente en el proceso de
descomposicin
X
0
= peso inicial del material sometido a
descomposicin
e = base del logaritmo natural
K = constante de descomposicin
t = tiempo transcurrido
Este anlisis permiti determinar el
cambio esperado en Y como resultado de
una unidad de cambio en X. La informa-
cin de la produccin de hojarasca y otras
variables se analizaron mediante varianza
y estadstica descriptiva.
RE S ULTADOS
Clima
En el periodo de estudio se registr un
total de 206 mm de precipitacin con el
valor ms alto en el mes de mayo (92 mm)
y el menor en los meses de enero y febrero
(0,0 mm). La temperatura media durante
el tiempo de estudio fue 29,1C, siendo
el valor ms alto el registrado en febrero
con 30,2C, y los ms bajos en los meses
de diciembre y mayo con 27,6C y

27,8C,
respectivamente. La velocidad del viento
present un promedio de 3,38 km/h; se
registr el mximo valor en febrero (6,46
km/h) y el ms bajo en diciembre (1,80
km/h). La humedad relativa oscil de 82,8
a 59,8%, siendo mayo el mes con mayor
porcentaje de humedad relativa y febrero,
el de menor humedad.
Suelos
Los suelos de los dos sistemas estudiados
son de textura franco arcillosa (Far). El
bosque nativo present la mayor con-
centracin de materia orgnica (M.O.)
(3%), mientras en el sistema basado en
Leucaena sp. el contenido fue de 2,7%. Los
contenidos de fsforo, potasio y calcio
presentaron valores altos en los suelos
de ambos sistemas, con baja presencia de
sodio (tabla 1).
Produccin de hojarasca
Produccin de hojarasca en el bosque
nativo
La cantidad total de material vegetal
cada en el bosque fue de 16,7 t/ha/ao,
considerada alta para ecosistemas fores-
tales tropicales; estos valores son superio-
res a los obtenidos en bosques hmedos
tropicales por varios autores (Huntel y
Bernard, 1975; Golley, 1975; Rodrguez,
1987; Burbano, 1989, citado por Snchez
y Gmez, 1999; Palacios-Bianchi, 2002;
Mosquera et al., 2007). Este efecto puede
atribuirse a que en la formacin vegetal
del bosque seco tropical, la mayor parte
de las especies son caducifolias, las cuales
pierden gran parte de su follaje en los pro-
longados perodos de dficit hdrico.
No fue significativa la correlacin entre
los factores temperatura, humedad y pre-
cipitacin con la produccin de hojarasca.
Posiblemente no hubo correlacin entre
los factores estudiados debido a que el
periodo de tiempo fue muy corto. Sin
embargo, se present una correlacin sig-
nificativa con el factor viento; la poca de
mayor produccin correspondi a la ms
alta velocidad del viento (febrero).
En los dos sistemas evaluados se pre-
sent cada continua de material durante
todo el perodo de muestreo (figura 3), la
cual puede atribuirse a la posicin ecua-
torial. Sin embargo, se observan perodos
de mayor aporte. En el bosque la mxima
produccin se present en febrero (2,41
t/ha) y los valores mnimos de cada de
hojarasca se presentaron en los meses de
mayo (0,88 t/ha) y julio (0,86 t/ha).
Produccin de hojarasca en el sistema
basado en Leucaena sp.
En el sistema basado en Leucaena sp., se
obtuvo una produccin de hojarasca de
13,2 t/ha/ao; con valores mximos en
los meses de diciembre (1,46 t/ha) y junio
(1,49 t/ha) y los ms bajos en marzo (0,57
t/ha) (figura 3). Estos valores son supe-
riores a los obtenidos por Mahecha et al.
(2000) y Crespo et al. (1999) en evaluacio-
nes con Leucaena sp., pero son superiores
a los obtenidos por Crespo et al. (2000) con
Albizia lebbeck.
No fue significativa la correlacin de
los factores ambientales con la produc-
cin de hojarasca. No obstante, se observ
que la mxima produccin se alcanz
en diciembre y junio, pocas precedidas
de los meses con mayor precipitacin
(noviembre y mayo), es decir, se present
una renovacin del follaje en el inicio de
las pocas de sequa. Snchez et al. (2003)
afirman que las fluctuaciones en la pro-
duccin de hojarasca en bosques tropi-
cales muestran un patrn de produccin,
que revela un aumento en las pocas de
menor precipitacin, lo cual est asociado
al dficit hdrico, ante el cual las plantas
reaccionan perdiendo el follaje.
Hojarasca cada por estructuras
Bosque nativo. En el bosque nativo el
mayor componente de la necromasa estuvo
Tabla 1. Caractersticas fsico-qumicas del suelo. Estacin Experimental Motilonia (Codazzi, Cesar)
Sistemas Textura pH
M.O.
%
P
ppm
Ca Mg K Na
Meq/100 g suelo
Bosque nativo Far 6,9 3,0 124 19,7 2,57 0,50 0,30
Sistema Leucaena sp. Far 6,2 2,7 117 10,0 2,19 0,70 0,33
Figura 3. Produccin de hojarasca en el bosque nativo y en el sistema basado en Leucaena sp.
8
representado por las hojas, que aport 10,4
t/ha/ao (tabla 2), correspondiente a 62,2%;
las ramas ocuparon el segundo lugar con
2,5 t/ha/ao. Las flores y los frutos pre-
sentaron valores bajos, 1,4 y 1,1 t/ha/ao
respectivamente (tabla 2). Se afirma que en
condiciones tropicales, las hojas contribu-
yen entre 60 y 70% con la produccin total
del material vegetal (Bray y Gorhan, 1964).
Rodrguez (1987) obtuvo en una zona
de bosque hmedo tropical una produc-
cin de hojas equivalente al 82,7%; por su
parte Rodrguez y Rosas (1993) registraron
un aporte de las hojas de 74,4% en un bos-
que a 3100 msnm. Segn Burbano (1989),
en reas tropicales la produccin de nueva
fitomasa es equiparable a la deposicin
y descomposicin de restos vegetales, de
modo que en estas condiciones se tienen
en estos ecosistemas un ciclo cerrado de
elementos nutritivos. En este sentido las
hojas desempean un papel importante en
relacin con la dinmica y estabilidad de
estos ecosistemas, pues constituyen una
fuente importante de energa y nutrientes
para la edafofauna y las plantas.
Sistema basado en Leucaena sp. En
este sistema la produccin de hojas fue
de 9,7 t/ha/ao, equivalente a 73,5% del
total (tabla 2). El segundo componente
mayor representado fueron los frutos (2
t/ha/ao). Las ramas registraron valores
ms bajos (1,2 t/ha/ao), seguido por las
flores (0,12 t/ha/ao); estos resultados
son inferiores a los obtenidos por Crespo
y colaboradores (2000) con la especie
Cajanus cajan en la cual las hojas repre-
sentaron 86,6%.
El alto porcentaje de hojas en la
produccin de hojarasca le permite a
Leucaena sp., acumular altas cantidades
de materia orgnica y de esta manera
retornar importantes cantidades de
nutrientes al suelo.
Aporte por especie a la hojarasca del
bosque nativo
Los valores mximos de produccin de
hojarasca fueron obtenidos en las especies
Anacardium excelsum (Caracol) y Guazuma
ulmifolia (Gucimo), con producciones de
1,35 y 1,18 t/ha/ao, respectivamente. La
especie Spondias mombin present una
produccin intermedia (0,9 t/ha/ao);
Astronium sp. (Garcero) y Basiloxilon sp.
(Guacamayo) presentaron los menores
aportes (figura 4).
Tabla 2. Aporte de la hojarasca (t/ha/ao) discriminada por estructuras. Estacin Experimental Motilonia
Sistema Hojas Ramas Flores Frutos Otros Total
Bosque nativo (t/ha/ao) 10,4 2,5 1,4 1,1 1,3 16,7
Porcentaje 62,2 15,0 8,4 6,6 7,8 100,0
Sistema basado en
Leucaena sp. (t/ha/ao)
9,7 1,2 0,1 2,0 0,2 13,2
Porcentaje 73,5 9,1 0,7 15,1 1,6 100,0
Algunas especies como Anacardium
excelsum, Guazuma ulmifolia, Spondias
mombin, Astronium sp. y Basiloxilon sp.
presentaron una produccin continua de
hojarasca. Cada especie present un pico
de produccin en tiempos diferentes
coincidiendo con periodos de sequas:
Spondias mombin present su valor
mximo de produccin en diciembre;
Anacardium excelsum, durante el mes de
enero; Basiloxilon sp., en febrero; Guazuma
ulmifolia, en marzo; Astronium sp., en
julio. El comportamiento observado
indica que existe un aporte permanente
de hojarasca y un flujo continuo de
nutrientes en este sistema.
Organismos del suelo
Macrofauna
En la poca de sequa (0,0 mm de pre-
cipitacin), la densidad poblacional de
la macrofauna del suelo presente en el
sistema basado en Leucaena sp., fue menor
que la encontrada en el bosque nativo.
En todos los tratamientos se presentaron
incrementos de las densidades en la poca
de lluvia, siendo de 78,1% y 82,7% en el
sistema basado en Leucaena sp., y en el bos-
que nativo, respectivamente. Durante esta
poca la distribucin de los organismos
no fue similar en los diferentes perfiles del
suelo; en la sequa se observ una reduc-
cin de la densidad poblacional a mayor
profundidad del suelo en el relicto del
bosque nativo, mientras que en el sistema
basado en Leucaena sp. se comport, as:
0-10 > 20-30 > 10-20. Entretanto, en pocas
de lluvia, los sistemas basados en Leucaena
sp., y bosque nativo presentaron una dis-
tribucin en su densidad de poblacin en
el siguiente orden: 0 - 10 > 20-30 > 10-20,
siendo relevante la presencia de fauna ed-
fica en el mantillo del bosque nativo.
Las concentraciones de humedad del
suelo y la actividad biolgica de los dife-
rentes organismos estn asociadas a la
presencia de la edafofauna en los distin-
tos niveles de profundidad del suelo. En
los dos sistemas evaluados, la distribu-
cin de los organismos no se comport
de igual forma entre los estratos y pre-
dominaron los individuos en el primer
estrato; esto puede atribuirse a que en el
primer horizonte se encuentra depositado
el mayor contenido de residuos orgni-
cos, lo cual crea condiciones favorables
para el desarrollo de los organismos des- Figura 4. Aportes por especie a la hojarasca del bosque nativo
9
dependiente posiblemente de las condi-
ciones de humedad, temperatura, caracte-
rsticas edafolgicas (biticas y abiticas)
y calidad de los nutrientes especficos
para cada sistema. Estos resultados coin-
ciden con los obtenidos por Anderson e
Ingram (1993), Jordan (1985), y Snchez y
Gmez (1999). Al comienzo del proceso la
descomposicin fue ms rpida, y a medi-
da que las sustancias fcilmente degra-
dables desaparecan la actividad dismi-
nuy y la descomposicin fue ms lenta.
Berg (2000, citado por Schadler y Brandl,
2005), sugiere que las interacciones basa-
das en diferentes contenidos de nitrgeno
y lignina de la hojarasca pueden ser ms
pronunciadas en la ltima fase del proce-
so de descomposicin. Segn Fioretto y
colaboradores (2005), la descomposicin
de la hojarasca est determinada por la
calidad en trminos de abundancia de sus
diferentes componentes, as como de la
disponibilidad de nutrientes del suelo.
La tasa ms alta de descomposicin se
present en el sistema basado en Leucaena
sp., con 7,8 x 10
-5
t/ha/ao; la cual es
semejante a la obtenida por Parra (2000)
en diferentes leguminosas arbustivas,
donde encontr una liberacin de 70% en
la especie Cratylia argentea. Valores ms
bajos se encontraron para las especies
Flemingia macrophylla (40%) y Codariocalyx
gyroides (25%). Esta situacin puede estar
asociada a las altas concentraciones de
nitrgeno presente en los tejidos y al
rpido retorno de este elemento, que a
su vez facilita el reciclaje de los dems
nutrientes. Los valores de descomposicin
estn asociados a la cantidad de nutrientes
que poseen las hojas en un momento
dado ya que estos son responsables de la
componedores (fauna detritvora). Dentro
de la macrofauna del suelo se resalta la
presencia de los artrpodos, los cuales
revisten gran importancia por la cantidad
de individuos, su biomasa, su funcin
trfica y por la variedad de especies que
representan los diversos grupos. La tasa
de descomposicin de la hojarasca puede
ser afectada por la abundancia absoluta
as como por la diversidad de la fauna
(Gonzlez y Seastedt, 2001, citados por
Hou et al., 2005)
La presencia y diversidad de especies
en la macrofauna estuvo influenciada por
la poca del ao y los sistemas evaluados
(figura 5).
sidad de organismos. Las lluvias ejercie-
ron un efecto positivo en la aparicin de
nuevos grupos: Hompteros, Seudoescor-
piones e Ispodos; as mismo, la densidad
aument en 82,7% (1011,5 individuos/m
2
)
y se observ un aumento significativo
de grupos como Ispteros, Chilopodos y
Haplotaxida (lombrices).
La fauna edfica desempea un papel
importante en la regulacin de los pro-
cesos del suelo, puesto que ingieren una
mezcla de partculas orgnicas y mine-
rales, que al excretar son de gran tamao
y contienen mayor cantidad de materia
orgnica (Lavelle, 1994). La presencia de
estos grupos facilita la incorporacin de
nutrientes e incrementa la aireacin y
la capacidad de retencin de agua en el
suelo dadas las diversas actividades que
realizan (Lobo y Veiga, 1990, citado por
Snchez, 1997). Adl (2003, citado por Hou
et al., 2005) indica que macrofauna como
Oligochaeta, Gastropoda, Diplopoda, Iso-
poda, Isoptera, Coleoptera e Himenopte-
ra, y mesofauna como Oribatida y Allem-
bola son importantes fragmentadores de
hojarasca o detritvoros.
Descomposicin de la hojarasca
El presente estudio revel el registro de
altas tasas de descomposicin en los dos
sistemas evaluados. Las curvas de des-
composicin presentaron un modelo de
tipo exponencial (figura 6) similar a los
registrados por otros autores como Jenny
et al. (1949), Jordan (1985), y Snchez y
Gmez (1999).
Cada uno de los sistemas present una
curva exponencial diferente (figura 6),
Figura 5. Densidad de macrofauna por estacin
climtica en los tratamientos evaluados: BBL:
bosque basado en Leucaena sp. BN: bosque nativo
En el sistema basado en Leucaena sp.,
las densidades ms altas en la poca
de sequa correspondieron a los rde-
nes Coleoptera (39,0 %), Himenoptera
(16,7%), Isoptera (12,2%) y Oligoqueta
(12,2%); mientras que en pocas de llu-
via, los rdenes predominantes fueron
Isoptera (29,4%), Coleoptera (23,7%) e
Himenoptera (16,3%). Mahecha et al.
(2000) evaluaron el comportamiento de
la macrofauna en un sistema silvopastoril
establecido con Leucaena sp. y encontra-
ron que sta aumentaba significativamen-
te durante la poca de lluvia, siendo los
Colepteros y Oligoquetos los rdenes
con mayor poblacin.
En el bosque nativo, los rdenes pre-
sentes en poca de sequa fueron: Hime-
noptera (53,0%), Coleoptera (24,1%) y
Diplopoda (9,63%). En poca de lluvia
predominaron los rdenes Himenoptera
(31,6%), Isoptera (12,6%), Aranea (12,1%),
Oligochaeta (12,1%) y Chilopoda (11,0%).
En este sistema se encontr la mayor den-
Figura 6. Tasa de descomposicin de la hojarasca en un bosque nativo, sistema basado en
Leucaena sp., en Codazzi, Cesar
10
cantidad de organismos descomponedores
que se pueden encontrar (Hernndez y
Murcia, 1992). Estudios realizados con
leguminosas asociadas a gramneas
demostraron que el elemento de mayor
reciclaje presente en este sistema fue el
nitrgeno, el cual mejora la composicin
qumica del suelo (Mahecha et al., 2000).
Durante la poca de lluvia se present
un aumento en la macrofauna, hecho que
pudo acelerar el proceso de degradacin
como se observa en la figura 5. Durante
mayo y junio la descomposicin tiende
a ser ms rpida coincidiendo con
los meses de lluvia. El bosque nativo
present un comportamiento en sus tasas
de descomposicin de 1,9 x 10
-3
t/ha/ao.
En el presente trabajo durante la poca
seca se present una disminucin en los
artrpodos; dentro de este grupo los isp-
teros presentaron una baja participacin
con un porcentaje de 1,91; estos orga-
nismos son de vital importancia en la
transformacin de los compuestos lig-
nocelulsicos. Los artrpodos maceran
las hojas transformando los compuestos
orgnicos complejos en compuestos ms
simples a travs de su sistema digestivo;
estas excretas son transformadas por otros
organismos que favorecen la actividad
por parte de bacterias y hongos, eslabo-
nes fundamentales en la descomposicin
(Jordan, 1985).
Ensayos realizados por Gmez y Sn-
chez (1999) relacionados con la descom-
posicin de residuos vegetales con altas
concentraciones de molculas lignocelu-
lsicas registraron bajas tasas de des-
composicin ya que esta molcula no
se descompone fcilmente debido a la
complejidad de sus enlaces. Por el contra-
rio, una baja relacin carbono/nitrgeno
(C/N) y un bajo contenido de lignina
pueden hacer de la hojarasca un recurso
alimenticio ms atractivo para una gran
variedad de descomponedores (Jordan,
1985). La celulosa y la lignina, los ms
abundantes componentes de la hojarasca,
son descompuestos lentamente; los altos
contenidos de lignina influyen, reducien-
do la tasa de descomposicin de la hoja-
rasca al inicio y final del proceso (Fioretto
et al., 2005).
Los anteriores argumentos explican
parcialmente las menores tasas de des-
composicin de los residuos en el bosque.
Se pudo apreciar que la mayora de las
especies presentaban hojas con gruesas
cutculas, de parnquima leoso, carac-
tersticas que se asocian con presencia
de altos contenidos de lignina y celulosa.
Schdler y Brandl (2005) encontraron que
una tasa de desaparicin de la hojarasca
fue negativamente correlacionada con el
contenido inicial de carbono y positiva-
mente correlacionada con el contenido
inicial de nitrgeno.
Descomposicin en bolsas con agujeros
La tasa de descomposicin fue mayor en
el sistema basado en Leucaena sp. seguida
por el bosque nativo. Sin embargo, se
encontraron diferencias significativas (p >
0,05) entre los tratamientos con y sin agu-
jeros en los dos sistemas, lo cual indica
que el tamao del poro puede influir en
la velocidad de la descomposicin de la
hojarasca, debido a que todos los organis-
mos (microfauna, mesofauna y macrofau-
na) pueden acceder libremente al sustrato
(figura 7). La biota del suelo desempea
un papel integral en los procesos de
descomposicin. Se ha demostrado que
la fauna del suelo desempea un papel
importante en la descomposicin de bos-
ques tropicales (Liu y Zou, 2002; Gon-
zlez y Seastedt, 2001, citados por Ruan
et al., 2005). Los invertebrados del suelo
pueden influir sobre la descomposicin
por transformacin de la hojarasca o a tra-
vs de interacciones con microorganismos
(Adl, 2003, citado por Hou, 2005).
CONCL US I ONE S
En todos los sistemas evaluados la velo-
cidad de descomposicin es rpida en las
etapas iniciales y gradualmente el proceso
se reduce con el transcurrir del tiem-
po, situacin explicada por la presencia
de compuestos lignocelulsicos de difcil
degradacin.
El tamao del poro en las bolsas para
evaluar la descomposicin de la hojarasca
influye en la velocidad de degradacin,
gracias a que facilita el acceso de los orga-
nismos del suelo al sustrato.
La macrofauna edfica present la
mayor densidad poblacional en el bosque
nativo: en todos los sistemas evaluados
la densidad se incrementa en la poca de
lluvia y, por lo general, presenta una ten-
dencia a disminuir a mayor profundidad
del suelo.
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1
, Nubia Rodrguez
Hernndez
2
, Eduardo Pea Rojas
3
,
Silvio Bastidas Prez
4
Nursery growth and development of
commercial oil palm (Elaeis guineensis
Jacq.) in Tumaco, Colombia
AB S T RACT
Growth and development were evaluated
under nursery conditions for commercial
D x P oil palm materials (Elaeis guineensis
Jacq.) belonging to four different origins. All
genotypes showed harmonic growth among
all plant components evaluated. Bulb diameter
and plant height observed statistically
significant differences among genotypes.
Statistical significant differences were not
detected for total leaf area and leaf area index.
However, for leaf dry matter accumulation
and two of its component, rachis and leaflets
dry weight, as well as for leaf number per
plant, statistical significant differences
were observed. On the other hand, for leaf
petiole dry weight there were no significant
differences among genotypes. These results
likely suggest the existence of a proper species
mechanism for specific organization of its
photoassimilatory apparatus under specific
environmental conditions. Nevertheless,
the observed trend and growth pattern on
each material did not permit to point out a
particular genotype having the best growth
pattern. Additionally, for all genotypes, bulb
diameter and plant height growth reference
curves equations were estimated following the
Y = a + bX general equation. Finally, equations
were validated and fit for leaf area estimation
according to the formula AHE = C x (n x L x a)
and a model for leaf dry weight estimation as
PSHE = FC x (P x S).
Keywords: Oil palm, plant physiology,
mathematical models, dry matter, allometry.
Crecimiento en vivero de materiales comerciales
de palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.) en
Tumaco, Colombia
*
RE S UME N
Se evalu el crecimiento en vivero de cuatro materiales comerciales de palma aceitera (Elaeis
guineensis Jacq.). Todas las variedades presentaron crecimiento armnico entre las diferen-
tes partes de la planta. El dimetro del bulbo y la altura de planta presentaron diferencias
estadsticas significativas entre variedades. No se observ diferencia estadstica significativa
para rea foliar e ndice de rea foliar. Sin embargo, para la acumulacin de la materia seca
de la hoja y de sus componentes, raquis y foliolos, como tambin para el nmero de hojas
por planta, fueron observadas diferencias estadsticas significativas. Por otro lado, para la
materia seca del pecolo no se observaron diferencias significativas entre variedades. Estos
resultados sugieren la existencia de un mecanismo propio de la especie para la organizacin
de su aparato fotoasimilatorio, en unas condiciones ambientales especificas. No obstante,
las tendencias y el patrn de crecimiento observados para cada material no permiten sea-
lar a un genotipo en particular como el de mejor crecimiento. Adicionalmente, para todas
las variedades se determinaron ecuaciones del tipo Y = a + bX, para la estimacin de curvas
de referencia del comportamiento del dimetro del bulbo y altura de planta. Finalmente, se
validaron y ajustaron ecuaciones para la estimacin del rea de la hoja del tipo AHE = C x (n
x L x a) y modelos para la estimacin del peso seco de la hoja del tipo PSHE = FC x (P x S).
Palabras clave: palma de aceite, fisiologa vegetal, modelos matemticos, materia seca,
alometra.
1
Investigador mster principal, Fisiologa Vegetal.
Corpoica E.E. El Mira, Tumaco, Nario.
rreyes@corpoica.org.co
2
Investigador mster principal, Fisiologa Vegetal.
Corpoica C.I. La Libertad, Villavicencio, Meta.
nrodriguez@corpoica.org.co
3
Investigador mster principal, Proteccin de
Cultivos. Corpoica E.E. El Mira, Tumaco, Nario.
epena@corpoica.org.co
4
Investigador mster principal, Fitomejoramiento
y Gentica Vegetal. Corpoica E.E. El Mira, Tumaco,
Nario. sebastidas@corpoica.org.co
*
Contribucin del proyecto Respuesta fisiolgica
y productiva de diferentes genotipos de material
comercial tenera de palma de aceite a variaciones en
la disponibilidad de agua. Fase I. Alianza Corpoica
MADR IICA - Inversiones Rankin Bolvar -
Cordeagropaz. Estacin Experimental El Mira,
Corpoica, Tumaco.
I NT RODUCCI N
Uno de los elementos bsicos para
tener una plantacin productiva, competi-
tiva y sostenible es obtener en la etapa de
vivero palmas de crecimiento adecuado.
Para ello, es necesario disponer de estu-
dios locales con los diversos materiales de
siembra, que puedan ser utilizados como
gua o referencia para el seguimiento al
desarrollo de las palmas de vivero y su
seleccin previa a siembra en campo (Bul-
garelli et al., 1993; Restrepo, 1996; Coto et
al., 2002), proceso en el cual se descarta
alrededor de 15% a 25% de la poblacin
(Chee et al., 1998).
Estudios realizados en frica, Mala-
sia y Amrica han permitido desarro-
llar, para palmas en campo, ecuaciones y
modelos matemticos para estimar el rea
de la hoja y el peso seco de sta (Hardon
et al., 1969; Corley et al., 1971; Contreras,
1996; Breure, 2005). En el caso de palmas
de vivero se han propuesto ecuaciones
para obtener curvas de referencia del
comportamiento de varias caractersticas
de crecimiento (Bulgarelli et al., 1993). Sin
embargo, estas ecuaciones y modelos, as
como sus constantes o factores de correc-
cin, deben ser validados para ambien-
tes diferentes, etapa ontognica, condi-
cin agroecolgica y materiales genticos
(Henson, 1993; Contreras, 1996: Corley y
Tinker, 2003; Taylor, 2007).
Para las regiones productoras de
Colombia, incluyendo Tumaco, se carece
de estudios para la estimacin del creci-
miento en vivero de palma aceitera y, por
consiguiente, no se dispone de ecuacio-
nes y modelos matemticos validados. El
objetivo del presente estudio fue conocer
el crecimiento en la etapa de vivero de
varios genotipos comerciales de palma
aceitera, en las condiciones agroecolgi-
cas de Tumaco. Tambin, validar y ajustar
ecuaciones y modelos matemticos que
permitan realizar estimaciones precisas
de caractersticas de crecimiento de pal-
mas de vivero y su comportamiento en el
mbito local, que puedan ser utilizados
como referencia para el seguimiento de
ste y la seleccin de palmas en vivero.
Los estudios de esta ndole, en el caso de
Colombia, se justifican por la importan-
cia del cultivo de palma aceitera (Elaeis
guineensis Jacq.), cuya rea sembrada
actual es de 326.000 hectreas, con pro-
yecciones de incremento a 996.000 para
el ao 2020 (Ministerio de Agricultura y
Desarrollo Rural, 2006).
13
Crecimiento en vivero de materiales comerciales de palma aceitera (Elaeis guineensis Jacq.) en Tumaco, Colombia
El estudio se realiz en condiciones de
campo, durante el periodo julio de 2005
a diciembre de 2006, en la Estacin Expe-
rimental El Mira de Corpoica, ubicada en
Tumaco, Colombia; cuyas coordenadas
geogrficas son 132'58'' LN y 78 41'21''
LO. La regin presenta altura de 16 msnm;
promedio de precipitacin 3067 mm/ao,
temperatura media 25,5C, humedad
relativa 88%, evaporacin 1037 mm/ao y
brillo solar 1008 horas sol/ao.
Se utilizaron palmas Elaeis guineensis
tipo Tenera de los genotipos Tanzania x
Ekona, Deli x Yangambi (1) origen Costa
Rica, Deli x Avros y Deli x Yangambi (2)
origen Colombia; sembradas en suelo
arenoso, en bolsas plsticas de color negro
(30 x 42 cm). Las palmas se distribuyeron
en cuadro a 0,80 m entre bolsas y 1,00 m
entre plantas. El manejo agronmico se
ajust al esquema propuesto por Bastidas
y colaboradores (2002). El periodo total
de evaluacin fue de 432 das, incluida la
etapa de previvero (71 das).
Se emple un diseo experimental com-
pletamente al azar, con cuatro tratamien-
tos (variedades) y 25 repeticiones (pal-
mas) por tratamiento. Las evaluaciones de
dimetro del bulbo (DB), altura de planta
(AP) y emisin de hojas se realizaron con
periodicidad de uno a dos meses, a partir
de 123 das despus de siembra (DDS) y
331 DDS, respectivamente. La altura de
planta se determin entre el nivel de la
superficie del terreno y el punto de inser-
cin del inicio de foliolos rudimentarios
en el pecolo de la hoja 4. En la ltima
poca de evaluacin se realizaron en la
hoja 4 determinaciones de caractersticas
morfolgicas. El rea de la hoja se obtuvo
a travs del llamado mtodo de discos
(Benincasa, 1988). En general, los criterios
de medicin y determinaciones emplea-
dos se ajustaron a los indicados para la
especie por varios autores (Corley et al.,
1971; Daniel, 1979; Corley y Breure, 1981;
Corley y Tinker, 2003).
Se determin el contenido de biomasa
en la ltima poca de evaluacin (432
DDS). Para ello, las partes constituyen-
tes de las palmas fueron separadas y
se retir el sistema radicular del suelo
adherente mediante lavado sobre malla.
El material vegetal fue secado en estufa
de ventilacin forzada, a temperatura de
75C, hasta peso constante. Los pesos de
la materia fresca y seca de cada rgano se
obtuvieron mediante el uso de una balan-
za analtica con aproximacin al miligra-
mo. A partir de los valores de rea foliar
(AF), peso seco de foliolos (PSF) y peso
seco total de planta (PSP), se dedujeron
los valores de razn de rea foliar (RAF),
rea foliar especfica (AFE) y razn de
peso foliar (RPF) (Radford, 1967; Beadle,
1988; Benincasa, 1988; Rodrguez y Leih-
ner, 2006). Con los valores por planta de
peso seco total de los rganos areos (PA)
y peso seco de las races (SR) se determi-
naron los valores de la razn parte area
sistema radicular (PA/SR) (Benincasa,
1988; Rodrguez y Leihner, 2006).
Los valores obtenidos para cada varia-
ble y los ndices generados fueron some-
tidos a anlisis de varianza y pruebas de
comparacin de medias de Tukey ( =
0,05). Con los valores acumulados en fun-
cin del tiempo, para dimetro del bulbo
y altura de planta, se realizaron anlisis
de regresin curvilnea (Richards, 1969;
Benincasa, 1988; Bulgarelli et al., 1993).
Los valores de la tasa de crecimiento
transversal del bulbo y de crecimiento
en altura, fueron obtenidos mediante la
primera derivada de las ecuaciones ajus-
tadas para dimetro del bulbo y altura
de planta (Radford, 1967; Richards, 1969;
Benincasa, 1988). Con los valores de rea
y peso seco de la hoja se validaron y ajus-
taron ecuaciones y modelos para estimar
el rea de la hoja (AHE) y el peso de la
hoja (PSHE), con base en la metodologa
implementada para palma aceitera por
Hardon y colaboradores (1969), Corley y
colaboradores (1971) y Contreras (1996).
RE S ULTADOS Y DI S CUS I N
Crecimiento
El comportamiento del dimetro del bulbo
(DB) y altura de planta (AP) a travs del
tiempo, para todas las variedades, se
muestra en las figuras 1 y 2. Las ecuacio-
nes para su descripcin correspondieron
al tipo Y = a + bX, lo cual fue concordante
con lo obtenido en Costa Rica para descri-
bir el comportamiento de nueve variables
de crecimiento en palmas de vivero (Bul-
garelli et al., 1993). En la tabla 1 se pre-
sentan las ecuaciones determinadas y que
permiten estimar los valores y curvas de
referencia para DB y AP, en el mbito de
tiempo para el cual fueron determinadas.
Para los 432 DDS, poca que represen-
ta el crecimiento acumulado durante el
periodo evaluado, se presentaron diferen-
cias estadsticas significativas entre varie-
dades para dimetro del bulbo (p < 0,05)
y altura de planta (AP) (p < 0,01), pero no
para la tasa de emisin foliar (TEF) (tabla
2). Esto coincide con el comportamiento
de dichas variables durante el tiempo de
evaluacin. Las diferencias en dimetro
del bulbo y altura de planta observadas
entre variedades se explican por las dife-
renciales de crecimiento transversal del
bulbo y altura. Los mayores valores para
altura de planta los present Deli x Avros
Figura 1. Comportamiento del dimetro de bulbo de plantas de vivero de materiales de palma
aceitera en Tumaco, Colombia. (T x E: Tanzania x Ekona. D x Y1: Deli x Yangambi Costa Rica. D x A:
Deli x Avros. D x Y2: Deli x Yangambi Colombia)
14
sin diferencias con Deli x Yangambi (1),
lo cual concuerda con lo reportado por
Taylor (2007) para el primer genotipo.
Para el dimetro del bulbo, Tanzania x
Ekona exhibi el mayor valor, sin dife-
rencias con Deli x Yangambi (1) y Deli x
Yangambi (2) (tabla 2).
En la hoja 4 se observaron diferencias
estadsticas significativas entre varieda-
des (p < 0,01) para todas sus caractersti-
cas morfolgicas, excepto para ancho del
foliolo (ADF) y rea de la hoja (AH) (tabla
3). Esto indica que en condiciones de
vivero, la especie en cada variedad posee
atributos internos propios para modificar
el tamao y estructura de las partes que
conforman la hoja, lo cual le permite
regular el tamao de su rea asimilatoria.
Para la situacin observada, dichos atri-
butos probablemente les permiti a todas
las variedades obtener tamao similar de
rea de la hoja (AH).
No se observaron diferencias estads-
ticas significativas entre variedades para
el rea foliar (AF) e ndice de rea foliar
(IAF), pero s para l numero de hojas
por planta (HPL) (p < 0,01), presentando
el mayor valor Deli x Yangambi (1) sin
diferencias con Tanzania x Ekona (tabla
4). Esto indica que a nivel de planta, en
cada variedad para las condiciones y la
etapa en estudio, la obtencin del tamao
de su rea foliar dependi del nmero
de hojas por planta; caracterstica que
present diferencias significativas entre
variedades. Lo cual probablemente puede
corresponder a un mecanismo propio
de la especie y planta para obtener en
unas condiciones especficas el tamao de
su rea asimilatoria. El comportamiento
observado para el rea foliar, probable-
mente les permiti a todas las varieda-
des poseer similar capacidad productiva
biolgica, la cual est determinada por
el rea foliar de la planta (Rodrguez y
Leihner, 2006).
Se observaron diferencias estadsticas
significativas entre variedades (p < 0,01)
para el peso seco de la hoja (PSH) y de
sus componentes raquis (PSRA) y foliolos
(PSF), pero no para el peso seco del peco-
lo (PSPe) (tabla 5). Por su parte, la distri-
bucin de asimilados de la hoja present
diferencias estadsticas significativas entre
variedades para todos los componentes de
la hoja, raquis (p < 0,01), pecolo y foliolos
Figura 2. Comportamiento de altura de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco
Colombia. (T x E: Tanzania x Ekona. D x Y1: Deli x Yangambi Costa Rica. D x A: Deli x Avros. D x Y2:
Deli x Yangambi Colombia)
Tabla 1. Ecuaciones para estimar dimetro de bulbo (DB) y altura de planta (AP) en plantas de vivero
de palma aceitera en Tumaco, Colombia
Variable Materiales Ecuacin R2
Tasa de
crecimiento
cm/da
Periodo
1/

DDS
DB
(cm)
Tanzania x Ekona (T x E) DB (T x E) = -4,282 + 0,02999 DDS 0,90 0,0299 150-432
Deli x Yangambi (1) (D x Y1) DB (D x Y1) = -4,115 + 0,0290 DDS 0,92 0,0290 150-432
Deli x Avros (D x A) DB (D x A) = -4,022 + 0,0281 DDS 0,91 0,0281 150-432
Deli x Yangambi (2) (D x Y2) DB (D x Y2) = -4,180 + 0,0295 DDS 0,93 0,0295 150-432
AP
(cm)
Tanzania x Ekona (T x E) AP (T x E) = -27,77 + 0,1427 DDS 0,80 0,1427 331-432
Deli x Yangambi (1) (D x Y1) AP (D x Y1) = -27,00 + 0,1429 DDS 0,81 0,1429 331-432
Deli x Avros (D x A) AP (D x A) = -24,83 + 0,1407 DDS 0,75 0,1407 331-432
Deli x Yangambi (2) (D x Y2) AP (D x Y2) = -19,79 + 0,1198 DDS 0,70 0,1198 331-432
DDS: das despus de siembra, incluidos 71 das de previvero.
1/: periodo aplicacin ecuaciones.
Tabla 2. Variables de crecimiento de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco,
Colombia, 432 DDS
Materiales
Dimetro del bulbo
cm
Tasa de emisin foliar
Hojas/mes
Altura de planta
cm
Tanzania x Ekona 9,72 a 2,52 a 34,48 b
Deli x Yangambi (1) 9,49 ab 2,36 a 35,56 ab
Deli x Avros 9,10 b 2,20 a 37,12 a
Deli x Yangambi (2) 9,57 ab 2,24 a 33,32 b
CV (%) 7,90 10,37 8,81
F (variedades) * ns **
**,*: significativo al 1% y 5% de probabilidad, por la prueba de F, respectivamente.
ns: no significativo.
Las medias seguidas de la misma letra en las columnas no difieren entre s, de acuerdo con la prueba de Tukey al 5%.
15
Lo anterior indica que las modificaciones
de la distribucin de biomasa en la hoja se
dan principalmente en el raquis y foliolos,
lo que puede contribuir al mecanismo de
reorganizacin estructural de sus partes
que le permite a la especie y, por consi-
guiente, a sus variedades en condiciones
ambientales especificas, regular el tamao
de su aparato fotoasimilatorio.
La biomasa por rgano y total por
planta, as como la distribucin de asimi-
lados en la planta, no presentaron dife-
rencias estadsticas significativas entre
variedades (tablas 6 y 7). Se observa, para
todas las variedades, un orden de prefe-
rencia similar de destino de asimilados
en la planta: foliolos > races > bulbo >
raquis > tallo > base peciolar > pecolo >
flecha (tabla 7); lo cual est relacionado
con la fuerza de sumidero intrnseco de
cada uno de los componentes de la planta
(Wareing y Patrick, 1975; Villalobos et al.,
2001). Por lo tanto, todas las variedades
presentaron crecimiento armnico entre
las diversas partes de la planta, como
producto de una similar distribucin de
asimilados a sus rganos.
En la planta no se presentaron diferen-
cias estadsticas significativas entre varie-
dades para la razn de rea foliar (rea
foliar / materia seca total planta) (tabla 8).
Esto fue corroborado por la ausencia de
diferencias estadsticas presentadas entre
variedades para la razn de peso foliar
(peso seco foliolos / peso seco total planta)
y rea foliar especfica (rea foliar / peso
seco foliolos), componentes de la razn
de rea foliar (tabla 8). Lo anterior est de
acuerdo con lo reportado por Kvet et al.
Tabla 3. Caractersticas de la hoja de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco, Colombia, 432 DDS
Materiales
Foliolos Longitud Seccin pecolo
rea
seccin
pecolo
(P x S)
cm
2
Foliolos por
metro de
raquis
(FMR)
No
No.
(FPH)
Longitud
(LF)
cm
Ancho
(ADF)
cm
rea
Hoja
(AH)
m
2
Pecolo
(LP)
cm
Raquis
(LR)
cm
Hoja
(LH)
cm
Ancho
(P)
cm
Grosor
(S)
cm
Tanzania x Ekona 62,8 a 33 a 2,81 a 0,2051 a 10,28 a 78,73 a 89,01 a 1,68 a 0,94 a 1,59 a 79,8 a
Deli x Yangambi (1) 58,6 b 40,3 b 2,71 a 0,1937 a 9,34 b 90,01 b 99,35 b 1,73 a 0,93 a 1,61 a 65,1 b
Deli x Avros 59,2 ab 39,2 b 2,79 a 0,2117 a 10,85 ab 93,12 b 103,97 b 1,79 ab 0,91 a 1,65 a 63,6 b
Deli x Yangambi (2) 57,9 b 36,7 c 2,87 a 0,2205 a 8,72 c 88,98 b 97,70 b 1,88 b 1,05 b 1,97 b 63,7 b
CV (%) 8,17 6,95 7,47 20,35 13,9 9,71 9,11 10,36 12,3 19,00 10,97
F (Variedades) ** ** ns ns ** ** ** ** ** ** **
Las medias seguidas de la misma letra en las columnas, no difieren entre s, de acuerdo con la prueba de Tukey al 5%.
Tabla 4. Caractersticas foliares de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco
Colombia, 432 DDS
Materiales
Hojas por planta
(HPL)
No.
rea foliar por planta
(AF)
m
2
ndice de rea foliar
(IAF)

Tanzania x Ekona 13,68 ab 2,800 a 2,8 a
Deli x Yangambi (1) 14,04 a 2,720 a 2,7 a
Deli x Avros 12,84 c 2,710 a 2,7 a
Deli x Yangambi (2) 13,4 bc 2,950 a 3,0 a
CV (%) 6,31 23,69 23,69
F (Variedades) ** ns ns
Tabla 5. Biomasa de la hoja y su distribucin en plantas de vivero de materiales de palma aceitera
en Tumaco, Colombia, 432 DDS
Materiales
Materia seca hoja (gramos/hoja)
Distribucin materia seca
hoja (%)
Pecolo
(PSPe)
Raquis
(PSRA)
Foliolos
(PSF)
Hoja
(PSH)
Pecolo Raquis Foliolos
Tanzania x Ekona 3,463 a 11,176 a 29,379 a 44,018 a 7,9 a 25,4 a 66,7 a
Deli x Yangambi (1) 2,798 a 13,499 ab 29,484 a 45,780 a 6,1 b 29,5 b 64,4 b
Deli x Avros 3,421 a 14,806 bc 32,383 ab 50,611 ab 6,8 ab 29,3 b 64,0 b
Deli x Yangambi (2) 3,441 a 15,902 c 35,570 b 54,912 b 6,3 ab 29,0 b 64,8 ab
CV (%) 36,57 23,45 22,15 21,61 3.66 7.86 4.40
F (Variedades) ns ** ** ** * ** *
(p < 0,05), observndose para todas las
variedades un orden de preferencia simi-
lar de destino de asimilados en la hoja:
foliolos > raquis > pecolos (tabla 5). Este
orden de preferencia est relacionado con
la fuerza de sumidero intrnseco de cada
uno de los componentes de la hoja (Ware-
ing y Patrick, 1975; Villalobos et al., 2001).
16
de factores externos o el ambiente. Al
respecto, Marschner (1986) indica que la
particin de asimilados entre parte area
y races sufre mudanzas durante la onto-
gnesis de una especie, pero puede ser
modificada por factores externos, como
la disponibilidad de nutrientes. Por su
parte, Rodrguez y Leihner (2006) mani-
fiestan que la razn PA/SR sta deter-
minada genticamente, pero puede ser
modificada por el ambiente. El rango de
valores observado para PA/SR, 3,4 a 4,9
fue concordante con el rango 3,1 a 4,9
obtenido por Sterling (1993) en palmas de
vivero en Costa Rica.
Estimacin del rea y peso de la hoja
Para palmas de vivero de 1,1 aos (432
DDS) se validaron tanto la ecuacin para
estimar el rea (m
2
) de la hoja en palma
aceitera: rea (A) = C x (n x L x a) (Hardon
et al., 1969), como el modelo estadstico
W = FC x (P x S) determinado por Con-
treras (1996) en la Orinoquia de Colom-
bia para pronosticar el peso seco de la
hoja en palma aceitera (W). En la tabla
9 se presentan las ecuaciones y modelos
correspondientes a cada uno de los cuatro
materiales evaluados.
La estimacin del rea de la hoja
empleando dichas ecuaciones mostr,
respecto al rea de la hoja observada,
diferencias promedio para la especie de
1,3%; lo cual indic la precisin de las
estimaciones. Mientras que el uso de
dicha ecuacin con el valor de C = 0,51
indicado por Hardn et al. (1969) para
palmas de 1 a 2 aos en campo present
sobreestimacin promedio para la especie
de 34% (tabla 10). Este comportamiento
Tabla 6. Biomasa de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco, Colombia, 432 DDS
Materiales
Materia seca (gramos/planta)
Races
(PSR)
Bulbo
(PSB)
Tallo
(PST)
Base
Peciolar
(PSBP)
Pecolo
(PSPe)
Raquis
(PSRA)
Foliolos
(PSF)
Flecha
(PSFL)
Total
(PSP)
Tanzania x Ekona 185,099 a 148,049 a 64,635 a 43,593 a 27,750 a 107,388 a 216,562 a 21,618 a 814,695 a
Deli x Yangambi (1) 155,774 a 165,875 a 98,672 a 50,341 a 27,861 a 141,271 a 248,301 a 19,676 a 907,769 a
Deli x Avros 189,068 a 167,279 a 87,144 a 53,900 a 30,956 a 152,799 a 271,383 a 25,616 a 978,145 a
Deli x Yangambi (2) 140,349 a 149,500 a 68,798 a 39,886 a 26,219 a 132,284 a 249,592 a 21,038 a 827,666 a
CV (%) 34,57 19,68 46,85 27,24 24,06 34,57 22,72 35,00 16,42
F (Variedades) ns ns ns ns ns ns ns ns ns
Tabla 7. Distribucin de la biomasa de plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco,
Colombia, 432 DDS
Materiales
Distribucin de materia seca (%)
Races Bulbo Tallo
Base
Peciolar
Pecolo Raquis Foliolos Flecha
Tanzania x Ekona 22,7 a 18,2 a 7,9 a 5,4 a 3,4 a 13,2 a 26,6 a 2,7 a
Deli x Yangambi (1) 17,2 a 18,3 a 10,9 a 5,5 a 3,1 a 15,6 a 27,4 a 2,2 a
Deli x Avros 19,3 a 17,1 a 8,9 a 5,5 a 3,2 a 15,6 a 27,7 a 2,6 a
Deli x Yangambi (2) 17,0 a 18,1 a 8,3 a 4,8 a 3,2 a 16,0 a 30,2 a 2,5 a
CV (%) 28,12 13,94 40,95 20,21 22,85 16,45 14,31 32,15
F (Variedades) ns ns ns ns ns ns ns ns
Tabla 8. Razones de rea foliar, peso foliar, parte area - sistema radicular y rea foliar especifica, de
plantas de vivero de materiales de palma aceitera en Tumaco, Colombia, 432 DDS
Materiales
Razn de rea
foliar
(RAF)
cm
2
/g
Razn de peso
foliar
(RPF)
g/g
rea foliar
especifica
(AFE)
cm
2
/g
Razn parte
area
Sistema radicular
(PA/SR)
Tanzania x Ekona 33 a 0,27 a 130 a 3,4 a
Deli x Yangambi (1) 34 a 0,27 a 120 a 4,8 a
Deli x Avros 29 a 0,27 a 110 a 4,3 a
Deli x Yangambi (2) 32 a 0,30 a 110 a 4,9 a
CV (%) 16,78 14,31 16,74 37,89
F(Variedades) ns ns ns ns
(1971) y Benincasa (1988), quienes indican
que las variaciones en la razn de rea
foliar estn en funcin de alteraciones en
uno de sus dos componentes.
La razn entre materia seca de la parte
area y el sistema radicular de la planta
(PA/SR) no mostr diferencias estadsticas
significativas entre variedades (tabla 8);
lo cual indica que la distribucin de asi-
milados entre estas partes, para todas las
variedades, correspondi a la de la etapa
ontognica de la especie en estudio, sin
haberse presentado efectos modificadores
17
de 5 aos en campo, lo cual motiv
la determinacin de nuevas ecuaciones
para la estimacin del peso de la hoja en
diversas regiones del mundo (Henson,
1993; Corley y Tinker, 2003; Breure, 2005;
Taylor, 2007). Adicional a lo anterior, en
este trabajo, para la determinacin de
nuevos modelos polinomiales, los valo-
res de peso seco de la hoja observados
no permitieron obtener un polinomio
que cumpliera con los parmetros esta-
dsticos requeridos para estimar el peso
seco de la hoja.
CONCL US I ONE S
El dimetro del bulbo y la altura de planta
presentaron diferencias estadsticas sig-
nificativas entre variedades, explicadas
por las tasas diferenciales de crecimiento
transversal del bulbo y altura. Pero no se
presentaron diferencias para la tasa de
emisin foliar.
El rea de la hoja, el rea foliar y el
ndice de rea foliar no presentaron dife-
Tabla 9. Ecuaciones y modelos para estimar el rea de la hoja (A) y el peso de la hoja (W),
respectivamente, en plantas de vivero de palma aceitera en Tumaco, Colombia, 432 DDS
Materiales
Ecuaciones rea de la hoja
(m
2
)
Modelos peso seco de la hoja
(kg)
Tanzania x Ekona (T x E) A (T x E) = 0,34 x (n x l x a)
1/
W (T x E) = 0,028 x (P x S)
2/
Deli x Yangambi (1) (D x Y1) A (D x Y1) = 0,30 x (n x l x a) W (D x Y1) = 0,028 x (P x S)
Deli x Avros (D x A) A (D x A) = 0,32 x (n x l x a) W (D x A) = 0,031 x (P x S)
Deli x Yangambi (2) (D x Y2) A (D x Y2) = 0,37 x (n x l x a) W (D x Y2) = 0,028 x (P x S)
Promedio Especie (PE) A (PE) = 0,33 x (n x l x a) W (PE) = 0,029 x (P x S)
1/: n = nmero de foliolos por hoja. L x a = promedio del largo por el ancho de foliolos en cm
2
.
2/: P x S = seccin transversal del pecolo en cm
2
.
Tabla 10. Estimacin del rea de la hoja en plantas de vivero en bolsas plsticas de materiales de palma aceitera en Tumaco, Colombia
Material
rea hoja
observado
(AHO)
m
2

rea hoja
calculado
(AHCA)
m
2
Sobreestimacin
rea hoja
(AHCA - AHO)
%
Factor de
correccin
(C)
rea hoja
estimada
(AHE)
m
2
Diferencia rea
hoja
AHO-AHE
%
Tanzania x Ekona 0,2051 0,3045 36,9 0,34 0,2030 1,0
Deli x Yangambi (1) 0,1937 0,3268 26,6 0,30 0,1922 0,8
Deli x Avros 0,2117 0,3293 31,3 0,32 0,2066 2,4
Deli x Yangambi (2) 0,2205 0,3038 42,2 0,37 0,2204 0,1
Promedio Especie 0,2077 0,3161 34,3 0,33 0,2050 1,3
AHO: valor de rea de la hoja observado real.
AHCA: valor de rea de la hoja calculado con la ecuacin A = 0,51 x (n x l x a) (Hardon et al., 1969).
C: factor de correccin calculado a partir de AHO y la ecuacin A = C x (n x l x a) (Hardon et al., 1969).
AHE: rea de la hoja estimada con la ecuacin A = C x (n x l x a) (Hardon et al., 1969) utilizando los factores de correccin (C) obtenidos.
Tabla 11. Estimacin del peso seco de la hoja en plantas de vivero en bolsas plsticas de materiales de palma aceitera en Tumaco, Colombia
Material

Peso
seco hoja
observado
(PSHO)
kg
Peso
seco hoja
calculado (1)
(PSHCA 1)
kg
Sobreestimacin
PSHCA1 - PSHO
%

Peso
seco hoja
calculado (2)
(PSHCA 2)
kg
Sobreestimacin
PSHCA 2 - PSHO
%

Factor de
correccin
calculado
(FC)
Peso seco
hoja estimado
(PSHE)
kg
Tanzania x Ekona 0,044 0,368 735,7 0,106 141,5 0,028 0.044
Deli x Yangambi (1) 0,046 0,370 708,2 0,108 135,3 0,028 0.045
Deli x Avros 0,051 0,374 638,9 0,110 118,0 0,031 0.050
Deli x Yangambi (2) 0,055 0,407 641,2 0,132 140,5 0,028 0.054
Promedio Especie 0,049 0,380 674,9 0,114 132,9 0,029 0.049
PSHO: valor de peso seco de la hoja observado real.
PSHCA 1: valor de peso seco de la hoja calculado con la ecuacin W = 0,2062 + 0,1023(PxS) (Corley et al., 1971).
PSHCA 2: valor de peso seco de la hoja calculado con el modelo W= 0,067(PxS) (Contreras, 1996).
FC: factor de correccin calculado a partir de PSHO y el modelo W = FC x (P x S) (Contreras, 1996).
PSHE: peso seco de la hoja estimado con el modelo W= FC x (P x S) (Contreras, 1996) utilizando los factores de correccin (FC) calculados.
tambin se observ en otros pases, para
palmas de 1 a 8 aos en campo; lo que
llev efectuar validaciones y ajustes de la
ecuacin (Henson, 1993; Corley y Tinker,
2003; Taylor, 2007).
La estimacin del peso seco de la hoja,
empleando el modelo ajustado W = FC x
(P x S) mostr valores similares respecto
al peso de la hoja observado. Mientras
que la aplicacin del modelo con el valor
de FC = 0,067, indicado por Contreras
(1996) para palmas de 6 aos en campo,
present sobreestimacin mayor al 100%
(tabla 11).
Por otra parte, la estimacin del peso
seco de la hoja con la ecuacin de Cor-
ley y colaboradores (1971), W = 0,2062
+ 0,1023 (P x S) present sobreestima-
cin superior al 200%, respecto al peso
seco de la hoja observado (tabla 11).
Este comportamiento ha sido reportado
por otros autores para palmas menores
18
rencias estadsticas significativas entre
variedades. Pero s se presentaron para
la mayora de los componentes de la
hoja y hojas por planta. Esto evidenci
la probable existencia de un mecanismo
propio de la especie, manifestado en
cada variedad, para la organizacin de
su aparato fotoasimilatorio, en unas con-
diciones ambientales especficas.
La biomasa de la hoja y de sus com-
ponentes raquis y foliolos, as como su
distribucin porcentual entre los dife-
rentes componentes de la hoja, presenta-
ron diferencias estadsticas significativas
entre variedades, pero no para la bio-
masa del pecolo. Lo anterior indic que
las modificaciones de la distribucin de
biomasa, probablemente, pueden con-
tribuir al mecanismo de organizacin de
las partes de la hoja para que la especie
obtenga un rea de aparato fotoasimila-
torio similar.
Todas las variedades presentaron cre-
cimiento armnico entre las diferentes
partes de la planta, producto de la similar
distribucin y acumulacin de asimilados
a sus rganos.
Todas las variedades presentaron un
orden de preferencia similar para el des-
tino de la distribucin y acumulacin de
los asimilados en la hoja: foliolos > raquis
> pecolo. As como en la planta: foliolos >
races > bulbo > raquis > tallo > base pecio-
lar > pecolo > flecha. Lo cual est relacio-
nado con la fuerza de sumidero intrnseca
de cada rgano componente.
Las tendencias y el patrn de crecimien-
to observados para cada material no per-
miten sealar a un genotipo en particular
como el de mejor crecimiento.
Curvas de referencia para el compor-
tamiento del dimetro del bulbo y altura
de planta, de palmas de vivero para las
cuatro variedades estudiadas, pueden ser
estimadas con ecuaciones del tipo Y = a
+ bX, determinadas en este estudio para
periodos de tiempo especficos.
El rea de la hoja para palmas de
vivero puede ser estimada en Tumaco,
para la etapa vegetativa en que fue deter-
minada, utilizando para cada variedad y
la regin, ecuaciones ajustadas del tipo
AHE = C x (n x L x a), obtenidas en este
estudio a partir de la ecuacin de Har-
don y colaboradores (1969).
El peso seco de la hoja para palmas
de vivero puede ser estimado en Tuma-
co, para la etapa vegetativa en que
fue determinado, utilizando para cada
variedad y la regin, modelos ajustados
del tipo PSHE = FC x (P x S), obtenidos
en este estudio a partir del modelo de
Contreras (1996).
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ART CULO DE REVI SI N
Mario Lobo A.
1
Agrobiodiversity relevance, at genetic
resources level, for the development of
sustainable production systems
AB S T RACT
Colombia is a megadiverse country, from
the viewpoint of genetic diversity, with
ample ecosystem variability, which can be
employed for the development of sustainable
production systems, efficient and competitive.
This means, besides conservation of strategic
genetic resources of plants, animals and
microorganisms, to know the potential of
this agrobiodiversity for its ample utilization,
with the support of conventional procedures
and those from the modern biotechnology,
which allow the efficient production of food
and feed, as well as the implementation of
the novel concept of integrated management
of agroecosystems. Thus, in the current
review, are included, in the new world
context, the importance of the agricultural
biological diversity, as well as the actions
to be developed in order to translate the
agrobiodiversity from existence value to
option and use values.
Keywords: Agroecosystems, biodiversity, plant
domestication, resource utilization.
Importancia de los recursos genticos de la
agrobiodiversidad en el desarrollo de sistemas de
produccin sostenibles
RE S UME N
Desde la ptica de la diversidad gentica, Colombia es un pas megadiverso con varia-
bilidad ecosistmica importante, la cual puede ser aprovechada para el desarrollo de
sistemas de produccin sostenibles, eficientes y competitivos. Esto implica, aparte de la
conservacin de los recursos genticos estratgicos vegetales, animales y de microorga-
nismos, conocer el potencial de esta agrobiodiversidad para su utilizacin amplia, con
apoyo de procesos convencionales y de la biotecnologa moderna, que permitan pro-
veer alimentos y el desarrollo del concepto integral del manejo de agroecosistemas. Por
ello, en la revisin actual se incluye una descripcin de la importancia de la diversidad
biolgica agrcola, en el nuevo contexto mundial y la necesidad de realizar procesos
de conocimiento de la variabilidad y los atributos presentes en sta, para trasladar el
recurso gentico de valor de existencia a los de opcin y utilizacin.
Palabras clave: agroecosistemas, biodiversidad, domesticacin de plantas, utilizacin de
los recursos.
1
Ingeniero agrnomo Ph.D. Investigador titular,
Grupo de Recursos Genticos y Mejoramiento de
Frutales Andinos, Corpoica, C.I. La Selva, Rionegro,
Antioquia. Profesor asociado Universidad Nacional
de Colombia, sede Medelln. mlobo@corpoica.org.co
Radicado: 4 de noviembre de 2008
ECOF I SI OLOG A
VEGETAL
GENTI CA VEGETAL
Y BI ODI VERSI DAD
I NT RODUCCI N
Colombia posee una gran riqueza biol-
gica, lo cual se desprende de la diversidad
de ecosistemas -337 segn Van Winngaar-
den y Fandio-Lozano (2005)-, del elevado
nmero de especies vegetales, animales
y de microorganismos, muchos de ellos
endmicos del pas (CIPRF, 1996; Lobo,
2000), y de la variabilidad dentro de espe-
cies. Por lo anterior ha sido incluida en
el grupo de los pases megadiversos del
mundo; en 0,77% del rea del planeta
cuenta aproximadamente con 10% del
total de las especies vegetales y animales
(Dvalos et al., 2003). Se estima que en
la regin del Choc, zona importante de
endemismos en el mbito mundial, se
encuentran alrededor de 8.000 especies, y
que all existen algunos de los bosques ms
ricos en especies del planeta (Gentry, 1986,
1993; Galeano, Surez y Balslev, 1998).
La biodiversidad mencionada es un
elemento con valor estratgico para la
insercin dentro del nuevo orden mundial,
el cual incluye aspectos como: el desarro-
llo generalizado de conciencia alrededor
de la preservacin del medio ambiente y
la biodiversidad, lo que condujo a la for-
mulacin del Convenio sobre Diversidad
Biolgica (Conferencia de las Naciones
Unidas sobre el Medio Ambiente y el
Desarrollo 1992), del cual Colombia es
parte; el reconocimiento de la soberana de
los pases sobre su biodiversidad en el ins-
trumento anterior, en contraposicin con el
paradigma existente previamente de que:
los recursos genticos eran patrimonio de
la humanidad (Hammer et al., 2003); el
desarrollo de derechos de propiedad inte-
lectual, incluyendo patentes y derechos
de obtentor sobre las variedades vegetales
(King y Eizaguirre, 1999) y patentes sobre
componentes y productos derivados de la
biodiversidad (Hamilton, 2006); y la globa-
lizacin que tiene efectos en la agricultura,
el modo de vida, el uso de los recursos y la
conservacin ambiental (Zimmerer, 2007),
lo que implica una produccin agropecua-
ria eficiente y competitiva (Pingali, 2007).
A lo anterior se adicionan: 1. La nece-
sidad de adoptar un modelo productivo
de agricultura sostenible, y limpia, lo que
depende, de acuerdo con Liebman y Davis
(2000) y Mder y colaboradores (2002), de
la relacin entre la diversidad de especies
y el funcionamiento de los ecosistemas,
procurando preservar la base de recursos
naturales, con empleo bajo de insumos
externos y un mnimo disturbio causado
por el cultivo y la cosecha, de manera
que stos sean econmica y socialmente
viables (Gliessman, 2007). 2. El aumento
de la poblacin humana, con una mayor
demanda de alimentos y agua, elemento
este que debe sustraerse de la agricultu-
ra, lo que ha conducido al concepto del
agua virtual, o sea, la necesaria para
la produccin de alimentos, lo cual se ha
vinculado, actualmente, a los debates de
20
Importancia de los recursos genticos de la agrobiodiversidad en el desarrollo de sistemas de produccin sostenibles
temas polticos mundiales (Roth y War-
ner, 2008). 3. El desarrollo de usos alterna-
tivos de las especies vegetales, en especial
la produccin de biocombustibles a partir
de cultivos bsicos para la alimentacin
(Windhorst, 2007). 4. El cambio climtico
global, aspecto internacionalmente reco-
nocido desde la dcada de 1990 como
consecuencia de la acumulacin de gases
del efecto invernadero (Barker, 2008).
Segn Brussaard y colaboradores (2007)
la biodiversidad empleada en la agricultu-
ra tiene dos componentes: el planeado,
o sea los cultivos o tipo de ganado que
el granjero quiere producir, y el no pla-
neado que corresponde a la biota que
participa en el sistema, cuya mayor parte
est presente en el suelo. El componente
planeado, conjuntamente con las especies
silvestres relacionadas, comprende el con-
glomerado de recursos genticos emplea-
dos para la alimentacin y la agricultura
(Jarvis et al., 2007). A partir de lo expre-
sado, emergi, como nueva disciplina,
la agrobiodiversidad; esta se ha definido
como el componente de la biodiversidad
que contribuye a la produccin agrcola
y de alimentos (European Environmental
Agency, 2005), la cual evolucion como
una sntesis de la investigacin en biodi-
versidad y la aproximacin de los recursos
genticos (Hammer et al., 2003).
Schrder y colaboradores (2007) afir-
maron que la agrobiodiversidad es un
componente pequeo de la biodiversidad,
que desempea un papel indispensable
en la provisin del alimento humano y
productos primarios renovables, la cual
brinda una base importante para la inno-
vacin en el sector alimentario, en el
campo de productos primarios renova-
bles, biomasa industrial y produccin de
bioenerga a partir de las plantas. En la
agrobiodiversidad se han incluido, aparte
de las especies citadas como planeadas,
los taxa silvestres relacionados, polini-
zadores, simbiontes, pestes, parsitos,
depredadores y competidores (Qualset
et al., 1995). El trmino agrobiodiversidad
se utiliz, al principio, para categorizar
la diversidad presente en los cultivos
(FAO, 1995), con el fin de diferenciarla de
la biodiversidad, la cual se asociaba con
las especies silvestres, que se consideraba
tenan mayor variabilidad que las culti-
vadas, lo que Caballero y colaboradores
(2007) consideran una creencia errnea.
Para que la utilizacin sostenible de la
agrobiodiversidad, de la cual los recursos
genticos para alimentacin y agricul-
tura son un componente, contribuya en
forma eficiente al crecimiento econmico
de un pas, se requiere conservar ade-
cuadamente esta riqueza biolgica, ade-
lantar procesos de conocimiento de la
variabilidad presente en ella y promover
ampliamente su utilizacin mediante la
documentacin de los atributos presentes
en los materiales y el apoyo a procesos
de premejoramiento y mejoramiento con
visin sistmica (Lobo, 2000). Estos deben
buscar la oferta de variedades vegetales y
estirpes superiores de animales adapta-
dos a la oferta ambiental, al igual que la
utilizacin de microorganismos benficos
y de productos derivados que contribu-
yan a la sostenibilidad y mejoramiento de
los sistemas agropecuarios.
Igualmente, la agrobiodiversidad, ade-
cuadamente caracterizada, debe permitir
el desarrollo de nuevas alternativas pro-
ductivas competitivas nacional e inter-
nacionalmente, empleando las especies
relegadas y las subutilizadas. Hammer y
colaboradores (2001) definieron las pri-
meras como aquellas que han sido ignora-
das por la ciencia y el desarrollo pero que
se usan en las reas de adaptacin y son
competitivas; y las segundas, aquellas que
se sembraban y cayeron en desuso. En un
contexto ms amplio Brown y Hodgkin
(2007) indicaron que el gran desafo de
la comunidad agrcola mundial es cmo
desarrollar y mejorar la productividad de
los ecosistemas agrcolas para disminuir
la pobreza y brindar la seguridad alimen-
taria de una manera sostenible, para lo
cual se ha reconocido que la diversidad
gentica vegetal es esencial (Smith et al.,
2008). Brown y Hodgkin (2007) agrega-
ron que el manejo de la biodiversidad es
complejo y que incluye diversos niveles:
ecosistemas, especies, genes y ambiente,
e involucra una gran variedad de dis-
ciplinas, entre las cuales se encuentran
la gentica, los sistemas agrcolas y las
ciencias sociales.
Importancia de la biodiversidad para la
agricultura
La biodiversidad se refiere a la variedad
de formas vivas: animales, plantas y
microorganismos diferentes, los genes
que contienen y los ecosistemas que con-
forman, lo cual es el producto de millo-
nes de aos de historia evolutiva, de los
que obtiene la humanidad su alimento
y un nmero apreciable de medicinas y
productos industriales, derivados de los
componentes silvestres y domesticados
de la diversidad biolgica (Department
of the Environment, Sport and Territo-
ries, 1999). Se estima que las poblaciones
rurales pobres dependen en 90% de los
recursos biolgicos para satisfacer sus
necesidades de supervivencia (Shand,
1997); por lo cual, hay consenso mundial
sobre que la biodiversidad es funda-
mental para la produccin agrcola y
la seguridad alimentaria, como tambin
un ingrediente importante de la conser-
vacin del ambiente (Thrupp, 2000). La
biodiversidad en los sistemas agrcolas
provee el alimento y la manera de produ-
cirlo, lo cual depende del gran nmero
de taxa que llevan a cabo servicios regu-
ladores esenciales, como soporte de la
produccin (Jarvis et al., 2007).
A partir de la biodiversidad, el hombre
recibe un amplio conjunto de beneficios,
conocidos como servicios ecosistmicos.
Estos, segn Tilman y colaboradores
(1999) comprenden una serie de aspec-
tos crticos para el soporte de funciones
de las cuales depende la productividad
de las actividades agrcolas como son:
purificacin del aire y el agua; control
de sequas e inundaciones; generacin y
preservacin de suelos y restitucin de
su fertilidad; detoxificacin y descom-
posicin de desechos; polinizacin de
cultivos y vegetacin natural; ciclos y
movimiento de los nutrientes; control de
la mayora de las pestes agrcolas poten-
ciales; proteccin contra los rayos ultra-
violetas; estabilizacin parcial del clima;
moderacin de condiciones climticas
extremas y su impacto; y mantenimiento
de la biodiversidad.
El valor de los bienes y servicios deri-
vados de la biodiversidad es inmenso
y difcil de cuantificar (Tilman et al.,
1999). Daily (1997) presenta un listado
que incluye: 1. La librera gentica de
la biodiversidad, la cual contribuye a
aproximadamente la mitad del incre-
mento en la productividad agrcola y a la
capacidad de respuesta a enfermedades
y plagas. 2. Polinizacin de aproxima-
damente la mitad de las especies vege-
tales, incluyendo cultivos para producir
21
alimentos; se conocen ms de 100.000
polinizadores, y se estima que el valor de
los servicios de la polinizacin en Esta-
dos Unidos est en el orden de billones
de dlares. 3. Control de plagas, sobre lo
cual se sabe que ms de 25% de las prdi-
das agrcolas son causadas por plagas y
que ms de 90% de las pestes potenciales
son controlados por enemigos natura-
les que viven en reas adyacentes a los
cultivos; en este contexto, se estima que
la sustitucin de pesticidas por controla-
dores naturales representa $54 billones
de dlares por ao en Estados Unidos. 4.
Praderas nativas que proveen follaje para
alimentacin del ganado y son el hbitat
natural de muchos animales domsticos
y cultivos. 5. Productos farmacuticos; se
informa que de las 150 drogas prescritas
ms frecuentemente en Estados Unidos,
118 se basan en compuestos derivados
de fuentes naturales. 6. Pesca, que es una
de las mayores fuentes de oferta animal
y cuyo valor, mundialmente, supera los
cincuenta billones de dlares.
La agrobiodiversidad comprende la
variedad y variabilidad de animales, plan-
tas y microorganismos que son importan-
tes para la alimentacin y la agricultura,
lo cual se deriva de una interaccin entre
el ambiente, los recursos genticos y los
sistemas de manejo, que incluyen las
prcticas utilizadas para tal fin por la
gente (Pimbert, 1999). Se ha sealado
que la gran diversidad de cultivos, siste-
mas de produccin, especies de animales
y razas de stos es una medida de la
importancia de la biodiversidad para la
agricultura (National Research Council,
1993). La agrobiodiversidad comprende
diferentes cultivos para satisfacer necesi-
dades varias de mercado (Pimbert, 1999)
e, igualmente, una gama amplia de culti-
vares y diversas combinaciones de genes
relacionados que confieren resistencia a
plagas y tolerancia a factores adversos,
los cuales conducen a una mayor pro-
ductividad y tipos de productos (Crop
Science Society of America, 1993).
La agrobiodiversidad es bsica para el
desarrollo de los sistemas productivos, en
la situacin actual de apertura y adopcin
de un modelo de agricultura limpia y sos-
tenible. En ella se encuentran alternativas
productivas nuevas o relegadas, competi-
tivas y eficientes, de existir mercados para
las mismas, lo cual va ligado a estudios
de cuantificacin de consumo probable y
estrategias de mercadotecnia para captu-
rar la demanda potencial. Igualmente, la
agrobiodiversidad brinda alternativas de
reemplazo de cultivos ilcitos, con pro-
ductos que tengan posibilidades no slo
en el mercado de consumo fresco, sino
tambin con potencial de procesamiento,
lo cual da valor agregado a los bienes
derivados del sector agropecuario.
Brookfield y Stocking (1999) emplea-
ron el trmino agrodiversidad en un
sentido ms amplio que el de agro-
biodiversidad: Agrodiversidad son las
formas diversas en que los agricultores
usan la diversidad natural del ambiente
para la produccin, lo que incluye no
slo la seleccin del cultivo, sino tambin
el manejo del suelo, el agua y la biota
como un todo. Agregan estos autores
que tiene cuatro componentes que inclu-
yen: 1. diversidad biofsica, la cual se
refiere al ambiente natural, que controla
la calidad intrnseca que se utiliza para
la produccin; 2. manejo, relacionado
con los mtodos de empleo del suelo, el
agua y la biota para la produccin de los
cultivos y el mantenimiento de la fertili-
dad y la estructura del primero de stos;
3. agrobiodiversidad, lo que significa, en
concordancia con Guo y colaboradores
(1996), la manipulacin y uso de las espe-
cies biolgicas, incluyendo las cultivadas,
las semidomesticadas y las silvestres; y 4.
la variabilidad organizacional, que com-
prende los aspectos socioeconmicos.
El papel en la agricultura de los recur-
sos genticos de los cultivos, el ganado y
las especies acuticas ha sido reconocido
por un perodo de tiempo considerable,
pero slo en la ltima dcada la comuni-
dad global ha comprendido la importan-
cia del complejo de diversidad agrcola
en el funcionamiento de los ecosistemas
agrcolas (Jarvis et al., 2007). En concor-
dancia con lo anterior, Thrupp (2000)
indic que la biodiversidad agrcola o
agrobiodiversidad es un componente
fundamental de los sistemas producti-
vos en el mundo, que involucra muchos
recursos biolgicos ligados a la agri-
cultura, entre los cuales se encuentran:
los recursos genticos; las plantas y los
cultivos comestibles que incluyen varie-
dades tradicionales y materiales desa-
rrollados por los mejoradores; el ganado
y los peces; los organismos del suelo
importantes para la fertilidad, estructu-
ra, calidad y sanidad; los insectos, bac-
terias y hongos que controlan pestes y
enfermedades de las plantas y animales
domesticados; los componentes de los
agroecosistemas indispensables para el
ciclo de los nutrientes, la estabilidad y la
productividad; y los recursos silvestres
de los hbitat naturales y reas de cul-
tivo que proveen funciones y servicios
ecosistmicos.
La importancia de la agrobiodiversi-
dad fue enfatizada en la consulta inter-
nacional llamada: Funcin de la agro-
biodiversidad en el logro del objetivo de
desarrollo para el milenio de erradicar el
hambre y la pobreza, celebrada en Chen-
nai, India, en abril de 2005 (IPGRI, GFAR,
MSSRF, 2005); los participantes, de 25
pases, resaltaron el potencial de la con-
tribucin de la diversidad agrcola para
mejorar los medios de vida, al proveer
las bases para la seguridad alimentaria y
nutricional y ofrecer oportunidades para
la generacin de ingresos.
Como resultado de la mencionada con-
sulta, se adopt una plataforma para la
Accin en pro de un mundo sin hambre
ni pobreza, con diez componentes que
incluyeron acciones relacionadas con la
agrobiodiversidad, las cuales, de manera
resumida, comprenden: incorporacin de
su conservacin y uso sostenible en los
planes nacionales de desarrollo y en la
implementacin de instrumentos de pol-
tica mundial existentes; introduccin de
medidas legislativas para el uso de la tie-
rra y otros recursos naturales para mejo-
rar la capacidad de utilizacin de la diver-
sidad; ampliacin del sistema multilateral
de acceso a los recursos genticos del
Tratado Internacional de Recursos Fitoge-
nticos; reconocimiento de los aportes de
las comunidades locales a la conservacin
de sta; promocin de mercados locales
y el facilitamiento de entrada a mercados
internacionales de los productos de la
agrobiodiversidad; defensa y fortaleci-
miento del llamado alfabetismo nutri-
cional, relacionado con alimentos tradi-
cionales; fomento de una mayor diversi-
dad de alimentos; reestructuracin de las
prioridades de investigacin y desarrollo;
y prevencin de la prdida de los cultivos
subutilizados y relegados, muchos de
los cuales tienden a desaparecer (IPGRI,
GFAR, MSSRF, 2005).
22
Dentro del desarrollo de sistemas de
produccin sostenible, la variabilidad
cobra relevancia ya que la aproximacin
de la funcin productiva, fenotipo = geno-
tipo + ambiente + genotipo x ambiente, da
un alto peso al componente genotpico,
en los sistemas de produccin sostenible.
Esto seala la necesidad de contar con una
oferta de materiales eficientes en la toma
de nutrientes, con resistencia o toleran-
cia a plagas y enfermedades, con menor
dependencia de insumos externos y con
posibilidades de su inclusin en sistemas
de produccin mltiple, incluyendo agro-
forestera y arreglos silvo-pastoriles y otra
serie de atributos especficos como son
caractersticas que permitan la utilizacin
industrial de los productos derivados de
la actividad agropecuaria.
Lo anterior ha sido considerado
importante aun en los pases desarro-
llados y condujo a la consolidacin del
concepto de sistemas agrcolas integra-
les (Hendrickson et al., 2008), con base
en que la agricultura intensiva moderna
altera los recursos y disminuye la capa-
cidad productiva (Huang et al., 2002) y
la sostenibilidad misma (Tilman et al.,
2002). Esto privilegia una aproximacin
de seleccin de genotipos con adaptacin
local y amplia estabilidad, en lugar de
la adaptacin amplia, con base en que
muchos productores prefieren minimizar
las variaciones en el tiempo en compara-
cin con un alto potencial productivo en
perodos favorables (Dawson et al., 2008);
en consonancia con lo anterior Ceccarelli
(1994) postul que la estabilidad en ren-
dimiento era el objetivo ms importante
en trminos de las necesidades sociales
y econmicas. Lo precedente favorece
el empleo de una mayor variabilidad y
apoya un manejo integral del agroeco-
sistema, considerando sus componentes
biolgicos. Esto contrasta con la prctica
agrcola en los pases industrializados
la cual, de acuerdo con Omer, Pascual y
Rusell (2007), se focaliza en la creacin
de un ambiente ptimo para una especie
cultivada determinada, ajustando ste
para el desarrollo de la produccin, cuyo
resultado es ignorar las interacciones
simbiticas y las complementariedades
del uso de recursos entre especies.
Para Jarvis, Padock y Cooper (2007) la
biodiversidad en los ecosistemas agrco-
las suministra el alimento humano y los
medios para producirlo, lo cual seala
que los agricultores diariamente manejan
la diversidad agrcola para la produc-
cin de comida y una serie de productos
esenciales para la vida humana, al igual
que otros servicios como la proteccin
del agua y la captura de carbono. Frey
y Becker (2004) recopilaron una serie
de funciones de la biodiversidad agr-
cola (agrobiodiversidad) presentadas
por diversos autores, entre las cuales se
encuentran: 1. Reduccin de la vulnerabi-
lidad de los agroecosistemas e incremento
en la resistencia a plagas y enfermeda-
des (Main, 1999; Olasantan, 1999; Thrupp
2000; Zhu et al., 2000). 2. La diversidad
gentica es una fuente importante para la
investigacin y el mejoramiento (Frisvold
y Condon, 1998; Jana 1999; Olasantan
1999; Ishikawa et al., 2002). 3. Las varie-
dades locales y los sistemas diversos de
cultivo mltiple contribuyen a la diver-
sidad rural y cultural (Thrupp 2000). 4.
La diversidad agrcola permite un uso
complementario de recursos como luz,
agua y nutrientes, como tambin capital
y trabajo (Vandermeer et al., 1998; Main,
1999; Olasantan, 1999; Altieri, 2002). 5. La
diversidad de agroecosistemas produce
rendimientos estables y constantes, aspec-
to importante para disminuir los riesgos
a escala de pequeos productores (Smale,
1998; Main, 1999; Olasantan, 1999). 6. Los
agroecosistemas con diversidad simulan
los ecosistemas naturales y sirven como
hbitat para numerosas especies (Thrupp,
2000; Peroni y Hanazaki, 2002).
Tomando en consideracin las especies
vegetales, la diversidad dentro de cada
cultivo es esencial para la agricultura (Til-
man et al., 1999), con demanda por parte
de los productores de un arreglo de varie-
dades de plantas (Duvick, 1984), premisa
que ha sido valida desde el momento en
que comenzaron los procesos de domes-
ticacin de especies, los cuales crearon el
concepto de recurso gentico al agregar
conocimiento al recurso biolgico. Esto
produjo un arreglo inmenso de varieda-
des locales, que fueron la base para el
desarrollo de los cultivares comerciales. A
partir de stas, los agricultores y los cien-
tficos utilizaron la variabilidad acumula-
da por cientos de generaciones, las cuales
observaron, seleccionaron, multiplicaron,
intercambiaron y mantuvieron variantes
de las plantas cultivadas; esto produjo el
legado de recursos genticos que alimenta
millones de seres humanos (Brush, 2000).
Igualmente, en el caso de los taxa anima-
les, el proceso de domesticacin se bas
en la variabilidad existente y tom dos
lneas en cuanto al uso de los productos
derivados del conjunto biolgico. La pri-
mera focaliz la seleccin de individuos
para carne, grasa y fibra, derivada de ove-
jas, cabras, perros y cobayos; la segunda
seleccion, adicionalmente, especies que
sirvieran para transporte y fuerza de tra-
bajo, lo que incluy el ganado vacuno, el
bfalo, el yak, el caballo, el burro, la llama
y el camello; con ocurrencia de inter-
cambio de animales entre continentes y
pases, lo cual se increment durante la
poca del colonialismo, particularmente
despus del siglo XIX (Hoffmann, 2007).
Pese a los esfuerzos de domesticacin
de las especies vegetales, las taxa domes-
ticadas representan una fraccin mnima
de la biota terrestre. As, de un estimado
de 320.000 plantas vasculares, alrededor
de 25% de las mismas tienen propiedades
comestibles y 3000 se utilizan con este fin
(UNEP, 1995), aun cuando este nmero
puede ser ms amplio. As, Hammer et
al., (2003) afirmaron que el nmero de
plantas empleadas por el hombre para la
alimentacin y la agricultura puede llegar
a 7000; Khoshbakht y Hammer (2008) afir-
man que al agregar al grupo anterior los
taxa utilizados para ornamentacin, jardi-
nera y paisaje, se podra hablar de 35.000
plantas cultivadas, o sea alrededor de 14%
del total de especies vegetales superiores.
Se estima que se utilizan entre 25.000 y
50.000 plantas en procesos de medicina
tradicional (UNEP, 1995). Cabe sealar
que a escala mundial, del conjunto de
entidades vegetales para la alimentacin,
y tomando como referencia el aporte de
protenas y caloras, 30 cultivos aportan
el 95% de stas (Lobo, 1998); y tres cerea-
les -arroz, trigo y maz- contribuyen con
cerca del 60% de las caloras (Thrupp,
2000). Es preocupante el reducido nme-
ro de especies vegetales empleadas en la
alimentacin y la agricultura, y la erosin
gentica intra e interespecfica (Frey y
Becker, 2004). Estos dos tipos de erosin
gentica son ocasionados por el reempla-
zo de variedades locales por unos pocos
cultivares de productividad elevada (Cox
y Wood, 1999), y por la concentracin de
pocas especies sembrados en reas gran-
des en monocultivo (Cox y Wood, 1999;
Singh, 2000), respectivamente.
23
En relacin con las especies animales,
se ha sealado que ms de 6.379 razas
de animales de alrededor de 30 especies
se han desarrollado en los doce mil aos
del proceso de domesticacin (Scherf,
2000), con evolucin de adaptaciones que
permiten la produccin pecuaria en una
amplia gama de situaciones, las cuales
incluyen algunos de los ambientes ms
inhspitos poblados por el hombre (Gib-
son et al., 2007). Se estima que aproxi-
madamente mil conjuntos de animales
domsticos estn en peligro de extincin
(Loftus y Scherf, 1993, citados por Mar-
tnez, 2000). En consonancia con lo pre-
cedente, Gibson y colaboradores (2007)
informaron que 35% de los mamferos y
63% de las aves utilizados por el hombre
estn en peligro de desaparicin. De los
anteriores, estn envueltos en sistemas
comerciales de produccin animal, menos
de 20 especies, con pocas razas predo-
minantes, de las cuales, de acuerdo con
Hoffman (2007), 14 de ellas, correspon-
dientes a mamferos y aves, suministran
el 90% de los alimentos de origen animal.
El ganado vacuno representa 90% de la
produccin mundial de leche y 32% de
la de carne; los cerdos aportan aproxima-
damente 40% de la carne consumida en
el planeta, en tanto que las ovejas y las
cabras, el 4% de la leche, 6% de la carne
y alrededor de 85% de la produccin de
fibras animales para textiles (FAO, 1995,
citado por Martnez, 2000). La ganadera
utiliza dos terceras partes de la superficie
destinada a la agricultura, lo cual equivale
a una tercera parte del rea global, razn
por la cual es evidente la necesidad de
incorporar medidas de conservacin uni-
das a sistemas de produccin pecuarios
ms eficientes (Martnez, 2000).
Se ha puntualizado que alrededor de
70% de la poblacin campesina depende
de animales como un componente de su
vida (Livestock in Development, 1999) y
que la diversidad gentica encontrada en
las razas de stos les permite seleccionar
individuos o desarrollar nuevos tipos,
como respuesta a las enfermedades, las
condiciones del mercado y las necesida-
des sociales, aspectos que son impredeci-
bles (Pattison, Drucker y Anderson, 2007).
Cada especie animal domesticada inclui-
da en sistemas productivos est repre-
sentada por un arreglo gentico conocido
como raza (breed), cuya identidad se desa-
rroll a travs de aislamiento regional,
adaptacin a condiciones extremas loca-
les, deriva gentica y preferencias de los
granjeros por caractersticas fsicas o de
produccin (Tilman et al., 1999). La Food
and Agriculture Organization (FAO) en
1995 estim que el nmero total de razas
de mamferos y aves est entre 4.000 y
5.000, lo cual es aproximadamente igual
al nmero de especies de mamferos.
En estas razas y sus parientes silvestres
se encuentra la variabilidad gentica de
la cual depende la produccin pecuaria
actual y futura (Tilman et al., 1999).

Con relacin a lo anterior, la eficiencia
productiva de las especies que se explotan
en ambientes no controlados o en pasto-
reo est fuertemente ligada al uso de la
diversidad gentica, en la cual se encuen-
tran atributos que permiten adaptacin
a diferentes condiciones ecolgicas y sis-
temas de produccin (Martnez, 2000).
Es importante anotar que en Colombia,
gracias a la diversidad ecosistmica, se ha
desarrollado una gran cantidad de bioti-
pos localmente adaptados y con caracte-
rsticas importantes incluyendo fertilidad,
sobrevivencia, rusticidad y resistencia a
enfermedades. Hoffman (2007) afirm que
el uso y desarrollo de razas de animales y
la conservacin de conjuntos valiosos, de
escaso inters para los productores, debe
ser mejorado en forma sustancial para
garantizar la seguridad alimentaria y el
desarrollo rural continuado y que su uso
sostenible, mejoramiento y conservacin
son elementos crticos complementarios
para el cumplimiento de lo anotado.
La diversidad de microorganismos,
menos conocida que la de los grupos
anteriores, representa un recurso gentico
de alta importancia en la agricultura. La
productividad agrcola y la sostenibilidad
se benefician de los microorganismos en
diversas formas que se mencionan a con-
tinuacin. Simbiosis de los Rhizobium con
las leguminosas con reduccin del nitr-
geno atmosfrico, el cual se torna dispo-
nible para la planta (Sessitsch et al., 2002),
lo que contribuye en forma importante a
la agricultura sostenible y al ciclo global
del elemento (Colebatch et al., 2002). Rela-
ciones simbiticas de los hongos micorri-
zgenos con las races de la mayora de
las plantas terrestres (Rosendahl, 2008),
desde las regiones subpolares hasta los
bosques hmedos tropicales, presentes
aun en ecosistemas acuticos (Read, 1991,
Nielsen et al., 2004); estos microorga-
nismos forman un micelio extrarradical
que permite una transferencia recproca
de carbono a partir del hospedante y
nutrientes tomados del suelo (Leake et al.,
2004) y entre las plantas unidas por la red
micelial (Simard et al., 2002). El llamado
complejo de bacterias ayudadoras de las
micorrizas, las cuales modulan, en condi-
ciones naturales, la simbiosis de hongos
micorrizgenos (Frey-Klett et al., 2007).
La amplia gama de microorganismos que
proveen control biolgico de insectos,
plagas y malezas y los microorganismos
asociados a los vegetales que contribu-
yen con factores de crecimiento o a los
mecanismos de defensa de stos contra
los ataques de insectos y enfermedades
(Tilman et al., 1999), con amplia difusin
y empleo de Bacillus thuringiensis, el cual
ha sido aplicado, durante ms de 50 aos,
para el control de plagas causadas por
lepidpteros (Navon, 2000).

La gran diversidad de microorganis-
mos benficos ofrece numerosas opor-
tunidades, para el mejoramiento de su
actividad, a travs de seleccin natural o
modificaciones genticas, siendo impor-
tante sealar que stos representan un
potencial de genes nuevos para el mejora-
miento vegetal (Tilman et al., 1999) con el
advenimiento de la transgnesis. En lnea
con lo expuesto, Hirsch (2004) seal
que el uso de inoculantes microbiales, en
agricultura y horticultura, para mejorar la
nutricin y el crecimiento e inhibir pestes
y patgenos vegetales es una prctica
ampliamente utilizada. Adicionalmente,
se han reportado microorganismos end-
fitos que viven en el interior de las plantas
sin causar efectos negativos, que brindan
una fuente potencial de productos natu-
rales, con diversas finalidades: medicina,
agricultura e industria; los que han sido
encontrados y aislados, en forma incre-
mental, a partir de los vegetales (Guo et
al., 2008).
En concordancia con lo anterior, Brown
y colaboradores (2007) indicaron que la
biota del suelo, que incluye los microor-
ganismos, es responsable de las modifi-
caciones de ste e interviene en sus pro-
piedades fsicas, qumicas y biolgicas.
Estos tratadistas agregan que algunas de
estas especies, que crecen principalmente
en la rizosfera, son promotoras de creci-
miento asimbitico y que otros microbios
24
participan activamente en la degradacin
de contaminantes, tales como pesticidas
y derivados del petrleo, y en procesos
como la descomposicin de la materia
orgnica, los ciclos de los nutrimentos,
la captura de gases del efecto invernade-
ro, (en especial metano, xido nitroso y
dixido de carbono); y adicionalmente,
muchos son fuentes de medicinas. Brown
et al. (2007), en concordancia con otros
investigadores, sealaron que el suelo,
como sistema, contiene el arreglo mayor
de organismos encontrado en la tierra
(Brusaard et al., 1997; Giller et al., 1997;
Wall y Moore, 1999); por su parte Hgvar
(1998) indica que un gramo de suelo
puede contener varios miles de especies
de bacterias y millones de individuos.
Los microorganismos tambin pue-
den contribuir en la nutricin animal,
mediante la manipulacin de la micro-
biota simbitica fngica y bacteriana del
tracto gastrointestinal de los rumiantes,
la cual se considera responsable de la
degradacin de los compuestos celul-
sicos y de otros polisacridos, compo-
nentes de las paredes celulares vegeta-
les, que son de baja digestibilidad para
los mamferos (Cotes, 2000). Al respecto
Edwars y colaboradores (2008) indicaron
que el propsito del rumen es convertir
la ingesta en biomasa microbiolgica y
productos que puedan ser utilizados por
el animal y que los microorganismos del
rumen fermentan material lignocelul-
sico complejo para ser utilizado por los
rumiantes, sobre lo cual Broudiscou y
Jouany (1995) indicaron que, ms de la
mitad de la protena que llega a los intes-
tinos corresponde al tipo microbial.
En el contexto de la alimentacin, las
levaduras podran estimular la poblacin
de bacterias ruminales, incrementando la
sntesis de protena microbiana, y mejo-
rando el balance protena:energa en el
proceso de absorcin por parte del duo-
deno y por lo tanto la productividad de
los individuos alimentados con pastos
tropicales (Cotes, 2000). Igualmente, la
utilizacin de inculos microbianos ben-
ficos para combatir patgenos del tracto
gastrointestinal por exclusin competiti-
va es una actividad promisoria especial-
mente en especies monogstricas (Cotes,
2000). Otro tipo de microorganismos
benficos son los llamados probiticos,
los cuales se definen como organismos
vivos que benefician a los hospedantes
al mejorar el balance intestinal microbial
(Raoult, 2008). Estos, especialmente del
tipo Lactobacillus, Enterococcus y Bifidobac-
terium, han sido suministrados al hombre,
as como a ganado vacuno, ovejas, cerdos,
aves de corral, caballos y mascotas, cau-
sando modificaciones en la flora de los
organismos anaerbicos del tracto diges-
tivo (Fuller, 1989; Raoult, 2008), y se ha
demostrado que actan como promotores
del crecimiento, por su efecto en la ganan-
cia de peso y la mejora en la conversin de
los alimentos (Gill et al., 2006).
Conocimiento y utilizacin de la
agrobiodiversidad
Day-Rubestein y Heisey (2001) sealaron
que la agricultura y los recursos genticos
son crticamente interdependientes y que
todos los materiales empleados en agri-
cultura, aun las variedades modernas,
descienden de un conjunto de recursos
genticos silvestres y mejorados, prove-
nientes de todo el mundo. Estos tratadis-
tas aadieron que la produccin agrcola
depende de una inclusin continua de
recursos genticos para la estabilidad e
incremento del rendimiento, y que los
recursos biolgicos incluyen los recursos
genticos empleados para producir los
cultivos agrcolas, con una relacin bidi-
reccional entre estos. As, la produccin
agrcola puede afectar los recursos silves-
tres y, a su vez, depende de los recursos
genticos de las plantas y los animales,
muchos de los cuales se encuentran en
ecosistemas espontneos.
La agricultura se desarroll luego de
los procesos de domesticacin por parte
de las comunidades ancestrales, lo cual
ocurri hace alrededor de doce mil aos
(Gepts, 2002), aspecto que ha sido atri-
buido a diversos factores, sobre lo cual se
formul, entre otras, la llamada teora
del oasis de Childe, la cual sugiere que
luego de la glaciaciones, el norte de frica
y el oeste de Asia se tornaron secos y los
humanos comenzaron a congregarse en
reas con disponibilidad de agua (Childe,
1952). Varios autores sostienen que el cul-
tivo precedi a la domesticacin (Moore et
al., 2000; Tanno y Willcox, 2006) y que sta
fue un proceso adaptativo lento que tom
casi 2000 aos para su establecimiento
(Mac Key, 2005). Una vez domesticadas
las plantas, fueron dramticamente alte-
radas por los humanos a travs de selec-
cin dirigida y no dirigida (Araus et al.,
2007), lo que se llev a cabo a travs de la
acumulacin de conocimiento tradicional
sobre la utilidad de las plantas y animales
y de algunos microorganismos, el cual
pas de generacin en generacin.
Posteriormente, con base en el desarro-
llo del conocimiento cientfico y utilizando
las variedades del agricultor, comenz una
poca de produccin de cultivares mejora-
dos por parte de programas pblicos que
pusieron estos materiales a disposicin
de empresas de semillas, pasando luego
dichas empresas a la implementacin y la
produccin de hbridos y de variedades
comerciales. Esto condujo al desarrollo
de derechos de propiedad intelectual, que
se inici con la promulgacin, en Estados
Unidos en 1930, del Acta de Patentes de
Plantas, primer instrumento jurdico en
conceder proteccin sobre los cultivares
vegetales (Fowler, 1994); a este evento le
sigui el establecimiento de los Derechos
de Obtentor sobre los Variedades Vegeta-
les, en el marco del Convenio Internacio-
nal para la Proteccin de las Obtenciones
Vegetales, de la Unin Internacional para
la Proteccin de las Obtenciones Vegetales
(UPOV), el cual se firm en 1961 y entr
en vigor en 1968 (Fowler, 1993). La UPOV,
segn el IPGRI (hoy Bioversity Interna-
tional (2004), es una forma sui generis de
proteccin diseada especficamente para
las variedades vegetales, lo cual se comple-
ment con la tendencia de patentamiento
de stas, incluyendo transgnicos (Brown,
2003, Fagerlin, 2003), as como de procesos
de punta, desarrollados con el empleo de
recursos genticos (Cahoon, 2000).
Scarascia-Mugnozza y Perrino (2002)
afirman que el uso y explotacin de los
recursos genticos requiere conocimiento
y evaluacin de los caracteres expresados
por las muestras del genoma y la identi-
ficacin de atributos deseables, y que la
investigacin en numerosas disciplinas
relacionadas con los recursos heredables
ha permitido el desarrollo de metodolo-
gas refinadas relacionadas con el obje-
tivo anterior, en particular aquellas que
pueden ser aplicadas progresivamente
para conocer el genoma de accesiones
especficas valiosas. Lo anterior condujo a
la formulacin de un proyecto para el uso
y la valoracin de la agrobiodiversidad
mundial, durante las reuniones del Foro
25
de Megaciencia de la OECD en 1999 y
al establecimiento de la Entidad Global
de Informacin en Biodiversidad (GBIF),
enmarcada en los preceptos del Convenio
sobre Diversidad Biolgica.
Una de las limitaciones importantes
para la utilizacin de los recursos genti-
cos es el escaso conocimiento de la agro-
biodiversidad. As, el Informe del esta-
do de los recursos fitogenticos (FAO,
1996a), documento que se encuentra en
fase de actualizacin, demostr esta falen-
cia, por lo cual el Plan Global de Accin
para la Conservacin y la Utilizacin
Sostenible de los Recursos Fitogenticos
para la Alimentacin y la Agricultura
seal que la falta de caracterizacin y
evaluacin de los recursos fitogenticos
ha impedido un empleo mayor de stos
en programas de mejoramiento. Por lo
anterior, se incluy en el plan: Expandir
las actividades de caracterizacin, evalua-
cin y el nmero de colecciones ncleo
para facilitar su uso (FAO, 1996b).
En igual sentido, en el Plan Mundial de
Accin sobre los Recursos Zoogenticos
(FAO, 2007) se consider importante la
ampliacin de la caracterizacin de los
recursos genticos; se indica all que una
comprensin adecuada de las caractersti-
cas de las razas es necesaria para orientar
la adopcin de decisiones en los progra-
mas de desarrollo pecuario y de mejora-
miento gentico y que los resultados de la
caracterizacin permiten a los agricultores
determinar qu raza utilizar en las condi-
ciones de produccin del momento; por
lo anterior se estipul como una medida
a tomar, la ampliacin de las actividades
de caracterizacin. Lo precedente se basa
en que el valor agregado dado al recurso
gentico es lo que brinda posibilidades de
utilizacin de ste.
Gotor y colaboradores (2008) escribie-
ron que el valor de los recursos genticos
vegetales, en conservacin, depende de
la informacin utilizada para promover
su uso, lo cual es vlido tambin para los
de origen animal y los microorganismos;
sobre esto, Scaracia-Mugnozza y Perrino
(2002) indicaron que el uso y explotacin
de los recursos genticos postula cono-
cimiento y evaluacin de los caracteres
expresados por el genoma de las accesio-
nes y la identificacin de caractersticas
deseables.
Dado el inters por los atributos mor-
folgicos por parte de los usuarios del
germoplasma se desarrollaron, en el caso
de las plantas, listas de descriptores
estandarizados a partir de 1976, los cua-
les evolucionaron de conjuntos mnimos
de atributos a una lista amplia para la
categorizacin de accesiones de los taxa
vegetales, los cuales brindan informacin
que puede ser compartida y utilizada por
usuarios de diversa ndole (Gotor et al.,
2008). La resea, actualmente, compren-
de cinco clases de informacin: 1. Datos
de pasaporte, que describen los parme-
tros a ser observados en el momento de
colecta del material o que acompaan
las introducciones provenientes de otros
sitios. 2. Informacin de manejo, regis-
tros de multiplicacin, almacenamiento,
mantenimiento y regeneracin. 3. Cate-
gorizadores de ambiente y localidad e
informacin de los sitios de colecta, mul-
tiplicacin, caracterizacin y evaluacin.
4. Descriptores de caracterizacin, rela-
cionados con las caractersticas de las
plantas que se emplean para describir
una accesin, los que comprenden los
atributos cualitativos, generalmente de
mediana a alta heredabilidad. 5. Descrip-
tores de evaluacin, los cuales cubren
atributos cuantitativos tales como rendi-
miento y otras caractersticas agronmi-
camente importantes (Gotor et al., 2008).
Muchos de los cultivos modernos han
sido seleccionados a partir de materiales
silvestres y variedades locales para suplir
las demandas de la alimentacin; por
ello, para asegurar la sostenibilidad agr-
cola y el consumo es esencial estudiar la
variabilidad de los conjuntos citados, lo
que permitir derivar atributos de valor
tales como resistencia a plagas y toleran-
cia a condiciones ambientales adversas
(Ohara y Simamoto, 2002). Lo anterior,
complementado con anlisis multivaria-
do, permite seleccionar genotipos y acce-
siones para conservacin y utilizacin
que tengan la mejor representacin de la
poblacin o coleccin de genes, con un
mnimo de prdida de diversidad genti-
ca (Crossa y Franco, 2004). Esto, adems
del conocimiento morfolgico, implica
determinar la variacin gentica, sobre lo
cual se ha afirmado (Vashney et al., 2008)
que la deteccin y caracterizacin de
diversidad heredable presente en colec-
ciones de germoplasma es importante
para programas de mejoramiento y para
la ampliacin de la base gentica de las
poblaciones incluidas para este fin.
Scarracia-Mugnozza y Perrino (2002)
anotaron que la investigacin en diversas
disciplinas cientficas, importantes para
los recursos genticos, ha permitido el
desarrollo de metodologas refinadas que
permiten a los genetistas y biotecnlo-
gos manejar sus programas con mayor
eficiencia. En conexin con lo anterior,
Brown y Hodgkin (2007) sealaron que
la era de la biologa molecular suminis-
tra herramientas nuevas y medios para
entender la diversidad gentica y sus
niveles fundamentales, lo que parte del
uso de marcadores moleculares, con desa-
rrollos recientes que brindan perspectivas
al respecto y nuevas formas de manejar
los recursos genticos vegetales, como
son los polimorfismos de nucletido sim-
ple (SNP), el anlisis filogentico y la
genmica funcional. Esta ltima permite
conocer la fraccin expresable del geno-
ma, o sea aquella que es funcionalmente
importante, para lo cual la tcnica de los
microarreglos ha brindado un procedi-
miento adecuado (Aharoni y Vorst, 2001;
Peackoc y Chaudhury, 2002).
Con relacin a los animales, Talle y
colaboradores (2005) informaron que la
conciencia sobre el valor de los recursos
genticos ha estimulado el estudio de la
diversidad heredable de razas locales, las
cuales pueden ser caracterizadas usan-
do informacin fenotpica y genotpica
para priorizar la conservacin y que la
variabilidad observada es influida por la
biologa y las circunstancias por las cuales
pasan los animales, incluyendo migra-
cin, tamao poblacional y seleccin.
Estos autores sealaron que la produc-
cin pecuaria depende de un complejo de
especies domesticadas, cuya diversidad
gentica es requerida para cumplir con las
necesidades de produccin en diversos
ambientes, con el fin de permitir el mejo-
ramiento gentico y facilitar la adaptacin
a cambios en los objetivos del mejoramien-
to. En este contexto, se ha sealado que la
sostenibilidad de la produccin pecuaria
depende de la diversidad de los animales
(Goldstein et al., 1999; Loftus et al., 1999),
y aaden Talle y colaboradores (2005)
que aun cuando una proporcin elevada
de las razas est en peligro de extincin,
los recursos para su conservacin son
an limitados, por lo cual las especies, en
26
general, y las razas, en particular, deben
ser caracterizadas para priorizar su valor
de conservacin.
La caracterizacin fenotpica ha sido
empleada tradicionalmente para la des-
cripcin de las razas, pero uno de los
desafos asociados con el proceso es la
combinacin de las medidas, con el fin
de brindar una herramienta til para su
descripcin; por ello, la clasificacin de
la diversidad de los animales, basada en
observaciones fenotpicas, se ha comple-
mentado con anlisis del genoma (Talle
et al., 2005). En este sentido, las primeras
determinaciones de la variacin genmica
se focalizaron en el anlisis de la variacin
de las protenas y el tipo sanguneo, usan-
do electroforesis o metodologas inmu-
nolgicas (Schltterer, 2004) con empleo
actual de nuevas tecnologas para esta
finalidad (Morin et al., 2004; Schltterer,
2004). Al respecto, Sancristbal y colabo-
radores (2006) indicaron que el empleo
de marcadores de ADN para evaluar la
diversidad heredable es un componente
importante para el manejo de los recursos
genticos animales.
Tambin se ha indicado (Piyasatian
y Kinghorn, 2003) que la conservacin
de los recursos genticos animales, con
relacin a su utilizacin, debe considerar
el tamao poblacional de los conjuntos
a mantener, lo cual podra conducir a
entrecruzamientos entre razas relacio-
nadas, para reducir la endogamia y los
riesgos de extincin de grupos locales.
Otro criterio es tomar en consideracin la
presencia de atributos de valor, particu-
larmente de aquellos relacionados con la
adaptacin a los ambientes en los cuales
se van a utilizar los animales (Piyasatian
y Kinghorn, 2003).
Con relacin a la utilizacin de los
microorganismos en los agroecosistemas,
se ha indicado que la biota del suelo
representa una porcin importante de la
diversidad biolgica, la que contribuye
significativamente al bienestar humano
por su papel en la produccin de bie-
nes y servicios que incluyen productos
agrcolas, regulacin del clima y cali-
dad del agua subterrnea (Brown et al.,
2007). Pese a lo anterior, existe un gran
desconocimiento sobre este conjunto de
especies y son generalmente ignoradas
en las evaluaciones cientficas de la bio-
diversidad y en el desarrollo de sistemas
productivos, lo cual es crtico por sus
nexos estrechos con los organismos que
se encuentran por encima de la superficie
del suelo, en especial las plantas. Por ello,
se ha anotado que el conocimiento y la
utilizacin de los microorganismos en
agroecosistemas es uno de los desafos
importantes en el siglo actual (Brown et
al., 2007). Para esto se han creado herra-
mientas modernas que permiten conocer
la variabilidad aprovechable de este con-
junto de especies, como la construccin
de libreras metagenmicas (Hao-Xing
et al., 2008). La investigacin reciente en
ecologa molecular ha demostrado que
la mayora de los microorganismos son
refractarios al cultivo y deben de conte-
ner un potencial de desarrollo ilimitado
de genes nuevos (Pace, 1997); por eso
la metagenmica brinda una alternativa
importante para investigar lo anterior
(Handelsman, 2004).
En el campo del conocimiento de la
variabilidad de microorganismos benfi-
cos asociados con plantas, Picard y Bosco
(2008) indicaron que se han estudiado
desde la ptica fenotpica y genotpica
diversas especies de ellos que colonizan
las races -brindando control de patge-
nos vegetales- llamados microorganis-
mos probiticos de las plantas (Haas y
Keel, 2003). Picard y Bosco (2008) agrega-
ron que tcnicas como RAPD o rep-PCR
son apropiadas para medir la diversidad
interespecfica y que la variabilidad geno-
tpica y fenotpica podra servir para su
asociacin con la localizacin geogrfica,
el clima, el tipo de suelo, el manejo de
ste y las interacciones con otros microor-
ganismos del suelo y plantas hospederas.
Este es un ejemplo de que procedimientos
complementarios pueden ayudar a la pro-
mocin de los microorganismos benficos
para los agroecosistemas, con base en su
identificacin y conocimiento.
Lozupone y Knight (2008) indicaron
que la medicin de la diversidad es
importante para comprender la estruc-
tura y la dinmica de las poblaciones -lo
cual es un desafo en el caso de los micro-
organismos- y que la caracterizacin de
comunidades de esta ndole mediante
el empleo de subunidades pequeas de
secuencias de genes rRNA (SSU RNA)
ha revelado una variabilidad amplia no
sospechada, la cual apenas comienza a
ser comprendida. Esto se ha potenciado
por el desarrollo de datos de secuencias
gnicas de 16 sRNA disponibles pblica-
mente (Margulies et al., 2005).
Tilman y colaboradores (1999), respec-
to a la racionalidad del empleo efectivo
de la diversidad en los agroecosistemas,
indicaron que sta es un componente de
los ecosistemas complejos, y desempea
funciones vitales en todo los niveles. Es
esencial la diversidad de microorganis-
mos, plantas y animales para el aumento
de la productividad vegetal y pecuaria,
con base en las demandas de alimen-
tos del futuro; la variabilidad gentica
adecuadamente empleada aumentar su
dependencia por parte de los sistemas de
produccin. Sealaron la importancia de
una serie de acciones que comprenden
el desarrollo del concepto de agrosis-
tema integral, el cual est relacionado
con todos los aspectos de la naturaleza,
la ampliacin de uso de la diversidad
agrcola, con sistemas de produccin
mltiples; el conocimiento adecuado de
la diversidad, con documentacin de los
resultados para promover una utilizacin
mxima de sta; la utilizacin de proce-
dimientos biotecnolgicos como apoyo
a procesos de mejoramiento animal y
vegetal; el empleo de la diversidad de
microorganismos benficos y la imple-
mentacin de sistemas de produccin
basados en uso amplio de la biodiversi-
dad. A esto se adiciona el conocimiento
de la oferta ambiental para unirlo a
la oferta de diversidad disponible, con
medicin de las interacciones entre stas
y el estudio de las interrelaciones entre
los componentes de la agrobiodiversidad
en los sistemas productivos.
CONCL US I ONE S
La agrobiodiversidad es un bien estratgi-
co de gran importancia para el desarrollo,
lo cual se magnifica en los pases megadi-
versos, como es el caso de Colombia.
La agrobiodiversidad en conservacin
debe ser caracterizada adecuadamente
para darle valor agregado y promover su
utilizacin en procesos productivos.
La utilizacin de la agrodiversidad
cobra gran importancia en el desarrollo
del nuevo paradigma de produccin sos-
tenible; es primordial integrar la oferta
27
ambiental con la oferta gentica y estu-
diar el manejo de los sistemas segn
enfoques de diversidad gentica amplia
y la interaccin entre los componentes de
la agrobiodiversidad.
Lo anterior implica privilegiar la esta-
bilidad (adaptabilidad especfica), con el
fin de garantizar rendimientos no fluc-
tuantes por localidad y el manejo de
agroecosistemas con diversidad gentica,
lo cual disminuye la vulnerabilidad ante
factores exgenos.
El empleo sostenible de la diversidad
debe vincularse a procesos biotecnolgi-
cos para hacerlo ms eficiente.
Es importante desarrollar una visin
integral de la agrobiodiversidad para el
manejo de agroecosistemas sostenibles.
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Erika Snchez-Betancourt
1
,
Vctor Manuel Nez Zarantes
2
Evaluation of SCAR molecular markers
to determine sex in papaya plants
(Carica papaya L.)
AB S T RACT
In this study the molecular markers SCAR-
SDSP, SCAR T1 and W11 -reported as sex
discriminators at seedling level-, were used
to validate the effectiveness in flowered
plants in the field. SCAR-SDSP amplified a
band of 369 bp in male and hermaphrodite
plants which allows corroborate the results
obtained with this marker, developed at
Corpoica using Colombian genotypes, in a
previous study. With the use of the SCAR
T1 and W11 markers combined in one
reaction, it was possible to differentiate
female and hermaphrodite plants. When
the sex prediction was done with a blind
sample using two months-old plantlets,
from commercial seeds, a ratio of 1:1
female:hermaphrodite was observed,
according to the segregation pattern of a
cross between these two types of plants. The
amplification with the SCAR W11 generated
a band of 800 bp in male and hermaphrodite
plants, independently of the samples place
of origin. However, when this band was
sequenced and analyzed with the BLAST
program, the analysis showed 98% identity
between male and hermaphrodite sequence.
Keywords: Plant sexual organs, DNA sequence,
seedlings, sex determination, economic
importance.
Evaluacin de marcadores moleculares tipo
SCAR para determinar sexo en plantas de papaya
(Carica papaya L.)
RE S UME N
En este estudio se emplearon los marcadores moleculares SCAR-SDSP, SCAR T1 y W11,
registrados como secuencias especficas, para discriminar el sexo en las plntulas de papa-
ya y validar su efectividad en plantas florecidas en campo. El SCAR-SDSP amplific una
banda de 369 pares de bases en plantas machos y hermafroditas, lo que permiti corroborar
los resultados obtenidos con este marcador, desarrollado en Corpoica en un estudio anterior
que utiliz genotipos colombianos. Con el uso de los marcadores SCAR T1 y W11 combi-
nados en una sola reaccin, se diferenci el sexo de plantas hembras y hermafroditas. En la
prediccin de sexos, en una muestra ciega utilizando plntulas de dos meses de edad deri-
vadas de semilla comercial, se observ una proporcin de 1:1 de hembras:hermafroditas,
lo esperado segn el patrn de segregacin en un cruce entre estos dos tipos de plantas.
La amplificacin con el marcador SCAR W11 gener una banda de 800 pares de bases
en plantas machos y hermafroditas, independientemente del lugar de procedencia de la
muestra. Sin embargo, cuando esta banda se secuenci y analiz con el programa BLAST
mostr identidad de 98% entre las secuencias de machos y hermafroditas.
Palabras clave: rganos sexuales de las plantas, secuencia de ADN, plntula, determina-
cin de sexo, importancia econmica.
1
Investigadora profesional, Laboratorio de Gentica
Molecular Vegetal, Centro de Biotecnologa y
Bioindustria, Corpoica, C.I. Tibaitat, Mosquera.
esbetancourt@corpoica.org.co
2
Investigador principal, Laboratorio de Gentica
Molecular Vegetal, Centro de Biotecnologa y
Bioindustria, Corpoica, C.I. Tibaitat, Mosquera.
vnunez@corpoica.org.co
I NT RODUCCI N
La papaya (Carica papaya L.) es la espe-
cie del gnero Carica econmicamente
ms importante de la familia Caricaceae.
Esta planta es nativa de Centroamrica
y de la costa occidental suramericana,
principalmente de los valles hmedos
de la cordillera andina. Crece en condi-
ciones clidas con abundante lluvia o
irrigacin, en un rango de altitud desde
el nivel del mar hasta 1600 m. Los frutos
de la papaya tienen gran aceptacin en
los mercados nacionales e internacionales
(Reyes, 2003).
Esta fruta es una especie polgama
que presenta tres tipos sexuales: plantas
estaminadas o masculinas, pistiladas o
femeninas y bisexuales o hermafroditas
(Malo y Campbell, 1994). Genticamente,
la expresin del sexo es controlada por
un solo gen con tres alelos, los cuales
exhiben efecto pleiotrpico. El genotipo
sexual fue designado como M para plan-
tas masculinas, M
H
para hermafroditas y
m para femeninas. Todas las combinacio-
nes de alelos dominantes, tales como MM,
M
H
M
H
y M
H
M son letales, por lo tanto,
los machos y hermafroditas son hetero-
cigotos obligados. En consecuencia, los
genotipos viables son Mm para plantas
masculinas, M
H
m para hermafroditas y
mm para femeninas (Storey, 1953).
Debido al estado polgamo de la papa-
ya, el conocimiento del sexo de la misma
es una herramienta para apoyar al agri-
cultor, no slo para la obtencin de la
semilla, sino tambin para el manejo del
cultivo. En casos en que es necesario el
uso de plantas macho, deben distribuir-
se, en relacin con las hembras, adecua-
damente para asegurar la polinizacin.
Hasta ahora, la determinacin del sexo no
es posible antes de que la planta alcance
el estado de floracin, que ocurre cinco
a ocho meses despus de la siembra de
la semilla, ya que no existen diferencias
embriolgicas ni morfolgicas entre los
tres tipos sexuales en etapas tempranas
antes de la prefloracin (Rojas, Ramos y
Salazar, 1985). Por lo tanto, la diferencia-
cin sexual se ha convertido en una limi-
tante para el cultivador de papaya puesto
que implica costos adicionales y dificulta-
des en la planeacin del cultivo, especial-
mente en plantaciones donde se requiere
solamente plantas hermafroditas.
La semilla utilizada para plantaciones
comerciales segrega en una proporcin
de 1:1 hembras y hermafroditas. Las plan-
tas hembras producen frutas redondas,
mientras que las hermafroditas producen
frutas alargadas. Estas frutas alargadas
son preferidas por los comercializado-
res debido a la mayor facilidad para el
32
Evaluacin de marcadores moleculares tipo SCAR para determinar sexo en plantas de papaya (Carica papaya L.)
empaque. Es deseable y muy importante
seleccionar plantas de sexo hermafrodita
para obtener plantaciones de frutas alar-
gadas en mayor proporcin. Por lo tanto,
la determinacin del sexo de las plntulas
antes de llevarlas a campo definitivo sera
una ganancia considerable en tiempo,
espacio y dinero para el productor. Una
vez conocido el sexo, el agricultor deter-
mina con qu plantas obtendr mayo-
res rendimientos y podr sembrarlas de
acuerdo con las exigencias del mercado
(Acosta y Len, 2003).
Por otro lado, la naturaleza dioica, la
reversin ocasional del sexo de las flores
masculinas y hermafroditas junto con la
ausencia de un par heteromrfico de cro-
mosomas sexuales hacen de las plantas
de papaya un sistema interesante para
estudiar la diferenciacin sexual desde
el punto de vista molecular (Magdalita
y Mercado, 2003; Snchez y Medina,
2003). Estas tcnicas permiten una iden-
tificacin rpida y confiable, son cmo-
das y algunas no requieren del conoci-
miento previo sobre la secuencia que
se amplifica. Para diferenciar el sexo en
papaya se han desarrollado marcadores
moleculares tipo secuencias caracteriza-
das de regiones amplificadas (sequence
characterized amplified regin SCAR-)
(Deputy et al., 2002; Urasaki et al., 2002;
Magdalita y Mercado, 2003; Chaves y
Nez, 2007). En Colombia, Chaves y
Nez (2007) desarrollaron el marca-
dor SCAR-SDSP y en la Universidad de
Hawai se desarrollaron los marcadores
SCAR T1 y W11. Con el SCAR-SDSP se
amplifica un fragmento de 369 pares de
bases (pb) en plantas machos y herma-
froditas, lo que permite diferenciar estos
dos tipos sexuales de las hembras. Con
los marcadores SCAR T1 y W11, Magda-
lita y Mercado (2003) diferenciaron los
tres tipos sexuales en papaya, al ampli-
ficar dos bandas -una de 1300 pb y otra
de 800 pb- en plantas hermafroditas; una
banda de 1300 pb en plantas hembras; y
en machos, ausencia de banda.
Comercialmente se busca la diferen-
ciacin de sexo entre plantas hembras y
hermafroditas, por lo tanto, la presente
investigacin se hizo con el fin de evaluar
marcadores moleculares tipo SCAR para
determinar el sexo en plantas de papaya
(Carica papaya L.), para establecer una
metodologa rpida que permita brindar
asesora a los productores mediante el
sexaje de plntulas de vivero.
La investigacin se llev a cabo en el labo-
ratorio de Gentica Molecular Vegetal del
Centro de Biotecnologa y Bioindustria
(CBB), de la Corporacin Colombiana
de Investigacin Agropecuaria (Corpoica-
Tibaitat), ubicada en el municipio de
Mosquera, Cundinamarca.
Material biolgico
En total se usaron 52 muestras de papaya
(Carica papaya L.), de las cuales 24 fueron
plantas florecidas (tabla 1) y 28 plntulas
sin florecer. Adems, se incluyeron ocho
accesiones correspondientes a tres espe-
cies de papayuela (Vasconcella spp.) para
validar la especificidad de los marcado-
res SCAR empleados en este estudio con
relacin a la especie Carica papaya, puesto
que el gnero Vasconcella pertenece a la
Tabla 1. Material vegetal usado en el estudio
Especie No. accesin No. individuo Sexo* Procedencia Genotipo
C. papaya 299 H C.I. La Libertad ILS
C. papaya 655 He C.I. La Libertad ILS
C. papaya P1 He Armenia Comercial
C. papaya P2 M Armenia Comercial
C. papaya P3 H Armenia Comercial
C. papaya 1NAT M El Espinal Comercial
C. papaya 2NAT He El Espinal Comercial
C. papaya 3NAT H El Espinal Comercial
C. papaya 4NAT H El Espinal Comercial
C. papaya 5NAT M El Espinal Comercial
C. papaya 6NAT He El Espinal Comercial
C. papaya 1SM M C.I. Caribia Zapote
C. papaya 2SM H C.I. Caribia Zapote
C. papaya 3SM He C.I. Caribia Zapote
C. papaya 4SM H C.I. Caribia Zapote
C. papaya 5SM He C.I. Caribia Zapote
Papayuela
V. goudotiana 501005 H C.I. La Selva
V. goudotiana 501005 M C.I. La Selva
V. cauliflora 501033 H C.I. La Selva
V. cauliflora 501036 H C.I. La Selva
V. pubescens 501038 M C.I. La Selva
V. pubescens 501038 H C.I. La Selva
V. cauliflora 501045 M C.I. La Selva
V. goudotiana 501047 H C.I. La Selva
*Se emplea H para designar a hembras, He para hermafroditas y M para machos.
33
familia Caricaceae de la cual hace parte
el gnero Carica.
Extraccin de ADN
El ADN total se aisl a partir de hojas
jvenes de plantas machos, hembras y her-
mafroditas, siguiendo el protocolo descrito
por Rocha (2002). La calidad del ADN se
verific en geles de agarosa al 1%, teidos
con bromuro de etidio a 0,1 g/mL usando
el software Gene-snap. La concentracin
del ADN se determin por cuantificacin
a partir de marcador de masa (High DNA
Mass Ladder (Invitrogen), usando el soft-
ware Gene-tool. Este programa compara
el patrn de bandas generado y la banda
obtenida por cada muestra y da un esti-
mativo de la concentracin obtenida a 260
nm. Igualmente, se utiliz el espectrofot-
metro UV 260/280 (Beckman Du530) para
corroborar la concentracin y determinar
la pureza de la muestra.
Amplificacin de ADN
Tanto las muestras de papaya como las de
papayuela se amplificaron con el marca-
dor SCAR-SDSP (Fw 5-AAACTACCGT-
GCCATTATCA-3 y Rv 5-TCTCTACCCA-
ACACAGTGAC-3) reportado por Chaves
y Nez (2007) y los marcadores SCAR T1
(Fw 5-TGCTCTTGATATGCTCTCTG-3 y
Rv 5-TACCTTCGCTCACCTCTGCA -3) y
W11 (Fw 5-CTGATGCGTGTGTGGCTC-
TA -3 y Rv 5-CTGATGCGTGATCATC-
TACT-3) reportados por Magdalita y Mer-
cado (2003). Con los marcadores SCAR T1
y W11 se realiz una PCR mltiplex y una
PCR usando cada marcador por separado.
Las condiciones de amplificacin se opti-
mizaron para un volumen final de 20 L
de acuerdo con lo reportado por Chaves
y Nez (2007) para el SCAR-SDSP y
Magdalita y Mercado (2003) para el SCAR
T1 y W11. La amplificacin se realiz en
un termociclador PTC-100 (MJ Research,
Inc). Los productos de PCR se visualiza-
ron en geles de agarosa al 1% teidos con
bromuro de etidio (0,1 g/mL). El peso de
las bandas se determin utilizando como
patrn el marcador 100 pb (Promega).
Limpieza y secuenciacin de las bandas
generadas con los marcadores SCAR T1
Y W11
En plantas machos y hermafroditas se
observ el mismo producto de amplifica-
cin; en consecuencia, con el propsito de
dilucidar si estas bandas correspondan a
secuencias diferentes, se escogieron alea-
toriamente, por lugar de procedencia, dos
individuos machos y cuatro hermafrodi-
tas de los genotipos zapote, ILS y papaya
comercial, para determinar la secuencia
de la banda de 800 pb. Estos productos
amplificados se secuenciaron automti-
camente con el software de secuenciacin
ABI Big Dye TM Terminator de Macrogen
(Corea), utilizando los cebadores T1 y
W11. La limpieza y purificacin de las
bandas se hizo con el kit Wizard SV Gel
and PCR Clean-up system. Las secuen-
cias se analizaron usando el programa
BLAST (Altschul et al., 1990) y se realiz
un alineamiento mltiple usando Clusta-
lW. Luego se hizo una comparacin para
determinar homologa con las secuencias
existentes en el GeneBank.
Para evaluar la eficiencia de los mar-
cadores moleculares en la discrimina-
cin sexual, se usaron en total 52 mues-
tras vegetales provenientes de cultivos
comerciales. El nmero de muestras por
cada lugar fue variable, de acuerdo con
el material disponible en campo en el
momento de la recoleccin. Al igual que
en este estudio, otras investigaciones
en las que se emple este tipo de mar-
cadores, utilizaron un tamao variable
de muestra. Por ejemplo, Mandolino y
colaboradores (1999) trabajaron con 167
plantas que corresponden a siete culti-
vares; Urasaki y colaboradores (2002)
usaron 11 cultivares, con un total de
45 individuos; Deputy y colaboradores
(2002) usaron en conjunto ADN de 25
individuos por sexo; Magdalita y Mer-
cado (2003) utilizaron 95 individuos en
tres cultivares; Xu, Wang y Cui (2004)
manejaron 10 individuos por cada sexo,
y Chaves y Nez (2007) utilizaron, de
tres cultivares, en total siete individuos.
Con los marcadores SCAR evaluados
no se obtuvo amplificacin de ADN en
las especies de papayuela. Teniendo en
cuenta que las papayuelas pertenecen
a un gnero diferente (Vasconcella), este
resultado se podra explicar como la
falta de especificidad de los cebadores
en esta especie. Lo cual quiere decir
que los SCAR utilizados en este estudio
son altamente especficos para la especie
papaya, puesto que, adems de contener
20 nucletidos, fueron diseados a partir
de secuencias amplificadas en papaya.
Por ende, y de acuerdo con Paran y Mil-
chelmore (1993), es muy baja la posibili-
dad que estos marcadores amplificaran
una secuencia homloga en algn ADN
diferente al de papaya.
Al amplificar con el marcador SCAR-
SDSP, en las muestras de papaya se obser-
varon bandas de aproximadamente 369
pb en machos y hermafroditas y ausencia
de bandas en hembras, lo cual concuerda
con los resultados obtenidos por Cha-
ves y Nez (2007). En ese estudio, el
SCAR-SDSP genera una banda comn
para machos y hermafroditas (figura 1).
Debido a que este marcador fue desarro-
llado a partir de genotipos colombianos y
el material de este estudio tiene la misma
procedencia, se esperaban estos resulta-
dos, lo cual confirma la validez del SCAR
desarrollado por Chaves y Nez (2007).
Con los marcadores SCAR T1 y W11 se
observaron resultados diferentes, depen-
diendo de si se usaban separados o en
combinacin. En plantas machos y her-
mafroditas, con el SCAR T1 se amplific
una banda de 1300 pb, mientras que con
el SCAR W11, una banda de 800 pb. Con
los cebadores T1 y W11 combinados (PCR
mltiplex) tambin se observaron las mis-
mas bandas en plantas machos y herma-
froditas. En las plantas hembras, machos
y hermafroditas, T1 amplific un produc-
to de 1300 pb, mientras W11 no amplific
ningn producto en las hembras, y la
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se observan las bandas amplificadas en machos y
hermafroditas con el marcador SCAR-SDSP. El nmero sobre cada banda corresponde a la accesin
o al individuo y el respectivo sexo (H para hembras, He para hermafroditas y M para machos)
34
combinacin de los dos cebadores (ml-
tiplex) amplific slo una banda de 1300
pb en hembras (figura 2). De acuerdo con
estos resultados, al realizar la PCR mlti-
plex, se pueden discriminar las plntulas
hembras de las plntulas machos y her-
mafroditas (figura 2). Teniendo en cuenta
que slo se comercializan plantas herma-
froditas y hembras, el uso de este marca-
dor es muy til, pues permite diferenciar
claramente estos dos tipos sexuales. Con
el SCAR-SDSP slo se pueden identifi-
car, por presencia de bandas, las plantas
hermafroditas puesto que hay ausencia
de bandas en las hembras. Para el caso
de programas de mejoramiento gentico,
sera deseable diferenciar plantas herma-
froditas de machos, especialmente si se
encuentran plantas machos tolerantes a
factores biticos o abiticos, y se quisiera
introducir esta caracterstica en plantas
hermafroditas comerciales.
Los resultados antes mencionados no
concuerdan con los obtenidos por Mag-
dalita y Mercado (2003). En ese estudio se
logr la diferenciacin sexual al obtener
dos bandas en las plantas hermafroditas,
una banda para hembras y ausencia de
bandas en machos. La diferencia en los
resultados utilizando los mismos marca-
dores se podra explicar por la variabili-
dad gentica molecular de los genotipos
de papaya. Esta variabilidad se ha deter-
minado en poblaciones de papaya anali-
zadas con marcadores AFLP (Kim et al.,
2002) y es an ms evidente, como en este
caso, cuando se trata de genotipos de dife-
rentes continentes. Magdalita y Mercado
(2003) utilizaron la variedad hawaiana,
la cual no responde de la misma manera
que otras variedades de papaya, cuando
se emplean marcadores SCAR (Deputy et
al., 2002; Kim et al., 2002; Chaves y Nez,
2007). Kim y colaboradores (2002) atribu-
yen este comportamiento a la gran diver-
sidad gentica de estas plantas producto
de los cruces ocasionales que se presentan
en el campo. Las diferencias en los resul-
tados de la amplificacin de genotipos de
diferentes procedencia han sido observa-
das en trabajos previos (Chaves-Bedoya y
Nez, 2007, Oliveira et al., 2008).
Ya que el marcador SCAR T1 ampli-
fica un producto en todas las plantas de
papaya, independientemente del sexo,
este resultado sera til como un control
positivo de amplificacin para analizar
diferentes genotipos dentro de la especie
y evaluar la calidad de ADN de indivi-
duos de un mismo genotipo. En el presen-
te estudio este marcador se utiliz para
predecir el sexo e identificar las plntulas
hermafroditas. De las 28 muestras corres-
pondientes a la muestra ciega -plantas
comerciales de 2 meses de edad- analiza-
da con los marcadores SCAR T1 y W11,
se identificaron 12 plantas hembras y 16
hermafroditas. En plantaciones comer-
ciales, la presencia de plantas hembras
y hermafroditas tiene una proporcin de
1:1, de acuerdo con el patrn de segrega-
cin esperado, lo cual concuerda con los
resultados mencionados.
Deputy y colaboradores (2002) cons-
truyeron un mapa gentico empleando
marcadores SCAR donde incluyen el mar-
cador W11. En este mapa el marcador
W11 ha sido ubicado en el cromosoma
Y, ligado al locus Sex1 a una distancia de
0,3 cM. Segn Liu y colaboradores (2004),
las plantas machos y hermafroditas lle-
van un cromosoma Y donde se ubica el
locus de determinacin sexual Sex1. Esto
explicara el resultado de amplificacin
obtenido con este marcador en los dos
tipos sexuales.
Anlisis de secuencias
Debido a que no fue posible diferenciar
plantas machos y hermafroditas, por el
tamao de las bandas con los marcado-
res utilizados, se decidi hacer un an-
lisis comparativo de la secuencia de la
banda presente en estos dos tipos sexua-
les amplificada con el marcador SCAR
W11. Al realizar el alineamiento por
ClustalW con las secuencias obtenidas a
partir de este marcador se encontr una
identidad de 98% entre las secuencias de
plantas hermafroditas y plantas machos,
procedentes de diferentes lugares. El 2%
restante de las secuencias corresponde
a polimorfismos de una base, los cuales
fueron corroboradas con el cromatogra-
ma para descartar la posibilidad de poli-
morfismos errneos al ser transferidos
al formato Fasta. Asimismo, el BLASTn
confirm que el producto secuenciado
pertenece a la especie Carica papaya L.,
derivada de la amplificacin del ADN
genmico. Esta secuencia posiblemente
se ubica en el cromosoma Y; adems, es
una secuencia especfica para machos y
hermafroditas. En la base de datos del
GeneBank se han registrado seis secuen-
cias con variaciones de un nucletido,
accesiones FJ011100, FJ011101, FJ011102,
FJ011103, FJ011104 y FJ011105. Estas
secuencias presentaron un valor e de
0 con trabajos previos en Carica papa-
ya realizados por Ko y colaboradores
(sin publicar) accesin AY849325, Liu y
colaboradores (2004) accesin AY428939
y Yu y colaboradores (2007) accesin
EF661024. No se encontr una secuencia
con un valor e inferior a 1e
-10
con prote-
nas reportadas en plantas.
En papaya se describi un cromosoma
Y de tipo homomrfico sobre el cual se
ubica el marcador W11 (Deputy et al.,
2002; Liu et al., 2004). Debido a la gran
similitud encontrada entre la secuencia de
machos y hermafroditas como producto
de la amplificacin con este marcador,
y a su ubicacin sobre el cromosoma Y,
adems de la regulacin del desarrollo
floral, se podra pensar que el sistema de
determinacin del sexo estara influencia-
do por factores de transcripcin.
Un factor de transcripcin es una pro-
tena que despus de ser estimulada por
seales citoplasmticas, tiene la capaci-
dad de regular la expresin gnica en el
ncleo celular que acta reconociendo
sitios en el ADN, a otro factor o a la ARN
polimerasa (Celada, 1991). Al respecto,
Sondur, Manshardt y Stiles (1996) sugi-
Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa al 1%. Visualizacin de las bandas correspondientes
a las plantas machos, hermafroditas y hembras amplificadas con los marcadores T1, W11 y en
combinacin de los dos cebadores (T1/W11)
35
rieron un modelo de tipo sexual basado
en alelos alternos de un gen que codifican
este tipo de factores. Proponen que el
alelo masculino del gen sexual, designado
Sex1-M, codifica un factor de transcrip-
cin que induce el desarrollo de partes
florales masculinas a la vez que inhibe el
desarrollo de los carpelos. El alelo herma-
frodita Sex1-H es intermedio, pues indu-
ce las estructuras masculinas -pero slo
reduce el tamao del carpelo- mientras
los carpelos funcionales estaran en las
plantas Sex1-H/sex1-f. El alelo Sex1-f sera
incapaz de inducir estructuras masculinas
y podra ser un alelo nulo.
Se explica que los sexos de papaya,
adems de diferir en la funcionalidad
del androceo y el gineceo, tienen varias
caractersticas sexuales secundarias que
cosegregan de manera diferente. Entre
ellas estn la forma, el grado de la fusin
de la corola, el nmero de flor y longitud
de pednculo. Esto permite formular la
hiptesis de que el sexo en la papaya
es controlado por mltiples genes liga-
dos estrechamente; es decir, las formas
allicas que constituyen los segmentos
diferenciales del cromosoma. Incluido
en esta hiptesis est un supresor de
recombinacin asociado con esta regin
cromosmica que mantiene todos estos
genes ligados como una simple unidad
hereditaria (Sondur et al., 1996).
Por lo anterior, se puede deducir que
los marcadores empleados en el presente
estudio no amplifican los diferentes alelos
involucrados en la determinacin sexual.
En consecuencia se podra pensar que sta
sera una razn para que no se lograra
discriminar entre el tipo sexual macho y
hermafrodita. Es posible que existan otros
factores que intervienen en la formacin
del conjunto de partes de las flores y en la
formacin de rganos sexuales como son
los mecanismos epigenticos, especial-
mente la metilacin del ADN (Negrutiu
et al., 2001; Vyskot y Hobza, 2004). Con
base en lo anterior, el entendimiento de
la determinacin sexual es un proceso
complejo. Por lo tanto, es posible que
adems de marcadores moleculares que
permiten reconocer sitios especficos en
los cromosomas, sea necesario el uso de
otros mtodos para determinar y evaluar
la expresin de los genes involucrados en
la determinacin del sexo en diferentes
estados de desarrollo de planta.
Perspectivas de este estudio
Los resultados de este estudio, utilizando
los marcadores SCAR T1 y W11 combina-
dos, permitieron diferenciar plantas hem-
bras de plantas machos y hermafroditas.
Desde el punto de vista comercial, estos
marcadores son tiles para este propsi-
to. Los resultados obtenidos consisten en
un patrn molecular de bandas de ADN,
caracterstico para las plantas hembras, lo
cual se muestra en la tabla 2; puesto que
las combinaciones homocigotas dominan-
tes producen cigotos letales fueron omiti-
das de esta tabla. El patrn observado es
equivalente a las proporciones de segre-
gacin mostradas por Storey (1953), de los
posibles cruces que se pueden realizar en
las plantas de papaya.
Los resultados obtenidos con los marca-
dores SCAR T1 y W11 constituyen la base
para el diseo de una metodologa rpida
que permita la identificacin del sexo en
plntulas de papaya, de dos semanas de
edad, en genotipos comerciales utilizados
en Colombia. Adems, para programas de
mejoramiento gentico, esta metodologa
permitir seleccionar plantas machos y
hembras, en el caso de los genotipos dioi-
cos, a muy temprana edad, que presenten
caractersticas de resistencia a determina-
das enfermedades y plagas para ser usadas
en programas de cruzamientos.
En resumen, este trabajo abre las puertas
para el diseo de una estrategia prctica
de identificacin de sexos en papaya de
aplicacin comercial. La metodologa con-
sistira en tomar muestras pequeas de
hojas, en forma de disco, cuando la planta
tenga de tres a cuatro hojas, transferir el
disco a un tubo eppendorf, agregar bfer
de extraccin, centrifugar y almacenar en
hielo (Kasajima et al., 2004). El extracto sera
utilizado para preparar la reaccin de PCR
directamente y de esta forma se podran
analizar unas 100 plantas por da por perso-
na. Este es el segundo trabajo que se hace en
Colombia en relacin con la identificacin
de sexos en papaya y el primero con poten-
cial de aplicacin comercial.
CONCL US I ONE S
Al usar los marcadores SCAR T1 y W11
en una PCR mltiplex se logr diferen-
ciar hembras de hermafroditas con una
muestra de plantas provenientes de semi-
lla comercial. Adems, se comprob que
estos marcadores son especficos para
Carica papaya L., puesto que no amplifica-
ron en especies relacionadas como las del
gnero Vasconcella.
Debido a que no se logr la diferen-
ciacin entre macho y hermafrodita para
las variedades en estudio, se conside-
ra como desventaja para programas de
mejoramiento gentico, en el caso que los
machos tengan caractersticas deseables.
Por ltimo, no se observ variabilidad
entre plantas machos y plantas hermafro-
ditas, en las secuencias amplificadas con
el marcador W11.
AGRADE CI MI E NT OS
Los autores expresan sus agradeci-
mientos a Corpoica y al Ministerio de
Tabla 2. Patrn molecular de bandas obtenido al realizar una PCR mltiplex con los marcadores T1
y W11 en los diferentes cruces de plantas de papaya (adaptado de Storey, 1953)
Cruce* Genotipo
Proporcin de segregacin
Macho Hembra Hermafrodita
H X M mm X Mm
H X He mm X MHm
He autofecundado y He X He MHm X MHm
He X M y M X He MHm X Mm
* H: alelos para hembras; M: alelos para macho, MH: alelos para hermafrodita.
36
Agricultura y Desarrollo Rural por el
apoyo para la realizacin de esta investi-
gacin. Adems, a la investigadora Clara
Medina (C.I. La Selva) por facilitar las
muestras de papayuela; a los investiga-
dores Gilberto Gmez (C.I. Caribia) y
Buenaventura Monje (C.I. Nataima) por
proporcionar muestras de papaya, y a
Ivn Ochoa y Laura Arango (C.I. La Liber-
tad) por suministrar muestras de papaya
del banco de germoplasma.
RE F E RE NCI AS
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ngela Liliana Rivera Caldern
1
, Ral Ivn
Valbuena Benavides
2
, Rigoberto Hidalgo
Hidalgo
3
, Jos Dlmer Moreno Mendoza
4
Cryoconservation of buds of potatos
microtubers Solanum tuberosum ssp.
andigena by means of drying tissues
AB S T RACT
At the Corporacin de Investigacin
Agropecuaria Corpoica, C.I. Tibaitat, the
cryoconservation of microtubers buds was
evaluated in two potato accessions of Solanum
tuberosum ssp. andigena, C.C.C. 4318 (carriza)
and C.C.C. 4981 (guata negra), from the
Colombian Central Collection by using the
dried bud methodology. This methodology
had two steps, the preliminary one or
adjustment and the main one. In the main
step, the tissue drying was made with sterile
air flow for 30 minutes, cryoconservation
in liquid nitrogen at -196C during 1 day,
water bath thawing at 37C for 3 minutes and
recuperation culture medium (100% MS +
8% sucrose + 2 g/L activated charcoal) during
7 days in dark, then the cultured medium
was changed (100% MS + 0.04 mg/L kinetin
+ 0.1mg/L gibberellic acid). A completely
randomized experimental design with 2
accessions, 4 treatments, 10 replications and 10
buds, was used. The survival was evaluated
at 7, 14 and 30 days. At the same time, the
tetrazolium test on seeds was adapted at 0.5%
a 25C for 24 hours, and evaluated after 14
and 30 days. In this bioassay, the survival
evaluation of the buds was difficult possibly
due to the effect of culture medium and
environmental factors. The final result was
loss of survival at 30 days, probably because
the recovery conditions were not suitable.
Keywords: Cryopreservation, germplasm
conservation, survival, tissue drying, liquid
nitrogen.
Crioconservacin de yemas de microtubrculos de
papa Solanum tuberosum ssp. andigena mediante
desecado de tejidos
*
RE S UME N
En la Corporacin de Investigacin Agropecuaria Corpoica, C.I. Tibaitat, se evalu la crio-
conservacin de yemas de microtubrculos en dos accesiones de papa Solanum tuberosum
ssp. andigena de la Coleccin Central Colombiana: C.C.C. 4318 (carriza) y C.C.C. 4981 (guata
negra) mediante la metodologa del desecado de yemas. Esta metodologa tuvo dos etapas:
la preliminar o de ajuste y la principal. En la principal, el secado se hizo con flujo de aire
estril durante 30 minutos, crioconservacin en nitrgeno lquido a -196C durante un da,
descongelamiento en bao mara a 37C durante 3 minutos y recuperacin en medio de cul-
tivo (100% MS + 8% sacarosa + 2 g/L carbn activado) durante siete das en oscuridad; luego,
el medio de cultivo se cambi (100% MS + 0,04 mg/L kinetina + 0,1mg/L cido giberlico). El
diseo experimental fue al azar: dos accesiones, cuatro tratamientos, diez repeticiones y diez
yemas. Se evalu sobrevivencia a 7, 14 y 30 das. Paralelamente se adapt la prueba de tetra-
zolio en semillas al 0,5% a 25C durante 24 horas, y se evalu a los 14 y 30 das; en esta prueba
se dificult la evaluacin de la sobrevivencia de las yemas posiblemente por efecto del medio
de cultivo y los factores ambientales; el resultado final fue prdida de sobrevivencia a los 30
das, posiblemente porque las condiciones de recuperacin no fueron aptas.
Palabras clave: criopreservacin, conservacin de germoplasma, sobrevivencia, secado
de tejidos, nitrgeno lquido.
1
Ing. Agr., estudiante de Maestra en Ciencias con
nfasis en Recursos Fitogenticos Neotropicales.
Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira.
anliriverac@palmira.unal.edu.co
2
Ing. Agr. M.Sc. Corpoica, Tibaitat.
i.valbuena@corpoica.org.co
3
Ing. Agr. M.Sc. Universidad Nacional de Colombia,
sede Palmira. rhidalgoh@palmira.unal.edu.co
4
Ing. Agr. Ph.D Corpoica, Tibaitat.
jdmoreno@corpoica.org.co
* Artculo derivado de la tesis de Maestra en
Ciencias con nfasis en Recursos Fitogenticos
Neotropicales de la primera autora.
Radicado: 4 de agosto de 2008
I NT RODUCCI N
Los recursos fitogenticos estn sien-
do afectados por diferentes factores que
han provocado su erosin gentica, por
lo cual han presentado una reduccin
continua en la variabilidad de los genes
disponibles para su utilizacin en el mejo-
ramiento gentico. Con el objeto de con-
tribuir a reducir este proceso, se han
implementado estrategias de conserva-
cin de germoplasma ex situ que preten-
den mantener y preservar la variabilidad
original de las poblaciones con la menor
prdida de informacin gentica posible.
La papa es uno de los cultivos con
mayor diversidad gentica. Esta diversi-
dad est concentrada en la zona Andina
de Amrica de Sur, y se encuentra amplia-
mente distribuida (Hijmans et al., 2002
citados por Bonierbale et al., 2004). La papa
cultivada en la zona Andina pertenece a un
conjunto de especies diploides (S. ajanhuiri
Juz. et Buk., S. phureja Juz. et Buk., S. ste-
notomun Juz. et Buk), triploides (S. chaucha
Juz. et Buk., S. juzepzuckii Buk.), tetraploi-
des (S. tuberosum ssp. andigena Hawkes)
y pentaploides (S. curtilobum Juz. et Buk.);
por su parte, la papa cultivada en la regin
litoral del sur de Chile pertenece a la espe-
cie tetraploide S. tuberosum ssp. tuberosum.
Estos grupos cultivados, sin embargo, no
son reconocidos por ciertos investigado-
res como ocho especies independientes,
sino como unas pocas o una sola especie
(Dodds, 1962; Huamn y Spooner, 2004
citados por Bonierbale et al., 2004). S. ste-
notomum es probablemente el grupo ms
primitivo, mientras que S. tuberosum ssp.
andigena predomina como la papa cultiva-
da ms importante en los Andes (Bonier-
bale et al., 2004).
El Programa Nacional de Recursos
Genticos y Biotecnologa Vegetal de la
Corporacin Colombiana de Investiga-
cin Agropecuaria (Corpoica, C.I. Tibai-
tat, Mosquera, Cundinamarca), la cual
es la segunda coleccin de este cultivo en
cuanto a variabilidad gentica (13%) des-
pus del Centro Internacional de la Papa
(CIP) (20%) (FAO, 1996).
En la actualidad, la Coleccin Central
Colombiana de papa (C.C.C.) posee 2985
accesiones de variedades cultivadas
y silvestres de papa. Consta de 1607
accesiones conservadas en condiciones
de campo, 2062 en cava fra (temperatura
entre 0 y 5C) y 818 en condiciones in
vitro (algunas de las accesiones presentan
duplicados en dos o tres sistemas) en el
Centro de Investigacin de Tibaitat. Las
anteriores se han clasificado de acuerdo
38
Crioconservacin de yemas de microtubrculos de papa Solanum tuberosum ssp. andigena mediante desecado de tejidos
con el tipo de material (variedades de
agricultor, introducciones, especies
silvestres, variedades sustituidas, etc.).
Dentro de estas colecciones se encuentran
diferentes especies y/o subespecies como
Solanum tuberosum subespecie andigena,
Solanum tuberosum subespecie tuberosum
(papa de ao o guatas), Solanum phureja
(papa criolla o chauchas), Solanum chaucha
(papa amarilla) y especies silvestres
(Solanum colombianum, Solanum estradae),
entre otras (Cern et al., 2005).
El tipo de material conservado en los
tres sistemas (campo, in vitro y cava fra) se
refiere a material silvestre y cultivares del
agricultor procedentes de diferentes par-
tes del pas, en especial de Nario, Cauca,
Boyac, Cundinamarca, Santander, Norte
de Santander, Caldas, Quindo y Magda-
lena e introducciones de Per, Bolivia,
Ecuador, Mxico, Argentina, Inglaterra,
Escocia, Alemania, Holanda y Blgica; y
variedades colombianas producto de pro-
cesos de mejoramiento gentico del cruce
de las subespecies andigena x tuberosum
(Moreno y Valbuena, 2006).
La Coleccin Central Colombiana
(C.C.C) de papa en el actual esquema de
conservacin podra estar en riesgo de
prdida de variabilidad gentica debido
a factores tan importantes como la gota
Phytopthora infestans, los virus y el clima,
entre otros. A esto se suma el hecho
de que los costos de preservacin son
muy altos; en el 2005, la conservacin in
vitro fue de $31.724.91 y en condiciones
de campo fue $53.869.967 (Cern et al.,
2005); razones por las cuales se ha visto
la necesidad de iniciar investigaciones en
crioconservacin. Se estima que los costos
podran reducirse hasta 20% para condi-
ciones de conservacin en campo.
La crioconservacin se puede conside-
rar un sistema no letal de almacenamien-
to de tejidos biolgicos a temperaturas
ultrabajas, pues permite detener su meta-
bolismo celular (Kartha, 1985 citado por
Escobar, 2005).
Este sistema es la nica opcin disponi-
ble para el almacenamiento a largo plazo
del germoplasma de especies propagadas
vegetativamente y especies con semillas
intermedias o recalcitrantes. La utiliza-
cin de nitrgeno lquido (-196C) asegura
las temperaturas ultrabajas y la indepen-
dencia de la electricidad. Tiene una gran
ventaja y es que requiere de un espacio
muy reducido, permite que el material
est protegido de la contaminacin, ya que
una vez almacenado no se manipula y el
mantenimiento requerido por la coleccin
es mnimo (Abdelnour, 1999).
En crioconservacin se recomienda
el almacenamiento de estructuras
organizadas como meristemos, pices,
semillas, embriones cigticos, polen y
embriones somticos para asegurar la
estabilidad gentica de los materiales.
Este sistema de conservacin permite
almacenar desde clulas hasta rganos, y
tanto materiales generados en el laboratorio
como los producidos por ingeniera
gentica. Requisito indispensable antes de
iniciar el programa de crioconservacin
de la especie de inters es contar con
el protocolo de micropropagacin, el
cual debe estar bien evaluado y permitir
altos porcentajes de regeneracin de
las plantas. Para la gran mayora de las
especies vegetales, la crioconservacin se
encuentra en estado experimental, sin
embargo se han logrado buenos avances
en gneros como Rubus, Pyrus, Solanum y
Elaeis guineensis (Abdelnour, 1999).
La crioconservacin comprende dife-
rentes metodologas que se encuentran
enmarcadas en dos grandes grupos: cl-
sicas y modernas. Las clsicas hacen refe-
rencia a la crioproteccin qumica, en
la que la deshidratacin de los tejidos
es paralela a la congelacin lenta. Las
modernas estn basadas en el principio
de vitrificacin, el cual permite la transi-
cin de agua a una fase amorfa o vtrea en
la que se impide la formacin de cristales
de hielo; tcnica que supera a la qumica
por su simplicidad ya que no requiere de
congelacin programada y es aplicable
a un amplio rango de genotipos (Villa y
Snchez, 2003).
Las tcnicas de crioconservacin clsi-
cas se desarrollaron en las dcadas de 1970
y 1980; involucran un pretratamiento con
un crioprotector que despus es sometido
a una congelacin muy lenta empleando
un aparato de enfriamiento programa-
ble. Las sustancias crioprotectoras ms
utilizadas son dimetilsulfxido (DMSO),
manitol, sorbitol, sacarosa y polietilen-
glicol (PEG). Los crioprotectores tienen
accin osmtica, pero algunos de ellos
(por ejemplo DMSO) pueden entrar en
las clulas y proteger la integridad celular
durante la congelacin. Para la mayora
de los materiales, es conveniente hacer un
enfriamiento lento (0,5 a 2C/min) hasta
alcanzar aproximadamente los -40C, y
posteriormente realizar la inmersin rpi-
da de muestras en el nitrgeno lquido.
Los procedimientos de crioconservacin
clsicos son principalmente usados para
el enfriamiento de tejidos no diferencia-
dos como las suspensiones celulares y
callos (Engelmann, 2000).
Para la crioconservacin de tejidos
diferenciados como rganos, pices,
embriones cigticos y somticos, se han
desarrollado nuevas tcnicas durante los
ltimos aos. Consisten en extraer la
mayor parte del agua por deshidrata-
cin fsica u osmtica de los explantes
seguida por una congelacin muy rpida
que produce vitrificacin de los solutos
contenidos dentro de las clulas, es decir,
la formacin de una estructura vtrea
amorfa sin que se presente la formacin
de cristales de hielo que son perjudiciales
para la estructura celular. Sus principales
ventajas comparadas con los procedi-
mientos clsicos son su simplicidad -no
requiere de un congelador programable-
y su aplicacin a una gama amplia de
genotipos. A estas tcnicas pertenecen
algunas como la encapsulacin-deshi-
dratacin, encapsulacin-vitrificacin,
el desecamiento, el precrecimiento, el
precrecimiento-desecamiento, la gota
congelada (Engelmann, 2000).
En crioconservacin tambin es muy
importante estimar la sobrevivencia o
viabilidad de los tejidos crioconserva-
dos. Generalmente la sobrevivencia se
determina por la recuperacin de los
tejidos empleando el cultivo de tejidos.
Adicionalmente, existen pruebas como la
de diacetato de fluorescena (fluorescein
diacetate -FDA) y tetrazolio por espec-
trofotometra que permiten determinar la
sobrevivencia en menor tiempo.
La prueba de FDA, es apta para cul-
tivos de clulas viables no diferenciadas,
las cuales poseen la esterasa activa. En
esta prueba, las clulas vivas se observan
de color amarillo verdoso bajo la luz
ultravioleta del microscopio. Las clulas
no viables no presentan fluorescencia.
Esta prueba tiene como ventaja que puede
39
efectuarse inmediatamente despus del
descongelamiento con el fin de determi-
nar la habilidad de las clulas para sobre-
vivir a la crioconservacin. Sin embargo
se recomienda efectuar una segunda eva-
luacin 24 horas despus del descongela-
miento con el fin de evitar falsos positivos
(Widholme, 1972).
La prueba de tetrazolio por espectrofo-
tometra puede ser utilizada para diferen-
tes tipos de tejidos. La principal ventaja
de esta metodologa es que permite deter-
minar la cuantificacin de la viabilidad a
travs del espectrofotmetro (Steponkus
y Lamphear, 1967).
Las deshidrogenasas y el NADH
(nicotinamida adenina dinucletido)
reducen el tretrazolio generando el
formazn (color rojo), el cual puede
ser detectado por el espectrofotmetro.
La prueba puede interpretarse como
la medida de la viabilidad y actividad
respiratoria. Al igual que la prueba de FDA,
tambin se pueden crear falsos positivos
por lo cual es importante repetir la prueba
24 horas despus del descongelamiento
(Steponkus y Lamphear, 1967).
En Corpoica C.I. Tibaitat en el 2003
se iniciaron evaluaciones de diferentes
metodologas de crioconservacin de una
accesin de Solanum phureja utilizando
meristemos apicales. Dicho estudio obtu-
vo como resultado que son muy impor-
tantes, entre otros, las etapas previas al
congelamiento para que el explante sea
vigoroso, y las condiciones del cuarto de
crecimiento para obtener exitosamente
la recuperacin de plntulas despus
de la etapa de descongelamiento (Villa
y Snchez, 2003). De acuerdo con estos
antecedentes, fue necesario continuar en
este proceso, con nuevas investigaciones
que permitieran establecer un protocolo
de crioconservacin apto, y facilitar el
uso de esta herramienta como medio
alternativo a los tres sistemas de conser-
vacin que se poseen hasta el momento
en Corpoica.
Teniendo en cuenta los resultados de
Villa y Snchez (2003) el uso de yemas de
microtubrculos puede ser una alternati-
va ms til que el uso de meristemos api-
cales para conservacin del germoplasma
de papa gracias a las siguientes ventajas:
ms fciles de manipular, las yemas pre-
sentes en los microtubrculos tambin
permiten obtener plntulas idnticas a
la madre, son ms vigorosas que los
meristemos apicales, un brote en realidad
cuenta con tres yemas viables y adems se
encuentran libres de enfermedades.
La presente investigacin se realiz
en el laboratorio de cultivo de tejidos,
del Programa de Recursos Genticos y
Mejoramiento Vegetal de Corpoica C.I.
Tibaitat, con el objetivo de evaluar el
potencial de la crioconservacin de yemas
de microtubrculos de papa Solanum
tuberosum ssp. andigena, mediante la
metodologa del secado de tejidos como
parte de los proyectos de investigacin
para encontrar estrategias alternas en la
conservacin del germoplasma de papa.
El estudio se adelant en la Corporacin
Colombiana de Investigacin Agropecua-
ria Corpoica-, en el Centro de Investiga-
cin Tibaitat, municipio de Mosquera,
Cundinamarca (471'28,2'' N, 7418'30,5''
W y altitud 2516 msnm), en el Laborato-
rio de Cultivo de Tejidos del Programa
Nacional de Recursos Genticos y Mejo-
ramiento Vegetal.
Material vegetal
Para el presente estudio se utilizaron
microtubrculos de dos accesiones: C.C.C.
4318 (carriza) y C.C.C 4981 (guata negra)
utilizadas en los ensayos preliminares y
cuyo registro de pasaporte se presenta en
la tabla 1.
Propagacin inicial de plntulas
Se realiz una multiplicacin previa a
partir de dos plntulas por cada accesin.
Estas plntulas fueron obtenidas de la
coleccin in vitro de papa, de Corpoica
C.I. Tibaitat. Se extrajeron tanto pices
como entrenudos para su propagacin,
los cuales se colocaron en frascos de
vidrio de 500 mL repartidos en grupos de
diez explantes, para un total de cuarenta
explantes por accesin, lo cual constituy
el material inicial para el presente estudio.
Los explantes fueron sembrados en medio
de propagacin MS convencional para
papa (Murashigue y Skoog, 1962) (CIP,
1997), (tabla 1). Posteriormente fueron
colocados en un cuarto de crecimiento
durante un mes, a temperatura de 18C,
humedad relativa de 60% y fotoperodo
de 16 horas-luz/da.
Produccin de microtubrculos
Los microtubrculos empleados en esta
investigacin fueron producidos en con-
diciones in vitro de las dos accesiones
mediante el protocolo slido lquido
(Rivera, 2007).
Despus de la multiplicacin inicial se
realiz una nueva propagacin emplean-
do pices y entrenudos que corresponde
a una etapa previa a la induccin de
tuberizacin. En esta propagacin se
utiliz un medio de cultivo descrito por
Gmez y Reyes (1998), que fue modifi-
cado con la adicin de gelificante. Las
condiciones de crecimiento fueron igua-
les a la propagacin inicial durante un
mes (tabla 2).
Para la induccin de tuberizacin, se
adicion el medio de cultivo descrito por
Borda y colaboradores (2005, citados por
Rivera 2007) a los contenedores donde
se hallaban las plntulas (tabla 2). Las
condiciones empleadas fueron total oscu-
ridad, temperatura de 18C y humedad
relativa de 60%, durante un mes, periodo
necesario para el desarrollo total de los
microtubrculos (Rivera, 2007).
Etapa exploratoria
Se emplearon yemas de los microtubrcu-
los de las dos accesiones exponindolas a
diferentes tiempos de secado en el flujo
de la cmara. El tiempo de exposicin
Tabla 1. Datos de pasaporte de las accesiones seleccionadas para la produccin de microtubrculos
Recoleccin
No.
Especie/subespecie
Nombre
vulgar
Municipio Vereda
Altitud
(msnm)
C.C.C. 4318 S. tuberosum ssp. andigena Carriza Beln (Boyac) El Bosque 2900
C.C.C. 4981 S. tuberosum ssp. andigena Guata negra
Guachucal
(Nario)
Corregimiento
Muellanuez
3140
40
fue desde 15 minutos, aumentando cada
5 minutos hasta 1 hora. Posteriormente,
parte de las yemas empleadas en este
proceso fueron congeladas en nitrgeno
lquido (-196C) durante un da. El des-
congelamiento se efectu en bao mara
a 37C durante 3 minutos. Para la recu-
peracin se utiliz el medio de cultivo 1,
durante los primeros 7 das despus del
descongelamiento en oscuridad y tempe-
ratura de 18C. Posteriormente, se trans-
firieron las yemas al medio de cultivo 2,
y se efectu el acondicionamiento a la
luminosidad gradualmente; la tempera-
tura fue 18C (tabla 3).
Estudio principal
Diseo experimental
El diseo utilizado fue completamente
al azar, empleando las dos accesiones en
cuatro tratamientos (tabla 4), por diez
repeticiones y cada una de ellas con diez
yemas. Para un total de 800 yemas.
Se evalu la sobrevivencia en una esca-
la de 0 y 1, donde 0 fue muerto y 1 fue
vivo. Los resultados obtenidos se analiza-
ron mediante el programa estadstico SAS
Versin 9.01.
Secado
Las yemas en este proceso se secaron con
flujo de aire estril en la cmara de flujo
laminar durante 30 minutos.
Tabla 2. Composicin de un litro de medio de cultivo para propagacin de plntulas y produccin
de microtubrculos
Composicin
Medio de
propagacin de
papa
Medio de
cultivo previo a
tuberizacin*
Medio de cultivo
para induccin de
tuberizacin**
Solucin macro (MS) 50 ml 40 ml 50 ml
Solucin micro 1 ml 1 ml 1 ml
Solucin de hierro 10 ml 10 ml 10 ml
Tiamina 1 ml 0,4 ml 1 ml
Myioinositol 0,1 g 0,1 g 0,1 g
Azcar 30 g 30 g 30 g
cido pantotnico - 2 mg -
cido giberlico - 0,4 mg -
6 benzil amino purina (BAP) - 0,5 mg 5 mg
Cloruro de cloro colina - - 10 mg
Phytagel 3 g 3 g -
pH 5,7 5,7 5,7
* Gmez y Reyes (1998) (modificado).
** Borda et al. (2005).
Tabla 3. Composicin de los medios de cultivo para recuperacin de yemas crioconservadas para
1 litro de medio
Medio de cultivo 1 Medio de cultivo 2*
Solucin macro (MS) 50 ml 50 ml
Solucin micro 1 ml 1 ml
Solucin de hierro 10 ml 10 ml
Tiamina 1 ml 1 ml
Myioinositol 0,1 g 0,1 g
Azcar 80 g 25 g
Phytagel 2 g 2 g
Carbn activado 2 g -
Kinetina - 0,04 mg
cido giberlico - 0,1 mg
pH 5,7 5,7
* Golmirzaie y Toledo (1996). Este medio de cultivo es empleado generalmente para recuperacin de yemas apicales de papa crioconservadas.
Tabla 4. Tratamientos utilizados para la evaluacin de crioconservacin de yemas de microtubrculos
Tratamiento Descripcin
Testigo absoluto Yemas sin secar (control absoluto)
Yemas secadas Yemas secadas durante 30 minutos (etapa de secado)
Yemas secadas y congeladas Yemas secadas durante 30 minutos y congeladas (crioconservadas)
Testigo negativo Yemas sin secar y congeladas (control congelado)
Descongelamiento
Los tratamientos que implicaron el conge-
lamiento (-196C) en nitrgeno lquido (3 y
4) se descongelaron despus de un da de
permanecer en ste, en bao Mara a una
temperatura de 37C durante 3 minutos.
Recuperacin en medio de cultivo
Se realiz de igual forma que en la etapa
exploratoria empleando los medios de
cultivo mencionados en la tabla 2.
Prueba de viabilidad (trifenil tetrazolio
cloruro)
Esta prueba se utiliz como metodologa
complementaria para evaluar la sobrevi-
vencia o viabilidad de las yemas en cada
uno de los tratamientos. Esta se efectu
a los 14 y 30 das despus del desconge-
lamiento.
Se adapt la metodologa de tetrazolio
empleada para semillas de papa, ya que
la metodologa de Steponkus y Lanphear
(1967) para material crioconservado,
requiere 100 mg de material vegetal, can-
tidad que es difcil de obtener empleando
este tipo de explantes porque son muy
pequeos y de bajo peso.
Se tomaron submuestras al azar a los
14 y 30 das despus del descongela-
41
miento. Se usaron tres repeticiones con
diez yemas de cada uno de los cuatro
tratamientos para las dos accesiones y
se colocaron en una solucin de trifenil
tetrazolio cloruro (TTC) al 0,5%, duran-
te 24 horas a 25C en oscuridad; pasado
este tiempo se realiz el enjuague de
las yemas con agua desionizada y se
efectu la lectura a cada yema. Segn la
tincin de las yemas se asign el valor 0
para ausencia de tincin o tejido muerto
(color blanco) y 1, para buena tincin o
sobrevivencia (color rojo intenso); las
yemas con tincin muy deficiente (rosa
muy plido) se pueden considerar como
un estado intermedio de prdida de
viabilidad.
La calificacin para la tincin de yemas
debi efectuarse segn la intensidad del
color, ya que no pudieron ser cataloga-
das de forma efectiva como se hace en
semillas por la imposibilidad de realizar
observaciones y cortes ms detallados
debido al tamao de ellas.
Esta prueba no se realiz inmedia-
tamente despus del descongelamiento
porque las yemas son muy sensibles a
cambios abruptos y se encuentran muy
deshidratadas, condiciones no aptas para
hacer la prueba; por esta razn la primera
lectura se efectu 14 das despus del des-
congelamiento.
RE S ULTADOS
Estudios preliminares
Los estudios preliminares mostraron que
la sobrevivencia disminuy al aumentar
el tiempo de desecacin. A los 15 minu-
tos de secado la sobrevivencia fue de
70% a 80%, a los 30 minutos entre 50% y
60%, a los 45 minutos vari entre 20% y
30%, y al llegar a 60 minutos de secado
no haba sobrevivencia en el medio de
recuperacin 1.
En las yemas desecadas a 30 minutos
y sometidas a un da de congelamiento,
se observ la sobrevivencia y recupera-
cin de una yema de la accesin C.C.C.
4318 - carriza, la cual present regenera-
cin directa y un desarrollo similar a los
testigos. Por lo anterior se implement
esta metodologa para el desarrollo del
presente estudio (figura 1).
Estudio principal
Sobrevivencia de las yemas de
microtubrculos por accesiones
Segn el anlisis de varianza y prueba
de comparacin de promedios de Dun-
can, para la variable sobrevivencia no se
encontr diferencia significativa del 5%
entre accesiones para las evaluaciones
visual y de tetrazolio (tabla 5).
En las evaluaciones visuales, la acce-
sin C.C.C. 4318 (carriza) present
sobrevivencia promedio de 0,51 (51%),
mientras que en la accesin C.C.C. 4981
(guata negra) fue de 0,52 (52%). Estos
resultados son similares a los de la
investigacin de Schafer-Menuhr (1996,
citada por Engelmann, 2000) que evalu
la crioconservacin de yemas apicales
de 219 accesiones de papa y obtuvo 40%
de sobrevivencia. Golmirzaie y Panta
(1996) encontraron que 69% de los geno-
tipos que evaluaron presentaron dife-
rentes niveles de sobrevivencia pero al
parecer est relacionado con el genotipo
y el vigor de la planta madre y han
logrado incrementar la sobrevivencia
hasta 75%.
En la prueba de tetrazolio, el anlisis
de varianza y la prueba de comparacin
de promedios de Duncan mostraron que
las evaluaciones de sobrevivencia con
tetrazolio en las accesiones no presenta-
ron diferencias significativas entre stas.
La evaluacin visual de sobrevivencia
o viabilidad de las yemas present prome-
dios mayores que la prueba de tetrazolio.
Para la accesin C.C.C. 4981 (guata negra)
se obtuvo un promedio de 0,52 (52%) en
forma visual, mientras que el tetrazolio
fue 0,45 (45%); lo mismo sucede con la
accesin C.C.C. 4318 (carriza), la cual en
la parte visual obtuvo 0,51 (51%) y con el
tetrazolio obtuvo 0,42 (42%) (tabla 5).
Estas diferencias, aunque no muy
amplias, se pueden haber dado por sub-
estimacin o sobreestimacin de lo obser-
vado. En las evaluaciones visuales se des-
cribe la coloracin verde de la clorofila, lo
cual puede sobreestimar los porcentajes
de sobrevivencia. La evaluacin con tetra-
zolio, aunque es mucho ms exacta, pro-
duce tincin del tejido vivo, debido a que
las deshidrogenasas y el NADH reducen
la sal de tretrazolio y lo que genera el
formazn que produce la caracterstica
del color rojo intenso. Es probable que
se haya calificado como muertas yemas
con prdida avanzada de sobrevivencia o
viabilidad debido a que hayan presentado
tincin muy deficiente o no haya habido
tincin, por lo cual pudo haberse dado
una subestimacin de lo observado.
microtubrculos por tratamientos
En la prueba visual la sobrevivencia pre-
sent diferencias significativas del 5%. Se
encontr que el testigo absoluto (yemas
sin secar) obtuvo 0,99 de sobrevivencia
(99%); para las yemas secadas fue 0,71
(71%); para las yemas secadas y congela-
das fue 0,36 (36%) y para el testigo negati-
vo (yemas sin secar y congeladas) fue 0,0
(0%), (tabla 6).
El anlisis efectuado por tratamientos
en relacin con la prueba de tetrazolio
mostr tambin diferencias significativas
entre los cuatro tratamientos. El testi-
go absoluto (yemas sin secar) obtuvo la
mayor sobrevivencia 1,0 (100%), yemas
secadas 0,51 (51%), yemas secadas y con-
geladas 0,24 (24%) y yemas sin secar y
congeladas 0,0 (0%), (tabla 6).
Figura 1. Plntula obtenida de yema criocon-
servada, accesin C.C.C. 4318
Tabla 5. Sobrevivencia promedio de las yemas de microtubrculos por accesiones
Accesin Prueba visual Prueba de tetrazolio
C.C.C. 4318 (carriza) 0,51 a 0,45 a
C.C.C. 4981 (guata negra) 0,52 a 0,42 a
42
Entre ambas pruebas se observ que
hay una tendencia similar de la respuesta
de las yemas de microtubrculos a los
tratamientos; aunque tambin se encontr
que en la apreciacin visual se obtuvieron
mayores resultados de sobrevivencia que
con la prueba de tetrazolio, es probable
que se haya dado sobreestimacin.
El testigo absoluto en ambas pruebas
obtuvo el porcentaje ms alto de sobre-
vivencia, puesto que no se someti a
ningn proceso que lo pudiera reducir.
Las yemas secadas presentaron reduccin
de la sobrevivencia con respecto al testigo
absoluto por efecto del proceso al cual
fueron sometidas; las yemas de microtu-
brculos que fueron secadas y criocon-
servadas presentaron una reduccin de la
sobrevivencia mayor al tratamiento men-
cionado anteriormente, y en el caso del
testigo negativo no hubo sobrevivencia de
las yemas debido a los posibles daos que
pudieron presentarse por el congelamien-
to del agua contenida en los tejidos.
Aunque la prueba de tetrazolio fue
diseada para semillas, y se adapt como
metodologa alterna en esta investigacin
para la evaluacin de la sobrevivencia o
viabilidad de las yemas, no constituy
una prueba determinante para estimar
dicha viabilidad. Para obtener un diag-
nstico ms acertado de la viabilidad de
las yemas, sera necesario utilizar meto-
dologas complementarias, como por
ejemplo los cortes histolgicos de las
respectivas yemas.
microtubrculos por evaluaciones a
travs del tiempo
La sobrevivencia se evalu a los 14 y
30 das despus del descongelamiento
y siembra de las yemas en el primer
medio de recuperacin (tabla 3). La
primera lectura se efectu a los 14 das
puesto que a esta fecha las yemas de los
microtubrculos hicieron la transicin
a la luminosidad, y es menos probable
obtener evaluaciones de sobrevivencia
con falsos positivos como ocurre nor-
malmente en los primeros das despus
del descongelamiento.
La sobrevivencia present diferencias
significativas entre las lecturas efectua-
das: a los 14 das fue 0,53 (53%) y a los 30
das fue 0,42 (42%). Probablemente la pr-
dida de sobrevivencia se present por las
condiciones de recuperacin empleadas
en el presente estudio (tabla 7).
y congeladas). Se deduce que a este
tiempo se ha perdido la mayor parte de
la viabilidad de las yemas crioconserva-
das debido, probablemente, a las condi-
ciones y medios de cultivo empleados
en este estudio, los cuales no fueron
aptos para la recuperacin y diferencia-
cin de las yemas.
Testigo absoluto (yemas sin secar)
Las yemas sin secar presentaron una tin-
cin muy marcada de color rojo fuerte,
indicio de una buena actividad respirato-
ria (figura 2).
Tabla 6. Sobrevivencia promedio de las yemas de microtubrculos por tratamientos
Tratamiento Prueba visual Prueba de tetrazolio
Testigo absoluto (yemas sin secar) 0,99 a 1,0 a
Yemas secadas 0,71 b 0,52 b
Yemas secadas y congeladas (crioconservadas) 0,36 c 0,24 c
Yemas secadas y congeladas 0,00 d 0,00 d
Tabla 7. Sobrevivencia promedio de las yemas
de microtubrculos por evaluaciones a travs
del tiempo del estudio
Evaluacin
Prueba
visual
Prueba de
tetrazolio
14 das 0,53 a 0,51 a
30 das 0,42 b 0,36 b
En la prueba de tetrazolio tambin se
observaron diferencias significativas lo
que corrobor que la sobrevivencia se
redujo a travs del tiempo; los 14 das
despus del descongelamiento fue 0,516
(51,6%), mientras que a los 30 das fue
0,366 (36,6%) (tabla 7).
Aproximacin del uso de la prueba de
tetrazolio en crioconservacin de yemas
de microtubrculos
A continuacin se presentan algunas
figuras con relacin al comportamiento
de las yemas en los diferentes tratamien-
tos y la prueba de tetrazolio a los 14 das
de encontrarse en los medios de cultivo
para recuperacin.
En la prueba de tetrazolio efectuada
a los 30 das despus de encontrarse las
yemas en los medios de recuperacin, se
observ lo siguiente: tinciones similares
en el testigo absoluto (yemas sin secar) y
en las yemas que sufrieron procesos de
secado; ausencia de tincin en el testigo
negativo (yemas sin secar y congeladas)
y en las yemas crioconservadas (secadas
Figura 2. Yemas sin secar de papa Solanum
tuberosum ssp. andigena, tratadas con tetrazolio.
Vista superior e inferior de la yema
Yemas secadas
Las yemas secadas no presentaron tincin
muy marcada, lo cual evidencia la reduc-
cin en la viabilidad de las yemas. La tona-
lidad rojo fuerte observada en el testigo
absoluto no se percibi en stas. La tincin
se present en la base de la yema, sobre el
epiderma del microtubrculo; en cuanto al
segmento del microtubrculo se observ
una delgada lnea de tincin que demarca
la posicin de la yema (figura 3).
Yemas secadas y congeladas
(crioconservadas)
En este tratamiento se observaron dos
tipos de tinciones diferentes. La primera
43
corresponde a una tincin marcada, no
igual al testigo absoluto, pero claramen-
te visible; indicio de la viabilidad de
las yemas (figura 4). En la segunda no
se observa una clara tincin de la yema
pero s en el microtubrculo, sobre el
corte realizado para su extraccin, lo que
demarca la zona de la base de la yema.
Por lo anterior estas yemas se considera-
ron en proceso de prdida de la viabili-
dad (figura 5).
Testigo negativo (yemas sin secar y
congeladas)
En este tratamiento en el que las yemas
se sometieron a la congelacin rpida
en nitrgeno lquido lo que ocasion su
muerte. Despus de realizar la prueba
de tetrazolio no se observ tincin de las
mismas (muertas) (figura 6).
CONCL US I ONE S
Las yemas de microtubrculos de las acce-
siones C.C.C. 4318 (carriza) y C.C.C. 4981
(guata negra) evaluadas en el proceso de
desecacin y crioconservacin presenta-
ron respuestas similares.

Despus del proceso de descongela-
miento, las yemas presentaron una colo-
racin verde, por lo cual se pudo asumir
que estaban vivas, lo cual fue corroborado
con la prueba de tetrazolio, mucho ms
exacta, que produjo tincin de color rojo
en el tejido vivo.
La prdida de viabilidad o sobrevi-
vencia de las yemas es bastante rpida.
A pesar de que las yemas secadas y crio-
conservadas sobrevivieron al proceso de
congelamiento en nitrgeno lquido, los
medios y las condiciones ambientales de
recuperacin no fueron las adecuadas
para facilitar el desarrollo de plntulas
a partir de estas yemas. La apreciacin
visual y la prueba de tetrazolio pueden
ser complementarias para la evaluacin
de sobrevivencia.
La sobrevivencia no pudo corrobo-
rarse a los 30 das por la prdida de via-
bilidad de las yemas y la imposibilidad
de realizar cortes histolgicos de los
tejidos internos de las yemas, con el fin
de detectar algn dao en la membrana
celular. Por consiguiente no se obtuvo
regeneracin de plntulas en los medios
de cultivo.
Figura 3. Yemas secadas de papa Solanum tuberosum ssp. andigena, tratadas con tetrazolio. Vista
superior e inferior
Figura 4. Yemas secadas y congeladas de papa Solanum tuberosum ssp. andigena. Tincin
marcada de la yema. Vista superior e inferior
Figura 5. Yemas secadas y congeladas de papa Solanum tuberosum ssp. andigena. Tincin no muy
marcada de la yema y tincin leve en el segmento del microtubrculo
Figura 6. Yemas sin secar y congeladas de papa Solanum tuberosum ssp. andigena. Vista superior
e inferior
44
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AB S T RACT
Multiple researches have shown the
environmental, economic and productive
benefits that can be generated when including
natural vegetation in the margins of the
crops. This happens thanks to the presence
of natural habitats, which are the ones that
promote biotic factors such as natural enemies
and abiotic ones as temperature, humidity o
rain that can affect negatively the pests. The
objective of this research was to evaluate and
compare the effect of other natural systems
present at the same landscape such as crop of
oil palm and gallery forests over the natural
biological control of Spodoptera frugiperda in
growing areas of rice. For this purpose, an area
of study was selected at the Colombian plain
foothills (Villanueva, Casanare), a place that
is characterized for having big extensions of
rice, surrounded by oil palms plantations and
gallery forests. The abundance of S. frugiperda
in the stages of larva and imago was evaluated,
as well as the parasitism of eggs and larvae
and the diversity of natural enemies and other
arthropods. It was found that plantations of oil
palm, as the gallery forests promote the natural
biological control of S. frugiperda by increasing
the diversity of the natural enemies and
reduction of the pest population in the borders
of the crop. The importance of parasitoids as
Apanteles marginiventris and predators of the
order Odonata in the control of S. frugiperda
was identified. It is highlighted the importance
to associate perennial crops as oil palm with
transitory crops as rice in the planning of
agroecosystems on the region and promote the
conservation of gallery forest, as long as they
can become key factors in the natural biological
control of pests. Nevertheless, aspects as the
low quality of the habitat and frequently use of
chemical pesticides affected the results.
Keywords: Agroecosystem, biologic diversity,
natural enemies, oil palm, habitat.
Incidencia de los mrgenes sobre el control
biolgico natural de Spodoptera frugiperda (J. E.
Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en cultivos de arroz
RE S UME N
Mltiples estudios han mostrado los beneficios ambientales, econmicos y productivos
que se pueden generar al incluir vegetacin natural en los mrgenes de los cultivos.
Esto se debe principalmente a que la presencia de hbitats naturales favorece factores
biticos y abiticos que pueden afectar negativamente las plagas. Con base en lo ante-
rior, esta investigacin tuvo como objetivo evaluar y comparar el efecto de mrgenes
compuestos por plantaciones de palma de aceite y bosques de galera sobre el control
biolgico natural de Spodoptera frugiperda en cultivos de arroz. Para esto, se seleccio-
n un rea de estudio en el piedemonte llanero colombiano (Villanueva, Casanare),
compuesta por grandes extensiones de cultivos de arroz rodeados por plantaciones de
palma de aceite y bosques de galera. Se evalu la abundancia de S. frugiperda en estados
de larva y adulto, el parasitismo de huevos y larvas, y la diversidad de enemigos natu-
rales y de otros artrpodos. Se observ aumento en la presencia de insectos benficos y
disminucin de la poblacin de la plaga en los estadios de larva y adulto en cercanas a
los mrgenes. Se identific la importancia de parasitoides como Apanteles marginiventris
y depredadores, en especial correspondientes al orden Odonata para el control natural
de S. frugiperda. Se encontr que tanto las plantaciones de palma de aceite como los
bosques de galera promueven el control biolgico natural de S. frugiperda; sin embargo,
aspectos como la baja calidad del hbitat y la aplicacin constante de insumos qumicos
afectaron los resultados significativamente.
Palabras clave: agroecosistema, diversidad biolgica, enemigos naturales, palma de
aceite, hbitat.
1
Eclogo. Pontificia Universidad Javeriana, Bogot.
javiervila4@hotmail.com
2
Profesor asistente Facultad de Estudios Ambientales
y Rurales. M.Sc. Pontificia Universidad Javeriana,
Bogot. guillermo.baptiste@javeriana.edu.co
3
Investigador Ph.D. Principal, Laboratorio de
Entomologa. Centro de Biotecnologa y Bioindustria,
Corpoica C.I. Tibaitat, Mosquera.
alopez@corpoica.org.co
I NT RODUCCI N
La mayor limitante en la produccin
de cultivos de arroz en Colombia, como
en muchas partes del mundo, son las
plagas (Settle et al., 1996). Por esta razn,
el arroz es el cultivo con mayor aplicacin
de insecticidas en el mundo (Woodburn,
1990). Entre las principales plagas se
encuentra el gusano cogollero Spodoptera
frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera:
Noctuidae), especie considerada de
importancia econmica por los graves
daos que ocasiona a la planta (Pantoja
et al., 1997, Meneses et al., 2001). Los
daos que esta plaga genera en el arroz
se deben a su accin defoliadora, aunque
tambin acta como trozador y puede
atacar la pancula. El ataque al cultivo lo
realiza nicamente en el estadio de larva
(Pantoja et al., 1997).
El control del gusano cogollero en
arroz est determinado principalmente
por medidas de tipo qumico y cultural,
dejando a un lado mtodos alternativos
como el control biolgico natural. Este
tipo de control puede llegar a ser muy
efectivo si se implementa correctamente;
esto implica tomar medidas de conser-
vacin, planificacin de agroecosistemas
y diseo del paisaje de tal manera que
se promueva el aumento en la diversi-
dad de enemigos naturales (Haynes et
al., 1980). De los agentes potenciales en
el control biolgico, los depredadores y
parasitoides son catalogados como los
de mayor eficacia. Desafortunadamente,
estos agentes son los que se han visto ms
afectados por la simplificacin ambiental
de los agroecosistemas (monocultivos) y
la utilizacin de productos qumicos para
la proteccin de cultivos.
El inters por el control biolgico
natural y el conocimiento de la dinmica
de poblacin de las plagas y de sus
enemigos naturales han generado
mltiples investigaciones en los ltimos
aos. Muchas de estas investigaciones
han identificado la importancia de la
vegetacin adyacente a cultivos en el
control natural de plagas. Por esto, los
mrgenes de los campos han tomado un
papel muy importante en muchos paisajes
agrcolas al ser hbitats potenciales de
SANI DAD VEGETAL
Y PROTECCI N DE CULTI VOS
46
Incidencia de los mrgenes sobre el control biolgico natural de Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae) en cultivos de arroz
insectos benficos (Marshall y Moonen,
2002). Los estudios se han enfocado
primordialmente en el efecto de vegetacin
nativa, sin embargo los cultivos de tipo
perenne tambin pueden influir de manera
positiva. Las plantaciones de palma de
aceite pueden contribuir a la creacin
de un ecosistema con caractersticas
cercanas a las de un bosque secundario,
por lo que es posible que promuevan el
control natural de plagas tanto dentro de
la plantacin como en cultivos adyacentes
(Rodrguez et al., 2006).
Las funciones que brindan los mrgenes
son diversas, sin embargo su funcin como
hbitat ha sido esclarecida en los ltimos
aos: Denys y Tscharntke (2002) realizaron
una recopilacin de investigaciones en
torno al tema donde se han evidenciado
los servicios ambientales que brindan los
mrgenes a los cultivos. Por ejemplo, se ha
observado que la riqueza de especies en
comunidades de artrpodos se beneficia
al establecer franjas sin cultivar en los
mrgenes de cultivos. Adicionalmente,
estudios han mostrado que depredadores
polfagos presentan mayores densidades
cerca de los mrgenes (15-30 m),
aumentando de esta manera el control de
plagas en las hileras de cultivo cercanas
a bordes (Altieri et al., 1999). Estudios
realizados en parches no cultivados
adyacentes a cultivos determinaron que
zonas en barbecho y amplias franjas
no cultivadas pueden otorgar mayores
ventajas en el control de plagas que
mrgenes delgados (Kruess y Tscharntke,
1994; Tscharntke y Kruess, 1999; Denys y
Tscharntke, 2002). La importancia de los
corredores naturales en algunos tipos de
cultivos ha resultado determinante en lo
que se refiere al control de plagas: Nichols et
al., (2001) evaluaron el efecto de vegetacin
riparia sobre la distribucin y abundancia
de las plagas Erythroneura elegantula Osborn
(Homoptera: Cicadellidae), Frankliniella
occidentalis (Pergande) (Thysanoptera:
Thripidae) y predadores generalistas en
viedos. Tanto adultos como ninfas de
los herbvoros fueron ms abundantes en
las hileras centrales de la parcela que
en los bordes donde los predadores eran
ms abundantes y ejercan un impacto
regulador.
Este tipo de estudios han ido demos-
trando que la eficacia de los mrgenes
para un posible control biolgico depende
de factores como el estado sucesional,
edad de la vegetacin, el grado de dis-
turbio y el tamao de las reas (Thies
y Tscharntke, 1999), ya que permiten a
poblaciones de niveles trficos altos man-
tenerse a travs de los aos.
Los mrgenes de cultivos tambin
pueden brindar beneficios como barreras
de dispersin y movimiento de plagas,
modificando el microclima a travs de la
intercepcin de corrientes de aire, influen-
ciando el flujo de nutrientes, materiales y
agua y proporcionando hbitat a vida
silvestre (Altieri et al., 1999).
Existen mltiples estudios en Amrica
en torno al control biolgico natural de
S. frugiperda, sin embargo la gran mayo-
ra de estos estudios se han realizado
en agroecosistemas de maz y enfocados
principalmente al grupo de los parasi-
toides. A pesar que el control biolgico
natural, la diversidad de enemigos natu-
rales y la presencia de algunos insectos
benficos puede variar segn el cultivo
en el que se haya realizado el estudio,
esta informacin otorga datos clave sobre
los enemigos naturales potenciales y el
control natural que estos insectos benfi-
cos y patgenos pueden ejercer sobre S.
frugiperda en arroz.
Hymenoptera y Diptera son los rdenes
que presentan el mayor nmero de
especies parasitoides del gusano cogollero.
Se han reconocido especficamente
unas especies con alto parasitismo a S.
frugiperda. Entre ellas se resalta Lespesia sp.,
Archytas mormoratus (Towsend), Apanteles
marginiventris (Cresson), Campoletis sp.
Chelonus insularis, Ophion sp., y Meteorus
laphygmae Viereck (Riggin et al., 1993,
Molina-Ochoa et al., 2004).
En el caso de los depredadores, la gran
mayora son polfagos generalistas por
lo que el nmero de especies potenciales
del gusano cogollero puede llegar a ser
muy alto. Prcticamente todos los rdenes
tienen depredadores, sin embargo los
de mayor importancia son: Orthoptera,
Dermaptera, Hemiptera (principalmente
las familias Anthocoridae, Pentatomidae y
Reduviidae), Coleoptera (principalmente
Carabidae, Staphylinidae y Coccinelidae),
Diptera (Syrphidae), Hymenoptera
(Formicidae, Vespidae y Sphecidae)
Odonata y en Arcnida el orden Araneae.
Entre las especies ms relevantes estn el
coccinlido Coleomegilla maculata (De Geer),
el chinche de ojos anchos Geocoris punctipes
(Say) (depredadores diurnos de huevos),
las tijeretas Labidura riparia Pallas y Doru
lineare (Eschscholtz), junto a Coleomegilla
maculata (depredadores nocturnos), Podisus
maculiventris Say, Orius insidiosus (Say),
Nabis ferus L., Vespula carolina L., la tijereta
Doru taeniatum (Dohrn), Solenopsis geminata
(Fab.), y Pogonomyrmex barbatus Smith; y la
chinche asesina Apiomerus pictipes. (Maes,
2003; Hoballah et al., 2004).
Los beneficios que pueden generar
estudios en torno al control natural son
especialmente de tipo ambiental, social
y econmico. El control biolgico natu-
ral tiene como estrategia fundamental la
conservacin de hbitats para generar ser-
vicios ambientales que beneficien los culti-
vos, por lo que de manera indirecta resulta
un claro mtodo de conservacin de reas
naturales o reas con alta calidad de hbi-
tat para especies nativas. Adicionalmente,
estos estudios proponen alternativas a la
aplicacin qumica en cultivos, buscando
de esta manera la disminucin de la conta-
minacin en zonas rurales. Tambin ofre-
cen alternativas que permitan a los pro-
ductores reducir los costos de produccin
a mediano y largo plazo ya que, al incor-
porar una visin a mayor escala que tenga
en cuenta los procesos que suceden en el
paisaje, especialmente lo relacionado con
los procesos ecolgicos que ocurren y que
pueden beneficiar al cultivo, se promueve
la sostenibilidad y mayor estabilidad del
agroecosistema (Bennett et al., 2006).
La entrada en vigencia de tratados
de libre comercio con varios pases y en
especial con Estados Unidos ubica a los
sistemas productivos arroceros colom-
bianos en una situacin complicada y de
desventaja por los altos costos de produc-
cin, por lo que son de gran importancia
y pertinencia para Colombia estudios
que generen alternativas de reduccin de
costos. Cabe resaltar que las principales
fuerzas de cambio del paisaje en la actua-
lidad son las socioeconmicas y polticas
por los procesos actuales de globaliza-
cin, economa del mercado y tratados
multinacionales (Brgi et al., 2004), lo
que significa que si el arroz en Colombia
deja de ser competitivo, en los Llanos
orientales podra incentivarse an ms
el reemplazo de los sistemas productivos
47
arroceros por plantaciones de palma de
aceite, lo cual generara graves efectos en
aspectos como la seguridad alimentaria
y aumentara el problema de monocul-
tivos y homogenizacin del paisaje en
esta regin.
Teniendo en cuenta lo anterior, el
objetivo de esta investigacin consis-
ti en evaluar y comparar la incidencia
de los mrgenes de cultivos de arroz
compuestos por plantaciones de palma
de aceite y bosques de galera sobre el
control biolgico natural de S. frugiperda
en el piedemonte llanero colombiano
(Villanueva, Casanare). Como lo muestra
el objetivo, se seleccion un cultivo de
tipo perenne y un ecosistema natural.
Cabe aclarar que se denomina bosque de
galera a la vegetacin riparia, es decir,
aquella que crece en las orillas de un ro
de manera natural.
El rea de estudio correspondi a un
agroecosistema arrocero localizado en el
departamento de Casanare (Colombia),
especficamente sobre la parte baja del
municipio de Villanueva. Presenta una
altitud aproximada de 200 m sobre el nivel
del mar, y una extensin actual de 3800 ha
dedicadas al cultivo de arroz de riego.
Est delimitada por sistemas productivos
de palma de aceite, sabanas naturales con
ganadera y algunos bosques de galera
correspondientes a pequeos caos. Es
una zona administrada por la entidad
privada Soceagro S.A., que provee los
servicios de riego para el cultivo de arroz
y realiza el arriendo de tierras.
Para el desarrollo de la investigacin
en campo, se seleccionaron tres zonas de
muestreo dentro del rea de estudio as:
cultivos de arroz adyacentes a planta-
ciones de palma de aceite (arroz-palma);
cultivos de arroz adyacentes a bosques
de galera (arroz-bosque); y un control
correspondiente a cultivos de arroz ubi-
cados en el centro del rea de estudio,
aproximadamente a 2000 m de los bordes.
La seleccin de estas zonas se realiz con
base en los siguientes criterios: estado
fenolgico de los cultivos (deban estar en
etapas de desarrollo similares), similitud
en las variedades de arroz utilizadas, y
aplicacin de productos para la protec-
cin de cultivos.
El trabajo de campo tuvo una duracin
de dos meses (noviembre y diciembre de
2006) durante la poca del macollamiento
del cultivo. Es importante aclarar que el
estudio fue esttico, por lo que todos los
datos se tomaron simultneamente.
En campo se recolect informacin
sobre la abundancia de adultos y larvas de
S. frugiperda, parasitoides y depredadores
de huevos y larvas de S. frugiperda y otros
artrpodos identificados en las zonas de
estudio. Para obtener esta informacin,
fue indispensable la aplicacin de
diferentes mtodos de muestreo todos
planteados bajo un mismo diseo
experimental.
El registro del ndice de abundancia
de adultos de S. frugiperda se determin
en un tiempo de cinco das por medio de
trampas de feromonas sexuales, las cuales
se disearon segn las recomendaciones
de investigadores del laboratorio de Ento-
mologa en el C.I. Tibaitat de Corpoica.
Se utilizaron feromonas marca Chemtica
y se colocaron a 1,5 m de altura del suelo.
Estudios como el de Malo y colaboradores
(2004) han mostrado una gran efectividad
de Chemtica en comparacin con otros
tipos de feromonas para la vigilancia de
poblaciones de S. frugiperda, y recomien-
dan manejar una altura de 1,5 m. El con-
teo e identificacin de los individuos se
realizaron directamente en campo.
El muestreo de parasitoides de huevos
consisti en la exposicin de posturas de
S. frugiperda en campo durante un perio-
do de tres das por medio de trampas
de huevos. Estas trampas se elaboraron
con base en la metodologa utilizada en
el laboratorio de Entomologa en el C.I.
Tibaitat de Corpoica. El diseo de estas
trampas permite nicamente la entrada
de parasitoides, evitando de esta manera
el ataque por depredadores de huevos.
Para la realizacin de este muestreo fue
necesaria una fase de laboratorio prelimi-
nar. Esta consisti en el establecimiento
de una cra de S. frugiperda siguiendo la
metodologa realizada por Lpez-vila
(1981) para la produccin de posturas. Se
tomaron 300 larvas a partir del pie de cra
y se separaron en recipientes plsticos con
el fin de evitar el canibalismo. Cada reci-
piente contena 6 g de una dieta artificial
a base de frjol y maz.
En el estado de pupa se registr el sexo
de los individuos (Lpez-vila, 1981),
posteriormente cuando emergieron los
adultos, se ubicaron parejas (macho y
hembra) en frascos de plstico con tapa de
velo. En esta etapa de la cra, se aliment
a los adultos con una solucin de miel de
abeja en agua al 10%. Para la obtencin
de huevos se ubicaron tiras de papel
Kimberly en los recipientes sobre las que
las hembras colocaron sus posturas. Estas
posturas se recolectaron en las madruga-
das o muy temprano en la maana para
exponerlas en campo el mismo da y lo
ms temprano posible. Antes de llevarlas
a campo, se registr el nmero aproxima-
do de huevos por postura.
Luego de exponer las posturas en
campo, se recolectaron y ubicaron en
recipientes plsticos y se llevaron al
laboratorio para dejar en observacin.
Cabe resaltar que existen parasitoides
de huevo que eclosionan en el estado
de larva (huevo-larva) como Chelonus
texanus (Hymenoptera: Braconidae), por
lo cual fue necesario separar las larvas
de S. frugiperda que lograron emerger y
continuar su cra para observar si haba o
no presencia de parasitoides huevo-larva.
El muestreo de larvas de S. frugiperda,
enemigos naturales y otros artrpodos se
realiz por jameo con red entomolgi-
ca, ya que es el mtodo ms apropiado
para cultivos de ciclo corto como el arroz.
La toma de datos se realiz en las horas
de la madrugada, ya que es el momento
del da donde se presenta una actividad
de artrpodos (Sutherland ,1998).
Las larvas se recolectaron en campo y
se ubicaron en recipientes de plstico con
dieta artificial. Posteriormente, se llevaron
al laboratorio para dejar en observacin
dos semanas hasta el estado de adulto
asegurando de esta manera la emergencia
de los parasitoides, ya que algunos como
Archytas incertus (Diptera: Tachinidae)
parasitan en estado de larva pero emer-
gen cuando su husped se encuentra en
estado de pupa (Molinari y Avalos 2003).
En el muestreo se tuvieron en cuenta
larvas de todos los instares para evitar
discriminar especies parasitoides.
Los enemigos naturales y dems artr-
podos colectados se dispusieron en alco-
hol al 70% luego de su recoleccin para
48
su posterior identificacin. El proceso de
identificacin de los individuos colecta-
dos se realiz en el laboratorio de Ento-
mologa en Corpoica C. I. Tibaitat, con el
apoyo de la Coleccin Taxonmica Nacio-
nal de Insectos Luis Mara Murillo y
bibliografa adicional (Borror et al., 1989).
Para la realizacin de los muestreos se
determinaron varias distancias: 0, 200 y
400 m en cada zona de estudio partiendo
de los mrgenes hacia el interior de los
cultivos de arroz (figuras 1a y 1c). Estas
distancias se determinaron con base en
el rango de accin de la feromona sexual
(100 m) y en estudios donde se corrobora
que la mayora de enemigos naturales que
provienen de los mrgenes colonizan los
cultivos hasta no ms de 100 m (Gross y
Pair, 1986; Boatman, 1994; Tscharntke et al.,
2002; Bianchi et al., 2005; Fournier y Loreau,
1999; Thies y Tscharntke, 1999). En cada
zona de muestreo, se realizaron cuatro
repeticiones separadas 500 m una de otra
(figura 1) para una adecuada representa-
tividad del muestreo. Cabe resaltar que en
el caso del control slo se ubicaron cuatro
repeticiones, ya que la comparacin se rea-
liz entre el control y las distancias de las
zonas de estudio, por lo que este diseo fue
el ms adecuado para mantener un mismo
esfuerzo de muestreo (figura 1b).
Para el anlisis estadstico se utilizaron
los programas SPSS y Excel (SPSS 2002).
Se realizaron comparaciones entre las
zonas de estudio y entre las distancias
teniendo en cuenta la distribucin de los
datos y la homogeneidad de varianzas.
Adicionalmente, se realizaron anlisis de
regresin para evaluar la existencia de
una relacin entre variables dependien-
tes (abundancia, diversidad) y variables
independientes (distancia). Por ltimo, se
realizaron anlisis de correlacin, lo cual
permiti determinar si existe alguna rela-
cin entre variables independientes. Cabe
resaltar que todos los anlisis estadsticos
se realizaron con un = 0,05.
El anlisis de los artrpodos y espec-
ficamente de enemigos naturales encon-
trados requiri la aplicacin de ndices
y mtodos adicionales que mostraran de
manera clara los resultados, para lo cual
se aplic el ndice de diversidad Shannon-
Wiever el cual tiene en cuenta tanto la
riqueza de especies como la abundancia
de cada una de ellas.
Cada poblacin est influenciada por
un nmero de interacciones. La regulacin
biolgica de una plaga, por ejemplo, es
dependiente significativamente de las inte-
racciones que se presenten con los parasi-
toides y depredadores (Wilby y Thomas
2002), por lo que es adecuado un anlisis
detallado de los artrpodos presentes con
base en los grupos funcionales y rde-
nes. Como grupos funcionales se definie-
ron fitfagos, depredadores, parasitoides,
detritvoros y nectarvoros teniendo en
cuenta los hbitos especficos de las dife-
rentes familias y especies. Duelli y Obrist
(2003) resaltan la importancia de incluir
en estudios a corto plazo la variable abun-
dancia de enemigos naturales, debido a
que las presas y hospederos pueden verse
reducidos por el nmero de individuos
ms que por el nmero de especies. Por
esto tambin se incluy un anlisis de la
abundancia de enemigos naturales.
Previo a la fase de campo se recolec-
t informacin sobre las caractersticas
de las zonas de muestreo en el rea
de estudio. Esto se realiz a partir de
un formato entregado a trabajadores de
las empresas Soceagro S.A. y Palmar de
Oriente. Posteriormente se identificaron
caractersticas generales del paisaje, para
lo cual se realiz un mapa de coberturas
a escala 1:50.000 con base en una ima-
gen satelital ortorrectificada Landsat del
2000. Se realiz un registro en campo
de las pocas en las que se aplicaron
productos para la proteccin de cultivos
para tener un conocimiento del posible
sesgo en la informacin obtenida por el
control qumico. Se determin el esfuerzo
de muestreo necesario para obtener una
diversidad representativa y un nmero
de larvas de S. frugiperda adecuado para
un anlisis estadstico del parasitismo.
Tambin se determin el tiempo necesario
de exposicin de las posturas en campo y
la ubicacin adecuada de las trampas de
feromonas teniendo en cuenta aspectos
como la direccin del viento. Por ltimo,
se realiz un entrenamiento previo en
campo para la correcta identificacin de
S. frugiperda (larvas y adultos).
En la semana de muestreo se registr
la precipitacin, temperatura, inundacin
y altura de cultivos como variables que
tambin pudieran influir en los resultados
obtenidos. Por ltimo, se evalu el estado
del bosque de galera por medio de un
anlisis estructural de la vegetacin. Para
esto, se realizaron tres transectos de 30
m cada uno y se registr: forma de vida
(hierba, arbusto, palma, rbol, liana), altu-
ra, dimetro a la altura del pecho (DAP)
y cobertura en su estrato para la elabora-
cin del perfil.
Control natural de adultos de
Spodoptera frugiperda
Se encontraron diferencias significativas
entre la abundancia de adultos a 0 m y
a 400 m tanto en arroz-palma como en
arroz-bosque (tabla 1). Esto puede indicar
la presencia de factores en los bordes de
cultivos que afectan negativamente la
abundancia de adultos del cogollero. En
las dos zonas, los menores promedios de
abundancia de S. frugiperda se encontraron
a 0 m, con 69,25 individuos/trampa para
arroz-palma y 42 ind/trampa para arroz-
bosque, mientras que a 400 m se regis-
traron 152 ind/trampa para arroz-palma
Figura 1. Diseo experimental del trabajo en campo. a) Ubicacin trampas en cultivos adyacentes
a plantaciones de palma de aceite. b) Control (arroz aislado). c) Ubicacin trampas en cultivos
adyacentes a bosque de galera
49
y 155 ind/trampa para arroz-bosque. El
mayor valor se encontr en el control con
211,25 ind/trampa. Cabe resaltar que en
arroz-bosque se identific adicionalmente
una relacin directa entre la abundancia
de S. frugiperda y la distancia a bordes
adyacentes a bosques de galera (a mayor
distancia de los bordes mayor abundancia
de la plaga) (figura 2).
que la abundancia de algunos enemigos
naturales especficos s haya ejercido un
efecto sobre la plaga (Duelli y Obrist,
2003). Este es el caso de especies
depredadoras correspondientes al orden
Odonata. Segn Shepard et al., (1987) son
depredadores muy efectivos de adultos
de S. frugiperda, y como se muestra en
las figuras 3 y 4, en las dos zonas de
estudio las distancias en las cuales hubo
disminucin en la abundancia de la plaga
se presentaron las mayores abundancias
de este tipo de depredadores. Este posible
efecto de Odonata sobre S. frugiperda toma
fuerza si se tiene en cuenta que en campo
se registr la presencia de Agriocnemis sp.
(Odonata: Coeniagronidae) depredando
adultos de S. frugiperda en cercana a
las trampas de feromonas. Estos casos
donde se observa un efecto en la plaga
por parte de un bajo nmero de especies,
posiblemente puede estar determinado
por vnculos estrechos entre estas especies
(Wilby y Thomas, 2002).
En arroz-palma, especies de enemi-
gos naturales correspondientes a Dip-
tera, Coleoptera, Hemiptera y la clase
Aranae no mostraron relacin con la
abundancia de la plaga. Esto puede
deberse a que las especies registradas
no son depredadoras especficas de S.
frugiperda en estado de adulto. En el caso
de arroz-bosque especies de Hymenop-
tera, Coleoptera, Hemiptera y la clase
Aranae parecen estar ms relacionados
con otro tipo de presas de los rdenes
Lepidoptera y Orthoptera.
Existen diferencias claras en la presencia
de especies, grupos funcionales y rdenes
en comparacin con el control, que sugiere
un efecto positivo de estas dos coberturas
sobre la diversidad de enemigos naturales
en arroz, especialmente por un aumento
en la presencia de depredadores de
varios rdenes. Mientras en el control
se identificaron depredadores casi en
su totalidad correspondientes al orden
Diptera, en las zonas de estudio arroz-
palma y arroz-bosque se presentaron
adicionalmente depredadores
correspondientes a Odonata, Hemiptera y
Coleoptera, y un aumento en depredadores
correspondientes a Hymenoptera
y Aranae. La diversidad de enemigos
naturales registrada en arroz-bosque y en
arroz-palma alcanz valores hasta de 2,10
y 2,24 respectivamente, mientras que en el
control se registr una diversidad de 1,74.
Como enemigos naturales se incluyeron
tanto especies que han sido registradas
anteriormente como enemigas de S.
frugiperda, como aquellos depredadores o
parasitoides generalistas que hasta ahora
no se ha registrado que ataquen a esta
plaga, pero que por sus caractersticas
pueden calificarse como enemigos
potenciales del cogollero. En la tabla 2 se
listan las especies de enemigos naturales
encontradas en las zonas de estudio;
cabe resaltar especies como Cicindela sp.
(Coleoptera: Cicindelidae), Sarcophaga
sp. (Diptera: Sarcophagidae), Polistes sp.
(Himenoptera: Vespidae), Coleomegilla
Tabla 1. Estadstico de comparaciones mltiples Games-Howell para la abundancia de poblacin de
Spodoptera frugiperda en los diferentes puntos de muestreo
ndice de abundancia S. frugiperda arroz-palma
Distancia A Distancia B
Diferencia de
medias (A-B)
Error estndar Significancia
0 m 400 m -81,75 22,017 0,04 (< 0,05)
ndice de abundancia S. frugiperda arroz-bosque
Distancia A Distancia B
Diferencia de
medias (A-B)
Error estndar Significancia
0 m 400 m -115,5 27,042 0,026 (< 0,05)
Figura 2. Grfico de dispersin de datos en la
zona arroz-bosque con lnea de tendencia del
tipo polinomial, su ecuacin de la recta y su R
2
En teora, la diversidad de artrpodos
y enemigos naturales pueden afectar
negativamente la abundancia de S.
frugiperda por depredacin, parasitismo
o competencia por recursos, sin embargo
ni en arroz-palma ni en arroz-bosque
se identificaron relaciones inversas entre
la diversidad de artrpodos y enemigos
naturales con la abundancia de adultos de
la plaga. Esto puede estar relacionado con
las caractersticas especficas del cogollero,
ya que por ser un insecto endopterigoto,
se necesita una diversidad de enemigos
naturales alta que ataque los distintos
estados y de esta manera se produzca un
control significativo de la plaga (Wilby y
Thomas, 2002).
A pesar que la diversidad general
de enemigos naturales no influy sobre
el control de S. frugiperda, es posible
Figura 3. Comportamiento de la abundancia
del orden Odonata y la abundancia de adultos de
Spodoptera frugiperda en la zona arroz-palma
Figura 4. Comportamiento de la abundancia
del orden Odonata y la abundancia de adultos de
Spodoptera frugiperda en la zona arroz-bosque
50
maculata (Coleoptera: Coccinelidae) y
Nabis sp. (Hemiptera: Nabidae), las cuales
se registraron en campo y ya han sido
registradas anteriormente como enemigos
de S. frugiperda.
Controles naturales de tipo abitico
tambin pudieron influir sobre la abun-
dancia de la plaga especialmente a los 0
m, ya que los bosques de galera al igual
que las plantaciones de palma pueden
estar generando condiciones distintas
a los requerimientos de hbitat ideales
para S. frugiperda (herbceas, cultivos
de ciclo corto, temperatura, humedad,
vientos) (Murua y Virla 2004, Lpez et
al., 1999, Meagher y Gallo, 2003).
En arroz-bosque se present una
relacin adicional entre la abundancia de
adultos de S. frugiperda y la diversidad
de enemigos naturales. Esta relacin
fue directa (significancia = 0,05), lo que
significa que a mayor abundancia de la
plaga, mayor diversidad de enemigos
naturales (figura 5). Este tipo de relacin
es un claro ejemplo de que un aumento
de la diversidad no siempre va ligado
a un aumento en el control de plagas;
contrario a algunos principios en los que
se basa la agroecologa (Altieri y Nichols,
2004). Como se explic anteriormente,
varias especies depredadoras parecen
estar ms relacionadas con otro tipo
de fitfagos que con el cogollero, lo
que puede ser una razn de por qu
no hay control significativo de la plaga
por parte de estos enemigos naturales.
Tambin es coherente pensar que la
mayor diversidad de enemigos se
encuentre en zonas donde hay mayor
oferta de alimento.
Tabla 2. Listado de especies benficas (depredadores y parasitoides de plagas) identificadas en las
distintas zonas de estudio (arroz-palma, arroz-bosque y control), Villanueva, Casanare 2006, 2 semestre
Enemigos naturales de S. frugiperda en arroz-palma
Orden Familia Especie
Coleoptera Cicindelidae Cicindela sp.*
Coleoptera Lampyridae Photuris sp.
Coleoptera Cantharidae Disiodon sp.
Odonata Coenagrionidae Agriocnemis sp.*
Odonata Libellulidae Erythrodiplax umbrata
Arachnida/Aranae sp.
Diptera Sarcophagidae Oxysarcodexia sp.*
Diptera Sarcophagidae Sarcophaga sp.*
Diptera Tabanidae Tabanus claripennis
Diptera Syrphidae Mesograpta sp.
Hymenoptera Vespidae Polistes sp.*
Hymenoptera Halictidae sp.
Hymenoptera Pompilidae sp.
Hemiptera Phymatidae Phymata sp.
Enemigos naturales de S. frugiperda en arroz-bosque
Coleoptera Carabidae Lebiini ealleida
Coleoptera Carabidae Platinus sp.
Coleoptera Coccinellidae Coleomegilla maculata*
Coleoptera Staphylinidae Paederus columbinus
Coleoptera Lampyridae Photinus sp.
Coleoptera Lampyridae Aspisoma sp.
Odonata Coenagrionidae Agriocnemis sp.*
Odonata Libellulidae Erythrodiplax umbrata
Diptera Sarcophagidae Sarcophaga occidua*
Diptera Dolichopodidae sp.
Diptera Ephydridae sp.
Hymenoptera Sphecidae Chlorion sp.
Hymenoptera Formicidae sp.*
Hymenoptera Vespidae Polistes sp.*
Hymenoptera Vespidae Polistes canadensis
Hymenoptera Halictidae sp.
Hemiptera Reduviidae Calliclopius nigripes (L.)
Hemiptera Reduviidae Ricolla sp.
Hemiptera Reduviidae Sirthena
Hemiptera Nabidae Nabis sp.*
Hemiptera Phymatidae Phymata sp.
Enemigos naturales de S. frugiperda en control
Diptera Sarcophagidae Sarcophaga sp.*
Diptera Sciomyzidae Sepedon sp.
Diptera Syrphidae Mesograpta basilare Wied.
Diptera Syrphidae Mesograpta sp.
Hymenoptera Sphecidae Larra sp.
* Especies enemigos naturales directas de S. frugiperda.
Figura 5. Correlacin de diversidad de enemigos
naturales frente a abundancia de adultos de
Spodoptera frugiperda en arroz-bosque
51
Control natural de larvas de Spodoptera
frugiperda
En cuanto a la abundancia de larvas de
S. frugiperda, el comportamiento en las
zonas de estudio no mostr relacin con
la cercana a los bordes; sin embargo,
se evidenciaron correlaciones entre la
presencia de artrpodos y la abundancia
de la plaga.
En arroz-palma se evidenci una rela-
cin negativa (significancia = 0,005) entre
la abundancia de larvas de S. frugiperda
y la diversidad de enemigos naturales,
lo cual muestra que los depredadores
presentes parecen ejercer un efecto sobre
la plaga disminuyendo su abundan-
cia (figura 6). Con base en esto, espe-
cies depredadoras correspondientes a
Coleoptera, Hemiptera, Hymenoptera y
la clase Aranae influyeron posiblemente
en el control de larvas.
Meloidae, Scarabeidae, Chrysomelidae,
Curculionidae, Membracidae y
Cicadellidae. Es posible que algunas de
estas especies acten como antagonistas
y compitan con S. frugiperda, sin embargo
se deben realizar estudios adicionales que
corroboren esta afirmacin. Con lo anterior
es importante dejar claro que los enemigos
naturales no estn generando en arroz-
bosque un efecto sobre la abundancia de
larvas de S. frugiperda y por ende no existe
evidencia que afirme que la disminucin
en el nivel de poblacin de larvas de la
plaga se deba al bosque de galera.
En cuanto al parasitismo de larvas, no
se identific una relacin con la abundan-
cia de la plaga en ninguna zona de estu-
dio. Sin embargo, se evidenci un control
de S. frugiperda por parte del parasitoide
Apanteles marginiventris. En arroz-palma
se registr un parasitismo de 24,8% y en
arroz-bosque de 28,1%. La baja abundan-
cia de larvas registrada puede explicar
la dominancia de A. marginiventris en el
parasitismo, ya que segn Gross y Pair
(1986) este parasitoide se caracteriza por
atacar las poblaciones del cogollero del
maz cuando las densidades de la plaga
son bajas.
La mayora de especies parasitoides
necesitan fuentes alternas de alimento
como nctar y polen (Menalled et al., 1999),
recursos que los monocultivos de arroz
no proveen, por lo que debe haber hbi-
tats cercanos que ofrezcan estos recursos.
Un mtodo utilizado en esta investigacin
para conocer si las plantaciones de palma
y los bosques de galera en realidad esta-
ban ofreciendo recursos alternativos a los
parasitoides fue evaluando la presencia
de especies nectarvoras en los bordes.
El estudio identific que la abundan-
cia de especies nectarvoras aument en
arroz-palma a medida que la cercana a
los bordes fue mayor, mientras que en
arroz-bosque no se observ lo mismo.
Esto es una posible evidencia que apoya
la idea de que son las plantaciones de
palma las que estn ofreciendo recursos
adicionales, sin embargo son necesarios
estudios ms detallados para confirmar
esta afirmacin.
Apanteles marginiventris tiene una alta
capacidad de movimiento y colonizacin,
(Lpez-vila 2002; Van Driesche y Bellows,
1996). Lo anterior se evidenci en el estu-
dio al haber registrado porcentajes altos
de parasitismo en el tratamiento control,
resaltando que ste se encuentra aproxi-
madamente a 2000 m de los bordes.
Adicionalmente, en arroz-palma
se encontr otro parasitoide de larva
correspondiente a la familia Tachinidae
(Diptera), sin embargo su porcentaje de
parasitismo fue menor a 2%.
Parasitismo de huevos
No se registraron parasitismos en los
huevos del cogollero expuestos en
las trampas durante el estudio. Se ha
comprobado que parasitoides potenciales
de huevos S. frugiperda como Telenomus
sp. y Trichogramma sp. presentan alguna
resistencia a insecticidas (Gonzlez y Estay,
2003; Montesbravo, 1999), por lo que a pesar
de que hubo una aplicacin de insecticidas
en la zona, no explica suficientemente los
resultados obtenidos. El control de insectos
endopterigotos necesita realizarse en todos
los estados, y un control de la plaga en el
estado de huevo es de los ms efectivos si
se busca evitar daos al cultivo (Bianchi et
al., 2005). La metodologa utilizada para
detectar el parasitismo de huevos fue la
nica que se aplic dos veces con el fin
de corroborar que el muestreo se realiz
correctamente, y que el resultado no fue
debido a un error de muestreo. Por lo
anterior, es probable que aspectos como
la calidad y fragmentacin de hbitats
en la regin sean los responsables de no
haber registrado parasitismo de huevos.
Est comprobado que estos fenmenos a
escala de paisaje tienen mayor efecto en
la abundancia y riqueza de especies de
niveles trficos altos donde los parasitoides
son particularmente susceptibles (Kruess
y Tscharntke, 1994; Zabel y Tscharntke,
Figura 6. Correlacin de diversidad de
enemigos naturales frente a abundancia de
larvas de Spodoptera frugiperda en arroz-palma
Para el caso de arroz-bosque, se evi-
denci una relacin negativa (significan-
cia = 0,02) entre la diversidad de artrpo-
dos y la abundancia de larvas de S. frugi-
perda. En este caso es posible afirmar que
mayor diversidad incide negativamente
en la poblacin de la plaga (figura 7); sin
embargo, debido a que no se present una
relacin especfica con la diversidad de
enemigos naturales, es posible que el efec-
to sobre la plaga se deba a otras razones
como puede ser la presencia de especies
antagonistas que generen exclusin por
competencia (Greathead y Waage, 1983).
En arroz-bosque se identificaron 12
especies de fitfagos pertenecientes a
las familias Tettigonidae, Acrididae,
Pyralidae, Noctuidae, Miridae, Cupedidae,
Figura 7. Correlacin de diversidad artrpodos
frente a abundancia de larvas de Spodoptera
frugiperda en arroz-bosque
52
1998; Tscharntke y Kruess, 1999). Es
recomendable hacer estudios de poblacin
de este tipo de parasitoides de huevos en
el piedemonte llanero para conocer en
detalle la condicin demogrfica en la que
se encuentran estas especies.
Manejo de hbitat y diseo de
agroecosistemas
Con base en los resultados, se propusie-
ron estrategias que buscan promover el
control natural de plagas en monocultivos
de arroz del piedemonte llanero. Es priori-
dad la restauracin de hbitats claramen-
te degradados como son los bosques de
galera, ya que es la vegetacin nativa de
mayor importancia en la regin (Forero,
1998). Para esto, el diseo del paisaje es
una herramienta adecuada ya que propone
estrategias claras de restauracin (Farina,
2000). Es necesario mejorar las condiciones
de hbitat de estos bosques reduciendo
o removiendo los procesos amenazantes,
por lo que se requiere controlar las acti-
vidades en la matriz del paisaje (sistemas
productivos) para controlar as los proce-
sos degenerativos. Es indispensable res-
taurar los componentes de los mrgenes
en los bordes de cultivos, ya que las fun-
ciones que brindan son mltiples en pro
de un mejoramiento de las condiciones de
hbitat (Marshall y Moonen, 2002).
Es adecuado promover el mejoramien-
to de los corredores de vegetacin a tra-
vs del mejoramiento de la estructura
del suelo, la regeneracin de especies de
plantas o reintroduccin de especies de
flora y fauna (Gutzwiller, 2002). Es impor-
tante que estos bosques de galera ten-
gan una clara conectividad con parches
naturales, que permita de esta manera el
movimiento y dispersin de especies de
niveles trficos superiores.
La disminucin en la aplicacin de
qumicos es importante para un control
biolgico natural efectivo. Si este estudio
evidenci niveles de control biolgico
en unas condiciones con aplicacin de
productos para la proteccin de cultivos,
es lgico pensar que en condiciones sin
aplicacin de estos productos el control
biolgico aumente considerablemente.
Teniendo en cuenta la mejora de los
hbitats naturales, la estrategia a seguir
es evitar la colonizacin de S. frugiperda
a los cultivos. El paisaje en el que se
encuentra ubicada el rea de estudio es
homogneo y estructuralmente pobre con
una matriz dominante de coberturas bajas
(principalmente herbceas) ideales para
el establecimiento de S. frugiperda, por
lo que muy seguramente la colonizacin
de esta plaga a cultivos de arroz es alta.
Para esto se pueden promover controles
biolgicos y abiticos que eviten la entra-
da de la plaga al cultivo; estos controles
pueden generarse con la combinacin de
reas de plantaciones de palma con bos-
ques de galera. Adems, se debe buscar
estrategias para que el aumento de la
diversidad de enemigos naturales en los
bordes llegue al interior del monocultivo.
Thomas y colaboradores (1991) proponen
crear islas de hbitat en el interior de los
cultivos para promover el aumento de
depredadores. En este caso, los canales de
riego pueden aprovecharse como corre-
dores de vegetacin riparia que permitan
a especies benficas con baja capacidad de
dispersin adentrarse en los cultivos.
En resumen, es importante integrar
cultivos perennes, hbitats naturales y
cultivos de arroz para promover el control
natural, aumentar la estabilidad de los
cultivos y reducir la dependencia de insu-
mos qumicos y disminucin de costos a
largo plazo en el piedemonte llanero.
Limitaciones del estudio
Durante el estudio se presentaron algunos
aspectos de manejo tanto del cultivo como
del ecosistema circundante que pudieron
influir de manera significativa sobre los
resultados. La aplicacin de productos
para la proteccin de cultivos es la prin-
cipal variable que intervino en los datos
obtenidos. Productos aplicados como
methoxifenozide no slo genera efectos
sobre la plaga sino sobre la diversidad de
artrpodos. Esto condiciona la capacidad
de algunas especies parasitoides y preda-
doras de colonizar los cultivos y generar
controles en la plaga.
Para conocer el efecto de la aplica-
cin de insecticidas sobre la diversidad
y abundancia de la plaga, es necesario
un estudio temporal antes y despus
de la aplicacin, por lo que este estudio
no tuvo la capacidad de cuantificar esta
variable dado que fue un estudio esttico.
Sin embargo, la aplicacin de productos
para la proteccin de cultivos aunada a
la inundacin de cultivos, pudo haber
ocasionado la baja abundancia de larvas
de S. frugiperda lo que limit el anlisis de
los resultados. La poca del muestreo es
la de mayor abundancia del cogollero en
la zona, por lo que se realiza una alta apli-
cacin de qumicos de manera preventiva
por parte de los agricultores.
Como se mencion anteriormente, la
inundacin de los cultivos es una variable
que afecta notoriamente la abundancia
de la plaga y la diversidad de artrpodos
en los cultivos de arroz. La alta humedad
de los cultivos gener algunos problemas
en la recoleccin de artrpodos con red
entomolgica.
Tambin es pertinente resaltar que
el bosque de galera que se estudi se
encontraba en muy malas condiciones
por la presin de actividades ganaderas
y la constante aplicacin de qumicos
por la cercana a los cultivos de arroz. Se
realizaron tres transectos en el bosque,
se determin la estructura de la vege-
tacin en cao Cuchillo como un bos-
que bajo (altura mxima 12 m), abierto,
altamente intervenido y degradado, con
alta presencia de especies pioneras como
Melastomatceas. Se observ claramente
el deterioro del bosque por la presencia
del ganado y por el manejo intensivo de
los sistemas de cultivos arroceros. A partir
de esto, es importante aclarar que el mal
estado de este ecosistema pudo influir
considerablemente en los datos obtenidos
en la zona arroz-bosque.
Los mrgenes de los cultivos de arroz
no estaban adecuadamente diseados,
ya que no incluan los elementos que se
recomienda para este tipo de cultivos
como sonlos lmites de cultivo, la
franja y el borde del cultivo. Se ha
comprobado que estos elementos ayu-
dan a la amortiguacin de la actividad
agrcola en las mrgenes, evitando efec-
tos negativos drsticos sobre los bosques
(Marshall y Moonen 2002).
CONCL US I ONE S
El trabajo permite concluir que los mrge-
nes con plantaciones de palma de aceite y
bosques de galera ejercen un efecto sobre
la abundancia de adultos de S. frugiperda
en cultivos de arroz.
53
Depredadores, en especial los corres-
pondientes al orden Odonata, parecen
influir de manera directa sobre la abun-
dancia de adultos de S. frugiperda en los
mrgenes de los cultivos. Este efecto se
evidenci tanto en cercanas a plantacio-
nes de palma de aceite como al bosque
de galera.
La diversidad de enemigos natura-
les promovida particularmente por las
plantaciones de palma de aceite parece
influir sobre la abundancia de larvas de
S. frugiperda.
En los mrgenes de los cultivos (tanto
adyacentes a plantaciones de palma como
a bosque de galera) se observ aumento
en la diversidad de enemigos naturales
de S. frugiperda y un cambio en la compo-
sicin de especies en comparacin con el
interior del cultivo (control).
La especie Apanteles marginiventris es
un parasitoide de gran importancia en
el control biolgico natural de larvas del
cogollero en cultivos de arroz cercanos
tanto a plantaciones de palma de aceite
como a bosques de galera.
No se registraron parasitoides de hue-
vos de S. frugiperda en campo, por lo
cual es recomendable realizar estudios
detallados sobre diversidad y abundancia
de este tipo de insectos benficos en el
piedemonte llanero.
Las plantaciones de palma de aceite y
los bosques de galera pueden calificarse
como vegetacin que puede llegar a otor-
gar servicios ambientales a cultivos de
arroz para el control de plagas.
Es importante recalcar que los resul-
tados obtenidos con relacin al bosque
de galera estudiado se vieron afectados
principalmente por la baja calidad de su
hbitat. Por otro lado, los resultados en
las distintas zonas de estudio estuvieron
afectados por la aplicacin de insumos
qumicos.
AGRADE CI MI E NTOS
Especiales agradecimientos a la compaa
Soceagro S.A. por permitir la realizacin
de esta investigacin en sus predios. A
Corpoica, por permitir el acceso a la
Coleccin Taxonmica Nacional de Insec-
tos. A Orlando Parada y Elizabeth Agui-
lera por los valiosos y tiles aportes y
consejos para la realizacin del trabajo.
RE F E RE NCI AS
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REVI EW ARTI CLE
Takumasa Kondo
1
, Penny J. Gullan
2
,
Douglas J. Williams
3
Coccidologa. El estudio de insectos
escama (Hemiptera: Sternorrhyncha:
Coccoidea)
RE S UME N
Se presenta una breve introduccin a la
ciencia de la coccidologa y se discute una
sinopsis de la historia, avances y desafos de
este campo de estudio. Se hace una breve
revisin de los cambios de la coccidologa
desde la publicacin de Systema Naturae por
Carolus Linnaeus hace 250 aos. Tambin
se discuten la importancia econmica, las
relaciones filogenticas y la aplicacin de
cdigos de barras del ADN en la identificacin
de insectos escama.
Palabras clave: insectos, escama, coccidae,
ADN, historia.
Coccidology. The study of scale insects (Hemiptera:
Sternorrhyncha: Coccoidea)
AB S T RACT
A brief introduction to the science of coccidology, and a synopsis of the history,
advances and challenges in this field of study are discussed. The changes in coccidology
since the publication of the Systema Naturae by Carolus Linnaeus 250 years ago are
briefly reviewed. The economic importance, the phylogenetic relationships and the
application of DNA barcoding to scale insect identification are also considered in the
discussion section.
Keywords: Scale, insects, coccidae, DNA, history.
Radicado: 15 de septiembre de 2008
1
Entomologist Ph.D. Corporacin Colombiana de
Investigacin Agropecuaria Corpoica, C.I. Palmira,
Colombia. tkondo@corpoica.org.co
2
Entomologist Ph.D. Department of Entomology,
University of California, One Shields Avenue, Davis,
CA 95616, U.S.A.
3
Entomologist Ph.D. Department of Entomology, The
Natural History Museum, London SW7 5BD, U.K.
I NT RODUCT I ON
Coccidology is the branch of
entomology that deals with the study of
hemipterous insects of the superfamily
Coccoidea, particularly on areas related
to systematics. For the purpose of this
synopsis, we set the starting point for the
study of coccidology as 1758, beginning
with Carl Linnaeus 10
th
edition of the
Systema Naturae (Linnaeus, 1758). During
this period of 250 years, the number of
described scale insects has increased from
24 species (Williams, 2007) to some 7,700
species in more than 1,050 genera (Ben-
Dov et al., 2006). The root of the word
coccidology is derived from the word
Coccus, the genus in which Linnaeus
included the bulk of his scale insects. Most
scale insects were not recognisable as
insects by the ancients, but rather as seeds
or berries, and were given the ancient
Greek word Kokkos and then the later
Latin word Coccus meaning a berry.
The word coccidology, as a branch of
entomology, was probably coined for the
first time by Tinsley (1899) in his article
Contributions to coccidology. I. Here
we attempt to summarize briefly how
coccidology has changed in the last 250
years, with emphasis on the remarkable
changes that have happened in the
field in the XXI century. This account
supplements a brief history of Coccoidea
by Ferris (1957).
What are scale insects?
Scale insects are sap sucking hemipterous
insects that include all members of the
superfamily Coccoidea. These are closely
related to aphids (Aphidoidea), whiteflies
(Aleyrodoidea) and jumping plant lice
(Psylloidea), which make up the suborder
Sternorrhyncha (Gullan & Martin, 2003).
These insects are usually less than 5 mm
in length. Their taxonomy is based mainly
on the microscopic cuticular features of
the adult female. The adult female is
paedomorphic, maturing in a juvenile
form, whereas the adult male (when
present), after going through a prepupal
and pupal stage, turns into an alate with
non-functional mouthparts. The Coccoidea
form a rather small group of insects
in terms of species richness with some
7,700 species described. However, scale
insects are an interesting group of insects
to study. According to Gullan & Cook
(2007), scale insects have great variation
in chromosome number (Nur et al., 1987);
sperm structure (Robison, 1977; 1990);
types of bacterial endosymbioses (Buchner,
1965; Thao et al., 2002; Gruwell et al., 2005,
2007); and genetic systems, including
hermaphroditism, diplodiploidy,
thelytoky and haplodiploidy (Nur, 1980;
Normark, 2003). Their morphology
varies greatly amongst members of the
different families, with some species
producing cysts (e.g. Margarodidae
sensu stricto) that can live underground
for many years, and other species are
highly modified to live under the bark
of their hosts (e.g., some Diaspididae
and Eriococcidae). For ecologists and
evolutionary biologists, scale insects are
often subjects to study because of their
mutualistic relationships with tending ants
and their close associations with their hosts.
For example, the ant-scale association
in Macaranga plants has been a subject
of studies in Southeast Asia (Heckroth
et al. 1998; Ueda et al., 2008). Moreover,
some scale insects are even known to
have symbiotic relationships with stingless
bees (Hymenoptera: Apidae: Meliponinae)
(Camargo & Pedro, 2002).
56
Coccidology. The study of scale insects (Hemiptera: Sternorrhyncha: Coccoidea)
There are currently 46 known scale insect
families, of which 32 are extant and 14 are
known only as fossils. Scale insects are
generally divided into two informal groups,
the archaeococcoids and the neococcoids.
The archaeococcoids are defined by the
presence of 28 pairs of abdominal spiracles,
which are absent in the neococcoids. The
archaeococcoids consist of 27 families,
i.e., 15 extant families (Callipappidae,
Carayonemidae, Coelostomidiidae,
Kuwaniidae, Marchalinidae, Margarodidae,
Matsucoccidae, Monophlebidae,
Ortheziidae, Phenacoleachiidae,
Pityococcidae, Putoidae, Steingeliidae,
Stigmacoccidae and Xylococcidae) and 12
fossil families (Electrococcidae, Jersicoccidae,
Kukaspididae, Labiococcidae, Naibiidae
and seven recently described families,
namely Arnoldidae, Lithuanicoccidae,
Weitschatidae, Grohnidae, Serafinidae
(Koteja, 2008), and Hammanococcidae and
Lebanococcidae (Koteja & Azar, 2008)).
The neococcoids are composed of
17 extant families, i.e., Aclerdidae,
Asterolecaniidae, Beesoniidae,
Cerococcidae, Coccidae, Conchaspididae,
Dactylopiidae, Diaspididae, Eriococcidae,
Halimococcidae, Kermesidae, Kerriidae,
Lecanodiaspididae, Micrococcidae,
Phoenicococcidae, Pseudococcidae and
Stictococcidae; and 2 extinct families,
namely Inkaidae and the recently
described Pennygullaniidae (Koteja
& Azar, 2008). Koteja and Azar (2008)
considered the Putoidae a neococcoid,
however, we consider this family (and the
probably related Labiococcidae) to belong
to the archaecoccoids. The adult females of
species of Putoidae superficially are most
similar to those of the neococcoid family
Pseudococcidae, with most females of
these families possessing trilocular pores,
cerarii and dorsal ostioles. However, the
adult females of Putoidae differ from
those of Pseudococcidae in having: (i)
three or four campaniform sensilla on
each surface of each trochanter; (ii) three
pairs of interflagellar setae; and (iii) a pair
of basal denticles on each claw (Hardy et
al., 2008). Furthermore, the adult males of
putoids differ from those of pseudococcids
in many morphological features (Hardy et
al., 2008; Hodgson & Foldi, 2006) and
the chromosome system of putoids does
not show paternal genome elimination,
which is characteristic of neococcoids
(Cook et al., 2002).
Scale insects are known by various
names depending on the family to
which they belong, e.g., the armoured
scales (Diaspididae), the mealybugs
(Pseudococcidae), the putoids (Putoidae),
the soft scales (Coccidae), the felt
scales (Eriococcidae), ground pearls
(Margarodidae), lac insects (Kerriidae),
cochineal insects (Dactylopiidae), and
ensign scales (Ortheziidae). The most
commonly encountered families are
those with the most species, namely
the Diaspididae, Pseudococcidae and
Coccidae.
Although among the ortheziids
Arctorthezia cataphracta (Olafsen) is known
to feed on a basidiomycete fungal species
(Thorpe, 1968) and Newsteadia kanayana
Kawai & Takagi on fungal mats (Kawai,
1980), the majority of scale insects feed
on plants, especially flowering plants
(angiosperms). Scale insects are generally
phloem-sap feeders; however, some feed
on parenchyma tissue by directly feeding
on the contents of parenchymatic cells.
Scales are found on various parts of
their hosts, and may infest leaves, twigs,
branches and roots, and some live inside
plant domatia. Some scale insects are even
known to survive on plants completely
submerged at high tide (Harrison, 1916).
Many are important pests of agriculture
(e.g., Peronti et al., 2001; Miller et al.,
2005; Culik et al., 2007) and may injure
or kill plants by depleting them of their
sap, injecting toxins, transmitting viruses
or excreting honeydew, which serves as
a medium for sooty moulds (Williams
& Granara de Willink, 1992; Gullan &
Martin, 2003).
Scale insects have been known for
centuries, not just for the damage they
cause, but for the useful red dyes that some
of them produce, for valuable secretions
in the form of waxes and resins, and even
for their use as medicine and food. In the
Oriental Region, Mahdihassan (1954), for
instance, has given us an account of how
lac insects were known to the Chinese in
writings dating to 320 AD when the insects
produced a red dye and a substance for
sticking things together. Lac insects are
now known to be tropicopolitan. The most
important species are still deliberately
grown in India and surrounding countries
for shellac and sealing wax. The use of
lac in India probably dates back many
centuries. In the New World, Chamberlin
(1923) reported that the Mexicans used the
lac of Tachardiella fulgens Comstock, under
the name of jomilla, medicinally and
for repairing crockery and other utensils.
Kamel & Afifi (1970) have reported how
the wax from Ceroplastes africanus Green
in Egypt is used for welding porcelain
and mending metal cracks and holes.
Another scale insect, Kermes vermilio
Planchon (Kermesidae), that produces a
red dye, has been known for more than
two millennia and lives on species of
oaks around the Mediterranean shores
(Foldi, 2003). These insects were originally
thought to be little worms, hence the Latin
name vermiculi from which the name
vermilion is derived (and similar names
in languages derived from Latin).
Armenian red, a name for the red
dye obtained from the scale insect
Porphyrophora hameli Brandt that lives
mainly on grass roots in Armenia and
surrounding countries was widely used
for dying silks (Donkin, 1977b). A related
insect Porphyrophora polonica (L.) found in
Poland and surrounding areas, known as
the Polish cochineal insect, also feeding
on roots, was widely used to produce a
red dye and exported to Western Europe.
Both of these insects are peculiar in that
the intermediate instars encyst and these
cysts were originally thought to be of plant
origin. A famous treatise on this insect by
John Philip Breyn (Breyn, 1731) showed
how an insect could be studied in detail
and illustrated showing all the instars.
In the New World, the cochineal
insect of commerce, Dactylopius coccus
Costa, a species used by Mayans, Aztecs
and Incas, interested many European
workers. The red dye produced by this
insect proved to be superior to any of the
red dyes produced by other scale insects
(for an account see Donkin, 1977a) and
at a time the species was even grown
on cactus in North Africa. The Spanish
also exported supplies to southern Asia
via the Philippines from South America
(Donkin, 1977b). Currently, the cochineal
insect is grown for commercial purposes
in Chile, Mexico, Peru and the Canary
Islands. Cochineal dye is still produced
commercially in chemical factories in
Europe and the USA (Prez Guerra &
Kosztarab, 1992) and has been used as
57
a biological control agent of noxious
Opuntia weeds (Moran & Zimmermann,
1984; Volchansky et al., 1999).
Scale insects provide other products
too. It is generally thought that flower
nectar is the main ingredient of honey.
However, honeybees collect other sweet
ingredients, especially when flowers are
scarce. In Greece and Turkey, honeybees
collect honeydew from Marchalina
hellenica (Gennadius) (Marchalinidae)
feeding on pine trees and, in Greece
alone, this pine honey accounts
for 60%65% of all honey produced
(Hodgson & Gounari, 2006). In Middle
Europe, about 50% of all honey produced
is from honeydew, particularly from
the soft scale Physokermes hemicryphus
(Dalman), a species found mostly on
the Norway spruce, Picea abies (Kunkel,
1997). According to Kunkel (1997), the
honeydew of many species of scale
insects in at least six families are known
as a source of bee honey worldwide.
The pela wax scale, Ericerus pela
(Chavannes), is cultivated in China
for the production of high quality wax
(Qin, 1997). The wax of this soft scale is
produced by the immature stages (second-
instar nymphs, prepupa and pupae) of
the males and is used for making candles,
coating material for pills, papers, and
for shining leather products and tires
amongst its uses.
Some scale insects are also used as
human food. In Australia, aboriginal
people eat the gall-inducing scale,
Cystococcus pomiformis (Froggatt), which
according to the natives has a watery
female and nutty-flavoured nymphs
(Gullan & Cranston, 2005). In Sakorn
Nakorn Province, Thailand, the giant
mealybug, Nietnera sp. (Margarodidae
sensu lato) is cooked together with sticky
rice and consumed (Kondo, 2001).
History of Coccidology
Like many other fields in entomology,
coccidology has gone through its own
evolution. The original Latin description of
Coccus hesperidum (L.), as given in Systema
Naturae (1758: 455-457) can be fitted in one
sentence as follows: The Coccus of the
greenhouses; It lives on evergreen trees
(English translation as given in Williams,
2007). The most recent redescription of C.
hesperidum by Hodgson (1994) consists of
three and a half pages beginning with a
section on classification and nomenclature,
a description including the morphology
of the insect in life and of slide-mounted
specimens as seen under a compound
microscope, a figure, a section on the
material studied and a discussion section
where the author considers its affinities
with other coccids. In Linnaeus time, a
single sentence sufficed to describe C.
hesperidum, however, the family Coccidae
in which C. hesperidum is included
currently contains more than 1,100 species
in more than 100 genera! Even after 250
years, C. hesperidum continues to be a
common scale insect in greenhouses, but
we know now that there are many other
scale insects that are commonly found in
greenhouses. For example, in southeastern
USA, according to Baker (1994), the list of
common scale insects in greenhouses and
on indoor plants includes the mealybugs:
Planococcus citri (Risso), Pseudococcus
longispinus (Targioni Tozzetti), Phenacoccus
gossypii Townsend & Cockerell [probably a
misidentification of Ph. madeirensis Green],
Rhizoecus falcifer Kunckel dHerculais, the
armoured scales Diaspis boisduvalii Signoret
and Pinnaspis aspidistrae (Signoret), and
the soft scales, Coccus hesperidum L.,
Eucalymnatus tessellatus (Signoret) and
Saissetia coffeae (Walker). Thus, Linnaeuss
1758 description of C. hesperidum is not
useful in the present day.
It was Rn Antoine Ferchault de
Raumur who produced a remarkable
account of scale insects, mainly of
Europe, with illustrations of the external
appearance (Raumur, 1738), many of
which can be recognised today. Linnaeus
(1758), in his Systema Naturae, the starting
point of zoological nomenclature, drew
heavily on Raumurs work for his
chapter on the genus Coccus.
In the 18th and 19th centuries, some of
the European countries were interested in
the fauna of their overseas territories. Insects
were sent to Europe for identification and
it became clear that identification from the
external appearance was not satisfactory.
With better microscopes, entomologists
such as Signoret in many works on scale
insects from 18601886 produced articles
based on slide-mounted specimens (Ben-
Dov & Matile-Ferrero, 1995). Unfortunately,
only a few of his mica slides have survived
(Deyrolle, 1875).
There then followed important works
based on slide-mounted specimens by
William Miles Maskell in New Zealand
from 18791897 and by Theodore Dru
Alison Cockerell, Edward Ernest Green,
Robert Newstead and many French
workers whose slide collections are
housed in the United States National
Museum of Natural History (actually
at the USDA, Beltsville, Maryland),
The Natural History Museum, London,
and the Musum National dHistoire
Naturelle, Paris. Although identifications
are possible from many illustrations by
these authors, we owe much gratitude
to Gordon Floyd Ferris who, in a series
of articles published in the journal
Microentomology from 19361955 and
in his Atlas of Scale Insects of North
America (19371955), adopted a method
of illustration first used by Karl ulc
(ulc, 1895). This method includes a full
outline of the insect divided by a line in
the middle and showing the dorsum on
the left and the venter on the right with
enlargements of important characters
either elsewhere on the illustration
or around the perimeter of the main
drawing. This unique drawing method for
scale insects was adopted later by Alfred
Serge Balachowsky and most subsequent
authors and has stood the test of time
so that accurate identifications can now
be made from printed works. Although
access to slide collections is necessary, it
has even become clear that some of the
oldest microscope slide preparations in
collections can be remounted successfully
when necessary.
Scale insects as economic pests
There have probably been outbreaks of
scale insects causing damage to local
crops and plants for centuries, but the
arrival in the USA of Icerya purchasi
Maskell (Monophlebidae) towards the
end of the 19th century, resulting in the
almost collapse of the citrus industry,
seemed to attract attention throughout the
world. Outbreaks causing considerable
damage are occurring to the present day
and in the last 40 years the accidental
introduction of the cassava mealybug
Phenacoccus manihoti Matile-Ferrero
(Pseudococcidae) from South America to
58
West Africa caused considerable damage
to cassava throughout Africa affecting the
staple food of 200 million people (Herren
& Neuenschwander, 1991). About the
same time, another mealybug Rastrococcus
invadens Williams was introduced to West
Africa from the Oriental Region affecting
a wide variety of fruit trees (Agounk
et al., 1988). In more recent times, the
hibiscus mealybug Maconellicoccus hirsutus
(Green) was introduced accidentally to the
Caribbean area affecting a large number
of plant species including fruit trees and
plants of economic importance (Chang
& Miller, 1996). Yet another mealybug
species, the papaya mealybug Paracoccus
marginatus Williams & Granara de Willink
that had been known only locally in
Mexico, suddenly spread to much of the
Caribbean area and beyond (Miller et
al., 2001). All of these pest species were
brought under control by parasitoids or
predators with the aid of taxonomists who
could identify the pest species accurately
and suggest areas where natural enemies
could be located. More recently, the lobate
lac scale Paratachardina pseudolobata Kondo
& Gullan has caused serious damage in
Florida, the Bahamas and in Christmas
Island, Australia (Kondo & Gullan 2007;
Schroer et al., 2008). In Florida alone, the
lobate lac scale has been recorded on over
300 species of plants (Howard et al., 2006).
Now this scale has also been reported in
Cuba, and no effective natural enemies
have been found because its place of
origin is still unknown.
One would expect that these outbreaks
might lead to an increase in workers
studying the group but in three of the
worlds most important centres for scale
insects housed in the USDA at Beltsville,
Maryland, The Natural History Museum,
London, and the Natural History Museum
in Paris, there are no full-time employed
incumbents and research is carried out by
retired associates or collaborators.
The phylogenetic relationships of scale
insects
New tools and resources are making the
study of scale insects by taxonomists more
exciting, and in some administration centres
it is thought that eventually identifications
from the DNA of a species could dispense
with the skill of the traditional taxonomist.
However, there will always be a need to
link a DNA sequence to a certain species,
which needs to be identified by the
traditional taxonomic expert.
The classification of the Coccoidea,
particularly the archaeococcids has gone
through a series of overhauls in the last 40
years. Koteja (1974) introduced a multi-
family classification for scale insects
based on the morphology of mouthparts
recognizing a number of families formerly
included in the Margarodidae sensu lato.
In a special edition of the online journal
Zootaxa celebrating the 300
th
anniversary
of the birth of Carolus Linnaeus (Zhang &
Shear, 2007), Gullan & Cook (2007) gave
a summary of our current understanding
of the higher classification of the
Coccoidea. Many coccidologists now
accept that the superfamily Coccoidea
comprises up to 32 extant families. The
neococcoids are considered more derived
than the archaeococcoids and form a
monophyletic group supported by both
morphological and genetic data, but the
monophyly of the archaeococcoids is
uncertain and their higher-level ranks
have been controversial.
Recent studies using the nuclear small
subunit ribosomal RNA gene (SSU rRNA
or 18S) have helped resolve some of the
higher relationships within the Coccoidea,
particularly those of the neococcoids.
According to Gullan and Cook (2007), future
studies may show that some of the species-
poor families are autapomorphic members
of a larger group, e.g., the Aclerdidae and
Micrococcidae are similar to Coccidae and
their recognition at family rank may render
the Coccidae paraphyletic; the Beesoniidae,
Dactylopiidae and Stictococcidae are each
closely related to a different subset of the
Eriococcidae in molecular phylogenetic
studies; the Phoenicococcidae is monotypic
and together with the Halimococcidae
has affinities to the Diaspididae; the
Conchaspididae resemble the diaspidids
and also other distantly related
neococcoids, and its phylogenetic position
is an enigma.
The higher-level relationships of the
archaeococcoids still remain unresolved.
According to Gullan and Cook (2007),
the extent of 18S divergence among the
coccoid families is as high as or higher
than among the aphid families, and
it seems that the radiation of extant
archaeococcoid families occurred well
prior to that of extant aphid families.
They suggest the lack of resolution of
relationships among scale insect families
from 18S data and morphology indicates
that the basal radiations might have been
relatively rapid (Gullan & Cook, 2007).
In order to elucidate the unresolved
phylogenetic relationships of scale insects,
future studies may consider increasing
taxon sampling and the number of infor-
mative genetic markers, as well as adding
more morphological data, especially from
the adult males and first-instar nymphs.
Insects of the suborder Sternorrhyncha
harbor maternally transmitted bacteria
housed in a specialized organ called
the bacteriome (von Dohlen et al.,
2001). Mealybugs have primary and
secondary endosymbionts belonging
to different subdivisions of the phylum
Proteobacteria, although some mealybug
species lack secondary endosymbionts
(von Dohlen et al., 2001; Thao et al., 2002).
The primary endosymbionts of armoured
scale insects belong to a different phylum,
the Bacteroidetes, and their phylogeny
follows closely that of their scale insect
hosts (Gruwell et al., 2007). This appears
also to be the case in mealybugs in which
the mealybug microbial ecology appears
strongly correlated with phylogeny
(Downie & Gullan, 2005; Hardy et al.,
2008). Perhaps it may be possible to help
elucidate unresolved relationships of scale
insects by looking at the relationships of
their endosymbionts.
DNA Barcoding and scale insects
DNA barcoding uses a short fragment
of the mitochondrial DNA to link an
organism to a species (Herbert & Gregory,
2005). The mitochondrial DNA (mtDNA)
of eukaryote cells has a relatively fast
mutation rate, resulting in significant
variance in mtDNA sequences between
species but generally small variation within
species. The concept of barcoding has been
successfully implemented in organisms
such as some birds (Hebert et al., 2004a),
mammals (Borisenko et al., 2008), and
insects, especially Lepidoptera (e.g., Hebert
et al., 2004b). The genetic marker of choice
for DNA barcoding (sanctioned by the
Consortium for the Barcode of Life, CBOL)
has been the 5 region of the CO1 gene,
59
but in scale insects, universal primers fail
to amplify the region for any but a few
taxa. Instead the D2 region of 28s rDNA
is currently being proposed by scale insect
workers as a possible marker for barcoding
of scale insects. The barcoding method in
coccidology is closely associated with the
preparation of voucher specimens and the
correct identification of the scale insect by
taxonomic experts. The aim of barcoding in
scale insects is the accurate, economic and
fast identification of important pest species.
The damage caused by scale insects is said
to sum up to billions of dollars in damage
and control every year (Kosztarab, 1990).
Coccidologists in general agree that DNA
barcoding is not a replacement tool for
systematics, but rather a tool that can be
used for identification of morphologically
defined species. We agree with Kipling
and Rubinoff (2004) in that an extremely
well developed background knowledge
of the taxa to be sampled and an a priori
understanding of sequence variation
among populations and individuals
are needed in order to use properly the
barcoding method.
al., 2006), which allows users to obtain
information on numerous aspects of most
described species by just the click of a
button. Advances in molecular genetics
are helping to resolve the phylogenetic
relationships of this morphologically
highly derived group, and new techniques
such as barcoding are being contemplated
as a tool for identification of common
pest species. Despite all of these advances
in technology, and our accumulated
knowledge about scale insects, the field
of coccidology still faces many challenges.
The higher-level relationships of scale
insects are far from being resolved, and
every year there are new species of
scale insects being added to the list of
agricultural pests. Perhaps, the greatest
problem that the field of coccidology
faces today is the decline of scale insect
specialists worldwide. Museums that used
to employ coccidology experts no longer
replace the retirees. We only hope that
the science of coccidology will continue
to progress.
ACKNOWL E DGE ME NT S
Many thanks to Dr. Lyn G. Cook,
University of Queensland, for reviewing
the barcoding section of the manuscript.
Thanks also to Juan Jaramillo Vsquez,
Corpoica, Centro de Investigacin
Palmira, and three anonymous reviewers
for kindly reviewing the manuscript.
RE F E RE NCE S
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Figure 1. DNA Barcoding and scale insects
DI S CUS S I ON
The advances in coccidology during the
last 250 years have been remarkable.
The number of scale insect species has
increased from 24 species in 1758, to
nearly 8000 species today. Our knowledge
on the taxonomy of Coccoidea has
been substantial; with the advances of
high-resolution microscopes, electron
microscopy, digital photography,
computer illustration and graphic
editing programs, molecular biology and
phylogenetic methods have contributed
to high standard descriptions of scale
insects. The worldwide web has made
possible the creation of the online scale
insect database ScaleNet (Ben-Dov et
60
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Hugo Alexander Jaramillo Torres
1
,
Roco Esperanza Patio Burbano
2
,
Jos Luis Rodrguez Bautista
3
Yersinia pseudotuberculosis detection in
feces of guinea pigs (Cavia porcellus)
using microbiological and molecular
methods
AB S T RACT
The suitability of two methodologies, a
conventional microbiological method and a
molecular method, based on amplifications
by Polimerase Chain Reaction (PCR) was
evaluated for the detection of Yersinia
pseudotuberculosis in feces of guinea pig. The
analytical sensitivity and analytical specificity,
as well as the economic cost, time and
complexity for each method were evaluated.
Molecular detection of Y. pseudotuberculosis
was done by a nested PCR with specific
primers for the inv chromosomal virulence
gene. The microbiological confirmation was
done by using a commercial identification
kit. In order to reduce the side effect caused
by PCR inhibitors that are normally present
in feces, an amplification protocol for such
type of samples was standardized. The
highest sensitivity level was observed in
the method that combined pre-enrichment,
microbiological isolation and PCR. This
method was able to detect bacterial
concentrations between 1.5 x 10
4
and 1.5 x
10
3
colony-forming units per gram (CFU/g)
of feces, whereas the highest diagnostic
sensitivity level obtained by nested PCR was
1.5 x 10
5
CFU/g of feces. Both, the molecular
and the microbiological methodologies, had
advantages with experimentally inoculated
sterile feces. Since the detection of the
microorganism on samples of non-sterilized
feces was difficult using either method, the
use of a combination of microbiological
and molecular techniques is suggested to
get a better diagnostic performance for the
detection of this pathogen.
Keywords: PCR, yersiniosis, diagnosis, fezes,
enterobacteriaceae.
Deteccin de Yersinia pseudotuberculosis en
heces de cuyes (Cavia porcellus) utilizando una
metodologa microbiolgica y una molecular
RE S UME N
En este trabajo se evalu el desempeo de dos metodologas, una microbiolgica y
una molecular basada en la amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), para la deteccin de Yersinia pseudotuberculosis en heces de cuyes. La evalua-
cin de cada una de las metodologas se realiz teniendo en cuenta su sensibilidad y
especificidad analtica, as como su costo econmico, tiempo y complejidad. La detec-
cin molecular de Y. pseudotuberculosis se realiz por PCR anidada usando iniciadores
especficos para el gen de virulencia cromosomal inv, mientras que en los ensayos
microbiolgicos la identificacin bacteriana se hizo mediante una batera comercial de
perfiles bioqumicos. Se estandariz un protocolo de amplificacin en materia fecal,
el cual redujo el efecto negativo que causan los inhibidores de la PCR presentes en
muestras de esta naturaleza. La sensibilidad analtica ms alta se observ con la meto-
dologa en la que se combin preenriquecimiento, aislamiento microbiolgico y PCR,
con un rango de deteccin entre 1,5 x 10
4
y 1,5 x 10
3
unidades formadoras de colonias
por gramo (ufc/g) de material fecal; mientras que la mayor sensibilidad obtenida en
PCR anidada fue de 1,5 x 10
5
ufc/g de materia fecal. Tanto la metodologa microbiol-
gica como la molecular presentaron ventajas en los ensayos en los que se us materia
fecal estril experimentalmente inoculada. Sin embargo, en muestras de materia fecal
sin esterilizar la deteccin del microorganismo se dificult al utilizar una nica meto-
dologa, por lo que se sugiere combinar tcnicas microbiolgicas y moleculares para
obtener un mejor desempeo diagnstico.
Palabras clave: PCR, yersiniosis, diagnstico, materia fecal, enterobacteriaceae.
Radicado: 4 de agosto de 2008
1
Investigador profesional en misin. Grupo Salud
Animal. Corpoica, Ceisa. ajaramillo@corpoica.org.co
2
Investigador especialista asistente. Grupo Salud
Animal. Corpoica Ceisa. rpatino@corpoica.org.co
3
Investigador mster asistente. Grupo Salud Animal.
Corpoica Ceisa. jlrodriguez@corpoica.org.co
I NT RODUCCI N
La yersiniosis en cuyes (Cavia por-
cellus) es una enfermedad causada por
Yersinia pseudotuberculosis, una bacteria
perteneciente a la familia Enterobacteria-
ceae que est relacionada genticamente
con dos especies de gran importancia
en salud pblica, Yersinia enterocolitica y
Yersinia pestis. Aunque se ha reportado Y.
pseudotuberculosis como agente causal de
enfermedad en humanos, es principal-
mente un patgeno de animales (Viboud
y Bliska, 2005). En los cuyes la yersiniosis
es una de las enfermedades que causan
importantes prdidas econmicas debido
a sus altos ndices de morbi-mortalidad
(Gonzlez et al., 1989).
La cuyicultura se desarrolla en Colom-
bia principalmente en Nario y Cauca;
estos departamentos contribuyen con
85,3% y 9,4% respectivamente, del total
de la poblacin cuycola del pas, esti-
mada en 1.292.644 animales en el 2007.
La cuyicultura se ha constituido en una
alternativa de produccin tradicional en
Nario gracias a los bajos costos de inver-
sin; provee a la poblacin campesina
una fuente de protena, as como la posi-
bilidad de obtener beneficios econmicos
paralelo al desarrollo de otras actividades
agrcolas y pecuarias (Ministerio de Agri-
cultura y Desarrollo Rural, 2007).
A pesar del impacto de la yersinio-
sis en la produccin cuycola, no se
han tomado medidas sanitarias efectivas
para su control debido principalmente a
la carencia de programas de diagnstico
y prevencin. Actualmente los produc-
tores medican los animales con base
en experiencias previas de brotes de la
enfermedad. Sin embargo, los signos cl-
nicos de la yersiniosis son inespecficos y
pueden ser confundidos con otras enfer-
medades como la salmonelosis. Este tipo
de tratamientos sin criterio diagnstico
contribuye a la aparicin de cepas bac-
terianas resistentes a antibiticos, lo cual
puede causar serias repercusiones en la
salud humana (Paglia et al., 2005).
Algunas de las pruebas que actual-
mente se utilizan para la deteccin de Y.
pseudotuberculosis son hemoaglutinacin,
aislamiento bacteriano y confirmacin
mediante pruebas bioqumicas, las cuales
SANI DAD
ANI MAL
63
Deteccin de Yersinia pseudotuberculosis en heces de cuyes (Cavia porcellus) utilizando una metodologa microbiolgica y una molecular
tienen limitado valor diagnstico ya que
tienden a ser dispendiosas, poco sensibles
y requieren de mucho tiempo para su
desarrollo. Debido a la importancia del
diagnstico como herramienta en el con-
trol de las enfermedades infecciosas, es de
gran inters determinar una metodologa
diagnstica base, con buen nivel de sen-
sibilidad y especificidad. El objetivo de
este trabajo fue evaluar el uso de meto-
dologas microbiolgicas y moleculares
para la deteccin de Y. pseudotuberculosis
en muestras de materia fecal de cuyes
experimentalmente inoculadas.
Cepas bacterianas
Las cepas bacterianas utilizadas en este
estudio pertenecen a la coleccin del
laboratorio de salud animal de Corpoica
Ceisa. Se utilizaron dos cepas de referen-
cia de Y. pseudotuberculosis: una de campo
perteneciente a un aislamiento a partir
del hgado de un cuy afectado durante
un brote de yersiniosis ocurrido en una
explotacin cuycola de Nario (YPCC
024), clasificada mediante identificacin
bioqumica con un kit comercial para
enterobacterias no fermentadoras (BBL
Crystal); y una cepa de referencia pro-
veniente de la coleccin americana de
cultivos (ATCC 29833). As mismo, se uti-
lizaron diferentes bacterias de la familia
Enterobacteriaceae con el fin de evaluar
la especificidad analtica de las metodolo-
gas diagnsticas (tabla 1).
Inoculacin experimental de heces
La materia fecal para los diferentes ensa-
yos se obtuvo de una explotacin cuy-
cola sin historia de brotes de yersiniosis,
hecho corroborado mediante aislamiento
bacteriano que demostr la ausencia de
Y. pseudotuberculosis. La inoculacin expe-
rimental de las heces se realiz con las
cepas bacterianas de Y. pseudotuberculosis
(cepa de referencia ATCC 29833 y cepa
de campo YPCC 024); para esto se utili-
z materia fecal sin esterilizar (normal)
y materia fecal previamente esterilizada
en autoclave a 120C con 15 lb de pre-
sin durante 15 minutos. Los dos tipos
de materia fecal se inocularon en nueve
suspensiones bacterianas de Y. pseudo-
tuberculosis y se ajustaron con solucin
tamponada de fosfato (PBS) pH 7,4 a un
volumen total de 10 mL, de forma que las
concentraciones finales estuvieran entre
1,5 x 10
8
a 1,5 ufc/g para ambas cepas.
Aislamiento y deteccin microbiolgica
de Y. pseudotuberculosis en heces
El aislamiento y deteccin microbiolgica
de Yersinia pseudotuberculosis se realiz con
una metodologa modificada de la suge-
rida por la Food and Drug Administra-
tion (FDA, 2001). Las nueve suspensiones
bacterianas en materia fecal nombradas
anteriormente se sometieron a tratamien-
to alcalino con KOH al 0,125% dilucin
1:10 durante 30 segundos; se sembr 0,1
mL de cada uno de estos homogenizados
tanto en agar MacConkey como en agar
CIN (cefsulodina, irgasan, novobiocina)
y se incubaron a 30C durante 24 horas.
Se transfiri 1 mL de cada una de dichas
suspensiones bacterianas a 9 mL de caldo
peptona fosfato manitol (PMP), y se lleva-
ron a preenriquecimiento a 4C durante 10
das. Al dcimo da se transfiri 1 mL del
caldo a 9 mL de KOH (0,125%) en solucin
salina, se mezcl durante 30 segundos y se
sembr 0,1 mL en agar MacConkey y 0,1
mL en agar CIN; cada uno de los medios
sembrados se llev a incubacin a 30C
durante 24 horas. La confirmacin de Y.
pseudotuberculosis se realiz utilizando la
batera comercial Crystal para entero-
bacterias no fermentativas siguiendo las
instrucciones del fabricante.
Deteccin molecular
Aislamiento de ADN bacteriano a partir
de suspensiones bacterianas en PBS y
materia fecal: para la obtencin de ADN
bacteriano se compararon dos protocolos:
uno basado en el uso de fenol-cloroformo
y otro donde se sometan las muestras a
ebullicin en una solucin de lisis celular.
Previamente a la extraccin del ADN,
las muestras provenientes de heces se
centrifugaron durante 2 minutos a 200 x
g para la separacin de detritos y restos
vegetales y el sobrenadante resultante fue
congelado a -20C hasta el momento de su
utilizacin (Mller et al., 1998).
El aislamiento del ADN de las suspen-
siones bacterianas en materia fecal y PBS
por fenol-cloroformo se realiz siguiendo
una metodologa reportada anteriormen-
te (Jaramillo et al., 2007). Viales de suspen-
siones bacterianas previamente desconge-
lados se llevaron a centrifugacin durante
5 minutos a 20.000 x g; el sobrenadante
se descart, y el botn celular se someti
a digestin proteica con proteinasa K en
agitacin durante 2 horas a 55C en solu-
cin de lisis (0,2 M de solucin tampn
de Tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA y 6%
de dodecil sulfato sdico). Finalizada la
incubacin, se mezcl vigorosamente la
muestra durante 10 segundos con 600 L
de fenol-cloroformo alcohol isoamlico
25:24:1(v/v/v). Posteriormente, la mezcla
se centrifug a 20.000 x g durante 5 minu-
tos; finalizada la centrifugacin, la fase
superior se removi y transfiri a un vial
de 1,5 mL, al cual se le adicionaron 60 L
de NaCl 3 M y 1 mL de etanol al 100%
fro, se mezcl suavemente por inversin
y se puso en hielo durante 5 minutos. Des-
pus, la mezcla se centrifug a 20.000 x g a
4C durante 2 minutos y el sobrenadante
resultante se descart. El botn de ADN
se lav con etanol al 70% y se disolvi en
25 L de solucin tampn TE (10 mM de
Tris-HCl y 1 mM de EDTA) a temperatura
ambiente durante 12 horas y se mantuvo
a -20C hasta el momento de usarlo.
Tabla 1. Bacterias utilizadas en los ensayos experimentales para evaluar la especificidad analtica
de las tcnicas
Especie Fuente
Yersinia pseudotuberculosis YPCC 024* aislamiento clnico de cuy
Yersinia pseudotuberculosis ATCC 29833**
Yersinia enterocolitica ATCC 23715
Yersinia kristensenii ATCC 33639
Salmonella enterica serovar Enteritidis Aislamiento clnico de hgado de cuy
Escherichia coli Aislamiento de materia fecal de cuy
Escherichia coli Aislamiento de materia fecal de pollo
* Cepa de campo.
** Cepa de referencia.
64
El aislamiento del ADN bacteriano
por ebullicin se realiz modificando la
metodologa empleada por Mller y cola-
boradores (1998). Se centrifug 1 mL de
suspensin bacteriana en materia fecal o
en PBS durante 5 minutos a 20.000 x g;
el sobrenadante se descart y el botn se
disolvi en 400 L de solucin de lisis (50
mM de Tris-HCl pH 8,4; 1 mM de EDTA
y Tween al 0,5%). La muestra se calent al
bao mara a 90C durante 10 minutos y
se centrifug 30 segundos a 15.000 x g. El
sobrenadante se almacen a -20C hasta
ser procesado por PCR.
Para comparar la eficiencia entre los
mtodos de extraccin de ADN se inocul
Y. pseudotuberculosis en 10 mL de caldo
de infusin cerebro corazn (brain heart
infusion, BHI) el cual se incub mnimo
12 horas a 37C. El cultivo bacteriano se
concentr por centrifugacin, se suspen-
di en 10 mL de PBS, se homogeniz y
dividi en 20 viales (500 L por vial);
para cada mtodo de extraccin de ADN
se procesaron 10 viales. La eficiencia de
extraccin de ADN se determin por
espectrofotometra en cada muestra. Se
determinaron la concentracin de ADN
por la absorbancia a 260 nm y su pureza,
calculando el cociente entre la absorbancia
a longitudes de onda de 260 y 280 nm.
Adicionalmente se realizaron dilucio-
nes bacterianas seriadas a partir de un
cultivo de la cepa de referencia de Y.
pseudotuberculosis ATCC 29833 desde 1,5 x
10
8
a 1,5 x 10
0
ufc/mL en materia fecal y en
PBS. Dichas diluciones se procesaron por
ambos mtodos de extraccin de ADN y
se analizaron mediante amplificacin del
gen inv por PCR anidada, con el fin de
comparar el nivel de deteccin con cada
mtodo de extraccin.
Amplificacin por PCR: se usaron dos
pares de iniciadores para el gen de viru-
lencia cromosomal inv para la deteccin
de Yersinia pseudotuberculosis por PCR
anidada (figura 1). Los iniciadores se
escogieron con base en reportes previos
(Kageyama et al., 2002; Jaramillo et al.,
2007); la secuencia del fragmento amplifi-
cado reposa en el GenBank con el nmero
de accesin M17448 (tabla 2).
El procedimiento de amplificacin
del gen inv por PCR y PCR anidada se
realiz en un termociclador GeneAmp
2400 Perkin Elmer; la reaccin se llev
a cabo en las siguientes condiciones: 1,5
mM MgCl
2
, 0,1 mM de dNTP, 0,625 uni-
dades de Taq polimerasa (Invitrogen),
tampn de PCR 10X, 0,4 M de cada
iniciador y 2,5 L de ADN blanco en un
volumen total de 25 L con condiciones
de amplificacin de 95C en una prime-
ra desnaturalizacin y 35 ciclos de 30
segundos de desnaturalizacin a 94C, 1
minuto de hibridacin a 57C y 1 minuto
de extensin a 72C, con una extensin
final de cinco minutos a 72C. Para la
PCR anidada se utilizaron estas mis-
mas condiciones utilizando como ADN
blanco 1 L del producto obtenido en la
primera PCR. Finalmente, 10 L de cada
producto se sometieron a electroforesis
horizontal durante 40 minutos a 100 V
en geles de agarosa al 0,9% y teidos con
SYBR Green al 0,015%; la visualizacin
se llev a cabo bajo luz ultravioleta en un
transiluminador. Se utiliz como marca-
dor de peso molecular X174 RF ADN/
Hae III Fragments (Gibco BRL).
Reduccin del efecto de inhibidores de
la PCR en heces: para determinar la dilu-
cin ptima en la cual inhibidores de la
PCR existentes en las heces no afectan la
sensibilidad de la prueba, se extrajo ADN
de la cepa de referencia (ATCC 29833)
en la concentracin 1,5 x 10
8
ufc/mL en
materia fecal normal y estril por los
dos mtodos de extraccin previamente
Figura 1. Ubicacin de iniciadores en el gen inv para la deteccin de Y. pseudotuberculosis por
PCR y PCR anidada
Tabla 2. Iniciadores para la deteccin del gen inv por PCR y PCR anidada
Nombre del
iniciador
Secuencias (53)
No. de
accesin en
GenBank
Ubicacin
Tamao
producto
PCR (pares
de bases)
invAf (directo) TCTGTCTCTTCATCTGCATT*
M17448
0666-0685
738
invAr (reverso) GCGTTGCAGATTATCTTTAC* 1384-1403
invBf (directo) CGCCAATAAGGAGCAGGAGA** 0776-0795
470
invBr (reverso) ACGAGTGCCATCCATTGAGG** 1226-1245
* Iniciadores para primera PCR
** Iniciadores para PCR anidada
descritos. Este ADN se diluy en tampn
TE a concentraciones de 1:5, 1:25, 1:125 y
1:625; cada dilucin se evalu por PCR y
PCR anidada en las condiciones anterior-
mente mencionadas.
Lmite mnimo de deteccin de ADN por
PCR y PCR anidada: el lmite mnimo de
deteccin de la tcnica molecular, enten-
dido como la mnima cantidad de ADN
capaz de ser detectada tanto por PCR
simple como por PCR anidada, se llev a
cabo sometiendo a amplificacin solucio-
nes de concentracin de ADN conocidas
en valores descendentes, las cuales fue-
ron obtenidas realizando diluciones 1:1
de una muestra de ADN de alta pureza
(cociente ADN/protena cercana a 2) ini-
ciando como concentracin de 1 ng/L de
ADN genmico de Y. pseudotuberculosis.
Determinacin de la sensibilidad y
especificidad analticas
La sensibilidad y especificidad analtica
se evaluaron teniendo en cuenta las defi-
niciones utilizadas por la Organizacin
Mundial de Sanidad Animal (OIE) en el
2004 sobre la evaluacin de pruebas diag-
nsticas para enfermedades infecciosas.
Mtodo microbiolgico: la especificidad
de la metodologa microbiolgica se evalu
utilizando la batera comercial Crystal en
colonias puras de diferentes enterobac-
terias (tabla 1). Se procesaron muestras
65
de materia fecal inoculadas con Y. pseu-
dotuberculosis por medio de los mtodos
microbiolgicos previamente descritos y
se recuperaron las colonias identificadas
por Crystal. Para evaluar la sensibili-
dad analtica de este mtodo, se tomaron
muestras de materia fecal estril y normal
previamente inoculadas con las dos cepas
de Y. pseudotuberculosis (ATCC 29833 y
YPCC 024) a una concentracin final de
1,5 x 10
8
a 1,5 x 10
0
ufc/g de materia fecal,
y se procesaron siguiendo la metodologa
microbiolgica previamente mencionada.
Mtodos moleculares: para determinar la
especificidad de la metodologa molecu-
lar se emple la metodologa previamente
reportada por Jaramillo y colaboradores
(2007), para lo cual se realiz la amplifica-
cin del gen inv por PCR anidada de ADN
aislado a partir de cultivos bacterianos
puros de diferentes enterobacterias (tabla
1), y ADN resultante de un cultivo bac-
teriano a partir de la siembra de materia
fecal de cuyes en caldo BHI. La evalua-
cin de la sensibilidad analtica de estos
mtodos se realiz tomando muestras
de las diluciones de Y. pseudotuberculosis
entre 1,5 x 10
8
a 1,5 x 10
0
ufc/g de materia
fecal estril y normal hechas para el ensa-
yo de medicin de la sensibilidad por el
mtodo microbiolgico. Estas muestras se
sometieron a extraccin de ADN por los
mtodos ya descritos y se amplificaron
por PCR anidada y se registr la dilucin
ms alta en la cual se observ la presencia
de un producto amplificado del tamao
molecular esperado.
Evaluacin de ventajas y desventajas de
las metodologas diagnsticas
Para comparar las ventajas de cada una de
las metodologas empleadas, se tuvieron
en cuenta tres parmetros: la complejidad
de cada tcnica, el tiempo necesario para
el procesamiento y obtencin de resulta-
dos en cada una de las metodologas, y el
costo que implica procesar una muestra
por los diferentes mtodos. Los costos del
montaje de las tcnicas moleculares y las
microbiolgicas se determinaron con pre-
cios de catlogo y cotizaciones suminis-
tradas por los distribuidores representan-
tes de las casas matrices; en este anlisis
slo se tuvieron en cuenta los costos de
los materiales y reactivos consumibles y
no, los costos de los equipos utilizados,
personal o instalaciones.
RE S ULTADOS
Aislamiento e identificacin de Y.
pseudotuberculosis en heces
La metodologa microbiolgica utilizada
en este estudio permiti el aislamiento e
identificacin de Y. pseudotuberculosis a
partir de materia fecal estril. Sin embar-
go, en los ensayos a partir de materia fecal
normal la identificacin bacteriana fue
compleja cuando se utiliz nicamente
la batera comercial Crystal, debido al
exceso de distintas poblaciones bacteria-
nas presentes en los aislamientos prima-
rios en los cuales no se diferenciaba la
morfologa tpica de Y. pseudotuberculosis,
lo cual oblig a realizar subcultivos en
agares selectivos con el fin de obtener
colonias puras.
Comparacin de mtodos de extraccin
de ADN
Dos mtodos de extraccin de ADN
se evaluaron en suspensiones bacteria-
nas puras de Y. pseudotuberculosis ATCC
29833, teniendo en cuenta su pureza
(cociente ADN/protena) y la cantidad
de ADN obtenido por muestra. Con
el mtodo de extraccin de ADN por
fenol-cloroformo a partir de colonias
bacterianas puras se obtuvo mayor can-
tidad y mejor calidad de ADN en com-
paracin del mtodo de ebullicin (P <
0,05) (tabla 3).
Tabla 3. Cuantificacin de ADN comparando dos mtodos de extraccin en cultivos puros de Y.
pseudotuberculosis
Mtodo n ng/L DE D.O 260 nm/D.O 280 nm
Fenol-cloroformo 10 545,124 52.11 1,988 0,06
Ebullicin en solucin de lisis* 10 322,909 69.08
b
1,605 0,14
b
a, b
Para cada columna, medias con superndices diferentes presentaron diferencias significativas (P<0,05).
DE. Desviacin estndar.
D.O. Densidad ptica.
En la tabla 4 se comparan los resulta-
dos obtenidos en la aplicacin de los dos
mtodos de extraccin de ADN en dife-
rentes matrices, despus de la amplifica-
cin por PCR y PCR anidada. Se evidencia
un mejor nivel de deteccin en las dife-
rentes matrices cuando se utiliz el mto-
do de ebullicin; as como la ausencia de
amplificacin cuando se llevaron a cabo
los mtodos de extraccin evaluados en
las muestras de materia fecal no diluida.
Deteccin molecular por PCR y PCR
anidada
La deteccin de poblaciones bacterianas
de Y. pseudotuberculosis por PCR y PCR
anidada vari en su sensibilidad depen-
diendo del tipo de matriz evaluada. Se
observ inhibicin de la PCR cuando se
realiz en materia fecal normal y estril
sin diluir; cuando la materia fecal se
diluy, se obtuvieron amplificaciones con
sensibilidad menor en la materia fecal
normal que en la materia fecal estril
(tabla 4).
Reduccin del efecto de inhibidores de
la PCR en materia fecal: una dilucin
1:5 de ADN obtenido a partir de materia
fecal estril por cualquiera de los dos
mtodos de extraccin fue suficiente para
obtener un producto amplificado en la
PCR anidada, pero no en la primera PCR;
esto se logr mediante la realizaron de
diluciones mayores del ADN. Para lograr
Tabla 4. Niveles de deteccin (de Y. pseudotuberculosis en ufc/g de materia fecal) obtenidos por PCR
y PCR anidada segn la matriz de origen y sus diferencias segn el mtodo de extraccin de ADN
Matriz
Mtodo de extraccin de ADN
Ebullicin Fenol-cloroformo
PCR simple PCR anidada PCR simple PCR anidada
PBS 10
5
10
3
10
8
10
4
Materia fecal estril diluida 10
7
10
4
10
8
10
5
Materia fecal normal diluida 10
8
10
5
- 10
6
Materia fecal sin diluir - - - -
66
una adecuada amplificacin con el ADN
obtenido a partir de materia fecal normal
fue necesario realizar una dilucin 1:125
en bfer TE tanto en la primera PCR como
en la PCR anidada (tabla 5).
Lmite mnimo de deteccin de ADN por
PCR: el lmite mnimo de deteccin de
ADN para la primera PCR fue de 156,25
pg mientras que para PCR anidada fue de
1,22 pg, como lo indica la figura 2.
Determinacin de la sensibilidad y
especificidad analticas
Especificidad: se evalu la especificidad
de PCR y PCR anidada con las especies
bacterianas descritas en la tabla 1 obte-
niendo amplificacin nicamente en las
muestras que tenan ADN de las cepas de
Y. pseudotuberculosis. Los productos obte-
nidos despus de amplificar el gen inv en
las cepas ATCC 29833 y YPCC 024 fueron
de los tamaos esperados 738 y 470 pares
de bases (pb) para PCR y PCR anidada
respectivamente (figura 3).
Cuando se us la batera comercial
Crystal con colonias puras de diferen-
tes enterobacterias no present resulta-
dos positivos para Y. pseudotuberculosis.
Sin embargo, en materia fecal normal
mostr baja especificidad debido a la
poca selectividad obtenida en el pro-
ceso de preenriquecimiento y siembra
en agares selectivos. Debido a la baja
especificidad se decidi remplazar esta
tcnica con la deteccin por PCR usando
ADN aislado por el mtodo de ebullicin
-a partir de una mezcla de colonias obte-
nidas despus del preenriquecimiento
microbiolgico-, con lo que se obtuvie-
ron mejores resultados.
Sensibilidad microbiolgica: en la
tabla 6 se muestran los resultados de sen-
sibilidad de la metodologa microbiolgi-
ca en la deteccin de Y. pseudotuberculosis
a partir de un gramo de materia fecal.
Los resultados de sensibilidad en mues-
tras de materia fecal normal correspon-
den a la combinacin de procedimientos
microbiolgicos de preenriquecimiento
con deteccin por PCR a diferencia de
los resultados de sensibilidad en mate-
ria fecal estril, donde slo se utiliz la
metodologa microbiolgica. A pesar de
esto la sensibilidad fue mejor en materia
fecal estril.
Tabla 5. Amplificacin por PCR y PCR anidada obtenida tras la dilucin de muestras de ADN de Y.
pseudotuberculosis extrado en muestras de materia fecal estril y sus diferencias segn el mtodo
de extraccin
Metodologa Dilucin*
Materia fecal estril

Materia fecal normal
Fenol-
cloroformo
Ebullicin
Fenol-
cloroformo
Ebullicin
P
1
era
C
R
Sin diluir - - - -
1:5 - - - -
1:25 - + - -
1:125 - + + +
1:625 + + - +
P
2
da
C
R
Sin diluir - - - -
1:5 + + - -
1:25 + + - -
1:125 + + + +
1:625 + + - +
* Las diluciones de ADN fueron hechas a partir 1,5 x 10
8
ufc/g de materia fecal.
Figura 2. Lmite de deteccin de ADN mediante amplificacin del gen inv de Y. pseudotuberculosis
por PCR. A. Primera PCR. B. PCR anidada. M. Marcador X174 RF ADN/Hae III, 1. 2.500 pg, 2.
1.250 pg, 3. 625 pg, 4. 312,5 pg, 5. 156.25 pg, 6. 78,125 pg, 7. 39,06 pg, 8. 19,53 pg, 9. 9,76 pg,
10. 4,88 pg, 11. 2,44 pg, 12. 1,22 pg, 13. 0,61 pg, + control positivo primera PCR, -.control negativo
primera PCR, +a. control positivo PCR anidada, -a control negativo PCR anidada
Figura 3. Especificidad de PCR anidada con diferentes enterobacterias. M. Marcador X174 RF
ADN/Hae III, Yp. Yersinia pseudotuberculosis, Yk. Yersinia kristensenii, Ye. Yersinia enterocolitica,
S. Salmonella Enteritidis, Ec1. E. coli 1, Ec2. E. coli 2, Mis. Miscelanea bacterias de origen fecal,
M+. Mezcla de enterobacterias con Y. pseudotuberculosis, M-. Mezcla de enterobacterias sin Y.
pseudotuberculosis, +a. Control positivo PCR anidada, -a. Control negativo PCR anidada,+. Control
positivo primera PCR, -. Control negativo primera PCR
Sensibilidad de la metodologa molecu-
lar: la sensibilidad de la PCR simple y la
PCR anidada se evalu con ADN extrado
de materia fecal estril y normal; el ADN
obtenido fue llevado a una dilucin 1:125
en TE para contrarrestar el efecto de los
inhibidores de la materia fecal. Se observ
que la sensibilidad tanto en la PCR sim-
67
ple como en la PCR anidada en materia
fecal normal fue 10 veces menor que en
la materia fecal estril (figuras 4 y 5). La
realizacin de la PCR anidada aument la
sensibilidad mil veces en ambos tipos de
materia fecal.
Evaluacin comparativa de ventajas
y desventajas de las metodologas
diagnsticas
En la tabla 7 se resumen los resultados
referentes a tiempo, complejidad y costos
de los materiales y reactivos consumibles
requeridos en la realizacin de cada una
de las metodologas evaluadas. En gene-
ral se observaron mejores resultados en
cuanto a tiempo, complejidad y costos
en la metodologa molecular en compa-
racin de la metodologa microbiolgica.
Sin embargo, estas desventajas se dismi-
nuyen cuando ambas metodologas son
combinadas.
DI S CUS I N
Recientemente han aparecido gran can-
tidad de publicaciones sobre el uso de
metodologas moleculares como herra-
mientas en el diagnstico de enfermeda-
des infecciosas, principalmente aquellas
en las que las metodologas convenciona-
les no han tenido el rendimiento diagns-
tico esperado (Yamada et al., 1998; Notomi
et al., 2000; Savill et al., 2001; Shehee et al.,
2004). Sin embargo, estas tcnicas mole-
culares, como PCR, tienen limitaciones
cuando se usan en especmenes fecales
en especial por la presencia de sustancias
que interfieren con la amplificacin, que
influyen negativamente en la sensibilidad
diagnstica de la tcnica (Rdstrm et al.,
2004). Gracias a las ventajas de los espec-
menes fecales como muestra diagnstica,
principalmente por su facilidad de obten-
cin, se han realizado diferentes trabajos
tratando de estandarizar protocolos para
el tratamiento de este tipo de muestras
antes de llevar a cabo las reacciones; as
mismo se ha sugerido la combinacin de
tcnicas microbiolgicas y moleculares
para mejorar tanto la sensibilidad como
la especificidad del diagnstico (Lou et al.,
1997; Malorny y Hoorfar, 2005). El objeti-
vo de este trabajo fue disear una meto-
dologa diagnstica para la deteccin de
Y. pseudotuberculosis en materia fecal ino-
culada artificialmente, usando metodolo-
gas microbiolgicas y moleculares.
Tabla 6. Sensibilidad de la metodologa microbiolgica en materia fecal estril y normal
Concentracin
bacteriana
Cepa campo Cepa referencia
Estril Normal Estril Normal
1,5 x 10
8
+ + + +
1,5 x 10
7
+ + + +
1,5 x 10
6
+ + + +
1,5 x 10
5
+ + + +
1,5 x 10
4
+ + + +
1,5 x 10
3
+ + + -
1,5 x 10
2
+ - + -
1,5 x 10
1
+ - + -
1,5 x 10
0
- - - -
Figura 4. Sensibilidad de la PCR en material fecal estril. A. Primera PCR, B. PCR anidada. M.
Marcador X174 RF ADN/Hae III, 10
8
-10
0
: concentraciones bacterianas en materia fecal estril, +.
Control positivo primera PCR, -. Control negativo primera PCR, +a. Control positivo PCR anidada y
-a. Control negativo PCR anidada
Figura 5. Sensibilidad de la PCR en materia fecal normal. A. Primera PCR, B. PCR anidada. M.
Marcador X174 RF ADN/Hae III, 10
8
-10
0
. Concentraciones bacterianas en materia fecal normal, +.
Control positivo primera PCR, -. Control negativo primera PCR, +a. Control positivo PCR anidada y
-a. Control negativo PCR anidada
68
La metodologa que en este trabajo se
utiliz para el aislamiento bacteriano de
las dos diferentes cepas de Y. pseudotu-
berculosis permiti la recuperacin hasta
de 1,5 x 10
1
ufc/g en materia fecal estril;
en materia fecal normal vari entre 1,5 x
10
4
y 1,5 x 10
3
ufc/g. Sin embargo, el aisla-
miento de Y. pseudotuberculosis a partir de
materia fecal normal tambin fue posible
sin la utilizacin de preenriquecimiento,
lo cual diminuy 10 veces el lmite de
recuperacin de suspensiones bacterianas
para la cepa de campo y en diez mil veces
para la cepa de referencia. Este efecto
no se observa en el caso de materia fecal
estril, donde la cepa de referencia puede
ser recuperada sin previo preenriqueci-
miento desde una carga bacteriana inicial
equivalente a 1 ufc/g de materia fecal.
Estos resultados sugieren que la flora bac-
teriana presente en materia fecal redujo la
supervivencia de esta cepa.
El rendimiento de las tcnicas basadas
en la amplificacin de cidos nucleicos
dependen del tipo de muestras de donde
se obtiene el ADN o ARN y del protocolo
utilizado para la extraccin y purifica-
cin de estos, principalmente cuando se
trabaja con muestras biolgicas comple-
jas como las heces (McOrist et al., 2002;
Hoorfar et al., 2004; Rdstrm et al., 2004;
Di Pinto et al., 2007).
Con el fin de obtener suficiente ADN
de buena calidad para ser amplificado
por PCR, en este estudio se compararon
dos protocolos de aislamiento de ADN,
tanto en colonias puras como en materia
fecal estril y normal. En la extraccin
de ADN por fenol-cloroformo a partir
de colonias puras se obtuvo ADN de
mejor calidad y con una concentracin
significativamente mayor (tabla 3) que
el mtodo de ebullicin; sin embargo,
este mtodo tiene una eficiencia baja
cuando se realiza en especmenes que
tienen una concentracin muy baja de
ADN total, posiblemente porque se
hace difcil concentrar el ADN, el cual
quiz se pierde en los procedimientos de
lavados que se realizan para la remocin
de contaminantes. Este efecto no es
observable en el mtodo de ebullicin,
puesto que se asume que la lisis celular
y subsecuente liberacin del ADN
se da directamente en la muestra, sin
realizar posteriores pasos de purificacin
(Jensen et al., 2002). Para confirmar esto se
disearon dos ensayos comparativos de
extraccin de ADN con fenol-cloroformo;
uno con suspensiones bacterianas
de concentraciones conocidas de Y.
pseudotuberculosis, y otro con suspensiones
bacterianas de Y. pseudotuberculosis a la
misma concentracin a las que se adicion
una poblacin conocida de E. coli. En estas
ltimas el nivel de deteccin por PCR
fue mayor (resultados no mostrados). Al
evaluar la eficiencia de amplificacin en una
primera PCR aplicando ambos mtodos
de extraccin de ADN en suspensiones
bacterianas, se observa mayor sensibilidad
con el mtodo de ebullicin (1,5 x 10
5
ufc/mL) con relacin al mtodo de fenol-
cloroformo (1,5 x 10
6
ufc/mL).
La PCR anidada es ms sensible para
muestras procesadas por el mtodo de
fenol-cloroformo que para las sometidas
al mtodo de ebullicin, posiblemente
debido a una mayor calidad del ADN
cuando se usa fenol-cloroformo, lo cual
podra producir amplificaciones indetec-
tables visualmente en una primera PCR y
que se hacen evidentes en la PCR anida-
da. Lo anterior confirma que adems de
la cantidad de ADN, su calidad tambin
desempea un papel fundamental en la
eficiencia de la amplificacin y por ende
en la sensibilidad de la prueba, principal-
mente en matrices donde la presencia de
inhibidores es alta (McOrist et al., 2002;
Amagliania et al., 2007).
Diferentes trabajos han evidenciado
desventajas en la aplicacin de tcnicas
moleculares de amplificacin de cidos
nucleicos, como PCR para la deteccin de
organismos en heces (Malorny y Hoorfar,
2005; Jaramillo et al., 2007). Esto se debe
principalmente a la presencia de sustan-
cias inhibidoras que actan sobre puntos
esenciales de la reaccin: interfiriendo con
la lisis celular necesaria para la extraccin
de ADN, degradando el ADN blanco o
su captura e inhibiendo la actividad de
la polimerasa responsable de la amplifi-
cacin (Wilson, 1997). Para resolver este
inconveniente se han diseado diversas
estrategias. En este trabajo se diluyeron
las muestras obtenidas despus de rea-
lizar la extraccin de ADN para dismi-
nuir el efecto de los inhibidores sobre la
PCR, consiguiendo as que los inhibidores
existentes no afectaran la reaccin de
amplificacin y que a su vez una cantidad
suficiente de ADN bacteriano estuvie-
ra presente para lograr amplificaciones
visualmente detectables. Estos hallazgos
confirmaron el gran efecto de inhibicin
que tienen algunos componentes de la
materia fecal, sobre la amplificacin del
ADN. Estudios anteriores han identifica-
do algunos de los principales inhibidores
encontrados en la materia fecal de anima-
les y humanos entre los que se destacan
polisacridos, urea y cidos biliares, entre
otros (Monteiro et al., 1997; Wilson, 1997;
Rdstrm et al., 2004).
Al comparar la capacidad de amplifi-
cacin por PCR y PCR anidada en los dos
tipos de materia fecal -estril y normal-
diluidas, es claramente apreciable que la
materia fecal normal debe diluirse ms
que la estril para obtener amplificaciones
visibles; esto puede deberse a que el pro-
ceso de esterilizacin al que fue sometida
la materia fecal elimina algunos compo-
nentes inhibidores de la PCR que afectan
la actividad de la Taq polimerasa o el
Tabla 7. Evaluacin del tiempo, complejidad y costo de las diferentes metodologas diagnsticas
Metodologa
Tiempo
aproximado
Complejidad**
Costo (pesos)
Colombia Catlogo**
PCR anidada
Extraccin ADN por ebullicin 1 da + 7.124 4.789
Extraccin ADN por fenol-cloroformo 2 das +++ 12.216 6.998
Microbiologa Confirmacin por kit BBL Crystal 13 das ++++ 27.010 17.358
Combinacin de tcnicas Confirmacin por PCR (ebullicin) 11 das +++ 9.911 5.637
* La complejidad para cada prueba fue asignada tomando como criterio el nmero de pasos necesarios para obtener un resultado, y la exigencia del nivel de destreza necesario para realizar la prueba.
** El precio de catlogo se calcul teniendo en cuenta una tasa de cambio de dos pesos por dlar (tasa representativa del mercado el 5 de septiembre de 2008).
69
ADN blanco. Otra posibilidad es que el
ADN de la flora acompaante de la mate-
ria fecal normal disminuya la capacidad
de amplificacin, como lo describieron
Knutsson y colaboradores (2002), quienes
comprobaron que el ADN procedente de
poblaciones iguales o mayores a 10
6
ufc/
mL de flora acompaante tiene un efecto
negativo sobre la eficiencia de amplifica-
cin. Diferentes trabajos han reportado
resultados similares (Logue et al., 1996;
Lambertz et al., 2000; Ramesh et al., 2002).
Por lo tanto, se debe tener en cuenta
que los procedimientos de extraccin y
purificacin de ADN a partir de mues-
tras complejas como las fecales influyen
directamente y de forma importante en
mejorar o reducir la sensibilidad de la
amplificacin por PCR.
La especificidad de la metodologa
microbiolgica fue comprobada
finalmente por PCR, ya que como se
mencion anteriormente la especificidad
del mtodo microbiolgico normalmente
requiere de identificacin bacteriana con
base en perfiles bioqumicos, lo cual se
busc con el kit comercial Crystal para
enterobacterias no fermentativas. Sin
embargo, este procedimiento no fue posible
en materia fecal normal, por la abundante
flora acompaante que esta contiene, lo cual
no permite la diferenciacin de colonias
compatibles con Y. pseudotuberculosis. El
kit diagnstico Crystal es adecuado
cuando se utiliza en muestras poco
contaminadas como fluidos corporales u
rganos. Robinson y colaboradores (1995)
compararon tres diferentes pruebas
comerciales de diagnstico basadas
en perfiles bioqumicos en las que se
inclua el Crystal para la identificacin
de bacterias pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae, las cuales fueron
evaluadas con 512 aislamientos clnicos
de bacterias gram negativas; encontraron
que el Cristal puede producir resultados
por encima del 95% de confiabilidad.
Diferentes autores han descrito el gen
inv como un marcador molecular alta-
mente conservado entre aislamientos de
Y. pseudotuberculosis y no tiene similitud
con otras especies del genero Yersinia
(Nakajima et al., 1992; Thoerner et al.,
2003). En el ensayo de especificidad de
las tcnicas moleculares se confirm que
los iniciadores utilizados en este estu-
dio son especficos para la amplificacin
del gen inv de Y. pseudotuberculosis, sin
presentar reaccin cruzada con otras
especies del mismo gnero u otras ente-
robacterias. Estos hallazgos concuerdan
con los observados por diferentes auto-
res (Shiozawa et al., 1995; Kageyama et
al., 2002; Horisaka et al., 2004).
De las metodologas diagnsticas aqu
evaluadas, el protocolo en el que se uti-
liz preenriquecimiento, aislamiento y
deteccin por PCR permiti la deteccin
de concentraciones ms bajas de Y. pseu-
dotuberculosis en materia fecal normal; se
pudo detectar entre 1,5 x 10
4
a 1,5 x 10
3

ufc/g de materia fecal. La deteccin por
las metodologas moleculares por s solas
tuvo una sensibilidad de 1,5 x 10
8
ufc/g
de materia fecal en una primera PCR y
de 1,5 x 10
5
ufc/g de materia fecal por
PCR anidada.
El incremento o reduccin de la sensi-
bilidad de la PCR es variado en relacin
con metodologas basadas en la detec-
cin de patgenos por cultivo microbio-
lgico en materia fecal, lo cual depende
del microorganismo blanco y del mtodo
de purificacin y extraccin de ADN a
partir de la muestra de heces. As, Vans-
nick y colaboradores (2007) encontraron
un nivel de sensibilidad similar en la
deteccin molecular y microbiolgica de
Mycobacterium paratuberculosis en heces
de bovinos mediante extraccin de ADN
bacteriano por captura magntica. Por
otro lado, Rasbck y colaboradores (2006)
encontraron que la PCR aplicada a culti-
vos bacterianos puros presenta niveles de
sensibilidad entre 10 y 100 veces mayores
a los observados cuando se aplica directa-
mente a materia fecal.
La sensibilidad de la PCR en materia
fecal en este trabajo se evalu comparan-
do el mtodo de fenol-cloroformo frente
al de ebullicin, sin encontrar grandes
diferencias. Este ltimo mtodo tiene
grandes ventajas sobre el de fenol-cloro-
formo, entre las que se destacan su rapi-
dez, costo, facilidad e inocuidad para el
operario, hallazgos que coinciden con los
reportados por diversos autores (Mller et
al., 1998, Amagliania et al., 2007).
En este estudio la sensibilidad de la
PCR en materia fecal normal aument
mil veces cuando fue realizada una PCR
anidada. Otros autores han encontrado
que la realizacin de una PCR anidada
mejora la sensibilidad de la prueba (entre
cien y mil veces). Sin embargo, la realiza-
cin de una segunda PCR puede llevar a
un riesgo mayor de falsos positivos por
contaminacin cruzada proveniente de
fragmentos de ADN de amplificaciones
anteriores (McOrist et al., 2002; Vansnick
et al., 2007).
Para comparar la sensibilidad analtica
entre las metodologas moleculares se
hicieron diluciones de ADN puro 1:1, el
cual se amplific por una primera PCR
y PCR anidada. El lmite de deteccin de
ADN en la primera PCR fue de 156,25 pg
mientras que para PCR anidada fue de
1,22 pg. Estos resultados son similares a
los reportados previamente por Enosawa
y colaboradores (2003), quienes reporta-
ron un lmite de deteccin de ADN de
1 pg para PCR anidada y 100 pg para
PCR en muestras de ADN perteneciente a
Mycobacterium paratuberculosis.
Pocos trabajos evalan, adems de
la sensibilidad y la especificidad de las
metodologas diagnsticas, el costo eco-
nmico, lo cual puede ser un punto
definitivo al momento de implementar
un protocolo diagnstico para la detec-
cin de algn patgeno. En este trabajo
se analiz comparativamente el valor
de cada una de las metodologas diag-
nsticas sin tener en cuenta los costos
correspondientes a infraestructura, equi-
pos o personal. Se tuvieron en cuenta los
precios nacionales de reactivos y mate-
riales en comparacin con los precios de
catlogo (tabla 7).
En relacin con los resultados referen-
tes al tiempo y complejidad que requiere
cada prueba, se observa que las metodo-
logas moleculares son menos complejas,
requieren menor tiempo y su costo eco-
nmico es menor en comparacin con las
metodologas microbiolgicas. Sin embar-
go, al combinar el aislamiento microbiol-
gico con la PCR se reducen tanto la com-
plejidad como el tiempo de realizacin
(un da) y hasta 2,7 veces el costo de la
metodologa microbiolgica sin incluir la
identificacin bacteriana por perfiles bio-
qumicos. En el caso de la metodologa de
PCR anidada, la extraccin de ADN por el
mtodo de ebullicin tiene una reduccin
entre 1,7 y 1,9 veces en el costo total del
ensayo en comparacin con el mtodo de
70
extraccin de ADN por fenol-cloroformo,
as como tambin se reduce la compleji-
dad y tiempo de la prueba.
CONCL US I ONE S
La evaluacin analtica de un mtodo
microbiolgico y de un mtodo de PCR
para la deteccin de Y. pseudotuberculosis
en materia fecal mostr que cada uno pre-
senta ventajas que pueden ser utilizadas
en conjunto para mejorar la sensibilidad
y especificidad del diagnstico.
La combinacin de la metodologa
microbiolgica y la molecular para la
deteccin de Y. pseudotuberculosis en mate-
ria fecal mejor el nivel de deteccin y
disminuy el alto costo del uso de bate-
ras comerciales usadas en la identifica-
cin de este patgeno.
Se sugiere optimizar y aplicar las dos
metodologas conjuntamente en estudios
dirigidos a la determinacin de la epide-
miologa de Y. pseudotuberculosis en plan-
teles cuycolas, con el fin de observar las
virtudes de las metodologas diagnsticas
al ser usadas en condiciones de campo.
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Ligia Denise Torres Higuera
1
, Diego Ortiz
Ortega
2
, Jos Luis Rodrguez Bautista
3
,
Roco Esperanza Patio Burbano
4
Comparison of three methods for the
cryopreservation of Leptospira strains
in Liquid Nitrogen
AB S T RACT
Traditional methods for preservation of
bacteria belonging to the genus Leptospira,
by frequent passages in culture media,
are expensive, time consuming and may
cause losses in genetic characteristics
of the strains. In the present study a
cryoprotective technique in liquid nitrogen
was standardized for six serovars of
Leptospira (Pomona, Hardjoprajitno, Canicola,
Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa and
Bratislava), by using as agent cryopreservative
a 2% Dimethyl Sulfoxide (final concentration)
solution in a 1C/min rate of cooling, which
was compared with 0.2% and 10% glycerol
solutions (final concentrations). All three
cryopreservative methods were evaluated by
the determination of the bacterial viability pre
and post freezing. In 0, 30, 90, 180, 270 and
360 days bacterial counting was done using
a counting chamber. Analysis of variance
(ANOVA) and the Bonferroni method
were used for the analysis of the results. A
final concentration of 10% Glycerol in the
cryopreservative reduced the viability of the
serovars. The liquid nitrogen cryopreservation
technique either with 2% Dimethyl Sulfoxide
or 0.2% (final concentrations) glycerol,
allowed the successful preservation of all
six serovars of Leptospira during a year.
The cryopreservative method ensured the
conservation of the bacterial viability and
was less expensive and less time consuming.
Additionally, this method is a better method
of long term conservation when compared
with the traditional maintenance by serial
subcultivation.
Keywords: Bacteria, glycerol, deep freezing,
viability, chamber.
Comparacin de tres tratamientos para la
crioconservacin de serovares de Leptospira en
nitrgeno lquido
RE S UME N
La preservacin de bacterias pertenecientes al gnero Leptospira por mtodos tradicio-
nales -repiques frecuentes del cultivo- es costosa, dispendiosa y puede generar prdi-
das de las caractersticas genticas del cultivo. En el presente estudio se estandariz
una tcnica de crioconservacin en nitrgeno lquido para seis serovares de Leptospira
-Pomona, Hardjoprajitno, Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa y Bratislava-,
usando como agente crioprotector el dimetil sulfxido (DMSO) a una concentracin
final de 2% y una tasa de enfriamiento de 1C/min y se compar con el uso de glicerol
a concentraciones finales de 0,2% y 10%. Los tres mtodos se evaluaron mediante la
determinacin de la viabilidad bacteriana antes y despus de la congelacin (a 0, 30,
90, 180, 270 y 360 das) por recuento bacteriano en cmara. Los datos se sometieron a
anlisis de varianza y comparacin por parejas usando la prueba de Bonferroni. La pre-
sencia de glicerol al 10% (concentracin final) en el medio crioconservante disminuy
la viabilidad de los serovares. La tcnica de criopreservacin en nitrgeno lquido con
DMSO al 2% y glicerol al 0,2% (concentraciones finales) permiti la exitosa conserva-
cin de los seis serovares de Leptospira. El mtodo de criopreservacin asegur una alta
viabilidad, lo que disminuy costos y tiempo en su ejecucin y demostr ser un mejor
mtodo de conservacin a largo plazo en relacin con el mantenimiento tradicional por
subcultivos peridicos.
Palabras clave: bacterias, glicerol, ultracongelacin, viabilidad, cmara.
1
Investigadora. Corpoica, Ceisa, Bogot.
ltorres@corpoica.org.co
2
Investigador. Corpoica, Ceisa, Bogot.
dortiz@corpoica.org.co
3
Investigador. Corpoica, Ceisa, Bogot.
jlrodriguez@corpoica.org.co
4
Investigadora. Corpoica, Ceisa, Bogot.
rpatino@corpoica.org.co
I NT RODUCCI N
Corpoica, en las instalaciones del
Centro de Investigacin Ceisa, tiene a su
cargo el mantenimiento y conservacin
del subsistema Banco de Germoplasma
de Microorganismos de Inters en Salud
Animal Bacterias y Virus BGMSA-BV,
el cual cuenta entre otros microorga-
nismos con el cepario de Leptospira. La
conservacin de estos serovares requiere,
para su mantenimiento, pases seriados
en medios de cultivo, incluyendo varias
rplicas por cepa, en cortos periodos de
tiempo (Myers, 1985; Levett, 2003; Bharti
et al., 2003). Los subcultivos seriados
de un gran nmero de cepas presentan
entre otros inconvenientes el riesgo de
contaminacin cruzada entre los diferen-
tes cultivos o prdida de la viabilidad de
la cepa; por lo tanto, con el fin de evitar
su prdida ya sea por contaminacin o
deshidratacin del cultivo es necesario
verificar peridicamente cada serovar
(Levett, 2001; Bomfim et al., 2007 y OIE,
2008). Este sistema de conservacin es
el que tradicionalmente se ha utilizado
en Colombia; sin embargo, es un mto-
do costoso, dispendioso, que demanda
tiempo y puede ocasionar prdida de la
cepa por contaminacin o alteracin de
sus caractersticas genticas (Coghlan,
1967). La adecuada conservacin de los
microorganismos implica mantener la
cepa viva, en estado puro y gentica-
mente estable (Shung-Chang Jong, 1989;
Bajaj, 1995).
Investigaciones realizadas por Linscott
y Boack (1960) y Coghlan (1967) demues-
tran que a pesar de haberse logrado pre-
servar leptospiras a bajas temperaturas
(-70C) utilizando como crioprotector el
glicerol, se afect la viabilidad de los
microorganismos. Sin embargo, varios
investigadores (Stalheim, 1971; Alexan-
der et al., 1972; Palit et al., 1986 y Reed et
al., 2000) crioconservaron leptospiras en
nitrgeno lquido (-196C), por un largo
periodo, manteniendo la viabilidad y las
caractersticas genticas de estos micro-
organismos.
El objetivo principal de este trabajo
fue estandarizar una metodologa para
la adecuada conservacin en nitrgeno
lquido de serovares de Leptospira per-
tenecientes al Banco de Germoplasma
de Microorganismos de Inters en Salud
Animal Bacterias y Virus (BGMSA-BV),
73
Comparacin de tres tratamientos para la crioconservacin de serovares de Leptospira en nitrgeno lquido
como sistema de conservacin a largo
plazo. As mismo, se evalu el efec-
to crioprotector de dos concentraciones
finales de glicerol (0,2% y 10%) y una
de DMSO (2%), mediante el recuento en
cmara Kova Glasstic (Hycor Biome-
dical Inc, Estados unidos), de leptospi-
ras mviles por microscopia de campo
oscuro, estableciendo la concentracin
de leptospiras antes y despus de la con-
gelacin en nitrgeno lquido, durante
un ao de seguimiento.
Serovares
Para la evaluacin cuantitativa de la
viabilidad de los microorganismos despus
de diferentes periodos de conservacin
en nitrgeno lquido, se utilizaron seis
serovares de Leptospira pertenecientes al
BGMSA-BV. Los serovares utilizados fueron:
Pomona (Lep 025), Hardjoprajitno (Lep 016),
Canicola (Lep 009), Icterohaemorrhagiae
(Lep 018), Grypothyphosa (Lep 014),
Bratislava (Lep007).
Cultivos bacterianos
Los serovares de Lepstospira se inocularon
en 35 mL de medio lquido EMJH Difco
Bacto (New Jersey, USA) (Meiwan,
2007) y se incubaron de 7 a 9 das a una
temperatura de 30C, en oscuridad y agi-
tacin continua (150 rpm) hasta obtener
una concentracin de por lo menos 10
8
cel/mL (Faine et al., 1999). Un nmero
alto de clulas en precongelacin garan-
tiza un mayor porcentaje de recupera-
cin (Heckly, 1978). Cultivos jvenes,
activamente mviles, con la concentra-
cin anterior se consideraron adecuados
para ser crioconservados. La pureza de
cada cultivo se estableci sobre caldo
de infusin de cerebro y corazn (brain
heart infusion BHI), agar triptosa, agar
sangre y agar saboureaud.
Recuento de leptospiras en cmara
La concentracin de leptospiras en los
cultivos, antes y despus de la conge-
lacin en nitrgeno lquido se estable-
ci mediante recuento por microscopia
de campo oscuro, usando la cmara de
recuento Kova Glasstic (Hycor Biome-
dical Inc, Estados unidos) (Gallego, 2001).
Los cultivos de leptospiras de 7 a 10 das
de crecimiento se colocaron a 4C durante
12 horas con el fin de disminuir el movi-
miento activo y facilitar el conteo (Turner,
1970). Al cabo de este tiempo se estableci
la dilucin hasta obtener de 20 a 30 leptos-
piras por campo, se contaron 10 campos y
se aplic la siguiente frmula:
Tcnica de congelacin
Cada cultivo con un recuento de por lo
menos 10
8
cel/mL se mezcl con DMSO
estril (Sigma Aldrich St. Louis USA)
para una concentracin final de 2%, y
con glicerol (Sigma Aldrich St. Louis
USA) en cantidad suficiente para con-
centraciones de 0,2% y de 10%. De cada
mezcla, se dispens 1 mL en crioviales
de 2 mL (20 viales por cada concentra-
cin de crioconservante). Las mezclas se
dejaron a temperatura ambiente durante
30 minutos (Simione, 1998), al cabo de
los cuales se congelaron gradualmente
a -70C durante cuatro horas en iso-
propanol puro, utilizando el recipiente
para congelacin (Nalgene Nunc Inter-
national Corporation New Jersey USA),
sistema que permite obtener un ritmo
de congelacin controlado de 1C/min;
finalmente se transfirieron a los tanques
de nitrgeno lquido a 196C.
Prueba de viabilidad
De cada cepa se extrajeron del tanque de
nitrgeno tres viales por cada concen-
tracin de crioprotector y se sometieron
a descongelamiento rpido a 37C en
bao de agua con agitacin. De cada
vial descongelado se colocaron rpi-
damente 0,5 mL en 4,5 mL de medio
EMJH para minimizar la exposicin al
agente crioprotector, sin necesidad de
hacer diluciones (Simione, 1998). Los
medios con cada cepa se incubaron a
30C de 1 a 3 semanas. La concentracin
de leptospiras viables se determin por
conteo microscpico en cmara, antes y
luego sobre los cultivos crioconservados
a intervalos de 30, 90, 180, 270 y 360 das;
slo se contaron organismos mviles
(Alexander et al., 1972).
Tratamiento estadstico
Los datos obtenidos sobre la viabili-
dad de los serovares de Leptospira duran-
te un ao de seguimiento con los tres
tratamientos (DMSO al 2%, glicerol al
0,2% y glicerol al 10% como concentra-
ciones finales) se sometieron a anlisis
de varianza (ANOVA) y se les realiz la
comparacin por parejas utilizando la
prueba de Bonferroni mediante el paque-
te estadstico XLSTAT.
RE S ULTADOS
Los resultados demostraron que con el
uso de DMSO al 2% como crioprotector,
despus de un ao en crioconservacin,
se mantuvo la viabilidad de los seis
serovares de Leptospira incluidos en el
estudio. El glicerol a una concentracin
de 0,2%, mantuvo la viabilidad de cinco
de los serovares utilizados; el serovar
Bratislava present un menor porcentaje
de viabilidad cuando se us el glicerol
a esta concentracin, comportamiento
diferente al resto de los serovares eva-
luados. El menor porcentaje de viabili-
dad se observ en trminos generales
cuando se us como crioprotector el
glicerol a una concentracin final del
10%, con una viabilidad cercana al 55%.
En la figura 1 se observa porcentaje de
recuperacin de cada serovar despus
del proceso de congelacin, utilizando
los tres tratamientos (DMSO al 2%, gli-
cerol al 0,2% y glicerol al 10%).
Al comparar los tratamientos utiliza-
dos en este estudio (DMSO al 2%, glice-
rol al 0,2% y glicerol al 10%) por recuento
en cmara de leptospiras, despus de un
ao de seguimiento, se encontr dife-
rencia significativa (p < 0,001) entre el
DMSO a una concentracin del 2% y gli-
cerol al 10%. Entre el DMSO y el glicerol
al 0,2% no se encontr diferencia signi-
ficativa (p > 0,05); sin embargo, como se
puede apreciar en la tabla 1 y figura 2,
el DMSO es el tratamiento que mostr
mejores porcentajes de supervivencia de
estos microorganismos.
DI S CUS I N
En el presente estudio se describe un
mtodo simple para la conservacin a
largo plazo de serovares de Leptospira.
Los resultados encontrados confirman los
obtenidos por Stalheim (1971) y Palit y
colaboradores (1986), quienes reportaron
que las leptospiras pueden ser crioconser-
74
Figura 1. Porcentaje de viabilidad obtenido de seis serovares de Leptospira, utilizando como
crioprotectores DMSO al 2%, glicerol al 0,2% y al 10% como concentracin final
Tabla 1. Recuento de leptospiras antes y despus de la congelacin en nitrgeno lquido utilizando
dimetil sulfxido al 2%, glicerol al 0,2% y al 10%, al final de un ao de seguimiento
Cepa
Recuento
precongelacin/mL
Recuento poscongelacin/mL 360 das
DMSO 2% Glicerol 0,2% Glicerol 10%
Pomona 9,405 x 10
8
7,74 x 10
8
6,57 x 10
8
4,5 x 10
8
Hardjoprajitno 9,90 x 10
8
6,75 x 10
8
7,49 x 10
8
2,40 x 10
8
Canicola 8,6 x 10
8
7,5 x 10
8
3,8 x 10
8
1,8 x 10
8
Icterohaemorrhagiae 1,3 x 10
9
8,5 x 10
8
6,9 x 10
8
4,8 x 10
8
Grippotyphosa 1,15 x 10
9
8,9 x 10
8
5,8 x 10
8
4,6 x 10
8
Bratislava 9,3 x 10
8
4,8 x 10
8
9,2 x 10
7
2,0 x 10
8
Figura 2. Efecto de los tres tratamientos (DMSO al 2%, glicerol al 0,2% y al 10%) sobre la
viabilidad de seis serovares de Leptospira durante un ao de seguimiento
vadas exitosamente por largos periodos
de tiempo en nitrgeno lquido, usando
como agente crioprotector DMSO en bajas
concentraciones. El mtodo se pudo apli-
car a las seis cepas del estudio con resulta-
dos satisfactorios en cuanto al porcentaje
de recuperacin del microorganismo des-
pus de un ao de seguimiento.
En este estudio se decidi probar como
crioprotectores para la conservacin de
cepas de Leptospira el DMSO al 2% y el
glicerol al 0,2% y al 10% (concentraciones
finales) por dos razones principalmente:
en primer lugar porque de acuerdo con
Hubaleck (2003) son los dos agentes crio-
protectores que han demostrado tener
mayor xito en la crioconservacin de
microorganismos (bacterias, virus, hon-
gos, algas y protozoos); en segundo lugar,
para verificar los resultados obtenidos
por Palit en 1986, quien encontr que el
DMSO al 2% era menos txico que el gli-
cerol aun en concentraciones tan peque-
as como 0,2%.
Los resultados encontrados demostra-
ron que el DMSO al 2% y el glicerol
al 0,2% tuvieron un efecto crioprotector
similar y que en trminos generales el
DMSO permiti un mayor porcentaje de
recuperacin posterior a la crioconser-
vacin en cinco de los seis serovares
estudiados. Los resultados mencionados
se debieron posiblemente a que el DMSO
por ser un poderoso solvente tiene mayor
capacidad de penetracin pasando rpi-
damente a travs de la membrana celular,
ejerciendo su efecto crioprotector intrace-
lular y extracelularmente, disminuyendo
el efecto adverso que produce la concen-
tracin de solutos (Shung-Chang Jong,
1989). Otro factor que se control fue
permitir un periodo de equilibrio entre
la suspensin celular y el crioprotector,
con el fin de permitir que ste penetre en
el interior de la clula por un periodo no
mayor de 30 minutos para evitar efectos
txicos del crioprotector (Hubaleck, 2003).
Finalmente, porque al buscar la concen-
tracin ptima, se pretendi minimizar
el potencial efecto txico que todo agente
crioprotector ejerce sobre las clulas en
altas concentraciones (Fahy, 1986).
Debido a que estudios preliminares
indicaron que el congelamiento rpido
colocando las cepas directamente en
nitrgeno lquido no fue satisfactorio en
75
la conservacin de cepas de Leptospira
(Linscott y Boack, 1960; Stalheim, 1971 y
Reed et al., 2000), en este ensayo se utili-
z un congelamiento lento y controlado
(1C/min). Este mtodo de congelacin
ha mostrado resultados exitosos en la
recuperacin y viabilidad de la mayora
de los sistemas biolgicos donde ha sido
aplicado (Mazur, 1970), incluyendo la
recuperacin de serovares de Leptospira.
El congelamiento lento aumenta la des-
hidratacin celular, impide la formacin
de cristales de hielo intracelular -que pue-
den provocar graves daos en la membra-
na celular- e incrementa la concentracin
de solutos en el espacio intracelular. Para
retrasar el congelamiento intracelular y
minimizar el efecto de los solutos se usa
el DMSO, el cual tiene gran capacidad de
penetracin celular (Simione, 1998). Es
importante tener en cuenta que la tasa de
congelacin depende del volumen de la
suspensin celular en el vial; la cantidad
suficiente para la preservacin de una
cepa bacteriana es de 0,5 a 1 mL en 99%
de los casos (Donev, 2002), razn por la
cual se almacen 1,0 mL de cultivo, para
asegurar que el proceso de congelacin
fuese uniforme.
Estudios recientes han demostrado
que un congelamiento excesivamente
rpido (vitrificacin) permite un alto
porcentaje de recuperacin de la viabili-
dad de varios sistemas biolgicos, simi-
lar al obtenido con un congelamiento
lento y controlado (Dumont et al., 2004).
Teniendo en cuenta que este tipo de
estudios no se han realizado con cepas
de Leptospira, sera interesante llevarlos
a cabo. En general, los mejores resulta-
dos en la supervivencia y recuperacin
de muchos cultivos de bacterias se han
obtenido usando congelamiento lento y
descongelamiento rpido (37C) (Shung-
Chang Jong, 1989). Los resultados obte-
nidos en este trabajo concuerdan con los
de Reed y colaboradores (2000), quienes
encontraron que las ptimas condicio-
nes de criopreservacin se consiguieron
con un congelamiento lento y utilizan-
do glicerol o DMSO en concentraciones
menores al 5%.
Las muestras se almacenaron en la fase
lquida del tanque de nitrgeno (-196C),
puesto que a ms baja temperatura, mayor
es el tiempo que pueden durar almacena-
das; adems, la estabilidad de las clulas
congeladas no se puede asegurar a menos
que el material sea mantenido por debajo
de los -130C (Mazur, 1984).
Aunque el efecto de la edad de los
cultivos sobre la viabilidad de las cepas
de Leptospira durante el proceso de crio-
preservacin no fue determinado, la edad
de los cultivos utilizados en este estudio
fue de 7 a 9 das. En cultivos de ms edad
(final de la fase logartmica y comienzos
de la fase estacionaria) la lisis celular
puede aumentar debido a la actividad
de las lipasas generadas durante el creci-
miento, las cuales pueden generar lpidos
txicos (Faine et al., 1999).
Otro factor crtico que se incluy en
este estudio fue la concentracin celular.
Las seis cepas de este estudio se con-
gelaron con un recuento inicial de 10
9
cel /mL, ya que generalmente a mayor
nmero de clulas presentes antes de
la congelacin, mayor ser el porcentaje
de recuperacin. Para la mayora de las
bacterias una concentracin aproximada
entre 10
7
y 10
8
cel/mL es suficiente para
una adecuada recuperacin (Simione,
1998). En resumen, para este estudio, se
consideraron aptos para crioconservar
en nitrgeno lquido cultivos jvenes de
Leptospira, activamente mviles con una
concentracin de 10
9
cel/mL.
CONCL US I ONE S
El propsito de este trabajo fue estanda-
rizar una tcnica sencilla y eficaz para la
conservacin a largo plazo de serovares
de Leptospira, que permita el manteni-
miento de la viabilidad y pureza de estas
cepas, as como la preservacin de sus
caractersticas genticas.
Los resultados de viabilidad obtenidos
en este estudio, mediante la estandariza-
cin de conteo de poblacin en cmara
Kova Glasstic (Hubaleck, 2003) mues-
tran que esta tcnica de crioconservacin
usando DMSO en bajas concentraciones
es un mtodo confiable en la conserva-
cin de estas cepas, lo cual sugiere que
podra ser aplicable a todos los serova-
res de Leptospira capaces de crecer en
condiciones de laboratorio.
Este mtodo de crioconservacin con
DMSO permite solucionar el problema del
mantenimiento tradicional de los ceparios
de Leptospira, el cual se hace rutinariamen-
te por pases seriados, labor bastante dis-
pendiosa y costosa debido al gran nmero
de serovares existentes y al alto costo de
los medios de cultivo. De acuerdo con
los resultados obtenidos, este mtodo de
crioconservacin puede ser aplicado en
cualquier laboratorio que maneje este tipo
microorganismos exigentes en su conser-
vacin y servir de modelo para la criocon-
servacin de otras colecciones.
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Jess Alfonso Torres Ortega
1
, Oscar Yesid
Surez Palacios
2
, Paulo Csar Narvez
Rincn
3
, Francisco Jos Snchez Castellanos
4
Sulfonation of methyl esters derived
from palm oil
AB S T RACT
Sulfonation with sulfur trioxide
(SO
3
) of methyl esters produced by a
transesterification of hydrogenated palm
stearin, was studied in the present research.
The generation of sulfur trioxide (SO
3
), by
heating, stirring and bubbling nitrogen on
oleum, helped establish the conditions for
processing. Through gas chromatography and
infrared spectroscopy, raw materials were
characterized; and with volumetric titrations,
the percentage of active substance (Hyamina
1622) and sulfuric acid content in the product
were determined, oil-free through drawings
with petroleum ether, and coloring was also
determined in a spectrophotometer (420 nm).
Recommendations were developed from the
standpoint of the process used to identify
the main variables for the functionality of
the sulfonation plant to a scaling-level pilot.
The flow of liquid reactant, the molar ratio
SO
3
/methyl ester, the mole fraction of SO
3
(or
the percentage by volume) in the sulfonante
gaseous flow, and the temperature process
are the variables that have a more decisive
influence on the conversion and properties of
the product.
Keywords: Surfactant, biodiesel, absorption,
estearin, Elaeis guineensis.
Sulfonacin de steres metlicos derivados del
aceite de palma
RE S UME N
En la presente investigacin se estudi la sulfonacin con trixido de azufre (SO
3
) de
steres metlicos fabricados mediante una transesterificacin de la estearina hidroge-
nada de palma. La generacin del agente sulfonante (SO
3
) mediante calentamiento,
agitacin y burbujeo de nitrgeno sobre leum permiti establecer las condiciones de
procesamiento. La materia prima se caracteriz mediante cromatografa de gases y
espectroscopia infrarroja, y a travs de titulaciones volumtricas se determin el por-
centaje de materia activa (Hyamina 1622) y del cido sulfrico contenido en el producto.
Se determinaron el aceite libre mediante extracciones con ter de petrleo, y la colora-
cin mediante espectrofotometra (420 nm). Se sugieren valores de las condiciones de
proceso con miras a un escalamiento piloto. Las variables que tienen una influencia ms
determinante sobre las propiedades finales del producto son: el caudal de reactante
lquido, la razn molar SO
3
/metilster, la fraccin molar de SO
3
(o el porcentaje volum-
trico) en la corriente sulfonante, la temperatura del proceso.
Palabras clave: surfactante, biodisel, absorcin, estearina, Elaeis guineensis.
AGROENERG A
1
Ingeniero Qumico, M.Sc, candidato a Doctor en
Ingeniera, Departamento de Ingeniera Qumica y
Ambiental, Universidad Nacional de Colombia sede
Bogot. jatorresor@unal.edu.co
2
Ingeniero Qumico, M.Sc, aspirante a Doctor en
Ambiental, Universidad Nacional de Colombia, sede
Bogot. oysuarezp@unal.edu.co
3
Ingeniero Qumico, Ph.D. profesor asociado,
Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental,
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogot.
pcnarvaezr@unal.edu.co
4
Qumico, Ingeniero Qumico, Ph.D.
frasaca@hotmail.com
I NT RODUCCI N
Colombia ocupa mundialmente el quin-
to puesto en la produccin de aceite de
palma y el sector palmicultor colombia-
no cuenta con una buena organizacin
gremial. Actualmente el cultivo posee un
rea sembrada de 316.402 hectreas, 4.500
productores y 51 plantas de beneficio,
como resultado de un acelerado ritmo de
sembrados, 65% de las cuales estn en
etapa productiva. Segn el plan Biocom
de Colciencias Corpodib, entre 2004 y
2007 se sembraron 94.601 nuevas hec-
treas que significan un crecimiento de
62,9% respecto del rea cultivada en el
2000 (Torres, 2008). Con un desarrollo
tecnolgico apropiado sera posible esta-
blecer medianas y pequeas industrias en
las regiones palmicultoras -caracterizadas
por pertenecer a zonas no interconecta-
das- para un aprovechamiento ptimo del
aceite de palma mediante el desarrollo de
las cadenas oleoqumicas productivas para
grasas y aceites (Mesa, 2008; Wood, 2008).
Esto permitira obtener derivados oleoqu-
micos requeridos en diferentes campos
de la industria nacional y as satisfacer las
necesidades inmediatas de dichas regiones
en cuanto a comestibles, surfactantes y
biocombustibles, entre otras aplicaciones
(Kohashi, 1990; Bogaerts, 1990).
Figura 1. Proceso para la obtencin de detergente a partir de grasas y aceites
78
Sulfonacin de steres metlicos derivados del aceite de palma
Los metilsteres como alternativa
oleoqumica permiten obtener cosmti-
cos, pinturas y otras sustancias (Ong et
al., 1990; Irazoqui e Isla, 1996), para esta-
blecer as la transformacin del aceite
de palma como una cadena productiva
con mltiples aplicaciones industriales.
Los steres metlicos sulfonados son una
fuente renovable de materia prima, y con
su desarrollo se explota un recurso nacio-
nal, se genera conocimiento y fuentes
adicionales de trabajo.
Las propiedades biolgicas de los meti-
lsteres permiten desarrollar detergen-
tes de baja toxicidad al medio ambiente
(Lewandowski, 2003). Colombia impor-
ta alquilbencenos sulfonados de cadena
lineal (detergentes corrientes) que tienen
la desventaja de su baja biodegradabili-
dad, por lo que se hace evidente la nece-
sidad de desarrollar un reemplazo que
adems de ser limpio tambin permita
el aprovechamiento de los recursos reno-
vables existentes en el pas. Dicho sustitu-
to se puede obtener a partir del aceite de
palma, que es una materia prima abun-
dante con alto potencial para otorgar el
suficiente valor agregado a sus derivados
(Irazoqui e Isla, 1996).
Con esta investigacin se quiere avan-
zar en el estudio de la sulfonacin de
steres metlicos, con la determinacin de
las principales variables requeridas, como
un aporte a la ingeniera bsica del pro-
ceso que permita el escalamiento para la
industria nacional de la palma de aceite
(Torres et al., 2003). Se considera de espe-
cial inters adelantar un estudio intensivo
sobre las variables significativas del proce-
so que determina el grado de sulfonacin
y la coloracin del producto efectuando
ensayos en laboratorio. En este artculo se
presentan los resultados de un conjunto
de experimentos realizados a escala labo-
ratorio en dispositivos especialmente inte-
grados, en los que se variaron la relacin
molar de los reactantes, la temperatura del
proceso y el porcentaje del agente sulfo-
nante en la corriente gaseosa.
El aceite de palma
Los productos oleoqumicos bsicos se
producen mediante la separacin y poste-
rior transformacin qumica de aceites y
grasas. As, el aceite de palma puede con-
siderarse como una gran materia prima
que puede adquirir muchos valores agre-
gados, por sus volmenes de produccin
y precios. Los productos oleoqumicos
bsicos mantienen parte de esa condicin,
pero tienen un mercado ms especfico y
precio ms elevado, en tanto que sus deri-
vados ya pueden considerarse productos
de lo que se ha dado en llamar qumica
fina. En la produccin de precursores
oleoqumicos derivados de grasas y acei-
tes naturales, las principales materias pri-
mas utilizadas son los cidos grasos y los
propios triglicridos; sin embargo, en los
ltimos aos se ha venido incrementando
el nmero de investigaciones en la sntesis
de oleoqumicos a partir de steres grasos,
principalmente metilsteres ya que estas
sustancias presentan algunas ventajas con
respecto a los cidos grasos.
Para la fabricacin de los steres metli-
cos usados en la presente investigacin se
requieren los procesos previos de fraccio-
namiento, refinacin, interesterificacin
e hidrogenacin del aceite de palma. El
fraccionamiento es un proceso de modifi-
cacin puramente fsico y completamente
reversible de separacin, en el que una
parte de la materia grasa se cristaliza de
un modo selectivo, luego del cual la fase
lquida que permanece se separa de la
slida mediante filtracin o centrifuga-
cin (Gmez, 1995; Mongui, 1995).
Comercialmente a la estearina de
palma se le conoce como aceite hidroge-
nado, aunque qumicamente su composi-
cin no corresponda a la triestearina. Su
obtencin, como se observa en la figura
2, es un proceso fsico que se puede con-
trolar para que se obtengan diferentes
niveles de endurecimiento que va desde
los lquidos hasta los semislidos, en el
cual se modifican las caractersticas fsicas
del aceite como el punto de fusin. En
el proceso de neutralizacin se eliminan
cidos grasos libres (AGL) por la accin
de soda custica, adems de neutralizar la
acidez residual del aceite proveniente de
los cidos grasos libres.
En el proceso de sulfonacin para la
produccin de detergentes se requiere
de una cadena carbonada insaturada que
evite reacciones laterales o polisulfonacio-
nes. La longitud de cadena de los metils-
teres encontrados en el caso del aceite de
palma vara entre C12 y C18 que son las
ms adecuadas para el posterior procesa-
miento para la fabricacin de surfactantes
(Irazoqui e Isla, 1996). Los diferentes ci-
dos grasos contienen un grado variable de
instauracin; esta diferencia estructural se
relaciona con diferencias fsicas, princi-
palmente en el punto de fusin. De esto se
deduce que a mayor proporcin de cidos
insaturados en la molcula de triglicrido
ser mayor la tendencia del producto a
ser lquido a temperatura ambiente.
Figura 2. Balance de masa de los racimos de fruta fresca de la palma de aceite (Elaeis guineensis)
durante la extraccin (Bernal, 2001)
79
La introduccin de hidrgeno en las
molculas causa que los cidos grasos
insaturados se saturen, y los aceites de
los cuales forman parte se endurecen
formando los productos denominados
grasas slidas, como es el caso de la estea-
rina hidrogenada de palma; a este proceso
se le llama endurecimiento. Para la sulfo-
nacin es necesario el manejo de steres
altamente hidrogenados (ndices de yodo
< 0,5), con el fin de trabajar con el menor
nmero de insaturaciones, para as evitar
la formacin de productos indeseados
como sulfatos y disales (Roberts, 1995).
El hidrgeno se une al enlace doble en
presencia de un catalizador reduciendo
las insaturaciones presentes en la cadena
carbonada como se observa en la figura
3. Comercialmente cuando se realiza en
aceite de palma se le denomina esteari-
na al producto obtenido, debido a que
se disminuyen las instauraciones en los
cidos grasos que lo componen. Esta ope-
racin se efecta en un reactor adecuado
para resistir alta presin y temperatura,
donde el hidrgeno gaseoso se adiciona
en presencia de un catalizador, asociado
a una temperatura entre 121C y 132C
y una presin de 100 psi (Hastert, 1979).
En la presente investigacin se parti
de estearina refinada e hidrogenada de
palma donada por la compaa nacional
Protcnica Ingeniera S. A.
En el blanqueamiento se separan sus-
tancias colorantes como la clorofila, jabo-
nes y algunos carotenos (Torres y Rodr-
guez, 2007). La desodorizacin se efecta
despus del proceso de blanqueado, para
eliminar los compuestos voltiles que
imparten olores y sabores indeseables al
aceite. La interesterificacin produce cam-
bios en las caractersticas fsicas mediante
el reordenamiento de la distribucin de
cidos grasos.
Metilsteres derivados de la estearina
hidrogenada de palma
Los steres metlicos grasos se derivan de
cidos grasos donde el grupo sustituyente
es un radical metilo. Tienen una impor-
tancia relevante en la industria qumica,
ya que son intermedios reactivos para
una gran variedad de sustancias como
los monoglicridos, diglicridos, alcano-
amidas, steres de sucrosa, lubricantes,
cosmticos, frmacos y, particularmen-
te, los estearatos alqulicos sulfonados
(Roberts y Garrte, 1999) los cuales son
precursores qumicos para la formulacin
de detergentes (Farris, 1979). Actualmen-
te son tambin de gran aplicacin como
combustible en motores diesel (Gerhard
et al., 2005). La produccin de steres
metlicos de cidos grasos se ha clasifica-
do de acuerdo con el mtodo utilizado de
la siguiente manera: catlisis homognea,
catlisis cida, catlisis bsica, catlisis
heterognea y catlisis enzimtica.
La reaccin de transesterificacin ocu-
rre entre un alcohol y un cido carbox-
lico para formar un ster que contiene
el grupo funcional carboalcoxi COO,
como se aprecia en la figura 4.
La catlisis homognea y bsica, utili-
zada en este trabajo, consiste en premez-
clar un catalizador (sustancia inorgnica
alcalina), por lo general hidrxidos o car-
bonatos de sodio o potasio, con el alcohol.
La mezcla del alcohol y el catalizador se
agregan al aceite en un reactor (continuo
o por lotes) a una temperatura de 60C.
Este es el proceso ms empleado y desa-
rrollado industrialmente, alcanzndose
conversiones superiores al 95%. El alcohol
utilizado debe ser anhidro, puesto que el
agua causa hidrlisis de los triglicridos
e incrementa la produccin de jabones,
lo que perjudicara la separacin entre la
fase oleosa y la de glicerol por la forma-
cin de microemulsiones como se observa
en la figura 5.
Investigaciones sobre transesterifica-
cin de cidos grasos establecieron las
condiciones ptimas para la obtencin
de steres metlicos derivados de aceites
vegetales, analizando variables como son
la relacin molar aceite/metanol, porcen-
taje de catalizador usado, el contenido de
agua y de cidos grasos libres, la agitacin
del sistema de reaccin y la temperatura
(Sridharan y Mathai, 1974). Se han plan-
teado varios estudios dependiendo de
los factores mencionados; para catlisis
homogneas De Filippis y colaboradores
emplearon KOH (1995), y Cheah y colabo-
radores (1998), NaOH; para catlisis hete-
rognea Urresta y colaboradores (2000)
manejaron catalizadores soportados a
base de Sn y Ni. Las propiedades ms
importantes de algunos estearatos usados
como materia prima en la produccin de
tensioactivos se presentan en la tabla 1.
Un estudio reciente desarrollado por
Narvez (2006) para la produccin de
Figura 3. Esquema de reaccin para la hidrogenacin de grasas y aceites (Ahmad et al., 1999)
Figura 4. Reaccin global de la transesterificacin de triglicridos (Darnoko y Cheryan, 2000)
80
metilster de cidos grasos en un con-
tactor de filamentos metlicos, que se
encuentra en patentamiento actualmente,
encontr un conjunto de condiciones de
operacin para determinar la cintica de
la transesterificacin de aceite de palma
con soda y metanol; dicho contactor faci-
lita una buena conversin, productividad
y separacin de los productos.
Un esquema simplificado del proce-
so de produccin de steres metlicos a
partir de aceite refinado, blanqueado y
desodorizado de palma africana (RBD) se
presenta en la figura 6. La transesterifica-
cin se lleva a cabo en un reactor de lotes,
con una capacidad de 20 litros, provisto
de una chaqueta de calentamiento con
aceite trmico y agitacin mecnica (300
500 rpm), como se observa en la figura 7.
Se determin que la concentracin de la
soda a usar que se agregar al aceite para
iniciar la reaccin, corresponde a 0,75%
en peso respecto del aceite, mediante la
disolucin del hidrxido de sodio en el
metanol bajo un leve calentamiento minu-
tos antes de iniciar la reaccin.
El reactor se encuentra provisto de un
sistema de agitacin mecnica con aspas,
adems est provisto de bafles en sus
paredes internas para favorecer el con-
tacto entre las sustancias reaccionantes.
Una vez se carga la estearina y al finalizar
la adicin del metanol y el metxido de
sodio empieza a contabilizarse el tiempo
de reaccin. La reaccin se sucede por
espacio de 2 horas, con control de tem-
peratura y reflujo total del metanol, para
lo que se adaptan dos condensadores
de igual longitud (30 cm), el primero de
espiral y el segundo de tubera recta lisa,
con el fin de mantener una relacin molar
de 6:1 entre el metanol y la estearina, que
es considerada la relacin ptima (Fredd-
man, 1984), la temperatura se fija en 60C
(la temperatura de ebullicin del metanol
en Bogot es de 58,5C) y se opera el pro-
ceso a presin atmosfrica.
Mediante una transesterificacin por
catlisis bsica (NaOH < 1% w/w) se
utilizaron las condiciones de operacin
para asegurar una buena conversin y
productividad en un reactor de tanque
agitado, con lo cual se obtuvo una mezcla
conformada principalmente por palmita-
to de metilo y estearato de metilo (Torres
Figura 5. Conversin de metilster a jabn (Foster, 2001)
Tabla 1. Propiedades de steres metlicos referenciados en publicaciones cientficas y/o comerciales
Propiedades
Choo
et al.
Stein y
Baumann
De
Groot
Henkel
Company
Procter y
Gamble
Cheminton
Company
Valor cido 0,28 0,2 1,2 3,8 0,8 mx, 0,4
ndice de yodo 19,7 < 0,5 0,1 0,19 0,1 0,3
ndice de saponificacin 239,2 240 240 197 252 -
Peso molecular promedio - 233 - 281 218 279
Figura 7. Esquema del reactor de tanque agitado con reflujo total, chaqueta de calentamiento y
provisto de bafles
Figura 6. Esquema simplificado del proceso de obtencin del metilster a partir de aceite de palma
refinado, blanqueado y desodorizado
81
et al., 2005). Dicha mezcla se destil al
vaco varias veces para lograr la ausencia
total de agua, lo que se verific con el
mtodo de Karl Fischer; se caracteriz por
cromatografa de gases (Narvez et al.,
2005) y se almacen para su disposicin
en el proceso de sulfonacin.
El agente sulfonante SO
3
El otro reactante involucrado en la sulfo-
nacin se obtuvo a partir del leum (20%
- 65% peso/peso), mediante el despoja-
miento del SO
3
con la accin combinada
del calentamiento (70C), agitacin mec-
nica (500 rpm) y burbujeo del leum con
nitrgeno. La composicin de SO
3
como
funcin del flujo de nitrgeno, utilizado
en la experimentacin a escala laborato-
rio, se determin empricamente median-
te la reaccin sobre una solucin de cido
sulfrico con la implementacin de una
columna semiempacada; se encontraron
as las relaciones ptimas de flujo para
las concentraciones deseadas de SO
3
en la
corriente gaseosa de 3% a 7% vol/vol (De
Groot, 1991; Ahmad et al., 1998).
El SO
3
existe en por lo menos tres
modificaciones slidas que se forman por
la condensacin de unidades de SO
3
en
molculas ms grandes llamadas polme-
ros. A temperatura ordinaria, se puede
presentar en tres formas: gamma (trme-
ra), beta (polmera lineal) y alfa (polmera
reticulada), cuyos puntos de fusin son
respectivamente: 16,8C, 32,5C y 62,3C.
En la figura 8 se aprecian la estructuras
del SO
3
sugeridas mediante tcnicas de
difraccin electrnica IR. El SO
3
es un
material voltil; en estado lquido las
formas alfa y beta se transforman rpida-
mente en la forma gamma, cuyo punto de
ebullicin es 44,7C. En fase vapor existe
nicamente el monmero.
El grupo SO
3
H le confiere a la mol-
cula del producto sulfonado un carcter
polar, que lo hace compatible con com-
puestos polares, tales como el agua. A
pesar de la introduccin del grupo polar,
la cadena aportada por la materia prima
no pierde su carcter apolar, haciendo
que la molcula resultante sea compatible
con compuestos apolares. El resultado es
una molcula compatible con compuestos
polares y apolares, o hidroflicahidro-
fbica. Esta caracterstica puede cuan-
tificarse mediante una sencilla medida
denominada balance lipoflico hidroflico
(Hydrophile-Lipophile Balance HLB-).
En los experimentos de desorcin y
posterior absorcin del SO
3
a partir del
leum se utilizaron dos equipos. Para el
despojamiento se realizaron tres accio-
nes sobre el mismo tanque de alma-
cenamiento del leum en la planta: el
calentamiento, la agitacin y el burbujeo
con nitrgeno. La corriente gaseosa es
llevada a un retenedor de gotas para
sustraer los vapores de cido sulfrico,
luego pasa a un absorbedor o columna
de vidrio de 40 cm de longitud y 2,54
cm de dimetro (1 pulgada), empacado
con cilindros cnicos de vidrio (6 mm
de dimetro) hasta una altura de 30 cm
dispuestos al azar, el cual contiene agua
acidulada (cido sulfrico).
El gas de arrastre proveniente del reac-
tor de generacin del agente sulfonante
ingresa por el fondo de la columna y se
hace burbujear por medio de una placa
porosa adaptada para tal fin, como se
muestra en la figura 9(a). A intervalos de
2, 4 y 10 minutos se toman muestras para
las respectivas lecturas del porcentaje de
H
2
SO
4
en el Laboratorio de Combustibles.
Para los experimentos se usaron 200 mL
de una solucin de cido sulfrico 0,05N,
y se deriv una toma desde el reactor
de generacin del agente sulfonante o
tanque de almacenamiento del leum, la
cual se conecta por la parte inferior de la
columna empacada, como se muestra en
la figura 9(b). La columna cuenta en la
parte superior con dos salidas, una para
toma de muestras y una para el escape del
gas de arrastre.
De acuerdo con la experimentacin se
deduce que la razn de cambio en las solu-
ciones se debe a la absorcin de SO
3
y la
reaccin qumica en la solucin diluida de
cido sulfrico. Por lo anterior se presenta
un aumento en la concentracin de SO
4
2
,
la cual se determina mediante titulacin
volumtrica. As se obtienen los porcenta-
Figura 8. Polmeros del trixido de azufre. (a) forma gamma; (b) forma beta; la forma alfa es similar
a sta pero con las cadenas unidas en estructura de capas (Knaggs y Nepras, 1997)
Figura 9. Esquema del dispositivo utilizado para determinar la absorcin de SO
3
arrastrado
mediante una corriente de nitrgeno; (a) columna empacada de absorcin; (b) tanque agitado de
almacenamiento del leum
82
cin, el proceso debe estar diseado para
minimizar la formacin de compuestos
coloreados producto de la sulfonacin
de compuestos poliinsaturados. Las apli-
caciones de los MES incluyen su uso
como emulsificante para polimerizacin,
adhesivos, agentes antiestticos, baos
de burbujas, intermediarios qumicos,
limpiadores, inhibidores de corrosin,
agentes dispersantes, espumado, flota-
cin de minerales, germicidas, lubrican-
tes, limpieza de metales, metalurgia (pro-
cesamiento y molienda), recuperacin
de aceite, pinturas, fabricacin de papel,
champes, suavizantes, uretanos, agentes
humectantes, etc.
Efecto de los parmetros operativos en
la sulfonacin de metilsteres
El arrastre del SO
3
se estableci en el
laboratorio como funcin del flujo de
nitrgeno y se verific midiendo la den-
sidad del leum gastado para determinar
el SO
3
libre correspondiente para esa
densidad y temperatura del ensayo (Kirk
y Othmer, 1981; Ullmann, 1985). Una
vez determinada la composicin de la
corriente sulfonante se realizaron ensayos
en laboratorio, con el objeto de establecer
las variables ms significativas del pro-
ceso de sulfonacin del ster metlico.
El diseo de experimentos realizado se
presenta junto con los resultados y el
anlisis de la influencia de las variables
analizadas, para la evaluacin del proceso
de sulfonacin de steres metlicos en un
reactor por lotes en el laboratorio en las
siguientes tablas. En este desarrollo expe-
rimental se busc definir el efecto de tres
variables como la relacin molar SO
3
/ster
metlico, la temperatura del proceso y el
porcentaje volumtrico de SO
3
en la fase
gaseosa, sobre el porcentaje de materia
activa, el porcentaje de ster metlico no
sulfonado porcentaje de aceite libre), el
color por medio del anlisis de color Klett
(espectrofotmetro Gnesis 5 Milton Roy)
y el porcentaje de cido sulfrico que da
una medida del SO
3
que se difundi en el
ster metlico pero no reaccion (Battagli-
ni et al., 1986; Yamada y Matsutani, 1996;
Schmitt, 2001). A continuacin se define
el intervalo de estudios de cada una de
las variables:
Relacin molar SO
3
/ster metlico: el
intervalo de estudio para esta variable
mantuvo una buena relacin molar
Figura 10. Diagrama del proceso industrial de sulfonacin (MacArthur et al., 1998)
jes volumtricos del trixido de azufre en
la corriente de arrastre de nitrgeno. Se
determin una funcin exponencial de la
absorcin en la columna empacada, %SO
3

= 2 10
-5
(flujo de nitrgeno)
2
+ 0,0002
(flujo de nitrgeno), R
2
= 0,9778.
Metilsteres sulfonados
Como se observa en la figura 10, en las eta-
pas del proceso de sulfonacin de steres
metlicos se encuentra la etapa de acondi-
cionamiento de las materias primas, segui-
da de la etapa de reaccin en el reactor de
pelcula y la inmediata digestin para dar
lugar a la formacin y el reordenamiento
de las molculas. Las principales variables
para el seguimiento durante el proceso de
sulfonacin son el porcentaje de SO
3
en la
mezcla sulfonante, la relacin molar entre
el agente sulfonante y el lquido orgnico,
la temperatura del reactor, la temperatura
del reactor de digestin, la temperatura de
neutralizacin y el tiempo de blanquea-
miento, entre otras.
Los steres metlicos sulfonados (MES)
son surfactantes aninicos, producidos
con la reaccin de sulfonacin de los
steres metlicos de cidos grasos. Qu-
micamente se componen de carboxilatos
grasos sulfonados en la posicin alfa con
respecto al grupo carbonilo, un grupo
alquilo y un catin orgnico o tpicamen-
te inorgnico unido al grupo sulfnico.
Dentro de la categora de MES se incluyen
las sales disustituidas en las que el grupo
alquilo de la molcula es reemplazado por
un catin. De manera general, este tipo de
compuestos puede ser representado por
las frmulas mostradas en la figura 11.
Donde R puede ser una cadena com-
prendida entre C
12
y C
18
. Cuando el MES
es derivado de la estearina de palma R
est entre C
16
y C
18
. La neutralizacin
generalmente se hace con sodio, pero
puede hacerse con otros iones metlicos
monovalentes, como el potasio, lo que
confiere a la molcula otras propiedades
de solubilidad. Durante la etapa de reac-
Figura 11. Molculas de MES, (a) frmula neutralizada, (b) frmula cida, (c) frmula disal
83
de SO
3
/ster metlico, por lo tanto se
tomaron los valores recomendados por
la literatura en el proceso de obtencin
de dodecilbenceno sulfonado (DDBS),
como lmites experimentales 1 y 1.2
(De Groot, 1991).
Temperatura del metilster: se toma el
valor mnimo como el cercano al punto
de cristalizacin del ster: 43C y el
valor mximo, el cercano al valor de
operacin en el reactor: 70C.
Porcentaje de SO
3
en el gas de la
mezcla gaseosa que entra al sistema
reaccionante: se determin teniendo
en cuenta los parmetros de operacin
que varios autores recomiendan en los
procesos de DDBS, de forma que el
intervalo es de 3% a 7% vol/vol SO
3
/
N
2
(De Groot, 1991).
Como el objetivo de este experimen-
to es evaluar dentro de un intervalo de
condiciones de operacin el efecto de las
variables en el proceso de sulfonacin
por lotes, la metodologa de superficies
de respuesta es adecuada. El propsito
es optimizar las condiciones del proce-
so para obtener una alta productividad,
lo que se logra mediante experimentos
secuenciales que involucran las variables
de inters. El criterio es el siguiente: la
respuesta es una variable cuantificable
continua que es una funcin suave pero
desconocida de los niveles de n factores
experimentales. La funcin de respues-
ta principal, cuando se grafica, es una
superficie en n+1 dimensiones (Dean y
Voss, 1999). Por lo tanto, la utilidad de
una superficie de respuesta se ve en la
posibilidad de ubicar dentro de un inter-
valo de variables experimentales, una
combinacin de condiciones de operacin
para la cual la respuesta se maximiza
o minimiza. Los modelos de segundo
orden permiten estimar eficientemente
las superficies de respuesta, e incluyen
los diseos compuestos centrales (CCD
por su sigla en ingls), que son los ms
empleados y tienen cinco niveles por cada
factor: + 1, + , + 0.
Para el diseo de experimentos desa-
rrollado en este trabajo se seleccion un
CCD rotable con tres factores y siete pun-
tos centrales. En la tabla 2 se presentan las
variables de estudio y los niveles + 1 de
cada una de ellas. En la tabla 3 se muestra
el experimento diseado. El anlisis de las
variables de operacin fue desarrollado
Tabla 2. Variables y niveles de estudio para la evaluacin de la sulfonacin en tanque agitado
Variables ,Lmite inferior Lmite superior
Relacin molar SO
3
/ster metlico 1 1,2
Temperatura del ME, C 50 70
Porcentaje de SO
3
en la corriente sulfonante,
3 7
Tabla 3. Diseo de experimentos para la evaluacin de la sulfonacin de steres metlicos en el
laboratorio
Experimento
Relacin molar SO
3
/
ster metlico
Temperatura del
ME, C
Porcentaje de SO
3

gas de entrada
1 1,1 60 5
2 1,1 60 5
3 1,1 60 5
4 1,1 60 5
5 1,1 60 5
6 1 50 3
7 1,2 50 3
8 1 70 3
9 1,2 70 3
10 1 50 7
11 1,2 50 7
12 1 70 7
13 1,2 70 7
14 0,9 60 5
15 1,2 60 5
16 1,1 43 5
17 1,1 76 5
18 1,1 60 1,6
19 1,1 60 8,3
Nmero de factores experimentales: 3. Nmero de bloques: 1. Nmero de ejecuciones: 19.
con la ayuda del programa Statgraphics
Centurion. En la tabla 4 se presentan los
resultados de la experimentacin realiza-
da a escala laboratorio en las condiciones
presentadas en la tabla 3.
Anlisis de las variables en el
laboratorio
Materia activa (metilster sulfonado)
El incremento del porcentaje de trixido
de azufre tiene una accin positiva, pro-
bablemente porque se favorece la trans-
ferencia de masa en el ster metlico;
tambin se puede observar la variacin
que presenta la temperatura del proceso
y la relacin molar SO
3
/ME, los cuales
acrecientan la sulfonacin del ster met-
lico. Sin embargo, el cambio de pendiente
que se presenta con respecto a la variable
de temperatura del proceso se debe a la
generacin de reacciones colaterales, y la
formacin de productos indeseados que
disminuyen el porcentaje de materia acti-
va (Roberts, 1995).
El aumento del caudal del ster met-
lico manteniendo el porcentaje de SO
3

84
ster metlico y la formacin de produc-
tos indeseados, lo que redundar en el
incremento de la materia no sulfonada.
Este fenmeno es verificado con la grafica
de la temperatura de la mezcla sulfonada
que al alcanzar 60C presenta un punto de
inflexin y revierte su tendencia debido al
aumento de reacciones colaterales. El por-
centaje de materia no sulfonada decrece
en la medida que aumenta el porcentaje
de agente sulfonante en la mezcla gaseosa
con nitrgeno, lo que est de acuerdo con
los datos de la literatura.
Se puede notar en la figura 13 que al
aumentar el porcentaje de SO
3
en el gas,
disminuye el porcentaje de aceite libre;
igual sucede con un aumento de la relacin
molar y la temperatura. Vale la pena men-
cionar que la presencia de otras sustancias
de mayor grado de sulfonacin (sobresul-
fonacin) y los otros productos generados
por las reacciones colaterales -los cuales no
presentan las mismas caractersticas que
s posee el ingrediente activo sulfonado-
son consideradas en el anlisis de aceite
libre como materia no sulfonada, por lo
cual se hace necesario realizar un control
riguroso de las variables en el proceso de
sulfonacin y llevar a cabo un proceso de
optimizacin de las variables para maximi-
zar la conversin del ster. Con lo anterior
se debe asegurar que la relacin molar
SO
3
/ME sea al menos de 1,0 y la tempera-
tura de la chaqueta se mantenga en 60C,
incluyendo las temperaturas del proceso
para la mezcla de gases y de steres que
ingresen al cabezal de entrada del reactor
de pelcula. Finalmente, un exceso de SO
3

es necesario en la reaccin para as dismi-
nuir la cantidad de aceite libre o materia
orgnica no sulfonada.
Coloracin
Se presentan en la figura 14 las curvas
obtenidas para el color del producto en
Tabla 4. Resultados del experimento de evaluacin del proceso de sulfonacin a escala laboratorio
de steres metlicos
Experimento
Materia activa,
%
Aceite libre,
%
cido sulfrico,
%
Color Klett
1 62 25 0,30 61
2 60 26 0,38 66
3 62 25 0,40 64
4 63 38 0,46 64
5 63 32 0,40 65
6 46 20 0,31 70
7 52 40 0,28 84
8 55 35 0,25 65
9 65 36 0,28 80
10 58 27 0,36 38
11 64 32 0,34 82
12 60 29 0,34 84
13 69 23 0,40 85
14 57 38 0,33 79
15 59 31 0,33 86
16 48 35 0,30 58
17 50 37 0,42 60
18 40 39 0,23 41
19 68 28 0,30 38
constantes implica un aumento de todos
los caudales. Dicho efecto tiene como
consecuencia un aumento de la materia
activa y una disminucin del contenido
en trixido de azufre.
De estas curvas pueden confirmarse
los efectos de las variables descritos ante-
riormente, en las cuales se presenta un
comportamiento directo de la generacin
de materia activa frente al aumento de la
relacin molar SO
3
/ster, ya que la reac-
cin se favorece con el exceso del agen-
te sulfonante. La figura 12 muestra el
efecto de las variables principales: rela-
cin molar SO
3
/ME, temperatura y %SO
3

sobre el porcentaje de materia activa.
La generacin de materia activa frente
a la temperatura de la mezcla sulfonan-
te es favorable hasta aproximadamente
65C; por este motivo la temperatura
no debe ser menor al valor mencionado,
pero tampoco mayor, puesto que luego
se presenta un decrecimiento debido a
la generacin de reacciones colaterales.
Caso contrario se aprecia con el porcen-
taje de SO
3
en la mezcla sulfonante, ya
que resulta muy favorable el incremento
de esta mezcla frente a la produccin de
materia activa. El aumento de la razn
molar con una concentracin de SO
3

constante implica un aumento simult-
neo de la mezcla sulfonante (SO
3
/N
2
);
este efecto causa un aumento del conte-
nido en la materia activa.
Aceite libre (metilster no sulfonado)
El efecto de las variables estudiadas sobre
el porcentaje de materia no sulfonada es
inverso al efecto que presentan en el por-
centaje de materia activa, como se observa
en la figura 13. Sin embargo, cuando la
relacin molar de SO
3
/ME es mayor que
1,0 inicia un crecimiento; este cambio en
el comportamiento de la variable puede
explicarse con la sobresulfonacin del
Figura 12. Efecto de las variables de estudio
sobre el contenido de materia activa
sobre el contenido de aceite libre
85
los valores lmite de concentracin de
SO
3
, sobre las cuales se puede mencionar
que la variable de mayor influencia es la
relacin molar SO
3
/ster metlico seguida
por el porcentaje de SO
3
. Todas las varia-
bles mostraron una influencia directa al
aumento del color. Se observa claramente
la influencia del agente sulfonante y el
efecto de la temperatura en la reaccin,
ya que a mayor grado de sulfonacin se
presenta mayor coloracin del producto.
La influencia de las variables estudiadas
sobre el color, en orden de importancia es
el porcentaje de SO
3
seguida por la tem-
peratura de los gases y la relacin molar
SO
3
/ster metlico.
Contenido de SO
3
libre (disuelto en el
producto)
La figura 15 muestra el efecto de las
variables estudiadas sobre el porcentaje
de cido sulfrico. De acuerdo con lo
esperado, el incremento del porcentaje
de trixido de azufre tiene un efecto
positivo. Tambin se puede observar el
efecto creciente en la presencia de SO
3

en el producto debido al aumento en la
temperatura del proceso; como ya se men-
cion anteriormente este comportamien-
to puede encontrarse relacionado con
el favorecimiento en la transferencia de
materia, pero el cambio en la pendiente
de todas las curvas resultante es causado
por los efectos cinticos favorecidos por el
aumento de temperatura.
El incremento tanto de la relacin
molar como del porcentaje del trixido de
azufre en la mezcla sulfonante se puede
explicar por la efectividad de la reaccin
resultante de un exceso de SO
3
que favo-
rece el consumo de ste mismo para la
generacin de materia sulfonada. Por el
contrario, una temperatura alta en el gas
de entrada al reactor de pelcula aumenta
la acidez del producto, con trixido org-
nicamente combinado o disuelto.
CONCL US I ONE S
La extraccin del SO
3
desde el leum
por medio del calentamiento, la agitacin
y el arrastre con distintos flujos de nitr-
geno puede ser utilizada para la sulfona-
cin de steres metlicos de estearina de
palma con resultados aceptables.
Los resultados muestran que es viable
la obtencin de steres metlicos sulfona-
dos usando como agente sulfonante SO
3

derivado del leum.
La experimentacin realizada permiti
determinar las variables influyentes en la
sulfonacin de steres metlicos y tambin
establecer las condiciones de operacin:
la relacin molar SO
3
/ME: 1,1; la tempe-
ratura del proceso: 60C y el porcentaje
volumtrico de SO
3
: 5% en la corriente
sulfonante.
Las curvas presentadas en las figuras
12 a 15 reafirman las condiciones de ope-
racin ptimas para el proceso de sulfo-
nacin de steres metlicos, las cuales se
pueden aplicar en el proceso de sulfona-
cin a escala banco, piloto o industrial.
Se recomienda la construccin de una
planta semiindustrial de sulfonacin de
steres metlicos derivados del aceite de
palma que permita el aprovechamiento
de un recurso propio, renovable, biode-
gradable y de alto consumo como agente
tensioactivo.
Este trabajo fue apoyado por el Institu-
to Colombiano para el Desarrollo de la
Ciencia y la Tecnologa Francisco Jos de
Caldas -Colciencias- bajo el contrato RC
3892003 cdigo 11010814678, y el Progra-
ma de Apoyo a Doctorados Nacionales a
travs del Convenio 067/2002 con la Uni-
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1
,
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3
Kinetic study of methyl esters
sulfonation derived from palm stearin
AB S T RACT
The methyl esters as an alternative to
oil-chemical compounds, is an feedstock
to manufacture of detergents, polymers,
coatings, cosmetics, paints and other
substances, establishing them the palm oil
transformation like a productive chain with
multiple applications at the industry level.
Biological properties of biodiesel (methyl
ester) sulfonated allow to develop low toxicity
detergents to the environment, they are a
renewable source of raw material, and with its
development it is possible to take advantage
of a national sources of knowledge and
employment. Methyl esters sulfonation is a
reaction highly exothermic, where reaction
velocity determines the charge of heat, which
should be dissipated by reactor. Therefore,
it is important for sulfonation reactor design
and its mathematical modelling. In this
investigation, a kinetic study for methyl ester
from palm oil stearin with sulfur trioxide
SO
3
sulfonation is presented, whereby with
experimental techniques, it was possible
to obtain a kinetic expression for reaction
velocity. Tests in the laboratory allowed
the deduction of a second-order kinetics
for the reaction mechanism proposed, the
reaction rate described adequately with SO
3

sulfonation of methyl esters derived from
hydrogenated palm stearin. It was observed
second order kinetics of the reaction for the
overall process of sulfonation with SO
3
methyl
esters.
Keywords: Biodiesel, oil palm, chemical
reactions, surfactant, reactor.
Estudio cintico de la sulfonacin de steres
metlicos derivados de la estearina de palma
RE S UME N
Los steres metlicos como alternativa oleoqumica permiten sintetizar compuestos para
la fabricacin de detergentes, polmeros, recubrimientos, cosmticos, pinturas y otras
sustancias. As, la transformacin del aceite de palma se establece como una cadena
productiva con mltiples aplicaciones industriales. Las propiedades biolgicas del ster
metlico sulfonado, derivado del aceite de palma, permiten desarrollar detergentes de
baja toxicidad al medio ambiente, son una fuente renovable de materia prima, y con
su desarrollo se explota este recurso nacional; se generan as conocimiento y fuentes
adicionales de trabajo. La sulfonacin de steres metlicos es una reaccin altamente
exotrmica en la que la velocidad de reaccin determina la carga trmica que debe
disipar el reactor, y por tanto es trascendental para el diseo del reactor de sulfonacin
y su modelamiento matemtico. Mediante tcnicas instrumentales se estableci una
expresin cintica para la velocidad de reaccin. Los ensayos realizados en el laborato-
rio permitieron la deduccin de una cintica de segundo orden para el mecanismo de
reaccin propuesto; esta velocidad de reaccin describe adecuadamente la sulfonacin
con SO
3
de steres metlicos derivados de la estearina hidrogenada de palma. Se verific
la cintica de segundo orden de la reaccin global del proceso de sulfonacin de steres
metlicos con SO
3
.
Palabras clave: biodisel, aceite de palma, reacciones qumicas, surfactante, reactor.
1
Ingeniero Qumico, M.Sc. candidato a Doctor en
Ambiental, Universidad Nacional de Colombia sede
Bogot. jatorresor@unal.edu.co
2
Ingeniero Qumico, estudiante de Maestra en
Ingeniera Qumica, Departamento de Ingeniera
Qumica y Ambiental, Universidad Nacional de
Colombia sede Bogot. ladiaza@unal.edu.co
3
Qumico, Ingeniero Qumico, Ph.D.
frasaca@hotmail.com
I NT RODUCCI N
En Colombia el mayor potencial de
materia prima para la produccin de
estearatos se encuentra en el cultivo de la
palma de aceite (Elaeis guineensis), gracias
a las condiciones del cultivo que cuenta
con los mayores rendimientos por hect-
rea entre las oleaginosas, el crecimiento
de rea cultivable en los ltimos aos,
el posicionamiento en el mercado mun-
dial, las acciones del gremio y el impul-
so gubernamental. Esto contrasta con el
poco desarrollo que han tenido otras olea-
ginosas tropicales que ofrecen potenciales
ventajas como biomasa para la produc-
cin de biocombustibles como la higueri-
lla (Ricinus communis), inchi (Sacha inchi) y
jatrofa (Jatropha curcas), entre otras.
La sulfonacin es el proceso mediante
el cual un sustrato orgnico que cuenta
con un tomo de carbono en capacidad de
donar electrones, reacciona con un agente
sulfonante como trixido de azufre, cido
sulfrico o cido sulfmico, entre otros,
para dar como resultado un sulfonato. Se
trata de una reaccin electroflica tpica
donde los tomos de oxgeno que rodean
el tomo de azufre en la molcula de SO
3

deslocalizan los electrones, creando en el
azufre un centro electroflico. Este cen-
tro electroflico reacciona fcilmente con
densidades electrnicas deslocalizadas,
ubicndose en los puntos de mxima den-
sidad electrnica. El ejemplo ms comn
de este ataque se presenta en los com-
puestos aromticos, cuya alta densidad
electrnica , los hace susceptibles a un
ataque electroflico (Wade, 1993).
Un sulfonato se caracteriza por la intro-
duccin del grupo sulfonato SO
3
H a una
molcula orgnica por medio de un enla-
ce carbonoazufre. Entre los compuestos
que se pueden sulfonar se encuentran los
hidrocarburos aromticos: olefnicos, ami-
das y fenoles, cuyo producto es muy esta-
ble. Ejemplos tpicos de sulfonaciones son
los ataques del trixido de azufre sobre
un anillo bencnico que forma un com-
plejo sigma (R + SO
3
R SO
3
H), o
sobre un doble enlace (RCH
2
CH=CH
2

+ SO
3
RCH=CHCH
2
SO
3
H), cuyas
reacciones suelen producir cierta varie-
dad de subproductos, entre ellos deriva-
dos polisulfonados (Edwars, 1976).
Para efectos del escalamiento y el dise-
o de equipos para la sulfonacin, la velo-
cidad de reaccin es importante porque
determina la generacin del producto y,
89
Estudio cintico de la sulfonacin de steres metlicos derivados de la estearina de palma
por tratarse de una reaccin exotrmica,
la generacin de calor (Torres et al., 2004).
Los datos termodinmicos establecidos
por medio de la simulacin molecular se
encuentran en el rango de los compues-
tos similares reportados en la literatura
para compuestos sulfonados (Torres et
al., 2005). Con esta investigacin se quiere
dar un paso adelante en el estudio de la
sulfonacin, a travs de la determinacin
de una expresin cintica para la reaccin
de steres metlicos con SO
3
, como una
etapa inicial pero teniendo como punto
de llegada el aporte de una mejor com-
prensin del proceso en especial para la
industria nacional de la palma de aceite
(Torres et al., 2003). En este artculo se
presentan los resultados de experimentos
realizados a escala laboratorio en dispo-
sitivos especialmente integrados, en los
que se variaron la relacin molar de los
reactantes, la temperatura del proceso y
el porcentaje del agente sulfonante en la
corriente gaseosa.
Qumicamente el metil ster sulfonado
(MES) neutralizado presenta una estructu-
ra anfiptica, compuesta por un carboxi-
lato graso sulfonado en la posicin alfa
con respecto al grupo carboxilo, un grupo
alquilo y un catin orgnico o tpicamente
inorgnico unido al grupo sulfnico. La
sal monosdica del MES es un agente
aninico de actividad superficial que es
producida a partir de cidos grasos. Con
el proceso de sulfonacin el ME adquie-
re un carcter hidroflico y simultnea-
mente hidrofbico, como consecuencia de
la introduccin del grupo sulfnico que
le confiere a la molcula solubilidad en
el agua, mientras la cadena al que se
une aporta la hidrofobicidad o lipofilidad
como se observa en la figura 1 (Drozd,
1990; Roberts, 1992; Hovda, 1993).
Las caractersticas polares del grupo
sulfnico sumadas a las propiedades
apolares de las molculas configuran la
estructura ambiflica de este tipo de mol-
culas (Ingegard y Martin, 2001). La alta
produccin de tensoactivos aninicos sul-
fonados y/o sulfatados es una actividad
de la mayor importancia en la industria
qumica y de considerable relevancia,
debido a la progresiva restriccin en el
uso de sustancias fosfatadas (Ghazali,
1999). Los MES poseen excelentes propie-
dades como surfactantes con una buena
dispersabilidad en aguas duras (Stein y
Baumann, 1975; Drozd, 1990; Inagaki,
1990; Ismail et al., 1990; Lim y Ho, 1990;
Ahmad et al., 2007).
La doble compatibilidad de los com-
puestos sulfonados les otorga ciertas
propiedades muy interesantes y bastante
tiles; en primer lugar, la ubicacin prefe-
rencial en las superficies de los lquidos o
en las interfases de compuestos no com-
patibles, por lo que sirven de puente entre
ellas y facilitan su dispersin. En segundo
lugar, la ubicacin de las molculas hace
que disminuya la energa de superficie
del sistema, modificando de esta forma la
tensin superficial en sistemas conforma-
dos por lquidos inmiscibles.
Los sulfonatos, o sales de cidos sul-
fnicos, son importantes agentes de acti-
vidad superficial, conocidos como sur-
factantes. Adems de sus propiedades de
desempeo, son excelentes intermediarios
orgnicos en la produccin de compuestos
como aminas, nitrilos, etc. La amplitud de
aplicaciones de los sulfonatos, sumada a
los altsimos volmenes de produccin
de las industrias en las cuales se emplean,
hace que todo el proceso de sulfonacin
tenga una gran importancia comercial.
Los MES se comportan de forma seme-
jante a los alquilsulfatos (AS), con longi-
tudes de cadena similares pero con mejor
estabilidad hidroltica. Los detergentes
basados en cadenas C16/18, como los
derivados de la palma de aceite, muestran
una detergencia superior que los alquil-
benceno sulfonados (LAS) en ausencia de
polifosfatos a altas durezas de agua, como
se muestra en la figura 2(a). Los MES
poseen mayor detergencia en agua dura
fra y caliente que los lineales LAS -usados
en preparaciones en polvo para lavar-, los
alquilbenceno sulfonados -usados en pre-
paraciones lquidas- y los alquilsulfatos
etoxilados (AS) -usados como tensoac-
tivos no inicos en champes- como se
observa en la figura 2(b).
La biodegradabilidad sobresaliente
del MES es bien conocida. Estudios
reportaron la biodegradabilidad
mediante el mtodo de cultivo agitado,
entre ellos el de Ghazali (1999) cuyos
resultados muestran que el MES pierde
la actividad de sustancia activa al
azul de metileno en dos das, y el
carbono orgnico disuelto desaparece
completamente en cinco das, como se
aprecia en la figura 3(a). Estos resultados
son comparables con los reportados para
-olefinas sulfonadas (Maurer et al.,
1977). Se puede decir de estos resultados
que el MES es un surfactante fcilmente
degradable tanto en la degradacin
Figura 1. Estructura del MES donde R es la cadena aliftica C12/18 (Roberts et al., 1999)
Figura 2. (a) Tolerancia al calcio de un detergente -MES/LAS, (b) efecto de la concentracin del
surfactante sobre la detergencia (Satsuki, 1998)
90
primaria como en la final, y se considera
fcilmente degradado en las plantas
de tratamiento de aguas residuales
(Satzuki, 1998; Ingegard, 2001).
Sumado a la aceptabilidad medio-
ambiental de los MES, la cual ha sido
discutida por aos (Maurer et al., 1977;
Roberts, 1992; Ghazali, 1999), stos no
muestran acumulacin ambiental con su
uso en bajas concentraciones debido a
que su carga orgnica por lavada deber
ser tomada en consideracin como se
aprecia en la figura 3(b). Cuando la
cantidad total de sustancia orgnica por
lavada es comparada con diversos sur-
factantes, los jabones son los ms altos
en consumo seguidos por los detergen-
tes basados en LAS, mientras que los
detergentes basados en MES presentan
la carga orgnica ms baja.
Dado que los MES muestran una
detergencia similar a niveles de concen-
tracin menores que LAS, los detergen-
tes basados en MES requieren menores
niveles de ingredientes activos, lo que
redundar en la economa de produc-
cin de esta clase de detergentes (Hoyt
et al., 1979). Aunque la sulfonacin de
steres fue abordada desde mediados
del siglo XX (Stirton et al., 1954), recien-
temente se ha transformado en objeto
de estudio con miras a un escalamiento
comercial; por ejemplo, en el Japn los
steres metlicos de cadena media (C12/
C14) se utilizan en las formulaciones
de detergentes en polvo (Lion Co.) y
en Estados Unidos (Stepan) los steres
metlicos derivados del aceite de coco
se emplean para detergentes lquidos y
otros productos (De Groot, 1991).
Algunos autores han presentado equi-
pos de pequea escala para la sulfonacin,
tal es el caso de Hulbert y colaboradores
(1967) y Gilbert y colaboradores (1953,
1955). Para el presente trabajo se ha imple-
mentado un equipamiento especial a esca-
la laboratorio que permita el seguimiento
de las variables, el cual se presenta en la
figura 4. El trixido de azufre fue generado
mediante combinacin del calentamiento
del leum (60%), arrastre con nitrgeno
burbujeado desde el fondo del dispositi-
vo y agitacin magntica (Ishikawa et al.,
1986). El arrastre del SO
3
se estableci en
el laboratorio como funcin del flujo de
nitrgeno y se verific midiendo la den-
sidad del leum gastado para determinar
el SO
3
libre correspondiente para esa den-
sidad y temperatura del ensayo (Kirk y
Othmer, 1981; Ullmann, 1985).
Los steres metlicos fueron fabrica-
dos a partir de estearina hidrogenada
de palma (Torres et al., 2005). Es posi-
ble encontrar en la literatura diferen-
tes estudios sobre sulfonacin de steres
metlicos para las etapas posteriores de
digestin y blanqueamiento del produc-
to sulfonado (Fabry y Giesen, 1990; De
Groot, 1991; Roberts et al., 1988, 1995, 2007,
2008; Yamada, 1996; US Patents 3,169,142;
4,080,372; 5,587,500), lo mismo sucede con
la etapa de neutralizacin (Stirton, 1962,
1965; Stein et al., 1975; De Groot, 1991; US
Patents 5,391,783; 5,391,786; 6,657,071);
sin embargo, se carece de una profundi-
zacin en la primera etapa del proceso
que ocurre en el sulfonador (contactor).
Por esto, se considera de especial inters
adelantar un estudio sobre las variables
significativas del proceso que determina
el grado de sulfonacin efectuando ensa-
yos a escala laboratorio.
Ensayos para determinar la cintica de
la sulfonacin en steres metlicos
La sulfonacin de steres metlicos se
lleva a cabo en dos etapas. En la primera
etapa el SO
3
reacciona exotrmicamente
con los steres metlicos llevando a la
formacin de productos intermedios, los
cuales se transforman completamente en
steres sulfonados luego de una segunda
etapa de digestin o maduracin. Roberts
(1988) propone una expresin de con-
versin contra tiempo para la etapa de
digestin. Sin embargo, debido a que la
primera etapa de reaccin es muy rpida
no ha sido posible desarrollar una expre-
Figura 3. (a) Biodegradacin de surfactantes por el mtodo del cultivo agitado, (b) carga orgnica
total por lavada (Satsuki, 1998)
Figura 4. Dispositivo experimental (reactor de mezcla completa) para el estudio cintico de la
sulfonacin del estearato de metilo con SO
3
burbujeado a escala laboratorio
91
sin cintica para esta primera etapa de
reaccin. De acuerdo con lo propuesto
por varios autores (Stein y Baumann,
1975; Kapur et al., 1978; Nagayama, 1975;
Roberts, 1988; Inagaki, 1990; De Groot,
1991; Satsuki, 1994), los productos que
se forman ms rpido se transforman en
otros compuestos ms estables conforme
transcurre la reaccin. Se requieren al
menos tres pasos para la adicin de una
molcula de SO
3
, los cuales tienen que ver
con la formacin de complejos o aductos.
Para efectos de la determinacin de
un valor experimental de la velocidad de
reaccin se considerar que el mecanismo
de reaccin seguir el siguiente camino
de acuerdo con el esquema planteado
en la figura 5: el SO
3
es absorbido por el
ME en la reaccin 1, producindose as
el intermediario (I); ste intermediario (I)
se encuentra en equilibrio activando el
carbono alfa para sulfonarlo, reaccin 2,
y formar el intermediario (II). La reaccin
3 es impulsada mediante la reaccin del
trixido de azufre con el intermediario
(II). Al mismo tiempo que el intermedia-
rio (II) es consumido, la reaccin 3 avanza
lentamente. Por lo general, en sulfonacio-
nes poco controladas de steres metlicos
con SO
3
la cantidad de intermediario (III)
que se obtiene vara entre 10% y 20%
(Foster, 2004); sin embargo, esta cantidad
puede ser reducida mediante una extensa
y temperada digestin como se observa
en la figura 5(b), reaccin 4 en el digestor,
en la cual se obtiene un producto con una
coloracin muy intensa para obtener as el
cido metilster sulfonado deseado.
De acuerdo con la revisin bibliogr-
fica se considerar que la sulfonacin del
metil estearato con SO
3
tiene un perfil de
reaccin similar al mostrado en la figura
6. La energa de activacin (Ea) para el
tercer paso -E
3
del diagrama- es mayor
que las dems energas de activacin, la
velocidad total entonces depende de la
velocidad a la cual las molculas reaccio-
nantes sobrepasan la tercera barrera de
energa potencial.
Debido a que el paso controlante de la
ecuacin es la tercera reaccin, se puede
considerar que los pasos anteriores se
encuentran en equilibrio, lo que hace que
la velocidad de reaccin del proceso total
sea igual a la velocidad de reaccin del
paso controlante.
El aumento de la transferencia de
materia en los procesos de absorcin en
fase lquida de un soluto gaseoso se debe
a reacciones en el seno de la fase lquida.
Tanto la concentracin de materia org-
nica a sulfonar como la concentracin de
agente sulfonante determinan la veloci-
dad de reaccin.
Para el caso especial en que la concen-
tracin de SO
3
sea suficientemente alta
-como es el caso de las reacciones de sul-
fonacin que requieren de exceso de SO
3

para que se desarrollen- si se eleva la con-
centracin de SO
3
, entonces la reaccin
en el lquido se hace de pseudo primer
orden, as:
r
SO3
= kC
SO3
C
ME
= (KC
SO3
)C
ME
= k
relativa
C
ME
(1)
donde k
relativa
es la constante especfica de
velocidad y representa el trmino expo-
nencial
Ea

RT
, que corresponde a la
fraccin de colisiones en la que las par-
tculas tienen la energa mnima Ea nece-
saria para reaccionar; esta constante debe
encontrarse experimentalmente.
El objeto de los ensayos realizados en la
presente investigacin fue obtener una
expresin matemtica de la velocidad
promedio de reaccin para la etapa de
contacto que sucede en el sulfonador
contactor entre el estearato de metilo y el
SO
3
, ya que para las etapas de digestin
y neutralizacin ya se han desarrollado
Figura 5. Mecanismo de reaccin en la sulfonacin de estearato de metilo: (a) tres pasos para el
contactor y (b) globalizada para la etapa de digestin (Torres et al., 2004)
Figura 6. Diagrama de energa potencial para
un mecanismo de tres pasos en el sulfonador
de ME con SO
3
, en el cual el tercero es el que
determina la velocidad de reaccin
92
ecuaciones cinticas. El procedimiento
consisti en medir las concentraciones
de los reactivos a pequeos intervalos de
tiempo conforme la reaccin procede y
con los datos obtenidos construir un gr-
fico, programando una serie de ensayos
a temperatura constante para hallar la
velocidad inicial (Mishra y Kapoor, 1978;
Masterton y Hurley, 2003).
Se cargaron los steres metlicos y se
llevaron a la temperatura del ensayo, para
determinar velocidades para reacciones
rpidas, usando el mtodo de flujo se
mantiene una solucin fresca de lquido
orgnico y se va adicionando gradual-
mente el otro reactante sulfonante a fin de
poder medir el cambio de concentracin,
para as utilizar temperaturas que per-
mitan que la reaccin deseada proceda a
una velocidad razonable, sin aumentar
la velocidad de reacciones secundarias
inaceptables. Se utiliz el flujo de nitr-
geno grado analtico con flujo regulado
entre 20 a 100 ml/min para obtener un
porcentaje de 4% a 5% v/v de SO
3
en la
mezcla gaseosa, ajustando una relacin
molar SO
3
/ME de 1. Se carg el estearato
mantenindolo agitado a la temperatura
del proceso y al iniciar el burbujeo del
agente sulfonante empez a registrarse el
tiempo de reaccin. Se tomaron muestras
de la mezcla reaccionante a intervalos de
tiempo definidos. El tiempo de cada ensa-
yo fue de 10 minutos. El gas de arrastre
fue nitrgeno.
En las tablas 1 a 3 se presentan los datos
obtenidos para la sulfonacin de estearato
de metilo determinados a la temperatura
de proceso. Se observa en los resultados
presentados que la velocidad de la reac-
cin disminuye a medida que decrece la
concentracin del reactante gaseoso. Para
obtener una expresin matemtica -que
describa la variacin de la velocidad en
funcin de la concentracin del reactante
y que incluya la constante especfica de
velocidad k
rel
- se midi la velocidad de
desaparicin del componente orgnico;
lo cual puede lograrse por la facilidad de
determinar el aceite libre o metilster no
sulfonado.
La constante especfica de velocidad,
k
rel
, mide la influencia de otros factores
como la temperatura sobre la reaccin y,
en cierto modo, es una medida de la ten-
dencia de la reaccin a verificarse. Gene-
Tabla 1. Datos cinticos para la sulfonacin de estearato de metilo con SO
3
a 313 K
Experimento
Tiempo
t (min)
Porcentaje de
aceite libre
1/
%
Concentracin
del aceite libre
C (Kmol/m
3
)
Velocidad calculada de C/t
2/
t C C/t
0 100 3,014
1 1 83,5 2,517 1 0,497 0,497
2 3 75,2 1,894 3 0,623 0,126
3 5 70 1,518 5 0,376 0,247
4 10 66 1,014 10 0,504 0,128
1
Porcentaje de aceite libre =
Peso de residuo
x 100
Peso de la muestra
(2) Extraccin con ter de petrleo.
2
Razn de cambio de las concentraciones
C
=
C
2
C
1
t t
2
t
1
(3).
3
a 318 K
Experimento
Tiempo
t (min)
Porcentaje de
aceite libre
%
Concentracin
del aceite libre
C (Kmol/m
3
)
t C C/t
0 100 3,014
1 1 74,5 2,22 1 0,794 0,794
2 3 71 1,57 3 0,65 0,216
3 5 68,3 1,09 5 0,48 0,096
4 10 66 0,665 10 0,43 0,043
3
a 323 K
Experimento
Tiempo
t (min)
Porcentaje de
aceite libre
%
Concentracin
del aceite libre
C (Kmol/m
3
)
t C C/t
0 100 3,014
1 1 62 1,869 1 1,145 1,145
2 3 57 1,062 3 0,807 0,269
3 5 70 0,742 5 0,320 0,064
4 10 57 0,423 10 0,319 0,032
ralmente, valores grandes de k
rel
corres-
ponden a reacciones rpidas y valores
pequeos, a lentas; por lo anterior se tom
la velocidad inicial como la representativa
de las velocidades puesto que representan
las mayores barreras para la formacin
del complejo activado. Asumiendo que
la velocidad de reaccin es de pseudo
primer orden respecto al estearato de
metilo, y reemplazando los valores de los
datos cinticos presentados en las tablas
4, 5 y 6 se calcularon k
40C
, k
45C
y

k
50C
, tiles
para determinar la energa de activacin.
Se utilizaron estas temperaturas: 40, 45
y 50C debido a que con el aumento de
la temperatura todas las reacciones se
Tabla 4. Determinacin de la constante de velocidad a 313 K
Experimento
Concentracin de ME
C (Kmol/m
3
)
Velocidad, Kmol/m
3
min
C/t
Constante de
velocidad, s
-1
K
40C
1 2,517 0,497 0,197
2 1,894 0,126 0,066
3 1,518 0,247 0,162
4 1,014 0,128 0,126
93
Con base en los resultados obtenidos
se hall por medio de un procedimiento
iterativo, una expresin equivalente para
el modelo matemtico de la sulfona-
cin de estearato de metilo en el reactor
de pelcula, que estuviera dentro del
intervalo de sensibilidad, y el resultado
encontrado para la energa de activacin
Ea/R = 14350 K, y el factor de frecuencia
A = 1,4 10
19
s
-1
.
Determinndose as la siguiente ecua-
cin de velocidad:
r = kC
ME
C
SO3
, k = 1.14 10
19
e
14350

T
m
3
/kmols (9)
La ecuacin 9 es de segundo orden
en general, aunque de primer orden con
respecto a cada uno de los dos reactantes,
porque es proporcional a la concentracin
de los reactivos ME y SO
3
.
CONCL US I ONE S
Los ensayos realizados en el laboratorio
permitieron la deduccin de una cintica
de segundo orden para el mecanismo
de reaccin propuesto; esta velocidad
de reaccin describe adecuadamente la
sulfonacin con SO
3
de steres metlicos
derivados de la estearina hidrogenada de
palma.
Se verific la cintica de segundo orden
de la reaccin global del proceso de sulfo-
nacin de steres metlicos con SO
3
as:
r = kC
SO3
C
ME
, donde la constante cintica
como funcin de la temperatura es: k =
1,1410
19
e
-14350/T
.
Experimento
Concentracin de ME
C (Kmol/m
3
)
Velocidad, Kmol/m
3
min
C/t
Constante de
velocidad, s
-1
K
45C
1 2,22 0,794 0,357
2 1,57 0,216 0,137
3 1,09 0,096 0,088
4 0,665 0,043 0,665
Experimento
Concentracin de ME
C (Kmol/m
3
)
Velocidad, Kmol/m
3
min
C/t
Constante de
velocidad, s
-1
K
50C
1 1,869 1,145 0,612
2 1,062 0,269 0,253
3 0,742 0,064 0,086
4 0,423 0,032 0,075
aceleran, incluyendo las reacciones secun-
darias indeseables.
Las constantes de velocidad relativa
encontradas a las temperaturas especifi-
cadas se presentan en las tablas 4, 5 y 6.
Conociendo la expresin de la velo-
cidad para la reaccin y su constante
especfica de velocidad a diferentes tem-
peraturas, se puede calcular la energa
de activacin mediante la ecuacin de
Arrehenius: Lnk =
Ea
.
1
+ LnA
R T
(4)
La ecuacin (4) representa una lnea
recta y = mx + b (5), cuya pendiente es
negativa. Si se hace el grfico de Lnk
frente a 1/T, se encuentra la pendiente de
las lneas que es Ea/R, y su intercepto
con el eje y simboliza LnA. La figura 7
representa un intervalo de sensibilidad
determinado entre la velocidad inicial
y un tiempo corto, el cual ser utiliza-
do en el modelamiento matemtico para
determinar los valores que mejor ajusten
los datos entre el rango especificado en
la tabla 7. El factor preexponencial A se
determina usando la intercepcin de las
funciones con la ordenada: LnA
1
= 34,941
y LnA
2
= 43,888, entonces, A
1
= 1,5 10
15
y
A
2
= 1,14 10
19
.
Considerando la reaccin global, el fac-
tor e
Ea
RT
, representa la fraccin de molcu-
las que adquiere la energa de activacin
necesaria para una reaccin exitosa. La
ecuacin de Arrhenius tambin se aplica a
Tabla 7. Intervalo de sensibilidad de valores de la pendiente y el factor de orientacin
Funcin Ea/R, K
Factor de
orientacin, A
R
2

Lnk =
11446
+ 34,941
T
(6)
11446 1,5 10
15
0,995

Lnk =
14761
+ 43,888
T
(7)
14761 1,14 10
19
0,998
Figura 7. Efecto de la temperatura sobre la
constante de velocidad en la sulfonacin de
steres metlicos
las reacciones de muchos pasos. Un meca-
nismo de un slo paso bimolecular como el
que se muestra en la figura 8 sera consis-
tente con la ecuacin de velocidad puesto
que de la estequiometra de la reaccin
global se obtendra: r = kC
ME
C
SO3
(8)
Figura 8. Esquema global de reaccin para la obtencin del cido sulfo estearato de metilo
94
La energa de activacin calculada a
partir de la constante cintica para la
reaccin global, comprueba que aunque
la reaccin de sulfonacin de los steres es
rpida, no es instantnea, probablemente
debido al mecanismo de reaccin de tres
pasos en el contactor.
Este trabajo fue apoyado por el Instituto
Colombiano para el Desarrollo de la Cien-
cia y la Tecnologa Francisco Jos de Cal-
das Colciencias bajo el contrato RC 389
2003 cdigo 11010814678, y el Programa de
Apoyo a Doctorados Nacionales a travs
del Convenio 067/2002 con la Universidad
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La Revista Corpoica Ciencia y Tecnologa
Agropecuaria es una publicacin peridica
de carcter cientfico al servicio del sector
agropecuario colombiano y del Sistema
Nacional de Ciencia y Tecnologa. Es
publicada semestralmente por la Corpo-
racin Colombiana de Investigacin Agro-
pecuaria Corpoica y tiene circulacin
nacional e internacional. Est dirigida a
investigadores, profesionales, profesores
y estudiantes de las ciencias agrcolas y
pecuarias, extensionistas y a quienes tra-
bajan para beneficio de la productividad
del campo. La revista tiene por objeto
divulgar artculos inditos derivados de
la investigacin y experimentacin en las
diferentes reas de las ciencias agrcolas,
pecuarias y afines. Publica artculos cien-
tficos (investigaciones originales), artcu-
los de revisin que aporten soluciones y
nuevas perspectivas al agro colombiano,
y ensayos (artculos de reflexin) que esti-
mulen el debate acerca de aspectos cien-
tficos relevantes, desarrollados con una
ptica crtica, proactiva y prospectiva. Lo
anterior enmarcado en altos estndares
de rigor cientfico y calidad editorial. Las
opiniones y afirmaciones publicadas en la
Revista Corpoica reflejan exclusivamente
los puntos de vista de sus autores y no
comprometen necesariamente las polti-
cas de la Corporacin.
P OL T I CA E DI T ORI AL
Todos los artculos enviados son revisa-
dos y analizados por tres evaluadores
(peer review): uno interno y dos externos
a la Corporacin, de alto nivel acadmico
seleccionados por el Comit Editorial, la
editora y el director de la revista. Si los
artculos son aceptados para publicacin,
los autores debern corregirlos segn las
observaciones de los pares de evaluacin,
en el perodo de tiempo otorgado para
ello; el material no se publica si dos eva-
luadores consideran que no tiene el nivel y
la calidad requeridos. La presentacin de
los artculos deber ajustarse a las normas
establecidas por el Comit Editorial en la
seccin Instrucciones a los autores (ver
al final de la revista o bajarlas de: http://
www.corpoica.org.co/SitioWeb/Revistas/
Revistas.asp). Los materiales de texto e
ilustracin se deben enviar impresos y en
medio magntico al director de la revista.
Aquellos artculos que no se ajusten a
Revista Corpoica
Ciencia y Tecnologa Agropecuaria
Objetivos y alcance
Poltica editorial
Instrucciones a los autores
estas pautas sern devueltos antes de ser
considerados para evaluacin.
Los artculos puestos a consideracin
del Comit Editorial de la Revista Corpoica
Ciencia y Tecnologa Agropecuaria deben
ser inditos; en consecuencia, los autores
se abstendrn de presentar aquellos escri-
tos que hayan sido publicados en otras
revistas o publicaciones tcnico-cientficas
en cualquier idioma (excepto si forma
parte de una tesis de grado o un abstract de
un congreso). El Comit Editorial se reser-
va el derecho de rechazar o aceptar los
materiales enviados para su publicacin.
La presentacin de artculos a la revis-
ta implica: 1) que su publicacin ha sido
aprobada por todos los coautores (si los
hay) y por las autoridades responsables
de la institucin donde se llev a cabo la
investigacin; 2) que los autores transfie-
ren los derechos de publicacin a Corpoi-
ca y su revista cientfica en sus versiones
impresa y en lnea.
La Revista Corpoica Ciencia y Tecnolo-
ga Agropecuaria acepta artculos origina-
les de los siguientes tipos:
Artculo cientfico: en un artculo cien-
tfico original se busca comunicar los
resultados de investigaciones, ideas
y debates de manera clara, concisa
y fidedigna. Consta de cuatro partes
esenciales: introduccin, metodologa
(materiales y mtodos), resultados y
discusin, y conclusiones.
Ensayo cientfico: emana de las reflexio-
nes y meditaciones originales del autor,
y por tanto presenta su visin y juicio
sobre un tema cientfico, en su inters
de explorar ms a fondo la realidad.
Artculo de revisin: presenta un pano-
rama amplio de un campo especfico
de la ciencia desde una perspectiva
analtica, interpretativa y crtica del
autor y recurriendo a fuentes origina-
les. Se caracteriza por presentar un cui-
dadoso soporte bibliogrfico no menor
de 50 referencias.
I NS T RUCCI ONE S A L OS
AUT ORE S
El documento y sus ilustraciones
Los idiomas oficiales de la revista son
espaol, ingls y portugus. En general,
97 Instrucciones a los autores
la redaccin de los textos debe cumplir las
normas gramaticales del idioma en que
se escribe. Para esta revista se presentan,
ms adelante, algunas normas generales
de la gramtica del espaol bajo el ttulo
Normas de estilo.
El artculo debe presentarse en el pro-
cesador de palabra Word; no exceder de
25 pginas tamao carta, numeradas con-
secutivamente, con mrgenes de 2,5 cm
por cada lado, escritas en espacio interli-
neal de 1,5 cm, en letra o fuente Arial con
tamao de 12 puntos en redondas. Las
lneas de texto irn numeradas. Las tablas
y las figuras (grficos, dibujos, esquemas,
diagramas de flujo, diagramas de frecuen-
cia -barras y tortas-) llevan numeracin
consecutiva (Tabla 1, etc., Figura 1, etc.)
y deben ser en blanco y negro -excepcio-
nalmente se incluir color en caso de que
sea estrictamente necesario. Las tablas,
adems, deben suministrarse en su origi-
nal de Excel. Figuras como fotografas y
mapas, ya sean originales o escaneadas,
deben imprimirse en hojas independien-
tes, adems del formato digital de com-
presin JPG (o JPEG), preferiblemente
con una resolucin de 600 x 600 dpi (mni-
mo 300 dpi); se prefiere que las fotografas
sean enviadas como diapositivas.
Remisin de artculos
La remisin de los artculos debe incluir:
el documento impreso y en medio mag-
ntico (CD-R), el formato de presentacin
del artculo, la informacin de los auto-
res y la declaracin de indito (bajarla
de http://www.corpoica.org.co/SitioWeb/
Revistas/Revistas.asp). Dirigir a:
Dr. Jairo Osorio
Subdirector de Investigacin
CORPOICA
Centro de Investigacin Tibaitat
Km 14 va Mosquera
O al: Apartado areo 240142, Las Palmas
Bogot, Colombia
Telfono: ++[571] 422 73 00 ext: 1230, 1252,
1096
Fax: ++[571] 422 73 00 ext: 1069, 1248
Ttulo y autores
El ttulo del artculo debe ser en redon-
das, negrilla, de 16 palabras mximo sin
subttulo, y sin abreviaturas; si inclu-
ye nombres cientficos deben seguir
la norma para stos. Debe traducirse
al ingls. Debajo de ste se escribe
nombre(s) y apellido(s) de los autores,
sin ttulos acadmicos ni cargos labo-
rales, en una lnea horizontal, en orden
de contribucin en la investigacin y/o
preparacin del artculo, as: en los pri-
meros lugares quienes hayan redactado
el artculo, seguidos opcionalmente de
quienes hayan contribuido de manera
importante a mejorar su calidad median-
te una lectura crtica y aportes de texto,
bibliografa o ilustracin; finalmente
quienes se desempeen como lderes
del proyecto y estn a cargo del equipo
de investigacin. En la parte inferior de
la primera pgina se escriben el grado
acadmico, cargo laboral y direccin
de correo electrnico de los autores, el
nombre de la entidad a la cual prestan
sus servicios o del patrocinador para la
realizacin del trabajo y la ciudad.
Resumen y palabras clave
El resumen debe describir brevemente el
problema, su justificacin, los mtodos
utilizados y los resultados ms relevantes;
no debe exceder de 250 palabras escritas
en un nico prrafo.
Las palabras clave son trminos para
indexacin; deben identificar el contenido
del artculo y preferiblemente ser diferen-
tes de las que constan en el ttulo; deben
ser cinco aproximadamente. Para selec-
cionar sus palabras clave, se sugiere con-
sultar y usar los descriptores del tesauro
agrcola multilinge AGROVOC, creado
por la FAO; el cual abarca terminologa de
la agricultura, silvicultura, pesca, medio
ambiente y temas afines (http://www.fao.
org/aims/ag_intro.htm).
El resumen y las palabras clave se escri-
ben en el idioma del artculo y en ingls
(abstract y keywords); si el idioma original
es el portugus se traducirn adems
al espaol y deben cumplir los mismos
parmetros -250 y 5 palabras, respectiva-
mente- (use en el men Herramientas la
opcin contar palabras).
Introduccin
Debe contener el problema, su definicin
y la revisin de los trabajos previos rela-
cionados con l; adems, los objetivos y la
justificacin de la investigacin.
Materiales y mtodos
En este apartado se deben describir de
forma clara, concisa y secuencial, los
materiales (vegetales, animales, imple-
mentos agrcolas o de laboratorio) utiliza-
dos en desarrollo del trabajo, adems de
los procedimientos o protocolos seguidos
y el diseo escogido para el tratamiento
estadstico de los datos.
Resultados y discusin
Se deben discutir los resultados sobresa-
lientes, contrastndolos con la literatura
ms actual sobre el tema. Los resulta-
dos deben presentarse de manera lgica,
objetiva y secuencial mediante textos,
tablas y figuras; estos dos ltimos apo-
yos deben citarse siempre en el texto,
y su lectura e interpretacin deben ser
fciles y autnomas. Las tablas se deben
elaborar con pocas columnas y renglo-
nes. Las grficas sern bidimensionales y
a una sola tinta con porcentajes de negro
para las variaciones de las columnas; las
lneas de las curvas deben ser de color
negro, punteadas o continuas usando las
siguientes convenciones:
Conclusiones
En este apartado se relacionan los hallaz-
gos ms concluyentes de la investiga-
cin, es decir, aquellos que constituyan
un aporte significativo para el avance
del campo temtico explorado, adems
de un direccionamiento sobre futuras
investigaciones.
Agradecimientos
Si se considera necesario, se agradecen
contribuciones importantes en cuanto a la
concepcin, financiacin o realizacin de
la investigacin: financiadores, especialis-
tas, firmas comerciales, entidades oficiales
o privadas, asociaciones de profesionales
y operarios de campo y laboratorio.
Referencias bibliogrficas
Para la presentacin de las referencias
bibliogrficas que sustentan las afirmacio-
nes dentro del texto se utiliza el sistema
autor(es), ao. Las referencias bibliogr-
ficas completas van al final del artculo y
98 Instrucciones a los autores
se rigen por las normas bibliogrficas del
Council of Science Editors (CSE), las ms
usadas internacionalmente en biologa,
qumica y campos afines. Se lista en orden
alfabtico de autores, en letras redondas.
La norma general es: apellido, ini-
ciales del nombre (sin puntos y cada
autor se separa con comas). Ao. Ttulo.
Edicin, Ciudad, Editorial (slo el nom-
bre propio de sta), pginas consulta-
das o totales segn el caso. Cuando se
citan varias publicaciones del mismo(s)
autor(es) se listan en orden cronolgico
de la ms antigua a la ms reciente. Si
la publicacin citada tiene ms de tres
autores, se menciona el apellido del pri-
mer autor acompaado de la expresin
latina et al. (y otros), en cursivas (Gar-
ca et al., 2003).
Libros: autor(es). Ao. Ttulo del libro.
Edicin, Ciudad, Editorial, pginas.
Ejemplo: Gilman AG, Rall TW, Nies
AS, Taylor P. 1990. The pharmacologi-
cal basis of therapeutics. 8th ed. New
York, Pergamon, 1811 p.
Captulos de libros: autor(es), ao.
Ttulo del captulo. En: apellidos y
nombres de los compiladores o edi-
tores (eds.), Ttulo del libro, edicin,
Ciudad, Editorial, pginas del cap-
tulo (pp.). Ejemplo: Carpio L. 1996.
Materiales didcticos. En: Garca A.
Educacin sistemtica. Madrid, Nar-
cea, p. 229-250.
Revistas: autor(es), ao. Ttulo del art-
culo, Nombre de la revista, volumen
(nmero): pginas consultadas (unidas
por guin). Ejemplo: Omer A, Pascual
U, Russell N. 2007. Biodiversity Con-
servation and Productivity in Intensive
Agricultural Systems. Journal of Agri-
cultural Economics 58(2):308-329.
Citas de internet: autor(es), ao. Ttulo
del artculo. En: nombre de la publi-
cacin electrnica (si aplica), sitio de
internet, portal o pgina y su URL,
fecha de consulta. Ejemplo: Mahmoud,
Y. 1996. Siembra de olivos en el desier-
to palestino. En: Agricultura Tropical,
http://agrotropical.edunet.es; consulta:
noviembre 2005.
NORMAS DE E S T I L O
Se debe redactar en voz activa (Se
evaluaron dos metodologa, y no: dos
metodologas fueron evaluadas); en
impersonal, es decir, tercera persona
del singular (Se encontr, y no: encon-
tr o encontramos).
En cuanto a los tiempos verbales, el
uso comn es el pasado para la intro-
duccin, procedimientos y resultados;
el presente para la discusin.
Se debe evitar el gerundio, si no se
domina al mximo su uso. Recurra a
esta forma verbal slo para indicar dos
acciones simultneas; en los dems
casos, redacte diferente la frase. (Rem-
plazar: un protocolo fue estandariza-
do, minimizando el efecto negativo...,
con: se estandariz un protocolo, lo
cual minimiz el efecto negativo...)
Los nombres cientficos de vegetales o
animales se escriben igual en todos los
idiomas: la familia se escribe en redon-
das con mayscula inicial; el gnero en
cursiva y mayscula inicial, y la especie
en cursiva y minsculas, as: Familia
(Solanaceae), Genero especie (Solanum
tuberosum, la primera vez, las siguientes
veces puede ser S. tuberosum).
El texto se escribe en redondas (en
Word se llama: regular). Las cursiva o
itlicas se usan para los nombres cient-
ficos y palabras en idioma extranjero.
El significado de las siglas y abreviatu-
ras debe citarse por extenso cuando se
mencionan por primera vez en el texto.
Las siglas no tienen forma plural; ste
se indica en las palabras que la acom-
paan: las ONG, dos elisa.
Los ttulos y los nombres de figuras y
tablas no llevan punto final.
Los smbolos no llevan punto, plural ni
mayscula: 1 kg, 25 kg, 1 m, 30 m, etc.
Entre el valor numrico y el smbolo se
deja un espacio: 35 g (no 35g), p > 12
(no p>12); excepto para los signos: %,
+, - (estos dos ltimos cuando indican
positivo y negativo). Ejemplos: 99%,
+45, -37.
En una serie de medidas, el smbolo
va al final: hileras a 3, 6 y 9 m (excepto
para el signo de porcentaje, que se
escribe siempre 14%, 16% y 18%).
La barra oblicua (/) es un signo lings-
tico que en alguno de sus usos significa
por: tres flores/planta, 4 tabletas/da,
2 L/matera, 10 frutos/rama. Uno de
sus usos no lingsticos es expresar los
cocientes de magnitudes y unidades de
medida: 80 km/h, 10 m
3
/s, 10C/h.
Uno de los usos no lingsticos del
punto () es indicar la multiplicacin de
dos cantidades, caso en que se coloca
separado de stas y a media altura: 6
3 = 18; 2 (x + y) = 30.
La coma (,) se usa para separar deci-
males.
Las unidades que se basan en nombres
se usan en minsculas: un siemens
(con algunas excepciones como cuan-
do el smbolo se deriva de un nombre
propio: C, grados Celsius).
Las instrucciones a los autores pueden
consultarse en: http://www.corpoica.org.
co/SitioWeb/Revistas/Revistas.asp.
Unidades de medida
En la Revista Corpoica se usa el sistema de unidades del Sistema Internacional de Unidades (SI), tambin llamado Sistema Interna-
cional de Medidas, usado internacionalmente y basado en el sistema mtrico decimal. Sin embargo, debido a las particularidades
de las ciencias agrcolas y pecuarias, debern usarse algunas unidades especficas que no pertenecen al SI (por ejemplo, la unidad
de superficie hectrea) (ver listado de abreviaturas y smbolos). A continuacin se presentan algunas abreviaturas, siglas y unida-
des de medida.
S I GL AS , AB RE VI AT URAS Y S MB OL OS
Trmino o locucin Abreviatura o smbolo
Asterisco *
Atmsfera controlada AC
Atmsfera modificada AM
Ji cuadrado
2
Coeficiente de correlacin lineal r
Coeficiente de determinacin R
2
, r
2

Coeficiente de variacin Cv
Conductancia elctrica G
Conductividad elctrica (su unidad es el siemens) CE ( sigma)
Cromatografa en capa fina CCF
Cromatografa gaslquido CGL
Cromatografa lquida de alta eficiencia CLAE o HPLC
Cruzado con x (minsculas)
Cultivar(es) cv., cvs.
Dao por el fro (chilling injury) CI
Desviacin estndar de una muestra (standard deviation) SD
Diferencia honestamente significativa DHS
Diferencia mnima significativa DMS
ADN polimrfico amplificado al azar (Randomly amplified polymorphic DNA) RAPD
Error estndar (standard error) se
Especie (singular y plural) sp., spp. (redondas)
Especies cruzadas (hbrido interespecfico)
Flujo fotosinttico de fotones FFF
Fotosntesis neta Fn
Generaciones filiales F
1
, F
2
Generaciones parentales P
1
, P
2
Grados de libertad gl
Gravedad (en centrifugacin) G (cursiva)
Humedad relativa HR
ndice de rea foliar IAF
Infrarrojo IR
Ingrediente activo i.a.
Logaritmo comn (base 10) log
Logaritmo natural ln
Magnificacin, poder de
Metros sobre el nivel del mar msnm
Microscopia electrnica de barrido MEB
100 Unidades de medida
Trmino o locucin Abreviatura o smbolo
Microscopia electrnica de transmisin MET
Molaridad (o concentracin molar) M
No significativo(a) ns
Nmero no.
Nmero de observaciones en una muestra n
Nmero de observaciones en una poblacin N
Pares de bases pb
Polimorfismos de longitud de fragmentos por restriccin (Restriction Fragment Length Polymorphism) PLFR (RFLP)
Por (dimensin, interaccin)
Potencial osmtico
S
Probabilidad P
Promedio de una muestra X, Y
Prueba enzimtica inmunoabsorbente elisa (minsculas)
Prueba t student t
Radiacin fotosintticamente activa RFA
Repeticiones de secuencia simple RSS
Subespecie ssp. (redondas)
Ultravioleta UV
Unidades formadoras de colonias ufc
Varianza V
Volumen/volumen total (razn de una mezcla) v/v
UNI DADE S DE L S I S TE MA I NTE RNACI ONAL DE ME DI DAS ( B S I CAS Y DE RI VADAS )
Unidad Abreviatura/smbolo
Becquerelio Bq
Brix Brix
Centmetro cm
Centmetro cuadrado cm
2

Centmetro cbico cm
3

Curie Ci
Dalton Da
Da d
Decisiemens dS
Decmetro dm
Desintegracin por minuto dpm
Eigen voltio eV
Einstein E
Grado (angular)
Grado celsius C
Gramos por centmetro cbico g/cm
3
Hectrea ha
Hertz Hz
Joule J
Kelvin K
Unidad Abreviatura/smbolo
Kilodalton kDa
Kilogramo kg
Kilolux klx
Kilmetro km
Kilovoltio Kv
Lux lx
Megagramo Mg
Metro m
Metro cuadrado m
2
Metro cbico m
3

Tonelada mtrica t
Microequivalente eq
Microgramo g
Microlitro L
Micrometro (antes, micrn) m
Micromol mol (m)
Miliequivalente meq
Miligramo mg
Mililitro mL
Milmetro mm
Milimol mmol (mM)
Milivoltio mV
Mol mol (M)
Nanolitro nL
Manmetro nm
Irradiancia espectral nm
-1
Nanosegundo ns
Newton o neutonio N
Solucin normal n
Pascal Pa
Rotaciones por minuto rpm
Segundo (tiempo) s
Tonelada (mtrica) t
Voltio V
Vatio W
UNI DADE S NO P E RTE NE CI E NTE S AL S I DE US O ACE P TADO CON S TE
Magnitud Nombre de la unidad Smbolo de la unidad
Tiempo
minuto min
hora h
da d
ngulo plano
grado
minuto ' 1'
segundo '' 1''
Magnitud Nombre de la unidad Smbolo de la unidad
rea hectrea ha
Volumen litro L, l
Masa tonelada t
Presin bar bar (1 bar = 0,1 MPa = 100 kPa = 10
5
Pa)
Presin milmetro de mercurio mmHg
Longitud ngstrm
AL GUNOS P RE F I J OS COMUNE S DE L S I S T E MA I NT E RNACI ONAL DE ME DI DAS
10
2
hecto h
10
3
kilo k
10
6
mega M
10
1
deci d
10
2
centi c
10
3
mili m
10
6
micro
10
9
nano n
10
12
pico p

FORMATO DE SUSCRIPCIN
Revista Corpoica - Ciencia y Tecnologa Agropecuarias
Corporacin Colombiana de Investigacin Agropecuaria
A.A. 240142 Las Palmas, Bogot, Colombia
C.I. Tibaitat, km 14 va a Mosquera
Tels. (571) 422 73 00 ext. 1252
NIT 800194600-3
NOMBRE / Name _____________________________________________________________________________________
DOCUMENTO DE IDENTIDAD / ID document _____________________________________________________________
DIRECCIN DE ENVO / Mailing Address _________________________________________________________________
CIUDAD y PAS / City and Country _________________________________ DEPARTAMENTO / Province ____________
CDIGO POSTAL / Zip Code ______________________________________ TELFONO / Phone __________________
E-mail /_________________________________________________________ FAX / Fax number ___________________
APARTADO AREO / Mail Box ______________________________________
PROFESIN / Profession __________________________________________
INSTITUCIN / Employer __________________________________________
TARIFAS /Cost 2008/2009:
Particulares - Colombia $40.000,oo (2 nmeros por ao / 2 issues per year)
Entidades - Bono de apoyo $60.000,oo (2 nmeros por ao / 2 issues per year)
Venta directa $20.000,oo (nmero / issue)
Exterior / Abroad USD $30 (mailing values not included)
Estudiantes con carn 20% de descuento
FORMA DE PAGO / Payment:
Consignacin nacional: Efectivo o cheque a nombre de la Corporacin Colombiana de Investigacin
Agropecuaria
Banco BBVA Cuenta 309-00066-9
Envar una copia de este formato y del recibo de consignacin
al fax : (571) 422 73 00 - extensiones 1095 y 1171
Efectivo Pagadura de los Centros de Investigacin o eventos de Corpoica.
ltimo ejemplar recibido / Last issue received:
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