DIVISIN DE CIENCIAS BIOLGICAS Y DE LA SALUD

BIOLOGA EXPERIMENTAL
PROYECTO FINAL DE INVESTIGACIN
Anlisis fitoqumico y ac tivid ad insecticida d e C ercidium praecox
Alumna:
Garca Solrzano Mara del Consuelo
Asesoras:
M. en C. Elisa Vega Avila
Biol. Maras del Carmen Herrera Fuentes
24 de marzo del 2003.
A MI PADRE:
Eduardo Garca Ortiz, que me dio el apoyo moral y econmico durante toda mi
carrera, que me anim cuando desfalleca y me impulso ha seguir adelante
hasta obtener el xito anhelado.
A MI MADRE:
Mara Angelina Solrzano Alvarado, que siempre me impulso ha seguir
adelante para obtener el xito anhelado y aunque ya no se encuentra a mi lado,
se que en donde se encuentra siempre voy a seguir contando con su apoyo y
su bendicin.
A MIS ASESORAS:
Elisa Vega vila y Mara del Carmen Herrera Fuentes, que con sus amplios
conocimientos y sus sabias enseanzas, hicieron posible la realizacin de est
proyecto, corrigindome incansablemente mis errores y alentndome en mis
aciertos llevndome al feliz trmino de este proyecto .
A MIS PROFESORES:
Que durante toda mi carrera la nutrieron no solo de conocimientos tericos,
sino con el ejemplo para lograr mis ideales.
A MIS AMIGOS Y FAMILIARES Y A TODAS LAS PERSONAS QUE HAN
DEPOSITADO TODA SU CONFIANZA EN MI, Y ME ALENTARON EN LOS
MOMENTOS DIFCILES.
PROYECTO FINAL DE INVESTIGACIN
Anlisis fitoqumico y actividad insecticida de Cercidium praecox.
Asesores: M. en C. Elisa Vega vila
M. en B. Maria del Carmen Herrera Fuentes
MARCO TEORICO:
El reino vegetal en sus distintas formas ha sido factor decisivo en los diferentes
estudios que se han llevado a cabo de los fenmenos de la naturaleza
(Oyama, 1989) .
La identificacin de algunas plantas tiles y otras dainas muestra semejanzas
y diferencias entre vegetales y otras formas de vida, dando origen a la relacin
Biologa Botnica, que con sus mtodos de investigacin y sistematizacin
hacen posible junto con la Qumica, crear la FITOQUIMICA, disciplina que
proporciona de manera integral el conocimiento de algunos de los distintos
productos qumicos naturales de las plantas que pueden ser extrados,
separados, purificados y determinados fisicoqumicamente (Domnguez, 1989).
La Fitoqumica estudia la multitud de compuestos qumicos que se encuentran
en la complejidad de las clulas vegetales, pero no solo como entidades
qumicas, sino tambin como productos de una serie de mecanismos que
intervienen en su biognesis, como sustancias activas que desempean una
funcin en los procesos bioqumicos de las clulas o bien como elementos que
pueden provocar alteraciones fisiolgicas en humanos y en animales
(Domnguez, 1989).
1
INTRODUCCIN
Esta disciplina ha impulsado el avance sustancial en el conocimiento de las
plantas medicinales en nuestro pas, con el surgimiento de una slida y
prometedora tecnologa basada en la qumica de sntesis, el inters de la
industria farmacutica es cada vez ms elevado (Kumate, 1993 ) .
En general, las plantas suelen tener una cantidad considerable de compuestos
que siempre han originado confusin acerca de la bioqumica y fisiologa de las
plantas, debido a su imposibilidad de huir frente a agresiones. A estos
compuestos se les ha denominado compuestos secundarios(Oyama, 1989).
El trmino compuesto secundario engloba sustancias qumicamente muy
diversas y se establece como contraposicin a los productos del metabolismo
primario, que aparecen en el citoplasma de todas las clulas vegetales y cuyas
diferencias entre plantas son nicamente de ndole cuantitativo.
En trminos generales, se ha propuesto denominar a los compuestos
secundarios sustancias ecolgicamente eficaces, frente a los compuestos
primarios que seran sustancias fisiolgicamente eficaces (Augner, 1994).
Ahora bien, debido al elevado costo energtico que implica su sntesis, las
plantas encauzan su metabolismo hacia un tipo u otro de compuesto
secundario dependiendo de los recursos disponibles (Bryant et al; 1992), en
general, frente a condiciones severas, como las que se dan en climas ridos,
las plantas tienden a aumentar sus defensas, sobretodo de tipo cualitativo
(alcaloides, glucsidos cianogneticos, etc ), ya que en estos casos, les resulta
mucho ms difcil regenerar los tejidos daados por los herbvoros (Barry et al;
1987).Casi siempre en una misma planta existen varios componentes
biolgicamente activos, en donde el principal determina las aplicaciones que
tendr la especie en cuestin. Sin embargo, el grado en el que los
componentes secundarios influyen sobre la accin biolgica queda puesto de
manifiesto al aislar el principio activo principal. Los principios activos no se
distribuyen de una manera uniforme por toda la planta; si no que se concentran
preferentemente en las flores y las hojas (Pawlow, 1985).
2
Sin duda alguna, el tipo de compuestos secundarios ms abundantes desde el
punto de vista de variedad, es el constituido por los alcaloides, que son un
grupo muy heterogneo de bases nitrogenadas (carcter bsico), con accin
fisiolgica sobre el organismo de los animales (especficamente sobre el
sistema nervioso central), y merecen mencin especial la cafena, morfina y
cido lisrgico (Maldoni, 1991).
Los alcaloides se encuentran en las plantas en forma de sales, son solubles en
agua y poco solubles en disolventes orgnicos. Con estas propiedades se
fundan los procedimientos que se siguen para su extraccin, as como para su
purificacin (Muoz, 1996).
Al margen de los metabolitos secundarios nitrogenados, existen tambin otros
compuestos que carecen de este elemento y que pueden ser utilizados por las
plantas con una clara funcin defensiva. En este sentido los terpenoides
incluyen a un elevado nmero de compuestos entre los que cabe destacar a los
aceites esenciales, monoterpenos, etc; sin embargo, son igual de importantes
que los alcaloides. Otros compuestos secundarios importantes son :
Taninos: Sustancias no definidas qumicamente, pero que se agrupan debido
a que tienen algunas propiedades comunes. Comprenden una pequea parte
del tan amplio como diverso grupo de los compuestos fenlicos vegetales, que
abarca los cidos fenlicos de 7 a 9 tomos de carbono, tales como los cidos
glico y p- cumarico, los flavanos de 15 tomos de carbono, y las ligninas. A
pesar de su indefinicin qumica, generalmente los taninos se dividen en
hidrolizables y condensados, aunque ambos tipos pueden tener procesos
hidrolticos en medio acuoso (Austin, 1989 ). Los taninos hidrolizables estn
constituidos por un ncleo compuesto por un glcido, cuyos grupos hidroxilo se
encuentran esterificados con cidos carboxlicos fenlicos.
3
Por su lado los llamados taninos condensados son polimeros no ramificados de
hidroxiflavonoles (FLAVAN 3,4- diol), tanto unos como otros son insolubles en
solventes no polares (ter, cloroformo, hexano, benceno) y solubles en agua y
alcohol (Austin, 1989).
La gran cantidad de grupos hidroxilo fenlicos que poseen los taninos les hace
ser muy reactivos, proporcionndoles numerosos puntos de anclaje
susceptibles de formar puentes de hidrgeno, siendo ste el motivo por el que
forman asociaciones reversibles con otras molculas, demostrando mayor
afinidad por las protenas debido a la fuerte tendencia a formar puentes de
hidrgeno entre los grupos hidroxilo de los taninos y el oxgeno del grupo
carbonilo de los pptidos. Tanto los taninos hidrolizables como los
condensados se encuentran principalmente en hojas de rboles, arbustos y
leguminosas herbceas.
Cumarinas: Son compuestos heterocclicos derivados del cido cinmico con
un ncleo formado por un anillo bencnico condensado con un anillo tirnico,
aunque en muchas se fusiona un tercer anillo heterocclico (Berembaum,
1991). Las cumarinas se encuentran en leguminosas y rutceas, poseen
propiedades fotosensibilizadoras, esto es, su accin txica se refuerza en
presencia de la luz ultravioleta, algunas son causantes de fotodermatitis cuya
accin retardada podra no ser suficiente para evitar la ingestin de las plantas
por los herbvoros.
Saponinas: Las saponinas se han empleado como detergentes naturales ya
que son sustancias que rebajan la tensin superficial y producen espuma al
contacto con el agua. Cuentan adems con la capacidad de unirse al colesterol
impidiendo su absorcin.
4
La mayora de las plantas que contienen saponinas no tienen un solo
compuesto sino una mezcla compleja, con diferencias en la aglicona o en la
longitud y composicin de la cadena glucdica, lo que influye en sus
propiedades. Cabe mencionar que puede alterar la permeabilidad de las
membranas.
Las saponinas son muy frecuentes en las plantas medicinales y debido a su
capacidad espumante resultan unos excelentes emulsivos, producen la
hemlisis de los glbulos rojos (eritrocitos); es decir, liberan hemoglobina lo
que explica el efecto txico de algunas de ellas. Algunas saponinas han
mostrado diversas actividades biolgicas (antimicrobiana, citotxica,antitumoral
e insecticida).
Aunque los aminocidos son conocidos especialmente por su papel estructural
como los pilares bsicos de las protenas animales y vegetales, ciertas plantas
poseen aminocidos no proteicos que pueden emplear con fines defensivos.
As por ejemplo, las leguminosas disponen de ellos, muchos de los cuales
pueden ser utilizados como mecanismo de defensa contra insectos y otros
depredadores (Argilis, et al. 1990).
Una caracterstica importante en la estrategia de defensa de las plantas es la
distribucin variable de los compuestos secundarios en los diferentes tejidos
vegetales, dependiendo de su vala para la planta, as como su redistribucin
segn avanza el desarrollo fenolgico (Cheeke, 1995).
Los metabolitos secundarios aparentemente no tienen un propsito fijo en el
metabolismo de las plantas; sin embargo, algunos de estos compuestos son
empleados por la planta con distintas funciones. As, intervienen en relaciones
de competencia con otras plantas actuando como agentes alelopaticos; como
molculas portadoras de informacin relacionada con posibles funciones
defensivas; adems actan como sustancias naturales que son repelentes o
inhibidores del crecimiento, desarrollo y alimentacin de los insectos.
5
En este sentido, se estudia como una alternativa el uso de extractos vegetales
que contienen una gran diversidad de metabolitos secundarios que pueden
actuar como insecticidas, debido a que los insectos se han ido adaptando y
resisten cada vez ms a los efectos de los insecticidas qumicos a
concentraciones cada vez mayores. Pero recientemente los insecticidas han
sido objeto de innumerables criticas, principalmente por sus efectos adversos
(Ramrez, 1984) como:
1. El envenenamiento directo de los humanos y el peligro que representan
los residuos de productos qumicos que quedan en los alimentos.
2. El riesgo de contaminacin general del medio ambiente.
3. El desarrollo de resistencia a los plaguicidas en insectos.
Estos hechos han obligado a reflexionar sobre las ventajas de utilizar otros
productos con propiedades insecticidas que no causen contaminacin, que
sean econmicos y fciles de aplicar, una alternativa lo constituye el uso de
plantas como agentes insecticidas.
As como las plantas proporcionan compuestos que son una alternativa para la
preparacin de nuevos insecticidas, en la naturaleza existen numerosos
ejemplos donde se muestran herbvoros adaptados a alimentarse de plantas
que presentan compuestos secundarios, debido a que son capaces de
metabolizar y almacenar los compuestos que pueden ser sumamente txicos y
ocuparlos para su proteccin en contra de sus depredadores (Oyama, 1989)
Normalmente estas substancias no se encuentran en las plantas en estado
puro, sino en forma de complejos moleculares y en cantidades muy pequeas
(Farnsworth, et al.1999).
6
A. Cercidium praecox "PALO VERDE"
1.- Caractersticas Botnicas y distribucin en Mxico
La planta en estudio pertenece a la familia Leguminosae, es una especie con
distribucin muy localizada, se encuentra en zonas ridas y semiridas en el
sur de Mxico, especficamente en el Valle de Zapotitln Tehuacn, Puebla. Es
un arbusto de 10- 12 m, pubescente. Tronco corto de 30 cm de dimetro, tiene
espinas de 0.5-1 cm de largo. Hojas bipinnadas, con pice redondeado.
Semillas 1-2, pardogrisceas de 1 cm de largo. Fruto en forma de legumbre de
3-6 cm de largo (figura 1). Sus flores de 1-6 con pedicelos de 5-10 mm de
largo; cliz estrecho y profundo hacia la base; ptalos plidos o profundamente
amarillos (Ruiz, 1989).
El rea de estudio se encuentra ubicada dentro de las coordenadas 18
0
20 de
latitud norte y 97
0
28 de longitud oeste, con una superficie de 86.74Km
2
. Est
enclavado en la sierra del mismo nombre que forma el lmite suroeste del valle
de Tehuacan en el estado de Puebla, Mxico (Vite et al; 1992)
El clima determinado para el valle de Zapotitln corresponde a un clima seco
con rgimen de lluvias de verano, con dos mximas de lluvias separados por
dos estaciones secas. Se puede decir, que la vegetacin de esta rea ocupa
un poco ms de la mitad de la extensin total del valle de Tehuacn. Es una
vegetacin que corresponde al matorral espinoso; es decir , la vegetacin es
bsicamente de leguminosas arbustivas espinosas (Zavala, 1982).
7
ANTECEDENTES
2. Etnobotnica
Existen pocos reportes sobre el uso de esta planta, en 1992 Ramrez, reporta
el uso de esta planta para el tratamiento del dolor de cabeza y del odo por los
pobladores de la zona de Tehuacan. Tambin se ha reportado su uso contra
afecciones cardiacas (Lara, 1996).
B. ESTUDIOS QUMICOS DE Cercidium praecox
Anlisis previos de Cercidium praecox muestran la presencia de polisacridos,
resinas, alto contenido en compuestos nitrogenados, glicina y una mayor
proporcin de cido galacturnico y xilosa. Las soluciones acuosas presentan
una apariencia viscosa semejante a la "goma arbiga" (Ramrez, 1996).
Algunos estudios fitoqumicos que se estn llevando a cabo en la Universidad
de Puebla demuestran que entre los metabolitos secundarios, los taninos estn
presentes en gran cantidad, por lo que se estn llevando a cabo pruebas
qumicas que demuestren el papel que juegan estos compuestos en la relacin
biolgica entre plantas y animales (Ramrez, 1996).
C. LAS PLANTAS COMO FUENTE DE INSECTICIDAS
Los insecticidas de origen vegetal estn considerados dentro de la primera
generacin de plaguicidas, ya que su uso como tal se remonta a siglos antes
de la era cristiana (Jacobson y Crosby, 1971).
De las casi 700,000 especies de plantas que hay en el mundo (la mayora en
los tropicos), solamente algunas se conocen y se ha investigado con fines de
aprovechamiento, segn investigaciones ms de 2000 especies en el mundoi
tienen propiedades plaguicidas (Munich,1988).
9
Solamente pocas de estas especies han sido aprovechadas hasta el momento
para el control de plagas y enfermedades.
El uso de extractos vegetales para el control de insectos no es nuevo. Su
aplicacin se registra desde antes de la segunda guerra mundial, la cual fue
descontinuado por el surgimiento del DDT y compuestos organoclorados, los
cuales a pesar de ser baratos son muy txicos y persistentes en el ambiente.
La utilizacin de extractos vegetales para el control de plagas tiene la ventaja
de no provocar contaminacin debido a que estas substancias se degradan
rpidamente en el medio (Fersth,1978).
Existen muchas plantas cuyos extractos poseen propiedades insecticidas; sin
embargo, desde el punto de vista comercial, slo algunas se han aprovechado
como la Ryania, Lenchocarpus, Chrisantemum y Nicotiana tabacum (Lagunes y
Rodrguez, 1990). A continuacin se describen algunas de estas.
Nicotiana tabacum: El extracto de la hoja del tabaco ha sido usado en
aspersiones para controlar insectos. La nicotina es el alcaloide principal,
destruye a los insectos al penetrar en la cutcula y las vas respiratorias,
estimulando y deprimiendo la actividad del sistema nervioso; la muerte se
presenta en poco tiempo (Vlez,1988). Desafortunadamente, los alcaloides que
presenta son muy txicos inclusive para los mamferos.
Lonchocarpus: Su principio activo es la rotenona; la cual es inocua para las
plantas, sumamente txica para muchos insectos y relativamente inofensiva
para los mamferos (Velez, 1988).
Ryania Speciosa: Los polvos obtenidos de la molienda de los tallos y races de
la planta se han utilizado para el combate de algunos insectos, y en los aos
1940-1950 fueron desplazados por compuestos organoclorados que eran ms
baratos.
10
Chrysantemus cinerariafolum: El uso del piretro como insecticida se remonta
desde el siglo XIX. Sus principios activos son las piretrinas, las cuales deben su
importancia a su alta toxicidad para artrpodos y baja toxicidad para animales
mamferos; tienen accin inmediata y sus residuos son de vida corta (Casida,
1973). Actualmente son los plaguicidas de origen vegetal ms utilizados en el
mundo, por lo cual se siembran grandes extensiones de esta planta.
Ahora bien, el efecto de un plaguicida vegetal, depende de algunos factores
como los son: la especie y variedad de la planta, poca de
recoleccin,influencia del ambiente, forma de preparacin, forma de extraccin
y aplicacin del plaguicida. Comnmente, no se conoce el modo exacto de
aplicacin de los plaguicidas vegetales, razn por la que se debe mantener una
experimentacin constante (Girn,1994).
1. plantas insecticidas en Mxico
En Mxico, el uso de plantas como insecticidas es muy antiguo. Existen dos
referencias de principios de siglo que nos informan del uso de plantas contra la
mosca y el gusano de la naranja y mango, as como contra el picudo del
algodonero (Romn, 1990). En la primera se asperjaban soluciones preparadas
con la hierba de la cucaracha Haplophyton cinicidum y en la segunda se
menciona el uso de una solucin acuosa de la raz del chichicamole para matar
mosquitos.
Actualmente los campesinos continan empleando diversas plantas para el
control de plagas. En la regin de Ixtapan de la Sal, Estado de Mxico, es
costumbre intercalar plantas secas de Artemisa luduviana entre costales de
maz para evitar el dao del gorgojo del maz (Lagunes, 1990). Existen plantas
con propiedades insecticidas poco conocidas, que representan una esperanza
futura para el combate de plagas insectiles sin el eventual problema de
contaminacin que pueden presentar algunos insecticidas orgnicos modernos.
Entre ellas encontramos a la especie Hippocratea excelsa, que en Mxico es
conocida como cancerina.
11
Por lo general, ninguna de las especies vegetales insecticidas tienen la
actividad fulminante de los insecticidas qumicos. Es por esto que la poblacin
de insectos no disminuye rpidamente con el uso de insecticidas extrados de
plantas.
Entre los efectos que causan los insecticidas naturales se encuentran los
siguientes:
a) Repelencia en larvas y adultos
b) Suspensin de la alimentacin
c) Bloqueo de la muda en larvas
d) Bloqueo del desarrollo
e) Causa esterilidad en las hembras
f) Suspensin de la ovoposicin.
Como se observa, la gran mayora de los efectos de los insecticidas vegetales
son fisiolgicos, por lo que el insecto tiene que adquirirlos a travs de su
alimentacin (Solrzano, 1993).
Los plaguicidas extrados de plantas no representan el remedio universal para
proteger las plantas contra insectos. Existen tambin plantas que producen
plaguicidas que pueden ser txicos. Para que una proteccin vegetal sea
realmente ecolgica, esta se logra no solo con la sustitucin de plaguicidas
sintticos por plaguicidas naturales, se necesitan buenos conocimientos acerca
de las relaciones biolgicas y ecolgicas entre planta y plaga y plaga -
ambiente. Estos conocimientos deben ser obtenidos y divulgados a travs de
instituciones, de manera que estn disponibles para el uso de la poblacin
(Munich, 1988).
Por lo general, para probar insecticidas de tipo vegetal, se realizan pruebas
antialimentarias; las cuales, entre sus principales ventajas esta que no
perjudican la fauna benfica, tienen poca toxicidad y pueden ser aplicados con
equipos convencionales.
12
D. PRODUCTOS NATURALES CON ACTIVIDAD ANTIALIMENTARIA
Hoy en da la proteccin de cultivos de plantas y la conservacin de granos y
semillas almacenados, contra las plagas de insectos es un problema relevante
para el desarrollo de la agricultura. Los primeros productos naturales utilizados
para detener dichas plagas fueron arena, ceniza y sal, los cuales eran
espolvoreados en las plantas. El agente ideal que proteja los cultivos deber
ser un compuesto que repele o mate a las plagas y que prevenga que estos
puedan desarrollarse o alimentarse de las plantas.
Los fumigantes e insecticidas de contacto utilizados en el control de plagas en
los productos almacenados y en los cultivos no cumplen con stos criterios;
por ello, se buscan nuevas plantas con actividad insecticida o nuevas
alternativas antialimentarias. Los compuestos con actividad antialimentaria se
definen como factores que inhiben la alimentacin o causan la suspensin de la
actividad alimenticia.
Los metabolitos secundarios con propiedades antialimentarias pueden causar
cambios fisiolgicos en el desarrollo del insecto ; es decir, causan inhibicin de
las mudas o reducen la fecundidad en las hembras (Nawrot et al; 1989). Dentro
de los metabolitos secundarios con actividad antialimentaria se encuentran los
taninos, alcaloides y los triterpenos. Estos ltimos, poseen diferentes
propiedades biolgicas como son: actividad antifngica, aleloptica y
proteccin contra herbvoros; adems, se les ha atribuido propiedades
antialimentarias que pueden hacer que se les utilice como insecticidas de
origen vegetal (Rosenthal y Janzen, 1979).
13
Por otro lado, es bien sabido que los insectos son las principales plagas de las
plantas y de algunos alimentos en almacenamiento. En general, son muchos
los ordenes de insectos que atacan a las plantas ; entre ellos se encuentran la
Coleptera y Lepidptera (Daz, 1985).
En este sentido, Tenebrio molitor cultivado en su forma silvestre es un buen
modelo para estudiar la actividad insecticida de extractos vegetales, debido a
que este insecto tiene hbitos alimenticios muy variados; adems, tiene un
ciclo de vida corto que puede ser manejado perfectamente en los estudios de
laboratorio y finalmente porque en la naturaleza son los que causan el mayor
dao dada su voracidad.
E. Tenebrio molitor EL GUSANO DE LA HARINA
1. Clasificacin
La clasificacin de Tenebrio molitor de acuerdo a Borror et al (1981) es :
Phylum: Arthropoda
Subphylum: Uniramia
Clase: Insecta
Orden :Coleptera
Suborden: Polyphaga
Superfamilia: Tenebrionoidea
Familia :Tenebrionidae
Gnero y especie: Tenebrio molitor
2. Ciclo de vida de T. molitor
El ciclo de vida del Tenebrio puede dividirse en cuatro fases: huevecillo, larva,
pupa y adulto. En la vida silvestre este ciclo puede variar de 6 a 12 meses; sin
embargo, bajo circunstancias de criadero, este ciclo se reduce de 6 a 7
semanas; es decir, los huevecillos se desarrollan de 5 a 7 das, las larvas de 2
a 3 semanas y el adulto emerge alrededor de la quinta semana .
14
JUSTIFICACION
Dado que los insecticidas de origen vegetal estn considerados dentro de la
primera generacin de plaguicidas con actividad txica contra insectos, y desde
el punto de vista comercial solo se ha aprovechado algunas plantas como la
Ryana, Lonchocarpus, Chrisanthemun y Nicotiana tabacum , con el presente
estudio se desea encontrar nuevas plantas que puedan ser usadas como
insecticidas naturales. Para esto se eligi Cercidium praecox ya que presenta
baja depredacin; adems, de que no existen estudios previos que muestren
alguna actividad biolgica. Esta investigacin se dirigi para determinar las
familias de los compuestos presentes en los diversos extractos, aqs como
evaluar la actividad antialimentaria de estos y proponer el uso de esta planta
como insecticida natural.
Ahora bien, dado que los compuestos de las hojas de Cercidium praecox que
podran actuar como insecticidas naturales no han sido determinados,
decidimos investigarlos planteando los siguientes objetivos.
OBJETIVO GENERAL
Determinar las familias de los compuestos presentes en Cercidium praecox y
su efecto biolgico sobre insectos.
15
OBJETIVOS PARTICULARES
-Obtencin y caracterizacin de Cercidium praecox
-Obtencin de los extractos de Cercidium praecox
v Hexnico
v Acetato de etilo
v Metanlico
v Acuoso
-Determinar las familias de compuestos presentes en Cercidium praecox a
travs de pruebas fitoqumicas cualitativas
-Determinar la actividad insecticida de los extractos de Cercidium praecox
sobre larvas de Tenebrio molitor.
HIPOTESIS:
Considerando que Cercidium praecox es una especie vegetal que no muestra
presencia de depredadores, es posible que contenga compuestos que le
confieran esta proteccin y adems le den la capacidad de tener actividad
insecticida. Por lo que un estudio fitoqumico permitir conocer las familias de
compuestos responsables que intervienen en estos procesos.
16
a) COLECTA
1. Se realiz una salida de campo a Zapotitln de las Salinas en Tehuacn
Puebla; donde se colectaron las hojas de Cercidium praecox .
2. Las hojas se pesaron en fresco y se transportaron en bolsas de papel al
laboratorio de la Universidad.
3. El material vegetal se dej secar a temperatura ambiente en el laboratorio y
se determin su peso seco.
4. Las hojas secas se trituraron mecnicamente y con este material se
prepararon los extractos.
b) OBTENCIN DE LOS EXTRACTOS VEGETALES
1. Se tomaron 300g del material vegetal triturado y se colocaron en un matraz
erlenmeyer de 4 L.
2. Se agreg 1.5 L de hexano, se tap y cubri con papel para protegerlo de la
luz.
3. Se macer durante 48 hrs a temperatura ambiente.
4. Se filtr y evapor el disolvente empleando un rotavapor.
5. La planta residual se dej secar a temperatura ambiente en una campana
de extraccin para eliminar restos del disolvente anterior (hexano) y una vez
seca se trat con acetato de etilo como segundo disolvente, metanol (como
tercer disolvente) y agua (como cuarto disolvente).
17
MATERIAL Y METODOS
Para cada uno de los solventes empleados se siguieron los puntos 2, 3 y 4
antes mencionados, el ltimo disolvente se elimin por liofilizacin.
El uso de los diferentes disolventes es para separar los compuestos con
caractersticas de polaridad similar a la de los disolventes. Los principios
activos deben pasar de la planta al disolvente de manera que se obtenga un
extracto lquido. Posteriormente dicho extracto se puede concentrar eliminando
mayor o menor cantidad del disolvente ( Kuklinsky, 2000).
c) ANLISIS FITOQUMICO DE LOS EXTRACTOS
Se tomaron alcuotas de cada uno de los extractos y se realizaron diluciones en
los disolventes adecuados con el fin de solubilizar e identificar la presencia de
alcaloides, flavonoides, saponinas, cumarinas, terpenoides y taninos, cuyas
pruebas consisten en la evaluacin cualitativa por cambios de coloracin
formacin de precipitado como se describen a continuacin:
Alcaloides: Se tomo 0.1 g de cada uno de los extractos y se disolvi con 5 ml
de HCl 2 M, se calent en un bao Mara y se filtr. Se colocaron 1.5 ml del
filtrado en tres tubos de ensayo, los cuales se marcaron como A1, A2, y A3. Al
tubo A1 no se le adicion nada, puesto que es el control, al tubo A2 se le
adicionaron 0.2 ml del reactivo de Mayer y al tubo A3 se le adicionaron 0.2 ml
del reactivo de Wagner. Ambos reactivos forman un precipitado que indica la
presencia de alcaloides. La preparacin de los reactivos estn en el apndice
A.
Flavonoides: 0.2 g del extracto se disolvi en 10 mL de etanol y se le agreg
0.5 mL de HCl concentrado y 0.5 g de magnesio. La reaccin se consider
positiva cuando se formo una coloracin rosa o morada dentro de los tres
primeros minutos.
18
taninos: se tom una porcin de cada uno de los extractos y se disolvi con 10
mL de cloruro de sodio al 0.85% caliente, se filtr y dividi en dos partes
iguales. A una parte se le adicion solamente solucin de gelatina 1%
(apndice A); a una segunda porcin se le adicion cloruro frrico. Debido a
que los taninos precipitan protenas y forman complejos coloridos con Fe
3+
; es
por eso que se utiliza el cloruro frrico para corroborar la presencia de taninos
(Harborne, 1989).
En este sentido, la coloracin verde nos indica la presencia de taninos
condensados y la coloracin azul nos indica la presencia de taninos
hidrolizables (Barba, 1997).
Saponinas: Se disolvi en un tubo de ensaye 0.3 g del extracto con agua
caliente y se agit vigorosamente por algunos minutos. La formacin de
espuma por algunos minutos se consider positiva la prueba (Harborne, 1989),
como se muestra a continuacin:
No espuma La prueba es negativa
Espuma < 1 cm La prueba es ligeramente positiva
Espuma de 2 cm La prueba es positiva
Espuma> 2 cm La prueba es fuertemente positiva
Cumarinas: 0.2 g de cada uno de los extractos se colocaron con 1 ml de agua
a bao mara durante 5 minutos, posteriormente se coloc en la parte superior
una tira de papel filtro impregnado con NaOH 0.1 M. Esta tira se observa con
luz ultravioleta; la aparicin de manchas amarillas fosforescentes nos indica
que la prueba es positiva (Rizk,1982). Cabe mencionar que el anlisis se hace
para todos los extractos obtenidos; es decir, el extracto hexnico, el extracto
tratado con acetato de etilo, el extracto metanlico y el extracto acuoso.
19
d) PRUEBAS BIOLGICAS
La actividad biolgica se examin mediante la alimentacin forzada de larvas
de Tenebrio molitor del mismo peso y fase del desarrollo (segunda etapa
larvaria). Para ello, las larvas fueron puestas a dieta 2-3 horas antes de realizar
las pruebas y se les proporcion como alimento una dieta artificial de obleas de
harina trituradas.
Preparacin del alimento artificial
El alimento se elabor triturando obleas de harina en la licuadora; este alimento
fue impregnado con cada uno de los extractos obtenidos a una concentracin
del 1%. Cabe mencionar que cada uno de los extractos fue solubilizado
nuevamente en los disolventes adecuados; es decir, el extracto hexnico y
acetato de etilo fueron solubilizados en acetona, el extracto metanlico en
etanol y el acuoso en agua.
El alimento con su respectivo extracto, fue colocado en cajas petri para cada
uno de los extractos y se dej volatilizar el disolvente por 24 horas.
Posteriormente se colocaron 10 larvas por cada extracto. Cada tratamiento
consisti de 3 replicas y su respectivo control (tratamiento sin extracto y
tratamiento con el solvente .
A las 24 horas se contabilizaron las excretas y para ello la caja de petri fue
colocada en el microscopio estereoscpico para proceder al conteo de las
excretas. Una vez teniendo el conteo se obtuvo el promedio y se determin el
ndice de actividad antialimentaria (IAA) mediante la frmula :
IAA = 100 - (media de la muestra de alimentacin/ media de la muestra del
control de alimentacin) 100
Cabe mencionar, que para corroborar que hubo actividad antialimentaria se
pesaron las larvas todos los das.
20
Porcentaje de Mortalidad
Se identific el nmero de individuos muertos en los tratamientos cada 24
horas. Para la evaluacin de la mortalidad de las larvas se utiliz la formula:
MC= (Y- X/ 100- X) 100
Donde MC es mortalidad corregida
Y es % de mortalidad del tratamiento y
X es % de mortalidad del testigo.
A. ANLISIS QUMICO DE Cercidium praecox
El rendimiento de los extractos de las hojas de Cercidium praecox se muestran
en la tabla 1. El extracto acuoso present el mayor rendimiento (4.31 %) y el
menor fue el de hexano (0.64 %).
EXTRACTO Rendimiento (% )
Hexnico 0.645
Acetato de Etilo 0.678
Metablico 2.051
Acuoso 4.314
Tabla 1. Rendimiento de los extractos de Cercidium praecox
21
RESULTADOS
En la tabla 2 se puede apreciar a aquellos compuestos secundarios detectados
en Cercidium praecox mediante el estudio fitoqumico cualitativo.
EXTRACTO ALCALOIDES
MR WR
CUMARINAS FLAVONOIDES TERPENOS SAPONINAS TANINOS
FeCl3 G
Hexnico _ _ _ _ +++ ++ +++
CV/TC
Acetato de
Etilo
_ _ _ _ +++ ++ +++
CV/TC
Metanlico + + _ _ + ++ +++
CA/TH
Acuoso + + _ _ _ _ +++
CA/TH
Tabla 2. Datos obtenidos del estudio fitoqumico de Cercidium praecox.
MR: Reactivo de Mayer WR: Reactivo de Wagner +++: Abundante +:Poco abundante
-: No presencia G: Reactivo de Gelatina : precipitado CV/TC: Una coloracin verde
indica la presencia de taninos condensados CA/TH: Una coloracin azul indica la
presencia de taninos hidrolizables
Como se puede observar, los extractos extrados de las hojas de Cercidium
praecox que presentaron mayor cantidad de compuestos, fueron el metanlico
y el acuoso; ya que se detect la presencia de alcaloides, poca presencia de
terpenos, saponinas y taninos, siendo estos ltimos de tipo hidrolizable; es
decir, son compuestos que se hidrolizan en medio cido formando una
coloracin azul. Cabe mencionar, que los taninos fueron los de mayor
abundancia.Por otra parte, los extractos hexnico y Acetato de etilo que son
poco polares, presentaron compuestos como saponinas en muy pequea
cantidad, y los de mayor abundancia fueron los taninos y los terpenos; estos
ltimos se volatilizaron muy rpido; sin embargo se detecto su presencia.
Es factible mencionar, que los taninos que se detectaron en los dos extractos
(hexnico y Acetato de etilo), son de tipo condensado, ya que, en medio cido
se polimerizaron formando una coloracin verde intensa.
22
Finalmente, es importante mencionar que los cuatro extractos no presentaron
Cumarinas y flavonoides; adems, cuando se sometieron al reactivo de
gelatina, los cuatro extractos precipitaron; por lo tanto, se puede decir que esta
alternativa nos ayud a corroborar que haba presencia de taninos.
B. ACTIVIDAD BIOLGICA DE Cercidium praecox
Con respecto a las pruebas biolgicas realizadas con los diferentes extractos,
los resultados se resumen en la tabla 3.
EXTRACTO % IAA %MC
Control
(tratamiento sin extracto)
0.0 0.0
Control
(tratamiento con el solvente)
0.0 0.0
Hexnico 61.34 45.9
Acetato de etilo 9.96 3.0
Metablico 41.45 47.2
Acuoso 3.56 0.0
Tabla 3. ndice de Actividad Antialimentaria (IAA) y mortalidad corregida (%MC)
de Cercidium praecox contra Tenebrio molitor
Como se puede observar, los extractos de las hojas de Cercidium praecox
mostraron resultados favorables para dos de ellos (tabla 3). La mayor actividad
la present el extracto hexnico (61.34%), seguido por el extracto metanlico
(51.45 %), mientras que los dems extractos mostraron valores menores al
10%.Con respecto al ndice de mortalidad actividad insecticida, sta fue de
baja a nula en los extractos acetato de etilo y acuoso; el valor ms alto fue el
del extracto metanlico (47.2 %), mientras que el extracto hexnico fue de
45.9%. Sin embargo, todos los extractos redujeron la alimentacin de los
insectos y esto se pudo observar al pesar a los insectos diariamente, ya que se
observ un decremento de los pesos de estos.
23
Dados los antecedentes, es muy grato comentar que los resultados obtenidos
de esta investigacin fueron satisfactorios, ya que se encontr que Cercidium
praecox posee tanto actividad antialimentaria como insecticida.
En el caso de la actividad antialimentaria (IAA), se observ que el extracto
hexnico a pesar de presentar un bajo rendimiento(0.64%), est mostr el
mayor ndice de actividad antialimentaria (61.34%), seguido por el extracto
metanlico que presento actividad alimentaria del 51.45%; mientras que los
extractos de acetato de etilo y acuoso presentaron muy baja actividad. En el
caso del extracto hexnico, su actividad se debe quizs a la presencia de
terpenoides que se detectaron en el estudio fitoqumico, ya que de acuerdo a la
bibliografa se ha comprobado que estos compuestos pueden actuar como
agentes antialimentarios e insecticidas; sin embargo, es muy aventurado
atribuir la actividad biolgica nicamente a estos compuestos pues se
identificaron tambin saponinas y taninos. Con respecto a la actividad
insecticida se obtuvieron valores mayores al 40 %; el valor ms alto fue el del
extracto metanlico con el 47.2% mientras que el extracto hexnico present el
45.9%.
Ahora bien, es factible mencionar que la actividad antialimentaria se encontr
en el extracto menos polar, mientras que el extracto ms polar present la
actividad insecticida; lo que sugiere que los alcaloides detectados en el estudio
fitoquimico pueden ser los responsables de esta actividad; dado que a este tipo
de compuestos se les conoce por su capacidad txica.
Aunque los extractos acetato de etilo y acuoso tuvieron nula actividad
insecticida y baja actividad antialimentaria, presentaron compuestos
secundarios muy importantes sobretodo el extracto acuoso que present
saponinas, alcaloides y taninos; quizs con un estudio ms detallado que nos
permita detectar alguna actividad biolgica importante, ya que se requiere de
nuevas plantas para el tratamiento y control de algunas enfermedades.
24
DISCUSIN
Con los resultados de esta investigacin, se deben buscar alternativas para
que Cercidium praecox pueda ser utilizado como un agente insecticida para
proteger los cultivos de plantas de diferentes insectos; adems, se deben de
encontrar las estructuras qumicas de los compuestos responsables de la
actividad; sin embargo, se debe evitar la explotacin de esta planta para evitar
que se extinga. La ventaja de Cercidium praecox, es que los compuestos
activos se encontraron en las hojas y al cortarlas se seguiran producindose y
no necesariamente se tendra que obtener la planta completa.
De acuerdo a los objetivos planteados es muy satisfactorio concluir que :
Las hojas de Cercidium praecox presentaron compuestos secundarios del
tipo de los alcaloides, terpenoides, saponinas y taninos.
El extracto metanlico present mayor variedad de compuestos, ya que se
determinaron alcaloides, taninos, saponinas y terpenos en muy poca
cantidad.
En los extractos hexnico y acetato de etilo, presentaron compuestos del
tipo terpenoides.
Dos de los extractos de las hojas de Cercidium praecox presentaron tanto
actividad antialimentaria como insecticida.
25
CONCLUSIONES
La actividad antialimentaria se encontr en el extracto menos polar (extracto
hexnico), su actividad se debe quizs a la presencia de terpenoides.
El extracto ms polar (extracto metanlico) present la actividad insecticida;
lo que sugiere que los alcaloides pueden ser los responsables de esta
actividad; dado que a este tipo de compuestos se les conoce por su
capacidad txica.
Cabe mencionar que es necesario que dichos extractos sean sometidos a
procesos de purificacin para que estos estudios nos conduzcan a encontrar
las estructuras qumicas responsables de dicha actividad.
26
Reactivo de Mayer: En un matraz Erlenmeyer de 125 mL se colocan
1.36 g de cloruro de mercurio con 50 ml de agua. En otro matraz se
disuelven 5 g de yoduro de potasio con 50 ml de agua y se mezclaron
las dos soluciones aforando a 100 ml.
Reactivo de Wagner: En un matraz volumtrico se disuelven1.27 g de
yodo (resublimado) y 2 g de yoduro de potasio en 20 ml de agua y se
afora a 100 ml.
Reactivo de Gelatina al 1%: En un matraz volumtrico se colocan 100
mL de agua destilada y se agrega 1 g de gelatina y se agita
vigorosamente para deshacer los grumos.
Reactivo de cloruro frrico: En un matraz volumtrico de 100 mL se
colocan 50 mL de agua destilada y se adiciona 0.8 mL de HCl
concentrado, se agita la solucin, se aade 1g de cloruro frrico y se
afora a un volumen de 100mL.
27
Apndice A. preparacin de reactivos
Argilis ,H ; Soriano , F; Joseph ,M. 1990. Las armas bioqumicas de
los seres vivos. Mundo Cientfico, 35: 444-451.
Augner , M. 1994. Should a plant always signal its defense against
herbivores?. J. Chem. Ecol; 15: 1335-1347.
Austin , P; Suchar, J. 1989. Tannin-binding proteins in saliva of deer
and their absence in saliva of sheep and cattle. J. Chem. Ecol; 15:
1311-1315.
Barba, C. 1997. Introduccin al Laboratorio de Fitoqumica
Universidad Autnoma Metropolitana . Mxico , D.F. pp 7-9.
Barry, T.N. and B. J. Blaney. 1987. Secondary compounds of forages
In: Hacker and J. H Ternouth (Ed). The Nitrition of Herbivores pp: 91-
119. Academic Press. Australia.
Berenbaum, M.R. 1991. Coumarins. In: G. A. Rosenthal and M. R.
Berenbaum (Ed) Herbivores: Their interactions with Secondary Plant
Metabolites. Vol I : The Chemical participants pp: 221-249. Academic
Press, New York.
Borror, D. 1981. An introduction to the study of inseacts. 5
rd
. ed.
Saunders College. Philadelphia. USA. pp:927
Casida, J. 1973. Pyrethrum the natural insecticide. Academic press.
New York. Pp 3-18
28
BIBLIOGRAFIA
Cheeke, P. R. 1995. Plant toxins and mammalian herbivores. J.
Chem. Ecol; 15: 437-456.
Daz, V.1985. Actividad de aceites vegetales para proteger granos
almacenados contra insectos. Tesis profesional de Licenciatura del
Colegio de Postgraduados Chapingo. Mxico. pp 73
Domnguez, X. 1989. Mtodos de Investigacin fitoqumica. Editorial
Limusa. Mxico, D.F. pp 211-228, 281.
Farnsworth, N; Segelmen, A. 1999. Biological and Phytochemical
Evaluation of plants. J. Pharm Sci, 55: 215
Forsth, A. 1978. Iniciacin a la toxicologa vegetal. Manual de
tcnicas agropecuarias. Editorial Trillas. Mxico. Pp 23-45
Gavio, G; Jurez O; Figueroa H. 1999. Tcnicas biolgicas selectas
de Laboratorio y de campo. Noriega Editores. Mxico. pp 213-223.
Girn, L. 1994. Tcnicas bsicas para el cultivo y procesamiento de
plantas medicinales. Editorial Trillas. Mxico. Pp 12-15.
Harborne,J.1989. Phytochemical Methods. Chapman and Hall,
segunda edicin. pp 120-124.
Hawkins, J, White L; Hughes C. 1999. Phytochemical studios of the
plants. J. Chem. Educ; 57: 123-127.
29
Jacobson, M. And Crosby , D. 1971. Naturally occurring insecticides.
Marcel Deckeker. Inc New York. Pp. 3, 131-134
Kuklinski, C. 2000. Farmacognosia. Editorial Omega. Espaa. pp. 138-
139
Kumate, J. 1993. La investigacin cientfica de la Herbolaria
Medicinal mexicana. Secretaria de Salud. Mxico. p.p 11-12, 69-73.
Lagunes, T ; Rodriguez, C. 1990. Utilizacin de plantas con actividad
insecticida en zonas agrcolas de subsistencia. Primer informe
tcnico. Consejo de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) y Colegio de
Posgraduados, Chapingo. Mxico. Pp 23-56.
Lara, O.1996. Plantas medicinales de Mxico: composicin, usos y
actividad biolgica. Universidad Autnoma de Mxico. Mxico, D.F.
1996. p.p 14-15.
Maldoni, B. 1991. Alkaloids: Isolation and purification. J. Chem.
Educ., 68:700-703.
Munich, E. 1988. Plantas con propiedades plaguicidas. Editorial
Limusa. Mxico. D; F. PP 78-87.
Muoz, M. Qumica Orgnica. Editorial Mc Graw- Hill Interamericana.
Mxico, D.F. 1996. p.p 560-586.
Nawrot, J; Harmatha, I; Kostova, O. 1989. Antifeeding activity of
rotenone and some derivatives towards select insect storage pest.
Biochemical Systematics and ecology; 17: 55-57
30
Oyama, K. 1989. Herviboros y plantas como interactuan. Ciencia,
9:38-46
Pawlow, M. 1985. El gran libro de las plantas medicinales. Editorial.
Everest. Espaa pp 22, 25, 405.
Ramrez A, 1996. Conocimiento de la Flora Medicinal de Zapotitln
de las Salinas Puebla. Universidad Autnoma de Mxico. Facultad de
Ciencias. Tesis para obtener titulo en Biologa .Mxico. pp 42
Ramrez, G and Janzen D. 1984. Almacenamiento y conservacin de
granos y semillas. CECSA. Mxico. pp. 300.
Risk, A, M. 1982. Constituents of plants: A chemical survey of sixty
plants. Fitoterapia . 58: 123-126.
Rosenthal, G and Janzen D. 1979. Herbivores: Their interaction with
secondary plant metabolites. Academic Press. Inc. pp 718.
Ruiz, P. 1989. A descriptive Account of the vascular plants of
Western Mxico.Editor General: Anderson. pp 40-43
Solrzano, R. 1993. Manejo de plagas y el sistema de produccin
orgnica de insecticidas: Bases prcticas de la agroecologa.
Edfitorial Mc Graw-Hill. Iteramericana. Mxico. Pp. 37.
Velez, L. 1988. Parasiticidas agricolas. Editorial Mc Graw- Hill.
Interamericana. Mxico. PP 346.
31
Vite, F; Zavala, J; Armella, M; Garca, M. 1992. Regionalizacin y
caracterizacin macroclimtica del matorral xerfilo. Superficies de
respuesta a variables climticas de once gneros de plantas
caractersticas de este tipo de vegetacin. Atlas Nacional de Mxico.
Instituto de Geografa. UNAM, Mxico.
Zavala, H. 1982. Estudios ecolgicos en el valle semirido de
Zapotitlan, Puebla. Clasificacin numrica de la vegetacin basada
en atributos binarios de presencia o ausencia de las especies.
Biotica: Volumen 7.
32