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[1] A portaria descreve os procedimentos para fenotipagem ABO, incluindo a realização de prova direta e reversa. [2] A prova reversa não deve ser realizada em recém-nascidos até 4 meses de idade. [3] A interpretação dos resultados deve seguir estritamente as instruções das bulas dos reagentes.
[1] A portaria descreve os procedimentos para fenotipagem ABO, incluindo a realização de prova direta e reversa. [2] A prova reversa não deve ser realizada em recém-nascidos até 4 meses de idade. [3] A interpretação dos resultados deve seguir estritamente as instruções das bulas dos reagentes.
[1] A portaria descreve os procedimentos para fenotipagem ABO, incluindo a realização de prova direta e reversa. [2] A prova reversa não deve ser realizada em recém-nascidos até 4 meses de idade. [3] A interpretação dos resultados deve seguir estritamente as instruções das bulas dos reagentes.
TUTORA- MOR: ANA LCIA GIRELLO Fenotipagem ABO o que diz a portaria.... PORTARIA N 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013
Art. 175. Os testes pr-transfusionais incluiro: I - para sangue total e concentrado de hemcias: a) a tipagem ABO (direta e reversa) e RhD e pesquisa de anticorpos antieritrocitrios irregulares no sangue do receptor; b) a retipagem ABO (direta) e RhD do componente sanguneo; !"#" % &'%#() *+, -./(0% ( /(1(/2% 23" "4/.#%05/.%2 6" /(7('0"/ PORTARIA N 2.712, DE 12 DE NOVEMBRO DE 2013
No Art. 176. 3 A tipagem ABO ser realizada testando-se as hemcias com reagentes anti-A, anti-B e anti-AB. 4 Na hiptese do 3, caso sejam usados antissoros monoclonais, a utilizao do soro anti-AB no obrigatria. 5 A tipagem reversa sempre ser realizada, testando-se o soro ou plasma com suspenso de hemcias conhecidas A1 e B e, opcionalmente, A2 e O. 6 Nenhum resultado de tipagem ABO ser concludo at a resoluo das discrepncias entre a tipagem direta e reversa. Fenotipagem ABO o que diz a portaria.... 4 O que pesquisamos na fenotipagem ABO? ! Prova direta ! Pesquisa a presena ou ausncia dos antgenos ABO na membrana das hemcias. ! Prova reversa ! Pesquisa anticorpos naturalmente formados contra os antgenos que no possuimos, e que esto presentes no soro/ plasma. 5 Realizao de prova reversa
Segundo a Portaria 2.712/ 2013: " No realizar prova reversa em em recm-natos at os 4 meses de idade. ! Pois desenvolvem anticorpos naturais a partir do nascimento, e somente em torno de 03-06 meses de idade teremos pequenas quantidades anticorpos formados. ! Esta produo mxima entre 05- 10 anos de idade. 6 Tcnica em tubo Fenotipagem ABO REAGENTES NECESSRIOS PARA A FENOTIPAGEM ABO (TUBO) " Soro anti-A " Soro anti-B " Soro anti-AB * ! *segundo a portaria, sua utilizao opcional
" Reagente de hemcias A 1 " Reagente de hemcias B ! *concentrao de 3 a 5% Para a tipagem direta Para a tipagem reversa Cad meus EPIs? Pergunta que no quer calar! Quais so os equipamentos de proteo individual obrigatrios para quem atua em Laboratrios de imuno-hematologia?
" Jaleco manga longa " Luvas de procedimentos " culos ou viseira de proteo " Calados fechados " Roupas adequadas (mangas e calas compridas) " Mscaras " Usar sempre cabelos presos (com ou sem touca) " NO USAR adereos/adornos, maquiagem, salto alto PROIBIDOS! http://www.faciltst.com.br/cgi-sys/suspendedpage.cgi Observar o correto modo de procedimento, as limitaes da tcnica, a interpretao de resultados, entre outras informaes importantes, nas bulas dos reagentes! 11 Uma bancada limpa e organizada ajuda a garantir a qualidade do trabalho! SEMPRE identifique e numere os tubos de ensaio para os testes!
12 Importante! A centrifugao inadequada das amostras pode trazer problemas tcnicos. O tempo, velocidade e rotao adequados pode variar de uma centrifuga para outra. Por isso, temos que validar os equipamentos antes do uso!
13 Voce sabe o que VALIDAR? A lavagem das hemcias coletadas de sangue venoso para fenotipagem ABO e Rh(D) no obrigatria. Contudo, se a amostra for coletada de sangue de cordo umbilical, esta lavagem obrigatria! (Proceder de 6 a 9 lavagens para remover toda a gelia de Wharton!)
14 Caso seja necessria a lavagem das hemcias, separe uma alquota em um tubo identificado. Voc sabe COMO lavar hemcias corretamente? 15 16 Voc sabe COMO lavar hemcias corretamente? Este tempo e rotao podem variar de acordo com a validao da centrfuga! Aps a cetrifugao, remover o sobrenadante. Proceder as demais lavagens, repetindo as etapas anteriores. Preparo da suspenso de hemcias de 3 a 5%: Em um tubo devidamente identificado, adicionar 50 microlitros (1 gota) do concentrado de hemcias; adicionar 950 microlitros (19 gotas) de soluo fisiolgica 0,9%; Homogeneizar delicadamente. 17 18 PROVA REVERSA No plasma vamos buscar os anticorpos naturais do Sistema ABO que esto regularmente presentes, usando para isto hemcias comerciais fenotipadas dos tipos A 1 e B.
Pipetar 100 microlitros de plasma/ soro + 50 microlitros (1 gota) de cada hemcia nos respectivos tubos.
Prova reversa ABO 19 20 21 PROVA DIRETA Usamos anticorpos comerciais conhecidos para procurar os antgenos correspondentes na membrana das hemcias. Seguir a indicao da bula dos reagentes! Geralmente consiste em adicionar-se 50 microlitros (1 gota) de cada antissoro nos tubos identificados. A seguir 22
+ 50 microlitros (uma gota) da suspenso de hemcias.
Importante!
A *qualidade da pipeta e a posio em que ela e/ou o conta gotas so usados, so aspectos importantes para garantir esta medida!
*preferencialmente, pipetas semi-automticas calibradas periodicamente. Etapa de leitura
Existem centrfugas prprias para Imuno-hematologia!
Ateno velocidade, rotao e ao tempo de centrifugao. 25 26 Etapa de leitura Voc sabia que..
Existe uma maneira correta para se soltar o boto de hemcias do fundo do tubo?
E e que, para se fazer a leitura, tambm existem algumas regras bsicas?
27 P (w) Escore=3
4+ (Escore=12) 3+ (Escore=10)
2+ (Escore=8) 1+ (Escore=5) boto slido/nenhuma clula livre alguns aglutinados grandes aglutinados mdios/sobrenadante claro aglutinados pequenos/sobren.avermelhado vrios aglut. pequenos/sobren.avermelhado Negativo: nenhum aglutinado INTENSIDADE DAS REAES: PROMOVER A PADRONIZAO NOS RESULTADOS Slide:Regina Aparecida Cardoso Interpretao dos resultados Ler atentamente o preconizado nas bulas dos reagentes!
A B AB RA 1 RB B RB RA 1 AB A TIPO B TIPO A TIPO AB A B AB RA 1 RB A B AB RA 1 RB TIPO O Interpretao dos resultados Ler atentamente o preconizado nas bulas dos reagentes! 31 Tcnica em Gel teste Fenotipagem ABO Linha Bio-Rad de microplacas Lyra Centrfuga/Agitador/Leitor Produtos da linha Microplaca Microplaca DiaCell MP Diluent 1 Ver mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?206 Fenotipagem ABO - Teste em microplaca Lyra centrfuga/Agitador/Leitor Prova reversa P r o v a
d i r e t a
Em microplacas, para uma interpretao correta dos resultados, a agitao/ centrifugao uma etapa crtica ATENO! Agitao insuficiente Agitao excessiva Agitao correta Leitura dos aglutinados 39 Tcnica em Gel teste Fenotipagem ABO Primeiramente, escolha o perfilde cartela adequada para seu teste Veja mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?121 Cada um deles tem uma tcnica, que pode variar! Consultem as bulas! Cartes para Prova Reversa ABO Veja mais em : http://www.diamed.com.br/Cmi/Pagina.aspx?121 Conjunto de equipamentos Tcnica manual ID-System Bio-Rad Usando como exemplo da cartela ID-ABO/ reversa: Prova direta Prova reversa Organize sua bancada de trabalho: Equipamentos, estao de trabalho, reagentes, amostras, planilhas de trabalho e descarte de materiais. OBS:Ateno utilizao dos equipamentos de proteo individual . Reagentes: hemcias para prova reversa, diluentes e cartelas. Identificar os cartes com dados da amostra-teste Pipeta de volumes adequados ao mtodo. Retirar o lacre de alumnio dos cartes. Homogeneizar os reagentes de hemcias. Observar que todos os reagentes estejam temperatura ambiente a, no mnimo, 10 min) Adicionar primeiramente as hemcias aos microtubos correspondentes prova reversa: 1 gota (50 ul) de ID-Diacell A1*... *observar que a concentrao destas hemcias varia de 0,8 a 1% ... E 1 gota (50 ul) de ID-Diacell B Aspirar plasma ou soro Vantagem do gel: podemos utilizar apenas uma nica amostra coletada com EDTA para todos os testes da rotina! Adicionar 50 ul de plasma ou soro aos microtubos de prova reversa. Incubar 10 minutos a T.A. Preparar suspenso de hemcias de trabalho: 1 ml de diluente 2 (LISS) ... Pipetar 12, 5 microlitros de hemcias (sedimento). No necessrio lavar hemcias, nem mesmo de recm-nascido coletada de sangue de cordo umbilical! Homogeneizar. Aspirar a suspenso de hemcias-teste Pipetar 50 ul em cada microtubo do carto de fenotipagem ABO+reversa Proceder centrifugao (Contrabalanar sempre as caapas em forma de cruz) A velocidade (varivel de acordo com o modelo do equipamento) e tempo de centrifugao (10 minutos) so fixas para este mtodo.
Ateno: nunca interromper a centrifugao e reiniciar, sob pena de falsos resultados. Ler, interpretar e anotar resultados (manualmente ou em equipamentos automatizados prprios para esta tcnica. Interpretao fenotipagem ABO/Rh e prova reversa. Os resultados podero ser conferidos, pois so estveis por at 48 horas e passveis de documentao por scanner, xerox ou leitores automatizados. Uma das vantagens deste mtodo a biossegurana, j que os cartes e ponteiras so descartveis . Descarte dos materiais* *Descartar de acordo com as normas preconizadas pelo servio de GRSS !"# %"&%" ' (")%*+, INTERPRETAO DAS AGLUTINAES W 1+ 0 64 Fenotipagem ABO
" O fenmeno de dupla populao bastante fcil de ser visualizado por esta metodologia! " Dados devem ser analisados, c o mo h i s t r i a c l n i c a , transfusional e laboratorial: ! Transfuso recente no isogrupo ! Transplante de medula ssea no isogrupo ! Quimera de sangue (Me/RN) ! Subgrupo ABO ! Descartar efeito fibrina! Dupla populao Interpretao: BRhD+ Seguir o padro de intensidade de aglutinao especificado para este mtodo. INTERPRETAO DOS RESULTADOS ARhD- BRhD+ ABRhD+ ORhD+ Resultados dos testes O que so discrepncias ABO? # quando ocorre incompatibilidade entre os resultados observados na fenotipagem ABO direta e reversa.* # *E tambm com os resultados lanados anteriormente deste mesmo doador/ paciente. # Segundo a Portaria 2.712/2013: # Toda discrepncia ABO deve ser resolvida antes da liberao dos resultados. 67 O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013? " Seo VI Dos Exames de Qualificao no Sangue do Doador " (....) " Art. 120. O registro de uma tipagem ABO e RhD prvia de um doador no serve para a i denti fi cao das uni dades de sangue subsequentemente doadas pelo mesmo doador. " 1o Novas determinaes devem ser realizadas a cada doao. " 2o Em caso de doaes prvias, deve ser comparada a tipagem ABO e RhD com o ltimo registro disponvel. " 3o Qualquer discrepncia nos resultados das tipagens sanguneas de que trata o caput ser resolvida antes de se rotular e liberar para uso os componentes sanguneos produzidos.
O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013? " Seo VI Dos Exames de Qualificao no Sangue do Doador " (....) Art. 124. recomendada a realizao da investigao de subgrupo de A em doadores de sangue, quando houver resultados discrepantes entre as provas ABO direta e reversa ou na busca de concentrado de hemcias de subgrupo A2 para pacientes que apresentam anticorpo anti-A1 clinicamente significante.
O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013? " Seo X Da Transfuso Sangunea " (....) " 3o A tipagem ABO ser realizada testando-se as hemcias com reagentes anti-A, anti-B e anti-AB. " 4o Na hiptese do 3o, caso sejam usados antissoros monoclonais, a utilizao do soro anti-AB no obrigatria. " 5o A tipagem reversa sempre ser realizada, testando-se o soro ou plasma com suspenso de hemcias conhecidas A1 e B e, opcionalmente, A2 e O. " 6o Nenhum resultado de tipagem ABO ser concludo at a resoluo das discrepncias entre a tipagem direta e reversa. O que diz literalmente a Portaria 2.712/2013? " Seo X Da Transfuso Sangunea " (....) " Art. 181. Na amostra pr-transfusional inicial para transfuso em neonatos e crianas de at 4 (meses) de vida ser realizada a tipagem ABO direta. " 1o No ser realizada a tipagem reversa.
I- Fatores relacionados tcnica
II- Fatores relacionados s hemcias
III- Fatores relacionados ao soro
Discrepncias nas Classificaes ABO Discrepncias de resultados Como resolv-las? # Rever os detalhes operacionais: # Rever detalhes da execuo da tcnica # Rever registros # Transcrio de resultados # Verificar possvel troca de amostras # Qualidade da amostra: $ Hemolisada, lipmica, aglutinao espontnea. $ Data da coleta! PORQUE ACONTECEM? Primeiramente, levar em considerao que pode ter ocorrido uma falha tcnica. Discrepncias nas Classificaes ABO FALHAS TCNICAS PODEM OCORRER DEVIDO: 1- AMOSTRA: - identificao inadequada da amostra - anotao incorreta de resultados - interpretao incorreta
Discrepncias nas Classificaes ABO Resultados Discrepantes " Podem ser devidos a erros clericais ! Identificao ! registros, amostras ! Anotao ! Transcrio ! Interpretao
76 FALHAS TCNICAS PODEM OCORRER DEVIDO: 2- REAGENTES: - Manuseio incorreto dos reagentes - Falha em seguir as orientaes do fabricante - Reagentes contaminados ou inativados - Falha em adicionar reagentes
Discrepncias nas Classificaes ABO 3- NA REAO DE AGLUTINAO - Concentrao inadequada das hemcias a serem testadas - Vidrarias sujas - Temperatura de incubao incorreta - Razo clula/soro incorreta
4- EQUIPAMENTOS -excesso de centrifugao -centrifugao insuficiente
Discrepncias nas Classificaes ABO Resultados Falsos Negativos Resultados Falsos Positivos Reagente ou soro teste no adicionado ao tubo Centrifugao acima do recomendado Hemlise no identificada como uma reao positiva Uso de reagentes , glbulos vermelhos ou salina contaminados Quantidade inadequada de soro (ou reagente) adicionado aos glbulos vermelhos Uso de tubos sujos Centrifugao abaixo do recomendado Interpretao ou anotao dos resultados incorretamente Incubao a temperatura acima de 20-24C Interpretao ou anotao dos resultados incorretamente PODEM OCORRER resultados falso-positivo e/ou falso negativo:
Causas comuns de resultados falso-negativos e falso-positivos Discrepncias nas Classificaes ABO 1- Conferncia dos dados Amostras (tubo seco X tubo anticoagulante) Identificar os tubos de ensaio na execuo do teste
2- Conferir dados do paciente Idade, diagnstico, medicao, tipagem prvia, nveis de hemoglobina
3- Controle de Qualidade Reagentes, equipamentos, tcnica e funcionrios
Resolvendo Discrepncias ABO Fatores relacionados tcnica CATEGORIA CAUSAS Perda/Diminuio da reatividade nos GV
- Subgrupo ABO; Leucemia; Transfuso; Transplante Reatividade extra nos eritrcitos - Autoaglutininas / excesso de protenas recobrindo os GV; - GV no lavados protenas no plasma; - GV no lavados Anticorpo no soro do paciente que reage com componente do anti-soro; - Transplante; Antgeno B adquirido ; Fenmeno B(A) Campo misto - Transfuso recente; Transplante, subgrupo ABO, quimera Perda/Diminuio da reatividade no Soro - Idade; Subgrupo ABO; Hipogamaglobulinemia; Transplante. Reatividade extra no soro - Autoanticorpo e/ou Aloanticorpo frio; - Anticorpo no soro/plasma que reage com componente do anti-soro; Transfuso de componentes plasmticos; - Transplante; Infuso de Imunoglobulina. Possveis causas de discrepncia ABO
Discrepncias nas Classificaes ABO Problemas com as fenotipagens Variabilidade de nmero de stios antignicos Limites de deteco dos testes Tipos de anticorpos utilizados nos reagentes Transfuses anteriores TMO Alteraes temporrias devido patologias
Antgenos ABO fracos ou ausentes
Ex.
Anti-A
Anti-B
AC
Hemcias A 1
Hemcias B
Fentipos Provveis
1
0
0
0
0
4+
A
2
0
4+
0
0
0
AB (ou B *) *Anticorpo Anti-A no detectado
3
1+
0
0
0
4+
A Causas mais provveis para as discrepncias: 1- Diminuio ou perda de antgenos devido a doenas como Leucemia, linfoma ou outras afeces malgnas (exs: 1, 2 e 3)
2- Subgrupos de A fracos : A m , A y (exs: 1 e 2) e A x (ex: 3)
1) Incubar a prova direta por 15-30 minutos temperatura ambiente ou 4 o C para aumentar a associao antgeno anticorpo (acompanhar o teste de um autocontrole); 2) Adsoro-eluio: Incubar uma alquota de clulas vermelhas lavadas, a 4 o C, com anti-A ou anti-B (conforme o caso) para adsorver anticorpos para o correspondente antgeno de clulas vermelhas e posterior eluio. 3) Realizar pesquisa de subgrupos de A com Lectinas Anti-A1 e anti-H 4) Pesquisa de substancias solveis ABO na saliva.
Causas mais provveis para as discrepncias: 1- Fenmeno B adquirido (ex: 1) 2- Poliaglutinao por exposio do antgeno T (exs: 2 e 3) 3- Gelia de Wharton (ex: 4) 4- Dupla populao de clulas (Como nos casos de quimera e TMO)
" Fentipo B (A): - Pode-se suspeitar do Fentipo B (A) quando os glbulos vermelhos do paciente reage fracamente com anticorpos monoclonais anti-A e fortemente com anti-B na prova direta e o soro reage com hemcias A 1 , mas no com hemcias B na prova reversa.
- A maioria dos exemplos reage fracamente com o reagente Anti-A devido ao clone MHO4 sendo a reao de aglutinao frgil e fcil de dispersar. Um teste com anti-A de procedncia diferente pode confirmar e resolver a discrepncia.
Resolvendo Discrepncias ABO Fatores relacionados Hemcias Antgenos Extras " Paciente apresenta sepse bacteriana, e na tipagem ABO em gel policlonal observamos: Exemplo: Fenmeno B adquirido
" Repetida a tipagem ABO em tubo com anti-A monoclonal observamos: ! Resposta: ARh+ (lindo!) " Perguntas possveis: O que houve de errado? ! O que o gel est pegando? ! O gel est com problema? ! O paciente tem algum problema? ! Tipagem em tubo melhor? ! Oh meu Deus, esta eu no sei mesmo!..... Exemplo: Fenmeno B adquirido
Hoje isto raro! Fentipo B adquirido
Apenas detectado com Antisoros monoclonais: clone ES2 ou policlonais I- Fatores relacionados tcnica
II- Fatores relacionados s hemcias
III- Fatores relacionados ao soro
Resolvendo Discrepncias ABO Anticorpos ABO fracos ou ausentes: - imunodeficincia - neonatos - idade avanada - quimioterapia - plasmafrese teraputica - pacientes com hipogamaglobulinemia Discrepncias nas Classificaes ABO 1- Incubar o soro do paciente com os glbulos vermelhos comerciais (A 1 e B) em temperatura ambiente por 15-30 minutos.
2- Se continuar a no apresentar reao de aglutinao, incubar a 4C por 15-30 minutos, incluindo um tubo para auto-controle, e tambm os tubos a pesquisa de anticorpos irregulares (PAI). Resolvendo Discrepncias ABO Fatores relacionados ao Soro Anticorpos ABO fracos ou ausentes Anticorpos Irregulares:
- Alo-anticorpos IgM : anti-M, -N, -Le a , -Le b , -P1Pk
- Anti-A 1 em indivduos A 2 e A 2 B
- Transfuso de componentes plasmticos contendo anticorpos ABO Discrepncias nas Classificaes ABO 1- Realizar a identificao do anticorpo em temperatura ambiente, e 4C se necessrio (caso de PAI positiva). 2- Se confirmada a presena de anticorpos frios, realizar a PAI+AC pr-aquecida para verificar se o anticorpo em questo tem significado clnico. 4- Se confirmado presena de anti-A1, realizar prova reversa pr-aquecida para verificar se o anticorpo em questo tem significado clnico.
Resolvendo Discrepncias ABO Fatores relacionados ao Soro Anticorpos Irregulares TAREFA DESTE MDULO " CRIE OU DESCREVA um caso de discrepncia ABO e indique os testes realizados na sua resoluo. " Indique todos os dados que forem necessrios para a compreenso do caso. " Todos os casos postados sero apresentados e discutidos na webconferencia. " Use como apoio, o Guia Rpido para resoluo da Bio-Rad que est postado nos materiais do mdulo. OBRIGADA A TODOS!