NUMERACIN DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

VIABLES
1. INTRODUCCION
El anlisis de los alimentos est catalogado por diversas tcnicas y mtodos para
determinar microorganismos que se encuentran viables en los alimentos ya sean
slidos como las carnes, verduras y frutas, o lquidos ya sea leche y jugos de
frutas; entre estos mtodos tenemos la numeracin de microorganismos
aerobios mesfilos, la cual nos permite determinar cuntos microorganismos
contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su interior.
Por otro lado las tcnicas para poder encontrar la numeracin de aerobios
mesfilos viables son: el recuento de colonias en placa por profundidad,
superficie o por goteo; otro el Mtodo del nmero ms probable (MPN) de
grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas viables.
El recuento total de bacterias en placa es un mtodo til para obtener una idea
del grado de frescura o pronta alteracin de los alimentos, dependiendo de la
cantidad de bacterias presentes.
En el grupo de los mesfilos aerobios se incluyen todas las bacterias, mohos y
levaduras capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas.
En este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos.
Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura la ausencia de
patgenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa
presencia de flora patgena. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por
fermentacin, no son recomendables recuentos elevados.
Un recuento elevado puede significar: Excesiva contaminacin de la materia
prima. Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin. La posibilidad
de que existan patgenos, pues estos son mesfilos. La inmediata alteracin del
producto.
El recuento de mesfilos nos indica las condiciones de salubridad de algunos
alimentos.
2. OBJETIVOS
Cuantificar la poblacin de microorganismos aerobios viables en
determinada muestra.
Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos que contiene
un alimento
Familiarizarse con mtodos directos para la obtencin de
microorganismos utilizando el mtodo de recuento de colonias en placa.
Determinar si el producto alimenticio que se analiza est en condiciones
aptas para el consumo humano.
Determinar cuntos microorganismos presenta la muestra que
analizamos.
3. PROCESAMIENTO DE MUESTRA
a. Diluciones
Una dilucin es la disminucin de concentracin por volumen de una sustancia,
en este caso de microorganismos. Dado que en la mayora de los casos
las poblaciones microbianas son altas, de varios miles y /o millones, no es
posible contarlos en su densidad original. Por esta razn es necesario
disminuir su concentracin por volumen, agregando agua u otra sustancia
lquida a la muestra.
Cuando se considera que la muestra tiene una alta poblacin, se recomienda
usar esta mtodo, pues al diluir de manera calculada la muestra, se
asegura la separacin de microorganismos presentes en ella y por tanto se
logra la formacin de colonias separadas cuando se hace recuento en caja o
baja densidad para la cmara de recuento, facilitndose el clculo del nmero
de clulas.
Las diluciones pueden ser tiles no solamente para el recuento de clulas
viables sino tambin para recuento directo en cmara y medicin de
biomasa por densidad ptica.
Por ejemplo en un suelo frtil la proporcin promedio bacterias hetertrofas
est el orden de 10
6
y 10
8
UFC /gr de suelo, mientras que en agua de
pozo por ejemplo contiene de 10
2
a 10
4
UFC/ml.
El objetivo de la siembra: silo que se desea es hacer un recuento de UFC en un
medio universal, se debe diluir ms que si se siembra en medios selectivos,
donde sern mucho menos los microorganismos que crezcan.
Medio para la preparacin de las diluciones:
Algunas veces la dilucin se hace en agua destilada estril, una solucin de
NaCl al 0.5 %, caldo peptonado al 0.1 % o el mismo medio de cultivo sin agar.
Tambin se puede agregar una alcuota determinada de la muestra
directamente en medio de cultivo con medio nutriente +agar fundido, cuidando
que no se encuentre tan caliente como para que mate los microorganismos o
tan fro que se haya solidificado. El agua destilada estril puede significar un
cambio muy brusco para los microorganismos por lo que se prefiere las otras
soluciones.
Se prepara la cantidad requerida la solucin seleccionada, segn sea el
nmero de diluciones y se esteriliza a 1 atmsfera en un Erlenmeyer. Una
vez estril la base de las diluciones, se dispensa 9ml o 9.9 ml (dependiendo si
se quiere una dilucin de 1/10 o 1/100), en tubos de ensayo en condiciones
aspticas utilizando pipeta estril de 10 ml.
Al primer tubo de ensayo que contiene la solucin, se le agrega 1ml o 0.1 ml
respectivamente de la mezcla con los microorganismos preparada con
anterioridad o de la muestra de agua. El tubo contenido del tubo se mezcla en
un vortex y con una pipeta se vierte la cantidad correspondiente al siguiente tubo
y as hasta completar el set de diluciones.
b. Tcnicas empleadas
i) Mtodo de placa vertida - Profundidad:
Primero se diluye la muestra a analizar.
Luego se saca con una pipeta 1 ml de todas las diluciones y se vierten en
dos placas por dilucin.
Despus de esto rpidamente agregamos el Agar Plate Caunt,
homogenizamos con 5 movimientos lentos de arriba hacia abajo y de
derecha izquierda.
Para fines de la prctica solo trabajaremos con la dilucin 10-3. Por lo que
solo utilizaremos 6 placas.
ii) Mtodo de Superficie:
De la dilucin 10-, sacamos 1 ml y hacemos las diluciones hasta 10-6.
Luego en una placa servida con Agar Plate Count, agregamos 1 ml sobre
la superficie.
Inmediatamente procedemos a expandir el mililitro sobre la superficie con
la esptula de Drigalsky.
Con fines de la practica solo se trabaja hasta la dilucin 10-3 y con tan
solo 1 placa por dilucin
iii) Mtodo de Goteo:
Con una micropipeta sacamos 20 ul, y dejamos caer a manera de gota
sobre un lado de la placa con Agar Plate Caunt. Este procedimiento se
realiza dos veces en la misma placa en lados opuestos.
Para fines del curso solo otilizaremos las soluciones 10-2 y 10-3.
1ml
1ml
1ml 1ml 1ml 1ml
9ml 9ml 9ml 9ml
9ml
Cultivo
Microbiano
90ml
10 10 10 10 10 Dilucin
10
0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1m
l
4. RECUENTO STANDARD DE MESOFILOS AEROBIOS VIABLES
Procedimiento
Tradicionalmente se ha recomendado que con la finalidad de minimizar el
error producido en los recuentos, todas las diluciones se siembren por
duplicado.
Preparar las diluciones del alimento siguiendo las instrucciones de
la seccin anterior
Pipetear de la dilucin 1cc en una caja de Petri vaca y estril
empezando por la dilucin 10
-1
hasta 10
-6
Se sugiere esta serie de
diluciones cuando no se conoce el grado de contaminacin que pueda
tener el alimento
Teniendo el medio de cultivo fundido y enfriado a una temperatura de
45C aproximadamente agregar a cada caja de Petri que contiene el ml
de las diferentes diluciones el contenido del tubo. Con movimientos
suaves en sentido vertical, luego horizontal y finalmente circulares en el
sentido de las agujas del reloj y a la inversa. Teniendo el cuidado de no
formar burbujas, se logra una mezcla uniforme entre la muestra y el
medio de cultivo debe hacerse siguiendo los pasos anotados para
conseguir un crecimiento bacteriano uniforme y rpido, para evitar la
solidificacin del agar
Una vez solidificado el agar las cajas se invierten y se incuban a 35-37C
Realizar los recuentos:
Seleccionar para hacer el recuento aquella dilucin donde haya
crecimiento bacteriano que contenga entre 30 y 300 colonias, Utilice el
cuenta colonias
Cuente las colonias y el numero encontrado deber multiplicarlo por el
reciproco de la dilucin que utilizo para hacerlo
Pueden presentarse ciertas variaciones en los cultivos realizados. En
la hoja siguiente usted encontrara las diferentes posibilidades y que hacer
en cada caso. Lo importante es saber que cuando se puedan encontrar
diluciones que contengan entre 30 y 300 colonias si el recuento es
preciso, se informa como recuento Standard
Recuento estimado del standard
Este clculo se realiza cuando no es posible encontrar ninguna dilucin que
contenga menos de 300 colonias. Para hacer recuentos se puede dividir la caja
en 2, 4 o aun 8 porciones y contar las colonias. Este nmero de colonias
se multiplica por el factor apropiado (2,4 u 8) y adems por el reciproco de la
dilucin, que en este caso sera la ms alta.
Cuando hay ms de 200 colonias por 1/8 se asume que en toda la caja hay
ms de 1600 (200x8). El recuento total deber ser mayor de 1600 multiplicado
por el reciproco de la dilucin ms alta.
Si no hubiese colonias en la caja de dilucin menor (10
-1
) se reporta como
menos de 10 colonias puesto que el mnimo nmero de colonias puesto que el
mnimo nmero de colonias que se puede obtener es de 1 y al multiplicarlo
por el reciproco de la dilucin dar 10.
Expresin los resultados
El recuento bacteriano se debe expresar con 2 dgitos y el resto en potencias
de 10. Como no siempre el conteo de colonias produce valores como por
ejemplo 10-20-50-80-300 etc, es necesario aplicar algunas correcciones con la
finalidad de convertir el nmero hallado en uno con 2 dgitos.
Ejemplos:
Si el recuentos se realiz en la dilucin 10-3 y fue de 138 colonias, el
tercer digito por ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2 o sea
que el recuento seria 140.000 = 14x104.
Si el recuento fue de 124 por ser el 3er. Digito menor que 5 se anula y se
expresa 120.000 = 12x104.
Cuando el recuento de mes aerobios se utiliza para determinar la aceptacin o
rechazo de un alimento, nicamente se considerara el recuento standard y
nunca el estimado.
5. CONCLUCIONES
Los resultados obtenidos en la prctica realizada son los siguientes:
Dilucin 10
Placa 1 = 119 colonias
Placa 2 = 141 colonias
Por lo tanto al promediar se tiene
x=130
Nmero de colonias * factor de dilucin
UFC / ml =
ml sembrados en la placa
UFC/ml=

UFC/ml=13x10/g-suelo
6. BIBLIOGRAFA
MANUAL PRCTICO DE MICROBIOLOGA - Tomo I: Microbiologa
Ambiental I Manacorda A. M., Cuadros D. P y lvarez A. S. Ao 2007
Gamazo, C., Lpez-Goi, I., y R. Daz. 2005. Manual prctico de
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Madigan, Michael T., Martinko Gohar M. y Parker Jack.Brock. 1998.
Biologa de los Microorganismos. Ed. Pretice Hall. 8 edicin.
R. Daz, y col. 1999. Manual Prctico de Microbiologa. 2a edicin. Ed.
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UNAM, 1986, "Biologa celular", Manual de prcticas. Departamento de
Biologa, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional Autnoma de
Mxico, pp. 20-28.