3era Clase Zavaleta

CINTICA ENZIMTICA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
FACTORES QUE AFECTAN
DETERMINACIN DE ACTIVIDAD
ENZIMATICA
CONSTANTES CINETICAS

abril 2014 CINETICA ENZIMATICA 1
ACTIVIDAD ENZIMTICA

moles de sustrato convertido en
producto por unidad de tiempo
Actividad enzimtica
FACTORES QUE AFECTAN
Temperatura
pH
[sustrato]
[enzima]
Buffers (kits)
Efectores
Tiempo
EFECTO DE LA TEMPERATURA
El fro disminuye las
interacciones entre la
enzima y el sustrato
(disminuye la velocidad
de reaccin).
El calor incrementa la
velocidad de interaccin
entre enzima y sustrato a
un punto que la enzima
obtiene tanto calor que se
desnaturaliza
abril 2014 5 CINETICA ENZIMATICA
EFECTO DE LA TEMPERATURA
V
T
EFECTO DEL PH
Cambia la estructura
terciara y su
capacidad de fijar
su sustrato (s)
Tripsina pH 7.5
Pepsina pH 2.0
Pepsina
Amilasa
Acetilcolinesterasa
E
n
z
y
m
e

a
c
t
i
v
i
t
y

Efecto del pH
pH
v
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
Se mide bajo
condiciones
definidas (T, pH,
[E], [S], [Efectores]
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
ACTIVIDAD ENZIMTICA
UNIDAD DE ACTIVIDAD ENZIMATICA (U): mol de
sustrato transformado en un minuto

ACTIVIDAD ESPECIFICA: unidades de enzima por
miligramo de protena (U/mg protena o mol min
-1

mg protena
-1
)

CONSTANTE CATALITICA O NUMERO DE
RECAMBIO (TURNOVER): unidades de actividad
enzimtica por mol de enzima ( mol min
-1
mol de
enzima
-1
). Catalasa y alfa amilasa 5x10
6
y 1.9 x 10
4

Por qu realizar ensayos
enzimticos?
1. Sustratos nativos y sintticos (anlogos)
2. Parmetros cinticos de reaccin (pH, T,
[S], [E], [Ef])
3. Constantes catalticas Km, Vmax
4. Disear ensayos automatizados (dx)
5. Disear inhibidores (frmacos)
6. Reacciones reversas para generar nuevos
productos
Ejemplo de actividad enzimtica

-galactosidasa
-enlace

Nitrofenilgalactosido nitrofenol + galactosa
ONPG (incoloro) (amarillo)

(sustrato) (productos)
Actividad enzimtica en dx
Alcohol deshidrogenasa (ADH)
CH
3
CH
2
OH + NAD
+

CH
3
CH
2
O + H
+
+ NADH

NAD
+
oxidado a NADH reducido

NADH SE LEE A 340 NM
1. Efecto de la concentracin de enzima
(relacin lineal)
v
[E]
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
Una cintica hiperblica implica un
proceso saturante:
Por mucho que aumente [s] la velocidad
permanecer constante tendiendo un valor asinttico

E + S ES E + P
Velocidad inicial (v
o
)
Iniciar de bajas a altas [S]
Mantener la [E] saturante
Medir la velocidad de reaccin v
o
hasta que la
velocidad sea constante V
max
Cuando la enzima se mezcla con altas [S] no
permite determinar Vmax

v
[s]
Velocidad inicial
.
.
.
.
.
. .
.
E + S ES E + P
k
1

k
2

k
-1

k
-2

1. [ES] esta constante, en estado estacionario :
d[ES]/dt = 0
2. E, S y ES estn en equilibrio
3. La descomposicin del complejo ES en E + P
es limitante de la velocidad
4. Kd = [E] [S]/[ES]

E + S ES E + P
k
1
k
2

k
-1

A [S] muy elevadas [ES] = [E]t = K
2
[ES]

K
2
[E
t
] [S]
V
0
= ------------------
[S] + K
m

V
max
ocurre cuando

[ES] = [E
t
]
As, V
max
= K
2
[E
t
]

V
max
[S]
V
0
= ------------------ (Ecuacin Michaelis-Menten)

K
m
+ [S]
E + S ES E + P
k
1

k
2
k
-1

K
m
= [S] a 1/2 V
max

K
m
, concentracin de substrato a la cual se
alcanza la mitad de la velocidad mxima

K
m
ms baja (menor sustrato para alcanzar la 1/2 V
max
)

K
m
mide la afinidad de la enzima por el sustrato.
A bajo K
m
alta afinidad.

DETERMINACIN DE Km y Vmax
CMO DETERMINAR LA K
m
y V
max
?

Fosforilacin de la glucosa
Km, 0,2 mM
Km, 10 mM
V
max
[S]
V
0
= ------------------ (ecuacin Michaelis-Menten )

k
m
+ [S]

1

k
m
+ [S]
--------- = ------------------
V
0
V
max
[S]

1

k
m
[S]
---------- = ------------ + ------------
V
0
V
max
[S]

V
max
[S]

1 k
m
1 1
---------- = ------ ------ + ------ (ecuacin Lineweaver-Burk)
V
0
V
max
[S]

V
max

Ecuacin Lineweaver-Burk

y = mx + c 1 k
m
1 1
---------- = ------ ------ + ------
V
0
V
max
[S]

V
max

Variables: y = 1/ V
0
, x = 1 / [S]
Constante: c = 1 /

V
max

Pendiente: m = k
m
/

V
max

DETERMINACIN DE Vmax
Representacin recproca doble
(Lineweaver - Burk)
1/s
-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6
1/v
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
1 1 1
v
K
V s V
m
mx mx

-1/K
m

1/V
max

Representacin s -s/v
(Eadie - Hofstee)
s
-20 0 20 40 60 80 100 120
s/v
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
s
v V
s
K
V
mx
m
mx

1
-K
m

Representacin v/s - v
(Wong - Hanes)
v/s
0 2 4 6 8 10 12 14 16
v
0
20
40
60
80
100
v K
v
s
V
m mx

V
max

Km DE ALGUNAS ENZIMAS
Beta- galactosidasa xx
Sustrato
Km (mM)

Lactosa 2,10
ONPG 0, 03
Lactitol

20,00
Lactulosa 40,00

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