La Ciencia Del Diagnostico Del Laboratorio

La ciencia
del diagnstico
de laboratorio
Segunda edicin
La ciencia
del diagnstico
de laboratorio
Segunda edicin
John Crocker
Department of Cellular Pathology,
Birmingham Heartlands Hospital,
Bordesley Green East, Birmingham, UK
David Burnett
Micropathology, LTD
University of Warwick Science Park
Sir William Lyons Road
Coventry CV4 7EZ, UK
Traduccin:
QFB Carina Amador Vzquez
Revisin tcnica:
Dr. Cs. Ismael Vsquez Moctezuma
MXICO BOGOT BUENOS AIRES CARACAS GUATEMALA LISBOA
MADRID NUEVA YORK SAN JUAN SANTIAGO SAO PAULO
AUCKLAND LONDRES MILN MONTREAL NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO SINGAPUR ST. LOUIS SYDNEY TORONTO
LA CIENCIA DEL DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra,
por cualquier medio, sin la autorizacin escrita del editor.
DERECHOS RESERVADOS 2007 respecto a la primera edicin en espaol por
McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES. S.A.DE C.V.
A Subsidiary of The McGraw-Hill Companies. Inc.
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Piso 17, Colonia Desarrollo Santa Fe,
Delegacin lvaro Obregn
C.P. 01376, Mxico, D.F.
Miembro de la Cmara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. Nm. 736
ISBN-13: 978-970-10-6200-5
ISBN-10: 970-10-6200-0
Translated from the Second English edition of
The science of laboratory diagnosis
By: John Crocker and David Burnett
Copyright 2005 by: John Wiley & Sons, Ltd.
The Atrium, Southern Gate, Chichester,
West Sussex PO 19 8SQ England
All rights reserved
ISBN (original): 0-470-85912-1
1234567890 09865432107
Impreso en Mxico Printed in Mexico
Director Editorial: Marco Antonio Tovar Sosa
Editor Sponsor: Fausto Acosta Garca
Editor de desarrollo: Camilo Heras Martnez
Supervisor de produccin: Olga Snchez Navarrete
Diseo de portada: Utopa visual
NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se
requerirn cambios de la teraputica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que
los cuadros de dosicacin medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la
fecha de publicacin. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina,
ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparacin de la obra ga-
rantizan que la informacin contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables
de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha informacin se obtengan. Convendra
recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habr que consultar la hoja
informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la informacin de
esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contra-
indicaciones para su administracin. Esto es de particular importancia con respecto a frmacos
nuevos o de uso no frecuente. Tambin deber consultarse a los laboratorios para recabar infor-
macin sobre los valores normales.
A nuestras familias con amor
Faith is a ne invention
When Gentlemen can see
But microscopes are prudent
In an Emergency
Emily Dickinson
Contenido
Prefacio a la primera edicin xv
Prefacio a la segunda edicin xvii
Lista de colaboradores xix
SECCIN 1 HISTOPATOLOGA 1
Editor de seccin John Crocker
1 Manipulacin y preparacin de la muestra
para el diagnstico histopatolgico
de rutina 3
P.J. Smith y J.L. Wareld
Introduccin 3
Sistemas para manipular la muestra 4
Recepcin y manipulacin de la muestra 4
Fijacin y descalcicacin 5
Preparacin e inclusin del tejido 7
Microtoma 11
Tcnicas especiales 13
Lectura adicional 15
Reconocimientos 15
2 Tinciones generales 17
Barrie Sims
Por qu la tincin? 17
Mecanismos bsicos de tincin 17
Mtodos comunes de tincin 20
Conclusiones 25
Lecturas adicionales 25
Agradecimientos 25
3 Histoqumica de la enzima 27
Trevor Gray y Neil Hand
Introduccin 27
Estructura y clasicacin 27
Conservacin y preparacin 28
Tcnicas histoqumicas 29
Aplicaciones diagnsticas de la histoqumica
enzimtica 31
Conclusin 34
Referencias 34
4 Inmunohistoqumica 35
Jane Starczynski y John Crocker
Introduccin 35
Mtodos directos 35
Mtodos indirectos 35
Mtodos de mltiples etapas 35
Aplicaciones de la inmunohistoqumica 41
Control de calidad 41
Automatizacin 41
Proyeccin de imagen 41
5 Microscopia electrnica en patologa 43
Brian Eyden
Introduccin
Principios de la tcnica y de la organizacin de la ME 44
Aplicaciones de la microscopia electrnica
de transmisin 48
Tcnicas y procedimientos especializados 54
Resumen 59
Reconocimientos 59
Bibliografa 60
6 Microscopia de luz 61
Brian Boullier
Introduccin 61
Diseo bsico del microscopio 61
Tipos de microscopia 63
Micrografa 66
7 Mtodos cuantitativos en la patologa
tisular 69
Peter W Hamilton y Derek C Allen
Introduccin 69
Mtodos 69
Aplicaciones de la medicin en la patologa
diagnstica 75
Automatizacin en histologa 79
Conclusin 81
8 Marcadores de la proliferacin
en histopatologa 83
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes
Introduccin 83
Marcadores de proliferacin 83
Uso prctico de marcadores 88
Mtodo de evaluacin 89
Conclusin 92
SECCIN 2 CITOLOGA 93
Editor de seccin Adrian T Warfield
9 Citopatologa 95
Adrian T Wareld
Introduccin 95
Tipos de muestra citolgica 95
Tcnicas para la preparacin de frotis 99
Fijacin de la muestra 99
Tcnicas de concentracin celular 99
Mtodos de tincin 103
Citodiagnstico 104
Citomorfologa 105
Exactitud y limitaciones de la citologa 112
Citopatologa ginecolgica y exploracin cervical 113
Aseguramiento de la calidad en la citologa
diagnstica 119
SECCIN 3
MICROBIOLOGA - BACTERIOLOGA 121
Editor de seccin Darrel Ho-Yen
10 Microscopia en bacteriologa:
aplicacin y preparacin de la muestra 123
Dugald R Baird
Introduccin 123
Microscopia de luz 123
Microscopia de uorescencia 123
Muestras para microscopia 124
Examen de muestras sin teir por
transmisin de luz 124
Examen de muestras sin teir mediante
iluminacin de fondo oscuro 125
Tincin de las muestras 125
11 Medios de cultivo en bacteriologa 129
Eric Y Bridson
Medios de cultivo en microbiologa 129
Formulacin de los medios de cultivo 130
Enriquecimiento y seleccin en medios uidos 131
Medios de cultivo qumicamente denidos
medios complejos indenidos 131
Factores ambientales de crecimiento 132
Actividad del agua (a
w
) 132
Almacenaje de los medios de cultivo 132
Pruebas de calidad 133
El futuro de los medios de cultivo 134
Microbiologa cuntica 134
12 Identicacin de bacterias 135
Andrew J Hay
Introduccin 135
Identicacin directa 135
Identicacin despus del cultivo 136
Identicacin de bacterias de importancia mdica 140
13 Pruebas automatizadas en bacteriologa 145
Paul C Boreland
Introduccin 145
Sistemas de cultivo sanguneo 145
Comprobacin de la sensibilidad antimicrobiana
y sistemas de identicacin 146
Sistemas de examen de la orina 148
Sistemas de identicacin y
sensibilidad antimicrobiana para micobacterias 149
Comentario 150
14 Tcnicas de bacteriologa molecular:
preparacin y aplicacin de la muestra 151
Richard E Holliman y Julie D Johnson
Necesidad de mtodos moleculares 151
Preparacin de la muestra 151
Amplicacin 152
Prctica actual 153
Epidemiologa y tipicacin 156
Problemas con los mtodos moleculares 156
Aplicacin futura 157
15 Otras pruebas en bacteriologa 159
Darrel Ho-Yen
Introduccin 159
Pruebas para el anticuerpo 159
Pruebas para el antgeno 162
Prueba del complejo inmunitario especco
del antgeno 162
Otras pruebas 163
Desarrollos futuros 164
16 Control de la quimioterapia
antimicrobiana 165
Ian M Gould
Introduccin 165
Principios generales del control del laboratorio
de la quimioterapia 167
Comprobacin de la sensibilidad 168
viii CONTENIDO
Automatizacin 169
Control del hospital y enlace clnico 170
Conclusin 171
SECCIN 4 MICROBIOLOGA, VIROLOGA,
MICOLOGA Y PARASITOLOGA 173
Editor de seccin Darle Ho-yen
17 Microscopia en virologa: aplicacin
y preparacin de la muestra 175
Marie M Ogilvie
Introduccin 175
Histopatologa: cuerpos de inclusin y clulas
multinucleadas gigantes 175
Virologa 176
Inmunouorescencia 177
Examen microscpico de los cultivos celulares 178
Desarrollos 180
Reconocimientos 180
18 Microscopia electrnica en virologa 181
Hazel Appleton
Introduccin 181
Mtodos 181
Usos de la microscopia electrnica 182
Laboratorio de virologa 187
Reaccin rpida de urgencia 187
Virus de nueva aparacin 188
Conclusiones 188
19 Cultivo tisular 191
William L Irving y Alan Pawley
Introduccin 191
Seleccin de los cultivos celulares 191
Preparacin de cultivos celulares 192
Especmenes clnicos para el aislamiento de virus 193
Identicacin del crecimiento vrico 193
Conclusiones 196
20 Pruebas serolgicas en virologa 197
Goura Kudesia
Introduccin 197
Principios 197
Tcnicas 198
Interpretacin y uso de las pruebas serolgicas 203
Futuro de la serologa 204
21 Pruebas automatizadas en virologa 207
Roger P Eglin
Introduccin 207
Automatizacin en el laboratorio
de diagnstico 209
Debe automatizarse el Laboratorio? 210
Otros desarrollos en la automatizacin 212
Conclusiones 212
22 Tcnicas moleculares en virologa 213
Paul E Klapper
Introduccin 213
Tcnicas de amplicacin del cido nucleico 213
Anlisis de la secuencia 220
Resumen 222
23 Virologa: otras pruebas 225
Alex WL Joss
Deteccin de la enfermedad por prion 225
Diagnstico 227
Pruebas de susceptibilidad antivrica 228
Inmunidad mediada por clulas 231
24 Micologa 233
David W Warnock
Introduccin 233
Examen microscpico 234
Cultivo 235
Identicacin 236
Pruebas serolgicas 237
Nuevas direcciones en el diagnstico 238
25 Parasitologa 239
Robert WA Girdwood
Introduccin 239
Microscopia 239
Montajes hmedos 240
Extendidos y frotis 240
Histopatologa 241
Fluorescencia 241
Microscopia electrnica 241
Cultivo 242
Infeccin animal 242
Xenodiagnstico 242
Serologa 243
Mtodos moleculares 243
CONTENIDO ix
SECCIN 5 HEMATOLOGA 245
Editor de seccin Peter E Rose
26 Morfologa de las clulas sanguneas
y de la mdula sea 247
Supratik Basu
Morfologa de la sangre perifrica 247
Examen y morfologa de la mdula sea 249
Clulas no hematopoyticas y parsitos en sangre
y mdula sea 263
27 Principios de los contadores
automatizados de clulas sanguneas 265
Graham Martin
Introduccin 265
Medicin de la Hb 265
Mediciones de los eritrocitos 265
Medicin de los reticulocitos y RBC nucleados 267
Eritrocitos nucleados 268
Mediciones de los leucocitos 269
28 Mtodos para la identicacin
de hemoglobinopatas 273
Nick Jackson y Anne Sermon
Introduccin 273
Tcnicas de tamizaje 273
Diagnstico de laboratorio de hemoglobinopatas
y de talasemias 274
Deteccin, identicacin y cuanticacin
de hemoglobinopatas 274
Agradecimientos 279
29 Investigaciones especiales del factor
von Willebrand 281
Mohammad S. Enayat
Introduccin 281
Pruebas fenotpicas 282
Pruebas genotpicas para identicar la mutacin 285
30 Anlisis de plaquetas 289
Steven Walton y Peter E Rose
Introduccin 289
Estructura y funcin 289
Conteo plaquetario 290
Anticuerpos plaquetarios 291
Tiempo de sangrado 291
Adherencia plaquetaria 291
Investigaciones de la agregacin plaquetaria 291
Analizador PFA-100 para la funcin plaquetaria 292
Investigaciones sobre la liberacin plaquetaria 292
Citometra de ujo 292
Tromboelastograma 293
31 Servicio transfunsional del hospital 295
Identicacin del grupo sanguneo 295
Mtodos para identicar el grupo sanguneo 296
Tamizaje de anticuerpos 297
Compatibilidad cruzada 300
Prctica de la transfusin 301
32 Citometra de ujo y biologa molecular
en la hematologa 303
Ian Chant
Introduccin 303
Citometra de ujo e inmunofenotipicacin 304
Valoracin de la funcin plaquetaria por citometra
de ujo 307
Biologa molecular en la hematologa 307
Resumen 310
33 Investigaciones hemticas 313
Frank Wells
Cobalamina (vitamina B
12
) y folato 313
Hierro 317
Resumen 322
34 Investigacin del laboratorio
de la hemlisis 323
Paul Revell
Introduccin 323
Caractersticas clnicas 323
Desrdenes hemolticos 326
Segmento nal 332
35 Investigaciones de laboratorio
de la hemostasis 333
Peter E Rose y Catherine Caveen
Introduccin 333
Tiempo de protrombina 333
Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) 335
Tiempo de trombina 337
Tiempo de reptilasa 338
x CONTENIDO
Fibringeno 338
Ensayos del D-dmero y de los FDP 339
Ensayos del factor 339
Marcadores de la coagulacin activada 340
Evaluacin automatizada de la coagulacin 341
Lectura adicional 341
SECCIN 6 CITOGENTICA 343
Editor de seccin Brian Boullier
36 Bandeo y anlisis cromosmico 345
Mervyn Humphreys
Introduccin 345
Bandeo cromosmico 345
Anlisis cromosmico 352
37 Hibridizacin in situ
uorescente 357
Ivor Hickey
Eleccin de la sonda 357
Marcacin de las sondas 357
Hibridacin 358
Deteccin de la sonda hibridada 358
Aplicaciones en la investigacin bsica 358
Aplicaciones en la gentica mdica 360
Aplicaciones en el diagnstico e investigacin
del cncer 361
SECCIN 7 QUMICA CLNICA 363
Editor de seccin William J Marshall
38 Adquisicin, aplicaciones
e interpretacin de los datos
bioqumicos clnicos 365
William J Marshall
Introduccin 365
Recoleccin y anlisis de la muestra 366
Interpretacin de los datos de laboratorio 367
Bioqumica clnica basada en evidencia 371
Conclusin 371
39 Inmunoensayo en bioqumica
clnica 373
Joan Butler y Susan M Chambers
Introduccin 373
Diseo del ensayo 373
Condiciones del ensayo y calibradores 374
Marcadores 375
Ensayos homogneos 376
Mtodos de separacin 376
Automatizacin 377
Miniaturizacin 377
Clculo de los resultados 377
Exactitud y precisin 378
Especicidad, reactividad cruzada e interferencia 379
Efecto de gancho por dosis alta 380
40 Electrodos ion-selectivos 381
Alan D Hirst
Introduccin 381
Teora 381
Especicidad: cmo los electrodos se hacen
selectivos 384
Reacciones electroqumicas 386
Electrodos de glucosa 389
Detectores electroqumicos 390
Electrodos complejos 390
Otros electrodos complejos mediados
por las enzimas 391
Comprobacin en los puntos de cuidado (POCT) 392
Respaldo 393
Reconocimientos 394
41 Absorcin de la luz, dispersin
y tcnicas de luminiscencia
en bioqumica clnica rutinaria 395
Bernard F Rocks
Introduccin 395
Tcnicas de absorcin de la luz 395
Turbidimetra y nefelometra 397
Luminescencia 399
42 Espectrometra atmica analtica 405
Andrew Taylor
Introduccin 405
Principios 405
Instrumentacin 407
Aplicaciones 413
Aseguramiento de la calidad 414
Conclusiones 414
Referencias 415
43 Tcnicas qumicas del reactivo seco 417
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand
Introduccin 417
Principios de la metodologa 418
CONTENIDO xi
Ejemplos especcos 419
Control de calidad de la qumica del reactivo seco 423
Resumen 427
44 Tcnicas de separacin 429
Roy Sherwood
Por qu separar? 429
Cromatografa 429
Cromatografa de capa na (TLC) 429
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) 431
Cromatografa de gases (GC) 433
Electroforesis 434
SECCIN 8 INMUNOLOGA 437
Editor de Seccin David Burnett
45 Ensayos proteicos 439
David Burnett
Introduccin 439
Una breve perspectiva histrica 439
Tcnicas cualitativas 440
Mtodos cuantitativos 443
Conclusin 446
Reconocimientos 446
46 Ensayos del complemento 447
J North y K Whaley
Introduccin 447
Ensayos de los niveles sricos del complemento 449
47 Inmunologa celular 455
Aarnoud Huissoon
Introduccin 455
Pruebas cuantitativas y cualitativas 455
Estudios funcionales 459
El futuro de la inmunologa celular 463
48 Enfermedades del complejo
inmunitario y crioglobulinas 465
Siraj A Misbah
Introduccin 465
Ensayos para los complejos inmunitarios circulantes 466
Enfermedad srica 467
Lupus eritematoso sistmico 468
Crioglobulinemia 477
Lecturas complementarias 480
49 Tipicacin de HLA 481
Mark Hathaway
Introduction 481
Estructura y funcin de HLA 481
Gentica del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) 482
La mecnica de tipicacin HLA 482
Tipicacin molecular 483
Resumen 486
SECCIN 9 PATOLOGA MOLECULAR 487
Editor de seccin John OLeary
50 Microdiseccin por lser y captura
de tejido 489
Orla Sheils, Paul Smyth, Esther ORegan,
Stephen Finn, Richard Flavin y John OLeary
LCM-PixCell y AutoPix de Arcturus 489
Microdiseccin con microrrayo lser 492
Leica AS LMD 493
51 Anlisis del gen por reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) en tiempo real 495
Cara M Martin, Orla Sheils y John O Leary
Introduccin 495
Qumica de la reaccin en cadena de la
polimerasa en tiempo real 495
Qumica de la TaqMan de PCR (ensayo de la
5nucleasa) 496
Sondas TaqMan de unin al surco menor del DNA 498
Iniciador TaqMan y diseo de la sonda 498
Deteccin del amplicn 499
Deteccin por TaqMan en tiempo real 500
Cuanticacin absoluta 500
Cuanticacin relativa 500
Genes housekeeping 500
Aplicaciones de TaqMan PCR en patologa 501
Referencias 504
52 Reaccin en cadena de la polimerasa
en la clula 505
John OLeary, Cara M Martin y Orla Sheils
Introduccin 505
Visin general de la metodologa 505
Tecnologas de PCR celular: deniciones 506
Amplicacin del DNA en la clula 508
Deteccin de los amplicones 510
Reaccin de amplicacin, controles y deteccin
en el tejido para uso en ensayos de PCR DNA
en la clula 510
Amplicacin del RNA en la clula 511
Problemas de la amplicacin por PCR en la clula 511
xii CONTENIDO
Trabajo futuro con los ensayos basados en la PCR
en la clula 513
Referencias 513
53 Anlisis de SNP de alta densidad
y de arreglos de cDNA 515
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth,
Jon Sherlock, Stephen Finn, Esther ORegan,
Steve Picton y John OLeary
Introduccin 515
Tecnologa Affymetrix GeneChip 515
Perl de SNP y matrices de DNA 517
Sistema de expresin con microarreglo de Applied
Biosystems 517
Ilumina, microarreglo de ordenamientos 519
Manejo de datos y anlisis secundario 521
Referencias 521
54 Anlisis por microarreglo de la
hibridacin genmica comparativa
de los tejidos humanos 523
Esther ORegan, Paul Smyth, Stephen Finn,
Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Antecedentes de hibridacin genmica comparativa
(CGH) y de su microarreglo 523
Apreciacin global de hibridacin genmica
comparativa 524
Aplicaciones clnicas 525
Microarreglos 525
Conclusin 528
Referencias 528
55 Secuenciacin de cidos
desoxirribonucleicos 531
Cara M Martin, Steven J Picton,
Orla Sheils y John OLeary
Introduccin 531
Historia de la secuenciacin del cido
desoxirribonucleico 531
Secuenciacin qumica del cido
desoxirribonucleico 532
El mtodo dideoxi de secuenciacin del DNA 532
Secuenciacin automatizada 534
Proyecto del Genoma Humano 536
reas que avanzan en la secuenciacin
de los cidos nucleicos 537
Referencias 538
ndice alfabtico 539
CONTENIDO xiii
bookmedico.blogspot.com
Prefacio a la primera edicin
Tanto nosotros como nuestros colegas hemos encontrado
en nuestra experiencia de muchos aos que las personas de
todos los niveles que trabajan en nuestros laboratorios no
tienen experiencia en algunos aspectos. Nos hemos dado
cuenta que existe la necesidad de un libro que una todas
las disciplinas de la patologa, el cual pueda explicar los
porqu y para qu de la medicina de laboratorio. Debemos
enfatizar que este material no intenta ser un libro de re-
cetas; nuestro objetivo es mucho mayor que explicar los
principios bsicos de las tcnicas de laboratorio y la inter-
pretacin de los resultados que se obtienen de ellos. Hemos
tratado de asegurar que este libro lo puedan utilizar varios
tipos de lectores. Estos podran incluir estudiantes, patlo-
gos, cirujanos y mdicos, as como tcnicos de laboratorio.
Los contenidos son multidisciplinarios y existe coinciden-
cia entre algunos captulos y secciones. Esto es intenciona-
do y reeja el estado verdadero de la patologa moderna.
Sentimos que es importante que los patlogos de cada sub-
especialidad muestren ms inters por la actividad de sus
colegas de laboratorio. Este libro tiene la intencin de pre-
sentar los mtodos ms comunes y sus avances ms recien-
tes. Otra vez se enfatiza que la unin entre la patologa y la
medicina de laboratorio es forzada aunque con frecuencia
conveniente. Sin embargo, esperamos que los profesiona-
les de una especialidad lean otras secciones. Por ejemplo,
para trabajar el campo de los linfomas, los histopatlogos
necesitan entender bien la hematologa y la microbiologa.
Lo anterior, por supuesto, interviene en el tratamiento del
linfoma en los pacientes, como la microbiologa cuando se
presentan infecciones oportunistas despus de la quimiote-
rapia. Adems, los qumicos necesitan relacionar sus descu-
brimientos a los procesos hematolgicos.
Otra caracterstica de este libro es que en algunas partes,
existen coincidencias entre captulos y secciones; esto es
completamente intencional y reeja una vez ms el esta-
do actual del laboratorio clnico. As, la aplicacin, con-
textos e interpretacin de varios mtodos inevitablemente
sern diferentes dependiendo de la disciplina. El lector ser
avisado de esta particularidad en las secciones cubriendo
temas como la microscopia de electrones y tcnicas mo-
leculares, que son metodologas que forman parte de mane-
ra extensa de diferentes disciplinas. Es ms, los problemas
de comunicacin producen un efecto de deterioro evitable
en los avances de metodologas de uso comn y de in-
vestigacin. En nuestro conocimiento este libro es nico
y esperamos que d los elementos a mucha gente capaci-
tada o en capacitacin en medicina de laboratorio no slo
en su propio campo sino tambin en otros. La mayora de
los captulos incluye una lista de las principales referencias
aunque en algunos casos lo hemos credo innnecesario;
adems, algunos captulos tienen una lista de referencias
grande que puede reejar su complejidad o su contenido
de gran alcance. Por supuesto, deseamos expresar nuestra
garatitud a todos nuestros editores de seccin y los autores
de los captulos. Naturalmente, tambin estamos en deuda
con nuestro editor John Harrison y su equipo. Extende-
mos nuestro agradecimiento a Ruth Fry, Vivien Garland y
Valerie Grifths por su ayuda en la asistencia y respuesta a
las interminables llamadas telefnicas.
John Crocker
David Burnett
John Crocker (1952-2004)
John Crocker demostr en su relativa corta vida un conocimiento agudo y un profundo in-
ters en la ciencia de muchas formas. Fue premiado en el Kings College, Cambridge, a
la edad de 16 aos. Despus, estudi medicina. Su primer libro, de cerca de 250 pginas,
lo realiz en su tercer ao en Cambridge, los resultados de su tesis de patologa. Ah fue en
donde John conoci a su pareja de toda la vida y esposa, Kate. Despus de su examen, John
decidi estudiar patologa. Su primer puesto fue en el East Birmingham Hospital (ahora el
Birmingham Heartlands Hospital), del cual regres como colaborador despus de siete aos
en el Departamento de Patologa en la University of Birmingham, durante los cuales obtuvo
su M.D. Fue ah donde desarroll su inters por la investigacin de linfomas.
John disfrutaba su trabajo en el Departamento de Histopatologa en el Heartlands Hospital,
especialmente gracias a su buena relacin con sus colaboradores. A pesar de haber contri-
buido al diagnstico usual, servicios de enseanza y administrativos del departamento, John
trat de mantener una carrera activa de investigador, colaborando con otros patlogos y cien-
tcos, especialmente de las universidades de Warwick, Birmingham y Wolverhampton; sus
dos ltimas ctedras. Con Jane Starczynski y sus colaboradores, desarroll tcnicas nicas
en la disciplina. Sus aportaciones a la patologa fueron reconocidas en un evento de admisin
poco usual, en 1995, como miembro honorario del Royal College of Physicians. Con gran
inters que inclua astronoma, msica, literatura contempornea, biologa marina, compu-
tacin, arte, fotografa, qumica y geologa, es claro que John fue polifactico. Su naturaleza
eclctica fue parte de su trabajo y sus creencias que los patlogos de todas las disciplinas
tienen mucho que aprender del otro, y efectivamente, de otras disciplinas cientcas, fue el
lsofo detrs del libro que tiene en sus manos. Por desgracia, John muri antes de que su
segunda edicin se publicara. Todos sus familiares, amigos y colegas lo recordaremos no
slo como un cientco extremadamente inteligente y entusiasta, sino tambin como un hom-
bre jovial y bondadoso con un profundo sentido de compasin. Deseo dedicar este segunda
edicin a su memoria.
David Burnett, marzo 2005
Prefacio a la segunda edicin
Han pasado seis aos desde la primera edicin de este libro
y actualmente tenemos un nuevo editor, John Wiley & Sons,
que convino que era oportuno poner al da este volumen.
Los autores siempre estn entusiasmados de tener la
oportunidad de mejorar lo que escribieron y esto se reeja
aqu. Tambin es la oportunidad de actualizar ciertas reas
debido al rpido desarrollo en esos campos, aunque, inevi-
tablemente, hay algunos captulos a los que se les ha cam-
biado el ttulo. Algunos captulos ahora tienen nuevo autor
o incluyen otros. Las razones son varias. En algunos casos,
los autores han recibido apoyo de nuevos colaboradores y
otros se han retirado desde la publicacin de la primera edi-
cin. De forma trgica, un autor, Graeme Bird, muri. No
obstante, la esencia del libro contina, aunque el estilo ha
cambiado inevitablemente a consideracin de los editores
actuales, quienes quieren agradecer todo su apoyo, espe-
cialmente al Dr. Joan Marsh. Tambin queremos agradecer
a Ruth Fry por su asistencia.
John Crocker
David Burnett
Lista de colaboradores
Derek C Allen Histopathology Laboratory, Belfast City
Hospital, Belfast BT9 7AD, UK
Hazel Appleton Health Protection Agency, Specialist
and Reference Microbiology Division, 61 Colindale Ave-
nue, London NW9 5TH, UK
Dugald R Baird Formerly Department of Microbio-
logy, Lanarkshire Acute Hospitals NHS Trust, Hairmyres
Hospital, Eaglesham Road, East Kilbride G75 8RG,
UK
Diana M Barnes Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory Guys Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Supratik Basu Pathology Laboratory, Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
Paul C Boreland Microbiology Department, Ulster Hos-
pital, Dundonald, Beifast BT16 1RH
Brian Boullier Illuminate Communications, The Bea-
cons, Leeds Road, Lightcliffe, Halifax HX3 8NU, UK
Eric Y Bridson Formerly Oxoid Ltd, 3 Bellever Hill,
Camberley, Surrey BU15 2HB, UK
David Burnett Micropathology Ltd. University of
Warwick Science Park, Sir William Lyons Road, Coventry
CV4 7EZ, UK
Joan Butler Honorary Lecturer, Guys, Kings and St.
Thomass School of Medicine, London
Catherine Caveen Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
G S Challand Department of Clinical Biochemistry,
Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1 5AN,
UK
Susan M Chambers Department of Clinical Biochem-
istry, Kings College Hospital, Denmark Hill, London SE5
9RS, UK
Ian Chant Department of Heamatology, Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
John Crocker Department of Cellular Pathology, Bir-
mingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East,
Birmingham B9 5SS, UK
Roger P Eglin National Transfusion Microbiology La-
boratories National Blood Service, Colindale Ave Colin-
dale, London NW95BG
Mohammad S Enayat Molecular Heamostasis La-
boratory, Birmingham Childrens Hospital NHS Trust,
Ladywood, Birmingham B16 8ET, UK
Brian Eyden Department of Histopathology, Christie
Hospital NHS Trust, Manchester M20 4BX, UK
Stephen Finn Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Richard Flavin Department of Histopathology, Trinity
College, Dublin, Dublin, Ireland
Cheryl E Gillett Hedley Atkins/Cancer Research UK
Breast Pathology Laboratory, Guys Hospital, St. Thomas
Street, London SE1 9RT, UK
Robert WA Girdwood formerly Scottish Parasite Diag-
nostic Laboratory, Stobhill Hospital, Balornack Road,
Glasgow, G21 3UW
Ian M Gould Department of Medical Microbiology,
Medical School, Foresterhill, Aberdeen AB9 2ZB, UK
Trevor Gray Histopathology Department, Queens Me-
dical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Peter W Hamilton Department of Pathology, The
Queens University of Belfast, Grosvenor Road, Belfast
BT12 6BL, UK
Neil Hand Histopathology Department, Queens Medi-
cal Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham
NG7 2UH, UK
Mark Hathaway National Blood Service, Vincent Drive,
Selly Oak, Birmingham B15 2SG, UK
Andrew J Hay Department of Microbiology, Raigmore
Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2 6DJ, UK
xx LISTA DE COLABORADORES
Ivor Hickey School of Biology and Biochemistry, Medi-
cal Biology Centre, Queens University Belfast, 97 Lisburn
Road, Belfast BT9 7BL, UK
Alan D Hirst Department of Biochemistry, Bradford
Royal Inrmary, Duckworth Lane, Bradford BD9 6RJ,
UK
Richard E Holliman Department of Medical Micro-
biology, St. Georges Hospital and Medical School,
Blackshaw Road, London SW17 0QT, UK
Darrel Ho-Yen Department of Microbiology,
Raigmore Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2
6DJ, UK
AP Huissoon Regional Immunology Department, Bir-
Mervyn Humphries Northern Ireland Regional Gene-
tics Centre, Leukaemia Cytogenetics Laboratory, Floor A,
Belfast City Hospital, Tower Block, Lisburn Road, Belfast
BT9 7AB, UK
William L Irving Department of Virology, University of
Nottingham, Nottingham, UK
Nick Jackson Department of Heamotology, University
Hospital Coventry and Warwickshire NHS Trust, Clifford
Bridge Road, Coventry, UK
Julie D Johnson Department of Medical Microbiolo-
gy, St. Georges Hospital and Medical School, Blackshaw
Road, London SW17 0QT, UK
Alex WL Joss Microbiology Department Raigmore
Hospital NHS Trust, Perth Road, Inverness IV2 3UJ,
UK
Paul E Klapper Department of Virology, Health Pro-
tection Agency, Leeds Laboratory, Bridle Path, York Road,
Leeds LS15 7TR, UK
Goura Kudesia Department of Virology, Northern
General Hospital NHS Trust, Herries Road, Shefeld S5
7BQ, UK
William J Marshall Consultant Clinical Biochemist,
The London clinic, 20 Devonshire Place, London W79
6BW
Cara M Martin Department of Histopathology, Trinity
College Dublin, Dublin, Ireland
Graham Martin Heamotology Department, Glouces-
ter Hospitals NHS Trust, Great Westerm Road, Gloucester
GL1 3NN
Siraj A Misbah Department of Immunology, Churchill
Hospital, Old Road, Headington, Oxford OX3 7LJ, UK
Jonathan North Department of Immunology, City Hos-
pital, Dudley Road, Birmingham B18 7QH, UK
Marie M Ogilvie Division of Medical Microbiology,
College of Medicine and Veterinary Medicine, University
of Edinburgh, Edinburgh, UK
John OLeary Department of Pathology, The
Coombre Womens Hospital Dublin, Ireland; and Depar-
tment of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin,
Ireland
Esther ORegan Department of Histopathology, Trinity
College Dublin, Dublin, Ireland
Jacqueline C Osipiw Department of Clinical Bioche-
mistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1
5AN, UK
Alan Pawley Virology Laboratory, Queens Medical
Centre Trust, Nottingham, UK
Steven J Picton Affymetrix UK Ltd, Wooburn Green,
Hight Wycombe HP10 0HH, UK
Paul Revell Department of Haematology, Stafford-
shire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
Bernard F Rocks Department of Clinical Pathology,
Royal Sussex County Hospital, Brighton, Sussex BN2
5BE, UK
Peter E Rose Department of Haematology, Pathology
Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34
5BJ, UK
Jessica Schroeder Department of Clinical Biochemis-
try, Royal Berkshire Hospital, Reading, RG1 5AN
Anne Sermon Department of Haematology, Notting-
ham City Hospital, Hucknall Road, Nottingham NG5
1PB, UK
Orla Sheils Department of Histopathology, Trinity Co-
llege Dublin, Dublin, Ireland
Jon Sherlock Applied Biosystems, Applera, UK
Roy A Sherwood Department of Clinical Biochemis-
try, Kings College School of Medicine and Dentistry,
Bessemer Road, London SE5 9PJ, UK
Barrie Sims Department of Histopathology, Stafford-
shire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16
3SA, UK
LISTA DE COLABORADORES xxi
Paul J Smith Department of Cellular Pathology, Bir-
Paul Smyth Department of Histopathology, Trinity Co-
llege Dublin, Dublin, Ireland
Jane Starczynski Department of Cellular Pathology,
Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
Andrew Taylor Trace Element Laboratory, School of
Biological Sciences, University of Surrey, Guildford, Su-
rrey GU2 5XH, and Clinical Laboratory, Royal Surrey
County Hospital, Guildford Surrey GU2 5XX, UK
Steven Walton Department of Haematology, Warwick
Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK
Adrian T Wareld Department of Histopathology,
Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green
East, Birmingham B9 5SS, UK
Janine L Wareld Birmingham Heartlands Hospital,
Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK
David W Warnock Division of Bacterial and Mycotic
Diseases, National Center for Infectious Diseases, Center
for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333,
USA
Frank Wells Biochemistry Department Warwick Hospi-
tal, Lakin Road, Warwick, CV34 5BJ
Keith Whaley Department of Immunology, Leicester
Royal Inrmary, Leicester LE1 5WW, UK
SECCIN 1
HISTOPATOLOGA
Introduccin
La histopatologa diagnstica es una especialidad que, in-
cluso hoy en da, no ha dejado de ser una labor en particu-
lar intensa, sobre todo si se considera que en esta rea el
desarrollo de la tecnologa automatizada ha sido discreto
y an toman tiempo sus procedimientos. Las mquinas que
procesan y tien cortes, como parte integral de cualquier
laboratorio de histologa comn, son cada vez ms com-
plejas en trminos de su aplicacin y contribucin a un am-
biente de salud y seguridad. El registro manual de casetes
para procesar tejidos y el portaobjetos del microscopio se
ha vuelto en poco tiempo obsoleto desde la introduccin
de sistemas de transcripcin independientes conectados a
una computadora. Los sellos hermticos y automatizados
tambin son comunes en muchos laboratorios y hacen po-
sible minimizar la exposicin del personal a los solventes
orgnicos; en consecuencia, los laboratoristas pueden con-
centrarse en las tareas manuales del departamento y no en
las labores de montaje.
El moderno laboratorio de histopatologa, aunque se ha
beneciado en cierto grado con la automatizacin y el con-
tinuo desarrollo de mejoras del equipo estndar, es todava
un rea sensible a las cargas de trabajo. La posibilidad de
renovacin se relaciona de manera directa, primero, con
la capacidad de procesamiento y, segundo, con el personal
disponible para realizar las tareas requeridas para obtener
los cortes histopatolgicos teidos necesarios para el exa-
men microscpico subsiguiente y el diagnstico patol-
gico. Muchos laboratorios modernos han experimentado
aumentos notables de la carga de trabajo en los ltimos
aos, como resultado de nuevos lineamientos y fusiones,
sin un aumento correspondiente de la contratacin de per-
sonal. De manera inevitable, estos laboratorios han mejo-
rado sus metodologas y tcnicas para no sucumbir a las
exigencias del alto rendimiento y proporcionar un servicio
de calidad eciente.
La intencin de este captulo es proporcionar una si-
nopsis de la preparacin de tejidos en el moderno laborato-
rio de histopatologa, con nfasis en la eciencia y calidad
del servicio. Rebasa los lmites de este estudio explicar, en
cualquier grado, la qumica o los pormenores de la prepa-
racin del tejido. La descripcin debe ser suciente para
conocer de forma general las tcnicas y estandarizar la
histopatologa de rutina en el diagnstico de laboratorio.
La preparacin de las muestras de tejido para el diag-
nstico se analiza bajo los siguientes ttulos:
1. Sistemas de control de la muestra.
2. Recepcin y manipulacin de la muestra.
3. Fijacin y descalcicacin.
4. Procesamiento e impregnado.
5. Microtoma.
6. Tcnicas especiales.
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker,
2005 John Wiley & Sons, Ltd.
1
Manipulacin y preparacin de la muestra
para el diagnstico histopatolgico de rutina
PJ Smith y JL Wareld
4 CAP. 1 MANIPULACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNSTICO HISTOPATOLGICO DE RUTINA
Sistemas para manipular la muestra
La mayor parte de los laboratorios modernos de histopa-
tologa tiene su propia tecnologa de informacin depar-
tamental para almacenar y obtener los datos demogrcos
y muestrales del paciente. El sistema de registro manual o
computarizado del enfermo se debe situar dentro del rea de
reserva del laboratorio. Esta ubicacin debe separarse del
cuarto de corte y, en condiciones ideales, localizarse en
un ambiente de ocina, integrada al rea administrativa del
laboratorio.
Sistemas de informacin computarizados
Una de las funciones esenciales de un sistema de control
computarizado de la muestra consiste en facilitar la asig-
nacin de los identicadores especcos del hospital y de
la muestra: nmero de registro hospitalario y nmero del
laboratorio de referencia. El primero debe tener el formato
de solicitud histolgica y colocarse en la muestra de acom-
paamiento. El segundo lo asigna de manera automtica
el sistema, pero tambin es posible el procedimiento ma-
nual. El nmero del laboratorio permanece con la muestra
en todo el proceso histolgico y se transere a la forma
de solicitud, el (los) contenedor(es) de la muestra, el (los)
casete(s) del tejido, el portaobjeto(s) del microscopio y
el informe nal del diagnstico.
Los patlogos, el responsable del laboratorio, las secre-
tarias y las reas del laboratorio requieren terminales para
facilitar el ingreso y la codicacin de los informes diag-
nsticos, datos muestrales, generacin de la lista de traba-
jo, procedimientos tcnicos adicionales, seguimiento de la
muestra (fases del procedimiento), relacin especca de
tejido, y trastornos y recoleccin de datos para determinar
la carga de trabajo, las condiciones laborales y los costos.
Ingreso manual de datos
El ingreso manual de datos, mediante un libro diario qui-
rrgico, y el etiquetado de los casetes del tejido y los por-
taobjetos del microscopio tienen ms desventajas que un
sistema de laboratorio computarizado. Los sistemas ma-
nuales confan en la letra legible y clara, y la asignacin
exacta de los nmeros progresivos del laboratorio para una
persona. Los errores de transcripcin pueden ocurrir du-
rante la transferencia del nmero de laboratorio a los ca-
setes del tejido y portaobjetos del microscopio si la letra
asentada en el libro diario, o en la solicitud, es confusa.
El marcado impreciso o ilegible de los casetes del tejido
puede ocasionar que los bloques del tejido se vinculen mal
con las formas de solicitud y portaobjetos, y por lo tanto, es
posible, en el mejor de los casos, establecer un diagnstico
equvoco si dos tejidos son similares o perder un tiempo
valioso en el laboratorio mientras se resuelve la situacin.
Es esencial en todos los laboratorios, tanto si se utiliza un
sistema manual o uno computarizado, que medidas de con-
trol rigurosas garanticen la integridad del informe diag-
nstico nal.
Los sistemas manuales requieren la disposicin de un
archivo de referencia cruzada, un registro diagnstico y
amplias instalaciones para almacenar los informes y las
formas de solicitud.
La calidad de la informacin que procesa el departa-
mento de servicio depende de la solicitud o los informes
que proporcione la administracin hospitalaria (o los siste-
mas de comunicacin si es que se dispone de una red por
computadora).
Al realizar el ingreso de datos, manual o computari-
zado, las formas de solicitudes se anexan a su respectivo
contenedor(es) de la muestra y los recipientes se marcan
de modo indeleble con el nmero de laboratorio. Algunos
centros asignan el nmero de laboratorio, antes de asentar-
lo en el registro, mediante rollos preimpresos de nmeros
secuenciales autoadhesivos.
Marcadores de casete y portaobjetos automticos
Los marcadores de casete y portaobjetos estn disponibles
en el comercio y pueden utilizarlos todos los laboratorios.
Las instituciones que efectan el ingreso manual de los da-
tos confan tambin en el ingreso manual de estas mquinas,
del mismo modo que los laboratorios que tienen sistemas
informticos genricos menos comunes. Los laboratorios
con sistemas ms complejos pueden interconectarse con
estas mquinas, de tal modo que el marcado del casete y el
portaobjetos se convierte en un procedimiento automtico
ligado, por ejemplo, al registro de datos y la generacin
de la lista de trabajo, respectivamente. El advenimiento de
estas mquinas ha permitido el etiquetado preciso de ca-
setes y portaobjetos y reducido el error de transcripcin a
mrgenes mnimos (g. 1-1).
Recepcin y manipulacin de la muestra
Cuarto de corte
La estancia diseada para la prctica de los cortes debe es-
tar disponible para la recepcin y manipulacin de todas las
muestras tisulares que requieren un diagnstico histopato-
lgico. Esta sala debe estar por completo separada de otras
adaptaciones del laboratorio, contar con buena iluminacin
y ventilacin y proporcionar las reas para el desempaque,
FIJACIN Y DESCALCIFICACIN 5
correlacin y diseccin de la muestra. El almacenamiento
de los tejidos jados con formalina (mojados), despus de
la diseccin, puede tambin ser una funcin del cuarto
de cortes. Los almacenadores para muestras construidos
a la medida y ventilados estn disponibles en el mercado y
se pueden incorporar a las salas de corte ms grandes o
alojarse de modo conveniente en un rea separada, usada
de forma especca para guardar las muestras.
Las precauciones con el formaldehdo son la primera
preocupacin en esta rea y se legislan de manera conjun-
ta en las secciones Health and Safety Act (1974) y Con-
tainment of Substances Hazardous to Health (COSHH)
Regulations. El formaldehdo es el jador ms usado en
el laboratorio moderno de histologa y se discute ms ade-
lante. Hasta la fecha, el rea de corte de la muestra debe
contar con un equipo de extraccin que incluya un banco
de diseccin adaptado a un sistema de extraccin que haga
circular los humos lejos del usuario. El banco debe incluir
un lavabo integral, con agua corriente caliente y fra, para
lavar las muestras y limpiar el rea despus de la desinfec-
cin con el agente qumico apropiado. El rea de diseccin
del banco debe inclinarse hacia el lavabo para facilitar el
drenaje de la formalina lejos de las muestras jadas e in-
cluir un tablero de diseccin de polipropileno, o resistente
al corte, para el examen y corte de las biopsias jadas y de
rganos enteros.
Un equipo estndar de corte debe incluir una regla de
acero inoxidable, un bistur y un mango con hojas de cor-
te intercambiables y lminas PM40, cuchillos de mano de
Figura 1-1 Marcadores Leica IP C e IP S para casete y portaobjetos.
acero, un cuchillo cerebral, tijera, tijeras intestinales, son-
das, una fuente de luz amplicadora, pinzas atraumticas
intestinales y pinza de diseccin para la manipulacin de
biopsias y cortes de tejido. El equipo de proteccin per-
sonal debe incluir batas u overoles, mandiles, guantes qui-
rrgicos y resistentes al corte, gafas, viseras, cubrebocas y
respiradores (usados en la etapa de desechar la muestra).
La sala de corte puede, donde hay espacio disponible,
alojar las mquinas que procesan tejidos. Los procesadores
pueden ser por completo cerrados, aprobados por Health
and Safety, o abiertos, y deben incluirse en un gabinete
ventilado para contener los vapores del solvente.
Fijacin y descalcicacin
Cuando se retiran los tejidos del cuerpo experimentan di-
versos cambios degenerativos, como la autlisis y la putre-
faccin. La primera es la descomposicin de las clulas y
los componentes del tejido por accin de enzimas propias
del cuerpo; la segunda es el cambio degenerativo del tejido
como consecuencia de la accin bacteriana.
Objetivos de la jacin
La jacin debe detener la autlisis y la putrefaccin y pre-
servar las clulas y los componentes tisulares en un estado
tan natural como sea posible. El jador no debe propiciar
la contraccin, inamacin o endurecimiento del tejido y
debe estabilizarlo pese al rigor del proceso. Por ltimo, el
jador debe complementar y mejorar los subsecuentes pro-
cedimientos histolgicos de tincin, inmunohistoqumicos
y de biologa molecular. En trminos amplios, stas son las
exigencias de un jador ideal. Sin embargo, la jacin
depende en realidad de la conjuncin de estos requisitos.
Fijadores
Los jadores simples son soluciones de un solo qumico,
por ejemplo metanol, etanol, cido actico glacial y for-
maldehdo; stos, que carecen de aditivos, pueden indu-
cir algunos de los artefactos ya mencionados si se usan
solos. Los jadores compuestos son mezclas de jadores
simples que se han formulado para compensar y reducir
al mnimo los artefactos de la jacin, como el lquido
de Carnoy (etanol-cloroformo-cido actico), que se reco-
mienda para la jacin de cidos nucleicos.
Ambos tipos de jadores reaccionan con las protenas
de dos maneras. Los coagulantes, como lo sugiere su nom-
bre, coagulan la protena del tejido, por ejemplo el etanol.
Los jadores no coagulantes, como el formaldehdo, for-
man enlaces cruzados (reticulaciones) con la protena del
tejido.
Duracin de la jacin
La jacin adecuada es esencial para todas las tcnicas
histolgicas posteriores. Una demora en la colocacin de
un tejido en el jador o la inltracin inapropiada del ja-
dor antes del proceso pueden afectar la interpretacin mor-
folgica y el anlisis histoqumico o inmunohistoqumico.
La extensin de la jacin depende de la densidad del te-
jido y la velocidad de penetracin del jador. Tejidos ms
blandos y menos densos se penetran en menos tiempo que
los tejidos brosos y seos. El grado de penetracin de los
jadores vara entre uno y otro; por ejemplo, el glutaralde-
hdo y el lquido de Carnoy son ms rpidos en su accin
que el formaldehdo. Para facilitar la jacin minuciosa, en
los laboratorios de histologa es comn describir primero y
seccionar despus muestras densas grandes. De modo al-
ternativo, el jador se puede inyectar en un rgano entero y
se calienta en un horno de microondas o una incubadora.
Formaldehdo como jador de rutina
El jador utilizado de forma ms extensa en los depar-
tamentos de histopatologa es la formalina al 10% (formal-
dehdo al 4%) y sus derivados. El formaldehdo es soluble
en agua a un mximo de 40% por peso (formalina al 100%)
y est disponible en el comercio como solucin al 40%, con
la adicin de 10 a 14% de metanol como estabilizador. En
condiciones normales se diluyen 10 partes de formalina al
100% con 90 partes de agua, amortiguador salino siolgi-
co o de fosfato para obtener la solucin de trabajo al 10%.
La formalina no amortiguada puede adquirir acidez perma-
nente debido a la formacin de cido frmico. ste reac-
ciona con la sangre en tejidos muy vascularizados, como el
bazo, para producir un pigmento negro llamado hematina
formalina cida. Esto ocurre casi siempre despus de una
jacin prolongada; las soluciones amortiguadas de forma-
lina resuelven este artefacto de la jacin.
La formalina tiene un olor acre y es un intenso irritante
de los ojos, la piel y las membranas mucosas; en algunos
trabajadores puede causar dermatitis por contacto. El per-
sonal que manipula esta sustancia debe someterse a una
valoracin respiratoria anual de sensibilizacin. Los lmi-
tes mximos de exposicin recomendados son una parte
por milln y los grados de exposicin deben supervisarse
con regularidad. Las soluciones de formalina deben ma-
nipularse de forma cuidadosa en cuartos bien ventilados
que dispongan de extractores para vapores; asimismo, debe
usarse ropa protectora, como guantes, capas de laboratorio,
gafas y respiradores.
La formalina reacciona para formar enlaces cruzados (re-
ticulaciones) entre las protenas. Las protenas solubles se -
jan a las estructurales y ello suministra fuerza al tejido y hace
posible el proceso siguiente. La formalina no ja los carbo-
hidratos sino el glucgeno cuando se adhiere a una protena
jada. Es un buen jador para los lpidos complejos.
El calor y la agitacin aceleran el proceso de jacin. El
tiempo recomendado para la jacin de tejidos en forma-
lina es de 24 a 48 horas; el tiempo ptimo es de siete a 10
das. Las mquinas modernas cerradas que procesan tejido
pueden calentar los reactivos (40 a 45C) durante el procedi-
miento y, por lo tanto, el proceso de jacin puede acelerar-
se. Los tejidos recibidos en el laboratorio se deben sumergir
por completo en el jador cinco a 10 veces su volumen.
No existe un jador ideal, pero la formalina al 10%
tiene la ventaja de preservar una amplia variedad de te-
jidos. La formalina es tolerable y permite llevar a cabo
con posterioridad una histoqumica adecuada. El tejido
se puede almacenar por largos periodos sin sufrir efectos
dainos en el ncleo, el citoplasma o la morfologa total
de la muestra. No es el jador de eleccin para la inmu-
nohistoqumica o biologa molecular, pero muchos de los
problemas derivados de su uso pueden superarse con
los pretratamientos apropiados del tejido.
Otros jadores de uso general
El glutaraldehdo es a menudo el jador de eleccin
para el tejido que requiere la microscopia electrnica, ya
que proporciona una buena preservacin de la ultraes-
tructura celular. Es un sensibilizador respiratorio y tiene
un vnculo evidente con la denominada asma industrial.
Deben observarse las medidas de seguridad adecuadas
al usar glutaraldehdo. Su uso como desinfectante en las
caeras se ha proscrito en muchos hospitales.
El tetraxido de osmio se emplea como jador secun-
dario en microscopia electrnica, por lo regular des-
pus de la jacin primaria en glutaraldehdo. Fija los
lpidos y tambin preserva la estructura na de la clula.
El tetraxido de osmio es txico y exige tambin la ins-
titucin de medidas de seguridad adecuadas.
El dicromato de potasio se puede utilizar para identi-
car tumores medulares suprarrenales, macroscpicos
y microscpicos. Reacciona con las catecolaminas me-
dulares suprarrenales y produce un precipitado negro
o marrn que es insoluble en agua. No conviene como
jador general cuando penetra el tejido lentamente y
causa contraccin.
El alcohol penetra el tejido con rapidez y se puede usar
junto con otros jadores para aumentar la velocidad de
la jacin. El etanol absoluto preserva al glucgeno,
pero distorsiona el contorno nuclear y altera la contrac-
cin del citoplasma. El jador de Carnoy es un buen
jador para los cidos nucleicos, si bien propicia la con-
traccin del tejido y la lisis de los eritrocitos; consiste en
etanol absoluto, cloroformo y cido actico glacial.
Pueden emplearse diversos aditivos en los jadores. Por
ejemplo, las soluciones de cido tnico, fenol o metales
pesados se pueden adicionar a la formalina para incre-
mentar el grado de penetracin y de esa manera mejorar
la preservacin o favorecer los procedimientos subse-
cuentes de teido.
La jacin por vapor mediante jadores voltiles per-
mite la retencin de sustancias solubles in situ y las
convierte en productos insolubles antes de que entren
en contacto con los solventes. Este mtodo es de uso
frecuente junto con la liolizacin. Los jadores con-
venientes para esta tcnica incluyen al formaldehdo, el
tetraxido de osmio y el alcohol.
Los hornos de microondas son recursos en la jacin
para conservar el tejido mediante la accin del propio
calor o acelerar el proceso de jacin, como se descri-
bi con anterioridad.
Descalcicacin
El hueso o los tejidos que contienen material calcicado
requieren la descalcicacin antes del proceso para per-
mitir la microtoma estndar (es posible realizar el corte
en huesos an calcicados cuando es necesario cuanticar
este elemento). Se pueden emplear varios lquidos descal-
cicantes, incluidos cidos como el ntrico, agentes quelan-
tes como el cido diaminotetraactico de etileno (EDTA),
una combinacin de ambos, o soluciones disponibles en el
comercio. El calor aplicado a las soluciones descalcican-
tes, mediante un horno de microondas o la incubadora, se
puede aplicar para acelerar el proceso de la descalcica-
cin. El tiempo prolongado en un lquido descalcicante,
en especial en las soluciones cidas, puede daar la mor-
fologa del tejido y afectar de manera adversa la calidad de
las tcnicas subsecuentes. El lmite de la descalcicacin
puede determinarse con la prueba qumica de la solucin,
los rayos X o, con ms frecuencia, la evaluacin manual.
Preparacin e inclusin del tejido
El tejido jado y estabilizado se somete a continuacin a la
microtoma, que implica la preparacin de cortes gruesos
de 1 a 6 m del tejido para el examen microscpico. Para
facilitar este proceso, el tejido debe apoyarse de modo in-
terno y externo. Aunque los protocolos congelantes estn
disponibles para las muestras jadas y sin jar de tejido, es-
tos mtodos se emplean casi siempre para la demostracin
de componentes de jacin lbil o las tcnicas de diagns-
tico rpidas. Para el diagnstico histopatolgico general,
los tejidos se someten a diversos reactivos, a su inltracin
y por ltimo al recubrimiento con un medio de apoyo rgi-
do. Casi todos los jadores son variaciones de la formalina
acuosa al 10% y, en consecuencia, son el objetivo de la pre-
paracin del tejido para sustituirlos, dentro de la muestra,
por la cera de parana inmiscible en agua. Para lograr esto,
el espcimen se somete a las etapas siguientes:
1. Deshidratacin: el alcohol sustituye al jador acuoso
dentro del tejido.
2. Claricacin: un antimedio, como el xileno, reemplaza
al alcohol.
3. Inltracin: la cera de parana sustituye a la sustancia
claricante y se inltra en el tejido.
4. Inclusin: la cera de parana encapsula al tejido inl-
trado y le proporciona un soporte rgido para la micro-
toma.
Para asegurar una buena preparacin del tejido es esen-
cial que los cortes no sean mayores de 2 a 3 mm de gro-
sor para las programaciones rpidas o urgentes y de 3 a
5 mm para las programaciones comunes durante la noche
o el n de semana. Es posible una preparacin deciente si
el tejido se acumula en el casete del procedimiento, lo que
impide a los reactivos circular con propiedad. Las biopsias
minsculas se pueden colocar en bolsas o casetes de malla
para biopsia, disponibles en el mercado, que pueden dejar-
se dentro del casete (g. 1-2a, b).
Factores que afectan el proceso tisular
Temperatura
Los reactivos para la preparacin a bajas temperaturas son
ms viscosos y por tanto su difusin tisular es ms lenta.
Una temperatura de proceso elevada aumenta la energa
cintica de las molculas del reactivo, disminuye la vis-
cosidad del reactivo e incrementa la difusin del reactivo
en el tejido. La calefaccin ligera de los reactivos para la
deshidratacin y la claricacin, en lmites de 37 a 45C,
acorta en proporcin sustancial los tiempos de preparacin,
pero puede aumentar la contraccin del tejido debido al
efecto del calor sobre la colgena.
PREPARACIN E INCLUSIN DEL TEJIDO 7
Figura 1-2 a) Casete y bolsa de biopsia para la preparacin tisular. b) Contenedor seguro de biopsia celular.
Las temperaturas elevadas en la etapa de la inltra-
cin pueden provocar la contraccin y el endurecimiento
indebidos del tejido. Esto puede prevenirse con el uso de
temperaturas de 2 a 3C sobre el punto de fusin de los me-
dios de la inltracin para reducir al mnimo estos efectos.
Sin embargo, la sangre y el msculo pueden an tornar-
se frgiles durante la inltracin y, en consecuencia, debe
tambin considerarse el efecto combinado del tratamiento
de la jacin, el deshidratante y el tipo de tejido.
Vaco y presin
Las mquinas modernas de preparacin tisular incorporan
un ciclo intercambiable de vaco y presin. En la prctica,
la aplicacin de presin durante la deshidratacin y la cla-
ricacin ejerce poco efecto sobre la difusin de los reacti-
vos, aunque puede tener un efecto creciente en la etapa de
la inltracin. No obstante, la aplicacin de vaco mejora la
deshidratacin, la claricacin y la inltracin.
Agitacin
El rea supercial mxima del tejido debe estar disponible
para el intercambio y la circulacin de lquido y reactivo
durante el procedimiento. ste no es el caso cuando los
casetes tisulares permanecen en el fondo del recipiente, se
hallan estticos en el reactivo o se envasan de forma herm-
tica en la cesta de procesamiento. El rea supercial mxi-
ma para el intercambio de lquido se daa y es imposible la
circulacin del reactivo alrededor del tejido; el efecto es el
estancamiento, es decir, el reactivo que circunda al tejido
permanece a una concentracin ms baja y se requiere un
tiempo mucho mayor para la preparacin satisfactoria.
Para conseguir resultados constantes, los casetes tisula-
res se deben envasar, suspender y agitar en el reactivo para
prevenir la inmovilizacin y posibilitar la circulacin del
medio. La agitacin se puede facilitar con los agitadores y
rotores magnticos para el procesamiento manual, mientras
que las mquinas modernas aplican cualquier movimiento
rotatorio, de arriba abajo, de lado a lado o de marejada.
Deshidratacin, claricacin,
inltracin e inclusin
Deshidratacin
La mayor parte de los jadores tisulares se elabora en so-
lucin acuosa y la funcin del deshidratante es eliminar las
molculas de agua libres y unidas de la muestra. El des-
hidratante ms empleado para el procesamiento de rutina
en parana es el etanol al 99.85% que, en virtud de su alto
costo, los laboratorios adquieren en la forma menos costo-
sa de alcohol desnaturalizado industrial (IMS, por sus si-
glas en ingls) al 99%, que contiene metanol al 2%. Ciertos
lpidos y protenas solubles en agua se eliminan del tejido
durante esta etapa.
Los tejidos se procesan por medio de una concentra-
cin creciente de etanol hasta 99% de IMS (etanol abso-
luto). El mtodo de jacin empleado y el tipo de tejido
determinan la resistencia del primer bao con IMS. Las
programaciones comunes del proceso histolgico emplean
IMS al 70% como el primer paso en la deshidratacin
del tejido. Los tejidos delicados pueden necesitar IMS al
50% para un proceso lento, mientras que los tejidos jados
en un reactivo alcohlico, como el jador de Carnoy, se
pueden sumergir directamente en varios cambios de IMS
al 99%.
El tiempo de deshidratacin depende del tamao y el
tipo de muestra tisular. En general, los bloques de tejido de
1 mm de espesor requieren 30 minutos en cada gradua-
(a) (b)
cin de alcohol y los bloques de tejido de 5 mm hasta 90
minutos.
Claricacin
El agente claricador es un reactivo que puede mezclarse
con la cera de parana y acta como un enlace entre el des-
hidratante (no miscible) y la cera de parana. Los agentes
claricadores ms empleados para las tcnicas habituales
son los hidrocarburos, como el xileno, el tolueno, el clo-
roformo y los solventes del petrleo. Estos reactivos, que
regula el COSHH, son sustancias inamables, eliminan la
grasa de la piel y tienen grados variables de toxicidad. El
tolueno es un posible agente carcingeno, el cloroformo
tiene un efecto narctico y el xileno, aunque no est de-
mostrado que sea un carcingeno, puede causar dolores de
cabeza como efecto secundario de la inhalacin del vapor,
cuando el laboratorio carece de las instalaciones adecuadas
de extraccin (sobre todo en reas desprotegidas y de tin-
cin manual).
Por tales razones, el xileno es quiz el agente clarica-
dor ms utilizado. Pueden usarlo todos los procesadores
tisulares importantes y es relativamente barato. El xileno
se debe adquirir como reactivo libre de benceno (carcin-
geno) y azufre. La exposicin prolongada al xileno puede
causar endurecimiento tisular excesivo y deben formular-
se las programaciones del procesamiento para reducir al
mnimo este efecto. Los tejidos de 1 a 2 mm de espesor
requieren dos o tres cambios de xileno en 30 a 60 minutos
y los bloques de 3 a 5 mm de espesor exigen tres cambios
en un lapso de dos a cuatro horas para el proceso normal.
Las funciones de calor y vaco en las mquinas modernas
reducen de forma sustancial estos tiempos.
Inltracin
La cera de parana es el medio de eleccin para la inl-
tracin e inclusin en la histopatologa comn. Es una
mezcla de hidrocarburos policristalinos de cadena lineal
producida a partir de la destilacin y separacin del aceite
mineral crudo. La cera de parana se caracteriza por su
punto de fusin, que reeja la mezcla de pesos moleculares
de sus hidrocarburos constitutivos. Los puntos de fusin,
aunque no son exactos del todo, se hallan en los lmites
de 39 a 68C; como regla general, cuanto ms alto sea el
punto de fusin, ms dura es la cera. Los tejidos ms blan-
dos se benecian con la inltracin de ceras con puntos de
fusin ms bajos y los tejidos ms duros, con la inltracin
de aqullos con un punto de fusin ms alto. Empero, el
procesamiento histopatolgico de rutina es en parte una di-
cultad debido a la variacin de tamao y la dureza de las
muestras tisulares y el agente claricador elegido. Para este
n se emplea la cera de parana con un punto de fusin
de 56 a 58C. Los tiempos de la inltracin se ilustran en
el cuadro 1-1. Estos tiempos se reducen de forma consi-
derable si se utiliza vaco, el que resulta esencial para las
muestras del pulmn, en las cuales el vaco fuerza a las mo-
lculas de aire atrapadas a abandonar el tejido.
En algunas ceras de parana se incluyen aditivos para
mejorar su consistencia cristalina, atenuar su dureza y fra-
gilidad y, por lo tanto, mejorar las caractersticas de corte
(microtoma). Entre estas sustancias guran, entre otras,
las resinas termoplsticas, los polmeros plsticos y el sul-
fxido de dimetilo, que ayuda a la inltracin y permite un
corte no.
Inclusin
La cera de parana para la inclusin tisular debe estar lim-
pia, ltrada y mantenida a 2 a 4C alrededor de su punto
de fusin. Al trmino de la tcnica, la cesta del tejido se
transere a un depsito calentado o un bao jo libre de
cera. Los tejidos se remueven de sus casetes, uno a la vez,
con pinza calentada y la cara colocada abajo en un mol-
de con cera de parana fundida. El molde se aplica en una
supercie refrigerada o un recipiente congelado para faci-
litar la adhesin del tejido a su base. Est disponible una
gran variedad de moldes, entre ellos los moldes de acero
inoxidable de capacidades graduadas que reciben el casete
del procesamiento/inclusin que acta como la platafor-
ma de soporte del tejido; las piezas L de Leuckhart; los re-
cipientes congelados; los botes de metal, y los recipientes
de plsticos desmoldables. Los moldes se dejan en la placa
fra hasta que la cera se solidica; si no se cuenta con una
forma de refrigeracin, se puede sumergir en agua fra
una vez formada una corteza bastante gruesa en la super-
cie de la cera. En la actualidad estn disponibles los cen-
tros de infusin comerciales, que combinan un almacn de
molde calentado, un depsito/dispensador de cera fundida
y una placa fra (g. 1-3). Una vez que la cera se solidica,
los bloques del tejido se pueden desprender con suavidad
de sus moldes y prepararse para la microtoma.
Para la orientacin apropiada de las muestras de teji-
do, una regla general seala que la supercie inferior del
tejido en el casete debe colocarse cara abajo en el molde.
La orientacin es en extremo importante para el diagns-
tico efectivo. Una biopsia de piel se debe impregnar en
sentido perpendicular a su supercie para suministrar un
plano correcto de corte. El tejido cilndrico/tubular, como
las trompas de Falopio o los vasos deferentes, se debe im-
pregnar en su extremo, de modo que puedan practicarse
cortes transversales a sus paredes y luz. Es posible utilizar
tinturas especiales para marcar los planos de la reseccin y
observar la orientacin correcta del tejido.
PREPARACIN E INCLUSIN DEL TEJIDO 9
Procesadores tisulares automticos
Los procesadores tisulares tipo carrusel abiertos (g. 1 -4a)
se han sustituido sobre todo con los cerrados (g. 1-4b), esto
es, mquinas de procesamiento que satisfacen los linea-
mientos de Health and Safety y tienen capacidades ma-
yores para casetes. Los procesadores abiertos liberan los
vapores del reactivo a la atmsfera cuando la cesta del te-
jido se mueve entre las fases y, por lo tanto, deben estar
instalados en un rea de extraccin bien ventilada. La agi-
tacin se efecta por un movimiento rotatorio o de riego y
el vaco est disponible en la impregnacin nal de la inl-
tracin de cera. Los tejidos se procesan mediante solventes a
temperatura ambiente.
Los procesadores cerrados son las unidades indepedien-
tes (modulares) que retienen por completo los vapores del
reactivo durante el procedimiento del tejido por medio de
trampas de agua o vapor y ltros de adsorcin con carbn.
Los reactivos se bombean hacia dentro y fuera de un com-
partimiento/retorta del procesamiento. La agitacin se pro-
porciona bajo la forma de ujo de marejada de los reactivos
dentro y fuera del recipiente o mediante un movimiento
rotatorio de lado a lado. El ingreso de los reactivos se pue-
de mejorar si se alternan los ciclos programables de vaco
y presin, de los cuales el primero es el ms ecaz. Las eta-
pas de deshidratacin y claricacin se pueden reducir en
grado notorio por la capacidad para calentar los reactivos
(25 a 45C). La tecnologa de microprocesadores permite
que mltiples programaciones del procesamiento se alma-
cenen y recuperen y, en algunas mquinas, hacen posible
el uso simultneo de unidades adicionadas para diversas
programaciones bajo el control de un mdulo regulador.
Programaciones de rutina durante la noche
y rpidas del procesamiento tisular
El cuadro 1-1 muestra una comparacin de las programa-
ciones de rutina durante la noche y rpidas para los pro-
Figura 1-3 Centro de impregnacin tisular Shandon Histocentre 3 .
cesamientos tisulares automticos abierto y encerrado. El
reabastecimiento de los reactivos y los medios de inltra-
cin de la tcnica son dependientes del volumen de reac-
tivo usado por etapa y el nmero de casetes procesados.
Figura 1-4 a) Procesador de tejido Leica TP1020. b) Procesa-
dor de tejido cerrado Shandon Excelsior.
(a)
(b)
Procesador de tejido abierto Procesador de tejido cerrado
Rutina durante Rpida Rutina durante Rpida
Reactivo la noche (minutos) (minutos) Vaco la noche (minutos) (minutos) Vaco
Formol salino al10% 60 30 No 30* 15 S
Alcohol al 70% 60 0 No 30* 0 S
Alcohol al 95% 60 0 No 30* 15 S
Alcohol al 100% 60 15 No 30* 15 S
Alcohol al 100% 60 15 No 30* 15 S
Alcohol al 100% 60 30 No 60* 15 S
Alcohol al 100% 60 30 No 60* 15 S
Xileno 30 15 No 30* 10 S
Xileno 60 15 No 30* 15 S
Xileno 60 30 No 30* 15 S
Cera de parana 60 30 No 30* 15 S
Cera de parana 60 30 S 60* 30 S
Cera de parana 90 30 S 60* 30 S
* La temperatura del procesamiento es de 45C.
Deben considerarse medidas de seguridad apropiadas y es
esencial el uso del equipo de proteccin personal al decan-
tar estas soluciones.
Procesamiento por microondas
La utilizacin de la tecnologa de microondas para el pro-
cesamiento rpido de los tejidos se adopt hace ya tiempo.
Es en particular til en procedimientos simples, cuando se
requiere un resultado diagnstico expeditivo de la biopsia,
antes que el paciente egrese de la institucin. Las biopsias
urgentes y las del mismo da tambin se benecian de esta
tecnologa y, lo que es de gran importancia, sin perder la
calidad de la preparacin nal.
Microtoma
La microtoma es la ejecucin de cortes nos, de uno a
cinco micrones (m) de grosor, a partir de bloques de teji-
do embebidos en cera de parana. Este proceso emplea
un micrtomo y un cuchillo o una hoja de micrtomo de-
sechable, adems del mango de la hoja. Los micrtomos
son de la variedad rotatoria o de base deslizable y es-
tn disponibles en el comercio por innumerables provee-
dores de equipos de laboratorio. La hoja desechable del
micrtomo ha reemplazado al cuchillo del micrtomo en
las prcticas de los departamentos de histopatologa. Estos
instrumentos deben estar alados, sea de modo manual (un
procedimiento calicado) o por mquina; esta ltima pue-
de consumir demasiado tiempo, algo inadecuado en una
era en la que las cargas de trabajo exigen la uidez de los
servicios de histopatologa.
Micrtomos
El micrtomo rotatorio (g. 1-5) es una mquina de uso
general para la produccin de cortes de tejido seminos
Figura 1-5 Microtmo rotatorio Shandon Finesse E.
Cuadro 1-1 Programaciones de rutina durante la noche y rpida para el procesamiento de tejidos
MICROTOMA 11
para microscopia ligera. La rotacin manual de la rueda
montada en un plano lateral hace que el mecanismo de
avance mueva al sostenedor del bloque hacia el cuchillo -
jado rgidamente a un espesor preestablecido de corte (gro-
sor). El bloque se mueve de arriba abajo contra el cuchillo
en un plano vertical con la ejecucin de cortes planos, casi
siempre de un espesor de 3 a 5 m para propsitos histol-
gicos de rutina. La velocidad del bloque contra el cuchillo
la controla el ritmo al que gira la manivela. Los micrto-
mos rotatorios y motorizados de uso industrial tambin es-
tn disponibles para usarse en cortes seminos (0.5 a 1 m)
impregnados en resina para la microscopia de luz; en estos
casos la velocidad constante del bloque contra el cuchillo
puede controlarse de forma automtica. Por lo general, los
lmites de grosor del corte de estos micrtomos uctan
entre 0.5 y 60 m.
El micrtomo de deslizamiento, aunque es ms conve-
niente para el corte de tejidos duros y algunas resinas ms
blandas, es tambin til para el corte y formacin de tiras
de tejidos y biopsias blandas. La pesada estructura de es-
tas mquinas impide la vibracin y el mango del cuchillo
puede angularse lejos de la direccin del corte, lo cual re-
sulta de utilidad en caso de tejidos duros. El sostenedor
del bloque se monta sobre dos corredores paralelos y el
sostenedor del bloque discurre por el avance manual de la
muestra sobre la misma manivela o por una palanca ensam-
blada sobre el borde del transportador del bloque, que se
mueve contra un soporte esttico. El bloque se pasa hacia
delante y atrs contra el cuchillo, mediante movimientos
de empuje y traccin. Los cortes son de 3 a 5 m para la
histologa comn.
Cuchillos del micrtomo
En general, las hojas desechables para la prctica histopa-
tolgica de rutina reemplazaron a los cuchillos convencio-
nales de acero del micrtomo.
Los cuchillos de acero se fabrican a partir de un car-
bn de alto grado o acero de gran calidad y deben estar
libres de impurezas y ser inoxidables. Los cuchillos se tem-
plan (endurecimiento) de un extremo al otro y el grado de
dureza se mide mediante la escala de Vickers (casi siempre
400 a 900). Los grados de dureza pueden variar entre los
fabricantes y entre los propios cuchillos del mismo fabri-
cante. Se recomienda una dureza de 700; la de 400 es muy
blanda y la de 900 demasiado quebradiza para el uso de
rutina. Los cuchillos de acero pueden dividirse en perles,
segn sea el uso para el que estn destinados (g. 1-6):
El perl A corresponde a dispositivos bicncavos y se
emplean para el corte de tejidos impregnados en celoi-
dina. Rara vez se usan en histopatologa comn.
El perl B incluye instrumentos planos y cncavos y
pueden utilizarse para seccionar tejidos blandos embe-
bidos en cera y tejidos y muestras botnicos impreg-
nados en celoidina. Este perl y el anterior poseen los
bordes ms alados.
El perl C se reere al dispositivo acuado y es el cu-
chillo de acero de empleo ms comn en histopatolo-
ga de rutina. Los cuchillos son ms rgidos respecto de
los perles A y B y se utilizan para el corte de cera
de parana de todos los tejidos y en los cristatos para el
corte de material congelado (vase ms adelante). Los
instrumentos de esta categora no son tan alados como
los de los perles A y B.
El perl D corresponde a herramientas ms anchas y
planas y se usa para seccionar materiales duros, como
resinas, y bloques de tejidos en cera de parana de ex-
trema dureza. Este cuchillo produce el borde menos
agudo cuando se aplica.
Se sugiere la consulta de varios mtodos manuales y auto-
matizados disponibles para el anado y alado de los cu-
chillos mencionados.
Las hojas desechables se modicaron y engrosaron a
partir de hojas de afeitar; se fabrican con acero inoxidable
de alta calidad y permiten hacer cortes reproducibles, sin
compresin y de buena calidad. La hoja na se sujeta con
rigidez en su propio sostenedor especial para minimizar la
vibracin durante la microtoma. Las hojas pueden recu-
brirse con platino o cromo para otorgarles una vida ms
larga. Hoy en da, estas hojas son la primera opcin para la
histopatologa comn.
Otros cuchillos incluyen carburo de tungsteno para
trabajar la resina y cortar hueso sin descalcicarlo; los
cuchillos de vidrio, diamante y zaro se usan con materia-
les tratados con araldita y resina epxica en microscopia
electrnica o para obtener bloques pequeos y estrechos de
tejidos impregnados en acrlico o resina de polister para
la microscopia de luz.
Figura 1-6 Perles de los cuchillos de micrtomo.
Corte de la cera de parana
Para la prctica de un corte se requiere un cuchillo recin
alado del micrtomo o una hoja desechable nueva con
un borde agudo sin defectos. Todas las operaciones refe-
rentes a la colocacin o retiro del bloque dentro y fuera
del sostenedor del bloque se deben efectuar con rmeza
y seguridad. Las hojas son en extremo peligrosas y deben
tratarse con mesura. Debe sujetarse el mango de los mi-
crtomos rotatorios; el transportador del bloque se coloca
en los micrtomos de deslizamiento y se sujeta de donde
se disponga en el extremo del micrtomo, lo ms alejado
de la lmina.
Algunos laboratorios emplean un micrtomo de corte
spero para recortar el bloque del tejido hasta obtener un
rea representativa seccionada de forma transversal. Las
muestras se remueven en intervalos de 10 a 15 m, hasta
que la faz del tejido est disponible; luego se practican va-
rios cortes a 4 o 5 m para asegurar un bloque de supercie
lisa (que evita el artefacto del corte burdo). El sostenedor
del bloque del cortador burdo se coloca en el mismo plano
que el resto de los micrtomos del laboratorio. El corte bur-
do puede realizarse con el mismo micrtomo o incluso con
la misma lmina. El corte de la seccin se debe efectuar en
un rea separada de la hoja o el cuchillo utilizados para los
propsitos del corte general.
Los bloques extrados para el diagnstico se preenfran
en un recipiente congelado o una placa ms fra antes del
corte. El enfriamiento propicia la compresin del bloque y
opone una faz ms rgida del bloque al cuchillo para faci-
litar el corte. El grosor de la seccin es casi siempre de 3 a
5 m. Cuando el lo del cuchillo pasa a travs de la super-
cie del bloque, los cortes del tejido se desplazan hacia
arriba (micrtomo de deslizamiento) o abajo (micrtomo
rotatorio) de la cara del cuchillo. Cuando el bloque golpea
el lo del cuchillo, la friccin producida crea una super-
cie que se derrite en la cera y, en consecuencia, las seccio-
nes subsecuentes se adhieren una a otra y forman una cinta.
sta se sostiene, se retira del lo del cuchillo y se hace
otar sobre un bao de agua a 48 a 50C con la pinza cor-
tante. Las secciones se separan de sus puntos de adhesin y
se jan a los portaobjetos de vidrio del microscopio por su-
mergimiento parcial del portaobjetos en el agua. El exceso
del agua se elimina del portaobjetos, que se deja secar so-
bre una placa caliente a 60C, no en contacto directo, hasta
que todos los restos de agua se eliminen. Slo entonces el
portaobjetos se pone en contacto con la placa caliente por
cinco a 10 minutos para facilitar la adherencia de la seccin
de cera de parana al cristal. Los cortes quedan listos para
la tincin con hematoxilina y eosina o un sinfn de mto-
dos de tincin e inmunocitoqumica que el histlogo tiene
a su disposicin. El montaje, como se mencion con ante-
rioridad, puede ser automatizado.
Corte de un macrobloque
El informe del laboratorio y el suministro de un mnimo
de datos establecen la base del diagnstico histolgico. El
muestreo, procesamiento y cortes transversales enteros de
un tumor son ahora tcnicas histolgicas adoptadas y pro-
porcionan informacin ms precisa sobre la naturaleza del
tumor y las distancias de los mrgenes de reseccin. El m-
todo tiene una aplicacin extensa, pero es en particular til
en las afecciones de la mama, prstata e intestino.
El procesamiento de macrobloques requiere megaca-
setes, portaobjetos grandes e instalaciones especiales.
Los tiempos de la tcnica se incrementan y las muestras
se resecan con micrtomos rotatorios o de deslizamiento
modicados. La tincin se facilita sobre todo de manera
manual.
Tcnicas especiales
Corte por congelamiento de tejidos frescos
La mayor parte de los laboratorios histolgicos de rutina
incluye en su inventario un servicio de diagnstico que re-
curre al corte por congelamiento para pacientes con sospe-
cha de tumor. El diagnstico puede noticarse al cirujano
por telfono 10 a 20 minutos despus de tratar la muestra
del tejido; por consiguiente, es de gran ayuda para la aten-
cin clnica del paciente. Para este procedimiento se utiliza
el cristato (g. 1-7), un micrtomo rotatorio u oscilatorio
Figura 1-7 Cristato Leica CM3050S.
TCNICAS ESPECIALES 13
alojado dentro de una cmara refrigerada. La temperatura
de la muestra y el sostenedor del espcimen, el cuchillo y la
cmara pueden jarse de modo independiente o bien puede
seleccionarse una sola temperatura para todo el conjunto.
El tejido fresco para diagnstico rpido se enva desde el
quirfano, congelado en el contenedor de la muestra con
dixido de carbono, nitrgeno lquido o un aerosol conge-
lante, y se transere al cristato para cortarlo. Si las condi-
ciones tisulares son ptimas, es posible obtener cortes tan
delgados como de 1 m. Los tejidos frescos se deben dise-
car y congelar en un gabinete de seguridad microbiolgica.
La mayora de los cristatos modernos incorpora un ciclo
de descontaminacin de cuatro horas con formalina para
la desinfeccin de la cmara despus de casos de cortes
infecciosos insospechados (algunas lesiones tuberculosas
pueden parecer a simple vista tumoraciones).
El micrtomo congelante (g. 1-8) puede aplicarse para
cortes seminos de tejidos frescos, cuando apremia demos-
Figura 1-8 Micrtomo congelante Leica 1325.
trar sustancias que de manera habitual se eliminan duran-
te el procesamiento de rutina (p. ej., lpidos). Este tipo de
micrtomo tiene un recipiente esttico para la muestra y
el propio cuchillo discurre de forma manual a travs de la
supercie del tejido tanto como el sostenedor de la mues-
tra avanza de acuerdo con un espesor preestablecido. El
tejido se congela in situ por medio de un cilindro adjunto
de dixido de carbono o un refrigerante que circula. Los
cortes delgados consistentes son difciles de obtener.
Cortes de hueso sin descalcicar
Este procedimiento exige la produccin de cortes de 4 a
5 m de hueso sin descalcicar embebidos en una resina
acrlica o de polister. Aunque un micrtomo de desliza-
miento puede usarse para este propsito, es ms comn
emplear un micrtomo motorizado industrial (g. 1-9).
Los cuchillos del perl D (herramienta con lo), de tungs-
teno, vidrio o diamante, se emplean con frecuencia para los
cortes de ese tejido.
Figura 1-9 Micrtomo rotatorio motorizado de uso industrial
Leica RM2255.
Microscopia electrnica
La microscopia electrnica requiere practicar cortes ul-
tranos impregnados de resina y usar un ultramicrtomo.
Las resinas epxica o de araldita se usan con regularidad
y el grosor de la seccin se mide en nanmetros (nm). El
corte se facilita con el uso de cuchillos de vidrio o dia-
mante y el grosor de la seccin se vigila al observar el color
de la interferencia que produce la seccin en contacto con
el agua, es decir, oro (90 a 120 nm), plata (60 a 90 nm) y
gris (< 60 nm). Los cortes se recuperan y tien sobre reji-
llas especiales de cobre o rodio. Las tinturas emplean sales
de metales pesados, como el citrato de plomo y el aceta-
to de uranilo, que impregnan a ciertas estructuras tisulares.
Estos metales pesados desvan un haz de electrones que
emite el microscopio electrnico. Esto crea reas de to-
nos negros y grises dentro del corte tisular, donde los ele-
mentos ultraestructurales se impregnaron de metales pesa-
dos. El microscopio electrnico incorpora un sistema de
cmara que puede fotograar reas de inters dentro de la
seccin; el resultado nal es la micrografa electrnica.
sta es una revisin en extremo general de la microscopia
electrnica.
Lectura adicional
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological
Techniques, 5th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 2002.
Reconocimientos
Fotografas por cortesa de Thermo Electron Anatomical
Pathology, Leica UK Ltd, y Dr AT Wareld, Histopatholo-
gy, University Hospital Birmingham, UK.
RECONOCIMIENTOS 15
Por qu la tincin?
Cuando se examinan al microscopio, los cortes nos de te-
jido muestran una diferenciacin muy sutil entre las estruc-
turas compuestas. La tincin de los tejidos con colorantes
contrastantes permite que las estructuras se visualicen bajo
el microscopio de luz. Adems, la demostracin de varios
productos, inclusiones o microorganismos celulares exige
el uso de procedimientos de tincin especializados.
La mayor parte de la histopatologa diagnstica de rutina
se realiza sobre tejidos impregnados en cera de parana.
Los cortes por congelamiento son una excepcin. Estos
procedimientos son necesarios para el diagnstico de ur-
gencia o para demostrar sustancias perdidas, destruidas o
inhibidas en el proceso de jacin e impregnacin.
Despus de la microtoma, el corte en parana an est
inltrado con cera. La cera presente en las secciones os-
curece la estructura del tejido y es impermeable en grado
notable a los colorantes. Casi todos los mtodos de tincin
se basan en agua o alcohol y, por lo tanto, la remocin de
la cera es imprescindible. Una vez que los cortes se secan
sobre el portaobjetos, las secciones se tratan con xileno
para eliminar la cera. Claricar las muestras en alcoholes
graduados elimina el xileno y hace posible la hidratacin
de los especmenes. Este proceso se conoce a menudo en la
metodologa con diversos trminos: cortes desencerados,
secciones al agua, hidratacin de muestras.
Mecanismos bsicos de tincin
En la histopatologa diagnstica, los mtodos de tincin se
pueden agrupar en cuatro procesos principales (la tincin
vital, es decir, cuando el colorante se aplica a tejidos vivos,
se utiliza slo de modo ocasional, si acaso).
Solubilidad electiva
ste es el mecanismo por el cual los colorantes disueltos en
un solvente son ms solubles en el componente del tejido
que en el solvente mismo. Este mecanismo se emplea sobre
todo en la demostracin de grasa en cortes congelados. Por
lo general, los tintes usados son del tipo Sudn (III, IV).
Impregnacin metlica
Es posible la aplicacin de plata metlica a los elementos
del tejido para demostrar una amplia variedad de estructu-
ras y sustancias.
Las clulas que tienen la capacidad de reducir una so-
lucin amoniacal de plata, sin la necesidad de un agente
de reduccin externo, se conocen como argentanes. La
melanina y las clulas de Kultschitzky del aparato digesti-
vo son ejemplos tpicos.
Las clulas o las estructuras que requieren un agente de
reduccin externo se llaman argirlas. Se recurre con
regularidad a la impregnacin metlica en la demostracin
de bras reticulares, membranas basales, hongos, inclusio-
nes celulares y clulas nerviosas y sus axones.
Reacciones histoqumicas
stos son los mtodos en los cuales existe una comprensin
clara de los mecanismos que intervienen. La reaccin nal
2
Tinciones generales
Barrie Sims
18 CAP. 2 TINCIONES GENERALES
puede usar un colorante o inducir por s misma una reaccin
coloreada. Por ejemplo, el reactivo de Schiff, utilizado en
la demostracin de aldehdos, emplea la fucsina de tincin
bsica en la reaccin, que tie de magenta los sitios que
tienen aldehdo; por su parte, en la reaccin de Perl para
los depsitos de hierro frrico (g. 2-1), la interaccin entre
el ferrocianuro de potasio (un componente de la solucin de
Perl) y el hierro frrico en los tejidos produce el pigmento
azul de Prusia en el sitio donde se halla el hierro frrico.
dos comprenden a la gran mayora de los colorantes usados
en las tcnicas histolgicas (p. ej., eosina, azul de metileno
y fucsina bsica). Los colorantes se pueden tambin agru-
par como cidos, bsicos o neutros.
Colorantes cidos y bsicos
De forma sinptica, los colorantes cidos (aninicos) su-
fren atraccin de los elementos del tejido con propieda-
des bsicas, por ejemplo el citoplasma de las clulas. Los
colorantes bsicos (catinicos) experimentan atraccin de
las estructuras que poseen una naturaleza cida, como el
DNA del ncleo celular. Mediante una combinacin de co-
lorantes cidos y bsicos de un color contrastante pueden
diferenciarse el ncleo y el citoplasma. sta es la base de la
tincin con hematoxilina y eosina (H-E), un mtodo de tin-
cin usado en la mayor parte de los laboratorios de histopa-
tologa diagnstica para demostrar la estructura general.
Colorantes neutros
Los colorantes neutros se elaboran al combinar soluciones
cidas y bsicas. El producto resultante de la combinacin
tie las estructuras cidas y bsicas con una solucin ni-
ca. Los colorantes de Romanowsky, aplicados por ejemplo
en la demostracin de clulas de la mdula sea, son una
combinacin de azul de metileno y eosina.
Metacromasia
Los colorantes que se combinan con ciertos elementos
tisulares y que producen un color que es diferente al del
colorante original se denominan metacromticos. Los
mtodos de tincin metacromtica se pueden emplear para
la demostracin de mucinas, grnulos de mastocitos, ami-
loides y cartlago del tejido conectivo. La metacromasia se
pierde casi siempre durante la deshidratacin de los espe-
cmenes antes del uso de los cubreobjetos. Por lo regular,
lo anterior puede prevenirse con la utilizacin de un medio
acuoso para el montaje. Existen algunas variaciones en los
mtodos metacromticos que conservan la metacromasia
durante la deshidratacin.
Fluorescencia
Casi todos los mtodos de tincin se observan con la luz
visible. Los colorantes que tienen la capacidad de absorber
la luz ultravioleta y luego transmitirla dentro del espectro
visible se conocen como uorescentes. stos pueden
utilizarse para demostrar el amiloide de Mycobacterium
Muchas enzimas se pueden demostrar por la incubacin
de los cortes (congelados o en cera) en los sustratos que con-
tienen una sustancia con la cual reacciona la enzima, lo que
induce un producto de reaccin primaria. A continuacin, un
segundo reactivo interacta con el producto de reaccin primaria
para formar un depsito coloreado en el sitio de la actividad.
Las muestras de control que tienen o no la sustancia (positivas
o negativas) se usan para determinar la especicidad de la re-
accin. Las sustancias que inhiben la reaccin tambin pue-
den emplearse para mejorar la especicidad de la reaccin.
Tincin con colorantes
Casi todos los procedimientos de tincin en patologa diag-
nstica pertenecen a este grupo. En muchos casos, la com-
prensin del mecanismo de tincin no es completa y los
resultados dependen con frecuencia de la capacidad y el
conocimiento del clnico.
Clasicacin
Los colorantes se pueden clasicar como naturales o sint-
ticos. Los primeros incluyen a la hematoxilina; los segun-
Figura 2-1 Reaccin de Perl para el hierro frrico. Los depsitos
de hierro frrico estn teidos de azul.
MECANISMOS BSICOS DE TINCIN 19
tuberculosis (y antgenos tisulares cuando se aplican en las
tcnicas inmunocitoqumicas). Para ver las preparaciones
se requieren microscopios uorescentes y un cuarto oscuro
para conseguir una claridad ptima. La tincin uorescente
es a menudo de breve duracin y en tal caso se recurre a la
fotografa para proporcionar un registro permanente.
Colorantes directos
Los colorantes que tienen la propiedad de combinarse
con las estructuras tisulares a partir de soluciones acuosas
simples o alcohlicas se llaman colorantes directos. La
eosina y muchos otros colorantes anilnicos poseen esta
caracterstica.
Colorantes indirectos
Los colorantes que no poseen ninguna anidad directa por
las estructuras tisulares y requieren una sustancia interme-
diaria para permitir la tincin se llaman colorantes indirec-
tos. La sustancia intermediaria se conoce como mordiente
(similar a un catalizador). El colorante se combina con el
mordiente y a su turno con el elemento del tejido, lo que
produce un complejo colorante-mordiente-tejido. La hema-
toxilina, sin el uso del mordiente, es un colorante tisular
dbil. La adicin de metales a la solucin de hematoxilina,
como el sulfato de aluminio y potasio o el cloruro frrico,
puede crear colorantes potentes para usos diversos.
Tincin con hematoxilina
Las soluciones de hematoxilina necesitan oxidarse (algu-
nas veces se dice madurarse) antes de emplearlas para
teir tejidos. La oxidacin se puede realizar por medios
qumicos con la adicin de agentes oxidantes, como yo-
dato de sodio o, desde luego, mediante la luz solar (lo que
puede tomar varios meses). El proceso de la oxidacin con-
vierte a la hematoxilina en hematena. Por lo general, las
preparaciones de hematoxilina se oxidan slo en parte y
la oxidacin adicional prosigue con el tiempo. El uso de la
oxidacin incrementa la vida de la solucin.
Segn sea el mordiente utilizado, la hematoxilina puede
demostrar diversas estructuras.
Hematoxilinas de alumbre
stas se producen por la adicin de sulfato de aluminio y
potasio o amonio a la solucin de hematoxilina. Las hemato-
xilinas de alumbre se usan para teir de azul a los ncleos
celulares. Hay varias formulaciones disponibles, por ejem-
plo las de Harris, Ehrlich, Mayer, Delaeld, Cole y Gill.
Las hematoxilinas de alumbre deben ser azuladas (vase
ms adelante) para que los ncleos se tian de azul.
Hematoxilinas de hierro
Se obtienen tras agregar cloruro frrico o sulfato frrico y
amonio a la solucin de hematoxilina. La solucin resultan-
te produce un colorante negro e intenso que se puede utili-
zar para demostrar ncleos celulares, elastina, estriaciones
musculares y mielina. El colorante es ms resistente a la
extraccin cida que las hematoxilinas de alumbre y est
indicado cuando se emplean las contratinciones cidas, por
ejemplo en el mtodo de Gieson para tejidos conectivos.
La estructura demostrada depende del reactivo usado para
diferenciar (eliminacin del exceso de colorante del fondo
de la muestra hasta que slo se delinea la estructura reque-
rida). Los diferenciadores cidos eliminan el colorante ne-
cesario para perlar los ncleos de la clula. Al reaplicar la
solucin mordiente a la seccin se observa una eliminacin
progresiva de hematoxilina de la muestra; esto permite que
puedan observarse la mielina, elastina y estriaciones muscu-
lares. Las hematoxilinas de alumbre se pueden convertir a
hematoxilinas de hierro mediante el tratamiento del corte
con una solucin de hierro antes de la hematoxilina. Un
ejemplo es la secuencia azul celeste-hemalum.
Hematoxilina de plomo
Las soluciones de hematoxilina que contienen plomo reve-
lan clulas endocrinas.
Hematoxilina de cido fosfotngstico
Esta tincin perla estriaciones musculares, brina, ncleos,
mielina, cilios, clulas neurogliales y amebas. El cido fos-
fotngstico se utiliza tanto como el mordiente y la hemate-
na o la hematoxilina como colorante. El uso de la hematena
elimina la necesidad de la oxidacin.
Preparaciones comerciales
Ahora estn disponibles muchas soluciones de hematoxili-
na en el comercio. Esto evita la necesidad de la preparacin,
que consume tiempo en el laboratorio y la manipulacin
de sustancias txicas. Las nuevas frmulas eliminan el uso de
sustancias dainas o txicas (p. ej., mercurio) de la prepara-
cin y se elaboran soluciones menos perjudiciales.
Tinciones regresivas y progresivas
Regresivas
Una tincin regresiva se aplica casi siempre al corte por un
periodo que tia de manera inicial todas las estructuras del
tejido. Al eliminar de modo selectivo el exceso de coloran-
te se revelan los elementos de inters. El retiro del exceso
del colorante se llama diferenciacin. Esto puede con-
seguirse con el uso de solventes (alcohol), cido diluido y
soluciones cidas o alcohlicas o la solucin mordiente.
Progresivas
Una tincin progresiva tie de manera creciente elementos
del tejido, de acuerdo con el tiempo en la solucin de tin-
cin. Las tinciones progresivas no tien los tejidos de modo
excesivo y el periodo de impregnacin se suspende des-
pus de un lapso determinado. La hemalum de Mayer es
una tincin nuclear progresiva de uso frecuente como con-
tratincin nuclear en otras tcnicas, por ejemplo el mtodo
del cido perydico de Schiff (PAS).
Mtodos comunes de tincin
Los mtodos de tincin habituales se pueden agrupar en
nueve categoras (vase el cuadro 2-1).
tuados luego de la tincin con eosina eliminan a sta de
la muestra. El control cuidadoso de este proceso permite
que varias estructuras (msculo, colgena y eritrocitos) se
muestren de forma selectiva en diversas intensidades, des-
de el rosa hasta el rojo.
Estructura general
Fibras de tejido conectivo
Carbohidratos y mucosustancias
Pigmentos
Microorganismos
Sustancias extracelulares (brina, amiloide)
Lpidos
Grnulos citoplsmicos
Clulas neurolgicas
Cuadro 2-1 Categoras de los mtodos comunes de tincin
Estructura general
El mtodo con hematoxilina y eosina (designado a menudo
como H-E) es uno de los ms utilizados para la tincin de
estructuras generales en histopatologa diagnstica (vase
g. 2-2). El procedimiento sigue el orden mostrado en el
cuadro 2-2. Los procesos de lavado y deshidratacin efec-
Figura 2-2 Corte de rin teido con hematoxilina y eosina
que muestra un glomrulo de situacin central. Los ncleos es-
tn teidos de azul (las intensidades que dieren dependen de la
cantidad de cromatina nuclear presente) y la estructura general de
rosa. Los eritrocitos son de color rosa salmn.
1. Desencerar los cortes con xileno, tratar con alcoholes gra-
duados y lavar en agua
2. Teir los ncleos con una hematoxilina de alumbre (p. ej.,
Harris, Gill, etc.)
3. Claricacin en agua para eliminar el exceso de colorante
4. Eliminar el exceso de colorante de los tejidos (diferenciar)
hasta que slo se delineen los ncleos (se utiliza con fre-
cuencia una mezcla de cido clorhdrico al 0.5 a 1.0% en
alcohol al 70%)
5. Lavar las muestras hasta que los ncleos sean azules. El
trmino azulado se utiliza para describir el proceso por el
cual los ncleos celulares teidos con una hematoxilina de
alumbre se lavan en agua o un lcali dbil hasta que los
ncleos cambian del rojo al azul. La reaccin es anloga a
los cambios de color mostrados por el tornasol
6. Teir el citoplasma celular con la eosina (hay un buen n-
mero de formulaciones que se pueden utilizar para ajustar
las condiciones locales y el pH del agua)
7. Despus de una breve claricacin en agua (o directamente
en alcohol) las muestras se devuelven al xileno y se aplica
un cubreobjetos
Cuadro 2-2 Protocolo para la tincin de H-E
Soluciones simples para tincin
Una solucin acuosa al 0.5 a 1% de azul de metileno, por
ejemplo, tie de azul todas las estructuras del tejido. La
eliminacin selectiva del colorante mediante claricacin
y alcoholes revela los elementos tisulares en intensidades
que se diferencian del azul.
Colorante de Romanowsky
Se trata de un colorante neutro (vase antes) que puede in-
ducir una reaccin de tincin similar a la de H-E cuando se
aplica a los cortes con cera de parana.
Fibras y msculos del tejido conectivo
Colgena y msculo
van Gieson van Gieson y sus variantes son los colorantes
ms comunes para colgena y msculo. La solucin que
tie es una mezcla de cido pcrico y fucsina cida. Debido
a la naturaleza cida de la solucin de van Gieson, se uti-
liza una hematoxilina de hierro para la tincin nuclear. El
msculo y los eritrocitos se tien de amarillo, mientras que
la colgena lo hace de rojo; los ncleos son negros.
Tricromos Delinean la colgena y el msculo de manera
diferenciada (g. 2-3). El msculo teido es rojo, en tanto
que la colgena puede adoptar un tono azul o verde, de
acuerdo con el orden de tincin usado. Por lo regular, la -
jacin basada en mercurio produce mejores resultados que
los del formaldehdo. La tincin requiere habilidad para su
prctica. Los principios tericos del tricromo son comple-
jos y rebasan los alcances de este captulo.
Hematoxilina fosfotngstica cida (PTAH) De uso fre-
cuente en la demostracin de tejidos musculares, la tincin
PTAH tie las estriaciones y las miobrillas musculares de
azul. La colgena se delinea en rojo.
Fibras reticulares
Impregnacin con plata Las bras reticulares se de-
muestran en particular con los mtodos de impregnacin
en plata (g. 2-4). Existe una amplia variedad disponible
Figura 2-3 Para la demostracin de los tejidos conectivos se uti-
liza un mtodo de tricromo (o tricrmico). Las bras del msculo
se tien de rojo, la colgena de azul, los ncleos de negro y las
clulas sanguneas rojas de rojo brillante.
Figura 2-4 Impregnacin de plata de bras reticulares en una
seccin del hgado. Una na red negra de bras envuelve a las
clulas. El teido ms burdo (derecha inferior) es colgena.
de estas tcnicas; empero, su metodologa es similar (vase
el cuadro 2-3). La contratincin de los ncleos es opcio-
nal. Se ennegrecen las bras reticulares y otras estructuras
emiten sombras de tono marrn (a menos que de suyo sean
oscuras). Tambin pueden impregnarse los ncleos. La pre-
paracin de la solucin de plata amoniacal debe estar fres-
ca y requiere habilidad. La reaccin del cido perydico de
Schiff (PAS) tambin perla bras reticulares.
Membranas basales Es necesaria la demostracin de
membranas basales glomerulares durante el diagnstico
de la enfermedad glomerular. Los cortes se oxidan con cido
perydico y se impregnan con una solucin de metenamina
de plata. La reaccin es progresiva y se detiene en el punto
MTODOS COMUNES DE TINCIN 21
deseado de impregnacin. Se requiere el corte de las mues-
tras en 1 a 2 m para que se visualicen las estructuras nas
de la membrana basal. La reaccin con PAS tambin puede
emplearse para delinear las membranas basales.
Elastina Varios colorantes se pueden usar para demostrar
tejido de elastina, entre ellos la hematoxilina (mtodo de
Verhoeff), fucsina de rescorcina (mtodo de Weigert o Mi-
ller) y aldehdo de fucsina y orcena. El mtodo de Ver-
hoeff, aunque es comn, tiene dicultades para demostrar
bras gruesas y nas en el mismo corte. La variante de
Miller de la tincin de Weigert para la elastina produce
resultados buenos y conables de modo consistente. Las
calicaciones de este mtodo son superiores de manera
constante respecto de otros mtodos en estudios de calidad
(United Kingdom National Quality External Quality As-
surance Service for Cellular Pathology Technique [UKN-
EQAS-CPT]; portal: www.ukneqas-cpt.co.uk). La orcena
tiene xito razonable para demostrar la elastina de la piel.
Se usa con frecuencia la tincin de van Gieson del tejido
conectivo para la contratincin de la elastina.
Carbohidratos y mucosustancias
Reaccin de cido perydico de Schiff (PAS)
La reaccin del PAS se emplea en patologa para demostrar
una amplia gama de sustancias. El cido perydico rompe
los enlaces de carbono de los grupos adyacentes de glicol
1:2 por oxidacin y forma aldehdos. stos inducen al reac-
tivo incoloro de Schiff para recolorear y teir los sitios de
actividad de un tono magenta oscuro. Dado que muchas
sustancias contienen grupos glicol 1:2, la tincin no es muy
selectiva. Para mejorar la selectividad de la reaccin para
algunas sustancias es necesario extraer o bloquear esa sus-
tancia en una muestra duplicada mediante enzimas o pro-
ductos qumicos.
Glucgeno
La reaccin de PAS se usa con frecuencia para la demostra-
cin del glucgeno. Para identicar los sitios de acumulacin
del glucgeno es necesario pretratar un corte duplicado con
diastasa. sta extrae el glucgeno y, cuando se tien ambas
muestras, la digerida seala una ausencia de PAS al teir los
sitios del glucgeno.
La metenamina de plata se puede utilizar de una manera
similar y reconoce al glucgeno como producto ennegre-
cido. El carmn de Best es otro mtodo difundido para el
glucgeno.
Mucosustancias
Por lo general, las mucosustancias se encuentran en la forma
de mezclas de tipos diversos e incluyen a las mucinas. stas
se localizan en muchos sitios tisulares (p. ej., tejidos glan-
dular y conectivo). La demostracin de las diversas mucinas
depende de sus propiedades particulares. Las mucinas neu-
tras se pueden teir por la reaccin de PAS (g. 2-5), mien-
tras que las mucinas cidas lo hacen con el azul alciano.
1. Desencerar los cortes y claricar en agua destilada
2. Oxidar con permanganato de potasio
3. Blanquear con cido oxlico
4. Sensibilizar con el alumbre de hierro
5. Impregnar con una solucin de nitrato de plata amoniacal
6. Reducir con formaldehdo
7. Fijar con el tiosulfato de sodio
8. Tonicar (opcional) con cido clorourico (cloruro de oro)
9. Lavar, deshidratar con alcohol, tratar con xileno y montar
Cuadro 2-3 Protocolo para la tincin con impregnacin de plata
Figura 2-5 Demostracin de mucina que se tie mediante una
combinacin del mtodo de cido perydico de Schiff (PAS) y
azul alciano. Las mucinas neutras se tien de magenta, las muci-
nas cidas de azul y las mezclas, de azul prpura intenso.
El azul alciano, preparado a diferentes pH, diferencia
las mucinas cidas generales de las sulfatadas. Esta tincin
preparada con concentraciones que dieren del cloruro de
magnesio revela mucosustancias como el cido hialurni-
co, el sulfato de condroitina, el sulfato de queratina y la
heparina.
Las mucinas del tejido conectivo se pueden tambin re-
conocer con colorantes metacromticos como el azul de
toluidina, en tanto que la mucicarmina de Southgate perla
las mucinas carboxiladas o dbilmente cidas.
Las tcnicas de bloqueo para prevenir la tincin de gru-
pos qumicos particulares (p. ej., carboxilo) se aplican para
mejorar la especicidad por la ausencia de tincin en las
secciones tratadas.
Demostracin de pigmentos
Los pigmentos se pueden encontrar en material normal y
patolgico y se forman de modo natural o como artefactos
de la jacin o la tincin del tejido.
Artefactos
Por lo regular, los artefactos ocurren durante la jacin y
pueden deberse a las soluciones cidas del formaldehdo
que reaccionan con la sangre (pigmento de formalina).
Pueden evitarse con el uso de soluciones neutrales amor-
tiguadas de formalina. Los jadores basados en el mercu-
rio (p. ej., Zenker) dejan un depsito de sales de mercurio
dentro de los tejidos. Ambos pigmentos se eliminan con
facilidad antes de aplicar la tincin. El cuadro 2-4 enlis-
ta algunos pigmentos comunes y los mtodos usados para
demostrarlos.
Microorganismos
Los microorganismos que pueden delinearse en el plano
histolgico incluyen bacterias, inclusiones vricas, hongos
y espiroquetas. Los colorantes simples como el azul de me-
tileno proporcionan a menudo medios rpidos y fciles de
identicar la presencia de agentes patgenos dentro de una
muestra; sin embargo, el azul de metileno suministra infor-
macin slo en relacin con la morfologa.
Bacterias
Las bacterias se dividen en grampositivas o gramnegativas,
segn sea su reaccin de tincin con el colorante cristal
violeta de Gram. Las bacterias grampositivas conservan la
tincin despus de la diferenciacin en acetona o alcohol,
mientras que las bacterias gramnegativas se decoloran.
Luego de aplicar el colorante cristal violeta, en el cual el
yodo se utiliza como mordiente o agente atrapador, que
precipita el colorante dentro del citoplasma de las bacterias
grampositivas, se emplea una contratincin roja para mos-
trar las bacterias gramnegativas. La tcnica requiere destreza,
dado que es posible una sobrediferenciacin del cristal vio-
leta que produce bacterias grampositivas rojas.
Bacilos rpidos para el cido y el alcohol
Estos patgenos se demuestran casi siempre mediante el
mtodo de Ziehl-Neelsen (ZN). La fucsina bsica y el fe-
nol se mezclan para producir carbol fucsina intensa. La
siguiente tincin (con o sin el uso de calor) de la muestra se
diferencia con una solucin de alcohol cido hasta decolo-
rar el espcimen. Una contratincin (azul o verde) demues-
tra otros microorganismos y la estructura general.
Tambin es posible emplear un mtodo uorescente
(auramina-rodamina). Visto bajo un microscopio uores-
cente, el microorganismo emite luz uorescente amarilla
o verde. Este mtodo es ms sensible que el ZN estndar
puesto que los agentes patgenos aislados se identican
con mayor facilidad. Casi siempre es necesario desarrollar
el mtodo con un ZN estndar una vez que se identica la
localizacin de los microorganismos.
Inclusiones vricas
No hay mtodos de tincin especcos para las inclusiones
vricas ya que muchas de las tcnicas tien a otras estructu-
Cuadro 2-4 Demostracin de algunos pigmentos comunes
Pigmento Mtodo de demostracin
Hemosiderina Azul prusiano de Perl
Pigmento de la bilis Gmelina
Melanina Masson Fontana
Lipofucsinas Ferrocianuro frrico de Schmorl
PAS
Masson Fontana
Negro de Sudn
Ziehl-Neelsen largo
Digestin del precursor de Hematoxilina de plomo
la amina y descarboxilacin Masson Fontana
de grnulos celulares en Diazo
clulas neuroendocrinas Grimelius
Bodian
Clulas cromanes Reaccin cromafn
Giemsa
Cobre cido rubenico
Rodanina
Asbesto Azul prusiano de Perl
Birrefringencia
MTODOS COMUNES DE TINCIN 23
ras. Se ha usado la tartracina oxina para demostrar cuerpos
vricos en la inclusin y la orcena para la identicacin
de la hepatitis B. Los mtodos inmunocitoqumicos han
reemplazado en buena medida al reconocimiento de las in-
clusiones vricas.
Hongos
Los hongos pueden ser evidentes en muestras teidas con
H-E, pero pueden teirse de forma ms selectiva mediante
PAS, metenamina de plata de Grocott (g. 2-6), mucicar-
mina de Southgate (para Cryptococcus), tincin de Gram,
Ziehl-Neelsen y Giemsa.
colorante a la hematoxilina fosfotngstica cida. Fibri-
noide es un trmino aplicado a una sustancia hialina que
induce reacciones de tincin similares a las de la brina.
El mtodo azul de escarlata de Matius-Lendrum delinea
a los eritrocitos en tono amarillo, a la brina y brinoide
en rojo y a la colgena y brina menos reciente en azul. El
mtodo requiere una hbil diferenciacin. El mtodo origi-
nal recomend la jacin basada en el mercurio; empero,
pueden alcanzarse resultados aceptables con soluciones de
formaldehdo sin mercurio.
Amiloide
El amiloide se tie de rosa en cortes con H-E, es positivo
en moderada medida al PAS y se tie de amarillo o marrn
con la tincin de van Gieson. El amiloide se revela de ru-
tina si se utiliza el rojo Congo. Un gran nmero de formu-
laciones tie al amiloide en tonos rosados a rojos. Bajo luz
polarizada, el amiloide teido con rojo Congo es dicroico y
emite birrefringencia amarilla o verde.
El violeta de metilo o el azul de toluidina tien al ami-
loide de manera metacromtica (rojo prpura a violeta).
La tioavina T es un colorante uorescente que posee
uorescencia amarilla brillante. Este mtodo no es espec-
co pero s muy sensible.
Lpidos
Los lpidos se pueden encontrar en tejidos normales y pa-
tolgicos.
En condiciones normales, los lpidos simples se pier-
den durante el procesamiento con cera de parana y se
requieren cortes congelados para probar su presencia. Se
demuestran los lpidos simples mediante colorantes solu-
bles en grasa (p. ej., colorantes de Sudn). El principio de
la tincin se basa en la presuncin de que el colorante es
ms soluble en la grasa que en el solvente del que est com-
puesto (solubilidad electiva).
Los lpidos compuestos, en los cuales estn presentes
otros productos (p. ej., fosfolpidos), pueden resistir el pro-
cesamiento y los revelan diversos mtodos en cortes de pa-
rana. La mielina (fosfolpido) se puede perlar con azul
Luxol rpido o colorantes basados en hematoxilina.
Grnulos citoplsmicos
Grnulos de mastocitos
Los grnulos de mastocitos son metacromticos y se pue-
den demostrar mediante azul de toluidina, tionina o azul ce-
Figura 2-6 Impregnacin de plata de hifas micticas. Mtodo
de Grocott.
Espiroquetas
Quiz las espiroquetas sean los microorganismos ms dif-
ciles de demostrar en cortes tisulares. El mtodo de Leva-
diti se realiz en bloques de tejido impregnados con plata.
La impregnacin y el corte subsiguientes revelaron que las
espiroquetas aparecan en tonalidad negra.
Se han descrito varios mtodos con plata para demostrar
espiroquetas en muestras tisulares. Todos requieren un gra-
do sustancial de habilidad para obtener buenos resultados.
Algunos de ellos se han adaptado para revelar Helicobacter.
Sustancias extracelulares (brina y amiloide)
Fibrina
La brina se tie de forma intensa con eosina y es positiva
al PAS en grado moderado. La brina ja con solidez el
leste A. Los grnulos poseen metacromasia prpura o roja
con los ncleos y otras estructuras teidas de azul. Tambin
pueden reconocerse otros tejidos conectivos y algunas mu-
cinas epiteliales. De igual modo, puede emplearse el azul
alciano para reconocer los grnulos. Bancroft recomend
la esterasa de cloracetato como el mtodo de eleccin.
Grnulos celulares de Paneth
Los grnulos celulares de Paneth son acidlos y se obser-
van con facilidad y diferenciacin en muestras teidas con
H-E. El mtodo de tartracina oxina de Lendrum tie los
grnulos rojos contra un fondo amarillo.
Grnulos celulares pancreticos
Los ms especcos mtodos inmunocitoqumicos sustitu-
yeron en gran medida a la tincin de las clulas insulares
del pncreas. Algunos mtodos tradicionales incluyen he-
matoxilina con alumbre-cromo y aldehdo de fucsina para
las clulas B, Grimelius para las clulas A y el mtodo de
Hellerstrm y Hellman para las clulas D.
Grnulos celulares pituitarios
De nueva cuenta, los mtodos inmunocitoqumicos reem-
plazaron en buena medida a los mtodos tradicionales de
tincin. El PAS-anaranjado G era un mtodo aceptado y se
realizaba lo mejor posible sobre jadores basados en di-
cromato (lquido de Helly). El PAS tea a los baslos
pituitarios de magenta, el anaranjado G a los acidlos de
anaranjado y los cromfobos permanecan sin tonalidad.
Los tricromos tambin se han utilizado para reconocer los
tipos celulares.
Eosinlos
Los eosinlos son acidlos y la tincin de H-E los deli-
nea y diferencia con claridad. Tambin se han empleado las
tinciones Cromotrope y de Romanowsky.
Tejidos neurolgicos
En la histopatologa diagnstica de rutina, la demostracin
de elementos neurolgicos por mtodos de tincin conven-
cionales se reduce a las neuronas, axones y mielina. Los
mtodos inmunocitoqumicos reemplazaron en gran parte
a algunas de las tcnicas ms difciles de impregnacin en
plata (cuadro 2-5).
Conclusiones
Los mtodos convencionales de tincin an tienen una
funcin relevante en el diagnstico de la patologa tisular.
En la actualidad, los laboratorios de diagnstico usan una
combinacin de tincin y tincin inmunocitoqumica para
proporcionar la informacin necesaria que permita esta-
blecer un diagnstico informado. El aspecto morfolgico
del tejido teido con H-E represent el precursor para las
investigaciones subsecuentes.
Aunque la inmunocitoqumica ha sustituido a un nme-
ro notorio de mtodos de tincin histricos, existe todava
una gran cantidad de investigaciones que confan slo en la
tincin habitual con colorantes.
Lecturas adicionales
Este captulo slo proporciona una introduccin muy sinptica a
los aspectos relacionados con las tinciones. Para una informacin
ms profunda se recomiendan los siguientes libros:
Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Te-
chniques. 5th ed. Edinburgh: Churchill-Livingstone, 2002.
Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Techni-
que. 4th ed. London: Butterworths, 1885.
Lectura avanzada
Horobin RW, Kiernan JA (eds.), Conns Biological Stains. A Hand-
book of Dyes, Stains and Fluorochromes for use in Biology and
Medicine. 10th ed. Oxford, UK: Bios Scientic, 2002.
Agradecimientos
Quisiera expresar mi agradecimiento al Dr. Stephen Harris,
consultor histopatlogo del Staffordshire General Hospital,
por su ayuda durante la preparacin del manuscrito, y a
Jim Elsam de HTEQA Services por facilitar las imgenes
digitales.
Estructura Mtodo
Neuronas y axones Impregnacin en plata
Sustancia de Nissl Cristal violeta rpido
Mielina Azul Luxol rpido
Cianina solocrmica
PTAH
Hematoxilina de hierro
Cuadro 2-5 Algunas tinciones neurolgicas comunes
AGRADECIMIENTOS 25
Introduccin
Las enzimas son grandes protenas terciarias que actan como
catalizadores de la mayor parte de las reacciones biolgicas y
son vitales en el metabolismo celular, puesto que mantienen
la homeostasis en el hombre. Existen alrededor de 700 enzi-
mas conocidas y cada una cataliza una reaccin particular al
actuar sobre molculas especcas (sustratos). El producto
de la reaccin puede actuar como un nuevo sustrato para una
enzima diferente, segn lo ilustra el ciclo de Krebs. Despus
de cada reaccin metablica, la enzima de cada caso perma-
nece inalterada para intervenir en reacciones futuras.
Los bioqumicos estudian de rutina las concentraciones
enzimticas de las soluciones derivadas de lquidos corpo-
rales, cultivos tisulares y tejidos resecados con nes de diag-
nstico y durante las investigaciones. Esto suministra eviden-
cia valiosa en la deteccin y vigilancia de los procesos de la
enfermedad y la evaluacin de los cambios siolgicos que
induce un medicamento. Sin embargo, los resultados obteni-
dos por anlisis bioqumicos se relacionan con una poblacin
heterognea de las clulas que se encuentran en los tejidos
y no proporcionan valores celulares especcos. Es posible
llevar a cabo una valoracin ms precisa de la localizacin
intracelular de la enzima y su actividad biolgica si se recurre
a la histoqumica de la enzima. sta se basa en la aplicacin
de un sistema de deteccin enzimtico en los cortes de tejido
o en un frotis. La tcnica ofrece el producto nal de una reac-
cin coloreada que se localiza en las clulas con una intensi-
dad proporcional a la actividad de la enzima. A diferencia de
los mtodos bioqumicos, esta intensidad es difcil de cuanti-
car, pero los aspectos microscpicos cualitativos como los
que observa un patlogo experimentado son ms relevantes
en la deteccin y determinacin histolgicas de los procesos
patolgicos.
El principal problema con la histoqumica enzimtica es
la retencin de la funcin de la enzima durante la prepara-
cin del tejido y la tincin histoqumica. Se han desarrollado
numerosos mtodos histolgicos para enzimas especcas,
y si bien estos mtodos no son difciles, los procedimientos
no estandarizados de manipulacin de los tejidos requeridos
han obligado a realizar con regularidad estas tcnicas en la-
boratorios especializados.
Otros mtodos histoqumicos no enzimticos para la de-
teccin de la enzima en cortes estndar de parana incluyen
la inmunohistoqumica y la hibridacin in situ del mRNA.
Estos mtodos pueden identicar la presencia o produccin
de enzimas celulares, pero ninguno puede mostrar la activi-
dad biolgica de la enzima.
Estructura y clasicacin
Estructura
Las enzimas son protenas globulares de alto peso molecular
que pueden hallarse libres dentro del citoplasma (lisoenzi-
mas) o jarse en las membranas celulares (desmoenzimas).
Los componentes no protenicos (grupos prostticos) pue-
den unirse a la enzima, lo cual puede ayudar a formar una
estructura cuaternaria activa. La propiedad funcional de la
enzima depende de mantener la forma y carga de su sitio
activo en el punto de la interaccin enzima/sustrato.
Se necesitan varios cofactores para la mayor parte de las
reacciones. Activadores como los iones de calcio, magne-
sio, manganeso, sodio, potasio y otros ayudan a transferir
el electrn durante la reaccin enzimtica. Las coenzimas
son molculas que se combinan con una apoenzima in-
activa y crean un sitio activo en trminos estricos por la
3
Histoqumica de las enzimas
Trevor Gray y Neil Hand
alteracin de la estructura cuaternaria de la apoenzima. La
coenzima puede tambin combinarse con el sustrato y des-
empear una parte activa en la reaccin metablica. Casi
todas las vitaminas B son coenzimas.
Clasicacin
Se puede clasicar a las enzimas de varias maneras; la ms
precisa se basa en el cdigo de cada una, de acuerdo con el
nombre sistemtico de la enzima. ste contiene el nombre
del sustrato especco sobre el que reacciona, seguido por
una palabra con el sujo -asa, y se especica el tipo de
reaccin participante. En el diagnstico histoqumico de la
enzima se utiliza un nombre ms corto debido al pequeo
nmero de enzimas investigado.
Los seis grupos mayores de enzimas se clasican segn
sea su efecto sobre el sustrato: oxidorreductasas, transfe-
rasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Probable-
mente, los grupos ms importantes para el diagnstico
histoqumico de la enzima son las oxidorreductasas (antes
conocidas como oxidasas y deshidrogenasas) e hidrolasas.
stas se llaman a menudo enzimas oxidativas e hidrol-
ticas, respectivamente.
Conservacin y preparacin
Conservacin de la enzima
Los efectos acumulativos de las etapas del procesamien-
to requeridas en la produccin de un bloque de tejido
impregnado en parana, como la jacin, deshidratacin
e inclusin en cera de parana, no son favorables para la
preservacin funcional de las enzimas. Por lo general, es-
tos procedimientos dan lugar a la prdida completa de la
actividad enzimtica, aunque la esterasa de cloracetato y
la peroxidasa son resistentes en grado suciente al dao
del procesamiento de la parana. Por lo tanto, las demos-
traciones de la mayor parte de las enzimas se llevan a cabo
casi siempre en cortes congelados, pero tambin pueden
emplearse otras preparaciones como los frotis.
Es importante recordar que diversas enzimas reaccionan
de manera diferente a las inuencias externas, pero la ma-
yor parte de las enzimas se pierde con rapidez si el tejido
fresco se deja a temperatura ambiente. Muchas enzimas
oxidativas que poseen relevancia diagnstica para inves-
tigar una enfermedad del msculo se localizan en la mi-
tocondria. Cuando se sustrae el oxgeno del tejido fresco,
las membranas mitocndricas se daan en poco tiempo y
se observa la reduccin de la actividad de la enzima. En
consecuencia, es importante congelar a la brevedad el teji-
do, que est fresco, ya que casi ninguna enzima oxidativa
puede soportar la jacin convencional. Las enzimas hidro-
lticas estn contenidas en los lisosomas, pero se alteran por
el congelamiento y el subsiguiente descongelamiento de los
bloques o cortes con liberacin de enzimas. La difusin de
las enzimas hidrolticas puede minimizarse y la localizacin
mejorarse si el tejido se trata con un jador antes de la crio-
toma, aunque es posible alguna prdida de la actividad enzi-
mtica. En la prctica, la tincin histoqumica de la enzima se
efecta sobre las muestras desmontables del cristato, sobre
todo en circunstancias clnicas en las que un retraso diagns-
tico es indeseable o cuando se necesita reconocer diferentes
enzimas en la misma muestra. Empero, la localizacin de
algunas enzimas puede resultar un poco mejor si se ja el
espcimen de tejido despus de la criotoma.
Si se recurre a la jacin, los jadores deben estar a 4C y
utilizarse por el menor tiempo posible. Con frecuencia se re-
comienda el formol de calcio para los bloques de tejidos, ya
que ayuda a mantener la integridad de la membrana celular,
aunque la formalina amortiguada o la salina formal son satis-
factorias en casi todos los casos. La criotoma y la actividad
de la enzima pueden mejorarse al lavar el tejido jado en una
solucin amortiguadora de sucrosa antes del congelamiento.
Para resultados ptimos es importante mantener estas solu-
ciones cercanas al pH siolgico del tejido. Se ha empleado
una variedad de jadores, adems del formol de calcio, en
frotis y secciones de cristatos, entre ellos acetona, vapor
de formalina y mezclas de formalina-alcohol. La opcin del
jador depende de la enzima particular investigada y de la
relacin entre la actividad enzimtica y el aspecto morfol-
gico. Aun despus de tiempos de jacin cortos, la mayora
de las enzimas oxidativas se torna inactiva pero, segn se
mencion ya, la jacin puede emplearse en la demostracin
de estas enzimas al ayudar a preservar la morfologa celular
y la localizacin del producto nal de la reaccin.
Preparacin del tejido
Varios mtodos estn disponibles para el examen de las en-
zimas, pero en este captulo slo se consideran los cortes
congelados, frotis y secciones de parana. Como se ha se-
alado, las enzimas que deben revelarse determinan el tipo
de preparacin empleada.
Cortes congelados
La preparacin ms comn de la muestra en la histoqumica
de la enzima es el uso de cortes congelados, casi siempre
practicados con un cristato. Es necesario que el tejido se
congele con rapidez, ya que el congelamiento lento induce
artefactos de cristal de hielo: el congelamiento ms rpido
forma cristales de hielo ms pequeos. Las biopsias muscu-
28 CAP. 3 HISTOQUMICA DE LAS ENZIMAS
lares se consideran para la mayora de las muestras his-
toqumicas de la enzima de diagnstico, aunque son muy
propensas a los artefactos de cristal de hielo. El mtodo
ptimo para el congelamiento del msculo incluye el uso
del isopentano congelado con nitrgeno lquido y el des-
congelamiento gradual. La fraccin slida acta como un
amortiguador trmico y mantiene la temperatura de la frac-
cin lquida estable (150C) durante el congelamiento del
tejido. El tejido (jado o sin jar) se orienta sobre un disco
de corcho en gel de OCT y se sumerge en el isopentano
descongelado hasta que el gel y la muestra se congelan. De
igual modo, el corcho se une al bloque sostenedor median-
te el compuesto de OCT y entonces se coloca dentro del
cristato listo para la seccin a 23C. El nitrgeno lquido
solo no puede emplearse, ya que tiene un ndice bajo de
conductividad trmica y produce una barrera trmica ga-
seosa alrededor del tejido, lo cual provoca dao celular al
permitir la formacin de grandes cristales de hielo.
Frotis
Los frotis pueden prepararse por varios mtodos a partir de
suspensiones de sangre, mdula sea y clulas de tejido. Los
frotis impresos de tejido, por ejemplo los ganglios linfti-
cos, son tambin tiles si el tejido fresco se corta y la nueva
supercie se coloca suavemente otra vez en un portaobjetos
limpio. La mayor parte de los frotis se seca al aire y se ja
(segn sean las enzimas requeridas) por pocos segundos,
casi siempre con acetona fra, antes de la tincin citoqumica
de las clulas.
Secciones de cera de parana
Casi ninguna enzima resiste los efectos del procesamien-
to de cera de parana estndar, por lo cual este modo de
preparacin no suele ser til. La peroxidasa y la esterasa
de cloracetato son lo suciente fuertes para sobrevivir a
la inclusin en cera de parana y pueden demostrarse con
facilidad. Algunas otras enzimas pueden preservarse de
modo parcial al usar medidas especiales con ceras de bajo
punto de fusin, pero esto slo es ocasional.
Tcnicas histoqumicas
Estos mtodos histolgicos son los nicos en los que las
enzimas nunca se tien; slo los productos de reaccin se
delinean. Para obtener resultados relevantes son esenciales
la cuidadosa optimizacin de la reaccin de la enzima y la
coloracin del producto de reaccin.
El proceso implica el desdoblamiento de un sustrato por
la enzima ligada al tejido para formar un producto de reac-
cin primario (PRP). Este PRP puede entonces reaccionar con
un qumico conocido como agente de captura para formar un
producto de reaccin nal (PRF), que debe ser insoluble y
estar en el sitio de la enzima. Numerosos factores modican
las reacciones y todos deben controlarse de manera cuidado-
sa. El pH de las soluciones de incubacin es crtico para la
mayora de las reacciones de la enzima y debe mantenerse
con los amortiguadores apropiados. Al cambiar la tempera-
tura puede alterarse la tasa de reaccin de la enzima; algunos
mtodos requieren incubacin a 37C, mientras que otros se
realizan a temperatura ambiente. La temperatura ambiente
subptima permite ms tiempo para la terminacin de la for-
macin del PRF y el agente de captura, lo cual mejora la lo-
calizacin del PRF en el sitio de la enzima y reduce la tasa de
reaccin. Los sustratos y los agentes de captura deben ele-
girse para prevenir interacciones y ambos deben difundirse
con facilidad a travs de las membranas celulares. El sustrato
y el agente secuestrador deben usarse a una concentracin
que prevenga el agotamiento durante la rpida actividad de
la enzima, pero no a una concentracin que podra inhibir la
reaccin de la enzima. La seleccin de un agente de captura
depende del mtodo enzimtico utilizado y el tipo de tejido
en el cual se encuentra la enzima. Por ejemplo, cuando se usa
el mtodo de precipitacin de metal sobre el msculo, se
preere la sal de calcio a la sal de plomo, dado que la segun-
da puede ligarse de modo inespecco al msculo. Adems,
muchas veces hay una eleccin de sustratos, aunque muchos
sustratos que ocurren de forma natural, si bien econmicos,
pueden ser inespeccos o producir PRP que no sean del
todo insolubles. Los sustratos especialmente sintetizados
casi siempre ofrecen resultados superiores.
Es importante incluir un control positivo del tejido du-
rante la tincin histoqumica de modo que puedan exami-
narse la calidad de los reactivos y la exactitud del protocolo
empleado. La omisin del sustrato del medio de incuba-
cin o la inclusin de inhibidores especcos actan como
un control negativo.
Mtodos de reaccin de la enzima
En histopatologa, la mayor parte de las enzimas se de-
muestra mediante: a) acoplamiento simultneo o b) aco-
plamiento posincubacin.
Acoplamiento simultneo
El acoplamiento simultneo slo requiere una solucin que
contenga el sustrato y un agente secuestrador con el cofac-
tor requerido. La enzima ligada al tejido reacciona con el
sustrato en la solucin para producir un PRP. ste puede
ser insoluble o soluble, ya que el agente secuestrador (tam-
TCNICAS HISTOQUMICAS 29
bin en solucin) se liga con el PRP de forma instantnea
para formar un PRF. Este PRF insoluble se liga al sitio de la
enzima y puede colorearse o permanecer incoloro, aunque
lo ltimo podra requerir un paso de coloracin adicional
para la visualizacin.
Acoplamiento posincubacin
Algunas veces no es posible tener el sustrato y el agente se-
cuestrador en una solucin, ya que las condiciones necesarias
para la produccin del PRP pueden ser diferentes respecto de
las requeridas para la elaboracin del PRF. En ocasiones, el
agente secuestrador puede adems interferir con la funcin
de la enzima o inhibirla. En los mtodos de acoplamiento
posincubacin, la solucin inicial slo contiene al sustrato
y algunos cofactores necesarios. El PRP debe ser insoluble
puesto que son posibles falsos negativos o la difusin den-
sa del PRF. Una solucin secundaria que contiene al agente
secuestrador se aplica entonces para producir el PRF, como
se indic. En la prctica es difcil encontrar los sustratos con-
venientes para los mtodos de acoplamiento posincubacin,
con un resultado que se utiliza rara vez.
Mtodos de demostracin
En condiciones normales, los PRF coloreados se producen
por uno de los siguientes mtodos:
1. Precipitacin del metal.
2. Diazo.
3. Sal de tetrazolio.
4. Mtodo indigognico.
Otros mtodos incluyen:
5. La oxidacin de 3,3-diaminobencidina (DAB) por la
oxidasa de citocromo o las peroxidasas para formar un
pigmento marrn.
6. El metabolismo del glucgeno por la fosforilasa para
producir un polisacrido que se colorea de azul/negro
con yodo.
Mtodos de precipitacin de metal
Los mtodos de precipitacin de metal se usan de rutina para
identicar fosfatasas, por ejemplo fosfatasa cida, fosfata-
sa alcalina y trifosfatasa de adenosina (ATPasa; g. 3-1).
stos dependen de la liberacin de iones de fosfato del
sustrato, que entonces reaccionan con el plomo o las sales
de calcio en la solucin (agente de captura) para formar el
PRF insoluble de plomo o fosfato de calcio.
El fosfato de plomo es incoloro pero se ennegrece con
solucin de sulfuro de amonio para formar sulfuro de plo-
mo. El fosfato de calcio es insoluble a un pH alcalino y
debe convertirse en fosfato de cobalto con solucin de clo-
ruro de cobalto, tratado antes con sulfuro de amonio para
formar sulfuro de cobalto negro. Con el tiempo, estos m-
todos son propensos a desteirse, pero pueden recolorearse
con sulfuro de amonio.
El mtodo con la acetilcolinesterasa que usa el sustrato
acetilcolina puede considerarse un mtodo de precipitacin
metlica que produce un PRP de tiocolina, el cual reaccio-
na con el sulfato de cobre y el ferrocianuro de potasio, res-
pectivamente, para formar ferrocianuro de cobre marrn.
Mtodos diazo
Los mtodos diazo se utilizan para identicar las fosfata-
sas alcalinas y cidas, la esterasa inespecca y la esterasa
de cloracetato. Los diferentes sustratos contienen un grupo
naftol que puede atacar a una de las enzimas anteriores.
Varias sales de diazonio o la pararrosanilina hexazotizada
se emplean para reaccionar con el grupo naftol y formar
un diazo insoluble coloreado. De manera caracterstica, las
sales de diazonio usadas incluyen rojo rpido TR, azul r-
pido RR, azul rpido B y Garnet rpido GBC, que deben
montarse en medio acuoso. El diazo, formado a partir de la
pararrosanilina hexazotizada, es el mtodo de opcin, ya
que puede practicarse en una resina sinttica, lo que mejora
la localizacin ptica en la microscopia de luz. Las sales
Figura 3-1 Los cortes congelados muestran la tincin diferen-
cial de bras musculares para ATPasa tras la incubacin a pH 4.2
con una tcnica de precipitacin de metal.
de diazonio pueden usarse con mtodos simultneos o de
acoplamiento posincubacin.
Mtodos con sales de tetrazolio
Las sales de tetrazolio, que son incoloras y solubles en
agua, aceptan hidrgeno liberado de modo enzimtico del
sustrato para formar depsitos microcristalinos coloreados
insolubles en agua, los llamados formazanes. Muchas enzi-
mas oxidativas, como la deshidrogenasa succnica, se iden-
tican mediante sales de tetrazolio, como el metil-tiazolil-
difenil tetrazolio (MTT; g. 3-2) y el tetrazolio nitroazul
(NBT). Como en el caso de las sales de diazonio, varios
Figura 3-2 Corte congelado de msculo teido para diaforasa de
NADH con la sal de tetrazolio MTT.
Figura 3-3 Corte congelado de yeyuno que muestra la actividad
de la lactasa sobre la microvellosidad, teida de turquesa median-
te el mtodo indigognico.
2. Sospecha de enfermedad de Hirschsprung en nervios y
ganglios.
3. Valoracin de la malabsorcin del tejido gastrointestinal.
4. Demostracin de clulas linfoides y mieloides.
5. Identicacin de degeneracin temprana del hgado.
Las dos primeras aplicaciones son las ms comunes, pero
se remiten inusualmente a los centros de diagnstico espe-
cializados.
Msculo esqueltico
Se ha establecido con rmeza el uso de la histoqumica enzi-
mtica en el diagnstico de las enfermedades neuromuscu-
lares y miopatas congnitas; en realidad, muchos aspectos
histopatolgicos slo se reconocieron y describieron despus
de la introduccin de la histoqumica de las enzimas.
La tincin tradicional del msculo estriado es suciente
para mostrar las reacciones inamatorias y la variacin del
tamao de la bra, pero es incapaz de diferenciar entre los
diversos tipos de bra muscular. Esto es importante porque
muchas enfermedades se limitan a tipos especcos de -
bras musculares o muestran alteracin de stas. La anomala
puede asumir la forma de atroa o hipertroa y, en ciertas
afecciones, de alteracin de la estructura celular interna. La
aplicacin de los mtodos de histoqumica enzimtica al
msculo esqueltico cortado en sentido transversal facilita la
distincin de los tipos de bras; esto, junto con el examen de
su distribucin y tamao, puede ser de utilidad diagnstica.
En general, las bras del msculo estriado pueden dividirse
en los tipos 1 y 2, de acuerdo con el nivel de actividad de la
ATPasa mostrada a un pH de 9.4. Si la tincin de la ATPasa
se aplica despus de la preincubacin en un amortiguador a
APLICACIONES DIAGNSTICAS DE LA HISTOQUMICA ENZIMTICA 31
factores modican su seleccin, pero el NBT se usa ms a
menudo que el MTT, de modo que puede montarse en una
resina sinttica.
Mtodo indigognico
Los sustratos contienen un grupo indoxilo, que se libe-
ra como un PRP; ste, a su vez, se oxida por accin del
agente de captura ferrocianuro de potasio para formar PRF
turquesa (g. 3-3). La solucin de incubacin tambin in-
cluye ferrocianuro de potasio, que previene la sobreoxida-
cin del PRF.
Aplicaciones diagnsticas
de la histoqumica enzimtica
La histoqumica de la enzima puede ser de utilidad en va-
rias aplicaciones diagnsticas, entre ellas las siguientes:
1. Tipicacin de la bra muscular esqueltica.
un pH de 4.2 o 4.6, es posible establecer una diferenciacin
adicional de las bras de tipo 2 en los subtipos 2A, 2B y
2C (g. 3-1). Otra enzima importante para demostrar es la
fosforilasa, que en la enfermedad de McArdle es decien-
te en las clulas del msculo estriado, pero no desaparece
del msculo liso de los vasos sanguneos, y por tanto es
til como control. La diaforasa de NADH (dinucletido de
nicotinamida y adenina reducido) se utiliza para el estudio
de la estructura interna de las clulas musculares, dado que
delinea a la mitocondria y a la red del retculo sarcopls-
mico (g. 3-2). Cuando esto se compara con la distribu-
cin miobrilar de la ATPasa pueden reconocerse varias
anomalas. Los patrones anormales de la distribucin de la
enzima se describen a menudo en trminos de sus aspectos,
que son especcos de una enfermedad particular, como
bras objetivo, bras anulares y ncleos centrales.
La oxidasa del citocromo, deshidrogenasa succnica y des-
hidrogenasa de lactato son ms especcas para la mito-
condria y pueden proporcionar ayuda en la identicacin
de miopatas mitocndricas. En el cuadro 3-1 se muestra
un resumen de la tincin diferencial enzimtica del mscu-
lo esqueltico.
Cuadro 3-1 Histoqumica enzimtica diagnstica
Msculo
estriado
Nervios
Yeyuno
ATPasa
miobrilar
NADH
diaforasa
Deshidrogenasa
succnica
Oxidasa de
citocromo
Miofosforilasa
Desaminasa de
mioadenilato
Aldolasa
Fosfofructocinasa
Acetilcolinesterasa
Lactasa
Sucrasa
Precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
Preincubacin de
precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
@ pH 4.6
Preincubacin de
precipitacin metlica
(cloruro de calcio)
@ pH 4.2
Sal de tetrazolio (MTT)
Sal de tetrazolio (MTT)
Oxidacin de DAB
Metabolismo de
glucgeno (yodo)
Sal de tetrazolio (NBT)
Ferricianuro de potasio
reaccin de sulfato de
cobre (precipitacin
metlica)
Mtodo indigognico
(ferrocianuro de potasio)
Diazo (pararrosanilina)
Trifosfato de adenosina
(ATP)
NADH
Succinato de sodio
Citocromo c
Glucosa-1 fosfato
Adenosina 5-
monofosfato (AMP)
Fructosa disdica
1,6 difosfato
Fructosa 6-fosfato
Yoduro de acetiltiocolina
d-Fucosida de 5-bromo-
4-cloro-3-indoxil-
d-Glucosida de 6-bromo-
2-naftil-
9.4
7.0
7.0
7.4
5.9
6.1
8.6
7.0
6.0
6.0
6.0
Negro/marrn
Negro
Negro
Marrn
Prpura/negro
Azul
Rojo/marrn
Turquesa
Rojo
Fibras tipo 1: plidas
Fibras tipos 2a, 2b y 2c:
oscuras
Fibra tipo 1: oscuras
Fibras tipos 2b y 2c: in-
termedias
Fibras tipo 2a: plidas
Fibras tipo 1: oscuras
Fibras tipo 2c: interme-
dias
Fibras tipos 2a y 2b: p-
lidas
Mitocondria (bras tipo
1: ms oscuras)
Retculo sarcoplsmico
Para mitocondria (bras
tipo 1: ms oscuras)
Anormalidades mitocn-
dricas
Tincin negativa de las
bras musculares en la
enfermedad de McArdle
Ausente en algunos tras-
tornos metablicos
Fibras y clulas del nervio
En recto, colon (Hirsch-
sprung) y enfermedades
musculares
Reducido o negativo con
malabsorcin
Tejido Enzima Mtodo Sustrato pH Color Identicacin
En fecha reciente, los mtodos inmunohistoqumicos se
han desarrollado para la tipicacin conable de la bra
muscular del tejido procesado con parana. Si bien ste
puede tener un importante potencial diagnstico para tales
tejidos procesados, no permite la identicacin de las otras
enzimas relevantes desde el punto de vista diagnstico o la
capacidad para mostrar su actividad metablica.
Nervios y ganglios
En el colon y recto normales, las clulas ganglionares y
nervios relacionados se encargan de la motilidad del colon.
En la enfermedad de Hirschsprung infantil se reconoce
la ausencia ganglionar en la unin de las capas circular y
longitudinal del msculo liso (plexo mientrico) y en la
submucosa. Existe tambin un incremento marcado del
nmero y grosor de las bras nerviosas no argirlas en la
submucosa y la lmina propia. En la actualidad, las clulas
ganglionares pueden identicarse sobre un corte con H-E,
pero esto es mucho ms difcil con las bras del nervio. Las
clulas ganglionares y las bras del nervio contienen coli-
nesterasa, la cual puede reconocerse con el mtodo rpido
de la acetilcolinesterasa. En condiciones normales se re-
quiere la identicacin de la enfermedad de Hirschsprung
para conrmar el diagnstico inicial y ms tarde, durante
la operacin correctiva, cuando los lmites de la reseccin
deben precisarse antes de la eliminacin del intestino anor-
mal. Como sta se lleva a cabo durante la intervencin me-
diante biopsias pequeas de aspiracin rectal, la rapidez
es esencial. Las muestras obtenidas con cristato y teidas
con H-E suelen ser sucientes para detectar la presencia
o ausencia de clulas ganglionares grandes; no obstante,
puede utilizarse cualquier biopsia supercial que no des-
carta el mtodo de la acetilcolinesterasa para mostrar las
bras del nervio anormales en la lmina propia (g. 3-4).
El mismo mtodo puede usarse para demostrar anorma-
lidades motoras de la placa terminal en biopsias de mscu-
lo estriado.
Tejido gastrointestinal
Para determinar un diagnstico denitivo en las biopsias
gastrointestinales con sospecha de mala absorcin, la in-
formacin morfolgica es insuciente. Varias enzimas en
el contorno de la vellosidad son tiles, pero las disacari-
dasas, lactasa, trehalasa y sucrasa son en particular impor-
tantes. Estas enzimas reejan cambios observados al da-
arse el enterocito; la lactasa (g. 3-3) es la ms sensible,
mientras que la sucrasa es la ms resistente y por lo tanto
la tincin histoqumica para estas dos disacaridasas es de
utilidad. Estos mtodos pueden tambin emplearse para
detectar deciencias primarias de lactasa o sucrasa, aunque
en clnica la prueba bioqumica de estos disacridos es ms
importante que la identicacin histoqumica.
La fosfatasa cida encontrada en los lisosomas de los
enterocitos y en macrfagos de la lmina propia puede
tambin ser una enzima til para demostrar malabsorcin.
Para evaluar y vigilar de modo apropiado la malabsorcin se
requiere que el yeyuno se oriente de tal forma que las ve-
llosidades se seccionen en sentido longitudinal.
Clulas linfoides y mieloides
Diversas enzimas, incluidas la esterasa inespecca, la fosfa-
tasa cida y la esterasa de cloracetato, se usan para la identi-
cacin citoqumica y evaluacin de clulas en preparacio-
nes para frotis, como se muestra en el cuadro 3-2. Adems
de la actividad enzimtica, las clulas especcas pueden
diferenciarse por su patrn de tincin, es decir, focal o difu-
so. La inmunohistoqumica es ahora el mtodo optativo para
APLICACIONES DIAGNSTICAS DE LA HISTOQUMICA ENZIMTICA 33
Figura 3-4 Corte congelado de tejido rectal con enfermedad de
Hirschsprung teido para acetilcolinesterasa que demuestra las -
bras engrosadas del nervio.
la identicacin de estas clulas en la histopatologa, pero
algunos departamentos de hematologa todava utilizan los
mtodos enzimticos histoqumicos. La esterasa de clora-
cetato, que resiste la inclusin en parana, como se men-
cion con anterioridad, puede distinguir clulas linfoides y
mieloides. Los mastocitos se reconocen con facilidad por
su tincin intensa, morfologa y granularidad mediante este
mtodo histoqumico de la enzima (g. 3-5).
Conclusin
La histoqumica de la enzima todava desempea un papel
vital en la histopatologa, sobre todo en la deteccin y diag-
nstico de la enfermedad muscular, incluso si estn ahora
disponibles nuevos mtodos inmunohistoqumicos. En la
inmunocitoqumica y la biologa molecular, las tcnicas his-
toqumicas de la enzima se utilizan de rutina en los sistemas
de deteccin. El mtodo del formazn para la deshidrogena-
sa succnica se ha usado de manera exitosa en macrocortes
frescos del corazn tras identicar post mortem el infarto
del tejido. El cientco forense tambin ha usado los mto-
dos histoqumicos de la enzima para determinar la fecha y
el tiempo en que se cometi una herida. En la investigacin
se estudia un espectro mucho ms amplio de enzimas con
tcnicas diversas, entre ellas microscopia electrnica y cito-
metra de ujo, adems de la microscopia de luz.
Referencias
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Cuadro 3-2 Tincin histoqumica enzimtica de los leucocitos
Enzima Mtodo Sustrato pH Color Comentario
Esterasa de cloracetato
Fosfatasa cida
Fosfatasa alcalina
Esterasa inespecca
Diazo (rojo rpido TR)
Cloracetato de
naftol AS-D
Fosfato de naftol
AS-BI
Acetato de -naftilo
Rojo
Rojo
Rojo
Rojo
6.3
5.0
8.0
7.6
Primero se tien las clulas ceba-
das, luego los eosinlos y neu-
trlos
Las clulas T de los monocitos di-
fusamente teidos tienen una sola
mancha pequea
Neutrlos
Monocitos
Figura 3-5 La muestra en parana de la piel muestra mastocitos
de la dermis teidos de rojo para esterasa de cloracetato con clo-
racetato de naftol AS-D y pararrosanilina de hexazonio.
Degeneracin heptica
La ausencia de actividad enzimtica en los cortes congela-
dos de hgado puede ser til en la identicacin temprana
del dao al hepatocito y los cambios cirrticos. Donde existe
un cambio cirrtico notorio, es importante el control de la
muestra en ausencia de algunos hepatocitos normales pre-
sentes que acten como control interno. La redistribucin de
la actividad enzimtica, como la fosfatasa cida localizada
en los ncleos, es tambin una seal temprana de dao celu-
lar y necrosis eventual debido a la degeneracin lisosmica.
Introduccin
En trminos de la funcin normal y los estados de enferme-
dad, el estudio de la morfologa simple de cortes o clulas
casi siempre es suciente para el anlisis. Segn se describe
en los captulos 3 y 5, las tcnicas auxiliares como la histo-
qumica, histoqumica enzimtica y microscopia electrnica
pueden ser las ms provechosas para entender mejor la natu-
raleza y el estado funcional de una clula o un tipo de teji-
do. Sin embargo, en el decenio de 1970 result evidente que
era necesaria y posible una valoracin ms detallada de los
productos de la funcin celular. En histopatologa, el adve-
nimiento de la inmunohistoqumica (IHQ) fue emocionante
y abri grandes y nuevas perspectivas en la investigacin de
biopsias y las muestras quirrgicas de escisin. El principio
que subyace a la IHQ es la demostracin del antgeno por
medio de su enlace a un anticuerpo que, a su vez, se une
a una marca que puede visualizarse en forma histolgica
(g. 4-1). En consecuencia, puede delinearse el sitio del an-
tgeno en cuestin. Los mtodos de IHQ se pueden clasicar
en tres grupos principales, directos, indirectos y complejos,
desde aquellos que usan la uorescencia ultravioleta activa-
da hasta los cromgenos. Adems, el material particulado,
como el metal pesado, se puede utilizar en los microscopios
de luz y electrnico.
Mtodos directos
En los mtodos directos, el anticuerpo dirigido contra cierta
molcula o parte de ella (epitopo) se une a un espcimen. El
anticuerpo tiene un agente indicador unido a l y entonces
se visualiza de manera directa. El mtodo es relativamente
insensible en tanto que no haya ninguna amplicacin
de la seal antignica. La tcnica directa se ha abandonado
en gran parte en los procedimientos IHQ; empero, an es
el mtodo de eleccin para la citometra de ujo (vase
cap. 8).
Mtodos indirectos
Los mtodos indirectos implican el uso de capas del an-
ticuerpo para demostrar el antgeno en cuestin. Esto lo
ilustra de forma tpica la acumulacin de estratos de anti-
cuerpos dirigidos contra antgenos de especies que dieren
en especicidad, lo que crea un cono invertido de mo-
lculas, de tal modo que se amplica en grado notable la
seal original. Por ejemplo, como primer paso se reactiva
mejor el antgeno de conejo antihumano con un anticuerpo
de cerdo anticonejo marcado. Esto proporciona mayor sen-
sibilidad que los mtodos directos, pero los mtodos ms
complejos lo han reemplazado en gran proporcin.
Mtodos de mltiples etapas
Estos mtodos emplean capas de anticuerpos y marcas para
amplicar la seal en el sitio de enlace del anticuerpo. Son
ejemplos los mtodos del puente enzimtico, la peroxidasa-
antiperoxidasa (PAP) y las tcnicas de la fosfatasa alcalina-
antifosfatasa alcalina (APAAP), adems de los basados en
avidina/estreptavidn-biotina. En todas estas reacciones la
sensibilidad de la seal es mucho mayor que en las tcnicas
directas e indirectas y el cono invertido de la amplicacin
es mucho ms grande con las capas mltiples de molculas.
4
Inmunohistoqumica
Jane Starczynsky y John Crocker
36 CAP. 4 INMUNOHISTOQUMICA
Figura 4-1 Diagrama esquemtico para mostrar algunas de las secuencias ms comunes en IHQ. a) Mtodo directo: el anticuerpo primario
marcado reacciona con el antgeno del tejido. b) Mtodo indirecto de dos pasos: el anticuerpo secundario marcado en forma enzimtica
reacciona con el anticuerpo primario unido al antgeno del tejido. c) Mtodo indirecto de tres pasos: el anticuerpo terciario marcado de modo
enzimtico reacciona con el anticuerpo secundario marcado. d) El complejo APAAP reacciona con el anticuerpo secundario. El anticuerpo
primario y el anticuerpo del complejo inmunitario deben ser de la misma especie. e) En el mtodo CAB, el complejo avidina o estreptavi-
dina-biotina-enzima reacciona con el anticuerpo secundario biotinilado. f) En la secuencia catalizada de la amplicacin de la seal (CSA),
el anticuerpo primario antecede a un anticuerpo secundario biotinilado, luego sigue el complejo (estrept)avidina, despus el reactivo de la
amplicacin y, por ltimo, el complejo (estrept)avidina-enzima. g) Tincin dual para dos epitopos mediante la metodologa CSA. Se aplica
el primer anticuerpo, le sigue la primera molcula de la espina y a continuacin un cromgeno apropiado. Despus se aplica un agente de
bloqueo. Se utiliza luego el segundo anticuerpo primario, con una segunda molcula espina y un segundo cromgeno. h) Simbologa para
a) a f). Reproducido con autorizacin de DAKO Cytomation Ltd.
Molculas indicadoras y de acoplamiento
Para visualizar el antgeno, si bien de modo indirecto, es
necesario producir una seal visual para localizar el sitio
de unin en las clulas o los tejidos. Por consiguiente, se ha
desarrollado una gama de sistemas indicadores a travs
de los aos. stos se describen a continuacin en un orden
cronolgico aproximado.
Molculas uorescentes
El indicador original fue la tincin uorescente, que marca-
ba al anticuerpo apropiado. A continuacin se poda visua-
lizar el antgeno por microscopia uorescente (vase cap.
6). Una limitacin del uso de las molculas uorescentes
indicadoras es su fotoinestabilidad, esto es, la seal se de-
colora de manera gradual al exponerse a la luz del da. Debe
advertirse que las propiedades antignicas, no tanto las uo-
rescentes, de la uorescencia se utilizan ahora por el buen
efecto sobre los sistemas de deteccin que no se basan en la
biotina por IHQ. En la actualidad se dispone de uorforos
mltiples con diversas frecuencias de excitacin y emisin
que puedan emplearse para permitir el marcado simultneo
de antgenos mltiples dentro del mismo tejido.
La inmunouorescencia tiene un uso relativamente limi-
tado en el laboratorio de diagnstico, pero todava se con-
sidera en la valoracin de las biopsias de rin (g. 4-2) y
MTODOS DE MLTIPLES ETAPAS 37
Figura 4-1 (Continuacin)
Figura 4-2 Micrografa de un glomrulo de una biopsia renal.
El paciente padeca una glomerulopata IgA y la delicada inmuno-
tincin se puede reconocer en este corte congelado, reactivado
con IgA (verde uorescente). Reproducido por cortesa del Dr.
Aarnoud Huissoon.
piel, quiz porque el material favorece la demostracin del
antgeno lineal o membranoso. Todava se utiliza extensa-
mente para la localizacin del antgeno en la investigacin;
adems, con la capacidad simultnea de localizar los ant-
genos mltiples dentro del mismo tejido o clula, propor-
ciona la informacin til sobre las interacciones celulares
y protenicas.
Peroxidasa
La peroxidasa de rbano (PR) es una molcula que se adap-
ta de modo extraordinario para la investigacin de la enfer-
medad humana. En primer lugar, no es de origen mamfero,
Anticuerpo secundario
Anticuerpo primario
Anticuerpo secundario (anticonejo)
Anticuerpo secundario (antirratn)
Antgeno tisular primario
Antgeno tisular secundario
Enzina PR
Enzima FA
Bloqueo de tincin doble
Rojo sensible
Polmero (molcula espinal)
sino que se deriva, por supuesto, de una planta. Esto signica
que las oportunidades de una reaccin cruzada antignica se
reducen; no obstante, debe notarse que la actividad enzim-
tica de la PR es similar a la de los mamferos y esto puede
causar problemas cuando la enzima se demuestra en tejidos
o clulas (vase ms adelante). En segundo lugar, puede re-
velarse con facilidad a travs de su reaccin con diversos
sustratos y se forma un producto teido de la reaccin que
puede visualizarse al microscopio, por ejemplo la 3,3-dia-
minobencidina (DAB) en presencia de perxido de hidrge-
no. Por ltimo, es una molcula que puede usarse en el plano
ultraestructural. El marcado de PR se ha utilizado en tcni-
cas directas, indirectas y de mltiples etapas. Por algunos
aos, la principal tcnica de los laboratorios de histopato-
loga fue el mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP).
Sin embargo, la tcnica de la avidina-biotina (CAB) ms
amplicadora ha desplazado en buena medida a aqulla.
Un problema con el uso de la PR es que arroja resultados
falsos en presencia de actividad peroxidsica endgena en
tejido humano u otros, lo que conduce a una reaccin po-
sitiva; por ejemplo, los neutrlos polimorfonucleares tie-
nen actividad peroxidsica endgena. Afortunadamente, esta
actividad se puede bloquear en gran parte mediante pre-
tratamiento de la muestra con reactivos bloqueadores, sobre
todo perxido de hidrgeno o cido clorhdrico en metanol
y azida de sodio. Incluso con esta medida, ciertas clulas, en
particular neutrlos polimorfonucleares y mastocitos, que
son muy ricos en peroxidasa, pueden expresar resultados po-
sitivos falsos.
Fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina (FA) es otra enzima que ha encontrado
amplio uso en la IHQ, en especial en las preparaciones celu-
lares. Esto ltimo se debe en gran medida a la gran sensibili-
dad de la interaccin fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina
(APAAP) resultante. La FA puede proporcionar productos
de reaccin de color vivo con ciertos sustratos, pero en ge-
neral stos maniestan el problema de que, al contrario del
producto de reaccin de la DAB, son solubles. Esto signi-
ca que las muestras se deben montar en medios acuosos;
anteriormente, stos eran lquidos y creaban problemas con
el almacenamiento por largo tiempo, pero en la actualidad
se dispone de montajes permanentes. Una vez ms, puede
haber problemas con la fosfatasa alcalina endgena tisular,
pero esto puede bloquearse con agentes como el levamisol.
Oro-plata
Los anticuerpos se pueden unir a los agregados uniformes
y nos del oro elemental y ste reacciona de forma alter-
nada con la plata a partir de compuestos argentosos, en vir-
tud de la diferencia de electropositividad. Esto suministra
una secuencia muy sensible de la reaccin, que encontr un
uso extendido en la microscopia de luz hace unos 10 aos,
cuando se utiliz en estudios como mtodo de marcado para
los epitopos de baja expresin, como aquellos de supercies
celulares. Sin embargo, debe indicarse que el mtodo nunca
encontr una amplia aplicacin diagnstica y slo se limit
a su uso en investigacin. Adems, lo ha sustituido en bue-
na medida la serie de mtodos del complejo avidina-biotina
(CAB). Pese a ello, un uso importante de la tcnica inmu-
nourica se reconoce en el campo de la microscopia inmuno-
electrnica, en la cual las partculas metlicas se pueden ver
al localizarse en sitios antignicos; en realidad, es posible
demostrar ms de un antgeno en la misma preparacin con
los anticuerpos ligados a las partculas de oro de tamaos
diversos.
Avidina-biotina
Los mtodos de avidina-biotina se basan en la unin de al-
ta anidad entre avidina (o estreptavidina) y biotina. Esta
anidad en extremo elevada es esencial para su aplicacin
como una etapa intermedia de los mtodos de amplicacin
y extrema sensibilidad, como el CAB (g. 4-3). Los anti-
Figura 4-3 Micrografa de un linfoma folicular, inmunoteido
para la oncoprotena bcl-2, mediante la metodologa CAB.
cuerpos secundarios se biotinilan, con la capa terciaria de
avidina conjugada a una molcula indicadora, por ejemplo
PR o FA. El mtodo CAB ha encontrado un uso extenso en
laboratorios de diagnstico e investigacin y es tal vez el
estndar actual. Un problema potencial con los sistemas ba-
sados en CAB es que la avidina y la biotina se pueden en-
contrar en tejidos normales. Es importante considerar esto
cuando se analizan estos especmenes y puede recurrirse
al uso de los bloques de avidina/biotina para contrarrestar
este problema.
Amplicacin de la seal de la tiramina
Este mtodo muy sensible amplica en grado notable la
seal, hasta 10
3
veces ms respecto de otros mtodos. En
este sistema, la PR acta como catalizador en la sedimen-
tacin de la tiramida, ligada a un uorocromo o la biotina
en las reacciones directas e indirectas. Lo anterior es de
gran valor cuando el antgeno objetivo se expresa en grados
bajos y puede ser inferior al umbral para la deteccin con
mtodos estndar de IHQ.
Sistemas sin biotina
Se ha observado ya que puede haber problemas con la activi-
dad enzimtica endgena y molculas endgenas dentro del
tejido normal. Se han desarrollado mtodos ms recientes
mediante marcas que no se encuentran habitualmente en el
tejido normal. La uorescena encontr aceptacin reciente
como reactivo acoplador, no en virtud de su uorescencia
sino como antgeno: esta molcula presenta la ventaja obvia
de que carece de un anlogo humano.
Un acercamiento novedoso para la amplicacin de la se-
al ha sido la introduccin de sistemas basados en polmeros.
stos permiten que las marcas mltiples enzimticas (PR/FA)
se unan al anticuerpo secundario a travs de la columna ver-
tebral del polmero. Este tipo de sistema es un procedimiento
de dos etapas y de ese modo ahorra tiempo en relacin con
los sistemas convencionales de avidina/biotina, mientras que
las marcas mltiples enzimticas mantienen la sensibilidad.
Enlace inespecco del anticuerpo
Los lectores deben observar que los anticuerpos primarios pue-
den ligarse de forma inespecca a muestras de tejido, en gran
parte por medio de sus fracciones Fc. Es mucho ms proba-
ble que el problema se suscite con policlonales y menos con
reactivos monoclonales. Esto puede superarse casi siempre por
medio del bloqueo con el suero no inmunitario apropiado.
Mtodos de recuperacin de antgeno
Pretratamiento de la enzima
A nales de la dcada de 1970 se reconoci que la inmuno-
tincin se poda mejorar con el pretratamiento de las mues-
tras con ciertas enzimas proteolticas, como la pronasa o la
tripsina. La base exacta de tales procesos es incierta, pero
se admite que ciertos grupos antignicos son desenmasca-
rados en trminos bioqumicos por la eliminacin de las
cadenas laterales que oscurecen, lo cual hace posible el ac-
ceso del anticuerpo primario. Las enzimas son muy lticas
y la titulacin antes del uso regular es esencial para evitar
la alteracin del tejido.
Pretratamiento con microondas
En el decenio de 1990 result evidente que ciertos epitopos
se podan desenmascarar con el uso de la radiacin de
microondas controlada de las secciones del tejido en medio
acuoso. Como en el caso del pretratamiento de la enzima,
el mecanismo que subyace a esto se encuentra lejos de ser
claro; no obstante, esta tcnica encontr una aplicacin
muy amplia en los ltimos aos. Como los mtodos enzim-
ticos, el tratamiento con microondas no slo mejora la vi-
sualizacin en algunos casos de ciertos antgenos, sino que
tambin puede permitir la deteccin, cuando antes ninguna
era posible. Como en el tratamiento enzimtico, es necesa-
ria la titulacin de la sincronizacin de la microonda.
Otro desarrollo reciente ha sido el uso del cocimiento
a presin de las secciones para mejorar la inmunotincin.
Esto es algo ms peligroso que el uso cuidadoso de los hor-
nos de microondas. En algunos centros tambin se utilizan
el cocimiento a presin mediante hornos de microondas, la
esterilizacin, el cocimiento con vapor y ebullicin simple.
Con la metodologa de la recuperacin, es esencial uti-
lizar portaobjetos microscpicos precubiertos para evitar
la prdida de tejido de la supercie del portaobjetos. Los
portaobjetos cargados de modo positivo estn disponibles
en el comercio; las alternativas incluyen recubrimiento de
los portaobjetos con poli-l-lisina, APES o Vectabond.
Controles
Es muy importante instituir ciertos controles esenciales an-
tes de probar cualquier anticuerpo nuevo y, en condiciones
ideales, por lo menos algunas de estas exigencias se deben
aplicar sobre una base de diagnstico diario. Los controles
positivos implican la inclusin de las muestras conocidas
para tener elementos reactivos con el anticuerpo en cues-
tin. ste es el control ms importante y usado con regu-
laridad en el diagnstico diario IHQ. Es til algunas veces
preparar un bloque tisular compuesto incluido en cera de
parana que contenga una combinacin de piezas peque-
as de los controles positivos conocidos y montarlo en el
mismo portaobjetos como la muestra de prueba. Esto per-
mite al patlogo ver ambas estructuras teidas, de forma
positiva o negativa, al mismo tiempo.
MTODOS DE MLTIPLES ETAPAS 39
Cuando un anticuerpo nuevo se halla bajo evaluacin
antes de su uso diagnstico o de investigacin, se requiere
una gama de controles ms rigurosos, entre ellos los si-
guientes: bloqueo con el antgeno/epitopo puro (es de-
cir, el anticuerpo preadsorbente con su antgeno objetivo);
la omisin del anticuerpo primario (o reemplazo con un
control igualado de modo isotpico) u otros anticuerpos en
la secuencia y aplicacin de la reaccin cromgena sola.
Tales controles comprueban la especicidad de la unin
primaria del anticuerpo y la necesidad de su presencia en el
resultado positivo de la reaccin.
Mtodos de marcacin dual
A menudo es importante poder demostrar ms de un an-
tgeno o epitopo en una clula o tejido particular. Un ejem-
plo es la demostracin de las cadenas ligeras (kappa) y
(lambda) para determinar la clonalidad en una lesin lin-
focitoide (g. 4-4). La pregunta es, por supuesto, se trata
de una muestra de tejido linfoide benigno o maligno? La
exposicin de monoclonalidad en las clulas o sobre ellas
de un corte debe indicar malignidad; la capacidad para de-
mostrar esto debe modicar el control del paciente. Para
identicar ms de un antgeno/epitopo se utilizan los sus-
tratos cromgenos de diversos colores y por consiguien-
te se determina la preparacin. La IHQ tambin se puede
combinar con otras tcnicas, como el mtodo de AgNOR
(vase cap. 8), histoqumica convencional e hibridacin
in situ.
Anticuerpos policlonales y monoclonales
El trabajo inicial sobre IHQ se llev a cabo mediante an-
tisueros policlonales inoculados en mamferos contra pre-
paraciones antignicas. Estos antisueros fueron politpicos
y por tanto tendieron a proporcionar patrones de tincin
que no estaban muchas veces claros en los cortes, con la
unin de diversos anticuerpos constitutivos a sitios micros-
cpicos ms bien variables. El mtodo de puricacin de
anidad, en el cual el anticuerpo policlonal se hizo pasar
a travs de una columna que contena el antgeno objetivo
unido a la matriz, mejor la especicidad de los reactivos.
Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales re-
sult posible la localizacin mucho ms clara y espec-
ca de epitopos y por consiguiente una mejor delineacin de
las especies celulares y tisulares.
Pese a ello, un problema inicial de peso fue que, a dife-
rencia de muchos anticuerpos policlonales, la mayor parte de
los anticuerpos monoclonales no poda aplicarse con xito
de forma regular a las muestras incluidas en cera de parana
guardadas. Por consiguiente, la mayora de los estudios ini-
ciales dependi de la disponibilidad de material congelado
de la seccin, con su preservacin morfolgica relativamente
pobre. Sin embargo, hoy, con la llegada de los anticuerpos
Figura 4-4 Cortes teidos de forma doble para demostrar la reactividad citoplsmica en marrn (DAB, Menarini) para la cadena ligera
de Ig y la actividad citoplsmica (Vector SG) de gris acero para la cadena ligera . En a), las clulas plasmticas en una amgdala
reactiva muestran una mezcla de clulas, en la que algunas contienen una cadena y otras la restante. En b), todas las clulas plasmticas
(en una biopsia de piel) contienen la cadena y son, por lo tanto, clonales.
monoclonales de anidad ms alta, muchos se pueden aplicar
a los cortes en parana, sobre todo tras el uso de los mto-
dos de recuperacin del antgeno. No obstante, las secciones
congeladas pueden ofrecer una ventaja sobre las muestras en
cera de parana dado que pueden suministrar una mejor vi-
sualizacin de los antgenos de supercie.
Aplicaciones de la inmunohistoqumica
Rebasa los lmites de este libro delinear una explicacin
comprensiva de los innumerables usos de la IHQ en el la-
boratorio de diagnstico. Basta con sealar que esta tecno-
loga se puede utilizar en el diagnstico y como indicador
del pronstico en patologa celular comn. La IHQ ha per-
mitido distinguir entre los linfomas y carcinomas celulares
pequeos, melanomas y seminomas, mesoteliomas y adeno-
carcinomas, y linfomas de clulas B y T. Adems, es posible
identicar microorganismos muy diversos, desde Cytomega-
lovirus hasta Toxoplasma y, como se discute en el captulo
8, se puede determinar la proliferacin celular y el estado
apoptsico. Adems, pueden demostrarse las hormonas, los
receptores de la hormona, los factores del crecimiento, las
molculas de adhesin y los productos oncgenos, al igual
que los ligandos para ciertas molculas. No obstante, como
advertencia debe subrayarse que los epitopos compartidos
no indican en todos los casos orgenes comunes. Por ejem-
plo, las clulas de Reed-Sternberg de la enfermedad de
Hodgkin y las clulas del adenocarcinoma expresan CD15,
sin que ello indique que estos tipos de clula posean un linaje
comn. Un campo cada vez ms importante para el uso de la
IHQ se sita en la valoracin del pronstico, que puede ayu-
dar al clnico a prescribir con mayor precisin el tratamiento
ms conveniente para una enfermedad maligna en particular.
Los ejemplos se hallan en la valoracin de la fraccin del
crecimiento por medio del anticuerpo Ki67. Asimismo, la
expresin de la oncoprotena bcl-2 conere un pronstico
relativamente pobre en linfomas de alto grado. La investi-
gacin del receptor de estrgeno y progesterona y el estado
HER2 son tambin de gran importancia en el tratamiento de
los carcinomas de mama.
Control de calidad
En el mundo actual que exige estndares de laboratorio
cada vez ms estrictos, son del todo recomendables el con-
trol externo de la calidad y la vigilancia interna de rutina.
Muchos pases cuentan con esquemas externos de asegura-
miento de la calidad que, en general, dependen de la eva-
luacin de la tincin de los antgenos seleccionados por el
laboratorio objetivo. Las muestras son una combinacin
de casos directos indudables y cortes de ineludible dicul-
tad (p. ej., la tincin de las cadenas ligeras superciales
de Ig sobre las clulas que presentan antgeno). Esto debe
permitir a los laboratorios mejorar y estandarizar su tcnica
a la luz de las revisiones.
Automatizacin
La inmunohistoqumica lleg al campo de la automati-
zacin relativamente tarde (g. 4-5), quiz porque pocos
PROYECCIN DE IMAGEN 41
Figura 4-5 Aparato automtico de inmunotincin del fabricante
Dako Cytomation Ltd. Reproducido con autorizacin de DAKO
Cytomation Ltd.
anticuerpos que eran convenientes para su uso de rutina
estaban disponibles. No obstante, en poco tiempo cualquier
laboratorio dispondr de un panel grande de reactivos apli-
cados a numerosos cortes en cualquier procedimiento diag-
nstico; la automatizacin slo es cuestin de tiempo.
Los dispositivos anteriores eran semiautomatizados
y servan en gran parte para ahorrar tiempo y manipular
grandes volmenes de reactivos; esto atenuaba, por ejem-
plo, el tedio de los lavados mltiples con amortiguadores.
Ms adelante aparecieron en el mercado mquinas ms
automatizadas, por supuesto mucho ms costosas que sus
precursoras. Los aparatos recientes poseen microproce-
sadores, controlados y programables a las exigencias del
usuario, que permiten procesar de modo simultneo mues-
tras que emplean distintos tipos de tincin.
Proyeccin de imagen
Hoy en da cada vez ms es posible cuanticar la tincin
IHQ. En el pasado, ello resultaba difcil debido al pobre
entendimiento de la estequiometra de las reacciones IHQ,
en particular en la unin cromgena. Sin embargo, ahora
se cuenta con sistemas como el Applied Imagings Ariol
SL-50 (g. 4-6), que permite la cuanticacin y anlisis
de portaobjetos IHQ con instrumentos de alta ecacia de
procesamiento y programas de anlisis de imagen. Esto
tambin permite crear una red virtual gracias a la cual
los patlogos pueden evaluar paneles de portaobjetos que
analizan el sistema y poner a disposicin los resultados de
manera directa en los sistemas del hospital.
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Introduccin
Los tejidos o lquidos humanos que contienen clulas se
muestrean sobre todo con propsitos diagnsticos, es de-
cir, para la identicacin de las categoras patolgicas que
pueden reconocerse y tratarse. A menudo es necesario un
diagnstico microscpico para optimizar el control del pa-
ciente y, cuando menos en el campo del cncer, muchos
diagnsticos clnicos se modican tras la investigacin mi-
croscpica histopatolgica.
El examen microscpico de luz de las muestras teidas
con hematoxilina y eosina (H-E) de tejidos embebidos en
cera de parana es el procedimiento tcnico ms importan-
te para el diagnstico slido de especmenes humanos. En
este punto, un patlogo determina aspectos de la clula y
la matriz, incluida la estructura, en el contexto de hallaz-
gos generales y datos clnicos para precisar un diagnsti-
co. Mientras que la microscopia de luz de los cortes con
H-E es an la base del diagnstico histolgico, tcnicas ms
nuevas, como la microscopia electrnica (ME), inmunohis-
toqumica, tincin AgNOR, citometra de ujo, adems de
las tcnicas citogenticas y moleculares (anlisis de re-
conguracin gnica, hibridacin de uorescencia in situ
y la reaccin en cadena de la polimerasa [PCR]), pueden en
la actualidad proporcionar informacin adicional para de-
purar el conocimiento de la enfermedad y el diagnstico.
La microscopia electrnica de diagnstico ha resultado
importante desde nales de la dcada de 1960 y principios
del decenio de 1970. Sin embargo, a partir de los inicios de
los aos de 1980, la inmunohistoqumica en particular se
ha convertido en una tcnica imprescindible y ha propicia-
do cierta declinacin en la prctica de la ME. Dado que
la inmunohistoqumica se reconoce como la tcnica ms
conveniente y til, atrajo recursos que antes se destinaban
a la ME. Empero, la ME proporciona una informacin ni-
ca (sobre la morfologa subcelular) y puede proporcionar
por tanto nuevos datos sobre la enfermedad, parte de los
cuales tienen aplicaciones diagnsticas. Esto es as porque
en algunas afecciones bastan las caractersticas puramente
morfolgicas para establecer el diagnstico (cuadros 5-1 y
5-2), aunque tambin porque la inmunohistoqumica tie-
ne limitaciones, si bien es una tcnica de particular impor-
tancia en el diagnstico oncolgico.
La bibliografa actual atestigua el valor de la conti-
nuacin de la ME en la investigacin y el diagnstico de
los casos de la enfermedad humana que son problemticos
para la microscopia de luz (Dar et al., 1992; Hashimoto,
1994; Kandel et al., 1998; Mierau, 1999; Eyden, 1999,
2002; Lloreta-Trull et al., 2000; Tucker, 2000; Al-Sarraj et
al., 2001). La carencia de informacin ultraestructural dis-
minuye el rendimiento de un departamento de diagnstico,
puesto que la ME puede conrmar o descartar de modo
continuo las interpretaciones de los patlogos basadas en
la microscopia de luz; de esa manera aumenta la conanza
con la cual se sustenta un diagnstico. Se suele decir con
cierta razn que la ME hace mejores a los patlogos.
El grado al cual se emplea la ME en un departamen-
to de diagnstico de rutina depende de la experiencia dis-
ponible (tcnica e interpretacin) y, en grado notorio, de
los lineamientos y antecedentes del jefe de servicio. Al-
gunos utilizaron la ME en el pasado, pero ahora no con-
fan ms en ella y preeren la inmunohistoqumica y las
tcnicas moleculares nuevas para solucionar los proble-
mas diagnsticos (pese a que la inmunohistoqumica con-
tina su transformacin en trminos tecnolgicos y existen
dudas acerca de la especicidad de muchos de los anticuer-
The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
5
Microscopia electrnica en patologa
Brian Eyden
44 CAP. 5 MICROSCOPIA ELECTRNICA EN PATOLOGA
pos usados). Por el contrario, otros recurren a la ME en
mayor grado y ocupan casi siempre posiciones en las insti-
tuciones grandes o especializadas en las cuales la carga de
trabajo ingente o la referencia de muchas de las muestras
representan nmeros ms grandes de casos difciles.
La cuanticacin del valor de la ME es difcil. Se ha di-
cho que hasta 5% de todos los tumores, por ejemplo, puede
ser bastante problemtico para beneciarse de la investi-
gacin con ME, mientras que 25% de las muestras renales
no neoplsicas puede necesitar ME (Pearson et al., 1994).
Cualesquiera que sean los nmeros, la ME debe aplicarse
siempre que haya una dicultad en la interpretacin del corte
con H-E. La ME es siempre digna de practicarse en estas
circunstancias porque nunca es posible predecir en un caso
individual qu resultados pueden obtenerse y algunas veces
se experimenta el placer de reconocer hallazgos del todo in-
esperados y nuevos. Adems, la ME y la inmunohistoqumi-
ca (y todas las tcnicas ms recientes) se deben considerar
como complementarias; es una idea generalizada admitir
que la informacin proveniente de la inmunohistoqumi-
ca y la ME pueden delinear un cuadro ms completo de
una lesin que cualquier tcnica sola. El cuadro se complica
a veces por el uso de ambas tcnicas (pueden ser excluyen-
tes), pero esto puede considerarse un estmulo para la inves-
tigacin suplementaria.
Cuadro 5-1 Marcadores ultraestructurales de diferenciacin celular usados en la identicacin de tumores
Tipo celular Caractersticas ultraestructurales
Epitelio escamoso Desmosomas, tonobrillas, lmina basal
Epitelio glandular Complejo apical conjuntivo, microvellosidades, grnulos mucgenos
Neumocito tipo 2 Cuerpos amortiguadores (mielinosomas)
Mesotelio Microvellosidades lisas, largas, sinuosas
Clula neuroendocrina Grnulos neuroendocrinos (ncleo denso)
Clula de Schwann Proyecciones nas cubiertas con lmina externa
Adipocito Gotas de grasa, lmina
Clula del msculo estriado Sarcmeros consistentes en formaciones de actina y miosina y discos Z
Clula del msculo liso Miolamentos nos con densidades focales, lmina externa
Miobroblasto Retculo endoplsmico rugoso, miolamentos, articulaciones bronexales
Fibroblasto Retculo endoplsmico rugoso, grnulos con secreciones de colgena
Endotelio Cuerpos de Weibel-Palade
Neurona Grnulos neuroendocrinos, retculo endoplsmico liso, microtbulos, conexiones
sinpticas
Melanocito Melanosomas
Clula yuxtaglomerular Grnulos romboidales
Clula de Leydig Cristales, lpidos, retculo endoplsmico liso, crestas tubulares
Clula granulosa Desmosomas
Clula de Langerhans Grnulos de Birbeck
Clula plasmtica Aparato de Golgi, retculo endoplsmico rugoso
Macrfago Lisosomas, proyecciones lopodiales
Linfocito Clula indiferenciada (organelos indistinguibles)
Adaptado segn Cameron and Toner (1998).
Principios de la tcnica
y la organizacin de la ME
Microscopia electrnica de transmisin:
energa de resolucin
Casi todo el trabajo de diagnstico ultraestructural utiliza la
microscopia electrnica de transmisin (MET) para demos-
trar las propiedades celulares especcas o las caractersti-
cas de la matriz, que pueden contribuir a la comprensin y el
diagnstico de la enfermedad (cuadros 5-1 y 5-2). Adems
de la MET existen algunas aplicaciones, aunque no dema-
siadas, que pueden denominarse tcnicas especializadas,
por ejemplo la ME de barrido, que es otra clase morfo-
lgica de ME, y otras tcnicas que suministran informa-
cin sobre el contenido elemental (microanlisis de rayos
X) o la composicin biomolecular (inmunocitoqumica
e histoqumica ultraestructurales) (cuadro 5-3). Tambin se
han desarrollado las versiones ME de los procedimien-
tos de la microscopia de luz, como la morfometra, para
proporcionar la informacin cuantitativa ultraestructural
(p. ej., la irregularidad nuclear en los linfomas).
Pese al desarrollo de las tcnicas funcionales ultraes-
tructurales ms recientes, la ME es an un mtodo esen-
cialmente morfolgico, como la histopatologa con H-E.
PRINCIPIOS DE LA TCNICA Y LA ORGANIZACIN DE LA ME 45
Como la microscopia de luz, la ME utiliza muestras so-
metidas a una forma de radiacin para observarlas. La ra-
diacin (haz electrnico) interacta con el material interno
del corte para emitir una imagen, que se puede interpretar
para obtener informacin sobre la naturaleza de la muestra.
La importancia de la ME radica en que utiliza un haz elec-
trnico. Puesto que la energa de resolucin depende de la
longitud de onda de la radiacin, la energa de resolucin
de un microscopio electrnico es en la prctica cerca de
100 veces mayor respecto de un microscopio de luz. En
Cuadro 5-2 Aplicacin de la microscopia electrnica en trastornos no neoplsicos
Enfermedad renal Espesores de la membrana capilar basal (p. ej., enfermedad de la membrana basal delgada)
Presencia y localizacin de depsitos inmunitarios (p. ej., glomerulonefritis [GN]
membranosa)
Presencia de brillas extracelulares (p. ej., amiloide), inclusiones celulares (p. ej., guras
de mielina en la enfermedad de Fabry), estadicacin de ciertas enfermedades (p. ej.,
GN membranosa), procesos de apoyo (la fusin extensa puede ser indicativa de GN
de cambio mnimo)
Padecimientos neuromusculares Mitocondrias, miopatas congnitas y metablicas
Trastornos cutneos Afecciones de queratinizacin
Dermatosis mecanobulosa
Defectos del cabello y las uas
Enfermedades del tejido conectivo Trastornos estrmicos que incluyen alteraciones de la colgena, proteoglucanos y
amiloidosis de la elastina
Alteraciones hematopoyticas Enfermedades plaquetarias
Anomalas granulocticas
Errores innatos del metabolismo Acumulacin de metabolitos
Potencial para la deteccin prenatal
Biopsias peditricas hepticas Enfermedad metablica del hgado
Sndrome de Reye
Biopsias endomiocrdicas Cardiomiopatas, amiloidosis
Enfermedades respiratorias Anormalidades ciliares
Identicacin de partculas pulmonares
Trastornos del sistema nervioso Demencias, neuropatas, CADISIL*
central y perifrico
Medicina reproductiva Anormalidades de los espermatozoides
Agentes infecciosos Virus, bacterias, protozoarios, hongos
*Arteriopata cerebral autosmica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopata.
Adaptado segn Cameron y Toner (1998).
consecuencia, pueden proyectarse detalles estructurales de
la clula y la matriz tan pequeos como de tan slo algunos
nanmetros en tamao, lo cual rebasa de forma notable la
capacidad de la microscopia de luz. Por lo tanto, a travs
de los aos se han identicado las estructuras celulares
y de la matriz que son distintivas o especcas de una c-
lula o enfermedad, y esta abundancia acumulada de infor-
macin representa la base de la microscopia electrnica de
diagnstico en los tumores y la enfermedad no neoplsica
(cuadros 5-1 y 5-2).
Formacin de la imagen
En la MET, los electrones en el haz que ilumina (inci-
dente) producen un nmero importante de interacciones
al entrar en contacto con la muestra. Muchos pasan simple-
mente a travs del espcimen casi sin cambio alguno. Otros
se desvan de su trayectoria (se dispersan) por reas o
puntos de mayor densidad electrnica en el corte y se l-
tran hacia afuera del haz incidente nal por una abertura
(g. 5-1a). Por consiguiente, el haz incidente nal posee
Cuadro 5-3 Tcnicas y procedimientos ultraestructurales
especializados
Microscopia electrnica de barrido
Microscopia inmunoelectrnica
Histoqumica ultraestructural
Microanlisis por rayos X y difraccin electrnica
Fractura y delineado por congelacin
Hibridacin in situ ultraestructural
Morfometra ultraestructural
reas que carecen de electrones en comparacin con el haz
incidente inicial (g. 5-1b) y esta diferencia establece la
base de la imagen. La densidad dentro de una muestra pue-
de ser natural, como en un concentrado de mineralizacin,
o el tratamiento qumico del tejido en el espcimen puede
introducirla. Por lo general, lo anterior se lleva a cabo con
la solucin de tetraxido de osmio (vase la tcnica ms
adelante), en la cual los tomos del osmio se unen de mane-
ra selectiva a los materiales biolgicos, como las membra-
nas. En consecuencia, una la de tomos de osmio unidos
a una membrana celular produce una imagen que reeja
Figura 5-1 Formacin de la imagen en el microscopio electrnico de transmisin. Los electrones en el haz incidente entran en contacto
con el corte ultradelgado (a). Algunos pasan sin desviarse a travs de su trayectoria incidente (a), mientras que los que se impactan sobre
un punto denso de la muestra (p. ej., un tomo de metal pesado) se desvan fuera de la trayectoria incidente (dispersados de forma elstica)
y no avanzan hacia la pantalla de visualizacin por una abertura del metal (a). Por lo tanto, el haz incidente nal contiene la informacin
que resulta de la combinacin de electrones sin desviar y de otros que sufrieron dispersin elstica (b). Representacin de Paul Chantry.
esta lnea de electrones ausentes en el haz incidente nal
(g. 5-1b), que a su vez se convierte en una lnea sobre la
pantalla del microscopio electrnico cuando los electrones
chocan con el recubrimiento uorescente de la pantalla que
se visualiza y se convierten en luz visible.
Tcnica
Las tcnicas empleadas para preparar el tejido para la MET
de corte no se han estandarizado bastante en los ltimos
aos. Como en la microscopia de luz, el tejido necesita -
jarse con rapidez para evitar la autlisis y primero se ja en
un aldehdo, es decir, un jador con el que predominan las
uniones cruzadas con protenas. Se acepta que el glutaral-
dehdo, entre una variedad de aldehdos disponibles en el
comercio, ofrece el mejor desempeo para la conservacin
ultraestructural. No obstante, la jacin de una biopsia o
una muestra de reseccin en glutaraldehdo requiere perso-
nal y tiempo para atender un problema quirrgico. Segn
sean las condiciones del laboratorio, puede ser necesario
recuperar tejido de la muestra principal en formalina his-
tolgica. Resuelto lo anterior, se amortigua a un pH sio-
lgico; la muestra es bastante pequea y no debe recoger-
se para la ME de la profundidad de un espcimen grande
(donde la autlisis puede alterar la estructura del tejido);
la conservacin puede ser muy buena. La opcin de mues-
treo del tejido en formalina histolgica imposibilita la in-
clusin de la muestra entera en cera y requiere una pieza
representativa pequea para retenerse, dado que es posible
la eventualidad de un problema diagnstico identicado
en la investigacin con H-E. Esto puede no ser factible en
una institucin con grandes cargas de trabajo.
La muestra jada en glutaraldehdo o recuperada a par-
tir de formalina necesita cortarse en piezas pequeas (mi-
lmetros cbicos), puesto que los reactivos del proceso
subsecuentes tienden a penetrar con lentitud. Las muestras
pequeas disponibles para el estudio constituyen una de las
limitaciones principales de la ME. Despus de la jacin en
aldehdo, el contraste selectivo se incorpora mediante una
solucin de tetraxido de osmio y algunas veces tambin
con una solucin de acetato de uranilo. Estos tomos del
metal pesado se unen de modo selectivo a las estructuras de
la clula y proporcionan la energa de dispersin electrnica
y el contraste. Aunque las reacciones de estos reactivos con
los componentes biolgicos son complejas, el tetraxido de
osmio se conoce por ser un jador de lpidos y una de sus
funciones principales es delinear las membranas al deposi-
tar los tomos de osmio en los intersticios bimoleculares.
El acetato de uranilo es un jador de fosfolpidos y tambin
realza la delineacin de la membrana, aunque ja adems
los cidos nucleicos y de este modo proporciona densidad
a los ribosomas y a la desoxirribonucleoprotena (croma-
tina) nuclear.
Despus de la tincin y jacin en bloque, el tejido se
deshidrata en etanol o acetona y se inltra con una resina
epxica lquida, en ocasiones con un solvente transitorio
como el xido de propileno, tolueno o el limoneno, que es
el menos usado pero tambin el menos txico. El bloque
del tejido inltrado en resina epxica entonces se polime-
riza por medio de calor a un estado slido. Los pasos de la
inltracin se pueden realizar de forma manual con el tejido
en frascos pequeos, encapsulados, de cristal, con reactivos
recolocados con pipeta o mediante un procesador automa-
tizado de tejido. Los instrumentos basados en microondas,
de reciente introduccin, pueden procesar el tejido hasta
un bloque polimerizado en cuestin de algunas horas, algo
comparable con los procedimientos tpicos de la inmuno-
histoqumica.
Los bloques de resina epxica tienen las propiedades
fsicas que permiten que las secciones se corten con un ul-
tramicrtomo manual sobre el cristal disponible o con
cuchillas permanentes de diamante. Las secciones con un
espesor de alrededor de 80 nm son bastante delgadas para
el paso de los electrones requeridos para la formacin de la
imagen, y aun bastante fuertes para soportar el efecto trmi-
co de la exposicin a electrones de alta energa. Las seccio-
nes se recolectan casi siempre en rejillas de malla de cobre
de 3 mm de dimetro, teidas para el contraste adicional en
soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo (Mauns-
bach y Afzelius, 1999) y entonces se encuentran listas para
el examen en el microscopio electrnico.
Manipulacin de los tejidos antes de la jacin
Los procesos de muestreo y manipulacin del tejido pre-
vios a la jacin pueden ser cruciales para obtener un tejido
bien seleccionado y preservado. Esto es de lo ms impor-
tante, puesto que la interpretacin se facilita en gran medi-
da por la calidad de la conservacin estructural. A pesar de
los deseos de usar el glutaraldehdo o incluso la formalina
histolgica amortiguada, a veces es necesario recuperar el
tejido a partir de un bloque de cera. sta es la directriz
de rutina en algunas instituciones de diagnstico, es decir,
conformar todo en bloques en cera, lo cual se aplica en es-
pecial a las muestras pequeas, un tratamiento en particular
inapropiado para la muestra de ME con el n de no poner
en peligro el examen con la microscopia de luz.
El tratamiento bastante radical con xileno y cera calien-
tes daa de modo inevitable algunas ultraestructuras, pero
ciertos componentes de la clula pueden sobrevivir en la
cera: desmosomas, tonobrillas, miolamentos, lamentos
intermedios, luces, grnulos de Birbeck, grnulos neuroen-
docrinos y melanosomas. Ciertas estructuras exclusiva-
mente membranosas, como el retculo endoplsmico liso y
la mitocondria, suelen preservarse mal, pero algunas mem-
branas del plasma se pueden conservar o delinear bien y
as reconocerse. Una variacin en la recuperacin de cera
es el mtodo llamado pop-off, en el cual una seccin de
H-E se puede procesar para la microscopia electrnica, so-
metida al osmio, deshidratada e inltrada con resina sobre
el portaobjetos de cristal. La muestra se puede entonces
tratar (popped-off) en un molde convencional con resi-
na epxica para el corte ultrano subsiguiente (vase la
seccin de Lecturas adicionales). Esta tcnica se puede
PRINCIPIOS DE LA TCNICA Y LA ORGANIZACIN DE LA ME 47
tambin aplicar a los frotis, pero es exigente desde el punto
de vista tcnico.
El tejido secado o congelado sin agentes criopreserva-
dores, o dejado durante la noche antes de la jacin, pue-
de ser intil para la ME (con la salvedad de que ciertos
microorganismos pueden sobrevivir; vase la g. 5-7b).
Sin embargo, el tejido crioprotegido, que se congela y des-
pus se descongela, puede suministrar buenos resultados
ultraestructurales. Muchas otras muestras pueden o nece-
sitan jarse en glutaraldehdo. Los especmenes de sangre
perifrica, semen, de cepillados nasales y bronquiales y los
fragmentos pequeos de tejido que pueden verse en una
muestra aspirada con aguja na en una jeringa se jan con
facilidad, desde el punto de vista del proceso, se trate de
glutaraldehdo o formalina. Algunas muestras no necesitan
jarse. El sndrome de Hermansky-Pudlak, una afeccin
compleja que implica disfuncin plaquetaria, puede de-
mostrarse tan slo al secar una preparacin de la plaqueta
en una rejilla revestida con pelcula y examinarla de forma
directa en el microscopio electrnico para reconocer los
grnulos distintivos y el nmero de grnulos anormales
(vase g. 5-9d).
Preliminares para examinar cortes ultranos
En la histopatologa tisular, rara vez se realiza la ME sin te-
ner en cuenta otras fuentes de informacin diagnstica. El
patlogo necesita disponer de toda la informacin clnica
apropiada, conocer los aspectos histolgicos detallados de
la lesin y, en el caso de tumores, contar con los hallazgos
inmunohistoqumicos a la mano cuando se efecta la ME.
La idea de ejecutar la ME antes de la inmunohistoqumi-
ca para eliminar inmunotinciones innecesarias puede ser
til y tal vez lgica, pero carece al parecer de aceptacin
general.
Es usual realizar la ultramicrotoma con cortes semi-
nos. Por lo general, stos son de 1 a 2 m de espesor, se
tien con azul de toluidina o una tincin similar y se exami-
nan en el microscopio de luz. Las muestras conrman que
el tejido posee una morfologa comparable a la obtenida con
H-E o que las clulas son las esperadas a la luz del antece-
dente clnico cuando no hay muestras con H-E de una con-
traparte slida del tejido (p. ej., en un espcimen de lquido
corporal). Con este procedimiento pueden evitarse los focos
indeseados de colgena o necrosis hallados a menudo en los
tumores. Por ltimo, los cortes seminos pueden suministrar
informacin sobre la calidad de la conservacin del tejido.
La tincin plida de clulas y ncleos indica casi siempre
una buena preservacin, mientras que los ncleos delinea-
dos de forma aguda con espacios interiores claros sue-
len sealar una pobre conservacin (Eyden, 2002). Por lo
tanto, en la investigacin de un tumor los cortes seminos
de varios bloques deben dividirse y el ms apropiado se eli-
ge con base en el contenido celular del tumor y la calidad
de la preservacin. En lesiones complejas es deseable cortar
muestras ultranas a partir de los bloques que representen a
todas las reas histolgicamente diferentes.
Al asegurar la seleccin apropiada para ultramicroto-
ma, el patlogo o bien el cientco examinan los cortes ul-
tranos para las estructuras celulares o los componentes
de la matriz considerados como caractersticos o espec-
cos de ciertos padecimientos. La identicacin de estas
estructuras depende de una interpretacin detallada de la
ultraestructura de la clula y el tejido, as como de un cono-
cimiento de las caractersticas ultraestructurales de las en-
fermedades especcas: sta es una experiencia que tiende
a acumularse a travs de los aos. Cuando los cientcos
clnicos o los biomdicos examinan cortes ultranos bajo la
instruccin de patlogos, son esenciales el enlace y la co-
municacin cercanos entre estas partes, como sucede en
el Reino Unido. En el trabajo arduo de un tumor complejo
las ideas diagnsticas pueden cambiar en el curso de pocos
das a medida que las inmunotinciones se hallan disponibles.
Aplicaciones de la microscopia
electrnica de transmisin
Tumores
En el diagnstico de una tumoracin, la caracterizacin
acertada de la neoplasia depende del hallazgo de las es-
tructuras distintivas de la clula o la matriz. Debe determi-
narse si son iguales o no respecto de las encontradas en la
clula normal correspondiente. En tal caso, por ejemplo,
un carcinoide intestinal se puede diagnosticar por los gr-
nulos neuroendocrinos hallados en las clulas enteroendo-
crinas normales (g. 5-2); un carcinoma mamario por los
desmosomas, tonobrillas, lmina basal, luces y grnu-
los de mucgeno (gs. 5-3a y 5-5), como en el epitelio nor-
mal de la mama, y un melanoma maligno por el hallazgo de
los melanosomas tpicos de los melanocitos normales (g.
5-3b). Esto no signica que estos procesos malignos se ori-
ginen a partir de esas clulas normales diferenciadas; ms
bien se piensa que proceden de las clulas embrionarias
diferenciadas de forma ms primitiva. Una amplia variedad
de tumores se puede identicar con base en su ultraestruc-
tura distintiva o especca (cuadro 5-1). Los ejemplos de
los organelos especcos tiles en el diagnstico del tumor
se muestran en las guras 5-2 a 5-5.
Hay obstculos en el diagnstico ultraestructural de los
tumores. Desde luego, muchos tumores pierden las propie-
dades esperadas y se vuelven menos diferenciables. En un
protocolo de revisin tpico se examina de forma cuidadosa
un bloque (una rejilla de cortes ultranos) por una hora. No
obstante, los tumores con grados decrecientes de diferen-
ciacin pueden ameritar una valoracin ms extensa (va-
rias horas y mltiples bloques, segn sean la percepcin del
patlogo, la necesidad clnica, el resultado del diagnstico,
etc.). Como complicacin adicional, los tumores pueden
tambin expresar caractersticas inesperadas y mostrar as
una diferenciacin divergente o anmala. Por lo tanto,
el clnico debe tener un conocimiento de estas propiedades
tumorales a partir de la experiencia personal y bibliogr-
ca. No obstante, la ME es de un valor mayor respecto de la
seccin H-E, en la cual los tumores aparecen apenas dife-
renciados y revelan casi siempre una inmunotincin tenue
o negativa para los marcadores previstos; en consecuencia,
la conrmacin inmunohistoqumica de un diagnstico con
H-E puede ser incompleta. La ME es tambin en extremo
importante cuando la inmunotincin no puede reconocer un
fenotipo denido con claridad, sea por la especicidad in-
cierta del anticuerpo, la incertidumbre interna si la tincin
es levemente positiva o negativa o una tincin inesperada
(aberrante). Por ejemplo, las variantes del melanoma, el
linfoma y el sarcoma malignos son tales que se tien de
modo positivo el lamento epitelial intermedio y la citoque-
ratina y, en consecuencia, puede ser necesaria la investiga-
cin ultraestructural para dilucidar la diferenciacin.
Es importante considerar la posibilidad de encontrar c-
lulas no neoplsicas en el tejido tumoral. En la bibliografa
APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA DE TRANSMISIN 49
Figura 5-2 a) Clula normal enteroendocrina del intestino delgado humano normal. Las inclusiones muy electrodensas cerca del polo
basal de la clula (*) son grnulos neuroendocrinos que contienen hormonas. Obsrvense los grnulos redondeados y en forma de barra
(8 700 ). b) Tumor carcinoide del intestino delgado (hace metstasis a un ganglio linftico mesentrico). Ntese la misma clase de
morfologa del grnulo neuroendocrino (60 700 ).
se notican micrografas de clulas y pericitos endotelia-
les en paredes vasculares, malinterpretados como clulas
tumorales. Deben tambin distinguirse como no neo-
plsicas las clulas de los tejidos normales invadidos por
el tumor o las clulas normales del tejido que se regeneran
(p. ej., clulas estriadas del msculo), adems de las clu-
las inamatorias o reactivas (p. ej., macrfagos, linfocitos,
clulas del plasma, miobroblastos). Estas clulas tienden
a diferenciarse bien y se deben observar con sospecha, en
particular si se localizaron en un tumor de escasa diferen-
ciacin.
Aunque cualquier tumor que demuestre cierta incerti-
dumbre por microscopia de luz merece la valoracin por
ME, la tcnica ha demostrado utilidad particular en un
buen nmero de grupos tumorales (tumores anaplsicos
epitelioides de clulas redondas; tumores de clulas redon-
das pequeas; tumores de clulas falciformes, y la extensa
categora de lesiones mesenquimatosas o del tejido blando,
incluidos los sarcomas). Uno de estos ltimos lo repre-
sentan las neoplasias broblsticas y puede esperarse que
muestren poca inmunopositividad, con excepcin de la vi-
mentina, un marcador bastante inespecco. La microscopia
electrnica puede tambin ayudar a sugerir el sitio prima-
rio de una masa metastsica, mientras que en los tumores
del sistema nervioso central la identicacin de las ca-
ractersticas de tumoraciones menngeas, schwannomas y
Figura 5-3 Sistemas membranosos intracitoplsmicos 1. a) Grnulos de mucgeno en un carcinoma ductal de mama. Tienen un centro denso
proteinceo en un espacio claro. En concordancia con su naturaleza exocrina, se encuentran a menudo cerca de la luz, en la cual descargan
su contenido (24 000 ). b) Los melanosomas constituyen el sello ultraestructural para la diferenciacin melanoctica. Este melanosoma es
un melanoma maligno de clulas fusiformes sin pigmento y se encuentra libremente en la matriz citoplsmica (98 000 ). Los melanosomas
mltiples dentro de un lisosoma secundario (un melanosoma compuesto) son evidencia de la digestin de melanosomas sometidos a exoci-
tosis y se encuentran a menudo dentro de macrfagos o broblastos. c) Los lisosomas son marcadores de macrfagos pero muchos tumores
(tumores de clulas granulares) pueden mostrar lisosomas secundarios abundantes. Esta gura delinea lisosomas secundarios en un tumor
estrmico gastrointestinal (36 000 ). d) Grnulo de Birbeck en una granulomatosis de las clulas de Langerhans (69 000 ).
Figura 5-4 Sistemas membranosos intracitoplsmicos 2. Adenoma negro de la corteza suprarrenal en un paciente con sndrome de Cushing.
El fenotipo esteroidognico consiste en lpido (a), retculo endoplsmico liso (* en b) y mitocondria con crestas tubulares (vase la mitocon-
dria gigante en b), y se encuentra sobre todo en las clulas de Leydig, clulas hiliares y tumores adrenocorticales. La lipofuscina es tambin
comn en estos tumores y a ella se atribuye la pigmentacin en este tumor. Ntense tambin los apilados cortos del retculo endoplsmico
rugoso (a, 10 000 ; b, 30 000 ).
cnceres neuronales, gliales o ependimarios por ME es im-
portante para el neuropatlogo, puesto que la inmunohisto-
qumica tiene un valor limitado para discriminar entre estos
tumores (Cameron y Toner, 1998; Al-Sarraj et al., 2001).
Por ltimo, no debe subestimarse el valor de la ME
en la conrmacin simple de un diagnstico sospechoso.
Diagnosticar una lesin no es una edicin en blanco y ne-
gro: los patlogos efectan diagnsticos con cierto grado
de seguridad y stos pueden incrementarse por hallazgos
ultraestructurales.
Enfermedad no neoplsica
En la actualidad, la ME aplicada a la enfermedad no neopl-
sica est quizs en una posicin ms segura que la ME apli-
cada a los tumores, ya que en la patologa oncolgica las
tcnicas inmunohistoqumicas y moleculares se apropiaron
del territorio ultraestructural. Mientras que en el diagns-
tico del tumor el objetivo primario es a menudo la de-
terminacin de la diferenciacin celular de la masa, en la
enfermedad no neoplsica hay muchas aplicaciones en las
cuales se pueden identicar las mltiples formas del cam-
bio estructural dentro de un solo organelo, clula o tejido
(cilio, epitelio glomerular, clula del msculo estriado, ner-
vio perifrico), que son indicativas de diversas afecciones.
Por lo tanto, en esta rea la ME puede tener un papel ms
crtico y quizs se dependa menos de la inmunohistoqumi-
ca y la biologa molecular. Las guras 5-6 a 5-9 incluyen
ejemplos de la ME diagnstica aplicada a la enfermedad no
neoplsica. Puntos similares del procedimiento son vlidos
para examinar la enfermedad no neoplsica si el objetivo
es conrmar la presencia de clulas afectadas y su calidad
de conservacin a partir de cortes seminos, como en los
tumores. No obstante, muchas enfermedades no neopl-
sicas se estudian a partir de lquidos y es preciso llevar a
cabo una valoracin de las clulas esperables en los cortes
seminos con base en el antecedente clnico.
La ME tuvo por mucho tiempo un valor en la identi-
cacin de microorganismos. Entre los ms signicativos en
clnica respecto de la incidencia numrica estn los virus,
los cuales se identican por tradicin mediante la tcnica
rpida y precisa de la tincin negativa (vase el cap. 18
para revisar ms detalles). La ME puede reconocer otros
agentes patgenos microscpicos o detalles de su estructu-
ra, entre ellos bacterias como las espiroquetas (g. 5-7a),
protozoarios como Cryptosporidium, microsporidios y
Leishmania (en el sida) y hongos como Candida y Pneu-
mocystis (g. 5-7b).
Figura 5-5 Caractersticas ci-
toesquelticas y superciales.
a) Las tonobrillas son la con-
traparte ultraestructural de in-
munotincin con citoqueratina
que pueden ayudar a reconocer
la diferenciacin epitelial en los
tumores. Las tonobrillas se po-
nen a menudo en contacto con
los desmosomas y promueven
de tal modo la cohesin celular,
una caracterstica tpica de los
carcinomas. Carcinoma celular
escamoso seudoangiosarcoma-
toso (31 900 ). b) El desmo-
soma es la unin intercelular
ms importante para identicar
la diferenciacin epitelial. Tiene
placas submembranosas, una lnea intermedia en el espacio entre las membranas opuestas del plasma, y las tonobrillas adhieren
las placas al citoesqueleto perinuclear. Mesotelioma epitelial (99 000 ). c) La lmina es una capa distintiva de clulas como el epitelio,
el endotelio, las clulas de Schwann y las perineuriales, los adipocitos y las clulas del msculo. Carece de broblastos, miobroblastos,
condroblastos, osteoblastos y neuronas, y por tanto tiene importancia diagnstica. En este schwannoma benigno, las capas mltiples
de lmina rodean a los procesos de la clula (30 000 ). d) Los miolamentos del msculo liso con sus densidades focales distintivas
son marcadores importantes de la diferenciacin celular del msculo liso. Tambin se reconocen en clulas mioepiteliales, pericitos,
miobroblastos y clulas intersticiales de Cajal, y sus tumores. Obsrvense los miolamentos ms nos (echa) en contraste con los
lamentos ms gruesos de la citoqueratina que forman tonobrillas en este carcinoma escamoso de clulas fusiformes (20 100 ).
Figura 5-6 Microscopia electrnica de una enfermedad no neoplsica: patologa tisular. a, b) Glomerulonefritis membranosa. a) Depsitos in-
munitarios despus de la microscopia de luz e inmunouorescencia mediante un anticuerpo anti-IgG marcado con uorescena. b) Micrografa
electrnica de transmisin correspondiente a tejido jado en glutaraldehdo que demuestra los depsitos inmunitarios subepiteliales (echas)
de una organizacin discreta que reeja la microscopia de luz. Ntese el engrosamiento de la membrana basal y la prdida de las proyeccio-
nes de apoyo del podocito (25 000 ). Fotografas cortesa del Dr. Alan Curry. c) Miopata de bastones de nemalina en una mujer de 15 aos.
La presentacin clnica incluy retraso en la motricidad, deambulacin sobre los dedos del pie, cadas frecuentes y dolores de pierna despus
del ejercicio. El bastn de nemalina es denso, demuestra las estriaciones transversales y se considera una anormalidad del disco Z. Los discos Z
normales y los sarcmeros se muestran para nes de comparacin (60 000 ). Fotografa cortesa del Dr. Liz Curtis. d) Sndrome de discinesia
ciliar primaria. Obsrvese la ausencia de brazos de dinena de los dobletes perifricos (160 000 ). Fotografa cortesa de Ann Dewar.
Figura 5-7 Microscopia electrnica de una enfermedad no neoplsica: microorganismos infecciosos. a) Espiroquetosis en una biopsia
de intestino grueso (8 800 ). b) Pneumocystis recuperado de la necropsia de tejido pulmonar. De forma inadvertida, este tejido se dej
toda la noche sin jacin. Por lo tanto, aunque su mayor parte se preserv mal (segn se esperaba), los agentes patgenos an son
identicables por sus perles curvos distintivos. Aqu, el aspecto en un paciente inmunocomprometido con cncer sugiere una infeccin
oportunista (7 500 ).
La distincin entre el diagnstico, por un lado, y el de-
sarrollo de la investigacin tecnolgica, por otro, es a veces
imprecisa y la ME posee una funcin en tal desarrollo. Tie-
ne utilidad, por ejemplo, en la determinacin de la calidad
de la conservacin estructural de los ovocitos en la corte-
za del ovario extirpado y criopreservado in vitro en las
mujeres jvenes con cncer durante la quimioterapia. El
diagnstico prenatal se puede realizar a partir de las clulas
obtenidas del lquido amnitico (Cameron y Toner, 1998),
al tiempo que existe un inters cada vez mayor en la carac-
terizacin ultraestructural de las clulas embrionarias en el
campo emergente de la ingeniera tisular.
Tcnicas y procedimientos especializados
El cuadro 5-3 enumera las tcnicas sealadas como es-
pecializadas y que no se utilizan de modo tan amplio en
los laboratorios de diagnstico como la MET, por lo cual
tienen pocas aplicaciones diagnsticas reales. En muchos
casos, las imgenes de estas tcnicas conrman un diagns-
tico bastante seguro que se basa sobre todo en resultados
clnicos e histopatolgicos; empero, muchas veces ofre-
cen nuevos detalles que pueden mejorar la comprensin
de la enfermedad. Son sin duda de un valor potencial en la
investigacin y debe recordarse que los hallazgos de la in-
vestigacin son en ocasiones precursores de pruebas diag-
nsticas. Estas tcnicas suelen encontrarse en laboratorios
que efectan tambin trabajos de investigacin; en estos cen-
tros, la investigacin genera experiencia con la tcnica y se
dispone de personal con entrenamiento y experiencia en la
tcnica para aplicar el procedimiento a casos diagnsticos
raros (vase la seccin de Lecturas adicionales).
Microscopia electrnica de barrido (MEB)
La MEB suministra informacin tridimensional, en parti-
cular de las caractersticas superciales y, en consecuencia,
las imgenes son a menudo ms fciles de interpretar (g.
5-8a) en comparacin con las de la MET, en las cuales es
necesario extrapolar una interpretacin a partir de cortes -
nos y es posible una interpretacin difcil debido a la orien-
tacin subptima. Por lo general, el tejido se ja como en
la MET, pero al nal de la fase de deshidratacin el etanol
se sustituye por dixido de carbono lquido, casi siempre
bajo presin en un secador de punto crtico. En el punto
crtico, el lquido y el dixido de carbono gaseoso forman
Figura 5-8 Tcnicas especiales 1. a) Microscopia electrnica de barrido. Eje del pelo humano. El paciente se valor por cabello retor-
cido, afeccin en la cual el eje del cabello se tuerce y es frgil, pero el anlisis de MEB indic tricorrexis nudosa, con supuesto dao se-
cundario al traumatismo mecnico o qumico (830 ). b) Microscopia inmunoelectrnica. MET de doble tincin de la regin mesangial
de un glomrulo de un individuo con nefropata mesangial por IgA que demuestra doble inmunolocalizacin de colgena de tipo IV (10
nm de oro) dentro de la matriz e IgA mesangiales (20 nm de oro) dentro del depsito electrodenso (33 000 ). Micrografas cortesa del
Dr. Jill Moss y Ian Shore.
una serie continua, que permite el secado del espcimen
de una manera que evita las distorsiones de la clula y la
estructura del tejido que de otra manera se presentaran con
el secado convencional. El espcimen seco se cubre enton-
ces con una capa delgada del metal evaporado (oro, pala-
dio, platino o cromo), que ayuda a eliminar la acumulacin
de la carga durante la exposicin al haz electrnico. El te-
jido, jado habitualmente a una base metlica (un trozo), se
encuentra entonces listo para colocarse en el microscopio
electrnico de barrido. En contraste con el haz incidente en
la MET, el haz electrnico en la MEB se aplica al espci-
men como rastreador. Esto da lugar a la emisin de electro-
nes secundarios, que recolecta un detector de electrones y
los convierte en una imagen observable en un tubo de rayos
catdicos. Adems del contorno y el detalle superciales,
los microscopios electrnicos de barrido ofrecen la ventaja
de suministrar una ampliacin ms baja (10 o 100 veces)
comparada con las tcnicas tradicionales disponibles para
la MET y por tanto se pueden utilizar para los especmenes
patolgicos completos.
Las aplicaciones diagnsticas de la MEB son limitadas.
Incluyen la valoracin del cabello humano (g. 5-8a) y la
identicacin de las partculas respiratorias, en especial las
bras de asbesto, que se pueden tambin estudiar por micro-
anlisis con rayos X para identicar la composicin qumica
o elemental. Los resultados pueden tener relevancia legal
respecto de la exposicin industrial (Ingram et al., 1989).
La capacidad exigida para distinguir las clulas B
y T y el mesotelioma y el adenocarcinoma a partir de
la morfologa diferenciada de la supercie celular no se
ha explotado de manera extensa en la prctica de rutina.
En el cuadro 5-4 se dan algunos de los mltiples ejemplos
de la MEB aplicada a las clulas y tejidos humanos que han
contribuido con datos para la comprensin de la enfermedad
sin conducir a la creacin de pruebas diagnsticas.
Microscopia inmunoelectrnica
La microscopia inmunoelectrnica (inmunomarcacin ul-
traestructural) proporciona de manera simultnea los datos
TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS 55
Figura 5-9 Tcnicas especiales 2. Histoqumica ultraestructural. a) Procedimiento de uranana para los grnulos neuroendocrinos en
un carcinoma mucoide de mama (25 700 ). b) La tincin de Grimelius para ME distingue los grnulos neuroendocrinos de los grnulos
de secrecin lctica en un carcinoma ancrino de mama (39 600 ). c) Tincin de Warthin-Starry modicada para que la ME demuestre
la melanina en un melanoma maligno (45 000 ). d) Plaquetas enteras, desmontadas y sin teir en una rejilla revestida con Formvar. El
paciente tena una anomala similar al sndrome de Hermansky-Pudlak secundario a una enfermedad mielodisplsica. Los grnulos (e-
chas) son ricos en calcio, que proporciona densidad electrnica inherente. La cuenta de los grnulos fue de 3.8 por plaqueta (valor nor-
mal, 5.3). Obsrvense los grnulos densos en una plaqueta y la ausencia en la plaqueta adyacente y un grnulo con colas (17 700 ).
Micrografas cortesa de Bart E. Wagner.
Cuadro 5-4 Aplicaciones de la MEB en material
clnico humano
Fibras de asbesto y otras partculas respiratorias
Distingue las clulas B y T a travs de la morfologa
de la supercie celular
Microvellosidades mesoteliales y adenocarcinomatosas
Anormalidades de espermatozoides
Urotelio y carcinoma urotelial
Hiperplasia endometrial
Hiperplasia prosttica benigna y cristales intraluminales
en carcinoma prosttico
Papilas renales/conductos de Bellini
Supercies esofgicas e intestinales
Giardia lamblia en la supercie duodenal
Espiroquetosis
Cryptosporidium
Enfermedad de Crohn
Apendicitis aguda
Tejidos y clulas sinoviales en artritis reumatoide
y gota
Cristales de pirofosfato de calcio en cartlago y tejido
del menisco
Mitocondria en oncocitos
Supercies de la clula leucmica (clula del cabello)
Cuadro 5-5 Aplicaciones de la microscopia inmunoelectrnica en anormalidades
clnicas y patolgicas
Contenido hormonal en los grnulos neuroendocrinos en los tumores
Depsitos de inmunoglobulinas y complemento en las clulas plasmticas, linfoma, enfermedad renal y queratopata cristaloide;
amiloide en plasmacitoma
Protenas citoesquelticas (actina del msculo liso, actinina alfa, citoqueratina, vimentina, desmina y neurolamento protenico)
en clulas no neoplsicas y tumorales
Fibronectina en la supercie de los miobroblastos
Laminina y colgena tipo IV en membranas basales
Molculas de adhesin intercelular (p. ej., ICAM-1, CD44) en clulas reactivas y neoplsicas
Molculas de supercie celular (CD4, CD8, CD56) en enfermedad de injerto contra husped aguda
El vasopresor y la protena vasoconstrictora, endotelina 1, en glndula suprarrenal
La diferenciacin del antgeno, receptor de la urocinasa, en neutrlos
La protena antiapoptsica, BCL2, en tumores tiroideos
Factor de von Willebrand en cuerpos de Weibel-Palade en el endotelio
Lisozimas y mucinas en lesiones epiteliales glandulares
Lactoferrina y lisozima en leucemia mielomonoctica
Mieloperoxidasa en leucemia mieloide
Protena cristalina de Charcot-Leyden (lisofosfolipasa) en baslos
Catepsina D en lisosomas en las clulas vasculares del msculo liso en anastomosis arteriovenosas
Sintasa del xido ntrico en la vescula seminal humana
Rotavirus en extractos fecales humanos
morfolgicos de la MET convencional y la informacin
sobre la composicin biomolecular, como en la inmunohis-
toqumica microscpica de luz. Los datos de la microscopia
inmunoelectrnica, como los de la MEB, son casi siempre
conrmatorios o se suman a la comprensin cientca de
un padecimiento clnico; empero, el potencial de la tcnica
para conrmar un diagnstico, al eliminar incertidumbre
de interpretacin y acentuar la probabilidad de un diagns-
tico, es muy grande. Pero, en la prctica, los requerimientos
de personal y nanciamiento para la ME comprometen el
uso de la microscopia inmunoelectrnica diagnstica, que
tambin exige ms atencin para su prctica. La gama de
protenas identicables en material clnico con la micros-
copia inmunoelectrnica se resume en el cuadro 5-5.
Una de las formas ms simples de microscopia inmuno-
electrnica se observa al desparanar y procesar una mues-
tra teida por medios de microscopia inmunohistoqumica
a partir de un portaobjetos de cristal. Esto representa un
desafo tcnico y tiende a ofrecer una preservacin estruc-
tural mala. Algunas veces tambin, al identicar la inmu-
notincin, que es densa en electrones como resultado de la
exposicin al tetraxido de osmio, puede ser menos que
clara. Las mejores tcnicas utilizan un anticuerpo espec-
co marcado con partculas de oro coloidal. Las partculas
TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS 57
de oro son en su mayor parte de 5, 10 o 20 nm de dimetro
y, una vez localizadas en los cortes del tejido, se identican
con facilidad en la pantalla del microscopio electrnico por
su contorno agudo, que tambin facilita el enfoque y la fo-
tografa (g. 5-8b).
Es preciso tener precaucin al aprovecharla para mejo-
rar la conservacin del antgeno. Las protenas varan en
grado considerable en la conservacin de su inmunorreac-
tividad y, por lo tanto, en el grado al cual pueden demos-
trarse por microscopia inmunoelectrnica. El tejido que
acaba de obtenerse ha de jarse en una solucin de reciente
preparacin de paraformaldehdo. Aunque el tejido pueda
recuperarse del espcimen histolgico principal, muchos
antgenos sobreviven en la formalina histolgica. Los
jadores de metal pesado no se usan para evitar la desna-
turalizacin adicional de la protena, y a menudo la deshi-
dratacin no se lleva a cabo con un etanol de ms de 70%
antes de la impregnacin en una resina hidrla como LR
White. Luego, la muestra se somete a una polimerizacin
trmica mnima antes de la seccin de los cortes ultranos
y la aplicacin de los reactivos apropiados que soportan el
oro. Lowicryl es una resina hidrla alternativa de cierta
demanda que proporciona conservacin ultraestructural
superior; este agente, dado que es una resina hidrla a
baja temperatura, conserva mejor al antgeno. La forma
ms exigente de la microscopia inmunoelectrnica utili-
za los cortes ultranos congelados (crioultramicrotoma).
La microscopia inmunoelectrnica se puede tambin reali-
zar en cortes ultranos a partir de tejido impregnado en re-
sina epxica procesado de modo convencional para MET,
a menudo con el uso de reactivos que develen la resina y
expongan sitios antignicos.
Histoqumica ultraestructural
La histoqumica ultraestructural (histoqumica electrnica)
es anloga a la histoqumica de la microscopia de luz tpica,
pero proporciona informacin sobre la naturaleza qumica o
bioqumica de clulas y tejidos en el plano ultraestructural.
Para ello, las tcnicas requieren un marcador electrodenso,
las ms de las veces un compuesto que contiene los tomos
del metal que dispersa a los electrones. Se ha identicado
una amplia gama de sustancias en las clulas y los tejidos,
incluidas las enzimas, mediante histoqumica ultraestructu-
ral (cuadro 5-6). Como en la microscopia inmunoelectrni-
ca, los estudios publicados que identican estas sustancias
se sitan en el campo de la investigacin, en vez de tener
un valor real en la histopatologa diagnstica. Sin embar-
go, como en el caso de la microscopia inmunoelectrnica,
los individuos o los laboratorios con intereses, experiencia
o lneas de investigacin tal vez encuentren aplicaciones
diagnsticas para estas tcnicas.
La prctica de las tcnicas vara en grado considera-
ble, segn sea la sustancia que se revela. Para las enzimas,
como la peroxidasa plaquetaria, pueden requerirse jado-
res especializados (p. ej., uno que contenga cido tnico,
formaldehdo y una concentracin baja de glutaraldeh-
do). Para el glucgeno, el jador tetraxido de osmio se
puede modicar con la adicin de ferrocianuro de potasio,
mientras que para los lpidos, que se pierden durante el
procesamiento de MET tpico, puede emplearse una so-
lucin de imidazol-tetraxido de osmio amortiguada. Por
el contrario, en la reaccin de uranana para los grnulos
neuroendocrinos (g. 5-9a) es preferible el glutaraldehdo
a la formalina histolgica, puesto que las molculas pue-
den perderse del tejido recuperado a partir de la formalina,
lo que genera una reaccin dbil.
El procedimiento con uranana es una tincin til de
la ME para los grnulos neuroendocrinos, dado que stos
muestran heterogeneidad ultraestructural y pueden algunas
veces ser difciles de distinguir de los lisosomas primarios,
grnulos pequeos de secrecin lctica y grnulos peque-
os serosos. La tcnica se basa en la hiptesis segn la cual
el centro granular neuroendocrino consiste en un complejo
de hormonas, protenas y nucletidos (Payne, 1993). Las
cargas negativas de los ltimos se unen a los iones uranilo
de carga positiva para proporcionar electrodensidad. Todo
el fosfato libre debe eliminarse despus de la jacin con
aldehdo, antes que el tejido pase a la solucin concentrada
de acetato de uranilo (hasta por dos das) y no debe usar-
se ninguna otra tincin que conera electrodensidad. Los
Cuadro 5-6 Histoqumica ultraestructural: aplicaciones
en material clnico
Reaccin de uranana (acetato de uranilo) para grnulos
neuroendocrinos
Acetato de uranilo modicado-citrato de plomo para la
tincin selectiva de cidos nucleicos
Tincin de Grimelius (tincin con plata) para grnulos
neuroendocrinos
Tcnica de Warthin-Starry para la melanina
Reaccin L-DOPA modicada para ME y tirosinasa
y melanosomas
Peroxidasa plaquetaria en el diagnstico diferencial
de leucemias
cido fosfotngstico etanlico para sinapsis
Procedimiento de ferrocianuro de osmio-potasio para
glucgeno
Imidazol-tetraxido de osmio amortiguado para lpidos
Fosfatasa cida para lisosomas (p. ej., en linfocitos
granulares grandes)
Rojo de rutenio, azul cuprolnico, metenamina de plata,
diamina de hierro para porciones de polisacridos
ribosomas y la cromatina nuclear, en virtud de su conteni-
do de nucletidos, pueden actuar como controles internos
positivos. Las tcnicas de tincin con plata en el plano ul-
traestructural estn tambin disponibles para grnulos neu-
roendocrinos y melanina (g. 5-9b, c).
Microanlisis con rayos X y difraccin electrnica
Una de las interacciones de los electrones con tomos de
un espcimen fsico conduce a una reconguracin de los
niveles energticos en las rbitas del electrn alrededor de
los tomos, con la consecuente emisin de rayos X. stos
son caractersticos del nmero atmico y por tanto esta-
blecen la naturaleza qumica elemental del material bajo
investigacin. Una variedad de elementos con importancia
clnica se puede identicar mediante esta tcnica; los ms
importantes son las partculas respiratorias, incluidas las
diversas formas de la bra de asbesto (Ingram et al, 1989;
Cameron y Toner, 1998). Con frecuencia puede ser necesa-
rio digerir el tejido para liberar las bras para el anlisis.
La tcnica de difraccin electrnica puede ser til para
demostrar una periodicidad y por consiguiente la naturaleza
cristalina dentro de un objeto expuesto a electrones, como
un resultado en el cual se observan los patrones de difrac-
cin, que consisten en puntos de alta intensidad dispuestos
con precisin en el espacio. Esta informacin puede discri-
minar sustancias de composicin qumica diferente.
Fractura y delineado por congelacin
En la tcnica de fractura y delineado por congelacin, el
tejido se congela con rapidez y despus se fractura por
impacto con un borde agudo dentro de un instrumento es-
peccamente diseado y disponible en el comercio. La
fractura plana pasa a travs de sistemas membranosos y
proporciona una supercie para la observacin posterior del
sombreado metlico. El sombreado puede retardarse des-
pus del delineado, para revelar reas ms grandes de
supercies reales de la membrana adems de supercies
membranosas hendidas. No existen aplicaciones diagns-
ticas reales, pero la tcnica se aplica a clulas y tejidos
humanos para suministrar nueva informacin sobre la or-
ganizacin de la membrana celular, por ejemplo exocitosis
de los grnulos neuroendocrinos de las clulas y espacios
alterados y uniones estrechas en los tumores oncocticos de
la tiroides humana (Cochand-Priollet et al., 1998).
Resumen
Este captulo tiene como objetivo transmitir una perspectiva
contempornea de la microscopia electrnica en el diagns-
tico de rutina en el campo de la patologa. Se han delineado
algunos principios de la teora cientca de estas tcnicas
ultraestructurales prcticas para facilitar la interpretacin
de las imgenes microgrcas electrnicas. A pesar del de-
sarrollo continuo de nuevas tcnicas, sobre todo en la in-
munohistoqumica y la biologa molecular, el microscopio
electrnico an es valioso en el diagnstico de lesiones
problemticas en la investigacin clnica o la microscopia
de luz. Es una cuestin de experiencia directa de quienes
practican la microscopia electrnica que las lesiones se
encuentren todava donde los hallazgos clnicos e inmu-
nohistoqumicos son contradictorios o intiles, al grado de
establecer un diagnstico impreciso: esto se puede, en algu-
nas circunstancias, modicar por microscopia electrnica,
incluso a pesar de la propia limitacin del muestreo de la
tcnica. En el campo del diagnstico tumoral, algunas de
estas dicultades se deben a las limitaciones de la inmuno-
histoqumica, en la que hoy da confa el patlogo tumoral;
es una tcnica que, a diferencia de la microscopia electr-
nica, todava no alcanza la etapa de estabilidad tecnolgica.
En el campo ms grande de las anomalas no neoplsicas
enfermedad renal y neuromuscular, microorganismos
infecciosos, enfermedades ciliares, dermatopatologa, para
mencionar quizs las principales la microscopia electr-
nica ejerce una inuencia ms notoria dado que es menos
dependiente de la inmunohistoqumica; en este caso, la mi-
croscopia electrnica puede identicar una multiplicidad de
cambios estructurales dentro de una clula o tejido que se
pueden relacionar con diversas enfermedades.
En gran medida, la mayora de las aplicaciones morfo-
lgicas tiene lugar en la microscopia electrnica de trans-
misin. Sin embargo, aunque existen diversas tcnicas
especializadas que han contribuido a mejorar la comprensin
de la biologa estructural de la clula, tejidos y lesiones hu-
manas, se conocen pocas aplicaciones reales al diagnstico.
Por ltimo, la microscopia electrnica es una tcnica
esencial para el anlisis diagnstico de las lesiones humanas.
En este contexto, es necesario enfatizar que mientras el an-
lisis de la expresin del gen es fundamental para compren-
der la enfermedad, dicha comprensin slo ser completa
si se acepta que las afecciones observadas en los cortes con
H-E o los ultranos resultan no slo de la expresin del gen,
sino tambin de actividades posgenmicas: estas actividades
pueden constatarse de modo ms efectivo con las tcnicas
fenotpicas, como la demostracin inmunohistoqumica de
protenas funcionales y su elaboracin dentro de las estruc-
turas funcionales de la clula por microscopia electrnica.
Reconocimientos
En la preparacin de este captulo merecen un reconoci-
miento especial los colegas siguientes por su inestimable
RECONOCIMIENTOS 59
colaboracin: Dr. Alan Curry (Manchester Royal Inrma-
ry), Dr. Liz Curtis (Queen Elizabeth Hospital, Birming-
ham), Ann Dewar (Royal Brompton Hospital, Londres), Dr.
Jill Moss y Ian Shore (Charing Cross Hospital, Londres), y
Bart E. Wagner (Northern General Hospital, Shef eld), por
proporcionar los micrgrafos electrnicos; y Paul Chantry
y Elizabeth White (ambos del Christie Hospital) por trazar
la gura 5-1 y la recopilacin bibliogrca de investigacin
y la impresin fotogrca, respectivamente. Asimismo, es-
tamos en deuda con el Dr. Jill Moss, Dr. Alan Curry y el
profesor Peter Toner por los comentarios valiosos sobre
el manuscrito y nuestro reconocimiento a la importancia
del captulo original del Dr. Stuart Cameron y el profesor
Peter Toner como el punto de partida para este trabajo.
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and Tokyo, in conjuction with the Society for Ultrastructural
Pathology.
Artculos especiales de revistas dedicados
a la microscopia electrnica
Curr Diagn Pathol 2002; 8(4): contiene un minisimposio sobre
microscopia electrnica de diagnstico.
Semin Diagn Pathol 2002; 20(1): se dedica a la microscopia
electrnica de tumores.
Hum Pathol 1998; 29(12): contiene un simposio de la micros-
copia electrnica sobre tumores.
Ultrastruct Pathol 1992; 16: contiene los artculos sobre tcnicas
de ME especializadas, incluidas la microscopia inmunoelec-
trnica, hibridacin in situ ultraestructural, tcnica pop-off y
morfometra ultraestructural.
Artculos sobre tcnicas ultraestructurales especializadas
Las tcnicas y los procedimientos como los enumerados en el
cuadro 5-3 se pueden encontrar en diarios especializados, como
Ultrastruct Pathol, J Submicrosc Cytol Pathol y Med Electron
Microsc.
Introduccin
El microscopio de luz apareci hace mucho tiempo, cuan-
do Hans y Zacharias Janssen crearon el primer microscopio
compuesto, en 1590. A diferencia de una simple lupa, el
instrumento consista en un tubo con una lente particular
en cada extremo. Los cientcos clnicos se beneciaron de
forma subsecuente con las mejoras radicales en el diseo,
construccin y tcnica del microscopio, en particular du-
rante los ltimos 100 aos.
El microscopio de luz compuesto es el caballo de batalla
de todo laboratorio clnico y con l se observa la mayor
parte de las muestras con la ayuda de la iluminacin de
campo brillante. Sin embargo, la disponibilidad cada vez
mayor de herramientas diagnsticas, como los anticuerpos
monoclonales marcados con uorescencia, obliga al cien-
tco clnico a adquirir destreza con mltiples tcnicas mi-
croscpicas en los aos recientes.
Este captulo introduce los conceptos bsicos del dise-
o del microscopio, explica de forma sinptica los prin-
cipios que subyacen a los procedimientos actuales ms
comunes del laboratorio clnico y discute varias reas de apli-
cacin. El lector puede consultar las referencias adiciona-
les (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Determan y Lerpusch,
1988; Lacey, 1999) para una descripcin ms extensa y una
explicacin ms completa de cada tcnica.
Diseo bsico del microscopio
El ms simple, el microscopio compuesto, se conforma
con dos sistemas de lentes, la lente objetivo, que forma una
imagen real de la muestra, y la ocular, la cual crea una ima-
gen al innito que puede observar el operador. La amplia-
cin total es el producto de la magnicacin de estos dos
grupos de lentes. En la prctica, el microscopio tpico de
laboratorio contiene de forma adicional grupos de lentes,
prismas y divisores de la imagen, lo cual puede o no afec-
tar la ampliacin total, pero en forma invariable mejora el
funcionamiento ptico del instrumento o la conveniencia
de operacin, por ejemplo, al inclinar los oculares hacia el
operador.
El funcionamiento del microscopio se describe de modo
ms correcto en trminos de poder de resolucin (la capa-
cidad del microscopio para distinguir dos puntos separados
por una distancia diminuta). En el mejor de los casos, el ojo
humano puede resolver sin ayuda dos puntos tan prximos
como 150 m uno del otro. El lmite de la longitud de onda
de la luz visible y la abertura numrica de las lentes del mi-
croscopio se combinan para precisar la resolucin terica
mxima del microscopio de luz a 0.22 m, al margen de la
ampliacin mxima.
Casi todos los microscopios modernos son modulares
en su construccin. Esto ofrece varios benecios para el
usuario, incluida la facilidad para ampliar las capacidades
del microscopio y satisfacer demandas futuras. Lo ms
importante es tal vez que el presupuesto inicial incline la
compra por la obtencin de la ms alta calidad ptica posi-
ble; despus de todo, un microscopio completo es tan bue-
no como la calidad de sus sistemas de lentes. Las mejoras
futuras pueden incluir fuentes alternativas de iluminacin
y sistemas pticos accesorios o quiz la adicin de una
computadora personal, programas y cmara digital ja o
de video (la integracin de computadoras personales con
los microscopios pticos facilita la optimizacin automa-
tizada de los ajustes del microscopio y la obtencin de la
6
Microscopia de luz
Brian Boullier
62 CAP. 6 MICROSCOPIA DE LUZ
imagen conveniente, adems del almacenamiento de datos
y el anlisis de imgenes de gran alcance).
La gura 6-1 ilustra las partes principales del micros-
copio tpico de laboratorio. Varias partes merecen explica-
cin: las lentes objetivo, los oculares, el condensador, el
diafragma de campo y la(s) fuente(s) de luz.
Las lentes objetivo son la parte ms importante del mi-
croscopio, dado que determinan las diversas ampliaciones
posibles y denen la calidad ptica alcanzable. De manera
caracterstica, las lentes objetivo de 10, 40 y 100 estn
sujetas a una torreta giratoria. Esto ofrece ampliaciones to-
tales de 100, 400 y 1 000 , respectivamente, cuando se
usan oculares de 10 .
Las propiedades de cada lente objetivo estn casi siem-
pre inscritas sobre el can de la lente. Las marcas inclu-
yen lo siguiente:
Nombre del fabricante.
Floutar, Fluor, Neouar o UV, lo cual signica
que la lente transmite luz ultravioleta y por lo tanto es
conveniente para la microscopia de uorescencia.
Phaco, Phase o Ph, que indica la presencia de un
anillo de fase y que la lente es conveniente para la mi-
croscopia de contraste de fase (un nmero lo acompaa,
p. ej., Ph 2, que especica la abertura del condensador
de contraste de fase a usar).
Plan, que seala que la lente produce una imagen de
campo plano en la cual todo se enfoca a travs del
campo entero de visin.
Apo, es decir, que la lente es corregible para aberra-
cin cromtica, lo que de otra manera produce franjas
de color visible alrededor de los puntos nos en la
imagen.
Ampliacin de la lente y abertura numrica (en esen-
cia el poder de recoleccin de luz de la lente), como
40 /0.85.
Longitud del tubo (que es la distancia efectiva entre el
ocular y el objetivo, casi siempre de 160 mm) y grosor
requerido del cubreobjetos (en mm), como 160/0.17.
Oel, Imm u Oil, esto es, que la lente est diseada
para el uso con aceite de inmersin entre el elemento
nal de la lente y el cubreobjetos.
CDI, que signica que la lente est diseada de ma-
nera especca para contraste diferencial de interferen-
cia de Nomarski.
Figura 6-1 Corte transversal de un microscopio tpico de laboratorio (cortesa de Leica UK Ltd).
TIPOS DE MICROSCOPIA 63
Los oculares amplan adems la imagen producida
por las lentes objetivo, por lo regular por un factor de 10.
La imagen que producen se enfoca en el innito, lo que
permite al operador verla como si estuviera en la distancia.
Los oculares son tiles para los usuarios de anteojos debi-
do a que se disean para permitir que la imagen completa
se observe desde varios centmetros arriba del ocular.
El condensador es una parte importante del sistema de
iluminacin. Cuando se ajusta de forma correcta, enfoca
un cono uniforme de luz sobre la muestra (en ampliaciones
bajas, una lente desplazable situada por encima del con-
densador puede removerse respecto de la trayectoria de la
luz para asegurar que el campo de visin est iluminado).
El ajuste correcto del diafragma del condensador asegura
un equilibrio ptimo de la resolucin de la imagen, el con-
traste y la profundidad del campo.
El diafragma del campo se centra y su abertura se ajusta
para que slo la regin observada de la muestra se ilumi-
ne. Esto minimiza la dispersin de luz innecesaria, que se
produce dentro de las regiones exteriores inadvertidas de
la muestra.
La fuente de luz utilizada en los microscopios modernos
del laboratorio es un bulbo de tungsteno/halgeno de bajo
voltaje; ste proporciona iluminacin intensa y estable en
el espectro visible. El bulbo puede alojarse dentro del cuer-
po del microscopio o en un bastidor externo. Por lo general,
la microscopia de uorescencia explota las caractersticas
espectrales ms adecuadas de la lmpara de arco de mercu-
rio de alta presin, que se emite con intensidad en la regin
ultravioleta (UV) del espectro. Los lseres proporcionan
una fuente de luz monocromtica de alta intensidad, que
en condiciones ideales satisface a la microscopia confocal,
as como tambin a varias tcnicas de investigacin como
el fotoblanqueamiento y la uorescencia de reexin in-
terna total.
Tipos de microscopia
La iluminacin de campo brillante es an la forma ms em-
pleada de la microscopia en el laboratorio clnico. Otros mto-
dos, incluidas las microscopias uorescente y la de contraste
de fase y, cada vez ms, las microscopias de campo oscuro,
luz polarizada y de Nomarski, tienen diversas aplicaciones en
el diagnstico de laboratorio. Sin embargo, el costo y la re-
lativa complejidad del microscopio confocal han restringido
mucho su uso para aplicaciones de investigacin. Cada uno
de estos tipos de microscopia se comenta a continuacin.
Como su nombre lo seala, la iluminacin de campo bri-
llante presenta al observador una imagen del conjunto de
la muestra contra un fondo brillante. Para trabajar de ma-
nera eciente, la muestra debe absorber suciente luz para
producir un grado aceptable de contraste. Las tinciones se
emplean de manera habitual para incrementar el contraste
de la muestra y revelan adems detalles estructurales.
La iluminacin de Khler, que introdujo de forma ini-
cial en el siglo pasado August Khler, se ha convertido
en la forma universal utilizada de iluminacin de cam-
po brillante debido a la calidad de la imagen producida.
No obstante, la calidad de la imagen ptima requiere el
reajuste regular del microscopio. Infortunadamente, mu-
chos instrumentos no se utilizan a su mxima capacidad
debido a que se soslaya la necesidad de reajustar el mi-
croscopio al cambiar las lentes objetivo y se desconoce en
general la tcnica requerida.
En la iluminacin de Khler, dos conjuntos de rayos
de luz contribuyen a la imagen nal, uno de ellos llama-
do rayos iluminadores y el otro rayos formadores de
la imagen. Ambos se derivan del lamento de la lmpara
incandescente (en la prctica, un ltro de vidrio molido se
ja frente al lamento de la lmpara para proporcionar una
fuente ms uniforme de los rayos iluminadores).
La gura 6-2 ilustra las trayectorias separadas seguidas
por los rayos iluminadores y los rayos formadores de la
imagen en un microscopio dispuesto de modo correcto para
la iluminacin de Khler. Ms notable an es lo siguiente:
1. Los rayos que iluminan son paralelos al plano de la
muestra para proporcionar la amplia rea de ilumina-
cin requerida.
2. Los rayos iluminadores se enfocan con precisin sobre
el cristalino antes de divergir para proporcionar una
gran rea de iluminacin sobre la retina.
3. Los rayos formadores de la imagen convergen sobre el
plano de la muestra y crean una imagen magnicada
pero invertida de la muestra en el plano de la imagen
primaria debajo del ocular.
4. Las lentes oculares invierten de nueva cuenta los rayos
formadores de la imagen de la muestra antes de que en-
tren al ojo y se enfocan sobre la retina para producir una
imagen de la muestra.
De esta manera, la iluminacin de Khler proporciona un
gran campo de visin iluminado de modo uniforme sobre
la retina del observador, junto con una imagen enfocada y
ampliada de la muestra.
La microscopia de uorescencia aprovecha la propie-
dad de las molculas llamadas uorocromos para emitir luz
de una longitud de onda particular cuando se excitan por
luz incidental de longitud de onda ms corta. Estos uo-
rocromos pueden ser naturales de la muestra bajo estudio,
pero por lo regular la muestra se trata de manera directa
o indirecta con colorantes uorescentes. Por ejemplo, el
46-diamidino-2-fenilindol especco de DNA (DAPI)
puede usarse de forma directa para revelar la presencia
extracelular del micoplasma que contiene DNA, el que
contamina con frecuencia los cultivos celulares. Los com-
ponentes celulares, por ejemplo el citoesqueleto, pueden
teirse de manera indirecta mediante sondas muy espec-
cas creadas por la conjugacin de uorocromos, como el
isocianato de uorescena con anticuerpos monoclonales.
La microscopia de uorescencia requiere una moderni-
zacin relativamente simple del microscopio de luz con-
vencional. Las lmparas de arco de mercurio de alta presin
suelen utilizarse para proporcionar iluminacin intensa en
la regin ultravioleta (UV) del espectro, lo cual excita la
uorescencia en muchos uorocromos importantes. El
uso de UV tambin exige el empleo de lentes objetivo es-
peciales capaces de transmitir la UV. Esto se debe a que
en la conguracin tpica del microscopio de uorescen-
cia, las lentes objetivo tambin sirven para enfocar los ra-
yos de iluminacin sobre la muestra. Dado que los rayos de
iluminacin pasan a travs del objetivo e inciden sobre la
muestra (ms que transmitirse a travs de ste desde aba-
jo), esta tcnica se conoce como epiiluminacin.
Debe utilizarse una combinacin apropiada del ltro de
excitacin, el divisor del haz cromtico y el ltro de barre-
ra para cada uno de los uorocromos en uso (g. 6-3). El
ltro de excitacin est situado enfrente de la lmpara de
mercurio y se selecciona para permitir la transmisin de un
espectro estrecho de longitudes de onda de la luz, incluida
la longitud de onda necesaria para excitar la uorescencia.
El divisor de haz monocromtico debe reejar las longi-
tudes de onda excitatorias de la luz sobre la muestra y de-
tener la luz incidente reejada que alcanzara los oculares.
Figura 6-2 Montaje de los componentes del microscopio para la iluminacin de Khler: a) trayectorias de los rayos formadores de
imagen; b) trayectorias de los rayos de iluminacin.
Como su nombre lo sugiere, el ltro de barrera asegura que
slo la luz emitida por el uorocromo alcance los oculares
(la luz UV puede daar los ojos y la piel desprotegida).
Figura 6-3 Trayectoria de la luz en un microscopio epiuores-
cente.
La microscopia de contraste de fase permite el estudio
de muestras biolgicas sin teir con contraste inherente
pequeo (incluidas muestras vivas). La tcnica explota las
diferencias de fase que se presentan entre la luz que pasa
a travs de una muestra biolgica y la luz que pasa de for-
ma ininterrumpida a travs del medio circundante (en los
materiales biolgicos esta diferencia es cercana a 1/4). El
microscopio de contraste de fase requiere un condensador
especial con una serie de aberturas anulares en su plano fo-
cal delantero y lentes objetivo alineadas con los anillos de
fase en su plano focal posterior (g. 6-4). Estas disposicio-
nes introducen otro desplazamiento relativo de fase de 1/4
a la luz ya difractada a travs de la muestra y el resultado
es un total de 1/2 de retraso de fase en relacin con la luz
de fondo. La interferencia destructiva producida da lugar
a que los detalles refractivos en la muestra aparezcan ms
oscuros que el fondo, un efecto conocido como contraste
de fase positivo. Por el contrario, el contraste de fase ne-
gativo, en el cual los detalles de la muestra aparecen ms
brillantes que el fondo, surge cuando se produce interferen-
cia constructiva al retardarse la luz de fondo por 1/4.
Los microscopios de contraste de fase son excelentes
para observar muestras vivas con la mnima distorsin,
incluidas las clulas animales cultivadas en contenedores
estriles y cerrados y la motilidad del espermatozoide en
cajas de Petri.
La microscopia de campo oscuro revela detalles estruc-
turales como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. Se
usa un condensador especial para proporcionar ilumina-
cin oblicua que, si la muestra no la altera, no puede entrar
a las lentes objetivo. Slo aquellas partes de la muestra que
desvan la luz hacia la lente objetivo presentan una ima-
gen a los oculares. Dos tipos de condensador facilitan la
iluminacin de campo oscuro. Una simple pieza de deten-
cin puede usarse para oscurecer la porcin central de la
iluminacin que proporciona un condensador convencio-
nal y que deja slo que los rayos oblicuos incidan sobre la
muestra (g. 6-5). Los condensadores de espejo especia-
les proporcionan la mejor calidad de imagen, pero slo son
apropiados para la iluminacin de campo oscuro.
La microscopia de campo oscuro no proporciona una
imagen por completo representativa de la muestra (muchas
estructuras intracelulares pueden no ser evidentes). Sin em-
bargo, el mtodo es til para revelar detalles adicionales de
estructuras de borde no que son difciles de observar con la
iluminacin de campo brillante debido a su carencia de con-
traste. Adems, puesto que la tincin es innecesaria (como
con la microscopia de contraste de fase y de Nomarski), este
mtodo de iluminacin es til para observar muestras vivas,
los espermatozoides y protozoos agelados ofrecen imge-
nes fascinantes cuando se observan de esta manera.
La microscopia de luz polarizada representa otra modi-
cacin del microscopio de luz convencional. La luz que
emana desde una fuente de luz puede ser el reejo de las
numerosas ondas sinusoides que oscilan en alguno de los
planos de nmero innito alrededor de un eje central; en
otras palabras, no est polarizada. El microscopio de po-
larizacin incluye dos ltros polarizantes: primero, el pola-
rizador, que por lo general puede rotarse, se localiza entre
la lmpara y el condensador y adems proporciona rayos de
iluminacin a la muestra que oscilan en un solo plano, y, se-
gundo, el analizador, que suele estar jo, y se halla entre la
lente objetivo y el ocular. Si se asume que la muestra no est
en la trayectoria de la luz, entonces hay una sola posicin
del polarizador donde coinciden los planos transmitidos y la
imagen aparece mucho ms brillante. En cambio, a 90 de
esta orientacin los dos planos transmitidos se cruzan y el
resultado es la extincin de la luz que alcanza los oculares.
El microscopio polarizante explota la caracterstica bi-
refringente de las muestras para dividir la luz polarizada
TIPOS DE MICROSCOPIA 65
Figura 6-4 Trayectoria de la luz en la microscopia de contraste
de fases.
Figura 6-5 Trayectoria de la luz en la microscopia de campo
oscuro.
incidente en dos componentes, que oscilan en planos pa-
ralelos respecto de las dos direcciones del ndice refractivo.
Los dos componentes se retardan de forma distinta den-
tro de la muestra, lo que introduce una diferencia de fase.
Puesto que estos componentes no comparten el mismo
plano no conducen a la interferencia. Sin embargo, al alcan-
zar el analizador, slo los componentes paralelos al ana-
lizador se transmiten, y dado que comparten entonces el
mismo plano, pueden interferir. Rotar el portaobjetos de la
muestra permite que la cantidad de interferencia construc-
tiva se modique, con el cambio consiguiente de la lumino-
sidad de las estructuras birrefringentes bajo observacin.
Los objetos de birrefringencia conocidos, llamados
compensadores, incluidos el cuarzo y el ltro placa roja
de primer orden, se pueden insertar en la trayectoria de la
luz y usarse para calcular las caractersticas birrefringentes
de estructuras desconocidas, lo que contribuye a su identi-
cacin. El microscopio de polarizacin se benecia tam-
bin del uso de las lentes objetivo especializadas libres
de tensin, que minimizan la cantidad de birrefringencia
introducida por el propio sistema ptico. La microscopia
polarizante ha encontrado aplicacin, por ejemplo, en la
diferenciacin entre el urato cido de sodio y el de pirofos-
fato de calcio deshidratado del lquido sinovial; empero, casi
siempre las aplicaciones de la microscopia polarizante en el
diagnstico de laboratorio son limitadas e infrecuentes.
La microscopia de contraste diferencial de interferen-
cia (CDI) de Nomarski representa una combinacin de la
microscopia de polarizacin y la de contraste de fases y
es ms adecuada para las muestras nas transparentes sin
teir. La aplicacin acertada requiere un instrumento dise-
ado especialmente, que incluye los ltros cruzados del
polarizador y analizador y dos divisores de haz del prisma
de Wollaston. Junto con las diferencias de fase introduci-
das por los divisores del haz, el retardo adicional de luz
impuesto por la muestra produce una imagen en la cual el
fondo es gris, los bordes de la mano izquierda son brillan-
tes, las reas centrales son grises y los bordes de la mano
derecha son oscuros. Esto da a los objetos en la trayecto-
ria de la luz un aspecto casi tridimensional, con organelos
como la mitocondria y los ncleos denidos con claridad.
En condiciones ideales, la microscopia de CDI satisface el
estudio de los organismos vivos. Asimismo, ha encontrado
apoyo en el estudio de rutina de muestras hmedas como el
sedimento urinario.
La descripcin de la tcnica microscpica moderna no
estara completa sin al menos hacer una referencia breve
a la microscopia confocal, la cual representa una modi-
cacin importante de la microscopia epiuorescente. La
diferencia principal entre la microscopia confocal y los
mtodos ya explicados radica en que aqulla depende de la
iluminacin de punto ms que de la iluminacin de campo.
Esta ltima la proporciona un rayo lser enfocado, que se
aplica a la muestra a una profundidad especca (g. 6-6).
La imagen que se produce es un compuesto generado por
computadora formado por las intensidades que dieren de
la luz emitida por las diferentes regiones de la muestra. En
consecuencia, la calidad de la imagen depende al nal de
la sensibilidad de la luz y la resolucin de la cmara elec-
trnica, as como tambin de la calidad de los elementos
pticos del microscopio y el montaje del instrumento. La
microscopia confocal puede proporcionar imgenes muy
ntidas desprovistas de la imagen desenfocada relacionada
con la observacin convencional de uorescencia y desde
el interior de muestras relativamente gruesas (<100 m).
Micrografa
La buena micrografa es an cierto objeto de arte en los la-
boratorios cientcos y se describe de manera ms detalla-
da en varios textos (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Smith,
1990; Rost y Oldeld, 2000; Olympus Microscopy Resour-
ce Centre, noviembre 2004). La capacidad para crear un
registro conveniente y permanente de las imgenes deriva-
Figura 6-6 Trayectoria de la luz en un microscopio confocal que
realiza el escrutinio con lser.
das del microscopio es importante en muchos campos de la
patologa diagnstica y por lo tanto la mayora de los labo-
ratorios posee uno o ms fotomicroscopios. Por ejemplo, la
micrografa es en particular til para registrar las muestras
teidas con uorescencia, que tienden a decolorarse con el
tiempo. Entre los instrumentos disponibles guran los mi-
croscopios bsicos de laboratorio con un cuerpo de cmara
convencional de 35 mm unido por medio de un adaptador
simple y los microscopios con complejos sistemas de medi-
cin de luz y una o ms cmaras adjuntas. Mejoras recientes
en la sensibilidad de la luz, resolucin y accesibilidad de las
cmaras electrnicas, sea las cmaras tradicionales de tubo
o las de dispositivo acoplado de carga y las de semicon-
ductor complementario de xido metlico, le han conferido
aceptacin para este propsito. Adems, la rpida disponi-
bilidad de las poderosas computadoras personales y los pro-
gramas especializados satisfacen las necesidades del cada
vez ms ocupado laboratorio clnico o de investigacin en
relacin con la automatizacin del microscopio, procesa-
miento de imgenes digitales y anlisis, as como tambin
del cmputo de los datos.
A pesar de los cada vez ms asequibles sistemas digitales,
muchos laboratorios clnicos todava cuentan con cmaras
de pelcula convencionales. La calidad del fotomicrgrafo
tradicional depende de varios factores. La resolucin regis-
trada obviamente se afecta por la calidad de los componentes
pticos del microscopio, pero tambin depende del tamao
del grano de la pelcula, lo que determina la nitidez de la
imagen fotogrca. Desafortunadamente, la sensibilidad de
la luz o velocidad del lme fotogrco se relaciona inver-
samente con el tamao del grano; al elegir la opcin correcta
del lme adecuado se consideran estos dos parmetros. La
interpretacin exacta del color de la muestra exige atencin
cuidadosa, sobre todo porque la sensibilidad espectral de las
emulsiones fotogrcas diere de la del ojo humano. Por lo
LECTURAS ADICIONALES 67
tanto, la seleccin cuidadosa de ltros que compensan el co-
lor respecto de la temperatura del color de la luz de ilumi-
nacin (que vara cuando el voltaje de la lmpara se ajusta)
es tambin necesaria para registrar una representacin el
del aspecto original de la muestra.
La micrografa digital y la microscopia de video cada
vez encuentran una funcin mayor en la consulta, edu-
cacin e investigacin remotas entre sitios geogrcos
distantes. Basta sealar que la telepatologa implica la
transmisin unidireccional de datos, incluidas imgenes
digitales, entre los sitios, quizs a travs del correo elec-
trnico. Pese a ello, los desarrollos ya mencionados en la
automatizacin del microscopio, junto con las asequibles y
disponibles conexiones de internet de banda ancha, signi-
can que la telepatologa verdaderamente dinmica implica
el control interactivo de un microscopio remoto (incluidos
la posicin de la muestra, enfoque, amplicacin, ilumi-
nacin, etc.) y enlaces en vivo simultneos por videocon-
ferencia, los cuales se han convertido en una emocionante
realidad en la patologa clnica de rutina.
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Introduccin
La prctica de la medicin es central para casi todos los as-
pectos de la investigacin cientca, ya que proporciona los
medios para comparar observaciones de una manera obje-
tiva, reproducible y conable. Desde su inicio, la patologa
diagnstica se basa, en buena medida, en la determinacin
visual de la morfologa tisular por microscopia, el uso de
indicios diagnsticos visuales para clasicar la enferme-
dad y la utilizacin de criterios descriptivos y lingsticos
para sealar la forma de alcanzar este proceso. Al tiempo
que se han observado enormes avances en la identicacin
de signos morfolgicos de relevancia clnica en histologa
y citopatologa, la patologa diagnstica es an un proceso
subjetivo, que a menudo da lugar a una pobre reproducibi-
lidad en la clasicacin del diagnstico entre un patlogo y
otro e incluso entre uno mismo en ocasiones diversas.
La clasicacin de una alteracin maligna inicial, como
la displasia, proporciona un ejemplo. Los estudios demues-
tran valores de (kappa) tan bajos como 0.15 en la clasi-
cacin de la displasia cervical, 0.27 en la displasia bucal y
0.55 en las lesiones preinvasivas del bronquio. La es una
medida de consenso entre diversos observadores y sus lmi-
tes son de 0 (ausencia de consenso) a 1 (consenso unnime).
En la citologa cervical, los ndices de error de 2% se han
cuanticado con valores de tan bajos como 0.46 y la cla-
sicacin de la neoplasia intraepitelial cervical de cortes del
tejido demuestra la falta de consenso hasta en 36% de los
casos. Estos resultados destacan la dicultad de clasicar
con exactitud y consistencia los cambios morfolgicos si se
usa tan slo el ojo humano. Por lo tanto, existen oportuni-
dades de explorar los novedosos recursos diagnsticos que
proporcionan objetividad, consistencia y reproducibilidad.
Se ha reconocido por mucho tiempo que la medicin
de las caractersticas histolgicas y citolgicas puede su-
ministrar datos objetivos para mejorar en grado notable la
capacidad de tomar decisiones diagnsticas. En patologa,
la medicin se conoce de muchas formas, entre ellas mor-
fometra, microscopia cuantitativa, patologa cuantitativa,
anlisis de imagen y morfologa matemtica. La cuanti-
cacin tiene diversas ventajas. Permite describir en trmi-
nos numricos los cambios morfolgicos que observa el
ojo. Esto revela, a partir de datos cuantitativos y objetivos,
la informacin que es reproducible y puede utilizarse de
modo estadstico para ciertas hiptesis sobre los cambios
morfolgicos del tejido. Adems, la medicin permite la
deteccin de caractersticas sutiles, subvisuales, apenas
distinguibles para el ojo. En ambos casos, la medicin pue-
de ser una herramienta invaluable para la interpretacin
objetiva de anormalidades morfolgicas y para la clasica-
cin cuantitativa de la enfermedad humana.
Mtodos
Existen diversos mtodos disponibles que permiten obte-
ner informacin microscpica cuantitativa. Las mediciones
lineales simples se pueden realizar mediante un instrumen-
to graduado (una pieza plana de cristal que incluye una
regla o rejilla microscpica de dimensiones denidas que
puede insertarse en el tubo ocular de cualquier microsco-
pio). La regla se sobrepone a la imagen de la muestra y se
puede utilizar para registrar datos cuantitativos (ver gs.
7-1 y 7-11). Con un ajuste simple, esto puede emplear-
se para medir distancias lineales de profundidad o espe-
sor (ver gs. 7-11 y 7-12). Por otra parte, la estereologa
7
Mtodos cuantitativos en patologa tisular
Peter W Hamilton y Derek C Allen
70 CAP. 7 MTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGA TISULAR
es una aproximacin que usa sondas de punto o lineales
que se sobreponen a la imagen (ver g. 7-1). Esta tcnica
antigua y bien establecida, aunque simple, todava encierra
un valor considerable para obtener las medidas tridimen-
sionales (p. ej., volumen, rea supercial, longitud) a partir
de imgenes de dos dimensiones (es decir, cortes de teji-
do). Dichos mtodos se aplican rara vez en la investigacin
y la prctica de la patologa. Esto es as no porque sean
inecaces, sino ms bien porque la tendencia a la automa-
tizacin y el anlisis de una gran cantidad de muestras ha
convertido a la computadora en el instrumento central para
la medicin en patologa, ms an por la gran disponibili-
dad de computadoras personales; stas, con los programas
apropiados, tienen mayor capacidad de medir parmetros
morfolgicos lineales, estereolgicos y ms complejos a
partir de imgenes microscpicas de muestras tisulares y
celulares.
Computadoras
Las computadoras han tenido un efecto esencial en mu-
chos aspectos de la prctica y la investigacin mdicas.
En patologa, estas mquinas son parte importante de la
infraestructura del laboratorio y en tareas como los sis-
temas de informacin de los pacientes, la generacin de
informes de patologa, la identicacin de la muestra y
la fotomicroscopia digital. Las computadoras tambin se
han convertido en la herramienta principal para la medi-
cin del tejido y la clula en la microscopia de luz. Cuan-
do se suministran las coordenadas del contorno de una
estructura tisular o celular, el programa puede efectuar
con rapidez una gran variedad de mediciones referentes al
contorno, como rea, permetro, dimetro mximo, dime-
tro mnimo, morfologa, etc. Esta informacin se puede
almacenar de manera electrnica en una base de datos y
se analiza de modo estadstico para comparar grupos de
diagnstico, muestras de tejido de pacientes con pro-
nstico diferente y cambios morfolgicos posteriores al
tratamiento. A continuacin se describen en extenso dos
tcnicas computarizadas.
Medicin interactiva automatizada
Esta modalidad confa por completo en el usuario humano
para trazar o marcar los lmites de las estructuras tisulares
o celulares a medir. Consiste en una computadora con un
dispositivo de trazo (el ratn o una pluma digital), y una
tabla para efectuar dibujos ms especializados. Al delinear
el lmite de un objeto especco, el sistema registra las
coordenadas x y y (g. 7-2). stas se pueden utilizar para
medir caractersticas del tamao y la forma o denir el
lmite dentro del cual pueden computarse las mediciones
densitomtricas. Es posible trazar los lmites a partir de las
microfotografas simples, las imgenes reales transmitidas a
la pantalla mediante una cmara de video o las imgenes di-
gitales almacenadas (vase la seccin siguiente). Casi todas
las computadoras de escritorio se pueden jar con facilidad
para que funcionen como aparatos de medicin interacti-
vos. El programa para facilitar la medicin est disponible
en el comercio. Un programa gratuito, que desarrollaron
los National Institutes of Health, est tambin disponible
en el portal de Scion Imaging (www.scioncorp.com). Esta
herramienta es por tanto econmica, fcil de practicar y uti-
lizable en una amplia variedad de aplicaciones.
Imgenes digitales en patologa
La capacidad de registrar imgenes microscpicas digita-
les ha tenido un efecto importante en el almacenamiento
electrnico de una gran cantidad de imgenes y tambin en
la rpida obtencin de la informacin numrica a partir de
Figura 7-1 a) Uso de un marco reticulado para
determinar el porcentaje del rea ocupada por
los ncleos. La rejilla consiste en 30 puntos, 14
de los cuales se hallan dentro de los ncleos, lo
que representa un valor de 47%. Esta tcnica se
adopta en la estereologa para obtener mediciones
bidimensionales y tridimensionales a partir de las
imgenes microscpicas. b) Gravado lineal para
inferir el rea supercial de las microvellosidades
a partir de una biopsia de intestino delgado. (a) (b)
MTODOS 71
estas imgenes para la evaluacin cuantitativa. Las cmaras
fotogrcas digitales se pueden conectar a un microsco-
pio mediante un adaptador estndar. La cmara fotogrca
registra la imagen en una tarjeta de memoria interna, que se
transere despus a una computadora para el procesamien-
to y anlisis. De manera alternativa, las cmaras de video
digitales o anlogas se pueden conectar a un microscopio
y la computadora digitaliza las imgenes de modo direc-
to a travs de una tarjeta digital de imagen. Cualquier op-
cin puede ser satisfactoria, aunque para las aplicaciones
especiales es vital el control sobre los ajustes de la cmara
fotogrca, como la velocidad del obturador, el aumento y
la temperatura del color.
La mayor parte de las cmaras digitales, jas o de video,
muestrean imgenes cuando menos a tres megapixeles.
Algunos equipos de captura de imagen especiales pueden
registrar imgenes solas hasta de seis megapixeles.
Dos factores determinan la calidad de la imagen: la
resolucin espacial y la del color. La primera depende
del nmero de pixeles que representan un rea denida del
campo. Cada pixel (contraccin del ingls picture element)
representa una caja que dene un punto en la imagen.
Cuantos ms pixeles tenga una imagen, mayor es la resolu-
cin espacial (g. 7-3).
Mientras que el nmero de pixeles en una imagen de-
termina su resolucin espacial, tambin es necesario deter-
minar cuntos valores se permiten para la representacin
de la densidad o el color. En la gura 7-4 se observa que
cada pixel se puede representar por un solo valor de gris. A
mayor nmero de valores de grises, mejor resolucin de la
imagen. En tanto que el ojo humano slo puede distinguir
de modo conable cerca de 64 valores de grises, 256 valo-
res de grises suministran habitualmente una representacin
exacta de la imagen original. Cada pixel puede asignarse a
cualesquiera de los 256 valores de grises posibles segn sea
la densidad de ese punto en la imagen original (0 = negro
y 255 = blanco). En consecuencia, una imagen digital es
tan slo una matriz de nmeros que se puede almacenar y
recuperar para proyectarla en un monitor de computadora.
Las imgenes a color se realizan con pixeles de inten-
sidades diferentes de los colores primarios: rojo, verde
y azul. De nueva cuenta, el nmero de posibles valores
disponibles para representar las contribuciones rojas, ver-
des y azules a un color particular determina la resolucin
Figura 7-2 Trazo interactivo de ncleos a partir de la imagen microscpica viva. El panel izquierdo muestra la imagen original. El panel
derecho demuestra cmo el contorno de la supercie de cada ncleo se traza con el ratn y se utiliza para computar el rea nuclear. El
ncleo sobre la parte superior derecha est en proceso de delinearse. Estos valores nucleares se pueden almacenar y utilizar para calcular
con rapidez diversas mediciones estadsticas sobre la muestra, incluidas la media, la desviacin estndar y la variacin del tamao nuclear.
Esta tcnica ha demostrado ser muy til en la caracterizacin de los cambios sutiles del tamao y la forma nucleares en relacin con
malignidad.
Figura 7-3 La misma imagen con dife-
rentes resoluciones espaciales. Puede verse
que cuanto mayor es la resolucin del pixel,
mejor es la denicin de la imagen y sus es-
tructuras. 55 (25 pixeles) 2525 (625 pixeles) 100100 (10 000 pixeles) 500500 (250 000 pixeles)
del color de la imagen nal. Como en las imgenes de gri-
ses, cada color puede representarse por valores en lmites
de 0 a 255, lo que supone un nmero posible de combina-
cin de 16 millones de colores (256 [rojo] 256 [verde]
256 [azul]). Cada imagen de color se puede por tanto
descomponer en tres imgenes de nivel de gris y cada una
representa los componentes rojos, verdes y azules de la
imagen a color (g. 7-5).
Segmentacin automtica de la imagen
Tener una representacin digital de una imagen histolgica
permite efectuar numerosos procedimientos imposibles
con una imagen anloga. Al trazar un histograma de fre-
cuencia en el nivel de los grises se obtiene un resumen de
la densidad de informacin dentro de la imagen. Si se ja
un umbral en este histograma es posible excluir todos los
pixeles que rebasan por arriba o abajo el umbral. ste es el
llamado umbral del nivel de gris y permite de forma espe-
cca identicar los objetos dentro de la imagen que tiene
ciertas caractersticas de densidad, por ejemplo los ncleos
(g. 7-6). La identicacin de objetos de esta manera se de-
nomina segmentacin. La computadora puede precisar de
manera automtica el lmite del contorno de los objetos
que segmenta y derivarse a partir de estas caractersticas
morfomtricas.
Fijar slo un umbral del nivel de gris no siempre posi-
bilita la segmentacin exacta de todos los ncleos. En la
gura 7-6 se puede ver que algunos ncleos juntos se han
identicado como un objeto solo. Si la computadora midie-
ra el rea de estos objetos de modo automtico, los resul-
tados seran inexactos. Sin embargo, puesto que se dispone
de la informacin almacenada en un formato digital, existe
Figura 7-4 La misma imagen con diferen-
tes resoluciones de valores grises. En condicio-
nes normales, 256 valores grises representan el
nmero mximo de las densidades usadas para
representar una imagen.
una variedad de procedimientos que pueden utilizarse para
resolver este problema. Cada contorno nuclear sospechoso
se puede examinar por separado en relacin con sus carac-
tersticas morfomtricas (tamao, forma, etc.). Si stas no
rebasan los lmites denidos, entonces el objeto se puede
aceptar como ncleo. Si, pese a ello, las caractersticas del
objeto exceden el lmite denido, puede procesarse ms
para determinar si puede obtenerse un mejor resultado de
la segmentacin. Por ejemplo, se puede buscar el contor-
no del objeto por transiciones destacadas en la direccin
(llamadas cspides). Si se encuentra que ocurren dos
en los lados opuestos del objeto, puede activarse una fun-
cin divisora y el objeto se divide (g. 7-7). Est disponible
un catlogo extenso de algoritmos que procesa la imagen
y ello permite que, en casi todas las circunstancias, se seg-
menten de manera conable objetos o estructuras dentro de
una imagen histolgica o citolgica.
La capacidad de identicar componentes importantes de
la imagen mediante algoritmos de la computadora y medir
con rapidez caractersticas morfolgicas, y utilizar stas
para clasicar un caso dado, lleva a preguntar si esto se
puede hacer de una manera automatizada. La automatiza-
cin se ha desarrollado con rapidez en otras disciplinas del
laboratorio, como hematologa y bioqumica clnica, pero
ha sido lenta en patologa. La carencia de la automatiza-
cin en patologa diagnstica no est del todo injusticada
hasta la fecha. La patologa de diagnstico requiere la vi-
sualizacin directa de las estructuras tisulares y celulares
complejas con el microscopio de luz estndar, lo cual hace
de la automatizacin un proceso en extremo difcil en com-
paracin con el uso de las pruebas bioqumicas o cuentas
celulares. Sin embargo, con los progresos del anlisis de
imagen computarizada y la visin de una computadora, es
posible en teora automatizar la tarea de la interpretacin
Figura 7-5 Cada imagen de color se realiza
con tres imgenes de valores grises que repre-
sentan los componentes rojos, verdes y azules.
Cada valor gris determina la contribucin de ese
color a un pixel particular.
2 valores grises 4 valores grises 16 valores grises 256 valores grises
A todo color Canal rojo Canal verde Canal azul
morfolgica y la clasicacin del diagnstico. El mayor
esfuerzo en este campo se observa en el desarrollo de los
dispositivos de exploracin cervical automatizados (discu-
tidos ms adelante), pero en la actualidad se experimentan
las tcnicas en la histologa tisular.
Por supuesto, el desarrollo de un sistema por comple-
to automatizado con la visin de una computadora lleva
tiempo; una opcin por la que se inclinan muchos es la de
utilizar una combinacin de algoritmos de segmentacin
de imagen y de trazo interactivo para asegurarse de que
todos los componentes de la imagen se identiquen con
exactitud.
Densitometra y textura
Como se ha visto, cuando las imgenes se registran en for-
mato digital, la informacin cuantitativa se almacena en la
densidad de cada pixel dentro de la imagen. En patologa,
esta informacin se puede utilizar con ecacia para cuanti-
car la densidad ptica (DO) de la reaccin de una tincin
particular. Esto se consigue al medir el valor de gris de una
serie de ltros de DO y trazar una curva de calibracin para
convertir el valor de gris en DO. Mientras que la informa-
cin geomtrica es ms fcil de estandarizar y no necesita
equipo especial para la captura de imagen, las medidas den-
sitomtricas exigen la estandarizacin y el control de los
niveles de luz de una imagen a la siguiente, lo cual requiere
la calibracin cuidadosa del microscopio y todo el aumen-
to automtico, la temperatura del color y los ajustes del
obturador sobre la cmara fotogrca al apagarse. La me-
dicin de la DO es la ms ecaz cuando la reaccin de tin-
cin es estequiomtrica, es decir, cuando la densidad de la
tincin es proporcional al sustrato que se mide. Esto se en-
cuentra cuando se usa la reaccin de Feulgen para marcar el
DNA, en la cual la medicin de la densidad ptica nuclear
MTODOS 73
Figura 7-6 Uso del histograma de umbral para iden-
ticar objetos dentro de la imagen. A. Imagen original
del nivel de gris. B, Histograma del nivel de gris para la
imagen que muestra los lmites de los valores de grises
del pixel de 0 a 255. C. Se dene un umbral que instru-
ye a la computadora para seleccionar todos los pixeles
con valores a la izquierda de la lnea del umbral. D. La
imagen ilustra regiones segmentadas que, debido a su
densidad ms alta (valores grises ms bajos), son sobre
todo ncleos.
Figura 7-7 Algoritmos de divisin para la
segmentacin exacta del ncleo.
Valor de gris
Valor de gris
5 000
10 000
10 000
5 000
integrada por densitometra proporciona una medida cuan-
titativa del contenido de DNA. Como el contenido de DNA
se altera, en particular en la enfermedad maligna, esta me-
dicin se ha explorado de forma extensiva como un indicio
cuantitativo til en el diagnstico y pronstico. La identi-
cacin de distribuciones alteradas en el contenido del DNA
(g. 7-8) tiende a vincularse con la inestabilidad del cro-
mosoma y ello se incrementa en las tumoraciones, casi
siempre con un pronstico pobre. Otros mtodos, como la
citometra de ujo, permiten una medicin ms rpida del
contenido del DNA y las alteraciones de ploidia en mues-
tras clnicas. No obstante, la citometra de DNA que usa
la proyeccin de imagen automatizada tiene en cuenta un
anlisis ms especco de poblaciones denidas de clulas
dentro de una seccin o frotis de tejido.
En el diagnstico convencional, la distribucin de
la cromatina nuclear o el fenotipo de la cromatina es un
indicio visual que suministra informacin vital sobre la ac-
tividad biolgica de una clula. Al emplear la informacin
numrica proporcionada a travs de imgenes digitales es
posible cuanticar la organizacin de la cromatina y deter-
minar la distribucin espacial de los valores de gris dentro
de un ncleo (g. 7-9). Puesto que una matriz de nmeros
que representan la densidad de cada pixel delinea el ncleo
de modo digital, puede inferirse un grupo de caractersti-
cas estadsticas de tal manera que se puede medir la distri-
bucin espacial de valores de gris dentro del ncleo (g.
7-9). Este grupo de caractersticas se conoce como textu-
ra y proporciona una medida objetiva del fenotipo de la
cromatina. Asimismo, al suministrar apoyo cuantitativo
para los cambios visuales evidentes en la organizacin de la
cromatina, se ha demostrado que estas medidas ilustran las
propiedades de la cromatina que no son obvias para el ojo.
Estas caractersticas se han utilizado en la identicacin
de los cambios vinculados con malignidad (CVM), que se
discuten ms adelante.
Por convencin, el anlisis de la textura se ha realizado
sobre los ncleos teidos de forma especca para el DNA
mediante la reaccin de Feulgen. No obstante, en fecha
reciente se ha utilizado la hematoxilina para la medicin
de la textura nuclear y ha demostrado ser muy ecaz. Esta
tincin es fcil de aplicarse y es la ms usada en la pa-
tologa diagnstica de rutina. Pese a ello, no proporciona
una reaccin estequiomtrica y requiere estandarizacin y
control cuidadosos.
Mediciones espaciales nucleares
El aglomerado nuclear, las distancias entre los ncleos y
sus patrones dentro de los tejidos representan indicios
Figura 7-8 Citometra de DNA. Al cuanticar la densidad pti-
ca de los ncleos teidos para DNA puede obtenerse una medida
cuantitativa del contenido (ploidia) del DNA. Al comparar con las
clulas del control, cuyo estado de DNA diploide se conoce (p.
ej., linfocitos), pueden identicarse las desviaciones a partir de
valores normales de ploidia del DNA y medirse. Esto se conoce
a menudo como DNA aneuploide y es en particular evidente en
la neoplasia.
Figura 7-9 El anlisis de la textura de la cro-
matina nuclear implica la revisin de las rela-
ciones espaciales de los valores de grises dentro
de un ncleo teido. Esto se puede utilizar para
generar una huella nuclear de cromatina, que
proporciona indicios sutiles pero muy sensibles
de la patobiologa fundamental de la clula.
Clulas de control/diploides
Tincin de Feulgen
DNA aneuploide
Densidad ptica
E
s
c
a
l
a

d
e

v
a
l
o
r
e
s
nicos de la extensin de la enfermedad fundamental y
en especial de la gravedad de las lesiones preinvasivas. Se
pueden usar diversas tcnicas para medir el espaciamiento
nuclear, la mayor parte basada en la teora grca que deter-
mina las caractersticas espaciales de un grupo de puntos en
el espacio bidimensional. De manera general se denominan
anlisis sintcticos de la estructura o sociologa celular.
Existe un nmero de mtodos disponibles para el anlisis
sintctico de la estructura, incluidos la teselacin de Vo-
ronoi, la triangulacin de Delaunay y el rbol conector
mnimo. La triangulacin de Delaunay es la formacin de
tringulos entre cada grupo posible de puntos: se aceptan
slo los tringulos en los cuales la circunferencia no con-
tiene otros puntos que los del tringulo (g. 7-10). La te-
selacin complementaria de la grca de Delaunay es la
teselacin de Voronoi. A partir de estas grcas puede ex-
traerse una variedad de mediciones, por ejemplo, el nmero
de puntos, la longitud lineal promedio del tringulo, la lon-
gitud total de lneas, la media, la desviacin estndar, la
oblicuidad, la curtosis y la entropa de las longitudes linea-
les, el rea del tringulo, las reas del objeto incluidas, etc.
Por otra parte, el rbol conector mnimo es un grco sin
asas y conecta todos los puntos donde la suma mnima de la
longitud de las lneas vincula los puntos. Como se indic,
diversas mediciones pueden obtenerse de esta grca, que
reejan cambios adyacentes en la estructura aglutinada de
ncleos. Ejemplos de estos tres mtodos se ilustran en la -
gura 7-10. Las aplicaciones de este tipo de tcnica en la mor-
fologa cuantitativa se han demostrado en la clasicacin
de la displasia colorrectal, determinacin de la atroa gs-
trica y denicin de los patrones de distribucin nuclear en
muestras endomtricas citolgicas.
APLICACIONES DE LA MEDICIN EN LA PATOLOGA DIAGNSTICA 75
Figura 7-10 Mediciones espaciales nucleares generadas a partir de una citologa de aspiracin con aguja na. Las posiciones nucleares
se identican y se utilizan como puntos trazados sobre una grca. Las mediciones espaciales generadas de estas grcas proporcionan
datos cuantitativos sobre la cohesin celular.
Aplicaciones de la medicin
en la patologa diagnstica
Para establecer el diagnstico en la prctica diaria, los
patlogos utilizan con regularidad la cuanticacin. Las
mediciones lineales simples del dimetro del tumor de-
terminan la progresin patolgica en la clasicacin in-
ternacional TNM (tumor/ganglios/metstasis) y tambin
suministran la informacin pronstica en varios cnceres
comunes, como el de mama. La precisin de los mrge-
nes quirrgicos del tumor es importante para predecir la
posibilidad de recurrencia local del tumor y seleccionar a
los sujetos para quimioterapia o radioterapia coadyuvantes
posoperatorias en las neoplasias de mama y colorrectal. El
tratamiento ptimo del melanoma maligno y el carcinoma
cutneos es la reseccin quirrgica completa y la excisin
y delineacin completa del margen, y debe determinarse en
la muestra patolgica. Las tcnicas bsicas son apropiadas,
como el uso de la estadicacin microscpica de Vernier,
una retcula o regla ocular. Son en particular tiles las lupas
(amplicadores) de cristal o Perspex que incorporan una
escala lineal. Los clculos porcentuales semicuantitativos
del compromiso tumoral en la biopsia con aguja de centros
prostticos son un buen indicador del volumen total de la
masa y la probabilidad de que el cncer se extienda ms
all de la glndula.
Varias aplicaciones estndar se detallan ms adelante,
pero algunos de los desarrollos potenciales ms recientes
son:
Cuanticacin patolgica de los trastornos neurodege-
nerativos, como la enfermedad de Alzheimer.
Imagen original
Teselacin de Veronoi Triangulacin de Delauney rbol conector mnimo
Figura 7-11 Medida de Breslow para calcular la invasin del me-
lanoma en la piel. Se muestra el ocular graduado (unidades princi-
pales en milmetros) sobrepuesto en la seccin del tejido canceroso.
Distincin de lesiones melanocticas benignas y ma-
lignas mediante una combinacin de inmunoexpresin
cuantitativa con protena S100, rea nuclear y citome-
tra de DNA.
Cuanticacin de las poblaciones celulares y la distri-
bucin del tejido en los padecimientos hematolgicos
en biopsias de mdula sea.
Anlisis de la estructura del tejido en las brosis pulmo-
nar y heptica.
Medida de Breslow para el grosor del melanoma
sta es una de las mediciones de uso ms general en la his-
topatologa diagnstica y cuantica la profundidad de la in-
vasin del melanoma por debajo de la capa celular granular
de la piel (g. 7-11). Breslow deni este mtodo y su va-
lor pronstico. Las mediciones se pueden efectuar con un
ocular graduado y hoy da se ha convertido en una prctica
aceptada para clasicar el melanoma maligno como no
(< 0.76 mm), de grosor intermedio (0.76 a 1.5 mm) o grue-
so (> 1.5 mm), con un porcentaje de supervivencia libre de
enfermedad de 100, 70 y 40, respectivamente.
Biopsia del hueso
El anlisis morfomtrico puede suministrar datos en extre-
mo valiosos para el diagnstico de la enfermedad meta-
blica sea. Las biopsias del hueso se toman de la cresta
iliaca y el anlisis se realiza con cortes sin descalcicar
y microscopia con luz transmitida, polarizada cruzada y
ultravioleta. Se pueden realizar y utilizar las mediciones
del volumen trabecular y osteoide, supercies osteoides y
mineralizadas y el grosor del osteoide para diagnosticar
la osteoporosis y la osteomalacia (g. 7-12). Son posibles
mediante rejillas de punto/lnea y procedimientos estereo-
lgicos. En la actualidad, el uso del anlisis computarizado
de imagen se ha convertido en un medio ms atractivo para
medir esas caractersticas.
Biopsia muscular
La valoracin de las caractersticas de la bra muscular
en cortes longitudinales y transversales es central para el
diagnstico de los trastornos neuromusculares, incluidas
las miopatas congnitas, metablicas y destructivas y la
distroa muscular. La medicin morfomtrica del tamao
y el nmero de bras del msculo se realiza sobre cortes
transversales, teidos de modo diferencial para el tipo de
Figura 7-12 El clculo cuantitativo del hueso, el osteoide y la m-
dula en biopsias de hueso permite identicar el hueso normal (N), la
osteomalacia (Om) y la osteoporosis (Op).
bra mediante la reaccin de la APTasa de miosina (g.
7-13). La atroa y la hipertroa de la bra se determinan
por la medicin del tamao de la bra, que se toma por
convencin como el dimetro de la bra muscular que cru-
za la supercie menor del contorno.
Cncer de mama
El mtodo de Bloom y Richardson para clasicar el cncer
de mama es un intento de introducir criterios semicuan-
titativos simples al diagnstico histopatolgico. Esto re-
quiere la clasicacin subjetiva del pleomorsmo nuclear,
esto es, un clculo del porcentaje del tumor que mues-
tra formacin de tbulos y una cuenta de mitosis por 10
campos de alto poder. El nmero de mitosis parece ser en
particular relevante en el pronstico de sujetos con cncer
de mama (g. 7-14). Se ha demostrado en ensayos clnicos
a gran escala que el clculo de un ndice pronstico mul-
Figura 7-13 Morfometra de la biopsia de msculo
en la valoracin de los trastornos neuromusculares. La
imagen izquierda muestra una biopsia teida con la
reaccin de la ATPasa para distinguir las bras muscu-
lares tipos I y II. No slo puede contarse el nmero de
bras, sino tambin se puede medir la supercie menor
de la bra muscular (derecha) para determinar la hiper-
troa y la atroa de la bra.
tivariado basado en cuentas mitticas, tamao del tumor y
estado linftico del ganglio puede proporcionar una medi-
da valiosa del pronstico en el cncer de mama, sobre todo
en mujeres premenopusicas. El anlisis cuantitativo de la
estructura del conducto y la valoracin del patrn epite-
lial pueden tambin suministrar datos de utilidad para la
discriminacin de la hiperplasia intraductal y el carcinoma
ductal in situ.
Endometrio
La medicin del tamao y la forma nucleares es de gran
valor en la diferenciacin del endometrio normal respecto
de la hiperplasia atpica y el carcinoma endometrial. Estas
ventajas pueden completarse con el anlisis cuantitativo
de las caractersticas estructurales que, en combinacin,
permiten la identicacin de casos de hiperplasia atpica
que progresan hacia una entidad maligna. Un sistema de
clasicacin morfomtrica multivariado ha demostrado
una correlacin slida con la profundidad de la invasin
miometrial y es ms especco que los esquemas de clasi-
cacin subjetiva, como el de Kurman. En los Pases Bajos,
el anlisis de la morfometra endometrial por curetaje o de
muestras de histerectoma se efecta de modo sistemtico
en un intento por reducir el sobretratamiento de estas lesio-
nes. Se ha considerado que esto podra ahorrar alrededor
de 15 millones de dlares por ao en Estados Unidos. La
combinacin del eje nuclear medio ms corto, ploidia del
DNA y profundidad de la invasin miometrial tambin ha
demostrado tener un valor pronstico de importancia, en
especial en cnceres endometriales de etapa I de la FIGO
(International Federation of Gynecology and Obstetrics).
Citologa cervical automatizada
La citologa cervical automatizada representa uno de los
esfuerzos principales en los ltimos 30 aos para introdu-
cir la automatizacin en un proceso diagnstico de gran
exigencia visual. Esta tcnica se ha desarrollado luego de
Figura 7-14 Esta gura ilustra el papel de las cuentas mitticas
en la prediccin de la supervivencia en pacientes con cncer de
mama. Mientras el ndice de actividad mittica (IAM = nmero
de mitosis por 10 campos de alto poder) aumenta, el porcentaje de
los pacientes que sobreviven por periodos ms largos dentro de ese
grupo disminuye.
APLICACIONES DE LA MEDICIN EN LA PATOLOGA DIAGNSTICA 77
Meses despus del diagnstico
IAM = 0
IAM = 4
IAM = 16
IAM = 36
IAM = 81
P
o
r
c
e
n
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Figura 7-15 Identicacin automtica de ncleos celulares
cervicales a partir de un frotis. La caracterizacin cuantitativa
permite la clasicacin del tipo de clula y el reconocimiento de
clulas malignas.
reconocer, primero, la notoria reduccin de la mortalidad
del cncer cervical tras la introduccin de los programas
de deteccin de cncer cervical y, segundo, la demandan-
te carga de trabajo que sta propici. Result claro que
los tcnicos con trabajo excesivo y los citlogos clnicos
podan diagnosticar casos difciles de modo errneo. El
desarrollo de dispositivos de escrutinio computarizados
comenz a nales del decenio de 1950, pero slo en fecha
reciente han salido al mercado sistemas con capacidades
automatizadas en esta rea.
En esencia, estos sistemas se basan en el mismo princi-
pio: las imgenes se proyectan en un microscopio, se someten
a una exploracin mecnica, se ordena en forma secuen-
cial y se graban en formato digital; las clulas se identican
y segmentan, y despus se sujetan al anlisis cuantitativo
(g. 7-15). Se registran mltiples propiedades, como tama-
o, forma, densidad y textura nucleares. Cada ncleo se
Control de calidad
La exploracin de la citologa cervical exige una valoracin
de la calidad para la reexploracin sistemtica de al menos
10% de los portaobjetos o la rpida revisin de todos los
portaobjetos. Esto lo realizan por convencin individuos ex-
perimentados del equipo de citologa y es un proceso que
consume tiempo. Se puede utilizar un sistema de exploracin
cervical automatizado para someter a escrutinio una propor-
cin de portaobjetos, lo cual exime al citlogo de efectuar
esta tarea. Se delinean discrepancias entre la clasicacin
humana y la de la mquina del mismo caso y se formula una
explicacin posible. Puesto que la mquina posee una exac-
titud denida de clasicacin, se asegura el mantenimiento
de la calidad de los procedimientos diagnsticos.
Preescrutinio
Hasta 95% de los frotis cervicales es normal. Los sistemas
automatizados pueden seleccionar una gran proporcin
de frotis normales y dejar las muestras visuales ms com-
plejas para la valoracin del citlogo humano. De nueva
cuenta, esto podra representar una reduccin notable de la
carga de trabajo de un laboratorio y un enriquecimiento del
trabajo de exploracin, dado que el citlogo slo analizara
los casos ms conictivos.
Automatizacin completa
Los dispositivos por completo automatizados, que propor-
cionan un diagnstico denitivo de todos los frotis presenta-
dos, reclamados por tantos aos, ahora son una posibilidad.
Existen aspectos medicolegales que deben superarse, pero la
automatizacin completa podra ser importante en el abaste-
cimiento de servicios de exploracin cervical en los pases
en los que no existe un programa de investigacin.
Es probable que en los prximos aos se desarrolle con
rapidez el uso de sistemas automatizados con proyeccin de
imagen en la citologa diagnstica del cervix y otros sitios.
Dichos sistemas se introdujeron ya en algunos laboratorios
como dispositivos del control de calidad y se promueven
ahora como sistemas de preescrutinio. Con los avances de
la tecnologa informtica, la deteccin de la computadora
y los procedimientos de clasicacin, es probable que los
sistemas por completo automatizados funcionen a niveles
que superen las mejores cualidades humanas.
Fenotipo de la cromatina y cambios vinculados
con la malignidad (CVM)
Las caractersticas cuantitativas del fenotipo de la cromatina
se han demostrado en muchas situaciones para proporcionar
clasica entonces como normal o potencialmente anormal.
Esta informacin se puede procesar de varias maneras.
Algunos sistemas estn diseados para almacenar todas
las imgenes de anormalidades, que ms adelante revisa
el citlogo para conrmar un diagnstico de enfermedad
maligna. Esto requiere experiencia humana en el proceso
de tomar decisiones nales, pero reduce en grado signica-
tivo la carga de trabajo, dado que la mquina selecciona los
campos sospechosos de manera automtica.
Como alternativa, el sistema puede determinar una cla-
sicacin diagnstica sin requerir la intervencin humana.
Esta clasicacin por completo automatizada de frotis cer-
vicales se puede utilizar con varios propsitos.
Figura 7-16 Esta grca muestra el ndice del fenotipo de la
cromatina cuanticado mediante el anlisis de la textura en la
mucosa normal a una distancia (lejana) a partir del adenocarci-
noma colorrectal y en su contigidad. Puede observarse que hay
una tendencia monotnica con el aumento de anormalidades a
medida que es mayor el acercamiento a la tumoracin. Esto des-
taca los cambios vinculados con la malignidad (CVM) en la or-
ganizacin de la cromatina en las clulas normales que circundan
a una lesin maligna. La grca tambin muestra las alteraciones
principales de la organizacin de la cromatina dentro de adeno-
mas y adenocarcinomas.
indicios nicos de procesos celulares subyacentes y pueden
utilizarse como un medio objetivo para clasicar la enferme-
dad y, ms importante an, para predecir resultados clnicos.
El anlisis de la textura de la cromatina parece tener un papel
relevante en el diagnstico, la clasicacin y el pronstico de
las neoplasias vesicales. Adems, la evidencia sugiere que el
anlisis de la medicin del fenotipo de la cromatina antes
del tratamiento se pueda emplear para anticipar la reaccin
a la quimioterapia y radioterapia en el cncer de vejiga. La
textura de la cromatina nuclear tambin se puede usar para
discriminar entre los carcinomas de prstata, los sensibles a
hormona y los resistentes a la misma, y ha demostrado ser
til en el pronstico predictivo del cncer metastsico de la
prstata.
Las alteraciones sutiles de la conguracin nuclear de
la cromatina se han demostrado no slo en las clulas ma-
lignas, sino tambin en las clulas de apariencia normal
de sujetos con un tumor maligno. Estas transformaciones
se han llamado cambios vinculados con la malignidad o
CVM. Tales cambios pueden cuanticarse de modo con-
able mediante el anlisis automatizado de la textura de
los ncleos (g. 7-16) y destacar a menudo las caracters-
ticas nucleares que no son evidentes al ojo humano. Por
ejemplo, se ha demostrado en citologa cervical que en un
anlisis de tan slo 30 clulas que parecan normales por
muestra podra identicarse hasta 70% de muestras con
displasia moderada o grave. Esto subraya su papel en los
dispositivos cervicales automatizados de exploracin y
muchos de los sistemas actuales emplean la textura nuclear
como una caracterstica diagnstica. Los CVM tambin se
han demostrado en el colon, la vejiga, la mama y el pulmn
(g. 7-16). No es del todo preciso si estos cambios en las
clulas al parecer normales indican un cambio premalig-
no primario en la clula o si se trata de cambios secunda-
rios atribuibles a la exposicin de clulas circundantes a
los factores relacionados del tumor. El hecho que los CVM
pueden desaparecer despus de la eliminacin de un tumor
se inclina por esto ltimo, al menos en algunos tejidos. El
trabajo reciente sugiere que los CVM se pueden emplear
como un mtodo potencial para la exploracin del cncer
de pulmn. El anlisis de los CVM en biopsias histolgicas
normales del pulmn permiti la identicacin correcta su-
perior a 80% de los pacientes con cncer. Adems, se ha de-
fendido en la exploracin de los pacientes para el cncer de
pulmn la identicacin de texturas alteradas en clulas
que parecan normales a partir de muestras de esputo.
Automatizacin en histologa
El anlisis automatizado de las preparaciones en la citologa
es una tarea exigente. An ms difcil es la interpretacin y
el anlisis automatizados de las muestras histolgicas debi-
do a la complejidad de las imgenes. Hasta hace poco tiem-
po, el anlisis automatizado de las imgenes histolgicas
se consideraba una tarea insuperable, excepto en las aplica-
ciones ms simples. Sin embargo, con el desarrollo de los
poderosos procesos de computadora y el uso de la metodo-
loga experta del sistema, ahora es posible el desarrollo de
los sistemas con visin para las tareas complejas de pro-
yeccin de imgenes. Esto requiere la denicin del cono-
cimiento referente a los componentes que comprenden la
imagen y sus interrelaciones. stos se denen en un archivo
y se utilizan para conducir las acciones de un sistema exper-
to de la segmentacin de la muestra. Los objetos se acep-
tan o rechazan como componentes histolgicos con base en
criterios cuantitativos explcitos. Los objetos rechazados se
pueden seleccionar para el proceso de imagen adicional y
facilitar su identicacin. Una vez que se identican todos
los objetos, la muestra histolgica se reconstruye y ello per-
mite la medicin de caractersticas histomtricas relevantes.
Esta metodologa ahora se aplica con xito al anlisis de
colon, prstata y mama (g. 7-17).
AUTOMATIZACIN EN HISTOLOGA 79
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Inmunohistoqumica cuantitativa
Uno de los avances principales en patologa diagnstica
durante los ltimos 30 aos es la visualizacin microsc-
pica de protenas mediante mtodos inmunocitoqumicos
(vase cap. 4). A pesar de ello, evaluar la reaccin de tin-
cin es an subjetivo, no slo para evaluar el nmero de
clulas inmunopositivas sino tambin en la determinacin
de la intensidad de la reaccin de marcado. Las tcnicas vi-
suales se basan en un sistema de marcacin numrico para
el porcentaje de clulas positivas y la intensidad con la cual
se suman para proporcionar una inmunomarcacin total en
casos especcos. Incluso este acercamiento bien deni-
do acusa una mala reproducibilidad cuando se compara la
marcacin generada por un experto y la de otro clnico en
la misma muestra de tejido. Por esta razn, muchos fabri-
cantes del instrumento comercializan ahora equipos con
anlisis de imagen, que pueden extraer datos cuantitativos
inmunohistoqumicos a travs del anlisis de la informa-
cin densitomtrica de imgenes digitales de color. Como
la molcula indicadora primaria tiene un color especco,
es importante que el sistema de la proyeccin de imagen
Figura 7-17 Automatizacin en histologa. Con un sistema experto de visin se pueden identicar de manera automtica las glndulas
colorrectales y sus componentes; se segmentan y se efectan mediciones que pueden emplearse para medir de modo objetivo el grado
de displasia colorrectal.
Figura 7-18 Portaobjetos digital. A la izquierda se muestra la exploracin de un corte completo de tejido de la prstata. La muestra
original del tejido era de 27 9 mm. Con exploracin a 40 se obtuvo una imagen digital de 58 877 42 336 pixeles en 24 bites de
color. La imagen nal fue de 456 megabites de tamao. La caja pequea enmedio de la imagen se puede agrandar de manera electrnica
para mostrar el detalle en el cual se registr la imagen (derecha).
sea capaz de identicar este color en preparaciones celu-
lares y distinguirla de cualquier otra contratincin. Existen
tambin problemas relacionados con la estandarizacin y
el control de calidad en la inmunocitoqumica cuantitativa
y se recomienda el uso de controles sobre el portaobjetos
de inmunorreactividad denida. El punto principal en el de-
sarrollo de la inmunohistoqumica cuantitativa ha sido la
evaluacin cuantitativa de los receptores de estrgeno y pro-
gesterona y positividad de HER2/neu en el cncer de mama.
La automatizacin es tambin la fuerza impulsora principal
y ahora se dispone de muchos sistemas comerciales enfoca-
dos en el procesamiento rpido de las microconguraciones
de tejido para la identicacin de biomarcadores inmunoci-
toqumicos potenciales para diagnstico, pronstico y res-
puesta a la terapia.
El portaobjetos digital
Los avances recientes en proyeccin de imagen digital
proporcionan la capacidad de analizar y registrar de forma
digital un portaobjetos microscpico completo (g. 7-18).
Esto se puede realizar a gran amplicacin para conservar
el detalle microscpico de la muestra y el portaobjetos pue-
de verse a cualquier amplicacin digital si se agranda o
reduce la imagen sobre la pantalla. Las dimensiones com-
pletas de la imagen habran hecho de esto una tarea impo-
sible hace apenas algunos aos. En la actualidad, con el
procesamiento rpido se ha desarrollado el programa que
permite el anlisis y la revisin rpidos de estas imgenes
en megapixeles. Esto permite que los casos de patologa se
distribuyan entre los centros de forma digital, ya no ms en
las diapositivas. El anlisis de portaobjetos completos tam-
bin facilita el estudio automatizado de las caractersticas
del tejido y la clula con la observacin de la computadora,
esto ltimo cada vez ms importante en la evaluacin de
las microconguraciones de tejido. El anlisis de imgenes
completas de esta manera todava es exigente, pero con la
utilizacin automatizada de portaobjetos, dado que es posi-
ble sin la intervencin humana, tiene un potencial enorme
para facilitar el anlisis automatizado en la investigacin y
la prctica de la patologa.
Conclusin
Sin duda alguna, la medicin en patologa mejora la inter-
pretacin visual convencional. Sin embargo, la incorpora-
cin de tcnicas a la prctica comn ha sido lenta y lo es
todava. Esto se atribuye a diversos factores y a la carencia
de pruebas clnicas a gran escala para probar la ecacia de
la medicin de problemas diagnsticos. La mayor parte
de los estudios se ha realizado en una cantidad relativamen-
te pequea de casos bajo condiciones semicontroladas. Aun
cuando los estudios a gran escala han ilustrado el valor y
la relacin costo-benecio de la medicin de la muestra
tisular, pocos centros han adoptado estas tcnicas. Esto
se debe muchas veces a las restricciones nancieras y de
tiempo impuestas a los patlogos, lo cual limita el esfuerzo
adicional necesario para generar datos numricos a partir
de las muestras del enfermo. Las escasas instituciones que
ofrecen la medicin en la patologa de rutina (sobre todo
en los Pases Bajos y Estados Unidos) cobran este servicio
adicional. Dicho costo lo absorbe el paciente, el asegura-
dor o el proveedor del cuidado mdico y las mediciones
las efecta sobre todo el personal tcnico. La promocin
del fabricante de equipo y la introduccin de tcnicas ms
automatizadas, en combinacin con la necesidad de cuan-
ticar nuevos marcadores desarrollados por las compaas
farmacuticas, pueden ser cuestiones que denan el futuro
de la medicin en la patologa diagnstica de rutina. Esto
podra modicar en grado notable la forma de practicar la
patologa y complementar la capacidad diagnstica del pa-
tlogo; con ello se proporcionara el soporte objetivo para
tomar decisiones diagnsticas y delinear el pronstico.
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Introduccin
En los tumores, la tasa a la cual las clulas proliferan tie-
ne un efecto signicativo sobre el pronstico. Puesto que
la actividad proliferativa se calcul primero de modo muy
general al medir el cambio del tamao de una masa du-
rante un periodo, el tema completo de la proliferacin y
la forma de medirla han prosperado y ahora se dispone de
centenares de publicaciones sobre el tema. Existe una co-
rriente continua de trabajos que ha introducido nuevos mar-
cadores, combinado marcadores establecidos, modicado
las tcnicas de demostracin y promovido tcnicas nove-
dosas de evaluacin. Tal informacin es una perspectiva
desalentadora para la persona inexperta que desea medir
la proliferacin y obliga a formular la pregunta: cul es la
mejor manera de hacerlo?
Antes de describir algunas de las diversas maneras de
cuanticar la proliferacin es importante tener una com-
prensin bsica del ciclo celular, ya que todos los marca-
dores demuestran un aspecto particular. El ciclo celular
completo o la etapa fraccin de crecimiento tiene cua-
tro fases: Gap 1 (G
1
), sntesis del DNA (S), Gap 2 (G
2
)
y mitosis seguida por citocinesis (M). Durante la fase del
ciclo celular completo, la clula produce de manera se-
cuencial las protenas necesarias para posibilitar la rplica
del DNA y divisin nuclear y celular subsiguientes. Los
puntos de comprobacin existen en todas las fases del ciclo
para determinar el estado de la clula antes de ingresar a
la fase prxima. En condiciones normales, slo las clulas
con DNA normal progresan a la siguiente fase. Las clu-
las defectuosas de cierta manera se detienen hasta que se
repara el DNA o se dirigen hacia la muerte programada de
la clula (apoptosis). Todas las clulas pueden ingresar a
una fase de no proliferacin o aciclicidad, que se conoce
como Gap 0 o (G
0
). Las clulas conservan su viabilidad y
pueden moverse de nueva cuenta dentro del ciclo cuando
sea necesario.
El trmino tasa de proliferacin se utiliza con frecuen-
cia para describir la cantidad de un marcador de prolife-
racin en material clnico. Por lo regular, estas mediciones
se realizan en una pieza de tejido en un momento espec-
co y, por lo tanto, el trmino tasa es inadecuado. Activi-
dad proliferativa es una expresin ms exacta de esta clase
de evaluacin y el concepto tasa debe reservarse para los
mtodos que miden el cambio respecto del tiempo.
Marcadores de proliferacin
El nmero de los llamados marcadores de proliferacin
sigue en aumento. Se describen a continuacin los que es-
tn razonablemente bien establecidos y han proporcionado
informacin pronstica.
Cuenta mittica o ndice de actividad mittica (IAM)
Las mitosis son los nicos marcadores proliferativos
que se pueden identicar y cuanticar en un corte teido
con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (g. 8-1).
Sin embargo, no son siempre fciles de reconocer y pueden
confundirse con los ncleos hipercromticos o los ncleos
en las fases iniciales de la apoptosis. La jacin inadecua-
da, corte deciente de la seccin y el sobreteido pueden
conducir a dicultades en el reconocimiento de las mitosis
y pueden incluso afectar el nmero de las mitosis identi-
cadas.
8
Marcadores de proliferacin en histopatologa
Cheryl E Gillett y Diana M Barnes
84 CAP. 8 MARCADORES DE PROLIFERACIN EN HISTOPATOLOGA
Calcular la actividad proliferativa de una pieza de teji-
do de acuerdo con el nmero de mitosis presentes puede
parecer al principio una tarea sencilla. No obstante, se han
desarrollado varios mtodos de evaluacin a travs de los
aos, y a pesar del valor reconocido de las mitosis como
marcadores de la proliferacin, no ha dejado de ser con-
troversial el mtodo correcto de evaluacin. El primer
mtodo formal de evaluacin usado fue una cuenta mi-
ttica, esto es, una escala de clculo (0, +, ++) usada por
muchos patlogos. Una cifra mittica cuenta el nmero de
mitosis presentes en un nmero de campos de alto poder
(CAP) y presenta los resultados como el nmero medio de
mitosis por CAP. Para hacer ms reproducible el mtodo
se han hecho algunas depuraciones, incluidas la evaluacin
de las clulas en la periferia de la lesin, realizacin de la
cuenta en campos consecutivos y denicin del rea de los
CAP. La cuenta mittica es una parte integral de la cla-
sicacin de la inltracin de los carcinomas mamarios,
mediante los criterios modicados de Bloom y Richardson;
tambin se utiliza en la determinacin del diagnstico y el
pronstico de los sarcomas de tejido blando.
Para superar algunas de las inconsistencias relacionadas
con una cuenta mittica se introdujo el ndice de la activi-
dad mittica. Con este mtodo de evaluacin el nmero de
mitosis se expresa como una proporcin del nmero de c-
lulas en interfase. El nmero total de clulas en interfase y
las guras mitticas se cuentan en CAP consecutivos hasta
que el corte se muestrea lo suciente. Puesto que el IAM
mide la proporcin de mitosis en la lesin, no se relaciona
o lo afecta el rea del CAP. Tambin considera variaciones
de la celularidad de la lesin y el tamao de la clula. Un
ndice de actividad mittica dura alrededor de 10 minutos
ms que una cuenta mittica, pero es una manera ms exac-
ta de comparar la proporcin de mitosis presentes en los
tumores.
Otra forma de identicar guras mitticas consiste en
emplear anticuerpos como el MPM2. Estos mtodos se di-
rigen a reducir las ocasiones de incluir cuerpos apoptticos
en una cuenta mittica y tambin son susceptibles al anli-
sis automatizado.
Regiones organizadoras del nucleolo (RON)
Las RON son los sitios de los genes del rDNA y estn pre-
sentes en grupos o asas sobre un nmero de cromosomas
especcos. Al tener varios sitios de transcripcin, la clula
puede continuar con la demanda de los ribosomas siempre
que sea necesario. Las protenas relacionadas con RON,
como lo indica su nombre, se sitan muy cerca de las
RON y se ha demostrado que funcionan como marcadores
de la proliferacin. Las protenas relacionadas con RON
son argirlas, se demuestran con una tcnica de plata y
Figura 8-1 Figuras mitticas en una muestra teida con hema-
toxilina y eosina (H-E) convencional (400 ).
Figura 8-2 Las regiones organizadoras del nucleolo (AgNOR)
relacionadas con protenas se demuestran mediante una tcnica
de plata (1 000 ).
se les conoce entonces como AgNOR. stas pueden verse
como puntos negros pequeos dentro del ncleo (g. 8-2).
Se considera que el nmero de AgNOR presente reeja la
produccin de ribosomas y por tanto la sntesis protenica
dentro de la clula. La valoracin de las AgNOR resultan-
tes se ha considerado no slo como un marcador de la ac-
tividad proliferativa, sino tambin como un mtodo para
distinguir entre lesiones benignas y malignas, una medida
del tumor ploide y del grado de malignidad.
Las AgNOR son en extremo difciles de contar y al-
gunos autores anteriores tambin se rerieron a su patrn
dentro del nucleolo como racimos y AgNOR satlites.
La evaluacin no era reproducible, lo que explic en buena
medida la variacin noticada de su valor pronstico. Di-
versas publicaciones describen el uso de los analizadores de
MARCADORES DE PROLIFERACIN 85
imagen para cuanticar la presencia de AgNOR y muchas
han demostrado que el rea media ocupada por las AgNOR
dentro del ncleo proporciona informacin pronstica.
Demostracin inmunohistoqumica de la proliferacin
El primer anticuerpo que se reconoci como marcador de la
actividad proliferativa fue el Ki67 monoclonal (mKi67). El
signicado funcional de la protena Ki67 es an impreciso,
a pesar de que se la ha estudiado bien en el plano molecu-
lar. Pese a ello, se ha establecido que la protena se expresa
durante todas las fases del ciclo celular, pero no durante
la etapa de aciclicidad. El mKi67 se ha usado en muchos
estudios y la medida resultante de la actividad proliferativa
se equipara bien con otros marcadores establecidos para la
proliferacin, entre ellos las cuentas mitticas y el ndice
de marcado con timidina (g. 8-3a,b). No obstante, la des-
ventaja con el anticuerpo mKi67 consiste en que el rea
del antgeno que reconoce es muy sensible a la jacin y
la antigenicidad se pierde despus de los procedimientos
estndar de jacin con formaldehdo e infusin en para-
na. En consecuencia, es posible llevar a cabo de forma
prospectiva estudios pronsticos con mKi67 en muestras
de tejido fresco congelado.
El potencial del mKi67 como marcador de la prolife-
racin proporcion el impulso para producir anticuerpos
similares a las protenas que eran funcionales durante el
ciclo celular, pero lo sucientemente resistentes para so-
brevivir a la jacin con formalina y al procesamiento con
parana, lo cual dot al marcador de una aplicacin mucho
ms amplia. Cuando se desarroll un anticuerpo contra el
antgeno nuclear de la clula en proliferacin (PCNA), se
lo consider el equivalente resistente al jador de mKi67
(g. 8-4). Sin embargo, despus del entusiasmo inicial, se
encontr que el PCNA (tambin conocido de forma con-
fusa como ciclina en algunos trabajos) desempeaba un
papel en la rplica del DNA y la reparacin del DNA. Esta
dualidad condujo a la gran variacin en cuanto a su valor
como marcador de proliferacin. Su expresin parece rela-
cionarse con la proliferacin en tejidos que tienen clulas
embrionarias activas, pero la relacin es menos clara en
las lesiones epiteliales. La protena tambin tiene una vida
media larga y por tanto se detecta an ms tiempo des-
pus de su periodo funcional dentro del ciclo celular. Otro
anticuerpo, KiS1, tambin se consider de manera inicial
como sobresaliente contra el antgeno Ki67 y un equivalen-
te resistente al jador de mKi67. Pese a ello, la evaluacin
subsiguiente del anticuerpo ha demostrado que detecta
la topoisomerasa II alfa, una de las enzimas que controla
los rompimientos de trenzado simple y doble en el DNA
durante la replicacin y la transcripcin. A pesar de este
nuevo hallazgo, el KiS1 todava se utiliza como un mar-
cador de la actividad proliferativa cuando se expresa en
Figura 8-3 El antgeno Ki67 se reconoce con el anticuerpo monoclonal Ki67 en tejido congelado a partir de un tumor que prolifera
con rapidez (a) y lentitud (b) (200 ).
Figura 8-4 El antgeno nuclear de la clula en proliferacin se
identic por el anticuerpo de la PC10 en tejido jado en forma-
lina impregnado en parana (400 ).
todas las fases del ciclo celular (g. 8-5a,b). Sin embargo,
el KiS1 es apenas menos especco que el mKi67, dado
que detecta un cierto nivel de protena despus que la clu-
la completa el ciclo y se halla en una fase acclica. Varias
publicaciones, que son necesarias para proporcionar una
informacin proliferativa ms exacta y reproducible, han
noticado el uso de estos anticuerpos con modicaciones
para el mtodo y el procedimiento de evaluacin.
Los anticuerpos establecidos para detectar Ki67, y por
consiguiente las clulas en proliferacin, son el Ki67 poli-
clonal (pKi67) y el MIB1 monoclonal. Ambos reconocen la
parte de la protena estructural Ki67 y pueden continuar la
unin al antgeno despus de la jacin y la impregnacin
en parana (g. 8-6). El MIB1 y la expresin de pKi67 han
demostrado un nexo cercano con el anticuerpo mKi67 y
su informacin de la actividad proliferativa se correlaciona
bien con otros marcadores. Se han aadido al desarrollo
de estos anticuerpos las mejoras recientes de los mto-
dos de recuperacin del antgeno ms all de la digestin
proteoltica. La recuperacin con mediacin de calor del
antgeno es esencial para el uso de ambos anticuerpos en
material embebido en parana y jado en formalina. Inclu-
so el mKi67 se puede utilizar en material impregnado en
parana despus de la recuperacin del antgeno, aunque
los resultados no son tan constantes como en los casos de
pKi67 o MIB1.
ndice de marcado con timidina (IMT)
y bromodesoxiuridina (IMB)
Ambas tcnicas implican la incorporacin de un nucletido
durante la fase S que puede demostrarse a continuacin.
En el caso del IMT, la timidina se grada y se demues-
tra su incorporacin mediante autorradiografa (g. 8-7).
Para la bromodesoxiuridina, la incorporacin se evidencia
tras emplear la inmunocitoqumica con un anticuerpo anti-
bromodesoxiuridina (g. 8-8). Una desventaja es que am-
bos mtodos necesitan material viable para incorporar los
nucletidos dentro del DNA. Adems, la deteccin de la
timidina radiomarcada trae consigo problemas de equili-
brio con la velocidad del desarrollo de las autorradiografas
y con aspectos de seguridad de la tcnica. No obstante, los
resultados son buenos cuando los realizan mdicos expe-
rimentados y proporcionan una evaluacin exacta de la
proporcin de clulas en la fase S. stas son tcnicas espe-
cializadas y no se incorporan con facilidad en laboratorios
de histopatologa con cualquier grado de conabilidad.
En fecha reciente se ha empleado el marcado de bro-
modesoxiuridina en combinacin con la citometra de ujo
para medir la proliferacin in vivo y ha proporcionado una
medida real de la tasa de proliferacin. A los pacientes
se les inyecta bromodesoxiuridina, que se incorpora en las
clulas durante la sntesis del DNA. De la lesin se recoge
Figura 8-5 La topoisomerasa II alfa se detect mediante el anticuepo KiS1 en tejido jado en formalina impregnado en parana a partir
de un tumor que prolifera con rapidez (a) y lentitud (b) (400 ).
Figura 8-6 Antgeno Ki67 reconocido mediante anticuerpo
MIB1 en tejido jado en formalina e impregnado en parana de
un tumor que prolifera con rapidez (400).
una biopsia de varias horas despus de la inyeccin y a
partir de este tejido se pueden medir en clulas individuales
la presencia de la incorporacin de bromodesoxiuridina y
el contenido de DNA. La relacin entre tiempo, inyeccin
y muestreo, incorporacin de bromodesoxiuridina y con-
tenido de DNA determina la tasa a la cual las clulas en la
lesin proliferan para determinarse.
Citometra de ujo
La citometra de ujo es uno de los mtodos ms conables
y reproducibles para medir la actividad proliferativa y se
puede usar en material citolgico, fresco o jado, impreg-
nado en parana. Al cuanticar la cantidad de DNA en los
ncleos individuales separados de una muestra de tejido se
puede crear un histograma que revela los nmeros de clu-
las con cantidades similares de DNA. El anlisis automa-
tizado de estos histogramas permite calcular la proporcin
de clulas en cada fase del ciclo celular. En consecuencia,
la informacin de la actividad proliferativa es la proporcin
de clulas en la fase S, o la fraccin de la fase S, que es de
enorme inters.
La citometra de ujo es uno de los mtodos ms objeti-
vos de evaluacin de la actividad proliferativa, pero como el
tejido tiene que desagregarse antes del anlisis, los resulta-
dos no se pueden relacionar con la morfologa y la muestra
puede incluir elementos normales, benignos e inespeccos
del tejido bajo estudio. Adems, al usar el material incluido
en parana, una proporcin sustancial del tejido es necesa-
ria e incluso entonces el nmero de ncleos incompletos o
mal preservados en la muestra signica que alrededor de
una cuarta parte de los histogramas no se puede interpretar
con exactitud. Se han desarrollado en grado considerable
las capacidades del citmetro de ujo desde los inicios al
medir un solo parmetro, el contenido de DNA. Ahora se
dispone de instalaciones para realizar las mediciones ml-
tiples y su uso se ha especializado an ms. La medicin
del contenido de DNA es ms probable que se realice junto
con la medicin de una o ms protenas inmunouorescen-
tes detectadas, lo cual suministra informacin sobre la re-
lacin entre la fase del ciclo celular y la expresin de la
protena. La tcnica de la citometra de ujo y el anlisis
automatizado de los resultados sugieren un acercamiento
ms cientco para determinar la proliferacin; empero,
un buen nmero de estudios ha demostrado que puede ob-
tenerse informacin similar por conteo cuidadoso de las
mitosis y positividad al Ki67 o MIB1, que se puede obtener
en laboratorios de histopatologa sin equipo especial.
Otros marcadores
No han dejado de aparecer otros marcadores potenciales de
la proliferacin; muchos de ellos son anticuerpos cultivados
contra las protenas que presentan un nivel creciente de ex-
presin durante el ciclo celular. En una manera similar al
Ki67 y PCNA, se ha aceptado que si un antgeno est pre-
sente durante una fase especca o fases del ciclo celular,
entonces su deteccin signica que puede utilizarse para
identicar las clulas que se encuentran en proliferacin.
Entre estos supuestos marcadores guran diversos miembros
de la familia de la ciclina y sus cinasas dependientes de la
ciclina (cdks) y la protena del retinoblastoma (pRb). Otras
protenas relacionadas con la replicacin del DNA tambin
se han identicado como marcadores potenciales, incluidas
protenas de mantenimiento del minicromosoma (Mcm). Es-
tas protenas Mcm (de las cuales hay seis, Mcm 2, 3, 4, 5, 6
MARCADORES DE PROLIFERACIN 87
Figura 8-7 Deteccin autorradiogrca de la timidina incorpo-
rada dentro del ncleo de clulas en proliferacin (200 ).
Figura 8-8 Deteccin inmunohistoqumica de bromodesoxi-
uridina incorporada dentro del ncleo de clulas en proliferacin
(400 ).
y 7) intervienen en el inicio de la replicacin del DNA y la
prevencin de la re-replicacin de un solo ciclo celular.
Infortunadamente, muchos de estos marcadores celula-
res relacionados con el ciclo poseen una expresin alterada
en clulas malignas, debido a los cambios del trayecto re-
gulador de las protenas que controlan el ciclo celular y no
son marcadores convenientes de la actividad proliferativa.
Como consecuencia del gran inters en identicar las pro-
tenas que controlan el ciclo de la clula, se desarrollan con
frecuencia nuevos anticuerpos y se comercializan a gran
escala. Esto sobrepasa el ritmo al cual su potencial como
marcadores de la proliferacin puede evaluarse del todo. Por
consiguiente, debe tenerse cuidado al usar cualquier anti-
cuerpo nuevo para asegurar una validacin adecuada antes
de aceptarse como marcador de proliferacin. No obstan-
te, muchos de los anticuerpos son de inters como blancos
relacionados con tratamientos biolgicos especcos, no
tanto como herramientas para medir la proliferacin.
La hibridacin in situ tambin se utiliza para demos-
trar la actividad proliferativa. La expresin del mRNA de
la histona 3 (H3) se ha reconocido bien como tal marcador
por varios aos y se equipara con otros marcadores que
proporcionan informacin pronstica. Las histonas son el
componente protenico principal de la cromatina y desem-
pean la funcin de empaquetar lamentos de DNA en
una forma compacta, el nucleosoma. Como las histonas se
vinculan de modo tan estrecho con el DNA, tambin se
producen durante la sntesis del DNA. Por lo tanto, la de-
teccin de niveles crecientes del mRNA de la H3 en la fase
S reeja la actividad proliferativa de los tejidos. Se conoce
que los valores del mRNA de H3 disminuyen con rapidez
durante la G
2
y ninguna sntesis ocurre una vez que la c-
lula entra a la fase G
0
, lo que las convierte en uno de los
marcadores ms especcos de la actividad proliferativa.
Empero, este mtodo no se emplea de forma extensa, sobre
todo porque la tcnica de hibridacin in situ requerida para
detectar el mRNA no es asequible para la mayor parte de
los laboratorios; adems, tampoco los resultados son signi-
cativamente mejores que los de otros marcadores que no
requieren un mtodo de deteccin especializado. Las tcni-
cas de hibridacin in situ, y en especial las no isotpicas, se
han introducido de modo gradual en ms laboratorios, as
que tal vez los datos de la proliferacin se obtengan en el
futuro con ms frecuencia mediante el mRNA de la H3.
La gura 8-9 muestra cmo los diferentes marcadores
de la actividad proliferativa se relacionan uno con otro y
con las diferentes fases del ciclo celular.
Uso prctico de marcadores
La eleccin del mtodo de medicin para la actividad pro-
liferativa depende en buena medida del tipo de material
que se evala. Si un estudio retrospectivo se conduce con
material impregnado en parana, no pueden utilizarse los
mtodos como IMT, IMB y mKi67.
Figura 8-9 Relacin de diferentes marcadores de proliferacin con las fases del ciclo celular.
S
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AgNOR
Topoisomerasa II
Ki-67 y KiS5
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a
Muerte
G0
Cclico
Acclico
Los puntos a considerar para la preparacin del tejido
incluyen el tipo de jador usado, puesto que ste inuye en
todos los marcadores, y el efecto que puede causar un retra-
so de la jacin. Las guras mitticas son muy difciles de
distinguir de los cuerpos apoptticos en algunos jadores
con base de alcohol; asimismo, tambin puede ser difcil
identicar la AgNOR. La expresin del antgeno se reduce
e incluso se pierde en algunas soluciones jadoras, a pesar
del uso de la recuperacin del antgeno regulada por calor.
Aun en la citometra de ujo los colorantes nucleares son
incapaces de ligar la cromatina cuando se utiliza un jador
que contiene metal. Algunos estudios muestran que un re-
traso de la jacin reduce el nmero de mitosis en el tejido
y, por consiguiente, se subestima la actividad proliferativa.
Por ltimo, casi nunca se considera que el espesor de la
muestra tenga un efecto importante sobre la demostracin
y evaluacin de los marcadores. No obstante, as como se
altera la calidad de la tincin, las cuentas mitticas y de
AgNOR varan segn sea el espesor de la seccin y en la
inmunohistoqumica la tincin resultante cambia de inten-
sidad, un factor importante si sta se incluye como parte de
la evaluacin. Todos los cortes que se someten a la recupe-
racin del antgeno regulada por calor deben montarse en
portaobjetos cubiertos con adhesivo y calentarse; de otra
forma las muestras se levantan y algunas se desprenden por
completo.
Mtodo de evaluacin
Una vez que se selecciona el marcador ms conveniente de
la proliferacin y se pone en prctica el mtodo, la siguiente
pregunta es: cmo se efecta la cuenta? Esto se conside-
ra a menudo como la etapa nal y ms fcil de la tcnica,
pero requiere un acercamiento metdico para obtener resul-
tados constantes y reproducibles. En esta fase la citometra
de ujo tiene una ventaja sobre otros marcadores, ya que
miles de clulas se pueden determinar con rapidez con un
grado satisfactorio de consistencia entre una muestra y otra.
El resto de los mtodos en los cuales se demuestra un mar-
cador de proliferacin en un corte histolgico tiene varios
criterios similares que deben cumplirse.
Primero, el tiempo tomado para realizar la evaluacin
debe equilibrarse contra el valor de la informacin obte-
nida. Sera intil tomar 20 minutos para llevar a cabo una
cuenta formal sobre una muestra si puede conseguirse tal
informacin del pronstico mediante un mtodo semicuan-
titativo que toma una fraccin de ese tiempo. En segundo
lugar, cualquier mtodo de evaluacin empleado debe ser
conable y consistente.
Casi todos los mtodos de evaluacin usados con los
marcadores descritos aqu son cuentas o clculos conven-
cionales, pero existe en el mercado un nmero creciente de
MTODO DE EVALUACIN 89
sistemas basados en el anlisis de la imagen que usan un
mtodo diferente de evaluacin. Con mtodos manuales,
varios criterios tienen que cumplirse para reducir la subje-
tividad relacionada con la evaluacin, de tal modo que sean
posibles las comparaciones, sea entre las muestras o los
evaluadores. Los siguientes puntos siempre deben conside-
rarse antes de emprender cualquier valoracin y no deben
soslayarse durante el curso del estudio.
Qu reas de la muestra deben evaluarse?
Por tradicin, el borde creciente de un tumor se consi-
dera el rea ms apropiada para la evaluacin. sta tiende
a ser la ms proliferativa y es con frecuencia el rea en la
que se calcula la cuenta mittica para un grado histolgico.
Una alternativa consiste en utilizar el rea peor o ms
mal diferenciada, pero ello proporciona decientes carac-
tersticas para el pronstico. Seleccionar el borde creciente
es virtualmente imposible en algunas formas de prepa-
racin del tejido, como las biopsias con aguja na o las
resecciones transuretrales de la prstata. Por otra parte, el
IMT y los mtodos del IMB requieren que el tejido fres-
co est cortado en piezas muy pequeas para permitir el
acceso de los nucletidos al ncleo. De nueva cuenta, es
casi imposible evaluar el borde creciente.
Si se lleva a cabo una cuenta formal, entonces debe eva-
luarse un nmero suciente de clulas para ser representa-
tivo de la muestra y de ese modo se reduce el efecto de la
seleccin del rea; si se realiza un clculo de la frecuencia
del marcador, entonces se evala la seccin completa. Los
sistemas automatizados tienen el benecio de efectuar una
evaluacin formal en reas seleccionadas a travs de la
muestra completa.
Qu mtodo de valoracin debe usarse?
Ya no es muy apropiado llevar a cabo una valoracin de
proliferacin sin denir los criterios utilizados para alcan-
zar el resultado nal. Es importante decidir si la intensidad
de la tincin es una caracterstica importante. Desde luego,
sta no es una consideracin para evaluar las mitosis o las
AgNOR, pero con marcadores basados en la inmunohisto-
qumica puede representar un aumento de la expresin de
la protena sobre su nivel basal habitual, como en el caso
del PCNA. Si la intensidad de la tincin es relevante, en-
tonces debe combinarse con una cuenta o un clculo de la
proporcin de clulas teidas.
La cuanticacin exacta de cualquier marcador exi-
ge hacer una cuenta formal de las clulas que expresan
el marcador y de aquellas que no lo hacen, de tal mane-
ra que se obtiene un ndice proliferativo. Una mirada
rpida a las publicaciones que notican una cuenta revela
la considerable variacin del nmero total de clulas eva-
luadas. Para ser estadsticamente correctos es necesario
evaluar sucientes nmeros de clulas para reducir el
error de conteo a un nivel aceptable; en condiciones nor-
males, se considera que ste debe ser menor de 5%. Si tan
slo se evalan algunas clulas, el resultado podra so-
brestimar o subestimar en grado notorio la actividad pro-
liferativa verdadera. Al aumentar el nmero de las clulas
incluidas en la evaluacin se reduce este error de manera
gradual. Una cifra universal para el nmero de clulas a
contar no puede aplicarse a todos los marcadores y a los
diversos tipos de tejido. En general, las cuentas necesitan
incrementarse en tejidos heterogneos y cuando es baja
la incidencia de la demostracin del marcador. Por ejem-
plo, el MIB1 detecta clulas en todas las fases del ciclo
celular excepto en la G
0
, mientras que un ndice mittico
detectaslo en una parte limitada del ciclo celular. Por
lo tanto, en cualquier pieza del tejido la proporcin de
clulas que expresan MIB1 es mucho ms alta respecto
de las que experimentan mitosis. Por consiguiente, para
alcanzar el mismo nivel aceptable de error para ambos
marcadores, el nmero total de clulas evaluadas por el
ndice de la actividad mittica necesitara ser ms grande
en comparacin con la cuenta MIB1.
Existe poco trabajo publicado enfocado en comparar
mtodos de conteo, pero en general las cuentas superiores
a 1 000 clulas parecen reducir el error de conteo a mr-
genes aceptables. Algunas veces, la cuenta de tantas c-
lulas puede ser un problema en muestras muy pequeas,
por ejemplo, biopsias de aguja na, o cuando la lesin de
inters forma slo una parte pequea del tejido examina-
do, como el carcinoma ductal mamario in situ u otras neo-
plasias intraepiteliales. En tales casos puede ser necesario
evaluar muestras mltiples del tejido para conseguir un
registro exacto de la actividad proliferativa.
Como ya se mencion, es importante equilibrar el tiem-
po gastado en evaluar un marcador proliferativo con la
cantidad de informacin proporcionada. Aunque la deter-
minacin de ms clulas incrementa la exactitud, muchas
veces no es prctico y desde luego no suscita la disposicin
de un histopatlogo ocupado. Han ganado aceptacin las
valoraciones semicuantitativas debido a su velocidad rela-
tiva de valoracin y porque correlacionan bien con mar-
cadores evaluados de modo ms cuantitativo. Por muchos
aos se han contado y expresado las mitosis por campo de
alto poder, que es en verdad una valoracin semicuantitati-
va. La informacin pronstica para la mama y los tumores
de msculo liso ha mejorado con una tcnica ms rigurosa
para contar las mitosis, aunque conserva el uso de campos
de alto poder. Ahora existen pautas en cuanto a los CAP a
examinar y el rea de la muestra bajo evaluacin. Tambin
se observa considerable variacin del tamao de los CAP
entre diferentes microscopios, por lo que es importante
citar el rea del CAP utilizada para efectuar la cuenta mit-
tica. Con apego a estas pautas generales se ha alcanzado una
reduccin considerable de la variabilidad del observador.
Si se utiliza una valoracin semicuantitativa, es impor-
tante recordar que tan slo se trata de una estimacin y que
los resultados no deben ser tan precisos; en condiciones
normales es suciente el uso de cuartiles. La ventaja con
este tipo de evaluacin radica en que puede hacerse con bas-
tante rapidez para el conjunto de la muestra que se evala,
sin la necesidad de denir el rea del corte examinada. Si
es apropiado, una medida de intensidad de la tincin puede
combinarse con la proporcin de clulas teidas para sumi-
nistrar un registro total.
En el cuadro 8-l se muestra una comparacin directa de
los diversos mtodos de evaluacin y el tiempo que toman
la tcnica y la evaluacin para marcadores establecidos.
Controles
Como en cualquier tcnica, es importante tener controles
durante el procedimiento. No slo se necesitan las mues-
tras de control metodolgico sino tambin deben realizarse
revisiones para asegurar la consistencia de la demostracin
y la evaluacin de los marcadores entre las muestras.
El material de control debe siempre incluirse al demos-
trar un marcador de proliferacin. Las mismas muestras de
control deben utilizarse a travs de un estudio para supervi-
sar la consistencia del interanlisis. Los controles internos,
cuando se conocen los patrones de la tincin de los ele-
mentos especcos del tejido, tambin son muy tiles para
constatar la calidad de la demostracin. Pueden emplearse
tambin para hacer ajustes al registro cuando los cortes
son ms gruesos (y por lo tanto la tincin es ms intensa) o
cuando el mtodo de jacin es subptimo.
La reproducibilidad del procedimiento de evaluacin
tambin debe incluirse como parte del aspecto del con-
trol de calidad de cualquier estudio o caso individual.
Si se introduce un marcador o un mtodo de evaluacin
nuevo, o bien no se ha determinado antes la actividad pro-
liferativa, entonces un evaluador experimentado debe
realizar la valoracin. La comparacin de los datos de
ambos asesores proporciona una gua para la variabilidad
entre un clnico y otro. Cualquier valor discordante se
puede reexaminar con la consulta comn. Las habilida-
des del evaluador tienden a mejorar con la prctica; por
lo tanto, lo que se determina al principio de un estudio
debe repetirse al nal para asegurar que el resultado es
el mismo y que el mtodo de evaluacin ha permanecido
consistente.
Ahora existen diversos sistemas automatizados de anli-
sis de imagen disponibles en el comercio, con los programas
especcos diseados para detectar y cuanticar marcadores
de proliferacin relacionados con Ki67. Por otra parte, s-
tos pueden adaptarse para el uso con cualquier antgeno
nuclear detectado por medios inmunohistoqumicos. La
evaluacin de los marcadores de proliferacin puede ser
ms exacta y conable con la ayuda de sistemas automati-
zados, y la evaluacin de AgNOR se ha beneciado en par-
ticular del anlisis semiautomatizado. Los AgNOR son en
extremo difciles de contar con grado de conabilidad y su
valor de proliferacin se ha objetado. La medicin del rea
media total de sedimentacin de plata por ncleo mediante
el anlisis de imagen muestra una relacin constante con la
actividad proliferativa medida por otros medios y ha mejo-
rado de modo considerable la credibilidad de los AgNOR.
El reconocimiento de clulas individuales en una
seccin histolgica es todava una tarea difcil para un
analizador de imagen y para distinguir una clula dbil-
mente inmunoteida positiva de una clula negativa; aun-
que parezca fcil para el ojo humano, es difcil para un
sistema de anlisis. Si una pieza se toma a travs de una
esfera, por ejemplo cuando se secciona un ncleo, entonces
los bordes internos de la esfera son menos densos que las
reas centrales. Si esto se considera en el contexto de un
ncleo teido por medios inmunohistoqumicos, el ncleo
posee una intensidad de color reducida en la periferia, que
puede ser difcil de distinguir del citoplasma sin teir. In-
fortunadamente, los programas que pueden reconocer las
diversas caractersticas vinculadas con los ncleos que ex-
perimentan mitosis todava no estn disponibles.
Uno de los problemas principales que debe superar
la progresiva adopcin de los mtodos automticos de
evaluacin es la necesidad de romper con la idea de que
el anlisis de imagen debe proporcionar la informacin
en un formato idntico al de una valoracin visual. En
varios estudios, en los cuales los marcadores inmuno-
histoqumicos han demostrado ser tiles en trminos del
pronstico, los sistemas del anlisis de imagen compa-
raron reas de color. Por ejemplo, en cada CAP o rea
especca marcada, el analizador compara el rea total
de marrn, que revela DAB de un anticuerpo relacionado
con la proliferacin, con el rea total de azul, que muestra
los ncleos teidos con hematoxilina. Estos parmetros
se miden dentro de esas reas seleccionadas y la actividad
proliferativa resultante se muestra por el cociente del rea
total del marcador de la proliferacin en relacin con el
rea total de los ncleos. A condicin de que slo los gru-
pos de clulas malignas se seleccionen, algunos sistemas
de anlisis transforman los resultados para presentarlos
en una forma convencional, es decir, como porcentaje de
clulas positivas.
Cuadro 8-1 Comparacin del tiempo consumido para demostrar y evaluar diferentes marcadores
de la actividad de proliferacin
Tiempo para la
Marcador Mtodo de evaluacin Tiempo para la tcnica evaluacin (minutos)
Mtodos de conteo
Mitosis Mitosis/10 CAP 5 minutos 5
Mitosis/2 000 clulas 5 minutos 15
pKi67/mKi67/MIB1/KiS5 Ncleos positivos/1 000 clulas 2 horas 5-10
KiS1 Ncleos positivos/1 000 clulas
PCNA Ncleos positivos fuertes/2 000 clulas 2 horas 15-20
IMT Ncleos marcados/2 000 clulas 10 a 14 das 15-20
IMB Ncleos positivos/2 000 clulas 3 horas 15-20
Histona 3 de mRNA Ncleos positivos/2 000 clulas 24 horas 15-20
AgNOR Nmero medio/100 clulas 15 a 45 minutos 20-35
Mtodos automatizados
Fraccin de fase S Cantidad de tincin nuclear/ 2 a 3 horas >5
(citometra de ujo) clula en > 10 000 clulas
Mtodos de anlisis de imagen Porcentaje de tincin positiva 2 horas 15-20
pKi67, MIB1 en relacin con todos los no positivos en
un rea seleccionada
AgNOR rea media de AgNOR que ocupan 15 a 45 minutos 15-20
ncleos en 150 clulas
MTODO DE EVALUACIN 91
Conclusin
La confusin inicial que padecen los principiantes en la
medicin de la actividad proliferativa puede remediarse
con facilidad si se considera cada aspecto del procedimien-
to a un tiempo. En primer lugar, algunos de los marcadores,
como TLI o mKi67, pueden descontinuarse si los tejidos de
inters estn jados e impregnados en parana. La eleccin
del marcador tambin depende de los recursos disponibles
en el laboratorio. Los proyectos especcos, con un nme-
ro limitado de casos, pueden emprenderse a menudo junto
con un laboratorio con instalaciones especializadas. Esto
permitira aplicar mtodos como el anlisis citomtrico de
ujo o la autorradiografa con timidina marcada. Sin em-
bargo, si la medicin de la proliferacin es una necesidad
continua, entonces el tipo de mtodo usado para detectar
las clulas que proliferan debe satisfacer al propio labo-
ratorio. Por esta razn se observa una inclinacin por los
mtodos morfomtricos ms convencionales, como las
mitosis y AgNOR o los mtodos inmunohistoqumicos,
para utilizarse en laboratorios de histopatologa.
Los mejores mtodos para medir la actividad prolife-
rativa en cortes histolgicos se basan an en el examen
de la proporcin de mitosis o clulas que expresan MIB1.
Ambos estn bien documentados en diversos trastornos,
son fciles de demostrar en trminos tcnicos, y siempre
que las muestras estn bien preparadas, son relativamente
fciles de determinar. Tambin suministran resultados re-
producibles que se comparan bien con otros mtodos ms
laboriosos o dependientes de una mquina, como el IMT
y la citometra de ujo. Persiste la gran discusin acerca
de cmo las mitosis y el MIB1 sirven como marcadores de
la actividad proliferativa. Las mitosis demuestran slo una
parte relativamente pequea del ciclo celular y a partir de
la cuenta mittica o ndice mittico resultante ninguna in-
ferencia puede hacerse alrededor del resto del ciclo celular;
empero, no hay problemas con la falta de especicidad con
este marcador. El MIB1 identica una protena presente a
lo largo del ciclo celular, aunque algunas clulas no expre-
san el antgeno con rapidez en G
1
y este efecto represen-
tara de modo equvoco la actividad proliferativa en esos
tejidos particulares. Al igual que la deteccin de muchas
protenas expresadas durante el ciclo de la clula, el MIB1
puede tambin detectarse si la clula ha dejado apenas el
ciclo celular. Se han realizado algunos intentos por desa-
rrollar nuevos marcadores, en particular anticuerpos, para
superar algunos de los problemas de especicidad. Estos
marcadores novedosos deben proporcionar datos de la pro-
liferacin y el pronstico, ms all de lo que proporcionan
las mitosis o el MIB1 si se aceptaran como alternativas via-
bles. Un desarrollo reciente consiste en que la mayora de
los antgenos relacionados con el ciclo celular, que alguna
vez se evaluaron como marcadores de proliferacin, ahora
se han examinado por su potencial como blancos relacio-
nados con terapias.
Al parecer, el debate de la evaluacin continuar du-
rante algn tiempo ms. Por ejemplo, las mitosis se han
reconocido como marcadores de proliferacin por dcadas
y an se promueven nuevos mtodos mejorados de evalua-
cin. Empero, no debe olvidarse que una vez que se aplica
alguno de los criterios de evaluacin, sin importar cul sea
el mtodo de valoracin elegido, la regla de oro consiste
en ser consistentes entre un caso y otro. Por supuesto, el
anlisis automatizado mejora la exactitud y la consistencia
al cuanticar algunos marcadores de proliferacin, pero
todava no es conveniente para todos los casos. Mientras
tanto, pueden obtenerse resultados sucientemente exactos
mediante una cuenta formal o una evaluacin semicuanti-
tativa, siempre que se practique una tcnica consistente y
se utilicen los controles adecuados.
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1990: Springer-Verlag, New York, 215-256.
SECCIN 2
CITOLOGA
El captulo proporciona una sinopsis de los principios ge-
nerales de la citopatologa diagnstica. ste es, en buena
medida, un tema visual y por lo tanto se incluyen abundan-
tes ejemplos e ilustraciones. No es de ninguna manera un
tratado tcnico o diagnstico. Para la cobertura sistemtica
y detallada se remite al lector interesado a consultar uno de
los trabajos de referencia, algunos de los cuales se enume-
ran en la parte nal de este captulo.
Introduccin
La citologa es el estudio cientco de la estructura y la
funcin celulares. La citopatologa es una rama de la medi-
cina de laboratorio relacionada con el examen de clulas,
en la salud y la enfermedad, para propsitos de explora-
cin, diagnstico e investigacin. La exploracin implica
la revisin de las muestras de individuos asintomticos
para detectar cambios premalignos o malignos tempranos.
El trabajo diagnstico supone la valoracin del material de
los pacientes con signos o sntomas establecidos de enfer-
medad.
Es una premisa bsica que el contenido de una muestra
de la citologa debe representar de forma exacta y reprodu-
cible la poblacin celular del tejido o la lesin. En realidad,
un buen nmero de variables de confusin atenta algunas
veces contra esta suposicin en mayor o menor grado.
Una cuidadosa valoracin citomorfolgica por micros-
copia de luz es fundamental para la prctica de la cito-
patologa de diagnstico y mucha informacin se deriva
de la comparacin directa de las muestras celulares con
las muestras histolgicas correspondientes. Sin embargo,
ciertas limitaciones son inherentes en tales estudios de
extrapolacin, incluso en muestras apropiadas, bien pre-
servadas y teidas.
El cultivo celular utiliza lneas de clulas inmorta-
lizadas para detectar efectos citopticos vricos y otros
txicos. Esto y las novedosas tcnicas especializadas de
microscopia, microaspiracin y microdiseccin permiten
el discernimiento en la siologa dinmica del protoplas-
ma vivo. No obstante, en la actualidad stas se consideran
marginales en la citopatologa diagnstica corriente y se
reservan por lo regular para el trabajo de diagnstico o
investigacin de virus.
Tipos de muestra citolgica
La mayor parte de las muestras clnicas de la citologa pro-
cede de uno de los procesos siguientes.
Exfoliacin
Las clulas muestreadas se toman (exfoliadas) de una su-
percie epitelial. Los ejemplos incluyen las clulas presen-
tes en esputo (expectorado), orina (expulsada o mediante
catter o cistoscopio) y secrecin del pezn (exprimido)
(gs. 9-1 y 9-2). De manera espontnea, las clulas exfo-
liadas dieren en su aspecto de las sustradas por medios
mecnicos, que tienden a desagregarse y disponerse de ma-
nera individual o en racimos pequeos. Tales clulas adop-
tan a menudo una forma esfrica, segn sean los factores,
como la membrana celular, fuerzas citoesquelticas inhe-
9
Citopatologa
Adrian T Wareld
rentes, tensin de supercie, naturaleza del microambiente
local y tiempo transcurrido desde la obtencin. Tales clu-
las son susceptibles a una serie de cambios degenerativos
que alteran al citoplasma y al ncleo, como se delinea ms
adelante.
Abrasin
Las muestras celulares son el resultado del muestreo de c-
lulas a partir de la exfoliacin por fuerza fsica (abrasin).
Ejemplos: cepillado (p. ej., bronquio, cervix), raspado
(p. ej., pezn, piel, cervix) o lavado (p. ej., bronquio); en
tales casos se instila una solucin salina isotnica y el
lquido reaspirado se somete a revisin. En contraste con
las clulas exfoliadas de forma natural, estas clulas tien-
den a conservarse mejor, a menudo en grupos ms grandes
o agregados cohesionados.
Figura 9-1 Muestra de esputo. a) Esputo mucoide teido con sangre obtenido por aspiracin directa (trampa de esputo). Esto ofrece
menos contaminacin por secreciones bucofarngeas que una muestra expectorada. b) Las clulas epiteliales bronquiales y los macrfagos
alveolares pulmonares indican un muestreo ms bajo de las vas respiratorias. Las barras terminales y las microvellosidades superciales se
pueden ver en los pices de las clulas bronquiales en medio de un fondo mucoinamatorio ralo (Pap, 250 ).
Figura 9-2 Clulas transicionales superciales normales en
orina. Estas clulas uroepiteliales exfoliadas muestran multinu-
cleacin variable correspondiente a clulas en paraguas en cor-
tes histolgicos. Obsrvese el fondo sin rellenar (limpio) (Pap,
100 ).
96 CAP. 9 CITOPATOLOGA
Aspiracin
Existen pocos rganos o sitios del cuerpo que representan
un acceso difcil para recoger con aguja cierta clase de
material celular para su examen. Las tcnicas radiolgicas
de proyeccin de imagen pueden ayudar a localizar pe-
queas lesiones profundas y mviles que de otra manera
es difcil delinear. Las clulas se obtienen a travs de una
aguja, con o sin aspiracin, de una cavidad llena de lquido
o un tejido slido. Son ejemplos los tumores, los lquidos
pericrdico, pleural o peritoneal (paracentesis) y cefalorra-
qudeo (puncin lumbar o cisternal) y el humor vtreo (gs.
9-3 y 9-4).
La aspiracin con aguja na utiliza un instrumento de
calibre no (19 a 25) unido con rmeza a una jeringuilla y
se introduce en una lesin. El mbolo de la jeringuilla se
retira de modo parcial, de tal manera que se crea un vaco
y se aspiran las clulas de la lesin. Hay que realizar varios
movimientos en diferentes direcciones a travs de la lesin
mientras dura la aspiracin para aumentar la recolec-
cin celular. Al trmino de esto, el mbolo se libera para
Figura 9-3 Aspirados pleurales malignos. a) Muestra teida con
sangre de un derrame pleural unilateral en un paciente sometido
a mastectoma por carcinoma de mama. La microscopia (b y c)
demuestra las clulas pleomrcas sin cohesin del adenocarci-
noma; muchas tienen una morfologa de sello anular con abun-
dante mucina intracitoplsmica a la que indenta el ncleo peri-
frico (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
igualar la presin anterior a la extraccin de la aguja de
la lesin. Varios accesorios para tomar la pistola, dise-
ados para facilitar la sujecin con una sola mano, estn
disponibles en el comercio (la mano opuesta se libera para
la palpacin; g. 9-5). Algunos clnicos preeren el mues-
treo por aguja sin aspiracin para las lesiones localizadas
en un plano supercial. La aspiracin con aguja na ha ga-
nado gran aceptacin, en gran parte porque es econmica,
rpida y mucho menos traumtica y, por lo tanto, se tole-
ra bien con pocas complicaciones y contraindicaciones.
Las lesiones percutneas casi nunca requieren anestesia
local. Las vas transrectal, transvaginal, transpleural y
transperitoneal mediante un endoscopio tambin pueden
aspirarse.
Las aspiraciones de la mdula sea son el campo del
hematopatlogo de diagnstico.
El fracaso para obtener una aspiracin satisfactoria no
es atribuible en todos los casos a una tcnica deciente.
Las lesiones desmoplsicas, hialinizadas o vasculares, la
necrosis extensa, el cambio cstico o la hemorragia pueden
imposibilitar el muestreo celular adecuado (g. 9-6).
TIPOS DE MUESTRA CITOLGICA 97
Figura 9-4 Lquido asctico. a) Alcuota de lquido asctico turbio
y maloliente, aspirado de un paciente con peritonitis fecal poco
antes de morir. Las microscopias b y c muestran innumerables
bacterias variformes con clulas de pus. El detrito y el pigmento
son de origen estercorceo (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).
Figura 9-5 Accesorio de la pistola para la aspiracin con agu-
ja na. Preparacin de la jeringuilla desechable cargada con la
aguja de calibre 23; este dispositivo permite la manipulacin con
una sola mano, de manera que se libera la otra mano para la pal-
pacin.
Figura 9-6 Diagrama esquemtico de un tumor durante la aspi-
racin con aguja na. La porcin slida viable del tumor se per-
fora con la aguja 1 para proporcionar el material potencialmente
diagnstico; la aguja 2 cruza reas con necrosis, hemorragia o
cambios qusticos; la aguja 3, que recoge muestras de tejido peri-
lesional, es poco probable que se utilice de esta manera.
Inamacin
perilesional
Tumor
viable
Necrosis
y cambios
qusticos
Hemorragia
intralesional
Tcnicas para la preparacin de frotis
El frotis ideal debe extenderse sin relieves, de modo uni-
forme, no y liso, para permitir un secado y una jacin
rpidos y facilitar la penetracin ptima del colorante. Las
tcnicas directas para preparar un frotis implican extender
el material fresco a travs de un portaobjetos, mediante otro
portaobjetos, instrumento punzante o esptula (g. 9-7).
Las tcnicas indirectas para preparar un frotis emplean el
material suspendido en lquido, por ejemplo una solucin
salina o medio de transporte. Puede realizarse un procedi-
miento de concentracin celular como un paso intermedio
para aumentar el rendimiento de una muestra hipocelular.
La formacin de un cogulo puede retener en gran me-
dida el componente celular de una muestra y ello impide la
transferencia adecuada del material a un portaobjetos. Si
un cogulo no se puede dispersar por medios mecnicos,
debe procesarse como bloque celular o someterse a una
histologa convencional y examinarse a fondo (g. 9-8).
Los depsitos celulares de trasudados, lavados con
solucin salina y de orina pueden no adherirse bien a los
portaobjetos de cristal. Los adhesivos, casi siempre del tipo
protenico (p. ej., albmina de suero bovino) o inico (p.
ej., poli-l-lisina), pueden efectuar la adherencia y maximi-
zar el material celular para el examen.
Otras tcnicas empleadas menos comunes incluyen las
impresiones de tacto, el raspado y las preparaciones con-
centradas; esta ltima tiene aceptacin en el diagnstico
neuroquirrgico preoperatorio y se preere a la histologa
convencional en cortes congelados.
Fijacin de la muestra
Fijacin hmeda
La jacin hmeda deshidrata el protoplasma y coagula las
protenas, casi siempre con empleo de un lquido basado en
alcohol, sea por inmersin o cobertura. Tal jacin induce
un grado de contraccin celular en la preparacin nal. El
lquido de Carnoy lisa de forma selectiva a los eritrocitos
y puede ser provechoso en muestras teidas de sangre con
intensidad. Otros jadores, como el glutaraldehdo o la for-
malina, pueden preferirse bajo ciertas circunstancias. El
glicol de polietileno en alcohol proporciona una capa ce-
rosa protectora para el envo postal, que debe eliminarse
antes de una tincin subsiguiente.
Secado al aire
El secado al aire se basa en la evaporacin, que debe ser
rpida, y se facilita con el movimiento del aire forzado
sobre el portaobjetos, ms que de forma pasiva. Este m-
todo tiende a aplanar las clulas con un alargamiento evi-
dente en comparacin con la jacin hmeda (gs. 9-9 y
9-10). Las preparaciones secadas al aire se jan despus
casi de manera invariable en metanol luego de secarse para
prevenir peligros de infeccin cruzada.
Los materiales como el lquido de quiste o de lavados
con aguja na por aspiraciones pueden recogerse en un me-
dio de transporte. Debe recordarse que cualquier muestra
biolgica fresca constituye un peligro biolgico potencial
para el personal del laboratorio y deben acatarse siempre
las medidas recomendadas de salud y de seguridad.
Tcnicas de concentracin celular
Centrifugacin
Este mtodo es aconsejable para muestras voluminosas,
como los derrames serosos, orina o muestras lavadas con
solucin salina.
Citocentrifugacin
La citocentrifugacin utiliza alcuotas pequeas de esputo
lquido sobre el portaobjetos del microscopio para formar
una monocapa localizada de clulas (gs. 9-11 a 9-13). Es
aconsejable para muestras de poco volumen con celulari-
dad moderada; no obstante, parte del material se pierde de
modo inevitable dentro de la tarjeta del ltro. Las muestras
viscosas o celulares son inapropiadas.
Filtracin con membrana
La presin positiva o la ltracin al vaco se emplean con
varios tipos de ltro y un poro de tamao predeterminado,
por ejemplo acetato de celulosa o policarbonato. Es conve-
niente para una amplia gama de muestras de gran volumen
o lquido hipocelular y permite obtener mayor captura de
clulas que los mtodos de centrifugacin.
Preparacin del bloque celular
Las clulas se agrupan en un estado parecido a un tejido
que permite cortar las secciones de forma similar a como se
hace en la histologa convencional. Los mtodos incluyen
coagulacin con trombina plasmtica y plasma y el bloque
celular con agar caliente. Son convenientes para la mayor
parte de las suspensiones celulares y hacen posible una tin-
cin especial, incluida la inmunocitoqumica.
TCNICAS DE CONCENTRACIN CELULAR 99
Figura 9-7 A, Tcnica directa para la preparacin de frotis para
muestras mucoides. a) Una gota de la muestra se aplica sobre un
portaobjetos. b) Un segundo portaobjetos se coloca encima con
ligera presin para extender el lquido de manera uniforme. c) Los
portaobjetos se separan en un solo movimiento y se jan de inme-
diato. d) Un mtodo alternativo consiste en extender la muestra
tan uniformemente como sea posible con un instrumento agudo o
una esptula. B, Mtodo de la pelcula de sangre para muestras no
mucoides. a) Se aplica una gota de la muestra a un portaobjetos.
b) Un portaobjetos esparcidor se desliza hacia la muestra. c) El
frotis se realiza con suavidad. d) Los agregados celulares tienden
a distribuirse hacia la periferia y el extremo del frotis. C, M-
todo de la presin para muestras no mucoides. a) Una gota de la
muestra se aplica a un portaobjetos. b) Un portaobjetos esparcidor
se coloca encima de ste y con presin uniforme al extender el
frotis. c) Los agregados celulares tienden a distribuirse de modo
uniforme en toda la preparacin.
Citologa basada en lquido
La depuracin de las tcnicas anteriores para el procesa-
miento y preparacin de muestras citolgicas ha sido gra-
dual durante un largo periodo. No obstante, las mayores
expectativas en aos recientes condujeron a la revaloracin
de muchos aspectos de la metodologa tradicional, sobre
todo en busca de formas de aplicar los ltimos avances tec-
nolgicos.
La citologa basada en lquido se ha desarrollado al mar-
gen del deseo de aumentar la sensibilidad y la especici-
dad de la citologa, como una modalidad de investigacin
y diagnstico. En la actualidad estn disponibles varios
sistemas basados en manuales especcos del fabricante,
protocolos semiautomatizados o por completo automa-
tizados. Pese a ello, los principios de operacin son muy
similares, con el objetivo de que se produzca una muestra
homognea, ms limpia y plana, que cubra un rea ms
pequea del portaobjetos. Esto facilita un examen ms fcil
y rpido, con una atenuacin concomitante de la frecuencia
de muestras insatisfactorias. La tecnologa se ha adaptado
con xito en ginecologa y otras reas mdicas.
Por lo general, las muestras se recolectan de la manera
usual y se transeren dentro del lquido especicado de trans-
porte o preservacin para formar una suspensin celular. Al-
gunos sistemas emplean cepillos o escobas patentados, que
agitan el lquido, con lo cual se asegura la obtencin de la
muestra completa, mientras que otros utilizan un procedi-
miento de depuracin para recolectar la poblacin celular
designada. En el laboratorio, el material se procesa para eli-
minar el exudado sanguneo, inamatorio y protenico. Una
alcuota de la suspensin se deposita al nal como una capa
na y uniforme sobre un portaobjetos de cristal. La dispersin
uniforme, la buena preservacin de la clula, la clula cons-
tante que se tie, el detalle microscpico mejorado y la dis-
minucin de artefactos se comparan de manera favorable
con los frotis preparados por tcnicas convencionales. Todas
las capas y grupos de la clula tienden a ser ms pequeos y
hay menos imprecisin por los elementos de fondo.
El mtodo ThinPrep (Cytyc Corporation) emplea un
tubo de plstico desechable abierto y forrado con un ltro.
La muestra se recolecta en un medio que contiene metanol
y se centrifuga. Una muestra del centrifugado celular se
transere entonces a un lquido preservador que contiene
metanol. Hay tres etapas principales ms de la preparacin:
primero, dispersin celular, en la cual la mquina inserta el
tubo ltrador en el vial de la suspensin celular y lo agita
para dispersar mucosidad y cualquier agrupacin celular;
segundo, recoleccin celular, en la que un pulso leve de
vaco desplaza el lquido hacia el tubo a travs del ltro,
sobre el cual se deposita una capa de material celular; un
poco de sangre, clulas inamatorias y detritos celulares
pueden pasar a travs del ltro y el ujo del lquido se vigi-
la para optimizar la captacin celular; tercero, transferencia
celular, cuando el tubo del ltro se invierte y se presiona
con suavidad contra un portaobjetos cargado en sentido
Figura 9-8 Tumor mucingeno benigno del ovario. Este cogu-
lo de brina secuestra virtualmente todo el epitelio aspirado
del lquido de este ovario qustico. Las citopreparaciones cor-
respondientes consistieron casi en forma exclusiva de sangre y,
en el aislamiento, se juzgaron poco satisfactorias para propsitos
diagnsticos. Esto ilustra la importancia de examinar cualquier
cogulo presente en lquidos aspirados (H-E, 25 ).
Figura 9-9 Efecto de la jacin hmeda y el secado al aire sobre
las clulas. a) Una clula desmontada en solucin adopta a menudo
una forma esfrica. b) La clula se coloca sobre un portaobjetos y se
aplana de manera parcial. c) Al nal, la jacin hmeda contrae en
cierto grado a la clula. d) El secado al aire causa aplanamiento y ex-
tensin de la clula con el alargamiento evidente en su estado nal.
Una clula esfrica puede presentar un dimetro dos veces mayor
respecto de su tamao original, mientras que una clula escamoide
madura revela poco aumento evidente de tamao.
TCNICAS DE CONCENTRACIN CELULAR 101
Citoplasma
Ncleo
electrosttico. El portaobjetos se sumerge inmediatamen-
te en el jador y queda listo para la tincin subsiguiente,
manual o automatizada. El procedimiento completo es re-
lativamente rpido, menor de 30 minutos, y requiere poco
tiempo tcnico. El rea de la sedimentacin celular mide 1.9
cm de dimetro y contiene alrededor de 100 000 clulas.
El mtodo SurePath Prep (TriPath Imaging Inc.) comien-
za con la recoleccin de la muestra en un medio con etanol.
En el laboratorio se agita el vial para dispersar las clulas
y la suspensin experimenta una fase de enriquecimiento
celular mediante centrifugacin por gradiente de densidad.
Esto tambin elimina la sangre y otros detritos contaminan-
tes. Se elimina el lquido sobrenadante, el sedimento celu-
lar se suspende de nuevo y se centrifuga por segunda vez.
Una alcuota del sedimento celular se transere entonces
por medios robticos a un compartimiento de asentamiento,
donde las clulas se sedimentan por gravedad para crear una
capa delgada en un portaobjetos de microscopio cubierto
con poli-l-lisina. La mquina tie a continuacin los porta-
objetos de modo automtico. Este proceso toma alrededor
de 60 minutos y requiere un grado de intervencin manual.
El depsito circular mide ms o menos 1.3 cm de dimetro
e incluye alrededor de 100 000 clulas.
El mtodo de citoexploracin es un proceso manual que
se basa en la fotometra para evaluar la celularidad de la
suspensin celular antes de la centrifugacin sobre un por-
taobjetos de cristal. El Labonard Easy Prep es otro mto-
do manual en el que una alcuota de lquido de la muestra
se carga en un compartimiento de separacin unido a un
portaobjetos de cristal, que contiene papel absorbente. Las
clulas se colocan en una capa delgada y la preparacin se
tie mediante procedimientos normales de laboratorio.
Figura 9-10 Clulas apocrinas metaplsicas de un quiste de mama. Estas clulas epiteliales benignas estaban presentes en el lquido de
un quiste e ilustran la naturaleza complementaria de las tinciones de Papanicolaou y May-Grnwald-Giemsa. La disparidad evidente en
el tamao de las clulas en la ampliacin idntica es por las jaciones hmeda y seca, respectivamente (a, Pap, 50 ; b, MGG, 50 ).
plo hibridacin in situ o tcnicas de captacin hbridas
para detectar virus del papiloma humano u otros agentes
infecciosos. Las preparaciones son tan favorables respecto
de otros procedimientos de tincin, como la inmunocito-
qumica, como las tcnicas convencionales, con la venta-
ja adicional de que el fondo limpio es menos susceptible
de teirse en falso. En ciertas muestras no ginecolgicas,
en que la prdida de material del fondo y la variacin
de las caractersticas estructurales pueden ser un problema,
los procedimientos basados en medio lquido se pueden
emplear junto con tcnicas tradicionales como un comple-
mento til.
Mtodos de tincin
Muchas tcnicas aplicadas a los cortes tisulares se pueden
tambin realizar sobre las citopreparaciones. En general, la
tincin de Papanicolaou se emplea para el material jado en
hmedo. El patrn diferencial de tincin es til para muestras
ginecolgicas y no ginecolgicas y permite periodos prolon-
gados de microscopia con una tensin mnima del ojo.
Las tinciones de Romanowsky (May-Grnwald-
Giemsa [MGG], Diff Quik, etc.) se realizan casi siempre
en preparaciones secadas al aire y son favorables para am-
bas tcnicas, automticas y manuales rpidas. Este mtodo
se emplea sobre todo en material no ginecolgico.
La tincin con hematoxilina y eosina es mucho ms co-
mn en cortes histolgicos convencionales.
Puede utilizarse una amplia variedad de tinciones his-
toqumicas auxiliares, como se indic antes. Los ejemplos
incluyen al cido perydico de Schiff, con o sin predigestin
con diastasa de las mucosustancias neutrales y glucgeno,
tinciones tricrmicas, tinciones de Ziehl-Neelsen, Gram y
metenamina de plata de Grocott, entre otras ms.
Figura 9-11 Una moderna mquina citocentrifugadora.
Figura 9-12 Componentes de la cmara citocentrfuga. Cmara
de aspiracin, tarjeta del ltro, portaobjetos de vidrio y gancho del
resorte antes del ensamblaje.
Figura 9-13 Diagrama esquemtico del montaje de la citocen-
trfuga. La fuerza centrfuga conduce la suspensin celular a travs
de la tarjeta del ltro y sobre el portaobjetos de cristal. Esto es incon-
veniente para las muestras mucoides.
MTODOS DE TINCIN 103
Suspensin
celular
Cmara para
la muestra
Tarjeta de ltro Portaobjetos
de vidrio
Direccin de
la fuerza
centrfuga
Burbuja de aire
La citologa basada en medio lquido no utiliza la mues-
tra completa y en consecuencia ofrece la oportunidad de
efectuar procedimientos con pruebas auxiliares, por ejem-
El repertorio de tcnicas inmunocitolgicas es compa-
rable al de las utilizadas en muestras tisulares. La inmu-
nocitoqumica puede ser inestimable para comprobar la
presencia de microorganismos o demostrar la diferencia-
cin celular del tumor (g. 9-14).
Citodiagnstico
El procedimiento citodiagnstico es un proceso complejo. La
consecucin de una conclusin depende de muchos factores,
entre ellos el conocimiento del sitio especco detallado jun-
to con la experiencia de la normalidad, la familiaridad con
los aspectos mltiples de muchos procesos patolgicos, el
conocimiento de simuladores y artefacto y la conciencia de
las limitaciones de la tcnica, adems de los detalles espec-
cos del paciente y el contexto clnico (vase el cuadro 9-1).
El material abundante y bien preservado siempre produce la
mejor oportunidad de alcanzar un diagnstico denitivo. Sin
esta informacin de fondo, la citopreparacin est en peligro
de convertirse en un artefacto de dos dimensiones, teido
y brillante, que puede ser tan engaoso como til. Algunas
veces puede ser mejor establecer un diagnstico morfolgi-
co inicial a ciegas a partir de los primeros principios para
evitar un sesgo preconcebido. Esto puede modicarse, si se
consideran tales variables como apropiadas, antes de deter-
minar un diagnstico y formular cualquier consejo sobre el
prximo control del paciente.
En condiciones normales, una citopreparacin es una
mezcla compleja de componentes en proporciones que
varan, segn sean el tejido o la lesin muestreadas. Las
clulas normales y anormales pueden estar presentes y hay
que determinar de manera sistemtica el contenido, la dis-
posicin y la distribucin celular dentro de una muestra.
Figura 9-14 Linfoma no Hodgkin de grado bajo. a) Este aspirado
de humor vtreo del ojo contiene innumerables linfocitos, mode-
radamente pleomrcos e inmaduros, con cantidades variables
de citoplasma (MGG, gran potencia). b) La inmunocitoqumica
conrma reactividad extendida de CD45 (antgeno comn del
leucocito) (inmunoperoxidasa, gran potencia).
No todas las caractersticas son relevantes para cualquier
muestra particular.
Citomorfologa
Gran parte de la carga del trabajo diagnstico en la mayora
de los laboratorios se preocupa en diferenciar entre lesiones
no neoplsicas, preneoplsicas y neoplsicas. Las clulas
normales se caracterizan por su uniformidad morfolgica.
La morfologa nuclear reeja el estado de proliferacin de
una clula y su capacidad reproductiva. El citoplasma de una
clula casi siempre ofrece una indicacin de su origen, es-
tado funcional y grado de diferenciacin.
La actividad creciente de la clula puede ser siolgica,
como en la hiperplasia, debido a la modulacin hormonal,
o reconstructiva y regeneradora en respuesta al dao. Un
estado de proliferacin anormal y descontrolado implica
un proceso neoplsico.
La disminucin de la actividad de la clula puede tam-
bin ser siolgica debido a la atroa, los cambios involuti-
vos secundarios a la inuencia hormonal, el envejecimiento
o la degeneracin, como en la apoptosis.
No hay un solo criterio citomorfolgico o grupo limita-
do de criterios que por s mismos permitan una distincin
conable entre las condiciones biolgicamente benignas y
malignas bajo todas las circunstancias. Las diferencias cito-
nucleares entre las clulas regeneradoras o hiperplsicas y
las clulas neoplsicas de grado inferior pueden ser sutiles
y en ocasiones indistinguibles. Los cambios posteriores a
la radioterapia o quimioterapia, los vricos y otros pueden
inducir aspectos que imitan en sumo grado los observados
en la neoplasia (g. 9-15).
Figura 9-15 Atipia de radiacin en un frotis de la bveda vaginal.
Clulas escamosas gigantes anormales (macrocitos) despus de
la radioterapia. Cambios extraos similares pueden aparecer tras
la quimioterapia y acompaan a la deciencia de vitamina B
12
o
folato y pueden ocurrir en los condilomas vricos. Obsrvense la
multinucleacin y el aumento en ambas reas, nuclear y citopls-
mica. Las clulas inamatorias del fondo y las escamas super-
ciales son caractersticas tiles de referencia (Pap, 100 ).
Cuadro 9-1 Variables que pueden modicar la interpretacin
nal de una citopreparacin
Detalles especcos Edad y sexo
del paciente Estado hormonal, como embarazo
Impresin clnica
Tratamientos previos, como
radioterapia, operacin
Material previo, como histologa,
citologa
Otras pruebas de laboratorio
Detalles especcos Conocimiento de la anatoma local
del sitio Caractersticas radiolgicas
Conocimiento de los errores y
simulaciones
Limitaciones tcnicas
Poblacin celular Grado de celularidad
Clulas presentes, como poblacin
bifsica o nica
Poblaciones ajenas o naturales
Morfologa normal o anormal
Citomorfologa Antecedentes
Distribucin y cohesin celulares
Morfologa de la clula individual
Informacin auxiliar Microscopia electrnica
Tinciones histoqumicas
Inmunocitoqumica
Anlisis de imagen
Citometra de ujo
Citogentica
Celularidad de la muestra
El nmero y el tipo de clulas proporcionan informacin
importante sobre el tejido designado. Ambos estn sujetos
a factores lesionales y no lesionales, en especial el mtodo
de muestreo empleado. Por lo general, la hipercelularidad
incrementa el ndice de sospecha para un proceso proli-
ferativo, hiperplsico o neoplsico. No obstante, de modo
inverso, la hipocelularidad no es en todos los casos una ca-
racterstica inocua, debido que la ausencia de clulas anor-
males no excluye de ninguna manera una afeccin grave.
Las neoplasias de grado inferior pueden exfoliarse ape-
nas y producir clulas que muestran una desviacin mnima
de la normalidad. Una escasez de material adecuado puede
ser un factor limtrofe crucial en el grado de conanza de
la interpretacin de una muestra.
CITOMORFOLOGA 105
Modelos de citoestructura
Con frecuencia no se reconocen en las citopreparaciones
muchos de los indicios estructurales presentes en cortes his-
tolgicos convencionales. Las acumulaciones ms grandes
de clulas (microbiopsias), si bien presentes, a menudo
reproducen el modelo histolgico del tejido designado (g.
9-16). El epitelio normal de muchos sitios se caracteriza
Figura 9-16 Glndula partida normal. Este aspirado con aguja
na contiene una microbiopsia que comprende tejido conjun-
tivo adiposo sumamente mezclado con el tejido secretor acinoso
normal de un sujeto de mediana edad (Pap, 80 ).
hesin, pero pueden exhibir un contorno inusual, como una
conguracin papiliforme, de rosetn o morular. La forma-
cin del sincitio con lmites celulares mal denidos y alguna
orientacin errtica son sospechosas de neoplasia. Las clu-
las epiteliales malignas (carcinoma) se presentan habitual-
mente como clulas mal polarizadas, superpuestas, a veces
en grupos tridimensionales (esferas de proliferacin), con
una tendencia a perder cohesin y desagregarse. Las clulas
linfoides normales poseen una cohesin intercelular escasa,
al igual que sus contrapartes neoplsicas (linfoma), y el mo-
delo celular dispersado del carcinoma mal diferenciado y el
linfoma de grado alto pueden ser indistinguibles sin recurrir
a las tcnicas auxiliares. Las clulas estrmicas normales,
reactivas o neoplsicas (mesenquimatosas), pueden ser evi-
dentes y los adipocitos, tubos capilares u otros fragmentos
del tejido conjuntivo emanan a menudo de un sitio perile-
sional. Los elementos estrmicos benignos se maniestan
las ms de las veces como clulas ovoides o fusiformes, de
pobre cohesin o con ncleos desnudos (clulas centinelas
o bipolares), de acuerdo con las circunstancias particulares.
Las clulas estrmicas malignas (sarcoma) demuestran un
modelo similar pero con las caractersticas nucleares y cito-
plsmicas anormales sobrepuestas.
Caractersticas nucleares
Las anormalidades de la morfologa nuclear se conocen
como discariosis y pueden calicarse como menores o mo-
deradas a graves o bien como de grados alto y bajo segn sea
el grado de desviacin respecto de la normalidad. En la c-
lula diferenciada como terminal normal (madura) el ncleo
es relativamente pequeo, en comparacin con el volumen
por conservar la polaridad y la cohesin intercelular. El
epitelio glandular produce con regularidad hojas dispuestas
en monocapa; stas, cuando se observan de frente, ofrecen
un aspecto de panal, y de perl un modelo en paliza-
da o vallado (g. 9-17a,b). El epitelio hiperplsico y el
neoplsico benigno casi siempre conservan tambin la co-
Figura 9-17 Epitelio glandular gstrico normal. a) Las clulas epiteliales glandulares columnares altas semejan una palizada regular o
un vallado cuando se ve de perl. Ntese la polaridad preservada y los ncleos redondos, espaciados con uniformidad, con uno o dos
nucleolos pequeos (Pap, 80 ). b) La monocapa del epitelio glandular cohesionado, bien orientada e isomrca, muestra un modelo de
panal cuando se observa de frente. Una vez ms, estn bien delineados los ncleos espaciados de forma regular con nucleolos peque-
os ocasionales y el contorno nuclear redondeado (Pap, 40 ).
total de la clula, casi siempre de forma redonda u ovoi-
de con un contorno nuclear liso, distribuido de modo unifor-
me, con cromatina na y granular y poca variacin entre las
clulas de tipo similar (isomrcas o monomrcas).
En una citopreparacin bidimensional el tamao nuclear
es proporcional al rea nuclear relativa y puede expresarse
como el ndice citonuclear, cociente nuclear:citoplsmico
o cuanticarse como un porcentaje. Las clulas con pobre
diferenciacin poseen ncleos agrandados (cariomegalia o
nucleomegalia) y dado que poseen el mismo volumen cito-
plsmico absoluto tienen por tanto un cociente nuclear:ci-
toplsmico elevado.
La mayora de las clulas normales muestra una cromati-
na nuclear razonablemente homognea con una distribucin
na y granular y una anidad discreta por los tintes nuclea-
res. El aumento del contenido del DNA nuclear propicia
una mayor densidad de tincin nuclear (hipercromasia). La
cromatina distribuida de forma irregular con una textura
gruesa y rugosa y un envolvimiento nuclear engrosado se
denomina carioteca. La variacin de tamao y forma de los
ncleos entre las clulas se llama anisocariosis o anisonu-
cleosis y con el incremento de la anormalidad la membrana
nuclear puede ser irregular en el contorno, con estriacin,
indentacin o crenacin. La constelacin de variaciones
anormales de tamao, forma e intensidad de la tincin nu-
clear se conoce como pleomorsmo nuclear (g. 9-18).
(cariorrexis) o puede experimentar disolucin (carilisis o
cromatlisis). La citlisis puede producir remanentes nu-
cleares expuestos o descubiertos, a menudo hipocrom-
ticos, y la fragilidad de la membrana nuclear inherente a
algunas clulas ocasiona uidez nuclear o artefacto en el
frotis. Esto afecta a menudo a las clulas linfoides o puede
ser una caracterstica del carcinoma anaplsico de clula
Figura 9-18 Carcinoma celular escamoso con pobre diferen-
ciacin. Estas clulas malignas de vellosidades bronquiales son
muy pleomrcas, con pobre polarizacin, y muestran una mem-
brana nuclear con macronucleolacin. La queratinizacin fue ms
evidente en las biopsias bronquiales acompaantes (Pap, 100 ).
Los ncleos normales pueden contener nucleolos peque-
os, discretos y compuestos por RNA y protenas relacio-
nadas. Se observan multinucleacin y macronucleolos en
estados de proliferacin, neoplsica y no neoplsica. La
cromatina degenerativa puede aparecer como una masa
densa, contrada (cariopicnosis), con fragmentos densos
Figura 9-19 Carcinoma anaplsico celular pequeo en esputo.
Las clulas apenas cohesionadas del carcinoma, en gran parte de-
generadas hasta clulas de avena, yacen dentro de una franja
mucosa. En algunas, la cromatina namente dispersa (sal y pi-
mienta) es apenas perceptible, al igual que el moldeado nuclear
focal. En su mayor parte, poseen citoplasma mnimo con ncleos
hipercromticos y cariopicnticos. Las escamas superciales, eri-
trocitos y linfocitos representan una indicacin del tamao rela-
tivo (Pap, 100 ).
pequea (g. 9-19). Lo anterior se puede delimitar de modo
estrecho por dao vorticoso cuando las clulas se expulsan
a travs de una aguja de calibre no sobre un portaobjetos.
La mayora de las clulas posee un solo ncleo aunque
algunas, que experimentan actividad de regeneracin o re-
paracin, por ejemplo hepatocitos y condrocitos, pueden
ser binucleadas. Los osteoclastos y sincitiotrofoblastos son
casi siempre polinucleados. La multinucleacin puede ser
una caracterstica de anomalas inamatorias y neoplsicas
(gs. 9-20 y 9-21).
Es inusual encontrar mitosis en citopreparaciones. Un
incremento del nmero de mitosis implica proliferacin
celular y es difcil identicar formas anormales del huso
(tripolar, tetrapolar, etc.) en condiciones benignas.
Caractersticas citoplsmicas
La variacin del tamao y forma de clulas similares se
denomina anisocitosis. El volumen citoplsmico de una
clula anormal puede ser ms grande o pequeo que su
contraparte normal, de tal modo que puede inuir en el n-
CITOMORFOLOGA 107
Figura 9-20 a) Clula gigante de Langhans en la tuberculosis. Esta clula gigante multinucleada en un aspirado con aguja na es
de origen histioctico. La orientacin perifrica en herradura de los ncleos es caracterstica. Otros tipos de clulas gigantes pueden
observarse en diversos trastornos inamatorios y neoplsicos (MGG, 250 ). b) Granuloma celular epitelioide en la tuberculosis. Este
grupo notoriamente arracimado de histiocitos epitelioides mal denidos del mismo aspirado con aguja na es evidencia de una reaccin
granulomatosa. La necrosis brilogranular fue obvia en otra parte y se aislaron bacilos resistentes al cido y el alcohol a partir de una
muestra similar (MGG, 100 ).
Figura 9-21 Linfoma de Hodgkin. La clula central de Reed-
Sternberg muestra la binucleacin en imagen de espejo con
macronucleolos de ojo de bho evidentes. El fondo variforme
de clulas plasmticas polimorfas eosinlas y neutrlas, linfo-
citos e histiocitos es tpico de esta tumoracin (MGG, 100 ).
dice nuclear:citoplsmico, con independencia de cualquier
cambio nuclear acompaante. La composicin ultraestruc-
tural del citoplasma, esto es, la concentracin del aparato
de Golgi, ribosomas, retculo endoplsmico, mitocondrias
y cualquier producto del metabolismo, ejerce una impor-
tante inuencia en la anidad de varias reacciones de tin-
cin. Los productos almacenados, como mucina, lpidos,
carbohidratos, hormonas o cristaloides, se pueden destacar
por tinciones especiales y apropiadas. Los glbulos de mu-
cina, microvacuolacin espumosa, bordes en cepillo de mi-
crovellosidades y cilios pueden ser perceptibles en clulas
normales o bien diferenciadas. La queratinizacin indica
diferenciacin escamosa y las clulas extraas alargadas
o caudadas (no isodiamtricas) pueden ser ms evidentes
que las de formas redondas o poligonales (isodiamtricas)
ms frecuentes (g. 9-22).
Las clulas adyacentes pueden mostrar moldeado cito-
plsmico o, en casos extremos, engullimiento (abrazamien-
Figura 9-22 Carcinoma celular escamoso. Esta clula escamosa
alargada y anmala (caudada, clula renacuajo o cometa) po-
see un ncleo hipercromtico agrandado y yace en medio de la
ditesis tumoral y remanentes celulares escamosos disqueratsi-
cos degenerados. Algunas veces pueden verse formas similares
a una correa (clula de bra o serpiente) y naranjlas bri-
llantes (clula de zanahoria) (Pap, 100 ).
to o canibalismo celular evidente (g. 9-23a,b). Esto se
reconoce en condiciones benignas y malignas, pero es ms
comn en estas ltimas.
Los cambios citoplsmicos degenerativos incluyen la
hinchazn o cambio hidrpico, vacuolacin y prdida de
la integridad de la membrana plasmtica con derramamien-
to del contenido celular (citlisis).
Entorno y artefactos del fondo
El contenido del fondo de una citopreparacin puede incluir
material de procedencia celular y no celular. Esto puede ser
til para precisar un diagnstico o un contratiempo. El ma-
terial teido de modo intenso con sangre o una respuesta
inamatoria vigorosa, por ejemplo, a menudo ocultan de-
talles citonucleares de cualquier poblacin celular epitelial,
lo cual limita la cantidad de informacin disponible.
Adems de los componentes estrmicos del tejido
conectivo, sealados con anterioridad, pueden ser per-
ceptibles el material de la membrana basal, la sustancia
granulada, mucosidad, cristales, exudado brinopurulento,
coloides, lquido rico en protenas o incluso microbiopsias
del tejido condroide (g. 9-24). La mineralizacin puede
manifestarse como depsitos amorfos del calcio o algunas
veces como cuerpos de psamoma (g. 9-25).
El tumor invasivo puede vincularse con detritos sangu-
neos, necroinamatorios y de degeneracin (ditesis tumo-
ral) (g. 9-26).
Figura 9-24 Sustancia granulada de un adenoma pleomrco
salival benigno. La sustancia granulada mucomixoide brilar
(plumosa) propensa a la tincin de Giemsa casi oculta a las
clulas epiteliales; la sustancia fue mucho menos notoria con la
tincin de Papanicolaou (MGG, 125 ).
Figura 9-23 Clulas mesoteliales reactivas dispuestas de forma individual o en grupos pequeos. Los bordes en cepillo de las microve-
llosidades son apenas observables alrededor de algunas clulas. Los espacios intercelulares vacos (ventanas) son una caracterstica
habitual. Pueden verse el moldeado nuclear y el engullimiento (abrazamiento o canibalismo) celular evidente (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).
CITOMORFOLOGA 109
Figura 9-25 Cuerpo de psamoma. a) Psamocalcicacin central que revela un aspecto tpico de laminacin concntrica, apenas
retrctil, entre un fondo de linfocitos y clulas sanguneas rojas (Pap, 250 ). b) Carcinoma epitelial-mioepitelial de la glndula partida.
Las clulas epiteliales mal cohesionadas, un poco pleomrcas, rodean a los glbulos densamente teidos del material de la membrana
basal, lo cual reeja los aspectos histolgicos. Modelos similares pueden reconocerse en diversos tumores de origen glandular salival y
no salival de la glndula, benignos y malignos (MGG, 250 ).
Figura 9-26 Carcinoma celular transitorio de la vejiga. Se iden-
tica un racimo apenas cohesionado, con pobre polarizacin, de
clulas pleomrcas uroepiteliales. Existe hipercromasia nuclear,
un contorno nuclear irregular y macronucleolacin. La biopsia
conrm un carcinoma celular transitorio de grado alto. Obsr-
vese el fondo citoltico e inamatorio (sucio) (Pap, potencia
media).
Algunas veces est indicada una bsqueda de micro-
organismos o parsitos. Los comensales incluyen Lacto-
bacillus en frotis cervicovaginal y Candida en muestras
bucofarngeas. Los patgenos incluyen virus, bacterias,
hongos y protozoarios, entre otros. Algunos pueden ser vi-
sibles con el microscopio de luz, mientras que la mayora
de las infecciones vricas est implcita por sus efectos cito-
pticos. La coilocitosis en el virus del papiloma humano, la
multinucleacin con nucleoplasma de cristal granulado
en Herpes simplex y las inclusiones nucleares de ojo de
bho en infecciones por Cytomegalovirus son ejemplos
caractersticos (gs. 9-27 y 9-28).
Un artefacto es un producto articial o un cambio morfo-
lgico en una citopreparacin originado en la degradacin
fsica de una muestra o durante el muestreo, el transporte o
la preparacin del frotis. Los contaminantes son cuerpos
ajenos que se introducen durante estos procesos. Su im-
portancia se debe sobre todo al hecho de que pueden ate-
nuar la exactitud de la interpretacin del aspecto microsc-
pico. Los artefactos pueden clasicarse como intrnsecos,
Figura 9-28 Clulas epiteliales en un frotis cervical que mues-
tra el efecto citoptico vrico de Herpes simplex. Se ha comparado
el aspecto general, con agrandamiento nuclear, aglomerado, super-
posiciones, amoldamiento, plurinucleacin y reas de carioplasma
de cristal granulado con semillas de granada.
Figura 9-29 Cristales romboidales de colesterol aspirados de
un quiste tiroideo benigno. Tal sedimentacin puede ser una con-
secuencia de hemorragias anteriores (MGG, 50 ).
Figura 9-27 Efecto citoptico del virus del papiloma humano. a) La histologa muestra multinucleacin con halos claros alrededor de los
ncleos hipercromticos e irregulares (coilocitosis) (H-E, potencia media). b) Coilocitos similares presentes en un frotis cervical. Ntese
de nueva cuenta la multinucleacin, claricacin perinuclear del citoplasma y leve condensacin citoplsmica perifrica (Pap, 100 ).
originados a partir de una fuente endgena, como bras
vegetales o crnicas y cristales de colesterol (g. 9-29), o
extrnsecos, por ejemplo depsitos del colorante y grnulos
de talco o algodn provenientes de los guantes quirrgicos
(g. 9-30). Una jacin deciente, en particular por secado
al aire seguido de la jacin en alcohol, las preparaciones
teidas con Papanicolaou, el artefacto de xileno y las bur-
bujas de aire coneren apariencias tpicas (g. 9-31). Ele-
mentos inorgnicos, como bras de asbestos, se reconocen
de modo ocasional (g. 9-32).
La transferencia de material celular (contaminacin
cruzada, transportadores o otadores), por el paso
de una muestra a otra durante el transporte, la jacin o los
procedimientos de tincin, constituye una fuente potencial
CITOMORFOLOGA 111
Figura 9-30 Numerosos grnulos de almidn que contaminan
esta muestra de un lavado bronquioloalveolar, tal vez procedentes
del polvo del guante quirrgico. Su tpico aspecto de cruz de Malta
se reconoce mejor mediante transiluminacin con luz polarizada
cruzada (MGG, 50 , polarizada).
Figura 9-31 Clulas en hojuela de maz en un frotis cervical.
Un depsito marrn apenas refrctil cubre los ncleos y el cito-
plasma de estas clulas escamosas. Esto es ms comn en frotis
cervicales y se cree que es el resultado del aire atrapado en la su-
percie celular durante la jacin. Rara vez es tan extenso para
producir un frotis del todo indescifrable (Pap, 100 ).
Figura 9-32 Cuerpo ferruginoso en esputo. Un macrfago multi-
nucleado alveolar pulmonar engulle en parte un cuerpo ferruginoso
refrctil. El aspecto marrn de cuentas ensartadas se atribuye a la
incrustacin del pigmento frrico en una bra decolorada, quiz de
asbesto. Los grnulos intracitoplsmicos oscuros comprenden una
mezcla de pigmento antractico y hemosidertico (Pap, 1 000 ).
para establecer resultados positivos falsos de la maligni-
dad y se debe evitar a toda costa. Es posible prevenir lo
anterior con una tcnica rigurosa y una buena higiene del
laboratorio.
La contaminacin ambiental espuria procede casi siem-
pre del agua o el aire y puede ser de naturaleza biolgica o
no (gs. 9-33 y 9-34).
Exactitud y limitaciones de la citologa
Es til alguna medida de la conabilidad y la exactitud
de la citologa diagnstica en varias circunstancias para la
comparacin y se expresa a menudo en trminos estads-
ticos (cuadro 9-2). La sensibilidad (fraccin de verdade-
ros positivos) es una medida de la ecacia con la cual una
prueba reconoce a pacientes con el trastorno bajo conside-
racin. La especicidad (fraccin de verdaderos negativos)
indica qu tan bien excluye una prueba a esos individuos
sin la enfermedad. Los valores predictivos positivo y nega-
tivo indican el modo preciso en que la prueba reconoce la
presencia o ausencia de la afeccin, respectivamente. Un
resultado falso negativo seala que la prueba no identica
una enfermedad que luego s se demuestra. Esto puede de-
berse a los errores de la investigacin o las dicultades de
la interpretacin. Un falso verdadero negativo se presenta
cuando la revisin retrospectiva del material conrma la
suciencia de la muestra y corrobora un resultado negativo
genuino. Las posibles explicaciones para esto incluyen el
muestreo perilesional en lugar del lesional o el inicio de
la enfermedad despus de practicar el mtodo de la prue-
ba (intervalo de la enfermedad). La sensibilidad de una
prueba disminuye mientras el nmero de falsos negativos
aumenta. Un resultado falso positivo aparece si la prueba
se informa como positiva pero la enfermedad no puede de-
mostrarse con posterioridad. Esto puede ser consecuencia
de dicultades en la interpretacin o del aspecto de cier-
tas anormalidades, que pueden semejarse de forma estre-
cha. La especicidad de una prueba disminuye mientras el
nmero de falsos positivos aumenta. La eciencia de una
prueba es una medida de cun bien clasica a los pacientes
que deben recibir el tratamiento y aquellos para los que el
tratamiento es innecesario.
Los valores estadsticos absolutos de una prueba par-
ticular se pueden modular por la inclusin o exclusin de
muestras inadecuadas o insatisfactorias. La inclusin de
stas suministra una indicacin global de la ecacia clni-
ca de la prueba, en tanto que la exclusin reeja con ms
exactitud el funcionamiento del laboratorio.
Citopatologa ginecolgica
y exploracin cervical
Las muestras de citologa de la zona genital femenina re-
presentan una proporcin considerable del procesamiento
de rutina de la mayora de los laboratorios de diagnstico,
en gran parte como resultado de la exploracin cervical.
El primer objetivo de la prueba del frotis cervical es la de-
teccin del carcinoma celular escamoso y sus precursores
en mujeres asintomticas. Tambin se utiliza en la inves-
tigacin de las pacientes que sufren sntomas ginecolgi-
cos y como parte del proceso de vigilancia despus del
Figura 9-33 Contaminantes areos. Estas condias (zapatos para la nieve) micticas segmentadas de manera interna se hallaban en el
borde de un frotis. Tales elementos son consistentes con Alternaria spp. y son presuntos contaminantes areos (a, Pap, 250 ; b, MGG,
250 ).
Figura 9-34 Un caro libre descubierto como contaminante ex-
geno en un frotis cervical. No es de consecuencia clnica (Pap,
250 ).
Cuadro 9-2 Algunos de los parmetros ms tiles para medir
la exactitud de la citologa y formas de calcularlos
Enfermedad Enfermedad
positiva (a c) negativa (b d)
Prueba positiva Verdadero positivo Falso positivo
(a b) (a) (b)
Prueba negativa Falso negativo Verdadero negativo
(c d) (c) (d)
Sensibilidad
a
a c
Especicidad
d
b d
Valor positivo predictivo
a
a b
Valor negativo predictivo
d
c d
Exactitud
a d
a b c d
Fraccin de probabilidad
de una prueba positiva

sensibilidad
1 especicidad
Fraccin de probabilidad
de una prueba negativa

1 sensibilidad
especicidad
tratamiento. De importancia secundaria es la deteccin de
lesiones glandulares del cervix u otros sitios ginecolgicos,
el reconocimiento de una variedad de anomalas inamato-
rias y contagiosas, y la valoracin del estado hormonal.
La exploracin cervical ha demostrado ser ecaz en la
reduccin de la mortalidad y la morbilidad del carcinoma
cervical en varios pases, aunque no por medio de ensayos
controlados aleatorios. Un programa de exploracin cer-
vical ha estado en funcionamiento en el Reino Unido desde
CITOPATOLOGA GINECOLGICA Y EXPLORACIN CERVICAL 113
Figura 9-35 Diagrama esquemtico de la anatoma del cervix. Se ilustra la morfologa cambiante de la zona de transformacin cervical y
la unin escamocolumnar con el paso de los aos.
Unin escamocolumnar original
Zona de transformacin con nueva
unin escamocolumnar
Eversin endocervical (ectropin)
con unin escamocolumnar
original
Unin escamocolumnar dentro
del canal endocervical despus
de la menopausia
S = epitelio escamoso C = epitelio columnar E = fondo de las glndulas endocervicales en el epitelio escamoso metaplsico
1964. La llamada sistemtica de la poblacin se introdujo
en 1988 bajo auspicios del NHS Cervical Screening Pro-
gramme (NHSCSP) con el establecimiento de una red de
coordinacin nacional. Esto propicia la clasicacin uni-
forme de las anomalas, la estandarizacin de la termino-
loga, el seguimiento de frotis anormales, la institucin de
mecanismos para el control de calidad, la evaluacin de la
efectividad del programa mediante el entrenamiento multi-
disciplinario de auditora y la vigilancia de los profesiona-
les del cuidado de la salud.
Cuando todos los aspectos del proceso de investigacin se
realizan de forma ptima, la prueba es un mtodo muy sen-
sible para la deteccin de los precursores del carcinoma
celular escamoso, excepto para el carcinoma invasivo. Sin
embargo, debe recordarse que como prueba de exploracin
tiene un margen de error diagnstico bajo pero de impor-
tancia. La erradicacin del carcinoma cervical tiene toda-
va que realizarse por esta va.
El objetivo de un frotis cervical es muestrear de manera
representativa la zona de transformacin cervical que limita
la unin escamocolumnar, que es el sitio con el riesgo ms
alto de cambio neoplsico (g. 9-35). Es en ltima instancia
tarea del clnico visualizar el cervix y recoger muestras de
la circunferencia cervical entera, sin importar cul sea la
celularidad o el contenido celular del frotis (g. 9-36). Los
indicadores de la probable transformacin de la zona que
se muestrea incluyen las clulas escamosas metaplsicas
inmaduras o el epitelio glandular endocervical con mucosi-
dad. No existen indicadores conables de la transformacin
de la zona que se muestrea en frotis atrcos.
El frotis cervical normal
La citomorfologa de las clulas escamosas superciales,
intermedias y parabasales reeja en gran parte la estructu-
ra histolgica del epitelio escamoso estraticado maduro
(g. 9-37). El espesor mucoso y el contenido de glucgeno
dependen de la actividad hormonal. En condiciones norma-
les, las clulas superciales se exfolian de forma natural y
no existe casi nunca queratinizacin. Las clulas muestran
escasa cohesin y se disponen casi de modo individual.
Por su parte, las clulas glandulares endocervicales poseen
una amplia variacin en el aspecto, segn sean su preser-
vacin y orientacin. Tienden a conservar la cohesin y
pueden mostrar modelos citoestructurales comparables a
los de otros sitios glandulares. Las clulas de la reserva
subcolumnar estn casi siempre presentes como ncleos
descubiertos e isomorfos. Las clulas escamosas metapl-
sicas son un componente normal de un frotis durante los
aos reproductivos. Mientras son inmaduras no se exfolian
de modo espontneo y cuando se eliminan por abrasin
exhiben a menudo proyecciones citoplsmicas (clulas en
araa). Una vez que alcanzan la madurez completa son
indistinguibles de las clulas escamosas del ectocervix
original. Las clulas estrmicas endometriales, las clulas
glandulares y los histiocitos (xodo) pueden observarse
al principio del ujo menstrual hasta el da 12 del ciclo
menstrual. Fuera de este intervalo se consideran anormales
y dicha hiperexfoliacin puede deberse a irregularidades
menstruales y dispositivos anticonceptivos intrauterinos,
adems de plipos, hiperplasia y neoplasia. Los leucocitos
polimorfonucleares estn invariablemente presentes y son
ms evidentes cerca de la menstruacin. Los linfocitos, los
eosinlos, los mastocitos y las clulas plasmticas suelen
ser escasos. La mera presencia de clulas inamatorias no
implica infeccin en todos los casos. Los espermatozoides
pueden persistir por varios das despus de la unin sexual.
El trofoblasto y el estroma deciduoide pueden perderse
durante el embarazo o el aborto y las clulas seudodeci-
duoides pueden ser el resultado de la terapia hormonal.
La queratinizacin anormal (hiperqueratosis) produce
escamas sin ncleo, profundamente naranjlas en prepa-
raciones con Papanicolaou. La paraqueratosis demuestra
espigas (ramitas) o perlas de escamas similares que poseen
ncleos picnticos. Ambos modelos pueden verse en con-
diciones inamatorias y neoplsicas. Puede hallarse una
variedad de contaminantes, incluidos los helmintos, piojos,
hongos, polen y gel lubricante.
Citologa hormonal
La evaluacin citohormonal se basa en la maduracin del
epitelio escamoso vaginal en respuesta a las hormonas
gonadotrpicas circulantes en combinacin. El epitelio es
delgado e inmaduro cuando carece de estrgeno y proges-
terona. El estrgeno sin oposicin promueve el crecimien-
to y la maduracin. La progesterona induce descamacin
y exfoliacin con citlisis y clulas naviculares. Los
andrgenos estimulan la maduracin parcial de clulas
intermedias en el epitelio atrco con un efecto recproco
sobre el epitelio maduro.
Los modelos caractersticos son reconocibles en el
periodo posnatal, durante la pubertad, los estados de ma-
durez sexual, de embarazo, el puerperio, la lactancia y la
premenopausia y posmenopausia establecidas, con mo-
dulacin de inuencias hormonales exgenas o fuentes
hormonales endgenas anormales, como los tumores ov-
ricos.
Se pueden utilizar diversos ndices para registrar cam-
bios hormonales, entre ellos el ndice de maduracin, el
valor de maduracin, el ndice cariopicntico, el ndice
eosinlo y el ndice celular plegado.
Figura 9-36 Dispositivos cervicales de muestreo. La esptula,
en particular la de tipo extendido (Aylesbury), proporciona un me-
jor rendimiento celular y se recomienda para la exploracin. Los
dispositivos con cepillo para el muestreo endocervical pueden ser
bencos en caso de un frotis anormal. La tcnica de muestreo y la
visualizacin del cervix son de enorme importancia, sea cual sea el
diseo empleado.
Figura 9-37 Maduracin epitelial escamosa ectocervical normal.
Obsrvense la polaridad desde el estrato basal hasta las escamas
superciales y la ausencia de queratinizacin supercial (H-E, po-
tencia media).
Inamacin y cambios regenerativos
La inamacin en la zona genital femenina tiene un origen
infeccioso y puede algunas veces mostrar un patrn agu-
do, crnico o granulomatoso. Es un proceso dinmico en el
que los cambios degenerativos y regenerativos se observan
de forma sincronizada.
Las infecciones ms comunes incluyen cervicitis foli-
cular con notorio vnculo con Chlamydia spp., Lepthothrix
spp., a menudo acompaada de Trichomonas vaginalis, va-
ginosis bacteriana por Gardnerella vaginalis, Actinomyces
spp., Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis,
Treponema pallidum, Candida albicans, Herpes simplex
virus y virus del papiloma humano; muchas de estas infec-
ciones son de transmisin sexual (gs. 9-38 y 9-39).
Las inuencias yatrgenas incluyen la ablacin con l-
ser, el dao trmico, la operacin, la radioterapia, el re-
emplazo o la manipulacin hormonales y los dispositivos
Figura 9-38 Clula indicadora en la vaginosis bacteriana. El
crecimiento excesivo de cocos conere un aspecto granular a una
clula escamosa supercial (clula indicadora) en un frotis cer-
vical. Por lo regular, se debe a la ora bacteriana mixta, incluida
Gardnerella vaginalis. Su presencia no es una indicacin invariable
de sntomas clnicos (vaginosis bacteriana) (Pap, 250 ).
anticonceptivos intrauterinos. stos pueden dar lugar a
varias hiperplasias y metaplasias, adems de complicar la
interpretacin exacta del frotis cervical.
Discariosis, neoplasia intraepitelial cervical
y carcinoma cervical
Al carcinoma celular escamoso invasivo del crvix lo ante-
cede un prdromo de cambios precancerosos (displasia)
del epitelio de la zona de transformacin cervical, la lla-
mada neoplasia intraepitelial cervical (NIC). ste es un es-
pectro biolgico continuo que se subdivide o se calica de
forma arbitraria en cortes histolgicos como NIC 1, 2 y 3,
de acuerdo con el aumento de la gravedad de la displasia
(gs. 9-40 y 9-41). Cada fase representa el potencial para la
progresin de la regresin. Estas categoras corresponden a
discariosis celular escamosa leve, moderada y grave en las
preparaciones de los frotis de transferencia cervical (g.
9-40). El sistema estadounidense de Bethesda utiliza una
nomenclatura apenas diferente para los mismos aspectos
citomorfolgicos (vase el cuadro 9-3). Cuanto ms alto
sea el grado de anormalidad, mayor es el riesgo estadstico
de progresin al carcinoma invasivo.
Figura 9-39 Tricomonas y Candida en un frotis cervical. a) Trichomonas protozoon binucleadas y ageladas (Pap, 250 ). b) Blastos-
poros y seudohifas de Candida (Pap, 250 ).
Figura 9-40 Precursores del carcinoma celular escamoso inva-
sivo del cervix. Representacin esquemtica de la progresin po-
tencial de la neoplasia intraepitelial cervical al carcinoma cervical
invasivo.
Figura 9-41 Discariosis celular escamosa moderada. Obsrven-
se la nucleomegalia desproporcionada, el ncleo que ocupa hasta
dos tercios del rea citoplsmica, la hipercromasia nuclear, el
contorno nuclear irregular y los bordes celulares angulados (Pap,
100 ).
Neoplasia cervical intraepitelial
Epitelio
maduro
normal
Displasia
leve
Displasia
moderada
Displasia
grave
Invasin estrmica inicial sobrepuesta o
carcinoma microinvasivo
Grado 1 Grado 2 Grado 3
La invasin estrmica inicial, la microinvasin y el car-
cinoma celular escamoso invasivo indican la transgresin
de la membrana basal a grados variables, en el caso extremo
con tumefaccin. Esto se evala mejor mediante el examen
histolgico, en tanto que la discariosis grave NIC 3 puede
ser indistinguible en el plano citomorfolgico respecto de
la discariosis grave que se observa en el carcinoma invasi-
vo. Las clulas disqueratsicas extraas y la ditesis tumo-
ral pueden ser caractersticas distintivas tiles, pero no son
patognomnicas ni estn presentes en todos los casos.
Se han establecido programas de exploracin para de-
tectar carcinoma de mama en mujeres asintomticas en va-
rios pases y los resultados iniciales parecen alentadores.
Citologa basada en lquidos en la exploracin cervical
En aos recientes, junto con el reconocimiento de la eca-
cia de la prueba del frotis cervical, tambin se han identi-
cado de modo ms extenso algunas de las limitaciones
del proceso. La sensibilidad aceptada de un frotis cervical
solo oscila entre 50 y 60%, lo que contrasta en grado consi-
derable con la elevada expectativa pblica, muchas veces
infundada. Los mtodos empleados han cambiado poco en
varias dcadas y estn sujetos al escrutinio creciente, con
la nalidad de reducir ms la mortalidad del cncer cervi-
cal. Se cree que slo una pequea proporcin de los frotis
falsos negativos son consecuencia del error humano de ob-
servacin o interpretacin durante el examen microscpico
por el personal del laboratorio. Los factores de confusin
ms signicativos se reconocen ahora durante las etapas
anteriores al muestreo y la preparacin. Por ejemplo, la
esptula de madera convencional no muestrea las clulas
anormales de manera uniforme y transere slo 10 a 60%
de las clulas recolectadas a un portaobjetos. Por lo tan-
Cuadro 9-3 Comparacin amplia de las terminologas ms recientes aplicadas a las clulas escamosas
anormales en la citologa cervical
Contraparte histolgica WHO, 1973 BSCC, 1986* Bethesda, 1991
Limtrofe CEAII
NIC 1 Displasia menor Discariosis menor LIE grado bajo
NIC 2 Displasia moderada Discariosis moderada LIE grado alto
NIC 3 Displasia grave Discariosis grave LIE grado alto
Carcinoma in situ
Carcinoma invasivo Carcinoma epidermoide Discariosis grave Carcinoma escamoso
Carcinoma invasivo?
WHO, World Health Organization; CEAII, clulas escamosas atpicas de importancia incierta; BSCC, British Society of Clinical Cytology; LIE,
lesin intraepitelial escamosa.
*Enmiendas propuestas por la BSCC en 2002 para emplear una clasicacin simplicada de dos grados (es decir, discariosis de grados bajo y alto),
en lugar de la estadicacin actual de tres grados de discariosis (esto es, menor, moderada y grave), la cual debe an raticarse en el Reino Unido.
to, la distribucin del material puede ser desigual y poco
representativa. Esto, y en verdad cualquier factor de la mu-
cosa, inamacin u otro pueden ser perjudiciales para la
jacin, dado que provocan artefactos, tinciones insucien-
tes y prdida del contorno citonuclear; todo ello representa
una proporcin inadecuada del frotis global de casi 10%.
Las tcnicas de citologa basadas en lquido reducen al
mnimo muchos de estos problemas. A partir de octubre de
2003, el National Institute of Clinical Excellence (NICE)
ha recomendado al NHS en Inglaterra y Pas de Gales que
se introduzca la citologa basada en lquido como medio
primario del procesamiento de muestras en el NHSCSP. Se
anticipa que tomar cerca de cinco aos para que esto se ins-
tituya por completo. Esta decisin incluye la evaluacin de
dos diferentes sistemas comerciales establecidos, ThinPrep
(Cytyc Corporation) y Sure-Path Prep (TriPath Imaging
Inc.). Estos productos ganaron la aprobacin similar de la
US Food and Drug Administration (FDA) varios aos an-
tes. Es probable que otros productos comerciales insistan
en la validacin ocial a su debido tiempo. Estudios piloto
predicen efectividad clnica reforzada (mayor sensibilidad
y especicidad, menos frotis limitados), mejor relacin
costo-benecio (menos frotis inadecuados, tiempos ms r-
pidos de consulta y mejor productividad del laboratorio) y
una mejor aceptacin (del pblico y los profesionales del
cuidado mdico) en comparacin con las tcnicas conven-
cionales del frotis cervical.
Exploracin automatizada y anlisis de la imagen
Los sistemas de anlisis de imagen de alta resolucin se
pueden semiautomatizar o automatizar por completo y
conectarse a la poderosa red neural de computadoras. El
objetivo de evitar la subjetividad de la valoracin manual y
la posibilidad de que las mquinas autnomas reduzcan el
error humano durante el proceso de exploracin son puntos
atractivos. El requerimiento de calidad ptima y muestras
uniformes han conducido en gran parte al avance de la cito-
loga basada en lquido. Varios paquetes comerciales se han
desarrollado y comercializado en poco tiempo. No obstante,
hasta la fecha parece discreta la perspectiva de reemplazar
a la mayora de los citlogos expertos y la relacin costo-
benecio de esta tecnologa todava no se establece.
Los dispositivos de la microscopia asistidos por una
computadora se han utilizado como adjunto del entrena-
miento de los citlogos y para registrar los datos del control
de calidad, pero an no se emplean de rutina en la mayor
parte de los laboratorios.
La telepatologa y la teleconferencia aprovecharon
los enlaces remotos en tiempo real con los usuarios, aleja-
dos desde el punto de vista geogrco, y ello hizo posible
las consultas interactivas para el entrenamiento, revisin
grupal o del experto y la valoracin de calidad.
Tcnicas auxiliares
En ocasiones, la valoracin citomorfolgica es un proce-
so muy subjetivo y por tanto propenso a las diferencias de
reproducibilidad entre el propio clnico y entre ste y otro.
Se ha tratado de depurarla y cuanticarla de modo ms ri-
guroso, con grados variables de xito.
La citometra de ujo implica la valoracin automati-
zada de clulas en suspensin, las ms de las veces para el
anlisis del DNA o con propsitos de inmunofenotipica-
cin. La microuorimetra permite el enfoque sobre clu-
las individuales en un campo para evaluar la cantidad de
actividad uorescente dentro de ncleos marcados.
El anlisis citogentico detecta anormalidades cromos-
micas, algunas de las cuales son tpicas de ciertos tumo-
res, como el t(x:18) en el sarcoma sinovial y el t(11:22) en
el tumor de Ewing. No obstante, casi ninguna neoplasia
muestra tales translocaciones consecuentes tpicas.
Las regiones del organizador nucleolar teidas con pla-
ta se incrementan en la mayora de los ncleos malignos.
Infortunadamente, la superposicin de anormalidades be-
nignas y malignas es considerable con frecuencia.
El escrutinio y la microscopia electrnica de transmi-
sin pueden identicar los detalles ultraestructurales tiles
e imperceptibles para la microscopia de luz y ello hace po-
sible una clasicacin ms exacta de diferenciacin celular,
como grnulos neurosecretorios de centro denso, uniones
rmes, tonolamentos, etctera.
Las tcnicas de hibridacin in situ se pueden utilizar
para identicar el material nuclear vrico y reconocer la
activacin oncgena en los tumores.
La microscopia con lser confocal procesa las imgenes
digitales, que pueden manipularse ms para reconstruir la
microtopografa tridimensional de las clulas; es conve-
niente en particular para las preparaciones gruesas y los
productos uorescentes que pueden cuanticarse.
La citometra con lser es una tcnica hbrida que
combina las caractersticas de la citometra de ujo con
el anlisis de imagen esttica de clulas marcadas por los
uorocromos multicolores; puede determinar la ploidia
del DNA e incorporar mtodos de hibridacin in situ uo-
rescentes mediante citopreparaciones convencionales y
basadas en lquido.
Las tcnicas de microdiseccin con captura de lser
permiten la seleccin de una subpoblacin relativamente
pura de clulas seleccionadas de un portaobjetos de la cito-
loga o la histologa. Un lser infrarrojo de baja energa se
emplea para extender un adhesivo plstico sobre las clu-
las seleccionadas, que despus se desprenden con suavidad
para el estudio adicional.
Aseguramiento de la calidad
en la citologa diagnstica
El propsito de un programa de aseguramiento de calidad
es evaluar el proceso diagnstico en su prctica. El control
de calidad interno indica una serie de procedimientos den-
tro de un laboratorio particular. Esto supone la educacin
continua, el adiestramiento, la revisin de los procedi-
mientos del laboratorio y su implementacin, la reevalua-
cin, la doble valoracin y la auditora. El aseguramiento
de calidad externo indica la evaluacin de la ejecucin
contra un grupo externo, ya sea en el plano regional o el
nacional, y esto puede ser parte de un esquema de acredi-
tacin, voluntaria u obligatoria.
Atkins KA. Liquid-based cytological preparations in gynae-
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SECCIN 3
MICROBIOLOGA-
BACTERIOLOGA
http://booksmedicos.org
Introduccin
A nales del siglo xvii, el tapicero y cientco acionado
holands Antonie van Leeuwenhoek puli lentes pequeas
de extraordinaria calidad y pudo observar microorganismos
por primera vez. Desde entonces, la microscopia desem-
pea un papel fundamental en la bacteriologa clnica. El
examen microscpico de una muestra clnica puede ayudar
a valorar la propiedad de la muestra (vase la seccin sobre
esputo ms adelante) y puede por s mismo indicar inme-
diatamente la probable naturaleza del agente patgeno
bacteriano en sitios casi siempre estriles, como el lquido
cefalorraqudeo (LCR) o cultivos de sangre. Los mtodos
en un laboratorio de diagnstico clnico incluyen las mi-
croscopias de luz y uorescencia; las muestras pueden es-
tar teidas o carecer de tincin, segn sea su aplicacin.
Microscopia de luz
La microscopia de luz puede emplearse de tres maneras: la
forma ordinaria transmitida (campo brillante), la de campo
oscuro y la de contraste de fase; la ms utilizada, sin duda,
es la primera. Un microscopio moderno es capaz de alcan-
zar una ampliacin de mil veces y un poder de resolucin
aproximado de 0.2 m. La mayor parte de los microscopios
se disea de tal modo que el observador mira a travs de
los oculares, que se inclinan a un ngulo conveniente, en di-
reccin del portaobjetos, que contiene el objeto a examinar.
Una disposicin alternativa (el microscopio de placa inver-
tida) se ide para observar la muestra desde abajo. La ilumi-
nacin de campo oscuro aumenta de forma ecaz el poder
de resolucin del microscopio de luz por abajo de 0.2 m.
Las muestras se iluminan de manera indirecta, dispersan la
luz y aparecen brillantes contra un fondo oscuro. Mediante
esta tcnica es posible visualizar bacterias, como las espiro-
quetas, que tienen un dimetro cercano a 0.1 m. La micros-
copia de contraste de fase permite el examen de estructuras
internas nas de tejidos y bacterias vivas sin teir y las dife-
rentes estructuras aparecen en distintas tonalidades de gris.
Microscopia de uorescencia
La uorescencia se emite cuando una molcula se somete
a la luz de una longitud de onda particular e irradia luz de
una longitud de onda ms larga. Los uorocromos (tintes
uorescentes) absorben luz ultravioleta invisible y emiten
luz visible. Un microscopio uorescente utiliza una lmpa-
ra de vapor de mercurio que irradia luz ultravioleta de alta
intensidad (luz de excitacin) y un espejo la dirige hacia la
muestra desde un plano superior. Las bacterias teidas con
un uorocromo absorben esta luz de longitud de onda cor-
ta, emiten luz de longitud de onda ms larga y se delinean
como objetos verdes o amarillos radiantes contra un fondo
oscuro. La microscopia de uorescencia permite el uso de
objetivos de poder ms bajo y por lo tanto puede analizarse
con rapidez un rea mucho ms grande de la muestra. Esto
es importante, por ejemplo, al buscar micobacterias en una
muestra de escasos microorganismos.
10
Microscopia en bacteriologa:
aplicacin y preparacin de la muestra
Dugald R Baird
124 CAP. 10 MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGA: APLICACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA
Muestras para microscopia
Los especmenes pueden ser de dos tipos principales: a)
frotis secos de muestras lquidas o escobillados o bien de
cultivos bacterianos, extendidos sobre un rea de 1 a 2 cm
de dimetro en portaobjetos de 31 y jados por calor
(pelculas); b) preparaciones hmedas de lquidos,
examinadas bajo un cubreobjetos o cmaras especiales.
Los escobillados contenidos en un medio de transporte
estn hmedos y se pueden frotar directamente sobre la
supercie de un portaobjetos, mientras las pelculas de
muestras lquidas, como pus, aspirados, LCR, etc., se pre-
paran al extenderse sobre una capa na. Los especmenes
de tejido se presionan sobre las supercies de los portaob-
jetos para crear las impresiones, o bien pueden suspenderse
en un volumen pequeo de agua peptonada. Las colonias
de bacterias que crecen en medios slidos se examinan al
remover con un asa la colonia y emulsicar sta en una
gota de solucin salina sobre el portaobjetos, de tal manera
que se obtenga una suspensin muy ligera para que las c-
lulas individuales se distingan con claridad.
Examen de muestras sin teir
por transmisin de luz
El examen de muestras lquidas en una cmara de conteo
sobre un portaobjetos con un cubreobjetos se utiliza para
evaluar la presencia de indicios de infeccin o inamacin
en lquidos corporales habitualmente estriles, como la
orina, LCR, aspirados y excreciones de dilisis peritoneal.
La luz transmitida se emplea con o sin contraste de fase
y la muestra se examina mediante el objetivo 25 para
eritrocitos y leucocitos, agentes patgenos, cilindros o cris-
tales, segn sea apropiado para la muestra. Las cuentas de
clulas pueden expresarse en trminos cuantitativos, si se
emplea una cmara de conteo, o semicuantitativos (p. ej.,
por campo de alto poder).
Las bacterias que crecen en medios de cultivo lquidos
pueden examinarse por la motilidad con un objetivo de 50 .
Al acercar el condensador aumenta el contraste y la visualiza-
cin de los microorganismos resulta ms fcil; en caso contra-
rio puede ser de utilidad el microscopio de contraste de fase.
El examen de monocapas de cultivo de clulas de tejido
para efectos citopticos es en particular competencia de la
virologa, pero tiene una aplicacin en la bacteriologa para
identicar la citotoxina de Clostridium difcile en extrac-
tos fecales o sobrenadantes de cultivos.
Lquido cefalorraqudeo (LCR)
En condiciones normales, el LCR es estril y contiene no
ms de cinco clulas blancas por milmetro cbico, sobre
todo linfocitos. El primer paso en el examen consiste en la
microscopia del lquido sin centrifugar para cuanticar el
nmero de clulas presentes y su tipo. Se usa una cmara
de conteo, casi siempre la Fuchs-Rosenthal modicada. Se
trata de un portaobjetos que contiene un hueco, el piso del
cual est grabado con una rejilla de nueve cuadros grandes,
cada uno de 1 mm
2
de rea. Estos cuadros estn a su vez
subdivididos en 16 cuadros pequeos. Cuando un cubreob-
jetos se aplica encima de la cmara de conteo y el lquido
se traslada mediante una pipeta de Pasteur, la profundidad
del lquido es de 0.2 mm. El volumen del lquido que cubre
cinco cuadros grandes es por consiguiente de 1 mm
3
.
Un cubreobjetos se aplica al portaobjetos para crear un
sello rme uniforme sobre la cmara de conteo, tras pre-
sionar con suavidad sus bordes hasta que los colores del
arco iris se ven de manera uniforme alrededor de los lados
del cubreobjetos (anillos de Newton); esto conrma que
el cierre e incluso el contacto se efectuaron entre el cu-
breobjetos y la cmara. El LCR se introduce en la cmara
con una pipeta de Pasteur na aplicada de modo cuidadoso
en el borde para que el lquido pase al interior y llene por
completo la cmara, sin burbujas de aire.
Despus de unos cuantos minutos de reposo, las clu-
las se cuentan con un objetivo de 40 ; los nmeros de
cuadros existentes examinados dependen del nmero
de clulas presentes. El LCR que contiene una gran canti-
dad de clulas blancas o el densamente teido de sangre,
en un caso como resultado de hemorragia intracerebral
y en otro por la puncin accidental de vasos sanguneos
pequeos durante la puncin lumbar, debe diluirse antes de
realizar un conteo celular exacto. Para este propsito se uti-
liza un lquido que contenga cido actico y cristal violeta
diluido: se rompen los eritrocitos y se tie el ncleo de las
clulas blancas, lo cual las hace ms visibles. La identi-
cacin de los tipos de clulas se facilita al centrifugar una
alcuota de LCR y crear una pelcula, que se impregna con
una tincin diferencial como la de Leishman.
Orina
No todos los laboratorios realizan la microscopia como una
rutina en las muestras de orina. En los especmenes toma-
dos de pacientes mediante catteres (muestras de catter
de orina) est justicado, ya que la ausencia de clulas de
pus en esos especmenes no excluye la infeccin. Sin em-
bargo, en las muestras obtenidas con limpieza sin catteres
(orina del chorro medio), la ausencia de piuria sugiere que la
relevancia de un aislado es en el mejor de los casos incierta;
puede tratarse de un contaminante y en tal caso se aconseja
la repeticin del muestreo. La microscopia tambin es til
para detectar eritrocitos, cilindros y cristales, que pueden
ser de importancia diagnstica. En consecuencia, la infor-
TINCIN DE LAS MUESTRAS 125
macin que se puede obtener de la microscopia de la orina
es valiosa y debe solicitarse siempre que sea posible.
La microscopia se realiza sobre orina fresca sin centri-
fugar. La visualizacin de microorganismos en tales pre-
paraciones es de importancia secundaria puesto que es la
cuanticacin del crecimiento bacteriano lo que importa en
la evaluacin de los aislados de una muestra de orina. Los
neutrlos se excretan en nmeros variables en la orina y
slo cifras mayores de 10
4
/ml pueden considerarse anor-
males en las muestras del chorro medio. Las clulas rojas
se encuentran como contaminantes en la orina de mujeres
saludables muy jvenes, en relacin con la menstruacin,
pero pueden tambin indicar afecciones graves del sistema
renal, como clculos, neoplasias o enfermedad glomerular.
En este ltimo caso, la morfologa de los eritrocitos puede
ser anormal (dismorsmo) y se reconocen fragmentacin,
crenacin u otras formas extraas.
Los laboratorios que procesan pocas muestras de orina
pueden examinarlos en cmaras de conteo, como se describi
para el LCR, pero casi todos usan un mtodo semicuantita-
tivo. ste suele incluir tan slo un portaobjetos y un cubre-
objetos de cristal ordinarios, cmaras de conteo desechables
o un microscopio de placa invertida. Este ltimo permite el
procesamiento por lotes de muchas muestras en pozos de
fondo plano dentro de una placa plstica. Se usa un objetivo
40 y, si se conocen el rea de campo (campo de alto
poder) y la profundidad de la orina, el nmero de clulas
visibles se puede expresar en cuentas/ml, aunque en la prc-
tica la mayor parte de los laboratorios registra las cuentas
slo como escasas, moderadas o numerosas.
Otras muestras
Las tcnicas descritas para la orina se pueden aplicar a otros
lquidos estriles, como los aspirados de articulaciones (en
los cuales tambin es importante el examen de cristales
como el cido rico), lquidos serosos y secreciones de
dilisis peritoneal. La microscopia de heces se emplea para
el diagnstico de infecciones parasitarias, pero no para el
diagnstico de la gastroenteritis bacteriana.
Examen de muestras sin teir mediante
iluminacin de fondo oscuro
Tiene una aplicacin en la bacteriologa clnica, sobre todo
en el examen de material tomado de un chancro primario
cuyos agentes patgenos pueden ser causantes de slis
(Treponema pallidum). El material se recoge de la lesin
sospechosa y se crea una pelcula hmeda bajo un cubre-
objetos, que se examina de inmediato para identicar la
motilidad de los treponemas.
Tincin de las muestras
Se emplea luz transmitida porque el ndice de refraccin de
las bacterias es similar al del fondo oscuro y es necesario
incrementar el contraste por el uso de tinciones. El mtodo
ms utilizado de tincin de bacterias es an el que intro-
dujo Christian Gram en 1884. Aunque no es un colorante,
sino un mtodo de tincin, el trmino tincin de Gram se
utiliza de modo universal; la tcnica delinea las diferencias
de la estructura de la pared celular que existen entre varias
clases de bacterias. El material que se tie puede ser una
muestra clnica, un caldo de cultivo o una suspensin en
solucin salina de un microorganismo tomado de una placa
de agar. En todos los casos se realiza un frotis no sobre
un portaobjetos y se seca de manera natural o con calor de
baja intensidad, despus de lo cual el frotis se ja al por-
taobjetos, sea que ste se pase rpidamente tres veces por
un mechero de Bunsen o se emplee una placa calentada.
El mtodo de tincin de Gram, que tiene varias modica-
ciones, somete el frotis de modo sucesivo a lo siguiente: a)
una tincin bsica de carga positiva, casi siempre cristal de
violeta; b) mordiente de yodo acuoso; c) decoloracin con
acetona, y d) contratincin con carbol fucsina o safranina.
La mayor parte de las bacterias se tie al principio con el
cristal violeta y yodo, que forma complejos insolubles den-
tro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas
gruesas de peptidoglucano en sus paredes celulares, y en
consecuencia retienen la tincin despus del tratamiento con
acetona y adquieren una tonalidad morada, se denen como
grampositivas. Los microorganismos que tienen capas ms
delgadas de peptidoglucano, que pierden con rapidez el com-
plejo con la acetona y por lo tanto se tien con el reactivo de
tincin rosa, se conocen como gramnegativos. Los ejemplos
de ambos se hallan en el cuadro 10-1. Algunas bacterias se
tien slo de modo muy discreto con la tincin de Gram
(p. ej., especies de Legionella), algunas son irregulares en el
Cuadro 10-1 Algunos ejemplos de gneros bacterianos
clasicados de acuerdo con su morfologa y tincin de Gram
Forma Grampositivos Gramnegativos
Cocos (esferas) Staphylococcus Neisseria
Streptococcus Moraxella
Peptococcus* Veillonella*
Bacilos (bastones) Bacillus Enterobacteriaceae
Listeria Pseudomonas
Corynebacterium Haemophilus
Clostridium* Bacteroides*
*Gnero anaerbico.
grado de tincin (gramvariables, como Gardnerella vagina-
lis) y otras no se tien en absoluto (p. ej., micobacterias).
Se requieren mtodos especiales de tincin para las mi-
cobacterias debido a la peculiar composicin de sus paredes
celulares, que contienen altas concentraciones de cidos
(grasos) miclicos. La tincin de Ziehl-Neelsen implica
el tratamiento de las pelculas con carbol fucsina calien-
te, seguido por pasos sucesivos de decoloracin con cido
sulfrico concentrado y alcohol; al nal se contratien con
malaquita verde o azul de metileno. Las micobacterias apa-
recen rojas contra un fondo verde o azul (g. 10-1).
uorocromo, casi siempre isotiocianato de uorescena, con-
jugado con un anticuerpo especco que se une directamen-
te al antgeno supercial bacteriano. La IFAT es un proceso
de dos etapas: el anticuerpo especco (p. ej., preparado en
un conejo) se liga al antgeno y lo detecta un anticuerpo con-
jugado (p. ej., anticonejo). La ventaja de la IFAT es que un
solo anticuerpo conjugado puede usarse para identicar
una gama entera de anticuerpos especcos.
En la bacteriologa clnica los principales usos de estas
tcnicas de inmunouorescencia son: a) la deteccin de las
especies de Legionella, que son fastidiosas y de lento creci-
miento, pero pueden visualizarse con rapidez en esputo, la-
vados bronquioalveolares y tejido pulmonar (fresco o jado
en formalina), sea con DFAT o IFAT, y b) la demostracin
directa de clamidias en muestras genitales o respiratorias.
A continuacin se describen algunos ejemplos adiciona-
les del uso de la microscopia de las preparaciones teidas
en microbiologa clnica.
Muestras de sitios estriles
Con estas muestras, la microscopia es una herramienta
poderosa para predecir el probable agente patgeno causal.
El hallazgo de microorganismos en el lquido cefalorra-
qudeo, aspirado o secreciones de dilisis peritoneal, por
ejemplo, en particular cuando se acompaan por un inl-
trado de clulas de pus, es un indicador seguro de infeccin
y la apariencia sola de las bacterias puede ser diagnstica.
Debe realizarse una investigacin minuciosa de las bacte-
rias, dado que algunas veces son muy escasas en las mues-
tras, y se examinan por centrifugacin (p. ej., 3 000 rpm
por 10 minutos); se desecha el sobrenadante y se crea una
pelcula del depsito, que a continuacin se tie por el m-
todo de Gram o bien con auramina o con tincin de Ziehl-
Figura 10-1 Esputo teido por el mtodo de Ziehl-Neelsen
que muestra micobacterias (rojo) contra un fondo azul (1 000 ).
Cortesa de J. Winning.
El otro mtodo de tincin usado para las micobacterias
es el fenol de auramina. Los frotis secos y jados por ca-
lor (esputo, lquidos pleural y asctico, primera orina del
da, LCR, pus, etc.) se tratan con fenol de auramina y se
decoloran con cido clorhdrico al 1% en alcohol metilado
industrial, seguido de solucin diluida de permanganato de
potasio. Los especmenes se observan bajo luz ultravioleta
con el objetivo de 40 y las micobacterias brillan en tonos
verdes y amarillos contra un fondo oscuro (g. 10-2). Esta
tcnica permite la rpida proyeccin de un frotis y es til si
el nmero de bacterias en la muestra es pequeo.
Otros dos mtodos de tincin se emplean en microsco-
pia de uorescencia, la acridina naranja y la uorescena,
que usan anticuerpos conjugados. La tincin con acridina
naranja es un mtodo til para demostrar las bacterias que
no pueden destacarse con claridad en una tincin de Gram
(como en los cultivos de sangre; vase ms adelante). Bajo
luz ultravioleta, las bacterias aparecen anaranjadas.
Se dispone de dos tcnicas inmunouorescentes princi-
pales que usan conjugados de anticuerpos de uorescena,
las pruebas directa e indirecta de anticuerpo uorescen-
te (DFAT e IFAT, respectivamente). La DFAT utiliza un
Figura 10-2 Esputo teido con fenol de auramina y visualizado
bajo luz ultravioleta; se reconocen micobacterias radiantes con
una uorescencia de tono verde o amarillo (400 ). Cortesa de
B. Watt.
TINCIN DE LAS MUESTRAS 127
Neelsen, si la situacin clnica sugiere una posible infec-
cin micobacteriana.
Casi todos los laboratorios utilizan ahora alguna forma
del sistema de cultivo en sangre semiautomatizado; el pri-
mer paso para la identicacin del microorganismo es el
examen de una gota teida de Gram del caldo de un tubo
que muestra crecimiento. La microscopia puede ser por s
misma diagnstica; por ejemplo, los estreptococos en la
sangre de un paciente con ebre y un soplo cardiaco apoyan
un diagnstico clnico de endocarditis infecciosa (vase g.
10-3). Por otro lado, los cocos grampositivos en racimos
son casi siempre estalococos, pero Staphylococcus aureus
no se puede distinguir por microscopia de las diversas es-
ra articial. Las pelculas de escobillados bucales muestran
muchas clulas de pus y un gran nmero de espiroquetas y
bacilos fusiformes (aspecto de huso) gramnegativos.
Esputo
Todas las muestras de esputo se registran como potencial-
mente peligrosas para el operador, ya que pueden contener
bacilos tuberculosos, y la preparacin se lleva a cabo en un
gabinete de seguridad alojado en un laboratorio de conten-
cin de categora 3. Aunque el esputo se origina en las vas
respiratorias inferiores casi siempre estriles, se contamina
de forma inevitable antes de la coleccin por la ora de las
vas respiratorias superiores. Es necesario tener cuidado al
interpretar los especmenes con tincin de Gram del esputo
y slo de modo ocasional puede predecirse con seguridad el
agente patgeno causal de la neumona con base en la mi-
croscopia. No obstante, los especmenes con tincin de Gram
son tiles porque las muestras de esputo que poseen menos
de 10 neutrlos por clula epitelial escamosa representan
probablemente saliva, ms que esputo, e indican que el cul-
tivo puede ser engaoso. Cuando se sospecha una infeccin
micobacteriana, se examinan los preparados teidos de au-
ramina y se conrman positivos con la realizacin de mues-
tras frescas y teidas con el mtodo de Ziehl-Neelsen.
Las desventajas del esputo se superan en buena medida
con la prctica del lavado bronquioalveolar, un procedi-
miento empleado cada vez ms en el diagnstico de neu-
mona en los sujetos muy enfermos o inmunosuprimidos.
Las muestras obtenidas estn libres de la contaminacin de
la ora de las vas respiratorias superiores y pueden exa-
minarse por las tcnicas de tincin de Gram, auramina y
Ziehl-Neelsen, adems de las tcnicas de inmunouores-
cencia para las especies de Legionella y un amplio espectro
de agentes patgenos protozoarios, micticos y vricos.
Lesiones de la piel
Los escobillados de lesiones de la piel encierran escaso
valor diagnstico debido a la presencia de la ora normal
de la piel, con una excepcin notoria: el examen micros-
cpico del material raspado de las lesiones purpricas
relacionadas con la infeccin meningoccica. En sta, la
presencia de cocos gramnegativos en pares, con su aspecto
caracterstico, es diagnstica.
Pus y escobillados de heridas
El valor de la microscopia de estas muestras es variable
y depende de ciertos factores, ms all del control del
Figura 10-3 Tincin de Gram de un cultivo en sangre que mues-
tra cocos grampositivos en cadenas largas. El agente patgeno era
Streptococcus sanguis y el paciente tena endocarditis infecciosa
(1 000 ). Cortesa del Dr. A McLay.
pecies coagulasa negativas, y puesto que estas ltimas son
microorganismos de la piel, resultan los contaminantes ms
comunes de los cultivos de sangre. La relevancia de los es-
talococos identicados en un cultivo de sangre deben casi
siempre esperar una identicacin adicional. Los patgenos
gramnegativos en los cultivos de sangre son algunas veces
difciles de visualizar contra la tincin rosada del fondo;
cuando los microorganismos no son visibles es a menudo
til solicitar una tincin de acridina.
Muestras de sitios con una ora bacteriana
residente normal
Escobillados bucales
La microscopia es el nico mtodo que diagnostica la angina
de Vincent (estomatogingivitis anaerbica), puesto que los
microorganismos causales (que actan de modo sinrgico
para provocar la infeccin) no se pueden cultivar de mane-
Figura 10-4 Espcimen de una supuracin uretral que ilus-
tra numerosos cocos intracelulares gramnegativos de Neisseria
gonorrhoeae (1 000 ). Cortesa de J. Winning.
laboratorio. El pus o escobillados de pus de sitios como la
piel o infecciones de tejidos blandos puede sugerir infec-
cin con estalococos, estreptococos o anaerobios, mien-
tras que las muestras similares de sitios intraabdominales
pueden mostrar un cuadro mezclado, no siempre fcil de
relacionar con los hallazgos posteriores del cultivo. En
muchos de estos casos, la administracin previa de anti-
bitico puede explicar las discrepancias. Sin embargo, es a
menudo til suministrar un informe provisional indicativo
de que es probable una muestra o escobillado de pus, por
ejemplo, originada por estalococos o, de manera alterna-
tiva, de que los microorganismos mezclados tienen un pro-
bable origen fecal.
Escobillados vaginales altos
Las muestras con tincin de Gram se utilizan para determi-
nar la presencia de clulas de pus y tambin la de clulas
epiteliales cubiertas con pequeos bacilos gramvariables
(clulas indicativas). El hallazgo de estos ltimos es un
indicador de un trastorno conocido como vaginosis bacte-
riana. En medicina genitourinaria, los escobillados uretral
y endocervical se examinan para reconocer clulas de pus
que contienen cocos intracelulares gramnegativos en pares,
esto es, Neisseria gonorrhoeae (vase g. 10-4).
(b)
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Medios de cultivo en microbiologa
Bulloch escribi la historia de las plagas y pestes desde los
primeros registros del gnero humano hasta principios del
siglo xx. Aunque los trminos contagio e infeccin se
usaban ya en tiempos medievales, el papel de los diminutos
agentes infecciosos no pudo probarse sino hasta el trabajo
de Louis Pasteur (1822-1895). En buena medida, el trabajo
de este cientco supuso la demolicin de las teoras de
Galeno sobre la enfermedad infecciosa y la generacin es-
pontnea de la vida microscpica.
Sin embargo, el padre de los medios de cultivo fue
Robert Koch (1843-1910; g. 11-1), quien cre los mto-
dos para el cultivo, aislamiento e identicacin de las bac-
terias. Primero Pasteur demostr que stas eran la causa
de la infeccin en seres humanos, animales y alimentos,
pero slo el trabajo de Koch conrm que agentes pat-
genos especcos ocasionaban enfermedades especcas.
En esencia, el trabajo de Koch consisti en apartarse de
los cultivos lquidos, con sus meticulosas diluciones y fre-
cuente contaminacin, y adoptar una simple pero poderosa
tcnica que usaba un medio slido. Al agregar gelatina, y
ms tarde agar, a su caldo de extracto de carne cre la placa
rayada con sus colonias aisladas. Ms tarde demostr que
al mezclar de forma cuidadosa material sospechoso dentro
del medio fundido y verterlo en una placa se produca una
valoracin cuantitativa de los nmeros bacterianos, una tc-
nica utilizada ahora en extenso en la forma de la placa raya-
da. Richard Petri, uno de los asistentes de Koch, reemplaz
la placa de vidrio de Koch por la placa de Petri. Este diseo
permaneci sin cambio por ms de 100 aos.
Koch fue consciente de que un medio universal para
bacterias patgenas era imposible. Mostr tambin que
Mycobacterium tuberculosis no poda crecer sobre el me-
dio de agar de infusin de carne. Para este microorganismo
utiliz suero coagulado, huevo o papa rebanada. A nales
del siglo XIX un libro de texto de bacteriologa mdica des-
criba siete medios. La adicin ms importante al caldo de
infusin de carne de Koch fue la peptona, un digerido pp-
tico de protena que sugiri Loefer. Este ltimo tambin
incorpor 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y su
medio de nutrimentos es a la fecha el cimiento de los me-
dios de cultivo complejos e indenidos para microorganis-
11
Medios de cultivo en bacteriologa
Eric Y Bridson
Figura 11-1 Robert Koch (1843-1910), el padre de los medios
de cultivo.
130 CAP. 11 MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGA
mos quimiohetertrofos (es decir, aquellos que requieren
utilizar compuestos de carbn orgnico, en oposicin a las
bacterias auttrofas, las cuales sintetizan compuestos de
carbn a partir del dixido de carbono).
Muchas formulaciones ms de medios de cultivo surgie-
ron en las primeras dcadas del siglo XX, cuando los medios
de enriquecimiento y seleccin y los indicadores se idea-
ron para agentes patgenos aislados en reas que no eran
mdicas, como la agricultura, manufactura de alimentos
y bebidas, farmacutica, etc. Alrededor de 1930, un estu-
dio sobre medios describi 2 540 formulaciones, muchas
de ellas variaciones pequeas de los medios ya publicados.
El nmero creci en proporcin enorme desde entonces,
pero ningn estudio similar se repiti.
Formulacin de los medios de cultivo
Las formulaciones empleadas para los diversos medios
pueden contener tan poco como tres ingredientes (caldo
nutriente de Loefer) hasta 10, como muchos medios para
microorganismos exigentes. El nmero de ingredientes tie-
ne poca relacin con su crecimiento. Un cultivo simple
puede ser complejo y del todo indenido. Una estructura
comn de los medios de cultivo para agentes patgenos
quimiohetertrofos es la siguiente:
Base amina-nitrgeno (peptona, protena hidrolizada, in-
fusin o extracto de protena). Pocos agentes patgenos
pueden utilizar protenas coaguladas; se proporcionan
los derivados predigeridos o cidos hidrolizados. Los
pptidos y aminocidos se pueden transferir dentro de
la clula y usarse como fuentes de carbn para energa
o polimerizacin de las protenas funcionales.
Factores de crecimiento suplementarios (sangre, sue-
ro, extracto de levadura, nucletidos, vitaminas). Los
microorganismos descritos como nutricionalmente exi-
gentes, como Neisseria, Bordetella, Legionella, exigen
factores de crecimiento adicionales. El considerable be-
necio de la sangre entera en estos microorganismos se
atribuy con anterioridad a los factores de crecimiento
agregados. Se considera ahora que el papel principal de
la sangre entera es proteger a los agentes patgenos vul-
nerables de los procesos txicos de la oxidacin.
Fuentes de energa, excepto pptidos (azcares, alco-
holes y carbohidratos complejos). Estas sustancias casi
siempre se agregan a los medios indicadores para realzar
los cambios de pH de los microorganismos que pueden
fermentar la fuente de energa. Los patgenos quimiohe-
tertrofos pueden metabolizar muchas otras molculas
orgnicas para proporcionar energa.
Sales amortiguadoras (fosfatos, acetatos, citratos).
Los amortiguadores suelen agregarse a las formulacio-
nes con grandes cantidades de carbohidratos (p. ej., las
que contienen peptona de soya) para prevenir los cam-
bios excesivos de los niveles de pH. Infortunadamen-
te, muchos amortiguadores tienden a quelar metales
esenciales y deben utilizarse con cautela. Los pptidos
y aminocidos pueden actuar como agentes amortigua-
dores a travs del efecto zwitterion de las agrupaciones
NH
2
/COOH.
Sales minerales y metales (fosfatos, sulfatos, Ca
++
,
Mg
++
, Fe
++
, Mn
++
, metales traza). Estas sustancias pue-
den adicionarse por separado como macrocantidades o
microcantidades en los casos en que son evidentes las
demandas particulares. Es importante que los metales se
hallen en la forma soluble y no formen complejos den-
tro de las formas insolubles durante el procesamiento de
calor. Por lo general se asume que los tejidos de plantas
o animales hidrolizados contienen sucientes minerales
y metales para el crecimiento ptimo.
Agentes selectivos (qumicos, antimicrobianos y algu-
nos colorantes de anilina). Como lo seala su nombre,
estos agentes se agregan en una concentracin sucien-
te para inhibir a los agentes patgenos indeseables, pero
se permite la multiplicacin de microorganismos selec-
cionados. Se requiere un cuidado extremo al determinar
la concentracin ptima en el medio. Todos los agentes
selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies
y es posible que de forma ocasional no supriman a to-
das las especies indeseables. Una regla general es que
cualquier incremento de los nutrimentos en el medio
requiere un aumento del agente selectivo y viceversa.
Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mu-
tua para acentuar o atenuar su selectividad; por ejemplo,
las sales biliares disminuyen la toxicidad de los colo-
rantes. Los agentes selectivos pueden tambin afectarse
por sustancias (p. ej., casi todos los amortiguadores) que
quelan cationes; por ejemplo, ciertos colorantes y sales
biliares pueden volverse ms txicos. Este efecto puede
revertirse con la adicin de cationes (Mg/Ca).
Colorantes indicadores (rojo fenol, rojo neutral, bromo-
cresol morado). Estos colorantes indican cambios en el
valor del pH posteriores a la fermentacin, desaminacin
o descarboxilacin. Los medios de cultivo cromgenos
desarrollados para indicar colonias que producen activi-
dades enzimticas especcas son casi siempre mezclas
de colorantes indicadores. Todos los colorantes requieren
cuidadosa dosicacin para evitar la inhibicin selectiva.
Agentes de gelicacin (agar, gelatina, alginato, gel de
slice). El agar extrado de las especies de algas marinas
MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS Y MEDIOS COMPLEJOS INDEFINIDOS 131
del genero Gelidium es el agente habitual de gelicacin
para el crecimiento de los microorganismos quimiohete-
rtrofos. Aunque la calidad del agar mejor mucho desde
sus comienzos, no puede considerarse un gel polmero
inerte. ste aporta metales, minerales y piruvatos que
pueden inuir en el crecimiento de los microorganismos.
No todos los agares son similares: las diferencias de la
fuente del agaroto y los procesos industriales de extrac-
cin pueden inducir un desempeo signicativamente
diferente en el crecimiento y la difusin del antibitico.
Las ocho categoras de materiales mencionadas cubren ca-
si todas las variaciones de las formulaciones publicadas de
los medios de cultivo. Detalles adicionales sobre estos mate-
riales y su manufactura pueden encontrarse en otras obras.
Enriquecimiento y seleccin en medios lquidos
Los procesos de enriquecimiento y seleccin en medios
lquidos no son mutuamente excluyentes. Por lo general,
el enriquecimiento se describe como un proceso que in-
crementa los nmeros de un agente patgeno desde menos
de 10 clulas hasta cantidades detectables. Los caldos en-
riquecidos pueden contener factores de crecimiento que se
adicionan para reducir la fase de retraso de los nmeros
bajos de microorganismos. Cultivar sangre es el ejemplo
ms comn de dicho proceso de enriquecimiento.
En una poblacin microbiana mezclada, el trmino en-
riquecimiento tambin se utiliza cuando una especie se se-
lecciona para el crecimiento preferencial. Para ello se
emplean formulaciones especcas, incluidos qumicos
selectivos o electivos, y ajustes del pH o una temperatura
favorable de incubacin. En los medios lquidos rara vez
es posible incrementar de manera particular el agente pa-
tgeno deseado y suprimir a los dems microorganismos
presentes. Las dinmicas de crecimiento de cultivos mixtos
de agentes patgenos en caldo son complejas. Los microor-
ganismos indeseables pueden retrasarse por un periodo ini-
cial, pero pueden invadir despus a los agentes de inters.
Aunque los periodos jos de incubacin y subcultivo
suelen determinarse por las horas de trabajo del laborato-
rio, en realidad pueden no ser ideales para la recuperacin
exitosa de agentes patgenos particulares. La funcin ms
importante de los caldos enriquecidos es elevar el nmero
de microorganismos deseados a valores que resulten su-
cientes para un asa del caldo de subcultivo para producir un
nmero cuanticable de colonias reconocibles sobre placas
de agar selectivas. Es probable que 10
4
microorganismos
patgenos/ml en el caldo sea la cifra mnima para la detec-
cin por este mtodo.
Debe recordarse que la funcin de los caldos enrique-
cidos se determina por los resultados del subcultivo para
un medio slido selectivo. La interaccin entre qumicos
selectivos en el caldo y aquellos presentes en la placa de
agar puede inhibirse para nmeros pequeos de agentes
patgenos. El caldo de tetrationato subcultivado con agar
de MacConkey puede registrar nmeros ms grandes de
salmonelas o shigelas respecto de cuando se subcultiva en
agar de desoxicolato-citrato.
En suma, los siguientes factores afectan en grado sig-
nicativo el enriquecimiento exitoso de microorganismos
particulares de medios lquidos: a) la formulacin de los
medios y sus agentes selectivos; b) el tamao del inculo de
los microorganismos deseados; c) los nmeros y la variedad
de los agentes patgenos competidores; d) la presencia/au-
sencia de material orgnico en el caldo; e) la temperatura de
incubacin; f) el periodo anterior al subcultivo; g) la interac-
cin de los componentes de enriquecimiento del caldo con
la placa de agar selectiva usada para el subcultivo.
No es de sorprender que las publicaciones muestren
demasiadas opiniones contrapuestas en relacin con este
asunto, si se considera la complejidad de la posible varia-
cin de los resultados nales.
Medios de cultivo denidos
y medios complejos indenidos
Hasta mediados del siglo xx los microbilogos aceptaron
que los medios de cultivo eran ms bien preparados culi-
narios y no formulaciones cientcas. Casi sin excepcin,
todos los ingredientes empleados eran materiales naturales
variables indenidos. El comportamiento del crecimien-
to vari en grado amplio y esto suscit el deseo de crear
medios sintticos o qumicamente denidos que reprodu-
jeran un comportamiento estndar. Entre 1950 y 1975, los
microbilogos intentaron fusionar aminocidos, nucle-
tidos, vitaminas, minerales y metales seleccionados para
que crecieran agentes quimiohetertrofos al mismo ritmo
y con las mismas caractersticas que en medios indeni-
dos. Las revistas microbiolgicas de ese periodo contenan
cientos de frmulas de medios de cultivo, pero todas ellas
mostraban comportamientos del crecimiento inferiores res-
pecto de los medios indenidos o se limitaban slo a unas
cuantas especies. Ninguna poda recomendarse como un
medio de enriquecimiento general para microbios mdicos.
La dicultad de idear y probar medios denidos, junto con
los decepcionantes resultados obtenidos, propici al nal
una prdida de inters. Un factor fue el reemplazo de los
medios de materia prima preparados en el laboratorio con
productos equivalentes deshidratados preparados de modo
comercial. Los benecios de las mejores especicaciones
de las materias primas, manufacturas controladas a gran
escala y la prueba rigurosa del control de calidad superaron
los principales problemas de variacin del comportamiento
del medio. En fecha ms reciente, los medios preparados
comerciales sustituyeron en gran medida a la preparacin
elaborada con anterioridad en los laboratorios de micro-
biologa.
Aunque resulte paradjico, en 1966 un nuevo medio
de agar sangre indenido apareci bajo el nombre de agar
Columbia. Este agente contena una mezcla precisa de
peptonas de diversas fuentes de protenas, hidrolizadas
por enzimas diferentes, lo cual creaba un amplio espec-
tro de pptidos, desde el aminocido ms grande posible
(peso molecular [PM] = 5 000) hasta el ms simple (PM
= 100). Un gramo de almidn, 5 g de cloruro de sodio y
12 g de agar componan la frmula. El agar Columbia, un
complejo medio indenido, se ha convertido en el medio
de enriquecimiento utilizado de forma ms amplia, en las
formas de caldo y agar, para recuperar una amplia varie-
dad de agentes patgenos exigentes. Esto pareca ser un
triunfo de quienes deseaban reemplazar tales medios con
formulaciones sintticas o denidas.
El dilema de los medios denidos o indenidos no se ha
resuelto todava. Al parecer, los hidrolizados de protena y
los factores de crecimiento son los dos grupos de materiales
que pueden ocasionar ms dicultades. Parecera que las
mezclas de aminocidos no pueden sustituir a una mezcla
compleja de pptidos. Es posible que se requiera una selec-
cin amplia de varios factores de crecimiento para asegurar
la recuperacin de microorganismos atenuados o exigentes.
Es improbable que un medio denido comparable al agar
Columbia pueda desarrollarse o justicarse sobre la rela-
cin costo-benecio.
Factores ambientales de crecimiento
La presencia de nutrimentos esenciales del crecimiento
no garantiza por s misma el desarrollo ptimo de los mi-
croorganismos deseados. Todos los medios de cultivo son
susceptibles a la oxidacin si se exponen a la luz, calor y
aire, es decir, fotooxidacin, termooxidacin y quimiooxi-
dacin. Alguna vez se consider que los procesos de oxida-
cin afectaban en grado menor a los microbios patgenos
quimiohetertrofos aerbicos y anaerbicos facultativos y
slo los anaerobios obligados los padecan. Ahora es evi-
dente que todos, salvo unas pocas especies bien protegidas,
son vulnerables a los efectos de la oxidacin. Los radica-
les txicos de oxgeno (superxido, singletos, hidroxilos)
formados por los electrones capturados adicionales pueden
daar a los cidos nucleicos y las enzimas. Para proteger-
se, los microorganismos producen enzimas protectoras que
pueden neutralizar a estos radicales txicos. Son ejemplos
la catalasa, dismutasa de superxido y peroxidasa. Algu-
nos aminocidos son secuestradores efectivos de oxidantes
txicos. Pueden adicionarse agentes protectores a los
medios de cultivo para el mismo propsito, como sangre
completa, carbn vegetal, piruvato y sales de hierro reduci-
das. Puede ser esencial incluir estos agentes para los agen-
tes patgenos que son en particular vulnerables, por ejem-
plo Neisseria, Bordetella, Campylobacter, Legionella. Los
componentes sulfhidrilo, como tioglucolato y cistena, se
agregan a los medios anaerbicos para reducir el potencial
de oxidacin-reduccin con grupos -SH, que neutralizan a
los agentes txicos oxidantes. Algunos medios se autooxi-
dan en el autoclave, sobre todo los medios que contienen
cistena, glucosa, fosfatos y algunos metales.
Actividad del agua
Los microorganismos tienen agua libre en la cual crecen y
esto se aplica en especial a las placas de agar. El traslado de
nutrimentos a la colonia y la movilizacin del residuo txi-
co desde sta dependen del agua libre presente en el agar.
El agua puede estar ligada o formar complejos con tanta
rmeza con las protenas o polmeros que los microorga-
nismos no pueden utilizarla. El hielo es una forma de agua
ligada y otras se reeren a menudo como cuasi-hielo.
El lmite biolgico de la actividad del agua es de 0.97
(1.00 si es agua pura) a 0.61 (la supercie del pescado seco
salado). Slo los hongos xerlos pueden crecer (con len-
titud) en la cifra ms baja. Los medios lquidos son casi
siempre convenientes para el crecimiento de todos los agen-
tes patgenos, a menos que se adicionen solutos al medio
(cloruro de sodio o glicerina) para atenuar la actividad del
agua y hacerla selectiva para estalococos u hongos.
Las placas de agar recin preparadas tienen concentra-
ciones satisfactorias de agua libre, pero en el almacena-
miento la evaporacin reduce la actividad del agua de la
supercie del agar. Las placas de agar supersecas o de-
masiado almacenadas pueden ser inhibitorias, muestran
colonias pequeas y no pueden recuperar los inculos
atenuados (g. 11-2).
Almacenamiento de los medios de cultivo
Una regla bsica seala que los medios recin preparados
son mejores que los almacenados. Sin embargo, rara vez es
posible preparar medios justo antes de usarse y por tanto
es inevitable alguna forma de almacenamiento. Los me-
dios de cultivo almacenados se deben utilizar estrictamente
por turnos para evitar almacenamientos demasiado largos.
Todos los contenedores de medios deben fecharse y nume-
rarse por lote.
Los medios de cultivo deben almacenarse lejos de la luz
para prevenir la fotooxidacin. Todos los medios lquidos se
almacenan en frascos o tubos cerrados, de preferencia con
tapones de rosca, a 2 a 8C, excepto el caldo de tioglucola-
to, que se preserva mejor a 15 a 22C. Los medios lquidos,
sin antibiticos u otros ingredientes lbiles, pueden almace-
narse por muchas semanas en el fro y lejos de la luz.
Las placas vertidas deben almacenarse a 2 a 8C, em-
paquetadas en pelcula de plstico adherente. sta es pre-
ferible a las bolsas de polietileno que retienen la humedad
en la forma de acumulaciones de lquido en cada bolsa.
La vida til en estantera de las placas preparadas depende
de la formulacin y las condiciones de almacenamiento y
transporte al laboratorio. Con placas empaquetadas en pe-
lculas semipermeables y almacenadas en cajas de polies-
tireno expandido en la temperatura correcta, la vida til de
estantera puede ser de muchos meses. No deben conser-
varse o usarse las placas tras ese lapso. Una inspeccin til
consiste en medir la prdida de agua durante el almacena-
miento. Una prdida de peso de 5% sugiere que las placas
alcanzaron un estado terminal.
Pruebas de calidad
La mayor parte de los laboratorios microbiolgicos adquie-
re medios de cultivo en formas deshidratadas o preparadas.
La responsabilidad de la prueba de calidad ha recado en
los fabricantes y stos deben proporcionar los detalles de
su protocolo y resultados de prueba a los compradores indi-
viduales. No obstante, debe advertirse que estas pruebas se
han llevado a cabo en medios de cultivo recin elaborados
y que el tiempo de almacenamiento, antes y despus de la
entrega, puede reducir la calidad del medio.
El aumento del uso de los medios preparados ha prote-
gido a los medios de cultivo con agar de los efectos oxi-
dativos complejos e impredecibles de la esterilizacin por
autoclave de los medios de cultivo insolubles. El descenso
de los valores del pH y el oscurecimiento del color indican
sobrecalentamiento, que da lugar a que se formen comple-
jos de carbohidrato-pptido.
Cuando se prueban medios de cultivo comprados deben
ser sucientes tres cepas seleccionadas de microorganismos
apropiados. Pueden adquirirse cepas estndar de microor-
ganismos patgenos y es preciso realizar una valoracin
cuantitativa. Los medios selectivos deben probarse para la
inhibicin de microorganismos indeseables, al igual que
para el enriquecimiento de cepas seleccionadas.
Si se elige un nuevo proveedor o se rm un gran con-
trato, entonces puede ser apropiada una prueba ms extensa
mediante un control de medios inoculados en paralelo. Se
utilizan inculos pequeos e incluso algunos agentes pat-
genos atenuados en la prueba. Snell y colaboradores (1991)
proporcionan ms informacin sobre este tema.
La recuperacin de microorganismos atenuados en la
prueba del control de medios de cultivo se estudia cada
vez ms. Los aislados microbiolgicos clnicos estn con
frecuencia atenuados puesto que son agentes patgenos
aislados de alimentos calentados o procesados. Los micro-
organismos muy atenuados, viables pero no cultivables,
representan una forma extrema de atenuacin. Stephens y
colegas (1997) usaron Salmonella atenuada de laboratorio
y mostraron que la recuperacin de estos agentes patge-
nos variaba entre la misma formulacin de medios de cul-
tivo de diferentes fabricantes. Este trabajo demostr una
PRUEBAS DE CALIDAD 133
Figura 11-2 Efecto de la prdida de agua en las placas de agar. a) Reduccin del tamao de las colonias superciales. b) Cambios en
la forma de las colonias sumergidas, de esfrica a lenticular.
Colonias pequeas
Colonias grandes
Gel de gran fuerza
Gel de baja fuerza
Colonias lenticulares Colonias esfricas
distribucin muy amplia de tiempos de retraso entre las di-
ferentes marcas del mismo medio cuando se utiliz un solo
inculo de clulas, con algunos tiempos de retraso de ms
de 20 horas. En el pasado, los fabricantes de medios emplea-
ban una mezcla de aislados clnicos y cepas NCTC/ATCC
estndar de microorganismos para probar lotes de medios
de cultivo. El uso de aislados clnicos se ha suspendido en
la industria y slo las cepas estndar de agentes patgenos
son de uso general. Estos microorganismos no se atenan
cuando se reconstituyen de forma apropiada y pueden ocul-
tar deciencias en los lotes de medios de cultivo. El uso de
cepas estndar, atenuadas en el laboratorio por la exposi-
cin a temperaturas altas o bajas, se investiga cada vez ms
y podran reemplazar la prdida de aislados clnicos.
El futuro de los medios de cultivo
La placa de agar de Koch, que es barata, simple y muy
verstil, es un amplicador muy poderoso de inculos pe-
queos. Si la preparacin es apropiada, crecen todos los
microorganismos esperados y muchos insospechados de
las muestras. Los dispositivos modernos de diagnstico
que tal vez sustituyan a la microbiologa convencional son
costosos, complicados y muy especcos. Es probable que
la microbiologa convencional no se modique demasiado
en este siglo.
Indudablemente, se dispondr de mejoras metodolgi-
cas, como el marcado semiautomtico, la inoculacin y
sealizacin con tecnologa de pelcula mediante micros-
copia lser confocal para la deteccin temprana del cre-
cimiento y los marcadores de identicacin incorporados
para la actividad especca enzimtica. Se observar una
mejor recuperacin de los agentes patgenos daados en la
fase de retraso de crecimiento. Estos procedimientos me-
jorados de recuperacin han de despejar las dudas sobre
algunas teoras de esterilizacin cinticas existentes y re-
solvern algunos de los misterios que rodean a los micro-
organismos viables pero no cultivables. El viejo axioma
bacteriolgico lo que no crece, no existe desaparecer.
Es improbable que la microbiologa se lleve a cabo por au-
tomatizacin, de modo similar a la bioqumica o la hemato-
loga. Gran parte de la actividad en microbiologa consiste
en igualar imgenes de colonias o campos del microscopio
con el banco de datos que contiene la cabeza del microbi-
logo. El cerebro humano es increblemente mejor en ese
quehacer que cualquier computadora.
Microbiologa cuntica
Las grandes poblaciones de microbios se adecuan a las
reglas taxonmicas, pero las clulas individuales exhiben
incertidumbres causadas por la mutacin y adaptacin a los
ambientes locales. Tales clulas representan variantes que
pueden convertirse en los ancestros de la siguiente pobla-
cin seleccionada. Las mutaciones son procesos cunticos
en los que intervienen molculas que son impelidas sobre
una barrera de energa desde una conguracin estable a
otra diferente. Las sustancias qumicas complejas siguen
las leyes de la mecnica cuntica y la ciencia de las clulas
microbianas individuales se puede llamar microbiologa
cuntica. Existe una analoga entre la fsica clsica/me-
cnica cuntica y la microbiologa clsica/microbiologa
cuntica. Ahora se necesita un sistema para estudiar las
clulas individuales.
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Introduccin
La identicacin de bacterias en poco tiempo y con exac-
titud es una capacidad que requiere muchos aos de expe-
riencia en el laboratorio. El propsito de este captulo es
describir la tcnica que adoptaron los laboratorios clnicos
britnicos para reconocer bacterias comunes de importan-
cia mdica. Se pretende que el lector adquiera una visin
bsica del proceso y sea capaz de consultar los excelentes
textos detallados con ms seguridad.
Las bacterias pueden identicarse de modo directo en
las muestras de los pacientes o, ms a menudo, en el creci-
miento posterior de los microorganismos en cultivos. Aun-
que se consideran por separado, estos dos mtodos pueden
combinarse.
Identicacin directa
Microscopia
Las bacterias pueden visualizarse en muestras clnicas
mediante microscopia y uso de colorantes; aunque es til,
proceder de esta manera rara vez permite la identicacin
completa. En la actualidad, la tincin de Gram es el pro-
cedimiento diferencial ms utilizado en los laboratorios de
bacteriologa clnica. Existen muchas modicaciones, pero
el principio es el mismo. Se aplica una solucin de violeta
de metilo seguida por una solucin de yodo a una prepa-
racin de bacterias jada por calor en un portaobjetos del
microscopio. Despus de lavarse, la preparacin se expone
a un decolorante (alcohol o acetona) por algunos segundos,
antes de que se aplique una contratincin roja (p. ej., safra-
nina). Las bacterias grampositivas no se decoloran con alco-
hol o acetona y se tien de prpura. Las bacterias gramne-
gativas se decoloran y permiten que las clulas adquieran la
contratincin roja. Esta reaccin depende de las diferencias
estructurales de la pared celular entre las bacterias gram-
positivas y gramnegativas. Tambin se tienen en cuenta el
tamao y la forma de las bacterias: redondas (cocos) o en
bastones (bacilos).
Sin embargo, muchas bacterias se tien mal o no lo hacen
en absoluto con la tincin de Gram, por ejemplo, las mico-
bacterias como Mycobacterium tuberculosis que requieren
tinciones acidorresistentes, como la tincin de Ziehl-
Neelsen. Estas tinciones se basan en el principio de que
ciertas bacterias, despus de teirse con soluciones calientes
de carbol fucsina, pueden resistir la accin decolorante del
cido clorhdrico y el alcohol. Las modicaciones de estas
tinciones permiten visualizar otras bacterias, por ejemplo las
especies de Nocardia.
En el pasado se usaron tinciones con anticuerpos uo-
rescentes para detectar bacterias especcas, como Legio-
nella, pero hoy da el desempeo deciente imposibilita su
uso en la bacteriologa regular.
Deteccin de anticuerpos y antgenos
Estas pruebas son tiles para las bacterias que no se culti-
van de rutina en medios slidos, como las espiroquetas, y
los agentes patgenos intracelulares obligados Rickettsia,
Coxiella y Chlamydia. Las infecciones consecutivas a estos
gneros se diagnostican casi siempre por la deteccin del an-
ticuerpo en el suero (serologa) o, en el caso de la infeccin
genital por Chlamydia, por la identicacin del antgeno.
12
Identicacin de bacterias
Andrew J Hay
136 CAP. 12 IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
La deteccin del antgeno puede usarse para el diagnstico
rpido de infecciones bacterianas graves, como en los casos
de meningitis; los antgenos bacterianos en el lquido cefa-
lorraqudeo pueden reconocerse con la aglutinacin en ltex.
Una variacin es la deteccin de un producto bacteriano,
por ejemplo, el uso de un inmunoensayo enzimtico para
identicar la toxina de Clostridium difcile en las heces, un
causante de la diarrea relacionada con antibiticos.
Mtodos moleculares
Desde la ltima edicin de este libro se han observado pro-
gresos importantes en el campo de la bacteriologa mole-
cular diagnstica. Aunque es verdad que algunas de estas
tcnicas experimentan la transicin de un laboratorio de
investigacin y referencia a uno de bacteriologa clnica, el
crecimiento del nmero de reactivos de prueba disponibles
en el comercio representa una posibilidad distinta para el
futuro prximo, en particular si el costo relativamente alto
de estos mtodos moleculares puede reducirse. Algunos
ejemplos se proporcionan ms adelante.
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y las
sondas gnicas han sido satisfactorias en la identicacin
rpida de Mycobacterium tuberculosis en muestras clnicas.
Los mtodos convencionales toman varias semanas para
identicar a este agente patgeno de lento crecimiento. De
forma similar, las pruebas de amplicacin de los cidos
nucleicos, como PCR o reaccin en cadena de la ligasa, se
recomiendan para el diagnstico de la infeccin genital por
Chlamydia trachomatis. En muestras de heces, la PCR se
utiliza para reconocer genes que codican a las verotoxinas
de Escherichia coli, como E. coli O157. La deteccin simul-
tnea del DNA de Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae y Haemophilus inuenzae en el lquido cefalo-
raqudeo o sangre completa por PCR mltiple se ha conver-
tido en un procedimiento invaluable en el diagnstico rpido
de la meningitis bacteriana. Tambin se han desarrollado
sistemas comerciales para la deteccin rpida (menos de tres
horas) de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y
especies de Enterococcus resistentes a la vancomicina me-
diante PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Mannheim,
Alemania). Estos mtodos deben permitir el inicio temprano
de la quimioterapia antimicrobiana efectiva y las precaucio-
nes de control de la infeccin, con lo cual se mejoran los
resultados clnicos. En otros captulos se discuten de modo
ms detallado los mismos mtodos.
Identicacin despus del cultivo
Cultivo puro
El primer paso en la identicacin de una bacteria consiste
en establecer un cultivo puro. Esto no siempre es posible y
conduce a demorar informes o suministrar resultados enga-
osos de laboratorio.
El material clnico debe colocarse en medios primarios
de aislamiento, de tal manera que buena parte del crecimien-
to consista en colonias bien aisladas (g. 12-1). Las colonias
obtenidas deben examinarse de manera cuidadosa con una
lente de mano y buena iluminacin, y las colonias aisladas
se seleccionan y transeren para la investigacin a un medio
no selectivo mediante un alambre recto y mano rme. Si este
proceso falla para proporcionar un crecimiento adecuado de
un cultivo puro, debe repetirse. Acortar el proceso en esta
etapa retrasa la identicacin, se desperdician reactivos y
tal vez se produzcan resultados engaosos; esto es frustran-
te para el bacterilogo y el clnico y supone un tratamiento
potencialmente incorrecto para el paciente.
Debe observarse que en esta etapa se utiliza un medio
no selectivo, ya que los medios primarios de aislamiento
selectivos o inhibitorios intereren a menudo con las tcni-
cas de identicacin bioqumicas y otras subsiguientes.
El arte de la identicacin
Cuando se analiza una placa de aislamiento primario que
contiene hasta una docena de agentes patgenos o especies
diferentes de bacterias comensales, y se sabe adems que
casi cualquier bacteria puede ocasionar la enfermedad, el
bacterilogo principiante puede desesperarse ante el apre-
mio de proporcionar un informe signicativo. Sin embargo,
la experiencia en examinar estas placas, combinada con el
conocimiento del sitio muestreado, el cuadro clnico, los
probables agentes patgenos y la ora comensal, suministra
una idea razonablemente exacta de los microorganismos que
requieren identicacin y pruebas de sensibilidad. Este en-
foque permite al bacterilogo elegir las pruebas que pueden
conducir a la identicacin rpida del agente patgeno.
Si lo anterior no puede conrmar al agente causal ms
probable, el investigador debe actuar con mente abierta y
ampliar las investigaciones. Esta conducta, que se conoce
como el mtodo progresivo, requiere el establecimiento de
algunas caractersticas fundamentales del microorganismo
y, a partir de stas, los grupos subsecuentes de pruebas se
eligen hasta identicar al agente patgeno.
Por ltimo, si todo lo anterior falla, puede adoptarse el
mtodo del trabuco, en el cual se realiza cada prueba y se
compara con las descritas en textos de bacteriologa. Rara
vez es necesario, pero se requiere para vericar, por ejem-
plo, una nueva especie.
Identicacin preliminar
La capacidad de las bacterias para crecer bajo condiciones
aerobias o anaerobias, sus requerimientos de crecimiento,
IDENTIFICACIN DESPUS DEL CULTIVO 137
morfologa de la colonia, efecto sobre el medio (p. ej., he-
mlisis en agar-sangre), motilidad en medio lquido, ca-
pacidad para formar esporas, y aspecto y reaccin en la
tincin de Gram permiten efectuar una identicacin pre-
liminar. El uso subsiguiente de algunas pruebas simples y
rpidas indica entonces qu tcnicas adicionales (si acaso)
se requieren para concluir la identicacin.
Despus de la tincin de Gram: la caja
de herramientas de los bacterilogos
Como un artesano, el bacterilogo experto selecciona las
herramientas requeridas para completar la identicacin
basada en los resultados de la morfologa de las colonias
y la tincin de Gram. Estas pruebas pueden agruparse en
amplias categoras, que se enumeran a continuacin. Pue-
den realizarse de forma secuencial o simultnea, segn sea
el microorganismo a identicar. Deben controlarse con
cuidado cada vez que se realizan, por ejemplo mediante
cepas testigo y reacciones conocidas.
Deteccin de enzimas
La capacidad de una bacteria para producir una enzima se
demuestra al exponerla a un sustrato y detectar el producto
resultante. Las pruebas comunes son las siguientes:
1. Prueba de la catalasa. Los microorganismos que pro-
ducen catalasa, cuando se exponen al perxido de hi-
drgeno, producen burbujas visibles en un plazo de 30
segundos. Esta prueba puede ayudar a distinguir a los
estalococos, que son positivos a la catalasa, de los es-
treptococos, que son negativos.
2. Prueba de la oxidasa. Esta prueba investiga la presencia
de la oxidasa de citocromo. Las bacterias positivas a la
oxidasa, como Pseudomonas, pueden oxidar el reactivo
Figura 12-1 Forma de establecer un cultivo puro.
El material clnico se aplica en
un tercio de la placa con agar
Depsito del inculo
Se amea
el asa
Asa de
alambre
El material se extiende hacia
fuera desde el depsito del
inculo. La placa se incuba
Se amea
el asa
Se amea
el asa
Despus de la incubacin se elige
una sola colonia bien aislada me-
diante un alambre recto a partir
del crecimiento mezclado
Se transere la colonia a una
placa no selectiva capaz de
mantener el crecimiento
El microorganismo se extiende
hacia fuera como en (b). La placa
se incuba
Se obtiene un cultivo puro
diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina para preci-
pitar un cambio de color. Enterobacteriaceae son negati-
vos a la oxidasa.
3. Prueba de la ureasa. Ciertas especies producen una en-
zima potente que degrada la urea hasta amoniaco; este
ltimo se puede detectar por un cambio de color con un
indicador de pH incorporado en el medio de crecimien-
to. Esta prueba ayuda a diferenciar Proteus mirabilis,
positivo a la ureasa, un comensal del intestino, de Sal-
monella spp. y Shigella spp., agentes patgenos intesti-
nales importantes que son negativos.
4. Prueba de la coagulasa. Staphylococcus aureus posee
una enzima que coagula al plasma in vitro. Otros esta-
lococos son negativos.
Esta lista no es exhaustiva. Existen muchas otras pruebas,
que a menudo son incorporadas en reactivos comercia-
les.
Deteccin del antgeno
La deteccin de antgenos celulares por antisueros espec-
cos se utiliza con amplitud en bacteriologa para determi-
nar la especie y el tipo de microorganismos. Dos ejemplos
son los siguientes:
1. Clasicacin de Lanceeld. Un antgeno del grupo de
la pared celular se extrae a partir de los estreptococos
hemolticos beta por una enzima. El antgeno se detecta
entonces por la aglutinacin con el antisuero unido a las
partculas del ltex.
2. Tipicacin O y H. Los antgenos de la pared ce-
lular (O) y antgenos agelares (H) se reconocen en
bacilos gramnegativos como Salmonella, tras mezclar
suspensiones de microorganismos con antisuero espe-
cco sobre un portaobjetos o un tubo de ensayo. Una
reaccin positiva se observa por la aglomeracin de los
microorganismos.
Metabolismo de los carbohidratos
La capacidad de un microorganismo para utilizar ciertos
azcares como glucosa, sea por oxidacin (aerobio) o fer-
mentacin (independiente del oxgeno), u otros carbohidra-
tos, como almidn, es casi siempre una caracterstica til en
la identicacin. La prueba requiere un medio denido que
contenga al carbohidrato y un sistema de deteccin para el
producto metablico, a menudo un indicador de pH.
La utilizacin del azcar puede incorporarse en medios
primarios de aislamiento, como agar de MacConkey, que
distingue Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa de
Enterobacteriaceae que no la fermentan, y agar de tiosul-
fato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS), que reconoce a Vibrio
cholerae que fermenta la sacarosa de otras especies. Otras
pruebas detectan la capacidad del agente patgeno para
utilizar un carbohidrato como fuente nica de carbn, por
ejemplo, la utilizacin del citrato. Los paneles de carbohi-
dratos pueden probarse de forma conveniente y simultnea
con reactivos comerciales.
Factores de crecimiento
El requerimiento absoluto de compuestos denidos para el
crecimiento bacteriano en un medio particular se utiliza
como herramienta para la identicacin; as, las especies
de Haemophilus dieren en sus requerimientos por dos
factores presentes en la sangre, X (hematina) y V (nucle-
tido de difosfopiridina), para el crecimiento en agar nutriti-
vo. Slo Haemophilus inuenzae, el agente patgeno ms
importante del gnero, requiere de ambos.
Metabolismo de protenas
Se somete a prueba la capacidad de una especie bacteriana
para metabolizar una protena o un aminocido a un pro-
ducto denido. Los sistemas de deteccin para el producto
y la necesidad de un medio especco son similares a los
requeridos para la utilizacin del carbohidrato. Es el caso
de diversas especies de Enterobacteriaceae que divergen en
su capacidad para lo siguiente: a) licuefaccin de la gela-
tina; b) descarboxilacin o desaminacin de aminocidos;
c) produccin de cido sulfhdrico a partir de aminocidos
que contienen azufre, y d) elaboracin de indol a partir de
triptfano. Estas pruebas se realizan a menudo con produc-
tos comerciales.
Pruebas de susceptibilidad
La susceptibilidad de una especie a un compuesto se puede
utilizar no slo para precisar el tratamiento con antibiti-
cos, sino tambin para contribuir a la identicacin. Dos
ejemplos de uso general son representativos, ambos proba-
dos mediante la colocacin de un disco de papel ltro, que
contiene el compuesto, sobre una placa de cultivo; la mues-
tra se incuba y despus se observa una zona de inhibicin.
1. Prueba con optocina. Streptococcus pneumoniae es
sensible a la optocina (clorhidrato de etilhidrocuprena).
Otros estreptococos similares en agar-sangre son resis-
tentes.
2. Sensibilidad al metronidazol. Los anaerobios verdade-
ros casi siempre son sensibles a este antibitico. Los
aerobios que pueden crecer de forma anaerobia son in-
variablemente resistentes.
Produccin de toxinas
Esta importante caracterstica puede ayudar a diferenciar
las especies patgenas de las que no lo son. Ejemplos:
1. Prueba de Elek. Esta prueba se utiliza para diferenciar
cepas de Corynebacterium diphtheriae productoras de
toxinas (por lo tanto patgenas), que causan la difteria,
de especies no patgenas. Se coloca una tira del papel l-
tro que contiene la antitoxina de la difteria sobre un medio
denido. El microorganismo se extiende sobre el agar de
forma perpendicular a la tira. Despus de la incubacin
pueden verse las lneas precipitantes que representan al
complejo antgeno (toxina)-anticuerpo (antitoxina).
2. Citotoxina. Se puede detectar una citotoxina que produ-
cen las cepas de Clostridium difcile relacionadas con
diarrea y antibiticos por la neutralizacin de la anti-
toxina en un cultivo celular.
Sistemas de identicacin comercial
El desarrollo de los sistemas comerciales para la identica-
cin rpida de bacterias patgenas ha simplicado en gran
medida la vida del bacterilogo clnico. Antes de su intro-
duccin, cada prueba bioqumica tena que prepararse de
modo individual en un tubo de ensayo o botella de cristal,
lo que conduca a la exhibicin de una impresionante cris-
talera de laboratorio. Los sistemas comerciales permiten
que muchas pruebas bioqumicas se realicen de manera si-
multnea a partir de un cultivo puro. El patrn obtenido de
los resultados de la prueba se compara entonces con los pa-
trones derivados de bacterias conocidas conservadas en un
banco de datos automatizado. Las pruebas estadsticas se
utilizan para determinar la identidad probable del aislado
clnico. El banco de datos tambin puede sugerir pruebas
adicionales si la identicacin es dudosa. Los sistemas de
uso general en el Reino Unido son los sistemas API y Vitek,
ambos comercializados por Bio Merieux (Bio Merieux UK
Ltd, Basingstoke, England), BD Phoenix (BD Diagnostic
Systems Europe, Le Pont de Claix, France) y Mastascan
elite (Mast Group Ltd, Bootle, Merseyside, UK).
1. Sistema de identicacin API (appareils et precedes
didentication). Este sistema consiste en cpulas de
plstico que contienen diversos sustratos y productos
qumicos indicadores jados a una tira plstica. Cada
cpula comprende una prueba bioqumica diferente. La
adicin de un inculo estndar del agente patgeno de
prueba a cada cpula en la tira, despus de la incuba-
cin, precipita una serie de cambios de color que puede
advertirse a simple vista. El patrn de los resultados ob-
tenidos puede interpretarse con facilidad al compararlo
con el banco de datos. Se dispone de tiras modicadas
para la identicacin de estalococos, estreptococos,
bacterias coriniformes, Enterobacteriaceae, anaerobios
y bacterias gramnegativas que no fermentan.
2. Sistemas Vitek y BD Phoenix. Estos sistemas se basan en
principios similares. Las pruebas bioqumicas se realizan
de manera simultnea en celdillas insertadas en una tar-
jeta plstica (Vitek) o tira (BD Phoenix). Las celdillas se
llenan con la suspensin bacteriana mediante aspiracin
por vaco (Vitek) o vaciamiento (BD Phoenix). Despus
de la incubacin, un lector modicado controlado por
computadora analiza las tarjetas y los sistemas automati-
zados interpretan los resultados. Se produce una gama de
tarjetas para identicar bacterias comunes de importancia
mdica, a menudo en un plazo de cuatro a seis horas. Las
ventajas de estos sistemas incluyen la capacidad de reali-
zar la prueba de susceptibilidad antibitica, la semiauto-
matizacin que requiere poco tiempo del operador y un
sistema incluido para mayor seguridad del laboratorio.
3. lite de Mastascan. Este sistema emplea la inoculacin de
puntos mltiples en medios de identicacin con cajas
de Petri. Despus de la incubacin, las placas se exponen a
un lector que analiza e interpreta de manera automtica
las pruebas de identicacin incorporadas en los medios
de prueba. El sistema tambin permite la comprobacin de
la susceptibilidad antibitica y la inoculacin directa de las
placas con muestras de orina, de tal modo que se elimi-
na la necesidad del cultivo primario de orina.
Todos los sistemas requieren un apego estricto a las ins-
trucciones del fabricante para prevenir errores. La omisin
de comenzar con un cultivo puro es una fuente comn de
error que puede evitarse si se inocula una placa para puri-
car la tarjeta o la tira mediante la suspensin de inoculacin
usada. Si la placa muestra un crecimiento inconsistente, las
pruebas se repiten. Los bacterilogos inexpertos aceptan a
menudo los resultados de estos sistemas sin objecin, sin
importar qu tan improbables pueden ser en clnica. Los
trabajadores experimentados interpretan los resultados en
su contexto clnico y conrman o repiten identicaciones
improbables o inusuales.
Nuevos desarrollos
Tcnicas moleculares
Como ya se explic, los mtodos moleculares son ti-
les para reconocer los agentes patgenos que crecen con
IDENTIFICACIN DESPUS DEL CULTIVO 139
lentitud y los incultivables en muestras clnicas. Adems,
se han adoptado estos mtodos para la tipicacin de bac-
terias por laboratorios de investigacin y de referencia o
bien para la caracterizacin de nuevas especies.
Es en particular apasionante el desarrollo de la tecno-
loga de DNA con chip, como los microensayos de DNA,
en los cuales se producen los millares de oligonucletidos
localizados en un soporte slido (chip). Tienen aplicacin
para secuenciar productos de la PCR. Asimismo, estn
disponibles los chips bioelectrnicos que utilizan campos
elctricos para mover muestras hacia las diferentes reas
analticas; visto de cierto modo, se trata de un laboratorio
en un chip. Para una discusin adicional, vase Nolte y
Caliendo (2003).
Espectrometra de masas
Los avances en las tcnicas de espectrometra de masas
han estimulado su aplicacin al campo de la identicacin
bacteriana. Por ejemplo, la espectrometra de masas con
ionizacin por desorcin de lser asistida por matriz en
tiempo de vuelo de microorganismos intactos ha demos-
trado la produccin de impresiones digitales espectrales
caractersticas de la masa que permiten la identicacin en
el lapso de minutos despus de remover una colonia de una
placa de cultivo. Aunque slo el tiempo establecer si esta
tcnica se ha de incorporar al laboratorio clnico comn,
representa sin duda un desarrollo interesante.
Identicacin de bacterias
de importancia mdica
La siguiente es una breve introduccin a la identicacin
de bacterias de relevancia mdica. Para mayor informa-
cin, vanse las Lecturas adicionales.
Cocos grampositivos
La capacidad de un coco grampositivo de producir catalasa
es una prueba rpida y til que diferencia gneros positivos
a la catalasa, como Staphylococcus y Micrococcus, de los
gneros negativos, como Streptococcus y Enterococcus. La
identicacin siguiente se relaciona con la gura 12-2.
Figura 12-2 Identicacin de cocos aerobios grampositivos de relevancia mdica.
Staphylococcus
Micrococcus
Crecen de
forma anae-
rbica
Positiva
Negativa
Hemlisis
en agar-sangre
Ninguna
S
Hidrlisis
de la esculina
Tolerancia de 40%
a sales biliares
Micrococos
Positiva
N e geea tiv ii e Negativa
Staphylococcus
aureus
Prueba
de la
coagulasa
Estafilococos
coagulosa
negativos
Reactivo
comercial
Grupo de
Lancefield
Sensible a
la optocina
Soluble en
sales biliares
S
No
S
No
Reactivo
comercial
Cocos aerobios grampositivos

Prueba de la
catalasa
Strep. pneumoniae
Enterococcus
Streptococcus
viridans
Grupo A = Streptococcus
pyogenes
Grupo B = Streptococcus
agalactiae
Grupo C = Streptococcus
Grupo G = Streptococcus
Especies
individuales
Especies
individuales
Streptococcus
Enterococcus
Staphylococcus y Micrococcus
Estos gneros positivos a la catalasa producen de modo ca-
racterstico clulas dispuestas en racimos cuando crecen en
medio lquido. Los estalococos se pueden diferenciar de
los micrococos por su capacidad para crecer bajo condicio-
nes anaerobias.
Staphylococcus aureus, una causa comn de infeccin
de la piel, las heridas y el pulmn, se puede diferenciar de
otros estalococos comensales de la piel por su capacidad
para coagular el plasma y producir la enzima termoestable
DNAasa. La actividad de la coagulasa se reconoce en po-
cas horas, lo que proporciona una identicacin rpida y
conable. Las cepas de estalococos negativas a la coagu-
lasa pueden clasicarse de acuerdo con su especie median-
te reactivos comerciales.
Streptococcus y Enterococcus
En medio lquido estos gneros negativos a la catalasa pro-
ducen clulas dispuestas en pares o cadenas. En agar-sangre
producen colonias con un dimetro de 0.1 a 1.0 mm despus
de 24 horas de incubacin y el tipo de hemlisis observada
alrededor de las colonias suministra una clasicacin inicial
de utilidad.
Los estreptococos hemolticos beta se demuestran mejor
en los cultivos con crecimiento anaerobio. Las cepas que
producen aclaramiento completo del medio de crecimien-
to que contiene sangre alrededor de la colonia (hemlisis
beta) incluyen varias especies patgenas importantes que
se diferencian por la clasicacin de Lanceeld. Esto pue-
de realizarse por las pruebas comerciales en menos de una
hora. Por lo general, lo anterior es suciente para completar
la identicacin, aunque los reactivos bioqumicos comer-
ciales de la prueba se pueden utilizar en casos de duda.
Los estreptococos hemolticos alfa producen hemli-
sis parcial (hemlisis alfa), una decoloracin verdosa del
medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la
colonia. La especie patgena ms importante es el neu-
mococo, Streptococcus pneumoniae. ste se diferencia de
la otra especie hemoltica alfa por el aspecto de su colonia
(colonias delineadoras), sensibilidad a la optocina y solu-
bilidad de sus colonias en una solucin de sales biliares.
Otras especies hemolticas alfa se encuentran como co-
mensales en las vas respiratorias superiores, pero pueden
causar de modo ocasional sepsis grave, como la endocar-
ditis bacteriana subcutnea. Pueden clasicarse de acuerdo
con su especie mediante reactivos comerciales.
De manera caracterstica, los enterococos no son hemo-
lticos en agar-sangre, aunque las cepas individuales pueden
mostrar hemlisis alfa o beta. Los enterococos, al contrario
de la mayor parte de los estreptococos, pueden crecer en
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MDICA 141
un medio que contiene 40% de bilis y pueden hidrolizar la
esculina; estas propiedades se utilizan para identicarlos en
el laboratorio clnico. Poseen a menudo el antgeno grupo
D de Lanceeld y pueden clasicarse de acuerdo con su
especie, si se requiere, con reactivos comerciales.
Bacilos grampositivos
Los gneros de relevancia mdica se identican de mane-
ra inicial por el aspecto de sus colonias, capacidad para
formar esporas y necesidad de condiciones de crecimiento
aerobias o anaerobias (g. 12-3).
Bacillus y Clostridium
Estos gneros formadores de esporas pueden diferenciarse
por la catalasa y las condiciones requeridas para el creci-
miento. Las especies de Clostridium, negativas a la catala-
sa, incluyen anaerobios estrictos. Los bacilos son positivos
a la catalasa y todos crecen de forma aerbica. Clostridium
perfringens, la causa de la gangrena gaseosa, se puede
identicar de manera preliminar por la prueba de Nagler,
que detecta una enzima especca, la lecitinasa, que pro-
duce esta especie. Ambos gneros pueden clasicarse de
acuerdo con su especie con pruebas bioqumicas.
Listeria y Corynebacterium
Estos gneros aerobios, no formadores de esporas, pueden
confundirse con cualquier otro en medios de aislamiento
primario. Listeria monocytogenes, un causante de sepsis
y meningoencefalitis, muestra motilidad en volteretas
caracterstica en caldo de cultivo a temperatura ambiente,
pero no a 37C, puede hidrolizar la esculina y es a me-
nudo hemoltica beta en agar-sangre. Corynebacteria spp.
comprende comensales de la piel, patgenos oportunistas
y varios microorganismos de importancia. Pocas especies
son hemolticas beta. El agente patgeno ms importante
es Corynebacterium diphtheriae, que puede aislarse a par-
tir de escobillados de la garganta en medios selectivos que
contienen telurito. Las cepas toxgenas se identican con
la prueba de Elek.
Cocos gramnegativos
Existen tres agentes patgenos humanos importantes en
este grupo: Neisseria gonorrhoeae (el gonococo), que pro-
voca la gonorrea; Neisseria meningitidis (el meningococo),
un causante de septicemia y meningitis, y Moraxella cata-
rrhalis, un factor de infecciones respiratorias y oculares.
Figura 12-3 Identicacin preliminar de bacilos grampositivos de importancia mdica.
Deben distinguirse entre s y de otras especies que son co-
mensales humanos comunes mediante las caractersticas
de crecimiento y pruebas bioqumicas (cuadro 12-1). Son
positivos a la oxidasa y catalasa.
Bacilos aerobios gramnegativos
Requerimientos simples para el crecimiento
Los sistemas comerciales simplicaron en gran media la
identicacin de este grupo; empero, todava se requieren
algunas pruebas simples para el examen externo de la ora
comensal de agentes patgenos potenciales y la eleccin de
la tarjeta o la tira correcta de la prueba (g. 12-4). La prue-
ba de la oxidasa es una investigacin preliminar til que
toma apenas algunos segundos. Los gneros negativos a
la oxidasa abarcan muchas especies que son comensales y
patgenas del tracto gastrointestinal (Enterobacteriaceae).
La fermentacin de la lactosa se observa casi siempre en
el agar de MacConkey que apoya el crecimiento de estos
microorganismos en el aislamiento primario. Los no fer-
mentadores de la lactosa pueden examinarse mediante la
Cuadro 12-1 Identicacin de cocos aerobios gramnegativos de importancia mdica
Neisseria Neisseria Especies comensales Moraxella
gonorrhoeae meningitidis de Neisseria catarrhalis
cido de*
Glucosa v
Maltosa v
Lactosa v
Sacarosa v
Crece en agar nutritivo v
Tributirina**
DNAasa
v variable, segn sea la especie.
* prueba realizada en medio libre de suero.
** detecta la capacidad de la bacteria para descomponer el tributirato de glicerilo.
Positiva
Positiva
Reaccin
de Nagler
Pruebas
bioqumicas
Reactivos
comerciales
Negativa
Negativo
S
S
S
No
Forma
esporas
Crece de
forma aerbica
Crece de
forma aerbica
Produccin de
catalasa
No
No
Pruebas
bioqumicas
Prueba de la
toxina
Bacillus
Clostridium
Corynebacterium
Listeria
monocytogenes
Corynebacterium
diphtheriae
Clostridium
perfringes
Especies de
Actinomyces
Filamentos
ramificados
Hidrlisis de
la esculina
Motilidad a temperatura
ambiente
Bacilos grampositivos
Coriniformes
Otras especies
Especies
individuales
prueba de la ureasa o con un reactivo comercial para la
presencia posible de Salmonella y Shigella, que luego se
conrma con ms pruebas bioqumicas y de aglutinacin
O (Salmonella y Shigella) y H (slo Salmonella). Los
gneros positivos a la oxidasa pueden diferenciarse: aque-
llos que fermenten azcares, como Vibrio y Aeromonas, y
los no fermentadores, como Pseudomonas. Pueden reque-
rirse diferentes tiras y tarjetas de pruebas comerciales para
fermentadores y no fermentadores.
Requerimientos estrictos para el crecimiento
Dentro de este grupo, Campylobacter spp. se identica con
facilidad por su morfologa y capacidad para crecer en una
atmsfera microaerobia a 42C, pero no en el aire a 37C.
Haemophilus, Bordetella y Brucella son bacilos muy
pequeos, sobre todo gramnegativos inmviles que crecen
comparativamente mal en agar-sangre y poco o nada en lo
absoluto en agar de MacConkey. Esto les permite diferen-
ciarse con facilidad de Pseudomonas y Enterobacteriaceae.
Requieren medios enriquecidos, que contienen sangre para
el aislamiento primario y la adicin de 5 a 10% de CO
2

mejora el crecimiento.
Figura 12-4 Identicacin preliminar de bacilos aerobios gramnegativos de importancia mdica.
Haemophilus spp. se aslan habitualmente a partir de
muestras respiratorias. Se clasican de acuerdo con su es-
pecie por sus requisitos distintos de los factores X y V para
el crecimiento en agar nutritivo. De modo inicial, Bordete-
lla se puede identicar por la aglutinacin con el antisuero
especco. El agente patgeno Brucella puede clasicar-
se de acuerdo con su especie (casi siempre por los labo-
ratorios de referencia por razones de salud y seguridad),
susceptibilidad a la fucsina y la tionina de los colorantes,
requerimiento para la produccin de CO
2
y H
2
S.
Anaerobios
Los anaerobios estrictos se diferencian por su incapacidad
para crecer en presencia de oxgeno y la sensibilidad al me-
tronidazol, detectada por un disco colocado en la placa de
aislamiento primario. Pueden clasicarse en relacin con su
especie mediante reactivos comerciales o la identicacin
de sus productos metablicos por cromatografa de gas-
lquido. Sin embargo, esto se realiza rara vez en laboratorios
clnicos, a menos que el anaerobio se asle a partir de un si-
tio estril, como sangre o tejido blando. Los gneros gram-
positivos incluyen Peptostreptococcus (cocos), Clostridium
Vibrio
Pasteurella
Aeromonas
Pseudomonas
Escherichia
Klebsiella
Enterobacter
Salmonella
Shigella
Proteus
Acinetobacter
Campylobacter
Stenotrophomonas
S
S S
No No
No
Positiva Fermenta
azcares
Fermenta
azcares
Oxidasa
Negativa
Simple
Bacilos aerobios gramnegativos
Requerimientos para
el crecimiento
Cocos-bacilos
Ureasa
Exigentes
Morfologa
+
cultivo
Negativa
Negativa Positiva
Especies
individuales
Especies individuales Especies individuales Especies individuales
Positiva
Sistemas
comerciales
Sistemas
comerciales
Sistemas
comerciales
Fermentacin
de lactosa
Filamentos
curvos
Microaerobios
Crece a 43C

Haemophilus
Bordetella
Brucella
Coco-bacilo
5-10% CO
2
Sistemas
comerciales
+
serologa
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MDICA 143
y Actinomyces (bacilos). Los gneros gramnegativos comu-
nes incluyen Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Por-
phyromonas (bacilos anaerobios) y Veillonella (cocos).
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13
Pruebas automatizadas en bacteriologa
Paul C Boreland
Automatizacin: uso del equipo automtico para
ahorrar trabajo mental y manual. The Concise Oxford
Dictionary.
Introduccin
Aunque la instrumentacin automatizada se introdujo en
el laboratorio clnico de microbiologa unos 30 aos antes,
muchos clnicos han mostrado cierta renuencia a aceptar
del todo este sistema. Esto se debe en parte a una actitud
conservadora entre los microbilogos, que perpetan el uso
de los mtodos para detectar el crecimiento de microorga-
nismos desarrollados a nales del siglo xix. Otros facto-
res relevantes son la variedad y naturaleza de las muestras
sometidas a anlisis, la mayor complejidad de las prue-
bas microbiolgicas, la dicultad de integrar un instrumen-
to a las prcticas de laboratorio existentes, adems de que
muchas de las primeras mquinas no se fabricaron de forma
adecuada. Pese a ello, los recientes progresos en tecnologa
y la interconexin bidireccional entre los instrumentos y
los sistemas informticos del laboratorio han hecho ahora
de la automatizacin una alternativa prctica y rentable.
En la actualidad, los instrumentos son parte integral de
muchos laboratorios de microbiologa clnica y el equipo
automatizado est disponible para el reconocimiento de
cultivos sanguneos positivos, la comprobacin de la sensi-
bilidad antimicrobiana, la identicacin de agentes patge-
nos, el examen de las muestras de orina para bacterias y el
aislamiento y la sensibilidad antimicrobiana de Mycobac-
terium tuberculosis en muestras clnicas. No se describe en
este captulo la totalidad de los sistemas automatizados que
pueden hallarse en el mercado mundial, pero s los que se
encuentran con regularidad en los laboratorios de micro-
biologa clnica del Reino Unido.
Sistemas de cultivo sanguneo
La deteccin rpida de microorganismos en la sangre es
importante para el diagnstico y el pronstico. Por lo tanto,
los cultivos sanguneos son esenciales en el diagnstico y
el tratamiento de los agentes etiolgicos de la septicemia.
Como sta constituye una de las enfermedades infecciosas
ms graves, la identicacin rpida de los patgenos bacte-
rianos de la sangre es una funcin esencial del laboratorio
de microbiologa clnica. En consecuencia, en los ltimos
30 aos se desarrollaron y perfeccionaron los sistemas au-
tomatizados del cultivo sanguneo. El primer instrumento
semiautomatizado empleado, el BACTEC 460 (Johnston
Laboratories Inc.), reconoci dixido de carbono radiac-
tivo metabolizado por microorganismos que crecan en un
medio lquido con
14
C incorporado. Esto condujo pronto
al desarrollo del BACTEC 660/730 no radiomtrico que
utiliz la deteccin infrarroja del dixido de carbono.
Con posterioridad surgi un buen nmero de instrumen-
tos por completo automatizados, cada uno de los cuales se
compone de tres unidades bsicas: una incubadora, un de-
tector y una computadora. Los recipientes o los frascos de
cultivo sanguneo inoculados se colocan en estantes y pue-
den o no agitarse. Cada envase se vigila de modo continuo
en relacin con el crecimiento cada 10 a 15 minutos y la
computadora analiza los datos por medio de un algoritmo
predeterminado e indica cundo un cultivo es positivo. Si se
identica un recipiente positivo, puede retirarse del sistema
para aislar e identicar al agente patgeno. A diferencia de
146 CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGA
bio de color del sensor, de verde a amarillo. Este cambio lo
reconoce una luz reejante a partir de un diodo que emite
luz roja fuera del sensor sobre un fotodiodo (g. 13-1). La
seal del voltaje producida es proporcional a la intensidad
de la luz reejada y por tanto a la concentracin del dixi-
do de carbono en el recipiente. Los datos obtenidos por la
computadora se trazan como una curva de crecimiento de
unidades de reexin contra el tiempo.
Comprobacin de la sensibilidad
antimicrobiana y sistemas de identicacin
La identicacin y comprobacin de la sensibilidad anti-
microbiana de aislados bacterianos son dos de las tareas
ms importantes del laboratorio de microbiologa clnica.
Varios sistemas estn disponibles, desde los instrumentos
semiautomatizados hasta los automatizados por completo,
y casi todos ofrecen la identicacin de agentes patgenos,
as como la comprobacin de la sensibilidad antimicro-
biana con opciones de incubacin convencional o rpida
y tiempos de anlisis. Algunos instrumentos disponen de
tiras que pueden inocularse de forma automtica o manual,
incubarse externamente y despus colocarse en un lector,
que interpreta reacciones de color y los puntos nales del
crecimiento. Con los sistemas por completo automatiza-
dos, las celdillas o las tarjetas de la microdilucin se incu-
ban dentro del instrumento que, de manera continua, vigila
e interpreta el crecimiento o las reacciones bioqumicas.
Cada sistema requiere un paso de estandarizacin del
inculo en condiciones normales con un densitmetro, para
medir la densidad bacteriana, que puede expresarse en uni-
dades McFarland. Para el reconocimiento de los cambios
de color o crecimiento en el medio lquido que contiene
los sustratos o las diluciones de los antibiticos, la mayor
parte de los lectores automticos emplea una combinacin
de tres mtodos de medicin de luz: a) transmisin de la luz
en cuatro regiones del espectro, la colorimetra; b) intensi-
dad de la luz transmitida, que es inversamente proporcional
a la cantidad de crecimiento bacteriano, la turbidimetra, y
c) intensidad de la luz dispersada a 30, que es directamen-
te proporcional a la cantidad de crecimiento bacteriano, la
nefelometra. Las mediciones de la luz se convierten con
facilidad en impulsos elctricos y luego se cuantican.
Algunos instrumentos utilizan la hidrlisis del sustrato
uorgeno para identicar el crecimiento bacteriano y pue-
den proporcionar resultados en un plazo de cuatro a cinco
horas. Todos los sistemas estn equipados con una compu-
tadora y programas capaces de interpretar los resultados a
partir de un lector. Las concentraciones inhibitorias mni-
mas (CIM) producidas se derivan de un algoritmo o valo-
res de corte; de ese modo se identican microorganismos a
partir de una base de datos que contiene varios biocdigos
y efecta anlisis estadsticos y epidemiolgicos.
los instrumentos ms antiguos, el crecimiento microbiano
se cuantica por medios no invasivos. La mayor parte de
los mtodos de deteccin se basa, directa o indirectamente,
en la produccin de gases (en particular dixido de carbo-
no) o los cambios del pH que resultan del crecimiento de
microorganismos en el caldo de cultivo.
Las series BACTEC 9000 (9240, 9120, 9050) de los ins-
trumentos para cultivo sanguneo (Becton Dickinson) se
disean para reconocer en poco tiempo agentes patgenos
en muestras clnicas. La muestra se inocula en un frasco,
que se introduce en el instrumento para la incubacin y la
lectura peridica. En la base de cada frasco existe un sensor
de pH que contiene uoroqumicos que reaccionan con el
dixido de carbono insertados en una matriz. El dixido de
carbono que producen los microorganismos al metaboli-
zar los nutrimentos en el medio de cultivo, se difunde a
travs de la matriz y ello propicia una disminucin del pH
que detectan los uoroqumicos. Los fotodetectores del
instrumento miden de forma especca el grado de uores-
cencia que emite el sensor cada 10 minutos, un aumento el
cual es proporcional a la cantidad creciente de dixido de
carbono o a la cantidad decreciente de oxgeno presente en
el envase. Las mediciones se interpretan con un programa
de computadora de acuerdo con parmetros de positividad
preestablecidos.
El sistema BacT/Alert 3D (bioMerieux) incuba, agita y
vigila de modo continuo el crecimiento de microorganis-
mos en cultivos sanguneos. Unido a la base de cada reci-
piente con cultivo sanguneo, se coloca un sensor colorim-
trico cubierto por una membrana de exclusin inica que
es permeable al dixido de carbono pero impermeable a los
iones de hidrgeno libres, los componentes del medio y la
sangre completa. Cuando el dixido de carbono se libera
por el crecimiento de los agentes patgenos, se difunde a
travs de la membrana, disminuye el pH y se inicia un cam-
Figura 13-1 Deteccin de la produccin acelerada de dixido
de carbono a partir del crecimiento microbiano. Reproducido con
la autorizacin de bioMerieux.
COMPROBACIN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y SISTEMAS DE IDENTIFICACIN 147
El sistema Vitek (bioMerieux) utiliza tarjetas reactivas
de plstico del tamao de una tarjeta de crdito que contie-
nen cantidades pequeas del medio de crecimiento y anti-
biticos o medios de pruebas bioqumicas en celdillas de
prueba. Las tarjetas estn disponibles para la identicacin
de 300 especies de bacterias y levaduras y una gama de
17 antibiticos a los cuales aqullas resultan susceptibles
(S), intermedias (I) o resistentes (R); tambin proporcionan
resultados de la CIM. Cada tarjeta de identicacin cuenta
con 30 celdillas de reaccin que contienen diversas pruebas
bioqumicas, sin la necesidad de agregar reactivos. La tar-
jeta de la sensibilidad contiene 45 celdillas de reaccin que
incluyen una gama de 17 antibiticos, cada uno presente
sobre lmites de concentracin. Las pruebas especcas
para deteccin de los mecanismos de resistencia tambin
se incluyen en esta tarjeta. El sistema cuenta con un m-
dulo de llenado y sellado para la inoculacin y el cierre
hermtico de las tarjetas, adems de una incubadora y un
lector; las tarjetas se sostienen en un carrusel y los cambios
de color bioqumico y la densidad ptica se miden por me-
dios fotomtricos cada hora. El sistema utiliza mediciones
cinticas determinadas de modo turbidomtrico del creci-
miento en presencia de antibiticos para realizar anlisis de
regresin lineal y, por ltimo, para determinar las CIM de-
rivadas del algoritmo.
Por lo regular, los resultados estn disponibles en un
plazo de cuatro a 18 horas, con la identicacin y la sen-
sibilidad antimicrobiana de un microorganismo individual
que se deriva del anlisis computarizado de los datos.
El Vitek 2 es una versin automatizada del Sistema Vi-
tek, con procesamiento automatizado y anticipacin de la
muestra, incluidos la dilucin inicial del inculo, la veri-
cacin de la densidad y los pasos de llenado y sellado de
la tarjeta. El instrumento transere de forma automtica las
tarjetas al lector-incubadora y las traslada a un comparti-
miento de eliminacin al trmino de la comprobacin. El
sistema permite el anlisis cintico tras analizar las pruebas
cada 15 minutos. El sistema ptico combina las lecturas de
multicanales del uormetro y el fotmetro para registrar
seales uorescentes de turbiedad y colorimtricas. El sis-
tema Vitek 2 emplea una tarjeta con 64 celdillas y permite
el escrutinio hasta con 20 antibiticos.
El sistema de microbiologa automatizado Phoenix (Bec-
ton Dickinson) usa un recipiente de plstico moldeado y
sellado mediante autollenado, con los depsitos de inocu-
lacin en la tapa para llenado, y contiene 136 microceldillas.
Se utiliza con el instrumento para probar la identicacin del
microorganismo o la sensibilidad antimicrobiana (AST), o
una combinacin de ambos.
Para la identicacin bacteriana, el rea para la identi-
cacin del panel de la mquina Phoenix utiliza una serie de
pruebas bioqumicas convencionales, cromgenas y uo-
rgenas en 51 celdillas. Los sustratos basados en el creci-
miento y las enzimas se emplean para cubrir los diversos
tipos de reactividad dentro de los lmites establecidos. Las
pruebas se basan en la utilizacin y la degradacin micro-
bianas de sustratos especcos detectados por varios sis-
temas indicadores. La produccin de cido se indica por
un cambio en el indicador rojo de fenol cuando un aislado
es capaz de utilizar un carbohidrato como sustrato. Los
sustratos cromgenos producen un color amarillo sobre la
hidrlisis enzimtica de los compuestos p-nitrofenilo o p-
nitroanilida. La hidrlisis enzimtica de sustratos uor-
genos resulta de la liberacin de un derivado uorescente
de la cumarina. Los microorganismos que usan una fuen-
te especca de carbn reducen el indicador basado en
reazurina. Adems, existen otras pruebas que detectan la
capacidad de un agente patgeno de hidrolizar, degradar,
reducir o utilizar en otra forma un sustrato.
La prueba de sensibilidad antimicrobiana mediante el
sistema Phoenix se basa en la microdilucin y usa un in-
dicador redox para la deteccin del crecimiento del agente
patgeno en presencia de un antibitico. Las mediciones
continuas de los cambios del indicador, as como de la tur-
biedad, se emplean en la determinacin del crecimiento
bacteriano. Cada conguracin del panel de AST contiene
varios antibiticos con una extensa gama de concentracio-
nes de doble dilucin. La identicacin del microorganis-
mo tambin se utiliza en la interpretacin de valores CIM
de cada antibitico.
El Sensititre ARIS (AccuMed International Ltd) detecta
crecimiento bacteriano por medio de compuestos cono-
cidos como uorforos. stos consisten en diversos sus-
tratos, como pptidos y steres, ligados a los compuestos
que emiten luz uorescente: 4-metilumbeliferona (4 MU)
y 7-aminometilcumarina (7 AMC). En condiciones norma-
les, estos complejos no son uorescentes, pero durante el
crecimiento bacteriano se producen enzimas especcas
que inciden sobre los sustratos de los uorforos, lo que
posibilita que la 7 AMC o la 4 MU despidan uorescencia
bajo luz ultravioleta. La sensibilidad a un antibitico es-
pecco se registra como la ausencia de uorescencia, es
decir, ningn crecimiento, y la resistencia como uores-
cencia debido a la produccin enzimtica de bacterias que
crecen en forma activa. Por lo regular, los resultados toman
slo cuatro a cinco horas, pero pueden requerir incubacin
por toda la noche. El sistema se integra con un inoculador,
una incubadora, un uormetro que lee la uorescencia a
450 m y una computadora. Las pruebas se realizan en cel-
dillas sobre bandejas preparadas de microtitulacin y los
programas emplean un algoritmo que interpreta las seales
y produce el punto de corte o los resultados de la CIM. El
sistema de identicacin trabaja de modo similar e incluye
slo las pruebas bioqumicas que puedan producir uores-
cencia o registrar su ausencia. El microorganismo se iden-
tica con una base de datos de la computadora.
Mastascanelite (Mast Group Ltd) es un sistema mo-
dular nico que utiliza la tecnologa de multipunto para
inocular en agar una dilucin para pruebas de sensibilidad
antimicrobiana, punto de corte y CIM, adems de pruebas
bioqumicas de identicacin. Consiste en un analizador
que contiene una cmara de video a color, un inoculador de
multipunto y una computadora. Las esferillas liolizadas
y predosicadas con antibiticos se emplean para preparar
el punto de corte y las placas para CIM y observar tambin
diversos cultivos para el reconocimiento bacteriano. Las
placas de agar se inoculan con 96 diferentes microorganis-
mos, se incuban y el crecimiento se visualiza con 19 o 36
macrocolonias. Despus, stas se colocan en el analizador
y la cmara de video las inspecciona en los puntos prede-
terminados. Los tres colores bsicos, rojo, azul y verde, se
emiten como seal elctrica cuantitativa al microanaliza-
dor, que convierte las seales en nmeros. Para el punto
de corte y las placas CIM, en los cuales la sensibilidad o
la resistencia se denen como crecimiento o ausencia del
mismo, las seales de tres colores se combinan para produ-
cir el equivalente de una seal en blanco y negro. Cuando
se examinan las placas de agar para la identicacin bio-
qumica, los detalles de los colores medidos se usan para
denir resultados positivos o negativos de los diversos mi-
croorganismos probados. La tecnologa de multipunto pue-
de tambin utilizarse para examinar la orina.
La creciente necesidad de contar con mtodos estandari-
zados y cuantitativos de la AST, como los que recomienda
la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC)
o el National Committee on Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), ha llevado a varios fabricantes a producir los
instrumentos semiautomatizados basados en la tecnologa
de difusin con disco, la cual requiere la medicin exacta de
los dimetros de la zona de inhibicin. Los instrumentos
Aura Image (Oxoid Ltd), BIOMIC (Giles Scientic Inc.),
Mastascanelite (Mast Group Ltd), Osiris (Sano Diagnos-
tic Pasteur) y Sirscan 2000 (i2a Montpellier) son sistemas
de anlisis de imagen que utilizan una cmara de video para
medir el dimetro de la zona de inhibicin e interpretar los
resultados de las placas de agar para sensibilidad mediante
la difusin con disco. La placa de agar se coloca en un re-
cipiente corredizo motorizado y aparece una imagen clara
con los dimetros calculados en la pantalla de video. Una
zona de inhibicin se interpreta como S, I, R de acuerdo
con las tablas BSAC/NCCLS para antibiticos.
La mayor parte de los sistemas tiene un sistema experto
basado en reglas programadas por el usuario y una base de
datos epidemiolgica detallada.
Sistemas de examen de la orina
El examen de las muestras de orina para identicar bacte-
riuria y piuria representa una proporcin considerable de
la carga de trabajo y el costo del funcionamiento de un la-
boratorio de microbiologa clnica. Tan slo 20 a 30% de
estas muestras produce resultados clnicos de importancia
y, por lo tanto, se han hecho varias tentativas de automati-
Figura 13-2 Anlisis de las partculas de la orina mediante citometra de ujo y medicin de la impedancia. Reproducido con auto-
rizacin de Sysmex UK Ltd.
SISTEMAS DE IDENTIFICACIN Y SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANAS PARA MICOBACTERIAS 149
zar el proceso para prevenir la obtencin de muestras ne-
gativas. Es preciso contar con un instrumento que detecte
bacterias y otras partculas en la orina, como eritrocitos y
leucocitos, procese las muestras con rapidez y tenga un alto
valor predictivo negativo. En la actualidad slo est dispo-
nible un instrumento que emplea la tecnologa de partcula
que satisface estos criterios.
El UF-100 (Sysmex UK Ltd) combina la citometra de
ujo con la deteccin de la impedancia para reconocer y
contar directamente las clulas y los microorganismos en
la orina (g. 13-2). Cada muestra de orina se mezcla con un
diluyente y se agrega un colorante uorescente dual con
anidad por el DNA y el RNA. La muestra teida se enva
entonces a una celda de ujo, que irradia un lser de argn.
Los rayos lser se dispersan por las clulas de la muestra y
la luz dispersada hacia adelante (uorescente y no uores-
cente), que es proporcional al rea de seccin transversal
de las clulas, se cuantica mediante un fotodiodo. Un fo-
tomultiplicador calcula la uorescencia emitida, que indica
el grado de nucleacin de la clula. Mediante cinco seales
de altura y anchura uorescentes y no uorescentes, ms las
mediciones de la impedancia, el instrumento distingue las es-
tructuras celulares tridimensionales en sus tipos y cantida-
des celulares apropiadas y cuenta los microorganismos. La
distribucin celular se puede mostrar en diagramas de dis-
persin e histogramas, con el programa Adaptive Cluster
Analysis.
Sistemas de identicacin y sensibilidad
antimicrobianas para micobacterias
La reaparicin de tuberculosos y la incidencia creciente de
brotes de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes
a mltiples frmacos ha conducido a la necesidad de contar
con sistemas automatizados para las pruebas de deteccin,
identicacin y sensibilidad antimicrobiana rpidas de las
micobacterias. La mayor parte de los sistemas disponibles
en la actualidad se ha desarrollado a partir de la tecnologa
que cultiva sangre existente y usa una instrumentacin si-
milar. Todos los instrumentos tienen caractersticas de se-
guridad diseadas para proteger al operador y prevenir la
contaminacin del ambiente.
El BACTEC 460 TB (Becton Dickinson) fue el primer
instrumento semiautomatizado empleado para la deteccin
rpida de micobacterias. Se trata de un mtodo radiomtri-
co que usa viales con base para caldo Middlebrook 7H12,
que contiene cido palmtico radiomarcado como sustrato
y cinco agentes antimicrobianos para reducir la contamina-
cin. El dixido de carbono radiomarcado se libera en el
espacio libre del frasco por las micobacterias de la muestra
inoculada y se metaboliza el cido palmtico. La radiacti-
vidad en el dixido de carbono se mide por un contador
de centelleo y se convierte a un valor del ndice de creci-
miento (IC). Un valor de IC de 10 o ms indica la presen-
cia de micobacterias. El complejo M. tuberculosis (MTB)
puede diferenciarse de otras micobacterias al inocular una
alcuota a partir de un vial positivo en un vial BACTEC que
contiene fosfato de cido nucleico (prueba NAP). Ningn
aumento o disminucin del valor del IC revela la presencia
del complejo M. tuberculosis. El sistema puede tambin
utilizarse para la prueba de sensibilidad antibitica de los
aislados de este complejo.
El Sistema BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson) se
dise para el aislamiento rpido de micobacterias a partir
de muestras clnicas y utiliza tecnologa uorescente para
identicar micobacterias que crecen en medio de cultivo
lquido. Cada vial de cultivo contiene un sensor uorescen-
te, que reacciona a la concentracin de oxgeno presente.
Si hay agentes patgenos, los nutrimentos del frasco se
metabolizan y el resultado es un agotamiento del oxgeno
en el medio. Los fotodetectores del instrumento miden el
grado de uorescencia, que corresponde a la cantidad de
oxgeno consumido. El anlisis del grado de disminucin
del oxgeno, cuando se mide mediante la uorescencia cre-
ciente, permite al instrumento determinar si el vial es un
instrumento positivo. Los frascos se acomodan en seis
estantes, cada uno de los cuales aloja 40 viales. Los es-
tantes se incuban de manera continua a 37C y se agitan
a intervalos de 10 minutos para la recuperacin mxima
de microorganismos. Los viales se prueban cada 10 minu-
tos por diodos electroluminosos que activan los sensores
uorescentes. Una determinacin positiva indica la posible
presencia de micobacterias viables y se indica por medio
de una luz que emite el instrumento en el monitor.
El mdulo de BacT/ALERT 3D (bioMerieux) para las
pruebas de crecimiento, deteccin y sensibilidad de las mi-
cobacterias tiene un sistema de deteccin idntico al em-
pleado en los cultivos sanguneos. Un sensor en la base de
cada envase detecta el dixido de carbono como indicador
de crecimiento, con el cambio del verde al amarillo que
vigila de modo constante un reectmetro en la unidad de
deteccin. El mdulo de la incubacin tiene cuatro com-
partimientos de 60 celdillas cada uno y stos poseen un
mecanismo de agitacin independiente para procesar cul-
tivos estticos o con agitacin dentro del mismo sistema.
El Sistema BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson) es
un instrumento con gran capacidad, completamente auto-
matizado, de vigilancia continua, que puede analizar has-
ta 960 tubos MGIT de 7 ml para reconocer micobacterias
(usa la misma tecnologa de uorescencia incluida en el
sistema BACTEC 9000 MB). Los tubos de cultivo contie-
nen un sensor uorescente que responde a la concentracin
de oxgeno en el medio de cultivo. Los fotodetectores del
instrumento miden la uorescencia en cada tubo cada 60
minutos. La intensidad de la uorescencia corresponde a
la cantidad de oxgeno que consumen los microorganismos
que, a su vez, es proporcional al nmero de bacterias pre-
sentes.
El instrumento puede tambin utilizar el reactivo BAC-
TEC MGIT 960 SIRE como un procedimiento cualitativo
rpido para la prueba de sensibilidad de Mycobacterium
tuberculosis a partir de un cultivo para estreptomicina, iso-
niacida, rifampicina y etambutol.
Comentario
Para realizar pruebas microbiolgicas en tiempo real,
es decir, envo de la informacin al mdico con un diag-
nstico clnico de laboratorio, es inevitable que los mi-
crobilogos incorporen cada vez ms la instrumentacin
automatizada. Esto tambin contribuir a aliviar la pre-
sin de los presupuestos, cada vez menores, las reduccio-
nes de personal y una carga de trabajo siempre creciente.
Las numerosas ventajas de las pruebas automatizadas
incluyen la liberacin del personal calicado del trabajo re-
petitivo para efectuar tareas complicadas y exigentes, con
lo cual mejora la calidad total del trabajo en el laboratorio;
tiempos de respuesta menores; mejor estandarizacin de
las pruebas al suprimir la subjetividad y el error humano,
y un funcionamiento rentable de las pruebas, al reducir la
proporcin de muestras negativas que requieren un proce-
samiento adicional. Es difcil imaginar la desaparicin de
la placa de agar y el asa de alambre despus de un siglo
de uso; empero, se acerca el momento en que el microbi-
logo elija como primeras herramientas clnicas los instru-
mentos automatizados.
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14
Tcnicas de bacteriologa molecular:
preparacin y aplicacin de la muestra
Richard E Holliman y Julie D Johnson
Necesidad de mtodos
moleculares
Con objeto de justicar la importancia de los recursos ne-
cesarios para desarrollar y realizar mtodos moleculares de
diagnstico, una infeccin bacteriana debe satisfacer algu-
nos criterios bsicos. Primero, debe representar un problema
clnico relevante en trminos de la cantidad de casos, mor-
bilidad y mortalidad. Segundo, el diagnstico temprano de
la infeccin debe mejorar el pronstico del paciente; casi
siempre est disponible una terapia especca y ecaz. Por
ltimo, la propuesta existente del diagnstico basado en los
mtodos tradicionales de microscopia, cultivo y serologa
debe proporcionar un rendimiento inferior. Existe poca jus-
ticacin clnica para desarrollar un mtodo de diagnstico
de base molecular para una infeccin bacteriana que puede
identicar y probar con facilidad la sensibilidad antimicro-
biana en el laboratorio de rutina. La aplicacin de mtodos
moleculares avanzados debe enfocarse en las bacterias que
son exigentes y difciles para crecer en cultivo; bacterias
que se daan en grado subletal; las que no pueden distin-
guirse de forma simple de las bacterias no patgenas simila-
res; aquellas en las que no puede evaluarse con seguridad la
sensibilidad microbiana, y las especies que no pueden distin-
guirse con razonable seguridad mediante los mto-dos de tipi-
cacin existentes. Este captulo se concentra en los mtodos
moleculares relacionados con cidos nucleicos bacterianos.
Preparacin
de la muestra
El xito de cualquier tcnica empleada para estudiar los ci-
dos nucleicos bacterianos confa de manera inicial en la libe-
racin y puricacin de los cidos nucleicos designados. No
existe hasta ahora un mtodo de aceptacin general para la
preparacin de muestras clnicas, pero hay muchos factores
interrelacionados que se deben tomar en cuenta. Luego de
seleccionar al agente patgeno, el tipo de muestra clnica lo
impone la patogenia de la enfermedad. Para maximizar la po-
sibilidad de deteccin debe considerarse la carga bacteriana
dentro de la muestra (el nmero de microorganismos por vo-
lumen de muestra). En condiciones ptimas, esto es, cuando
la carga bacteriana es baja, debe examinarse un volumen de
muestra conveniente ms grande; empero, las tcnicas mo-
leculares utilizan a menudo volmenes 100 l. En ltima
instancia, se necesita la concentracin de los agentes desig-
nados en un volumen pequeo. Esto requiere una concentra-
cin elevada en las muestras, como el esputo para Mycobac-
terium tuberculosis y la sangre para la bacteriemia, pero bajas
en muestras como orina para Chlamydia con la nalidad de
conseguir la sensibilidad. Los volmenes grandes de muestra
exigen tcnicas complejas de extraccin, como la precipita-
cin por etanol y la apropiacin de los cidos nucleicos ob-
jetivo, que propician una disminucin de la sensibilidad del
anlisis. Los volmenes grandes de muestra pueden tam-
152 CAP. 14 TCNICAS DE BACTERIOLOGA MOLECULAR: PREPARACIN Y APLICACIN DE LA MUESTRA
bin contener niveles ms grandes de cido nucleico ines-
pecco con DNA ajeno, lo cual puede comprometer el
anlisis. El tipo de muestra y la forma de procesarla du-
rante y despus de la coleccin revisten importancia. Las
muestras de lquido cefalorraqudeo, orina y esputo pueden
contener inhibidores. El hem (a 0.8 M) y sus productos
metablicos son inhibidores conocidos de las polimera-
sas de DNA, debido a la unin del hem o la porrina a la
enzima de amplicacin. Los polisacridos cidos, com-
ponentes de las glucoprotenas en el esputo, son tambin
inhibidores. Pueden ser necesarias medidas adicionales
para eliminar los inhibidores de muestras como esputo y
sangre en comparacin con orina o lquido cefalorraqudeo
(Woodford y Johnson, 1998).
Para la deteccin de enfermedades de transmisin sexual,
como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y
Trichomonas vaginalis, las novedosas tcnicas de muestreo
de autoadministracin que usan muestras recolectadas con
tampn han resultado ms sensibles por PCR que el anli-
sis urinario (Tabrizi et al., 1998).
Los reactivos utilizados en la recoleccin de la muestra,
como EDTA y heparina, tambin inhiben a las enzimas de
amplicacin. Si el objetivo est presente en abundancia,
la dilucin de la muestra puede eliminar el efecto inhibito-
rio, al tiempo que mantiene los cidos nucleicos a un grado
al cual la frecuencia de copias cero analizadas es baja. En
contraste, la destruccin qumica o enzimtica de los cidos
nucleicos reduce el nmero efectivo de objetivos ampli-
cables de cido nucleico. Los microorganismos objetivo y
la durabilidad de su pared celular poseen un efecto notable
sobre el procedimiento de extraccin; por ejemplo, la pa-
red celular de M. tuberculosis es en particular resistente a la
lisis, mientras que la de Mycoplasma spp. se lisa de modo
espontneo. Es tambin importante proteger al personal del
laboratorio que aplica tcnicas moleculares cuando agen-
tes patgenos como M. tuberculosis son los agentes de es-
tudio; por tanto, puede ser necesario incluir medidas de
esterilizacin dentro del procedimiento de extraccin. Es
necesario reducir al mnimo la manipulacin de la mues-
tra y acatar protocolos estrictos con requerimientos redu-
cidos de equipo especializado. La amplicacin extensa
del DNA bacteriano exige el procesamiento de la muestra
que libere el DNA desde una matriz de microorganismos
blanco y abata los factores inhibitorios. Para aumentar
la deteccin de agentes patgenos con paredes celulares
de lisis difcil, la puricacin del DNA con columnas de
ltro de bra de vidrio, con una medida adicional de soni-
cacin, ha probado ser tan buena como la extraccin estn-
dar con fenol-ter de DNA (Rantakokko-Jalava y Jalava,
2002). Los procedimientos de preparacin de la muestra
contribuyen a la conabilidad de la deteccin del objetivo
dentro de las muestras clnicas; existen numerosos equipos
comerciales y se recomienda que las tcnicas de extraccin
de DNA se seleccionen de forma cuidadosa, con particular
atencin en el tipo de muestra. Los equipos comerciales
han probado superioridad para la extraccin de DNA de
muestras fecales (McOrist et al., 2002) y la extraccin r-
pida de DNA en los estudios moleculares epidemiolgicos
de Plasmodium falciparum (Henning et al., 1999); incluso
la lisis no comercial que incluye la serie lavado-lcali-ca-
lor ha probado ser el mtodo ms sensible y simple para
la extraccin del DNA de bacterias, levaduras y hongos a
partir de material de cultivo en sangre (Miller et al., 2000).
Algunos trabajadores han modicado los equipos comer-
ciales para maximizar la recuperacin y pureza del DNA
extrado, en especial con protozoarios intestinales (da Silva
et al., 1999). Si la preparacin de la muestra es ineciente,
se generan resultados falsos negativos (cuadro 14-1).
Amplicacin
Los cidos nucleicos pueden ser DNA o RNA, de doble
hlice o simple, y deben estabilizarse una vez aislados
para prevenir la degradacin. El RNA es ms difcil de
estabilizar que el DNA. Es un requisito del aislamiento de
RNA la ausencia de DNA contaminante. La extraccin o
destruccin selectivas de DNA o RNA permite slo diri-
girse al cido nucleico apropiado. El rRNA puede esta-
bilizarse en soluciones caotrpicas por meses a tempera-
tura ambiente. Son problemticos los agentes patgenos
que tienen una etapa de RNA y una de DNA en su ciclo
vital. La reaccin en cadena de la polimerasa con trans-
cripcin inversa (RT-PCR) detecta mRNA pero tambin
DNA, a menos que se tomen medidas para destruir este
objetivo (Dilworth y McCarrey, 1992). La amplicacin
basada en la secuencia del cido nucleico puede tambin
usarse para detectar mRNA; sta es una reaccin isotr-
mica que no requiere un ciclador trmico. En fecha ms
reciente, la amplicacin por desplazamiento de hebra de
la transcriptasa inversa (RT-SDA) tambin se ha utilizado
como indicador de la viabilidad bacteriana (Keer y Birch,
2003). Los mtodos de amplicacin como la replicacin
de secuencia autosostenida, que en teora son capaces de
usar slo moldes de RNA, no deben amplicar DNA sal-
vo que se incluya una medida de desnaturalizacin como
parte de la tcnica de extraccin. Es importante determinar
si el DNA de hlice simple interere en realidad con este
planteamiento de RNA especco. De manera anloga, la
PCR reconoce slo DNA, a menos que un paso de trans-
cripcin inversa preceda a la PCR. Las investigaciones con
tinciones de sangre y semen en patologa forense han mos-
trado que el DNA y el RNA pueden aislarse de modo si-
multneo desde la misma muestra para el anlisis median-
PRCTICA ACTUAL 153
te precipitacin con etanol y extraccin cida con fenol y
cloroformo (Bauer y Patzelt, 2003). Los mtodos de am-
plicacin de cidos nucleicos estables pueden detectar
microorganismos muertos, inactivos y en replicacin. El
reconocimiento de todas las formas de los agentes pat-
genos puede ser ventajoso cuando la viabilidad se pierde
en poco tiempo durante el transporte o almacenamiento o
si el agente no puede cultivarse. Sin embargo, la discrimi-
nacin de microorganismos muertos y viables representa
un problema si los agentes patgenos inviables o inactivos
permanecen una vez que la infeccin activa es evidente.
Control de calidad
Cuando se asla, el blanco debe colocarse en un ambiente
acuoso compatible con la amplicacin. Muchos reacti-
vos utilizados en biologa molecular inhiben a las enzimas
de amplicacin para la puricacin de cidos nucleicos;
stos incluyen detergentes como el sulfato de dodecilo de
sodio o caotrpicos como clorhidrato de guanidinio, que
se utilizan para solubilizar la membrana celular o inactivar
nucleasas, sobre todo en la extraccin del DNA bacteria-
no y de levadura de productos sanguneos (Golbang et al.,
1996). Se deben tomar medidas adicionales para remover
o neutralizar dichos reactivos. El control de calidad de los
reactivos y el equipo en las tcnicas clnicas de biologa
molecular es de enorme importancia. Con tcnicas tan po-
derosas y sensibles como la PCR, el riesgo de reacciones
falsas positivas debido a la contaminacin y falsas negati-
vas debido a los inhibidores de reaccin ha llevado a idear
procedimientos escrupulosos de anulacin, que hacen a la
tcnica relativamente cara y limitada a quienes disponen
de tiempo, instalaciones y destreza necesarios. De impor-
tancia particular en la microbiologa diagnstica es el uso
de controles para anular los falsos negativos; por ejemplo,
los controles intrnsecos de DNA de un nmero bajo de co-
pias de una secuencia de control pueden incluirse en la
muestra clnica. Si el control no se amplica, puede asu-
mirse que la muestra es inhibidora. Los requisitos espe-
ciales del equipo incluyen puntas taponadas o pipetas de
desplazamiento positivo, estaciones de trabajo separadas,
termocicladores y equipo bsico de deteccin. Todo ello
requiere un gasto nanciero inicial grande. Debido a la fal-
ta de validacin y protocolos estndar, adems de reactivos
y equipos de calidad variable, las tcnicas moleculares son
todava la herramienta de los laboratorios de referencia y
unidades de investigacin. La European Commission ha
aprobado la investigacin en la validacin y estandariza-
cin del uso del diagnstico por PCR para la deteccin de
bacterias patgenas en los alimentos (Malorny et al., 2003)
y se espera que desarrollos similares en el diagnstico cl-
nico puedan generalizarse en el futuro.
Prctica actual
A principios del ao 2000 una cantidad creciente de infec-
ciones bacterianas se convirti en material para los mto-
dos moleculares de diagnstico en el curso de la prctica
Cuadro 14-1 Solucin de problemas en la preparacin de la muestra
Contexto clnico
Muestras de gran volumen
Tipos de muestras clnicas
Qumicos utilizados en la recoleccin de
la muestra
Agentes patgenos para examen
Pacientes con tratamiento parcial
Presencia de muestras clnicas y
productos de amplicacin previa en
el laboratorio
Problema
Grandes cantidades de DNA extrao
comparado con volumen pequeo de
procesamiento
Grados variables de inhibicin de enzima
Inhibicin de la enzima
Estabilidad variable del objetivo
Presencia de agentes patgenos viables o
inviables
La contaminacin de muestras crea
reacciones falsas positivas
Solucin
Extraccin rigurosa de DNA
Maximizar amplicacin de la
sensibilidad
Individualizar las tcnicas de extraccin
Dilucin
Agentes quelantes
Controles positivos
Procesamiento rpido de la muestra
Condiciones ptimas de almacenamiento/
transporte
RT-PCR
Pipetas de desplazamiento positivo/
taponadas
Estaciones de trabajo para el anlisis
antes y despus de la PCR
Equipo especializado
clnica de rutina. Un nmero ms grande de dichos m-
todos se ha analizado en el laboratorio de investigacin y
algunos de ellos pueden encontrar un papel clnico en el
futuro. Los mtodos de laboratorio habituales se emplean
en funciones diversas en el proceso diagnstico; stos com-
prenden la deteccin de microorganismos en una muestra
clnica, identicacin del aislado, pruebas de sensibilidad
y tipicacin epidemiolgica. Los mtodos moleculares
se han aplicado a cada una de estas cuatro funciones; el
cuadro 14-2 lista los ejemplos representativos. Desde la
perspectiva clnica, los mtodos moleculares se usan en el
diagnstico de infecciones bacterianas de las vas respira-
torias, tejidos blandos, sistema urogenital, aparato diges-
tivo y sistema nervioso central (Mandell et al., 2000).
Vas respiratorias
Muchas bacterias causantes de la infeccin de vas respira-
torias crecen o se identican con dicultad en cultivos. En
consecuencia, es conveniente la aplicacin de mtodos mo-
leculares avanzados en estas infecciones. Puede detectarse
Mycoplasma pneumoniae en escobillados de garganta me-
diante la PCR, en tanto que Legionella pneumophila puede
identicarse en secreciones profundas del pulmn por PCR
y sondas de DNA (Mandell et al., 2000). Se ha desarrolla-
do un anidado de PCR en un tubo simple que incorpora un
sistema de deteccin basado en EIA para el diagnstico de
la infeccin por Chlamydia pneumoniae (Clewley, 1996).
Pueden identicarse con rapidez, por hibridacin con son-
das especcas de DNA, aislados del complejo intracelular
Mycobacterium avium cultivados sobre desperdicios o en
medios lquidos. Los mtodos moleculares pueden utilizar-
se para reconocer Mycobacterium tuberculosis en mues-
tras clnicas, identicar aislados que crecen in vitro, valorar
sensibilidad, vigilar la respuesta a la terapia (por la cuanti-
cacin de los valores de mRNA) y distinguir las cepas en
los estudios epidemiolgicos.
Tejidos blandos
Los mtodos establecidos para la identicacin de especies
de estalococos se basan en las caractersticas fenotpicas.
Dichos mtodos no suministran suciente conabilidad de-
bido a la variable expresin de estos factores fenotpicos.
El gen 16S rRNA posee regiones reservadas y variables. Al
disear cebadores de PCR para secuencias especcas den-
tro del gen se logr clasicar, de acuerdo con la especie,
los aislados de estalococos con mayor exactitud (Clewley,
1996).
Los aislados de estreptococos del grupo A (Strepto-coc-
cus pyogenes) pueden someterse a genotipicacin por
el anlisis del patrn de la enzima de restriccin de 16S
rRNA, un proceso conocido como ribotipicacin. El gen
pirgeno de la exotoxina se puede detectar por amplica-
cin con PCR. Otro esquema de tipicacin se basa en la
amplicacin con PCR y la digestin con la enzima de res-
triccin del reguln de virulencia, un grupo de genes que
comprende factores de virulencia como el factor inactivador
del complemento y la actividad antifagoctica bajo control
de la transcripcin de un gen de virulencia (Clewley, 1996).
Los exmenes moleculares de muestras de piel han alcan-
zado una sensibilidad hasta de 68% para el diagnstico de
la enfermedad de Lyme.
Cuadro 14-2 Aplicacin clnica de la metodologa molecular
Funcin
Deteccin del agente
patgeno
Identicacin de aislados
Sensibilidad antimicrobiana
Tipicacin
Bacterias
Neisseria meningitidis
Staphylococcus spp.
Mycobacterium tuberculosis
Streptococcus pyogenes
Mtodos convencionales
Microscopia del cultivo
en medios de agar para
detectar antgenos
Examen de caractersticas
fenotpicas, como
produccin de la enzima
coagulasa
Cultivos sobre/en medios que
contienen antibiticos
Serotipicacin de la
protena M
Mtodos moleculares
Amplicacin por PCR y
sondeo DNA de productos
de amplicacin
Amplicacin por PCR con
cebadores especcos para
especies por secuencias del
gen 16S rRNA
Electroforesis de los productos
de la PCR para detectar
diferencias genticas
relacionadas con resistencia
Amplicacin por PCR de
16S rRNA y examen de los
fragmentos del producto de
la enzima de restriccin
PRCTICA ACTUAL 155
Sistema urogenital
Es posible detectar Chlamydia trachomatis en muestras
genitales mediante prueba de ELISA, tcnicas de inmu-
nouorescencia y sondas de DNA, pero estos mtodos son
menos sensibles que los cultivos convencionales. En con-
traste, la amplicacin por PCR parece ser ms sensible
que el cultivo de Chlamydia, al tiempo que conserva alta
especicidad y puede aplicarse a muestras de orina y esco-
billados endouretrales.
El diagnstico de gonorrea se basa an en el aislamien-
to de la bacteria por cultivo convencional. Sin embargo, el
sondeo de DNA, la amplicacin por PCR o la reaccin
en cadena de la ligasa pueden ser de valor cuando el aisla-
miento es imprctico debido a las dicultades de transporte
del espcimen o la falta de acceso inmediato a un labora-
torio con instalaciones de cultivo. Las sondas de DNA para
Neisseria gonorrhoeae tienen un lmite aproximado de sen-
sibilidad de 10
3
patgenos por muestra. La precisin de
los diversos mtodos de amplicacin iguala o excede la
del cultivo, pero la experiencia clnica es limitada (Man-
dell et al., 2000). Se han descrito mtodos moleculares
para el diagnstico y estudios epidemiolgicos de Haemo-
philus ducreyi y Treponema pallidum, adems de agentes
patgenos relacionados con la vaginosis bacteriana.
Sistema digestivo
En general, los mtodos moleculares son de valor limitado
para el diagnstico de la infeccin gastrointestinal. Aunque
los mtodos convencionales de microscopia y cultivo son
relativamente insensibles y consumen tiempo, la mayora
de los pacientes requiere slo tratamiento de apoyo y un
diagnstico especco, que a menudo no afecta la terapu-
tica. Una posible excepcin es la infeccin por Campylo-
bacter, en la cual los mtodos actuales de identicacin se
basan en factores bioqumicos poco ables. Los cebadores
de PCR especcos para el gnero Campylobacter y las es-
pecies del gnero, como C. upsaliensis, C. helveticus, C.
fetus, C. hyointestinalis y C. lari, se basan en las regiones
conservadas y variables del gen 16S rRNA. La digestin
por las enzimas de restriccin de los productos amplica-
dos puede utilizarse para desarrollar un esquema de tipi-
cacin para seguir la extensin de las cepas en roturas
(Mandell et al., 2000). La amplicacin molecular tam-
bin ha encontrado un papel en la deteccin de Escherichia
coli 0157:H7.
Sistema nervioso central
Las sondas de DNA no han sido capaces de proporcionar
un nivel clnico de sensibilidad til cuando se usan para la
deteccin de bacterias en el LCR; los mtodos de ampli-
cacin de DNA han mostrado mayor utilidad. La PCR
para Neisseria meningitidis en las muestras del LCR al-
canza grados de sensibilidad y especicidad por arriba de
90% en comparacin con los cultivos convencionales. Esta
tcnica puede ser de particular valor cuando el paciente re-
cibe antibiticos antes de la puncin lumbar y representa
un avance signicativo respecto de los mtodos de detec-
cin del antgeno. Estudios moleculares de la diversidad
de meningococos han identicado linajes hiperinvasivos
y posibilitado la introduccin de vacunas nuevas. La PCR
tambin se emplea para reconocer Listeria monocytogenes
en individuos inmunosuprimidos con meningitis y Trepo-
nema pallidum en el diagnstico de la neuroslis sintom-
tica. La sensibilidad y especicidad de estas aplicaciones
todava no se establece (Mandell et al., 2000).
Amplicacin de 16S rRNA y secuenciacin
Los cebadores universales para la amplicacin de los ge-
nes 16S rRNA, con la secuenciacin subsiguiente de los
productos, se pueden utilizar para la identicacin de
los aislados bacterianos y la deteccin de agentes patge-
nos en las muestras clnicas; este planteamiento ha susten-
tado el diagnstico de endocarditis infecciosa y el examen
de muestras de LCR en el caso de sospecha de meningitis.
La principal ventaja de los cebadores universales radica
en que las alcuotas de muestras clnicas son innecesarias
cuando se buscan con base en un lmite particular de agen-
tes patgenos, de tal forma que se conserva el volumen de
la muestra y se evitan errores vinculados con la seleccin
especca de microorganismos del anlisis. En la actuali-
dad se utiliza esta tecnologa para buscar causas infeccio-
sas antes desconocidas de la enfermedad clnica, como la
esclerosis mltiple. La causa de la angiomatosis bacilar,
Bartonella henselae, se reconoci de esta manera.
Microensayos de DNA/RNA
Dado que ya se han establecido las secuencias genmicas
parciales o completas de muchos agentes patgenos bac-
terianos, se puede emplear la tecnologa de microensayos
para medir los grados de transcripcin y detectar polimor-
smos de la secuencia. Las sondas de DNA se inmovilizan
sobre un soporte slido y se utilizan para reconocer DNA
o RNA luego de la amplicacin por PCR. Los trozos de
baja densidad son ms convenientes para las aplicaciones
clnicas de rutina debido a su simplicidad, fcil procesa-
miento de datos, reproducibilidad incrementada y bajo cos-
to. Los microensayos se pueden desarrollar para detectar
lmites de agentes patgenos en una sola muestra clnica
(por ejemplo, LCR) o establecer con rapidez resistencia
y sensibilidad antibiticas en un solo aislado. Hoy en da
tales aplicaciones se restringen a laboratorios de investiga-
cin, pero es probable que ingresen al uso diagnstico en
un futuro prximo.
Deteccin molecular de resistencia microbiana
Por tradicin, la resistencia antimicrobiana se determina
con el crecimiento de un agente patgeno bacteriano en
presencia de concentraciones apropiadas de agentes te-
raputicos seleccionados. Para mala fortuna, las tasas de
crecimiento variables de bacterias tienen como efecto un
retraso inherente, de modo que los resultados slo estn
disponibles muchas horas despus del aislamiento inicial
del agente. El incremento de la comprensin de la base ge-
ntica de la resistencia ha permitido el desarrollo de mto-
dos moleculares para detectar en poco tiempo los cambios
genmicos hallados en los fenotipos de resistencia. Este
principio se ha aplicado a la identicacin del gen Mec A
que codica la resistencia a la meticilina en estalococos,
la protena que liga la penicilina en Streptococcus pneu-
moniae y varios de los determinantes de la resistencia a la
rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. No obstante,
los mtodos moleculares tienen ciertas limitaciones: los
mecanismos de resistencia desconocidos o novedosos pue-
den omitirse, y cuando el nmero de genes diferentes que
inducen la resistencia es grande, los mtodos moleculares
son costosos. Como resultado, los anlisis fenotpicos son
todava el mtodo de opcin para analizar a la mayor parte
de las bacterias.
Epidemiologa y tipicacin
Los mtodos convencionales de tipicacin aplicados a
las bacterias incluyen fagotipicacin y serotipicacin.
Muchas veces, dichos mtodos muestran un poder bajo
de discriminacin y escasa reproducibilidad, sobre todo
cuando se aplican a microorganismos de crecimiento len-
to, como Mycobacterium tuberculosis. Las secuencias IS
6110 repetidas del DNA muestran suciente polimorsmo
para permitir un esquema de tipicacin basado en la am-
plicacin por PCR de la secuencia de insercin y la tc-
nica Southern blotting de los fragmentos de la enzima de
restriccin. Las cepas que portan slo una copia nica de la
secuencia de insercin no pueden separarse por la tipica-
cin de la IS 6110. Tales aislados pueden investigarse con
otro elemento repetitivo, la secuencia DR (Clewley, 1996).
En cada caso, el gen posee repeticiones directas separadas
por secuencias nicas. La variabilidad de estas secuencias
nicas conduce a diferentes patrones de bandas despus del
corte con enzimas de restriccin (polimorsmo de longitud
de fragmentos de restriccin). El mtodo desarrollado para
amplicar y marcar secuencias de DNA en la regin DR se
conoce como espaciador de oligotipicacin o espoligo-
tipicacin (Marshall y Shaw, 1996). Estos mtodos han
revelado microepidemias insospechadas y delinean la im-
portancia creciente de la tuberculosis como enfermedad de
reciente adquisicin. La tipicacin secuencial multilocus
ha hecho posible reconocer las vas de diseminacin de los
tipos individuales de Staphylococcus aureus multirresis-
tente. Tal herramienta tiene ventajas sobre la electroforesis
en gel de campo pulsado (PFGE), entre ellas la facilidad
del ingreso de informacin en una base de datos.
Problemas con los mtodos moleculares
Aunque los mtodos moleculares han conducido a avances
en el diagnstico y tratamiento de la infeccin, an son
problemas de importancia. Los recursos necesarios de es-
tas tcnicas suelen ser ms grandes que los de los mtodos
convencionales que tratan de reemplazar. El equipo espe-
cializado y los reactivos, junto con la necesidad de entrena-
miento adicional del operador, han limitado la aplicacin
de los mtodos moleculares en los laboratorios de diag-
nstico comunes. La importancia clnica de la sensibili-
dad incrementada de los anlisis basados en el sondeo del
DNA, en particular la amplicacin del DNA, puede ser
incierta. Por ejemplo, un frotis positivo de una muestra de
esputo en la microscopia habitual puede contener alrededor
de 10
4
bacilos tuberculosos. A pesar de esta falta relativa de
sensibilidad, los hallazgos son de gran valor clnico para
predecir la infectividad. En contraste, es menos segura la
importancia de un anlisis positivo con PCR para M. tu-
berculosis realizado sobre una muestra de esputo tomada
de un paciente sometido a terapia apropiada.
Est bien documentado el dao de las reacciones falsas
positivas debido a la prctica excesiva de la amplicacin
del DNA. En contraste, los volmenes limitados de prueba
utilizados en estos mtodos pueden dar lugar a resultados
falsos negativos en virtud del error de muestreo relacionado
con la distribucin irregular de los agentes patgenos en las
muestras clnicas. Por ltimo, los mtodos moleculares de
primera generacin se disearon para detectar slo la pre-
sencia o ausencia de un agente patgeno y no suministran
informacin acerca de la viabilidad del microorganismo.
Las tcnicas convencionales para determinar la viabilidad
dependen de la demostracin de la integridad o la activi-
dad celulares y es escasa la correlacin entre la deteccin
del DNA y la viabilidad. Los objetivos moleculares para
valorar la viabilidad incluyen mRNA y rRNA. Las especies
de rRNA de vida media ms larga y su retencin varia-
ble secundaria a una variedad de tratamientos bacterianos
hacen del rRNA un indicador menos exacto de viabilidad
que los objetivos mRNA (Keer y Birch, 2003). Aunque los
anlisis posteriores corrigieron este defecto, tienden a ser
complejos y ms difciles de realizar.
Aplicacin futura
Es posible que se desarrollen mtodos moleculares apro-
piados para otros agentes patgenos cuyo crecimiento es
difcil en cultivo, como las bacterias anaerobias, o en los
casos en que la terapia antibitica antecede a la obtencin
de las muestras para el diagnstico, como la infeccin de
las vas respiratorias y la osteomielitis. Los mtodos mo-
leculares pueden proporcionar informacin til en cuanto
a la virulencia probable de los aislados clnicos de esta-
lococos negativos a la coagulasa y estreptococos hemo-
lticos alfa. La genotipicacin puede ser de utilidad en
estudios sobre la extensin de la resistencia antibitica y
los mecanismos de la infeccin cruzada en los hospitales.
Si bien los mtodos moleculares no han revolucionado en
gran proporcin el campo de las enfermedades infeccio-
sas, la introduccin de estaciones de trabajo automatizadas
mejorar la estandarizacin, reducir costos y conducir a
una aplicacin ms amplia de los mtodos moleculares en
el laboratorio clnico.
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APLICACIN FUTURA 157
Introduccin
Una parte importante del trabajo en un laboratorio de bac-
teriologa diagnstica es el cultivo de bacterias. Tal iden-
ticacin posibilita el diagnstico denitivo, sobre todo
cuando crecen agentes patgenos; empero, cuando el cre-
cimiento es de microorganismos comensales, su papel no
puede relacionarse con la enfermedad. Otros problemas de
la tcnica de cultivo en relacin con el diagnstico son el
difcil crecimiento de algunas bacterias (p. ej., Legionella
pneumophila, causante de la enfermedad de los legiona-
rios), la imposibilidad de cultivar algunas (p. ej., Trepo-
nema pallidum, que provoca la slis) y el peligro notable
que entraa el cultivo de otras (como Brucella abortus, que
ocasiona la brucelosis). A pesar de estas limitaciones, el
cultivo de bacterias es todava el apoyo principal del labo-
ratorio de bacteriologa diagnstica.
Este captulo considera otros mtodos de identicacin
de bacterias como origen potencial de la enfermedad. Las
aproximaciones directas para el diagnstico son la iden-
ticacin de bacterias (deteccin del antgeno) o el reco-
nocimiento de anticuerpos especcos para la presencia de
bacterias (deteccin del anticuerpo). Las tcnicas para de-
tectar anticuerpos, IgM, aumentos cudruples del anticuerpo
IgG, baja avidez de IgG o valores elevados de IgA pueden
develar la infeccin en curso. Es importante recordar que
si bien los resultados de un anticuerpo pueden delinear la
infeccin, sta puede no ser la causa de la enfermedad. Por
lo tanto, una prueba especca sensible de IgM para Toxo-
plasma gondii puede ser positiva sin tener relacin con los
sntomas; puede tratarse tan slo de una infeccin pasada.
La formacin del complejo inmunitario es un proceso
natural durante cualquier infeccin. Por muchas dcadas
han existido mtodos intrincados e imaginativos que tra-
tan de identicar microorganismos especcos dentro de
los complejos inmunitarios. El xito ha sido limitado, pero
esta rea constituye todava un gran desafo intelectual para
los microbilogos. Por ltimo, las pruebas indirectas de la
infeccin bacteriana se realizan en muchos laboratorios de
bacteriologa. Estas pruebas se incluyen en dos grupos. En
el primero, los marcadores de una infeccin particular pue-
den utilizarse para reconocer al agente patgeno (como la
cromatografa de gas-lquido y las pruebas de respiracin).
El segundo grupo emplea los marcadores generales de las
infecciones y no son especcos de una bacteria particular
(como la protena C reactiva).
Pruebas para el anticuerpo
Aunque todos los lquidos corporales se pueden analizar
para anticuerpos, en la bacteriologa diagnstica se ana-
liza por lo regular una muestra srica. En individuos in-
munocompetentes, la infeccin por bacterias produce casi
siempre el anticuerpo especco contra ese agente. Los an-
ticuerpos son protenas elaboradas en el suero (el comparti-
miento de la sangre libre de clulas) y conforman molculas
complejas de diversos tipos (llamadas inmunoglobulinas).
Las inmunoglobulinas participan en diversos mecanismos
de defensa contra bacterias invasivas. Hay cinco tipos de
inmunoglobulinas en el ser humano, pero para la bacterio-
loga diagnstica, IgM e IgG son las de mayor uso (IgA
e IgE son mucho menos importantes). El anticuerpo IgM
aparece al inicio del curso de la infeccin (durante la pri-
mera semana) y es diagnstico de la infeccin en curso.
El anticuerpo IgG se forma ms tarde en la infeccin
15
Otras pruebas en bacteriologa
Darrel Ho-Yen
160 CAP. 15 OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGA
(en la segunda semana) y las ms de las veces es indica-
tivo de infeccin e inmunidad pasadas. El anticuerpo IgG
tambin cruza la placenta y conere inmunidad al recin
nacido. La IgA es la inmunoglobulina mucosa principal
y la IgE interviene en particular en reacciones alrgicas;
no obstante, ambas son incapaces de cruzar la placenta
y tienen utilidad diagnstica en el recin nacido. La IgM
no cruza la placenta, pero una cuarta parte de los neona-
tos no produce IgM. Los aumentos y descensos de estas
inmunoglobulinas (IgM, IgG, IgA e IgE) en el suero son
diferentes y tales diferencias pueden usarse para medir el
inicio de una infeccin, por ejemplo el diagnstico de la
infeccin durante el embarazo.
Pruebas ms antiguas
Pruebas de aglutinacin
Los anticuerpos especcos presentes en el suero pueden
aglutinar a las partculas bacterianas o partculas de ltex cu-
biertas con antgenos bacterianos. Un ejemplo de una prue-
ba de aglutinacin es el mtodo de aglutinacin directa para
la deteccin del anticuerpo contra Brucella abortus. En esta
prueba, una suspensin de B. abortus se agrega a una serie
de diluciones con suero del paciente contenida en tubos de
ensayo. Los tubos se incuban por una hora o ms tiempo,
casi siempre a 37C, y a continuacin se interpreta el resul-
tado. Para detectar la aglutinacin ms tenue, la prueba se
puede incubar durante la noche para incrementar su sensibi-
lidad. La aglutinacin se observa al golpear con suavidad los
tubos para perturbar las clulas; stas ascienden en el lquido
en la forma de agregados o, como en el caso de los controles
negativos, como suspensin na dispersada. Las pruebas de
aglutinacin se pueden adaptar con facilidad al uso en por-
taobjetos y resultan rpidas y fciles de realizar.
Las pruebas de aglutinacin son en particular sensibles
en presencia de anticuerpos de IgM dado que esta clase de
inmunoglobulina se aglutina mejor que otras. No obstante,
debe recordarse que el anticuerpo IgM no induce siempre
aglutinacin y son posibles resultados falsos negativos. Un
problema tcnico es el efecto prozona, en el cual la aglutina-
cin no se observa a concentraciones ms altas del anticuer-
po debido a la inhibicin estrica en los sitios de unin con
el anticuerpo; slo es obvia cuando se diluye la muestra.
Los eritrocitos (como los de oveja) pueden tambin
cubrirse con antgenos bacterianos. El anlisis de hemaglu-
tinacin de Treponema pallidum (TPHA) se emplea para el
diagnstico de la slis. Estas pruebas de la partcula reves-
tida tienen la ventaja de no sufrir ninguna autoaglutinacin,
es decir, la aglutinacin de las partculas se efecta a travs
de la simple adherencia de la protena, lo cual es un proble-
ma frecuente con las suspensiones bacterianas.
Pruebas de jacin del complemento
El suero del paciente se calienta primero a 56C para destruir
el complemento. En la segunda etapa se mezcla el suero en
una gama de diluciones con el agente patgeno o sus antge-
nos. Se agrega una fuente del complemento, que en condi-
ciones normales es una alcuota de suero fresco de cobayo,
y la mezcla se incuba. Los complejos antgeno-anticuerpo
formados entre las bacterias y la muestra del paciente ac-
tivan el complemento del cobayo y por tanto lo eliminan
de la mezcla. Al nal del periodo de incubacin, todas las
mezclas se eliminan en la tercera etapa de la prueba, para la
cual los reactivos se preparan de eritrocitos de una especie
conveniente sensibilizada con el anticuerpo contra los an-
tgenos del eritrocito. De manera caracterstica se utilizan
los eritrocitos de la oveja, que se sensibilizan con el anti-
cuerpo del eritrocito antioveja del conejo, de tal forma que
los eritrocitos se cubren con el anticuerpo en ausencia del
complemento. Si el complemento se encuentra presente en
la segunda etapa, los eritrocitos sensibilizados se lisan. Por
lo tanto, la lisis indica que las muestras del paciente en la
segunda etapa del procedimiento no tenan algn anticuer-
po presente, mientras que la ausencia de lisis seala que el
anticuerpo estaba presente y que el complemento se utiliz
hasta la segunda etapa.
Las pruebas de jacin del complemento se han usado con
alguna frecuencia para muchos propsitos, como el diagns-
tico de la infeccin por Brucella. Existen muchos problemas
potenciales con estas pruebas. Su conabilidad depende de la
estandarizacin de todos los reactivos de la prueba antes de su
realizacin. Adems, no es raro encontrar sustancias en suero
que ejercen efectos anticomplemento.
Pruebas de precipitacin
El principio seala que un anticuerpo, en especial IgG, pre-
cipita al antgeno soluble. La precipitacin se puede reali-
zar en solucin acuosa en tubos de ensayo, pero se efecta
con ms frecuencia mediante el mtodo de Ouchterlony.
Esta prueba utiliza una placa (placa de Petri) que contiene
1 a 2% de agar comn, con celdas perforadas que se llenan
de antgeno (del agente patgeno de inters) o el anticuer-
po (suero del paciente). El formato general se muestra en
la gura 15-1. El antgeno y el anticuerpo se difunden uno
hacia el otro a travs del agar y donde se encuentran se
forma una lnea de precipitacin. Casi cualquier antgeno
puede usarse, a condicin de que se difunda con facilidad.
Con un anticuerpo de especicidad conocida puede preci-
sarse la identidad de un antgeno desconocido. Esta clase
de prueba se puede emplear con las toxinas bacterianas,
como las relacionadas con el ttanos y la difteria.
PRUEBAS PARA EL ANTICUERPO 161
Pruebas recientes
El principio de estas pruebas establece que el anticuerpo del
paciente presente en el suero se une a un sustrato que se pro-
porciona bajo la forma de bacterias o sus productos unidos a
una supercie slida. Despus, las protenas indeseables del
suero se lavan a partir del sustrato y un segundo anticuer-
po, casi siempre cultivado en conejos, ovejas o cabras, que
es especco contra el anticuerpo humano y est marcado
de forma apropiada, se agrega en la segunda etapa de la
prueba. Si el anticuerpo del paciente se une al sustrato en
la primera etapa, el anticuerpo de la segunda etapa tambin
se liga. El marcador, o la marca, es variable, pero en cual-
quier caso debe cuanticarse con facilidad. Por ejemplo, en
la tcnica del anticuerpo uorescente, este marcaje se rea-
liza con uorescena, que puede visualizarse bajo luz ultra-
violeta, mientras que en el ensayo inmunoabsorbente ligado
a enzimas (ELISA) se emplea una enzima que puede actuar
con posterioridad sobre un sustrato conveniente para produ-
cir un cambio de color mensurable. El nmero de marcajes
disponibles es muy grande e incluye marcados radiactivos,
pero el principio es el mismo para todas estas pruebas.
Pruebas con anticuerpos uorescentes
Se utilizan portaobjetos especiales, muchas veces cubiertos
con ten, los cuales tienen 10 lugares para que puedan
examinarse varias muestras en un solo portaobjetos. Una
suspensin del microorganismo de la prueba se seca sobre
el portaobjetos, se ja en acetona o etanol y se aaden los
sueros de los pacientes. Despus de la incubacin (por lo
regular 30 min) se lava la laminilla y se agrega la inmunoglo-
bulina antihumana (IgG, IgM o IgA), que se ha marcado
con uorescena. Despus de la incubacin y el lavado, se
aplican los cubreobjetos y el portaobjetos se examina bajo
un microscopio ultravioleta. Si la muestra contiene el an-
ticuerpo contra el patgeno de la prueba, ese anticuerpo se
une a l y reacciona con la antiinmunoglobulina marcada
para producir microorganismos que emiten uorescencia
verde brillante bajo la luz ultravioleta. Mediante una serie
de diluciones del suero del paciente es posible cuanticar
la cantidad de anticuerpo presente. Existen varios proble-
mas con estas pruebas; por ejemplo, son muy laboriosas y
la lectura del resultado nal es subjetiva y depende de la
experiencia del observador. Adems, la luz ultravioleta da
lugar a que la uorescencia se atene, de modo que las ob-
servaciones deben ser bastante rpidas. Por lo regular, estas
pruebas son mejores con los antgenos de la pared celular,
dado que los anticuerpos casi nunca penetran en los agen-
tes patgenos para detectar antgenos internos. La prueba
no es fcil de utilizar para la medicin del anticuerpo IgM.
A pesar de estas dicultades, las pruebas con anticuerpos
uorescentes han sido muy tiles y todava se usan en el
diagnstico de la slis.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Este mtodo sumamente difundido puede estar por com-
pleto automatizado, pero por lo regular es semiautomtico.
De manera caracterstica, se usan microplacas de plstico
con 96 celdillas, que pueden alojar una gran cantidad de
muestras as como controles que pueden lavarse de mane-
ra automtica y centrifugarse en caso necesario; los resul-
tados los genera y analiza un lector automtico. Muchas
tcnicas de ELISA estn disponibles en el comercio. Las
muestras se pipetean dentro de las celdillas revestidas con
el antgeno, se incuban y se lavan, y se aade la inmunoglo-
bulina antihumana marcada con una enzima. Despus de la
incubacin y el lavado extensos se agrega un sustrato para
la enzima. Existe un cambio de color del sustrato si la en-
zima est presente y el lector automtico lo puede analizar.
La intensidad del color es proporcional a la cantidad de an-
ticuerpo que se une al antgeno; por lo tanto, el mtodo es
del todo cuantitativo. Sin embargo, es importante recordar
que esto es verdad slo si hay un exceso de antgeno unido
a la placa y si se proporciona un exceso de inmunoglobuli-
na antihumana en las fases posteriores. Estas condiciones
estn garantizadas en los dispositivos comerciales, pero es
importante atender estos detalles con tcnicas internas.
La antiinmunoglobulina usada puede ser anti-IgM, anti-
IgG, anti-IgA, etc., y por tanto la prueba ofrece una ruta
fcil para determinar el tipo de anticuerpo presente en las
Figura 15-1 Formato de la prueba de precipitacin de Ouchter-
lony.
diferentes etapas de la infeccin. El aspecto ms valioso de
esto es la medicin de IgM como marcador temprano de in-
feccin aguda. Los mtodos de ELISA son fciles de utili-
zar, baratos y menos laboriosos que muchos otros mtodos
serolgicos. Como una nota tcnica de menor importancia,
para los anlisis internos es esencial reconocer que las las
externas de las placas de ELISA suelen ser dudosas como
adsorbentes. Este problema puede superarse si se usan slo
las las internas.
Mtodos radioinmunomtricos
stos fueron los precursores de las pruebas ELISA y el
principio es el mismo. Por lo general, se realizan en tu-
bos en lugar de celdillas; la nica diferencia signicativa
radica en que la antiinmunoglobulina agregada est radio-
marcada, casi siempre con
131
I o
125
I. Debido a los peligros
potenciales de la radiactividad, estas pruebas se utilizan rara
vez hoy da, aunque tienen mayor sensibilidad que la tcni-
ca ELISA y pueden emplearse en ciertos trabajos de investi-
gacin en los que se requiere una medida meticulosa.
Pruebas para el antgeno
Las pruebas para el antgeno microbiano ganan cada vez ms
aceptacin. La razn principal de ello es que el antgeno est
presente en fase temprana de la infeccin y por lo tanto su
deteccin proporciona informacin clnica de utilidad. Un
buen ejemplo es la deteccin de los antgenos de Legione-
lla pneumophila en la orina de pacientes con la Enfermedad
de los Legionarios. Estas pruebas son a menudo positivas
cuando el sujeto est grave y agudamente enfermo, si otros
procedimientos diagnsticos no son convenientes.
Sin embargo, existen otros ejemplos, uno de los cuales,
la identicacin de los antgenos de Neisseria meningitidis
en casos de septicemia o meningitis por este microorganis-
mo, ha funcionado por muchos aos. De manera original,
este mtodo emple una tcnica llamada contrainmuno-
electroforesis, que es una variante de los mtodos de pre-
cipitacin que se presentaron antes. En esencia, el suero
del paciente se separa en un gel de agar al pasar un po-
tencial elctrico a travs de l, lo cual da lugar a que las
protenas humanas y el antgeno meningoccico migren
a posiciones diferentes y se separen. A continuacin, se tra-
za una ranura en sentido longitudinal en el gel junto a las
protenas separadas y se aade en la misma un anticuerpo
especco contra el antgeno microbiano de inters. La di-
fusin del anticuerpo hacia las protenas separadas detecta
la presencia del antgeno microbiano, si se encuentra all.
Al igual que otros mtodos de precipitacin, la contrain-
munoelectroforesis es relativamente insensible y la mayor
parte de los ensayos para detectar y medir el antgeno mi-
crobiano utiliza ahora los sistemas de ELISA. La modi-
cacin requerida a la tcnica de ELISA consiste en utilizar
el anticuerpo especco para el antgeno de inters en la
supercie de las celdillas de la microplaca. Este anticuerpo,
las ms de las veces un anticuerpo monoclonal, se usa para
capturar el antgeno de la muestra del paciente. En una
segunda etapa, el anticuerpo, que es especco para el an-
tgeno y est marcado por medios enzimticos, se agrega y
se lleva a cabo el resto del procedimiento. Suele aceptarse
que la captacin del anticuerpo y la deteccin del anticuer-
po deben ser diferentes, aunque la prueba trabaje con el
mismo anticuerpo en ambos lados del emparedado. Em-
plear los anticuerpos monoclonales para ambos propsitos
o usar uno policlonal y uno monoclonal son, en esencia,
una cuestin de ensayo y error.
Esta clase de aproximacin ha sido en particular til
para el diagnstico de infecciones vricas como el HIV y
los virus de la hepatitis. Para las bacterias se ha observado
una tendencia a tratar de simplicar los mtodos mediante
las partculas de ltex en una prueba de aglutinacin; las
partculas se cubren con el anticuerpo contra el antgeno
de inters. Como todas las pruebas de aglutinacin, stas
son relativamente insensibles y no han demostrado ser tan
tiles, como se pens al principio.
Como nota tcnica, si se utilizan muestras de orina o
esputo para reconocer un antgeno, muchas veces es nece-
sario eliminar a los inhibidores. La naturaleza de stos
no est bien establecida, pero con frecuencia basta calentar
la muestra al punto de ebullicin por dos o tres minutos
para eliminarlos. Esto no tiene casi nunca efectos de dete-
rioro sobre el antgeno. En los prximos aos se dispondr
tal vez de mejoras en los mtodos de ELISA para la detec-
cin del antgeno. En especial, deben usarse no slo para
detectar el antgeno, sino para cuanticarlo por completo,
algo que el mtodo puede realizar sin problemas.
Prueba del complejo inmunitario
especco del antgeno
La gura 15-2 muestra un anlisis terico de los sucesos
ocurridos durante una infeccin. El crecimiento de un mi-
croorganismo produce cantidades crecientes de antgeno
microbiano a las cuales responde el husped infectado con
la elaboracin de anticuerpo especco. Al nal, en una re-
accin ecaz, la cantidad de anticuerpo formada suprime
el crecimiento del agente patgeno. Varios puntos merecen
cierta consideracin a partir de este diagrama. Primero, en
una fase inicial hay ms antgeno disponible para la medi-
cin en comparacin con el anticuerpo. En segundo lugar,
el anticuerpo mensurable libre slo aparece de modo tardo
en el curso de la infeccin. Tercero, en el transcurso de
la mayor parte de la infeccin, los complejos inmunitarios
se forman entre el antgeno y el anticuerpo, segn lo re-
presenta el rea delineada en el diagrama. Dado que es-
tos complejos inmunitarios contienen los antgenos de los
microorganismos infectantes, su medicin proporciona un
medio para el diagnstico.
Se ha conocido por muchos aos que la mayor parte de
las infecciones microbianas sistmicas produce valores ele-
vados de complejos inmunitarios en la sangre del pacien-
te. Es raro que este reconocimiento se aproveche con nes
diagnsticos, quiz porque las tcnicas para la medicin de
los complejos han resultado difciles en el pasado. En los
ltimos aos se han descrito los mtodos para diagnosticar
pulmona neumoccica, endocarditis contagiosa, enferme-
dad de Lyme, lepra, meningitis tuberculosa e infeccin por
virus C de la hepatitis, que usaban ensayos del complejo
inmunitario. Algunas de las tcnicas practicadas se discu-
ten a continuacin.
Mtodos que usan polietilenglicol
En estas pruebas, los complejos se precipitan a partir del sue-
ro por la adicin del polietilenglicol. Esto funciona porque
los complejos poseen un tamao diferente de la inmunoglo-
bulina o el antgeno natural. El polietilenglicol se deja actuar
por varias horas, casi siempre toda la noche, y al nal de ese
tiempo la muestra de suero se centrifuga y el precipitado se
elimina para el anlisis adicional. La etapa siguiente de la
prueba supone romper los complejos y reconocer el compo-
nente del antgeno. Esto puede lograrse por calentamiento
(60C por 30 min), con la adicin de un amortiguador de
pH bajo (p. ej., glicina/HCl) o uno de molaridad alta, como
fosfato 1 M. Despus de la rotura de los complejos, se prue-
ba el antgeno mediante uno u otro de los mtodos descritos
con anterioridad, como la tcnica de ELISA.
Medicin directa de ELISA
Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales espec-
cos contra los antgenos de inters unidos a las celdillas de
las microplacas y con reactivo de captacin. Se agrega la
muestra del paciente y se captan los complejos presentes.
En una segunda etapa se aade la inmunoglobulina antihu-
mana marcada de forma enzimtica y se liga a cualquier an-
ticuerpo humano unido a la supercie de la placa mediante
un complejo inmunitario. Esta versin confa en la elevada
especicidad de los anticuerpos monoclonales para jarse
slo a los antgenos de inters. Tambin debe observarse
que el diagnstico por este mtodo se inere, no se prueba,
puesto que se aduce que el anticuerpo del paciente no pue-
de estar presente a menos que se una al antgeno captado
en la placa de ELISA.
Pruebas que utilizan agentes de unin
de complejos inmunitarios
Se conocen muchas sustancias que unen de modo especco
los complejos inmunitarios, como C1q, separado y puri-
cado (el primer componente del complemento), factor reu-
matoide (un anticuerpo desarrollado en algunos pacientes y
dirigido contra IgG humana) y conglutinina (una protena
del suero vacuno); todas ligan complejos inmunitarios. Estas
sustancias se pueden aplicar a las celdillas de la microplaca
de la manera descrita para los ensayos de ELISA en general
y las sustancias jan despus cualquier complejo inmunitario
presente en la muestra del paciente; entonces se determina la
naturaleza del complejo con un anticuerpo marcado por me-
dios enzimticos contra los antgenos de inters. Muchos de
los informes sobre el uso de esta clase de anlisis son en la
actualidad experimentales, pero ofrecen rapidez y economa
y muestran ser ms sensibles que los mtodos ya descritos.
Tal vez se empleen con regularidad en el futuro.
Otras pruebas
Pruebas cromatogrcas
Como se describi con anterioridad, se puede utilizar la
deteccin del antgeno de los microorganismos como un
OTRAS PRUEBAS 163
Figura 15-2 Diagrama de los aspectos tericos de las interac-
ciones antgeno-anticuerpo en una infeccin.
marcador de su presencia en una infeccin. De la misma
forma, la deteccin de metabolitos de los agentes pat-
genos se utiliza para sealar la presencia del microorga-
nismo. La identicacin de los metabolitos se realiza por
cromatografa de gas-lquido o cromatografa lquida de
alta resolucin, aunque la primera representa el ejemplo
de diagnstico mejor conocido.
La cromatografa de gas-lquido se utiliza para separar
e identicar cidos grasos voltiles y no voltiles al hacer
pasar una muestra a travs de una sustancia de separacin
conveniente (p. ej., Chromasorb) mediante un ujo de gas
acarreador. Los diferentes cidos grasos se separan en
tiempos diferentes. Una aplicacin temprana fue la identi-
cacin del arabinitol en el suero de individuos con infec-
cin sistmica por Candida albicans. De manera inicial se
pens que las concentraciones elevadas de este metabolito
se vinculaban slo con esa infeccin, pero investigaciones
subsecuentes probaron que la medicin fue un marcador
diagnstico poco conable. Se arma que la presencia de
esos microorganismos en pus y exudados puede determi-
narse de modo directo, aunque no es prctica comn utili-
zar el mtodo en muestras de rutina. Ms acertado ha sido
el uso del mtodo para identicar y clasicar bacterias
anaerobias, en particular patgenos gramnegativos.
Pruebas de respiracin
Estas pruebas no invasivas se han empleado para identi-
car Helicobacter pylori, ahora reconocido como causal
de lceras duodenales. H. pylori tiene una enzima de gran
alcance, la ureasa, que puede hidrolizar la urea marcada
de forma radiactiva e ingerida para liberar el CO
2
marca-
do; a continuacin se mide en la respiracin exhalada. Para
la prueba se usan dos istopos,
13
C y
14
C: el primero es
ms seguro pero ms costoso que el segundo. Las pruebas
son semicuantitativas, y puesto que la urea se distribuye a
lo largo del estmago, no hay error de muestreo. La sen-
sibilidad y la especicidad de estas pruebas se comparan
bien con el cultivo y la histologa. Las pruebas se pueden
emplear para el diagnstico de H. pylori o supervisar la
respuesta al tratamiento.
Desarrollos futuros
Existen varios desafos en el rea general de la serologa.
El primero es tratar la cuestin de la velocidad de los re-
sultados. Un resultado lento (es decir, varios das) es de
inters acadmico o intil en trminos del diagnstico y el
tratamiento de la infeccin. Es claro que el antgeno o la
deteccin del complejo inmunitario especco del antgeno
ofrecen una va ms rpida para el diagnstico respecto del
reconocimiento del anticuerpo y por lo tanto es deseable el
desarrollo de estos anlisis.
Adems, el antgeno y los anlisis del complejo inmuni-
tario especco del antgeno pueden ser por completo cuan-
titativos, y utilizados de forma correcta con mediciones
seriadas, pueden valorar la gravedad de cualquier infeccin
y la respuesta a la teraputica. No deja de ser decepcionan-
te que estos mtodos se usen hasta la fecha casi siempre de
manera cualitativa; en el futuro se espera ms un cambio
de esta posicin que las mejoras de la tecnologa.
Un desafo real para el futuro es la aplicacin de algu-
nos de los mtodos mencionados a las infecciones conse-
cutivas a patgenos comensales. Existen muchos casos,
pero el diagnstico y el control de la infeccin grave por
Escherichia coli sirven como ejemplo til. Las tcnicas
convencionales son con frecuencia intiles y los mtodos
de PCR, como se emplean hoy da, tienen poco qu ofrecer
porque slo identican la presencia del microorganismo.
El reto consiste en saber lo que hace el agente patgeno.
En consecuencia, el futuro debe enfocarse en la cuanti-
cacin cada vez ms compleja del antgeno, se halle ste
libre o en complejos; es probable que los inmunosensores
o sus equivalentes participen en este desarrollo. Dado que
la mayor parte de los mtodos serolgicos depende de la
interaccin antgeno-anticuerpo y sta ocurre en el lapso
de minutos, es sorprendente que casi todas las pruebas dis-
ponibles tomen varias horas y deban utilizar suero aislado.
Los mtodos que pueden cuanticar el antgeno micro-
biano dentro de cinco minutos, mediante secreciones de
sangre completa o del cuerpo, son antiguas y su desarrollo
representa un verdadero desafo para el futuro.
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16
Control de la quimioterapia antimicrobiana
Ian M Gould
Introduccin
Puede armarse que la era moderna de la quimioterapia
empez hace ms de 100 aos con el trabajo pionero de
Robert Koch; l y otros describieron la teora del germen
de la enfermedad que permiti el desarrollo del concep-
to de balas mgicas, es decir, agentes que destruan a los
microbios sin daar al husped. Las primeras sustancias,
derivadas del mercurio, antimonio y arsnico, demostraron
ser muy txicas para su uso general, aunque encontraron un
papel marginal en el tratamiento de la slis. Desde enton-
ces se hicieron grandes avances en la mayor parte de las
reas de la quimioterapia antimicrobiana, pero los deriva-
dos de estos primeros agentes todava se emplean para cier-
tas enfermedades parasitarias, como la leishmaniosis y la
enfermedad del sueo.
En el decenio de 1930, industriales y cientcos alema-
nes trabajaron juntos para crear los primeros antimicro-
bianos modernos, las sulfamidas, medicamentos derivados
de los colorantes. A stas les sigui en poco tiempo el descu-
brimiento de los antimicrobianos naturales (antibiticos),
como la penicilina (que descubri en realidad Alexander
Fleming en 1928, aunque primero se us para tratar las in-
fecciones durante la Segunda Guerra Mundial). Al princi-
pio el frmaco era tan escaso que los mdicos recolectaban
la orina de los pacientes tratados para extraer la droga del
milagro y reutilizarla en otros enfermos.
En consecuencia, la era de la quimioterapia, tal y como
se entiende ahora, comenz durante los decenios de 1940,
1950 y 1960, lapso en el que se hicieron grandes avances
con los descubrimientos de nuevos antibiticos, se apren-
di a sintetizarlos y se elaboraron frmacos por completo
nuevos, como las quinolonas.
Los primeros postulados de la quimioterapia
Desde la dcada de 1940 se comprendi que los diversos
antibiticos actuaban de forma sinrgica con las bacterias
de diferentes maneras, de tal modo que poda afectarse el
rgimen posolgico ptimo. Un decenio ms tarde result
evidente la resistencia a casi cualquier antibitico desa-
rrollado despus de su uso prolongado. Las primeras apli-
caciones clnicas de estos dos principios fundamentales de
la ciencia de la quimioterapia tuvieron lugar en el trata-
miento de la tuberculosis, una enfermedad con una inciden-
cia anual y un ndice de mortalidad medidos en millones.
El principio original del control de la terapia aprendido
en esos primeros das fue la aplicacin del conocimiento
sobre los parmetros de dosis y respuesta (farmacodinmi-
cos) de la interaccin antimicrobiano-microbio, que con-
dujo al tratamiento intermitente (dos veces por semana)
con rifampicina e isoniacida. Esto fue factible debido al
efecto supresor prolongado de estos antimicrobianos so-
bre el crecimiento del bacilo tuberculoso mucho despus
de la excrecin de los frmacos y permiti la indicacin de
regmenes teraputicos de uso ms fcil, lo que se tradujo
en notorias mejoras. Esta supresin prolongada del creci-
miento se conoce como efecto posantibitico.
Cuando se elabor el primer frmaco antituberculoso, la
estreptomicina, se reconoci que la respuesta inicial con-
duca a la recada despus de algunas semanas debido a que
las bacterias sobrevivientes se tornaban resistentes al mis-
mo. En efecto, ahora se entiende que la terapia simultnea
con tres frmacos activos (terapia triple) es esencial para
la remisin de la tuberculosis sin el riesgo del desarrollo
de cepas resistentes. ste es el segundo principio, de suma
relevancia para el tratamiento antimicrobiano de muchas
166 CAP. 16 CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA
infecciones, e ilustra cun necesaria resulta la prueba pri-
maria de la sensibilidad de los aislados como gua tera-
putica. El uso habitual de esas pruebas de sensibilidad
por los laboratorios de diagnstico clnico empez en ese
momento (nales del decenio de 1950 y principios del de
1960) y ahora tienen un uso extendido en todo el mundo.
La observancia de la terapia es otro principio importan-
te del control de la quimioterapia, aprendido en aquellos
primeros das del tratamiento de la tuberculosis, y es en
particular importante para las enfermedades en las que la
curacin depende de la terapia prolongada (seis a 18 me-
ses). Para mala fortuna, muchas de las vctimas de la tu-
berculosis provenan de estratos sociales empobrecidos,
lo que haca difcil la observancia teraputica. Pronto se
conoci que el tratamiento fracasaba con frecuencia en esta
situacin, a menudo debido al desarrollo de microorganis-
mos resistentes. Por lo tanto, gan aceptacin la terapia de
observacin directa. De manera alternativa, puede anali-
zarse la orina de los enfermos para reconocer la presencia
de frmacos excretados. En fecha reciente, estas lecciones
bsicas tuvieron que reaprenderse en Nueva York, en don-
de los recortes de los servicios sociales y mdicos condu-
jeron a la cesacin de la terapia de observacin directa, lo
que propici un enorme brote de tuberculosis multirresis-
tente con un alto grado de letalidad.
Resistencia antibitica (cuadro 16-1)
Desafortunadamente, el propio xito de la quimioterapia
antimicrobiana condujo a su declinacin. Los mdicos y
pacientes consideran a los antimicrobianos como una pana-
cea que cura toda afeccin, as que los antimicrobianos se
prescriben de manera irrestricta. Este sobreuso se vincula
de forma inextricable con la resistencia, bajo la forma de
un fenmeno de seleccin natural que permite la supervi-
vencia de cepas resistentes. La mayor parte de la poblacin
del mundo puede comprar antibiticos legal o ilegalmente,
aunque en muchos pases estn disponibles slo con rece-
ta mdica. Estos medicamentos representan una industria
mundial multimillonaria y se ha creado un gran mercado
negro con estos frmacos. Los habitantes del Tercer Mun-
do, que requieren los antibiticos con ms frecuencia de-
bido a sus ndices de infeccin muy elevados, no pueden
permitirse el consejo mdico apropiado, las pruebas de la-
boratorio o los cursos completos de tratamiento necesarios
para erradicar las infecciones; en consecuencia, la resis-
tencia antibitica es un problema particular en estas reas
del mundo, sobre todo en las zonas urbanas necesitadas.
Incluso en los pases ricos de Europa occidental y Nor-
teamrica, los clnicos emplean mal los antimicrobianos y
en los ltimos 10 aos se han identicado tendencias muy
preocupantes de la resistencia. El mal uso incluye prescrip-
ciones en las cuales el agente, la dosis, la duracin o la va
de administracin no se indican o son incorrectos. Mien-
tras que el uso ejerce una presin acumulativa sobre la se-
leccin de cepas resistentes (casi siempre por mutacin o
adquisicin de plsmidos resistentes) en los planos indi-
vidual y social, las dosis bajas por periodos prolongados
suscitan resistencia con ms probabilidad que el mismo
peso total del frmaco administrado como una dosis ms
alta por un periodo ms corto. Ante esta situacin, muchos
pases han introducido campaas educativas pblicas y
profesionales. Las del Reino Unido han sido en especial
exitosas en la reduccin del uso de antibiticos por la co-
munidad, aunque la utilizacin hospitalaria contina quiz
en aumento y prosiguen todava los problemas principales
de la resistencia, como el caso del multirresistente Staphy-
lococcus aureus.
Penicilina/neumococos
Penicilina/meningococos
Staphylococcus aureus multirresistente
Glucopptido/enterococos
Ciprooxacina/E. coli
Gentamicina/Pseudomonas
Ceftacidima/Klebsiella
Amoxicilina/Haemophilus
Amoxicilina/Moraxella
Ciprooxacina/Campylobacter
1997
Reino Unido Sur de Europa
10 50
0 40
5 75
1 5
2 15
3 40
1 20
20 30
80 80
1 40
Cuadro 16-1 Tendencias en los niveles de resistencia (%)
2003
Reino Unido Sur de Europa
5 50
0 40
40 75
5 10
8 30
7 50
10 40
15 40
95 95
10 60
PRINCIPIOS GENERALES DEL CONTROL DEL LABORATORIO DE LA QUIMIOTERAPIA 167
Principios generales del control
del laboratorio de la quimioterapia
En la actualidad existen ms de 100 antibiticos autoriza-
dos para uso clnico en el Reino Unido y muchos ms a
escala mundial. El papel principal del laboratorio de diag-
nstico de un hospital consiste en denir a los agentes
patgenos causantes de la enfermedad en pacientes cuyas
muestras se procesan y, en la medida de lo posible, some-
ter el aislado a prueba para determinar la sensibilidad con
antibiticos relevantes. En condiciones normales, la prueba
se realiza slo en relacin con una serie limitada y prede-
terminada de antibiticos con importancia clnica para la
infeccin y, de manera presumible, activos contra el agen-
te patgeno aislado.
El proceso para determinar los antimicrobianos que se
someten a anlisis es complejo y debe considerar facto-
res como el sitio y la gravedad de la infeccin, el mtodo
de excrecin o el metabolismo del antimicrobiano, la fun-
cin heptica y renal del paciente, la toxicidad, las vas de
administracin disponibles, el costo, la necesidad de una
terapia de combinacin, el benecio clnico probado, el
tratamiento actual con antimicrobianos u otros frmacos
y las interacciones del agente. Aunque hay cerca de 100
antimicrobianos autorizados en el Reino Unido, stos se
componen slo de algunas docenas de clases de frmacos
diferentes y a menudo basta probar un agente representati-
vo de cada clase.
Muchas veces los pacientes iniciaron ya el tratamiento
emprico, antes de contar con los resultados del cultivo y la
sensibilidad, con la esperanza de que el laboratorio conr-
me las muestras. No obstante, an es importante procesar
los especmenes a la brevedad posible y, en caso de que
el tratamiento necesite modicarse a la luz de los resulta-
dos del cultivo y la sensibilidad, se prescribe un agente
ms potente o menos txico. De igual modo, es importante
trasladar con propiedad las muestras y establecer una bue-
na comunicacin para obtener con facilidad un dictamen
y que ste se transmita con rapidez. Tambin es til para
que el laboratorio publique los resmenes de las sensibi-
lidades a varios microorganismos, los clnicos elijan la te-
rapia emprica ms adecuada y los laboratorios participen
en los esquemas de vigilancia con objeto de proporcionar
la advertencia oportuna de la aparicin de variantes raras
o nueva resistencia. Esto permite a los mdicos y funcio-
narios de salud pblica utilizar la informacin y planear
el tratamiento apropiado, adems de contener la expansin
de estas nuevas variantes resistentes; cabe sealar que en el
mundo moderno la propagacin de un pas a otro o de un
continente a otro toma muy poco tiempo (g. 16-1).
Existen otras maneras mediante las cuales el laboratorio
puede dirigir o controlar de manera provechosa la terapia
antimicrobiana. La ms importante es la medicin de las
concentraciones sanguneas, y en ocasiones hsticas, de los
frmacos, para asegurar que se obtienen los valores tera-
puticos adecuados en pacientes muy graves; de ese modo
puede asegurarse una toxicidad reducida al mnimo o nula.
Estas mediciones no son necesarias en la mayora de los
pacientes, slo en aquellos en quienes es necesario utilizar
los antimicrobianos en una proporcin teraputica redu-
cida, es decir, agentes cuyas dosis efectivas necesarias se
aproximan a las que pueden ser txicas. Los aminoglucsi-
dos y los glucopptidos son los ejemplos ms obvios de es-
tos grupos de antibiticos. El uso de dichos medicamentos
en particular txicos debe reservarse para las infecciones
graves en las cuales la eleccin de agentes activos est li-
mitada, a menudo por problemas de resistencia.
No se solicita con frecuencia la medicin de la actividad
antimicrobiana en el paciente, pero se logra con facili-
dad al medir la actividad inhibitoria o cidal del an-
timicrobiano en el suero; para ello se toman casi siempre
muestras antes de administrar una dosis (nivel mnimo) y
una hora despus (nivel mximo). Por lo regular, la distri-
bucin del antimicrobiano en los tejidos es completa para
entonces. Segn sean la farmacodinamia del antimicro-
biano y el estado de la enfermedad, puede ser importante
alcanzar niveles inhibitorios o cidales altos en los puntos
mximos de la muestra; por ejemplo, los aminoglucsidos,
como la gentamicina, tienen una actividad dependiente
de la concentracin. En cambio, en los lactmicos beta es
importante tener actividad durante el periodo completo de
dosicacin debido a su carencia de un efecto posantibi-
tico contra muchas bacterias (dependencia del tiempo).
En individuos muy enfermos suele ser til evaluar be-
necios potenciales de la terapia de combinacin en el la-
Figura 16-1 Un ejemplo de un paciente con notable inmunosu-
presin que sufre infeccin en piel y ojo por Pseudomonas, con la
circulacin sangunea extendida, despus de recibir terapia contra
el cncer que redujo las defensas del cuerpo contra la infeccin.
Alguna vez este tipo de infeccin mataba a los pacientes; en la
actualidad, el tratamiento con antibiticos modernos suele tener
xito. Sin embargo, cada vez son ms comunes estos individuos a
medida que la medicina moderna es ms exitosa y radical. Por lo
tanto, los antibiticos se utilizan cada vez ms, tanto en el hospital
como en la prctica general.
boratorio para predecir los regmenes ms activos. Estas
pruebas pueden ser tiles, sobre todo en la brosis qustica
y en los sujetos inmunosuprimidos o con infecciones como
endocarditis o meningitis, casos en los que es necesario
aniquilar al microbio con los antibiticos sin la ayuda del
sistema inmunitario del husped.
Comprobacin de la sensibilidad
El concepto de prueba de sensibilidad se ha conservado
desde que se introdujo a una escala amplia hace casi 40
aos. Por necesidad, las pruebas deben ser simples, ya
que un laboratorio clnico que atiende a una poblacin de
250 000 sujetos efecta las tcnicas en cientos de microor-
ganismos cada ao. Pese a su simplicidad, las pruebas han
resultado de suma utilidad durante aos para orientar la te-
rapia. Esto es lo que ms sorprende cuando se considera
la complejidad de los casos individuales, en los cuales el
microbio interacta con el sistema inmunitario del husped
en diversas afecciones, quiz sin relacin con el trastorno
sometido a prueba en el laboratorio.
Existen cuatro mtodos para la prueba de sensibilidad
de uso comn: a) difusin en agar (g. 16-2); b) incorpora-
cin en agar; c) macrodilucin en caldo, y d) microdilucin
en caldo. El primero es el ms usado en el Reino Unido (en
cerca de 85% de los laboratorios es el mtodo habitual). En
este mtodo, las cantidades escrupulosamente controladas
de los antibiticos se alojan en discos de papel; stos se
colocan de manera previa en una supercie de la placa de
agar inoculada con un nmero controlado de las bacterias
sometidas a anlisis. Por lo regular se prueban hasta seis
antibiticos por placa. Las placas se incuban en condicio-
nes controladas por 18 a 48 horas, segn sea el ndice de
crecimiento bacteriano. Se miden las zonas de inhibicin
del crecimiento por accin del antimicrobiano difundido y
se relacionan con las bacterias sensibles y resistentes cono-
cidas del control. Los resultados se informan como sen-
sibles o resistentes, con base en el conocimiento de la
farmacocintica especca de cada antimicrobiano, inclui-
das las concentraciones alcanzadas del frmaco en el sitio
de la infeccin. Muchos laboratorios del Reino Unido han
adoptado en fecha reciente los mtodos de difusin en agar
con disco, mucho ms estandarizados, con objeto de per-
mitir una comparacin ms exacta de los resultados para
propsitos de vigilancia (British Society for Antimicrobial
Chemotherapy y National Committee for Clinical Labora-
tory Standards; vanse las Lecturas adicionales).
De manera alternativa, en la dilucin en agar, las concen-
traciones preestablecidas de un antimicrobiano se incluyen
en placas de agar antes de que se vierta y entonces, cuando
se solidica, las bacterias se observan sobre la supercie.
Hasta 30 microbios pueden probarse con un solo agente
por placa. La concentracin ms baja del antimicrobiano
que inhibe el crecimiento visible de las bacterias despus
de la incubacin es la concentracin inhibitoria mnima
(CIM).
Las pruebas de dilucin en caldo para la sensibilidad
antimicrobiana se realizan en tubos de ensayo (macrodi-
lucin) o placas de microtitulacin (microdilucin). Se in-
cuba, a las concentraciones conocidas del antimicrobiano,
un inculo controlado de manera cuidadosa del microbio
que se prueba; ste, a diferencia de la prueba en agar, puede
ser un virus (si se incluye una variedad celular) o ciertos
hongos o parsitos protozoarios, como los parsitos del
paludismo, adems de las bacterias. La CIM es la concen-
tracin ms baja que inhibe el crecimiento (segn lo reve-
la la turbiedad a simple vista). Casi siempre es adecuado
evaluar slo los valores del antimicrobiano que inhibe el
crecimiento; el sistema inmunitario del husped permite la
curacin al destruir a la mayor parte de los microbios des-
pus de someterse a control por el antimicrobiano.
Figura 16-2 Un ejemplo de las pruebas de sensibilidad por
disco. ste es el mtodo ms comn que prueba la sensibilidad
en el Reino Unido. La zona de inhibicin del crecimiento de bac-
terias del husped se determina por la concentracin del antibitico
en cada uno de los discos de papel y la sensibilidad de la bacteria.
En este ejemplo la bacteria es totalmente resistente a cuatro anti-
biticos. Hay zonas pequeas de inhibicin alrededor de dos discos
(la bacteria es an resistente) y zonas grandes de la inhibicin al-
rededor de otros dos discos (sensibles). Este ejemplo de un agente
patgeno multirresistente es cada vez ms comn. La zona impar,
no circular, de la inhibicin de dos discos se debe a que el disco
adyacente entre ellos contiene un antibitico que interacta con
ellos, lo cual da lugar al antagonismo de la accin (intercepcin) y
la sinergia (forma de campana), respectivamente.
AUTOMATIZACIN 169
A diferencia de las pruebas de agar, las concentraciones
bactericidas mnimas (CBM) pueden evaluarse si se crea
un subcultivo de las concentraciones inhibitorias para bus-
car cualquier sobreviviente. La concentracin ms baja con
la eliminacin de 99.9% del inculo original es la CBM.
Para las infecciones complicadas puede ser importante es-
tablecer los valores para agentes patgenos individuales y
cerciorarse de que dichos niveles de actividad se logran en
el paciente.
Las pruebas de CIM, y algunas veces de CBM, se soli-
citan aun en el tratamiento de infecciones difciles, como la
endocarditis y la osteomielitis.
Pruebas con microbios diferentes de las bacterias
La comprobacin de la sensibilidad para microbios dis-
tintos a las bacterias es, por comparacin, muy limitada.
Hasta hace poco tiempo las investigaciones relativas eran
escasas, tal vez debido a la ausencia relativa de antimi-
crobianos ecaces para muchos de estos microbios. Esto
supona que no haba opcin teraputica en caso de resis-
tencia. Desde luego, tambin se han soslayado de cierta
manera los problemas de resistencia. No obstante, en la
actualidad se observa una verdadera explosin de nuevos
agentes, en particular antimicticos y antivricos, en res-
puesta a las necesidades crecientes generadas por nuevas
enfermedades, como el SIDA. Esta enfermedad no slo re-
quiere terapia antivrica especca para el virus HIV, sino
tambin tratamiento para muchas otras infecciones vricas,
micticas, bacterianas y protozoarias, a las cuales pueden
ser ms susceptibles los pacientes.
Es frecuente prescribir terapia antimicrobiana supresora
en los pacientes con HIV por muchos meses o aos, pues-
to que en virtud de la profunda inmunosupresin, es casi
imposible erradicar los microbios de la infeccin. ste es
un ejemplo claro de la aparicin de resistencia, como su-
cedi con la tuberculosis; stas son tambin lecciones para
mejorar la ecacia teraputica y prevenir la aparicin de
la resistencia y, sin duda, sern de utilidad para idear un
tratamiento apropiado del SIDA.
La resistencia es un problema particular en la terapu-
tica de la infeccin vrica primaria por HIV; en sta, para
el momento en que la enfermedad se hace evidente, se ad-
vierte una carga vrica enorme con capacidad de desarro-
llar mutantes resistentes naturales que pueden sobrevivir a
la terapia y multiplicarse. Ahora que ya estn disponibles
nuevos agentes anti-HIV, la deteccin de esas cepas ser
importante en el futuro, de tal modo que pueda individuali-
zarse la mejor terapia de combinacin para cada paciente.
Los recientes desarrollos han permitido la averiguacin
de CIM de bacterias y hongos en placas con agar mediante
el uso de pruebas E
, que contienen gradientes antimicro-

bianos en tiras plsticas, y el valor inhibitorio puede leerse
despus de la incubacin, casi de la misma forma como se
interpretan las zonas de inhibicin en la prueba tpica de
difusin en agar con disco (g. 16-3).
Automatizacin
Mientras la automatizacin se generaliza en los labora-
torios, se llevan a cabo tentativas para adaptar los mto-
dos de prueba existentes para la sensibilidad. Las pruebas
de microdilucin en caldo son tal vez las ms favorables
para la modicacin y las placas prepreparadas disponibles
pueden interpretarse de modo automtico por espectrofo-
tometra. La lectura automatizada de las zonas con inhibi-
cin en las pruebas de difusin en agar con disco tambin
es promisoria en cierto grado.
Los mtodos ms recientes para comprobar la sensibili-
dad son mucho ms susceptibles a la automatizacin y, en
realidad, a menudo la requieren. stos incluyen la nefelo-
metra, la bioluminiscencia, la impedancia o vigilancia de
la conductancia y la citometra de ujo. Mientras estos m-
todos directos no suministren resultados rpidos (dentro
de una a dos horas) acerca de la actividad inhibitoria y qui-
zs tambin de la actividad cidal de los antimicrobianos,
por el momento slo son tcnicas de investigacin.
Muchos de los valores sricos de los antimicrobianos
se cuantican de rutina por mtodos automatizados, por
Figura 16-3 Un ejemplo de la prueba E
para la comprobacin
de la sensibilidad. Las concentraciones graduadas de un antibitico
se incluyen en cada una de las tiras plsticas. Un microorganis-
mo control de sensibilidad conocida se coloca en el exterior de
cada tira y el agente patgeno de la prueba en el interior. En este
caso el microorganismo prueba es muy resistente. El grado de
resistencia o CIM (vase el texto) puede leerse fuera de la tira.
ejemplo EMIT
y TDX
, que utilizan reacciones y uo-

rescencia enzimticas. Los valores de los antimicrobianos
ms recientes se pueden analizar por cromatografa lquida
de alta resolucin o por la tcnica tradicional con placa,
en la cual el suero o la muestra hstica del paciente toman
el lugar del disco que contiene el antibitico en la prueba
de difusin en agar con disco y el campo del organismo se
convierte en una cepa control sensible. Es posible utilizar
la concentracin del frmaco en el suero (volumen cono-
cido) o el tejido (peso conocido) y el tamao de la zona de
la inhibicin para calcular la concentracin del frmaco.
En tanto el anlisis de los valores sricos de ciertos anti-
microbianos no se transforme en una prueba de rutina, el
anlisis de las concentraciones hsticas es slo una tcnica
de investigacin.
Control del hospital y enlace clnico
La base del conocimiento adquirido a partir del trabajo en
el laboratorio se puede emplear para coordinar el trabajo
de varios grupos de personas relacionadas con la infeccin
que trabajan en la comunidad y los hospitales. Entre estos
individuos guran el equipo de enfermeras y mdicos del
control de la infeccin, adems de los clnicos de la salud
pblica encargados del control de la infeccin en la co-
munidad. Con una alerta oportuna es posible prevenir con
ecacia los brotes. La infeccin adquirida en el hospital es
muy comn (quiz cerca de 10% de los pacientes admiti-
dos), de manera tal que cualquier informacin sobre pre-
vencin y actualizacin de los ltimos microorganismos
epidmicos puede prevenir muchas infecciones y limitar el
uso inadecuado de los antibiticos.
Es til el conocimiento de los patrones locales de sensi-
bilidad con objeto de que los mdicos establezcan el trata-
miento emprico de la infeccin, aunque la comunicacin
rpida de los resultados de pacientes individuales tambin
es relevante para orientar la terapia antimicrobiana a par-
tir de una base racional. La mayor parte de los hospitales
y algunas prcticas generales han redactado lineamientos
correspondientes; asimismo, los datos de sensibilidad que
ponen a disposicin los laboratorios locales crean una base
til para disear estas pautas y proporcionan las recomen-
daciones locales para instituir el tratamiento emprico ms
apropiado. Est probado que ello evita la exposicin inne-
cesaria a los antibiticos, algunos de ellos costosos y txi-
cos, y mejora el resultado del paciente.
El laboratorio tambin debe ser una plataforma para la
educacin de clnicos y pblico acerca del mejor uso de
los antimicrobianos. Este tema apenas si se toca entre los
estudiantes universitarios y todava constituye un campo
complejo; adems, la cantidad de frmacos crece de for-
ma constante, lo cual hace cada vez ms difcil que el cl-
nico los prescriba de forma apropiada. En fecha reciente
se ha propuesto que los estudiantes universitarios y pos-
graduados enseen la terapia antimicrobiana (www.bsac.
org.uk). Otra manera de reducir la exposicin antibitica
consiste en disminuir la cantidad de agentes noticados a
slo aquellos que parecen ms apropiados (quiz dos o tres)
o no divulgar ninguna sensibilidad para aislados que care-
Cuadro 16-2 Prescripcin de antibiticos: tipos de intervencin y administracin
Educativa
Lineamientos*
(ACUERDO)
Programas
Detalles de extensin/
acadmicos*
Auditora/
retroalimentacin*
Talleres interactivos*
Reguladora
Reembolso
Organizacional
Equipos
multidisciplinarios
Estructural
Prescripcin
computarizada
Formas de orden
Restrictiva
Listas limitadas,
formularios
Sustitucin teraputica
(incluido el cambio)
Ciclismo
Pruebas/informes del
lmite de sensibilidad
Fechas de suspensin
automtica
* Revisin de Cochrane.
Cuadro 16-3 Nuevos antibiticos (2003)
Grampositivos
Sinercida
Linezolida
Daptomicina
Dalbavancina
Ortavancina
Iclaprima
Cefalosporinas anti-PBP2
Respiratorios
Cetlidos
Quinolonas
De amplio espectro
Tigeciclina
Ertapenem
cen de relevancia clnica. Sin embargo, estas medidas no se
han evaluado de manera adecuada y confan demasiado en
la informacin que suministra el mdico al laboratorio. El
cuadro 16-2 enumera las medidas actuales aplicadas para
mejorar la administracin antimicrobiana. La base de la
evidencia para tales conductas se revisa con frecuencia, sea
en los hospitales o en la comunidad (www.cochrane.org).
Es importante redoblar los esfuerzos para limitar el uso in-
adecuado del antibitico. Esto resulta ms importante, ya
que en una reunin europea reciente se conrm que varias
compaas farmacuticas importantes suspendieron o re-
dujeron la investigacin en antibiticos. La aparicin de
nuevos y prometedores antimicrobianos se ha restringido
en comparacin con 30 aos antes (cuadro 16-3). Slo se
introdujo una clase nueva por completo de antimicrobianos
en los ltimos 40 aos.
Conclusin
Pasteur o Fleming no se expondran a ningn apuro en un
laboratorio diagnstico del hospital comn en estos aos.
No se han observado grandes avances en los mtodos de
prueba, no los imaginables si se considera el trabajo actual
de la gentica microbiana. Este trabajo ha incrementado
en gran proporcin el conocimiento y entendimiento de
los mecanismos resistentes y, sin duda alguna, tendr un
efecto en la manera de probar la resistencia en el laborato-
rio de diagnstico en los prximos 10 o 20 aos. Incluso
ahora, los laboratorios ms grandes pueden probar directa-
mente por sonda de DNA una pequea seleccin de genes
resistentes, como el mec A que convierte a Staphylococcus
aureus en un supermicrobio resistente a todos los antimi-
crobianos lactmicos beta. De forma similar, se prueba de
rutina la presencia de enzimas lactmicas beta en algunas
bacterias en vez de evaluar la expresin fenotpica de estas
enzimas (que puede ser difcil por mtodos de prueba tradi-
cionales para la sensibilidad). Desde luego, las pruebas ge-
notpicas directas se utilizarn de modo ms extenso en el
futuro, dado que delinean el perl de resistencia potencial
de un microorganismo, en vez de su resistencia al momen-
to de la comprobacin y bajo las articiales condiciones
experimentales del laboratorio. Por otra parte, el progreso
para establecer estas nuevas pruebas en los laboratorios de
diagnstico ha sido lento.
ste es un perl optimista y realista del papel futuro del
laboratorio en este campo. Empero, no es posible ayudar
sin ser pesimista acerca del potencial de las bacterias para
tornarse resistentes a todos los antimicrobianos, a menos
que se administren de modo mucho ms cuidadoso. El des-
cubrimiento de los mecanismos de los microbios, segn lo
atestigua el uso de los integrones, transposones, operones,
regulones, sinergones, etc., indica que los microbios son
muy adaptables y estn casi siempre cuando menos un
paso adelante de la batalla microbiana-antimicrobiana.
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pp 13-17.
CONCLUSIN 171
SECCIN 4
MICROBIOLOGA
Virologa, Micologa
y Parasitologa
Introduccin
La microscopia de luz ha desempeado un papel signicativo
en la virologa desde su uso ms temprano en el examen de
las preparaciones teidas de la clula o los cortes de tejido.
Hoy en da ningn microscopio se encuentra en la banca de
virologa de muchos laboratorios de microbiologa, pues-
to que el trabajo de diagnstico regional general se basa en
el uso de los reactivos de inmunoensayo para la deteccin
del antgeno o anticuerpo vricos. Cada vez ms, incluso
en el laboratorio de diagnstico especializado en virus, la mi-
croscopia se emplea con menos frecuencia, mientras que los
mtodos ms sensibles de deteccin de virus, basados en la
amplicacin del cido nucleico por la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR), se introducen junto con mtodos exis-
tentes de deteccin del antgeno. Sin embargo, en los prime-
ros aos del nuevo milenio los microscopios son an de uso
regular en el trabajo de diagnstico de virologa, ya que los
cultivos celulares se examinan para efectos citopticos debi-
do al crecimiento del virus, y las clulas teidas con reactivos
uorocromomarcados se examinan para antgenos del virus.
Histopatologa: cuerpos de inclusin
y clulas multinucleadas gigantes
El histopatlogo que examina frotis jos teidos de clulas
o cortes de tejido observa los cambios morfolgicos carac-
tersticos que se vinculan con la presencia de infecciones es-
peccas de virus. Las ms conocidas de estas caractersticas
distintivas son los cuerpos de inclusin partculas acumu-
ladas de virus (como en el cuerpo de Negri comn de la rabia)
o exceso de protenas sintetizadas durante la replicacin de
virus y las clulas multinucleadas gigantes. Estas ltimas,
una consecuencia de la fusin entre las membranas plasmti-
cas de las clulas adyacentes, son una caracterstica de infec-
cin con los virus envueltos, que poseen una glucoprotena que
induce la fusin independiente del pH en la supercie celular,
por ejemplo el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de
la inmunodeciencia humana (HIV). Los virlogos usan el
trmino sincitio (del griego, syn = unin) para tal clula. Los
virus del herpes simple (HSV) y la varicella-zoster (VZV)
producen clulas multinucleadas in vivo e in vitro (en un
cuerpo viviente y en vidrio, es decir, en cultivo). An se
da el nombre de Tzanck a los frotis de clulas preparados por
este mtodo para obtener raspados de la base de una lcera o
vescula, que despus se tien y examinan en busca de clulas
gigantes del herpes (HSV o VZV) (g. 17-1).
El bien conocido cuerpo de inclusin ojo de bho visto
en las clulas infectadas con citomegalovirus (CMV) es una
inclusin intranuclear rodeada por un halo claro, dentro de
una clula considerablemente agrandada (meglica), aunque
slo hay casi siempre un ncleo. El CMV puede producir
clulas multinucleadas gigantes in vivo; stas son de origen
endotelial y su presencia en la circulacin representa enferme-
dad sistmica grave. La evidencia de localizacin intracelular
de CMV es importante en la conrmacin del signicado
patolgico del hallazgo de este virus, lo que no siempre pue-
de proporcionar el simple aislamiento del microorganismo.
17
Microscopia en virologa:
aplicacin y preparacin de la muestra
Marie M Ogilvie
Virologa
El xito del aislamiento del virus (por cultivo) o la detec-
cin de antgenos vricos en las clulas del material clni-
co depende en gran medida de la obtencin de la muestra
correcta, su manipulacin apropiada y el uso de la gama
de cultivos celulares y sondas inmunouorescentes ms
convenientes para la deteccin del virus. No hay recursos
disponibles para el examen indirecto de cada virus posible,
aunque la inoculacin de una gama de cultivos celulares
permite que cualquiera se pueda cultivar para su creci-
miento. Deben consultarse los textos normativos modernos
sobre el trabajo de diagnstico para obtener detalles ms
completos de los aspectos discutidos ms adelante; uno de
ellos, el que editaron Mahy y Kangro (vanse las Lecturas
adicionales), proporciona una buena introduccin para el
investigador.
Recoleccin y transporte de la muestra
Muchas infecciones son relativamente cortas respecto del
periodo de replicacin vrica activa una vez que se manies-
tan los sntomas, de modo que las muestras que contienen
el virus infeccioso y las clulas que expresan el antgeno se
obtienen mejor en los primeros dos a tres das de la enfer-
medad. El material debe contener clulas del sitio afectado:
clulas epiteliales de la parte posterior de la nariz y la gar-
ganta o la base de una lcera. En lactantes, las secreciones
respiratorias se pueden recolectar por aspiracin con un ca-
tter no y en sujetos mayores por enjuague, pero las clu-
las recolectadas con una escobilla se colocan en un medio
de transporte de virus. Se puede utilizar cualquier lquido
isotnico amortiguado que contenga protena estabilizadora
para preservar la infectividad y evitar la desecacin de las
clulas. Las muestras no deben congelarse antes del proce-
samiento, pero deben trasladarse al laboratorio de virus tan
pronto como sea posible y mantenerse enfriadas sobre hielo
o en un refrigerador si hay algn retraso. Cuando el periodo
entre la recoleccin de una muestra y su inoculacin en el
cultivo celular se reduce al mnimo, se aumenta el ndice
de aislamiento y el virus se detecta en menos tiempo. Si no
es posible inocular las clulas apropiadas dentro del mismo
da, la muestra se puede guardar a 4C toda la noche. Un
almacenamiento mayor para mantener la viabilidad debe
plantearse a temperaturas muy bajas, por lo general en un
ultracongelador a 70C. (Los congeladores ms comu-
nes del laboratorio que funcionan a temperaturas de 18 a
20C no son convenientes para la preservacin del virus;
se observa un descenso considerable de la infectividad en
esos lmites de temperatura.)
Procesamiento de la muestra e inoculacin
de los cultivos celulares
Las formas de solicitud que acompaan a las muestras deben
indicar con claridad el carcter de la enfermedad, la fecha
de inicio, la naturaleza de la muestra, el sitio del cual se re-
colect y la edad del paciente para efectuar investigaciones
apropiadas. El procesamiento de la muestra para la inocula-
cin de los cultivos celulares o la preparacin de las clulas
para la tincin inmunouorescente es casi siempre un pro-
cedimiento estandarizado, de acuerdo con la naturaleza de
la muestra. Los cultivos tienen que examinarse para cuales-
quiera de los efectos citopticos (ECP: el cambio morfolgi-
co celular resulta de la replicacin del virus), sobre una base
diaria durante los primeros cinco das despus de la inocu-
lacin, para no perder algunas seales, aunque una lectura
posterior de los tubos en das alternos suele ser suciente
para captar los cambios ms graduales de los virus de creci-
miento ms lento como el CMV y muchos adenovirus.
Requisitos para el diagnstico rpido
de infecciones vricas
Pocos virus pueden identicarse en los cultivos celulares
de rutina en menos de tres das (el virus del herpes simple
es el nico regular). Para la atencin clnica son importan-
tes el control de la infeccin dentro de las salas del hospital
(y la terapia antivrica especca donde est disponible),
la conrmacin ms temprana de un diagnstico clnico o la
identicacin de una infeccin insospechada. Con este n,
las muestras apropiadas se examinan en forma directa para
reconocer evidencia de virus especcos, por microscopia
de inmunouorescencia (IF) para infecciones respiratorias,
drmicas y otras en las cuales las clulas infectadas se ob-
tienen con facilidad. Las secreciones respiratorias primero
Figura 17-1 Corte de una lesin herptica de piel, teido con
hematoxilina y eosina. La echa seala una clula multinucleada
gigante. Cortesa del Dr. K McLaren, Department of Pathology,
University of Edinburgh.
176 CAP. 17 MICROSCOPIA EN VIROLOGA: APLICACIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRA
se deben diluir y lavar en una solucin amortiguada salina
para preparar las clulas epiteliales respiratorias (libres de
moco) que puedan depositarse sobre el portaobjetos. Por
lo general se usan varios lugares o celdillas, pero una pre-
paracin citocentrifugada es til y rpida si el agente pa-
tgeno de estudio es un virus predominante, como en una
inuenza epidmica o por RSV de temporada. Una vez que
se secan al aire, los portaobjetos se jan por inmersin en
acetona fra por 10 minutos, lo que asegura que las clulas
permanezcan sobre el portaobjetos, retengan antigenicidad
y sean permeables al anticuerpo, aunque en la mayor parte
de los casos carecen de infectividad residual.
Inmunouorescencia
En los decenios de 1980 y 1990 los laboratorios de diagnsti-
co de virus ampliaron su uso de la microscopia, en particular
como una ayuda para el diagnstico rpido de infecciones
vricas. La disponibilidad comercial de los reactivos de alta
calidad en la forma de anticuerpos monoclonales apoya la
aplicacin de la inmunouorescencia (IF) para una amplia
gama de antgenos vricos. Se puede aplicar el anticuerpo
especco (o un conjunto de anticuerpos) conjugado con un
uorocromo colorante a una preparacin celular en una prue-
ba directa de inmunouorescencia (DIF) para el antgeno a
detectar. ste es el mtodo ms utilizado para el diagnstico
rpido por microscopia de luz, en especial conveniente para
las muestras simples, pero tambin aplicado a las secreciones
respiratorias diarias de lactantes y nios; lo anterior consti-
tuye una parte importante del trabajo de un laboratorio de
virus que suministra servicio a una unidad peditrica durante
la epidemia anual de enfermedades respiratorias.
Los mismos reactivos tambin pueden ser tiles para
la tincin de las clulas de los cultivos celulares, sea para la
conrmacin del cultivo, y tipicacin en el caso de HSV,
o para el examen de la deteccin temprana (pre-ECP) de
antgenos, en particular til para los virus de crecimiento
ms lento, como el CMV y los adenovirus. Ms adelante se
proporcionan ejemplos de la gama y aplicaciones. Algunas
pruebas serolgicas para los anticuerpos vricos todava se
basan en la inmunouorescencia indirecta, casi siempre para
los anticuerpos del virus de Epstein-Barr, parvovirus humano
(eritrovirus B19) o virus humano del herpes 6 (HHV6).
En virologa, el uorocromo, colorante ms utilizado es el
isotiocianato de uorescena (FITC), que conere una uo-
rescencia verde manzana brillante. Es provechoso si se inclu-
ye una contratincin, de modo que las clulas que contrastan
con el fondo negativo sean visibles (teidas de rojo apagado
si se emplea el colorante azul de Evans). El anticuerpo apro-
piado se aplica a la celdilla o portaobjetos que tiene las clulas
examinadas, un frotis o depsito de clulas directas de un
paciente, clulas de un cultivo o un cubreobjetos shell vial.
Figura 17-2 Tincin de inmunouorescencia directa de clulas
epiteliales respiratorias de un lactante con bronquiolitis aguda. La
tincin verde manzana brillante de las clulas marcadas con el anti-
cuerpo uorescente del RSV indica la infeccin con este virus; las
clulas no infectadas contrateidas con el colorante azul de Evans
aparecen en rojo apagado en el contraste.
Un periodo de incubacin (en promedio de 15 a 30 min) en
una cmara hmeda permite al anticuerpo reaccionar con al-
gn antgeno especco de virus en las clulas. El anticuerpo
separado se elimina al lavarlo con una solucin salina amor-
tiguada; antes, el portaobjetos se seca al aire y se monta para
observarse en un microscopio especial con una fuente de luz
ultravioleta incidente. El lquido de montaje consiste en gli-
cerol de grado analtico (50%) en una solucin salina amor-
tiguada de fosfato a un pH ptimo de 8.6 para maximizar
la uorescencia. sta se atena con rapidez al exponerse a la
irradiacin ultravioleta, de modo que la observacin prolon-
gada no es recomendable y los registros fotogrcos deben
obtenerse cuando se requieran.
Virus respiratorios
La inmunouorescencia directa es el procedimiento de IF
ms comn en la virologa diagnstica para la deteccin
rpida de antgenos y puede ser la nica prueba empleada
para diagnosticar la infeccin del RSV en nios; en rea-
lidad, en manos experimentadas puede ser tan conable
que ya no se considera necesario el aislamiento paralelo
del virus. La mayora de los lactantes se infecta con RSV
en su primera estacin invernal y uno de cada 100 recin
nacidos admitido en el hospital desarrolla la alarmante
complicacin de bronquiolitis. Puesto que el RSV tempo-
ral de la epidemia anual invernal es con mucho el agente
patgeno respiratorio ms comn en lactantes y nios, es
una prioridad principal la prueba rpida para RSV. En la
gura 17-2 se muestra la apariencia caracterstica (glbu-
los intracelulares que se tien de verde manzana) de una
INMUNOFLUORESCENCIA 177
prueba positiva de DIF para el RSV en clulas respiratorias
de secreciones de un lactante. Se dispone de tratamiento
antivrico especco para la infeccin por RSV en sujetos
con riesgo especial por una enfermedad grave y a menudo
se requiere la prueba DIF (o un equivalente marcado de
forma enzimtica) como procedimiento urgente.
Preparaciones celulares de la piel o mucocutneas
Las clulas raspadas de la base de lesiones vesiculares de la
piel se examinan con frecuencia mediante DIF con los anti-
cuerpos especcos para HSV-l, HSV-2 o VZV (si no es obvia
en clnica la infeccin presente). Puesto que est disponible
la terapia antivrica especca, y las infecciones por herpes
son graves en los huspedes inmunosuprimidos, es impor-
tante un diagnstico rpido. Para ser efectivos, los frmacos
antivricos deben suministrarse tan pronto como sea posible
y la dosicacin vara de acuerdo con el virus. La naturaleza
contagiosa del VZV es tambin un problema para el control
de la infeccin (alrededor de 10% de los adultos jvenes no
contrajo varicela y se halla en riesgo si se expone al VZV).
Clulas de cultivo
Es un procedimiento muy similar a DIF en las clulas del
paciente. Los benecios de la conrmacin rpida de un ECP
supuesto son clnicos y ahorran tiempo y recursos del labora-
torio. Como los HSV-l y HSV-2 tienen diferentes relaciones y
su tendencia a causar enfermedad recurrente en diferentes si-
tios es variable, es til conocer el tipo del virus, lo cual es po-
sible con los anticuerpos de tipo especco. Se puede emplear
el anticuerpo monoclonal para los antgenos especcos de
grupo comunes presentes en los adenovirus (antgeno hexon)
o los enterovirus (antgeno VP1) para conrmar el ECP que
producen los miembros de estos grupos, respectivamente.
Antgenos vricos producidos en fase temprana
del ciclo de crecimiento
Cuando el citomegalovirus se reconoci como un agente
patgeno peligroso en los receptores de trasplante que re-
queran terapia antivrica result esencial detectarlo con
mayor rapidez que en el pasado. Gleaves en Estados Uni-
dos y Grifths en el Reino Unido establecieron el valor de
reconocer los antgenos tempranos del CMV que aparecen
despus de unas cuantas horas, en comparacin con los das
que se toman para el DNA vrico y los antgenos posteriores,
y con el tiempo necesario para la aparicin de un ECP. En
Estados Unidos se acu el trmino shell vial, mientras que
en el Reino Unido la prueba se conoci como DEAFF (De-
tection of Early Antigen Fluorescent Foci). Los antgenos
tempranos del VZV tambin se buscan de manera ocasional.
Un uso ms amplio del sistema shell vial ha ganado acep-
tacin en Estados Unidos y Europa continental, donde mu-
chos laboratorios lo utilizan, en particular, para la deteccin
respiratoria del virus. En la propia experiencia del autor ha
mostrado gran utilidad para la identicacin temprana de las
infecciones del ojo por adenovirus y tambin para el ndice
rpido y mejorado del aislamiento del VZV. Algunos ejem-
plos de IF por shell vial se ilustran en la gura 17-3.
Examen microscpico de los cultivos celulares
Aunque ciertos cambios notables en el cultivo celular son
visibles a simple vista, como en el desafortunado caso de
la turbiedad o acidez por el crecimiento de bacterias u
hongos, es necesario el examen microscpico antes que se
reconozcan los cambios que produce el crecimiento del vi-
rus. Las observaciones seriadas se realizan por das, y aun
por semanas, y quiz deba trasladarse el virus a medios de
cultivo frescos para pruebas subsecuentes, de manera que
Figura 17-3 Tincin por DIF de cultivos shell vial HEF infectados 48 horas despus de la inoculacin con un escobillado de conjuntiva
teido con anticuerpo monoclonal especco del grupo de adenovirus (a); escobillado de la garganta teido con el anticuerpo especco
contra el grupo A de la inuenza que muestra tincin nuclear y ninguna extensin fuera de las clulas originales infectadas (b).
los cultivos se examinan sin teirse. Un soporte sostiene el
tubo de cultivo sobre la platina del microscopio, mientras
que el rea entera de la monocapa celular se explora de
modo cuidadoso a bajo poder (con objetivos de 4 o 10)
con el condensador inferior a la platina hacia abajo. Las
reas focales de clulas alteradas se examinan entonces a
una mayor ampliacin. No es difcil notar la diferencia en-
tre una monocapa de clulas por completo sanas (tubo con-
trol sin inocular del mismo lote de clulas) y una en la cual
los hoyos aparecen como clulas redondeadas y descendi-
das, o bien grupos de clulas que forman racimos grandes;
esto exige gran experiencia y cuidado y observacin cons-
tante para desarrollar destreza en el reconocimiento de los
efectos citopticos caractersticos que producen los virus
especcos en cultivos diferentes.
Efectos citopticos en los cultivos celulares comunes
ECP degenerativo: reas dispersadas con clulas redon-
das y contradas, que degeneran pronto la supercie del
tubo (se observan con los enterovirus como poliovirus y
rinovirus).
Clulas redondas, retrctiles y abultadas en grupos: se
identican con adenovirus (racimos de uvas en clu-
las HEp
2
) y HSV. Este ltimo crece con gran rapidez,
primero en pocas zonas (placas) el da posterior a la
inoculacin y luego se propaga a lo largo de la monoca-
pa al da siguiente. Se reconocen sincitios pequeos, en
especial con HSV-2.
ECP del citomegalovirus: aparece por completo nico,
con progresin muy lenta y focos alargados de clulas
(citomeglica) abultadas en cultivos de broblastos hu-
manos.
ECP sincitial tpico: marca caracterstica del RSV que
crece en clulas HEp
2
frescas (g. 17-4), aunque las c-
lulas multinucleadas gigantes tambin se observan con
el sarampin y el VZV en lneas celulares sensibles.
Las caractersticas son diferentes para el ojo adiestrado
en cada caso.
El HIV no se cultiva de rutina, pero su crecimiento se puede
reconocer por la aparicin del sincitio en los cultivos de c-
lulas mononucleares sanguneas que crecen en suspensin,
no como monocapas. El virus del herpes humano tipo 6
(HHV6) se descubri en 1986 cuando produjo ECP sincitial
en cultivos de sangre perifrica (g. 17-5) y, en el examen
adicional, result no ser HIV sino un virus herpes desco-
nocido. El ECP ms famoso y reciente fue el observado en
los primeros cultivos del desconocido coronavirus humano
relacionado con el sndrome respiratorio agudo grave.
Figura 17-4 Efecto citoptico sincitial tpico del RSV al crecer
en cultivos de clulas HEp
2
(sin teir), cinco das despus de la
inoculacin de la muestra respiratoria del paciente.
Figura 17-5 ECP en un sincitio con forma de globo (sin teir)
que produce el virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) en cultivo
de suspensin de la lnea celular linfoblastoide (JJhan).
Crecimiento vrico no citoptico en cultivo celular
El microscopista de virologa sabe que algunos virus se
reproducen en los cultivos celulares sin producir citopa-
tologa evidente. El mejor ejemplo conocido es el de los
virus de la inuenza que crecen en las clulas del rin del
mono, donde la presencia del virus se puede revelar me-
diante hemadsorcin. Una glucoprotena (hemaglutinina)
codicada por el virus e insertada dentro de la membrana
de clulas plasmticas es capaz de atacar a los eritrocitos de
la sangre aadidos a la supercie. En las etapas ms tem-
pranas de cualquier replicacin vrica, cuando slo se in-
fectan las clulas individuales, el ECP no es obvio pero los
antgenos vricos estn presentes.
Investigaciones adicionales de los agentes citopticos
El microscopista no ha acabado cuando ya se observa un
ECP reconocible en un cultivo inoculado. Se espera la con-
EXAMEN MICROSCPICO DE LOS CULTIVOS CELULARES 179
rmacin del diagnstico informada y se puede indicar
una identicacin adicional. El juicio del microscopista,
quien selecciona la prueba de conrmacin con base en el
ECP, la lnea celular, la muestra y otros factores, es crtico
para formular un diagnstico rpido y ahorrar recursos. La
conrmacin y tipicacin del HSV ya se mencionaron. El
ECP del adenovirus o el enterovirus se puede ahora con-
rmar mediante IF de las clulas, pero la tipicacin re-
quiere un ensayo de neutralizacin porque existen muchos
tipos diferentes. Esto exige mezclar alcuotas de un aislado
bien desarrollado con celdillas de antisuero que cubran los
tipos comunes, tras inocular cultivos frescos y observar el
antisuero que inhibe al ECP, es decir, la neutralizacin de
la infectividad vrica. Estos ejercicios de tipicacin raras
veces afectan el control clnico, pero son importantes para
los estudios epidemiolgicos.
Desarrollos
El virlogo de diagnstico debe disponer de la mejor de
las tcnicas para identicar las infecciones vricas. La
deteccin rpida es crtica por las razones ya explicadas.
En tanto se emplee la microscopia de IF para las muestras
individuales, pueden utilizarse los inmunoensayos o la in-
munoltracin enzimtica para la captacin del antgeno,
mtodos menos subjetivos, que pueden automatizarse, para
el examen de cantidades ms grandes de muestra y lquidos
de cultivo amplicados. La amplicacin molecular del
cido nucleico por la reaccin en cadena de la polimera-
sa (PCR) proporciona el medio ms sensible de deteccin
de una gama cada vez mayor de virus y los laboratorios
se orientan cada vez ms en esa direccin, con menor uso
del aislamiento y la microscopia habituales. Todava se re-
quieren los intentos paralelos al aislamiento del virus en
un laboratorio que ofrezca un servicio completo, incluidas
la tipicacin epidemiolgica y las pruebas de susceptibi-
lidad antivrica. Hoy en da se aplica el cultivo mejorado y
se advierte una bsqueda continua de clulas sensibles, en
particular para los virus incultivables. El rea que emerge
de la ingeniera gentica celular puede proporcionar tc-
nicas novedosas, como los sistemas inducidos por virus
ligados a enzimas (ELVIS), ya probados para el HSV (Oli-
vo 1996), que combinan tres cultivos celulares (viejos y
nuevos), la deteccin del antgeno y la tecnologa de DNA
recombinante, sin excluir la microscopia.
Reconocimientos
Merecen un agradecimiento especial los siguientes clni-
cos por las guras utilizadas en este captulo: gura 17-1,
fotografa del Dr. K McLaren, consultor histopatologista,
Universidad de Edimburgo; guras 17-2 a 17-5, fotografas
de AJ MacAulay FIMLS, principal cientco biomdico en
el Clinical Virology Laboratory, Department of Medical
Microbiology, University of Edinburgh. Las copias presen-
tadas de todas las guras se prepararon como impresos a
color en la Medical Photography Unit del Royal Inrmary
of Edinburgh, Little France.
Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET (eds). Diagnostic Proce-
dures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th edn.
1995: American Public Health Association, Washington, DC.
Mahy BWJ, Kangro HO (eds). Virology Methods Manual. 1996:
Academic Press, London.
Olivo PD. Transgenic lines for detection of animal viruses. Clin
Microbiol Rev 1996; 9: 321-343.
Simmons A, Marmion BP. Rapid diagnosis of viral infections. In
Mackie & McCartneys Practical Medical Microbiology, 14th
edn. Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A (eds).
1996: Churchill-Livingstone. Edinburgh.
Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR Grifths PD, Schoub
BD (eds). Principles and Practice of Clinical Virology, 5th
edn. 2004 Wiley, Chichester.
(b)
Introduccin
Los virus se consideran agentes malignos que causan en-
fermedad y dolor. Sin embargo, cuando se visualizan en el
microscopio electrnico se reconocen diversas estructuras.
Los tipos de los mltiples grupos vricos parecen diferentes
y es esa morfologa caracterstica la base para su identi-
cacin mediante microscopia electrnica. sta proporciona
los medios para detectar e identicar con rapidez los virus
en el material tomado directamente de los pacientes (cuadro
18-1). Un diagnstico rpido puede facilitar la atencin y el
tratamiento de los enfermos. El diagnstico tiene tambin
implicaciones de salud pblica para el control de brotes y
la propagacin de las enfermedades infecciosas en la comu-
nidad. A largo plazo, la microscopia electrnica desempea
un papel en la vigilancia epidemiolgica de la enfermedad
infecciosa. A diferencia de muchas pruebas diagnsticas,
que se seleccionan para un agente particular, la microscopia
electrnica es un mtodo que puede detectar cualquier virus
o una mezcla de virus en la muestra. Esto es en particular
til en el diagnstico y el estudio de los virus que no pueden
cultivarse con facilidad in vitro. El uso de la microscopia
electrnica ha conducido al descubrimiento e identicacin
de muchos agentes vricos nuevos en aos recientes y tiene
una funcin principal en el estudio de los virus nuevos.
Mtodos
Tincin negativa
Es el mtodo ms utilizado en virologa diagnstica y recu-
rre a la tincin del entorno vrico, no tanto al virus mismo.
La preparacin de la muestra es simple y los resultados se
pueden obtener con rapidez. Empero, la tcnica depende
de la presencia de nmeros sucientes de partculas del vi-
rus en la muestra (se requiere casi siempre un mnimo de
10
6
partculas del virus por mililitro de muestra) y de la
integridad estructural de las partculas del virus que per-
manecen intactas, de tal modo que puedan reconocerse e
identicarse. Algunas veces la sensibilidad se puede acre-
centar mediante el uso de sueros inmunitarios (microscopia
electrnica inmunitaria, MEI). Los virus que no se deli-
nean con claridad en relacin con el material del entorno,
por ejemplo los parvovirus, pueden agregarse en grupos si
se mezcla la muestra con un antisuero especco de mane-
ra que puedan observarse con facilidad. En caso contrario,
los virus pueden llevarse a una rejilla revestida con anti-
suero (microscopia electrnica inmunitaria de fase slida).
Los mtodos de MEI se pueden utilizar para la tipicacin
antignica de los virus. Cuando un virus se identica por
tincin negativa simple se reconoce como miembro de un
grupo o una familia de virus, pero casi nunca es posible
distinguir entre los miembros del grupo sin pruebas adi-
cionales; por ejemplo, el virus del herpes causante de la
varicela (virus de la varicela-zoster, VZV) posee una apa-
riencia idntica respecto del virus del herpes causante de
ampollas febriles (virus del herpes simple, HSV).
Corte no
La microscopia electrnica de corte no es til para el
examen de muestras en las que hay nmeros escasos de
partculas vricas para reconocerlas en las suspensiones ne-
gativas teidas. Algunos virus, como los retrovirus, tienen
18
Microscopia electrnica en virologa
Hazel Appleton
182 CAP. 18 MICROSCOPIA ELECTRNICA EN VIROLOGA
estructuras que se identican de modo ms fcil en cor-
tes nos en comparacin con las preparaciones negativas.
Aunque la sensibilidad puede acrecentarse, no es una tc-
nica rpida y tiene aplicacin limitada en un laboratorio de
diagnstico. Es til para estudiar la patogenia de la infec-
cin y puede emplearse para la conrmacin diagnstica
en biopsia y muestras post mortem. Las estructuras del vi-
rus son resistentes a la lisis celular y la preservacin pobre
del tejido; es posible obtener resultados positivos a partir
de material que aparenta ser poco prometedor.
Microscopia electrnica de barrido
Pocos laboratorios de diagnstico tienen acceso a un mi-
croscopio electrnico de barrido o incluso un accesorio de
barrido para un microscopio electrnico de transmisin.
Este ltimo se utiliza sobre todo como herramienta para
investigar la jacin y patogenia del virus y hasta el mo-
mento ha tenido poco uso en virologa diagnstica. Se ha
observado cierto inters en los inmunoensayos de fase s-
lida, con perlas de ltex cubiertas con el anticuerpo espe-
Cuadro 18-1 Virus detectados mediante microscopia electrnica
Muestras examinadas Ejemplos de virus detectados
Piel: lquidos Virus del herpes: herpes simple,
vesiculares o virus de la varicela-zoster
raspaduras de Poxvirus: ectima, molusco contagioso
lesiones* Virus del papiloma (verruga humana)
Heces* Virus de la gastroenteritis: rotavirus,
adenovirus, astrovirus, norovirus,
sapovirus (hepatitis A y E,
enterovirus)
Suero Parvovirus B19
Hepatitis B
Orina Poliomavirus BK
Citomegalovirus
Adenovirus (cistitis hemorrgica)
Hgado Hepatitis B
Hgado fetal Parvovirus B19 (hidropesa fetal)
Cerebro Virus del sarampin (SSPE)
Poliomavirus JC
Virus del herpes
Tumor Virus de Epstein-Barr
Cultivos celulares Cualquier virus cultivado, como
de laboratorio para inuenza, parainuenza, sarampin,
la identicacin paperas, adenovirus, poliomavirus,
rpida de los aislados* enterovirus, virus del herpes,
retrovirus (virus exticos, p. ej.,
Marburg, bola)
*Principales usos habituales de la microscopia electrnica en virologa
diagnstica.
cco. El virus se une a las perlas y se recubre con oro. La
tcnica parece ofrecer poca ventaja respecto de la MEI de
tincin negativa y tiene la desventaja de oscurecer la mor-
fologa caracterstica del virus, adems de que los reactivos
son costosos.
Usos de la microscopia electrnica
La microscopia electrnica empez a sobresalir en la viro-
loga diagnstica en el decenio de 1960 con el diagnstico
rpido de la viruela. Las lesiones de piel que se producen
en esta enfermedad y las consecutivas de la varicela pue-
den confundirse en clnica. Las alarmantes implicaciones
de la infeccin de la viruela llevaron en poco tiempo a di-
ferenciar estas infecciones bsicas. Las lesiones de piel,
y en particular los lquidos de las vesculas, son ricos en
partculas vricas. Basta mezclar la muestra con una gota
de un colorante negativo para ver con precisin el virus,
sin necesidad de recurrir a la concentracin. La viruela se
debe a un miembro de la familia del poxvirus y la varicela
al VZV. Los poxvirus y los virus del herpes tienen morfo-
logas muy diferentes y se pueden distinguir con facilidad
mediante el microscopio electrnico (gs. 18-1 y 18-2). El
virus de la viruela, variola, y el virus vaccinia utilizados
en la vacuna son indistinguibles y se requirieron pruebas
Figura 18-1 Vaccinia: un ortopoxvirus (180 000 ).
USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA 183
para diferenciarlos: por lo regular se realiza la distincin
en cultivo de la membrana corioalantoica de los huevos de
las gallinas, lo cual toma unos tres das. La deteccin de un
virus del herpes evit la necesidad de todas las medidas
sanitarias pblicas que deban activarse en presencia de un
caso de viruela.
Lesiones de la piel
En 1980, la Organizacin Mundial de la Salud declar que la
viruela se haba erradicado, pero la microscopia electrnica
no ha dejado de tener un papel importante en el diagnstico
rpido de la infeccin por el virus del herpes. Esto es en
particular til para los individuos inmunocomprometidos,
en los cuales el uso de frmacos antivricos apropiados
puede facilitar el tratamiento. Adems, puede auxiliar en la
atencin de los sujetos de las unidades de trasplante, en las
cuales un brote de varicela podra tener consecuencias gra-
ves y algunas veces mortales. La microscopia electrnica to-
dava se utiliza en el diagnstico de otras dos infecciones del
poxvirus, el ectima y el molusco contagioso, ninguno de los
cuales se puede identicar con facilidad por otros medios. El
ectima es una infeccin zoontica adquirida de las ovejas,
secundaria a un virus parapox, el cual es ms pequeo y alar-
gado que los virus ortopox, como el vaccinia y el cowpox
(g. 18-3). El molusco contagioso es un poxvirus humano
que causa erupciones benignas en la piel y es similar en
apariencia a los virus ortopox. La microscopia electrnica
tambin se utiliza de modo ocasional en la deteccin del vi-
rus del papiloma humano (HPV) que provoca verrugas.
Gastroenteritis
El descubrimiento de los virus que causan la gastroenteritis
condujo a la expansin del uso de la microscopia electrni-
ca en laboratorios de diagnstico y salud en las dcadas de
1970 y 1980. Diversos virus pueden causar gastroenteritis
y todos se descubrieron en el examen por microscopia elec-
trnica de muestras fecales. Result sorprendente que los
virus podan visualizarse en ese complejo material, pero en
verdad estos virus se excretan en nmeros inmensos dentro
del contenido intestinal y pueden reconocerse con facilidad
si las muestras se recogen en el momento apropiado.
Los virus de la gastroenteritis no crecen en los cultivos
celulares convencionales y la microscopia electrnica ha
sido el mtodo principal para su identicacin. Algunos
virus de la gastroenteritis, como los rotavirus y adenovi-
rus, tienen tales morfologas distintivas que slo necesitan
observarse una o dos partculas para el reconocimiento po-
sitivo (gs. 18-4 y 18-5). Las muestras pueden ser tan ricas
en virus que no se precisa ninguna concentracin (se calcu-
lan concentraciones de 10
12
partculas/g). A menudo es
Figura 18-2 Virus del herpes de una lesin de la piel (180 000 ). Figura 18-3 Ectima: un parapoxvirus (180 000 ).
suciente emulsionar una muestra pequea de heces en una
gota de agua destilada, mezclar con colorante negativo y
colocar sobre una rejilla. Para otros virus de las gastroente-
ritis, como astrovirus y norovirus, la identicacin es ms
difcil y deben examinarse ms partculas para realizar una
identicacin exacta (gs. 18-6 y 18-7). En estos casos, por
lo general, es necesario concentrar el virus de la muestra.
Se han desarrollado pruebas comerciales, como ELI-
SA, tcnicas de aglutinacin de ltex, PCR e incluso
pruebas con tira reactiva, y ahora se emplean como tcni-
Figura 18-4 Rotavirus: una causa importante de gastroenteritis
en recin nacidos y nios menores. Los rayos tpicos pueden
verse alrededor de las partculas. La partcula del centro perdi su
cpside (180 000 ).
ca primaria en muchos laboratorios de diagnstico. Esto
permite que nmeros ms grandes de muestras se sometan
a examen, en comparacin con la microscopia electrni-
ca, y muchas veces con mayor sensibilidad. Sin embargo,
Figura 18-5 Adenovirus: se relacionan en gran medida con las
infecciones de las vas respiratorias y oculares. Dos adenovirus
se vinculan con la gastroenteritis e infectan sobre todo a nios
jvenes (180 000 ).
Figura 18-6 Astrovirus. Pueden verse estrellas de cinco o seis
puntas en la supercie de algunas partculas (180 000 ).
Figura 18-7 Norovirus. Este virus provoca muchos brotes de
gastroenteritis en la comunidad (180 000 ).
estas pruebas tienen limitaciones puesto que son selecti-
vas para un tipo especco del virus y no detectan todas
las cepas dentro de un grupo del virus. Las muestras que
arrojan resultados negativos o equvocos se pueden exa-
minar posteriormente mediante microscopia electrnica.
El Health Protection Agency Centre for Infections rene
los informes de los virus detectados en casos de gastroente-
ritis en Inglaterra y el Pas de Gales. Esto ha facilitado que
se represente un panorama epidemiolgico de los grupos
de edad afectados por los diferentes agentes vricos, las
distribuciones estacionales, los patrones de excrecin y los
modos de transmisin. Esta informacin hace posible pro-
porcionar el consejo apropiado sobre factores como el con-
trol de brotes, tiempo que debe apartarse de los alimentos a
quienes los manipulan y tiempo ptimo para la recoleccin
de muestras.
Rotavirus
De los virus de la gastroenteritis, el mejor conocido e iden-
ticado con facilidad es el rotavirus (de la palabra latina
rota, rueda: la disposicin de los capsmeros vistos en la
supercie de las partculas del virus se asemeja a los rayos
de una rueda) (g. 18-4). El rotavirus es una causa impor-
tante de la gastroenteritis en recin nacidos y nios. En el
Reino Unido y otros pases desarrollados propicia el n-
mero ms grande de admisiones al hospital en este grupo
de edad, y en pases subdesarrollados se calcula que causa
alrededor de medio milln de muertes por ao. La infec-
cin ocurre sobre todo en los meses del invierno en climas
templados. Los brotes tambin se observan entre ancianos,
al parecer debido a la declinacin de la inmunidad.
El rotavirus se encontr primero en los cortes nos de
biopsias duodenales de nios en Australia, pero tales tc-
nicas invasivas no son necesarias ya que el virus puede
verse en las emulsiones simples de muestras fecales. Los
equipos comerciales para la deteccin de los rotavirus se
utilizan con amplitud. No obstante, estos equipos slo de-
tectan el tipo ms comn de los rotavirus conocidos, como
los rotavirus del grupo A. Otros tipos, como los rotavirus
del grupo C, tambin infectan a los seres humanos, aunque
se observan con menor frecuencia. Los rotavirus del grupo
C infectan a todos los grupos de edad y se han vinculado
con un buen nmero de brotes en familias y escuelas. En
muchos laboratorios, las muestras se examinan slo por
microscopia electrnica si los resultados de una prueba de
ELISA o ltex son negativos. Los rotavirus que no pertene-
cen al grupo A se identican casi siempre cuando surge una
discrepancia entre el resultado negativo del equipo y uno
positivo hallado con la microscopia electrnica. La carac-
terizacin se lleva a cabo por el anlisis PAGE o PCR.
Adenovirus
El examen de muestras fecales de nios con gastroenteritis
condujo al descubrimiento de dos adenovirus nuevos. Por
mucho tiempo los adenovirus se haban relacionado con las
infecciones respiratorias y oculares y se aislaban en culti-
vos celulares. Los dos adenovirus nuevos, los denominados
tipos 40 y 41, se vinculan de manera especca con la gas-
troenteritis y no pueden cultivarse con facilidad. La micros-
copia electrnica tiene limitaciones y puede indicar slo la
presencia de los adenovirus (g. 18-5) y no de manera espe-
cca los tipos 40 y 41, para los cuales se requieren pruebas
adicionales. Los adenovirus respiratorios comunes se aslan
algunas veces de muestras fecales, pero esto se considera un
hallazgo incidental. Del mismo modo que para el rotavirus,
ahora se dispone de los equipos de ELISA y tira reactiva.
Los tipos 40 y 41 de los adenovirus tienen una epidemiolo-
ga similar al rotavirus dado que infectan sobre todo a jve-
nes y se observan durante los meses invernales.
Astrovirus
Otro virus vinculado con la gastroenteritis es el astrovirus,
un virus original, nombrado as por la estrella de cinco o
seis puntas delineada en la supercie de una gran propor-
cin de partculas (g. 18-6). Los astrovirus explican al-
rededor de 1 a 2% de los informes de virus causales de
gastroenteritis en el Reino Unido. La infeccin se notica
sobre todo en los muy jvenes y se han descrito brotes en
las unidades neonatales; no obstante, se sugiere que la in-
feccin en otros grupos de edad se encuentra subestima-
da. Como el rotavirus, los brotes se reconocen de modo
ocasional en los ancianos. En raras ocasiones se reere la
transmisin que producen los alimentos. La microscopia
electrnica es todava el mtodo principal de deteccin.
Norovirus
Los norovirus, conocidos antes como virus similares al
Norwalk o virus pequeos redondos estructurados (SRSV),
se consideran la causa ms comn de la gastroenteritis en
la comunidad. Se reconocen en todos los grupos de edad y
se relacionan de modo frecuente con brotes en hospitales,
hogares residenciales y escuelas. Los virus de la gastroen-
teritis casi siempre se transmiten en forma directa de per-
sona a persona a travs de la va fecal-bucal o en gotitas
de aerosol. A veces tambin se pueden transmitir algunos
a travs del alimento o el agua y en estas situaciones los
norovirus son los que se notican ms a menudo. El primer
virus del grupo se descubri por microscopia electrnica
USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRNICA 185
en 1972. Originado de un brote en la ciudad de Norwalk, en
Estados Unidos, se conoci como el agente Norwalk. El
trmino virus pequeo redondo estructurado o SRSV
se relaciona con el aspecto del virus en el microscopio
electrnico (g. 18-7). Las partculas del virus miden 30 a
35 nm de dimetro y tienen una supercie amorfa y un
contorno irregular. Los norovirus se clasican dentro de la
familia Caliciviridae. Hay muchas cepas diferentes y stas
forman dos genogrupos amplios. Hay tambin un tercero,
el genogrupo emparentado de forma ms lejana, llamado
sapovirus porque se aisl en una guardera en Sapporo, Ja-
pn. Los sapovirus tienen el aspecto tpico de un calicivirus,
con depresiones similares a una taza vistas en la supercie
de las partculas del virus. Estas depresiones en forma de
taza casi nunca se identican en los norovirus. La diferen-
ciacin entre norovirus, calicivirus y tambin astrovirus
por microscopia electrnica puede ser difcil y requiere la
intervencin de un microscopista experimentado.
Los norovirus no se pueden cultivar y la mayor parte de
los diagnsticos se establece por microscopia electrnica.
Empero, los norovirus se excretan slo en nmeros sucien-
tes para la deteccin por cerca de 48 horas despus del inicio
de los sntomas y por tanto suele ser difcil obtener muestras
apropiadas. Los norovirus tienden a no excretarse en nme-
ros grandes, como el rotavirus y los adenovirus, y puesto que
no tienen tales caractersticas morfolgicas distintivas, son
mucho ms difciles de detectar en trminos tcnicos. Por lo
tanto, los norovirus no aparecen en una enorme proporcin
de los informes. La microscopia electrnica no es bastante
sensible para reconocer el virus en el alimento o muestras
ambientales. Se han desarrollado los ensayos de PCR para
los norovirus, pero estn slo disponibles en laboratorios es-
pecializados. Estos ensayos son muy sensibles: pueden de-
tectar al virus en las muestras clnicas por hasta una semana
despus del inicio de los sntomas y pueden emplearse para
examinar los alimentos y las muestras ambientales. Sin em-
bargo, no detectan todas las cepas del norovirus. En 2003 se
dispuso ya de los equipos comerciales de ELISA que iden-
tican una amplia gama de los norovirus de los genogrupos
1 y 2. stos tienen sensibilidad similar a la de la microsco-
pia electrnica, pero son mucho ms fciles de usar, pueden
procesar nmeros ms grandes de muestras y han tenido un
efecto signicativo en el examen de los norovirus. Existe
una gran diversidad dentro del grupo del norovirus y, pese
a ello, las tcnicas ELISA no detectan todas las cepas. En
consecuencia, la microscopia electrnica juega todava un
papel esencial en el diagnstico.
Otras infecciones
La microscopia electrnica tuvo un papel importante en el
descubrimiento de otros virus, en especial algunos de los
virus de la hepatitis, los papovavirus y el parvovirus B19.
Otras pruebas sustituyeron en gran medida a la microsco-
pia electrnica en el diagnstico.
Virus de la hepatitis
El virus que causa la hepatitis A se descubri en 1972 por
microscopia electrnica inmunitaria de muestras fecales de
los pacientes incluidos en los estudios de voluntarios. Sin
embargo, se demostr en poco tiempo que la mayor parte
de la excrecin del virus ocurre en la fase prodrmica de
la enfermedad y el diagnstico se establece ahora por la
deteccin del anticuerpo IgM especco de la hepatitis A.
Aunque no se utiliz para el diagnstico, fue la microsco-
pia electrnica la que revel que el otro virus transmitido
por va entrica, el de la hepatitis E, tiene la morfologa de
un calicivirus. La hepatitis E no se identica con frecuen-
cia en el Reino Unido, pero se vincula con brotes transmi-
tidos en reas en va de desarrollo del mundo y la infeccin
es en particular grave en mujeres embarazadas.
La microscopia electrnica fue ms til en el diagnstico
de la infeccin de la hepatitis B. Las partculas y antgenos
vricos, sobre todo el antgeno de supercie de la hepatitis
B, estn presentes en el suero por periodos prolongados. El
diagnstico puede determinarse con facilidad si se reconocen
partculas completas del virus, pero a menudo slo pueden
verse esferas de 22 nm de la capa protenica del virus (ant-
geno supercial). El antgeno supercial es difcil de distin-
guir de otro material de fondo en el suero. Para aumentar la
sensibilidad y la identicacin del caso, el suero del pacien-
te se mezcla con un antisuero especco en una prueba MEI,
la cual no es conveniente para examinar una gran cantidad
de muestras y debe emplearse de manera selectiva.
Parvovirus B19
Mientras se buscaba el virus de la hepatitis B por MEI del
suero se descubri primero el parvovirus B19. Con poste-
rioridad se reconoci que ste era el agente etiolgico del
eritema infeccioso, una infeccin comn de salpullido de la
niez que tambin se conoce a menudo como sndrome de
la cara abofeteada. La infeccin en el embarazo puede cau-
sar dao fetal. Puede tambin precipitar crisis aplsica grave
en individuos con trastornos hematolgicos como la anemia
falciforme. La conrmacin del laboratorio de la infeccin
por B19 puede modicar en grado notorio la atencin de estos
pacientes. Aunque no se han utilizado por ms tiempo para el
diagnstico de rutina, los resultados contradictorios entre las
pruebas para la infeccin por el parvovirus B19 (p. ej., una
PCR positiva pero un resultado negativo de la IgM) se pueden
resolver en poco tiempo mediante microscopia electrnica.
Cerebro
Cuando los frmacos antivricos estuvieron disponibles
para el tratamiento de la encefalitis herptica se realizaron
intentos para detectar al herpesvirus en suspensiones tei-
das negativas de material cerebral. El diagnstico rpido
y exacto era importante porque los medicamentos antiv-
ricos tempranos eran en extremo txicos. Sin embargo, la
microscopia electrnica no mostr particular sensibilidad
y pronto la sustituyeron la microscopia de uorescencia y
luego las tcnicas de PCR. El paramixovirus helix del sa-
rampin se ha identicado en cortes nos de tejido cerebral
de personas con panencefalitis esclerosante subaguda. El
primer poliomavirus humano, JC, se descubri en cortes
nos de tejido cerebral de pacientes con leucoencefalopata
multifocal progresiva. Aunque la microscopia electrnica
fue til para establecer la causa de estas dos anormalida-
des, las tcnicas de uorescencia y las pruebas de PCR son
ms sensibles para examinar material cerebral.
Orina
Los intentos para hallar virus en las muestras de orina han
tenido un xito variable. Mediante microscopia electrnica
se descubri un segundo poliomavirus humano conocido
como virus BK. ste infecta de manera regular a los in-
dividuos sometidos a trasplante y se excreta en la orina.
Muestra un crecimiento muy lento en los cultivos celulares
y la microscopia electrnica ha sido en extremo til para
el diagnstico. Se han desarrollado pruebas de PCR y son
ahora el mtodo habitual empleado para nes diagnsticos.
El citomegalovirus (CMV), un miembro del grupo del virus
del herpes, tambin se elimina en la orina, pero se reconoce
slo por microscopia electrnica cuando est presente una
gran cantidad de partculas vricas. Los sntomas de las in-
fecciones con los virus CMV y BK pueden semejar a los
del rechazo del rgano. El diagnstico de una causa vrica
da lugar a una mejor atencin del paciente, puesto que el
uso inadecuado de los agentes inmunosupresores prolon-
gara en realidad la infeccin del virus.
Laboratorio de virologa
Adems de su papel primario en el diagnstico, la mi-
croscopia electrnica tiene muchas otras funciones en un
laboratorio de virologa. Proporciona tambin apoyo en el
desarrollo de nuevas pruebas alternativas de diagnstico
y con frecuencia es til en proyectos de investigacin. La
microscopia electrnica se utiliza para la identicacin r-
pida de los virus aislados en cultivos celulares y puede redu-
cir en gran proporcin el tiempo invertido en identicar un
REACCIN RPIDA DE URGENCIA 187
agente citoptico, en especial si estn presentes varios tipos
vricos. Se utiliza cuando otras pruebas suministran resulta-
dos inconsistentes, equvocos o aun negativos; por ejemplo,
las pruebas de PCR y ELISA para el norovirus no iden-
tican todas las cepas y la microscopia electrnica puede
proporcionar resultados positivos sobre muestras al parecer
negativas. La microscopia electrnica tambin se usa para
comprobar los antgenos vricos, como los virus del saram-
pin y la rubeola y preparados de otras pruebas, y detectar
los contaminantes vricos que aparecen de forma natural
en los cultivos celulares, como SV40 (g. 18-8).
Figura 18-8 Poliomavirus encontrado como un contaminante en
un cultivo celular (180 000 ).
Reaccin rpida de urgencia
Los acontecimientos actuales del mundo condujeron a una
conciencia del potencial de la actividad bioterrorista, y las
agencias de gobierno revisan de forma continua los planes
para enfrentar algn acontecimiento de esta naturaleza. La
viruela se ha identicado como un agente posible para la li-
beracin intencionada. Puesto que la microscopia electr-
nica es el mtodo ms rpido para detectar un ortopoxvirus,
los microscopistas han revisado protocolos y examinado pa-
neles externos de aseguramiento de la calidad para garanti-
zar una respuesta. Despus de la erradicacin, la vacunacin
ces y por lo tanto casi todo el personal del laboratorio care-
ce de vacunacin. Mientras que la amenaza de infeccin sea
an muy baja, se considera que los riesgos relacionados con
la vacunacin pueden tener ms peso que los de la viruela.
Para proteger al personal que puede enfrentarse inesperada-
mente a un espcimen de la viruela, se recomienda inacti-
vacin del microorganismo antes del proceso. Es esencial
que cualquier mtodo elegido no comprometa la capacidad
de identicar a los poxvirus y virus del herpes. Se ha obser-
vado que una solucin de formaldehdo al 5% amortiguada
con fosfatos inactiva al virus sin enmascarar las caracters-
ticas morfolgicas identicables. El glutaraldehdo se usa
muchas veces como un jador para la microscopia electrni-
ca. Algunos microscopistas preeren no jar la muestra, te-
ir sobre una rejilla y despus impregnar la rejilla preparada
en una gota de glutaraldehdo. No obstante, si la muestra se
trata con glutaraldehdo antes del procesamiento, la estruc-
tura supercial de cualquier virus teido de forma negativa
se oscurece por completo. Si un ortopoxvirus se reconoce
por microscopia electrnica, se requieren pruebas adiciona-
les para identicarlo. Por lo regular, esto se realiza mediante
PCR en laboratorios especializados. El ortopoxvirus que se
presenta ms veces en el Reino Unido es el cowpox, que
suele adquirirse de gatos domsticos. En 2003 tuvo lugar un
brote de una enfermedad con lesiones vesiculares en seres
humanos en Estados Unidos que caus preocupacin y di-
fusin considerables. Un ortopoxvirus se reconoci en poco
tiempo mediante microscopia electrnica y con posteriori-
dad se identic como el monkeypox, adquirido de roedores
domsticos de latitudes lejanas. Aunque la infeccin por el
monkeypox puede ser muy grave, este poxvirus no es por
fortuna muy transmisible entre los seres humanos.
Virus de nueva aparicin
Nuevos virus se descubren y la microscopia electrnica
se halla a la vanguardia en la bsqueda y caracterizacin
inicial de estos microorganismos. La facilidad de los vue-
los internacionales supone que las nuevas infecciones se
pueden transmitir alrededor del mundo a las poblaciones
no inmunizadas en un tiempo muy corto. Por ejemplo, en
la primavera de 2003 se identic el sndrome respiratorio
agudo grave, que se origin en el Extremo Oriente, como
una enfermedad nueva. Se observ un esfuerzo mundial,
que coordin la Organizacin Mundial de la Salud, para
identicar el agente etiolgico. La microscopia electrnica
desempe un papel prominente al identicar con rapidez
un coronavirus nuevo como la causa (g. 18-9).
Conclusiones
La microscopia electrnica desempea un papel esencial
en la respuesta pronta a las situaciones de urgencia en las
cuales la salud pblica se pone en riesgo, tanto si la libera-
cin de un agente biolgico es deliberada como si se trata de
una nueva infeccin de surgimiento natural. La microscopia
electrnica se utiliza a menudo como mtodo de diagnsti-
co primario en las etapas tempranas despus que un virus
se descubre hasta el desarrollo de pruebas ms fciles. La
microscopia electrnica implica un trabajo intensivo y no es
conveniente para examinar una gran cantidad de muestras.
Por lo tanto, si las pruebas alternativas convenientes pueden
estar disponibles, la microscopia electrnica tiende a tomar
un papel ms bien conrmatorio. El nfasis principal de la
microscopia electrnica en virologa parece enfocarse ms
en los aspectos de la investigacin, donde ha tenido siempre
un papel esencial. El costo primario del equipo supone que
la microscopia electrnica no est disponible en todos los
laboratorios. Adems, un servicio satisfactorio requiere per-
sonal experto y experimentado y tiempo en el mantenimien-
to del equipo en condiciones de trabajo ptimas. Si bien
la microscopia electrnica ha sufrido una declinacin en la
virologa de rutina, puede ser prctico colaborar con los mi-
croscopistas electrnicos en otros campos de la patologa y
ofrecer una gama completa de tcnicas de microscopia elec-
trnica. Esto puede funcionar con eciencia, siempre que
las diferentes necesidades de todos los usuarios se atiendan
y haya acceso conveniente y fcil para todos ellos.
Figura 18-9 El virus del sndrome respiratorio agudo grave
(180 000 ).
La microscopia electrnica se ha utilizado en extenso
para la deteccin de virus en las muestras fecales de pacien-
tes con gastroenteritis y en particular para la investigacin
de lactantes con diarrea. Es probable que la introduccin de
equipos ELISA comerciales nuevos reduzca los nmeros
de muestras examinadas por microscopia electrnica. Es-
tos equipos ofrecen pruebas ms baratas y la capacidad de
examinar gran cantidad de especmenes, pero tienen limi-
taciones y no pueden identicar todas las cepas vricas. La
microscopia electrnica es todava el mtodo ms rpido
para el diagnstico de lesiones vesiculares por virus y tiene
importancia especial en la atencin de los pacientes inmu-
nocomprometidos. La microscopia electrnica tambin po-
see una funcin relevante en la identicacin rpida de los
virus aislados de muestras clnicas en cultivo celular.
Muchos virus nuevos se han descubierto gracias al uso
de la microscopia electrnica, en especial desde los prime-
ros aos de la dcada de 1970. La microscopia electrnica
tiene una contribucin importante en el descubrimiento y
caracterizacin de los virus nuevos, junto con los avances
recientes de la virologa molecular. Por ejemplo, 40% de
las infecciones de gastroenteritis todava permanece sin
diagnosticar. Algunos virus de la hepatitis y retrovirus an
requieren la caracterizacin por microscopia electrnica
y sta se emplea asimismo para buscar virus en tumores.
No dejar de utilizarse para comprender la patogenia de
las infecciones vricas y el papel de los antgenos vricos,
que podran conducir al desarrollo de tratamientos ecaces
y vacunas. Tales estudios pueden auxiliarse del desarrollo
de tcnicas mejoradas y pruebas automatizadas de pre-
paracin para el corte no y la exploracin. Los avances
recientes en el diseo del microscopio electrnico, como
los microscopios ambientales de exploracin que no re-
quieren procedimientos de secado complejos y extensos,
signican que no slo las muestras pueden procesarse de
modo ms rpido y fcil, sino que se evita la contraccin
y la distorsin de la muestra. Como los microscopios se
tornan cada vez ms de uso amable, la investigacin de
virus por microscopia electrnica ser ms fcil.
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19
Cultivo tisular
William L Irving y Alan Pawley
Introduccin
Las partculas vricas consisten en material gentico (cido
nucleico) ms una pequea cantidad de protenas, de ah la
memorable cita de sir Peter Medawar los virus son pro-
blemas envueltos en una capa de protenas. Algunos virus,
adems, poseen un recubrimiento de lpidos. No hay or-
ganelos internos, como mitocondrias, ribosomas o aparato
de Golgi. Por lo tanto, los virus son parsitos intracelula-
res obligatorios, es decir, slo pueden reproducirse dentro
de clulas vivas, de modo que usurpan la generacin de la
energa y la maquinaria biosinttica de la clula husped.
El aislamiento de los virus a partir del material clnico re-
presenta entonces varios desafos del todo distintos de los
que se encuentran en un laboratorio de bacteriologa, en el
cual las bacterias pueden crecer en medios inanimados. La
presencia de clulas vivas en una forma u otra es el primer
requisito esencial para el crecimiento exitoso de los virus.
Por muchos aos, los virus crecieron en huevos de galli-
nas fecundas. Una alternativa consiste en utilizar animales
experimentales completos. Aunque ambas tcnicas pueden
todava ser de valor en circunstancias especializadas, las
han reemplazado en gran parte los cultivos celulares deri-
vados de una variedad de tejidos en los laboratorios vricos
de rutina y crecen como monocapas sobre supercies de
cristal o plstico (es decir, tubos o frascos). En este captu-
lo se discuten los detalles prcticos del funcionamiento de
un laboratorio de cultivo celular para el aislamiento de los
virus y se resaltan las ventajas y desventajas de esta apro-
ximacin al diagnstico de la infeccin vrica.
Seleccin de los cultivos celulares
El primer paso en el ciclo de la rplica de cualquier vi-
rus es la unin a su clula objetivo. ste es un proceso muy
especco que implica la interaccin precisa entre un li-
gando sobre la supercie del virus y un receptor sobre la
supercie de la clula objetivo. En consecuencia, no todos
los virus infectan y crecen en todos los tipos celulares; las
clulas que carecen del receptor apropiado para un virus
particular son resistentes a la infeccin por ese virus. Esto
crea un problema para el laboratorio de diagnstico: para
proporcionar un servicio detallado para el aislamiento de
todos los virus posibles se requerira la disponibilidad de di-
versos tipos celulares. En la prctica, la mayor parte de los
laboratorios analiza slo dos o tres diferentes tipos de clula,
cada uno de los cuales apoya el crecimiento de una gama
de virus todo lo amplia posible. Los cultivos celulares ms
comunes se enumeran en el cuadro 19-1, que tambin se-
ala qu virus pueden crecer en cada uno. Aunque esta lis-
ta incluye a muchos de los virus comunes hallados en la
prctica clnica, algunos virus importantes (por ejemplo,
el virus de la inmunodeciencia humana [HIV], los virus
de la hepatitis, los virus de la gastroenteritis, incluidos ro-
tavirus y adenovirus entricos, y el virus de Epstein-Barr
[EBV]) no guran all, al igual que otros ms. El aisla-
miento de algunos de estos microorganismos se puede
alcanzar por medio de tcnicas especializadas de cultivo
celular, como el cultivo de rgano. Las caractersticas di-
ferenciales del tejido de origen pueden mantenerse en el
cultivo de rgano; por ejemplo, los anillos traqueales fetales
192 CAP. 19 CULTIVO TISULAR
humanos tienen clulas epiteliales ciliadas que funcionan
en el tracto respiratorio capaces de apoyar la replicacin
de los virus comunes del resfriado. De manera alternativa,
pueden utilizarse cultivos celulares especializados, como
el HIV y el EBV, que pueden crecer en linfocitos humanos
de la sangre perifrica, y algunos de los virus de la he-
patitis, que crecen en cultivos primarios del hepatocito, o
algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos
de hepatocitos primarios o estirpes celulares derivadas del
hepatoma. Sin embargo, las dicultades de la disposicin
de una fuente regular de estos cultivos ms especializados
signica que el aislamiento de estos virus se restringe a
los laboratorios de referencia o de investigacin. Otros vi-
rus (por ejemplo, los virus del papiloma humano, el virus
de la hepatitis C) son tan exigentes en sus requerimientos
para el crecimiento que el aislamiento en cultivo celular ha
demostrado ser casi imposible. El diagnstico de la infec-
cin con estos virus debe apoyarse siempre en otras tcni-
cas distintas del aislamiento en cultivo celular.
Preparacin de cultivos celulares
El funcionamiento eciente de un laboratorio de virologa
diagnstica requiere la disponibilidad de: a) clulas comu-
nes que crecen a gran escala y b) clulas maduras en nme-
ros pequeos. Estas ltimas se preservan en un receptculo
(casi siempre un tubo, aunque las placas de microtitula-
cin para cultivo celular son una alternativa) listo para la
inoculacin con el material clnico apropiado, a medida
que dicho material llega al laboratorio. Cuando estos tu-
bos se utilizan, se sustituyen por tubos frescos preparados
a partir de los cultivos de reserva.
Todos los tipos celulares estndar enumerados en el cua-
dro 19-1 crecen como clulas de adhesin, no tanto como
suspensiones celulares. Esto signica que se unen a una su-
percie plana (por lo regular frascos de plstico con cultivo
celular) y entonces se multiplican y dividen, a condicin
de que el medio de cultivo contenga los nutrimentos nece-
sarios, hasta que se cubra la supercie completa. En este
punto, casi todas las clulas dejan de dividirse debido a la
inhibicin por contacto. Este proceso se conoce como cre-
cimiento de conuencia. Una vez que una placa celular es
conuente, las clulas pueden desprenderse de la supercie
mediante una enzima proteoltica como la tripsina diluida
en un medio de cultivo, y verterse de nueva cuenta dentro
de una cantidad de frascos nuevos (p. ej., tres o cuatro),
donde crecen entonces otra vez para conuir. Este proceso
se conoce como pasaje celular y, de esta manera, el nme-
ro de las clulas disponibles puede ampliarse con rapidez.
De forma alternativa, las clulas de un frasco conuente
pueden distribuirse en concentraciones celulares bajas en
un estante para tubos con cultivo celular que, una vez que
las clulas se instalan y alcanzan la conuencia, esperan la
inoculacin con el material clnico.
Las clulas se diferencian en su capacidad de someterse
a pasajes repetidos. Los cultivos primarios, es decir, aque-
llos establecidos de manera directa a partir del tejido (por
ejemplo, clulas renales del mono) no sobreviven ms de
dos o tres pasajes in vitro. Esto es una desventaja impor-
tante para su uso, ya que el suministro continuo de cultivos
primarios frescos es costoso e inconveniente. En realidad,
existe una considerable preocupacin de que el suministro
de clulas renales del mono pueda cesar por varias razones.
Estas clulas se han replicado para el aislamiento de los vi-
rus circulantes de la inuenza y ha existido un gran esfuer-
zo para encontrar los sustratos celulares alternativos para
estos virus. Por comparacin, las lneas celulares tumorales
(por ejemplo, clulas Hep-2, clulas HeLa) pueden divi-
dirse de modo indenido cuando se transforman in vitro y
por lo tanto se conocen como lneas celulares continuas.
Entre estos dos extremos, las clulas diploides derivadas
del tejido embrionario humano (por ejemplo, broblastos
embrionarios humanos) pueden crecer con xito en 30 o 40
pasajes antes de cesar y, por lo tanto, se denominan lneas
celulares semicontinuas.
Las clulas se cultivan en frascos de cultivo bajo con-
diciones estriles. La preparacin se efecta a menudo en
gabinetes con ujo laminar vertical, pero se puede realizar
en un lugar abierto con un mechero de Bunsen y la tcnica
asptica apropiada. El medio agregado a los frascos debe
ser isotnico y con un pH conveniente (por ejemplo, 7.2 a
7.4), casi siempre basado en soluciones salinas siolgi-
Cuadro 19-1 Cultivos celulares comunes
Tipo de cultivo
Cultivos primarios/secundarios
Clulas renales del mono
Lneas celulares semicontinuas
Fibroblastos embrionarios
humanos
Lneas celulares continuas
Clulas Vero (derivadas del
rin del mono)
Clulas Hep-2/clulas HeLa
Clulas renales caninas de
Madin Darby (MDCK)
Virus capaces de crecer
Virus de la inuenza, virus
de la parainuenza,
enterovirus, virus de las
paperas
Virus del herpes simple
(HSV), virus de la varicela
zoster, citomegalovirus,
enterovirus, adenovirus,
rinovirus
HSV, virus de las paperas
Virus sincitial respiratorio,
adenovirus
Virus de la inuenza
IDENTIFICACIN DEL CRECIMIENTO VRICO 193
camente equilibradas. La composicin exacta del medio
puede variar de acuerdo con el tipo de clula: las frmulas
detalladas estn disponibles en guas prcticas. Es til agre-
gar un colorante indicativo para permitir el reconocimiento
del metabolismo celular por un cambio del color (clulas
sanas que al crecer producen un medio cido). Para el cre-
cimiento, son necesarios los aminocidos esenciales y la
protena y stos se proporcionan bajo la forma de suero pro-
cedente de un bovino fetal. Los antibiticos se agregan al
medio de crecimiento como precaucin adicional contra la
contaminacin bacteriana o mictica, cuyas fuentes prin-
cipales son las bacterias otantes, las levaduras a partir de
la fuente de dixido de carbono y las especies de Myco-
plasma a partir de reactivos contaminados o del operador.
Estos ltimos reducen en grado notable la capacidad de las
clulas para apoyar el crecimiento del virus.
Una vez que se alcanza la conuencia, las clulas se pue-
den desprender con procedimientos fsicos mediante un ras-
pador de caucho de silicn estril (conocido como polica
de caucho) o, las ms de las veces, mediante el tratamiento
con tripsina y EDTA, que interrumpen la adhesin de las
clulas a la supercie plstica y dan lugar a que las clulas
se agrupen y desprendan. En esta etapa las clulas se pueden
contar en un hemocitmetro y se calcula el volumen apro-
piado para la resuspensin (para proporcionar la concentra-
cin de siembra ptima). Sin embargo, con experiencia, es
suciente un clculo aproximado del volumen necesario.
Si las clulas no se transforman ms, como las que se ha-
llan listas en los tubos para la inoculacin, entonces el medio
de crecimiento se sustituye por un medio de conservacin,
una vez que se alcanza la conuencia; la diferencia radica en
que en el ltimo la concentracin de suero est sumamente
reducida. Las clulas conuentes en los tubos de cultivo ce-
lular con medio de conservacin sobreviven por varios das,
pero se atenan al nal con lentitud a pesar de los cambios
del medio, punto en el cual deben desecharse.
Las clulas generadas para las investigaciones con virus
pueden, cuando se exceden los requisitos, conservarse como
reservas de semillas congeladas en nitrgeno lquido. Las
clulas se suspenden en un medio que contiene dimetilsul-
fxido, que previene la formacin de cristales de hielo que
destruyen a las clulas. Si es necesario, en caso de contami-
nacin bacteriana de las clulas en uso, las clulas pueden
descongelarse con rapidez y prepararse los cultivos frescos.
Especmenes clnicos
para el aislamiento de virus
No hay ninguna restriccin en la naturaleza del material
clnico que impida inocular en cultivo celular para el aisla-
miento de virus. Las muestras lquidas (por ejemplo, lquido
cefalorraqudeo, saliva, orina, lquido vesicular, aspirados
nasofarngeos, lquido de lavado broncoalveolar, sangre,
heces diarreicas) pueden enviarse al laboratorio en un con-
tenedor estril y agregarse a tubos de cultivo celular apro-
piados y limpios o sometidos a dilucin en un medio de
conservacin. Los escobillados (por ejemplo, de conjun-
tivas, garganta, base de la lcera, cuello cervical, recto) se
deben introducir en el medio vrico de transporte (lquido
isotnico ms los antibiticos para inhibir el sobrecreci-
miento microbiano), puesto que los virus no sobreviven en
los escobillados secos. Despus de verter la botella para
liberar tanto material celular como sea posible a partir del
escobillado en el medio, el medio de transporte se inocula
sobre las placas celulares. Las biopsias tisulares (por ejem-
plo, cerebro, intestino, pulmn) se deben tambin colocar
en el medio de transporte vrico. El tejido puede picarse
muy no y el material celular y el sobrenadante inocular-
se en cultivo.
Identicacin del crecimiento vrico
Una vez que un espcimen clnico se inocula en los tubos
de cultivo celular, stos se incuban bajo condiciones que se
asemejen, tanto como sea posible, a aquellas de las que
se obtuvo el material. La mayor parte de los cultivos se
mantiene a 37C, pero algunos virus, sobre todo los de las
vas respiratorias superiores, crecen mejor a una tempera-
tura ligeramente ms baja, como 33C, y en presencia de
5% de dixido de carbono. Los cultivos se pueden rotar
lentamente con un tambor de rodillo, que mejora la ai-
reacin de la placa celular, o mantenerse inmviles. El
desafo para el microbilogo consiste entonces en determi-
nar si un cultivo celular dado contiene o no clulas en las
cuales se replica un virus. Existe una cantidad de opciones
disponibles para lograr este objetivo.
Efectos citopticos
Cuando los virus se replican dentro de las clulas, stas
pueden experimentar cambios morfolgicos como acre-
centamiento debido a la alteracin de la permeabilidad de
la membrana, contraccin por la muerte celular o forma-
cin de clulas gigantes multinucleadas por la presencia
de una protena de fusin que el virus codica. Estos cam-
bios de la morfologa celular, visibles bajo el microscopio
de luz, se reeren como efecto citoptico (ECP) y los virus
que inducen estos cambios son citopatgenos. Por consi-
guiente, la presencia de un virus dentro de un cultivo celu-
lar puede determinarse por el examen regular (por ejemplo,
cada dos das) del cultivo bajo la lente de bajo poder de un
microscopio de luz para reconocer el desarrollo de un ECP.
El aspecto exacto de un ECP es variable, de acuerdo
con el virus causante y el tipo de clula en que ocurre. Las
clulas pueden aumentar de tamao con rapidez, secarse o
fundirse en el sincitio (clulas multinucleares gigantes). El
efecto puede extenderse a lo largo de la placa celular en-
tera o puede ser mucho ms focal en naturaleza. Puede
verse de manera predominante, cuando no exclusiva, en el
borde de la placa, tanto como en el centro. El ritmo de de-
sarrollo del ECP puede variar de tan poco como 18 horas
hasta incluso cuatro semanas. Si se tienen en cuenta todos
estos factores, ms los detalles clnicos relevantes de un
espcimen particular, un virlogo puede diagnosticar qu
virus est presente en el cultivo a travs de la observacin
por microscopia de luz de tan slo el ECP. En consecuen-
cia, un ECP que se origina en un escobillado de una vescu-
la, que posee clulas agrandadas que aparecen despus de
24 horas de cultivo y que se extienden con rapidez para
destruir la placa celular entera, es muy probable atribuir-
lo al virus del herpes simple. En cambio, un escobillado
de una vescula que da lugar a que un ECP aparezca slo
despus de 10 das de cultivo, en slo dos o tres focos de
clulas agrandadas en el centro de la placa, y que se extien-
de en forma lenta durante varios das despus, es probable
que se explique por el virus de la varicela-zoster. En la -
gura 19-1 se listan las caractersticas de los ECP para virus
especcos.
Pasaje de los virus
La replicacin de los virus dentro de una placa celular no
es la nica causa de un ECP visible. El material inoculado
sobre la placa puede ser citotxico, un problema en espe-
cial frecuente con muestras fecales; puede ocurrir tambin
la contaminacin con otros microorganismos, a pesar de
todas las precauciones tomadas. Si existe alguna duda en
cuanto a los orgenes de un ECP, una manera simple de
distinguir entre un virus comparado con un efecto txico
consiste en procurar el pasaje del virus supuesto. Las c-
lulas que permanecen en la placa celular se raspan dentro
del sobrenadante del cultivo y algunas gotas del material
resultante se inoculan en un tubo con cultivo celular fresco.
Si haba en verdad un virus en el cultivo original, enton-
ces no slo reaparece el ECP dentro del tubo nuevo, sino
que el ritmo de desarrollo debe ser ms elevado; asimis-
mo, la cantidad, o el ttulo, del virus se tiene que incremen-
tar de forma signicativa luego del crecimiento vrico en el
primer cultivo. Empero, si el ECP original surge debido a
algn componente txico del espcimen, entonces ste se
diluye en el segundo tubo y el ECP subsiguiente debe desa-
rrollarse de forma ms lenta y extenderse menos, si acaso.
El pasaje de virus es til por otras dos razones. En pri-
mer lugar, algunos virus pueden no producir un ECP vi-
sible cuando crecen primero en un cultivo, aun cuando,
en efecto, la rplica tenga lugar. Sin embargo, en el pasaje
repetido en el mismo sustrato celular, un ECP puede ser
evidente despus de la adaptacin del virus al crecimiento
en ese tipo particular de clula. El proceso del pasaje de vi-
(a) (b)
(c)
Figura 19-1 Efectos citopticos. a) Una placa celular normal de
broblastos. Las clulas han crecido para conuir y toman la for-
ma de huso. b) Algunas de las clulas estn redondeadas y agran-
dadas. Este aspecto en focos discretos separados por las clulas
que parecen normales es tpico del efecto citoptico que induce
el citomegalovirus. c) Varias clulas se han agrupado por toda la
placa celular para conferir un aspecto de salpicadura. ste es el
aspecto caracterstico del ECP que induce un rinovirus.
IDENTIFICACIN DEL CRECIMIENTO VRICO 195
rus a partir de clulas al parecer normales se conoce como
pasaje ciego, quiz porque en esa etapa el virlogo no pue-
de reconocer la presencia del virus. La identicacin del
virus de la rubeola que crece en clulas renales de conejo
(RK13) puede requerir varios pasajes ciegos. En segundo
lugar, el pasaje de virus es un buen mtodo que incrementa
la cantidad de virus disponibles para otros estudios, como
en la prueba de neutralizacin (vase ms adelante).
Conrmacin del aislamiento del virus
En la mayor parte de los casos, el tipo de virus en un cul-
tivo celular se puede determinar con certeza razonable
mediante la observacin de las caractersticas del ECP pre-
sente en la placa celular, segn lo descrito antes. Pese a
ello, hay casos en que puede requerirse la conrmacin de
la identidad del virus, por ejemplo, si el ECP es atpico, no
se realiza bien el pasaje o est ausente o, de manera alter-
nativa, cuando se requiere ms informacin sobre la cepa
particular del virus. Esto se puede conseguir con el uso de
la microscopia electrnica, la deteccin del antgeno o las
pruebas de neutralizacin.
El proceso del cultivo celular acta como medio para
incrementar el ttulo vrico a un grado suciente que per-
mita la visualizacin por microscopia electrnica (ME).
De esta manera, a condicin de que haya acceso a ME,
casi todos los problemas relacionados con ECP atpicos
o inusuales pueden resolverse con rapidez por el examen
apropiado con ME de las clulas o el sobrenadante del cul-
tivo. Los virus necesitan tener una concentracin 10
6

partculas/ml para utilizar esta tcnica con xito.
Las clulas infectadas con un virus particular expresan
los antgenos derivados de ese virus. Estos antgenos pue-
den detectarse si se tien con anticuerpos. Por lo tanto, la
identidad especca de un virus que crece en cultivo celu-
lar puede determinarse al teir las clulas con un panel de
anticuerpos monoclonales apropiados, marcados de manera
conveniente con una marca inmunouorescente. Las c-
lulas pueden rasparse o aspirarse fuera de los tubos con
cultivo celular y despus secar sobre un portaobjetos de
cristal con multisitios cubiertos con ten o, si se conoce
que es necesaria la deteccin del antgeno, las clulas pue-
den crecer sobre una supercie plana, como un cubreobje-
tos, dentro del tubo con cultivo celular, que puede entonces
recuperarse, jarse y teirse. La deteccin del antgeno
hace posible la distincin entre, por ejemplo, virus de la
inuenza A y B o los virus de la parainuenza 1, 2, 3 o 4,
todos los cuales producen una prueba positiva similar a la
hemadsorcin (vase ms adelante).
Las pruebas de neutralizacin se utilizan casi siempre
para distinguir entre los diversos enterovirus que crecen
en cultivo o para la serotipicacin de adenovirus. En prin-
cipio, el virus aislado en cultivo se distribuye en una se-
rie de tubos y a cada tubo se agrega un antisuero diferente
(por ejemplo, antipolio 1, antipolio 2, antipolio 3 a los tu-
bos 1, 2 y 3, respectivamente). Despus de la incubacin
del virus ms el antisuero por una hora, las mezclas se agre-
gan a los tubos individuales con cultivo celular y el as-
pecto del ECP se supervisa durante los das siguientes. La
ocurrencia de un ECP tpico en los tubos 1 y 3, combinada
con la ausencia de un ECP en el tubo 2, indica que el virus
original era un poliovirus de tipo 2.
Adaptaciones del cultivo celular
En condiciones normales, el aislamiento del virus por cul-
tivo celular es mucho ms lento que el aislamiento bac-
teriano en medios inanimados. El crecimiento vrico ms
rpido, el del virus del herpes simple, puede producir un
ECP despus de 18 horas, pero casi todos los virus requie-
ren varios das (o aun semanas) para hacerlo. Esto es una
desventaja considerable! As, se han introducido diversas
modicaciones del cultivo celular con el propsito de ace-
lerar el proceso. Dos de ellas, adoptadas por los laborato-
rios de diagnstico son la hemadsorcin y la deteccin de
los focos uorescentes del antgeno temprano.
Algunos virus (por ej., los virus de inuenza y parain-
uenza y los de las paperas) poseen una hemaglutinina (es
decir, una protena que se une a los eritrocitos). Las clulas
infectadas expresan esta molcula en sus supercies. De
esta manera, si los eritrocitos se aaden a un tubo con cul-
tivo celular en el cual el virus se halla bajo replicacin, al
nal se adhieren a la placa celular, un fenmeno conocido
como hemadsorcin (g., 19-2a). La hemadsorcin es de-
mostrable (al girar con suavidad el tubo con cultivo) por
algunos das antes de que el ECP sea evidente. La naturale-
za exacta del virus hemadsorbente puede determinarse tras
teir con anticuerpos monoclonales.
La deteccin de focos uorescentes del antgeno tem-
prano (prueba de DEAFF) se desarroll de modo especco
para acelerar la identicacin del citomegalovirus (CMV)
en cultivo celular. En esencia, la DEAFF es una adapta-
cin de la deteccin del antgeno en la cual los antgenos
a detectarse se seleccionan como aquellos que aparecen en
fase temprana (dentro de las 24 a 48 h) en el ciclo de la
replicacin del virus (de ah la denominacin de antge-
nos tempranos). Entonces, el material clnico se inocula
sobre una placa celular que creci sobre un cubreobjetos
u otra supercie plana (un tipo de cultivo conocido como
shell vial). Hay un paso de centrifugacin (2 500 g h)
que aumenta en grado considerable la infectividad de la
placa celular por el virus. Despus de 24 horas, la placa
se lava y en seguida se tie con un anticuerpo monoclo-
nal marcado con uorescena dirigido contra un antgeno
temprano del CMV. El cubreobjetos se examina entonces
bajo luz ultravioleta. Un resultado positivo se indica por la
presencia de ncleos uorescentes en las clulas aisladas
(es decir, focos), que parecen normales desde el punto de
vista morfolgico (vase la g. 19-2b). Esta tcnica se ha
extendido a otros virus de crecimiento lento; por ejemplo,
los adenovirus pueden reconocerse mucho antes que sea
evidente cualquier ECP si se tien con anticuerpos contra
antgenos tempranos del adenovirus.
Conclusiones
El aislamiento de virus en cultivos celulares es todava una
tcnica importante para el diagnstico de las infecciones
vricas. En teora, una sola partcula vrica dentro de un
espcimen clnico puede crecer en cultivo celular y, de ese
modo, extenderse por muchos rdenes de magnitud, lo cual
permite la deteccin y caracterizacin exactas. Los altos
grados de sensibilidad y especicidad inherentes al aisla-
miento del virus son los estndares de oro contra los que
deben compararse las nuevas tcnicas. La metodologa es
apropiada para una amplia gama de especmenes clnicos y
diferentes virus (cuadro 19-2). En raras ocasiones, su uso
da lugar a la identicacin de virus inesperados o inclu-
so sin identicacin previa: el HIV y los virus del herpes
humano 6 y 7 se descubrieron primero en cultivo celular
y el ltimo virus que se identic de esta manera es el co-
ronavirus del sndrome respiratorio agudo grave. Es una
tcnica que analiza todo y est bien adaptada a la identi-
cacin de lo desconocido en especmenes clnicos.
Los dos inconvenientes principales de esta tcnica son,
primero, que no todos los virus pueden crecer en cultivo
y, segundo, que algunos virus experimentan adems creci-
miento lento. El desarrollo de los nuevos tipos de cultivo
celular, que contribuyen a disponer de un arsenal cada vez
ms extenso de virus, puede superar en cierto grado el pro-
blema anterior, aunque hay varias adaptaciones del cultivo
celular que pueden acelerar el proceso de identicacin vrica.
Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral
Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. 1996: American
Public Health Association, Washington, DC.
Cann AJ (ed.). Virus Culture: A Practical Approach. 1999: Oxford
University Press, Oxford.
Figura 19-2 Adaptaciones del cultivo celular. a) Hemadsorcin. La placa celular (rin del mono) es normal, esto es, ningn
efecto citoptico visible se ha desarrollado an. Sin embargo, muchas clulas dentro de la placa expresan una hemaglutinina
codicada de forma vrica sobre su supercie, como los eritrocitos, aqu observados como puntos pequeos que cubren la placa
celular, y se han unido a la placa. b) Prueba de DEAFF. La placa celular se tie con un anticuerpo monoclonal anti-CMV marcado
de modo uorescente. Un solo ncleo se advierte en tono verde manzana, intenso y brillante, bajo la luz ultravioleta, lo que indica
la presencia del CMV en esta clula. Todas las clulas (contrateidas con el colorante azul de Evans) son normales en trminos
morfolgicos.
(a) (b)
Cuadro 19-2 Aislados vricos potenciales obtenidos
de material clnico
Espcimen clnico
Lquido o escobillado de una
vescula
Aspirado nasofarngeo o
escobillado de la garganta
Heces
Lquido cefalorraqudeo
Orina
Escobillado conjuntival
Sangre (placa
leucoplaquetaria)
Virus que pueden aislarse en
cultivos celulares comunes
Virus del herpes simple (HSV),
virus de la varicela zoster
Virus sincitial respiratorio,
virus de la inuenza A y B,
virus de la parainuenza
1-4, adenovirus, rinovirus,
enterovirus, HSV,
citomegalovirus (CMV)
Enterovirus, adenovirus
Enterovirus, virus de las paperas
CMV, virus de las paperas
HSV, adenovirus
CMV
Introduccin
El sistema inmunitario produce los anticuerpos en respuesta
a varios estmulos, incluidas las infecciones, y la serologa
es la ciencia de la cuanticacin de estos anticuerpos en el
suero. Por convencin, el trmino serologa tambin inclu-
ye el estudio del suero para el antgeno y, por extensin, se
dene cualquier prueba que implica una reaccin antgeno-
anticuerpo como prueba serolgica. Las pruebas serolgicas
aprovechan el hecho de que la mayor parte de las infecciones
vricas y muchas bacterianas, micticas y parasitarias obtie-
nen buenas reacciones del anticuerpo. Estas pruebas se han
utilizado para el diagnstico de enfermedades vricas u otras
enfermedades en las que los microorganismos no se aslan
con facilidad, por ejemplo Toxoplasma y slis. En infeccio-
nes vricas como la hepatitis B, en la que hay una fase vir-
mica prolongada, se pueden utilizar tcnicas similares para
detectar el antgeno del virus. Este captulo, aunque se limita
sobre todo a la serologa del virus, tambin considera otras
pruebas serolgicas empleadas hoy da en los laboratorios de
serologa para el diagnstico de enfermedades infecciosas y
describe los principios, tcnicas, interpretacin y futuro de
estas pruebas.
Principios
La clase del anticuerpo producido y las propiedades fun-
cionales pueden explotarse para medir la respuesta inmu-
nitaria despus de la infeccin. Las clases de anticuerpo
ms tiles para la medicin son IgM e IgG. La cuantica-
cin del anticuerpo IgA secretorio y srico puede tambin
ser til, pero es ms exigente en trminos tcnicos y por lo
tanto no se utiliza de rutina en laboratorios de diagnstico.
El anticuerpo inicial que se produce despus de la infeccin
primaria es de la clase IgM y se vuelve casi siempre percep-
tible uno a dos das despus del inicio de los sntomas y as
permanece seis a 12 semanas. El anticuerpo IgG especco
comienza a aumentar en una a dos semanas y es perceptible
por muchos aos, cuando no el resto de la vida, despus de
la infeccin. Por consiguiente, el anticuerpo IgG especco
del virus slo se relaciona con la infeccin pasada y en casi
todos los casos denota inmunidad para la infeccin futura.
Por otra parte, como el anticuerpo IgM especco del virus
suele ser imperceptible despus de tres meses, su presencia
indica una infeccin reciente. La gura 20-1 muestra una
representacin grca de la reaccin de IgM e IgG despus
de la infeccin primaria. La medicin de los anticuerpos
IgG e IgM especcos del virus en una sola muestra del
suero puede por tanto auxiliar en el diagnstico y ayudar a
distinguir la infeccin vrica reciente de la pasada. Muchas
tcnicas, como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA
o EIA), el ensayo inmunouorescente (IFA, por sus siglas
en ingls) y el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en
ingls), se han desarrollado para medir IgG e IgM espec-
cas. En condiciones normales, estas pruebas se usan para
resultados cualitativos, es decir, un resultado de la prue-
ba positivo o negativo y no son cuantitativas. Tienen prin-
cipios similares por los cuales la reaccin del anticuerpo
con el antgeno se detecta por la adicin de un segundo
anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana. La
antiinmunoglobulina se marca con la uorescena (IFA),
la enzima (ELISA) o el radioistopo (RIA). Estas tcnicas
se pueden tambin emplear para la deteccin del antgeno.
El anticuerpo producido en respuesta a una infeccin
puede tambin ser distinto en su aspecto funcional, esto es,
20
Pruebas serolgicas en virologa
Goura Kudesia
198 CAP. 20 PRUEBAS SEROLGICAS EN VIROLOGA
puede ser jador del complemento, hemaglutinante o neu-
tralizante. Los antgenos presentes en el virus determinan
las caractersticas funcionales del anticuerpo producido
en respuesta, de modo que slo los virus (p. ej., rubeola,
sarampin o inuenza) que poseen hemaglutinina desen-
cadenan anticuerpos hemaglutinantes. Puede utilizarse
el conocimiento de la estructura antignica de los virus para
concebir pruebas serolgicas convenientes, como jacin
del complemento (FC), hemaglutinacin (HA) o pruebas de
inhibicin de la hemaglutinacin (IHA). Estas pruebas detec-
tan las clases de IgG e IgM del anticuerpo al mismo tiempo y
pueden cuanticar la reaccin serolgica. Es posible solicitar
diluciones seriadas del suero para determinar el ttulo del an-
ticuerpo presente. Se requieren muestras del suero agudas y
de convaleciente pareadas para establecer un diagnstico de
la infeccin reciente: un aumento del cudruple o mayor en
el valor del anticuerpo es diagnstico.
Tcnicas
Las tcnicas serolgicas se pueden dividir con base en la
complejidad de la prueba. Las ms simples son aquellas
en las cuales la presencia del anticuerpo se demuestra por
una interaccin simple con el antgeno (las pruebas de
precipitacin o aglutinacin). Las siguientes son las que
implican sistemas indicadores para reconocer la reaccin
antgeno-anticuerpo (neutralizacin o jacin del comple-
mento). Las pruebas ms complejas suponen el uso de un
segundo sistema con anticuerpo marcado, como el ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o IFA.
Precipitacin
El mtodo de doble difusin (DD) de Ouchterlony se pue-
de utilizar para detectar el anticuerpo o el antgeno. En el
primer caso se usa un antgeno conocido y en el segundo
un anticuerpo de especicidad conocida. El anticuerpo y el
antgeno se difunden el uno hacia el otro en gel de agaro-
sa y una lnea de precipitacin blanca indica una reaccin
positiva. La contrainmunoelectrouorescencia (CIE) dirige
de manera especca el movimiento del antgeno y el an-
ticuerpo el uno hacia el otro en un campo elctrico y por
lo tanto es ms rpido que el DD. La CIE fue el mtodo
usado de manera original en la identicacin del antgeno
supercial de la hepatitis B. Estos mtodos se han sustitui-
do sobre todo por tcnicas mucho ms sensibles, aunque
algunos laboratorios todava las utilizan para las pruebas
de anticuerpos de hongos.
Hemaglutinacin e inhibicin
de la hemaglutinacin (HA e IHA)
La hemaglutinina de ciertos virus, como los virus de la in-
uenza, el sarampin y la rubeola, tiene la propiedad de
aglutinar a los eritrocitos de las especies seleccionadas. Las
pruebas de HA son las ms utilizadas con los virus de la
inuenza. Las inuenzas A y B aglutinan a los eritrocitos
del grupo O humano, del cobayo y las gallinas a 4 y 20C,
mientras que la inuenza C aglutina slo a eritrocitos de
gallinas. Las pruebas de HA son por tanto tiles en la de-
teccin y titulacin del antgeno vrico. La IHA utiliza la
presencia de la hemaglutinina en el virus para identicar al
anticuerpo. La prueba se basa en el principio segn el cual
el anticuerpo especco se combina con la hemaglutinina
e inhibe a la HA. Se permite que diluciones seriadas del
suero del paciente reaccionen con una cantidad especica-
da de hemaglutinina y entonces se agregan los eritrocitos
indicadores apropiados. Si el anticuerpo especco est
presente, bloquea la hemaglutinina y por consiguiente se
advierte una reaccin positiva por la ausencia de la hema-
glutinacin. Donde est ausente el anticuerpo especco,
la hemaglutinina vrica est libre para aglutinar a los eri-
trocitos indicadores (reaccin negativa). En el pasado, las
pruebas de IHA se usaron de modo amplio para establecer
el estado inmunitario y diagnosticar infecciones recientes
del virus de la rubeola. Sin embargo, la IHA es complicada
por el hecho de que el suero necesita tratamiento anterior
para retirar los inhibidores inespeccos, y por lo tanto se ha
reemplazado con tcnicas ms sensibles y especcas para
el diagnstico de la rubeola. Pese a ello, los laboratorios de
referencia todava utilizan la IHA para la identicacin y
tipicacin de los virus de la inuenza. Las tcnicas de HA
se pueden tambin emplear para los virus que no poseen
Figura 20-1 Reaccin de IgM e IgG en las infecciones tem-
prana, reciente, convaleciente y pasada.
TCNICAS 199
hemaglutinina; esto se logra al hacer acoplar el antgeno
vrico a la supercie de los eritrocitos por un agente aco-
plador como el cido tnico. Cuando se mezclan con el
suero que contiene el anticuerpo especco, los eritrocitos
se aglutinan porque el antgeno vrico se liga a su supercie
(HA indirecta o pasiva). La HA indirecta se ha usado para
el reconocimiento del anticuerpo contra el toxoplasma. No
obstante, debido a la inestabilidad de los eritrocitos, en la
actualidad se utilizan partculas inertes de portador, como
partculas de ltex, gelatina y carbn.
Pruebas de aglutinacin de partculas
Muchas pruebas se basan en la aglutinacin de la partcula.
Estas pruebas se llevan a cabo sobre un portaobjetos o una
diapositiva de cartn o bien en celdillas de microtitulacin.
Lo que sigue no es una lista exhaustiva, sino ejemplos de
algunas de las pruebas ms comunes de uso actual.
Aglutinacin de ltex (AL)
Las micropartculas de ltex de poliestireno se sensibilizan
o cubren con el antgeno vrico aglutinado cuando se mez-
clan con el suero del paciente que contiene el anticuerpo
especco. Las partculas de ltex revestidas con el antgeno
se mezclan con el suero del paciente sobre un portaobjetos
o en una celdilla de microtitulacin. Un patrn visible de
aglutinacin aparece si el anticuerpo especco est presen-
te. Estas pruebas son de uso amplio en los laboratorios de
virus debido a su rapidez, simplicidad y facilidad de uso. En
la actualidad estn disponibles buenas pruebas de AL para la
rubeola, el toxoplasma y el citomegalovirus. Las pruebas
de AL se utilizan para el examen de una sola muestra de
suero para establecer inmunidad y los sueros pareados para
diagnosticar una infeccin reciente.
Prueba de aglutinacin de partcula de gelatina
Las partculas de gelatina se cubren con el antgeno y las
diluciones seriadas del suero de un paciente se prueban en
celdillas de microtitulacin. El ttulo del anticuerpo se de-
termina por la dilucin ms alta del suero que aglutina las
partculas revestidas de antgeno. Puede ocurrir la aglutina-
cin inespecca y por lo tanto las partculas de gelatina sin
cubrir se incluyen siempre como controles (g. 20-2).
VDRL
VDRL es una prueba serolgica para el examen de la in-
feccin de slis. Una modicacin de la prueba utiliza el
antgeno que contiene carbn microparticulado para exa-
minar el anticuerpo reagina. El uso de las partculas de car-
bn incrementa la lectura visual del resultado de la prueba
en un fondo blanco.
Fijacin del complemento (FC)
El suero del paciente, despus de la inactivacin a 56C por
30 minutos para destruir el complemento nativo, se agrega
a una cantidad conocida del antgeno vrico y del comple-
mento de conejo. Si ocurre la reaccin anticuerpo-antgeno,
entonces se activa el complemento, se ja o se liga. Luego
se agrega un sistema detector del antgeno y el anticuerpo,
Figura 20-2 Prueba de aglutinacin de partculas
de gel con Mycoplasma pneumoniae.
bajo la forma de eritrocitos de oveja sensibilizados con
el anticuerpo del conejo para los eritrocitos de oveja (he-
molisina). Si la primera reaccin antgeno-anticuerpo ja
el complemento, los eritrocitos de oveja no se lisan, lo
cual indica una reaccin y una presencia positivas del an-
ticuerpo especco en el suero. La hemlisis de eritrocitos
sensibilizados de las ovejas por el complemento seala una
reaccin negativa. La prueba FC es cuantitativa. El suero se
diluye de modo seriado y el valor del anticuerpo se expresa
como recproco de la dilucin ms alta del suero que da lu-
gar a la hemlisis de 50% de los eritrocitos sensibilizados.
Un aumento del cudruple del ttulo o la seroconversin
entre una muestra aguda y otra de suero de convaleciente
son diagnsticos. Esta tcnica requiere destreza conside-
rable y mucho trabajo, pero el suero se puede probar con-
tra antgenos mltiples en una sola ocasin con el mismo
sistema indicador. Las pruebas de FC se efectan slo en
laboratorios de virologa especializados y son todava las
pruebas de opcin para el diagnstico serolgico de las in-
fecciones vricas respiratoria y bacteriana atpicas.
Neutralizacin
La interaccin del anticuerpo especco con el virus neu-
traliza la infectividad y previene la infeccin de un siste-
ma husped viviente susceptible a ese virus. Una desventaja
importante de estas pruebas es que se requiere un sistema
husped vivo, bajo la forma de un cultivo celular o animales
vivos y por lo tanto muchas de estas pruebas se han reem-
plazado con otras tcnicas. Las pruebas de neutralizacin
todava se utilizan para detectar el anticuerpo del poliovirus
y ciertas toxinas, como en el caso de Clostridium difcile.
Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA)
sta es la prueba serolgica ms difundida de uso corrien-
te. Se conocen muchas variaciones de la metodologa, pero
todas implican la jacin del antgeno a una fase slida,
la cual es casi siempre una placa o gota de poliestireno o
polivinilo. Se agrega el suero del paciente y despus de
una extensin apropiada de tiempo para permitir al anti-
cuerpo unirse al antgeno sobre la fase slida, se eliminan
mediante lavado el material ligado de forma inespecca y
el exceso de suero. Entonces se agrega una inmunoglobuli-
na antihumana marcada por la conjugacin con una enzi-
ma (conjugado). El conjugado se une al anticuerpo en el
complejo de antgeno-anticuerpo. El exceso de conjugado
se lava entonces para removerlo y la presencia de la inmu-
noglobulina antihumana marcada ligada se identica por la
adicin de un sustrato conveniente para la enzima marca-
dora. Si han ocurrido las reacciones apropiadas, entonces
el sustrato se convierte en un producto absorbente de luz y
aparece coloreado. En ausencia del anticuerpo, no se pro-
duce ningn color (g. 20-3). La intensidad del color se re-
laciona directamente con la cantidad del anticuerpo ligado
al antgeno. El cambio del color puede cuanticarse a sim-
ple vista o lo registra un espectrofotmetro para revelar la
intensidad exacta de la reaccin. Los sistemas de enzima-
sustrato de uso corriente son peroxidasa del rbano (HRP),
O-fenilendiamina (OPD) y fosfatasa alcalina y fosfatasa de
p-nitrofenilo. Para adaptar la prueba a la deteccin del an-
tgeno, la fase slida se cubre con el anticuerpo especco
para el antgeno a detectar. Un segundo anticuerpo marca-
do se aade entonces para detectar cualquier complejo an-
tgeno-anticuerpo en la supercie de la fase slida. Segn
sea la secuencia de reaccin, las pruebas ELISA se dividen
Figura 20-3 Inmunoensayo de enzimas de IgG e
IgM de la varicela zoster.
TCNICAS 201
Figura 20-4 Diferentes formatos de la prueba ELISA.
(a) ELISA indirecta:
1. Fase slida de la capa con el antgeno vrico.
2. Incubar con el suero del paciente. El anticuerpo especco
presente se ja al antgeno unido a la fase slida.
3. Agregar la enzima marcada anti-IgG o anti-IgM.
4. Agregar el sustrato; cambia el color si la reaccin es positiva.
(b) ELISA de captura:
1. Fase slida de la capa con anti-IgG o IgM.
2. Incubar con el suero del paciente. Todas las IgG o IgM
presentes se capturan en la fase slida.
3. Agregar el antgeno; ste une a cualquier anticuerpo espe-
cco capturado.
4. Agregar el antivrico IgG marcado con enzima.
5. Agregar el sustrato; cambia el color si la reaccin es positiva.
(c) ELISA competitiva:
1. Fase slida de la capa con el antgeno.
2. Agregar el suero del paciente y el anticuerpo especco
marcado con enzima. El anticuerpo especco compite con
el conjugado para unirse a la fase slida.
3. Agregar el sustrato. La reaccin positiva se muestra sin color
en (a), ya que el anticuerpo especco bloque al conjugado.
La reaccin negativa se muestra por el color en (b), ya que el
anticuerpo marcado con enzima no se bloque.
en directas, indirectas, de captura o competitivas. La gura
20-4 explica algunas de las diferencias entre estos mto-
dos. Las pruebas son especcas para IgM o IgG, segn
sea que se emplee IgM antihumana o IgG como el segundo
anticuerpo. Para una revisin detallada, vase la obra de
Booth, 1983 (vanse las Lecturas adicionales).
ELISA es una tcnica muy sensible porque una cantidad
pequea de enzima puede procesar una cantidad grande de
sustrato. Los resultados negativos falsos de IgM pueden
ocurrir en presencia de valores altos de IgG especca, que
compiten por el antgeno en la fase slida. Esto puede evi-
tarse si se remueve la IgG antes de la prueba de la muestra.
Las reacciones inespeccas en el ensayo de IgM pueden
tambin ocurrir debido a la presencia del factor reuma-
toide (RF). El RF de la clase de IgM se une a los antgenos
nuevos expuestos debido a los cambios conguracionales
en la regin Fc de la molcula IgG especca cuando sta
se liga al antgeno en la fase slida. El RF de la IgM no
puede distinguirse de la IgM especca del virus, pero el
RF se puede remover por absorcin con el agregado de IgG
antes del examen para la IgM. Se preeren los ensayos de
captura para IgM, ya que no se afectan con el RF o la IgG
especca en el suero del paciente. Las pruebas ELISA tie-
nen la ventaja de ser objetivas, se pueden automatizar con
facilidad y no requieren gran destreza tcnica. Son pruebas
rpidas y la mayor parte de los mtodos se pueden comple-
tar dentro de dos a tres horas. Casi todos los laboratorios
microbiolgicos, si no todos, estn equipados para realizar
ELISA, que son de uso extenso para la investigacin y el
diagnstico serolgico del HIV, hepatitis vrica, rubeola,
citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela
zoster, sarampin, paperas, toxoplasma, Chlamydia tra-
chomatis, etctera.
Inmunouorescencia (IF)
En la IF indirecta para la deteccin del anticuerpo, las c-
lulas infectadas por virus o el antgeno bacteriano se jan
a las celdillas en portaobjetos cubiertos de ten, se aade
el suero del paciente y se detecta la reaccin antgeno-anti-
cuerpo por la adicin de la inmunoglobulina antihuma-
na marcada con el colorante uorescena (isotionato de
uorescena). La reaccin se registra debajo de un mi-
croscopio de luz uorescente y las reacciones positivas se
indican por la uorescencia verde manzana tpica. Se han
utilizado por muchos aos las pruebas de IF indirectas para la
identicacin de los anticuerpos IgM e IgG para los cito-
megalovirus, el virus de Epstein-Barr y el virus de la vari-
cela zoster. Las reacciones positivas falsas secundarias a la
expresin de receptores sobre las clulas infectadas, a las
cuales se puede unir el anticuerpo especco no vrico de
la clase IgM, son un problema. Las pruebas de IF tambin
requieren equipo especializado, como un microscopio de
uorescencia, y estn sujetas al criterio del operador en la
lectura. Por lo tanto, las han sustituido las pruebas ELISA
para la deteccin del anticuerpo. Por otra parte, la disponi-
bilidad de los anticuerpos monoclonales de buena calidad
para una variedad de antgenos vricos ha convertido a la
IF directa en el mtodo ideal para la deteccin del antge-
no en varios tejidos y muestras. El material infectado se
ja encima de un portaobjetos con la ayuda de acetona o
alcohol y se tie con el anticuerpo monoclonal marcado
con uorescena dirigido contra el antgeno bajo prueba.
La IF directa se utiliza extensamente para el diagnstico
rpido de virus respiratorios por el examen de las clulas
epiteliales de aspirados nasofarngeos para el virus sinci-
tial respiratorio, los virus A y B de la inuenza, los virus
1, 2 y 3 de la parainuenza y los adenovirus.
Radioinmunoensayos (RIA)
stos se basan en los mismos principios que los mtodos
ELISA. Las pruebas de RIA usan un radioistopo marcado
en vez de una enzima marcada. Debido a la corta vida til
del radiomarcador y los requisitos especiales para eliminar
la radiactividad, las tcnicas ELISA los han reemplazado.
Western blot (WB) o inmunoensayo en lnea (LIA)
Representan una herramienta muy especca y sensible
para detectar y caracterizar a los anticuerpos contra micro-
organismos en virtud de su enlace a los antgenos jados
a las membranas de nitrocelulosa. Para la prueba WB se
separan las protenas vricas o bacterianas semipuricadas
por electroforesis en un gel de poliacrilamida y despus
se transeren de modo electrofortico a una membrana de
nitrocelulosa. En el inmunoensayo en lnea los antgenos
vricos, producidos por tcnicas moleculares recombinan-
tes o sintetizados de manera articial (pptidos sintticos),
se unen directamente a la membrana de nitrocelulosa.
La membrana de nitrocelulosa se incuba con el suero del
paciente para permitir al anticuerpo unirse a los antgenos
jados en la membrana. Se agrega la inmunoglobulina
antihumana con enzima marcada con base en un princi-
pio similar al de la prueba ELISA. Se siguen los pasos de
lavado apropiados. En la adicin del sustrato pueden ser
visibles las bandas del antgeno para las cuales el anticuer-
po especco est presente.
La tcnica es nica en el sentido de que puede identi-
carse el anticuerpo contra las protenas vricas o bacte-
rianas simples o los epitopos antignicos, lo que torna a la
prueba muy especca. Se utilizan en extenso como prue-
bas de conrmacin para el HIV y el virus de la hepatitis C
y para el diagnstico de la enfermedad de Lyme.
Pruebas de avidez del anticuerpo
Las tcnicas para medir la avidez del anticuerpo IgG se han
desarrollado para ayudar a la cronologa de la infeccin por
serologa. El anticuerpo de avidez baja se produce de for-
ma inicial despus de la infeccin primaria, mientras que el
anticuerpo de avidez alta lo hace despus de la reinfeccin
o la recrudescencia. Las pruebas de avidez del anticuerpo
se basan en el principio de que los complejos antgeno-
anticuerpo de avidez alta requieren ms energa para la di-
sociacin o prevencin de la formacin del complejo. En la
celdilla de prueba, el anticuerpo de avidez baja se remueve
por lavado con 8 M de urea (disociacin) o los enlaces se
previenen desde la formacin con el uso del agente des-
naturalizante de la protena clorhidrato de guanidina en el
lquido diluyente del suero. Las celdillas control se tratan
con lavado normal y lquido diluyente. Los anticuerpos en
forma de complejos de la fase slida se detectan enton-
ces en las celdillas de prueba y control. Si un anticuerpo
muestra avidez alta, no hay diferencia signicativa entre
la lectura de la celdilla de prueba y la de control dado que
estos complejos no se disocian ni se previenen con facili-
dad desde que se forman. Los ensayos de avidez han sido
inestimables en la atencin de la rubeola e infecciones por
Toxoplasma en el embarazo y han contribuido a establecer
la cronologa de la infeccin.
Serologa en muestras no sricas
Las pruebas ELISA de captura de IgG e IgM se han adap-
tado para el examen de muestras de orina y saliva. Puesto
que stas son muestras no invasivas, se preeren para los
nios y otros grupos, como los consumidores de drogas
intravenosas, en los que es difcil obtener muestras de san-
gre. El diagnstico serolgico por el examen de la saliva
est disponible ahora para el sarampin, paperas y rubeola.
La serovigilancia a gran escala de la infeccin del HIV se
efecta mediante revisin de orina y saliva.
Interpretacin y uso de las pruebas
serolgicas
La capacidad con los mtodos ELISA semiautomatizados o
automatizados generaliz su disponibilidad para un nmero
extenso de laboratorios. Las pruebas ms antiguas eran di-
fciles desde el punto de vista tcnico y las practicaban slo
algunos laboratorios especializados. Las notorias mejoras
tecnolgicas del mtodo ELISA, junto con el conocimien-
to de la importancia de las infecciones vricas en muchos
grupos vulnerables de pacientes, convirti a la serologa en
un pilar fundamental del diagnstico del virus.
INTERPRETACIN Y USO DE LAS PRUEBAS SEROLGICAS 203
En la actualidad, la serologa se establece para el diag-
nstico de las infecciones, en especial enfermedades vri-
cas. La tecnologa ms reciente signica que muchas de
las pruebas diagnsticas comunes se pueden realizar por
medio de microbiologa general o por otros laboratorios no
especializados.
Diagnstico de las infecciones agudas
Los estudios serolgicos contribuyen en grado notorio al
diagnstico de las enfermedades infecciosas. De manera ha-
bitual, una conrmacin serolgica requiere el examen de
una muestra de suero tomada inmediatamente despus del
inicio de la enfermedad (aguda) y una segunda muestra de
una a dos semanas despus (convaleciente). Un incremen-
to del cudruple del anticuerpo o de la seroconversin del
estado negativo al estado positivo del anticuerpo entre las
muestras aguda y convaleciente indica infeccin aguda. Sin
embargo, las nuevas tecnologas para la deteccin espec-
ca de IgM e IgG permiten al laboratorio precisar un diag-
nstico o descartar una infeccin sospechada en una sola
muestra de suero. Para ello, las tcnicas ELISA se emplean
de forma amplia en los laboratorios de microbiologa. Si no
se reconocen IgM o IgG, entonces el paciente no estuvo ex-
puesto al microorganismo o la muestra se recogi demasia-
do pronto. Como el anticuerpo IgM para la mayor parte de
los virus se puede identicar dentro de una semana tras el
inicio de los sntomas, una muestra tomada en ese tiempo,
si es negativa para IgM vrica, es suciente para descartar
una infeccin reciente o actual. La IgM especca se pue-
de detectar slo por tres meses, pero algunas pruebas ms
sensibles pueden reconocer IgM ms all de los 12 meses.
Como la IgG est slo presente ms adelante, una reaccin
positiva de la IgM, con o sin la presencia de IgG especca,
indica una infeccin reciente. La IgG especca permanece
positiva por toda la vida y por tanto la presencia exclusiva
de IgG con IgM negativa indica una infeccin pasada y en
casi todos los casos inmunidad a la infeccin futura contra
ese agente patgeno especco. Est claro que la seleccin
de la prueba y la interpretacin del resultado dependen de
la afeccin clnica y la fecha de inicio de los sntomas, que
deben por tanto comunicarse siempre al laboratorio.
Deteccin del anticuerpo para vericar la inmunidad
La vericacin de la inmunidad a las infecciones se requie-
re en muchas situaciones clnicas, como el periodo pos-
terior a la vacunacin, solicitudes de empleo, embarazo,
condiciones anteriores al trasplante o pacientes inmunosu-
primidos que pueden entrar en contacto con infecciones.
Las pruebas para reconocer al anticuerpo protector tienen
que ser sensibles y requieren el examen para IgG especca.
Se utilizan las pruebas vricas ELISA de IgG especca, IFA
o anticuerpo total, como la prueba de aglutinacin de ltex.
Las encuestas seroepidemiolgicas posteriores a la va-
cunacin para determinar seroconversin e inmunidad des-
pus de la vacunacin para sarampin, paperas, rubeola y
hepatitis B han formado una parte vital de la evaluacin
de la ecacia de los programas de vacunacin. Los mto-
dos ELISA automatizados y sensibles han hecho factible
el examen masivo de la etapa posterior a la vacunacin.
El anticuerpo para la hepatitis B se expresa en unidades
internacionales y esta capacidad de cuanticar permite al
clnico decidir sobre la cronologa de las revacunaciones
consecutivas.
La inmunidad para la rubeola y la hepatitis B es un re-
quisito de empleo para muchos trabajadores de la atencin
sanitaria. La inmunidad a otras infecciones, como el vi-
rus de la varicela zoster, sarampin y paperas, es tambin
deseable, sobre todo para aquellos que trabajan con nios
o pacientes inmunocomprometidos, sea para protegerse o
para prevenir la propagacin de la infeccin a los pacientes
susceptibles. Quienes son susceptibles a la infeccin por
varicela zoster y los que se exponen a la varicela se deben
excluir del trabajo, para no exponer a los pacientes suscep-
tibles a la infeccin.
Durante el embarazo, el examen para identicar el an-
ticuerpo protector contra la rubeola se ofrece a todas las
personas y se vacuna a las mujeres susceptibles despus del
parto. Se recomienda examinar a todas las pacientes para el
virus de la hepatitis B y se suministra inmunizacin de la
hepatitis B a los recin nacidos de madres infectadas para
prevenir la transmisin vertical de la infeccin. El examen
del HIV para las madres en riesgo permite el tratamien-
to con el medicamento especco de la madre durante el
embarazo y el parto para reducir el riesgo de la transmi-
sin vertical del HIV. El examen del anticuerpo para otros
microorganismos, como varicela zoster, toxoplasma y cito-
megalovirus, permite al clnico aconsejar a pacientes sus-
ceptibles acerca de la forma de evitar la infeccin. Todos
estos controles requieren una prueba simple de aglutinacin
de ltex o ELISA de IgG. Sin embargo, en caso de contacto
reciente con una infeccin, los mtodos de IgM tienen que
realizarse adems de asegurarse que la IgG detectada es de
una infeccin pasada y no de una actual.
Pacientes sometidos a trasplante e inmunosuprimidos
Estos individuos son en particular propensos a desarrollar
infecciones por citomegalovirus (CMV). Los pacientes po-
sitivos al anticuerpo CMV que reciben un rgano de un
donante positivo al CMV requieren prolaxis para prevenir
el desarrollo de la infeccin por CMV primaria. Adems,
la infeccin por toxoplasma adquirida del donante es un
problema grave en el receptor del trasplante del corazn,
as que todos los donantes y receptores se examinan en re-
lacin con el anticuerpo contra el toxoplasma y se aplica
prolaxis en los receptores negativos de un corazn de do-
nantes positivos para anticuerpos contra el toxoplasma. Los
pacientes inmunosuprimidos tambin se examinan para las
infecciones comunes, como varicela, herpes simple y sa-
rampin, puesto que ellos pueden sufrir enfermedad grave
si se exponen a ellas.
Examen para la donacin de sangre, rganos y tejidos
Muchos microorganismos, en especial virus transporta-
dos en la sangre, se pueden transmitir por va sangunea y
productos de la sangre, trasplante de rganos y tejidos. Es
esencial que la sangre se examine antes de la transfusin.
En el Reino Unido toda la sangre se examina para HIV,
hepatitis B, hepatitis C y slis. En el caso del HIV y el
virus de la hepatitis C, la presencia del anticuerpo signi-
ca infeccin actual y el examen para el antgeno vrico es
innecesario. La sangre destinada para pacientes inmunosu-
primidos tambin se examina para CMV. Debido a la im-
portancia de desechar la sangre infectada, slo se emplean
las pruebas ms sensibles. Las donaciones que se encon-
traron positivas se someten a pruebas conrmatorias por
los laboratorios de referencia especializados. Para hacer
frente al volumen de exmenes requeridos, los laborato-
rios de transfusin de sangre tienen sistemas ELISA au-
tomatizados para el examen microbiolgico de la sangre.
Los donantes de rganos y tejidos se someten a procedi-
mientos de revisin similares.
Diagnstico de infeccin congnita
Como la IgG materna cruza la placenta y llega al feto, la
presencia de IgG con especicidad vrica en la sangre neo-
natal no indica en todos los casos infeccin. La persistencia
del anticuerpo IgG ms all de los seis meses de edad se-
ala infeccin congnita, dado que el anticuerpo derivado
de la madre desaparece para entonces. La presencia de IgM
especca en o poco despus del nacimiento supone infec-
cin congnita o vertical, ya que la clase IgM del anticuer-
po no cruza la placenta.
Futuro de la serologa
Aunque muchas infecciones se pueden diagnosticar con
rapidez por la deteccin de IgM especca del virus por
las tcnicas descritas en este captulo, para otras como las
infecciones respiratorias del virus slo es posible un diag-
nstico retrospectivo porque se requiere una muestra de
suero convaleciente para el examen por CFT. Es posible
que muchos pacientes inmunosuprimidos no activen una
buena respuesta del anticuerpo y por tanto la ausencia de
una reaccin de IgM especca para el virus no descarta
siempre la infeccin en este grupo de personas.
Los avances en las tcnicas de amplicacin del cido
nucleico, en especial en la reaccin en cadena de la poli-
merasa (PCR) en tiempo real con tecnologa automatizada,
han permitido a los laboratorios ofrecer PCR para el diag-
nstico comn de las infecciones vricas. Los mtodos ba-
sados en la PCR son rpidos: la PCR en tiempo real puede
demorar dos a tres horas. Muchos laboratorios se inclinan
ahora por realizar las tcnicas de PCR para diagnosticar
la infeccin. En virtud de la deteccin vrica de RNA o
DNA, se puede reconocer la infeccin mucho antes que se
establezca una reaccin del anticuerpo (segn lo establecen
los mtodos serolgicos). Esto puede ser de utilidad, sobre
todo en pacientes inmunosuprimidos.
Sin embargo, las pruebas serolgicas de IgM se emplean
todava para diagnosticar infecciones recientes en quienes
no las maniestan de inmediato, ya que la IgM se puede
detectar ms all de tres meses tras la infeccin y algunas
veces mucho tiempo ms. Los procesos serolgicos tam-
bin tienen un papel crucial para establecer evidencia de
inmunidad a la infeccin, como resultado de una infeccin
pasada o consecutiva a la vacunacin. Son tambin una
herramienta epidemiolgica importante en los estudios de
serovigilancia, que establecen la prevalencia de la infeccin.
En el futuro, aunque las tcnicas de amplicacin de
cidos nucleicos rpidas y sensibles (como la PCR) pue-
den reemplazar a la serologa para diagnosticar la infeccin
actual por muchos virus, la serologa no dejar de desempe-
ar un papel importante en el acompaamiento de la PCR
para el diagnstico de una infeccin reciente. Lo que es ms
importante, ser an el pilar fundamental en la medicina
preventiva al establecer la evidencia de inmunidad posterior
a la vacunacin, identicar a los individuos susceptibles a
la infeccin para protegerlos y estudiar la epidemiologa
de las infecciones vricas.
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FUTURO DE LA SEROLOGA 205
Introduccin
Durante los ltimos 50 aos la comprobacin diagnstica
en laboratorios clnicos se ha desarrollado a partir de la ope-
racin manual de pruebas como el examen de los frotis de
sangre y los mtodos qumicos simples mediante tcnicas
que requieren cantidades relativamente grandes de sangre,
suero o plasma. En el decenio de 1960 se desarroll el ana-
lizador multicanal para la qumica clnica y se introdujeron
mtodos de conteo electrnico, como el contador de Coul-
ter. El desarrollo continuo de estas comprobaciones auto-
matizadas comenz a concentrarse en mejoras de la calidad
y la consistencia de los resultados y en reducir los tiem-
pos requeridos para las pruebas y el volumen de la muestra
exigido para cada una. Aunque los sistemas automatizados
complejos son ya una prctica comn en otras reas de la
patologa desde los ltimos 20 aos, la microbiologa y en
particular los laboratorios de virologa han utilizado mto-
dos de comprobacin tradicionales. Para la virologa, s-
tos se basaron en el cultivo celular y el aislamiento vrico
con las pruebas del anticuerpo mediante reactivos produ-
cidos en buena medida en casa. Los inmunoensayos
enzimticos (IEE) aparecieron en la dcada de 1970 y sus
desarrollos comerciales posibilitaron la transicin hacia
la automatizacin. El impulso se origin tras el desarrollo
de estos equipos a solicitud del Blood Transfusion Service
(ahora National Blood Authority) para examinar las dona-
ciones de sangre para una gama limitada pero en aumento
constante de infecciones vricas transmitidas por la sangre.
Primero se emple el antgeno HBs en el decenio de 1970,
despus sigui el anti-HIV en 1984, el anti-CMV selectivo
en 1980 y el anti-HCV en 1991. La gran expansin de la
gama de IEE comerciales en el decenio de 1980 ampli el
uso de protocolos estndar e impuls la fabricacin de sis-
temas automatizados. Slo hasta comienzos de la dcada de
1990 se desarroll un equipo ideado de modo especco para
el laboratorio de virologa diagnstica. En la actualidad se
halla en el repertorio de estas mquinas automatizadas una
amplia variedad de pruebas diagnsticas. En trminos gene-
rales, los mtodos disponibles se basan en la tcnica de IEE.
Los primeros sistemas se desarrollaron para las pruebas de
examen solicitadas con ms frecuencia, es decir, antgeno
de HBs, anti-HBs, IgG de la rubeola y antgeno de Chla-
mydia trachomatis. Despus de la dicultad inicial para co-
mercializar los equipos automatizados en los primeros aos
del decenio de 1990, el mercado adquiri estabilidad en la
poca actual. Ahora se han identicado diferentes clases de
mquinas y el tipo de carga de trabajo ms apropiado para
cada clase de instrumento. Las deniciones bsicas del tipo
de automatizacin se discuten a continuacin.
Procesador de lquidos (PL)
Un PL completa la preparacin de una microplaca que con-
tiene muestras diluidas de forma apropiada y controles espe-
ccos de la prueba mediante una hoja de trabajo para identi-
car las muestras y los protocolos especcos para la prueba
requerida; asimismo, completa la separacin del suero a par-
tir de un cogulo de sangre y de ese modo prepara un alma-
cn de suero a partir de las muestras de sangre recibidas.
Procesador automatizado de IEE
Un procesador automatizado de IEE completa un IEE
con tan slo el suministro de las muestras y los reactivos
21
Pruebas automatizadas en virologa
Roger P Eglin
208 CAP. 21 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGA
especcos para esa prueba; adems, termina un IEE con
la simple adicin de una microplaca que contiene muestras
correctamente diluidas y los reactivos especcos para esa
prueba. En consecuencia, el equipo puede subdividirse en
las siguientes clases:
Acceso aleatorio/comprobacin por lote. Por lo general,
los procesadores de IEE se disean para pruebas espec-
cas sobre muestras que se acumulan como un lote y se
identican con una hoja de trabajo especca. Algunos
procesadores son tambin capaces de analizar pruebas de
muestras nicas para satisfacer la respuesta a la demanda
clnica urgente. Estas pruebas nicas requieren calibrado-
res de control para la prueba, adems de la muestra para
la prueba. Es posible interrumpir la prueba para procesar
una muestra urgente o puede introducirse en un momento
conveniente entre los lotes de otras pruebas. Estas mqui-
nas de acceso aleatorio requieren mdulos de la prueba
especcos del fabricante o el uso de controles permanen-
tes sobre el tablero para operar la prueba.
Cuadro 21-1 Qu equipo automatizado es ms apropiado?
Tipo de mquina Ventajas Desventajas
Acceso aleatorio: pruebas Comprobacin rpida de muestras nicas El rendimiento diario puede ser pequeo, p. ej., 300/da
especcas del fabricante Requiere un grupo completo de muestras El rendimiento del laboratorio total en un da de
control una vez/mes trabajo normal puede ser >400 muestras
No requiere grupo completo de control Recargo pagado para el mismo proveedor comercial
para cada prueba, usa calibradores nico de los mdulos y el equipo de prueba
Gama amplia de pruebas disponibles Pueden estar disponibles mrgenes limitados de
que cubren varias disciplinas pruebas para enfermedades infecciosas
Compartir costos con otros usuarios de la Si se usa como una instalacin de laboratorio central,
mquina (bioqumica, inmunologa) pueden interrumpirse en realidad las pruebas actuales?
Comprobacin por lote: Tambin puede incluir la omisin de la Deben ser pruebas especcas del fabricante, p. ej.,
sistema basado en dos o muestra AXSYM (quimioluminiscencia). Est disponible
tres microplacas Pueda ser capaz de procesar cualquier una gama completa de pruebas para enfermedades
sistema basado en microplacas infecciosas?
Puede procesar slo tres lotes en un da normal de
trabajo
Puede requerirse la planicacin cuidadosa del
procesamiento de la prueba
Sistema basado en Usa cualquier prueba de placa de Puede ser necesario separar la muestra que dispensa
microplacas de acceso microtitulacin basado en IEE el equipo
abierto Puede aceptar la placa de la prxima
prueba en cualquier momento
Sistema que no requiere Permite la manipulacin de pruebas no Los costos pueden incrementarse
muestra marcadas o vinculadas
Puede usarse para otros propsitos, como
alcuotas de la muestra para almacenar
suero en recipientes/microplacas, CFT,
SRH
Formato con tubo nico/formato con microplaca. Al-
gunos procesadores llevan a cabo un muestreo directo
del tubo y realizan todas las operaciones subsecuentes
como pruebas nicas del tubo, por ejemplo los equipos
VIDAS, E7001. Otros procesadores aceptan muestras
nicas del tubo, pero preparan la prueba con micropla-
cas. Este formato de la placa puede ser especco del
fabricante o aceptar cualquier microplaca basada en IEE
de uso estndar.
Sistema de prueba especco del fabricante/mtodo de
microplaca estndar. El sistema de procesamiento del
fabricante es nico y el uso del procesador impone la
necesidad de utilizar los equipos del fabricante, por
ejemplo VIDAS, AXSYM, PRISM. Se han diseado
otros procesadores para analizar cualquier IEE basado
en microplaca y la eleccin depende del laboratorio y de
las caractersticas de ejecucin de la prueba. En el cua-
dro 21-1 se proporcionan algunos ejemplos del equipo
actual disponibles de cada clase.
AUTOMATIZACIN EN EL LABORATORIO DE DIAGNSTICO 209
Automatizacin en el laboratorio
de diagnstico
Para discutir este asunto es necesario considerar las si-
guientes presuposiciones: en primer lugar, el laboratorio
utiliza un programa de diagnstico para procesar la base
de datos de los pacientes; en segundo lugar, se identican
mediante un sistema de cdigo de barras las etiquetas que
se aplican a la solicitud, el tubo de sangre primario y la
muestra de suero archivada, y en tercer lugar, el laboratorio
emplea un sistema automatizado que comprende un PL y
un procesador de IEE basado en microplaca.
Luego de la recepcin de la muestra y el formato de
solicitud en el laboratorio, muchas veces las primeras dos
etapas del procesamiento ocurren de forma simultnea.
Hojas de trabajo
Se ordena una serie de pruebas en conformidad con los de-
talles clnicos y la fecha de inicio anotados en el formato de
solicitud. Este grupo de pruebas se almacena en la compu-
tadora y ello conduce a la creacin de hojas de trabajo es-
peccas de la prueba, las cuales pueden cancelarse cuando
sea necesario de acuerdo con la hoja de planicacin diaria
del sistema automatizado.
Separacin del suero
Despus de centrifugar el tubo primario con la sangre, para
centrifugar el cogulo de sangre, el suero se separa por PL
o de forma manual en un tubo de almacenamiento, que se
etiqueta con la misma identicacin de cdigo de barras
que el tubo primario con la sangre.
Preparacin de las microplacas para el ensayo
Si un sistema de acceso aleatorio se halla en uso, entonces
el recipiente del almacenamiento con el suero se carga di-
rectamente en el sistema con las diluciones requeridas que
efecta la mquina. El PL debe ser capaz de identicar los
tubos con la muestra o los tubos primarios con sangre en
estantes o carruseles. Verica que todas las muestras en la
hoja de trabajo actual estn presentes y luego lleva a cabo
las diluciones apropiadas del suero en las celdillas, segn el
protocolo especco. La placa se identica con un cdigo
de barras para permitir la identicacin positiva y la selec-
cin del protocolo correcto por el programa. Esto permite
a la computadora ordenar los reactivos apropiados para el
IEE especco. Debe tambin agregar los estndares apro-
piados, los suministrados por los fabricantes y el laboratorio
en las muestras internas, y las muestras de calibracin cuan-
do sea necesario para permitir el control de calidad (QC) de
la prctica de la prueba. Estas muestras de QC se distribu-
yen en las celdillas designadas en el protocolo. El sistema
indica si en una muestra no se recolect el lquido.
Procesador IEE
La placa se identica con un cdigo de barras y el programa
reconoce la hoja de trabajo y el protocolo correctos corres-
pondientes a esa prctica especca de la prueba. La mqui-
na revisa la colocacin exacta de los reactivos solicitados
para el IEE en el sistema y se verican los volmenes de
estos reactivos con base en el peso. La comprobacin inclu-
ye la solucin amortiguadora de lavado y los reactivos de
la prueba y verica que el volumen del recipiente de dese-
chos es suciente. El primer paso, que es parte del control
de calidad que vigila el sistema, consiste en tomar una lec-
tura espectrofotomtrica de la placa para comprobar que se
agreg una muestra a cada una de las celdillas previstas. Una
lectura discrepante de la densidad ptica (DO) identica el
punto donde no hay muestra. El procesador activa al IEE y
a continuacin el protocolo se almacena en el programa. Si
un sistema de acceso abierto se halla en funcin, el proce-
sador recalcula los espacios de tiempo para los anlisis en
proceso y el ajuste en la nueva placa para procesar cuanto
antes. El tiempo de inicio aparece junto con una advertencia,
si el retraso antes del anlisis excede el lapso predenido por
el sistema. Por lo general se evitan los IEE que utilizan incu-
baciones a temperatura ambiente porque, aunque los periodos
de la incubacin suelen ser ms largos que los de las incu-
baciones a 37C, las primeras reacciones de la incubacin
comienzan inmediatamente despus que la muestra diluida
se distribuye en las celdillas. Las incubaciones a 37 o 40C
permiten un tiempo de inicio determinado, lo cual es necesa-
rio para las mquinas de acceso abierto. El protocolo del IEE
debe incluir la vigilancia despus de cada paso que requiera
la adicin de reactivos lquidos y tambin la revisin de las
cabezas de lavado despus de cada operacin para constatar
que todas las celdillas se lavaron de modo apropiado. Debe
mostrar la lectura a partir de la vigilancia de cada adicin
lquida cuando el IEE contina y cualquier error detectado
se seala de inmediato. Si una mquina de acceso abierto se
encuentra en uso, cada serie de reactivos de la prueba debe
aadirse cuando lo requiera el procesador.
Procesamiento de los datos
Las lecturas nales de la DO, tomadas al trmino del ensa-
yo, se envan de forma automtica al programa del sistema
para el procesamiento que realiza el paquete de reduccin
de datos. Este paquete requiere, segn sea el tipo de prueba,
calcular el valor de intercepcin a partir de los controles
y aplicarlo a los valores de la DO de la muestra; en este
caso, los resultados se expresan como positivos, negativos
o ambiguos para cada muestra; asimismo, debe generar una
curva estndar a partir de los controles y aplicarla a las lec-
turas de la muestra; esta vez los resultados para las muestras
se expresan como unidades/ml.
El programa tambin constata que los calibradores y los
estndares del fabricante incluidos en el examen se hallen
en los lmites permitidos y que no hay indicadores de cual-
quier discrepancia. Si los calibradores tienen valores acep-
tables, los valores estndar almacenados se aplican a la
DO de las muestras para el examen de la prueba. Despus
de la validacin de los resultados que presenta el tcnico
experimentado, stos se transeren de manera automtica
a la hoja de trabajo. sta se puede imprimir para almacenar
la copia dura, que contiene toda la informacin necesaria
para rastrear los detalles de la prueba si se descubre ms
adelante cualquier problema. Estos pormenores incluyen la
placa del anlisis y los reactivos relacionados, tipo, nmero
de lote, fecha de caducidad de la placa y reactivos, fecha de
la prueba, solicitante de la hoja de trabajo, operador del
mtodo y vericador de los resultados. A partir de la hoja
de trabajo, los resultados se transeren por medios electr-
nicos a los registros individuales de los pacientes en la base
de datos del laboratorio.
El programa tambin verica el control de calidad in-
terno exigido (sistema de control del proceso) en la prueba
mediante lo siguiente: a) anotacin de los 20 promedios
registrados para las muestras de control y marcacin de
cualquier resultado discrepante y b) proyeccin de las gr-
cas de Shewhart (Costongs et al., 1995) con los nuevos
resultados del control. A continuacin se aplican las reglas
de Westgard seleccionadas para vericar que la prueba es
vlida y puede proporcionarse. Cualquier resultado fuera
de los lmites de estos criterios activa a los indicadores para
realizar una accin inmediata.
En la evaluacin microbiolgica realizada en los laborato-
rios de comprobacin de los NBS Centres puede revisarse un
modelo en el cual este procesamiento automatizado y el con-
trol de proceso alcanzan un valor muy alto de aseguramien-
to de la calidad. Estos 10 centros procesan un total aproximado
de 10 000 donaciones por da en la evaluacin automatizada
para HBsAg, anti-HCV y anti-HIV. Todos los reactivos de
la prueba deben vigilar la adicin de la muestra, con una re-
visin positiva en cada adicin del reactivo como ideal. El
ndice de error del proceso es menor de 0.1%. Los resultados
de la determinacin se emiten directamente en el sistema IT
nacional alrededor de las 2 pm un da despus de la coleccin,
para la publicacin de los componentes producidos de la do-
nacin de sangre. Estos laboratorios se ajustan a la General
Manufacturing Practice y se revisan con regularidad.
Debe automatizarse el laboratorio?
Las consideraciones anteriores describen la operacin de un
sistema automatizado dentro del laboratorio. Antes de ello
debe tomarse la decisin de adoptar un sistema automati-
zado para la prueba de IEE. El trabajo preparatorio para al-
canzar esta decisin es considerable e incluye varios pasos
analticos. Tambin supone cambios relevantes en los patro-
nes de trabajo del laboratorio y el personal debe intervenir
en el desarrollo de este proyecto para adquirir nuevas for-
mas de trabajo. La prxima seccin describe algunos de los
factores importantes que deben tomarse en cuenta durante
este proceso de revisin.
Anlisis del laboratorio actual
Esto incluye pormenorizar la gama de virus, tipos y can-
tidad de pruebas que realiza el laboratorio y revisar los
tiempos de respuesta reales de los resultados requeridos
por la suscripcin de un contratado. Hay lugar para que la
adopcin del sistema satisfaga las demandas clnicas con
resultados ms oportunos?, la comprobacin por acceso
aleatorio es una opcin realista para una pequea canti-
dad de cualquier prueba que se realiza por lote para una o
dos pruebas a la semana? Si se identican los volmenes
grandes de algunos anlisis de evaluacin, se basan estas
pruebas en IEE y, si no es as, puede ajustarse la prueba
con xito a IEE sin prdida de la calidad y quizs con me-
S NO
NO S
Cmo puede hacerse?
Comprobacin antgeno/anticuerpo
Es posible adoptar las pruebas IEE?
Sistema basado en IEE
AUTOMATIZAR
Figura 21-1 Diagrama de ujo de la automatizacin.
jor sensibilidad y especicidad (g. 21-1)? Debe decidirse
cmo tratar por lotes las pruebas de evaluacin regulares
para una o dos pruebas al da (unas 30 pruebas es habitual-
mente el nmero mnimo por lote por razones econmi-
cas); se necesita un procesamiento diario?, se trata de un
servicio que proporciona el resultado el mismo da? Hay
que denir tambin los requerimientos para una compro-
bacin externa urgente o en la guardia y calcular cuntas
pruebas pueden incluirse en un procesamiento normal sin
que se retrase demasiado el resultado (g. 21-2).
Qu tipo de equipo elegir?
Un laboratorio primario (laboratorio general del hospital
del distrito) que emprende una determinacin regular de una
cantidad relativamente pequea de muestras puede elegir
una mquina especializada pequea; hacer uso del anali-
zador grande del departamento de patologa para atender
todo el espectro de pruebas infecciosas, y asegurar el costo
del equipo al procesar una prueba de diagnstico de la
mquina a usarse por acceso al azar, como los anlisis de
antibiticos.
Un laboratorio secundario (laboratorio de enseanza
hospitalaria, laboratorio grande de referencia) emprende una
amplia serie de pruebas sobre una gran cantidad de mues-
tras: se requiere un rendimiento considerable de muestras
cada da y proporciona una amplia gama de pruebas; con-
sidera procesamientos por lote, decide cuntas pruebas por
da se necesitan (la mayor parte de los IEE se termina en un
plazo de tres horas). Esto permite dos procesamientos en el
da laborable normal y uno durante la noche. Para un sistema
de tres placas esto equivale a nueve placas/da. Los siste-
mas de acceso abierto completan ocho placas de la prueba
cada cinco horas.
La opcin nal del equipo requiere la comparacin de-
tallada de su funcionamiento, la mecnica, los sistemas de
calidad y del programa, y rebasa los alcances de este ca-
ptulo.
Cuestiones de calidad
La transferencia a un sistema automatizado representa va-
rias ventajas para el laboratorio. El sistema elimina subjeti-
vidad en todos los aspectos de los procedimientos usados.
Los procesamientos se concluyen en trminos de reprodu-
cibilidad y se contina el protocolo del mismo modo en
cada ocasin. Las variaciones de los protocolos ocurren
slo cuando el encargado del sistema modica el protoco-
lo. Esta estandarizacin mejora la reproducibilidad de los
mtodos, a juzgar por los CV de los estndares (Westgard
et al., 1981). El sistema automatizado asegura la identidad
positiva de la muestra a lo largo de la prueba y permite que
el laboratorio se adecue a los estndares ya exigidos de los
laboratorios NBS. Esta seguridad de la identidad reside en
la codicacin con barras de todas las muestras y las placas
IEE a lo largo del sistema. La vigilancia de las adiciones
lquidas y las fases de lavado conrma que todos los pa-
sos del protocolo se realizaron con xito. Esto permite la
identicacin del punto crtico en el sistema en caso de
que un procesamiento de la prueba no logre la validacin
por control de calidad. La transferencia automatizada de la
hoja de trabajo del programa de diagnstico de laboratorio
al programa del sistema automatizado y el retorno de los
resultados validados directamente a la base de datos del
paciente elimina los errores de transcripcin de raz. Los
tiempos de regreso para la comprobacin tal vez se reducen
con los resultados producidos en un periodo que es efectivo
para la atencin del paciente.
Consideraciones nancieras
Las prcticas de trabajo adoptadas en fecha reciente permi-
ten que los miembros del personal procesen cantidades cre-
cientes de pruebas. Esto conduce a la generacin de mayor
ingreso o al desahogo de la carga de trabajo original con
DEBE AUTOMATIZARSE EL LABORATORIO? 211
Usa en la actualidad el equipo para lquidos en otras pruebas o produce alcuotas sricas?
S NO
Cuntas pruebas de IEE o placas se procesan/da?
<9 placas
Usa microplacas
basadas en lote
>9 placas
Usa procesador de acceso
abierto basado en microplacas
<9 placas/<300 pruebas
Usa acceso aleatorio/sistema
por lote con microplacas
>9 placas/<300 pruebas
Usa acceso aleatorio/sistema
abierto con microplacas
Figura 21-2 Qu tipo de equipo elegir?
menos personal; asimismo, si el nmero de clnicos no cam-
bia, entonces se puede efectuar el nuevo trabajo adicional
conducido por los requerimientos del cliente. El aumento
de la cantidad de pruebas distribuye los costos del personal
sobre una gran cantidad de muestras y ayuda a reducir los
costos directos por prueba. A mayor nmero de pruebas ter-
minadas en el sistema automatizado, menores gastos indi-
rectos por prueba por la depreciacin de capital del sistema
y las cargas anuales del mantenimiento. Debe tomarse la
eleccin entre la compra absoluta en lugar del alquiler con
opcin a compra o la renta del reactivo y depende en buena
medida del tipo de equipo requerido y la posicin nanciera
del laboratorio en ese momento. Si se decide usar un siste-
ma especco del fabricante, el recargo que se paga debe
calcularse con base en el costo de los IEE de rutina para la
misma prueba. Si se requiere el equipo de acceso aleatorio,
debe estimarse el nmero previsto de muestras que requiere
este tratamiento urgente y una prueba de determinacin co-
mn real identicada que pueda procesarse en este equipo
para calcular los costos, como en el caso de los antibiticos
en un AXSYM.
Mejorar la competitividad del laboratorio
La adquisicin de un sistema automatizado en el laboratorio
permite la conrmacin del papel del laboratorio dentro del
departamento de patologa. Debe ser posible convertirlo en
la instalacin central para el suministro de la comprobacin
basada en IEE dentro de la patologa y cubrir un amplio es-
pectro de comprobaciones para la virologa, bacteriologa,
inmunologa y bioqumica. Debe conseguirse una mejora
notoria en algunos tiempos de respuesta de los resultados.
El laboratorio puede realizar bien la funcin de encargarse
del trabajo de evaluacin para los nuevos desarrollos de la
prueba y las investigaciones de campo antes de que el pro-
ducto llegue al mercado. El laboratorio almacena grandes
cantidades de muestras para todas las pruebas de rutina y
puede ofrecer la comprobacin reproducible, despus de la
instalacin de los protocolos nanciados por la compaa
comercial.
Otros desarrollos de la automatizacin
Este captulo describe la automatizacin del IEE del anticuer-
po y el antgeno para la cual se dispone en la actualidad de
una opcin amplia de equipo. La prxima rea de comproba-
cin que se automatice ser la del anlisis de la amplicacin
del cido nucleico y, de manera especca, la prueba de la
PCR. Esto ya es posible al usar los sistemas automatizados
que procesan de manera automtica lotes de amplicacio-
nes y las detecciones de la PCR. En el prximo ao o dos
se anticipa que la extraccin de cidos nucleicos a partir de
las muestras relativamente limpias, como suero y plasma, se
automatizar, lo cual supone la creacin de un sistema por
completo automatizado, desde la muestra hasta el resultado.
Conclusiones
La automatizacin es la nica solucin para darle rentabi-
lidad a un laboratorio. Los gastos del laboratorio se abaten
cada vez ms, desde las reducciones de costos esperadas
ao con ao en contratos hasta las demandas cada vez
mayores de ms procesamientos y una gama creciente de
nuevas pruebas. Es esencial desprenderse de la vieja tecno-
loga. Estn disponibles nuevos sistemas y el laboratorio
ha experimentado modicaciones para darle mejor uso a
sus sistemas. Esto exige conseguir la conanza del perso-
nal para llevar a cabo estos cambios. Es necesario ver los
benecios de la implementacin de nuevos sistemas y la
aparicin de reas de trabajo del todo nuevas, como la car-
ga vrica, que se acrecienta de modo continuo a una tasa sin
precedente. Para hacer frente a estos cambios importantes
es esencial invertir en el personal, sea en capacitacin o
aprendizaje de nuevas capacidades.
Costongs GM, van Oers RJ, Leerkes B, Janson PC. Evaluation of
the DPC IMMULITE random access immunoassayanalyser.
Eur J Clin Chem and Clin Biochem 1995; 33, 887-892.
Westgard JO, Hunt MR, Groth T. A multi-Shewhart chart for
quality control in clinical chemistry. Clin Chem 1981; 27(1):
493-501.
Introduccin
Las tcnicas biolgicas moleculares saturan la virologa.
Su aplicacin en el descubrimiento de frmacos antivricos
ha contribuido al diseo racional de los medicamentos y
mejorado de forma radical el ritmo del descubrimiento y la
aplicacin de compuestos antivricos; tales pruebas promo-
vieron el desarrollo de vacunas antivricas y aumentaron la
gama de vacunas disponibles para su aplicacin; adems,
revolucionaron la virologa clnica y no han dejado de ha-
cerlo. La aplicacin de estos procedimientos permiti el
descubrimiento de muchos de los virus patgenos huma-
nos de reciente descripcin (cuadro 22-1) y acort de for-
ma notable el periodo desde el reconocimiento inicial de
un agente causal hasta la caracterizacin completa, el desa-
rrollo de la prueba diagnstica y la produccin de pruebas
serolgicas conables de la infeccin (p. ej., el sndrome
respiratorio agudo grave consecutivo al coronavirus origi-
nado en la provincia de Guandong, Repblica Popular de
China, en noviembre de 2002). No slo los procedimientos
de diagnstico molecular guran entre los principales m-
todos actuales para el diagnstico de la infeccin vrica,
sino tambin tienen un papel cada vez ms importante en el
control cotidiano de la terapia antivrica de los pacientes.
Tcnicas de amplicacin del cido nucleico
Las tcnicas de amplicacin del cido nucleico (TAAN)
son el soporte principal de las tcnicas empleadas en un
laboratorio clnico moderno de virologa. Las tcnicas pue-
den clasicarse como procedimientos de amplicacin del
blanco, la sonda o la seal. En la TAAN del blan-
co el cido nucleico presente en una muestra se amplica
directamente a un grado en el que puede detectarse con
facilidad. En la TAAN de la sonda la accin para vincu-
lar una secuencia especca de la sonda de cido nucleico
conduce a la amplicacin y el reconocimiento subsiguien-
te de la sonda. En la TAAN de la seal la vinculacin
inicial a una molcula blanco genera una seal que por s
misma se amplica a un grado en que la seal puede iden-
ticarse con facilidad. La distincin entre las tcnicas se
anula a menudo porque los procedimientos de amplica-
cin del blanco incluyen con frecuencia un elemento de
la amplicacin de la seal o la sonda, o ambas.
Varios mtodos disponibles en el comercio son tiles
para emplearse bajo estos formatos, basados en principios
diferentes y pasos tcnicos distintos. Sin embargo, los pro-
ductos comerciales estn slo disponibles para una cantidad
limitada de virus patgenos y, en consecuencia, la mayor
parte de los laboratorios clnicos utiliza una combinacin de
pruebas disponibles en el comercio y sus propios mtodos
de prueba internos (es decir, elaborados en los propios la-
boratorios); estos ltimos se basan casi de manera exclusi-
va en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
Amplicacin del blanco
Reaccin en cadena de la polimerasa
Debido a su exibilidad y facilidad de uso, la primera que
se estudia de las TAAN, la PCR, es tambin la tcnica ms
empleada. Este procedimiento implica el uso de dos mo-
lculas sintticas oligonucletidas, cada una de las cuales
hibridiza a una cadena del DNA blanco de doble cadena
22
Tcnicas moleculares en virologa
Paul E Klapper
214 CAP. 22 TCNICAS MOLECULARES EN VIROLOGA
(dsDNA). Estas molculas oligonucletidas se disean de
modo cuidadoso para unirse a una regin blanco especca
dentro del cido nucleico del virus que se amplica y atra-
viesan una regin denida dentro de ese cido nucleico.
La hibridacin del oligonucletido con el DNA acta
como un cebador (iniciador) para una enzima polimerasa
del DNA (casi siempre una enzima termoestable deriva-
da originalmente de la bacteria termla Thermus aqua-
ticus, conocida como polimerasa Taq). La enzima crea
una cadena complementaria de DNA al agregar desoxinu-
cletidos de forma secuencial. Para iniciar este proceso, el
dsDNA blanco se calienta a una temperatura superior a
Cuadro 22-1 Lista representativa de virus patgenos humanos recientes caracterizados mediante tcnicas biolgicas moleculares
Virus Enfermedad relacionada Tcnica de su descubrimiento
Virus de la hepatitis E Hepatitis infecciosa Transcripcin inversa
PCR con cebadores aleatorios +
experimentos de transmisin animal
Virus de la hepatitis C Hepatitis relacionada con la transfusin Transcripcin inversa
PCR con cebadores aleatorios para
producir genotecas del cDNA
Virus sin nombre Sndrome pulmonar por hantavirus Acuerdo general de PCR basado en la secuencia
Virus del herpes humano 8 Sarcoma de Kaposi, enfermedad de Castlemaine Anlisis de diferencia representacional
Virus GBV a-c Hepatitis relacionada con la transfusin Anlisis de diferencia representacional
Virus TTV Hepatitis relacionada con la transfusin Anlisis de diferencia representacional
Virus Nipah Encefalitis y neumona Transcripcin inversa
PCR con cebadores aleatorios
Metaneumovirus Enfermedad respiratoria Transcripcin inversa
Virus SEN Hepatitis relacionada con la transfusin Transcripcin inversa
Sndrome respiratorio agudo Enfermedad respiratoria aguda grave Transcripcin inversa
grave (coronavirus) PCR con cebadores aleatorios
90C. A esta temperatura las cadenas del DNA se separan.
La mezcla de reaccin se enfra entonces a una temperatura
de 50 a 70C y las molculas del cebador de oligonucle-
tido sinttico se unen a cada una de las cadenas del DNA.
La temperatura se eleva un poco, 72 a 76C, la cifra ptima
para que la polimerasa Taq efecte la extensin de la ca-
dena complementaria del DNA. Al repetir el ciclado de la
temperatura unos 30 ciclos o ms repetitivos se producen
millones de copias de la secuencia original del blanco. El
lmite del cambio de la temperatura y magnitud del tiempo
los controla un ciclador trmico programable (g. 22-1).
Al trmino de la amplicacin, la mezcla de reaccin se
Figura 22-1 Termociclador programable. Un termociclador programable tpico, junto con un perl de temperaturas idealizado de un
solo ciclo PCR. D, desnaturalizacin; A, hibridacin de cebadores; E, extensin del DNA. El instrumento programable automatiza esa
extensin, el calentamiento y los ciclos de enfriamiento de la tcnica PCR.
TCNICAS DE AMPLIFICACIN DEL CIDO NUCLEICO 215
analiza para determinar si tuvo lugar la amplicacin es-
pecca. El mtodo convencional consiste en someter a
electroforesis la mezcla de reaccin en geles de agarosa
o poliacrilamida en presencia de bromuro de etidio. Este
ltimo se intercala con la dsDNA y, cuando se expone a la
luz ultravioleta, emite luz uorescente para revelar el cido
nucleico (g. 22-2). Puede utilizarse la tcnica Southern
blotting para conrmar la especicidad del producto de la
reaccin de la prueba. En la prueba Southern blotting un
oligonucletido marcado designado para unirse a la regin
intercebadora del producto de reaccin del cido nucleico
se deja hibridar con el producto separado de forma elec-
trofortica y su vinculacin se revela mediante autorradio-
grafa. Un mtodo de deteccin menos laborioso que la
hibridacin consiste en desnaturalizar el DNA amplicado
y capturar el DNA de una sola cadena sobre una fase slida
(por lo regular una placa de microtitulacin de poliestire-
no) mediante avidina o biotina incorporadas dentro de uno
de los cebadores del oligonucletido. Un oligonucletido
marcado se deja unir al amplicn del DNA capturado y su
nexo se revela en una reaccin que incluye conversin ca-
talizada de manera enzimtica de un sustrato cromgeno.
Con la nalidad de detectar virus RNA es necesaria una
reaccin inicial para producir una copia de DNA (cDNA)
de la plantilla o molde del RNA. Esto se logra con el uso de
la transcripcin inversa, que se realiza mediante la adicin
de una enzima transcriptasa inversa separada o enzimas con
capacidad de transcripcin inversa termoestable y actividad
de polimerasa del DNA.
Es posible una amplia variedad de modicaciones del
procedimiento PCR bsico, incluida la PCR anidada, que
supone el uso de cuatro oligonucletidos del cebador en dos
reacciones separadas. Los productos de una primera ronda
de amplicacin PCR se reamplican en una segunda ron-
da de amplicacin trmica, mediante un segundo grupo de
oligonucletidos del cebador interno para el grupo utiliza-
do en la primera ronda de la amplicacin trmica.
La opcin de la metodologa depende de los requeri-
mientos de sensibilidad y especicidad, adems de las
circunstancias prcticas bajo las cuales debe realizarse la
PCR. Es necesario tener una gran capacidad tcnica, junto
con instalaciones y equipo especializados, para todos los
procedimientos PCR, pero la PCR anidada exige reas es-
pecializadas adicionales debido a la necesidad de separar
fsicamente los procedimientos de la primera y segunda
rondas para prevenir la adherencia del remanente del DNA
amplicado (amplicones) de la amplicacin de la pri-
mera ronda a la de la segunda, lo que arrojara resultados
falsos positivos de la prueba.
Para mejorar la utilidad de la PCR en el marco clnico
del laboratorio de virologa se han desarrollado PCR capa-
ces de detectar cidos nucleicos blanco vricos mltiples.
De manera caracterstica, estas tcnicas PCR multiplex
incorporan varios pares de oligonucletidos cebadores
dentro de una sola reaccin. Es posible la amplicacin de
cualesquiera de los cidos nucleicos blancos, con las mis-
mas condiciones trmicas del ciclo completo y la misma
composicin de la mezcla de reaccin.
La mayor parte de los mtodos PCR en uso actual pro-
porciona slo respuestas cualitativas (s/no). La determi-
nacin de la cantidad de virus presente en una muestra,
llamada cuanticacin vrica o vigilancia de la carga
vrica, es cada vez ms importante en la evaluacin del
efecto de la quimioterapia antivrica y en la vigilancia de
la progresin de la enfermedad. Por ejemplo, la vigilancia
de la sangre de los receptores del trasplante de mdula sea
para el DNA de citomegalovirus (CMV) permite suminis-
trar la terapia anticipada con el frmaco antivrico gan-
ciclovir para prevenir el desarrollo de la enfermedad por
CMV. La terapia antivrica se instituye casi siempre cuan-
do se detecta un aumento notable de los valores sanguneos
del DNA del CMV. La dilucin seriada de una muestra en
paralelo con un estndar que contiene cantidades elevadas
conocidas de cido nucleico vrico puede proporcionar la
cuanticacin cruda, pero est sujeta al error por la am-
plicacin diferenciada de las dos muestras, lo cual su-
ministra comparaciones entre una prueba y otra de difcil
cuanticacin. Una cuanticacin ms exacta se consigue
por la coamplicacin competitiva de un cido nucleico de
control interno de concentracin conocida, junto con el ci-
do nucleico de la muestra de concentracin desconocida; la
Figura 22-2 Electroforesis en gel de poliacrilamida con tin-
cin de bromuro de etidio. Representacin de los productos de
PCR separados sobre geles de poliacrilamida al 8%. El ejemplo
mostrado es de un mtodo para tipicar adenovirus por digestin
con una enzima de restriccin de los productos de PCR. El bro-
muro de etidio se intercala con el DNA de doble cadena y se
revela por la transiluminacin de la luz ultravioleta en el gel. M,
escala del peso molecular usada para calibrar el tamao de los
productos de PCR.
molcula del control interno que se designa amplica con
igual ecacia al blanco de la muestra. El mtodo constituye
la base de los mtodos comerciales ecientes para los virus
de las hepatitis B y C, el virus de inmunodeciencia hu-
mana (HIV) y el citomegalovirus. En el ltimo sistema, un
alto grado de automatizacin del ensayo y la deteccin del
producto reducen de modo adicional la variabilidad entre
las pruebas (g. 22-3).
PCR en tiempo real
La PCR cintica o en tiempo real es un mtodo que sus-
tituye cada vez ms a la PCR convencional. Esto es posible
por el marcado de los cebadores, las sondas o el amplicn
con molculas uorgenas. Cuando un producto especco
se acumula, la uorescencia incrementada emitida a par-
tir de la reaccin revela la acumulacin. En contraste con
la PCR convencional, no es necesaria la deteccin de la
amplicacin posterior del producto a travs de la manipu-
lacin de la mezcla de reaccin. El producto se identica
dentro de un tubo de muestreo cerrado. La posibilidad de
contaminacin cruzada derivada del amplicn de las prue-
bas se reduce as en gran proporcin y, dado que la acumu-
lacin del cido nucleico amplicado se reconoce mientras
sucede, la prueba se termina en menos tiempo. Adems, los
lmites de concentraciones sobre los cuales es posible la
cuanticacin exacta del producto son mucho ms grandes
respecto de los que pueden alcanzarse en formatos PCR
competitivos ms convencionales.
Varios mtodos estn disponibles para lograr la detec-
cin de la uorescencia en PCR en tiempo real. En su modo
ms simple, los compuestos como bromuro de etidio o el
verde 1 SYBR
se aaden a la mezcla de reaccin. stos se

unen al dsDNA y despiden luz uorescente cuando se exci-
tan con luz de una longitud de onda apropiada. Esta aproxi-
macin no es ideal dado que la formacin de artefactos por
los dmeros cebador-cebador y la amplicacin inespecca
del DNA que no es blanco y es irrelevante pueden emitir
seales uorescentes falsas positivas. Este problema puede
tratarse si se calienta el producto nal y se mide la tempera-
tura de disociacin de los productos. Los dmeros cebadores
se disocian a una temperatura ms baja que la empleada
para el producto PCR especco.
La especicidad de la PCR en tiempo real se mejora
muchas veces mediante el marcado de sondas de oligo-
nucletido con una sonda uorescente. En realidad, se tiene
acceso a una variedad de mtodos de marcado y deteccin
de la sonda. Dos de los ms difundidos son la sonda hbri-
da o los mtodos de sondeo con endonucleasa 5 (tambin
conocidos como Taqman
). La hibridacin de las sondas

requiere dos oligonucletidos de la sonda; uno se marca con
un uorforo donador 3 y el segundo con un uorforo re-
ceptor conveniente. Los oligonucletidos se unen al cido
Figura 22-3 Disposicin interna del instrumento Cobas
Amplicor de Roche Diagnostics. El ciclo trmico y la de-
teccin del producto por un sistema de ensayo basado en
micropartculas ligadas de manera enzimtica estn auto-
matizados en este instrumento.
nucleico blanco adyacente a otro y, cuando el uorforo se
activa por la luz a una longitud de onda conveniente, libera
luz uorescente y, por un proceso conocido como transfe-
rencia de energa de resonancia uorescente, transere ener-
ga al uorforo receptor 5 adyacente, que entonces emite
la luz a una diferente longitud de onda (g. 22-4). La detec-
cin de esta emisin seala la vinculacin especca de las
sondas adyacentes del oligonucletido a su cido nucleico
blanco. Una alternativa para el uso de estas sondas duales
es la utilizacin de un solo oligonucletido y la capacidad de
la polimerasa Taq para actuar como endonucleasa 5-3. Un
uorforo se une al extremo 5 de un oligonucletido de la
sonda y un segundo uorforo se agrega al extremo 3 del
oligonucletido de la sonda. Bajo circunstancias normales,
la excitacin de un uorforo conduce a la transferencia de
energa de resonancia uorescente al otro uorforo. Esto
lleva a la emisin de la luz de una diferente longitud de
onda, que no suele reconocerse. Se dice que la uorescencia
se extingue. Cuando el oligonucletido se hibridiza con su
cido nucleico blanco, los uorforos se liberan por hidr-
lisis y la uorescencia ya no se extingue ms (g. 22-4).
Existen numerosas alternativas para lo anterior, incluidas
las sondas de un pptido del cido nucleico (sondas Luz-
up), sondas del oligonucletido horquilla (faros mole-
culares) y amplicones autouorescentes (p. ej., cebadores
Sunrise o Scorpion).
En la actualidad existe una extensa variedad de instrumen-
tos para usar la PCR en tiempo real. Uno de los ms rpidos
de stos es el Lightcycler
(g. 22-5). Un capilar de cristal

asentado en plstico se utiliza como el recipiente de la reac-
cin. El capilar permite calentamientos y enfriamientos muy
rpidos de los reactantes y tambin posibilita la deteccin di-
recta de uorescencia dentro del recipiente de la reaccin. El
calentamiento y el enfriamiento se alcanzan con un elemento
trmico y un ventilador. Los capilares se rotan delante de un
diodo que emite un lser azul y la uorescencia intracapilar
se vigila a travs de tres diodos de fotodeteccin, cada uno
con ltros de longitud de onda diferentes para la activacin.
El calentamiento y el enfriamiento rpidos alcanzados en este
sistema (20C/seg) signican que un perl del ciclo trmico
tpico de 40 ciclos puede completarse en 20 minutos.
Automatizacin y PCR
El alto nivel de capacidad tcnica requerido para realizar la
PCR convencional se ha resuelto en cierto grado con la cre-
ciente disponibilidad de productos comerciales de la prueba.
Un obstculo importante que causa retrasos es la necesidad
de mtodos conables de alto rendimiento para la extrac-
cin de cidos nucleicos. Los recientes progresos en rob-
tica y la estandarizacin de los reactivos han conducido al
desarrollo de varias plataformas capaces de automatizar la
preparacin de la muestra y la disposicin del mtodo. Estos
procedimientos reducen la exigencia tcnica requerida para
realizar la PCR, mejoran la reproducibilidad de la prueba
y promueven la comprobacin de alto rendimiento, con lo
cual es posible introducir la comprobacin NAAT para un
espectro ms amplio de laboratorios clnicos y una gama
ms extensa de virus patgenos.
Figura 22-4 PCR en tiempo real. a) Sondas de hibridacin. Los oligonucletidos se unen al DNA blanco adyacente; cuando se excitan
por luz de una longitud de onda conveniente, el uorforo donador (D) transere energa mediante resonancia uorescente al uorforo
receptor (A), que emite luz uorescente. b) Sondas Taqman. Cuando la polimerasa Taq de DNA extiende la cadena del DNA, encuentra
la sonda de hibridacin unida al DNA de la plantilla. La actividad de la endonucleasa 5-3 de Taq desplaza y degrada a los oligonucleti-
dos, con lo cual libera al uorforo indicador (R) a partir del oligonucletido y lo separa por consiguiente del uorforo extintor (Q) de
manera que el indicador despide luz uorescente.
Amplicacin mediada
por transcripcin
Se han desarrollado varios mtodos alternativos para la
amplicacin del blanco; la amplicacin mediada por
transcripcin (AMT) es un ejemplo. Despus de una tc-
nica de extraccin propietaria para liberar y estabilizar el
cido nucleico a partir del virin, la muestra de la prueba
se calienta brevemente a 95C para desnaturalizar el cido
nucleico blanco. Para amplicar el cido nucleico, un oli-
gonucletido se une al blanco de manera especca, al cual
se adhiere una secuencia impulsora para la polimerasa de
RNA. Si el cido nucleico blanco es el RNA, en una reac-
cin isotrmica, una enzima transcriptasa inversa (TI) crea
una copia de DNA de la plantilla del RNA por extensin a
partir del extremo 3 del cebador-promotor. El RNA en el
dplex RNA-DNA se degrada entonces por la accin de la
RNAasa de la transcriptasa inversa. Un segundo oligonu-
cletido se une al cDNA copiado y una nueva cadena del
DNA se sintetiza por TI. El dplex de DNA con el promo-
tor del RNA adherido acta como plantilla para la trans-
cripcin por la polimerasa del RNA. Las copias del RNA
recin sintetizadas tambin actan como plantillas nuevas
que vuelven a entrar al proceso AMT, lo que produce una
nueva ronda de la rplica, que conduce a un aumento expo-
nencial de los amplicones de RNA. La adicin de una sonda
del DNA marcado con ster de acridinio, que une de modo
especco a los amplicones del RNA blanco, permite, des-
pus de la desnaturalizacin qumica de la sonda separada,
la deteccin del producto con quimioluminiscencia.
Amplicacin basada en la secuencia
del cido nucleico
La amplicacin basada en la secuencia del cido nucleico
(ABSAN) es en apariencia muy similar a la AMT; empero,
mientras que la AMT utiliza dos enzimas en una ampli-
cacin isotrmica, la ABSAN usa tres. Despus de la ex-
traccin del cido nucleico con un mtodo propietario para
la extraccin del cido nucleico basado en slice, un ceba-
dor del oligonucletido con un promotor de la polimerasa
de T7 RNA adherido se ampla por la accin de la TI, que
acta en una direccin 3 a 5. Una enzima RNAasa degrada
entonces la cadena del RNA y un segundo cebador se une
a la molcula del cDNA y la TI produce la molcula de
DNA de doble cadena (en repeticiones recientes de la tc-
nica se ha utilizado una enzima que combina la actividad
de la polimerasa de DNA en la transcripcin inversa y la
RNAasa de la misma forma que en la tcnica AMT).
La polimerasa T7 produce luego transcripciones del RNA a
partir del DNA de doble cadena y acta como plantilla adi-
cional para el procedimiento de ABSAN. La deteccin de
amplicones se logra por hibridacin con un oligonucletido
ligado a perlas paramagnticas revestidas de estreptavidina
y una sonda marcada con rutenio. Las perlas paramagnti-
cas que lleva el complejo hbrido amplicn-sonda se captu-
ran en la supercie de un electrodo por medio de un imn.
El voltaje aplicado a este electrodo desencadena una reac-
cin electroquimioluminiscente. Se han descrito mtodos
para una amplia gama de blancos y un desarrollo recien-
te es el uso de faros moleculares en esta tecnologa que
Figura 22-5 El instrumento Lightcycler. Diagrama de la estructura interna del aparato. Reproducido con autorizacin de www.light-
cycler-online.com.
permite la deteccin y la cuanticacin en tiempo real
del RNA del HIV.
Amplicacin por desplazamiento de la cadena
La amplicacin por desplazamiento de la cadena es un
comparativo recin llegado al campo de la amplicacin
del cido nucleico, pero ha ganado una amplia aceptacin.
Dicho mtodo se basa en la capacidad de las polimerasas
de DNA para iniciar la sntesis del DNA mediante un corte
a una sola cadena dentro de una molcula blanco de DNA
de doble cadena. Despus de la extraccin y la desnaturali-
zacin de la molcula de DNA blanco, un oligonucletido
cebador que contiene una secuencia especca del blanco y
una secuencia que posee un sitio que reconoce una enzima
de restriccin (casi siempre BsopI) se unen a la molcula
blanco de DNA de una cadena. Una enzima polimerasa de
DNA copia entonces la molcula de DNA. Sin embargo,
los trifosfatos de desoxinucletido (dNTP) usados para
este alargamiento se modican mediante la sustitucin del
tiol alfa. Cuando una enzima de restriccin se aade a la
reaccin, sta intenta cortar el DNA en el sitio de recono-
cimiento BsopI, pero puede cortar slo una de las cadenas
del DNA porque la cadena recin sintetizada contiene el
dCTP sustituido por tiol alfa, que la enzima de restriccin
no puede seccionar. La cadena recin sintetizada del DNA
se desplaza y el dplex cebador-DNA puede actuar como
iniciador para una ronda nueva del copiado conducido por
la polimerasa de DNA. Las copias liberadas pueden servir
como plantilla adicional para la reaccin. La acumulacin
del producto puede detectarse por quimioluminiscencia.
Amplicacin de la seal
DNA de cadena ramicada
Un ejemplo de un mtodo de amplicacin de la seal
para la deteccin y la cuanticacin del cido nucleico se
encuentra en el mtodo con cadenas ramicadas de DNA
(bDNA) disponible en el comercio. Se hallan en el mercado
tres productos para identicar y cuanticar el DNA del virus
de la hepatitis B, el RNA del virus de la hepatitis C y el RNA
del virus de inmunodeciencia humana. El mtodo usado
para la deteccin del RNA del HIV es un procedimiento de
hibridacin del cido nucleico emparedado para la cuanti-
cacin directa del RNA del HIV-1 en plasma humano. El
HIV-1 se concentra primero en el plasma por centrifugacin.
A continuacin se utiliza un procedimiento de extraccin
propietaria del cido nucleico para liberar el RNA a partir
de los viriones. Un conjunto de sondas especcas que cap-
turan el oligonucletido sinttico atrapan el RNA en una
microcelda. Se permite que un grupo de sondas blanco hi-
bridice al RNA vrico y las sondas del preamplicador. Las
sondas de captura, que comprenden a 17 extensores indivi-
duales de captura, y las sondas blanco, que incluyen a 81
extensores individuales blanco, unen a las diversas regiones
del gen pol del RNA vrico. La sonda del amplicador hibri-
diza al preamplicador y forma un complejo DNA ramica-
do (bDNA). Las copias mltiples de una sonda marcada con
fosfatasa alcalina (AP) se hibridan a este complejo inmovili-
zado. La deteccin se logra tras incubar el complejo con un
sustrato quimioluminiscente. La emisin de luz se relaciona
directamente con la cantidad de RNA del HIV-1 presente en
cada muestra y un analizador del luminmetro registra los
resultados como unidades de luz relativas (RLU). Una curva
estndar se dene por la emisin de luz a partir de los es-
tndares que contienen concentraciones conocidas del virus.
Las concentraciones de RNA del HIV-1 en las muestras se
determinan a partir de esta curva estndar.
Captura hbrida
Otra amplicacin de la seal disponible en el comercio
ofrece una sensibilidad ms limitada que el mtodo bDNA.
El mtodo de captura hbrida implica la suspensin de la
muestra para liberar el DNA blanco. Despus, el DNA se
combina con las sondas especcas del RNA en la solucin
y los hbridos DNA-RNA se capturan sobre una placa de
microtitulacin o un tubo de reaccin mediante anticuerpos
monoclonales especcos para los hbridos DNA-RNA.
Los hbridos capturados se detectan con el uso de los an-
ticuerpos mltiples conjugados con fosfatasa alcalina. La
fosfatasa alcalina ligada se identica mediante una reac-
cin quimioluminiscente con un sustrato del dioxetano.
Amplicacin de la sonda
Reaccin en cadena de la ligasa
La reaccin en cadena de la ligasa (LCR) supone la unin de
dos secuencias complementarias del oligonucletido de la
sonda a un DNA blanco (despus de la extraccin del cido
nucleico a partir del virin y la desnaturalizacin del DNA).
Una enzima ligasa de DNA se utiliza para unir los dos pares
de sondas complementarias despus que hibridan a la mo-
lcula blanco. La reaccin se calienta para separar las cade-
nas del DNA y las dos secuencias de una cadena de DNA
forman las plantillas para la unin de la sonda adicional. El
mtodo acusa ciertas limitantes por la alta anexin debido al
enlazamiento del extremo cohesivo de los dplex de la sonda
y las condiciones de la hibridacin deben ser rigurosas para
reducir la unin inespecca de la sonda. Sin embargo, la
tcnica encontr aplicacin comercial en los mtodos para
Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, las mico-
bacterias y Borrelia spp. No obstante, en fecha reciente los
proveedores comerciales de esta tecnologa parecen aban-
donar el procedimiento en favor de una tcnica PCR para la
deteccin de blancos microbianos.
Anlisis de la secuencia
La determinacin de la secuencia del cido nucleico de
un virus tiene aplicacin prctica importante en la virolo-
ga clnica. Mientras que el uso del aislamiento del cultivo
celular del virus ha declinado en favor de mtodos ms
rpidos de identicacin del mismo (como la deteccin
directa de antgenos o cidos nucleicos vricos), se obser-
va una reduccin de la cantidad de informacin epidemio-
lgica referente a cepas de virus circulantes. Para tratar
este problema se introdujeron los mtodos genmicos de
rastreo epidemiolgico. La informacin epidemiolgica
es de importancia en el control del paciente individual, en
medidas para prevenir o contener la extensin de la infec-
cin, en el rastreo del contacto y en el diseo de vacunas y
antivricos para prevenir o tratar la infeccin. En contraste
con los esquemas tipicantes epidemiolgicos basados en
caractersticas biolgicas como la capacidad para hema-
glutinar ciertos tipos de clulas rojas o en la tipicacin
serolgica sustentada en la capacidad de los antisueros
aislados para unir y neutralizar la infectividad de la con-
tagiosidad vrica el anlisis genmico proporciona casi
siempre una clasicacin biolgica ms exacta.
En el proceso de identicacin de un virus desconocido,
los datos de la secuencia, obtenidos a partir de cualquier re-
gin del genoma vrico, se pueden comparar con todas las
secuencias vricas conocidas a travs del uso de los progra-
mas de gran alcance de la alineacin secuencial (muchos
de los cuales estn disponibles, p. ej., a travs de internet),
hallados en bases de datos internacionales de cido nuclei-
co de acceso abierto, como las que pone a disposicin el
European Molecular Biological Laboratory o la base de
datos de Los lamos en Estados Unidos. Con los virus co-
nocidos, las bases de datos menores estn disponibles para
las comparaciones de la secuencia. Por supuesto, no todos
los virus humanos se han secuenciado todava, pero el n-
mero de secuencias vricas completas aumenta ao con ao
y para muchos ms virus la informacin de secuencia par-
cial est disponible; esto signica que la informacin de
la secuencia se ha convertido en el mtodo de facto para la
identicacin y la clasicacin de un nuevo virus.
La informacin de la secuencia tambin juega un pa-
pel importante en el control de ciertas enfermedades; por
ejemplo, se sabe que el genotipo del virus de la hepatitis C
es un determinante importante en la respuesta a la terapia.
A los pacientes identicados como crnicos e infectados
con el virus de la hepatitis C (persistencia del RNA vrico
de la hepatitis C en plasma) se les puede ofrecer una com-
binacin del frmaco antivrico ribavirina y el interfern
alfa formulado con una cadena lateral de glicol de polie-
tileno (interfern pegilado); empero, se ha encontrado que
la respuesta a la terapia de un individuo se correlaciona
notoriamente con el genotipo del virus. En consecuencia,
los individuos sometidos a tratamiento tienen el genotipo
de un virus determinado. Aquellos en quienes se determina
que portan virus de los genotipos 1 o 4 requieren terapia
antivrica prolongada para lograr la curacin.
Un uso muy importante de la tecnologa de secuencia-
cin se encuentra en el control de los sujetos infectados con
el HIV. En Europa, por lo menos 20% de los nuevos casos
de la infeccin con HIV implica la transmisin del virus a
partir de una persona que ya experiment la terapia con un
frmaco antivrico y es portadora de virus resistentes, por
lo menos a algunos de los frmacos antivricos usados en el
tratamiento de combinacin para el HIV. La determinacin
del patrn de resistencia al frmaco puede ser crucial para
la teraputica efectiva. El procedimiento tambin desem-
pea una funcin vital para seleccionar una combinacin
apropiada de compuestos antivricos en quienes fracasa
la terapia antivrica. Hay dos pruebas principales para la
resistencia antirretrovrica, la que detecta resistencia geno-
tpica y la que reconoce resistencia fenotpica.
Las pruebas genotpicas buscan la alteracin en la se-
cuencia base de los genes del HIV que se vinculan con el
desarrollo de la resistencia al frmaco. Por ejemplo, una
mutacin especca, M184V, en el gen de la transcriptasa
inversa conere resistencia al nuclesido anlogo 3TC. Las
pruebas fenotpicas miden la concentracin requerida de
un frmaco para inhibir la rplica vrica por 50 o 90% (IC
50

o IC
90
, respectivamente) y requieren el cultivo del virus o
la construccin de los virus recombinantes indicadores.
La comprobacin de la resistencia fenotpica para el
HIV se basaba (hasta nales del decenio de 1990) en los
mtodos de reduccin de la placa o los mtodos de cultivo
de clulas de monocapa de sangre perifrica (CMSP), que
exhiban distintas desventajas. Los mtodos de reduccin
de la placa del HIV requirieron el cocultivo del virus con
clulas HeLa-CD4
+
y slo as se podan utilizar para la mi-
nora de los aislados clnicos que pueden inducir al sincitio
en el cultivo celular (es decir, virus que son CXCR4 trpi-
cos). Los mtodos de cultivo de clulas de monocapa de
sangre perifrica son ms verstiles, pero requieren 10 a
14 das de cocultivo de las CMSP del paciente con CMSP
estimuladas por el mitgeno a partir de individuos sero-
negativos al HIV, junto con la vigilancia del crecimiento
a travs de un marcador sustituto de la infeccin, como el
antgeno HIV p24. Hoy en da se utiliza con regularidad
una tcnica molecular fundada en tal comprobacin. En
dos variantes de la tcnica disponibles en el comercio se
emplea una PCR de transcripcin inversa para amplicar
la proteasa, la mayor parte de las TI y una porcin de los
genes gag del HIV-1. En uno de estos mtodos el cDNA
se incorpora en un virus recombinante pol-suprimido para
crear un aislado HIV-1 recombinante por la recombinacin
homloga en cultivo celular. Este aislado recombinante
es capaz de infectar una lnea de clulas estndar y puede
usarse para medir la rplica vrica en presencia de concen-
traciones variables de frmacos antirretrovricos mediante
la observacin de la muerte celular inducida por el virus
recombinante. En el otro mtodo directo se usa la ligadu-
ra para combinar el cDNA producido con el vector HIV-1
pol-suprimido y prueba la construccin del recombinante
durante una sola ronda de la rplica con el mtodo del gen
indicador de la luciferasa. Ambos mtodos poseen la sensi-
bilidad del frmaco en trminos de la concentracin micro-
molar del agente requerido para inhibir la rplica del HIV-1
en 50%. Aunque la comprobacin fenotpica proporciona
un mtodo ms directo de medir la resistencia, en la ac-
tualidad la duracin del tiempo necesario para realizar la
prueba (hasta varias semanas) reduce su utilidad clnica.
Los cambios fenotpicos se originan a partir de las trans-
formaciones en el genotipo y de ese modo la comprobacin
genotpica puede proporcionar indicios sobre la resistencia
del frmaco antes de las pruebas fenotpicas. El virus extra-
do del plasma se transcribe de manera inversa y se efecta
una serie de PCR, diseada para permitir la amplicacin de
regiones de la proteasa vrica, la transcriptasa inversa u otras
regiones del genoma (p. ej., el gen de envoltura protenica
del gp41 del HIV-1 en los sujetos sometidos a la terapia con
frmacos inhibidores de la fusin del HIV). A continuacin
se secuencian los productos marcados de forma apropiada
(vase la g. 22-6). La secuencia del cDNA se alinea con
una cepa de tipo silvestre del HIV y se compara con una
base de datos en la cual se documentan las mutaciones de
punto y las combinaciones de las mutaciones de punto co-
rrelacionadas con el desarrollo de la resistencia a combina-
ciones individuales o mltiples de frmacos. A las bases de
datos las mantienen los proveedores comerciales de la prue-
ba o estn disponibles a travs de bases de datos de colabora-
cin internacional de acceso gratuito, como la base de datos
de la Stanford University HIV RT and Protease Database.
En el examen de los virus RNA, como el virus de la
hepatitis C o el HIV, el RNA extrado a partir del plasma
se transcribe en forma inversa y el cDNA se amplica por
PCR. Luego se puede examinar la secuencia de varias ma-
neras. En el mtodo InnoLipa, disponible en el comercio
para la genotipicacin de la hepatitis C, el cDNA desnatu-
ralizado se hibrida con las tiras de nitrocelulosa a las cua-
les estn unidos los oligonucletidos que corresponden a
las secuencias presentes en los genotipos aislados del virus
de la hepatitis C. Uno de los cebadores del oligonucletido
usado en la PCR se marca con una molcula de biotina. El
modelo de unin del cDNA se revela por la reaccin del
cDNA inmovilizado con un complejo avidina-enzima, se-
guida por un sustrato cromgeno; el patrn de bandas que
aparece en la tira revela el genotipo del virus. Los mto-
dos de resistencia comerciales similares de la transcriptasa
inversa y la proteasa del HIV-1 emplean principios meto-
dolgicos similares, pero en este caso las sondas del oligo-
nucletido inmovilizadas sobre la nitrocelulosa se disean
para seleccionar mutaciones de la resistencia en los genes
de la proteasa o la TI del HIV-1.
Pese a ello, en condiciones normales, el cDNA se marca
en una PCR adicional en presencia de 2,3trifosfatos de
Figura 22-6 Secuenciacin. Un ejemplo que muestra la secuenciacin de la proteasa del HIV-1 y los genes de la TI. Las bases que se
elucionan a partir del secuenciador capilar se codican por color (azul, citosina; negro, guanina; rojo, timina; verde, adenina), lo que
permite que la secuencia se construya y compare con la secuencia de una cepa de tipo silvestre de la secuencia HIV-1 para determinar los
cambios de base dentro de la cepa de prueba del virus que puedan vincularse con el desarrollo de la resistencia al frmaco antivrico.
ANLISIS DE LA SECUENCIA 221
didesoxinuclesido (ddNTP). Se usa una mezcla optimiza-
da de manera cuidadosa de los trifosfatos de desoxinucle-
tido (dNTP) y los ddNTP, junto con los oligonucletidos
en una PCR convencional. La sntesis de la cadena nueva
se termina de modo aleatorio por la incorporacin de un
ddNTP, que se marca con un colorante especco de la base
que ste marca. Al nal de la reaccin de establecimiento de
la secuencia, el tubo donde se produce la misma posee una
mezcla de las copias parcialmente sintetizadas del DNA.
Cada una tiene un extremo 5 comn (denido por el oli-
gonucletido cebador usado en la reaccin), pero sus longi-
tudes son diferentes (varan por una base de longitud en el
extremo 3). La mezcla se analiza mediante electroforesis
en gel de poliacrilamida y uorometra o secuenciacin en
gel capilar automatizada de alto rendimiento (g. 22-6). En
el ltimo mtodo, los fragmentos ms pequeos del DNA
marcado presentan la mayor movilidad y se elucionan pri-
mero a partir del capilar. Cada fragmento que se eluciona
con posterioridad del capilar es una base ms larga que
aquella que la precede. Los fragmentos separados del DNA
se revelan por excitacin con lser. Cada uno de los colorantes
unidos a una base terminal 23 emite luz en una diferente
longitud de onda que permite distinguir la base terminal in-
dividual. Los cuatro colores, y por lo tanto las bases, pueden
reconocerse con facilidad. La secuencia del fragmento se
lee en forma directa a partir del eluido capilar.
Las alternativas a este procedimiento incluyen el uso de
portaobjetos de cristal, lminas de silicn o membranas
de nylon con oligonucletidos incorporados (microchips de
DNA). Para la genotipicacin del HIV-1 se ide una se-
rie para analizar la secuencia completa del gen de la pro-
teasa del HIV-1 y una regin de 1 200 pares de bases del
gen de TI. El chip inclua 18 000 sondas de 18 a 22 pares
de bases y se dise para abarcar todas las combinaciones
posibles de la mutacin dentro de esta secuencia. Cada
nucletido en la secuencia por analizar requiere por lo
menos cuatro sondas del oligonucletido para determinar
si el nucletido en esa posicin es una A, T, C o G. Para
utilizar la serie, el cDNA que resulta de una TI PCR del
virus derivado del plasma se transcribe al RNA de una ca-
dena y se marca con molculas indicadoras uorescentes.
Despus de la hibridacin, se explora el chip mediante un
lser para activar la marca uorescente y el modelo de la
vinculacin se revela por el examen con un microscopio
confocal. Las molculas indicadoras despiden luz uores-
cente en proporcin con la astringencia con la cual se une
la sonda al cido nucleico. Las sondas que no se unen a
ningn cido nucleico no emiten luz uorescente, mien-
tras que las sondas unidas con un solo par de bases mal
emparejadas tienen hasta 35 veces menos uorescencia
respecto del emparejamiento completo de la secuencia.
El enderezamiento automatizado del modelo de la unin
observada permite la vinculacin de las secuencias deriva-
das de sondas superpuestas para determinar la secuencia a
partir de la secuencia de tipo silvestre del RNA del HIV-1
representada en el chip. La variacin gentica del HIV re-
presenta un gran desafo para el uso de los chips de DNA.
En comparaciones con la secuenciacin didesoxinucleot-
dica se encontr que el chip es menos conable en la detec-
cin de la mutacin y menos capaz del discernimiento de
inserciones o deleciones de la secuencia. El chip tampoco
es del todo apropiado para secuenciar cepas que no son
del subtipo B de HIV-1, el subtipo en el cual se dise el
chip. A pesar de este retroceso, las capacidades y el alto
rendimiento de los microchips de DNA condujeron a su
desarrollo comercial continuo y los chips para el anlisis
genotpico de los virus de las hepatitis B y C no estn le-
jos de su aparicin en el mercado. Un enfoque interesante
para el uso ms amplio de esta tecnologa es la descripcin
de una microconguracin del DNA de un oligonucletido
largo (70-mer) que ha demostrado ser capaz de detectar e
identicar centenares de diversos virus humanos. Median-
te una PCR de transcripcin inversa aleatoria fue posible
reconocer junto con esta tecnologa virus mltiples en es-
pecmenes respiratorios sin el uso de PCR, a partir de ceba-
dores especcos de la secuencia o degenerados.
Resumen
No han dejado de multiplicarse las aplicaciones de las tc-
nicas biolgicas moleculares en virologa, sobre todo en la
virologa clnica. Los mtodos moleculares de diagnstico
reemplazaron en poco tiempo a los mtodos convenciona-
les de diagnstico, como el aislamiento en cultivo celular,
la serologa, la microscopia de uorescencia y la micros-
copia electrnica. La automatizacin ha atenuado la com-
plejidad tcnica de la comprobacin, al tiempo que mejora
reproducibilidad y conabilidad. Su aplicacin desplaz a
la virologa clnica de una bsqueda de mero inters acad-
mico a una ciencia clave determinante en el diagnstico de
la fase aguda y el tratamiento de los enfermos.
Los ltimos datos sobre los patrones antirretrovricos de la resis-
tencia (comprobacin genotpica) se pueden encontrar en: An-
tiviral Drug Resistance Online, www.viral-resistance.com; en
la Stanford University HIV RT and Protease Database, http://
hivdb.stanford.edu/hiv; y en la base de datos de la secuencia
del HIV de Los lamos, http://hiv-web.lanl.gov
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Este captulo incluye la descripcin de las tcnicas no
descritas en las secciones anteriores; tales metodologas se
agrupan en tres reas que salen del mbito de los laborato-
rios de diagnstico vrico: enfermedad por prion, suscepti-
bilidad antivrica e inmunidad mediada por clulas.
Deteccin de la enfermedad por prion
Los priones se clasican como una entidad infecciosa inde-
pendiente porque la mayora de los investigadores cree que
carecen de cualquier cido nucleico y que consisten tan slo
en partculas proteinceas infecciosas. Se incluyen en esta
seccin por varias razones: son subvricos en tamao; en el
plano histrico se denominaron infecciones vricas lentas,
y la opinin de la minora sostiene an que se trata en rea-
lidad de virus, nemavirus. Son la causa de la enfermedad
cerebral, encefalopata transmisible espongiforme (ETE),
por la cual la acumulacin de la protena prion da lugar a la
vacuolizacin del tejido nervioso y neurodegeneracin, que
se maniesta en clnica como demencia de lenta progresin,
ataxia, sueo y trastornos de la alimentacin y conduce de
modo inevitable a la muerte. Las enfermedades incluyen
temblor en ovejas, encefalopata bovina espongiforme (EBE)
en el ganado y cuatro tipos de enfermedad humana: enfer-
medad de Gerstmann-Straussler-Schinker (GSS), insomnio
familiar mortal (IFM), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
(ECJ) y kuru, adems de una quinta si se incluye la variante
de la ECJ (vECJ) relacionada con la EBE epidmica (g. 23-1).
Es demasiado temprano para determinar si una segunda in-
feccin zoontica, por una ETE de los ciervos o los alces
(enfermedad caquectizante crnica), debe tambin incluirse,
aunque tres hombres han muerto de enfermedad neurodege-
nerativa despus de banquetes de caza silvestre en Estados
Unidos. Antes de considerar la cuestin del diagnstico, es
esencial entender algo del fondo y el mecanismo terico del
proceso infeccioso. Slo entonces es posible reconocer las
dicultades inherentes al diagnstico rpido.
La esencia de la enfermedad por prion es la alteracin
de la conformacin helicoidal alfa de una protena normal
y esencial de la membrana neuronal (PrP
c
) a una confor-
macin de lmina beta resistente a la proteasa (PrP
Res
), la
eliminacin de la cual conduce a la degeneracin neurol-
gica (g. 23-1). La presuposicin de que slo la protena
(PrP
Res
) puede inducir este cambio se apoya en evidencia
in vitro. Datos nuevos sugieren que la neurodegeneracin
se desencadena por el estrs oxidativo debido a que la a-
nidad de unin al metal de la PrP
c
se altera. sta es un anti-
oxidante que se une al cobre jado a las membranas celulares
neuronales y el efecto protector se puede perder cuando la
PrP
Res
se liga a otros metales, como zinc y manganeso.
De las enfermedades humanas por priones, la GSS e
IFM surgen de varias mutaciones puntuales en el gen PrP
c
,
las cuales se transmiten genticamente dentro de las fami-
lias (g. 23-1). La ECJ surge de modo espordico (ECJe),
otra vez con la evidencia de la mutacin puntual, o quiz
tambin con la sobreexpresin del gen PrP
c
. El aspecto in-
feccioso de la ECJ es su probada transmisin yatrgena a
partir de injertos durales o crneos, instrumentos neuroqui-
rrgicos o extractos de la hormona pituitaria y la posibilidad
de infeccin accidental por la manipulacin del tejido cere-
bral. El kuru, reconocido como la consecuencia de prcticas
canbales en Papa, Nueva Guinea, se ajusta ms a la imagen
de un proceso infeccioso. De manera similar, el canibalismo
articial de cerebro ovino o bovino conduce a la infeccin
por EBE, y la ingestin subsiguiente de tejido neural infec-
23
Virologa: otras pruebas
Alex WL Joss
226 CAP. 23 VIROLOGA: OTRAS PRUEBAS
Figura 23-1 Mecanismos de transmisin y evolucin de la enfermedad por prion.
DIAGNSTICO 227
tado de EBE provoca vECJ, la cual es distinta de la ECJe
en trminos histolgicos y epidemiolgicos. Es ms fcil
y estrecha la transmisin interespecies en relacin con la
PrP
c
en el receptor en comparacin con la fuente. Las PrP
c

ovina y bovina dieren slo en siete residuos, mientras que
las PrP
c
bovina y humana lo hacen en 30 residuos. Sin em-
bargo, todas las ETE, con excepcin del IFM, se han trans-
mitido de manera experimental a un grupo de especies.
Diagnstico
Las caractersticas que hacen tan difcil el diagnstico son
el sitio de la enfermedad, el parentesco cercano del agente
patgeno con su husped equivalente y la falta notoria de
cido nucleico. Es poco probable realizar una biopsia del
cerebro cuando la terapia es an inasequible, a menos que
se excluyan otras enfermedades tratables, y las muestras pe-
queas pueden ser falsamente negativas. Los signos clnicos
de la ECJ, como demencia de rpida progresin, mioclono,
ataxia, trastornos visuales o sndrome de la mano ajena, no
son diagnsticos, pero pueden serlo en una persona ms jo-
ven, como en la vECJ. Las mediciones siolgicas son casi
siempre intiles.
Histologa
El diagnstico denitivo de la enfermedad por prion re-
quiere evidencia de la eliminacin de PrP
Res
en el propio
cerebro humano o despus de la transmisin al cerebro ani-
mal. Las placas amiloides teidas de rojo Congo, depsitos
de PrP sinptica, cambios espongiformes, maraas neu-
robrilares y gliosis subcortical son todos caractersticas
histolgicas consistentes con el diagnstico. No obstante,
todos estos signos se comparten en grados diversos con
otros trastornos neurodegenerativos, como las placas ami-
loides en la enfermedad de Alzheimer. Pueden relacionarse
de manera especca con la enfermedad por prion con me-
dios inmunohistoqumicos.
El anticuerpo especco de prion no es fcil de producir,
pero se ha cultivado el antisuero policlonal de conejo con-
tra ncleos de placa amiloide puricados del cerebro hu-
mano, o el cerebro de ratn infectado con ECJ, y contra los
pptidos sintticos equivalentes a las secuencias alteradas
en el prion humano. Puede examinarse el tejido incluido en
parana y jado en formalina, pero despus de la despara-
nizacin es esencial el pretratamiento con una protena
desnaturalizante para incrementar la inmunorreactividad.
El cido frmico es el desnaturalizante ms simple y
ecaz, si bien se puede reemplazar con el autoclave hidro-
ltico a 121C por 10 minutos en una concentracin apro-
piada de cido clorhdrico. Se identica la eliminacin del
prion al ligarse el anticuerpo especco, el cual se visualiza
por la reaccin con una enzima marcada (biotina-estreptavidina
o peroxidasa-antiperoxidasa) o conjugado uorescente. Ce-
pas diferentes de prion producen proporciones variadas de
las dos anomalas principales, placas amiloides (GSS, kuru)
o depsitos sinpticos punteados (ECJe), mientras que la
vECJ humana y los cerebros del mono macaco infectados
con EBE producen abundantes placas corticales oridas en-
tremezcladas con vacuolas en un patrn de margarita.
Las partculas tubulolamentosas, a menudo de 1 m de
largo, son caractersticas diagnsticas observadas en im-
presiones de tejido cerebral humedecido recin cortado,
dispuestas sobre las rejillas del microscopio electrnico y
teidas negativamente con cido fosfotngstico. Son dis-
tinguibles de los lamentos neurobrilares identicados en
la enfermedad de Alzheimer. El diagnstico de la micros-
copia electrnica puede fallar debido al muestreo aleatorio
de tejido no infectado, pero puede encontrarse evidencia
positiva de la infeccin en animales antes de que sean evi-
dentes otros cambios histolgicos.
Cultivo
Adems del IFM, las infecciones por prion se pueden
conrmar por el pase en ratones o cricetos. El diagnstico
es lento y requiere por lo menos 60 das para demostrar la
histologa caracterstica en los cerebros inoculados, y ms
tiempo an que el periodo de vida de un ratn para algunas
cepas de crecimiento lento. El xito de la transmisin pue-
de ser bajo, pero las EBE cruzan la barrera de la especie
con mayor facilidad y se pueden transmitir por va bucal.
Los priones humanos se pueden expresar en cultivo tisular
(p. ej., clulas del ovario del criceto chino), pero no hay
efecto citoptico evidente. Se ha desarrollado el cultivo in
vitro sin clulas, si puede describirse as; en ste, la PrP
c

radiomarcada se convirti en PrP
Res
en dos das de expo-
sicin al prion de la encefalopata espongiforme ovina sin
marcado. Sin embargo, la segunda tuvo que puricarse y
agregarse ms de 50 veces, lo que indic que la tcnica
requera depuracin para tener aplicaciones diagnsticas.
Inmunoblotting
Es posible establecer el diagnstico rpido, en plazo de un
da, en muestras pequeas del cerebro por inmunoblotting.
El tejido digerido por la proteinasa K se separa en geles de
poliacrilamida SDS y se transere de modo electrofortico a
las membranas de nitrocelulosa, con lo cual se producen tres
o cuatro bandas de 16 a 31 kDa de peso molecular que reac-
cionan con el antisuero especco del prion. Sus cocientes de
tamao e intensidad pueden distinguir la vECJ de la ECJe.
stas no se encuentran en la enfermedad de Alzheimer y la
proteinasa K digiere por completo a la PrP
c
normal.
Pruebas en otros tejidos o lquidos corporales
Todos los mtodos discutidos hasta ahora se realizan en te-
jido cerebral; el diagnstico sera ms simple en un material
ms accesible. El anticuerpo monoclonal del PrP
c
se puede
utilizar para diagnosticar la ECJ tras detectar la proteasa re-
sistente de PrP en muestras distintas de las cerebrales. La
PrP
Res
se ha identicado en la orina de los pacientes con
ECJ por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS e in-
munoblotting de bolitas de ultracentrifugacin digeridas por
la proteinasa K. Puede tambin identicarse en amgdalas y
ganglios linfticos incluidos y jados en formalina, despus
de la desparanizacin, el tratamiento de cido frmico y el
autoclave hidroltico mediante el conjugado biotina-avidi-
na, aunque slo en pacientes con vECJ.
Las pruebas en el lquido cefalorraqudeo para los mar-
cadores sustitutos de la destruccin neuronal ahora son
parte del repertorio aceptado para el diagnstico de la ECJ.
El utilizado ms a menudo es un anlisis de inmunotransfe-
rencia con el anticuerpo policlonal de conejo para detectar
una protena neuronal muy conservada de 30 kDa, 14-3-3.
Como la presencia de esta protena en el LCR puede ocu-
rrir en otras enfermedades neurodegenerativas, incluidos
algunos casos de Alzheimer, la prueba es especca slo
en una proporcin de 88 a 95%. Es menos sensible para
la vECJ (50%) que para la ECJe, pero con la adicin de
la prueba ELISA comercial para la tau, una fosfoprotena
microtubular del axn, puede mejorar la sensibilidad a la
vECJ hasta 86 por ciento.
Tcnicas no invasivas
Por lo general se considera til la electroencefalografa,
aunque inespecca. Los complejos peridicos de onda
agudos y la reactividad a estmulos externos o frmacos son
observaciones notorias. La prueba ordinaria imagenolgica
de eleccin es la resonancia magntica de difusin ponderada,
que produce hiperintensidades corticales y subcorticales
multifocales; esta tcnica es un marcador que posee 100%
de sensibilidad y especicidad en pacientes con ECJe.
En conclusin, la naturaleza de la enfermedad por prion
limita de manera notable los procedimientos habituales para
el diagnstico y ste suele ser lento, invasivo y muchas ve-
ces slo se determina en la necropsia. Sin embargo, la vECJ
proporciona el impulso para idear tcnicas ms rpidas y
menos invasivas. El examen del LCR para la protena
14-3-3 ahora es el estndar de oro y los progresos en
resonancia magntica han mejorado las perspectivas del
diagnstico no invasivo.
Pruebas de susceptibilidad antivrica
Los mtodos de susceptibilidad antivrica todava no se lle-
van a cabo con regularidad en muchos laboratorios de ruti-
na de virologa. Las pruebas toman varios das o semanas
para realizarse y por lo tanto es probable que benecien slo
a los sujetos que requieren terapia extensa para los proble-
mas clnicos muy graves. Es ms probable que se efecten
en los laboratorios que atienden a gran cantidad de pacientes
inmunocomprometidos, quiz para supervisar la resistencia
antivrica del virus de la inmunodeciencia humana (HIV) o
identicar virus resistentes del grupo del herpes en tales pa-
cientes. En la prctica, las decisiones para cambiar la terapu-
tica antivrica se basan a menudo en la evidencia emprica de
la resistencia, es decir, el fracaso para responder en clnica
(g. 23-2). De manera alternativa, se miden los marcadores
sustitutos de la resistencia, como fracaso del antgeno vri-
co o los valores del cido nucleico en sangre para descender
en respuesta al tratamiento. Los mtodos de susceptibilidad
conables se agrupan en dos categoras: los fenotpicos, que
miden el efecto del antivrico sobre el crecimiento del virus
in vitro, y los genotpicos, que detectan en forma directa la
presencia de los mutantes que coneren la resistencia.
Ensayos fenotpicos
Los anlisis fenotpicos proporcionan la prueba denitiva
de la resistencia antivrica. Miden la concentracin anti-
vrica requerida para inhibir el efecto citoptico (ECP)
total del crecimiento del virus en el cultivo celular o las
etapas especcas del metabolismo vrico, esto es, sntesis
de DNA o protena. El virus debe propagarse primero en el
cultivo tisular, un paso que por s mismo puede confundir
el resultado al alterar la proporcin de mutantes resistentes
examinados con posterioridad. Por lo tanto, las pruebas se
realizan de preferencia en aislados de escaso pase. El HIV
se asla a menudo de clulas mononucleares perifricas de
la sangre por cocultivo con una lnea celular linfoblastoide,
otra complicacin agregada.
Pruebas de reduccin de placa (RP)
Cuando las monocapas celulares se siembran con el virus
diluido en condiciones que limitan el movimiento del virus,
es decir, bajo un agar o recubrimiento de celulosa, o lqui-
do que contenga inmunoglobulina antivrica, cada unidad
vrica formadora de placa produce una placa discreta de
ECP. La adicin de un antivrico diluido de forma seriada,
junto con cantidades tituladas jas de virus (15 a 500 uni-
dades formadoras de placa), permite la medicin de la sus-
ceptibilidad antivrica como la concentracin que causa
50% de reduccin de la placa (ID
50
). Los mtodos de RP
detectan slo cepas resistentes que constituyen ms de 20 a
25% del aislado. Proporciones ms bajas se pueden detec-
tar mediante un umbral de reduccin de placa de 90%, pero
las mediciones ID
90
son menos exactas que la ID
50
.
Las pruebas de RP utilizan tcnicas de cultivo relativa-
mente baratas, pero las desventajas son los volmenes de
los reactivos, los medios y el virus utilizados y el tiempo
requerido para estandarizar las concentraciones celulares,
vricas y antivricas, y para contar de manera manual las
placas en cultivos replicados. El tiempo total de la prueba
es cuando menos de dos semanas. El cociente virus:clula
se debe optimizar para evitar que se generen clculos altos
o bajos falsos de la susceptibilidad cuando los cocientes
son, respectivamente, demasiado bajos o altos. Los resul-
tados preliminares de la susceptibilidad del herpes simple
(HSV) se pueden obtener en tres das por examen prelimi-
PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIVRICA 229
Figura 23-2 Medidas para determinar la resistencia antivrica.
nar de los aislados en paralelo con la titulacin de su in-
fectividad por la incubacin de diluciones vricas seriadas,
con o sin aciclovir, a 1.5 veces la concentracin aceptada
del umbral de resistencia.
Los ensayos de RP son el estndar de oro para la de-
teccin de la resistencia del HSV, citomegalovirus (CMV)
y varicela zoster (VZV). Se han establecido los umbrales
de resistencia aceptados: 2 g/ml para el aciclovir, 100
g/ml para el foscarnet y un aumento triple a cudruple de
ID
50
para el ganciclovir en comparacin con el tratamien-
to previo. Pese a ello, la duracin de los procedimientos
y las tasas bajas de aislamiento, muchas veces tan bajas
como 30%, hacen en clnica menos tiles los mtodos de
RP del HIV que las pruebas genotpicas ms rpidas.
Captacin del colorante (pruebas CC)
La tecnologa semiautomatizada de una prueba CC conviene
a los laboratorios con un rendimiento ms alto. Principios
similares se aplican al examinar concentraciones constantes
del virus contra diluciones seriadas del antivrico, pero el
ECP despus de dos a tres das de incubacin se mide por
medios espectrofotomtricos. Las cantidades del colorante
rojo neutral absorbido por las clulas viables sobrevivien-
tes, en una hora, entonces eluidas en alcohol amortiguado,
producen lecturas de densidad ptica que son inversamen-
te proporcionales al ECP y a los ttulos del virus. Pueden
interpretarse de modo objetivo y calcularse de manera au-
tomtica a los valores ID
50
. Puesto que se utilizan recubri-
mientos lquidos, los valores ID
50
calculados son ms altos
que en los mtodos de RP y los umbrales de resistencia se
elevan en consecuencia, por ejemplo de 2 a 3 g/ml para el
aciclovir. La tcnica, en placas de microtitulacin, requiere
menos reactivo y detecta cepas resistentes que constituyen
slo 3 a 9% de un aislado total; empero, los mtodos de RP
predicen de forma ms exacta la falla clnica atribuida a la
resistencia.
Pruebas de sntesis de DNA
La sntesis del DNA vrico en cultivos celulares se puede
cuanticar por la hibridacin con sondas de DNA espec-
cas radiomarcadas. Se mide el valor ID
50
antivrico como
la concentracin que causa la reduccin de 50% de la seal
de la sonda ligada. El DNA de las clulas lisadas al nal de
un periodo denido del crecimiento del virus se transere a
lamentos de nylon y se cuantica mediante sondas mar-
cadas con
125
I (mtodos comerciales Hybriwix), o ltros de
nitrocelulosa y despus se hibridan con sondas marcadas
con
32
P. Estos anlisis son ms rpidos que los mtodos RP,
producen resultados en cuatro a seis das y se han utilizado
para detectar resistencia en cepas de HSV, CMV y VZV. Las
desventajas son su costo y la vida til breve de las sondas.
La resistencia al aciclovir en cepas de HSV o VZV puede
conrmarse tras demostrar el mecanismo de la resistencia.
La mayor parte de las cepas resistentes muestra mutacin
en el gen de la cinasa de timidina (TK), lo cual las inca-
pacita para fosforilar y activar al aciclovir. La deciencia
de TK se puede medir en pruebas de incorporacin de ra-
diomarcador en las lneas celulares apropiadas, como una
seal reducida sobre autorradiografa de la placa, mediante
125
I-yododesoxicitidina o
14
C-timidina. Esto se correlacio-
na bien con la imposibilidad de fosforilar al aciclovir.
Pruebas de sntesis de protena
Para algunos virus, el crecimiento se puede supervisar por
el aspecto de las protenas fcilmente identicables del
virus en cultivos celulares. El mejor ejemplo es la hemaglu-
tinina de la inuenza A, que se puede detectar en monoca-
pas de rin canino 18 horas despus de la infeccin con
el anticuerpo monoclonal en una prueba inmunoabsorbente
ligada a enzimas (ELISA). La resistencia a la amantadina
o la rimantadina se demuestra como una falla para reducir
las lecturas de densidad ptica del mtodo ELISA, es de-
cir, sntesis de hemaglutinina, excepto en concentraciones
elevadas del antivrico. Esta prueba discrimina con claridad
la resistencia de cepas susceptibles con ms xito que los
mtodos de RP y es la prueba de opcin para la inuenza A.
Con el advenimiento de los agentes antineuraminidasa osel-
tamivir y zanamivir, la resistencia antivrica se puede medir
como la inhibicin disminuida de la actividad enzimtica
vrica en sobrenadantes del cultivo tisular de inuenza me-
diante un sustrato uorgeno. Los mtodos de expresin
del antgeno vrico tambin se encuentran disponibles para
HSV, VZV y CMV y reconocen las protenas tempranas o
tardas. El grado de inhibicin de la expresin del antgeno
por antivricos se puede medir por citometra de ujo, que
es ms rpida que los mtodos de RP y ms automatizada.
Mtodos genotpicos
Cuando se conoce que las mutaciones puntuales dentro de
genes especcos del virus coneren resistencia antivrica,
pueden probarse de forma directa, en cualquier aislado o
muestra clnica, las ms de las veces sangre. Por lo general,
las mutaciones se identican mediante amplicacin de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) de las secuen-
cias de DNA pertinentes en las muestras clnicas, seguido
por los anlisis de secuencia o hibridacin con las sondas de
mutacin especcas. Una gama considerable de mtodos
comerciales o internos estn disponibles hoy da; es proba-
ble que los anlisis de secuencia sean el mtodo de deteccin
ms sensible. La complejidad de la metodologa y su inter-
pretacin obligan a efectuar las pruebas en los laboratorios
especializados, donde la prueba para la resistencia del HIV
se realiza de rutina. Los resultados de la susceptibilidad se
notican sobre antivricos individuales dentro de cada uno
de los tres grupos anti-HIV principales: inhibidores nucle-
sidos de la transcriptasa inversa, inhibidores no nuclesidos
de la transcriptasa inversa e inhibidores de la proteasa. Las
mutaciones en los genes fosfotransferasa o polimerasa de
DNA del CMV y el gen de la protena transmembrano-
sa de la inuenza A tambin se vinculan con la resistencia
antivrica y as proporcionan blancos para los ensayos
genotpicos. La ventaja de esta tcnica es su directividad,
que evita la necesidad de aislar, cultivar y cuanticar el vi-
rus. Esto no es slo ms rpido en trminos tcnicos; los
mutantes de resistencia se pueden identicar en la sangre
antes de que se asle el virus resistente. Las desventajas son
la incapacidad para detectar resistencia cuando se ignoran
las mutaciones especcas o reconocer las mutaciones pre-
sentes como una proporcin baja (p. ej., <10 a 25%) de la
poblacin vrica total en una muestra.
Conclusin
En la prctica clnica es probable que continen las deci-
siones de cambiar la terapia antivrica a partir de evidencia
emprica o del marcador sustituto. Sin embargo, todava
existe un lugar para la prueba de susceptibilidad in vitro
para conrmar la resistencia. La resistencia del CMV o
HIV puede demostrar heterogenicidad focal, por ejemplo
los aislados retinales de CMV resistente junto con los ais-
lados sistmicos sensibles, que modican el tratamiento.
Los aos recientes han visto que la innovacin rpida en la
terapia antivrica y la bsqueda de compuestos tiles han
suministrado buenos mtodos de susceptibilidad. La intro-
duccin de nuevos antivricos, la evaluacin de la terapia
combinada y la investigacin de los datos inconsistentes
acerca de la resistencia in vitro e in vivo deben incremen-
tar la demanda de esta tecnologa. Con la atencin actual
mejorada de la infeccin por HIV con terapia de mltiples
frmacos, la prueba genotpica de resistencia antivrica del
HIV se ha vuelto parte del repertorio de atencin cuando
falla el tratamiento.
Inmunidad mediada por clulas
Una inmunorrespuesta celular ecaz es importante en la su-
peracin de la infeccin vrica, aun si las investigaciones de
laboratorio se centran casi de modo exclusivo en la reac-
cin humoral. Las pruebas de inmunidad celular son mucho
INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS 231
menos favorables al rendimiento grande que las pruebas se-
rolgicas. Adems de los estudios de investigacin, estas
pruebas se reservan para el anlisis de deciencias, como
el fracaso para superar las infecciones del grupo del herpes.
Los mtodos tpicos in vitro valoran dos aspectos de la fun-
cin del linfocito, la capacidad de reconocer al virus (me-
diante pruebas de proliferacin) y la capacidad de destruir
las clulas infectadas (con mtodos de citotoxicidad).
Pruebas de proliferacin
Los linfocitos de la sangre perifrica (LSP) en el medio de
cultivo se estimulan para proliferar por activadores externos
y mitgenos, como tohemaglutinina (PHA) o, de forma
ms especca, los antgenos vricos. Se requieren varios
das de incubacin, despus de la cual la proliferacin se
mide como la cantidad de timidina radiomarcada que se in-
corpor dentro del DNA en las ltimas horas, cuanticada
por el contador de centelleo lquido de cido precipitado,
y las clulas se lavan. Las pruebas comparan la respuesta
de los linfocitos T del paciente a un virus particular de los
controles sin estimular (negativo) o estimulados con PHA
(positivo). Los mtodos se realizan por lo menos por tripli-
cado y, cuando se llevan a cabo en diluciones seriadas de
LSP, se calcula el nmero de linfocitos T circulantes que
reconocen el antgeno del virus y la frecuencia de la clula
reactiva. Pueden determinarse los antgenos puricados in-
dividuales o los extractos ordinarios de la clula infectada.
Pruebas de citotoxicidad
Los ensayos de citotoxicidad se pueden realizar en una
variedad de poblaciones de leucocitos (clulas asesinas
dependientes de anticuerpo, clulas asesinas naturales
inespeccas, monocitos), pero es la respuesta citotxica
del linfocito T (CTL) la ms relevante en este contexto. Las
clulas se pueden enriquecer a partir de la fraccin de LSP
por procedimientos de adsorcin-elucin y los anticuerpos
monoclonales o la citometra de ujo. La prueba implica
otra vez cultivo de varios das para medir la actividad efec-
tora en las clulas blanco que contienen al virus. Las clu-
las blanco deben ser histocompatibles con los CTL de los
pacientes y pueden ser broblastos, linfocitos B, macrfa-
gos o clulas del tumor que expresan antgenos vricos, ya
sea despus de infeccin, transfeccin o pulsaciones con
pptidos vricos. La actividad de CTL se cuantica por la
emisin del cromo radiactivo de las clulas blanco marca-
das sobre un corto periodo al nal de la incubacin. Las
pruebas de cultivos replicados, habitualmente de los CTL
diluidos en serie, miden el nmero de las clulas efecto-
ras que destruyen a un porcentaje especco de un nmero
predeterminado de clulas blanco. El anlisis de datos es
complejo y es esencial un protocolo de la prueba bien con-
trolado, con metodologa estadstica apropiada. Los CTL
activos deben ser perceptibles en pacientes con infeccin
vrica aguda, persistente o reactivada.
Citometra de ujo
Desde el punto de vista tcnico, la medicin de los marca-
dores CD4 en la infeccin por HIV es una investigacin de
inmunocompetencia celular. La citometra de ujo se uti-
liza para medir los cocientes CD4:CD8 en individuos con
HIV para determinar la progresin o recuperacin inmu-
nitarias despus del tratamiento. En fecha ms reciente el
mtodo se ha utilizado para determinar la persistencia de la
inmunidad mediada por clulas despus de la vacunacin
del sarampin o la varicela. Los linfocitos del paciente se
incuban con el antgeno vrico por varios das y la expre-
sin subsiguiente del antgeno CD25 en la poblacin CD4
indica inmunidad persistente. Estos datos proporcionan
evidencia tranquilizadora para la ecacia de la vacunacin
de la varicela en los sujetos inmunocomprometidos.
En suma, los mtodos de proliferacin y citotoxici-
dad consumen tiempo, utilizan radiactividad, tienen todos
los problemas del mantenimiento de los mtodos inter-
nos ms complejos y requieren un suministro regular de
LSP frescos, con control de edad y sexo de los voluntarios.
Los mtodos controlados de manera correcta de citotoxi-
cidad deben vigilar la variacin diaria de los resultados de
los CTL de control, con alta y baja toxicidad criopreser-
vada. Los lmites normales se deben establecer a partir de
un grupo grande de voluntarios. Por lo tanto, las pruebas
se realizan en centros especializados, las ms de las veces
con propsitos de investigacin. Sin embargo, los pacien-
tes individuales con infecciones graves y recurrentes de
HSV, VZV o EBV requieren investigacin para revelar la
disfuncin exacta de la inmunidad celular, de tal modo que
puedan sugerirse y supervisarse las medidas teraputicas.
La citometra de ujo se utiliza para personas inmunocom-
prometidas, pero su alcance se limita por su costo y reque-
rimiento de equipo complejo y destreza interpretativa.
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Introduccin
De las 50 000 a 250 000 especies de hongos que se han
descrito, menos de 500 se identican como patgenos hu-
manos. Con pocas excepciones, estos microorganismos
se encuentran en el ambiente y las infecciones humanas se
adquieren a travs de inhalacin, ingestin o implantacin
traumtica. Las enfermedades micticas humanas pueden
dividirse en tres amplios grupos: superciales, subcutneas
o sistmicas.
Las micosis superciales son infecciones limitadas a las
capas exteriores de la piel, uas y pelo, adems de las mem-
branas mucosas. Las infecciones principales en este grupo
son la dermatotosis y la candidiasis. Los agentes etiolgi-
cos de estas enfermedades dependen del husped viviente
para su supervivencia, pero dieren uno de otro en la manera
por la cual se logra esto. Los agentes etiolgicos de la der-
matotosis (las especies de dermattos Epidermophyton,
Microsporum y Trichophyton) dependen de la propagacin
de una persona a otra para su supervivencia, mientras que los
agentes etiolgicos de la candidiasis, de los cuales Candida
albicans es la ms importante, son comensales normales del
aparato digestivo. Estos microorganismos no producen en-
fermedad a menos que un cambio en el husped atene sus
defensas naturales. En esta situacin, la infeccin endgena
da lugar a la infeccin supercial o sistmica.
Las micosis subcutneas son infecciones que afectan a
la dermis, los tejidos subcutneos y el hueso adyacente.
Entre las infecciones de este grupo se hallan la micosis por
el cromoblasto, el micetoma y la esporotricosis. Estas anor-
malidades son las ms comunes en las regiones tropicales y
subtropicales y se adquieren casi siempre como resultado
de la implantacin traumtica de los microorganismos que
se encuentran en el ambiente. La enfermedad puede con-
narse al sitio de la implantacin o extenderse al tejido blan-
do y el hueso adyacentes. Es rara una diseminacin ms
extensa de la infeccin, a travs de la sangre o los linfti-
cos, y ocurre casi siempre slo si el husped se encuentra
de alguna manera debilitado o inmunocomprometido.
Las micosis sistmicas son las infecciones que suelen
originarse en aparato respiratorio o digestivo, pero pueden
propagarse a muchos otros rganos. Los agentes que causan
estas anomalas pueden dividirse en dos grupos distintos:
los patgenos verdaderos y los oportunistas. El primero de
estos grupos consiste en una pequea cantidad de micro-
organismos, como los incluidos en la especie Histoplasma
capsulatum, que pueden invadir los tejidos de un husped
normal sin predisposicin reconocible. Adems de la histo-
plasmosis, las infecciones principales por miembros de este
grupo son blastomicosis, coccidioidomicosis y paracocci-
dioidomicosis. En muchos casos, estas infecciones son asin-
tomticas o leves y de corta duracin. Los individuos que
se recuperan de estos padecimientos gozan a menudo de
resistencia duradera a la reinfeccin, mientras que aquellos
con enfermedad crnica o residual tienden con frecuencia
a sufrir una enfermedad subyacente intensa.
El segundo grupo de hongos patgenos sistmicos, los
oportunistas, comprende a un grupo mucho ms grande
de microorganismos menos adaptables, como Aspergillus
fumigatus, que slo pueden invadir tejidos debilitados o in-
munocomprometidos del husped. Aparte de la aspergilo-
sis, las infecciones principales secundarias a los miembros
de este grupo son la candidiasis, criptococosis y mucormi-
cosis (zigomicosis). Con excepcin de la candidiasis, que
de manera habitual se adquiere a partir del reservorio end-
geno propio del individuo, la mayor parte de las infecciones
24
Micologa
David W Warnock
234 CAP. 24 MICOLOGA
micticas oportunistas se adquiere a partir del ambiente, no
tanto como resultado de la propagacin de persona a perso-
na. Estas infecciones se vinculan con altas tasas de morta-
lidad, pero se piensa que las estimaciones de su incidencia
son absolutamente conservadoras en comparacin con su
verdadera magnitud, dado que muchos casos no se diagnos-
tican o informan.
Como en el caso de otras infecciones microbianas, el
diagnstico de las infecciones micticas depende de una
combinacin entre la observacin clnica y la investigacin
de laboratorio. Las infecciones superciales y subcutneas
producen a menudo lesiones caractersticas que sugieren el
diagnstico, pero las pruebas de laboratorio son esenciales
cuando ste no es el caso porque los signos clnicos semejan
los de otras enfermedades o un tratamiento previo altera el
aspecto de las lesiones. En casi todas las situaciones en las
cuales la infeccin mictica sistmica se considera como
un diagnstico, la manifestacin clnica es inespecca y
puede deberse a una amplia gama de infecciones, enferme-
dades subyacentes o complicaciones del tratamiento.
El diagnstico acertado de laboratorio de las infeccio-
nes micticas depende en buena medida de la recoleccin
de especmenes adecuados para la investigacin. Tambin
guarda relacin con la seleccin de los procedimientos de
prueba microbiolgicos, serolgicos e histopatolgicos
apropiados. stos dieren de una enfermedad a otra y de-
penden del sitio de la infeccin, as como de los sntomas
presentados y los signos clnicos. La interpretacin de los
resultados de las investigaciones de laboratorio puede en
ocasiones establecerse con conanza, pero algunas veces
los resultados pueden ser intiles o incluso engaosos. En
estas circunstancias es esencial el enlace cercano entre el
clnico y el laboratorio.
Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de las
infecciones micticas se apoyan todava en tres amplias
tcnicas: deteccin microscpica del agente etiolgico en
el material clnico; aislamiento e identicacin en cultivo,
y deteccin de una reaccin serolgica del agente patgeno
o de algn otro marcador de su presencia, como un com-
ponente mictico de la clula o un producto metablico.
En la actualidad se desarrollan nuevos procedimientos de
diagnstico basados en la deteccin del DNA mictico en
material clnico, pero todava no han tenido un efecto de
importancia en los laboratorios clnicos. En las secciones
que siguen se revisan el valor y las limitaciones de los pro-
cedimientos de diagnstico actuales para las infecciones
micticas.
Examen microscpico
Por lo regular, el examen microscpico directo del mate-
rial clnico es til en el diagnstico de laboratorio de las
infecciones micticas. Diversos mtodos pueden utilizar-
se: se pueden observar preparaciones humedecidas sin te-
ir mediante iluminacin de campo claro, campo oscuro o
contraste de fase, o bien es posible teir y examinar frotis
secos. En algunos casos, el examen microscpico directo
hace posible establecer un diagnstico preliminar o de-
nitivo, mucho antes de que el crecimiento sea evidente en
el cultivo. En otros casos, la observacin de elementos mi-
cticos en un espcimen clnico es ms signicativa que
aislar el hongo en cultivo, sobre todo si el agente es un
contaminante comn.
Aunque las clulas micticas son ms grandes que
las bacterianas, estos microorganismos se encuentran a
menudo presentes en cantidades mucho ms pequeas en
los especmenes clnicos. Por esta razn es esencial aumen-
tar la concentracin de elementos micticos en un espci-
men antes de examinarlo. Los lquidos y las secreciones
deben centrifugarse y el sedimento conservarse para la in-
vestigacin micolgica. Otras muestras, como el esputo, se
deben digerir antes de la centrifugacin.
Figura 24-1 Frotis de lquido de drenado peritoneal teido con
Gram que muestra racimos de clulas de levadura y numerosas
clulas bacterianas mucho ms pequeas.
Existen varios mtodos para preparar los especmenes
para el examen microscpico directo. Los frotis teidos
con Gram son de uso frecuente para detectar clulas mi-
cticas en lquidos y secreciones (g. 24-1). La tinta de
la India es til para la tincin negativa del sedimento del
lquido cefalorraqudeo (LCR) y as revelar clulas en-
capsuladas de Cryptococcus neoformans. La tinciones de
Giemsa y Wright se pueden emplear para perlar las clulas
de Histoplasma capsulatum en preparaciones de la mdula
sea o frotis de sangre. La tincin de Papanicolaou se usa
en el esputo u otras muestras de las vas respiratorias para
reconocer elementos micticos.
Los raspados de piel y otros especmenes dermatolgi-
cos deben examinarse despus de la digestin con solucin
CULTIVO 235
de hidrxido de potasio al 10 a 20%, que aclara el espci-
men sin daar las clulas micticas. Estas muestras pueden
examinarse sin tincin, como preparacin hmeda (g. 24-2).
La adicin de abrillantadores qumicos, como el blanco de
calcoor, es til en la demostracin de elementos micti-
cos en preparaciones hmedas de stos y otros materiales
clnicos, como esputo, cuando se examinan bajo un micros-
copio de uorescencia. Los elementos micticos aparecen
en tonos brillantes teidos contra un fondo oscuro.
En ciertas situaciones, el examen microscpico directo de
lquidos u otro material clnico puede establecer el diagns-
tico de una infeccin mictica subcutnea o sistmica. Los
casos incluyen el reconocimiento de clulas encapsuladas de
Cryptococcus neoformans en LCR o clulas de Histoplasma
capsulatum en frotis de sangre perifrica. Empero, con ms
frecuencia, slo puede determinarse un diagnstico presun-
tivo de infeccin mictica profunda con base en el examen
microscpico. No obstante, esto puede ayudar a determinar
si un agente recuperado ms adelante en cultivo es un conta-
minante o un patgeno y puede ser de utilidad en la seleccin
de las condiciones ms apropiadas de cultivo para recuperar
los microorganismos visualizados en un frotis directo.
El examen histopatolgico de los cortes tisulares es uno
de los mtodos ms conables para establecer el diagnsti-
co de infecciones micticas subcutneas y sistmicas. Pese
a ello, la facilidad con la cual puede reconocerse un hongo
patgeno en tejido depende no slo de su abundancia, sino
tambin de la distincin de su aspecto. Muchos hongos se
tien de modo incorrecto con hematoxilina y eosina, un
mtodo que resulta insuciente para revelar elementos mi-
cticos en el tejido. Existe un buen nmero de tinciones
especiales para detectar y resaltar microorganismos mic-
ticos, entre ellas la metenamina-plata (Grocott o Gomori)
y el cido perydico de Schiff. El mucicarmn se puede
utilizar para teir la cpsula de Cryptococcus neoformans.
Estos mtodos de teido, aunque tiles para revelar la pre-
sencia de elementos micticos en tejidos, rara vez precisan el
gnero mictico exacto identicado. Por ejemplo, la detec-
cin de la hifa septada y ramicada sin tincin es tpica de la
infeccin por Aspergillus, pero es tambin caracterstica de
una gran cantidad de microorganismos menos comunes,
como las especies de Fusarium y Scedosporium. Asimismo,
el reconocimiento de clulas micticas pequeas en fases
tempranas permite slo de modo ocasional un diagnstico
especco. Las clulas que forman el tejido de Histoplasma
capsulatum y Blastomyces dermatitidis, por ejemplo, pue-
den parecer similares y se confunden muchas veces con las
clulas de Cryptococcus neoformans sin cpsula.
Para superar este problema se han desarrollado diversos
mtodos para la identicacin especca de microorganis-
mos micticos en tejido. La inmunoperoxidasa y los reac-
tivos inmunouorescentes de tincin, sea monoclonales o
policlonales, estn disponibles para algunos hongos y pueden
facilitar la identicacin de elementos micticos atpicos y
la deteccin de cantidades pequeas de microorganismos.
En la actualidad est bajo investigacin una serie de tcni-
cas que incluye la unin especca de las sondas del DNA
al cido nucleico del agente mictico directamente sobre el
portaobjetos (hibridacin in situ) o en un tubo de prueba.
Cultivo
El aislamiento en cultivo hace posible identicar a la ma-
yor parte de los hongos patgenos. Casi ninguno de estos
microorganismos es exigente en sus requerimientos nutri-
cionales y crece en los medios usados para el aislamiento
bacteriano a partir de especmenes clnicos. Sin embargo, el
crecimiento en estos medios puede ser lento y el desarrollo
Figura 24-2 Preparacin de la piel con hidrxido de potasio
sin teir que muestra la presencia de hifas de dermattos rami-
cantes, algunos de los cuales estn fragmentados en artrosporas.
Figura 24-3 Cultivo tpico de Aspergillus nidulans sobre el
agar-dextrosa de Sabouraud. Obsrvese el aspecto polvoriento de
la supercie colonial debido a la presencia de nmeros enormes
de esporas.
de las esporas y otras estructuras usadas en la identicacin
mictica puede ser deciente. Por estas razones, la mayo-
ra de los laboratorios utiliza un medio especco, como el
agar-dextrosa de Sabouraud, para aislar hongos (g. 24-3).
Muchos especmenes clnicos sometidos al cultivo mictico
se contaminan con bacterias y es esencial aadir antibiti-
cos antibacterianos a los medios de cultivo micticos. Si
se aslan hongos dermattos o dimorfos, la cicloheximida
(actidiona) tambin se debe agregar al medio para prevenir
el crecimiento excesivo de hongos que crecen ms rpido.
La temperatura ptima de crecimiento para los hongos
patgenos se aproxima a 30C. El material de pacientes con
sospecha de una infeccin supercial se debe incubar de 25
a 30C porque la mayor parte de los dermattos no crece a
temperaturas ms elevadas. El material de sitios subcut-
neos o profundos se debe incubar a dos temperaturas, 25 a
30C y 37C, porque varios hongos patgenos importantes,
entre ellos Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermati-
tidis y Sporothrix schenckii, son dimorfos y el cambio en su
forma de crecimiento, que depende de las condiciones de la
incubacin, es til en la identicacin. A 25 a 30C estos
microorganismos se desarrollan como mohos en el agar-
dextrosa de Sabouraud, pero a temperaturas ms altas sobre
un medio enriquecido (como la infusin de agar-cerebro-
corazn), estos microorganismos crecen como levaduras.
Algunos hongos patgenos crecen con lentitud y los
cultivos deben conservarse por lo menos dos semanas, y en
algn caso hasta cuatro semanas, antes de desecharse como
negativos. No obstante, muchos hongos patgenos comu-
nes, como las especies Aspergillus y Candida, producen
colonias identicables en un plazo de uno a tres das. Los
cultivos deben examinarse con regularidad (por lo menos
tres veces por semana) y se realizan los subcultivos apropia-
dos, en especial a partir de medios enriquecidos con sangre,
en los cuales a menudo los hongos no pueden esporular.
Es importante reconocer que el crecimiento de un agen-
te en cultivo no establece en todos los casos su papel como
patgeno. Slo si el microorganismo se identica como pa-
tgeno inequvoco, por ejemplo Trichophyton rubrum o
Histoplasma capsulatum, puede establecerse el diagnstico
con rmeza. Si, pese a ello, se recupera un agente opor-
tunista como Aspergillus fumigatus o Candida albicans, su
aislamiento puede carecer de relevancia clnica, a menos
que haya evidencia adicional de su participacin en un pro-
ceso patgeno. En esta situacin, los resultados del cultivo
deben compararse con los del examen microscpico. El ais-
lamiento de hongos patgenos oportunistas a partir de sitios
estriles, como sangre o LCR, proporciona muchas veces
evidencia conable de una infeccin grave, pero su aisla-
miento a partir de material como pus, esputo u orina se debe
interpretar con cautela. Debe prestarse atencin a la cantidad
de hongo aislada y solicitar investigaciones adicionales.
Muchos mohos desconocidos se han informado como
causales eventuales de la infeccin sistmica mortal en
pacientes inmunocomprometidos. Ningn aislado debe ex-
cluirse como un contaminante sin la consideracin cuidado-
sa de la afeccin clnica del sujeto, el sitio del aislamiento, el
mtodo de coleccin del espcimen, la cantidad de microor-
ganismos recuperados y la probabilidad de contaminacin.
Aunque el cultivo establece con frecuencia el diagnstico
denitivo de una infeccin mictica, tambin tiene algunas
limitaciones; la principal es la falla para recuperar el agente.
Esto puede deberse a la recoleccin inadecuada del espci-
men o el transporte tardo de las muestras. Los procedimien-
tos incorrectos del aislamiento o los periodos inadecuados
de incubacin son otros factores de consideracin.
Identicacin
Una vez aislados en cultivo, los mohos y los dermattos
(hongos lamentosos) se identican con base en sus carac-
tersticas morfolgicas macroscpicas (colonias) y micros-
cpicas. Las propiedades macroscpicas, como forma colo-
nial, color supercial y pigmentacin, son a menudo tiles
en la identicacin, pero es esencial examinar las prepa-
raciones en portaobjetos del cultivo bajo un microscopio.
Si estn bien preparadas, stas suministran casi siempre la
suciente informacin sobre la forma y la disposicin de
las esporas y las estructuras que posibilitan la esporulacin
para el reconocimiento del hongo (g. 24-4).
Figura 24-4 La tincin de lactofenol azul de algodn de Clado-
phialophora carrionii muestra las largas cadenas de ramicacin
tpicas de las esporas que identican a este microorganismo.
Dado que la identicacin es dependiente de la visuali-
zacin de las estructuras particulares que un microorganis-
mo produce cuando esporula, el reconocimiento depende
por lo regular de la capacidad del agente para esporular.
Los mohos crecen a menudo mejor en medios ricos, como
el agar-dextrosa de Sabouraud, pero la superproduccin del
micelio da lugar con frecuencia a la prdida de la esporu-
lacin. Si un aislado de mohos no puede producir esporas
despus de dos semanas, debe subcultivarse en un medio
menos rico para promover la esporulacin. El uso de los
mtodos de identicacin basados en DNA puede eliminar
en un futuro este requisito.
De manera habitual, las levaduras (hongos unicelulares
recientes) se identican a partir de sus caractersticas mor-
folgicas y bioqumicas. Las caractersticas morfolgicas
tiles incluyen el color de las colonias, el tamao y la for-
ma de las clulas, la presencia de una cpsula alrededor
de las clulas y la produccin de hifas o seudohifas. Las
pruebas bioqumicas tiles incluyen la asimilacin y la fer-
mentacin de azcares y la asimilacin de nitrato y urea.
La mayor parte de las levaduras vinculadas con infecciones
humanas puede identicarse mediante uno de los nume-
rosos sistemas comerciales de identicacin, como el API
20C AUX (bioMerieux-Vitek Inc., Hazelwood, MO), que
se basan en la asimilacin diferencial de varios compues-
tos de carbono. Sin embargo, es importante recordar que el
examen morfolgico de cultivos en la placa Dalmau sobre
agar de harina de maz es esencial para evitar la confu-
sin entre los microorganismos con perles bioqumicos
idnticos. Se han ideado varias pruebas rpidas simples
para la presunta identicacin de algunos de los agentes
patgenos humanos ms importantes. La principal de stas
es la prueba en tubo con suero de germen para Candida
albicans, que puede realizarse en menos de tres horas, y
la prueba de la ureasa para Cryptococcus neoformans. En
fecha reciente se desarroll un buen nmero de pruebas
comerciales rpidas, entre las que se incluyen el sistema
de RapID Yeast Plus (Innovative Diagnostic Systems, Nor-
cross, GA) que contiene los sustratos convencionales y cro-
mgenos y requiere cuatro horas para realizarse. La mayor
parte de estos sistemas de pruebas rpidas es ms exacta en
la identicacin de levaduras patgenas comunes, no tanto
de las raras.
En el pasado, los hongos dimorfos como Blastomyces
dermatitidis e Histoplasma capsulatum se identicaron al
observar la conversin del crecimiento miclico a 25C al
crecimiento como levadura a 37C. Empero, el desarrollo
de las pruebas basadas en sondas de DNA (Accuprobe,
GenProbe Inc., San Diego, CA) ha permitido identicar
estos agentes patgenos con tan slo una cantidad pequea
de material miclico.
Pruebas serolgicas
La comprobacin serolgica proporciona a menudo los
medios ms rpidos para diagnosticar una infeccin
mictica sistmica. Casi todas las pruebas se basan en la de-
teccin de anticuerpos contra hongos patgenos especcos,
aunque las pruebas para antgenos micticos muestran ahora
una amplia disponibilidad. Las pruebas serolgicas indivi-
duales pueden ser diagnsticas, como las pruebas de anti-
genemia en la criptococosis y la histoplasmosis. Pese a ello,
en general los resultados de la comprobacin serolgica son
rara vez ms que sugestivos o se inclinan por un diagnsti-
co mictico. Estas pruebas deben interpretarse con cautela y
considerarse junto con los resultados de otras investigacio-
nes clnicas y de laboratorio.
Las pruebas de anticuerpos han probado ser tiles en
diagnosticar infecciones, como la histoplasmosis y la coc-
cidioidomicosis, en personas inmunocompetentes. En estos
individuos, el intervalo entre la exposicin y el desarrollo
de los sntomas (dos a seis semanas) es casi siempre su-
ciente para que se desarrolle una reaccin humoral. Las
pruebas para los anticuerpos de Histoplasma capsulatum y
Coccidioides immitis son muy provechosas cuando se ob-
tienen especmenes de suero (agudo y convaleciente), al
grado que puede determinarse si los ttulos se incrementan
o disminuyen. Las pruebas de anticuerpos tambin tienen
un uso diagnstico establecido en las diferentes formas de
infeccin de Aspergillus que ocurren en individuos inmu-
nocompetentes. En contraste, estas pruebas rara vez son
provechosas para el diagnstico de aspergilosis invasiva en
personas inmunocomprometidas, muchas de las cuales son
incapaces de activar una respuesta humoral detectable a la
infeccin. Las pruebas para los anticuerpos contra Can-
dida se han evaluado de forma extensa, pero son todava
de utilidad limitada en el diagnstico de formas invasivas de
candidiasis. Estas pruebas se complican con resultados
falsos positivos en pacientes con la colonizacin mucosa
o infeccin supercial y con resultados falsos negativos
en individuos inmunocomprometidos.
La comprobacin de antgenos micticos en suero, LCR
u orina es un procedimiento establecido para el diagnstico
de la criptococosis y la histoplasmosis; en la actualidad se
evalan pruebas similares para aspergilosis y candidiasis.
La prueba LPA para el antgeno polisacrido capsular de
Cryptococcus neoformans es sensible y especca y arroja
resultados positivos con especmenes de suero y LCR en
ms de 90% de los pacientes infectados. Los ttulos altos o
ascendentes indican la progresin de la infeccin, mientras
que los ttulos descendentes sealan la regresin de la en-
fermedad y la buena respuesta al tratamiento. La deteccin
del antgeno en orina ha probado ser un mtodo til para
el diagnstico rpido de la histoplasmosis en los pacien-
tes que se presentan con enfermedad aguda, as como en
aquellos con la infeccin diseminada. En la enfermedad
aguda, el antgeno puede detectarse en orina dentro del
primer mes despus de la exposicin, antes que aparezcan
PRUEBAS SEROLGICAS 237
los anticuerpos. Se han desarrollado varios formatos de la
prueba, incluidos RIA y ELISA.
Las pruebas para la deteccin del antgeno tambin se
han evaluado con amplitud para el diagnstico rpido de
las formas invasivas de aspergilosis en individuos inmuno-
comprometidos. Se han comercializado dos pruebas para
detectar el galactomanan circulante, un componente impor-
tante de la pared celular de la especie Aspergillus. Ambas
utilizan el mismo anticuerpo monoclonal, o en un formato
LPA o ELISA tipo emparedado. La ltima prueba (Platelia
Aspergillus, Sano Diagnostics Pasteur, Pars, Francia) es
ms sensible que la primera (Pastorex Aspergillus, Sano
Diagnostics Pasteur) y puede detectar el galactomanan en
suero en una fase temprana de la infeccin.
Nuevas direcciones en el diagnstico
Los nuevos mtodos diagnsticos de infecciones micticas
invasivas incluyen la deteccin de las secuencias micti-
cas genmicas en especmenes clnicos. La mayor parte de
los mtodos de diagnstico que se han diseado se basa en
el uso de los formatos PCR convencionales, pero muchas
tcnicas modicadas tambin se han evaluado, incluidos
los mtodos PCR multiplex y PCR anidada. Varias regio-
nes dentro del genoma mictico se han evaluado como
blancos potenciales para la deteccin, pero gran parte del
esfuerzo se ha centrado en el complejo gen del DNA ri-
bosmico (rDNA). Esta seccin del genoma incluye las
regiones relativamente conservadas de los genes 18S, 5.8S
y 28S y regiones espaciadoras transcritas intervencionales
ms variables. Los ltimos desarrollos en el diagnstico
molecular mictico implican el uso de mtodos PCR en
tiempo real, en los cuales el termociclado se combina con
la vigilancia de la uorescencia del producto amplicado
durante su generacin. Estas tcnicas permiten la cuanti-
cacin de las cantidades de cido nucleico mictico pre-
sentes en especmenes clnicos, lo cual permite medir la
carga microbiana.
A pesar del reciente progreso, el objetivo de contar con
pruebas clnicas simples, rpidas y rentables en vas de
desarrollo para el diagnstico molecular de infecciones
micticas agudas peligrosas para la vida an est lejos de
alcanzarse. Aunque los numerosos laboratorios de inves-
tigacin ahora ofrecen procedimientos internos para la
deteccin molecular de la infeccin mictica a partir de es-
pecmenes de tejido o lquidos corporales, la sensibilidad,
la especicidad y el valor pronstico de estas pruebas no
siempre se han investigado a fondo. Debe esperarse que, en
el futuro, se demuestre la importancia de la vigilancia se-
riada de los antgenos micticos y las secuencias del cido
nucleico especcas micticas en sangre y otros lquidos
biolgicos y que las pruebas conables estn disponibles
para un grupo mucho ms amplio de laboratorios clnicos.
Campbell CK, Johnson EM, Philpot CM, Warnock DW. Identi-
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Chen SC, Halliday CL, Meyer W. A review of nucleic acid-
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Introduccin
En el contexto de este libro, la parasitologa de diagnstico
se puede denir como la demostracin de evidencia de mi-
croorganismos protozoarios o metazoarios que viven en los
seres humanos u otros animales (los huspedes). La evi-
dencia puede ser directa o indirecta. Los hallazgos directos
proceden del examen de las muestras del supuesto hus-
ped, como heces, orina, sangre y otros tejidos, en una fase
del parsito o en una porcin de ste. La evidencia indirec-
ta puede obtenerse tras demostrar reacciones inamatorias
caractersticas, productos del parsito o los anticuerpos es-
peccos en el supuesto husped. La demostracin directa
de una fase del parsito en una muestra del husped, por
ejemplo un huevo del helminto en una muestra de heces,
es casi siempre la evidencia indiscutible de infeccin, pero
siempre debe considerarse la posibilidad de la contamina-
cin del espcimen. A la inversa, un fracaso para demostrar
huevos en una muestra fecal no descarta en todos los casos
un diagnstico, ya que se requiere tiempo para que los pa-
rsitos maduren en sus huspedes y lleguen a la fase en la
que pueden observarse o el estadio del parsito puede es-
tar presente de forma escasa o intermitente en las muestras
examinadas. La evidencia indirecta de la infeccin, como
la demostracin de anticuerpos, debe tambin tratarse con
precaucin, sobre todo debido a la posibilidad de reaccio-
nes cruzadas con otros parsitos. Es por estas razones que
un conocimiento detallado de los ciclos vitales del parsi-
to, los modos de transmisin y los tiempos tomados para
que las diversas fases se completen son requisitos para de-
terminar el diagnstico. Es preciso este conocimiento para
decidir qu muestras se envan a examen y cules son las
ms apropiadas en relacin con el posible tiempo de expo-
sicin a la infeccin y las manifestaciones de la enferme-
dad, si se presenta.
La piedra angular de la mayor parte de la parasitologa
de diagnstico se basa en la morfologa y parmetros mor-
fomtricos. En consecuencia, aunque en trminos microbio-
lgicos los estadios de transmisibilidad (es decir, huevos,
quistes, ooquistes o larvas) tienden a ser relativamente gran-
des (en el orden de decenas a centenares de micrones [m]),
el convencional microscopio de transmisin es todava la
herramienta diagnstica ms importante. De modo similar,
aunque la mayor parte de los gusanos adultos y casi todos
los parsitos artrpodos (o vectores) son macroscpicos,
casi siempre se requiere la microscopia para detectar las ca-
ractersticas morfolgicas, a menudo sutiles, necesarias
para la identicacin de la especie. En este ltimo caso, tie-
ne mayor utilidad el estereomicroscopio de bajo aumento.
Microscopia
El convencional microscopio de luz transmitida, que pro-
porciona magnicaciones totales de 100, 400 y 1 000 , es
el instrumento bsico de los parasitlogos. Dado que es muy
importante una medicin exacta del tamao de los quistes
del protozoario, los ooquistes y los huevos del helminto, es
esencial disponer de una escala grabada del ocular calibra-
do con precisin. La microscopia de luz transmitida exige
que el espcimen sea lo sucientemente transparente para
permitir que la luz pase a travs de l y que proporcione la
denicin adecuada de la morfologa. Esto signica que las
muestras tienen que ser nas, en el orden de micrones, y
cuando son relativamente opacas deben adquirir transparen-
cia mediante agentes claricadores. Cuando los parsitos
25
Parasitologa
Robert WA Girdwood
240 CAP. 25 PARASITOLOGA
tienen por s mismos un ndice de refraccin similar al de la
muestra que los contiene, requieren una tincin diferencial,
de tal modo que los colorantes usados se capten de manera
preferencial por los parsitos. Con menos frecuencia, los
tejidos o el medio circundante pueden teirse y los parsitos
contenidos permanecen sin teir: sta es la tincin negativa.
Un mtodo alternativo consiste en utilizar diferentes siste-
mas de iluminacin como la microscopia de campo oscuro,
la de contraste de fases o la de contraste de interferencia
diferenciada (Nomarski).
Montajes hmedos
En parasitologa, lo ms frecuente para examinar la mues-
tra es el montaje hmedo, en el cual unas cuantas gotas del
espcimen o una suspensin de ste se colocan sobre un
portaobjetos del microscopio, se cubren con un cubreobje-
tos y se examinan a amplicaciones totales de 100 y 400.
Los detalles especcos de la preparacin del espcimen
dependen del nmero de parsitos probables en la mues-
tra en relacin con la presencia de material contaminante u
oscurecedor. Por consiguiente, mientras que pueda ser til el
examen directo de gotas sin concentrar de sangre u orina o
suspensiones salinas de heces, casi siempre es necesaria la
concentracin de la muestra porque el parsito se halla en
cantidades pequeas respecto del volumen del espcimen
que se requiere examinar. Los lquidos transparentes, como
la orina, pueden analizarse por centrifugacin y examen
de un montaje hmedo del sedimento resuspendido o l-
tracin y examen similar del sedimento. El material fecal
representa un problema ms complejo dado que los escasos
parsitos pueden estar presentes en una masa de detritos
opaca y oscurecida. Se emplean tcnicas de concentracin
selectiva, en las cuales los huevos, quistes y ooquistes del
parsito se concentran y se separan del detrito fecal, o
viceversa (g. 25-1). Tales tcnicas utilizan la otacin o
centrifugacin, en las cuales se explotan las diferencias en-
tre las densidades de los estadios del parsito y el detrito
contaminante mediante varios medios de suspensin de di-
ferentes densidades especcas. Segn sea la tcnica usada,
la muestra concentrada limpia para examinar al micros-
copio se obtiene a partir del sedimento centrifugado, es de-
cir, la interfaz entre los medios en suspensin de diferentes
densidades especcas y el menisco supercial otante.
Ejemplos de estas tcnicas incluyen la otacin/centrifu-
gacin diferencial en formol ter de Ridley, la concentra-
cin del gradiente de sucrosa y la otacin de sulfato de
zinc. Los mismos principios se utilizan para la deteccin
de quistes, ooquistes y huevos del parsito en muestras am-
bientales, como agua, suelo, lodo y aguas residuales. En di-
chas muestras los parsitos son a menudo ms escasos y se
utilizan ahora tcnicas de concentracin adicionales, como
anticuerpos antiparasitarios ligados a partculas magneti-
zadas.
Los parsitos en la circulacin sangunea estn presentes
en concentracin baja y, de nueva cuenta, se emplean las
tcnicas que incluyen la concentracin de parsitos y per-
miten el examen de volmenes ms grandes de sangre. En
consecuencia, la deteccin de la microlaria, que tiende a
ser muy escasa aunque es relativamente grande (200 a 300
m), exige cualesquiera de estas tcnicas: a) la ltracin de
un volumen grande de sangre anticoagulada a travs de un
ltro de membrana que retiene a las microlarias y permite
que pasen componentes celulares ms pequeos de la san-
gre, con tincin, aclaracin y microscopia subsecuentes del
ltro, o b) lisis de los eritrocitos en un volumen grande de
sangre (cerca de 5 ml) y la sedimentacin de cualquier mi-
crolaria contenida, que se examinan en un montaje hme-
do del sedimento resuspendido.
Extendidos y frotis
Los extendidos y frotis se utilizan con amplitud para detec-
tar parsitos en muestras de sangre, mdula sea y heces.
Las muestras de sangre para la identicacin de parsitos
protozoarios, como los del paludismo y tripanosomas, se
examinan por lo general en la forma de extendidos nos o
gruesos teidos con tincin de Romanowsky (g. 25-2). Los
extendidos nos de sangre, del grosor de una clula, se jan
antes de teirse y, debido a ello, conservan la morfologa de
los eritrocitos as como, en el caso del paludismo, los par-
sitos intracelulares contenidos. Con los extendidos gruesos
los eritrocitos se lisan antes de teirse y jarse; de ese modo,
la preparacin nal revela slo leucocitos, plaquetas y par-
sitos. La ventaja de la pelcula gruesa es que puede exami-
narse ms material, pero son desventajas la imposibilidad
de reconocer los cambios morfolgicos importantes en los
Figura 25-1 Huevo de una especie de Taenia. Suspensin fecal
concentrada en formol ter (400 ).
MICROSCOPIA ELECTRNICA 241
eritrocitos que produce el parsito del paludismo y que los
parsitos se pueden confundir con plaquetas y viceversa.
Los frotis de mdula sea teidos con una tincin de Ro-
manowsky se usan para identicar Leishmania spp. intra-
celulares.
Se requieren frotis jados y teidos para la deteccin
de los trofozotos del protozoario en heces. Dichas tcni-
cas son indispensables porque se requieren la rotura de los
trofozotos en material sin jar y la visualizacin de los de-
talles nos de la estructura nuclear y las inclusiones
intracitoplsmicas para la identicacin de las especies de
amebas. La hematoxilina frrica, las tinciones tricrmicas
y el Giemsa se emplean en extenso para estos propsitos.
Adems, los frotis fecales teidos se utilizan para recono-
cer ooquistes de Cryptosporidium spp. y esporas de mi-
crosporidios.
Con menos frecuencia, los frotis de impresin teidos
de biopsia tisular o material de necropsia se emplean para
diagnosticar infecciones por Leishmania spp.
Histopatologa
Las secciones tisulares convencionales pueden propor-
cionar informacin diagnstica al parasitlogo o revelar
reacciones caractersticas del tejido para la infeccin o la
demostracin del parsito (protozoario) o cortes del parsi-
to (metazoario). De nueva cuenta, la micrometra es impor-
tante y, en el contexto del examen de cortes histolgicos de
gusanos y sus huevos, es preciso el conocimiento adecuado
por la contraccin debida a la jacin y las dimensiones
alteradas si los cortes son adems distintos de los trans-
versales o sagitales. Con frecuencia se emplean tinciones
especiales para acentuar ciertos componentes de las sec-
ciones del parsito, pero la descripcin de su uso rebasa los
alcances de este captulo.
Fluorescencia
La capacidad de los materiales de emitir luminosidad cuan-
do se observan con luz ultravioleta se emplea en la para-
sitologa diagnstica de tres maneras: autouorescencia,
tincin con uorocromo y marcado con uorocromo. La
autouorescencia se reere a la caracterstica intrnseca
del microorganismo o un componente de ste para emitir
luz uorescente y lo ejemplica el aspecto azulado de los
ooquistes de Cyclospora spp. cuando se observan en mon-
tajes hmedos sin tincin bajo luz ultravioleta. La tincin
con uorocromo se reere a una tincin directa del micro-
organismo o un componente de ste con el uorocromo. La
uorescencia verde manzana que producen los ooquistes
de Cryptosporidium spp. cuando se tien con el fenol de
auramina es un ejemplo de este mtodo. El marcado con
uorocromo incluye casi siempre mtodos inmunolgicos,
en los cuales los anticuerpos (policlonales o monoclonales)
especcos del parsito se conjugan con un uorocromo,
como el isotiocianato de uorescena, y se utilizan para
acentuar la detectabilidad de los parsitos en el material
clnico. El xito de esta tcnica depende en gran parte de
la especicidad del anticuerpo usado para unir la marca
uorescente al parsito. Ejemplos de ensayos tiles inclu-
yen la deteccin de quistes de Giardia duodenalis estruc-
turalmente daados en muestras fecales y la deteccin de
trofozotos de Entamoeba histolytica en cortes o abscesos
tisulares. Los mtodos indirectos, que utilizan microscopia
uorescente y el parsito especco como sustrato jado
para detectar anticuerpos en suero, se describen de modo
sinptico en la seccin de serologa ms adelante. La in-
corporacin o la exclusin de uorocromos se postula cada
vez ms como mtodo sustituto para determinar la viabili-
dad y, por lo tanto, la contagiosidad potencial de los quistes
o los ooquistes aislados a partir de muestras ambientales.
Por consiguiente, la exclusin del yoduro de propidio y
la inclusin de 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) por los
ooquistes de Cryptosporidium spp. se hallan bajo evalua-
cin actual.
A excepcin de las infecciones por microsporidios, la
microscopia electrnica ocupa un lugar discreto en la pa-
rasitologa diagnstica. Aunque se han desarrollado pro-
cedimientos de diagnstico alternativos, la microscopia
electrnica de transmisin de heces, biopsias intestinales
y otros tejidos es la tcnica denitiva, aunque algo incon-
veniente, para diagnosticar infecciones con estos micro-
organismos, sobre todo porque son pequeos (1 a 2 m),
intracelulares y se tien de modo deciente.
Figura 25-2 Tripomastigotos de Trypanosoma rhodesiense. Fro-
tis de sangre delgada teida con Romanowsky (400 ).
Cultivo
Una forma muy bsica de cultivo se emplea para el diagnsti-
co y especiacin de larvas de nematodo, como las uncinarias
y Strongyloides spp. Mientras que las larvas de Strongyloides
se evacuan en las heces del husped y los huevos casi nun-
ca estn presentes, lo contrario es vlido para las uncinarias
Ancylostoma duodenale y Necator americanus, en los cuales
los huevos slo se eliminan en heces frescas. Como los hue-
vos de los dos ltimos son indistinguibles desde el punto de
vista morfolgico, para efectuar la especiacin basta crear las
condiciones en las cuales el huevo se incube y se desarrolle
en larvas de tercer estadio. Adems, la motilidad de las lar-
vas de las tres especies se utiliza para facilitar la recoleccin.
Esto es en particular til en el diagnstico de la estrongiloi-
diosis, en la cual las larvas presentes en heces pueden ser
escasas y no se concentran bien cuando se aplican tcnicas
convencionales, como la de ter formol. Las condiciones que
pertenecen a la transmisin natural de estos parsitos se re-
construyen con la tcnica de Harada-Muri (o una similar).
En sta, el material fecal se frota sobre tiras de papel ltro,
cuyos extremos inferiores se suspenden en un pozo con agua
destilada contenido en tubos de prueba sellados y se incuba
a 28C por alrededor de 10 das. Bajo estas condiciones, las
larvas de uncinarias incubadas y las de Strongyloides migran
hacia abajo del papel ltro para recolectarse en el agua. Las
larvas se clasican entonces por especie y se reconocen las
diferencias morfolgicas. Debe observarse que ninguna r-
plica de los parsitos ocurre en esta tcnica de cultivo.
El cultivo in vitro de material clnico para propsitos de
diagnstico se utiliza relativamente poco en parasitologa
en comparacin con otras disciplinas microbianas. Esto se
debe a que los protozoarios y metazoarios tienen reque-
rimientos metablicos ms complejos; stos, en la mayor
parte de casos, no pueden reunirse en sistemas de cultivo in
vitro actuales. Sin embargo, los mtodos de cultivo repli-
cativos nicos tienen un papel limitado en la parasitologa
diagnstica, en la que se emplean mtodos alternativos,
con otras limitaciones. Por lo tanto, el sistema de cultivo
de Robinson para el aislamiento de Entamoeba histolyti-
ca como una tcnica de diagnstico es bastante incmoda
e insensible, pero ofrece la ventaja, cuando es exitosa, de
producir los trofozotos para el anlisis de la isoenzima.
La determinacin cimodmica de aislados puede distin-
guir entre las cepas patgenas y las no patgenas. De igual
modo, el cultivo in vitro del material de la biopsia se utili-
za de modo amplio en el diagnstico de la leishmaniosis,
cutnea y visceral, muchas veces como un adjunto para la
microscopia directa de una porcin convenientemente tei-
da del mismo material. La ventaja de la microscopia radica
en que es rpida y, si es positiva, diagnstica, aunque esto
se atena por la habitual escasez de parsitos. El cultivo es
relativamente lento das a semanas pero tiene la venta-
ja, cuando es positivo, de producir microorganismos viables
que pueden someterse a especiacin por anlisis molecular,
serolgico o enzimtico y, adems, se puede utilizar para la
comprobacin de la susceptibilidad a los frmacos. Debe
acentuarse otra vez que los resultados negativos del cultivo
no excluyen el diagnstico.
Cada vez ms, con la complejidad creciente de las tc-
nicas de cultivo in vitro, los parsitos se propagan en cul-
tivo axnico de tal forma que los parsitos, las fracciones
preparadas de ellos o sus productos metablicos pueden
recolectarse, puricarse y caracterizarse para el uso en pro-
cedimientos diagnsticos inmunolgicos. Dos ejemplos
bsicos del uso de los mtodos de cultivo para propsitos
inmunodiagnsticos son: primero, cultivo in vitro de los tro-
fozotos de Entamoeba histolytica, que se recolectan, se
adhieren a los portaobjetos del microscopio y se usan como
antgeno en la prueba indirecta del anticuerpo uorescente
para la amebiosis; segundo, el mantenimiento de las larvas
incubadas de Toxocara canis de segundo estadio in vitro
y la recoleccin, concentracin y estandarizacin de los
productos excretorios/secretorios que producen para el uso
como antgenos en una prueba de ELISA para la deteccin
de los anticuerpos circulantes de Toxocara.
Infeccin animal
La inoculacin o suministro de material clnico dentro de
especies susceptibles de animales experimentales mante-
nidos en laboratorio fue alguna vez el apoyo principal de
todas las disciplinas de la microbiologa diagnstica. El
diagnstico se estableca mediante el sacricio de anima-
les, despus de un periodo apropiado de incubacin, y la
demostracin del microorganismo o la enfermedad carac-
terstica que produca en los rganos o tejidos mediante tc-
nicas microscpicas e histolgicas convencionales. Cada
vez ms se utilizan mtodos alternativos de diagnstico,
pero todava se requieren animales, ya sea para el manteni-
miento de los parsitos para usarse como antgenos, cuan-
do no hay tcnicas de cultivo in vitro disponibles, o para
la produccin de anticuerpos antiparsitos usados en las
pruebas de diagnstico. Parece probable que en el caso an-
terior el uso de los antgenos constructivos o el desarrollo
de tcnicas de cultivo tisular reduzcan ms este requisito;
por ejemplo, el cultivo celular continuo para la produccin
de T. gondii reemplaz al cultivo animal.
Xenodiagnstico
Este mtodo inusual se halla entre el cultivo y la inocu-
lacin animal y utiliza un vector natural o un husped
intermedio en el ciclo vital del parsito para concentrar-
lo y de ese modo hacerlo ms detectable. El ejemplo t-
pico del xenodiagnstico emplea uno de los vectores del
insecto Trypanosoma cruzi para facilitar el diagnstico de
la enfermedad de Chagas (tripanosomiosis sudamericana).
Las ninfas (libres de parsitos) criadas en laboratorio de los
insectos redvidos se habilitan para que se alimenten sobre
el paciente y se sacrican algunas cuatro semanas despus.
Los contenidos del intestino posterior se exprimen, tien
y examinan al microscopio en busca de tripomastigotos.
Este ejemplo casi nico de xenodiagnstico reconoce que
los parsitos son en extremo escasos en la sangre perifrica
del husped y que los insectos redvidos son vectores muy
ecientes.
Serologa
El serodiagnstico es menos conable que los mtodos mi-
croscpicos ms directos debido a los problemas de reac-
tividad cruzada (escasa especicidad), sensibilidad baja y,
con frecuencia, incapacidad para distinguir entre infeccio-
nes pasadas y actuales. De los tres grupos principales de
mtodos serolgicos, es decir, la deteccin del anticuerpo,
deteccin del antgeno y deteccin de complejos inmunita-
rios, la primera es la ms utilizada para el diagnstico. En
condiciones normales, dichas tcnicas serolgicas se em-
plean cuando el material para el examen directo en busca
de parsitos no est disponible. Por lo tanto, las pruebas
serolgicas para el diagnstico de parsitos intestinales
casi nunca se recomiendan, ya que el diagnstico espec-
co mediante demostracin de huevos o quistes en las heces
sera el mtodo elegido. Por el contrario, en enfermedades
parasitarias invasivas del tejido, como equinococosis, toxo-
plasmosis o toxocariosis, la demostracin de anticuerpos
circulantes puede ser ms productiva que el examen de la
biopsia tisular. La interpretacin de los resultados serol-
gicos en relacin con la fase de la enfermedad (aguda o
crnica) producida por el parsito puede mejorarse si se
determina la clase y el isotipo de la inmunoglobulina in-
cluidos en la respuesta del anticuerpo. Algunas veces se
puede lograr mayor sensibilidad y especicidad de la prue-
ba mediante inmunoblotting. De forma similar, una me-
jor caracterizacin de las preparaciones del antgeno, por
ejemplo mediante anticuerpos monoclonales, puede lograr
el mismo objetivo. Debido a que los anticuerpos pueden
persistir por aos luego de la infeccin y el tratamiento
exitoso, la deteccin del antgeno del parsito en material
clnico es, en teora, ms atractiva porque la presencia del
antgeno debe indicar una infeccin actual o muy recien-
te. Los ejemplos del valor de este acercamiento son los
siguientes: a) uso de la tcnica ELISA para reconocer el
antgeno de la laria en suero, orina y lquido de hidrocele
de pacientes con infecciones por Wuchereria bancrofti (en
la cual la microlaria es difcil de demostrar en la sangre
perifrica en los estados crnicos), y b) en el suero y la
orina de individuos con infecciones por Onchocerca vol-
vulus. Una ventaja adicional potencial de la deteccin del
antgeno es que la cuanticacin del antgeno circulante o
excretado puede correlacionarse con la carga del gusano
y, por extrapolacin, con los sntomas y la transmisibili-
dad. La deteccin de complejos inmunitarios no es todava
especca lo suciente para propsitos diagnsticos, pero
la disociacin de estos complejos para detectar los com-
ponentes del antgeno o el anticuerpo es una tcnica ms
satisfactoria.
Mtodos moleculares
El uso de sondas de DNA y la tcnica PCR proliferaron
en todos los campos de la microbiologa en los ltimos 20
aos. En tanto que esto es verdad en la investigacin pa-
rasitolgica, en la cual predominan ahora dichas tcnicas,
en los campos de la parasitologa diagnstica el papel de
los mtodos moleculares sigue restringido an. La venta-
ja principal de los mtodos de deteccin basados en los
cidos nucleicos es su sensibilidad. En consecuencia, en
el diagnstico esto ocurre slo cuando la carga del par-
sito es baja y estas tcnicas pueden mejorar las pruebas
ms convencionales. La tripanosomiosis sudamericana es
un buen ejemplo; en la fase crnica de esta afeccin, las
parasitemias estn tan bajas que se hallan fuera del lmite
de deteccin por mtodos microscpicos convencionales
(vase antes la seccin Xenodiagnstico). Tambin en esta
enfermedad, debido a su carcter endmico, el serodiag-
nstico no slo carece de especicidad, sino que tampoco
puede distinguir entre la infeccin pasada o presente y el
estado actual de la enfermedad. De manera especca, una
secuencia de minirrepeticin conservada de los minicrcu-
los del DNA del cinetoplasto usados como sonda, seguida
por la amplicacin PCR, ha demostrado ms sensibilidad
y especicidad que la microscopia, el serodiagnstico o la
serologa. Los mtodos moleculares pueden ser tambin
valiosos con nes diagnsticos si los mtodos ms con-
vencionales estn comprometidos por los cambios en el
husped. Un primer ejemplo es el problema de diagnos-
ticar toxoplamosis en el husped inmunocomprometido.
Toxoplasma gondii tiene una distribucin mundial, con una
alta incidencia de infeccin subclnica. Por lo general, el
diagnstico de infecciones pasadas o presentes se deter-
mina tras probar varias clases de anticuerpos especcos.
En el husped inmunocomprometido, la infeccin latente
puede progresar a la enfermedad potencialmente mortal y,
MTODOS MOLECULARES 243
en virtud de la deciencia inmunitaria, el serodiagnstico
es intil. Los mtodos de PCR que se dirigen a los genes
B1 o P30 se han aplicado al lquido amnitico y por lo tan-
to el diagnstico de la infeccin fetal se puede establecer
sin fetoscopia.
La produccin del antgeno, por hibridacin o la tec-
nologa de DNA recombinante, ha proporcionado reacti-
vos de diagnstico especcos y sensibles tal vez tiles, y
el uso de tcnicas moleculares para detectar vectores
transportadores de parsitos es otro ejemplo de las posibi-
lidades de la investigacin molecular. Sin embargo, el en-
tusiasmo por el potencial de tales tcnicas debe moderarse
por el conocimiento de las desventajas del costo relativo
y los problemas de resultados falsos positivos debido a la
contaminacin de las muestras.
Los procedimientos de diagnstico principales con al-
gunas de sus ventajas y desventajas se resumen en el cua-
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Gillespie SH, Hawkey PM (eds). Medical ParasitologyA Prac-
tical Approach. 1995: Oxford University Press, Oxford.
Kettle DS (ed). Medical and Veterinary Entomology. 1995: CAB
International, Wallingford.
Cuadro 25-1 Algunas ventajas y desventajas de los mtodos principales usados en la parasitologa diagnstica
Mtodo Ventajas Desventajas
Microscopia Rpida (para espcimen individual) Requiere un microscopista experimentado
Visualizacin directa del parsito Requiere parsitos relativamente numerosos,
Resultado positivo casi siempre denitivo es decir, que el resultado negativo no excluya
el diagnstico
Lenta por la exploracin masiva
Cultivo in vitro Detecta parsitos slo viables Lento
Proporciona aislados adems de la caracterizacin, Slo disponible para un nmero limitado
comprobacin de la sensibilidad y preparacin de especies/cepas
del antgeno El cultivo negativo no excluye el diagnstico
Infeccin animal Como el anterior Como el anterior
Costoso
Serologa Simple Escasez de reactivos estndar (antgenos)
Rpida Difcil diferenciar entre infecciones pasadas
Puede usarse para la exploracin masiva y presentes
Resultados falsos positivos debido a la
reactividad cruzada
Xenodiagnstico Simple Sensibilidad baja
Barata Aplicacin muy limitada
Especca Lenta
Incmoda?
Mtodos moleculares Rpida Costosa
Sensible Detecta parsitos vivos y muertos
Puede detectar parsitos vivos y muertos Falsos negativos por inhibidores de PCR
Deteccin directa del parsito Falsos positivos por contaminacin
SECCIN 5
HEMATOLOGA
Morfologa de la sangre perifrica
La morfologa de la clula es una parte esencial de cual-
quier investigacin hematolgica, y se valora mejor con el
examen de una pelcula extendida, bien teida. Una pelcula
sangunea puede formarse a partir de sangre no anticoagula-
da (natural), que se obtiene de una vena o de un vaso capilar,
o de sangre anticoagulada con EDTA. Un frotis de sangre
bien hecho se extiende de manera uniforme y tiene un borde
torneado en lengeta. Despus, el frotis debe secarse rpido
al aire y jarse en metanol puro por 10 a 20 minutos.
Tincin
Una vez que se jan todos los frotis de sangre deben teirse
en seguida. Los frotis de sangre y de mdula sea se tien
con colorante Romanowsky, una mezcla de azul de meti-
leno y de eosina. El primero tie los componentes cidos,
por ejemplo, los ncleos y el RNA citoplsmico de azul,
mientras la eosina tie los componentes bsicos, como la
hemoglobina, de rojo. La tincin popular Romanowsky es
conocida como May-Gruenewald-Giesma. En ciertas si-
tuaciones, p. ej., en la diferenciacin de los diversos tipos
de leucemias, se usan tinciones especiales (cuadro 26-5).
Tcnica para examinar un frotis sanguneo
(un extendido)
Las pelculas deben examinarse primero en bajo aumento,
para tener idea de la calidad de la preparacin, del nme-
ro, distribucin y tincin de eritrocitos, de leucocitos y de
plaquetas. La visualizacin a bajo aumento tambin es ms
adecuada para detectar la presencia de precipitados y de
aglutinacin anormales. Una vez que la observacin a bajo
aumento es satisfactoria, un rea adecuada de la pelcula se
examina detalladamente a gran aumento o se usa un objeti-
vo de inmersin en aceite.
Morfologa del eritrocito
Cuando son saludables, los eritrocitos varan poco de ta-
mao y forma. La mayor parte son redondos y lisos y de
un dimetro dentro de un rango estrecho (la media es 2
DE) de 6.0 a 8.5 m con una palidez central. Si durante
el examen de una pelcula los eritrocitos se aprecian bien
separados y no se tocan unos a otros, menos de 10% de s-
tos deben tener una forma oval. Un porcentaje muy peque-
o (menos de 0.1%) puede contraerse o fragmentarse. En
lactantes prematuros y normales esta proporcin suele ser
ms alta (de 0.3 a 5.6%) (para la morfologa de la sangre
perifrica normal, vase g. 26-1).
26
Morfologa de las clulas sanguneas
y de la mdula sea
Supratik Basu
Figura 26-1 Frotis de sangre perifrica normal que muestra
neutrlos, linfocitos, monocitos.
248 CAP. 26 MORFOLOGA DE LAS CLULAS SANGUNEAS Y DE LA MDULA SEA
Cuadro 26-1 Alteraciones del eritrocito
Terminologa Qu signica Condiciones asociadas
Anisocitosis Variacin ms grande de lo normal Caractersticas no especcas. Pronunciada en anemia
en el tamao grave
Anisocroma Poblacin doble de clulas. Algunos Deciencia de hierro en pacientes tratados o transfundidos.
eritrocitos adquieren un tono plido Deciencia hematnica combinada
Acantocitosis Clulas pequeas con proyecciones Posesplenectoma (hiposplnica), fenotipo
espiculares regulares, mltiples McLeod, - lipoproteinemia, inanicin
Autoaglutinacin Agrupamiento irregular de eritrocitos Enfermedades de la aglutinina fra, anemia hemoltica
(g. 26-2) autoinmunitaria
Punteado basoflico Inclusiones pequeas de azul profundo en Envenenamiento con plomo, deciencia de pirimidina 5
(g. 26-3) el eritrocito. Se ven mejor con el objetivo nucleotidasa, mielodisplasia, anemia megaloblstica,
de inmersin en aceite enfermedad de la hemoglobina inestable, talasemia
Clulas crenadas eritrocitos mostrando proyecciones romas Artefacto, hipotiroidismo, vejez, falla renal
con espacios uniformes
Eliptocitosis Clulas elpticas u ovales Anemia megaloblstica, deciencia de hierro,
mielobrosis, eliptocitosis/ovalocitosis hereditaria
Cuerpos de Howell Teidos oscuros, inclusin como punto Hipoesplenismo de cualquier causa, anemia
Jolly (g. 26-4) dentro de las clulas (remanente nuclear) megaloblstica
Hipocroma Eritrocitos plidos (MCH <27 pg) Anemia por deciencia de hierro, talasemia, anemia
(g. 26-5) sideroblstica
Macrocitosis Clulas grandes (MCV >100 ) Anemia megaloblstica, mielodisplasia, hipotiroidismo,
(g. 26-6) anemia aplsica, enfermedad del hgado
Microcitosis Clulas pequeas (MCV <75 ) Vense hipocroma
(g. 26-5)
Eritrocitos nucleados Presencia de eritrocitos con ncleo Cualquier anemia grave, mielobrosis, hemlisis grave,
(g. 26-7) talasemia (posesplenectoma), inltracin de mdula.
Normal en sangre del cordn, se encuentran en gran
nmero en la enfermedad hemoltica del recin nacido
Poiquilocitos Eritrocitos con forma anormal Cualquier anemia, especialmente relacionada con
eritropoyesis anormal, por ejemplo, talasemia, mielobrosis
Policromasia Presencia de eritrocitos teidos de gris Hemlisis, prdida de sangre, eritropoyesis extramedular
azulado. stos son reticulocitos
Rouleaux Hacinamiento de eritrocitos en columnas Cierto grado es normal, mieloma, macroglobulinemia,
(g. 26-8) infeccin crnica e inamacin
Esquistocito Eritrocitos fragmentados DIC, carcinoma, anemia hemoltica microangioptica
(g. 26-9) (MAHA)
Clula falciforme Clulas delgadas, en forma de media luna Enfermedades de clulas falciformes
(g. 26-10) elongada
Esferocitos Clulas pequeas tensas y densas, sin palidez Esferocitosis hereditaria, enfermedad hemoltica del
(g. 26-7) central recin nacido ABO, anemia hemoltica autoinmunitaria
Clula en espuela Clulas con proyecciones irregulares, aladas Enfermedad del hgado, deciencia de piruvato cinasa
Estomatocitos Clulas con una rendija parecida a una boca Estomatocitosis hereditaria, alcoholismo, artefacto
en el centro
Clulas diana Eritrocitos con un rea central de coloracin Hemoglobinopatas, por ejemplo, HbCC, enfermedad del
(g. 26-11) densa y anormal, borde de hemoglobina en hgado SC
la periferia, con un anillo claro entre estos dos
Clula en forma Autoexplicatoria (tipo de poiquilocitosis) Mielobrosis, talasemia
de lgrima
(g. 26-12)
Anormalidades de la morfologa del eritrocito
No es posible una descripcin completa de todas las varia-
ciones normales y de las anormalidades en este captulo (los
detalles morfolgicos deben consultarse en un atlas). Algu-
nas alteraciones comunes que afectan a los eritrocitos con
sus desrdenes relacionados se listan en el cuadro 26-1.
Morfologa del leucocito
Los leucocitos normales de la sangre perifrica se clasi-
can como leucocitos polimorfonucleares y clulas mono-
nucleares. El ltimo trmino se reere a los linfocitos y
monocitos. En un frotis (extendido) de sangre los monoci-
tos y los neutrlos se concentran en el borde y al nal de
sta. La informacin vital se obtiene explorando en la pel-
cula para evaluar la morfologa celular y las alteraciones en
nmero en una ampliacin ms baja. El estudio detallado
de la granulacin y de la morfologa nuclear y citoplsmica
se realiza mejor bajo el objetivo de inmersin en aceite o
con una ampliacin de aumento ms alto.
Morfologa normal
Los leucocitos normales son de cinco tipos:
Neutrlos. El neutrlo maduro mide de 12 a 15 m de
dimetro. El citoplasma es acidlo con grnulos nos.
El ncleo con la cromatina agrupada se divide desde dos
a cinco lbulos distintos, los cuales son lamentos de
heterocromatina densa. En el sexo femenino, algunos
neutrlos tienen un apndice nuclear en forma de ba-
queta ligado al ncleo por un lamento. Esto representa
un cromosoma X inactivo (g. 26-1).
Eosinlos. Son ligeramente ms grandes que los neu-
trlos, 12 a 17 m de dimetro. El ncleo con frecuen-
cia es bilobulado. Los grnulos eosinlos son esfricos,
grandes, gruesos y de color naranja rojizo (g. 26-13).
Baslos. Su tamao es similar al de los neutrlos, y su
ncleo oscurecido por grnulos negro prpura, gruesos.
Linfocitos. stos miden de 10 a 16 m de dimetro. Los
linfocitos que predominan son los ms pequeos (10 m),
tienen citoplasma escaso y ncleo redondo con cromati-
na condensada. Cerca de 10% de los linfocitos son ms
grandes, tienen un citoplasma abundante y cromatina
nuclear menos condensada. Los linfocitos pueden tener
una pequea cantidad de grnulos que contienen enzi-
mas lisosomales (grnulos azuroflicos). En ocasiones las
clulas ms grandes, con un citoplasma ms abundante,
tienen grnulos azuroflicos bastante prominentes. stas
son llamadas linfocitos granulares grandes (para la mor-
fologa normal del linfocito, vase la g. 26-1).
Monocitos. Son las clulas ms grandes, con un di-
metro de 12 a 20 m; presentan un ncleo irregular y
lobulado; contiene abundante citoplasma de color gris-
ceo-azul. Pueden apreciarse grnulos azuroflicos nos
en estas clulas; su contorno con frecuencia es irregular
y es posible que el citoplasma tambin est vacuolado
(g. 26-1). El retraso en la elaboracin de frotis de san-
gre anticoagulada con EDTA propicia cambios en la
protena secuestrina. Esto se muestra como vacuolacin
del ncleo y del citoplasma; ello primero afecta a los
monocitos y luego a los neutrlos.
Anormalidades de la morfologa de los leucocitos
Algunas alteraciones comunes que afectan a los leucocitos
se listan en el cuadro 26-2.
Plaquetas
Las plaquetas normales miden de 1 a 3 m de dimetro.
Contienen grnulos nos que se dispersan o concentran en
el centro. Es posible efectuar una estimacin aproximada
del nmero de plaquetas mientras se examina una pelcula.
En sangre anticoagulada con edta las plaquetas permane-
cen por lo general separadas. En los frotis frescos se agrupan
con frecuencia. Una muestra mal colectada puede producir
un conteo falso de plaquetas bajo. Algunas anormalidades
comunes de las plaquetas se listan en el cuadro 26-3.
Examen y morfologa de la mdula sea
La distribucin de la mdula hematopoytica depende de la
edad. En recin nacidos, la mdula hematopoytica ocupa
casi toda la cavidad de la mdula sea. La hematopoyesis
ocurre prcticamente en todos los huesos. Con la edad, la
mdula hematopoytica se contrae y se sustituye por mdu-
la grasa. En adultos jvenes la mdula hematopoytica se
conna al crneo, a la espina dorsal, a las costillas, a la cla-
vcula, al esternn, a la pelvis y a las porciones proximales
de los huesos largos. Sin embargo, la mdula hematopoyti-
ca puede expandirse en respuesta a una demanda creciente.
Examen de la mdula sea
Debe examinarse la morfologa de la mdula sea por me-
dio de una biopsia obtenida mediante trepanacin por
aspirado. Las biopsias por aspirado de la mdula sea se
realizan con frecuencia en el esternn, la cresta iliaca o la
EXAMEN Y MORFOLOGA DE LA MDULA SEA 249
Cuadro 26-2 Alteraciones del leucocito
Terminologa Qu signica Condiciones relacionadas
Linfocitos atpicos Linfocitos grandes con citoplasma basflo. Infecciones virales, reacciones
(g. 26-14) Con frecuencia se rodean de los eritrocitos a las drogas
Bastones Auer Inclusin roja parecida a un bastn en las Leucemias mieloides
clulas inmaduras (blastos)
Clulas blsticas Clulas primitivas inmaduras Leucemias
Cuerpos de Dhle Inclusiones citoplsmicas azules en el Infeccin, inamacin
(g. 26-15) citoplasma neutrlo
Neutrlos hipogranulares Neutrlos con granulacin anormal Mielodisplasia
y reducida
Leucoeritroblstico Presencia de eritrocitos nucleados y Inltracin de la mdula,
granulocitos tempranos en sangre mielobrosis hemlisis aguda
Leucocitosis Recuento de leucocitos ms de 11 10
9
/L Infeccin, inamacin, leucemia
Linfocitosis Recuento de linfocitos >4 10
9
/L en adultos Leucemia linftica crnica,
linfoma en fase leucmica
>7 10
9
/L en nios Pertusis, infeccin viral
Neutrolia Neutrlos >7.5 l0
9
/L Inamacin, reaccin leucemoide,
leucemia mieloide crnica
Anomala de Pelger-Hut Neutrlos con dos lbulos no segmentados Mielodisplasia, leucemia mieloide,
(bilobulados) forma hereditaria
Cambio a la izquierda Presencia de clulas mieloides tempranas (Vase Neutrolia)
Cambio a la derecha Neutrlos de cinco o ms lbulos Anemia megaloblstica
Clula difusa Linfocitos difuminados, degenerando Leucemia linftica crnica
Granulacin txica (g. 26-16) Neutrlos con grnulos prpura gruesos Infeccin, inamacin
Clulas de Turk/clulas Clulas linfoplasmacticas reactivas Infeccin bacteriana, viral grave,
plasmacticas leucemia rarade la clula plasmtica
supercie intermedia de la tibia en bebs hasta los 18 meses
de edad. Hay agujas especiales de aspiracin para este pro-
cedimiento. Las muestras de aspiracin son apropiadas para
el examen citolgico con neza y detalle cuando se extien-
den en forma apropiada sobre un portaobjetos. El aspirado
de mdula sea es tambin conveniente para los estudios
de citometra de ujo, anlisis cariotpicos y moleculares, y
tambin para los estudios de cultivo celular de mdula sea.
Las biopsias de fragmento seo se realizan mejor, y con
mayor facilidad, a partir de la cresta iliaca. Las agujas es-
peciales para biopsia sea se encuentran disponibles para
este propsito. La obtencin de un fragmento de mdula
sea es esencial para una valoracin histolgica y de ce-
lularidad correcta. Las clulas de la mdula sea tambin
pueden evaluarse examinando fragmentos de la mdula
que fue aspirada.
Cuadro 26-3 Anormalidades de la plaqueta
Anormalidad Qu signica Condiciones relacionadas
Plaquetas grandes Plaquetas del tamao promedio antedicho Trombocitopenia inmunitaria, plaquetas gigantes
del sndrome Bernard-Soulier
Agrupamiento de Agrupamiento de plaquetas en el frotis, Anticoagulante relacionado, muestra mal
plaquetas dando lugar a un recuento de plaquetas bajo colectada, muestras coaguladas parcialmente,
grupos pequeos normales en frotis frescos
Trombocitopenia Recuento bajo de plaquetas <150 10
9
/L Trombocitopenia inmunitaria (ITP), aplasia de mdula,
o inltracin, mielodisplasia, hiperesplenismo
Trombocitosis Recuento alto de plaquetas >500 10
9
/L Infeccin, inamacin, estados mieloproliferativos
(g. 26-17)
La celularidad disminuye de manera constante con la
edad, con una declinacin acelerada a los 70 aos. Las
biopsias con trpano se realizan siempre que un aspira-
do seco o una muestra diluida se obtienen por aspiracin.
Esto sucede a menudo cuando una mdula es brtica, hi-
percelular o se inltra de modo anormal en alguna enfer-
medad. Las biopsias por aspiracin y con trpano deben
considerarse como procedimientos complementarios.
Morfologa de la mdula sea
Una vez que se aspira la mdula debe extenderse formando
una pelcula, como se describe antes. Los frotis de la mdula
sea, despus de teirse, deben examinarse al microscopio
con un objetivo de bajo aumento (10 ) para el conteo de la
celularidad total, la distribucin de las clulas hematopoy-
ticas, la presencia de grupos anormales de clulas no hema-
topoyticas, el nmero de megacariocitos y la morfologa.
La maduracin de los componentes eritroides y mieloides,
sus proporciones relativas y patrones anormales de madura-
cin (p. ej., megaloblstico o displsico) deben observarse.
El cociente normal mieloide a eritroide (cociente M:E) es
de 2.5:1 a 8:1. Lo ideal es hacer un recuento diferencial
(mielograma) de al menos 200 clulas nucleadas. Esto
es importante si se sospecha de inltracin anormal con
leucemia, mieloma o linfoma. Los nios tienen una gran
cantidad de linfocitos pequeos; este nmero disminuye al
incrementarse la edad. En adultos cerca de 5 a 15% de las
clulas nucleadas son linfoides. Otras clulas que deben lo-
calizarse son los megacariocitos, las clulas plasmticas, los
macrfagos y las clulas cebadas. Tanto su nmero como la
morfologa son importantes. A los parsitos con frecuencia,
se les ubica mejor dentro de los macrfagos.
Una tincin con azul de Prusia de la mdula permite
valorar las reservas y la distribucin del hierro. La mdula
Diagrama A Representacin diagramtica de la hematopoyesis. CFU-S, unidad formadora de colonias-bazo; CFU-GEMM, unidad
formadora de colonias-granulocito, eritrocito, macrfago, megacariocito; LSC (CFU-L), clula linfoide germinal (unidad formadora de
colonias-linfoide); CFU-GM, unidad formadora de colonias-granulocito; BFU-E unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-Meg,
unidad formadora de colonias-megacariocito; CFU-NM, unidad formadora de colonias-neutrlo, monocitos; CFU-Eo, unidad forma-
dora de colonias-eosinlo; CFU-Bas, unidad formadora de colonias-baslo; CFU-E, unidad formadora de colonias-eritroide; CFU-M,
unidad formadora de colonias-monocitos/macrfago; CFU-N, unidad formadora de colonias-neutrlo; N, neutroflica; E, eosinoflica;
B, basoflica; NB, normoblasto.
Diagrama B Mapa de maduracin. Reproducido con permiso de Churchill Livingstone, Atlas of Haematology, G.A.
FIJACIN Y DESCALCIFICACIN 253
McDonald, J. Paul y B. Cruickshank. 5 edicin, 1989.
hematopoytica entera se origina de una clula embrionaria
totipotencial hematopoytica en la mdula. Una represen-
tacin diagramtica simple se muestra en el diagrama A.
Eritropoyesis normal
El primer precursor eritroide reconocible, el pronormo-
blasto, se desarrolla en forma progresiva y se diferencia en
un eritrocito normal. En este proceso adquiere ms hemo-
globina de forma progresiva, y de manera gradual pierde
su basolia citoplsmica y su ncleo. Este proceso entero
se divide, en forma arbitraria, en tres etapas: normoblasto
temprano, normoblasto intermedio y normoblasto tardo.
Los normoblastos tardos no se dividen, pierden su n-
cleo por extrusin y dan lugar a un reticulocito de la mdu-
la. stos pasan hasta dos das en la mdula antes de entrar
en la sangre perifrica, donde constituyen menos de 1% de
la poblacin de eritrocitos. Los reticulocitos poseen una
coloracin gris azulado caracterstica que permite verlos a
detalle y contarlos mejor usando una tincin supravital. Los
eritrocitos maduros son viables cerca de 120 das antes de su
destruccin en el sistema reticuloendotelial. La eritropoye-
sis normal y la hematopoyesis se ilustran en el diagrama B.
Algunos desrdenes frecuentes que afectan
principalmente la eritropoyesis
Anemia megaloblstica
sta surge de una deciencia de la vitamina B
12
o del ci-
do flico. Debido sobre todo a la formacin defectuosa del
timidilato, la sntesis del DNA en la fase S del ciclo celular
se retrasa. Esto hace que la divisin nuclear se rezague, y la
Figura 26-2 Autoaglutinacin de los eritrocitos.
Figura 26-3 Punteado basoflico de los eritrocitos.
Figura 26-4 Cuerpos de Howell-Jolly.
Figura 26-5 Eritrocitos macrocticos, hipocrmicos.
sincronizacin citoplsmica nuclear en desarrollo se afecte.
Aparte de los eritroblastos, la mayor parte de las clulas
en proliferacin se modican, tambin la mucosa intesti-
nal, los granulocitos y los precursores de la plaqueta. La
mdula megaloblstica es hipercelular. La eritropoyesis es
desplazada a la izquierda, con aumento de tamao celular y
apertura del sistema nuclear de la red de cromatina. La ad-
quisicin de hemoglobina de manera temprana con prdida
de sincronizacin del desarrollo citoplsmico nuclear es fre-
cuente (son caractersticas megaloblsticas). Los cambios
paralelos en precursores del granulocito incluyen la presen-
cia de mielocitos o de metamielocitos gigantes y neutrlos
multilobulados (al desplazarse se mueve a la derecha). Los
megacariocitos tambin muestran hipersegmentacin. La
sangre perifrica muestra la presencia de macrocitos y de
neutrlos desplazados a la derecha (gs. 26-6 a 26-18).
Figura 26-6 Neutrlos macrocticos e hipersegmentados.
Anemias hemolticas
Las anemias hemolticas (destruccin excesiva de eritroci-
tos) por cualquier causa muestran hiperplasia compensato-
Figura 26-7 Esferocitos con eritrocitos nucleados en la anemia
hemoltica autoinmunitaria (AIHA).
Figura 26-8 Rouleaux con clulas de plasma anormal en el
mieloma.
Figura 26-9 Eritrocito fragmentado en la anemia microan-
gioptica hemoltica (MAHA).
Figura 26-10 Enfermedad de la clula falciforme.
Figura 26-11 Talasemia con los eritrocitos nucleados.
Figura 26-12 Clulas en forma de lgrima en mielobrosis.
Figura 26-13 Eosinlos.
Figura 26-14 Linfocitos atpicos en la mononucleosis infec-
ciosa.
Figura 26-15 Cuerpo de Dble en neutrlo.
Figura 26-16 Granulacin txica en neutrlos.
ria eritroide de la mdula. El cociente M:E se reduce, con
hiperplasia normoblstica y supresin de espacios grasos.
A partir de esta caracterstica compartida en comn, otras
pistas de diagnstico tiles se obtienen mejor al analizar la
morfologa del eritrocito perifrico, y de investigaciones su-
plementarias de laboratorio apropiadas para la hemlisis.
Estados aplsicos e hipoplsicos
Estos desrdenes se presentan con frecuencia con anemia,
leucopenia y trombocitopenia, por ejemplo, la pancitope-
nia. Las causas pueden variar pero son a menudo idiop-
ticas. La pancitopenia, en algunos casos, puede llegar a
ser progresiva y grave. La anemia es muy normocrmica
y normoctica con reticulocitos indetectables en la sangre
perifrica. La mdula celular es deciente con un predomi-
nio de espacios grasos. Puede detectarse una proporcin un
poco alta de linfocitos y de clulas plasmticas. La mdula
aspirada es acelular y el diagnstico denitivo se mejora al
realizar biopsia sea. La hipoplasia puede afectar slo a un
linaje, como en la aplasia del eritrocito puro cuando el lina-
je de los glbulos rojos tiene una alteracin predominante.
Sndromes mielodisplsicos
Es un grupo con condiciones morfolgicas heterogneas
que se producen por una alteracin adquirida de la clula
madre mieloide, que conducen a la proliferacin anormal
y a la maduracin desordenada de uno o ms linajes de
las clulas hematopoyticas. ste se caracteriza por una
hematopoyesis inecaz, que causa citopenia sangunea
perifrica y una propensin para la transformacin leuc-
mica. La clasicacin FAB (Francesa, Americana y Bri-
tnica) subdivide los sndromes de la mielodisplasia en
varios subgrupos.
La morfologa de la mdula muestra caractersticas dis-
plsicas que afectan a los tres linajes. La displasia eritroide
es notoria por una adquisicin de hemoglobina heterognea,
morfologa nuclear anormal e irregular, y puente citoplsmi-
co. En un subgrupo conocido como anemia sideroblstica
en los precursores del eritrocito se observan grnulos side-
rticos anormales (con tincin azul de Prusia) dispuestos en
forma de anillo alrededor del ncleo del eritroblasto (vase
la g. 26-27). Los cambios comunes del eritrocito perifri-
co incluyen anisocitosis, poiquilocitosis, microcitosis y, con
frecuencia, la presencia de hipocroma o un cuadro sangu-
neo dimrco. Los cambios correspondientes en las series
del leucocito incluyen neutropenia y la presencia de neutr-
los hipogranulares en sangre perifrica, con los cambios
seudo-Pelger. Anormalidades similares pueden tambin de-
tectarse en precursores granulocticos de la mdula sea.
Policitemia
La policitemia proliferativa primaria (PRV o PPP) se ca-
racteriza clnicamente por la hemoglobina alta, hematcrito
alto, cuenta y masa eritrocticas elevadas. Las cuentas de
leucocitos y plaquetas se elevan con frecuencia y la espleno-
megalia es comn. La mdula sea muestra obliteracin de
espacios grasos con hiperplasia de los tres linajes celulares.
Pueden ocurrir tambin cambios cromosmicos. La transi-
cin al estado mielobrtico puede ocurrir hasta en un 15
a 20% de los casos. Cuando esto sucede la muestra obteni-
da por biopsia sea muestra brosis creciente de reticulina
y de la mdula. Los poiquilocitos en forma de lgrima y
las caractersticas leucoeritroblsticas aparecen en la sangre
perifrica. Tambin suele ocurrir transformacin terminal a
leucemia mieloide aguda o a un estado mielodisplsico.
La policitemia secundaria es una condicin que slo
afecta a las series de los eritrocitos sin que muestre leu-
cocitosis o trombocitosis. Esto sucede principalmente en
enfermedades cardiovasculares crnicas o pulmonares,
causando disminucin en la saturacin del oxgeno que, a
su vez, produce policitemia compensatoria. La morfologa
de la hiperplasia eritroide predomina sin un aumento para-
lelo en otros linajes.
Anemia por prdida sangunea o deciencia de hierro
La prdida crnica de sangre produce anemia por decien-
cia de hierro. Los eritrocitos perifricos muestran hipo-
croma y microcitosis con clulas elongadas en forma de
lpiz. La eritropoyesis en la mdula es hiperplsica. Los
eritroblastos son a menudo pequeos, la acumulacin de
hemoglobina es deciente, el contorno es irregular y des-
igual (micronormoblastos).
La tincin con azul de Prusia no muestra ningn dep-
sito de hierro. Una condicin llamada anemia de la enfer-
medad crnica (que ocurre por la inamacin o surge de la
infeccin crnica) puede dar un cuadro sanguneo similar.
En estas condiciones la mdula exhibe un aumento en el
depsito de hierro. Sin embargo, los depsitos de hierro
intraeritroctico son reducidos.
Eritroleucemia
sta es una forma de leucemia mieloide aguda en la cual
el linaje eritroide afectado es predominante. Los precur-
sores eritroides son en general marcadamente anormales
con lobulacin nuclear extraa. La eritropoyesis puede ser
tambin megaloblstica o sideroblstica. Una prominente
anormalidad del eritrocito aparece en la sangre perifrica,
incluyendo muchos eritrocitos circulantes nucleados.
Anemia leucoeritroblstica (incluyendo mielobrosis
idioptica)
Esta condicin se caracteriza por la presencia de los poiqui-
locitos con forma de lgrima, de eritrocitos nucleados y
de granulocitos tempranos en sangre perifrica. Este cuadro
puede presentarse cuando la mdula est inltrada por un
tumor metastsico o con tejido extrao, o cuando la mdula
est brosada. La brosis prominente de la mdula puede
ser la manifestacin primaria de un estado mieloprolifera-
tivo. sta se designa como mielobrosis idioptica prima-
ria. La mdula muestra un aumento en la reticulina y en la
brosis extensiva. El aspirado de la mdula sea es difcil
o no sirve de ayuda en esta condicin. Una biopsia sea
siempre es segura y diagnstica.
Mielopoyesis y megacariopoyesis normales
Las clulas que pueden identicarse ms tempranamente
en las series granulocticas es el mieloblasto, que da lugar
a una secuencia de promielocitos, mielocitos, metamielo-
citos, clulas en banda y neutrlos maduros (diagrama B).
Del promielocito hacia adelante, los grnulos especcos
(neutrlos, eosinlos, baslos) surgen cada vez ms en
el citoplasma y se distinguen de los granulocitos neutr-
los comunes de los precursores eosinlos y baslos
menos comunes. Los monocitos y sus precursores, mono-
blastos y promonocitos slo estn presentes en cantidades
pequeas en la mdula normal. En estados anormales, no-
tables en la leucemia, pueden llegar a ser muy evidentes.
Los megacariocitos se reconocen con facilidad en la
mdula por su gran tamao y por el ncleo lobular. Con
la maduracin el citoplasma se fragmenta y aparecen las
plaquetas. Los megacariocitos son ms pequeos y pueden
tener una apariencia muy similar a los mieloblastos.
Desrdenes comunes que predominan
en la mielopoyesis y en la megacariopoyesis
Leucemia mieloide aguda
En la leucemia mieloide aguda la mdula sea se inltra
con los mieloblastos primitivos que ascienden a ms de
30% del total de las lneas celulares mieloides. Los mie-
loblastos tambin estn presentes con frecuencia en la
sangre perifrica. Los mieloblastos son clulas primitivas
que muestran un patrn de cromatina nuclear abierta y un
nucleolo.
La granulacin citoplsmica y los bastoncitos de Auer
pueden o no estar presentes (gs. 26-19 y 26-20). La mor-
fologa de la leucemia mieloide aguda est subdividida en
Figura 26-17 Cuenta plaquetaria elevada en trombocitemia es-
encial con algunas formas grandes
Figura 26-18 Mdula sea megaloblstica
Figura 26-19 Leucemia mieloide aguda
Figura 26-20 Leucemia promieloctica aguda
varios subtipos por el grupo FAB, dependiendo del grado de
diferenciacin y de la naturaleza de las clulas predominan-
tes en la mdula. A veces los mieloblastos y los monoblastos
primitivos son difciles de diferenciarse con facilidad de los
linfoblastos con las tinciones de Romanowsky. Las tinciones
citoqumicas especiales se utilizan, a veces, en esta situacin
(cuadros 26-4 y 26-5). Recientemente, la citoqumica ya se
reemplaza por la inmunofenotipicacin (vase el cap. 32).
La leucemia mieloide aguda es una enfermedad malig-
na. Los cambios cromosmicos se observan con facilidad
en el 50% de los casos. Clnicamente, es frecuente que el
paciente se presente con anemia, un conteo plaquetario
bajo, sangrado e infeccin. Es normal que en la sangre pe-
rifrica se encuentren blastos circulantes. El anlisis de la
mdula sea es obligatorio y diagnstico.
Leucemia mieloide crnica
ste es un desorden de la clula embrionaria que se caracte-
riza por mantener una cuenta leucoctica alta y la presencia
de precursores del granulocito, donde son muy notorios los
mielocitos y metamielocitos, junto con numerosos neutr-
los circulantes. La mdula muestra hipercelularidad con
hiperplasia granuloctica, y eosinolia o basolia frecuente
(g. 26-21). La hiperplasia megacarioctica con una cuen-
ta plaquetaria elevada tambin es comn. La alteracin
cromosmica distintiva es la presencia del cromosoma Ph
(Filadela). sta es una translocacin recproca entre seg-
mentos del brazo largo del cromosoma 22 y del brazo largo
del cromosoma 9, t(9:22) (q34:q11). Lo anterior genera
la transferencia del oncogn abl de 9q a un sitio en 22q,
conocido como la regin del punto de ruptura (BCR). La
transformacin a leucemia aguda (AML, o se indica como
ALL) ocurre despus de un periodo variable (tambin se
le llama crisis blstica), siendo el intervalo medio de tres
a cuatro aos.
Cambios reactivos en granulocitos y monocitos
En estados infectivos e inamatorios la cuenta de WBC se
incrementa cerca de 11 10
9
/L.
Cuadro 26-4 Clasicacin Francesa, Americana, Britnica (FAB) de las leucemias mielocticas agudas
Categora Criterio morfolgico (mdula sea)
M1 Mieloblstica sin maduracin 90% de clulas de la lnea mieloide son blastos
M2 Mieloblstica con maduracin 30 a 89% de las clulas de la lnea mieloide son blastos, >10% son promie-
locitos para PMN (con frecuencia displsica), <20% son monocitos
M3 Promieloctica Promielocitos hipergranulares con grnulos semejantes a polvo, frecuentes
barras de Auer; el ncleo, bilobulado; la variante microgranular puede ocurrir
M4 Mielomonoctica 30 a 80% de clulas de la lnea mieloide son mieloblastos ms neutrlos
madurando; >20% de clulas de la lnea mieloide son de linaje monoctico.
Adems, >5 000/L clulas monocticas en sangre perifrica
M4 Con eosinolia Como el anterior, con 5% de eosinlos anormales que pueden tener ncleos
no segmentados y grnulos eosinoflicos y basoflicos grandes
M5 Monoblstica, monoctica >80% de clulas de la lnea mieloide son monoblastos, promonocitos o
monocitos; en M5a, 80% de clulas de la lnea mieloide son monoblastos;
en M5b, <80% son monoblastos, y el resto son promonocitos y monocitos
M6 Eritroleucemia 50% de las clulas de la mdula sea son precursores eritroides; 30% de
las clulas de la lnea mieloide no eritroides son blastos
M7 Megacarioctica Los blastos en mdula o sangre se identican como linaje megacarioctico;
siempre que la mdula sea inaspirable, la biopsia muestra nmeros grandes
de blastos, con frecuencia con incrementos de megacariocitos y reticulina
PMN: Leucocitos polimorfonucleares.
Figura 26-21 Leucemia mieloide crnica.
Los neutrlos muestran un cambio a la izquierda con
granulacin txica. Algunos mielocitos circulantes y mie-
loblastos ocasionales tambin pueden observarse. La m-
dula muestra una hiperplasia mieloide con predominancia
de promielocitos y mielocitos.
El cuadro global suele, en casos graves, asemejarse a
un proceso leucmico, que a veces se denomina reaccin
leucemoide. Los antecedentes clnicos del paciente, in-
munofenotipicacin, estudios cromosmicos y estudios
de clonalidad son necesarios para separar esta condicin de
la leucemia.
Estados mielodisplsicos
Este grupo heterogneo de desrdenes se menciona antes
(vase pg. 257). Los estados mielodisplsicos graves, en
Cuadro 26-5 Tinciones especiales y ensayos usados en la clasicacin de las leucemias agudas
Tincin
Peroxidasa o Esterasas
Leucemia negro de Sudn B Especca
a

No especca
b
PAS
c
AML-M1 + + _ _
AML-M2 + a +++ + _ _
AML-M3 +++ +++ _ _
AML-M4 ++ a +++ + a +++ + a +++ _
AML-M5 + _ +++ _
AML-M6 _ _ _ +++
AML-M7 _ 0 a ++ 0 a ++ (moteado)
d
++ (moteado)
ALL _ _ _ +++
Neutrlos normales +++ +++ _ +++
Monocitos normales + _ +++ +++
Linfocitos normales _ _ _
a
-naftol AS-D cloroacetato.
b
-naftil acetato esterasa y -naftil butirato esterasa.
c
cido perydico de Schiff.
d
Megacarioblastos negativos para -naftil butirato esterasa.
particular los que implican displasia de los tres linajes
celulares, muestran de manera progresiva un incremento
en la proporcin de blastos en la mdula, y nalmente
su transformacin en leucemia mieloide aguda. Una sub-
categora especial, que se conoce como leucemia mielo-
monoctica crnica (CMML), muestra caractersticas de
displasia y de una condicin mieloproliferativa. sta se
caracteriza por la presencia de monocitosis en sangre pe-
rifrica > 1 10
9
/L. Los monocitos son a menudo anor-
males en la morfologa. Las caractersticas displsicas
relacionadas estn tambin presentes en los eritrocitos y
en otros leucocitos.
Megacariocitos y desrdenes plaquetarios
Trombocitopenia
Una cuenta plaquetaria baja < 150 10
9
/L puede ocu-
rrir por un consumo perifrico intenso (inmunitario o no
inmunitario) o por una produccin medular reducida de
plaquetas, es decir, aplasia medular o inltracin. En la
prpura trombocitopnica idioptica (IT), los anticuerpos
antiplaquetarios causan una destruccin reticuloendotelial
incrementada de plaquetas. En ITP u otros estados fsicos,
la mdula sea muestra un nmero normal a un incremento
de megacariocitos. Los desrdenes en la produccin pla-
quetaria se diagnostican mejor con la prueba sea. Aqu
los megacariocitos pueden estar ausentes, reducidos, o
mostrar morfologa displsica. El aspirado de mdula sea
tambin muestra la presencia de una inltracin anormal.
Trombocitosis
Una cuenta plaquetaria persistente elevada sobre 1 000
10
9
/L ocurre en la trombocitemia esencial (ET), una enfer-
medad mieloproliferativa que implica un predominio del
linaje megacarioctico. La presencia de plaquetas grandes
o incluso de fragmentos megacariocticos es tambin una
caracterstica de este desorden. La aspiracin de la mdula
sea puede ser difcil, pues suele coagularse con facilidad
antes de separarse. La biopsia de la mdula sea mues-
tra hipercelularidad con un aumento visible en la cuenta
de megacariocitos, con frecuencia atpicos en la morfolo-
ga medular sea.
Tambin es comn un aumento relacionado con la reti-
culina o la brosis medular.
La trombocitosis reactiva (por infeccin o inamacin)
suele producir, a veces, un cuadro similar y, ocasionalmen-
te, dicultad para diferenciarla de la trombocitemia esen-
cial slo por la morfologa (vase g. 26-17).
Linfocitos, clulas plasmticas y sus desrdenes
La variacin morfolgica en linfocitos y en clulas plas-
mticas cubre una gama mucho ms amplia que entre los
granulocitos. En las infecciones, en particular infecciones
virales, los linfocitos muestran caractersticas de activacin
o inmunoblsticas, con basolia citoplsmica y el aspecto
de nucleolos.
Los nios tienen con frecuencia linfocitosis relativa,
que disminuye con la edad. Las clulas plasmticas tienen
un tpico citoplasma basoflico ms abundante, con un n-
cleo excntrico que muestra una cromatina agrupada (con
aspecto de cara de reloj).
La inclusin citoplsmica de inmunoglobulinas puede
verse en algunas ocasiones.
Desrdenes comunes que afectan el linaje
de los linfocitos y de las clulas plasmticas
Leucemia linfoblstica aguda (ALL)
Es una enfermedad neoplsica monoclonal que surge de
los precursores linfoblsticos de los linfocitos. Explica cer-
ca de 85% de todas las leucemias agudas por abajo de los
16 aos. Los linfoblastos anormales permanecen con fre-
cuencia presentes en la sangre perifrica relacionada con
anemia y con una cuenta plaquetaria baja.
La mdula sea muestra inltracin anormal con linfo-
blastos que tienen un cociente citoplsmico nuclear ms
alto que un mieloblasto tpico. El grupo FAB clasica la
leucemia linfoblstica aguda en tres subtipos morfolgicos
(cuadro 26-6). Una distincin morfolgica pura entre un
linfoblasto y un mieloblasto indiferenciado puede ser dif-
cil en algunos casos. La citometra de ujo y las tinciones
especiales son muy tiles en esta situacin (vanse cuadro
26-5 y g. 26-22).
Figura 26-22 Leucemia linfoctica aguda.
Cuadro 26-6 Clasicacin FAB de la leucemia linfoctica aguda
Citologa L1 L2 L3
Tamao de la clula Pequeo Grande Grande, homogneo
Cromatina nuclear Homognea Inconstante Finamente revestida
Forma nuclear Regular Irregular De oval a redonda
Nucleolos Raros Presentes 1 a 3
Citoplasma Escaso Moderado Moderado, vacuolado
Basolia citoplsmica Moderada Inconstante Intensa
Incidencia en nios 85% 13% 2%
Incidencia en adultos 35% 63% 2%
Marcadores inmunolgicos B temprano o T tmico B temprano o T tmico B diferenciado (SIg positivo),
leucemia/linfoma tipo Burkitt
Figura 26-23 Leucemia linfoctica crnica.
Leucemia linfoctica crnica (CLL)
La enfermedad es rara antes que el individuo llegue a una
edad media; su incidencia aumenta con la edad. Es tpico
que se presente con linfocitosis perifrica, linfadenopata
y hepatoesplenomegalia. La sangre perifrica y la mdu-
la sea muestran muchos linfocitos pequeos que parecen
maduros y monomrcos. Es una caracterstica que clu-
las en forma de mancha se encuentren presentes en este
desorden. Las clulas de la CLL tienen tambin un perl
inmunofenotpico distintivo (g. 26-23).
Mieloma
Es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento
clonal y neoplsico de las clulas plasmticas. Los pacien-
tes se presentan con paraprotena, hipercalcemia, lesiones
seas lticas, anemia e insuciencia renal. La mdula sea,
que es diagnstica, muestra la presencia de clulas plasm-
ticas anormales en una proporcin grande (>30%) (vase
g. 26-8).
Linfomas
Los linfomas son un grupo complejo, heterogneo, de en-
fermedades neoplsicas clonales que surgen de los ganglios
linfticos, pero que involucran a la sangre perifrica o a la
mdula sea. El linfoma es una enfermedad con muchos
subtipos. Las clulas neoplsicas pueden ser pequeas y
parecer similares a linfocitos pequeos (linfoma de grado
bajo). Por otra parte, algunas clulas del linfoma tienen
morfologa similar a la de un blasto, grande, muy inmaduro
(linfoma de grado alto). La enfermedad de Hodgkin (HD),
la que se clasica como un tipo de linfoma, se caracteriza
por la presencia de las clulas de Reed-Sternberg.
Figura 26-24 Clulas de carcinoma metastsico.
Figura 26-25 Parsitos del paludismo en sangre.
Figura 26-26 Microlaria en sangre.
Clulas no hematopoyticas y parsitos
en sangre y mdula sea
Un aspirado y una biopsia de la mdula sea es una prue-
ba til para detectar clulas metastsicas de carcinoma, en
especial en presencia de un cuadro sanguneo leucoeritro-
blstico (g. 26-24). Los parsitos del paludismo se de-
tectan mejor en un frotis de sangre perifrica. El parsito
microlaria tambin puede encontrarse en ella, aunque es
poco frecuente (gs. 26-25 y 26-26). La especializacin y
la conanza en la morfologa celular se adquieren con la
prctica. Para una revisin ms exhaustiva en este tema,
vase Hayhoe y Flemans, 1992.
Bennet JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classi-
cation of myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 1982;
51: 189.
Bennet JM, Cartovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classica-
tion of acute leukaemia. Br J Haematol 1976; 33: 451.
Hayhoe FGJ, Flemans RJ. A Colour Atlas of Haematological
Cytology, 3rd edn. 1992: Wolfe, London.
Holtbrand AV. Pettit JE. Clinical Haematology, 2nd edn. 1994:
Sandoz Atlas, London.
Figura 26-27 Sideroblastos.
27
Principios de los contadores automatizados
de clulas sanguneas
Graham Martin
Introduccin
El conteo sanguneo completo (FBC) hace grandes progre-
sos a partir de una simple medicin de hemoglobina y de
componentes celulares en la sangre perifrica. El desarro-
llo y la adaptacin de diversas tecnologas ha generado una
gran variedad de parmetros celulares, algunos muy tiles;
otros todava tienen que demostrar su valor. En paralelo a
la tecnologa de medicin, se han desarrollado instrumen-
tos automticos que pueden analizar cantidades muy pe-
queas de sangre usando el muestreo del tubo cerrado y
tener rendimientos muy altos.
Numerosas mediciones que se obtienen por instrumentos
automticos y semiautomticos son principalmente modi-
caciones de las tcnicas manuales originales; sin embar-
go, existen varias aplicaciones interesantes de las nuevas
tecnologas. Estos instrumentos son precisos y exactos, y
las mediciones son reproducibles. Hay diferentes fabrican-
tes de instrumentos que emplean tecnologas y sistemas de
medicin similares que evalan el mismo parmetro con li-
geras variantes. Existen ventajas y desventajas en todos los
sistemas y podra argumentarse que un grupo de problemas
puede intercambiarse por otro.
En este captulo se propone revisar las diferentes tecno-
logas y sus principios de operacin. Los principales par-
metros son:
1. Cuanticacin de la hemoglobina (Hb).
2. Cuanticacin de los eritrocitos (RBC).
3. Cuanticacin de los reticulocitos y de los RBC nucleados.
4. Cuanticacin de los leucocitos (WBC).
5. Cuanticacin plaquetaria.
Medicin de la Hb
La medicin de la Hb (g. 27-1) se basa en la relacin li-
neal entre la cantidad de luz que se absorbe en una banda
de absorcin particular y la concentracin de la entidad de
absorcin en la muestra (ley de Beer) (Skoog DA, West
DM, 1965).
La mayor parte de los contadores automticos emplea el
mtodo de cianometahemoglobina que lee la absorbancia a
longitudes de onda de 525 o 540 nm. Los sistemas Sysmex
utilizan lauril sulfato de sodio, con la ventaja de que se
elimina el cianuro en los desechos del analizador.
Mediciones de los eritrocitos
Los eritrocitos pueden contarse con la impedancia de la
abertura, tcnicas que dispersan la luz, usando lser LED o
tungsteno o una combinacin de las dos tecnologas.
Impedancia de la abertura
Esta tcnica la patent, en 1956, Wallace Coulter y se co-
noce como el principio de Coulter (g. 27-2). Se utiliza
266 CAP. 27 PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CLULAS SANGUNEAS
para contar RBC, WBC y plaquetas. Un ujo de corriente
elctrica se establece a travs de una abertura de dimensiones
conocidas. Cuando una clula o una partcula pasa a travs
de la abertura, la clula o la partcula impide el ujo de la
corriente y causa un impulso en el voltaje. El voltaje primero
se eleva y despus cae por debajo de cierto umbral, indicando
que una clula o una partcula pasa por la zona de deteccin.
Las clulas y las partculas se cuentan registrando el nmero
de pulsos de voltaje que ocurren durante un intervalo de me-
dicin especco. El volumen celular se determina midiendo
la magnitud del pulso que se genera. Se jan los umbrales o
entradas electrnicas, permitiendo al analizador discriminar
los pulsos de Cuanticaciones de los eritrocitos de los pulsos
ms pequeos de las plaquetas, detritus y del ruido elctrico.
Coincidencia
La inexactitud puede introducirse por coincidencia. Si dos
o ms clulas entran en la abertura de la zona de deteccin,
el cambio en la resistencia crea un solo pulso alto o un pul-
so de doble pico. Las correcciones estadsticas se aplican
en el software del analizador para corregir esto. Para evi-
tar la recirculacin de clulas alrededor de la abertura, que
produzcan mediciones falsas de cantidades y de volumen,
las clulas se inyectan de manera convencional en el com-
partimiento de la abertura justo en el centro de una corrien-
te de un uido envolvente o, una vez contadas, se remueven
de la zona de deteccin con un lquido de arrastre.
Tcnicas de dispersin de luz
Con la dispersin de luz se estima el tamao aproximado
de la clula con base en la dispersin frontal, la cual es
sobre todo una medida ms del dimetro transversal. La
cantidad de luz que se dispersa es proporcional al rea su-
percial y, por tanto, al volumen de la clula. Los lser
tienen caractersticas pticas superiores, al compararse con
las fuentes luminosas de tungsteno, y pueden colocarse de-
tectores para recolectar la luz frontal dispersada en ngulo
amplio y estrecho (g. 27-3).
La luz lser se utiliza para medir el volumen y la con-
centracin celular de la Hb en los instrumentos Bayer. La
cantidad de luz dispersada en ngulo bajo (2 a 3) depende
del tamao del RBC, y la cantidad dispersada en ngu-
lo alto (5 a 15) se relaciona con el ndice de refraccin
de la clula. De la manera como se proyecten hacia el
lser, las clulas no esfricas como plaquetas y las cuan-
ticaciones de los eritrocitos pueden dar seales muy
diferentes hacia los detectores. Bayer ha superado este
problema con una tcnica que se conoce como generacin
de esfera isovolumtrica. El dodecil sulfato de sodio y el
C Bath
Detector
Absorbancia = log
10
(VR/Vs),
donde VR = el voltaje de referencia
Derivacin de la Hb
Fuente de luz
(lser, LED o tungsteno)
Muestra
Amplificador
y Vs = el voltaje de la muestra
Figura 27-1 Cuanticacin de Hb.
Figura 27-2 Principio de Coulter.
MEDICIN DE LOS RETICULOCITOS Y RBC NUCLEADOS 267
glutaraldehdo en el reactivo para el eritrocito producen
jacin parcial y la formacin esfrica a partir de los eri-
trocitos y de las plaquetas, eliminando resultados err-
neos. Permite esto medir con exactitud el porcentaje de
las clulas hipocrmicas?; no slo eso, ha demostrado ser
un parmetro til para perfeccionar la terapia con eritropo-
yetina y hierro (Richardson, et al., 2001).
Medicin de los reticulocitos y RBC
nucleados
Conteo de los reticulocitos
Todos los fabricantes de contadores celulares proporcio-
nan el anlisis del reticulocito en sus instrumentos. Al-
gunos sistemas miden reticulocitos y los parmetros re-
lacionados usando los colorantes uorescentes para cido
ribonucleico con luz lser (referencias de ALM en Hp90
Takubo et al., 1989; Tichelli et al., 1990; Davis et al.,
1996; Kim et al., 2003). Otros sistemas utilizan colorantes
bsicos supravitales que producen precipitacin y colo-
racin de la sustancia reticular, la cual se mide, en este
caso, por absorbancia y dispersin de la luz (referencias
de ALM en Hp90 Buttarello et al., 1995, 1996, 1997; Van
den Bossche J et al., 2001; Rudenski, 1997; Wysocka J,
Turowski D, 2000).
Resumen de los mtodos actuales
utilizados en los analizadores
Tambin es posible medir la madurez del reticulocito, debido
al hecho de que los reticulocitos inmaduros tienen una pro-
porcin ms grande de RNA, y por tanto, se tien con ms
intensidad o reejan una uorescencia mayor. La dispersin
de la luz monocromtica mide el volumen gracado contra
la absorcin y se usa en el Advia para proporcionar un ndice
de la maduracin del reticulocito y su contenido de Hb.
Figura 27-3 Sistema ptico de dispersin de luz lser usado por los instrumentos Sysmex.
Cuadro 27-1 Tcnicas de conteo de reticulocitos
Tincin del
Compaa Analizador Mtodo RNA
Abbott Cell-Dyn 4000 + Fluorescencia CD4K530
Sapphire
ABX ABX Pentra 120 Fluorescencia Naranja
de tiazol
Bayer ADVIA 120 + Dispersin y Oxacina 750
2120 absorcin en clulas
de luz esfricas
Beckman GEN-S + Dispersin Nuevo azul
Coulter LH750 de luz de metileno
en clulas
esfricas
Sysmex XE 2100 Fluorescencia Auramina O
Eritrocitos nucleados
Los fabricantes del instrumento adoptan aproximaciones
que dieren para distinguir a los RBC nucleados. Los n-
cleos se cuentan usando combinaciones de dispersin de la
luz e impedancia despus de que el citoplasma del RBC ha
sido eliminado (Beckman Coulter). El conteo se hace en el
canal de WBC y el WBC total se corrige por la presencia
de NuRBC. En los analizadores Sysmex, las cuentas de
NuRBC se determinan por medio de citometra de ujo y
luz lser. La muestra se aspira y se mezcla con una tincin
para RNA/DNA. En el conteo NucRBC usa uorescencia
lateral, dando informacin del RNA/DNA y de la disper-
sin frontal, una medida del tamao celular.
En los analizadores la cuenta de NucRBC se expresa
con NucRBC/100 WBC, a partir de la frmula:
%NucRBC=
NucRBC 100
NucRBC WBC
Cuadro 27-2 Tecnologas de los analizadores comunes
Compaa Analizador Tecnologa
Abbott Cell-Dyn 3500 Dispersin frontal de la luz
Dispersin de la luz en ngulo estrecho
Dispersin ortogonal de la luz
Dispersin de luz polarizada
Cell-Dyn 4000 + Todo lo anterior, ms cuenta de RBC posterior a la unin con el colorante
Sapphire uorescente
ABX Pentra 60 Citoqumica
Impedancia por ujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometra de ujo
Pentra 120 Retic Citoqumica
Impedancia-citometra de ujo enfocada y absorbancia
Absorcin de luz posterior a la tincin de los eosinlos
Impedancia posterior al desprendimiento preferencial del citoplasma
de los baslos a un pH bajo
Lser ion-argn
Bayer Advia 60 Citoqumica
Impedancia por ujo enfocado
Absorbancia de luz
Citometra de ujo
ADVIA 120, 2120, Dispersin de la luz posterior a la reaccin de la peroxidasa
H1, H2 y H3 Absorbancia de luz posterior a la reaccin de la peroxidasa
Dispersin de la luz posterior al desprendimiento del citoplasma
de las clulas, excepto baslos, por un agente ltico a un pH bajo
Beckman Coulter A
c
T 5diff Medicin de la impedancia posterior a la lisis diferencial
Mediciones de impedancia y absorbancia citoqumica
GEN-S + LH750 Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia
Conductibilidad con corriente electromagntica de baja frecuencia
Dispersin de luz lser
Sysmex SE 9000 Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia
Impedancia con corriente electromagntica de radiofrecuencia
Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia a pH bajo
y pH alto
XE 2100 Impedancia con corriente electromagntica de baja frecuencia
Impedancia con corriente electromagntica de radiofrecuencia
Dispersin frontal de la luz
Dispersin lateral de la luz
Intensidad de la reaccin de uorescencia posterior a la tincin uorescente
MEDICIONES DE LOS LEUCOCITOS 269
Mediciones de los leucocitos
Los leucocitos pueden contarse y diferenciarse dentro de
un amplio nmero de categoras por diversas tecnologas.
Existen ventajas y desventajas en todas. El desarrollo de
sistemas de conteo basado en un lquido vehculo, que per-
mite el pasaje de las clulas a travs de la zona de detec-
cin, condujo al anlisis multiparmetro en la misma clula
combinando las seales de varios sensores. Segn el fa-
bricante, la zona de deteccin puede ser: ptica, de conduc-
tancia, de impedancia o una combinacin de todas; y los
sensores colocarse para observar la dispersin frontal de la
luz, la dispersin lateral, la dispersin en ngulo estrecho
o amplio, la dispersin de la luz polarizada o la uorescen-
cia. Las tecnologas de cada una de las aplicaciones de los
instrumentos actuales se resumen en el cuadro 27-2.
Impedancia de la abertura
Al principio cuando el citoplasma es parcialmente eliminado
en los leucocitos, la impedancia de la abertura (g. 27-4),
como se describi antes, dar una medicin del tamao
como demarcadores entre poblaciones celulares. El desa-
rrollo de sistemas de asistencia diagnstica se considera
como otra mejora en la capacidad del laboratorio para in-
terpretar hallazgos diferenciales electrnicos.
Ambos sistemas diferenciales de tres y cinco partes estn
provistos con algoritmos indicadores, alertando al usuario
de posibles alteraciones morfolgicas o de otro tipo, requi-
riendo la revisin de los datos o de alguna otra forma de
intervencin, como una revisin de la morfologa.
Citometra de ujo y dispersin de luz
Los conteos de WBC y los diferenciales en los instrumen-
tos Sysmex XE se determinan usando citometra de ujo
combinada con un lser semiconductor. Se obtiene infor-
macin celular usando la dispersin de luz frontal para
determinar el volumen celular; la dispersin de luz lateral
para evaluar la estructura interna de la clula, y la luz uo-
rescente lateral para dar informacin sobre los cidos nu-
cleicos RNA/DNA. Aspirando la muestra de sangre en seis
canales separados con diferentes reactivos, puede aplicarse
un anlisis complejo del grupo para separar todas las va-
riantes normales y anormales de la clula. Los algoritmos
de aprendizaje competitivos permiten la adaptacin ptima
a las diferencias biolgicas entre las muestras, incluyendo
las clulas extremadamente alteradas.
El colorante polimetina se combina con los cidos nuclei-
cos (DNA y RNA nucleares y en organelos citoplsmicos).
El Sysmex XE tiene la capacidad de contar reticulocitos,
50 100 200 300 400 fl WBC
NUM.
REL.
Linfos
50-90 fl
Monos
90-160 fl
Granulocitos
160-450 fl
Figura 27-4 Una presentacin del histograma del canal 256 de
la poblacin celular de WBC entre 35 y 450 , usando slo datos
de impedancia de la abertura. Reproducida con el permiso de la
compaa Beckman Coulter
del ncleo y de la granularidad citoplsmica. Usando este
mtodo slo es posible cuanticar linfocitos, monocitos y
granulocitos.
Impedancia de la abertura y dispersin de luz
Los instrumentos Beckman Coulter realizan la diferencia-
cin de cinco poblaciones con tres mediciones simultneas
sobre cada clula: volumen (v), usando impedancia de la
abertura estndar; conductividad (c), empleando ondas
electromagnticas de alta frecuencia; determinacin de la
complejidad celular y dispersin de luz (s), midiendo las ca-
ractersticas de la supercie celular y la lobularidad de cada
clula (anlisis VCS tridimensional grupal, g. 27-5).
Los algoritmos adaptables de anlisis grupal despla-
zan en gran parte el uso temprano de discriminadores jos
Figura 27-5 Anlisis VCS tridimensional grupal. Reproducida
con el permiso de la compaa Beckman Coulter.
de reconocer las plaquetas que contienen RNA, de reco-
nocer y de contar los RBC nucleados y de distinguir clu-
las con caractersticas de clulas progenitoras hematopo-
yticas (HPC), que pueden utilizarse para predecir un au-
mento de clulas CD34
.
Citoqumica y dispersin de luz
Las series de instrumentos de la compaa Bayer derivan un
diferencial a partir de dos canales. El canal de la peroxidasa
utiliza una reaccin citoqumica en la cual la peroxidasa de
neutrlos, eosinlos y monocitos acta sobre un sustrato,
4-cloro-l-naftol, para generar una reaccin que se transfor-
ma en un producto de color negro.
La dispersin de luz, que es proporcional al tamao de
la clula, se graca contra la absorbancia de la luz, que es
proporcional a la intensidad de la reaccin de la peroxi-
dasa. Los neutrlos, los eosinlos, los monocitos y los
linfocitos caen en cuatro grupos, separados por umbrales
electrnicos. Debido a que los baslos caen en la regin
del linfocito, se separan de otras clulas en un canal aparte
con base en su resistencia a la eliminacin cida del cito-
plasma celular. Los baslos que son ms grandes que
otras clulas se clasican por dispersin frontal. Este ca-
nal tambin se emplea para detectar blastos. La dispersin
frontal se graca contra la dispersin de luz de ngulo alto
para medir la densidad y la lobulacin nuclear (g. 27-6).
Conteo plaquetario
Desde que se identicaron a mediados del siglo xix como
el polvo sanguneo, las plaquetas han presentado un desa-
fo en trminos de exactitud de las tcnicas de conteo. Las
terapias modernas requieren exactitud, no slo en el rango
clnico crtico, sino tambin en la capacidad para diferen-
ciar eritrocitos pequeos y plaquetas grandes. Las plaquetas
pueden contarse y clasicarse por tamao con impedancia,
la dispersin de la luz, una combinacin de las dos y la cito-
metra de ujo que usa la uorescencia (g. 27-7).
Impedancia
Los instrumentos de la compaa Beckman Coulter utilizan
impedancia para obtener una cuenta plaquetaria, que se de-
riva del nmero de clulas bajo la curva (g. 27-8). Usan-
do software apropiado para la curva, la exactitud de esta
cuenta se mejora cuando las plaquetas presentes superan
el volumen de los 20 femtolitros (). La cuenta plaquetaria
fuera del lmite de 35 ft se ampla hasta 70 .
Conteo plaquetario ptico
La gama de instrumentos Advia de la compaa Bayer
combina las seales de dispersin en ngulo alto (5 a 15)
y en ngulo bajo (2 a 3) para cada clula. stas se transfor-
man en volumen que se graca sobre un eje vertical y los
valores del ndice de refraccin sobre el eje horizontal para
dar un citograma de la dispersin plaquetaria (g. 27-9).
Las lneas curvas representan una cuadrcula del ndice de
refraccin variante a lo largo de la cual las plaquetas caen.
Tambin se graca el ndice de refraccin contra el rango
del volumen plaquetario, pueden separarse las macropla-
quetas y los eritrocitos.
Figura 27-6 La dispersin frontal se graca contra la dispersin lateral. Reproducida con el permiso de Sysmex UK Ltd.
Combinacin de impedancia y conteo ptico
La variedad de instrumentos Sysmex XE emplea un ca-
nal de impedancia cuando la cuenta y un canal de uo-
rescencia fallan en situaciones anormales. Las mediciones
plaquetarias se realizan usando la dispersin frontal para
determinar el tamao, la dispersin lateral que considera
la estructura interna y la uorescente que mide los cidos
nucleicos RNA/DNA teidos.
Cuentas inmunoplaquetarias
De esta manera por conteo ptico y por impedancia, el Cell-
Dyn 4000 y el Sapphire cuentan las plaquetas midiendo la
uorescencia verde del CD61. Un anticuerpo monoclonal,
presente en uno de los reactivos, se une al antgeno CD61
localizado en todas las plaquetas normales. El isotiocianato
de uorescena (FITC) es el colorante que se emplea, que
uorece cuando se excita a una longitud de onda de 488
nm. Esta tcnica es til cuando se observan una gran canti-
dad de fragmentos de RBC o de WBC.
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Figura 27-7 Fluorescencia gracada contra dispersin lateral. Reproducida con permiso de Sysmex UK Ltd.
2 10 20
Volumen celular (fl)
RBC
PLT
Cuenta de
partcula
Figura 27-8 Grca de Coulter que muestra la distribucin del
tamao celular de las plaquetas (PLT) y de los eritrocitos (RBC).
Figura 27-9 Citograma de la dispersin plaquetaria. 1, pla-
quetas; 2, plaquetas grandes; 3, RBC; 4, fragmentos RBC; 5.
detritus; 6, fantasmas de eritrocitos. Reproducida con permiso
de Bayer plc.
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28
Mtodos para la identicacin
de hemoglobinopatas
Nick Jackson y Anne Sermon
Introduccin
Las hemoglobinopatas y las talasemias son los trastornos
genticos heredados ms comunes. Los defectos molecula-
res se localizan en los genes que codican para la globina
y afectan la sntesis de hemoglobina (Hb) en el eritrocito
en desarrollo. Clnicamente se maniestan como anemia
hemoltica y la herencia es del tipo autosmica recesiva o
codominante. Por lo general, las mutaciones que generan
una hemoglobinopata son diversas; el estudio y la carac-
terizacin del gen humano de la hemoglobina pueden uti-
lizarse como ejemplo para mostrar la mayor parte de los
tipos conocidos de mutacin gentica. Los defectos clni-
cos signicativos se encuentran en los genes y (locali-
zados en los cromosomas 16 y 11, respectivamente), pero
las mutaciones que es posible identicar en cualesquiera
de los genes que codican para la globina generan altera-
ciones cualitativas y cuantitativas en la sntesis de Hb. Las
hemoglobinopatas producen una variante de Hb estruc-
tural anormal; las talasemias surgen de una reduccin en
la tasa de sntesis en uno o ms de los tipos de cadenas de
globina.
Las mutaciones puntuales que conducen a las sustitu-
ciones de aminocido o a la terminacin anormal de la
transcripcin del gen explican la mayor parte de los de-
fectos del gen que codica para la globina y son tpicas de
las hemoglobinopatas y de la -talasemia. La supresin
del gen es la causa comn de la - y -talasemia. En la
actualidad hay ms de 1 000 variantes identicadas del gen
para la globina, que pueden dividirse ampliamente dentro
de los grupos siguientes: a) clnicamente silenciosas (la
mayor parte); b) hemoglobinas talasmicas; c) hemoglobi-
nas inestables; d) hemoglobinas con anidad alterada para
el oxgeno; e) efectos atpicos diversos, por ejemplo, de la
hemoglobina falciforme (HbS).
La HbS es la variante clnica signicativa ms comn
de la Hb, y en el estado homocigtico (HbSS) o en combi-
nacin con la HbC o el rasgo -talasemia produce proble-
mas graves de salud. La isquemia del tejido, secundaria a la
aglomeracin de clulas falciformes aguda resulta en crisis
dolorosas y con un potencial fatal. La HbS es la ms comn
en las poblaciones oriundas del sub-Sahara, frica, pero
tambin se encuentra en gente de India, de Arabia Saudita y
de la cuenca del Mediterrneo. Las talasemias se localizan
en poblaciones de todas las reas tropicales del mundo y del
Mediterrneo. El tamizaje se dirige por lo general a aquellas
poblaciones tnicas en riesgo de portar estos genes, pero con
el aumento del mestizaje tnico el tamizaje puede llegar a
aplicarse en forma universal para no omitir algunos casos o
individuos portadores.
Tcnicas de tamizaje
La metodologa actual de tamizaje permite la deteccin rpi-
da y la identicacin exacta de los trastornos clnicos signi-
cativos de la hemoglobina, as como sus estados heteroci-
gticos. Estas tcnicas tambin son conables para aplicarse
en el tamizaje de recin nacidos en la deteccin de una en-
fermedad que no se sospecha, as como la condicin del in-
dividuo portador. Es posible determinar el riesgo gentico
a travs de la identicacin de los portadores y ofrecer el
diagnstico prenatal del feto. Se establecen polticas en la
mayor parte de los laboratorios para el tamizaje de adultos
y recin nacidos. Las tcnicas para el diagnstico prenatal
de fetos se basan en el anlisis de DNA y es una aplicacin
comn en centros nacionales de salud.
Para una interpretacin integral de los resultados del
anlisis de Hb en un individuo, la informacin siguiente
debe estar disponible: edad, sexo, origen tnico, condicin
clnica actual (p. ej., si hay embarazo o no) y conteo san-
guneo completo (FBC). Para aquellos con microcitosis del
eritrocito (MCV < 80 ), una medida conable del estado
de hierro se requiere (p. ej., de la ferritina srica) para ex-
cluir deciencia de hierro. Las muestras de los pacientes
sealados para el tamizaje deben entonces canalizarse a
travs de un protocolo exible de las investigaciones de
laboratorio, que puede incluir la cromatografa lquida
de alto rendimiento (HPLC) o la electroforesis, la solu-
bilidad falciforme y la medicin de los niveles de HbA
2

y de HbF. El diagnstico de la mayor parte de los esta-
dos del portador comn y de la enfermedad, es decir - y
-talasemia, HbS, HbC, HbD y HbE, puede conseguirse
comnmente con la evaluacin de estos parmetros.
Los laboratorios que manejan una pequea cantidad de
muestras pueden utilizar la electroforesis de Hb y la esti-
macin de HbA
2
por microcolumna como sus herramientas
primarias del tamizaje. Sin embargo, con polticas cada vez
ms amplias de tamizaje la mayor parte de los laboratorios
ahora tamizan muestras por HPLC. La electroforesis de Hb
y otras tcnicas se utilizan para conrmar la identidad de
las hemoglobinas variantes que se detectan por HPLC. La
prueba de la solubilidad de la hemoglobina falciforme se
emplea principalmente para la exclusin de los desrdenes
de la clula falciforme antes de la ciruga de urgencia en las
poblaciones en riesgo.
Diagnstico de laboratorio
de hemoglobinopatas y de talasemias
Conteo sanguneo completo, frotis sanguneo y ferritina
En la mayor parte de los estados de individuo portador con
hemoglobinopata estructural el FBC no muestra alteracin,
aunque el frotis sanguneo muestre ciertas caractersticas
(p. ej., las clulas en diana en los rasgos de HbC y de
HbE). El punteado basoflico se halla en el rasgo -talase-
mia y las clulas contradas en forma irregular en el rasgo
-talasemia. Los ndices de eritrocitos son indicadores im-
portantes en la evaluacin para el rasgo de talasemia, que se
caracteriza por microcitosis y una Hb normal o casi normal.
Un volumen celular medio (MCV) < 80 o una Hb celu-
lar media (MCH) < 27 pg indican una posible talasemia,
en particular cuando el recuento de RBC es normal o ele-
vado (> 5 10
12
/L) y la ferritina srica es normal (> 30
g/L). Sin embargo, estos parmetros pueden mostrar una
variacin leve de un laboratorio a otro, segn el mtodo de
medicin automtica y de los rangos normales que asigna
el laboratorio. En el FBC de los pacientes que son sintom-
ticos (p. ej., la -talasemia mayor, HbSS) se observan ca-
ractersticas de la anemia en grados variables y alteraciones
morfolgicas ms graves de los eritrocitos. La policitemia
suele encontrarse en los casos de hemoglobinas con ani-
dad elevada por el oxgeno.
Deteccin, identicacin y cuanticacin
de hemoglobinopatas
Los principios de la deteccin, identicacin y cuantica-
cin de hemoglobinas se basan en la separacin fsica de
las hemoglobinas en solucin, dependiendo de su carga.
Las sustituciones del aminocido en la mayor parte de las
variantes introducen un cambio en la carga supercial total
esencial para su deteccin. Una limitacin de estas tcnicas,
por tanto, ocurre porque las variantes de la Hb no pueden
distinguirse de la HbA si tienen la misma carga supercial.
Para la interpretacin correcta de todas estas pruebas, es
importante asegurarse de que la muestra no se obtenga en
los tres meses posteriores a una transfusin sangunea.
Deteccin e identicacin
Electroforesis
La metodologa bsica de tamizaje descansa en la migra-
cin de una molcula cargada (Hb) en un campo elctrico
hacia un ctodo o un nodo. La fuerza y la polaridad de la
carga se determinan por el pH del ambiente amortiguado.
La tasa de migracin la gobierna el tamao del poro del
medio de la matriz donde se realiza la electroforesis y la
magnitud de la carga sobre la molcula.
El acetato de celulosa es una matriz de uso general barato
y con una vida til indenida; el agar es una alternativa muy
empleada. El pH para el control preliminar es alcalino, jo
a un pH 8.4 a 8.9 con amortiguadores Tris-borato EDTA o
Tris-barbitona. A este pH la mayor parte de las hemoglobi-
nas tienen carga negativa y migran del ctodo hacia el nodo.
En estas condiciones, muchas variantes, aparte de la HbA,
hacen visible la deteccin, es decir, son ms obvias tindo-
las con un colorante especco para protena, por ejemplo,
el Ponceau S o el negro de Amido. El patrn de migracin,
marcado por controles de referencia, puede entonces com-
pararse con un mapa de variantes de hemoglobina para dar
con la identicacin probable. Las tcnicas de pH jas son
274 CAP. 28 MTODOS PARA LA IDENTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS
DETECCIN, IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS 275
relativamente insensibles a la separacin discreta de los
grupos de variantes con cargas similares. A un pH de 8.4,
dos grupos de las variantes comunes comigrantes: HbS,
HbD y HbG; y HbC, HbE y HbO Arab. Esto hace imposi-
ble la distincin entre las variantes de hemoglobina de cada
grupo sin investigacin adicional. Un cambio diferencial
en la carga, en las hemoglobinas, se induce cambiando el
amortiguador a cido (p. ej., a un pH de 6.3, en agar citra-
to), el cual altera la tasa y el patrn caracterstico de migra-
cin. Las movilidades relativas de la variante Hb a un pH
cido y alcalino se reeren en forma cruzada sobre mapas
de las hemoglobinas variantes y esto permite su identica-
cin segura, por ejemplo, a un pH de 6.3, la HbC llega a
diferenciarse de la HbE y de la HbO Arab, y HbS se separa
de la HbD y de la HbG. La identidad de algunas variantes
permanece sin resolver, y puede establecerse con anlisis
adicional por diversas tcnicas, por ejemplo, el isoelectro-
enfoque (IEF) o HPLC. Algunos casos raros requieren la
identicacin de la mutacin a nivel molecular.
Solubilidad de la hemoglobina falciforme
La prueba de solubilidad de la hemoglobina falciforme es
simple, rpida para la presencia de HbS. Un tamizaje positi-
vo no distingue entre los homocigotos y los heterocigotos y
debe tener una sensibilidad debajo de 20% de concentracin
aproximada de HbS. Esta prueba es ms til cuando se re-
quiere un examen rpido, por ejemplo, antes del anestsico
general en un paciente de un grupo tnico en riesgo cuyo
estado de hemoglobinopata es desconocido.
La deteccin de HbS se basa en su insolubilidad relativa
cuando se desoxigena y en la deformacin posterior de la
membrana del RBC en la forma clsica de hoz. En el tubo de
ensayo, la desoxigenacin se induce con ditionito de sodio
con trazas de saponina. Si la HbS est presente, entonces la
forma desoxi se polimeriza para formar cristales tactoides
clsicos. Una prueba positiva conserva un aspecto opaco
(debido a los RBC falciformes en suspensin), mientras que
la desoxihemoglobina en muestras negativas da una solucin
clara de hemoglobina. Hay otras seis variantes raras que tam-
bin tienen caractersticas de falciformacin. Este examen
no es exclusivo para HbS, sino ms bien para hemoglobinas
falciformes. La identidad debe conrmarse siempre por
electroforesis. Inversamente, una banda de la variante que
emigra en la posicin de la HbS debe conrmarse siempre
con una prueba de solubilidad falciforme.
Este examen es insensible a niveles muy bajos de HbS,
como en aquellos encontrados en los recin nacidos, y por
tanto sin utilidad alguna como parte del examen neonatal.
Sin embargo, es posible emplearla para detectar el gen HbS
en individuos donde no est disponible la electroforesis
como primera lnea de investigacin, por ejemplo, en pases
del Tercer Mundo.
Isoelectroenfoque (IEF)
El isoelectroenfoque es una forma muy sensible y mucho
ms sosticada de electroforesis que se basa en la separa-
cin de hemoglobinas segn su punto isoelctrico. Los an-
folitos de bajo peso molecular portadores con un rango de
puntos isoelctricos se incorporan en el gel o el agar de po-
liacrilamida para crear un gradiente del pH. Para los prop-
sitos de separacin de Hb, se utiliza un rango del pH de 5.5 a
8.5. Como las hemoglobinas emigran a travs del gradiente,
llegan a ser neutrales en su punto isoelctrico (pI) y se de-
tiene la migracin, es decir se enfocan en su pI. Puesto que
el pI es especco en la carga supercial en una molcula,
incluso las hemoglobinas con una carga diferenciada muy
pequea se separan en forma discreta. En geles prefabrica-
dos, las hemoglobinas de manera reproducible se enfocan
en el mismo lugar, para obtener, de tal modo, mayor certeza
de la identicacin en una sola separacin (g. 28-1). De-
bido a la sensibilidad elevada del IEF, aun las variantes que
estn presentes en concentraciones muy pequeas pueden
determinarse, por ejemplo, con Constant Spring, variantes
A
2
, H, de Bart. Esta tcnica, por tanto, tambin es conve-
niente para efectuar el tamizaje sanguneo a partir de sangre
del cordn umbilical de los recin nacidos.
Cuanticacin
La cuanticacin de las fracciones de la Hb se usa princi-
palmente en la distincin de los rasgos - y -talasemia en
gente con microcitosis H de RBC y estado normal de hierro.
Esto tambin tiene valor en: a) la caracterizacin adicional
de algunas variantes, por ejemplo, en las variantes de la cade-
na , HbE; b) el diagnstico de sndromes compuestos de
hemoglobinopatas; c) el diagnstico de los desrdenes de la
persistencia hereditaria de la Hb fetal (HPFH), y d) la super-
visin de los regmenes de transfusin en desrdenes de las
clulas falciformes. La estimacin de las fracciones de Hb
puede conseguirse con una variedad de tcnicas, incluyendo
la separacin de la variante por electroforesis, seguida por
elucin, cromatografa en microcolumna, HPLC, inmunodi-
fusin radial y ELISA.
Cromatografa en microcolumna
La cromatografa en microcolumna se emplea mucho para
determinar el porcentaje de HbA
2
en la deteccin del rasgo
-talasemia, pero puede tambin modicarse para la cuan-
ticacin de fracciones importantes, por ejemplo, de HbS.
El principio de separacin depende de la adsorcin y la
unin de las molculas de Hb cargadas a una resina con una
cadena lateral polar. Durante la adicin de un amortiguador
desarrollador a la columna, a la protena ligada se le des-
plaza con iones cargados ms fuertes del amortiguador, de
ah el trmino cromatografa de intercambio inico. Las
hemoglobinas que se desplazan se lavan despus a partir
de la resina en la elucin. La estimacin del porcentaje de
concentracin de la fraccin entonces se mide contra un
total diluido por densitometra ptica. La celulosa DEAE
(dietilaminoetil) es una resina de intercambio de aniones,
Figura 28-1 Representacin diagramtica del isoelectroenfoque en capa na de hemoglobinas normales y algunas variantes estructura-
les de la hemoglobina. IB
1
e IB
2
son hbridos ferrosos-frricos de la HbA. (Cortesa del Dr. Yves Beuzarda).
DETECCIN, IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE HEMOGLOBINOPATAS 277
que se acompaa con un amortiguador glicina-KCN o Tris-
HCl, pH de 8.3.
El rango normal para la HbA
2
es de 1.8 a 3.5%, con
niveles elevados (hasta cerca de 7.5%) indicando el rasgo
-talasemia. Los niveles fronterizos (3.3 a 3.7%) necesi-
tan interpretacin cuidadosa, y posiblemente un anlisis
del DNA, para conrmar normalidad o una talasemia (
+
)
leve. En el rasgo -talasemia, el nivel de HbA
2
puede ser
normal o bajo. Los niveles reducidos de HbA
2
tambin se
encuentran en la deciencia de hierro grave, enfermedad
de HbH y -talasemia.
Medicin de HbF
La HbF abarca < 1% en adultos normales, y se incrementa
un poco en cerca de la mitad de los portadores de -tala-
semia. La HPFH y la -talasemia producen niveles sig-
nicativos elevados de HbF y se distinguen por mantener
normales, en lugar de reducidos, el MCV y el MCH res-
pectivos. La prueba Kleihauer es probable que tambin sea
til, pues algunos tipos de HPFH son pancelulares (con
una distribucin uniforme de HbF en los RBC), mientras
que otros son heterocelulares (con una distribucin he-
terognea de HbF en los RBC). En -talasemia, la dis-
tribucin tpica es heterocelular. Sin embargo, puede ser
necesario realizar un anlisis de DNA para estar seguro de
esta distincin, en especial si la -talasemia es una condi-
cin coexistente posible que causa un MCV bajo.
Un mtodo de uso frecuente en el anlisis de HbF lo
introdujo primero Betke y se basa en la desnaturalizacin
selectiva de otras hemoglobinas por el lcali, dejando la
HbF intacta, que es resistente. Una solucin lisada diluida
se somete a una incubacin ja de 2 min con NaOH, que
oxida todas las dems fracciones que contiene. Las meta-
hemoglobinas resultantes se precipitan con una solucin de
sal saturada, que tambin neutraliza la oxidacin. La HbF,
que permanece en la solucin puede separarse del precipi-
tado por ltracin, o mejor por centrifugacin de alta ve-
locidad. La proporcin de la fraccin de HbF se determina
por densitometra ptica contra una dilucin de Hb total.
Un nivel de HbF < 1% es el rango normal del adulto; 1 a
5% se encuentra en 50% de los portadores de -talasemia;
5 a 20% es caracterstico del rasgo -talasemia y algunos
casos de HPFH; 20 a 45% es caracterstico de la HPFH
pancelular tipo africano. En algunos casos homocigotos, la
HbF puede representar > 90% de la Hb total.
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
La HPLC combina la deteccin, la identicacin y la cuan-
ticacin de hemoglobinas en una sola tcnica y es muy
adecuada para examinar una gran cantidad de muestras de
manera rpida, exacta y econmica. El principio de sepa-
racin es el mismo de la cromatografa en microcolumna,
aunque la resina tiene una cadena lateral de poliaspartato,
es un intercambiador catin y la fase uida es un ion Cl.
El anlisis se automatiza con un automuestreador de inyec-
cin sobre la columna y una bomba que ejerce una presin
constante del amortiguador de elucin en la parte superior
del lisado. Esto controla y regula el tiempo de elucin. El
aumento de la sensibilidad de la separacin es enorme con
el empleo de dos amortiguadores, que dieren en la concen-
tracin del ion o el pH o ambos. Las fracciones de Hb son
eluidas en forma secuencial de la columna por la creacin
de un gradiente de elucin, conseguido al mezclar las dos
fases uidas. Esto permite la separacin de las variantes de
hemoglobina previas sin identicar, es decir, D de G, y E
de O. La densidad ptica de los eluidos se mide directo cuan-
do pasan desde la columna y se trazan de forma continua
para crear un cromatograma (g. 28-2). La identicacin
se consigue por la comparacin de los tiempos de reten-
cin contra los de las variantes de hemoglobina conocidas.
Los componentes principales y menores pueden cuanti-
carse con exactitud integrando el rea bajo cada pico; las
- y -talasemias se distinguen con facilidad, pues el nivel
de HbA
2
se calcula de manera automtica. Se recomienda
que la identidad de una variante de Hb que se detecta por
HPLC se conrme con una segunda tcnica (p. ej., electro-
foresis o solubilidad de la hemoglobina falciforme).
Figura 28-2 Diagrama del empalme de los cromatogramas por
HPLC de las variantes comunes de Hb.
Deteccin de cuerpos de inclusin de RBC
La reaccin redox de la tincin supravital se utiliza para
teir los cuerpos de inclusin del eritrocito que se forman
de derivados de Hb. Esta propiedad es til en la caracteri-
zacin adicional de los desrdenes de la Hb.
La HbH es un tetrmero que se forma con el excedente
de cadenas (
4
) en la -talasemia y es perceptible por
electroforesis o HPLC cuando existen cantidades signica-
tivas (es decir, en la enfermedad de HbH). La HbH intracelular
es soluble pero muy inestable y se precipita por incubacin
con azul brillante de cresil. El precipitado se ja a la mem-
brana del RBC para dar un aspecto tpico de pelota de
golf a los RBC, con los cuerpos mltiples teidos. Las in-
clusiones de HbH estn presentes en 1 a 2 clulas/1 000 en
el rasgo -talasemia, pero pueden ser difciles de detectar
al microscopio. Son mucho ms numerosas y visibles en la
enfermedad de HbH.
Los cuerpos de Heinz (vase hemoglobinas inestables)
no son perceptibles en un frotis teido con Romanowsky
estndar, pero s como precipitados intracelulares grandes,
redondos y normalmente solos despus de la incubacin
con violeta de metilo. Su presencia comn se detecta slo
en la hemlisis aguda y no puede ser obvia si la funcin
esplnica est intacta o si la tincin se realiza sobre sangre
muy fresca.
Deteccin de hemoglobinas inestables
La inestabilidad molecular de la Hb puede surgir de la
sustitucin del aminocido en los grupos de unin hem,
las reas de contacto o en el interior del hueco del gru-
po hem. Estos defectos coneren debilidad en los contactos
hem-globina y en las estructuras tetramricas o helicoida-
les totales. Esto conduce a una tolerancia reducida a estrs
siolgico, con una tendencia a la oxidacin irreversible
del hierro del grupo hem y de la precipitacin intracelular
de Hb bajo la forma de cuerpos de Heinz. Hay ms de 180
hemoglobinas inestables conocidas, algunas de las cuales
conducen a las anemias hemolticas congnitas de cuerpos
de Heinz, con una gravedad dependiente de la naturaleza y
de la posicin del defecto molecular.
La electroforesis no es en particular til en el diagnsti-
co de la enfermedad de Hb inestable, puesto que la mayor
parte de estas mutaciones no muestra cambio en la carga
neta de la molcula. La inestabilidad se detecta cuando se
emplean dos controles de desnaturalizacin basados en la
exposicin a un solvente o en la precipitacin por calor.
Las muestras deben estar frescas, y la sangre del cordn
puede utilizarse como un control positivo (la HbF tiene una
intolerancia relativa al calor y al estrs hidrofbico compa-
rada con la Hb normal adulta).
Prueba de inestabilidad al calor
Este control somete la hemoglobina a una incubacin de
50C, lo que ejerce estrs adicional sobre las fuerzas de van
der Waals internas ya debilitadas, y producir subunidades
al disociar con ms facilidad de lo normal.
Prueba de estabilidad al isopropanol
La incubacin con isopropanol induce estrs hidrofbico.
El isopropanol es ms polar que el agua y debilita las unio-
nes hidrofbicas, permitiendo que el agua entre en el hueco
del grupo hem y facilite la oxidacin del hierro del grupo
hem. En ambos controles, la hemoglobina normal perma-
nece en solucin, mientras que las variantes inestables se
detectan con la oculacin y precipitacin variables.
Anlisis molecular
Las tcnicas estndares de control descritas antes son ade-
cuadas para la deteccin y la caracterizacin de las mutacio-
nes comunes, pero se limitan a identicar variantes raras y a
especicar los defectos de la talasemia. La identicacin de
la alteracin molecular exacta es esencial para los propsi-
tos de asesoramiento gentico, diagnstico prenatal y, algu-
nas veces, para el manejo clnico. Esto se logra con el an-
lisis del DNA genmico que se extrae, y luego se amplica,
a partir de leucocitos de la sangre perifrica, o de muestras
de las vellosidades coriales (CVS) para el diagnstico pre-
natal. En el desarrollo de las tcnicas de diagnstico para el
anlisis de DNA se ha logrado un progreso rpido que es
reciente. Una descripcin con detalle de las tcnicas y sus
aplicaciones est ms all del alcance de este captulo. Sin
embargo, en seguida se da una breve resea sobre el uso de
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagns-
tico de la hemoglobinopata.
La PCR se aplica sobre todo para la deteccin de las mu-
taciones puntuales, deleciones y polimorsmos del DNA.
Esta tcnica amplica una regin del DNA de inters, con
sencillez y de manera muy rpida, y en particular es apro-
piada para el diagnstico prenatal, puesto que requiere slo
de una muestra muy pequea que puede obtenerse por CVS
cerca de las 12 semanas de gestacin.
El principio de la PCR implica la sntesis de DNA usando
iniciadores sintticos (secuencias cortas de DNA de cadena
sencilla), los cuales anquean la regin del DNA de inters,
y una DNA polimerasa termoestable (polimerasa Taq). La
amplicacin enzimtica de cantidades grandes de DNA
permite la visualizacin directa de los fragmentos de
DNA teidos en un gel de agarosa. Una sola sustitucin
de base puede identicarse por el cambio en el tamao del
fragmento del DNA despus de la digestin del producto
de la PCR con enzimas de restriccin que reconocen se-
cuencias especcas de DNA, seguida por una hibridacin
del tipo Southern blotting. Sin embargo, esto consume
tiempo e involucra el uso de radioistopos.
Se han desarrollado nuevas tcnicas, que se basan en la
PCR, que permiten la prueba para mutaciones especcas
sin el uso de enzimas de restriccin o de radioistopos si
el defecto molecular exacto que se busca ya es conocido,
permitiendo as que los resultados estn disponibles en un
lapso de 24 horas. Una tcnica as es el sistema de am-
plicacin refractaria de la mutacin (ARMS), cuando
se emplean iniciadores especcos para el alelo. En esta
tcnica dos iniciadores diferentes se utilizan, uno comple-
mentario al alelo normal y el otro al alelo mutado, que
dieren slo en el sitio de la mutacin. Los iniciadores dan
un producto de PCR slo si el iniciador y las secuencias
de DNA son complementarios. As, los iniciadores normal
y mutante amplican los alelos normal y mutante respecti-
vos. Usando esta tcnica, el DNA del paciente puede exa-
minarse para una mutacin especca del gen, por ejem-
plo, HbS. Se han sintetizado iniciadores para
A
,
S
,
C
,
E
y la mayor parte de los genotipos comunes de -ta-
lasemia. En -talasemia, un nmero limitado de defectos
se encuentra con frecuencia en cada grupo tnico. As, el
origen tnico del paciente determina primero el empleo de
una serie particular de iniciadores en el anlisis, con una
alta probabilidad de identicacin positiva en el primer
control.
La GAP-PCR es una tcnica con la cual se detectan
huecos grandes (deleciones) en el DNA, y es til en el
diagnstico de las formas comunes de
+
y
0
talasemias,
que son sobre todo originadas por delecin. Tambin se
utiliza en el diagnstico molecular de Hb Lepore, -ta-
lasemia y las formas delecionales de HPFH. La PCR mul-
tiplex es una tcnica til para la demostracin/exclusin
simultneas de un nmero de mutaciones diferentes (p.
ej., en todas las
+
y
0
talasemias conocidas) en una sola
prueba. Las tcnicas que se basan en la PCR que se men-
cionan antes se utilizan cuando se examinan mutaciones o
deleciones especcas. Sin embargo, si el defecto molecu-
lar permanece indeterminado, la mutacin supuesta puede
identicarse secuenciando de modo directo el gen.
Agradecimientos
Gracias a Jaspal Kaeda FIBMS PhD (Leukaemia Unit, Im-
perial School of Medicine, Hammersmith Hospital, Lon-
don) por la ayuda con la seccin PCR, y a Yvonne Elliott
CSI FIBMS (Walsgrave Hospital, Coventry) por la revisin
crtica del manuscrito.
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Introduccin
La enfermedad de von Willebrand (vWD) fue descrita pri-
mero por Erik von Willebrand en 1926 en varios miembros
de una familia grande del archipilago land, en Finlandia.
En 1953, se identica una relacin entre la disminucin
de la actividad procoagulante del factor VIII (FVIII) y la
vWD, lo que condujo a cierta confusin referente a la natu-
raleza de la protena responsable de la hemolia A y de la
vWD. Pero slo hasta nales de la dcada de 1970 se logr
una mejor comprensin de las estructuras inmunolgica y
molecular del FVIII y del vWF que llevaron al mapeo ge-
ntico y la clonacin del cDNA que codica para el FVIII
en 1986 y del vWF en 1989.
La vWD es el ms comn de los desrdenes sanguneos
congnitos, con un fenotipo heterogneo. Deriva de de-
fectos cuantitativos (tipos 1 y 3) o cualitativos (variantes
del tipo 2) del vWF en plasma o plaquetas, o ambos. Esta
glucoprotena multimrica grande (10 a 20 10
6
kDa)
tiene dos papeles importantes en la hemostasis; actuando
como portador y protector proteoltico del FVIII, y como
mediador de la adherencia plaquetaria al subendotelio, des-
pus de una lesin vascular. El vWF se sintetiza en las c-
lulas endoteliales y en los megacariocitos por medio de la
transcripcin del mRNA de aproximadamente 9 kb resul-
tante a partir del gen del vWF de 180 kb sobre el extre-
mo telomrico del cromosoma 12 en 12p13.2 S pter (g.
29-1). Los estudios de localizacin que usan una sonda de
cDNA para la porcin media del vWF identican no slo
el gen autntico en este cromosoma, sino tambin una se-
cuencia del seudogn en el cromosoma 22 en 22q11-23.
Este seudogn tiene 21 a 29 Kb de longitud, con un DNA
genmico que corresponde tanto a exones como intrones de
la regin codicante de los exones 23 a 34 del gen del vWF
y con slo 3.1% de divergencia en la secuencia. El gen
del vWF tiene 52 exones, mide aproximadamente 178 kb,
que codican un producto de traduccin precursor (Prepro-
vWF) de 2 813 aminocidos (aa) con una repeticin interna
grande de dominios homlogos. El propptido (de 763 aa)
y la subunidad madura (de 2 050 aa) del vWF se componen
de dominios que se repiten en el siguiente orden: D1-D2-
D-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Antes de la
secrecin, el vWF experimenta un procesamiento postra-
duccional extenso, que incluye la eliminacin del proppti-
do D1-D2, seguida por la glucosilacin con oligosacridos,
12 N-ligados y 10 O-ligados, y multimerizacin. Algunos
de los oligosacridos N-ligados del vWF tienen la carac-
terstica rara de portar determinantes del grupo sanguneo
del ABO. Varios dominios funcionales (g. 29-1) se han
identicado en la molcula del vWF, y la mayor parte de
las mutaciones responsables de varios tipos de la vWD se
han mapeado en estas regiones.
Los resultados a partir de pruebas fenotpicas y genot-
picas forman la base del diagnstico y de la clasicacin
de los diferentes tipos de vWD. Sin embargo, como surgen
ms detalles de estos tipos de pruebas, un diagnstico ms
exacto y la clasicacin compleja se hacen regularmente.
Una clasicacin revisada de vWD fue publicada en 1994,
pero no se ha modicado y, como de manera continua se
identican ms mutaciones responsables de cada tipo de
vWD, se ha propuesto una nueva clasicacin basada en
defectos y mutaciones funcionales. En el ao 2003, en el
XIX Congreso de la Sociedad Internacional de Trombosis
y Hemostasia en Birmingham, Reino Unido, varias ponen-
cias enfatizaron la necesidad de una nueva clasicacin de
vWD, con base en el diagnstico molecular y el anlisis
29
Investigaciones especiales del factor de von Willebrand
Mohammad S Enayat
282 CAP. 29 INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND
multimrico mejorado del vWF. Con tantos pacientes in-
clasicables en el grupo tipo 1 de vWD, ahora se sugiere
que tal mtodo multimrico mejorado puede ayudar en la
clasicacin futura de estos pacientes.
En este captulo se describen tres pruebas fenotpicas
especiales que se utilizan ahora para el diagnstico y la cla-
sicacin de la vWD. Son el anlisis multimrico de vWF:
Ag, usado para el diagnstico diferencial de todos los tipos
de vWD variante; la agregacin plaquetaria inducida por
la ristocetina, esencial para el diagnstico de la vWD tipo
2B; y nalmente el ensayo de la unin vWF/FVIII para
el diagnstico de vWD tipo N Normanda. Aunque no
hace mucho tiempo que el gen del vWF fue identicado,
las pruebas moleculares ahora se introducen extensivamen-
te, y tambin se describen una breve metodologa y algunas
estrategias para la deteccin de la mutacin.
Pruebas fenotpicas
Anlisis multimrico del VWF
En 1981 una electroforesis en gel de SDS, bajo condiciones
no reductoras, permiti la alta resolucin de los multmeros
vWF:Ag y fue divulgada por Ruggeri y Zimmerman. Este
mtodo original se ha modicado y mejorado desde enton-
ces, pero el principio del mtodo es el mismo. Las modi-
caciones incluyen variaciones del mtodo actual, tipo de
Figura 29-1 Representacin esquemtica del gen y de la protena del vWF humano. De arriba hacia abajo: caractersticas estructurales
del gen, seudogn y cDNA del vWF; localizaciones y numeracin, antigua y nueva, del pptido seal (SP), del vWF prepropptido y
maduro. El vWF prepro contiene 2 813 (2 050 numeracin antigua) aminocidos, de los cuales 1-22 (-22-1 numeracin antigua) son pp-
tidos seal, 23-763 son propptidos y 764-2 813 son subunidades maduras. Las cajas rotuladas denotan regiones de dominios homlogos
internamente repetidos; localizaciones aproximadas del grupo de mutaciones responsables de diversos tipos de vWD; puentes disulfuro
Al y A3 y posiciones de los dominios funcionales; posiciones de los enlaces disulfuro responsables de la dimerizacin y de la multime-
rizacin del vWF. La glucoprotena de la plaqueta Ilb-IIIa (
llb
3) se une a la secuencia Arg-Gli-Asp (RGD) indicada en el dominio C1.

PRUEBAS FENOTPICAS 283
medio en el cual se separa la protena, semiautomatizacin,
y diversos tipos de anticuerpos y mtodos de visualizacin
de las bandas del multmero. Todos estos mtodos se utili-
zan para la identicacin de alteraciones cualitativas del
vWF:Ag, tal como son vistos en la vWD variante o tipo 2,
donde hay prdida de multmeros de peso molecular alto o
intermedio, o ambos. Para el anlisis comprensivo del mult-
mero del vWF:Ag usado en el diagnstico y clasicacin de
la vWD tipo 2, vWF:Ag del plasma y de la plaqueta deben
examinarse en geles de agarosa a concentraciones del 1.0 al
2.2%. El mtodo descrito aqu es la modicacin de Enayat
y Hill (1983) del mtodo original de Ruggeri y Zimmerman
(1981). Esta es una electroforesis en gel de agarosa-SDS
usando una tcnica en gradiente amortiguador. La visuali-
zacin de la banda del multmero es mediante autorradio-
grafa, usando un anticuerpo anti-vWF mono o policlonal
marcado con
125
I. Tambin es posible utilizar otros mto-
dos no radiactivos para la visualizacin de la banda des-
pus de transferir las bandas del multmero de los geles de
agarosa en diferentes tipos de ltros.
Preparacin de gel
Un sistema de sndwich hecho de una pieza del gel unida a
una pelcula (Flowgen), cubierto por una placa de vidrio y
separada de una segunda placa de vidrio por un espaciador
de plstico en forma de U de 1 mm de grueso, se utiliza
para preparar los geles. El gel (Agarosa LGT tipo VII; Sig-
ma) se vierte entre las placas de cristal y, despus de que se
ha jado, se quita la placa del cristal superior, y una tira de
3 cm de la parte superior de gel se corta y se sustituye por un
gel concentrador compuesto de agarosa a 0.8% (Agarosa de
SeaKem HGT (P), Flowgen Instruments Ltd). Los pozos
de la muestra se cortan en el gel aglomerante. Las muestras
que deben aplicarse se incuban por 30 min a 56C en un
amortiguador que contenga colorante azul de bromofenol,
para vigilar la migracin molecular, y dodecil sulfato de so-
dio (SDS) para la dispersin completa de las molculas del
vWF y aportar una carga negativa a todos los multmeros.
Condiciones electroforticas
Cada instrumento de la electroforesis se optimiza para este
mtodo pero, por lo general, la electroforesis se realiza r-
pidamente a 2 mA/cm al inicio, para que las muestras se
muevan de los pozos al gel concentrador. Los pozos vacos
se llenan de gel concentrador fundido y la electroforesis se
realiza durante toda la noche a una velocidad ms baja, 1.0
mA/cm. Cuando se completa la electroforesis, los geles se
jan en una solucin de isopropanol, se secan con presin
y se lavan con una solucin de suero de conejo al 10%. La
autorradiografa se realiza incubando en los geles el anti-
cuerpo (DAKO Ltd) de vWF antihumano marcado con
125
I
durante la noche. Despus de un lavado minucioso para
eliminar el anticuerpo sin reaccionar, los geles se secan y
se aplican a placas autorradiogrcas de rayos X y se alma-
cenan a 7C de 2 a 5 das antes del revelado.
Interpretacin de los resultados
La autorradiografa es un mtodo muy sensible y, cuando
se vara el tiempo de exposicin, se pueden obtener dife-
rentes autorradiografas con diversas intensidades de la
seal del mismo gel. El patrn normal del vWF:Ag en plas-
ma muestra la gama completa de bandas del multmero que
corresponde al factor de von Willebrand. ste se compone
de multmeros de peso molecular alto, intermedio y bajo
(g. 29-2). Cada banda del multmero se integra con un
tro de bandas, una central principal y dos bandas satlites
borrosas pero tambin teidas (a y b). La mejor extensin
de los multmeros de vWF:Ag se observa en gel de agaro-
sa de media resolucin (1.3 a 1.5%), la prdida de mult-
meros de peso molecular alto se investiga mejor en geles
de agarosa de baja resolucin (1.0 a 1.3%) (g. 29-2A), y
las anormalidades del tro de bandas en geles de agarosa de
alta resolucin (1.8 a 2.2%) (g. 29-2B). Por tanto, para un
anlisis multimrico completo deben usarse dos o tres con-
centraciones diferentes del gel. sta no es una tcnica f-
cil y cada corrida puede variar y necesitar la optimizacin
individual de las condiciones electroforticas. El anlisis
densitomtrico de cada patrn multmero puede tambin
ayudar en la cuanticacin de la cantidad de multmero
ganada o perdida en algunos pacientes con vWD tipo 2A
(g. 29-2C).
Las bandas del multmero del vWF:Ag en la plaqueta
normal son diferentes a aquellas observadas en el plasma.
Hay multmeros ms grandes presentes en las plaquetas ms
que en el plasma, y la organizacin multimrica tambin es
diferente (g. 29-3). Las bandas de multmeros ms peque-
as parecen estar compuestas de un do, y las bandas cen-
trales emigran menos que los multmeros correspondientes
en el plasma. La informacin del anlisis del multmero de
la plaqueta puede ayudar a decidir el tipo de tratamiento
de algunos pacientes con vWD tipo 2A y corresponder al
tipo de mutacin presente en ellos.
Ensayo de la agregacin plaquetaria inducida
por la ristocetina (RIPA)
Una de las funciones principales de la glucoprotena del vWF
es promover la adherencia de plaquetas al subendotelio en el
sitio de la lesin vascular, a travs de la interaccin profunda
con GPIb en el complejo receptor GPIb-IX (glucoprotena
IB-IX) en la membrana plaquetaria. Este dominio funcio-
nal que mapea el dominio A1 del vWF desempea un papel
importante en la hemostasis primaria. Los defectos en este
dominio dan lugar a aumento en la anidad del vWF por el
GPIb plaquetario. Sin embargo, esto no causa trombosis sino,
paradjicamente, sangrado. Este fenotipo raro de una varian-
te del tipo 2 de la vWD se reere como tipo 2B, y su anor-
malidad funcional caracterstica se detecta por el ensayo de
la agregacin plaquetaria inducida por la ristocetina (RIPA).
El antibitico ristocetina induce la unin del vWF al GPIb
plaquetario en el plasma rico en plaquetas (PRP) y el gra-
do de aglutinacin plaquetaria con diversas concentraciones
de ristocetina forma la base de este ensayo. Aparte de esta
alteracin, 2B vWD tambin se caracteriza por la ausencia
selectiva de multmeros de peso molecular alto (HMWM)
en el plasma, y es identicada por el anlisis multimri-
co del vWF:Ag. De hecho, los pacientes con la vWD tipo
2B pueden sintetizar una gama completa de multmeros
del vWF, como se muestra por patrones del multmero del
vWF:Ag multimrico normal en plaquetas y clulas endo-
teliales, pero los HMWM son eliminados de la circulacin
por la anidad incrementada del vWF anormal del receptor
GPIb plaquetario.
La metodologa RIPA descrita aqu es una modica-
cin del trabajo original referido en 1977. La ristocetina
(Paesel-Lore) se reconstituye en una solucin salina Tris
amortiguada, pH 7.4, y cinco soluciones diferentes, dando
Figura 29-2 Las autorradiografas de diferentes patrones vistos en los multmeros del vWF:Ag en el plasma del tipo 2A (carril 1), 2D
(carril 2), 2B (carril 3), normal (carril 4) y vWD tipo 1 (carril 5) sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (A) y al 1.8% (B).
El tro de la banda 2 es marcado por una llave, y las bandas satlites a y b pueden verse mejor en la banda 1 del plasma en la vWD tipo 2A
(carril 1). La echa en la parte superior del gel seala la lnea entre los geles concentrador y separador. La direccin de la electroforesis
es de arriba hacia la parte inferior. (C) Un gel al 1.0% que muestra la migracin de multmeros de gran peso molecular, segn lo visto en
la Vincenza tipo 2 (1) y algunos pacientes con vWD tipo 2 no clasicados (2). El panel siguiente ilustra el anlisis densitomtrico de uno
de los dos geles anormales y el rea de los multmeros de gran peso molecular.
concentraciones nales de 0.50, 0.1, 0.125 y 0.15 mg/ml,
se preparan para usarse en el anlisis. La PRP se prepara
centrifugando las muestras sanguneas de la prueba y del
control a 800 rpm durante 10 minutos. La cuenta plaque-
taria en el supernadante (PRP) se ajusta aproximadamente
a 250 10
9
/L. Se aaden 200 l de la sangre del paciente
o del control normal (blanco) a las cubetas que contienen
una barra magntica para agitar y se colocan en los blo-
ques de calentamiento a 37C del agregmetro plaquetario
Bio/Data de 4 canales por 2 minutos. Cada cubeta enton-
ces se inserta en uno de los canales del agregmetro y se
comienza la agregacin. Se aaden 20 l de ristocetina (co-
menzando con la muestra menos concentrada) a cada uno
de los especmenes. Se permite la agregacin durante un
mnimo de 3 minutos. Un trazo del patrn de la agregacin,
que es proporcional a la luz transmitida, se imprime; un
patrn tpico se muestra en la gura 29-4. Las muestras de
vWD tipo 2B requieren menos ristocetina para alcanzar un
patrn de agregacin comparable a las normales.
Ensayo de la unin vWF/FVIII
El vWF y el FVIII mantienen una relacin estrecha y en
el plasma forman un complejo molecular no covalente. La
integridad del dominio de unin del FVIII en la molcula
del vWF es un factor importante para la formacin de ste,
y para la estabilidad y transporte del complejo vWF/FVIII
en el plasma. En una investigacin de varios casos de vWD,
se observ que el vWF tiene una capacidad de unin al-
terada hacia el FVIII, causando la reduccin en el nivel
de este factor, lo que conduce a una condicin similar a la
hemolia A leve. A esta condicin se le reere inicialmen-
te como seudohemolia; ms tarde se le reconoce como
anormalidad del vWF y se renombra Normanda (rea de
donde provino el primer paciente denido) o vWD tipo 2N.
Los multmeros de vWF:Ag en esta variante de la vWD son
normales, pues los defectos mutacionales presentes en estos
pacientes no afectan el mecanismo de multimerizacin del
vWF. Recientemente se han mapeado mutaciones espec--
cas, dentro del vWF y los responsables de esta condicin en
los dominios D y D3, y la mayor parte de las mutaciones se
agrupan en los exones 18 a 24, entre Arg 19 y Cis 297.
El mtodo descrito aqu para determinar la unin del
FVIII al vWF es la modicacin de Nesbitt et al. (1996)
del mtodo que se populariza originalmente. Una concen-
tracin conveniente de un anticuerpo monoclonal anti-vWF,
MAS 533p (de la compaa Sera Lab), se une a las placas
de microtitulacin (Immulon 4, laboratorios Dynatech) in-
teraccionando durante toda la noche a 4C. Las placas se la-
van dos veces en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, a un pH
de 8.0 (TBS), conteniendo BSA a 0.1%. Diluciones seriales
del plasma del paciente que contienen 1 U/dl, 0.5 U/dl, 0.25
U/dl y 0.125 U/dl del vWF:Ag se agregan al amortiguador
TBS que contiene BSA al 3% y se incuba otra vez duran-
te toda la noche a 4C. Se lavan las placas como antes y
el FVIII endgeno en las muestras se elimina incubando
con 0.35 M CaCl
2
por una hora a temperatura ambiente.
Un FVIII recombinante (de la compaa Bioclate, Baxter) a
0.05 U/ml se diluye en TBS/BSA al 1% con CaCl
2
10 mM y
Tween 20 al 0.002% se adiciona y se incuba por dos horas a
37C. Despus de lavar el FVIII ligado al vWF se determina
usando el equipo cromognico Coamatic FVIII (de la com-
paa Quadratech) y se realizan lecturas a 405 nm.
Los resultados se gracan como porcentaje de dilucin
del vWF:Ag contra la absorbancia a 405 nm para la vincu-
lacin del FVIII. En el ejemplo que se describe aqu (g.
29-5), las muestras que se usan son de un control normal,
un control homocigoto y dos pacientes heterocigotos con
vWD tipo 2N (P1 y P2) con la mutacin de Thr28Met
como controles positivos. Para la determinacin de cual-
quier resultado anormal, debe utilizarse una gama de mues-
tras control normales.
Pruebas genotpicas para identicar la mutacin
Tamizaje para mutaciones
Las mutaciones relacionadas con todos los tipos de vWD
se han identicado desde nales de la dcada de 1980. Sin
PRUEBAS GENOTPICAS PARA IDENTIFICAR LA MUTACIN 285
Figura 29-3 Autorradiografa que muestra diferentes patrones
del multmero observados en el vWF:Ag normal del plasma (Pls)
y de la plaqueta (Plt), separacin electrofortica en agarosa a 1.4%.
La echa en la parte superior del gel seala los pozos donde se co-
loc la muestra. Dos echas pequeas en la parte inferior indican
el patrn de la banda doble mejor observada en agarosa al 1.4%.
Obsrvese la presencia de los multmeros de peso molecular muy
alto en la muestra de la plaqueta.
Figura 29-4 Un trazo tpico del patrn de agregacin en plasma
de un individuo normal con plaquetas en presencia de diferentes
concentraciones nales de ristocetina.
embargo, por el gran tamao y complejidad del gen vWF
y la presencia del seudogn en el cromosoma 22, con la ex-
clusin de grandes deleciones, por lo general existe menos
informacin sobre defectos moleculares de la vWD tipo
1 y tipo 3 que del tipo 2. La investigacin de las mutacio-
nes responsables de los subtipos 2A, 2B, 2N y 2M tiene
ms xito porque es el resultado de los datos aportados por
los estudios del fenotipo. Una regin sensible a las pro-
teasas dentro del dominio A2, cercana al sitio de digestin
de Tyr 842 a Met 843, se informa como la que genera los
cambios estructurales similares a aquellos que se observan
en 2A vWD, y este dominio se seala para detectar la mu-
tacin en la 2A vWD. En la 2B vWD, donde hay mayor
anidad por el GpIb plaquetario, los estudios de la detec-
cin de la mutacin se dirigen al dominio A1 del vWF, que
contiene el dominio funcional de la unin con el GpIb. De
hecho, casi todas las mutaciones responsables de estos dos
subtipos de vWD se han detectado en el exn 28, donde
mapean los dominios Al y A2 del vWF. De manera similar,
los exones 18 a 24 se estudian para detectar la mutacin en
la vWD tipo 2N. En 1993 se public una base de datos de
mutaciones puntuales, por insercin y delecin identica-
das en la vWD, junto con una gran cantidad de polimor-
smos que se encuentran en el vWF. Sin embargo, puesto
que esta lista aumenta continuamente mientras ms infor-
macin llega a estar disponible, una nueva base de datos en
lnea de la mutacin y del polimorsmo del vWF se crea
y mantiene por un consorcio de investigadores de la vWD
en Internet. Este sitio ahora ha cambiado y existe uno nue-
vo a nombre del Comit Cientco y de Normalizacin
de la ISTH para el vWF, que mantiene la Universidad de
Shefeld del Reino Unido. Este sitio Web (http://www.she
feld.ac.uk/vWF) contiene la informacin actualizada so-
bre las mutaciones y polimorsmos ms recientes que se di-
vulgan sobre el gen para el vWF. Aunque la mayor parte de
estas mutaciones reportadas se comprueban con estudios
funcionales, donde el vWF recombinante se expresa en un
cultivo de la lnea celular en la cual la mutacin se intro-
duce por mutagnesis dirigida al sitio, otras tienen todava
que expresarse. En algunas de las mutaciones divulgadas el
gen completo del vWF no se ha investigado para excluir la
posibilidad de cambios en otra parte.
En la vWD tipos 1 y 3, donde las mutaciones se po-
dran encontrar en cualquier parte a lo largo del gen del
vWF, se ha reportado el uso de diferentes tcnicas para
una bsqueda preliminar como son: la deteccin por medio
del corte qumico de la unin alterada entre las cadenas de
DNA (CMCD), la electroforesis en gel que detecta cam-
bios conformacionales (CSGE) o la electroforesis en gel
de gradiente desnaturalizante (DGGE). Para el tamizaje de
la mutacin por CMCD, todo el gen del vWF se amplica
en siete fragmentos del cDNA, que se obtienen por la trans-
cripcin inversa del mRNA ilegtimo encontrado en lin-
focitos perifricos por medio de la reaccin en cadena de
la polimerasa (RT-PCR). Estos segmentos pueden entonces
tamizarse por CMCD para la mutacin. La DGGE es tan
sensible como CMCD, pero requiere la sntesis de inicia-
dores especiales y el uso de la tcnica de electroforesis en
geles. La metodologa de CSGE es un mtodo de deteccin
simple y no radiactivo; sin embargo, implica amplicacio-
nes y anlisis de hasta 60 fragmentos para el anlisis del
gen que codica para el vWF.
Deteccin e identicacin de la mutacin
Secuenciacin de DNA
Los mtodos de tamizaje tales como CSGE y CMCD iden-
tican slo la posicin y a veces el tipo de un cambio mo-
lecular en un segmento pequeo del gen, y donde pudieran
encontrarse mutaciones. La naturaleza real de la mutacin,
sin embargo, slo podra determinarse por la secuencia-
cin directa del DNA. Los mtodos ms antiguos para la
preparacin de productos PCR de DNA de cadena sen-
cilla necesarios para la secuenciacin (usando cebadores
biotinados apropiados y perlas magnticas revestidas con
estreptavidina, o por PCR asimtrica) han sido sustituidos
en la actualidad por la secuenciacin cclica. Este mtodo
se basa en la sntesis de una hebra nueva de DNA a par-
tir de una cantidad pequea de la plantilla de doble hebra
original en un proceso de secuenciacin cclica, emplean-
do una enzima Taq termoestable especial y dideoxi-dNTP
marcados con compuestos uorescentes. Con la introduc-
cin de los analizadores genticos automticos con 16 a
Figura 29-5 Unin del FVIII al vWF de un control normal, de
dos pacientes heterocigotos, P1 y P2, con la mutacin Thr28Met y
un control homocigoto con la misma mutacin.
96 sistemas capilares de electroforesis, es posible ahora
realizar centenares de secuenciaciones por da.
Despus de la deteccin de una mutacin, sta puede
caracterizarse por mutagnesis dirigida al sitio y expresar-
se en un cultivo de lnea celular o por uno de los siguientes
mtodos:
1. Anlisis de la endonucleasa de restriccin. Una sola
sustitucin del par de bases puede crear o eliminar un si-
tio para la restriccin de la enzima endonucleasa. Para la
conrmacin de tal cambio, los productos de restriccin
de PCR relevantes obtenidos por el corte de una de
las cientos de enzimas de restriccin pueden analizarse
por electroforesis en agarosa o en gel de poliacrilamida,
y las bandas de DNA obtenidas por corte se visualizan
por medio de tincin con bromuro de etidio. Dentro del
tipo 2NvWD casi todas las mutaciones reportadas pue-
den detectarse de esta manera.
2. Hibridacin con oligonucletido iniciador especca de
alelo (ASO). En mutaciones donde no hay disponible
una enzima de restriccin para detectar el cambio, un
anlisis ASO-H o dot-blot puede utilizarse. Aqu se sin-
tetiza un oligonucletido corto (cerca de 15bp) con se-
cuencias del tipo silvestre y del mutante. Los productos
PCR puricados del exn relevantes se desnaturalizan
en NaOH. Los productos obtenidos por PCR tanto del
alelo normal como del paciente del exn apropiado se
aplican a tiras de nylon Hybond N
+
(Amersham Inter-
national), manualmente o con un aparato disponible en
el comercio. Las tiras de nylon del ltro entonces se hi-
bridan con los dos diferentes tipos de oligonucletidos
marcados con
32
P-ATP, usando el fragmento Klenow (de
la compaa Pharmacia) de la DNA polimerasa I. Des-
pus de las hibridaciones, las tiras del ltro se lavan tres
veces en concentraciones que dieren de SSC con SDS
por 10 a 20 min a una temperatura ptima determinada
empricamente para cada sonda del ASO. Por medio de
la exposicin a una autorradiografa, es posible visuali-
zar muestras positivas (hibridacin positiva) y negativas
(hibridacin negativa).
En la actualidad, por lo menos se listan 40 mutaciones de
sentido equivocado, cuatro microdeleciones y una inser-
cin, en la base de datos, como las alteraciones causantes
de la vWD tipo 2A. Una forma dominante rara de la vWD
tipo 2A (formalmente tipo IID) se encontr como causal de
una mutacin de sentido errneo en el dominio CK del car-
boxiloterminal. Una serie de mutaciones de sentido err-
neo responsables de la vWD tipo 2B se ha identicado
ahora, y todas se agrupan en el dominio 2A del vWF, que
contiene el dominio de la unin funcional con el receptor
GPIb. Con pocas excepciones, todas se connan a un pp-
tido corto (540 a 578 aminocidos). La mayor parte de las
mutaciones frecuentes son R1306W, R1308W, V1316M y
R1341Q, que explican cerca del 90% de las vWD tipo 2B.
Quince mutaciones de sentido equivocado, en los dominios
D y D3 relacionados con los exones 18 a 24, aparecen ac-
tualmente en la base de datos para la vWD tipo 2N, siendo
la mayor parte mutaciones de sentido equivocado R854Q.
Ya que las mutaciones para los tipos 1 y 3 podran estar
presentes en cualquier parte de los 52 exones del gen del
vWF, la deteccin de estas alteraciones en estos tipos de
vWD fue lenta y slo unas pocas, con grandes deleciones,
se han reportado al principio de la dcada de 1990. Sin em-
bargo, en la actualidad con la introduccin y la facilidad
relativa de secuenciacin directa de DNA, una gran canti-
dad de mutaciones se han comunicado para la vWD tipo 3,
sobre todo en forma homocigota en pacientes de familias
con matrimonios consanguneos. Como resultado de un
estudio europeo multicentro (MCMDM-1vWD) y de un es-
tudio canadiense en el diagnstico y el control de la vWD
tipo 1, muchas ms mutaciones se identican actualmente.
Estos resultados indican que las mutaciones heterocigotas
de sentido equivocado en el vWF maduro son una causa im-
portante de la vWD tipo 1, y que varios otros tipos de muta-
ciones pueden dar lugar a niveles reducidos en la expresin
del vWF y contribuir a este fenotipo de la vWD.
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Introduccin
Las plaquetas son fragmentos pequeos de citoplasma de
megacariocito con un dimetro medio de 1 a 2 m y un vo-
lumen medio de 5 a 8 , teniendo una vida media en la cir-
culacin perifrica de 1 a 10 das. Su funcin es mantener
la integridad de la pared vascular e iniciar la homeostasis
al daarse la red vascular. Su funcionalidad puede dividirse
en tres reas principales: adherencia al endotelio vascular;
agregacin entre s, y liberacin de productos qumicos en
el plasma. Este captulo describe el principio bsico de las
tcnicas usadas para investigar cada una de estas reas.
La prdida de esta funcin clnicamente se maniesta
en pacientes con contusin grave, erupciones petequiales o
sangrado prolongado posteriores a traumatismos menores,
como puncin venosa o tratamiento dental. Los pacientes
que presentan estos problemas deben sujetarse a una eva-
luacin de la funcin plaquetaria y a cuanticacin de la
cuenta plaquetaria.
Estructura y funcin
La funcin y la estructura de la plaqueta se relacionan
estrechamente. La membrana externa de la plaqueta es
un organelo muy funcional, que contiene diferentes glu-
coprotenas que atraviesan la membrana celular bilpida
estndar. Varias de estas glucoprotenas activan diferen-
tes vas bioqumicas dentro de la plaqueta para inducir
algunas funciones requeridas como respuesta normal de
la plaqueta. Se ha demostrado que la funcin plaqueta-
ria anormal se debe a falta de expresin de una o ms de
esas glucoprotenas (cuadro 30-1 y g. 30-1). La adhesin
anormal plaquetaria se observa en el sndrome de Bernard-
Soulier, en el cual la glucoprotena de membrana plaqueta-
ria interna ha mostrado ser deciente. Esta glucoprotena
tiene una capacidad de unin especca por el factor de von
Willebrand de la protena plasmtica, cubriendo la matriz
subendotelial expuesta al plasma, de tal forma que adhiere
las plaquetas al sitio de la lesin vascular por medio de la
glucoprotena Ib. La deciencia del complejo de la glu-
coprotena IIb/IIIa causa una alteracin en la capacidad
de las plaquetas para agregarse (g. 30-1). Esta condicin
se conoce como trombastenia de Glanzman. stas y otras
glucoprotenas actan como receptor siolgico para va-
rios agonistas plaquetarios de peso molecular bajo y alto.
Una vez que uno o ms de estos receptores glucoproteni-
cos se han activado, hay una transduccin de seales en
los organelos internos de la plaqueta. Esto es comn que
ocurra va activacin de la enzima fosfolipasa C, la cual
est expuesta a los extremos internos de las glucoprote-
nas transmembranales y a la activacin por sus respectivos
ligandos.
En el citoplasma de la plaqueta se encuentran muchas de
las estructuras internas encontradas en otras clulas secre-
toras; sin embargo, la plaqueta no tiene una gran capacidad
para la sntesis de protenas. La plaqueta contiene un retcu-
lo endoplsmico rugoso y aparato de Golgi muy pequeos
(g. 30-2). Contiene el retculo endoplsmico liso extenso,
que se seala con frecuencia como el sistema tubular den-
so. El citoplasma tambin contiene muchos -grnulos y
grnulos densos. Estos grnulos contienen una variedad
amplia de compuestos qumicos implicados en la respuesta
inamatoria y, principalmente, en la aceleracin del pro-
ceso de la hemostasia localizada. Los -grnulos contie-
nen los factores de coagulacin V, VII y el bringeno,
30
Anlisis de plaquetas
Steven Walton y Peter E. Rose
290 CAP. 30 ANLISIS DE PLAQUETAS
junto con factores de crecimiento para ayudar a la repara-
cin vascular, fundamentalmente el factor de crecimiento
derivado de la plaqueta (PDGF) y el factor de crecimien-
to endotelial (EGF). Otra sustancia almacenada en los
-grnulos es el factor IV plaquetario; es un compuesto
que se analiza y es uno de los principales factores para de-
terminar la respuesta de liberacin plaquetaria.
Los grnulos densos contienen una proporcin grande
de nucletidos plaquetarios disponibles, principalmente
difosfato y trifosfato de adenina y guanina, junto con iones
calcio y magnesio y 5-hidroxitriptamina (5-HT). El ADP
es un acelerador importante para la agregacin plaquetaria,
Cuadro 30-1 Factores implicados en una respuesta plaquetaria
Glucoprotena Funcin
receptora Ligandos plaquetaria
GP IIb-IIIa Vitronectina La agregacin y
Factor de von Willebrand adhesin a ndices
Fibronectina de ujos altos
Fibringeno
GP Ia-IIa Vitronectina Adhesin
Factor de von Willebrand
Fibronectina
Fibringeno
GMP 140 Varias glucoprotenas Interaccin plaqueta
(PADGEM) y glucolpidos a leucocito
mientras que el ATP tiene un efecto inhibidor sobre el ADP
y es, por tanto, una parte del mecanismo de control para lo-
calizar la formacin del trombo. La 5-HT es otro agregador
plaquetario de gran alcance; la membrana de la plaqueta
contiene numerosos receptores para 5-HT. Estos receptores
son miembros de la superfamilia de las protenas G, aco-
plados a un neurotransmisor y un receptor hormonal que se
encuentra en las clulas nerviosas y en el endotelio intesti-
nal en grandes cantidades
Conteo plaquetario
Es importante obtener una cuenta de plaquetas exacta an-
tes de proceder a las pruebas de la funcin plaquetaria.
La cantidad de plaquetas puede estimarse a partir de un
frotis sanguneo analizado por microscopia y teido con
Romanowski. La morfologa de la plaqueta que muestre
el tamao y la granularidad es til en los desrdenes rela-
cionados con plaquetas grandes, como en el sndrome de
Bernard-Soulier.
Las mquinas automatizadas para cuenta sangunea con
capacidad de conteo de plaquetas forman parte del equipo
rutinario de laboratorio (vase el cap. 27). La exactitud ms
grande de las tcnicas manuales permite medir cuentas tan
bajas como 5 10
9
/L y superiores a 1 000 10
9
/L.
Figura 30-1 Representacin esquemtica de los receptores pla-
quetarios
Figura 30-2 Representacin esquemtica de la estructura pla-
quetaria. El diagrama ilustra las estructuras internas principales
de una plaqueta discoide. CS, sistema canalicular conectado a la
supercie; M, mitocondria de la plaqueta; DTS, sistema tubular
denso; DB, cuerpo denso; G, grnulos de la plaqueta; MT, banda
circunferencial de los microtbulos.
INVESTIGACIONES DE LA AGREGACIN PLAQUETARIA 291
Anticuerpos plaquetarios
La disminucin de la cuenta plaquetaria ocurre por una
falla en la produccin medular (p. ej., despus de la quimio-
terapia citotxica) o por un aumento en el consumo de la
plaqueta. La produccin del anticuerpo dirigido en contra
de algn componente de la membrana de la plaqueta o para
una sustancia asociada a la membrana plaquetaria puede
dar lugar a un incremento del secuestro por el bazo. La pre-
sencia de inmunoglobulinas dirigidas contra la membrana
plaquetaria es, por tanto, una investigacin importante. La
presencia de la inmunoglobulina plasmtica dirigida contra
las plaquetas no se correlaciona con la gravedad clnica de
la trombocitopenia autoinmunitaria, mientras que la con-
centracin de la inmunoglobulina ligada a la plaqueta es un
mejor marcador de la actividad patolgica.
La demostracin de la inmunoglobulina unida a la pla-
queta es ms difcil que identicar la inmunoglobulina
relacionada a la supercie del eritrocito. Debido a las canti-
dades bajas de plaquetas y a la dicultad para visualizarlas,
se recomienda el mtodo que emplea un citmetro de ujo
y combinar el reactivo de la globulina antihumana con un
colorante uorescente. Se prepara un plasma rico en pla-
quetas por centrifugacin a baja velocidad. Este plasma se
centrifuga a gran velocidad en presencia de un amortigua-
dor que contiene EDTA o algn otro inhibidor plaquetario
para formar un botn de plaquetas, el cual es entonces la-
vado varias veces para eliminar cualquier plasma atrapado
que contenga globulinas humanas. Finalmente, las plaque-
tas son resuspendidas en albmina bovina al 5%. En segui-
da una alcuota de plaquetas se mezcla con una globulina
antihumana acoplada a isotiocianato de uorescena u otro
uorocromo detectable por citometra de ujo. Despus de
incubar en la oscuridad, las plaquetas se someten a un la-
vado nal con amortiguador PBS EDTA y se resuspenden
en una cantidad suciente de amortiguador para permitir
el ujo fcil a travs del citmetro de ujo. Las plaque-
tas del paciente sin colorante uorescente se usan como un
control negativo. Una reaccin positiva ocurre cuando el
ndice uorescente es ms alto en las plaquetas marcadas
con el uorocromo que en aquellas plaquetas sin colorante.
Tiempo de sangrado
Una de las pruebas ms simples de la funcin de la plaqueta
es el tiempo de sangrado. Se hace una incisin en la piel del
antebrazo, con un dispositivo para el sangrado, y se mide
el tiempo consumido para que se detenga el sangrado. Para
mejorar la reproducibilidad del mtodo, la tcnica se reali-
za haciendo una incisin dual, usando una lanceta cargada
por resorte en el rea convencional. El resorte tiene una
tensin estndar para dar una profundidad reproducible al
corte, mientras que un manguito del esgmomanmetro se
ina a una presin seleccionada de 40 mmHg. El tiempo
hasta que el sangrado cese es medido por un cronmetro y
la deteccin, limpiando el exceso de sangre del brazo con
papel ltro limpio. Cualquier defecto importante de la pla-
queta se registra con un tiempo prolongado, como sucede
en las alteraciones de la protena de von Willebrand.
Adherencia plaquetaria
La primera etapa siolgica de la activacin plaquetaria
es la adherencia de las plaquetas a la matriz subendotelial.
La medicin de la adherencia de la plaqueta es difcil y
es raro que se realice en los laboratorios rutinarios. Se re-
portan varios mtodos que pueden utilizarse para dar una
estimacin neta de la funcin de adhesin plaquetaria. El
ms simple indica tomar una muestra sangunea citratada
sin obstruccin venosa y someterla a un conteo plaqueta-
rio. Una alcuota de la muestra se pasa a presin constante
sobre un tubo que contiene perlas de cristal estandarizadas,
y un segundo conteo plaquetario se realiza en la muestra
emergente. Ahora, el porcentaje de adherencia de la pla-
queta puede calcularse. Una modicacin a esta tcnica es-
tndar usa una matriz subcelular como el colgeno y puede
semejar un cuadro siolgico mejor. Los problemas con la
reproducibilidad de los resultados restringieron el uso de
este mtodo en los laboratorios de investigacin, incluso
en compaas farmacuticas que evaluaban la ecacia de
los frmacos que modicaban la adherencia o la activacin
plaquetaria. Un mtodo ms complejo implica un sistema
para simular la presin venosa normal y requiere la elabo-
racin de un tubo de plstico inerte con un rea de matriz
subendotelial. La sangre entonces se hace pasar dentro del
sistema a tasas siolgicas normales de ujo sanguneo.
Investigaciones de la agregacin plaquetaria
Es probable que la medicin de la agregacin plaquetaria
sea la tcnica ms comn usada en la investigacin de los
desrdenes plaquetarios. Los estudios de agregacin se ba-
san en una tcnica fotomtrica. La agregacin se registra
como el cambio en la absorbancia de una mezcla de plasma
rica en plaquetas cuando los agregados se forman. Cuan-
to ms grandes son los aglomerados, ms pesados son, y
cuando se salen de la trayectoria luminosa se detecta una
transmisin ms alta de la luz. Existen varios agonistas de
uso general, incluyendo ADP, adrenalina, colgeno y el an-
tibitico ristocetina. Esta ltima es un agonista inusual ya
que no tiene ningn efecto directo sobre las plaquetas pero
modica la parte del complejo del factor VIII, conocido
292 CAP. 30 ANLISIS DE PLAQUETAS
como factor de von Willebrand. Cuando se modica, esta
protena cambia de una estructura globular a una lineal.
La estructura lineal entonces une a varias plaquetas y faci-
lita la seudoagregacin. Una respuesta anormal a la risto-
cetina se observa en pacientes con cambios cuantitativos y
cualitativos en la protena de von Willebrand.
Analizador PFA-100 para la funcin
plaquetaria
El dispositivo PFA 100 (Dade) se utiliza cada vez ms en
laboratorios de manera rutinaria para medir el tiempo de
sangrado inducido por colgeno/epinefrina. El dispositivo
mide la formacin del tapn plaquetario sobre un tubo ca-
pilar revestido de colgeno bajo tensin del ujo sangu-
neo. La sangre venosa citratada se conduce a travs de un
tubo capilar para que entre en contacto con una membrana
cubierta con epinefrina, y se activen las plaquetas. Enton-
ces la sangre se aspira a travs de una abertura de precisin
en la membrana, mientras las plaquetas comienzan a adhe-
rirse a la circunferencia hasta formar un tapn estable que
ocluye la abertura. El tiempo de sangrado es, por tanto,
el tiempo transcurrido para que deje de pasar la sangre a
travs de la abertura, y una medicin de la formacin del
tapn plaquetario ex vivo. Esta metodologa representa en
la actualidad la primera lnea de investigacin plaquetaria
en muchos laboratorios.
Investigaciones sobre la liberacin
plaquetaria
Las tcnicas que estudian la liberacin de la plaqueta pue-
den dividirse en dos, las que utilizan radioistopos y las
que emplean la produccin de luz usando la enzima lucife-
rinasa. Las tcnicas isotpicas es posible realizarlas en dos
formas. Las plaquetas pueden incubarse con un radioisto-
po que pueda incorporarse dentro de la molcula bajo in-
vestigacin, tal como 5-hidroxitriptamina (5-HT) marcada
con
14
C para observar la liberacin de 5-HT. En estos m-
todos, el plasma rico en plaqueta se incuba durante un pe-
riodo con un compuesto radiactivo ptimo. Las plaquetas
entonces se separan del plasma y el exceso de radioistopo
se elimina. Para hacer esto, las plaquetas se centrifugan
mediante un gradiente de densidad con albmina, dejando
la pastilla de plaquetas en el fondo y el plasma radiactivo
en la parte superior. Despus la pastilla de la plaqueta se
suspende de nuevo en un amortiguador, se lava otra vez
y se cuenta. Despus de la agregacin plaquetaria con un
agonista potente, el plasma pobre en plaquetas tambin se
cuenta y la cantidad de radiactividad en el plasma pobre en
plaquetas se expresa como un porcentaje de la actividad de
una muestra llena de plaquetas.
Una segunda tcnica que usa radioistopos se emplea
para realizar un ensayo radioinmunitario (RIA). Con esta
metodologa el compuesto bajo investigacin se mezcla con
una porcin del mismo compuesto marcado con un trazador
radiactivo. Se agrega a esta mezcla un anticuerpo especco
para el compuesto bajo investigacin. Despus de la incuba-
cin, el compuesto ligado al anticuerpo se separa del que no
est unido, generalmente por la adicin de carbn activado
y luego por una centrifugacin. Es posible cuanticar la ra-
diactividad en el sedimento o en el sobrenadante libre. Debi-
do a que el anticuerpo se liga en muestras radiomarcadas y no
radiomarcadas en igual cantidad, la proporcin de radiacti-
vidad ligada por el anticuerpo es inversamente proporcional
a la cantidad del compuesto en el plasma bajo investigacin.
El mtodo se cuantica usando concentraciones conoci-
das de plasma control para construir un grco y, entonces,
las lecturas para las muestras se miden a partir del grco.
La quimioluminiscencia es otra tcnica usada en la
investigacin de la reaccin de liberacin de la plaqueta.
sta se basa en la misma reaccin qumica que ocurre en la
lucirnaga, donde el ATP y la luciferinasa reaccionan con
la luciferina para producir fotones de luz. La reaccin
depende de la cantidad de ATP que se produce. Para la re-
accin plaquetaria, se agregan luciferinasa y luciferina a
un vial de la reaccin junto con compuestos que liberan
la plaqueta. La cantidad de ATP en el vial de la reac-
cin determina la cantidad de luz producida. Una pro-
duccin ms alta de luz resulta de una liberacin ms
elevada de ATP a partir de las plaquetas.
Citometra de ujo
La citometra de ujo se utiliza cada vez ms para investigar
la funcin plaquetaria en presencia de anticuerpos dirigi-
dos contra antgenos especcos expresados en las plaque-
tas. La metodologa para la citometra de ujo se discute
en el captulo 32. Para las investigaciones de la plaqueta
hay dos protenas principales que pueden identicarse; las
requeridas para la unin de la plaqueta a la pared celular y
las protenas necesarias para formar agregados plaqueta-
rios. La glucoprotena Ib es un antgeno de supercie que
se requiere para unir las plaquetas a la matriz subendotelial
va el factor de von Willebrand. La glucoprotena IIb/IIIa
es uno de los componentes principales requeridos para la
reaccin de agregacin plaquetaria. Un dcit de la fun-
cin de la plaqueta se puede, por tanto, identicar usando
anticuerpos monoclonales dirigidos contra cualesquiera de
estas protenas.
Para investigar las alteraciones en glucoprotenas aso-
ciadas a la membrana plaquetaria, se prepara un plasma
rico en plaquetas por centrifugacin lenta. El plasma enton-
ces se diluye en uido plasmtico pobre en plaquetas o en
albmina para obtener una cuenta plaquetaria aproxima-
da a 1 10
9
/L. Una alcuota de sta se mezcla con un
anticuerpo monoclonal marcado con uorescencia espe-
cco para la glucoprotena. Despus de la incubacin, la
cantidad completa se diluye otra vez para dar cerca de 0.5
ml. La muestra se analiza, en seguida, con un citmetro
de ujo. Para determinar que es positivo, el ndice de uo-
rescencia debe ser ms alto que el de la muestra control
con las mismas plaquetas del paciente, sin la presencia del
uorocromo. Las plaquetas son el componente celular ms
pequeo de la sangre, y no es necesario lisar los eritrocitos
o eliminar algn detritus de la muestra, pues es simple el
acceso con respecto a las plaquetas que se analizan.
Est aumentando el inters sobre el papel de las plaque-
tas en los desrdenes trombticos. Esto ha conducido a la
investigacin de plaquetas para identicar poblaciones ac-
tivas de plaquetas durante episodios trombticos, por ejem-
plo, despus de reemplazos de la prtesis de vlvula del
corazn. Se han identicado dos marcadores importantes
de la activacin. Uno se debe a los cambios en la conforma-
cin de las glucoprotenas membranales, notablemente en
las protenas IIb/IIIa. Este cambio expone sitios al ambien-
te externo que, en la plaqueta inactiva, se ocultan dentro de
regiones enrolladas de las molculas. Muchos anticuerpos
se generan dirigidos contra estos eptopos de la activacin.
Estos antgenos de la activacin slo son demostrables en
las plaquetas que se han activado con las soluciones dbiles
de trombina y son negativos en las plaquetas sin tratar. Un
segundo tipo de protena de activacin se identica cuando
las partes de los -grnulos se expresan sobre la membrana
supercial de las plaquetas. Esto sucede cuando los gr-
nulos han pasado por el proceso secretorio y la membrana
de stos se ha incorporado a la membrana externa de la
plaqueta. Se les ha nombrado como componente granular
derivado de la activacin plaquetaria para la membrana
externa (PADGEM). Usando anticuerpos dirigidos contra
estos marcadores, solos o combinados, y un citmetro del
ujo con la tcnica discutida antes, es posible determinar la
proporcin de plaquetas activadas.
Tromboelastograma
Un acercamiento ms siolgico y global a la funcin pla-
quetaria se evala usando un tromboelastograma que mide
la coagulacin en funcin de la temperatura, los factores
brinolticos y la funcin de la plaqueta supervisando las
caractersticas fsicas del cogulo y su capacidad para rea-
lizar trabajo mecnico a travs de su desarrollo y degrada-
cin. Se agrega CaCl
2
a la sangre venosa tratada con citrato
dentro de una cubeta a temperatura regulada (37C) que
oscila en un ngulo de 4 45. Un pistn disponible se co-
loca dentro de la muestra inmediatamente despus de la
recalcicacin. El torque de la cubeta rotante se transmite
al pistn sumergido despus de que la relacin plaqueta-
brina acopla a la cubeta y al pistn. La magnitud del mo-
vimiento del pistn depende de la fuerza del acoplamiento,
con cogulos fuertes que mueven el pistn directamente
dentro de la fase con el movimiento de la cubeta. Cuando
el cogulo se contrae o disuelve, las uniones se rompen y
disminuye la transferencia del movimiento de la cubeta. Se
proporciona informacin sobre el tiempo de formacin del
lamento de brina, la cintica de la formacin del cogulo
y la disolucin del cogulo. Este acercamiento se utiliza
cada vez ms en el cuidado intensivo que se establece para
vigilar el estado de coagulacin.
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TROMBOELASTOGRAMA 293
Un servicio de transfusion sangunea del hospital empren-
de tres investigaciones serolgicas importantes: a) identi-
car el grupo sanguneo de un paciente; b) detectar e
identicar los anticuerpos irregulares, incluyendo aquellos
que inducen anemia hemoltica; c) proporcionar compo-
nentes sanguneos compatibles con los pacientes.
Identicacin del grupo sanguneo
Los mtodos de laboratorio aplicados a la serologa de la
transfusin estn cambiando muy rpido para satisfacer una
necesidad creciente de simplicar y automatizar muchos as-
pectos del servicio. Los principios de la serologa, sin em-
bargo, siguen siendo los mismos. Hay aproximadamente
100 antgenos reconocidos en la membrana del eritrocito,
la presencia de los cuales pueden identicarse por la aglu-
tinacin de los eritrocitos al exponerse con el anticuerpo o
el antisuero correspondiente. La mayor parte de los antge-
nos del grupo sanguneo surgen naturalmente, y la exposi-
cin del antgeno puede estimular una respuesta primaria
con anticuerpos en una persona que carece del antgeno. El
aloanticuerpo resultante es especco para ese antgeno, y la
exposicin adicional al antgeno estimula una respuesta r-
pida y prolongada del anticuerpo, con el potencial de inducir
una reaccin signicativa de transfusin. Una hemlisis in-
travascular rpida se produce por la unin del anticuerpo (por
lo general, IgM) al antgeno y activacin de la cascada del
complemento. Esto resulta en incompatibilidad ABO cuan-
do el anti-A o el anti-B, naturalmente presente en el suero
del receptor, se expone al antgeno apropiado. Es normal que
un individuo genere anticuerpos que surgen de modo natural
contra los antgenos AB ausentes en sus propios eritrocitos,
debido a la estimulacin del mismo antgeno encontrado en
otras sustancias biolgicas, tales como polen o bacterias. Un
grupo sanguneo individual puede determinarse agregando
directamente los antisueros especcos a los eritrocitos de
prueba y de manera indirecta con una adicin de eritrocitos
de especicidad antignica conocida a los sueros de prue-
ba. Para determinar un grupo sanguneo de un paciente se
requiere la caracterizacin de los antgenos del eritrocito.
Para determinar el grupo sanguneo de forma rutinaria, es
necesario identicar los antgenos A, B y D. La gente que
expresa el antgeno A en las clulas no produce anti-A pero
puede producir el anti-B. La gente que expresa el antgeno
B no produce normalmente el anti-B pero puede producir el
anti-A, mientras que el grupo O no expresa el antgeno A o
el B. Histricamente, la identicacin del antgeno se realiz
usando anticuerpos puricados de pacientes previamente ti-
picados. Hoy en da, la mayor parte de los anticuerpos de
tipicacin son anticuerpos monoclonales modicados con
qumicos. Para su facilidad de empleo, los anticuerpos co-
merciales tienen un tinte coloreado especco agregado a
los anticuerpos anti-A y anti-B. Un mtodo indirecto para
comprobar el grupo sanguneo de un paciente es hacer
reaccionar el suero de un paciente, que contiene los anticuer-
pos, con clulas de especicidad conocida ABO, lo cual da
un grupo contrario o inverso. As, el suero de un paciente del
grupo A reacciona con las clulas B, los pacientes del grupo
B reaccionan con las clulas A, y los pacientes del grupo O
reaccionan con las clulas A y B. Los escasos pacientes que
poseen los antgenos A ms B no reaccionan con ninguna
clula. Una revisin adicional y parte de la investigacin
para los anticuerpos irregulares es colocar el suero del pa-
ciente con las clulas del grupo O, que no deben reaccionar,
independientemente del grupo sanguneo del paciente.
31
Servicio transfusional del hospital
296 CAP. 31 SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL
Es importante incluir controles negativos apropiados,
como clulas del propio paciente o clulas O. Las clulas
que se utilizan como control son necesarias para identi-
car las reacciones que producen los anticuerpos fros en la
muestra, excepto los anti-A y anti-B.
El sistema rhesus (Rh)
Es el segundo sistema ms importante de grupos sangu-
neos por identicar. Diferente a lo que ocurre en el sistema
ABO, los anticuerpos no estn presentes en forma natural
en ausencia del antgeno; sin embargo, los anticuerpos pue-
den formarse con facilidad despus de la exposicin de c-
lulas rhesus positivas (Rh
+
) en un receptor husped rhesus
negativo (Rh). Los anticuerpos formados, por lo general
IgG, pueden cruzar la barrera placentaria, ocasionando que
en el segundo o subsecuentes embarazos, en los cuales la
madre es Rh y el feto Rh
+
, desarrolle la enfermedad hemo-
ltica del recin nacido (HDN). Es, por tanto, importante
que se realicen todos los esfuerzos para evitar la sensibi-
lizacin de las mujeres en edad de tener hijos al antgeno
D. Los exmenes de grupo sanguneo rhesus se realizan
por duplicado, empleando un anticuerpo IgM monoclonal
anti-D. Los controles positivos y negativos se incluyen en
cada lote de pruebas y los resultados deben evaluarse por
microscopia, despus de la centrifugacin de los tubos,
por 1 min a una velocidad baja. En el Reino Unido, las
directrices nacionales recomiendan el uso de dos reactivos
anti-D diferentes. El antgeno D es un antgeno complejo
compuesto de muchos subantgenos (eptopos) diferentes.
Los anticuerpos monoclonales tienen una especicidad
elevada y pueden reaccionar a eptopos simples; por tanto,
si el eptopo particular al cual el reactivo reacciona est
ausente se obtiene un resultado negativo falso.
Usando estos ocho reactivos (anti-A, anti-B, anti-AB,
anti-D, anti-D2, clulas A, clulas B y clulas O), es po-
sible identicar a los grupos sanguneos comunes (cuadro
31-1).
Cuadro 31-1 Resultados esperados de los grupos sanguneos comunes
Grupo Anti-A Anti-B Anti-AB Clulas A Clulas B Clulas O Anti-D1 Anti-D2
A Rh

A Rh

B Rh

B Rh

AB Rh

AB Rh

O Rh

O Rh

Mtodos para identicar el grupo sanguneo
Hay muchos mtodos que usan estos reactivos bsicos para
conocer el grupo de los pacientes, los cuales pueden divi-
dirse en cinco categoras amplias: a) mtodos basados en
tubos individuales, convencionales, que requieren cerca
de una hora de incubacin a una temperatura ptima de
16C; b) mtodos en tubos individuales mejorados (para
determinaciones de grupos sanguneos rpidamente), que
requieren siempre centrifugacin, se realizan slo para la
tipicacin de la clula; c) mtodos que usan placas de
microtitulacin; d) mtodos que usan una matriz de fase
slida; e) mtodos automticos basados en los principios
de ujo continuo. El mtodo elegido depende del volu-
men de trabajo que se emprenda y de su urgencia. Los m-
todos rpidos empleados con regularidad comprueban slo
los antgenos del paciente sin un anlisis completo.
La visualizacin de los resultados vara dependiendo
del mtodo empleado. Para los mtodos de tubo y de mi-
crotitulacin es necesaria la aglutinacin de los eritrocitos,
que puede interpretarse micro o macroscpicamente. Las
metodologas de microtitulacin y de grupo rpido tienden
a utilizar la visualizacin macroscpica, mientras los m-
todos no realzados se emplean para ser interpretados por
microscopia.
Mtodos de microtitulacin
Las metodologas de microtitulacin permiten que se ha-
gan fcilmente grupos mltiples en lotes. Una placa de
microtitulacin estndar se forma de 96 celdillas en un
bloque plstico slido, alineado en 12 hileras de ocho.
Usando ocho reactivos para un grupo completo, la sangre
de 12 pacientes puede concentrarse en una placa. La vi-
sualizacin de todos los grupos sanguneos en la placa es
rpida, usando contraluz para ver los resultados positivos
y negativos. Hay sistemas disponibles con computadoras y
microrrobtica para automatizar o semiautomatizar los
TAMIZAJE DE ANTICUERPOS 297
sistemas para conocer el grupo sanguneo por microtitula-
cin. Estos sistemas incorporan lectores de placas de mi-
crotitulacin que pueden programarse para identicar los
grupos sanguneos por patrn de reactividad de la placa de
microtitulacin.
Sistemas en gel
Los sistemas en fase de gel se basan en la captura de clulas
que reaccionan en una matriz slida o semislida, con los
resultados negativos que se movilizan a travs del gel. Esto
ocurre para colocar los anticuerpos monoclonales, que se
mencionan antes, qumicamente unidos a la matriz. As, las
clulas que contienen el antgeno correspondiente se unen
(atrapadas en la matriz) cuando son empujadas para movi-
lizarse en el gel al utilizar centrifugacin (g. 31-1). Este
mtodo es en particular til para conocer el grupo sangu-
neo de pacientes en riesgo elevado de portar en la sangre
microorganismos, como el de hepatitis o el VIH. El alto
costo de fabricar los geles que incorporan los anticuerpos
especcos necesita considerarse al incluir esta metodolo-
ga en la prctica de rutina del laboratorio.
Sistemas automatizados
Mtodos automticos que usan equipo que puede utili-
zar la identicacin positiva de la muestra y se requieren
en laboratorios con mucha carga de trabajo. Al utilizar un
equipo automtico reduce el tiempo de manipulacin de
la muestra, y los pacientes se benecian de la eliminacin
de errores administrativos, ya que los resultados pueden
reportarse directo desde la lectura sin transcripcin. El
gran desembolso de capital requerido encarece los siste-
mas automticos, es decir, son demasiado costosos para los
laboratorios con una carga de trabajo baja. La mayor parte
de los laboratorios utiliza dos tcnicas, un sistema rpido
para el anlisis urgente y un sistema rutinario de lote para
el volumen de la carga de trabajo. Las tcnicas rpidas se
realizan para identicar el grupo sanguneo del paciente
en una urgencia cuando se requiere la sangre para la com-
patibilidad cruzada (cross-matching), permitiendo que la
sangre de un grupo sanguneo compatible se seleccione sin
demora.
Tamizaje de anticuerpos
El tamizaje de los sueros del paciente para la presencia de
cualquier anticuerpo irregular ahora es una parte rutinaria
del banco de sangre de los hospitales. Es raro en la ac-
tualidad emprender una identicacin del grupo sangu-
neo sin el tamizaje del anticuerpo al mismo tiempo, con
la excepcin posible de las muestras neonatales, donde la
produccin del anticuerpo no ha comenzado y el tamao de
muestra es pequeo.
Para muchos pacientes que se someten a procedimien-
tos quirrgicos de urgencia y electivos, la investigacin del
grupo sanguneo y el tamizaje del anticuerpo es todo lo que
se recomienda. Esta poltica ha reducido mucho el desper-
dicio de sangre, con la compatibilidad sangunea cruzada
reservada para los procedimientos con una probabilidad
mayor de 30% de requerimiento celular. Para los pacientes
en quienes un anticuerpo signicativo clnico se identica
con el procedimiento de la prueba de tamizaje, una compa-
tibilidad cruzada completa es necesaria.
Existen diferentes propiedades sicoqumicas exhibi-
das por diferentes anticuerpos que son importantes en su
identicacin. Primero, diversos anticuerpos del grupo san-
guneo se distinguen uno de otro con base en que algunos
anticuerpos aglutinan eritrocitos mejor con bajas tempera-
turas (anticuerpos fros), mientras otros son activos a 37C.
Los anticuerpos fros con frecuencia son anticuerpos IgM,
y es posible que no sean detectables o clnicamente signi-
cativos a temperaturas ms altas. Algunos anticuerpos que
surgen en forma natural, como los anti-A y anti-B, aun reac-
cionan a 37C; sin embargo, el ttulo ser mucho ms alto de
Figura 31-1 Anlisis del grupo sanguneo ABO del sistema en gel con una muestra del grupo B Rh
. Reproducida con permiso de

DiaMed-GB Ltd.
0 a 4C. Los anticuerpos calientes son, por lo general, IgG
y aglutinan eritrocitos ms rpido a 37C. Histricamente,
los anticuerpos tambin se han clasicado como completos
o incompletos, dependiendo de la cantidad de aglutinacin
de eritrocitos suspendidos en una solucin salina normal.
Los anticuerpos incompletos no aglutinan eritrocitos bajo
tales circunstancias, y esto conduce a la bsqueda de otras
tcnicas para mejorar la sensibilidad. Los eritrocitos sus-
pendidos en 20 a 30% de albmina bovina pueden ayudar a
identicar muchos anticuerpos incompletos. Otros mtodos
que emplean el polibreno o las clulas tratadas con enzimas
se emplean de rutina. Las enzimas como la tripsina, la papa-
na, la bromelana o la cina se utilizan para eliminar el cido
neuramnico de las supercies de los eritrocitos y reducir
la carga negativa, provocando que el anticuerpo incompleto
aglutine las clulas tratadas con enzimas. Las pruebas sa-
linas a temperatura ambiente, los mtodos de la albmina
y de la enzima se han reemplazado por la prueba indirec-
ta de antiglobina (IAT). La ltima prueba muestra una ele-
vada ecacia en identicar clnicamente los anticuerpos
signicativos, y sin la desventaja de identicar los anticuer-
pos irrelevantes que pueden dar lugar a un serio retraso en el
laboratorio, pues la evaluacin y la identicacin adiciona-
les del anticuerpo son necesarias.
El tamizaje del anticuerpo se emprende al reaccionar
los eritrocitos que contienen la mayor parte de los antge-
nos comunes del grupo sanguneo con el suero del pa-
ciente. Es frecuente mantener una serie de tres muestras
celulares, y los antgenos conocidos en cada muestra celu-
lar se obtienen de una hoja de informacin (g. 31-2).
El tamiz del anticuerpo puede realizarse usando cuales-
quiera de las tcnicas que se emplean en el laboratorio,
pero con mayor frecuencia la prueba indirecta de antiglo-
bulina se utiliza como el tamiz inicial. Esto es, porque la
prueba IAT es la ms sensible para la mayor parte de los
anticuerpos. Usando los nuevos sistemas en gel, se propone
que un tamiz del anticuerpo basado en la IAT negativa y la
seleccin de la sangre ABO Rh compatible sean sucientes
para emplear la sangre en un paciente, y la compatibilidad
cruzada ya no se requiere tanto. En la mayor parte de los
casos esto es verdad, pero hay un riesgo de que la sangre
incompatible pueda usarse en un paciente con anticuerpos
a un antgeno raro.
Prueba indirecta de antiglobulina
La IAT que usa eritrocitos suspendidos en solucin salina
de baja fuerza inica (LISS) es el mtodo recomendado
para el tamizaje del anticuerpo. En solucin salina normal
los grupos ionizados tanto en el antgeno como en el an-
ticuerpo se neutralizan parcialmente con iones opuestos
cargados en la solucin. El tiempo de incubacin mnimo
para las tcnicas de fuerza normal inica es de 45 min y no
es muy recomendado.
Si la LISS se utiliza como medio, las reacciones del an-
tgeno y del anticuerpo son ms rpidas. La LISS es una
solucin de glicina ms sodio que contiene 0.03 M de clo-
ruro de sodio. Es raro que los autoanticuerpos dependientes
de LISS puedan detectarse y, en estas circunstancias, las
tcnicas de fuerza inica normal son tiles.
Las clulas de tamizaje que se utilizan en la deteccin
del anticuerpo deben tener expresin homocigota de los
antgenos apropiados (Rh, Cc, Ee, Jk
a
, Jk
b
, Fy
a
, Fy
b
, Ss).
Se espera que el 99.9% de anticuerpos sea detectado, slo
con anticuerpos en los eritrocitos de muy de baja frecuen-
cia que no es posible visualizar. Despus de la incubacin
del suero de prueba con los eritrocitos de tamizaje, las c-
lulas se lavan para remover cualquier anticuerpo no unido.
Cualquier contaminacin por globulina libre neutraliza el
componente antiglobina en el reactivo antiglobulina, y por
tanto debe evitarse.
El anti-IgG monoespecco puede utilizarse sustituyen-
do un reactivo poliespecco antiglobulina que contenga
sueros anticomplemento, con el mtodo de LISS IAT. Esto
evita la susceptibilidad indeseable hacia la interfase de am-
plitud trmica baja y a los anticuerpos dependientes LISS
que estn ligados al complemento. Cuando se identica un
anticuerpo irregular, es necesaria la investigacin adicional
para identicar la especicidad del anticuerpo.
Figura 31-2 Ejemplo de clulas para el tamizaje de anticuerpos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.
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Identicacin del anticuerpo
Si un resultado positivo se obtiene en cualesquiera de las
clulas de tamizaje del anticuerpo es esencial identicar
la especicidad del anticuerpo. Esto requiere hacer reac-
cionar los sueros con un panel ms grande de clulas tipi-
cadas. Es comn que los paneles comerciales contengan
11 tipos de clulas y se abastezcan con un antigrama de los an-
tgenos correspondientes (g. 31-3). La identicacin del
anticuerpo se produce comparando el patrn reactivo del an-
ticuerpo con el patrn de los antgenos. Si la sangre se re-
quiere para transfusin, slo las unidades negativas para
el antgeno correspondiente deben seleccionarse. Como
en el tamiz del anticuerpo cualquier mtodo puede utili-
zarse, pero es mejor comenzar con la misma tcnica con la
que se obtuvo la reaccin positiva en el tamiz del anticuer-
po. Con frecuencia esta es la IAT. Si los resultados de este
panel son inconcluyentes pueden claricarse con facilidad
repitiendo el panel con una tcnica mejorada enzimtica-
mente. Incluso, si la identicacin es an inconcluyente,
debe utilizarse un panel diferente de clulas. Los resultados
no concluyentes pueden requerir la toma de una muestra
fresca para vericar que el anticuerpo es verdadero y no un
contaminante de la muestra. Si la identidad del anticuerpo
contina como desconocida, es posible que se necesite en-
viar la muestra al centro de referencia, donde permanece
disponible en un panel ms grande donador para ayudar a
la identicacin.
Compatibilidad cruzada
La compatibilidad cruzada es el procedimiento realiza-
do para asegurarse que la sangre del donador potencial es
compatible con el receptor. Una vez que se obtienen los
grupos ABO Rh y el tamiz negativo del anticuerpo, las com-
paraciones de la sangre pueden hacerse de manera directa.
Las unidades donadoras deben, en lo posible, seleccionarse
del mismo grupo ABO y Rh. El tipo de producto del eritro-
cito necesita considerarse; por ejemplo, la sangre comple-
ta, el concentrado de eritrocitos, las clulas con suplemento
agregado, pobre o escaso en leucocitos. Esto depende de
la condicin clnica que se requiere para la transfusin y
de la edad del receptor. Adems, es necesario vericar que
las mujeres menores de 50 aos que donan estn dando
eritrocitos Kell negativos. Esto es necesario porque los an-
ticuerpos producidos contra el antgeno Kell pueden cruzar
la barrera placentaria. Las mujeres estimuladas al producir
anti-Kell por la transfusin, que se embarazan, pueden te-
ner un beb que desarrolle anemia hemoltica in utero.
Una vez que se selecciona el producto correcto, el pro-
cedimiento de compatibilidad cruzada es relativamente
directo, ya que las clulas del donador recolectadas se lavan
y se hacen reaccionar con el suero del receptor. La eleccin
de la tcnica es la misma que se emplea para el tamizaje del
anticuerpo, pero debe incluir un mtodo indirecto con anti-
globulina. Cualquier unidad que da una reaccin positiva no
debe transfundirse. Son muy raros los casos donde es im-
posible obtener unidades compatibles, por ejemplo, en pa-
cientes con autoanticuerpos fuertes en el suero. En estos
pacientes debe realizarse una autocompatibilidad cruzada
(las clulas del receptor contra el suero del receptor). Las
unidades que no exhiben mayor fuerza de reactividad que
en el autocruce autoautlogo pueden usarse.
Todos los autoanticuerpos deben investigarse ms a fon-
do para identicar especicidad y rango trmico del anti-
cuerpo. Para esto es posible que se requieran tcnicas de
elucin.
Mtodos de elucin
Es posible remover los anticuerpos ligados a los antgenos
del eritrocito, sin alterar su especicidad antignica, por un
proceso que se denomina elucin; son tres procedimientos
principales para la elucin: temperatura, pH bajo y solven-
tes orgnicos.
Temperatura
El sistema de temperatura de elucin utilizado con ms fre-
cuencia consiste en calentar los eritrocitos lavados a 56C
por 5 min. Despus de la centrifugacin, el sobrenadante
contiene los anticuerpos. Con el congelamiento de las c-
lulas lavadas suspendidas en albmina se obtiene el mismo
sobrenadante hemolizado, que despus de la centrifuga-
cin est listo para la investigacin. Ambos mtodos son
rpidos y fciles de montar en cualquier laboratorio.
pH bajo
Si los eritrocitos lavados se resuspenden en amortiguadores
con un pH por abajo de 3.5, los anticuerpos IgG pueden
recuperarse de las membranas celulares sin lisis. Aunque
el pH bajo es la tcnica recomendada de elucin, un pH
sobre 10 parece dar mejores resultados para los anticuerpos
IgM.
Solventes orgnicos
Aunque los resultados de los eluidos usando ter o xileno
son muy buenos para los anticuerpos IgG, los riesgos para
los trabajadores por la exposicin a estos solventes restrin-
gen su uso a los laboratorios con campanas de extraccin.
Una vez que la elucin est preparada, se le sustituye por el
suero en un mtodo de identicacin del anticuerpo.
Prctica de la transfusin
La prctica actual de la transfusin hospitalaria debe in-
cluir sistemas para minimizar el uso de los productos san-
guneos en lo posible. La transmisin potencial de virus
patgenos de la hepatitis B, C, VIH y CMV en productos
sanguneos, junto con un riesgo potencial de la enfermedad
de Creutzfeldt Jakob (ECJ), ha promovido la creacin de
medidas para mejorar la seguridad de los productos sangu-
neos. stas incluyen sistemas mejorados para la seleccin
del donador, tamizaje viral de rutina, el uso de productos
inactivados del plasma y agotamiento de leucocitos de
los productos del eritrocito. Las medidas para minimizar
el uso de los productos de transfusin incluyen el uso de
esquemas de ordenamiento mximo de la sangre, el desa-
rrollo de la prctica de transfusin autloga y la partici-
pacin en el sistema que reporta los Riesgos Serios de la
Transfusin (SHOT). El ltimo es un sistema de divulga-
cin voluntario del Reino Unido de diversos acontecimien-
tos serios despus de la transfusin. Los acontecimientos
PRCTICA DE LA TRANSFUSIN 301
adversos agudos incluyen las reacciones hemolticas de la
transfusin, infusin de productos sanguneos contamina-
dos por bacterias, lesin aguda del pulmn relacionada con
la transfusin, sobrecarga de uido, reacciones alrgicas
graves o analaxis y prpura postransfusin. Las complica-
ciones potenciales a largo plazo ocurren por infeccin viral
(vase antes), injerto crnico vs. enfermedad del husped
grave en los inmunosuprimidos, y sobrecarga de hierro. En
todos los casos los riesgos de la transfusin necesitan un
balance contra los de no recibir los productos sanguneos.
Los pacientes deben, por tanto, tener acceso e informrse-
les apropiadamente sobre los riesgos.
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Citometra de ujo y biologa molecular
en la hematologa
Ian Chant
Introduccin
La utilidad diagnstica de la citometra de ujo y de la bio-
loga molecular contina extendindose dentro de diversas
reas de la hematologa clnica. La combinacin de una
aproximacin inmunobiolgica y molecular al diagnstico
y a la vigilancia del paciente ha demostrado ser ms til
respecto de las neoplasias sanguneas que en cualquier otra
rea de la biologa del cncer.
En la citometra de ujo, el desarrollo de nuevos ana-
lizadores automatizados, de mesa de trabajo y las combi-
naciones de anticuerpos monoclonales disponibles en el
comercio permite una aproximacin multiparamtrica al
diagnstico. Con ello se logra una denicin exacta de la
inmunofenotipicacin de clulas especcas. La acumula-
cin de datos de inmunofenotipicacin es importante, no
slo desde un punto de vista del diagnstico sino tambin
en trminos de la evaluacin pronstica. En diferentes neo-
plasias hematolgicas, la expresin o la ausencia de ciertos
antgenos muestra una importancia pronstica. Adems,
la citometra de ujo ahora se utiliza en la vigilancia del
tratamiento, en particular en trminos de la deteccin de
enfermedad residual mnima.
De manera similar, la biologa molecular se contina
extendiendo como herramienta indispensable en el diag-
nstico y vigilancia de la enfermedad. Las tecnologas
moleculares ms importantes de la hematologa de diag-
nstico son la hibridacin in situ uorescente (FISH) y las
metodologas de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Las estrategias moleculares son nicas en la detec-
cin de alteraciones genticas especcas que se observan
en las neoplasias sanguneas. Adems, la demostracin de
la clonalidad en los desrdenes linfoproliferativos se con-
sigue con tcnicas moleculares.
La importancia de un estudio del fenotipo inmunolgico
y molecular combinado para el diagnstico de la leucemia y
del linfoma se demuestra en una publicacin reciente de la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS), que las clasi-
ca en neoplasias hematopoyticas y linfoides. Este sistema
relaciona clasicaciones anteriores con nuevos datos ge-
nerados a partir de la citometra de ujo y de la biologa
molecular, al incorporarlos dentro de un sistema con im-
portancia clnica. Esto se ejemplica por el desarrollo de
las modalidades del tratamiento enfocadas a las alteracio-
nes genticas especcas.
En otras reas de la hematologa, la citometra de u-
jo y la biologa molecular continan evolucionando como
herramientas indispensables para el diagnstico clnico.
La base gentica de las hemoglobinopatas se contina
esclareciendo, mientras que las tcnicas moleculares son
cada vez ms importantes en el diagnstico de las coagu-
lopatas.
En este captulo se delinean los principales usos de es-
tas dos tecnologas en el laboratorio de hematologa y se
ilustra cmo la combinacin de la informacin inmunobio-
lgica y molecular produce un profundo impacto sobre el
diagnstico y la comprensin de la biologa de las altera-
ciones hematolgicas.
304 CAP. 32 CITOMETRA DE FLUJO Y BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA
Citometra de ujo e inmunofenotipicacin
El uso ms importante de la citometra de ujo en el labo-
ratorio de hematologa diagnstica es la identicacin del
linaje celular en leucemias y linfomas. La expresin de an-
tgenos de supercie celular que dependen del linaje y de la
diferenciacin permite el uso de anticuerpos monoclonales
especcos, marcados con uorocromos, para detectar es-
tos antgenos. Los anticuerpos monoclonales que recono-
cen eptopos especcos de antgenos son identicados por
el grupo de designacin numrica (CD). En el momento de
escribir este captulo, se han asignado cerca de 250 nme-
ros de CD y muchos de stos son en particular importantes
en la inmunofenotipicacin de clulas hematopoyticas.
La aproximacin al diagnstico de la leucemia y del
linfoma utiliza un panel de anticuerpos monoclonales que
identica el linaje especco de una poblacin celular, y
provee un fenotipo inmunolgico especco para una su-
puesta poblacin de clulas malignas. Junto con la infor-
macin morfolgica y molecular, este dato de la citometra
de ujo es una herramienta esencial en la clasicacin de la
clula maligna.
Inmunofenotipicacin de leucemias agudas
El objetivo de la fenotipicacin inmunolgica en una leu-
cemia recin diagnosticada es sobre todo discriminar entre
la leucemia mieloide y la linfoide. Esto puede conseguir-
se usando un panel relativamente pequeo de anticuerpos
monoclonales, que detectan antgenos especcos del li-
naje expresados en clulas mieloides o linfoides inmadu-
ras, discriminando leucemias mieloides agudas (AML) de
leucemias linfoblsticas (ALL). El panel inicial del linaje
primero debe diferenciar la clula B de la clula T en ALL
y permitir la denicin adicional del subtipo, por ejemplo,
de marcadores monocticos y megacariocticos en AML.
El cuadro 32-1 muestra un panel tpico de la primera lnea
del anticuerpo para el diagnstico de la leucemia aguda.
Este panel inicial incluye el linaje B (CD10, CD19, CD20,
CD22), el linaje T (CD2, CD3, CD7) y los marcadores
mieloides asociados (CD13, CD33, CD117), otros ms que
ofrecen la informacin sobre el grado de diferenciacin ce-
lular (TdT, CD34).
Leucemias mieloides agudas
Los marcadores mieloides especcos ms tiles usados
para discriminar las clulas mieloides de aquellas de origen
linfoide son CD13, CD33 y CD117. La expresin de ant-
genos linfoides est ausente en clulas AML, a excepcin
de CD7 y de Tdt, que pueden ser positivos en pocos casos.
Las AML son clasicadas por el sistema Francs-Ame-
ricano-Britnico (FAB) sobre fundamentos morfolgicos
y citoqumicos (cuadro 32-2). En AML, aunque no hay
marcadores especcos que distingan los subtipos AML
M1-M5, la inmunofenotipicacin se correlaciona razo-
nablemente bien con el subtipo FAB, algunos marcadores
son expresados preferentemente dentro de ciertos grupos.
stos incluyen los marcadores monocticos CD14 y CD64
en las categoras M4 y M5, mientras que los subtipos ms
raros M6 y M7 de AML pueden caracterizarse por su ex-
presin de antgenos especcos para el eritrocito y para
la plaqueta, respectivamente. Las clulas AML M0 care-
cen de diferenciacin y expresan antgenos mieloides ms
CD34, el marcador hematopoytico de la clula embrio-
naria, mientras que en AML M1 hay generalmente slo
expresin de antgenos mieloides. El cuadro 32-3 enumera
los inmunofenotipos generales vistos en AML en relacin
con su clasicacin FAB.
Cuadro 32-1 Un panel de anticuerpos usados como primera lnea
para determinar el linaje y la diferenciacin en leucemias agudas
Linaje CD3 Pan-T (tambin CD3
linfoide citoplsmico)
CD7 Pan-T
CD19 Pan-B
CD10 Pre-B
CD79 Pan-B (expresin
citoplsmica)
Linaje CD13 Granulocitos, monocitos
mieloide CD33 Progenitor mieloide, monocitos
CD14 Monocitos
CD64 Monocitos
CD15 Granulocitos, monocitos
CD117 Progenitor mieloide
MPO Mieloperoxidasa
Linaje sin HLA-DR Clula progenitora
restriccin CD34 Clula progenitora
Tdt (Expresin nuclear)
Cuadro 32-2 Clasicacin de leucemias mieloides agudas me-
diante el sistema Francs-Americano-Britnico (FAB)
AML M0 AML con inmadurez
AML Ml AML con maduracin mnima
AML M2 AML con maduracin
AML M3 Leucemia promieloctica aguda
AML M4 Leucemia monoctica aguda
AML M5a Monoblstica aguda sin diferenciacin
AML M5b Monoblstica aguda con diferenciacin
AML M6 Eritroleucemia aguda
AML M7 Leucemia megacarioctica
CITOMETRA DE FLUJO E INMUNOFENOTIPIFICACIN 305
La clasicacin reciente de la OMS de AML pone nfa-
sis sobre las caractersticas morfolgicas, inmunofenotpicas
y moleculares, por lo que la AML se clasica de acuerdo
con las alteraciones genticas recurrentes especcas, y
stas se relacionan a menudo con perles inmunofenotpi-
cos especcos. En casos de AML, donde no son eviden-
tes tales alteraciones genticas, stos se describen segn su
grado de diferenciacin y/o de diferenciacin a lo largo de
linajes monoctico, megacarioctico o eritroide. As que, el
inmunofenotipo es esencial en la caracterizacin de las c-
lulas leucmicas de la misma forma que su utilizacin en el
sistema FAB.
Leucemias linfoblsticas agudas (ALL)
Las leucemias agudas de origen linfoide se clasican ruti-
nariamente segn su origen, de clula B o de clula T. Las
clulas ALL de clula T expresan uno o ms de los antge-
nos de clula T (CD2, CD3, CD7) y Tdt. El antgeno CD3
se expresa en el citoplasma en los inicios de la maduracin
de la clula T y es el marcador ms til para T-ALL. Uno
de los primeros antgenos superciales en el desarrollo de
la clula T es CD7, presente en todas las clulas T-ALL.
Las leucemias linfoblsticas de clula B pueden clasi-
carse dentro de tres grupos, de acuerdo a su grado de ma-
duracin, que se relaciona con un fenotipo generalmente
caracterstico. ALL de clula nula, una leucemia inmadura,
tiene clulas que expresan marcadores de clula B (CD19,
CD22) ms TdT y CD34. La ALL comn se distingue por
la presencia de la expresin de CD10, junto con los antge-
nos de clula B y TdT. Las clulas B-ALL expresan todos
los antgenos de clula B comunes pero se distinguen por
la ausencia de TdT y de CD10.
Desrdenes linfoproliferativos crnicos
La citometra de ujo es una herramienta esencial en el
diagnstico de desrdenes linfoproliferativos cronicos o
maduros. La inmunofenotipicacin se disea para de-
mostrar la naturaleza de la clula B o T de la clula ma-
ligna, y para la clonalidad potencial de la expresin
supercial de la cadena ligera o sobre las clulas B. La
Cuadro 32-3 Inmunofenotipos tpicos en AML correlacionados con la clasicacin FAB
CD Anticuerpos M1, M2 M3 M4, M5 M6 M7
Linaje mieloide
CD11b Mo1, Leu 15
CD13 MY7, Leu-M7
CD14 MY4, Mo2, Leu-M3
CD15 Leu-M1
CD33 MY9, Leu-M9
Linaje T
CD2 T11, Leu-5b
CD3 T3, Leu-4
CD5 T1, Leu-1
CD7 3A1, Leu-9
Linaje B
CD10 CALLA, J5
CD19 B4, Leu-12
CD20 B1, Leu-16
Linaje eritroide
Glucoforina A D2.10
CD71 T9
Linaje megacariocito
CD41 gpIIb/IIIa
CD42 gpIb
CD61 gp/IIIa
Clula embrionaria
CD34 MY10, HPCA-1
CD38 Leu-17
No dependiente de linaje
HLA-DR Ia, 13
aproximacin, es para usar un panel de primera lnea de an-
ticuerpos especcos para un nmero de antgenos de clula
B y T, que identican la clonalidad o la expresin del ant-
geno anormal. Un panel de segunda lnea puede aplicarse en
forma selectiva de acuerdo a estos resultados, ms algunas
indicaciones morfolgicas o clnicas pertinentes. El cuadro
32-4 ilustra paneles de primera y segunda lnea tpicos.
Las malignidades de la clula B representan la mayor
parte de los desrdenes linfoproliferativos maduros, y s-
tos se relacionan por lo general con patrones particulares
de la expresin del antgeno de clula B. Adems de la
presencia o ausencia de ciertos antgenos, la interpreta-
cin de datos inmunofenotpicos necesita considerar la
intensidad de la expresin del antgeno, demostrada por
citometra de ujo como intensidad de la uorescencia.
Por ejemplo, en la leucemia linfoctica crnica (CLL), las
clulas B maduras coexpresan CD5 (un antgeno normal-
mente presente en las clulas B) ms CD23. En CLL, los
antgenos CD19 y CD20 de clula B estn subregulados,
al igual que la expresin de cadena ligera supercial. Por
el contrario, las clulas del linfoma de linaje B muestran
fuerte reactividad con CD19, CD20 y con cadenas lige-
ras superciales o . En casos donde un diagnstico de
leucemia de clula pilosa se sospeche sobre bases mor-
folgicas o clnicas, se utilizan anticuerpos para CD11c,
CD25 y CD103, mientras en casos potenciales de posible
proliferacin celular linfoplasmactica o plasmtica, se
incluyen anticuerpos contra CD38 y CD138.
Los desrdenes linfoproliferativos de la clula T ex-
hiben que un traslape de la expresin del antgeno CD y
las clulas malignas muestran a menudo prdida del an-
tgeno o la expresin anormal de los marcadores de c-
lula T. Ciertos marcadores son caractersticos, como la
expresin importante de CD25 en la leucemia de clula T
del adulto (ATLL), el incremento de reactividad con CD7
en la leucemia prolinfoctica de clula T del adulto, y la
expresin de CD56 en la leucemia del linfocito granular
grande (LGL).
En los desrdenes de las celulas B y T, el diagnstico
se basa no slo en el patrn inmunofenotpico revelado por
los paneles del anticuerpo, sino tambin reere los niveles
de la expresin del antgeno, como se detecta por la inten-
sidad de la uorescencia durante el anlisis citomtrico de
ujo. Esto se ilustra en el cuadro 32-5, que muestra los
patrones inmunofenotpicos vistos en estos desrdenes.
Cuadro 32-5 Patrones inmunofenotpicos en los desrdenes linfoproliferativos de clula B y T.
Desrdenes linfoproliferativos de clula B
Desrdenes linfoproliferativos
de clula B CD5 CD 10 CD19 CD20 CD23 CD25 FMC7 o
CLL (w) (w)
PLL (s) (s)
NHL (difuso) (s) (s)
Linfoma de clula manto (s) (s)
Linfoma folicular (s)
Leucemia de clula pilosa (s) (vs)
Desrdenes linfoproliferativos
de clula T
CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD16 CD25 CD56
T-PLL
L-GL
Clula de Szary
Reactividad dbil (w); reactividad fuerte (s); reactividad muy fuerte (vs); leucemia linfoctica crnica (CLL); leucemia prolinfoctica (PLL); linfoma
no Hodgkin (NHL); leucemia linfoctica granular (L-GL).
Cuadro 32-4 Un panel de primera lnea para la investigacin
de una linfocitosis para establecer el linaje celular B y T
Anticuerpo Linaje
Linaje T CD2 Clulas T, clulas NK
CD3 Pan-T
CD4 Colaborador T
CD8 Supresor T
CD7 Pan-T
Linaje B CD19 Pan-B
CD20 Pan-B
CD22 B madura
CD23 B inmadura, CLL
CD103 Clula pilosa
SIg
SIg
BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA 307
Valoracin de la funcin plaquetaria
por citometra de ujo
La disfuncin plaquetaria se observa en una variedad de
desrdenes sistmicos, incluyendo enfermedad renal, insu-
ciencia heptica, desrdenes del tejido conectivo, desr-
denes mieloproliferativos y mielodisplsicos, malignidad y
enfermedad cardiovascular. La disponibilidad de anticuer-
pos monoclonales que reconocen antgenos especcos
tanto en la supercie de plaquetas inactivas como activas
proporciona los medios para la evaluacin de la funcin
plaquetaria. Esto incluye anticuerpos para P-selectina
(CD62P), una molcula de adherencia, que se desplaza a
la supercie de la plaqueta durante la activacin. Los anti-
cuerpos dirigidos contra esta molcula slo se unen a pla-
quetas con degranulacin. Los anticuerpos tambin estn
disponibles para GPIIb/IIIa (CD41/CD61), un eptopo que
aparece cuando se activa la plaqueta. ste resulta de un
cambio conformacional que conduce a la unin del bri-
ngeno con la supercie plaquetaria y posteriormente a la
agregacin plaquetaria.
Hasta hoy, el anlisis citomtrico de ujo de la funcin
plaquetaria no reemplaza a las pruebas clnicas estndares
para la funcin plaquetaria, como el tiempo de sangrado y
la agregometra plaquetaria. Esto se debe, en parte, al costo
de la prueba y a la destreza del operador, aunque la cito-
metra ofrece varias ventajas como el anlisis de la sangre
completa, por lo que minimiza la activacin plaquetaria y se
requieren volmenes pequeos de sangre (20 l); por lo tan-
to, hacen posible los estudios neonatales. Las plaquetas de
pacientes con trombocitopenia profunda tambin pueden
analizarse con exactitud.
Biologa molecular en la hematologa
El impacto ms grande de las tcnicas de la biologa mo-
lecular en la hematologa ocurre en la identicacin de
alteraciones genticas relacionadas con leucemias y linfo-
mas. La identicacin de la translocacin cromosmica,
que da lugar al cromosoma Filadela, caracterstica de la
leucemia mieloide crnica, fue el primer cncer humano
para el cual se estableci una base gentica. De hecho,
se entiende ms sobre la patogenia molecular de las ma-
lignidades hematolgicas que sobre cualquier otro grupo
de cnceres humanos. El cuadro 32-6 ilustra algunas al-
teraciones genticas selectas relacionadas con neoplasias
hematolgicas.
Las herramientas principales de la biologa molecular
que se emplean para detectar tales aberraciones genticas
son la hibridacin in situ, especialmente la FISH y la PCR.
Ambas tcnicas tienen una sensibilidad muy alta y son ms
rpidas que el anlisis citogentico convencional, el DNA o
RNA pueden extraerse a partir de sangre de mdula sea
o de una gran variedad de uidos corporales para anli-
sis molecular. Estas dos tcnicas se usan para identicar
alteraciones cromosmicas y genes o mRNA anormales,
por ejemplo, la expresin de un oncogn. stas incluyen
rearreglos del gen inducidos por translocacin que involu-
cran la activacin del oncogn, ms los rearreglos norma-
les del gen que implican genes de cadena pesada y ligera
de inmunoglobulina que se utilizan para demostrar la clo-
nalidad en neoplasias linfoides. Los ejemplos delineados
adelante ilustran cmo la FISH y la PCR se utilizan para
identicar estos rearreglos genticos en neoplasias hema-
tolgicas.
Tabla 32-6 Algunas de las caractersticas citogenticas y moleculares frecuentes observadas en los neoplasmas hematolgicos
que son tiles en el diagnstico y como blancos para el monitoreo de la enfermedad
Enfermedad Cariotipo Gen anormal Uso diagnstico
CML t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL Diagnstico de CML
AML t(8;21)(q22;q22) AML 1-ETO AML con maduracin
t(15;17)(q22;q21) PML-RARA Promieloctico agudo
inv(16)(p13;q22) CBF-MYH11 Mielomonoctico
ALL t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 Precursor B-ALL
t(4;11)(q21;q23) MLL-AF4 Con frecuencia presentacin neonatal
t(8;14)(q24;q32) MYC desregulado Burkitt tipo ALL
t(1;14)(p32;q11) TAL1 desregulado T-ALL
t(7;9)(q34;q32) TAL2 desregulado T-ALL
Linfomas t(14;18)(q32;q21) bcl-2 desregulado Linfoma de centro folicular
t(11;14)(q13;q32) bcl-1 desregulado Linfoma de clula manto
CML, leucemia mieloide crnica.
AML, leucemia mieloide aguda.
ALL, leucemia linfoblstica aguda.
FISH para demostrar el cromosoma Filadela en CML
El cromosoma Filadela es el resultado de una transloca-
cin recproca, t(9;22) (q34;q11), que causa un rearreglo
del gen que implica un oncogn celular, c-abl, y el gen
BCR (g. 32-1). Esta reestructuracin se observa en 95%
de los pacientes con leucemia mieloide crnica (CML), ge-
nerando un gen hbrido de la fusin BCR-ABL, que codi-
ca para una protena con actividad creciente de la tirosina
cinasa. La activacin creciente de las protenas reguladoras
del crecimiento por bcr-abl incrementa el ndice mittico y
protege a las clulas contra la apoptosis.
Demostracin de la clonalidad por estudios
de rearreglo del gen
El diagnstico de los desrdenes linfoproliferativos se basa
en mtodos inmunofenotpicos para demostrar clonalidad
y linaje celular. En las malignidades de clula B, la res-
triccin de la cadena ligera o puede evaluarse a me-
nudo, pero para las de clula T la clonalidad es ms difcil
de determinar. Por tanto, el uso de tcnicas de la biologa
molecular para detectar clonalidad en clulas T o B es un
desarrollo diagnstico importante.
Anlisis de la clonalidad de la clula B por PCR
Durante el desarrollo de la clula B existen rearreglos de
la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH), que involucra
regiones V (variable), D (diversidad) y J (acoplamiento),
que se fusionan para formar una unidad funcional. En una
poblacin normal de clula B, cada clula utiliza una com-
binacin diferente de segmentos V, D y J, aunado a que
existe insercin de pares de bases al azar en las uniones
V-D y D-J (g. 32-3).
El mtodo de PCR utiliza dos iniciadores, uno que
corresponda a una secuencia consenso, encontrada en la
mayor parte de los segmentos V, y el otro a una secuen-
cia consenso comn a la mayor parte de los segmentos J.
Cuando se amplica el DNA, la longitud del producto de
PCR se determina por el nmero de nucletidos insertados
al azar durante la unin VDJ. En una poblacin normal de
clulas B, cada producto de PCR posee un tamao ligera-
mente diferente, de modo que cuando los productos de esta
amplicacin se separan por electroforesis, un barrido se
observa en el gel. En el caso de una poblacin neoplsica
de clulas B, todas con la misma reestructuracin VDJ, se
Figura 32-1 La translocacin recproca entre los cromosomas 9
y 22 produce un cromosoma 9 ms largo (der 9) y el cromosoma
Filadela Ph1, que contiene el gen fusionado bcr-abl.
La FISH puede usarse para visualizar los genes ABL y
BCR por medio de la hibridacin con sondas, de cidos nu-
cleicos, complementarias a las secuencias de DNA en los
dos genes (g. 32-2). Empleando una sonda marcada con
biotina para BCR, el gen BCR puede detectarse con avidi-
na-FITC, que une la sonda marcada con biotina y puede
visualizarse como puntos verdes por medio de microsco-
pia uorescente. Una sonda para el gen ABL se marca con
digoxigenina y se detecta con antidigoxigenina-rodamina,
que emite una luz uorescente como puntos rojos. La pre-
sencia del gen fusionado BCR-ABL sobre el cromosoma
Filadela, por tanto, se visualiza por los puntos rojos y ver-
des combinados.
Una gran cantidad de sondas marcadas estn disponibles
en el comercio y se utilizan con frecuencia en alteraciones
genticas observadas en leucemias y linfomas, lo anterior
permitir posiblemente la transferencia de las metodolo-
gas FISH dentro del laboratorio de diagnstico rutinario.
Figura 32-2 Visualizacin de los genes bcr y abl usando FISH
para demostrar el gen bcr-abl fusionado sobre el cromosoma Fi-
ladela.
crea un producto de PCR de un solo tamao, que se vi-
sualiza por la predominancia de una banda discreta en la
electroforesis.
El anlisis de la clonalidad de la clula B por PCR tiene
diferentes ventajas. Puede realizarse en sangre perifrica,
mdula sea, tejido fresco o congelado y muestras inclui-
das en parana. Se requieren muestras muy pequeas de
DNA y, como en la hibridacin in situ, los resultados estn
disponibles mucho ms rpido que con el anlisis citoge-
ntico convencional.
Estudios de los rearreglos del gen receptor de la clula T
El receptor para el antgeno en la mayor parte de las clulas
T maduras (TCR) comprende dos polipptidos, y , que
se ligan y relacionan con la molcula CD3. Una poblacin
ms pequea de clulas T tiene un heterodmero diferen-
te, integrado por dos polipptidos diferentes, designados
y , que tienen un grado de homologa con las cadenas y
, respectivamente. El desarrollo de la clula T normal im-
plica la reestructuracin de estas cadenas para obtener una
poblacin heterognea de genes receptores de la clula T.
La clonalidad de las clulas T es una evaluacin comn
de PCR, usando el sitio TCR. sta es la cadena sencilla
ms apropiada para examinar, puesto que las extensiones
inmaduras de la clula T pudieron no experimentar la re-
combinacin , mientras el gen se suprime durante una
recombinacin del gen. Por lo general, son tres grupos de
iniciadores de secuencia consenso para la cadena TCR
los que se usan, y de esta forma los productos amplicados
se separan por electroforesis. Una poblacin policlonal de
clula T da lugar a un barrido en el gel de los productos
de PCR, mientras que una poblacin monoclonal de clu-
las T malignas se demuestra por apenas una o dos bandas
distintas visibles en la electroforesis en gel.
Deteccin de la enfermedad residual mnima
La enfermedad residual mnima (ERM) se dene como
aquellas clulas malignas que sobreviven despus de la
quimioterapia inicial de remisin-induccin. La detec-
cin de una poblacin potencial muy pequea de clulas
malignas, por ejemplo, en una de la mdula sea que est
morfolgicamente en remisin, puede tener implicaciones
pronsticas y teraputicas importantes. Las tcnicas de
citometra de ujo y biologa molecular se emplean para
vigilar la ERM.
Uno de los problemas principales con la citometra de
ujo es la identicacin de un inmunofenotipo especco
de tumores. Sin embargo, algunos antgenos hematopoy-
ticos se encuentran en las clulas malignas en combina-
ciones que no estn presentes en sangre normal o mdula
sea; por ejemplo, en la mayor parte de los casos de leu-
cemia linfoblstica aguda de la clula T (T-ALL), las clu-
las malignas expresan TdT nuclear as como CD3, CD5 y
CD1. Este patrn no se observa normalmente en clulas T
Figura 32-3 Durante el desarrollo de la clula B, cada uno de los diversos segmentos V, D y J son ligados por rearreglo del gen. Usando
iniciadores V y J, el anlisis por PCR del DNA del gen de la inmunoglobulina se generan varios productos de PCR en clulas B normales.
En un desorden linfoproliferativo de la clula B, la clonalidad es demostrada por un solo producto o banda de PCR.
BIOLOGA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGA 309
fuera del timo y puede utilizarse para demostrar clulas
T-ALL en sangre o en mdula sea. Otras combinaciones
inmunofenotpicas se utilizan en el anlisis de ERM para
ALL de clula B y leucemia mieloide aguda (AML), con
grados variables de xito. Un problema importante con las
tcnicas inmunolgicas son las limitaciones en la sensibi-
lidad, y la citometra de ujo capaz de detectar una clula
blanco de entre 10
4
a 10
5
clulas. La mayor parte de los
estudios de la enfermedad residual, por tanto, utilizan la
sensibilidad extrema de la PCR para identicar las alte-
raciones genticas conocidas presentes en la malignidad
en cuestin. Por ejemplo, la deteccin de los genes resul-
tantes de la fusin BCR-ABL se utiliza de manera exten-
sa en el seguimiento de pacientes con CML, incluyendo
trasplantes de mdula sea posteriores. En desrdenes
linfoproliferativos, los rearreglos clonales nicos pueden
emplearse como blancos para los anlisis basados en la
PCR con sondas de cidos nucleicos especcas para las
clulas malignas de un paciente en particular. Tales aproxi-
maciones requieren de mucho trabajo, pero cuanta ms
informacin llega a estar disponible desempea un papel
importante en la evaluacin del pronstico y de la ele-
gibilidad para las diversas modalidades del tratamiento
especco.
Diagnstico de hemoglobinopatas
La biologa molecular tiene ventajas profundas en la iden-
ticacin de mutaciones comunes especcas que dan
lugar a una sntesis alterada de la cadena globina. La PCR
se ha aplicado sobre todo a la deteccin de las mutacio-
nes puntuales, deleciones y polimorsmos del DNA, para
proporcionar una prueba de tamizaje rpida que es en par-
ticular importante en el diagnstico prenatal. La opcin de
una tcnica especca depende del grado de la enfermedad
denida a nivel gentico. Por ejemplo, en enfermedad de
clula falciforme el gen afectado se conoce por medio del
anlisis de la secuencia del DNA, y diferentes estrategias
pueden elegirse para amplicar y analizar un perl del
DNA de un paciente por medio de la PCR. El conocimiento
de una mutacin puntual especca permite el desarrollo de
tcnicas de amplicacin uorescente para el tamizaje r-
pido. Estos mtodos utilizan iniciadores oligonucletidos
para las secuencias del DNA normales y mutantes, mar-
cadas diferencialmente con molculas uorescentes rojas
y verdes. Acoplando cada uno con un segundo iniciador
no marcado, los productos de PCR se pueden analizar por
uorescencia diferencial roja y verde en un uormetro,
obtenindose una tcnica de tamizaje rpida.
En enfermedades como las talasemias, los genes son
clonados y secuenciados, pero las mutaciones genticas
son heterogneas. El acercamiento a estudios de la heren-
cia, por tanto, se basa en estudios de ligamiento, usando los
polimorsmos de longitud variable de los fragmentos de
restriccin (RFLP). stas son mutaciones del DNA, por lo
general en secuencias del DNA no codicantes, que se he-
redan ligadas con un gen y pueden por tanto convertirse en
marcadores tiles para la deteccin de un gen mutante en el
diagnstico prenatal.
Alteraciones genticas en las coagulopatas
En cuanto a las hemoglobinopatas, se ha identicado un
nmero creciente de mutaciones especcas de la enferme-
dad que conducen a alteraciones relacionadas con la coa-
gulacin sangunea. La deteccin de mutaciones puntuales
en genes que codican factores de coagulacin se utilizan
para estudios diagnsticos y de escrutinio familiar.
Una prueba muy usada es la deteccin basada en PCR
de la mutacin del factor V de Leiden. Se estima que 2 a
6% de la poblacin normal lleva esta mutacin, y la ho-
mocigosidad de los alelos informa que existe un riesgo
incrementado 80 veces de trombosis. La deteccin de la
mutacin utiliza iniciadores especcos de la secuencia, un
iniciador sentido, que es complementario a ambos fac-
tores normales V y FV de Leiden, y un segundo iniciador
antisentido complementario a ambos, el alelo FV normal
o el alelo FV de Leiden. La naturaleza del genotipo de FV
puede entonces determinarse por el anlisis de los produc-
tos de la amplicacin, puesto que ambos, el iniciador es-
pecco normal o el especco a FV de Leiden, amplican
un producto.
Resumen
La citometra de ujo y la biologa molecular desempean
conjuntamente un papel fundamental en el diagnstico de
leucemias y de linfomas. El reconocimiento de los mar-
cadores inmunofenotpicos y genticos anormales que se
relacionan con desrdenes hematolgicos particulares con-
ducen a un anlisis replanteado del sistema de clasicacin
para las alteraciones hematolgicas. El sistema de clasi-
cacin reciente publicado por la Organizacin Mundial
de la Salud (OMS) toma ms en cuenta estos desarrollos
y esfuerzos para utilizar las caractersticas inmunolgicas y
genticas junto con las observaciones morfolgicas. Esto
produce un sistema de clasicacin que tiene ms valor
clnico en trminos de modalidades del pronstico y del
tratamiento.
Los avances futuros en el tratamiento de estos desrde-
nes deben surgir de las modalidades que pueden apuntar
hacia las caractersticas inmunolgicas o genticas espe-
ccas de la enfermedad. Est claro que incluso dentro de
entidades distintas de la enfermedad, la perspectiva pro-
nstica exacta para un paciente particular depende de una
variedad de factores, incluyendo la expresin de muchos
genes, algunos todava no identicados. Un desarrollo
inquietante implica la tcnica de los microarreglos de DNA,
que permiten la cuanticacin de miles de genes. Genes
distintos que son representados por fragmentos del cDNA
sobre un sustrato slido, miles de los cuales pueden aco-
modarse en un solo portaobjetos de vidrio. El cDNA o las
sondas de RNA marcados estn preparados a partir de clu-
las del paciente y se hibridan al microarreglo. La cantidad
de sonda que hibrida al DNA blanco del microarreglo es
proporcional a la expresin del mRNA del gen correspon-
diente en la clula del paciente. Este cuadro muy amplio,
de gran alcance de la expresin del gen, en el futuro, cierta-
mente nos dar un conocimiento de los factores implicados
en el proceso maligno y conducir a que se encuentre un
mejor tratamiento para los neoplasmas hematolgicos.
Jennings CD, Foon KA. Recent advances in ow cytometry:
application to the diagnosis hematologic malignancy. Blood
1997: 90: 2863-2892.
Provan D, Gribben J (eds). Molecular Haematology. 2000: Black-
well Science, Oxford.
Stamatoyannopoulous G (ed.). The Molecular Basis of Blood Di-
seases. 2001 W.B. Saunders, Philadelphia, PA.
La anemia puede ocurrir por prdida de sangre, destruccin
de eritrocitos o por una falla en la produccin de stos. El
fracaso para producir clulas sucede con ms frecuencia
por las deciencias separadas o combinadas del hierro he-
matnico, de la vitamina B
12
y del folato. La vitamina B
12

se conoce ms por su nombre qumico apropiado, cobala-
mina, y es como se utiliza aqu.
El punto de partida para la investigacin de laboratorio de
la anemia es el conteo sanguneo. La macrocitosis y la pan-
citopenia son hallazgos caractersticos en las anemias mega-
loblsticas que producen la deciencia de cobalamina y de fo-
lato, mientras la microcitosis y la hipocroma se caracterizan
por la deciencia de hierro. El examen microscpico de san-
gre y de mdula produce los hallazgos caractersticos, pero en
el caso de la anemia megaloblstica no es posible distinguir la
deciencia de folato y de cobalamina. La medicin de las vi-
taminas y de hierro en la sangre es de valor signicativo, pero
los resultados requieren interpretacin cuidadosa, basada en
las interacciones posibles entre el folato y la cobalamina, otras
patologas coexistentes, efectos de las protenas de captacin y
la posible presencia de estados de deciencia leve. En el caso
del hierro, una deciencia funcional puede ocurrir en presen-
cia de reservas adecuadas de este elemento. Todos estos fac-
tores se discuten de forma breve, junto con los mtodos para
esclarecer la causa de las deciencias identicadas y la inves-
tigacin del exceso de hierro.
Cobalamina (vitamina B
12
) y folato
La cobalamina y el folato son esenciales para un nmero de
transferencias de carbn simple, y en el contexto presente la
ms importante de stas se relaciona con la sntesis de DNA.
En la gura 33-1 se muestran de forma simplicada las vas
metablicas que involucran las dos vitaminas. La forma acti-
va del folato, el tetrahidrofolato (THF), transporta y utiliza la
unidad de carbn simple en diferentes estados de oxidacin
como 5-metil THF (>NCH
3
), 5,10-metileno THF (>N
CH
2
N<) o 10-formil THF (>NCHO). Se requiere inser-
tar dos veces carbn simple (del formado por la va 10-formil
THF) en la sntesis de las purinas; el metileno THF se utiliza
en la conversin de uridina a timidina en la sntesis de pirimi-
dina. El 5-metil THF y la cobalamina se deben agregar juntos
para la metilacin de la homocistena a metionina. La ma-
yor parte de la metionina se convierte, adems, a S-adenosilme-
tionina, un donador universal de grupos metilo requeridos en
un amplio rango de reacciones de metilacin que involucran al
DNA, al RNA, a las hormonas, a los neurotransmisores, a los
lpidos de la membrana y a la protena bsica de la mielina. La
falla de esta ltima funcin provoca la degeneracin subaguda
de la mdula espinal relacionada con deciencia grave de co-
balamina. sta tambin es un cofactor esencial para la mutasa,
que convierte el cido metilmalnico a cido succnico.
Tanto la cobalamina como el folato se presentan en las
formas unidas a protenas en la sangre. La protena princi-
pal de unin para la cobalamina es la transcobalamina II.
En la leucemia mielgena crnica, la transcobalamina III,
que es producida en cantidades grandes por los granuloci-
tos, puede generar falsas medidas de concentracion altas de
la cobalamina srica.
Anlisis de cobalamina y folato en sangre
Los mtodos de anlisis de laboratorio con frecuencia se
afectan por la necesidad de analizar grandes cantidades
33
Investigaciones hemticas
Frank Wells
314 CAP. 33 INVESTIGACIONES HEMTICAS
de muestras. Esto acta en contra de los procedimientos
que requieren la intervencin manual o de los pasos que
no pueden incorporarse fcilmente en un proceso autom-
tizado continuo. Los primeros mtodos para el anlisis de
ambas vitaminas dependan del crecimiento de organismos
que tienen un requerimiento absoluto por una de las vi-
taminas. Para la cobalamina se emple Euglena gracilis
o Lactobacillus leichmannii y para el folato Lactobacillus
casei, un organismo resistente al cloranfenicol. El creci-
miento se mide por un aumento en la turbiedad del medio
de cultivo con todos los dems nutrientes requeridos en ex-
ceso. Aunque estos ensayos an tienen valor como una me-
dicin de la vitamina biolgicamente activa, se sustituyen
en la prctica de rutina por los ensayos de unin proteica
competitiva.
Ensayos de unin proteica competitiva
El principio de estos anlisis puede resumirse respecto a la
cobalamina y se representa de manera esquemtica en la -
gura 33-2. Una protena debe ligarse a la cobalamina con
mucha fuerza y se agrega especcamente a una mezcla na-
tural de esta ltima (la muestra) y a una forma marcada. La
protena de unin est presente en una concentracin sig-
nicativamente menor que la de la vitamina y su anlogo
marcado. Las formas naturales y marcadas de la vitamina
compiten por el nmero limitado de sitios de enlace en la
protena durante un periodo de equilibrio. En equilibrio,
el cociente natural de la cobalamina marcada ligada a la
protena especca se aproxima a la misma que el cociente
natural de la cobalamina marcada en la solucin original.
La cobalamina ligada entonces se separa de la solucin, y
la cantidad de cobalamina marcada unida a la protena de
enlace se mide. El marcador puede ser una especie uores-
cente o una enzima, y pueden emplearse tcnicas sensibles
de medicin, como la quimioluminiscencia.
La comparacin del resultado con una curva estndar
permite la cuanticacin de la cantidad de cobalamina na-
tural en la muestra original, y tiene en cuenta que la cons-
tante de enlace para la cobalamina natural y marcada puede
no ser exactamente la misma, y que el enlace no especco
puede tambin ocurrir con otras protenas sricas. Los de-
talles de este proceso varan con diferentes analizadores,
pero el principio es comn en casi todos. Cuando la con-
centracin de cobalamina en la muestra es muy alta, la can-
tidad marcada ligada a la protena de enlace se aproxima a
cero, y cuando la concentracin de cobalamina en la mues-
tra es cero, la unin de esta vitamina alcanza un mximo.
Los primeros ensayos competitivos de la protena de
enlace utilizaron radioistopos para el marcaje de la co-
balamina, pero los riesgos implicados y las dicultades en
la automatizacin de tales tcnicas causaron que declinara
su uso.
Ensayo de cobalamina
La vitamina se separa de la protena ligante natural, transco-
balamina II, por el hidrxido de sodio (pH 12.9). El cianuro
de potasio convierte la vitamina a su forma de cianocoba-
lamina. Los mtodos anteriores utilizaban un pH ms bajo,
pero involucraban la ebullicin de la mezcla para liberar la
cobalamina de sus protenas naturales de unin. El factor
intrnseco porcino (HIF) se agrega como protena de unin
especca. En una forma particular del ensayo, la cobala-
mina libre de la muestra compite con la cobalamina que
est marcada en virtud de ligarse a un soporte slido (una
Homocistena
Metionina
5-Me-THF
THF
Otras especies
de un carbono,
5,10-
metilenoTHF,
10-formilTHF
d-UMP
Precursores
de la purina
d-TMP
y
purinas
DNA
S-adenosil
metionina
como
donador Me
Lpidos de la membrana
Protena bsica
de la mielina
Neurotransmisores
Formas
metiladas
B
12
Figura 33-1 Transformaciones metablicas que implican cobalamina (vitamina B
12
) y folato. Reproducida con permiso de Klee
(2000).
COBALAMINA (VITAMINA B
12
) Y FOLATO 315
perla de plstico). Estos componentes se incuban con un an-
ticuerpo HIF conjugado con la fosfatasa alcalina (Falc-HI-
FAb). El Falc-HIFAb se inmoviliza slo en aquellas perlas
que tienen HIF ligado. Las perlas se lavan, con lo que se li-
bran de excesos de reactivos, y la cantidad de HIF ligada se
determina por medio de la enzima fosfatasa alcalina ligada.
Si hay muy poca cobalamina en la muestra, mucho del HIF
ser ligado a la cobalamina en las perlas, e inversamente, si
la concentracin de cobalamina en la muestra es alta, habr
poco HIF, y as poca fosfatasa alcalina ligada a la perla.
Aunque la secuencia de eventos diere levemente, el prin-
cipio de este proceso puede verse idntico al del esquema
de la gura 33-2.
Ensayo de folato
El folato puede medirse en el suero o en los eritrocitos. El
folato eritroctico es, potencialmente, la medicin ms
signicativa, ya que representa una visin promedio del tiem-
po de la disponibilidad de folato sobre el cual los eritrocitos
circulantes se formaron, mientras que el folato srico es muy
dependiente de la ingestin diettica reciente. El principio
de los ensayos de folato es muy similar al de la cobalamina,
descrito antes, aunque los detalles varan considerablemente
con los diferentes sistemas analticos. La protena de enlace
especca usada en el anlisis competitivo es la -lactoglob-
ulina (un ligando del folato en la leche).
La disociacin del folato de las protenas de enlace se
logra otra vez por alcalinizacin con hidrxido de sodio.
Si el folato se mide en el suero y en la sangre completa,
los dos resultados pueden utilizarse, junto con el hema-
tcrito, para determinar el folato eritroctico. El mtodo
es ms impreciso que en la medicin del folato srico
por la naturaleza aditiva del error analtico. En general,
el coeciente de variacin de un anlisis que implica tres
mediciones est dado por:
Marcado
HIF HIF HIF
HIF
HIF HIF
En equilibrio el cociente de cobalamina natural a cobalamina marcada ligada a la
protena especfica (factor intrnseco porcino) ser el mismo que el del cociente
de cobalamina natural a cobalamina marcada en la solucin original. Los conteos
ligados se comparan con los valores encontrados en una curva de calibracin
construida usando seis a ocho muestras de cobalamina de concentracin conocida.
Marcado Marcado Marcado
Marcado Marcado Marcado Marcado
= cobalamina HIF = factor intrnseco porcino
El cuadro cortado identifica las especies
ligadas medidas
Figura 33-2 Esquema del principio del ensayo de unin proteica competitiva.
CV
t
(CV
2

+ CV
2

+CV
2
)
donde CV
t
es el coeciente total de variacin del anli-
sis y CV
1
, CV
2
y CV
3
son los coecientes de variacin de
los anlisis individuales implicados, en este caso del fola-
to srico, del folato de la sangre entera y del hematcrito,
respectivamente. La matriz ms compleja del hemolizado
de la sangre entera puede tambin causar interferencia. Por
ello, los laboratorios pueden elegir medir el folato srico,
porque el anlisis es menos impreciso, o el folato eritrocti-
co, porque el resultado es ms signicativo, o ambos.
La interpretacin del ensayo se altera porque la coba-
lamina, como el folato, tiene poca precisin en el extremo
inferior del rango, y tambin porque los rangos de refe-
rencia del folato son a veces inadecuados, particularmente
en poblaciones con una ingesta suplementada con folato.
Diferentes mtodos analticos para el folato muestran un
sesgo que diere, y los laboratorios deben determinar los
rangos de referencia locales.
Medidas alternativas del estado de la cobalamina
y del folato
Aunque los ensayos de estas vitaminas en la sangre dan
informacin valiosa, un nmero de factores puede causar
resultados engaosos. La cobalamina suele incrementar-
se, ya sea por desrdenes mieloproliferativos, o disminuir
por deciencia de folato (ambas son medidas falsas), por
embarazo, carencias de protenas de enlace y mielomato-
sis. La deciencia de cobalamina slo puede reducir las
concentraciones de folato intracelulares, y esto dar lugar
a folato srico normal relacionado con folato eritroctico
bajo y cobalamina srica baja. Hay tambin evidencia de
que secuelas clnicas signicativas pueden seguir a la de-
ciencia leve de la vitamina con concentraciones sricas en
el rango normal bajo.
La gura 33-1 muestra el papel de la cobalamina y del fo-
lato en la conversin de la homocistena (HC) a metionina.
La cobalamina sola tambin est implicada en la conversin
importante del cido metilmalnico a cido succnico. La
deciencia de cualesquiera de las dos vitaminas resulta de
este modo en el incremento de las concentraciones sricas
de homocistena, y la deciencia aislada de cobalamina en
incremento de los niveles sricos y excrecin del cido me-
tilmalnico (MMA). La medicin de estas dos sustancias,
HC del plasma y MMA de la orina o plasma, puede con-
rmar la deciencia de las vitaminas, y la comparacin de
los dos, distinguir las deciencias simples y combinadas y,
en general, mejorar la especicidad de la prueba de diag-
nstico, particularmente en los casos con cobalamina o
folato bajo en la lnea fronteriza. Hay evidencia de que las
concentraciones elevadas de estos dos metabolitos pueden
detectar clnicamente deciencia signicativa de la vitami-
na antes de que sta sea muy evidente desde la medicin de
las vitaminas mismas y de que haya evidencia de macroci-
tosis. Actualmente las dicultades analticas en la medicin
del MMA y de la HC impiden su uso extenso, pero am-
bos mantienen la posibilidad de una valoracin funcional
del estado de la cobalamina y del folato, que puede ser til
en una variedad amplia de situaciones, pero en particu-
lar en los ancianos, en quienes la deciencia marginal de
cobalamina se piensa que es relativamente comn.
Investigacin de los factores que generan
la deciencia de folato y cobalamina
La deciencia de folato es normal que sea causada por
una malabsorcin o una ingestin diettica inadecuada
(o una combinacin de uno de stos con un mayor requeri-
miento, como en el embarazo). La suplementacin es fran-
ca, y en algunos pases los alimentos se fortican de rutina
con folato adicionado, pero el cuidado es necesario debido
a que la administracin de folato a un paciente deciente
en cobalamina puede causar la degeneracin combinada
subaguda de la mdula espinal. Una causa importante de
deciencia de cobalamina es la anemia perniciosa (AP), en
la cual las clulas parietales gstricas no tienen la suciente
capacidad para producir el factor intrnseco esencial para la
absorcin de cobalamina en el segmento ileal del intestino.
La investigacin preliminar puede implicar la valoracin de
los anticuerpos dirigidos en contra de la clula parietal gs-
trica y los del factor intrnseco. Los primeros son positivos
en 90% de los casos de AP, pero tienen especicidad esca-
sa para la condicin, y estn presentes en 3 a 10% de los
sujetos normales. Los anticuerpos del factor intrnseco son
completamente especcos para la AP, pero su sensibilidad
es baja; hay dos tipos, los que bloquean la unin del FI a la
cobalamina y los que bloquean la captacin del complejo
IF-cobalamina por el leo terminal. El primer anticuerpo es
el nico que se mide de rutina y est presente en 50% de los
casos de AP. En el pasado, la prueba Schilling (que mide
la absorcin de cobalamina radiactiva en presencia y au-
sencia del factor intrnseco agregado) se utiliz para deter-
minar la capacidad de absorber cobalamina administrada
e identicar si esto era debido a la deciencia del factor
intrnseco (como en la AP) o por alguna otra causa, como
enfermedad ileal. La saturacin anterior con cobalamina
sin marcar, administrada por inyeccin intramuscular, ase-
gura que toda la cobalamina marcada que se absorbe es
excretada. La prueba Schilling se utiliza menos en la actua-
lidad que en el pasado debido a los problemas implicados
1 2 3
en el uso de radioistopos, y la inconveniencia general de
la prueba.
Casi 80% de los casos de anemia perniciosa tiene incre-
mento de la gastrina srica como resultado de la aclorhidria
debido a la falla de clulas parietales para producir cido
clorhdrico, de tal modo que la gastrina srica puede tener
valor en la investigacin de la AP. La ausencia del cido gs-
trico es signicativa por s misma, ya que la falla para li-
berar la cobalamina diettica (y el folato) de las protenas
naturales de unin en la dieta puede deteriorar la absorcin.
Una prueba Schilling normal (que mide la absorcin de la
cobalamina libre) es posible que suceda en un paciente que
absorbe mal la cobalamina ligada a la protena de los ali-
mentos naturales.
Un diagrama de laboratorio para la investigacin de la
anemia perniciosa se muestra en la gura 33-3. Esto evi-
ta el uso de la prueba Schilling pero implica mediciones
no disponibles de rutina en laboratorios del Reino Unido.
El cido metilmalnico es muy raro que est disponible, y
aunque no se carece de la gastrina, se utiliza poco en este
contexto. Debido a que la suplementacin oral de cobala-
mina es inecaz en el tratamiento de la AP, un diagnstico
exacto es importante.
Hierro
El hierro es un elemento importante, involucrado no slo
en la sntesis de hemoglobina sino en muchas metalopro-
tenas, que contienen y no grupo hem, implicadas en la uti-
lizacin del oxgeno molecular. El efecto ms obvio de su
deciencia es anemia por deciencia de hierro, pero puede
haber cambios ms sutiles que resultan de su implicacin
en otros procesos metablicos. La existencia del hierro en
dos estados principales de oxidacin, Fe(II) y Fe(III), y el
caso con el cual puede participar en la transferencia de un
electrn, resulta en una fuente potencial de radicales libres
del oxgeno, que tienen uso importante en la defensa del
husped contra las bacterias pero que, si no se conna a
su ubicacin apropiada, son demasiado perjudiciales a los
tejidos del husped. La absorcin y el transporte de hierro
estn as controlados en forma rigurosa para evitar la pre-
sencia de hierro libre, y las condiciones de la sobrecarga de
hierro tiene consecuencias clnicas serias.
Mediciones de laboratorio de la deciencia
y sobrecarga de hierro
Aparte de la hemoglobina misma, las mediciones de labora-
torio del estado de hierro con ms frecuencia utilizadas son
el hierro srico y la capacidad de unin al hierro, la ferritina
srica, la protoporrina zinc de la clula y, recientemente, la
concentracin del receptor de transferrina srico (TfR).
Hierro srico y capacidad de unin del hierro
El hierro srico es la medida ms obvia del estado de hierro
en el organismo, su concentracin es afectada por diferen-
tes factores, incluyendo la concentracin de su protena de
unin, la transferrina. Algunas mediciones de la transferri-
na son, de esta manera, esenciales en la interpretacin de
la concentracin del hierro srico, tanto por la medicin
directa de la protena como para valorar qumicamente la
capacidad de unin del hierro srico, que es equivalente a la
concentracin de transferrina.
HIERRO 317
Cobalamina srica (vitamina B )
12
150 a 300 ng/L
> 300 ng/L
< 150 ng/L
(sin comprobacin adicional)
Ensayo del MMA srico
Anticuerpo del factor intrnseco
0.4 mol/L > 0.4 mol/L Negativo
Ensayo de gastrina
> 200 ng/L 200 ng/L Positivo*
*
Figura 33-3 Un procedimiento de investigacin para la anemia perniciosa. *Indica que es consistente con anemia perniciosa.
Ferritina
La ferritina se compone de 24 subunidades de protena
alrededor de un ncleo, que puede contener hasta 4 500
tomos de hierro y comprende la forma principal de alma-
cenamiento de hierro disponible encontrada en la mayor
parte de los tejidos del cuerpo. En la forma desnaturaliza-
da, la ferritina forma hemosiderina. La concentracin de
ferritina en el plasma se relaciona de manera directa con el
nivel de reserva de hierro, con cada g/L de ferritina srica
que equivale a casi 8 mg del hierro de reserva. Es tambin,
sin embargo, una protena de fase aguda, la concentracin
de la cual se eleva en respuesta a la infeccin, a la inama-
cin y a la malignidad, y que pueden dar lugar a concen-
traciones normales de ferritina srica en un paciente con
deciencia de hierro y enfermedad inamatoria.
Protoporrina zinc (ZPP)
En la sntesis de hemoglobina, la enzima ferroquelata-
sa inserta el hierro (II) dentro del sistema de anillo de la
protoporrina para producir grupo hem. En ausencia del
hierro adecuado, el zinc se inserta (otra vez enzimtica-
mente) y la protoporrina zinc permanece en el eritrocito
durante toda su vida. La concentracin de ZPP aumenta
cuando el hierro es inasequible en la mdula sea, debido a
una deciencia simple o a una deciencia de tipo funcional
de hierro en presencia de reservas adecuadas de ste. Esta
ltima situacin corresponde a la anemia de la enfermedad
crnica. La medicin de ZPP tiene el mrito de identi-
car la disponibilidad disminuida de hierro en la mdula,
pero no siempre proporciona informacin directa sobre
las reservas de hierro. El aumento de ZPP tambin reeja
problemas antiguos en la sntesis del grupo hem (en el or-
den del periodo de vida de la clula) y puede ser normal en
la deciencia de hierro de inicio rpido que causa la prdi-
da gastrointestinal de sangre, por ejemplo. Aunque rara vez
es un problema interpretativo, la ZPP tambin aumenta en
la toxicidad por plomo.
Receptor de transferrina srico (TfR)
Los eritrocitos nucleados en la mdula sea transportan la
mayor parte de los receptores de transferrina, aunque tam-
bin existen en otras clulas en cantidades que reejan los
requerimientos de hierro de las mismas. Estos receptores,
situados en la membrana celular, internan la transferrina y,
despus de liberar su hierro regresan al uido extracelular.
El receptor de transferrina (TfR) consiste en dos subunida-
des idnticas de protena de masa molecular de 95 kDa. La
sntesis del TfR es controlada por el suministro de hierro,
disminuyendo cuando la clula est repleta de ion. El TfR
est presente en el plasma, ligado a la transferrina, y su
concentracin en el plasma o suero reeja el nmero de re-
ceptores celulares de transferrina y, siempre que las reser-
vas de hierro sean adecuadas, el TfR reeja el nmero de
eritrocitos en desarrollo en la mdula sea. La deciencia
de hierro produce un incremento en el TfR srico en pa-
ralelo con un aumento en los receptores celulares. El TfR
srico elevado puede reejar disponibilidad disminuida de
hierro, o eritropoyesis elevada, o ambos.
Investigacin por sospecha de deciencia de hierro
El conteo sanguneo es la primera lnea de la investigacin.
ndices hematolgicos ms especcos, como el porcenta-
je de clulas hipocrmicas, son vistos por muchos autores
como de las mejores medidas de la deciencia de hierro.
Medicin de la ferritina srica
El anlisis de la ferritina srica utiliza un ensayo de dos
sitios o inmunomtrico. En contraste con el ensayo de
competencia por las protenas de enlace descrito para la
cobalamina y el folato, la concentracin de los anticuer-
pos antiferritina utilizados para capturar ferritina es muy
superior a las concentraciones normales de sta. La que se
encuentra en la muestra del suero la capturan ecazmente
los anticuerpos antiferritina sobre un soporte slido (gra-
no o celdilla). Un segundo anticuerpo antiferritina, que se
une a un eptopo diferente sobre la molcula de ferritina,
se agrega, tambin en exceso. Este segundo anticuerpo
forma un emparedado con la ferritina en el centro. El se-
gundo anticuerpo lleva un marcador; originalmente un
radioistopo, pero ahora es ms comn que se sustituya
con una enzima o una especie uorescente. Despus de
lavarlo para remover todos los reactivos no unidos al gra-
no o la celdilla, se agrega el sustrato que reacciona qu-
micamente con el anticuerpo marcado para dar una seal
apreciable, que se compara con aquella que se produce
por una serie de estndares. Porque el mtodo confa en
un exceso de ambos anticuerpos, hay una posibilidad de
que las concentraciones excepcionalmente altas de ferri-
tina puedan saturar los anticuerpos y dar valores bajos
(el efecto gancho a dosis-altas [high-dose hook]). Hay
medios de diseo de ensayo que minimizan este riesgo,
pero en caso de duda la muestra del suero se analiza en di-
lucin, y si el efecto gancho est presente, la muestra
diluida exhibe un valor aparente ms alto para la ferriti-
na srica. El ensayo inmunomtrico se muestra de mane-
ra esquemtica en la gura 33-4.
Medicin de protoporrina zinc
Alguna confusin existe con respecto a la relacin de la
ZPP y la protoporrina libre, principalmente porque los
primeros mtodos de medicin de la ZPP implicaron la
extraccin cida, que remova el zinc para dar protopor-
rina libre. Excepto en porrinas raras, la protoporrina
libre abarca 5% o menos de la porrina que no es del
grupo hem total en el eritrocito, la mayor parte que exis-
te como ZZP.
La protoporrina zinc absorbe la luz de longitud de
onda de alrededor de los 425 nm (banda Soret) y uoresce,
emitiendo luz a una longitud de onda de 595 nm. El mtodo
ms comn de medir la protoporrina zinc implica emplear
la tcnica de la uorimetra de cara frontal. Una gota de
sangre entera es pretratada con un reactivo que convierte
la hemoglobina a cianohemoglobina y elimina el efecto de
interferencia del contenido variable de la oxihemoglobina.
La sangre diluida se coloca en un portaobjetos y un haz de
luz incidente (415 nm) se dirige sobre el lado ms bajo del
portaobjetos. La capa de eritrocitos sobre la supercie de
cristal plana absorbe la luz incidente, y la ZPP emite luz
uorescente a 595 nm que se dispersa en todas las direc-
ciones. Aquella luz emitida hacia abajo, por detrs del
HIERRO 319
Figura 33-4 Esquema del ensayo inmunomtrico de dos sitios para la ferritina.
portaobjetos, sufre reabsorcin mnima por la hemoglobina
y se detecta con un tubo fotomultiplicador. La concentra-
cin de ZPP se expresa como mol ZPP/mol del hem. La
interferencia surge de la hemlisis, de la bilirrubina srica
alta o de las concentraciones de riboavina. Lavando los
eritrocitos se remueven estas interferencias, pero esto con-
sume tiempo.
Medicin del receptor de transferrina srico
La medicin del TfR srico se realiza con un ensayo inmu-
nomtrico de dos sitios, similar en principio al de la ferriti-
na srica. El anlisis es un ensayo inmunoabsorbente liga-
do a enzima (ELISA). Desafortunadamente, las diferencias
en los procedimientos que se utilizan para puricar los re-
ceptores de transferrina ligada a la membrana que se usan
como estndares en el ensayo caen en rangos de referencia
que varan con el sistema de ensayo particular, aunque las
diferencias cualitativas entre los grupos de pacientes son
similares, independientemente de la formulacin del ensa-
yo. Gran parte del rango de referencia no lo afecta la edad
y el sexo (a diferencia de, p. ej., la ferritina), aunque la
informacin en nios y bebs es escasa. La deciencia de
Anticuerpo antiferritina (1)
Ferritina
Anticuerpo antiferritina marcado (2)
El cuadro cortado identifica las muestras marcadas medidas
hierro resulta en un aumento triple a cudruple de la con-
centracin de TfR srico comparada con la normal.
Medicin del hierro srico y de la capacidad
de unin del hierro
El hierro en el suero est en la forma Fe(III) y ligado a la
transferrina. A un pH menor de 4.5 y en la presencia de cido
ascrbico como agente de reduccin, el hierro trivalente es
liberado de la transferrina y reducido a Fe(II). Entonces se
forma un complejo con un cromforo, por ejemplo, fereno
[3-(2-piridil)-5,6-bis-2-(cido 5-furil sulfnico)-1,2,4-triazi-
na] o alternativamente ferrozina. Se mide la absorbancia del
complejo hierro-fereno a 700 nm. Este mtodo es homog-
neo (no implica precipitacin de protena), la mezcla de la
reaccin contiene detergente para mantener la protena en
solucin, y tiourea para minimizar la interferencia del cobre.
La capacidad de enlace del hierro puede medirse al adi-
cionar exceso de solucin Fe(III) para saturar totalmente la
transferrina y dejar un poco de hierro libre. Despus de la re-
duccin con cido ascrbico, el hierro libre se mide como un
complejo fereno a un pH 8.6, pH al cual el hierro ligado a la
transferrina permanece inasequible. La solucin entonces se
acidica y el ensayo del hierro se repite. El aumento en ste
debido a la acidicacin es la capacidad de enlace del hie-
rro del suero, que es equivalente al ligado a la transferrina.
De manera alternativa, la transferrina puede medirse
directo por mtodos inmunolgicos. stos implican la for-
macin de los complejos antgeno-anticuerpo en solucin
entre la transferrina y los anticuerpos antitransferrina. La
concentracin de estos complejos se mide por su capacidad
para dispersar la luz. O la disminucin de la luz transmitida
se mide en un espectrofotmetro (turbidimetra) o la luz
dispersada real se evala con detectores a 90 de la trayecto-
ria de la luz transmitida (nefelometra). La estandarizacin
del ensayo de la transferrina presenta algunos problemas,
y hay poco que elegir entre el ensayo de la transferrina y la
capacidad de unin del hierro como mtodos de medicin
de la concentracin de transferrina.
El lugar de las pruebas de laboratorio en la investigacin
de la deciencia de hierro
En casos sencillos, ninguna otra investigacin de labora-
torio puede ser necesaria cuando se identica una anemia
microctica hipocrmica y el tratamiento con hierro oral
es acertado, aunque la recurrencia de la anemia en presen-
cia de ingesta normal de hierro de la dieta requiere expli-
cacin. Una posible malabsorcin o la prdida oculta de
sangre del aparato digestivo pueden requerir endoscopia u
otros modos de investigacin.
Un problema diagnstico importante ocurre durante
la diferenciacin de la anemia por deciencia de hierro
(IDA) y la anemia por enfermedad crnica. Esta ltima
puede presentar un cuadro normoctico, normocrmico o
microctico, hipocrmico, y surgir en presencia o ausencia
de reservas adecuadas de hierro. Es posible denirla como
una anemia hipoproliferativa que ocurre en relacin con la
infeccin, la inamacin o la enfermedad neoplsica. Se
caracteriza por valores bajos de hierro srico, transferri-
na srica y porcentaje de saturacin de la transferrina, in-
cremento de la ferritina srica, aumento de las reservas de
hierro reticuloendotelial, incremento de la ZPP, elevacin
moderada del TfR y absorcin reducida de hierro. Ocurre
tambin un acortamiento moderado del periodo de vida
del eritrocito. El mecanismo exacto del proceso todava no
est totalmente aclarado y el metabolismo desordenado del
hierro no es el nico elemento, pues la entrega de ste a
la mdula eritroide se mantiene como una posibilidad y la
terapia con eritropoyetina puede corregir la condicin, pero
no la deciencia de hierro. El efecto de las citocinas ina-
matorias parece central. La anemia por enfermedad crnica
puede distinguirse de la anemia por deciencia de hierro
examinando la mdula, con la presencia de hierro que se
puede teir en las clulas reticuloendoteliales, excluyendo
la ADH como una causa de anemia, pero esta prueba no es
conveniente para un uso extenso.
El hierro srico tiene defectos importantes como prueba
de deciencia de hierro. Muestra variacin diurna signica-
tiva y tambin es afectado por la ingesta de comida recien-
te, lo que da por resultado alta variabilidad intraindividual.
En la anemia por enfermedad crnica, el hierro srico est
disminuido y es independiente de las reservas y, aunque el
uso de la saturacin de la transferrina supera parcialmen-
te esto (como la transferrina o IBC est deprimido en la
misma situacin), su valor predictivo no es alto. La estro-
genizacin (en embarazo, anticonceptivo oral o terapia de
reemplazo de estrgeno) puede confundir la situacin al
incrementarse la transferrina srica (e IBC).
La ferritina srica en una persona saludable indica un
buen ndice de reservas de hierro corporales, pero la in-
amacin y la enfermedad del hgado causan su aumento,
independientemente del estado del hierro, lo cual perjudi-
ca su valor diagnstico. Aunque una ferritina srica menor
de 20 g/L es congruente con la ADH y una superior a
100 g/L torna improbable la ADH, incluso en presencia
de enfermedad inamatoria, esto deja a un grupo grande de
pacientes con valores intermedios de ferritina en quienes el
diagnstico puede ser incierto.
La protoporrina zinc, a diferencia de la ferritina srica,
no se ve afectada por enfermedad del hgado, ni directa-
mente por la reaccin en fase aguda; que sea positiva en la
toxicidad por plomo es un problema raro. En la enferme-
dad reumatoide se correlaciona con el porcentaje de clulas
hipocrmicas, pero se incrementa con frecuencia cuando la
demora es normal y en la falla renal se eleva no espec-
camente cuando el porcentaje de las clulas hipocrmicas
es normal. Esta es una prueba de deciencia funcional, la
cual se incrementa cuando el hierro es inasequible al mo-
mento de la eritropoyesis, y esto es cierto en la anemia por
enfermedad crnica. Aunque se dice que no es afectada
por el rasgo de talasemia, hay evidencia de que 50% de los
pacientes con esta condicin tiene ZPP elevada; pero no
es diagnstico de deciencia de hierro, aunque proporcio-
na informacin sobre la disponibilidad funcional de hierro
para el desarrollo del eritrocito, excepto posiblemente en el
rasgo de talasemia.
El receptor de la transferrina srica est relacionado con
las reservas de hierro en individuos saludables y aumenta
cuando existe deciencia de hierro u ocurre incremento de
la eritropoyesis. Esta ltima situacin incluye eritropoye-
sis inecaz. En la enfermedad crnica, las concentraciones
aumentan, incluso en presencia de reservas adecuadas de
hierro, relacionadas posiblemente a la incidencia de eri-
tropoyesis inecaz. Sin embargo, una relacin con las re-
servas de hierro an permanece. El cociente de TfR srico
a ferritina srica ha mostrado ser una medida excelente de
las reservas en el estado de salud, y un mejor indicador de la
deciencia de hierro en la anemia por enfermedad crnica
que la ferritina srica sola. El TfR srico puede ser parti-
cularmente til en el embarazo. El embarazo puede causar
anemia por hemodilucin, la cual se relaciona con frecuen-
cia con una ferritina disminuida, incluso en presencia de
reservas adecuadas de hierro, y con un aumento en IBC
causado por los estrgenos puede sugerir deciencia de
hierro. El TfR srico parece, desde la evidencia preliminar,
ser relativamente afectado por el embarazo, permitiendo su
uso en la valoracin de la deciencia de hierro.
Aunque su naturaleza manual la hace inadecuada en
algunos laboratorios, la ZPP es una prueba de primera l-
nea buena y econmica para medir la deciencia de hierro,
apreciable en la muestra inicial del conteo sanguneo com-
pleto. La ferritina es una buena prueba de segunda lnea, si
se reconocen sus deciencias. El receptor de transferrina
srica puede asumir una mayor importancia cuando est
disponible fcilmente en los analizadores principales y su
papel es denido con ms claridad, pero hay probablemen-
te poco qu ganar en el presente al agregar la medicin del
TfR srico al rango existente de las pruebas disponibles
en los laboratorios. Es importante, cuando nuevas pruebas
de laboratorio se introducen, que los protocolos de inves-
tigacin sean revalorados, para evitar siempre paneles ms
amplios de las pruebas que se empleen sin la discrimina-
cin correcta.
Investigacin sobre la sobrecarga de hierro
La sobrecarga adquirida de hierro ocurre conjuntamente
con las anemias hemolticas crnicas, sobrecarga paren-
teral de hierro, o enfermedad crnica del hgado, pero el
origen est establecido desde la historia del paciente, y la
investigacin y el manejo de esta condicin no se describen
aqu.
La susceptibilidad gentica a la hemocromatosis es co-
mn en la poblacin general (1 en 100 a 300), aunque la
incidencia de la enfermedad sintomtica es probablemente
un vigsimo de la mutacin gentica, condicin importan-
te que se debe excluir en cualquier incidencia con elevacin
inexplicada de las enzimas hepticas, porque su potencial
es fatal pero fcilmente tratable, y el descubrimiento de
los casos ndice permite la investigacin de los parientes
cercanos para establecer el riesgo futuro. La primera anor-
malidad que surge es un aumento en la saturacin de la
transferrina, y valores mayores de 55% en mujeres o 60%
en varones sugieren acumulacin de hierro. El efecto del
alimento y la variacin diurna se evitan mejor con el em-
pleo de una muestra en ayuno temprano por la maana. La
ferritina srica aumenta en una etapa posterior de la acu-
mulacin de hierro, cuando el hierro heptico se eleva. Los
valores superiores a 500 g/L son sospechosos de sobre-
carga de hierro, pero otras condiciones que implican ina-
macin deben eliminarse, y la saturacin de la transferrina
tambin es una prueba superior en este aspecto, ya que la
enfermedad inamatoria produce una saturacin disminui-
da y menos incertidumbre del diagnstico.
Si la hemocromatosis gentica es sugerida por estas in-
vestigaciones preliminares, el anlisis de la mutacin del
gen de la hemocromatosis (HFE) debe realizarse, usando
una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La forma
ms comn de la sobrecarga heredada de hierro (cerca de
90% de los casos) est relacionada con mutaciones en el
gen para la HFE, en particular con la mutacin C282Y, en
la cual la cistena (C) en la posicin 282 es sustituida por
un residuo de tirosina (Y). La otra mutacin es H63D, en
la cual la histidina (H) en la posicin 63 es reemplazada
por el cido asprtico (D). La homocigosidad para la mu-
tacin C282Y est relacionada con la sobrecarga de hie-
rro, y hasta 10% de los hombres y 5% de las mujeres con
el fenotipo HH/YY desarrollan sobrecarga sintomtica de
hierro. La situacin con los heterocigotos compuestos (p.
ej., HD/CY) no es del todo conocida y, del mismo modo,
los homocigotos para la mutacin H63D (DD/CC) son se-
riamente menos afectados.
La valoracin del hierro heptico no es una parte necesa-
ria del proceso diagnstico, pero puede utilizarse para valo-
rar la gravedad de la enfermedad en pacientes seleccionados.
HIERRO 321
El tratamiento es por venodiseccin regular hasta donde la
lnea fronteriza de la deciencia de hierro se alcanza.
Resumen
La investigacin de las deciencias hematnicas siempre
comienza con el conteo sanguneo completo. La medicin
de la cobalamina srica, y del folato srico o del eritro-
cito, o ambos, puede contribuir en la identicacin de la
deciencia especca, aunque una comprensin de las
limitaciones de las pruebas es necesaria, y de otras prue-
bas no disponibles con facilidad en la actualidad, pueden
volverse ms importantes, en particular durante la investi-
gacin de la deciencia marginal. Hay diferentes medidas
de suciencia de las reservas de hierro con ferritina que, a
pesar de sus imperfecciones, continan siendo las mejores
pruebas fcilmente accesibles; y aunque la protoporrina
zinc tiene un papel importante, en el futuro el receptor de
transferrina srico puede ser la opcin. Si bien el hierro
srico, la capacidad de captacin del hierro y la saturacin
de la transferrina tienen una importancia menor en la va-
loracin de la deciencia de hierro, son las pruebas ms
sensibles para la sobrecarga de hierro, y la presencia de
hemocromatosis gentica puede ser demostrada de manera
precisa determinando la mutacin del gen HFE por PCR.
La investigacin de la sobrecarga de hierro puede susci-
tarse por anormalidades inexplicables de las pruebas de
funcin heptica.
Siempre en las pruebas de laboratorio, la interpretacin
debe ser en el contexto de una valoracin clnica comple-
ta del paciente y con un conocimiento basado en la evi-
dencia de las fortalezas y deciencias de las pruebas de
laboratorio individuales.
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Introduccin
En la vida normal, los eritrocitos se reciclan cada 120 das.
Los desrdenes hemolticos son aquellos en que hay des-
truccin acelerada del eritrocito, acompaados por un au-
mento compensatorio en la produccin eritroctica. Si la
mdula no puede mantener la demanda creciente para las
nuevas clulas, se produce anemia. La destruccin acelera-
da ocurre porque el eritrocito es anormal. Las alteraciones
relacionadas detectables en el laboratorio se muestran en
la gura 34-1 y se resumen en el cuadro 34-1. Algunas de
stas se ilustran en la gura 34-2.
Caractersticas clnicas
La manifestacin en el paciente es con frecuencia muy
inespecca y depende de la velocidad de inicio tanto como
de la enfermedad en particular que causa la hemlisis. Las
caractersticas clnicas principales observadas en anemias
hemolticas se resumen en el cuadro 34-2.
En las condiciones iniciales muy rpidas (p. ej., transfu-
sin sangunea incompatible) hay postracin, ebre y dolor
de espalda con hemoglobinuria y malestar, en lugar de las
caractersticas descritas en el cuadro 34-2. Las condiciones
ms crnicas alcanzan, con frecuencia, un estado estable
con destruccin y produccin en equilibrio, aunque nor-
malmente algunos resultados de la prueba siguen siendo
anormales. Este estado estable puede apreciarse por las
exacerbaciones de la enfermedad o crisis. Existen cuatro
tipos principales de crisis:
1. Una crisis hemoltica la ocasiona un aumento acelerado
en la hemlisis, originado a menudo por una enferme-
dad intercurrente, como una infeccin viral. Esto causa
un aumento en la ictericia y la anemia, y salida a la cir-
culacin de reticulocitos (y a veces de eritrocitos nu-
cleados) de la mdula. sta es una faceta de una crisis
falciforme.
2. En una crisis aplsica la mdula deja de trabajar du-
rante algn tiempo, por ejemplo en la infeccin del par-
vovirus. En la mayora de las personas esto tiene poco
efecto, pero en condiciones hemolticas el paciente pue-
de volverse con rapidez muy anmico y enfermo, puesto
que la mayor parte del tiempo cuenta con una mdula
muy activa para proseguir.
3. Una crisis de secuestracin ocurre en algunas condicio-
nes, como en la enfermedad de la clula falciforme en
nios, cuando de repente el bazo se agranda y secuestra
las clulas. El paciente o est muy enfermo o muere al
llegar al hospital; este caso, afortunadamente, es raro.
4. Una crisis megaloblstica la causa la mdula, que fun-
ciona sin folato (normalmente) a partir de la produccin
excesiva de eritrocitos requeridos para proseguir, y
una franca anemia megaloblstica se produce. Mega-
loblstica se reere a un aspecto caracterstico de la
mdula sea, donde los eritrocitos nucleados parecen
anormales porque la maduracin del ncleo y del cito-
plasma est asincrnica entre las clulas.
Control general del paciente
Cuando el paciente se presenta por primera vez, las prio-
ridades del diagnstico son establecer que la hemlisis
est ocurriendo (gs. 34-1 y 34-2 y cuadros 34-1 y 34-2)
34
Investigacin de laboratorio de la hemlisis
Paul Revell
324 CAP. 34 INVESTIGACIN DE LABORATORIO DE LA HEMLISIS
e intentar determinar si el proceso es lento o rpido, intra
o extravascular. Las pruebas para encontrar la causa de la
hemlisis entonces continan de manera lgica. Los pa-
cientes necesitan por lo general vitamina B
12
y que se veri-
quen los niveles de folato y despus se comience a aplicar
las dosis del tratamiento con cido flico por va oral. La
transfusin es necesaria en estados clnicos extremos. Si se
encuentra la causa, entonces el tratamiento especco se
inicia, por ejemplo, con corticoesteroides por va oral para
hemlisis inmunitaria. Las complicaciones pueden nece-
sitar tratamiento, como el retiro de los clculos biliares
formados por el pigmento, que son sintomticos en la es-
ferocitosis hereditaria. La extirpacin del bazo (esplenec-
toma, para reducir la destruccin) tiene que considerarse
en algunos casos.
La hospitalizacin del paciente es necesaria en tiempos
de estrs (embarazo, ciruga, etc.), y siempre es necesario
apoyar y educar al paciente y a la familia en condiciones
Figura 34-1 Caractersticas siopatolgicas de la hemlisis. Si la destruccin ocurre dentro de los vasos sanguneos, entonces se libera la
hemoglobina, y aparece en la orina (vase tambin la g. 34-2). Si la destruccin es extravascular (del bazo, a veces del hgado) entonces
esto se evita pero se libera excesiva bilirrubina sin conjugar, lo que puede ocasionar que el paciente presente ictericia (tonalidad amarilla; o
amarillo claro, si tambin es anmico, se identica de manera temprana en la esclertica ocular) y el producto secundario, urobilingeno, se
detecta en la orina durante la prueba (no decolora la orina). El aumento en la produccin crea un cambio de eritrocitos a formas ms jvenes,
que genera policromasia, un matiz azul, sobre el frotis de la sangre perifrica, que se reeja en una cuenta aumentada de reticulocitos. Los
eritrocitos nucleados, por lo general presentes slo en la mdula, tambin pueden observarse en la sangre en la hemlisis activa.
Vasos
sanguneos
Eritrocitos
anormales
Descenso en Hb
Mdula
sea
Hiperplasia
del eritrocito
Eritrocitos
incrementados
Utilizacin de
hierro y fosfato
Hgado
Intestino
Estercobilingeno
Hemoglobiona
Hemosiderinuria
Urobilingeno
Urobilongeno
Rin
Bilirrubina sin conjugar
Destruccin
prematura
en el bazo
Extravascular
Bilirrubina sin conjugar
Hemoglobina libre (y matanemalbmina)
Contiene suero intravascular
CARACTERSTICAS CLNICAS 325
Cuadro 34-1 Anormalidades de laboratorio en la hemlisis
No todas se encuentran en cada paciente. La gravedad relativa
de cada anormalidad depende del estadio que se ha alcanzado
de la enfermedad. La vida del eritrocito reducida se mide poco
en forma directa (vase la g. 34-5 como ejemplo). En general:
Hemoglobina baja si est descompensada
Cuenta del reticulocito incrementada
Bilirrubina incrementada (sin conjugar)
Urobilingeno en orina
Tiempo de vida reducido del eritrocito
Eritrocitos anormales (dependiendo de la causa)
Y si hay hemlisis intravascular:
Hemoglobinemia
Metahemalbuminemia
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
Haptoglobina srica baja
Cuadro 34-2 Caractersticas clnicas de la hemlisis
La informacin clnica proporcionada por el mdico puede
ayudar en la seleccin de investigaciones primarias y
secundarias cuando se sospecha hemlisis.
Historia de episodios anteriores
Asociacin de episodios con: infecciones
Anemia frmacos
Ictericia fro
Clculo biliar del pigmento alimentos
lceras en las piernas
Retraso en el crecimiento
Historia familiar de anemia/ictericia
Bazo alargado
Anormalidades del esqueleto
Figura 34-2 Algunos hallazgos de laboratorio en la hemlisis intravascular. a) La hemoglobina se libera dentro del suero, produciendo
un aspecto turbio-marrn. Un suero normal se muestra para la comparacin. b) Parte se aprecia directamente en la orina, causando una
decoloracin similar. Esto no debe confundirse con la incidencia, mucho ms comn, de la hematuria, donde eritrocitos enteros aparecen
en la orina. En la hemoglobinuria, por tanto, la prueba de la tira diagnstica para la sangre es positiva pero ningn eritrocito se muestra en la
microscopia de la orina. c) Las clulas del rin pasan a la orina (contratincin roja), toman hemoglobina y se presentan como grnulos
pequeos de hemosiderina (azules). Vase tambin el cuadro 34-7.
crnicas. Los estudios de asesoramiento genticos y sobre
la familia pueden ser apropiados en ciertos casos.
Desrdenes hemolticos
Existen centenares de diversas condiciones y se han escrito
grandes tomos de ellas! El cuadro 34-3 muestra un pano-
rama general de los amplios grupos y ejemplos comunes o
importantes. Una breve descripcin de cada uno de stos se
desarrolla para ilustrar dnde se sitan dentro de este esque-
ma general; los captulos anteriores dan mayor detalle sobre
algunas de las condiciones individuales. Hay tambin una
lista de lecturas al nal de este captulo.
Anemias de clulas falciformes y otras variantes
de la hemoglobina
El eritrocito contiene hemoglobina formada de cadenas de
globina alteradas. La hemoglobina A (HbA) es normal. La
HbF es una variante pero es normal en el feto. La hemo-
globina S anormal se presenta por un defecto gentico que
causa la sustitucin de un aminocido en la cadena de
la hemoglobina. En estas condiciones el eritrocito contiene
hemoglobinas particulares segn los genes que se portan.
Por ejemplo, en la enfermedad falciforme homocigtica
con dos genes S, el eritrocito contiene principalmente HbS
y un poco de HbF pero ninguna HbA. En el rasgo (un gen
S) contiene 45% de HbS y el resto de HbA. Vale considerar
que estos son los porcentajes en cada clula; en contraste,
un paciente con anemia falciforme homocigtica, a quien
se transfunde con sangre normal (slo HbA) tambin puede
tener 45% de HbS y el resto de HbA, pero cada clula ser
toda HbS o toda HbA.
Anemia de clula falciforme (SS)
La forma desoxigenada de la Hb anormal es menos soluble
que la HbA normal (en un amortiguador de fosfato sta
forma la base de la prueba de tamizaje para HbS). La HbS
produce eritrocitos deformes (clulas falciformes) debido
a la formacin tactoide, y stos son destruidos en el bazo
y perifricamente. Los pacientes tienen una hemoglobina
baja (5 a 10 g/dl) y con frecuencia tienen cuentas de neu-
trlos y de plaquetas elevadas. Las clulas falciformes y
con forma de bote son visibles en el frotis sanguneo. El
diagnstico se realiza por electroforesis de Hb sobre gel de
agarosa a pH cido o alcalino. Los laboratorios que mane-
jan una cantidad grande de muestras utilizan la cromato-
grafa lquida de alto rendimiento (HPLC). Una Hb baja es
suciente para daar el desarrollo en algunos nios. Los fe-
nmenos trombticos se deben, sobre todo, a la morfologa
falciforme de los eritrocitos, que causa dolor en los miem-
bros, y tambin afecta a pecho, abdomen y cerebro. El in-
farto (destruccin localizada por la carencia de oxgeno) del
bazo produce hipoesplenismo con cuerpos de Howell-Jolly
en eritrocitos sobre el frotis sanguneo. Un cuidado mdico
adecuado tiene un impacto signicativo sobre la calidad de
vida y mortalidad de pacientes con esa condicin.
En el rasgo de la clula falciforme (AS) la morfologa
falciforme no ocurre (ya que hay menos HbS en cada c-
lula) excepto bajo condiciones muy hipxicas (p. ej., en un
avin despresurizado, en anestesia general). Hay poco que
ver en el frotis.
Cuadro 34-3 Desrdenes hemolticos
Esta manera de dividir las condiciones permite, con una cantidad limitada de informacin clnica, guiar la comprobacin subsiguiente.
HEREDADOS Defecto de la sntesis de la hemoglobina, por ejemplo, enfermedad de la clula falciforme o talasemia
Anormalidad de la membrana, por ejemplo, esferocitosis hereditaria
Deciencia enzimtica, por ejemplo, deciencia de G6PD o PK
ADQUIRIDOS INMUNITARIOS Autoinmunitarios, por ejemplo, AIHA caliente o fra (CHAD)
Enfermedad hemoltica del recin nacido
Incompatibilidad de la transfusin
NO INMUNITARIOS Fsico-mecnico, por ejemplo, vlvulas cardiacas
Microangiopatas
Hemoglobinuria paroxstica nocturna
Enfermedad de HbC (CC)
Produce hemlisis leve y esplenomegalia, adems de pro-
blemas adicionales en la deshidratacin y en el embarazo.
El rasgo (AC) no es signicativo para el individuo, excepto
en trminos genticos.
Enfermedad HbSC (S/C)
Crea hemlisis leve pero los pacientes pueden tener proble-
mas de morfologa de clula falciforme, especialmente en
el embarazo. En algunos, ocurren problemas de retinopata
(infartos en la parte posterior del ojo) y de destruccin sea
(p. ej., de la cabeza del fmur).
Enfermedad falciforme/tal (S/tal)
La gravedad depende de la cantidad de Hb normal que se
produce, que a su vez depende del gen de la talasemia espe-
cca. Sin ninguna, entonces la enfermedad es en todo tan
grave como la forma SS homocigota.
Talasemias
En estas condiciones, existe produccin alterada, en cuanto
a nmero, de las cadenas de globina (en lugar de la produc-
cin de tipos anormales de la cadena). stas comprenden
desde la
0
-talasemia (ninguna cadena ) hasta las -talase-
mias leves, donde hay una reduccin mnima en la sntesis
de cadena y ningn problema clnico para expresarlas.
Los heterocigotos no se encuentran con el problema pero a
menudo muestran alteraciones visibles en el frotis sangu-
neo. La
0
-talasemia homocigota es una alteracin seria que
requiere de transfusiones por toda la vida y se complica a
veces por hiperesplenismo (el bazo hiperactivo que destru-
ye todas las clulas sanguneas). Los leucocitos presentan
caractersticas observables en el frotis. La falta de produc-
cin es ms importante que la hemlisis de clulas anorma-
les. La hiperplasia de la mdula produce las deformidades
seas tpicas de la niez. Los nios no crecen saludables y
mueren sin la transfusin. Los sobrevivientes de la transfu-
sin sufren los efectos de la sobrecarga de hierro. Si la que-
lacin falla, usando cada noche un frmaco quelante oral o
desferrioxamina como infusin subcutnea para aumentar
la excrecin del hierro, entonces ocurren daos en la gln-
dula endocrina (pituitaria, gonadal, pancretica), el hgado
e inltracin cardiaca, con resultado fatal, frecuentemente
antes de los 25 aos. La enfermedad de la hemoglobina H
es una forma de -talasemia (no una variante anormal de la
Hb llamada H!). Aqu la ausencia de algunas cadenas pro-
duce exceso de cadenas para formar los tetrmeros (
4
),
que se condensan como cuerpos de inclusin (cuerpos H,
vistos a la tincin con azul de cresilo).
Esferocitosis hereditaria
La esferocitosis hereditaria es autosmica dominante, es
decir, con un alelo del gen alterado una persona hereda la
condicin; se encuentra por lo general en caucsicos. Hay
alteracin de las protenas contrctiles de la membrana del
eritrocito que conduce a deformabilidad reducida. Las c-
lulas anormales son secuestradas en el bazo y se destruyen
de manera prematura. Es normal que la anemia sea leve
y que los esferocitos se observen en el frotis sanguneo,
DESRDENES HEMOLTICOS 327
Figura 34-3 Prueba de fragilidad osmtica. Alcuotas de san-
gre oxigenada bien mezclada se agregan a una serie de concen-
traciones salinas amortiguadas, por lo general NaCl en el rango
de 0.2 a 1.2%. Las diluciones se incuban a temperatura ambiente
por 30 min antes de que los tubos se centrifuguen y la cantidad de
hemlisis en el sobrenadante se lee espectrofotomtricamente. Los
esferocitos son anormalmente sensibles a las soluciones hipotni-
cas y se lisan en concentraciones ms altas que los eritrocitos nor-
males. Una prueba de fragilidad osmtica inconclusa puede repe-
tirse incubando la muestra sangunea por 24 h a 37C, antes de
la comprobacin. Esta modicacin es mucho ms sensible en la
deteccin de la esferocitosis leve que el mtodo original. El grco
para los eritrocitos normales aparece por lo general en el rea gris;
tambin se muestra un grco representativo para un paciente con
esferocitosis hereditaria. Algunos laboratorios utilizan una varia-
cin, la prueba del tiempo de lisis en glicerol acidicado.
(pero suelen ser fcilmente confundidos!). El diagnstico
se realiza por una fragilidad osmtica incrementada (g.
34-3) y puede conrmarse por un anlisis electrofortico
de los componentes de la membrana del eritrocito usando
geles de poliacrilamida SDS.
Deciencia de G6PD (glucosa 6-fosfato deshidrogenasa)
El eritrocito tiene una energa reductora que disminuye a
partir de una carencia de la primera enzima de la va de
desviacin, la pentosa fosfato del metabolismo de la glu-
cosa. Es frecuente que sea una condicin recesiva ligada
al sexo: la enfermedad se expresa en varones con un alelo
del gen afectado en el cromosoma X, pero en las mujeres
se necesitan ambos alelos afectados. Las mujeres con un
alelo afectado mostrarn expresin variable, dependiendo
del cromosoma X inactivo y en qu clulas, segn la hip-
tesis de Lyon. Esto se observa sobre todo en poblaciones
negras y mediterrneas, y afecta a 3% de la poblacin mun-
dial. La actividad de G6PD est presente en los reticuloci-
tos pero cae rpido y prematuramente en estos individuos.
La integridad del eritrocito, por tanto, se reduce durante la
exposicin a qumicos oxidantes y frmacos (p. ej., antibi-
ticos de sulfonamida). Los cuerpos de Heinz se observan en
los frotis sanguneos preparados de manera especial. El diag-
nstico se realiza mediante el anlisis de G6PD, pero slo en
el estado estable (no cuando hay una cantidad excesiva de
reticulocitos, p. ej., despus de una crisis hemoltica). Algu-
nos de estos episodios son producidos por alimentos (clsi-
camente por habas: favismo) y tambin por frmacos.
Tamizaje para la deciencia de 6GPD
Dentro de la va de la pentosa fosfato el NADP es reducido
por G6PD a NADPH. Este producto uoresce bajo luz ul-
travioleta, lo que forma la base de la prueba de la mancha
uorescente. La sangre completa se mezcla con:
Glucosa 6-fosfato.
NADP.
Agente lisante (normalmente saponina).
Amortiguador.
Esto se incuba de 5 a 10 min antes de colocarse sobre el
papel ltro, secarse y examinarse bajo luz UV de onda lar-
ga. Las muestras normales despiden luz uorescente bri-
llante, las decientes no, o slo una luz escasa uorescente.
Cualquier prueba de tamizaje anormal debe conrmarse
por un ensayo funcional de la G6PD; aqu la produccin
de NADPH por G6PD se mide espectrofotomtricamente,
como un cambio en la densidad ptica a travs del tiempo.
Deciencia de piruvato cinasa
La deciencia de piruvato cinasa es una condicin au-
tosmica recesiva (una persona maniesta la condicin
cuando ambos alelos de un gen son anormales) y otro pro-
blema enzimtico, el ms comn de las enfermedades raras
sin G6PD. Las clulas llegan a tornarse deformes y lbi-
les. El frotis sanguneo muestra poiquilocitos (eritrocitos
anormales) que son hemolizados de forma espontnea sin
estmulo de algn frmaco. Las transfusiones pueden ser
necesarias.
Tamizaje para la deciencia de piruvato cinasa
La piruvato cinasa es el catalizador para la reaccin:
ADP fosfoenolpiruvato S ATP piruvato
El producto de esta reaccin, piruvato, avanza dentro de la
siguiente reaccin, que es catalizada por lactato deshidro-
genasa (LDH):
Piruvato NADH S lactato NAD
NADH despedir uorescencia bajo luz UV de onda lar-
ga, mientras que NAD no. Por tanto, cuando la sangre com-
pleta es incubada con ADP, fosfoenolpiruvato y NADH,
en muestras normales, NADH se oxida a NAD, con una
prdida consecuente de uorescencia. Las muestras de-
cientes despedirn luz uorescente brillante. Una prueba
de tamizaje de PK anormal debe conrmarse por un ensayo
completo donde la oxidacin de NADH a NAD es medida
por un cambio en la absorbancia espectrofotomtricamente
en una cintica basada en el tiempo.
Hemlisis inmunitaria
Diferentes patologas (como las que se listan en el cuadro
34-4) dan lugar a eritrocitos que son el blanco de anticuer-
pos en su supercie; por lo tanto, tienen un periodo de vida
corto. La hemlisis inmunitaria se divide en el laboratorio
en caliente y fra, dependiendo de la variacin de la
temperatura en la que existe actividad del anticuerpo (y de
la aglutinacin) en el laboratorio, clsicamente a 37
C en
caliente y a 4
C en fro, aunque existe, a veces, un peque-

o traslape. As tambin como en una prueba de Coombs
(antiglobulina) directa de tamizaje amplio, que es positiva
Figura 34-4 Prueba de Coombs (o antiglobulina) directa. El DCT (o DAGT) detecta eritrocitos cubiertos de anticuerpos. a) A una
suspensin de eritrocitos del paciente (ya cubiertas con el anticuerpo) se agrega b) antiglobulina de espectro amplio (p. ej., antihumana
de conejo). c) La aglutinacin ocurre. El resultado se muestra en un mtodo tradicional con tubo (superior) o con la tecnologa de gel
(inferior)
Cuadro 34-4 Causas de la hemlisis inmunitaria
Hay muchas condiciones diferentes que pueden dar lugar a eritrocitos cubiertos con anticuerpos. Aqu se muestran amplios grupos.
La divisin bajo condiciones fras y calientes ayuda en la decisin del tratamiento.
Fra Desrdenes linfoproliferativos, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de grado bajo
Infecciones, por ejemplo, Mycoplasma pneumoniae
Enfermedad por hemaglutinina-fra (CHAD)
Caliente Desrdenes linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia linfoctica crnica
Enfermedades del tejido conectivo, por ejemplo, lupus eritematoso sistmico
Farmacos, por ejemplo -metildopa, usados para presin sangunea alta
(DCT, g. 34-4), los reactivos que dan un perl ms espe-
cco (IgG, complemento) pueden utilizarse en la hemli-
sis inmunitaria caliente. Es frecuente, cuando se sospecha
hemlisis inmunitaria fra, mantener el espcimen de la
sangre a una temperatura mayor a la ambiental hasta que el
suero se separe, despus se realiza la prueba contra clulas
del adulto (que contiene antgeno I) y del cordn umbilical
(que producen antgeno i). La DCT es, por lo general, slo
positiva con el reactivo complemento, y el frotis sangu-
neo muestra aglutinacin, a menos que se realice en condi-
ciones calientes. La distincin entre condiciones calientes
y fras es importante para el tratamiento. En la hemlisis
inmunitaria caliente, los esteroides y otros tratamientos in-
munosupresivos dirigidos a reprimir, o a interferir con el
efecto de la produccin del anticuerpo es con frecuencia
til. La esplenectoma a menudo funciona. En la hemlisis
inmunitaria fra, sin embargo, la quimioterapia citotxica
(a veces) y mantener caliente al paciente ayuda (casi siem-
pre), pero no los esteroides o la esplenectoma. La trans-
fusin por lo general se evita en la hemlisis inmunitaria,
pues la autoaglutinacin interere con la compatibilidad
cruzada. El estado clnico del paciente demanda, de cuando
en cuando, la transfusin y no puede permitirse ciertamen-
te sucumbir por la carencia de eritrocitos, en este caso se
proporciona la sangre que es menos incompatible.
Enfermedad hemoltica del recin nacido (HDN)
Las clulas rhesus positivas del feto Rh
+
pasan a la circu-
lacin de una madre Rh
, por ejemplo, en la hemorragia

durante el embarazo o por amenaza de aborto. Esto cau-
sa que la madre produzca anticuerpos anti-D (antirrhesus)
que ms tarde en este embarazo o en subsecuentes, pasan
al feto y se dirigen en contra de los eritrocitos, causando
hemlisis si el beb es Rh
+
. Las incompatibilidades del
grupo ABO pueden causar problemas similares pero de
menor gravedad. Altos niveles de bilirrubina sin conjugar
despus del nacimiento (debido a hemlisis) cruzan la ba-
rrera hematoenceflica y producen kerncterus, con dao
cerebral. El tratamiento, que puede incluir la transfusin de
intercambio, previene esto. Pueden verse esferocitos sobre
el frotis sanguneo y el DCT se torna positivo. En casos
graves el beb se vuelve hidrpico (anemia/ictericia/au-
mento de volumen con edema). En potenciales periodos
hemorrgicos feto-maternos, la produccin del anticuerpo
por la madre puede prevenirse con la administracin pasiva
de anti-D mediante inyeccin intramuscular para bloquear
clulas Rh
+
, antgeno que hace que ella produzca su propia
respuesta. El uso prolctico de anti-D de esta manera es
una de las historias exitosas de la medicina cientca mo-
derna, as los infantes afectados son ahora escasos; pueden
tratarse por transfusin intrauterina (una maniobra deli-
cada) o en induccin temprana de la labor del parto, con
transfusin de intercambio en el recin nacido.
Transfusin incompatible
La transfusin incompatible crea una hemlisis inmunome-
diada. En la incompatibilidad de grupo ABO (que ocurra es
muy raro y se espera) las clulas del donador se destruyen
en el lecho intravascular debido a que los anticuerpos del
paciente anti-A o anti-B (o ambos) se producen de manera
natural. El paciente puede enfermarse muy rpido, como
se describe antes, y desarrollar hemoglobinuria. Si la trans-
fusin no se detiene o el paciente est bajo anestesia, la
condicin puede ser fatal. Las reacciones de incompatibi-
lidad a otros antgenos es normal que provoquen hemlisis
extravascular con anemia e ictericia. La recuperacin es la
norma, pero se presentan problemas de compatibilidad cru-
zada despus de esto, por causa de aloanticuerpos para los
antgenos del eritrocito.
Mecanismos no inmunitarios
stos pueden dar lugar a eritrocitos anormales (que, por
tanto, tienen una vida media corta). El traumatismo fsico y
mecnico para los eritrocitos normales, como atravesar una
vlvula mecnica del corazn que se fuga, puede conducir
a la fragmentacin y lisis intravascular o a su reciclaje pre-
coz por el bazo.
La hemoglobinuria paroxstica nocturna (PNH) es una
enfermedad hematolgica adquirida rara. El paciente su-
fre una tpica hemlisis intravascular mediada por el com-
plemento, que resulta en hemoglobinuria, deciencia de
hierro, crisis aplsica y una predisposicin a la trombosis
venosa. ste es un desorden de la clula embrionaria que
produce clulas decientes en protenas reguladoras del
complemento, ocasionando un incremento de la sensibili-
dad de la membrana del eritrocito a la lisis por el comple-
jo del complemento. Por lo comn el diagnstico se hace
usando una variedad de pruebas. Las ms sensitivas son
las pruebas con suero acidicado (prueba de Hams) y la
prueba de la lisis de la sacarosa. stas ahora se sustituye-
ron en gran parte por la introduccin de la citometra de
ujo para la deteccin de las molculas superciales CD55
(factor acelerador del deterioro-DAF) y CD59 (factor de
restriccin homocigoto-HRF/protena ligada a C8 [C8bp]).
Estos antgenos estn reducidos o ausentes en PNH y la
citometra de ujo es la herramienta ms sensible y espe-
cca disponible para el diagnstico actual. La alteracin
puede detectarse en la supercie de los eritrocitos y leuco-
citos en esta condicin.
Cuadro 34-5 Causas de la microangiopata
Estos tres grupos amplios contienen todas las causas proba-
bles:
Coagulacin intravascular diseminada (DIC) (en problemas
obsttricos, septicemia, cncer, etctera)
Lupus eritematoso sistmico (SLE) y otros desrdenes re-
nales y del tejido conjuntivo
Prpura trombocitopnica trombtica (TTP) y sndrome
urmico hemoltico (HUS)
Cuadro 34-6 Diagnstico de laboratorio de las condiciones
microangiopticas
La deteccin de la coagulacin, la bioqumica renal y la infor-
macin clnica normalmente distinguen la causa.
Hb/ Insuciencia Contexto
Causa plaquetas Coagulacin renal clnico
DIC Baja Anormal
SLE Baja N
TTP Baja N
HUS Baja N
Cuadro 34-7 Investigacin de laboratorio de la hemlisis intravascular
Durante la hemlisis, la hemoglobina se libera en el plasma. sta se liga rpido a la haptoglobina y a la hemopexina de las prote-
nas del plasma antes de eliminarse de la circulacin por el hgado. Si la hemlisis es grave las concentraciones de haptoglobina y he-
mopexina se agotan muy rpido, y la hemoglobinuria/anemia y metahemalbuminemia se tornan detectables.
La metahemalbmina con su apariencia turbia-marrn, que puede medirse fotomtricamente, tiene un pico de absorcin carac-
terstico de 624 nm
Los niveles de haptoglobina y hemopexina sricas pueden medirse de varias maneras incluyendo la ltracin en gel y mtodos elec-
troforticos, fotomtricos e inmunolgicos. Los ms comunes actualmente son los mtodos inmunolgicos, que utilizan antihapto-
globina o antihemopexina, que permiten la demostracin por inmunodifusin radial o tcnicas del cohete de Laurell.
La demostracin de la hemosiderina urinaria es por el mtodo de la tincin de hierro con azul Prusia de Perl. Una muestra de
orina se centrifuga y el sedimento se extiende a un portaobjetos de vidrio, se seca al aire antes de jarse en metanol. El hierro
frrico presente en el sedimento reacciona con el ferrocianuro de potasio acidicado para producir ferrocianuro frrico que apa-
rece como grnulos teidos de azul en la microscopia.
Figura 34-5 Marcado del eritrocito. La seora ID, de 76 aos, sufra
ataques recurrentes de anemia relacionados con palpitaciones, falta de
respiracin y agotamiento. La conocan por tener una enfermedad car-
diaca valvular compleja, incluyendo un reemplazo de la vlvula artica,
que tena murmullos al escuchar el corazn, que podran indicar fuga. Se
le aplica warfarina y se le distingue por tener aloanticuerpos del eritroci-
to, haciendo la compatibilidad cruzada difcil. Un cuadro de deciencia
del hierro indica la prdida de eritrocitos pero, con poca fragmentacin
sobre el frotis sanguneo, reducida haptoglobina pero ninguna hemosi-
derinuria, y confusin para determinar una destruccin intravascular sig-
nicativa. Ella no tena algn sntoma intestinal y el examen completo
del aparato gastrointestinal no revel ninguna causa anatmica de la pr-
dida sangunea. Sus eritrocitos, por tanto, fueron marcados con
5l
Cr y se
transfundieron nuevamente (da 0). Las muestras de sangre se tomaron
todos los das para la actividad isotpica y las heces recolectadas, como
se muestra en la grca. El da 1 se toma como 100% para permitir pr-
didas tempranas inaplicables. Puede observarse que la vida media del cromo (T
50
Cr) se reduce a 15 das (lo normal es de 25 a 33 das),
aunque ella mantuvo su Hb durante el estudio. Esta modesta reduccin se explica por la prdida considerable advertida a partir del aparato
gastrointestinal, que se observa en las cuentas del istopo en las heces. La prdida es claramente variable y se asume que proviene de una
angiodisplasia en el intestino largo (stas no son demostrables anatmicamente). La paciente necesit varias transfusiones electivas y de
urgencia durante el primer ao, pero ninguna a partir de entonces. Pareca que la prdida de sangre haba cesado. La vlvula del corazn
no necesit reemplazarse.
Microangiopatas
Las microangiopatas causan destruccin del eritrocito por
los lamentos de brina de vasos pequeos y se relacionan
con un cuadro sanguneo caracterstico, que contiene por-
ciones de los fragmentos, algunos glbulos rojos alarga-
dos y pocos microesforocitos. La trombocitopenia y los
marcadores de la hemlisis (anemia, reticulocitos eleva-
dos y bilirrubina) estn con frecuencia presentes. Existen
varias causas de la microangiopata, las cuales se resumen
en el cuadro 34-5. Los indicadores del diagnstico que las
distingue se muestran en el cuadro 34-6. El diagnstico
debe hacerse de manera correcta porque todas estas condi-
ciones son serias y pueden de otro modo causar la muerte
a pacientes sanos jvenes, aunque a menudo son tratables.
La distincin acertada entre ellas es importante porque
ciertos productos sanguneos son en potencia peligrosos
en algunas personas, y asimismo el manejo con esteroides
es provechoso slo en algunos individuos.
En el cuadro 34-7 se muestra evidencia adicional de he-
mlisis intravascular que puede obtenerse a partir de las
investigaciones que se ejemplican aqu.
Segmento nal
Siempre existen algunos casos difciles de aclarar y la me-
dicin directa mediante el marcaje de eritrocitos con isto-
pos puede ser necesaria (g. 34-5). Por ltimo, es probable
que algunos pacientes presenten de forma clara la hemli-
sis, pero en quienes ninguna causa puede encontrarse. La
mayora de ellos presenta un desorden de la estructura o
siologa del eritrocito, hasta ahora no identicado.
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Lewis SM, Brain BJ, Bates I, Dacie and Lewis. Practical Hae-
matology. 9th edn. 2001: Churchill Livingstone, London.
Introduccin
El ujo sanguneo en el compartimiento vascular depende
del equilibrio entre la actividad anticoagulante y la procoa-
gulante. Bajo circunstancias normales la actividad anticoa-
gulante es la que domina; sin embargo, con el dao a las
clulas endoteliales que revisten los vasos sanguneos, el
subendotelio puede ser expuesto, con el inicio de la forma-
cin local del cogulo. La agregacin plaquetaria inicial
forma un tapn plaquetario, mientras la coagulacin lo-
cal produce un cogulo rme de brina. Posteriormente, un
sistema de digestin del cogulo (brinlisis) previene la
extensin del cogulo y restaura la permeabilidad.
La investigacin de laboratorio se utiliza de rutina para
evaluar a los pacientes con elevado riesgo trombtico o
hemorrgico. En muchas condiciones mdicas agudas el
equilibrio normal de la hemostasis se altera y requiere
correccin. Adems, el monitoreo de los agentes teraputi-
cos para promover la actividad anticoagulante o los agen-
tes para restaurar la hemostasis normal forma parte de las
investigaciones de rutina emprendidas en el laboratorio de
hematologa. La coagulacin in vivo requiere supercies
de calcio y de fosfolpidos como un componente integral
para la formacin del cogulo. Los factores de coagulacin
circulan como precursores inactivos, que bajo estmulos
apropiados se convierten a enzimas y a cofactores acti-
vos, con la generacin de trombina y la conversin sub-
siguiente del bringeno a brina. Los pasos iniciales en
la activacin de la coagulacin involucran el factor tisular,
expresado en las supercies no vasculares de la membrana
celular, actuando como un cofactor para la activacin
de los factores VII a VIIa, con la activacin subsiguiente de
los factores X y IX y la generacin eventual de trombina.
Hay, sin embargo, interacciones hemostticas numerosas
entre los factores de coagulacin, permitiendo a una di-
versidad de ellos actuar como anticoagulantes y, adems,
como procoagulantes en diferentes circunstancias.
Por tradicin, las pruebas de coagulacin in vitro se han
separado de forma conveniente en activacin de una va
intrnseca o una extrnseca. La activacin no siolgica de
la va intrnseca ocurre por el contacto con una supercie
ajena del factor XII, ciningeno de alto peso molecular y
por la activacin subsiguiente de los factores coagulantes a
travs de los factores XI, IX, X y la protrombina. In vivo,
sin embargo, las cantidades pequeas de generacin de
protrombina despus de la activacin de la va extrnseca
resulta en una amplicacin de la hemostasis va activa-
cin del factor XI (g. 35-1).
Tiempo de protrombina
El tiempo de protrombina se utiliza como medida de la ac-
tividad de la va extrnseca, en la cual la tromboplastina
(factor tisular) y el calcio se agregan al plasma, y el tiempo
requerido para la formacin del cogulo se mide (g. 35-2).
Un tiempo de protrombina prolongado puede deberse a:
Anticoagulantes orales.
Deciencia del factor I, II, V, VII o X, que puede here-
darse o adquirirse, por ejemplo, en la enfermedad del
hgado o coagulacin intravascular diseminada.
Altos niveles de heparina.
Inhibidores de los factores de coagulacin especcos,
incluyendo el inhibidor del lupus. La investigacin adi-
cional de un tiempo de protrombina prolongado puede
35
Investigaciones de laboratorio de la hemostasis
Peter E Rose y Catherine Caveen
334 CAP. 35 INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS
implicar estudios de correccin o ensayos de los facto-
res coagulantes.
Un tiempo de protombina prolongado puede corregir-
se en presencia de plasma normal. El patrn de correccin
identica el factor, o los factores, que son decientes. Di-
ferentes reactivos se utilizan en los estudios de correccin
(cuadro 35-1). Estas pruebas, sin embargo, se han sustitui-
do en gran parte por los ensayos de los factores coagulantes
individuales.
Control anticoagulante oral
El cociente normalizado internacional (INR) es el mtodo
recomendado para informar los resultados del tiempo de
protrombina para el control anticoagulante. El sistema del
INR se ha desarrollado para compensar la fuente principal
de discrepancia en los ensayos del tiempo de protrombina,
a saber, la variabilidad en la respuesta a diferentes reactivos
de tromboplastina a los cambios en los factores coagulantes
dependientes de la vitamina K inducidos por la warfarina.
Como los nmeros de los pacientes que requieren terapia
oral anticoagulante van en aumento (1 de 80 personas en el
Reino Unido) y la necesidad de vigilancia regular del INR,
esto representa una carga de trabajo importante. El princi-
pio de la anticoagulacin oral es proporcionar un nivel de
anticoagulacin para prevenir problemas trombticos pero
tambin para evitar problemas de sangrado de la sobreanti-
coagulacin. Para la mayor parte de los problemas tromb-
ticos venosos un INR en el rango de 2 a 3 es satisfactorio.
Figura 35-1 La va de la cascada de la coagulacin.
TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA ACIVADA (TTPA) 335
Para los pacientes con vlvulas mecnicas del corazn, un
nivel ms alto de anticoagulacin INR en el rango de 2.5 a
3.5, es necesario para prevenir la formacin del cogulo en
la vlvula (cuadro 35-2).
El INR se expresa como:
INR =
PT
GMNPT

(ISI)
donde ISI es el ndice de sensibilidad internacional del
reactivo de tromboplastina y GMNPT es la media geom-
trica del tiempo de protrombina normal.
Fuentes importantes de error permanecen en la medi-
cin del INR y pueden surgir de problemas en la medicin
del tiempo de protrombina, ISI o GMNPT.
Cuadro 35-1 Estudios de correccin de un tiempo de protrombina prolongado

Plasma normal Suero envejecido Plasma absorbido Plasma oxalatado Deciencia del factor Pruebas adicionales
I Ensayo de bringeno
II Ensayo del factor
V Ensayo del factor
VII Ensayo del factor
X Tiempo RVV
Inhibidor Tiempo de reptilasa
Neutralizacin por protamina
corregido; sin corregir; RVV prueba con veneno de la vbora de Russells (serpiente Vipera russelli).
Plasma normal citratado: ste proporciona todos los factores de coagulacin.
Suero envejecido: la sangre coagulada se incuba por 24 h a 37C; el suero contiene los factores VII, IX, X, XI y XII.
Plasma absorbido: el plasma normal se trata con el hidrxido de aluminio, que absorbe ciertos factores; el plasma resultante contiene los factores
I, V, VII, XI y XII.
Plasma oxalatado: plasma normal que se agrega a oxalato de sodio y se incuba por 72 h a 37C; contiene todos los factores excepto el V.
Errores de la protrombina
Los errores con la estimacin del tiempo de protrombina pue-
den crearse por los problemas con la coleccin de la mues-
tra, la concentracin del anticoagulante y el tipo de tubo de
coleccin utilizado. Adems, las diferencias entre los m-
todos manuales y automticos son reconocidas; con los
ltimos se producen tiempos de protrombina ms cortos.
Mientras se requieren productos manufacturados para
producir un valor del ISI para cada lote del reactivo de
tromboplastina, la calibracin incorrecta de los reactivos
de tromboplastina por el laboratorio local o los fabricantes
es un problema. Para la calibracin de una tromboplasti-
na, se recomienda un reservorio de muestras del plasma de
20 adultos normales y 60 pacientes en warfarina, adems,
diferentes preparaciones de referencia internacional de dis-
tintas especies producen diferencias en el ISI. La media
geomtrica del tiempo de protrombina normal debe deri-
varse de un reservorio de 20 muestras de plasma de adultos
normales y la media geomtrica calculada de ste.
Tiempo parcial de tromboplastina
activada (APTT)
Esta prueba mide la va intrnseca de la coagulacin. Un ac-
tivador, como el caoln, desencadena la va al activar los fac-
tores de contacto (g. 35-3). En presencia de iones de calcio
y de fosfolpido, esto culmina en la generacin de trom-
bina y en ltima instancia en la formacin del cogulo de
brina. El APTT tambin se utiliza en el monitoreo de la te-
rapia de heparina. Un APTT prolongado en un paciente con
historia de una ditesis hemorrgica requiere investigacin
adicional, en particular para excluir la hemolia A o B.
Figura 35-2 Va extrnseca
Figura 35-3 Va intrnseca.
Cuadro 35-2 Anticoagulantes orales para diversas condiciones clnicas
Condicin Rango INR Duracin recomendada
Tromboembolismo venoso
Trombosis posoperatoria de la vena de la pantorrilla sin algunos factores de riesgo 2 a 3 6 semanas
Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirrgicos sin 2 a 3 3 meses
algunos factores de riesgo
Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirrgicos con factores 2 a 3 Indenida (mientras los
de riesgo factores de riesgo persistan)
mbolo pulmonar y trombosis de la vena proximal 2 a 3 6 meses
DVT recurrente y/o PE 2 a 3 Indenida
DVT recurrente y/o PE aunque sobre warfarina (INR rango 2 a 3) 3 a 4 Indenida
Fibrilacin auricular
Fibrilacin auricular u otras arritmias de alto riesgo 2 a 3 Indenida
Prtesis de la vlvula del corazn y otras indicaciones cardiacas
Vlvulas protsicas mecnicas 2.5 a 3.5 Indenida
Vlvulas bioprotsicas del corazn (no articas) 2 a 3 3 meses
Cardiomiopata, trombo mural o segmento acintico 2 a 3 Indenida
El cido acetilsaliclico es la terapia de primera lnea para las siguientes condiciones; si est contraindicado, se recomiendan los
siguientes rangos
del INR para la terapia de warfarina:
Ataque TIA/isqumico 3 a 4 Indenida
Trombosis arterial perifrica e injertos 3 a 4 Indenida
Trombosis de la arteria coronaria 3 a 4 Indenida
Trombosis del injerto de la arteria coronaria 3 a 4 Indenida
Angioplastia coronaria y stents coronarios 3 a 4 Indenida
*Interrumpir la warfarina si no hay AF, trombo intracardiaco o embolismo sistmico. Los pacientes que no requieren warfarina deben considerarse
para la terapia antiplaquetaria (p. ej., con cido acetilsaliclico).
Un APTT prolongado puede causarlo la deciencia de
los factores I, II, V, VIII, IX, X, XI o XII, que se heredan
o adquieren debido a la enfermedad o a la consuncin he-
ptica, como en la coagulacin intravascular diseminada.
La terapia de heparina, los inhibidores para los factores
de coagulacin especcos, la presencia del anticoagulan-
te del lupus o los niveles altos de FDP (productos de la
degradacin del bringeno) tambin es posible que pro-
duzcan un APTT prolongado. Los estudios de correccin
tambin suelen utilizarse para investigar, adems, la causa
de un APTT prolongado. Si los estudios mezclados mues-
tran correccin del APTT, entonces los ensayos del factor
especco se realizan para determinar el factor deciente.
La falla que se pretende corregir requiere investigacin adi-
cional para excluir un inhibidor adicional especco o el
anticoagulante del lupus (g. 35-4).
El APTT se usa con ms frecuencia para monitorear el
tratamiento de heparina y ajustar el programa de infusin,
segn se ilustra en el cuadro 35-3.
Tiempo de trombina
El tiempo de trombina se utiliza como un tamiz rpido para
las anormalidades del bringeno y evaluar si la hepari-
na es la causa de un APTT prolongado. La trombina se
agrega al plasma citratado y se mide el tiempo para la for-
macin de brina (g. 35-5).
Un tiempo de trombina prolongado puede deberse a:
Disbrinogenemias, heredadas o adquiridas, con una
molcula de bringeno estructuralmente anormal con
las caractersticas funcionales alteradas.
Nivel bajo de bringeno (< 1 g/L).
Niveles elevados de los productos de degradacin del
bringeno.
Terapia con heparina.
TIEMPO DE TROMBINA 337
Figura 35-4 Investigacin de laboratorio de un APTT prolongado.
Investigacin de laboratorio de un APTT prolongado
La presencia de heparina en una muestra se conrma por la
correccin del tiempo de trombina con sulfato de protami-
na, que neutraliza la actividad anticoagulante.
Tiempo de reptilasa
La reptilasa es una enzima del veneno de la serpiente
Bothrops atrox (Per-de-lana), que coagula el bringeno
humano al cortar el brinopptido A del bringeno. La
reptilasa no es inhibida por la heparina o la antitrombina
III. Un tiempo de protrombina prolongado y tiempo de rep-
tilasa normal est tambin de acuerdo con la presencia de
heparina en la muestra. El tiempo de reptilasa se prolonga
en la disbrinogenemia e hipobrinogenemia.
Fibringeno
Si bien los desrdenes heredados del bringeno son raros,
los desrdenes adquiridos son comunes en pacientes con
coagulopatas de consumo, enfermedad heptica y, despus
de una ciruga mayor, derivacin cardiopulmonar. Adems,
la asociacin de niveles altos de bringeno y elevado ries-
go del corazn isqumico y la enfermedad vascular peri-
frica estn bien reconocidos. El bringeno es tambin
un reactor de fase aguda, con niveles elevados observados
con frecuencia en las enfermedades inamatorias. La in-
terpretacin de resultados es por tanto difcil, y el mtodo
ms apropiado depende del objetivo de la investigacin.
La conrmacin de los niveles bajos de bringeno con
un mtodo Clauss manual es el ms recomendable. Hay
muchos mtodos que se emplean para medir el bringe-
no, sobre todo con ms frecuencia los de coagulacin, que
miden el bringeno funcional, basados en la formacin
de brina. En el mtodo del tiempo de trombina (Clauss),
el tiempo de trombina es proporcional a la concentracin
del bringeno en la muestra de prueba. Una curva de cali-
bracin se prepara de las concentraciones conocidas de -
bringeno y se utiliza para convertir el tiempo de trombina
a una concentracin de bringeno. Hay poca interferencia
Cuadro 35-3 Rgimen de infusin de heparina, con monitoreo de laboratorio del tratamiento usando el APTT. El rango teraputico
debe determinarse del rango APTT equivalente a una concentracin de heparina del plasma de 0.2 a 0.4 UI/ml
Programa de infusin de heparina
Bolo IV 5 000 unidades
Infusin IV 15 000 unidades/12 h
Vericar el APTT despus de 2 a 6 h
Rango aceptable 1.5 a 2.5
En el embarazo 1.5 a 2.0
Ajustar la heparina como sigue:
> 5.0 Parar por una hora
Disminuir a 6 000 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 6 h
4.1 a 5.0 Disminuir a 3 600 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 6 h
3.1 a 4.0 Disminuir a 1 200 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 6 h
2.6 a 3.0 Disminuir a 600 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 12 h
1.5 a 2.5 Sin cambio Vericar el APTT dentro de 24 h
1.2 a 1.4 Aumentar a 2 400 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 12 h
< 1.2 Aumentar a 4 800 unidades/12 h Vericar el APTT en 2 a 6 h
Vericar el APTT 2 a 6 h despus de circular la heparina.
La heparina no debe represcribirse por ms de 24 h.
La vericacin del APTT sobre una base diaria es el mnimo obligatorio para todos los pacientes que reciben heparina intravenosa.
Vigilar las plaquetas despus de cuatro das del tratamiento con heparina.
Figura 35-5 Tiempo de trombina.
de los FDP o de la heparina, a menos que estn presentes
en altas concentraciones.
Un ttulo del bringeno puede obtenerse si se emplea
una serie de diluciones del plasma, seguidas por la adicin
de trombina. La dilucin en la cual el bringeno se di-
suelve es una medida de la concentracin del bringeno
presente. La prueba se efecta con frecuencia en paralelo
con sulfato de protamina y cido E-aminocaproico (EACA)
como indicadores de FDP y de brinlisis, respectivamen-
te. Los mtodos sicoqumicos que se usan con menos fre-
cuencia miden el bringeno total y pueden no reejar la
actividad funcional, mientras los mtodos inmunolgicos
miden el antgeno relacionado con el factor presente tanto
en el bringeno como en los FDP. El uso creciente de coa-
gulmetros automticos condujo a la automatizacin de
los ensayos del bringeno como parmetro derivado del
tiempo de protrombina, basados en un anlisis turbidim-
trico con un espectrofotmetro.
Ensayos del D-dmero y de los FDP
Los ensayos del D-dmero se utilizan cada vez ms en el
diagnstico de la enfermedad tromboemblica venosa. Los
fragmentos D-dmero se producen durante la degradacin
de los cogulos de brina generados desde la trombina
por la plasmina. Los ensayos se basan en la deteccin que
hacen los anticuerpos especcos de los fragmentos de -
brina entrelazada sin actividad cruzada con bringeno.
Estas pruebas se pueden, por tanto, realizar en muestras
de plasma. Hay actualmente tres mtodos principales para
la deteccin del D-dmero. Un ensayo inmunoabsorben-
te ligado a enzimas (ELISA) tiene una sensibilidad muy
alta y proporciona resultados cuantitativos. La desventaja
principal es que la tcnica consume tiempo y, por tanto,
presenta problemas donde este anlisis se utiliza en el ta-
mizaje rpido para la enfermedad tromboemblica venosa.
Los ensayos de aglutinacin de ltex son ms rpidos, pero
tienen una sensibilidad menor a 80%, requiriendo que se
utilicen conjuntamente con un tanteo de probabilidad cl-
nica como parte de cualquier procedimiento de tamizaje.
Los ensayos de ltex automticos cuantitativos requieren
equipo especial para medir la disminucin de la transmi-
sin de la luz a 405 nm; ste tiene la ventaja de ser sensible
y tambin rpido. Los ensayos de aglutinacin de sangre
entera ofrecen el ensayo ms rpido, basado en la agluti-
nacin cuantitativa del eritrocito, en la cual el anticuerpo
monoclonal para un D-dmero se liga al anticuerpo mono-
clonal que une a los eritrocitos. Estos ensayos son rpidos
pero dependen del operador, y no se obtiene un resultado
cuantitativo; asimismo tienen un alto valor predictivo ne-
gativo para la enfermedad tromboemblica venosa y, por
ENSAYOS DEL FACTOR 339
tanto, es frecuente que se combinen con una cuenta clnica
predictiva de probabilidad en el tamizaje de los pacientes
para excluir trombosis venosa. Los resultados elevados del
D-dmero no son especcos para la trombosis profunda de
la vena y, especialmente en los ensayos ms sensibles, los
niveles bajos de brina se detectan en una variedad de con-
diciones, como inamacin, infeccin, vasculitis, embara-
zo y en particular durante tres semanas, despus de la ci-
ruga. Los niveles elevados de los D-dmeros y de los FDP
se observan en la coagulacin intravascular diseminada,
la cual es un mtodo til en el monitoreo del progreso de la
enfermedad siguiendo la activacin in vivo de la plasmina.
El ensayo puede utilizarse tambin para valorar si una res-
puesta brinoltica a un agente brinoltico teraputico, tal
como estreptocinasa o urocinasa, se ha conseguido. Como
los ensayos del D-dmero son ms especcos y distinguen
entre la brinogenlisis y la brinlisis, han sustituido en
gran parte los ensayos para los FDP.
Los FDP se incrementan despus de la degradacin de
la plasmina del bringeno y de la brina no entrelazada,
y ocasionan un tiempo de trombina prolongado o uno de
coagulacin por la reptilasa. Los ensayos del FDP que se
emplean con ms frecuencia utilizan una tcnica de aglu-
tinacin de ltex, en la cual un anticuerpo que reconoce
los FDP es cubierto en la supercie de partculas de ltex.
Las partculas se aglutinan en presencia de los FDP, y la
concentracin se determina por la dilucin que sostiene
la aglutinacin. Como los anticuerpos utilizados en este en-
sayo pueden unirse al bringeno, el ltimo debe eliminar-
se de la muestra del paciente. Esto se consigue al coagular
la muestra con trombina o veneno de serpiente en presencia
de un inhibidor de plasmina para prevenir la generacin in
vitro de productos de digestin. Estos reactivos se incorpo-
ran en tubos de coleccin especiales.
Ensayos del factor
Los ensayos especcos del factor de coagulacin se basan
en el tiempo de protrombina o el APTT. Un rango de dilu-
ciones del plasma estndar se agrega a un plasma deciente
del factor especco. Los tiempos de coagulacin que se
obtienen muestran una relacin lineal en la concentracin
del factor cuando se trazan en el papel de registro. La ac-
tividad del factor en el plasma de prueba puede entonces
determinarse desde el grco. Estos ensayos son particu-
larmente importantes en la identicacin de pacientes con
desrdenes heredados y tambin en la observacin de la
concentracin del factor en la terapia de reemplazo. Los
factores II, V, VII y X se ensayan con frecuencia usando
una fase del tiempo de protrombina, mientras que los fac-
tores VIII, IX, XI y XII se basan en un mtodo de APTT.
La deciencia del factor XIII no la detectan algunas prue-
bas de coagulacin de rutina, ya que ste no participa en la
reaccin que conduce a la formacin de brina. Una prue-
ba de solubilidad de la urea es el mtodo ms utilizado para
tamizar la deciencia del factor XIII. Un cogulo de brina
se forma, y se agrega acetona o urea a la muestra de plas-
ma, a 37C. La brina unida por la accin del factor XIII
es insoluble en estas soluciones, pero en ausencia de la ac-
tividad del factor XIII un cogulo de brina se disuelve en
cerca de una hora.
Anticoagulantes naturales
In vivo hay activacin de grado bajo continua de la coagu-
lacin e inhibidores naturales de los factores de coagulacin
activos. Una deciencia de tales factores puede relacionarse
con una tendencia protrombtica.
Antitrombina III
La antitrombina III es un regulador principal de la trombi-
na in vivo. Se preeren los anlisis funcionales, pues se re-
conoce que una variedad de formas moleculares produce la
cuanticacin normal de acuerdo a lo medido por tcnicas
inmunolgicas. La mayor parte de los ensayos funcionales
miden la neutralizacin de la trombina del factor Xa en
presencia de heparina adicionada.
Protenas C y S
La protena C se activa despus de la generacin de trom-
bina. sta se une a la trombomodulina sobre la supercie
de las clulas endoteliales, y liga y activa la protena C. La
trombina en esta situacin pierde su actividad procoagu-
lante y es incapaz de convertir el bringeno en brina.
La protena C activada acta como anticoagulante natural
degradando los factores V y VIII, limitando la generacin
adicional de trombina. La protena S sirve como un co-
factor para la protena C activada. Un hallazgo adicional
importante es que la resistencia a la protena C activada
puede ocurrir por un defecto de la molcula del factor
V, la mutacin Leiden del factor V. sta se relaciona con
un riesgo aumentado de la trombosis venosa y es el factor
de riesgo protrombtico heredado conocido con ms fre-
cuencia. El tamiz por PCR se recomienda para los pacien-
tes con una historia protrombtica para excluir este factor.
El tamiz, que por PCR detecta la mutacin G2020 de la
protrombina, tambin se realiza de rutina como parte de un
tamiz de trombolia.
Fibrinlisis
La brinlisis produce la rotura del cogulo de brina y
se inicia la liberacin desde el endotelio vascular del acti-
vador del plasmingeno tipo tisular (tPA) y del activador
del plasmingeno tipo urocinasa (uPA). Estos activadores
convierten el plasmingeno en la enzima activa plasmina,
la cual degrada la brina. Hay tambin un inhibidor natural
para la plasmina, II antiplasmina y el inhibidor del acti-
vador del plasmingeno tipo 1 (PAI-1) liberado por el en-
dotelio, que se une al tPA y al uPA libres, y los inactiva.
Marcadores de la coagulacin activada
En los ltimos aos ha aumentado el inters en la hiper-
coagulabilidad y las pruebas disponibles para su deteccin.
Los ensayos para los marcadores de la activacin de la coa-
gulacin tienen varias aplicaciones potenciales, incluyendo
la caracterizacin de los pacientes con condiciones clnicas
que predisponen a la trombosis, ayudando al diagnstico
de casos trombticos agudos y al monitoreo de la terapia
anticoagulante. Esto puede lograrse midiendo las formas
enzimticas de los cimgenos de la coagulacin generadas
durante la activacin de la coagulacin, o de forma indirec-
ta, midiendo los pptidos de la activacin que se generan
cuando se activan los cimgenos. Adems, midiendo los
complejos que resultan de la inactivacin enzimtica por
los inhibidores naturales del plasma, un planteamiento adi-
cional est disponible; tambin un nmero de inmunoensa-
yos para medir los fragmentos que se crean de la activacin
de factores coagulantes como los pptidos de activacin de
los factores IX y X. El fragmento 1 + 2 de la protrombina,
que resulta de la activacin mediada por la trombina de
la protrombina y brinopptido A, cortado a partir de la
cadena del bringeno por la trombina, son ndices de
la generacin y de la actividad de la trombina, respectiva-
mente. Los inmunoensayos para cuanticar la protena C
activada o el pptido de activacin de la protena C pueden
considerarse como ndices de la funcin de la trombina y
de la trombomodulina. Los inmunoensayos estn tambin
disponibles para la medicin de los complejos inhibidos
enzimticamente, como la trombina, la antitrombina, y
otros complejos que resultan de la inhibicin de la prote-
na C activada por el inhibidor de la protena C y la anti-
tripsina. Actualmente, la utilidad de los marcadores de la
activacin de la coagulacin mejor la evaluacin de la hi-
percoagulabilidad en el diagnstico de los acontecimientos
trombticos agudos. Para el ltimo propsito es ms ecaz
medir los marcadores de activacin de la brinlisis, tales
como el D-dmero.
Evaluacin automatizada de la coagulacin
Los avances recientes en tecnologa han anunciado la in-
troduccin de instrumentos automticos para el tamiza-
je de la coagulacin. Un aumento en la carga de trabajo, la
demanda de mayor especicidad y la reduccin en traba-
jo manual garantizan que casi todos los laboratorios ahora
tengan automatizacin parcial o total. La mayor parte de
los mtodos manuales pueden modicarse para la instru-
mentacin, aunque los resultados varan mucho segn los
instrumentos. Todas las pruebas de rutina de tamizaje de
la coagulacin, incluyendo los ensayos del factor, pueden
analizarse en instrumentos automatizados. Instrumentos
ms avanzados permiten los ensayos cromognicos para
las pruebas especializadas de la coagulacin. Los primeros
instrumentos permitieron la deteccin del cogulo de bri-
na a travs de electrodos. Un electrodo se mueve dentro y
fuera del reactante/plasma. Se agrega calcio y, tan pronto
como se forme el primer cogulo de brina, el circuito elc-
trico se completa y se detiene el temporizador. La mayor
parte de los instrumentos modernos implican la deteccin
fotoptica de la terminacin. Ya que tiene lugar el proceso
coagulante, la luz dispersada de un haz jo se aumenta.
El tiempo de coagulacin se obtiene a partir de la curva
de coagulacin as como el tiempo requerido para que la
muestra alcance el porcentaje preestablecido de la intensi-
dad de la luz dispersada. La instrumentacin completa in-
cluye muestreo robtico, lectura por cdigo de barra de las
muestras, dispensadores automticos del reactante y un sis-
tema de manejo de datos. Sin embargo, como los tiempos
de coagulacin varan entre los diferentes instrumentos, de-
pendiendo del mtodo de deteccin de la terminacin, los
resultados de la automatizacin no son estrictamente com-
parables. Por tanto, las tcnicas manuales an se utilizan
como mtodos de referencia.
Lectura adicional
Lugassy G, Shulman S. Thrombosis and Anti-thrombotic Ther-
apy. 2001: Hartin Dunitz, London.
EVALUACIN AUTOMATIZADA DE LA COAGULACIN 341
SECCIN 6
CITOGENTICA
Introduccin
La citogentica implica el estudio de los cromosomas hu-
manos en la salud y en la enfermedad. En el ncleo huma-
no el material gentico (DNA) est qumicamente ligado
a las protenas y empaquetado en las distintas estructuras
llamadas cromosomas. En general las clulas humanas po-
seen un total de 46 cromosomas, o 23 pares, un miembro
de cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro lo
hereda la madre. El DNA de cada clula se empaqueta den-
tro de los cromosomas para facilitar la separacin correcta
del material gentico a ambas clulas hijas en cada divisin
celular. Cuando clulas, espermatozoides y huevos del ga-
meto humano se producen, el nmero de cromosomas se
divide en dos hasta formar 23 pares va divisin celular
meitica, de tal manera que cuando un nuevo cigoto sea
formado, por la fusin de un espermatozoide con un vulo,
las clulas tengan el nmero correcto de cromosomas, 46;
1956 es considerado el ao en que da principio la citogen-
tica humana moderna, ya que antes de ese ao se pensaba
que el nmero de cromosomas en la clula humana normal
era de 48.
El anlisis citogentico permite la deteccin de alteracio-
nes cromosmicas, que pueden ser numricas (cromosomas
adicionales o faltantes) o estructurales (deleciones, duplica-
ciones, translocaciones, etc.). Las preparaciones cromos-
micas o cariotipos pueden elaborarse y analizarse a partir
de diferentes tejidos del organismo, incluyendo sangre peri-
frica, lquido amnitico, piel o mdula sea. Los estudios
cromosmicos son un procedimiento diagnstico de labo-
ratorio importante en numerosas situaciones clnicas. Por
ejemplo, los pacientes con defectos de nacimiento mltiples
o retraso mental, o ambos, desarrollo sexual anormal o este-
rilidad y numerosos tipos de neoplasias que pueden resguar-
dar alteraciones citogenticas. Es, por tanto, muy importante
que los estudios cromosmicos se realicen como parte de
las investigaciones rutinarias en tales pacientes.
Hasta inicios de la dcada de 1970 el anlisis citogen-
tico slo se realiz sobre preparaciones cromosmicas sin
bandeo, con tincin slida. Los cromosomas slo podran
identicarse y clasicarse con base en la forma y el tamao
y, por tanto nicamente las alteraciones numricas o los arre-
glos estructurales grandes podan detectarse. Algunas altera-
ciones numricas claras no pueden caracterizarse de manera
denitiva usando slo la tincin como tal (g. 36-1); ste es,
sin embargo, an el mtodo de eleccin para las investiga-
ciones de inestabilidad cromosmica, posterior a la expo-
sicin de los pacientes o de clulas a agentes clastognicos.
A principios de la dcada de 1970 se introducen las pri-
meras tcnicas de bandeo cromosmico permitiendo una
identicacin mucho ms exacta de cada par cromosmi-
co. Esto, a su vez, permiti la deteccin de alteraciones
estructurales ms sutiles relacionadas con condiciones pa-
tolgicas especcas. Este captulo describe y explica los
principios fundamentales de las diversas tcnicas de ban-
deo cromosmico que estn disponibles y destaca sus prin-
cipales aplicaciones en el laboratorio. Tambin se describe
el procedimiento del anlisis citogentico.
Bandeo cromosmico
Desde que se describieron las primeras preparaciones cro-
mosmicas con bandeo a principios de la dcada de 1970,
36
Bandeo y anlisis cromosmico
Mervyn Humphreys
346 CAP. 36 BANDEO Y ANLISIS CROMOSMICO
utilizan la tincin de Leishmann en lugar de la de Giemsa.
Algunos mtodos implican el tratamiento previo de los por-
taobjetos con solucin salina (2 SSC). Cada cromosoma
exhibe un patrn caracterstico y constante con bandeo G,
permitiendo la identicacin exacta de cada par cromosmi-
co y la deteccin de alteraciones estructurales cromos-
micas, como deleciones, inversiones y translocaciones.
Es esencial que los portaobjetos sean expuestos a dife-
rentes tratamientos antes del bandeo G o dejarlos a tempe-
ratura ambiente 3 a 4 das, calentarlos durante la noche a
60C o tratarlos previamente con perxido de hidrgeno.
El almacenar de manera previa las preparaciones cromo-
smicas refuerza la integridad de los cromosomas, al ha-
cerlos menos vulnerables a la sobredigestin por la tripsina
(g. 36-2).
Figura 36-1 Metafase cromosmica con tincin slida de una
paciente con el sndrome de Down (trisoma 21). Aunque el cro-
mosoma 21 no puede distinguirse del 22 en las preparaciones con
tincin slida, los cinco cromosomas del grupo G presentes (21s y
22s) estn sealados.
ha ocurrido una proliferacin rpida de tcnicas de tincin
cromosmica permitiendo la caracterizacin precisa del
cariotipo humano normal. El mtodo de bandeo con Giem-
sa, desarrollado a mediados de la dcada de 1970, es la tc-
nica ms utilizada para el anlisis cromosmico rutinario.
Muchos otros mtodos de bandeo por lo general se utilizan
slo para ayudar en la identicacin de las alteraciones es-
peccas de un cromosoma, cuya naturaleza exacta es in-
cierta, despus del anlisis de bandeo G.
Aunque se conoce muy poco acerca de la base bioqumi-
ca del bandeo cromosmico, los diversos patrones que se
obtienen parecen reejar la mejor manera en que se orga-
niza, por la cual la enorme longitud del DNA humano es
empaquetada dentro de los cromosomas. Las tcnicas de
bandeo cromosmico pueden dividirse en dos grupos: a)
aquellas que dan lugar a bandas distribuidas a lo largo de
todo el cromosoma, como los bandeos G, Q y R; y b) las
que tien un nmero restringido de regiones especcas del
cromosoma, como el bandeo C, tinciones NOR y DAPI.
Bandeo Giemsa (bandeo G)
El bandeo G de los cromosomas puede hacerse con dife-
rentes qumicos que producen bandas alternas de intensidad
oscura y clara a lo largo de los cromosomas. El mtodo ms
utilizado implica la digestin de preparaciones cromosmi-
cas con la tripsina, una enzima proteoltica, seguida por una
tincin con Giemsa. Muchos mtodos de bandeo G ahora
Figura 36-2 Proliferacin en la metafase femenina normal teida
por bandeo G.
Mecanismo
Aunque ninguna hiptesis satisfactoria explica el meca-
nismo del bandeo G, parece estar relacionado con la com-
posicin del DNA e implica probablemente la eliminacin
selectiva de protenas de diversas regiones del cromosoma.
Se cree que los cromosomas contienen una estructura b-
sica que se evidencia por medio del procedimiento de ban-
deo G. Un nmero aproximado a los 146 pares de bases de
la cadena de DNA humano est enrollada alrededor de un
centro que consiste en ocho molculas de la protena his-
tona, para producir las rplicas de unidades llamadas nu-
cleosomas o crommeros. Los nucleosomas sucesivos se
ordenan como cuentas sobre un collar. Esta bra elemental
de nucleosomas ligados se enrolla sobre s misma como un
solenoide para formar la bra de cromatina. Las bras de
cromatina se unen y se enrollan ms dentro de los paquetes
nales del cromosoma. Se cree que las bandas G oscuras
pueden correlacionarse simplemente con estos cromme-
ros que parecen cuentas, y el patrn de bandeo G, por tanto,
reeja la organizacin estructural de la cromatina a lo largo
del cromosoma.
Se ha sugerido, como alternativa, que las bandas G oscu-
ras y claras se correlacionan con el contenido funcional que
diere del DNA en esas regiones del cromosoma. Los estu-
dios de replicacin exhiben que las regiones del DNA con
tiempos de replicacin similares se agrupan con el DNA en
las bandas G oscuras y se replican de manera tarda en la
fase S, en comparacin con el DNA de la banda G clara. Los
estudios de hibridacin in situ muestran una correlacin en-
tre el patrn de bandeo G y la localizacin de las secuencias
repetitivas del DNA. Se ha demostrado que las bandas G
oscuras son ricas en secuencias repetitivas del DNA tipo L1,
las cuales son relativamente ricas en AT y codican muy
pocos genes expresados. Tambin se ha vericado que las
bandas G claras son ricas en secuencias repetitivas del DNA
tipo Alu, que son relativamente ricas en GC y codican para
muchos genes que se expresan.
Aplicacin
El bandeo G es en gran medida el mtodo ms utilizado
para el anlisis citogentico rutinario en investigaciones
clnicas. Este mtodo permite la identicacin de cada par
cromosmico y la deteccin de la mayor parte de las al-
teraciones cromosmicas numricas y estructurales. Los
laboratorios citogenticos que no emplean como rutina el
bandeo G usan por lo general el bandeo R. Los otros m-
todos de bandeo cromosmico se utilizan slo cuando un
anlisis de bandeo G inicial detecta una alteracin cromo-
smica que requiere investigacin adicional para su carac-
terizacin exacta. El patrn de bandeo G es, a grosso modo,
similar al patrn de bandeo Q.
Bandeo con quinicrina (bandeo Q)
El bandeo Q, la primera tcnica de bandeo cromosmico,
se introdujo en 1968, cuando las preparaciones cromos-
micas eran teidas con la mostaza de quinicrina. El ban-
deo Q en la actualidad se produce por lo general usando
el dihidrocloruro de quinicrina, que es menos txico. Una
serie de regiones brillantes y opacas que despiden luz uo-
rescente se revelan a lo largo de los cromosomas cuando se
observan con microscopia uorescente (de 450 a 500 nm).
El patrn de bandeo Q se asemeja enormemente al patrn
de bandeo G, con bandas Q que despiden luz uorescente
brillante que corresponden con las bandas G que se tien de
Figura 36-3 Bandeo Q. La proliferacin en la metafase de un
paciente con un cromosoma X anormal, derivado de una reestruc-
turacin t(X;Y). La echa pequea indica el cromosoma Y nor-
mal; la echa grande indica X anormal con heterocromatina Yq
ligada a Xp.
oscuro. Excepciones notables incluyen la porcin distal del
brazo largo del cromosoma Y, que muestra uorescencia
muy brillante. Las regiones satlites de los cromosomas
acrocntricos (13 a 15 y 21 a 22) tambin muestran los
patrones caractersticos del bandeo Q (g. 36-3).
Mecanismo
Debido a que los patrones del bandeo Q y del bandeo G
muestran tales semejanzas, los mecanismos tienen inuen-
cias claras por los mismos parmetros de la composicin
del cromosoma (vase bandeo G). El patrn del bandeo
Q se explica por la especicidad de las mostazas de ni-
trgeno por la guanina. La uorescencia de la quinicrina
se realza en las regiones de DNA ricas en secuencias AT
y se opaca en las regiones ricas en GC, lo que produce el
patrn del bandeo Q. El contenido de DNA en AT/GC va-
riante de las bandas cromosmicas explica, por tanto, las
diferencias en la intensidad de la tincin cuando se tratan
con quinicrina.
Aplicaciones
El bandeo Q requiere un microscopio de uorescencia para
el anlisis. El bandeo Q en preparaciones cromosmicas no
es conveniente para las investigaciones citogenticas ruti-
narias, pues la uorescencia se pierde muy rpido durante
el anlisis. Este mtodo de bandeo, sin embargo, es til
para el examen especco de los heteromorsmos relacio-
BANDEO CROMOSMICO 347
Figura 36-4 Bandeo R usando naranja de acridina.
nados con el cromosoma Y y las regiones satlites de los
cromosomas acrocntricos. Los patrones del bandeo Q del
brazo corto y de los heteromorsmos satlites pueden, por
ejemplo, usarse a veces para determinar el origen parental,
y la etapa sin separacin meitica en las trisomas que in-
volucran cromosomas acrocntricos.
Bandeo reverso (bandeo R)
El bandeo R cromosmico es complementario de las ban-
das Q y G, y su primera aparicin se reporta en 1971. Las
laminillas se incuban en un amortiguador de fosfato a 85 a
89
C, despus se tien con Giemsa o con naranja de acridi-

na, lo que produce un patrn de bandas, que es el contrario
de los bandeos G o Q. Cuando se tien con Giemsa, las
bandas son plidas y requieren contraste de fases para el
anlisis. sta fue la primera tcnica de bandeo no uores-
cente en desarrollarse. Usando la tincin con naranja de
acridina, las bandas R positivas despiden luz uorescente
verde/amarilla, mientras las bandas R negativas emiten una
luz uorescente naranja/roja. El bandeo R es muy exitoso
si las laminillas se han envejecido a temperatura ambiente
por varios das o a 60C durante la noche. Las laminillas
recin hechas requieren tiempos de incubacin ms cortos,
dentro de un amortiguador (g. 36-4).
Mecanismo
Igual que en los bandeos G y Q, el patrn del bandeo R
parece reejar la composicin estructural y funcional de
los cromosomas. Las bandas R positivas son ricas en ba-
ses GC, se replican en forma temprana, y contienen genes
housekeeping, mientras las bandas R negativas son ricas
en AT, se replican de manera tarda y no contienen genes
housekeeping. El patrn de bandeo R se produce por la
desnaturalizacin diferencial de las regiones cromosmi-
cas ricas en GC y ricas en AT. Las regiones ricas en AT se
desnaturalizan a una temperatura ms baja y despiden luz
uorescente roja con el naranja de acridina. Este ltimo
cuando se intercala entre los pares de bases de las regiones
ricas en GC de doble hebra despide luz uorescente ama-
rilla. No est muy claro, en su totalidad, por qu los trata-
mientos con Giemsa tambin producen bandeo R. Puede ser
debido a la interaccin diferencial de las protenas con las
regiones cromosmicas ricas en AT y en GC. Que las lami-
nillas envejecidas requieran tiempos ms cortos de incuba-
cin y produzcan un mejor bandeo R sugiere, otra vez, que,
como las laminillas estn envejecidas, su estructura general
llega a ser ms estable y menos vulnerable a la degradacin
mediante diferentes agentes (vase bandeo G).
Aplicacin
Aunque los laboratorios citogenticos utiliza el bandeo
G para investigaciones de rutina, el bandeo R es el mto-
do empleado para el anlisis rutinario del cromosoma en
muchos laboratorios franceses. Esta tcnica de bandeo en
general no revela ninguna nueva informacin que no est
disponible siguiendo el bandeo G, pero en ocasiones se em-
plea para determinar con ms exactitud los puntos de rotura
de las alteraciones estructurales, sobre todo si existen pun-
tos de rotura cromosmicos en las porciones terminales.
Bandeo de heterocromatina constitutiva (bandeo C)
El procedimiento del bandeo C implica tratar los cromoso-
mas con cido clorhdrico (HCl), lcali (BaOH
2
) y solucin
salina caliente (2SSC). Las preparaciones cromosmicas
del bandeo C por lo general se tien ligeramente, excepto
las del teido oscuro de las regiones de heterocromatina
constitutiva. stas se sitan en los centrmeros de todos los
cromosomas, lo cual no ocurre en el cromosoma Y, que se
localizan en la regin distal del brazo largo (g. 36-5).
Mecanismo
Se piensa que los tratamientos astringentes para la tcni-
ca de bandeo C facilitan la prdida preferencial de DNA
y de protena de las regiones cromosmicas sin banda C.
La depuracin y la desnaturalizacin sucesivas de DNA
cromosmico ocurren durante los tratamientos con cido
clorhdrico y lcali. Adems, los fragmentos pequeos de
DNA se pierden durante el tratamiento con sal, dejando
slo la heterocromatina centromrica muy compactada.
Las protenas no histnicas ligadas a las regiones con ban-
da C pueden prevenir la desnaturalizacin de DNA que se
produce en esos sitios.
Aplicaciones
Las bandas C de todos los cromosomas, especialmente
de los cromosomas 1, 9, 16 y Y, varan de tamao entre ho-
mlogos as como entre individuos. La variacin extrema
del tamao de las bandas C no tiene ningn efecto feno-
tpico, pues estas regiones contienen slo heterocromati-
na constitutiva y ningn gen importante. Si es confuso que
una banda adicional o un segmento anormal del cromo-
soma, detectado por bandeo G, represente una variacin
normal de una regin heterocromtica o una alteracin cro-
mosmica dicromtica de posible importancia clnica, el
anlisis de bandeo C puede proveer informacin conclu-
yente. El bandeo C puede, en ocasiones, permitir la de-
terminacin del origen de la no disyuncin en pacientes
con trisomas. Cuando el cromosoma implicado tiene una
variante heterocromtica notable, entonces la comparacin
de las preparaciones para bandeo C del caso ndice y de
ambos padres puede indicar en cul de los padres, y posi-
blemente en qu etapa de la meiosis, ocurre el error de la
no disyuncin que causa la trisoma.
Tincin de la regin organizadora nucleolar
(tincin NOR)
Los genes ribosmicos que codican para el RNA, forman
y mantienen el nucleolo en ncleos interfsicos, estn situa-
dos en los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos
satlites (13, 14, 15, 21 y 22). Cuando las preparaciones del
cromosoma se incuban durante toda la noche con solucin
de nitrato de plata, estas regiones organizadoras nucleo-
lares (NOR) se tien de oscuro (g. 36-6). Los satlites
Figura 36-5 El bandeo C de una proliferacin en la metafase de
un paciente con una inversin del cromosoma 4. El cromosoma
4 invertido (echa grande) tiene la posicin del centrmero des-
plazada hacia el extremo del telmero del brazo corto (punta de
echa). Los cromosomas normales del grupo B (4 y 5) no pueden
distinguirse usando slo bandeo C (echas pequeas).
Figura 36-6 Metafase teida con NOR de un paciente con una
translocacin recproca entre los cromosomas 7 y 14. La echa
indica el cromosoma 14 anormal con el material del cromoso-
ma 7 translocado sobre la NOR.
de los cromosomas acrocntricos se ven con frecuencia en
grupo dentro de las clulas. Este fenmeno, llamado re-
lacin basada en los satlites, reeja una funcin comn,
probablemente, de las diversas NOR en la organizacin del
nucleolo celular.
Mecanismo
El teido de NOR implica la extraccin de DNA, RNA e
histonas a partir de los cromosomas. Realmente son pro-
tenas residuales adyacentes a las NOR, ms que NOR sin
histona, las que se tien selectivamente con este mtodo.
Los estudios han demostrado que este mtodo tie slo las
NOR activas que participaron en la formacin del nucleolo
en la interfase precedente del ciclo de la clula.
Aplicacin
El nmero de las NOR que se detectan por proliferacin
en la metafase vara en los individuos porque slo se ti-
en las NOR activas que participan en la formacin del
nucleolo durante la etapa interfase precedente. El patrn
de la tincin de la NOR de cromosomas acrocntricos es
consistente dentro de un individuo y es hereditario. Los
patrones de las NOR y el aspecto por el bandeo Q de los
satlites acrocntricos son, por tanto, tiles para determi-
nar el origen parental y/o la etapa sin disyuncin meitica
implicada en las trisomas que involucra a estos cromoso-
mas. La tincin de las NOR es til para la caracterizacin
de cromosomas marcadores pequeos, para conrmar si
poseen o no regiones satlite y, por tanto, se derivan a partir
de un cromosoma acrocntrico.
Bandeo DA-DAPI
Cuando los cromosomas se tien con el colorante uo-
rescente 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI) y se tratan con
distamicina (DA) en una contratincin no uorescente, un
subconjunto de bandas C uorescentes se revela. Las re-
giones heterocromticas de los cromosomas 1, 9, 16 y Y,
adems de la proximal del brazo corto del cromosoma 15
despiden luz uorescente muy brillante. Usando slo DAPI
se produce un patrn de bandeo similar al bandeo Q (g.
36-7).
Figura 36-7 Metafase masculina teida usando bandeo DA/
DAPI. Las echas indican el cromosoma 15s con brazos cortos
que despiden luz uorescente brillante.
Mecanismo
DAPI, que une al DNA, tiene una anidad por los pares de
bases AT. La unin de DAPI, en consecuencia, slo produ-
ce un patrn de bandeo Q dbil. Aunque la uorescencia
de DAPI es realzada por ambos pares de bases AT y GC,
existe un realce signicativo de la uorescencia en regio-
nes de DNA ricas en AT. Existe tambin cierta evidencia
de que DAPI se une a grupos AT en el surco menor de la
hlice doble del DNA. Tambin DA muestra anidad por
la unin al DNA especca de AT. Aunque los dos coloran-
tes usados tienen preferencia de apareamiento con bases
similares, poseen diferentes anidades de unin y estructu-
ras diferentes. La uorescencia diferencial que se obtiene
puede deberse a la unin competitiva entre los dos coloran-
tes, que se unen en sitios similares pero no idnticos. Alter-
nativamente, DA es probable que bloquee el enlazamiento
de DAPI en regiones eucromticas, mientras los sitios de
enlazamiento de DAPI permanecen disponibles en regio-
nes heterocromticas.
Aplicaciones
El bandeo DA/DAPI es predominante cuando se le utiliza
para la interpretacin de ciertas alteraciones del cromoso-
ma detectadas al usar los mtodos ms rutinarios de bandeo
(bandeo G o R), por ejemplo, el bandeo DA/DAPI puede
usarse donde un cromosoma modicado en su estructura
tiene un punto de rotura cercano a una regin teida selec-
tivamente con bandeo DA/DAPI. Este bandeo es til, en
particular, para estudiar cromosomas marcadores satlites
pequeos. Esta tcnica puede identicar aquellos cromo-
somas marcadores que involucran la regin proximal del
extremo del cromosoma 15. La tincin DAPI es tambin
la contratincin normal usada para la hibridizacin in situ
uorescente de rutina en preparaciones cromosmicas.
Bandeo de replicacin
Un patrn del bandeo G o R puede producirse sobre pre-
paraciones cromosmicas si se desarrollan en presencia de
5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), anlogo de la timidina, y
se tien con el colorante uorescente Hoechst 33258. Este
mtodo utiliza el hecho de que diversas regiones del com-
plemento del cromosoma se replican en diferentes etapas
durante la fase S; tambin confa en la incorporacin de la
marca dentro del DNA, as que BrdU se agrega a clulas
vivas en un cultivo tisular. Controlando la sincronizacin
cuando el pulso de BrdU se administra a los cultivos celu-
lares relativa al tiempo de recoleccin, un patrn de bandeo
que se replica temprano o tardamente puede producirse. Si
la BrdU se agrega al iniciar el cultivo, pero se elimina alre-
dedor de 6 h antes de la recoleccin a las 48 h, se obtiene
un patrn de bandeo G. Si la BrdU se agrega slo cerca de
6 h antes de que los cultivos sean recolectados, se producen
bandas R (g. 36-8).
Si las clulas experimentan dos ciclos completos de re-
plicacin en presencia de BrdU, las cromtides hermanas de
cada cromosoma se tien diferencialmente. El patrn de la
coloracin doble que se obtiene permite la deteccin de los
intercambios de cromtides hermanas (ICH), que son pun-
tos a lo largo de los cromosomas donde el material de la
cromtide se intercambia entre cromtides hermanas. Las
preparaciones de ICH se tien con el uorocromo Hoechst
33258. Entonces o son vistos por microscopia de uores-
cencia (360 a 400 nm) o, si primero se exponen a la luz
UV y en seguida se tien con el colorante Giemsa (uores-
cencia ms tincin Giemsa [FPG]), pueden analizarse por
medio de la microscopia de luz (g. 36-9).
Mecanismo
El BrdU es un anlogo de la timidina que se incorpora muy
rpido dentro de los cromosomas. Cuando los cromosomas
se tien con el uorocromo Hoechst 33258 (que se une a
pares de bases ricas en AT), las regiones del cromosoma
que se replican en presencia de BrdU contienen DNA sus-
tituido con BrdU. Cuando BrdU est presente al inicio del
cultivo, slo se observa durante la parte temprana de un
ciclo de la replicacin del DNA, y por tanto las regiones
cromosmicas que se replican temprano en la fase S (ban-
das R) llegan a sustituirse con BrdU, y por tanto despiden
luz uorescente dbil o se tien ligeramente con Giemsa.
Las bandas G que se replican tarde en la fase S, despus de
que BrdU se ha eliminado de los cultivos, y se incorpora la
timidina, despiden luz uorescente brillante, o se tien de
oscuro con Giemsa (bandeo G). De manera alterna, si slo
se aade BrdU a los cultivos alrededor de 6 horas antes de
la recoleccin, slo est presente en la ltima parte de un
ciclo de la rplica del DNA y a las regiones que se replican
temprano (bandas R) se les incorpora timidina, y despiden
luz uorescente brillante o se tie oscuro con Giemsa. Slo
Figura 36-8 Metafase prolongada despus del bandeo de repli-
cacin. Esta preparacin se obtuvo a partir de cultivos sanguneos
a los cuales se agreg BrdU seis horas antes de la recoleccin.
Los cromosomas muestran un patrn de bandeo R. Este paciente
porta una translocacin t(X;11). En este caso, X normal es repli-
cado tardamente. Con cultivos con pulsos tardos de BrdU, el X
que se replica tarde se tie ligeramente (echas).
Figura 36-9 Prolongaciones de la metafase teidas para los
intercambios de cromtides hermanas (ICH). a) Metafase de
cultivos sanguneos con slo tres ICH espontneos sealados. b)
Metafase de cultivos sanguneos del mismo individuo, incubados
con el agente intercalante (alquilante) mitomicina C, mostrando
un aumento muy signicativo en el nivel de ICH (> 100/clula).
las regiones que se replican tarde (bandas G) llegan a sus-
tituirse con BrdU y, por tanto, despiden luz uorescente
dbil o se tien ligeramente con Giemsa (bandeo R).
Aunque los cromosomas homlogos muestran patrones
similares de replicacin, en mujeres pueden distinguirse
los cromosomas X que se replican temprana y tardamente.
El cromosoma X que se replica tarde se tie ms oscuro
con bandeo de replicacin BrdU de pulso temprano y se
tie levemente con bandeo de replicacin BrdU de pulso
tardo (g. 36-8).
El patrn de tincin de dos colores que se obtiene cuan-
do BrdU est presente en los cultivos celulares durante dos
ciclos de replicacin reeja la incorporacin asimtrica de
BrdU dentro del DNA cromosmico. Mediante replicacin
semiconservadora, cada hebra nueva de DNA consiste de
una original de DNA y una nueva construida. Despus de dos
ciclos de replicacin en presencia de BrdU, una cromtide
contiene DNA con BrdU sustituido dentro de una hebra
de DNA, mientras que su cromtide hermana contiene dos
hebras de DNA sustituidas con BrdU. Esta diferencia qu-
mica entre las cromtides hermanas explica la que existe
en la intensidad de teido que se obtiene. La intensidad es
proporcional a la cantidad de DNA que contiene timidina
presente en cada cromtide. Cuando las preparaciones cro-
mosmicas se tien usando la uorescencia y el mtodo de
Giemsa, ms DNA se pierde a partir de la cromtide herma-
na sustituida con BrdU que su contraparte, por eso produce
el patrn de teido oscuro y claro caracterstico.
Aplicacin
Adems de aportar mtodos alternativos para los bandeos
G y R, los patrones de teido que se obtienen despus de
administrar un pulso de BrdU temprano o tardo en el ciclo
celular se utilizan sobre todo para los estudios de replica-
cin. En mujeres normales un cromosoma X se inactiva
en cada clula por un proceso aleatorio, y este X inactivo
siempre es el ltimo cromosoma en completar su replica-
cin en cada ciclo celular. El bandeo de replicacin es til
para investigar el patrn de la inactivacin X en las muje-
res que portan alteraciones estructurales que involucran el
cromosoma X, donde el patrn de la inactivacin del X por
lo general es un evento no aleatorio. El ejemplo ilustrado
en la gura 36-8 muestra una paciente que porta una trans-
locacin equilibrada t(X;11). La tincin de replicacin
muestra que el cromosoma X normal se replica tarde en
todas las clulas. Este sesgo del patrn de la inactivacin
X aleatorio normalmente asegura que los segmentos auto-
smicos implicados en tales translocaciones autosoma-X
no estn tambin inactivados, lo que tendra un impacto
clnico deletreo.
La produccin de patrones de teido cromosmico de do-
ble color permite la deteccin de los intercambios de cromti-
des hermanas. stos son puntos a lo largo de las cromosomas
donde hay intercambio de material entre las dos cromtides
hermanas de cromosomas individuales, creando un aspecto
de tablero de damas. Las clulas humanas normales mues-
tran una frecuencia media de 5 a 8 ICH/clula, pero se ob-
serva que los niveles de ICH aumentan con la exposicin a
muchos mutgenos. El uso principal de esta tcnica es, por
tanto, un mtodo para el monitoreo de dao cromosmico
inducido por mutgenos, en pacientes o clulas. En muchos
casos, ICH es ms sensible para la deteccin del dao cromo-
smico que para la medicin de las aberraciones cromos-
micas (g. 36-9). Sin embargo, no todos los mutgenos de la
prueba muestran una correlacin positiva entre la rotura cro-
mosmica inducida y los ICH inducidos, indicando por ello
que estos dos parmetros reejan expresiones diferentes e in-
dependientes del dao inducido por mutgenos. Este mtodo
tambin se utiliza como prueba diagnstica para el desorden
de la inestabilidad cromosmica, el sndrome de Bloom, en
el cual las clulas muestran un aumento signicativo del ni-
vel basal normal de los ICH espontneos. Los ICH tambin
pueden utilizarse para estudiar la cintica celular indicando la
duracin de las diversas etapas del ciclo celular.
Anlisis cromosmico
La mayor parte de los anlisis citogenticos rutinarios se
realiza examinando las preparaciones en metafase bandea-
das (principalmente por bandeo G o R). El anlisis citoge-
ntico es una disciplina muy especializada del laboratorio
y se requiere un entrenamiento de varios aos antes de que
un citogenetista llegue a ser competente en el reconoci-
miento del cariotipo normal y en la deteccin de la varie-
dad de alteraciones cariotpicas que puedan encontrarse.
Clasicacin de cromosomas bandeados y nomenclatura
Los cromosomas se identican, se clasica su cariotipo y
describen usando las pautas propuestas por el Sistema In-
ternacional de Nomenclatura Cromosmica (ISCN). ste
es el informe publicado por el Comit Permanente sobre
Nomenclatura Citogentica Humana. La terminologa
bsica para describir el cariotipo humano lo propuso este
grupo en 1971 (nomenclatura de Pars). Las caractersticas
principales que distinguen los cromosomas son longitud,
posicin del centrmero, presencia de las constricciones
secundarias (satlites) y patrn de bandeo. El centrme-
ro es la constriccin primaria que divide cada cromosoma
en un brazo corto (brazo p) y en uno largo (brazo q). Los
una regin tambin se numera en secuencia, iniciando con
la banda 1, la ms cercana al centrmero. Por tanto, 1p31
indica el cromosoma 1, brazo corto, regin 3, banda 1. La
calidad de las preparaciones cromosmicas ha mejorado a
travs de los aos, con la produccin de cromosomas ms
alargados. Con esta mejora, se muestra que ciertas bandas,
vistas en preparaciones cromosmicas como ms cortas, ac-
tualmente se resuelven en diferentes bandas ms nas. Por
esta razn, el ISCN produce actualizaciones de los ideo-
gramas cromosmicos que corresponden a cromosomas
con extensiones mejoradas ms largas. Donde se encuentra
que bandas cromosmicas se subdividen en ms bandas, se
asignan nmeros a las sub-bandas. Por convenio, un punto
decimal se coloca antes de cualquier sub-banda y hasta dos
nuevos nmeros se aaden despus de esto para describir
las nuevas sub-bandas. Por tanto, 1p31.2 describe el cro-
mosoma 1, brazo corto, regin 3, banda 1, sub-banda 2 (g.
36-11).
Figura 36-10 Cariotipo con bandeo G de un paciente con una
translocacin recproca equilibrada, que involucra el brazo corto del
cromosoma 5 y el brazo largo del cromosoma 14. Los cromosomas
anormales estn sealados.
ANLISIS CROMOSMICO 353
satlites son constricciones secundarias situadas en los ex-
tremos de los cromosomas 13 a 15, 21 y 22. Los autosomas
son numerados en pares por tamao decreciente a partir
de 1 a 22, dejando aparte los cromosomas del sexo (X y
Y). De acuerdo con la longitud, la posicin del centrmero
y los satlites, los cromosomas del cariotipo humano slo
pueden clasicarse en siete grupos, A-G (cromosoma X in-
cluido en el grupo C/cromosoma Y incluido en el grupo G)
(g. 36-10).
De acuerdo con la posicin del centrmero, hay tres
tipos de cromosoma: metacntrico (centrmero en el cen-
tro), acrocntrico (centrmero en un extremo) y submeta-
cntrico (centrmero excntrico). Los pares cromosmicos
individuales pueden, sin embargo, slo identicarse y cla-
sicarse exactamente a partir de sus patrones de bandeo. El
ISCN incluye un sistema completo de mapas cromosmi-
cos diagramticos (ideogramas). Estos ideogramas ilustran
cada cromosoma, dividindolos en segmentos convenientes
(regiones) de longitud casi igual deniendo varios puntos
establecidos (marcas). Estas marcas incluyen los extremos
del cromosoma (telmeros), los centrmeros y otras ban-
das prominentes. Cada regin se numera secuencialmen-
te, movindose hacia afuera, en cualquier direccin de los
centrmeros. Por ejemplo, 1p3 representa el cromosoma
1, brazo corto, regin 3. Cada banda importante dentro de
Figura 36-11 Ideograma del cromosoma 1, destacando los brazos
p y q, las regiones cromosmicas sobre el brazo p y las marcas sobre
el brazo q.
El sistema ISCN permite la descripcin exacta de
los puntos de rotura en todas las reestructuraciones cro-
mosmicas. Al usar ISCN para describir alteraciones ca-
riotpicas, el citogenetista debe utilizar el ideograma ms
apropiado que muestre la resolucin de bandeo equivalente
al cromosoma que se analiza.
Variacin cromosmica
Para reconocer alguna alteracin cromosmica presente en
cualquier preparacin de los cromosomas humanos, el ci-
togenetista debe estar muy familiarizado con el aspecto del
cariotipo humano normal. Esto es complicado por la ocu-
rrencia de variacin considerable en ciertas regiones he-
terocromticas, incluyendo polimorsmos centromricos
y satlites. Es importante que estas regiones de variacin
cromosmica normal se reconozcan y distingan de otras
alteraciones cromosmicas clnicas signicativas.
Anlisis cromosmico
La mayor parte de los anlisis rutinarios del cromosoma
se ejecuta examinando microscpicamente preparaciones
en metafase bandeadas. Las metafases convenientes se lo-
calizan primero tamizando las laminillas bandeadas, con
microscopia de bajo aumento (magnicacin 100). Las
metafases convenientes entonces se examinan con una
magnicacin ms alta (generalmente 1 000). Para el
anlisis de la constitucin del cariotipo, slo cinco o seis
metafases de calidad conveniente necesitan examinarse,
excepto donde un posible mosaicismo del cromosoma
puede esperarse, y ms clulas deben analizarse. La cali-
dad de las metafases seleccionadas para el anlisis depende
en gran parte del objetivo de la investigacin citogentica.
Si se verica una alteracin numrica obvia (p. ej., trisoma
21) entonces no se requieren metafases de alta calidad. Sin
embargo, si una alteracin sutil puede estar presente (como
una delecin o reestructuracin pequea que involucre seg-
mentos mnimos), entonces deben examinarse ms prepa-
raciones cromosmicas alargadas.
Si el citogenetista est satisfecho porque todos los pares
cromosmicos muestran el patrn de bandeo normal reco-
nocido, puede informarse un cariotipo normal. Los carioti-
pos se describen usando la nomenclatura ISCN. En general,
sta tiene el orden siguiente: nmero total de cromosomas,
constitucin del cromosoma del sexo, descripcin de la al-
teracin (si est presente), y cada uno de stos es separado
por una coma. As, la frmula del cariotipo femenino nor-
mal es 46,XX y el cariotipo masculino normal es 46,XY.
Donde se reconoce una alteracin del cromosoma, se asig-
na la frmula apropiada del cariotipo. Cada tipo de altera-
cin estructural tiene una abreviatura ISCN asociada, por
ejemplo, t para la translocacin, i para la inversin, etc.
Los cromosomas implicados y cualquier punto de rotura se
incluyen en la frmula del cariotipo asignada, por ejem-
plo, el cariotipo anormal ilustrado en la gura 36-10 tie-
ne la frmula 46,XY,t(5;14)(p15.2;q24.1). Esto indica que
el cromosoma 5 est fracturado en el brazo p en la banda
15.2, mientras que el cromosoma 14 presenta una rotura
en el brazo q en la banda 24.1. Si la alteracin es indistinta
o los puntos de rotura son confusos en el examen micros-
cpico, la preparacin de cariotipos puede ayudar a carac-
terizar la naturaleza exacta de la alteracin. Esto habra
implicado anteriormente fotograar las clulas anormales
usando la fotomicroscopia, desarrollar e imprimir la pel-
cula, cortando y recambiando los cromosomas en el orden
del cariotipo estndar. En la actualidad, la produccin de
cariotipos en los laboratorios citogenticos de diagnstico
se hace ms fcil usando sistemas de anlisis de imagen
especializados. Estos sistemas acoplan al microscopio con
una cmara fotogrca digital que se usa para capturar una
imagen digital de la preparacin metafsica que se preten-
de analizar. El software citogentico especializado enton-
ces permite el arreglo de los cromosomas en la pantalla de
la computadora para generar un cariotipo nal, que pue-
de imprimirse o almacenar, o ambos, electrnicamente.
Anlisis cromosmico para las alteraciones
adquiridas del cromosoma
El anlisis citogentico de alteraciones malignas (leuce-
mias y tumores slidos) se realiza de rutina para detectar
cualquier alteracin cromosmica adquirida asociada. La
deteccin de tales alteraciones proporciona la informacin
vital del diagnstico de la enfermedad, el pronstico del pa-
ciente y para monitorear la respuesta a la terapia. El anlisis
cromosmico para las alteraciones cromosmicas adquiri-
das produce algunas diferencias importantes del anlisis
de constitucin. Las alteraciones cromosmicas adquiridas
son clonales, connadas slo a las clulas malignas. Ade-
ms, las metafases que se obtienen de las clulas malignas
muestran tpicamente morfologa inferior (bandas cortas y
pobres) comparadas con las clulas benignas. Es impor-
tante, primero, que el citogenetista analice un nmero ms
grande de clulas para permitir la deteccin de alteracio-
nes clonales pequeas (es decir, no todas las clulas que se
detectan pueden pertenecer al clon anormal), y segundo,
que una seleccin representativa de todas las metafases sea
examinada para evitar la seleccin inadvertida de la mejor
calidad, pero posiblemente de las clulas benignas.
Citogentica molecular
El desarrollo signicativo ms reciente en el campo de la
citogentica de diagnstico rutinario ha sido la introduc-
cin de tcnicas citogenticas moleculares en la dcada
de 1980. Existe una amplia gama de sondas, disponibles
en el comercio, las cuales pueden utilizarse para resaltar
regiones especcas del cariotipo humano por la tcnica
de hibridacin in situ uorescente (FISH). sta permite la
deteccin de algunas alteraciones muy sutiles que estn
ms all de los lmites de cualquier tcnica de bandeo. Las
sondas FISH pueden utilizarse para caracterizar rpido y
con exactitud las alteraciones complejas o no identicadas
del cromosoma, que se detectan usando tcnicas de bandeo.
Adems, las sondas FISH permiten que sean tamizados es-
pecmenes para alteraciones citogenticas importantes, an
cuando extensiones de la metafase dividindose no estn
disponibles. Esto permite el diagnstico prenatal rpido, ya
que las muestras del lquido amnitico pueden tamizarse
para alteraciones especcas por FISH despus de 24 ho-
ras, en lugar de esperar dos semanas para que sucientes
clulas crezcan en cultivo para producir preparaciones cro-
mosmicas. La FISH tambin es particularmente til en los
estudios de malignidad donde las clulas mitticas pueden
ser difciles de obtener.
Todos los laboratorios citogenticos de diagnstico ruti-
nario ahora confan mucho en estas pruebas FISH, las cua-
les complementan los mtodos rutinarios de bandeo. En
muchos casos las pruebas FISH son realmente ms apro-
piadas que el anlisis alternativo del cariotipo completo.
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La hibridacin in situ uorescente (FISH) es una tcnica
poderosa que desempea una parte signicativa en varias
reas actuales de la investigacin gentica. Se reere a una
serie de procedimientos relacionados, en los cuales mol-
culas de cido nucleico de cadena sencilla (sondas) mar-
cadas con qumicos que por s mismos son uorescentes o
pueden detectarse por microscopia de inmunouorescen-
cia, son tiles para identicar secuencias especcas del
cido nucleico objetivo en preparaciones citolgicas.
Esta tcnica se deriva directamente de los primeros ex-
perimentos originales de hibridacin del cido nucleico ini-
ciados por Speigleman en la dcada de 1960, que adaptaron
varios grupos, usando sondas marcadas con radiactividad
para identicar secuencias de cidos nucleicos en material
jado sobre el portaobjetos que se observa al microscopio.
Los ejemplos iniciales incluyeron la identicacin de los ge-
nes del RNA ribosmico en los nucleolos de los oocitos de
Xenopus y del DNA satlite centromrico en los cromoso-
mas en metafase del ratn. Aunque los protocolos avanza-
ron mucho desde entonces, los pasos bsicos permanecen
en gran parte inalterados. Todas las variaciones de la tcnica
incluyen una sonda de cido nucleico, una preparacin cito-
lgica y un sistema de deteccin. Los pasos principales en
el sistema se describen en este punto; antes, las variaciones
y las aplicaciones de la tcnica se comparan.
Eleccin de la sonda
En muchos casos un clon de DNA genmico puede utili-
zarse, aunque, como se ver ms adelante, otras fuentes de
DNA tambin pueden utilizarse para el teido de cromo-
somas. En algunas aplicaciones se usan las molculas de
RNA, aunque es muy raro en la actualidad. La sonda debe
marcarse antes de usarse, por orden de deteccin, el ma-
terial se hibrida al nal del procedimiento. Es importante
tomar en cuenta que un factor en la deteccin de sonda
es la longitud de la misma. Bajo los mismos sistemas de
marcado y de deteccin, una sonda ms pequea proyecta
siempre una seal ms dbil que una ms larga. Aunque
las sondas tan pequeas como de 500 bases es posible de-
tectarlas en ciertas circunstancias, los csmidos, vectores
derivados del bacterifago , que contienen casi 40 kb del
DNA clonado, son las fuentes ms utilizadas de la sonda.
El DNA clonado en vectores que transportan insertos ms
grandes, como los cromosomas articiales bacterianos
(BAC), los cromosomas articiales P1 (PAC) o los cro-
mosomas articiales de levadura (YACS), trabaja bien en
todos los casos.
Marcacin de las sondas
Los marcadores que se utilizan con ms frecuencia en los
experimentos de FISH son los trifosfatos deoxiuridina modi-
cados. Las modicaciones implican la adicin de haptenos,
grupos inmunorreactivos tales como digoxigenina o biotina,
los cuales se enlazan a la posicin 5 del anillo de pirimidina
por un brazo largo espaciador. stos pueden detectarse por
tcnicas de inmunouorescencia indirecta. Alternativamen-
te, las sondas se pueden marcar con nuclesidos trifosfatos
que contienen un uorocromo tal como la uorescena y de-
tectarse directamente por su propia uorescencia. Es posi-
ble marcar las sondas usando algunos de los sistemas que se
emplean con frecuencia en otra parte en biologa molecular.
stos incluyen la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR),
37
Hibridacin in situ uorescente
Ivor Hickey
358 CAP. 37 HIBRIDACIN IN SITU FLUORESCENTE
nick translation y el marcado por medio de iniciadores de
secuencia aleatoria (random primer). De stos, el nick trans-
lation es, probablemente, el ms popular puesto que produce
fragmentos de DNA pequeos y marcados. El tamao de la
sonda es importante, ya que las molculas de sondas grandes
tienen dicultad para difundirse a travs del material citolgi-
co para alcanzar su DNA objetivo, y su uso resulta a menudo
en mucha uorescencia del fondo. El tamao ptimo de la
sonda est entre 200 y 500 bases. Las sondas que se producen
por PCR son cada vez ms importantes en las tcnicas de pin-
tado del cromosoma y de la FISH de bra que se describen
con detalle ms adelante.
Hibridacin
Aqu los procedimientos siguen ampliamente los de otros
protocolos moleculares de hibridacin de cidos nucleicos.
Las diferencias se relacionan con las tentativas de mantener
la morfologa de la preparacin citolgica en buenas condi-
ciones, y para prevenir la unin de la sonda a las secuencias
repetidas distribuidas por todo el genoma. Para mantener
la integridad de la preparacin citolgica, la hibridacin se
lleva a cabo normalmente a temperaturas reducidas tpicas
de 35 a 42C, en formamida a 50%. La mayor parte de los
genomas eucariotas contienen abundantes secuencias de
DNA repetidas y dispersas. Por esta razn, si el material
genmico se utiliza como sonda, es probable que conten-
ga secuencias de DNA que se repiten en otra parte en el
genoma. Esto resulta en un nivel de uorescencia a travs
de todas las regiones de los cromosomas, lo que reduce la
especicidad de la sonda. Para prevenir esto y mejorar la ca-
lidad y la sensibilidad de la imagen nal, el DNA sin marcar
de la fraccin repetitiva del genoma (Cot 1 DNA) se agrega
a la sonda durante la hibridacin.
Deteccin de la sonda hibridada
Cuando las sondas se marcan directamente con los nucle-
tidos uorescentes, la deteccin requiere slo una sencilla
observacin del material usando un microscopio de uo-
rescencia con los ltros apropiados. Puesto que la seal no
se amplica, este mtodo detecta una uorescencia menos
intensa, pero el nivel uorescente del fondo es bajo. El uso
de cmaras con dispositivo acoplado de cargas (CCD) para
detectar uorescencia de nivel bajo puede hacer este mtodo
bastante sensible para emplearse con pequeos DNA objeti-
vos. Cuando las sondas se marcan con haptenos, su presencia
se detecta con los anticuerpos conjugados con uorocromos.
Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina pueden
detectarse de esta manera, pero la biotina tiene la ventaja
agregada de tener una anidad en extremo alta por la prote-
na de la clara de huevo, la avidina. Esto permite el uso de la
avidina conjugada con los uorocromos para utilizarse en
la deteccin. El nico defecto de esta tcnica se localiza en el
tejido a analizar que contiene mucha biotina para dar origen a
la uorescencia del fondo. En el caso de la citogentica esto
no es un problema importante. Con frecuencia la seal uo-
rescente de un objetivo se amplica usando ms de una capa
del anticuerpo en el proceso de deteccin.
Una de las ventajas principales de la tecnologa de FISH
est en que diferentes uorocromos pueden utilizarse si-
multneamente junto con una serie de sondas marcadas
con diferentes haptenos. El resultado es una imagen de
FISH en dos colores. Por ejemplo, dos sondas pueden hi-
bridarse para la misma preparacin del cromosoma. Si una
est marcada con biotina y se detecta con los anticuerpos
conjugados con uorescena, y la otra se marca con la
digoxigenina y se detecta usando el rojo Texas, despus
ambos loci se detectan de manera simultnea como reas
de uorescencia verde o roja. Este acercamiento puede
extenderse tambin cuando se usan sondas directamen-
te marcadas en el mismo experimento, o cuando las sondas
marcadas con una mezcla de dos haptenos se utilizan. Si ta-
les sondas se detectan con los anticuerpos conjugados de dos
diferentes uorocromos, el resultado es una seal de color
intermedio; la uorescencia roja por el rojo Texas y la uo-
rescencia verde de la uorescena emiten una seal anaran-
jada. Una serie de sondas se pueden marcar con diferentes
cocientes de los mismos dos haptenos. La uorescencia
resultante se convierte en una seal digital en una cma-
ra CCD y el software reconoce las diferencias sutiles en
la uorescencia. stas entonces sern colores falsos asig-
nados. Este acercamiento condujo al desarrollo del carioti-
po espectral, que se describe ms adelante.
Despus de la deteccin de las sondas, es necesario
seguir localizando las reas restantes de los cromosomas
o de los ncleos a los cuales la sonda no ha hibridado. Esto
se hace usando los uorocromos 4,6-diamino-2-fenil-indol
(DAPI), Hoechst 33258 o yoduro de propidio. La combina-
cin del yoduro de propidio y del DAPI produce un patrn
de bandas que puede ser til en la identicacin del cromo-
soma. Sin embargo, debido a que el yoduro de propidio es
excitado por ms de una longitud de onda y uorescencias
de varias longitudes de onda diferentes, puede producir
problemas donde las imgenes se capturan usando cmaras
CCD monocromticas.
Aplicaciones en la investigacin bsica
Aunque esta tecnologa puede utilizarse potencialmente
con todas las especies de eucariotas, este captulo se con-
centra en los usos en la gentica humana. La FISH puede
utilizarse para detectar genes u otras secuencias de DNA
APLICACIONES EN LA INVESTIGACIN BSICA 359
de regiones cromosmicas especcas. La precisin reque-
rida por el experimento determina el acercamiento que se
utiliza. En el nivel ms simple, el proceso es posible em-
plearlo para identicar cromosomas enteros, una tcnica
conocida como pintado cromosmico. En este caso es
necesario aislar el DNA de un solo cromosoma humano
para hacer una sonda. Esto se realiza por dos mtodos. Por
principio, los hbridos celulares somticos humanos ms
roedor se utilizaron como una fuente de DNA. En estos
hbridos celulares es posible aislar clones que contienen un
solo cromosoma humano. El DNA se asla de tales clones
y el DNA humano se amplica usando iniciadores com-
plementarios a las secuencias alu. stas representan una
secuencia muy repetida que se encuentra en el ser humano
pero est ausente en el DNA del roedor.
Ahora es posible aislar cromosomas humanos espec-
cos en metafase directamente, usando la seleccin celular
activada por uorescencia (FACS). El DNA del sedimen-
to de los cromosomas puricados es amplicado por PCR
usando los iniciadores degenerados; es ahora el mtodo de
opcin para los proveedores comerciales del pintado cro-
mosmico. El pintado cromosmico es en particular til
para el estudio de las translocaciones; se ilustra en la gura
37-1. Aqu pintado de cromosoma se utiliza para identicar
los cromosomas implicados en una translocacin que se ha
presentado en un tumor humano. Los fragmentos translo-
cados pequeos de cromosomas son, con frecuencia, slo
perceptibles con este acercamiento.
El renamiento del principio del pintado de cromoso-
mas condujo a protocolos en los cuales cada par de cromo-
somas en una clula puede identicarse de manera simul-
tnea. Esto se conoce como cariotipo espectral. En esta
tcnica, los tintes para cada par de cromosomas se hibridan
a los cromosomas en la misma reaccin. Cada tinte del cro-
mosoma es una mezcla de varios uorocromos diferentes,
combinados en diversos cocientes. Esto signica que la
uorescencia emitida por cada cromosoma tiene un espec-
tro especco, el cual lo detecta el sensor, y el software
atribuye un color falso diferente a cada espectro. El resul-
tado es una imagen por computadora en la cual todos los
cromosomas pueden detectarse con un color especco.
Un uso ms sosticado de la FISH se requiere para ma-
pear la ubicacin cromosmica de una secuencia especca
de un gen. Para esta tarea, el DNA clonado en YAC, BAC
o csmidos se utiliza normalmente como sonda. Esto emite
suciente uorescencia fcilmente perceptible. Los ejem-
plos se muestran en la gura 37-1. Los procedimientos im-
plicados son similares a los que se emplean para el teido
de cromosoma, pero suele requerirse una amplicacin
ms grande de la seal. La FISH es mucho ms fructfera
para esta tarea que las sondas marcadas con radiactividad
previamente utilizadas, debido al fondo reducido y al corto
tiempo que se requiere para completar el experimento (dos
das, comparado con las varias semanas necesarias para la
exposicin de autorradiografas). Segn lo descrito antes,
ms de una sonda puede utilizarse simultneamente. Este
acercamiento se emplea de diferentes maneras. Cuando se
intenta localizar una sonda en un cromosoma, es a menudo
necesario identicar el cromosoma con mucha claridad, al
mismo tiempo. Esto se logra usando una sonda para una
Figura 37-1 a) Parte de una metafase de una clula tu-
moral humana teida con DAPI. Un cromosoma mor-
folgicamente atpico es indicado por la echa blanca.
b) El mismo cromosoma de una metafase hibridado
con tincin del cromosoma 2. Sin duda, la regin dis-
tal del cromosoma (echa) est compuesta del material
derivado del cromosoma 2. La tincin cromosmica
marrn es yoduro de propidio y el tinte est marcado
con FITC. Una copia normal del cromosoma 2 est tam-
bin presente en la estructura. Un acercamiento similar
mostr que el resto del cromosoma est compuesto del
cromosoma 17. c, d) Cmo la FISH puede utilizarse
para mapear el punto de la translocacin. Un BAC que
mapea la regin distal del cromosoma 17, 17q25.3
como se muestra en (c), fue hibridado al cromosoma
de translocacin en la clula tumoral. El hecho es que
se ha visto en (d) mapas la translocacin al telmero
extremo distal del cromosoma 17. c) y d) Son imgenes
digitales que se obtienen usando una cmara CCD.
secuencia de repeticin de DNA centromrico especco
del cromosoma en cuestin. Para determinar el orden de
los genes estrechamente ligados a lo largo del cromosoma,
la FISH de doble o triple color puede utilizarse. Debido
a los colores que se emplean, este proceso se conoce con
frecuencia como iluminacin de semforo. La posicin
de la sonda en un cromosoma puede algunas veces identi-
carse por el patrn de bandas, pero a menudo se expresa
simplemente como unidades F/pter. stas representan la
distancia mnima del telmero del brazo p del cromosoma,
en comparacin con la extensin del cromosoma entero.
Una limitacin importante para mapear los genes por
medio de la FISH la produce el estado relativamente con-
densado de los cromosomas mitticos en metafase. Esto
signica que las seales de los genes falsean en cerca de 1
a 2 Mb, una seal de otra, y ocurre un traslape que impide
distinguir las dos seales. Para superar este problema se
usan diferentes estrategias. La cromatina est mucho me-
nos condensada durante la interfase, y las secuencias que no
es posible separar en los cromosomas en metafase se re-
suelven con frecuencia por hibridacin de las sondas en
los ncleos de las clulas que no se estn dividiendo. Una
desventaja en este sistema es que no es posible orientar
los genes en relacin con el centrmero. Un proceso al-
ternativo que permite esto es el uso de las preparaciones
meiticas del cromosoma. stas son ms alargadas que las
mitticas. Sin embargo, tiene inconvenientes al preparar-
se. Un acercamiento exitoso para producir los cromosomas
mitticos alargados consiste en utilizar las preparaciones
de citocentrifugacin de metafases sin jar. Una citocen-
trfuga es un dispositivo que se emplea frecuentemente en
hematologa para preparar portaobjetos con clulas san-
guneas. Este dispositivo usa una centrifugadora modica-
da en la cual las clulas se hacen girar de manera directa
sobre el portaobjetos. Cuando las metafases sin jar que se
hinchan en solucin salina hipotnica se tratan de esta mane-
ra, las fuerzas de corte producidas durante la centrifuga-
cin estiran los cromosomas hasta veinte veces su longitud
normal. Aunque esto causa que muchas de las metafases se
interrumpan y que los cromosomas se deformen, tiene una
ventaja sobre el anlisis de la interfase, en que los cromo-
somas individuales pueden ser identicados, y la orienta-
cin de las seales de la FISH hacia los centrmeros y los
telmeros es posible observarlos.
El ltimo grado de resolucin que se obtiene con el an-
lisis de FISH se encuentra en la tcnica de FISH de bra.
Aqu la sonda se hibrida al DNA, que es extendido en un
portaobjetos despus de la eliminacin de la mayor parte
o de la totalidad de su cromatina empaquetada. Ninguna
informacin en lo absoluto se obtiene sobre la orientacin
de la seal en el cromosoma, pero la tcnica es muy pode-
rosa para el anlisis a escala na de las regiones pequeas
del genoma. La dispersin y elongacin del DNA se puede
conseguir de muchas maneras. Las bras extendidas de cro-
matina se pueden obtener de los ncleos de las clulas en
interfase sin jar tratadas sobre portaobjetos con detergente
y sal concentrada para quitar las histonas. Esto causa que
la estructura de la cromatina se desenrolle y se extienda el
DNA en una longitud comparable con la del DNA puro.
Tales tcnicas se conocen como produccin del halo o
DIRVISH (hibridizacin visual directa). stas permiten el
ordenamiento de la sonda a un lmite de resolucin ms bajo,
de 3 a 5 kb. El DNA puricado tambin puede extenderse so-
bre el portaobjetos del microscopio para usarse en el anlisis
de estructura na. El DNA se entrampa en bloques de agaro-
sa, como los que se usan en la electroforesis en gel de cam-
po pulsado, que se funden y se extienden suavemente en el
portaobjetos, o el DNA en solucin puede permitir que se
extienda en portaobjetos silanizados. En este caso, el extre-
mo de la molcula se une al vidrio y el resto del DNA se
rastrea fuera, en un patrn que es ms o menos lineal en el
menisco de la solucin que se evapora.
Ambos protocolos facilitan el estudio a escala na. Los
ejemplos tpicos incluyen la ordenacin de las sondas pro-
ducidas por PCR a lo largo del DNA clonado en los YAC
o los csmidos. Esto puede ser muy til en circunstancias
donde un contiguo (un grupo de fragmentos de DNA clo-
nados ordenados que se traslapan) est incompleto y el ta-
mao de los espacios necesita estimarse.
Aplicaciones en la gentica mdica
Como se seala antes, el pintado del cromosoma es parti-
cularmente til para detectar las translocaciones demasia-
do pequeas para resolverse con claridad por el bandeo G
convencional. Otros usos de la FISH incluyen la deteccin
de aneuploides, particularmente en la amniocentesis. Aqu
el anlisis de los ncleos en interfase puede emprenderse de
nuevo. En lugar de usar el teido de cromosoma completo
para detectar los nmeros de los homlogos, se utilizan las
sondas especcas para las secuencias de DNA repetidas en-
contradas en los centrmeros de diferentes cromosomas. Esto
puede detectar la presencia de copias adicionales de los cro-
mosomas implicados en los sndromes aneuploides comunes,
como los sndromes de Down, Edward y Pateau. El sexo de
un embrin puede determinarse tambin en las clulas amni-
ticas usando las sondas de dos colores para los cromosomas
X y Y. En estos procedimientos la FISH permite que un resul-
tado se obtenga en un tiempo mucho ms corto que el an-
lisis convencional del cromosoma, donde las clulas deben
cultivarse, y tiene la ventaja agregada que, como slo las c-
lulas en interfase son necesarias, el nmero de las clulas
registradas puede ser muy alto. No obstante, es ms costoso
y no aporta tanta informacin sobre la naturaleza de alguna
anormalidad citogentica como el bandeo G; por ejemplo,
no distingue entre la presencia de un cromosoma adicional
intacto y un fragmento del que contiene el centrmero.
Aplicaciones en el diagnstico
e investigacin del cncer
La FISH realiza su mayor contribucin a la medicina en
el estudio y el diagnstico exacto de los diferentes tipos
de cncer y la leucemia. En la mayor parte de los casos, el
tejido maligno muestra al menos algunas aberraciones ci-
togenticas. La citogentica convencional puede aplicarse
slo con dicultad en estas situaciones, pero la FISH, par-
ticularmente sobre los ncleos en interfase, puede producir
resultados exactos y en un periodo corto, dos criterios que
son de importancia evidente en el cuidado del paciente.
Aunque las translocaciones aleatorias son comunes en
las clulas tumorales, muchos tipos de cncer, en particular
leucemias y linfomas, portan translocaciones especcas
que pueden utilizarse para hacer un diagnstico exacto.
stas son a menudo de la fusin de copias de dos genes
diferentes, creando un gen original. Un ejemplo clsico
es el cromosoma Filadela, que se detecta en la leucemia
mieloide crnica. Aqu, las translocaciones especcas al-
tas entre los cromosomas 9 y 22 ocasionan la fusin de
los oncogenes abl y BCR para producir una tirosina cinasa
original. Aqu el bandeo G convencional es problemtico.
Esto ocurre porque las clulas malignas pueden no aportar
nmeros signicativos de metafases in vitro y la calidad de
las extensiones del cromosoma es frecuente que est muy
por debajo de la obtenida de los linfocitos normales. El
teido de cromosoma puede aplicarse incluso donde la ca-
lidad de las preparaciones del cromosoma es deciente, ya
que los cromosomas blanco se identican por la uorescen-
cia, aun cuando ellos no puedan detectarse claramente por
el bandeo G. La ventaja principal de la tecnologa de FISH,
en este caso, es otra vez la capacidad para obtener informa-
cin citogentica de las clulas que no se estn dividiendo.
El uso de las sondas uorescentes, con frecuencia csmi-
dos, para las regiones en cada lado de la translocacin es-
pecca del tumor permite un diagnstico exacto. Las dos
sondas se marcan con haptenos diferentes, de modo que
se detecten con dos colores distintos: rojo y verde. En las
clulas normales, donde no est presente la translocacin,
dos sitios rojos y dos verdes uorescentes aparecen en el
ncleo. Los puntos se distribuyen aleatoriamente a travs
del ncleo. En presencia de una translocacin, un punto
rojo y uno verde se localizan muy cerca uno del otro en
cada clula tumoral. El traslape ocurre con frecuencia y
una regin amarilla de la seal mezclada se observa. Este
acercamiento permite una deteccin neta de la translocacin
en una gran cantidad de clulas, y es posible distinguir las
clulas normales y las leucmicas en la muestra. Adems del
trabajo de diagnstico, este sistema se emplea tambin para
buscar clulas leucmicas residuales en los pacientes despus
de la terapia. Los aneuploides especcos pueden detectar-
se en el tejido leucmico con los mismos mtodos descritos
antes para las clulas amniticas.
El anlisis citogentico de los tumores slidos siempre
se ha quedado atrs de los cnceres de la sangre. Esto es en
parte una consecuencia de la mayor dicultad para obtener
preparaciones aprovechables del cromosoma. A pesar de
esto, muchos tumores slidos se han encontrado que por-
tan aberraciones cromosmicas especcas. stas pueden
buscarse por FISH en la interfase, o bien en preparacio-
nes de contacto, donde el material extirpado del tumor es
contactado sobre los portaobjetos para dejar un frotis de
clulas, o bien por el uso de frotis citolgicos de una pe-
quea cantidad de clulas que se obtienen en aspirados con
aguja na.
Adems de las translocaciones y de los cambios en el
nmero de cromosomas, los tumores contienen con fre-
cuencia copias mltiples de oncogenes o de genes que con-
eren resistencia a frmacos quimioteraputicos. stos se
presentan, o bien como regiones alargadas de los cromoso-
mas donde el gen es amplicado in situ, conocidas como
regiones homogneas teidas (HSR), o bien como elemen-
tos extracromosmicos pequeos, llamados diminutos
dobles (DM). La amplicacin del oncogn es un factor
importante en el pronstico. La FISH tiene en cuenta la
deteccin de la amplicacin en los ncleos de interfase de
las muestras del tumor. Un ejemplo de esto es el tamizaje
de las biopsias de cncer de mama para la amplicacin del
oncogn erbB-2 en el cromosoma 17. Las clulas norma-
les en la biopsia aportan un control, mostrando dos puntos
uorescentes pequeos que corresponden a las dos copias
sin amplicar del presente gen, mientras el rea de uores-
cencia es mucho mayor donde se amplica. Los ejemplos
de esto se muestran en la gura 37-2.
Una aplicacin algo diferente de la FISH, en la investi-
gacin y el tratamiento de cncer, es el desarrollo de una
tcnica que aporta una estimacin total de ganancias y de
prdidas especcas de cromosomas, o regiones del cromo-
soma de un tumor particular; se conoce como hibridacin
comparativa del genoma. Aqu el DNA se extrae del tumor
despus de la remocin del paciente. Este DNA se marca
con un uorocromo (verde); se mezcla con el DNA extra-
do de las clulas normales, las cuales se marcan con rojo, y
con la mezcla hibridizada sobre los cromosomas normales
en metafase. Las sondas diferentemente marcadas compi-
ten para situar los cromosomas. Si el tumor no muestra ga-
nancia o prdida de material cromosmico, la hibridacin
APLICACIONES EN EL DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DEL CNCER 361
in situ resultante contiene 46 cromosomas, la totalidad de los
cuales con una uorescencia amarilla uniforme. Sin embar-
go, las regiones del tumor que experimentan amplicacin
estn sobrerrepresentadas en el DNA extrado y superan al
DNA que emite uorescencia roja. Tales regiones, por tan-
to, aparecen verdes. Inversamente, las regiones perdidas del
tumor, que es probable que contengan genes supresores,
aparecen en rojo uorescente. El anlisis de esta hibridacin
competitiva a dos colores requiere software del computador
sosticado, pero puede convertirse en una herramienta im-
portante que aporte un anlisis molecular de amplio espectro
de los tumores individuales.
La FISH parece tener un papel establecido en la biologa
molecular. Cmo se desarrolle en el futuro la tcnica depen-
de de la comprensin creciente de los procesos genticos
en esta enfermedad. En algunas de las aplicaciones en las
cuales se sita puede reemplazarse por tcnicas no citoge-
nticas, tales como la PCR. reas donde esto puede suceder
incluye la deteccin de las translocaciones especcas del
cncer, o la determinacin del sexo en las clulas amniti-
cas. Sin embargo, una de las ventajas ms importantes de la
FISH es que no destruye las clulas en las cuales se lleva a
cabo. En muchas reas esta capacidad para obtenerse infor-
macin gentica molecular mientras an puede identicarse
la estructura celular y tisular es esencial, por ejemplo, en la
patologa molecular del cncer. Adems, el acoplamiento de
tcnicas moleculares y citolgicas agrega un control valioso
contra los resultados errneos que se presenten de la con-
taminacin de las muestras. Por estas razones, la tcnica es
probable que mantenga su importancia en la investigacin y
las biociencias aplicadas por un tiempo considerable.
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Figura 37-2 a) Clulas en interfase de un aspirado de aguja na de un tumor de pecho que se ha hibridado con una sonda para el on-
cogn erbB-2. En este caso las clulas muestran amplicacin del oncogn, mientras en (b) el aspirado contiene clulas en las cuales el
oncogn no se ha amplicado, y cada clula muestra uno o dos puntos, que corresponden a los genes normales. En las preparaciones
de frotis hechas de los aspirados por aguja na las clulas no se dispersan, lo que se explica porque la seal erbB-2 no est en el mismo
plano focal en cada clula. En estos ejemplos la sonda fue directamente marcada con FITC y los ncleos contrateidos con DAPI. Cor-
tesa del Dr. Damien McManus, Royal Victoria Hospital, Belfast.
SECCIN 7
QUMICA CLNICA
Introduccin
Las investigaciones en bioqumica clnica se utilizan am-
pliamente en la medicina con gran variedad de propsitos
(cuadro 38-1). La mayor parte de las investigaciones ms
familiares implica la medicin de un componente de algn
uido corporal, suero (o plasma) u orina. Los ensayos pue-
den tambin hacerse en otros uidos, por ejemplo, el espi-
nal, el obtenido por paracentesis, secreciones intestinales y
heces, y sobre muestras de biopsia de tejidos corporales.
Los resultados de la mayor parte de las investigaciones
bioqumicas clnicas se expresan cuantitativamente como
una concentracin o con frecuencia, en el caso de medicio-
nes enzimticas, como una actividad. El anlisis gentico
molecular, aunque aumenta en el repertorio de los labora-
torios bioqumicos clnicos, no se discute en este captulo.
El hecho de que los resultados se expresen en forma nu-
mrica permite el lujo de una simplicidad evidente: pare-
cen fciles de evaluar y comparar con rangos de referencia
(normales) o con resultados que se obtienen previamente
en el mismo paciente. Mientras, por ejemplo, un signo sutil
sobre una radiografa puede estar abierto a una variedad
de interpretaciones (o puede ser ignorado por un observa-
dor inexperto), una concentracin de sodio srico de 143
mmol/L parece inequvocamente normal (el rango de
referencia es 135 a 145 mmol/L) y es sin duda su valor
diferente a 147 mmol/L, que es por denicin anormal.
Pero, en realidad lo es? Examinemos estas armaciones
con cierto detalle. Una concentracin de sodio srico puede
estar dentro del rango normal, pero eso no excluye la posi-
bilidad de que una anormalidad sutil de la homeostasis del
sodio o del agua est presente, tampoco signica que el in-
dividuo sea sano. Inversamente, encontrar que un individuo
tiene una concentracin de sodio srico de 147 mmol/L no
signica que un desorden homeosttico del sodio o del agua
est presente; de hecho, el individuo puede estar perfecta-
mente sano. Estas armaciones provienen de que, como se
discute ms adelante en este captulo, se esperara que 5%
de los individuos normales tuviera valores fuera del ran-
go de referencia, aunque es evidente que en cuanto un valor
medido est ms alejado de los lmites del rango de referen-
cia, es ms probable que tenga una importancia patolgica.
La comparacin de un resultado con un rango de refe-
rencia puede tener valor cuando la medicin se hace en un
individuo por primera vez. En la prctica, las mediciones
se realizan con frecuencia, por ejemplo, para determinar el
progreso de una condicin o de una respuesta al tratamien-
to. Un valor medido establecido puede entonces comparar-
se con uno anterior para considerar si ha ocurrido un cam-
bio signicativo. Pero si, por ejemplo, una concentracin
de sodio srico de 145 mmol/L en un da es signicativa-
mente diferente (es decir representa un cambio siolgico
o patolgico verdico) a partir de una de 147 mmol/L del
da anterior se requiere un conocimiento de la conabili-
dad de los datos, no slo en trminos de calidad analtica,
sino tambin de cualquier variacin biolgica que afecte
la concentracin del sodio in vivo. Por ltimo, cualquier
conclusin que se arrastre no es conable si la muestra que
The Science of Laboratory Diagnosis, second edition. Editado por David Burnett y John Crocker.
38
Adquisicin, aplicaciones e interpretacin
de los datos bioqumicos clnicos
William J Marshall
366 CAP. 38 ADQUISICIN, APLICACIONES E INTERPRETACIN DE LOS DATOS BIOQUMICOS CLNICOS
se analiza no se recolecta y maneja antes del anlisis de una
manera que no afecte la concentracin de sodio.
A n de que los lectores dejen de preocuparse porque
ninguna conclusin categrica pueden sacarse de los datos
bioqumicos clnicos (o, peor, pensar que estas cuestiones
son triviales y sin ninguna consecuencia), debe enfati-
zarse que el personal de laboratorio emprende esfuerzos
considerables para asegurarse de que los datos que aporta
sean conables (una medicin verdadera de la variable en
cuestin) y precisos (reproducibles). Tambin es importan-
te que el analito (componente de inters analtico) pueda
medirse sobre un rango de concentracin clnica til, y que
los resultados estn disponibles lo sucientemente rpido
para informar a la gerencia clnica. Alcanzar esto requiere
de metodologa e instrumentacin apropiadas, y el apego a
procedimientos diseados para maximizar la calidad.
Sin embargo, sigue siendo importante que los usuarios
de datos del laboratorio bioqumico clnico estn conscien-
tes de las fuentes de error (no todas se encuentran en el
laboratorio), y de trampas en la interpretacin de los re-
sultados, si se esfuerzan para obtener el mximo de infor-
macin clnicamente til. La mayor parte del resto de este
captulo est dividida en dos secciones: la primera se ocupa
de la recoleccin y anlisis de la muestra; la segunda, de las
aplicaciones e interpretacin de los datos bioqumicos.
Recoleccin y anlisis de la muestra
Los factores que pueden perjudicar la calidad de los resul-
tados se dividen de manera convencional en preanalticos,
analticos y posanalticos, es decir, se presentan en este or-
den antes de que la muestra se analice, durante el anlisis,
y una vez que se han generado los resultados.
Factores preanalticos
Las variables bioqumicas son afectadas por muchas de las
siolgicas (cuadro 38-2). Adems, todas las variables bio-
qumicas estn sujetas a una variacin biolgica aleatoria.
Cuadro 38-1 Usos de las pruebas bioqumicas en la medicina
Usos Ejemplo
Diagnstico Concentracin de la glucosa
sangunea (diabetes)
Valoracin de la Concentracin de la creatinina
gravedad srica (insuciencia renal)
Pronstico Tiempo de protrombina, gravedad
de la acidosis, etc. (insuciencia
heptica aguda)
Monitoreo de la Hemoglobina glucosilada
enfermedad/tratamiento (diabetes)
Seguimiento a largo Algunos marcadores tumorales
plazo (cncer)
Tamizaje TSH sanguneo neonatal
(hipotiroidismo congnito)
Deteccin de la Pruebas de la funcin tiroidea
toxicidad del frmaco (para pacientes tratados con litio)
Estraticacin para Concentracin del colesterol en
los ensayos clnicos plasma (para ensayos de frma-
cos que disminuyen el colesterol)
Cuadro 38-2 Ejemplos de factores siolgicos que afectan los
resultados de pruebas bioqumicas
Factor Prueba (todas en suero o en plasma)
Edad Colesterol, urato, fosfatasa alcalina
Sexo Esteroides gonadales, gonadotropinas,
colesterol HDL
Masa corporal Triglicridos
Tiempo Cortisol (variacin diurna)
Gonadotropinas (variacin del
catamenial en mujeres)
25-Hidroxicolecalciferol (variacin
estacional)
Estrs Cortisol, prolactina, hormona del
crecimiento, catecolaminas, glucosa
Postura Renina, aldosterona, protenas del
plasma
Ingesta de alimentos Glucosa, triglicridos, fosfato
Para algunos, particularmente aquellos que estn sujetos al
control rgido de la retroalimentacin, la concentracin de
calcio plasmtico puede ser pequea, pero para otros es un
factor signicativo que debe considerarse cuando se inter-
pretan los resultados.
El efecto de los frmacos sobre las variables bioqumi-
cas in vivo es un problema potencial enorme, aunque en la
prctica el nmero de ejemplos importantes es relativamen-
te pequeo. La hipocalcemia, que ocurre con frecuencia en
pacientes tratados con diurticos, es uno de ellos. Las medi-
ciones bioqumicas tambin se realizan con frecuencia para
evaluar el efecto de los frmacos, por ejemplo, medicin
de la glucosa y de la hemoglobina glucosilada en pacientes
con diabetes tratados con agentes hipoglucemiantes. Los
frmacos tambin pueden convertirse en una fuente poten-
cial del error analtico; por ejemplo, la reaccin cruzada de
prednisolona con el cortisol en muchos inmunoensayos.
Los errores preanalticos, al nal, suelen ocurrir por una
recoleccin incorrecta de la muestra, por ejemplo, al medir
la glucosa en una muestra sangunea que no es recolectada
en un envase con uoruro para inhibir la gluclisis; o por el
INTERPRETACIN DE LOS DATOS DE LABORATORIO 367
manejo, por ejemplo, causando hemlisis o la evaporacin
del agua. Todos los laboratorios publican manuales que de-
ben incluir la informacin sobre el tipo de muestra que
colecta y cualquier condicin especial que deba observar.
Los errores pueden presentarse, excepcionalmente, por
una identicacin errnea de las muestras. La vigilancia
extrema es necesaria para prevenir el error en la identica-
cin. Las formas de solicitud deben llenarse con los datos
correctos adecuados y cotejarse directo con el paciente, y
que las muestras se identiquen positivamente en todas las
etapas de la manipulacin, por ejemplo, si el suero tiene
que transferirse del envase inicial (primario) a uno secun-
dario para el anlisis. En muchos hospitales y clnicas, la
sangre y otras muestras las recolectan las enfermeras o los
ebotomistas entrenados. Muchos laboratorios encuentran
que es ms probable que ocurran los errores si las mues-
tras las recolectan los mdicos. En medicina de laboratorio,
como en la clnica, es buena prctica tener mucho cuida-
do con procedimientos en apariencia simples, es decir,
igual al que se tiene con los complicados.
Factores analticos
Una discusin detallada de los procedimientos de labo-
ratorio est ms all del alcance de este captulo. Es una
condicin de acreditacin por CPA (UK) Ltd (Acreditacin
del Laboratorio Clnico) que los laboratorios usen proce-
dimientos aceptables para el control de calidad interno y
el aseguramiento de calidad externa. Los problemas que
pueden afectar la calidad de los resultados se discuten en
los captulos sobre tcnicas analticas individuales.
Factores posanalticos
Una vez que se han generado y validado los resultados,
los errores todava pueden presentarse antes de que lle-
guen las anotaciones de los pacientes. Con el uso creciente
de la transmisin electrnica de los resultados desde el la-
boratorio a la sala o clnica, el riesgo de tales errores dismi-
nuye considerablemente, pero nunca puede eliminarse del
todo. Tambin, es un riesgo particular si los resultados se
comunican por telfono al mdico, debido a una urgencia.
Es irnico que justo durante el manejo de los resultados
es cuando un error podra tener consecuencias especcas
perjudiciales.
Interpretacin de los datos de laboratorio
Aunque los datos bioqumicos se utilizan de manera ex-
tensa en el diagnstico y control de pacientes, es raro que
aporten un diagnstico completo. Ms bien con frecuencia
reejan procesos patolgicos que enfermedades espec-
cas, y pueden incluso no ser determinantes para un proce-
so, aunque en una situacin clnica particular o tomando
en cuenta otras investigaciones, es probable que una puede
ser mejor que la otra. Por ejemplo, una concentracin baja
de albmina srica tiene muchas causas potenciales, que
incluyen disminucin de la sntesis, incremento en el volu-
men de distribucin o aumento en la prdida o catabolismo
y cada uno de stos por s mismo tiene varias causas po-
tenciales. En un paciente conocido por tener enfermedad
heptica crnica, la disminucin en la sntesis es probable
que sea la causa ms importante.
Los resultados bioqumicos pueden evaluarse en rela-
cin con varios criterios, de acuerdo con las razones de
realizar la prueba: el rango de referencia comparable para
personas sanas; el rango de valores esperados en condicio-
nes particulares; valores de corte o lmites de accin, o re-
sultados obtenidos previamente en el mismo individuo.
Rangos normales e intervalos de referencia
El trmino normal tiene varios signicados. Una distri-
bucin normal (gaussiana) describe una distribucin sim-
trica de datos alrededor de una media que puede detallarse
con una funcin matemtica especca. Estadsticamente
el rango normal es el rango de los valores para tales datos
a partir de la media menos dos desviaciones estndar para
la media ms dos desviaciones estndar, y abarca cerca de
95% de los valores. Para mucha gente, sin embargo, nor-
mal signica conforme al tipo o, implcitamente, sano,
puesto que rangos normales para variables biolgicas huma-
nas estn con frecuencia basados sobre mediciones hechas
en una muestra de individuos de una poblacin normal
(en el sentido de saludable).
Hay muchas trampas en el uso de rangos normales.
Dentro de las disciplinas de la medicina de laboratorio, se
discute en forma extensa que el trmino no debe usarse.
En vez de poblacin normal se preere el trmino po-
blacin de referencia, puesto que ste no implica ninguna
caracterstica especca (p. ej., salud) en la poblacin. (De
hecho, no existe razn por la que no deba procurarse de-
nir los rangos caractersticos de los resultados de la prueba
de una poblacin de referencia integrada de pacientes con
enfermedades particulares.) Los valores superiores e infe-
riores de la distribucin se llaman lmites de referencia
y el rango entre ellos, intervalo de referencia. Pero aun-
que sea loable este esfuerzo para dirigir un anlisis ms
objetivo de los datos, los trminos no se usan de forma
amplia fuera de los laboratorios y, en la prctica, muchos
los continan reriendo como rangos normales. Ade-
ms, los intervalos de referencia se basan con frecuencia
en los mismos datos que se utilizan para calcular rangos
normales y son idnticos a ellos.
Por denicin, puesto que el rango normal abarca slo
95% de los valores de la poblacin que se estudia, 5% de
los valores caen fuera de este rango, 2.5% arriba y 2.5%
abajo. Asimismo, algunos valores de la gente sana caen
inevitablemente fuera del rango normal para la poblacin,
aunque el sentido comn nos dice que cuanto ms lejos
est un resultado de los lmites del rango, es ms probable
que sea anormal en el sentido patolgico signicativo.
Cuanto ms variables se midan, es ms probable que por lo
menos una caiga fuera del rango normal importante. Si 20
analitos independientes fueran medidos, la probabilidad de
que uno sea anormal es 0.64, es decir, mejor que constante.
Puesto que los analizadores automatizados miden en forma
rutinaria este nmero de analitos, resultados falsos, anor-
males, son una ocurrencia inevitable.
Otro problema en la interpretacin proviene de que el
rango de variacin de un resultado de la prueba en un indi-
viduo es probable que sea menor al rango observado en la
poblacin, ya que la poblacin, aun cuando es comparable
en trminos, por ejemplo, de edad, sexo y origen tnico, se
compone de individuos genticamente distintos. El rango
normal para la concentracin de creatinina plasmtica en va-
rones adultos es aproximado a 60 a 120 mol/L, pero el ran-
go de valores que se observa con mediciones repetidas en un
solo individuo es mucho menor que se. Un individuo puede
aportar un resultado dentro del rango normal cuando se de-
ne para la poblacin que es realmente anormal para l.
En seguida se presentan algunos ejemplos especcos,
donde los rangos normales no son estndares apropiados
contra los cuales juzgar los resultados de los pacientes.
Ejemplo 1: un resultado dentro del rango normal puede
sugerir falsamente una funcin normal
La creatinina se mide en suero como ndice de la funcin
renal, especcamente de la tasa de ltracin glomerular
(GFR). La concentracin de creatinina es inversamente
proporcional a la GFR (g. 38-1) y en la prctica, la GFR
puede caer hacia la media normal (equivalente a la prdida
de un rin funcionando) antes de que la concentracin de
la creatinina srica exceda el lmite superior de la normal.
La concentracin de la creatinina srica es entonces un n-
dice insensible de la prdida temprana de la funcin renal.
Ejemplo 2: un resultado dentro del rango normal puede
sugerir falsamente ningn riesgo de enfermedad
Si las concentraciones del colesterol plasmtico se miden
sobre un grupo de gente sana, es posible derivar un rango
normal, pero est bien establecido que el incremento en las
concentraciones del colesterol est ligado a un incremento
en el riesgo de la enfermedad cardiaca coronaria, incluso
dentro de este rango (g. 38-2). Para el colesterol, por con-
siguiente, el concepto de un rango normal es engaoso.
Ms bien, denimos las concentraciones ideales (las cuales
hasta cierto punto ellas mismas dependen de la presencia
de otros factores de riesgo para la enfermedad coronaria)
y valores de umbral para los valores de intervencin y del
Figura 38-1 Concentracin de la creatinina srica y eliminacin
de la creatinina. Debido a que la eliminacin (una medida de la tasa
glomerular de ltracin, GFR) se relaciona de manera inversa con
la concentracin de la creatinina srica, la eliminacin puede des-
cender a la mitad de su valor normal (casi 120 ml/min) antes de
que la concentracin de la creatinina srica llegue a ser anormal.
El rea sombreada muestra el rango de referencia normal para las
concentraciones de creatinina srica.
Figura 38-2 Distribucin de las concentraciones del colesterol
srico en adultos saludables y el riesgo de enfermedad cardiaca
coronaria. Cerca de un tercio de los valores excede la concentra-
cin ideal recomendada (5.0 mmol/L) y estn relacionados con un
riesgo signicativo incrementado de la enfermedad coronaria.
C
o
n
c
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d
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(
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l
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L
)
Eliminacin de la creatinina (ml/min)
Riesgo de enfermedad
cardiaca coronaria
Colesterol srico (mmol/L)
N
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r
o

d
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s
u
j
e
t
o
s
INTERPRETACIN DE LOS DATOS DE LABORATORIO 369
blanco para el tratamiento. El valor del blanco para la pre-
vencin secundaria de la enfermedad coronaria en el Reino
Unido es en la actualidad una concentracin de colesterol
total de menos de 5.0 mmol/L (LDL menor de 3.0), aunque
hay evidencia de que incluso blancos ms bajos pueden ser
ms apropiados.
Ejemplo 3: cualquier concentracin es anormal
Puesto que los frmacos no son componentes siolgicos del
cuerpo, las concentraciones de stos medidas en pacientes no
pueden compararse con rangos normales. En el contexto del
monitoreo teraputico del frmaco, rangos teraputicos y
txicos son ms apropiados (aunque incluso estos trminos
deben interpretarse con cautela), mientras en el contexto del
envenenamiento, niveles de accin se utiliza para ayudar a
determinar el control apropiado.
Diferencias crticas
La discusin precedente se relaciona con la comparacin
de datos medidos con valores esperados basados sobre ob-
servaciones en otras personas. Cuando se repite una me-
dicin, es ms pertinente considerarla en relacin con el
valor anterior. La pregunta adecuada es si los dos valores
dieren signicativamente.
Esto depende de dos factores: la variabilidad innata del
parmetro que se mide, aun cuando las condiciones de
muestreo sean idnticas (variacin biolgica), y la varia-
cin analtica, es decir, el error concomitante inevitable en
cualquier medicin (no obstante, debe esperarse que sea
muy pequeo). Ambos pueden determinarse a partir de los
resultados de mediciones repetidas del mismo y de una
serie de muestras similares, y con una funcin conocida
como la diferencia crtica (CD) calculada con la ecuacin:
CD = 2.8 (SD
2
A
+ SD
2
B
)
, donde SD
A
y SD
B
son las
desviaciones estndares analticas y biolgicas, respecti-
vas. La CD indica la diferencia mnima entre dos valores,
que es improbable que ocurran como resultado de la varia-
cin biolgica y analtica en una probabilidad de 0.95 (p =
0.05). Si cualquier cambio es clnicamente signicativo es
otro asunto, pero sin duda que un cambio no puede consi-
derarse que es de importancia clnica potencial si es menor
que la CD.
El concepto de diferencia crtica no es ampliamente en-
tendido fuera de los laboratorios, aunque es fundamental
para el uso de los datos de laboratorio en el monitoreo de
la historia natural de la enfermedad y de la respuesta al
tratamiento. Los valores para algunas CD deben estar dis-
ponibles a partir del laboratorio local. Las diferencias crti-
cas son independientes de rangos normales. De hecho, dos
resultados pueden ser extremadamente diferentes aunque
ambos estn dentro del rango normal. Si se considera, por
ejemplo, un incremento en la concentracin de la creati-
nina srica desde 80 a 100 mol/L entonces la CD para
la creatinina en este rango de concentraciones es cerca de
17 mol/L. As, un aumento de 20 mol/L es de impor-
tancia clnica potencial (implicando una disminucin en la
funcin renal), aun cuando ambos valores estn dentro del
rango normal. Esta discusin acenta el hecho de que las
mediciones seriales en individuos pueden (y en la prctica
frecuentemente lo son) ser ms informativas que las medi-
ciones nicas.
Lmites de accin, valores del blanco, puntos
de corte y valores predictivos
Para algunas investigaciones de laboratorio, es apropiado
considerar los resultados contra los lmites de accin, es
decir, valores usados para determinar si una accin espe-
cca debe tomarse. Ejemplos obvios incluyen lmites de
accin de concentraciones de venenos para tratamiento di-
recto, como la concentracin de paracetamol srico para
indicar si el tratamiento con N-acetilcistena debe iniciarse
(o continuarse) para prevenir dao heptico. Muchos la-
boratorios tienen lmites de accin para determinar cmo
responden a un resultado; por lo comn, cuando un valor
anormal debe telefonearse al mdico que lo requiere, o
cuando una investigacin adicional se debe realizar para
obtener ms informacin, por ejemplo, accionar electrofo-
resis de protenas del suero para buscar una paraprotena
cuando la concentracin de globulina total de un paciente
es inesperadamente alta.
Debido a que para la mayor parte de los datos de la-
boratorio existe un traslape entre el rango de los valores
que normalmente se observan en la gente sana y los que se
producen en la enfermedad (sobre todo en las etapas ini-
ciales de esta ltima, o cuando es relativamente leve), la
seleccin de los puntos de accin es en particular crtica
cuando las pruebas se utilizan para el tamizaje (que detecta
la enfermedad subclnica). Fijando el lmite de accin (con
ms frecuencia llamado valor de corte en este contexto)
demasiado bajo signica que, mientras a todos los pacien-
tes con esta condicin se les diagnostica correctamente
usando la prueba, se mantiene, a expensas de una mala ca-
tegorizacin de un nmero signicativo de personas sanas,
a otros como posibles poseedores de la enfermedad (falsos
positivos). Fijando el valor de corte demasiado alto excluye
a todos los individuos sanos, pero algunos con la enferme-
dad no sern detectados (los falsos negativos; g. 38-3).
En el tamizaje para una condicin seria, pero en potencia
tratable, es deseable no tener ningn falso negativo (casos
errados). Un ejemplo clsico es el extenso programa de
Figura 38-3 Efecto del movimiento del punto de corte que de-
termina la positividad/negatividad de un resultado de la prueba.
Se muestran las distribuciones hipotticas para la concentracin
de un analito en pacientes con y sin enfermedad. Debido a que
stos se traslapan, si el corte se selecciona para disminuir la can-
tidad de resultados falsos positivos (y por tanto aumentar la es-
pecicidad) (a), hay cantidades signicativas de resultados falsos
negativos (sensibilidad disminuida). Si el corte se ja ms abajo
(b), los falsos negativos se eliminan (maximizando la sensibili-
dad) pero a expensas de aumentar el nmero de los falsos positi-
vos (disminuyendo as la especicidad). Las distribuciones de los
valores para individuos con enfermedad se muestran por debajo
del eje horizontal, para mayor especicidad
tamizaje neonatal para la fenilcetonuria y el hipotiroidismo
congnito. Debe enfatizarse que las pruebas de tamizaje
no son diagnsticas. Adems, en denitiva, las investiga-
ciones se requieren para establecer el diagnstico, y, en los
falsos positivos, para excluirlo.
El desempeo de las pruebas de tamizaje puede medir-
se calculando funciones que se conocen (en este contex-
to) como la sensibilidad (una medida de la capacidad de
la prueba de detectar a la gente que tiene la enfermedad)
y especicidad (una medida de su capacidad de identicar
a la gente que no la tiene) (cuadro 38-3). Tales clculos
requieren la identicacin conable de verdaderos y falsos
positivos y negativos, que a su vez necesitan un estndar
de oro o prueba de diagnstico denitiva que identique,
inequvocamente, la presencia o la ausencia de la enfer-
medad. El examen histolgico del tejido o el anlisis ge-
ntico molecular pueden proporcionar el estndar de oro,
pero algunas veces la positividad o negatividad verdaderas
pueden determinarse slo en retrospeccin, observando el
resultado.
Las cantidades de resultados positivos y negativos ver-
daderos y falsos pueden tambin utilizarse para calcular
el valor predictivo (PV) de un resultado positivo o nega-
tivo, es decir, la probabilidad de que una prueba positiva
(o negativa) clasique correctamente a la persona que se
examina.
Los conceptos de sensibilidad, de especicidad y de va-
lores predictivos pueden tambin utilizarse para describir el
desempeo de las pruebas hechas para propsitos de diag-
nstico, pero en este caso y en el tamizaje son importantes
para apreciar que slo pueden aplicarse con conanza en pa-
cientes similares a aquellos sobre quienes los datos fueron
derivados. Una prueba, por ejemplo para la artritis reuma-
toide puede parecer tener sensibilidad y especicidad altas
cuando se aplica a un grupo de pacientes con la enfermedad
establecida. Sin embargo, es probable que la sensibilidad
sea mucho ms baja en un grupo de personas en quienes la
enfermedad tuvo un predominio muy bajo, o en quienes tu-
vieron la enfermedad en un periodo ms temprano. Esto es
un inconveniente (y fuente frecuente de error) para el uso de
estos conceptos.
Cocientes de probabilidad
Estas funciones expresan la probabilidad de que un ha-
llazgo, por ejemplo un resultado de la prueba, ocurrira en
una persona con cierta condicin, en comparacin de sin
sta. El cociente de probabilidad (LR) para un resultado
positivo es LR
pos
= sensibilidad/(1especicidad). La pro-
babilidad que un resultado negativo ocurriera en una per-
sona con una condicin particular (LR
neg
), en comparacin
(b)
Cuadro 38-3 Sensibilidad, especicidad y el valor predictivo
de las pruebas
Resultado de la prueba
Positivo Negativo
Estado de la Positivo Verdadero Falso
enfermedad positivo (TP) negativo (FN)
Negativo Falso Verdadero
positivo (FP) negativo (TN)
Sensibilidad (positividad en la enfermedad) TP/(TP FN)
Especicidad (negatividad en la salud) TN/(TN FP)
Valor predictivo positivo (PV
) TP/(TP FP)
Valor predictivo negativo (PV
) TN(TN FN)
en una sin sta, est dada por LR
neg
= (1sensibilidad)/
especicidad). Los cocientes de probabilidad pueden uti-
lizarse para convertir la probabilidad de la preprueba (en
una prueba de tamizaje, sta ser el predominio de la con-
dicin en la poblacin que es tamizada) en la probabilidad
de posprueba de la condicin que est presente. Tales datos
es posible utilizarlos para el control directo y son de gran
valor en la auditora clnica.
Bioqumica clnica basada en evidencia
Los resultados bioqumicos y otros de prueba de labora-
torio deben interpretarse con cuidado. Muchas pruebas en
la actualidad disponibles proporcionan menos informa-
cin conable que es a menudo apreciada o asumida, no
usualmente debido a problemas analticos sino, ms bien,
a sensibilidad y especicidad escasas. Las nuevas pruebas
de diagnstico se desarrollan e introducen todo el tiem-
po, y por lo regular las promueven con mucho entusiasmo
los fabricantes de kits de prueba, con el apoyo de mdi-
cos que buscan un desempeo diagnstico mejorado. Su
evaluacin, sin embargo, es a menudo pobre. Lo ideal es
que todas las pruebas de laboratorio deben evaluarse con
un rigor similar al requerido antes de la introduccin de
nuevos tratamientos, de tal manera que puedan utilizarse
de forma racional, sobre la base de evidencia bien fundada
cientcamente.
Conclusin
Las pruebas bioqumicas se han vuelto una parte esencial de
la prctica mdica moderna. Tienen diversas aplicaciones po-
tenciales pero, en muchas, la facilidad con que ellas pueden
solicitarse y realizarse contradice su complejidad. Deben rea-
lizarse con cuidado e interpretarse a travs de una apreciacin
de los principios siolgicos y patolgicos fundamentales,
cualquiera que sea el propsito para el cual deben usarse.
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BIOQUMICA CLNICA BASADA EN EVIDENCIA 371
Introduccin
El inmunoensayo utiliza la reaccin antgeno-anticuerpo
como un medio de cuanticacin del antgeno o del anticuer-
po. La mayor parte de las aplicaciones en bioqumica clnica
utiliza la tcnica para cuanticar el antgeno, mientras en in-
munologa y microbiologa tambin se emplea para cuanti-
car (o detectar) el anticuerpo circulante. Los anticuerpos se
incrementan frente a una amplia variedad de sustancias. Las
molculas pequeas pueden hacerse inmunognicas por el
acoplamiento qumico a una molcula grande, como albmi-
na o polilisina, y son entonces conocidas como haptenos.
Diseo del ensayo
A pesar de la complejidad aparente de los mtodos que se
publican, hay dos diseos bsicos del ensayo: los mtodos
competitivos o limitados del anticuerpo, que usan el mar-
cado del antgeno con una molcula trazadora o reportera
y teniendo el inmunoensayo de titulacin genrica; y los
mtodos no competitivos o de exceso del anticuerpo, que
emplean anticuerpo marcado y teniendo el ensayo inmu-
nomtrico de titulacin genrica.
En un ensayo competitivo, el antgeno en la muestra (o
el estndar) compite con el marcado por los sitios de unin
en una cantidad limitada de anticuerpo. Es esencial que la
cantidad de anticuerpo sea insuciente para ligar todo el
antgeno marcado, de modo que la competicin por los si-
tios de unin ocurra. En equilibrio la cantidad del antgeno
marcado ligado al anticuerpo est inversamente relaciona-
do con la cantidad del antgeno sin marcar en la muestra o
el control estndar. La determinacin del marcador en la
fraccin ligada aporta una medida de la cantidad de antge-
no, en la comparacin de una curva de calibracin:
Ag Ag* Ab AgAb Ag*Ab Ag*
estado inicial estado nal
Para determinar la cantidad de antgeno marcado en la
fraccin ligada (o libre), estas fracciones deben separarse,
excepto en los casos raros donde la seal del marcador es
modicada por la unin del antgeno marcado al anticuerpo.
En un ensayo inmunomtrico o no competitivo, las con-
diciones son tales que el antgeno puede reaccionar con un
exceso del anticuerpo marcado. El anticuerpo sin reaccio-
nar entonces se separa, y la cantidad del anticuerpo marca-
do ligado al antgeno se mide:
Ag Ab* AgAb* Ab*
Este diseo simple es la base para un nmero de forma-
tos ms complejos. Los antgenos que son molculas gran-
des pueden reaccionar con otro anticuerpo, denominado el
anticuerpo de captura, dirigido contra un eptopo diferente
y espacialmente distinto sobre la molcula del antgeno, y
usualmente enlazado a una fase slida:
Ab
1
Ag Ab
2
* Ab
1
AgAb
2
* Ab
1
Ab
2
*
donde Ab
1
anticuerpo de captura, Ab
2
* anticuerpo
marcado.
Este diseo del ensayo es el llamado ensayo inmunom-
trico sndwich, o ensayo inmunoenzimtico de dos sitios,
y es el ms utilizado en la actualidad para el ensayo de
39
Inmunoensayo en bioqumica clnica
Joan Butler y Susan M Chambers
374 CAP. 39 INMUNOENSAYO EN BIOQUMICA CLNICA
polipptidos. El antgeno debe ser bastante grande para la
unin simultnea de dos anticuerpos. La adicin del anti-
cuerpo a la muestra puede ser simultnea (formato de un
paso) o secuencial (con la eliminacin de la muestra antes
de la adicin del anticuerpo marcado, un formato de dos
pasos). Es posible utilizar ms de un anticuerpo de captura
o marcado, dando un ensayo de varios sitios.
Al requerir dos eptopos distintos pero conectados, el
diseo del ensayo con dos sitios ofrece una especicidad
considerable mayor que un diseo competitivo de un solo
anticuerpo. Aunque los antisueros policlonales pueden uti-
lizarse en ensayos sndwich, este diseo entr en uso ge-
neral slo cuando los anticuerpos monoclonales llegaron a
estar disponibles.
En los ensayos inmunomtricos para los antgenos pe-
queos, el anticuerpo marcado sin reaccionar es frecuen-
te que sea eliminado por la adicin del antgeno acoplado
a una fase slida. La unin a una fase slida deteriora la
reactividad y el antgeno acoplado, por tanto, no competir
con el antgeno libre de la muestra. De forma alternativa,
puede utilizarse el anticuerpo especco para el complejo
del hapteno y el anticuerpo antiantgeno, y no reactivo a
cualesquiera de estos componentes por separado (complejo
antiinmunitario o anticuerpo antimetatipo):
Ag Ab
1
AgAb
1
Ab
1
Ab
2
* AgAb
1
Ab
2
*
Ab
1
Ab
2
*
donde Ab
1
anti-Ag, Ab
2
anti-(AgAb
1
).
Con este formato se muestra la diferencia fundamental
entre los inmunoensayos competitivos y el de exceso de
anticuerpos; el primero mide la seal a partir del anticuer-
po no ligado al antgeno y el ltimo, la seal del anticuerpo
ligado al antgeno u ocupacin del anticuerpo; por lo tanto
es ms sensible, puesto que es ms fcil distinguir un n-
mero pequeo desde cero que uno grande de un nmero
levemente ms elevado. Por otra parte, los mtodos de ex-
ceso de anticuerpos son ms rpidos, se afectan menos por
las variaciones en calidad y cantidad del reactivo y pueden
tener un rango de funcionamiento ms amplio. La gura
39-1 muestra las curvas de calibracin comunes para un in-
munoensayo competitivo y uno inmunomtrico con dos sitios.
Condiciones del ensayo y calibradores
La concentracin del anticuerpo o de los anticuerpos que
se elige para optimizar el rango de funcionamiento del
ensayo para su propsito clnico, en general, iguales con-
centraciones, ms bajas, del anticuerpo y del antgeno. La
parte inclinada de la curva estndar y el rango de precisin
ms alto deben corresponder al rango de la concentracin so-
bre el que los valores son requeridos clnicamente. Se dedu-
ce que el rango de funcionamiento tiene limitaciones, por
ejemplo, en el ensayo de gonadotropina corinica humana,
que se disea para la oncologa, no es til en la determina-
cin de concentraciones en el embarazo.
Muchos factores, adems de las cantidades de los reacti-
vos deben controlarse dentro de y entre los lotes para mante-
ner la optimizacin de un ensayo. La cintica de la reaccin
y la posicin de equilibrio dependen de la temperatura, pH y
fuerza inica. La reactividad cruzada de molculas que tiene
una relacin estructural tambin ser afectada por los cam-
bios en estas variables. En la medida de lo posible, estos fac-
tores, en especial la matriz de la muestra, deben mantenerse
constantes. Si a una reaccin no se le permite alcanzar el
equilibrio, la falta de constancia de la sincronizacin puede
conducir a una desviacin, es decir, a un error sistemtico en
el resultado, de acuerdo con la posicin de la muestra en el
lote. En analizadores automticos estos factores pueden con-
trolarse de manera precisa, conduciendo a la consistencia de
resultados en y entre laboratorios.
Los reactivos para calibrar o los estndares pueden plan-
tear una dicultad especial en el inmunoensayo, puesto
que para muchas sustancias no hay un sistema de ensayo
alternativo practicable. En el caso del polipptido de las
Figura 39-1 Curvas estndar tpicas para a) un inmunoensayo
competitivo, b) un ensayo inmunomtrico con dos sitios.
MARCADORES 375
hormonas, hasta el advenimiento de la tecnologa del DNA
recombinante no era posible preparar suciente material
puricado para la medicin por mtodos sicoqumicos y
de esta forma obtener calibradores para el inmunoensayo.
Por esta razn, se adoptaron los estndares internacionales
preparados para los bioensayos en los inmunoensayos, con
el valor asignado como el consenso de estudios de colabo-
racin que usan diferentes sistemas de bioensayos. Estos
estndares contienen algunos microgramos de antgeno o
problema con miligramos de albmina transportadora y de
excipientes; y los mtodos absolutos de anlisis, como el
del aminocido, no pueden utilizarse. Los ensayos de la hor-
mona del crecimiento y de la prolactina en Estados Unidos
estn calibrados inadecuadamente en trminos de masa.
La heterogeneidad inherente de la glucoprotena de las
hormonas es una barrera importante para la estandariza-
cin, y condujo a diferir los cocientes de bioactividad/in-
munoactividad en los estndares internacionales sucesivos.
El uso de estndares internacionales tiende a minimizar,
pero no elimina, las diferencias entre los ensayos. Los
materiales de referencia, estndares basados en el suero,
o los certicados, no se utilizan como calibrantes prima-
rios, puesto que los inmunoensayos estn sujetos a efectos
de la matriz. El ltimo objetivo es calibrar los ensayos de
protena en trminos de masa o molaridad, un desafo para
muchos antgenos. Para una discusin de las dicultades de
la calibracin, vase Bristow, 1998; Stenman, 2001.
Marcadores
Muchos diferentes tipos de molculas tipo marcador o re-
portera se usan en la actualidad. Los procedimientos de mar-
caje se disean para no deteriorar la unin de la molcula
marcada a su anticuerpo o antgeno apropiado. La medicin
(deteccin) del marcador puede requerir otros reactivos o
un equipo muy especializado, o ambos. Los tipos de marca-
dor que ms se emplean se listan en el cuadro 39-1.
Los radioistopos son fcilmente detectables, pero el
peligro que representan es una desventaja, adems se re-
quiere de procedimientos especcos de manipulacin y de
eliminacin. Tambin tienen una vida til corta, ya que la
molcula marcada se daa por decaimiento radiactivo. Con
el advenimiento de la automatizacin, han llegado a restrin-
girse a ensayos ms especializados y de bajo volumen.
La polarizacin de la uorescencia slo es conveniente
para valorar haptenos pequeos y de frmacos, pero otros
mtodos uorescentes se aplican a un amplio rango de ant-
genos. Los uorforos utilizados con ms frecuencia inclu-
yen la uorescena, la umbeliferona, el luminol y los metales
raros. Las tcnicas de uorescencia de tiempo resuelto usan
quelatos de lantnido, que producen una uorescencia rela-
tiva duradera; la sensibilidad se mejora tomando las lecturas
despus que la uorescencia de fondo de corta duracin pro-
ducida por los componentes endgenos de la muestra ha de-
cado. La sensibilidad tambin se incrementa por el cambio
de Stokes amplio de los quelatos de lantnido (es decir, la di-
ferencia en la longitud de onda entre los picos de excitacin
y de emisin) y sus mximos de emisin muy estrechos, que
reducen la uorescencia del fondo. El marcado mltiple,
empleando diferentes lantnidos, es tambin posible, y ofre-
ce gran potencial para el anlisis multiplexado y miniaturi-
zado. Los iones del lantnido son tambin un componente
de los marcadores de criptato; los iones se incluyen dentro de
una molcula orgnica grande como jaula, un criptando, y
el criptato que resulta es muy estable e inerte. La tcnica de
emisin amplicada de tiempo resuelto del criptato se basa en
la transferencia no radiactiva amplicada de la energa desde
un donante uorescente (el criptato) a una molcula acepto-
ra espacialmente prxima. As, el marcador ligado y libre
puede distinguirse por sus espectros de emisin, permitien-
do un sistema de ensayo homogneo aplicable a molculas
grandes y pequeas.
En la quimioluminiscencia, la molcula excitada se pro-
duce por una reaccin qumica; los sustratos quimiolumi-
niscentes producen fotones (luz), por lo general con una
reaccin oxidativa. En la electroquimioluminiscencia, la
emisin de luz se inicia electrnicamente al aplicar un vol-
taje a la solucin de la reaccin, eliminando los problemas
relacionados con la adicin y mezcla del reactivo.
El marcaje con enzimas y la deteccin con sustratos que
dan puntos nales colorimtricos, ndices colorimtricos,
uorimtricos o quimioluminimtricos aportan mayor sen-
sibilidad y un rango ms amplio de funcionamiento. Esta
tcnica, cuando se aplica con uorescencia o quimiolumi-
niscencia, se describe como enzima realzada o enzima
amplicada. Una forma de ensayo de fase slida heterog-
nea que ha conseguido aplicacin extensa en muchos siste-
mas antgeno-anticuerpo es el ensayo de inmunoabsorcin
ligado a enzimas, o ELISA. La muestra primero se incuba
Cuadro 39-1 Tipos de marcador de uso corriente
Radioistopos
Quimioluminiscencia
Quimioluminiscencia incrementada
Electroquimioluminiscencia
Fluorescencia
Fluorescencia de tiempo resuelto
Enzimas
Colorimetra, colorimetra cintica
Fluorescencia
Quimioluminiscencia
Amplicacin (cascadas)
con un anticuerpo que est unido a una fase slida (por lo co-
mn sobre una placa de microtitulacin), entonces cualquier
antgeno no ligado se elimina por lavado, despus, se agrega
un segundo anticuerpo acoplado a una enzima. La actividad
de la enzima unida a la fase slida es proporcional a la con-
centracin del antgeno capturado (es decir, el antgeno).
La bsqueda para el marcador ideal contina (vase
Kricka, 1994); los estudios de desarrollo biotecnolgico
recientes incluyen marcadores particulares con tamaos
submicromtricos acoplados a los agentes de unin espec-
ca, que ofrecen mayor sensibilidad.
Ensayos homogneos
El trmino homogneo se utiliza para los inmunoensayos
en los cuales no se requiere la separacin del marcador ligado
o libre. En tales sistemas la seal es modicada por la unin
del anticuerpo, con lo que resulta que el marcador ligado o
libre puede distinguirse en la mezcla de reaccin, por ejem-
plo, la unin del antgeno marcado con enzima al anticuerpo
puede inhibir la actividad de la enzima, por impedimento es-
trico o induciendo cambio de conformacin del sitio activo.
Este sistema (EMIT
, tcnica de inmunoensayo multiplicado

por enzimas, Syva) puede utilizarse en analizadores de qu-
mica; en la prctica se emplea ampliamente para la medicin
de frmacos. La polarizacin de la uorescencia tambin se
usa para los ensayos de frmacos. Otro ejemplo es el inmu-
noensayo turbidimtrico para las molculas pequeas, en los
cuales la unin del anticuerpo cruzada con las partculas de
ltex revestidas con el antgeno es inhibida por el antgeno
libre de la muestra, causando una disminucin en la turbie-
dad. Si el antgeno es una molcula grande y en la concentra-
cin es sucientemente alta, la formacin de los complejos
antgeno-anticuerpo puede medirse por nefelometra y no
es necesario el marcador. Los ensayos homogneos para los
antgenos grandes y pequeos son factibles con los criptatos
recin desarrollados (vase la seccin sobre Marcadores). Al-
gunos tipos de ensayo homogneo disponibles se describen
en el cuadro 39-2. Sin embargo, la mayora de estas tcnicas
casi no se aplican, y gran parte de los inmunoensayos son del
tipo heterogneo, en el cual se requiere de la separacin del
marcador ligado y libre.
Mtodos de separacin
Cualquier tcnica para separar el antgeno ligado del libre o
del anticuerpo no debe perturbar la reaccin primaria.
La diferencia en el tamao molecular entre el antgeno
libre y el ligado al anticuerpo se aprovecha en los primeros
sistemas, como en la precipitacin de la protena con sul-
fato de amonio o polietilenglicol y la adsorcin del antge-
no libre con carbn vegetal. La separacin inmunolgica a
travs del uso de un anticuerpo antiespecie result mucho
ms conable. Por ejemplo, ya que los anticuerpos son bi-
o multivalentes, si el anticuerpo primario fue elevado en
un conejo, los anticuerpos para las inmunoglobulinas del
conejo elevados en un burro producirn complejos con
las inmunoglobulinas del conejo que son sucientemente
grandes e insolubles para formar un precipitado. Algn
suero o inmunoglobulinas de un conejo no inmunizado
(suero portador) se agrega regularmente para asegurar la
precipitacin. Tales reactivos son de aplicabilidad general.
Este sistema de separacin (en el ejemplo del anticonejo
del burro) se llama un anticuerpo secundario, y los ensa-
yos que lo usan, mtodos de doble anticuerpo, aunque este
nombre en ocasiones tambin se utiliza para describir un
ensayo con dos sitios. La formacin del precipitado del an-
ticuerpo secundario es lenta, por tanto, en estos ensayos es
frecuente que se deje que ocurra el precipitado toda la no-
che, pero esta etapa puede acortarse en forma considerable
agregando polietilenglicol. Despus de la centrifugacin, el
sobrenadante es removido por aspiracin o decantacin,
procedimientos que requieren habilidad y experiencia con
los precipitados muy pequeos que se producen.
Mtodos de separacin en fase slida
Estas tcnicas, que han reemplazado en gran parte al res-
to de los mtodos, implican ligar los reactivos a las fases
slidas por unin covalente o por adsorcin. La fase slida
puede ser la pared de un tubo plstico, la celdilla de una
placa de microtitulacin o la supercie de perlas grandes o
de partculas pequeas. Las partculas con una base mag-
netizable ofrecen separacin excepcionalmente rpida y
eciente. La separacin es por decantacin simple y conve-
niente o aspiracin de la fase lquida, seguida normalmente
por el lavado de la fase slida con amortiguador para ase-
gurar la terminacin de la separacin y reducir la unin no
especca (la unin evidente en ausencia del anticuerpo).
El ensayo simultneo de dos o ms antgenos es factible
ahora con la instrumentacin capaz de separar las mezclas
Cuadro 39-2 Inmunoensayos homogneos
Inhibicin o activacin enzimtica (EMIT
)
Polarizacin de la uorescencia
Transferencia de energa no radiactiva (+ uorescencia de
tiempo resuelto)
Nefelometra
Turbidimetra
de perlas revestidas de anticuerpos dentro de grupos codi-
cados con una tincin especca para el antgeno en la
etapa nal del ensayo de medicin separada. Tal sistema
permite, por ejemplo, el inmunoensayo de mltiples ant-
genos en un solo punto Guthrie para el tamizaje neonatal.
La fase slida puede ser un reactivo multipropsito,
realizado al cubrir con el segundo anticuerpo o con estrep-
tavidina, un reactivo especco que se acopla con biotina,
la cual tiene una anidad muy alta con la estreptavidi-
na. Otros pares incluyen uorescena con antiuorescena.
Esta tcnica tiene la ventaja adicional de que las reacciones
especcas ocurren en la fase lquida. El acoplamiento a una
fase slida disminuye la anidad de un anticuerpo y la velo-
cidad de reaccin, y puede alterar otras caractersticas. Las
tcnicas en fase slida tambin permiten variaciones del
protocolo del ensayo de la forma bsica de la adicin simul-
tnea de todos los reactivos a la muestra. Tales variaciones
pueden resultar en el incremento de la especicidad y otras
mejoras. Los reactivos inmovilizados sobre tiras de papel
forman la base de las pruebas con tira reactiva, por ejemplo,
para la prueba del embarazo. Otros dispositivos tambin
disponibles para inmunoensayo en el lugar de atencin in-
cluyen pruebas para los marcadores cardiacos y frmacos.
Automatizacin
La automatizacin de los inmunoensayos requiere la apli-
cacin de una tcnica muy exigente debido a la necesidad
de la separacin de los marcadores ligado y libre en la ma-
yor parte de los mtodos. Los primeros instrumentos eran
analizadores de lote que usaban un solo formato del ensayo
homogneo, para un nmero limitado de antgenos. Los sis-
temas actuales de alto rendimiento, totalmente automticos,
disponibles a nales de la dcada de 1980, pueden ser anali-
zadores de lote u ofrecer el acceso aleatorio con calibracin
poco frecuente (con intervalos de semanas o de meses) deri-
vada de un nivel alto de estabilidad del instrumento y de los
reactivos. El acceso aleatorio evita la necesidad del muestreo
por lotes incluso para las pruebas solicitadas con poca fre-
cuencia y da tiempos de espera cortos. Formatos de ensayos
diferentes, pero con un sistema comn de medicin, pueden
incluirse en un solo instrumento. La sincronizacin exacta
permite tiempos de reaccin cortos sin la incubacin para
el equilibrio. La precisin debe ser siempre superior que
la de los ensayos manuales, pero diere considerablemente
entre los diferentes tipos de instrumento. Las desventajas
inherentes son la complejidad y la inexibilidad.
Miniaturizacin
Los desarrollos en otras disciplinas han permitido la miniatu-
rizacin de los dispositivos del inmunoensayo. A la placa de
microtitulacin de 96 celdillas pueden sucederle placas de
alta densidad con muchos mltiplos de este nmero, requi-
riendo sistemas especializados de manipulacin del lquido
para los volmenes muy pequeos de muestra y de reactivos.
De inters particular en reas de la medicina, donde una gran
cantidad de pacientes requiere series idnticas de pruebas,
como en el tamizaje de frmacos o del marcador tumoral,
es el desarrollo de sistemas que usen microarreglos de reac-
tivos. Tal microarreglo consiste en microgotas discretas
mltiples del reactivo impresas o formadas de otra manera
en un soporte inerte (p. ej., un arreglo de puntos de 5 5
sobre un sustrato o chip de 1 1 cm, o un arreglo de 8 8 en
cada celdilla de una placa estndar de microtitulacin). Para
el inmunoensayo el reactivo inmovilizado es normalmente
un anticuerpo especco, y cada microgota puede ser un an-
ticuerpo diferente, permitiendo la estimacin simultnea de
antgenos. La incubacin con la muestra y una mezcla de los
otros reactivos especcos y el resto del procedimiento del
inmunoensayo, se lleva a cabo de manera normal, y la seal
(con frecuencia uorescencia o quimioluminiscencia) es de-
tectada o registrada con un dispositivo de cmara fotogrca
digital. Algunas microgotas en el arreglo pueden disearse
para detectar interferencias en la muestra, por ejemplo, anti-
cuerpos heteroflicos, y para garantizar el control de calidad
de los reactivos, un nivel de inspeccin de calidad no se lo-
gra fcilmente en sistemas ms simples. Estos dispositivos
ofrecen ahorros sustanciales de la muestra, de los reactivos
y del tiempo comparados con los sistemas automticos con-
vencionales.
En el futuro, los microchips completamente integrados
al inmunoensayo pueden llegar a estar disponibles, conte-
niendo estructuras microfabricadas capaces de llevar a cabo
todos los pasos de la preparacin de la muestra para la detec-
cin de la seal. Para una descripcin de los logros en el in-
munoensayo con microchip, vase Kricka y Wilding (1998),
y para un estudio de la literatura sobre el desarrollo de la
miniaturizacin en general, vase Kricka y Fortina (2001).
Clculo de los resultados
Ya que la curva de calibracin para el inmunoensayo (una
representacin del marcador ligado contra la concentracin
del antgeno) no es una lnea recta, ajustar una curva a los
datos, con su imprecisin concomitante, es una cuestin de
juicio. Varias manipulaciones empricas se han empleado
para hacer parte o la totalidad del grco lineal. El mar-
cador ligado (o el porcentaje ligado si la cantidad total del
marcador adicionado es conocida) en comparacin con la
concentracin o log de concentracin; el log del marca-
dor ligado contra el log de concentracin, y las grcas
logit-log se utilizan normalmente ([logit = log{(B/B
0
)/L
(B/B
0
)}], donde B
0
= marcador ligado en el calibrador
CLCULO DE LOS RESULTADOS 377
cero). Los papeles gracados lin-log, log-log y logit-log se
encuentran disponibles. Los instrumentos modernos dise-
ados para el inmunoensayo tienen programas de compu-
tadora para ajustar la curva, incluyendo mtodos complejos
como ajustes de la curva por Spline cbico o por log-logs-
tico de cuatro parmetros.
Exactitud y precisin
La exactitud del resultado de un ensayo es la proximidad
a la concentracin verdadera del antgeno; para muchas
sustancias an es tema de investigacin y discusin. La
precisin es la variabilidad del resultado que se obtiene, y
la imprecisin se puede minimizar por el uso de reactivos
apropiados, por ejemplo, un marcador con detectabilidad
superior, con la reduccin del nmero de pasos y con el
control estrecho de la tcnica. El control de calidad inter-
no proporciona informacin slo sobre la imprecisin. Los
ensayos manuales se realizan por duplicado. La impreci-
sin vara con la concentracin del antgeno. Un ejemplo
tpico se muestra en la gura 39-2.
cero en un solo lote. Esto a veces se denomina sensibilidad
analtica. Ms realista pueden ser el uso de SD entre lote,
y el suero antgeno libre, dando el lmite biolgico de de-
teccin. Otros utilizan la concentracin en la cual el CV
entre lote es de 20% en las muestras biolgicas, para un
valor denominado sensibilidad funcional.
Cuando el trmino sensible se utiliza en la descrip-
cin de un ensayo, implica no slo que las concentracio-
nes bajas del antgeno pueden distinguirse desde cero, o
la ausencia del antgeno, sino tambin que la precisin a
niveles bajos es bastante buena para los cambios pequeos
en concentraciones bajas del antgeno para medirse cona-
blemente. Esto es en particular importante en el campo de
los marcadores tumorales.
Ntese que sensibilidad tiene signicados alternativos;
es tambin la pendiente de la curva estndar en cualquier
concentracin, y la sensibilidad clnica es una medida de la
capacidad de una prueba para detectar la presencia de una
enfermedad.
Control de calidad
El control de calidad interno (CCI) proporciona informacin
sobre la precisin dentro de y entre los ensayos, y sobre la
variabilidad de la calidad del reactivo, pero no de la exactitud
ni validez, o errores con, o interferencia en, las muestras indi-
viduales. El CCI requiere materiales de composicin similar
(antgeno y matriz) para las muestras clnicas en suciente
cantidad para el uso repetido dentro de y entre los lotes de
un ensayo, o para el uso a largo plazo en un analizador au-
tomatizado. Los materiales lquidos por lo comn se alma-
cenan congelados. Los materiales comerciales de control de
calidad se suministran liolizados. Durante la liolizacin (y
el almacenaje subsiguiente) algunos componentes se pueden
daar, por ejemplo, los antgenos inestables o las protenas de
unin para los esteroides. Las concentraciones del antgeno
elegido para los materiales del control de calidad (con valores
bajos, medios y altos) deben corresponder a los puntos signi-
cativos del ensayo, como en los puntos de decisin clnicos,
pero evitarse las reas de alta imprecisin, que hagan la inter-
pretacin difcil. Con los materiales comerciales del control
de calidad se consiguen los valores requeridos por el uso de
suero tratado y la adicin del antgeno, que pueden limitar la
similitud con las muestras clnicas. Los materiales de origen
humano deben utilizarse.
El registro continuo de los resultados del CCI es esen-
cial; la demostracin del desempeo aceptable se requie-
re para la acreditacin del laboratorio, y los registros pueden
tambin ser invaluables en la localizacin y resolucin de
problemas (en el local o por el fabricante). El software del
ICC se suministra en los instrumentos automatizados pero
puede no ser ideal, haciendo necesaria la transferencia de
Figura 39-2 Un perl de precisin tpico.
El rango de concentracin de imprecisin baja debe, ideal-
mente, igualar el rango sobre el cual los resultados clnicos
se obtienen, y la imprecisin ser apropiada para una utilidad
clnica de los resultados. Algunos trabajadores denen el ran-
go de funcionamiento de un ensayo como aquel sobre el cual
el coeciente de variacin (CV) es menor de 10%.
La sensibilidad o la concentracin mnima perceptible
puede denirse de varias maneras, por ejemplo, como la
concentracin que corresponde a 2, 2.5 o 3 desviaciones
estndar (SD) de la seal del calibrador cero arriba de (para
los ensayos inmunomtricos) o debajo (para los ensayos
competitivos) del valor medio para el calibrador cero, la
SD que se obtiene de, digamos, 20 rplicas del calibrador
datos a un sistema o programa alternativo. Para las normas
sobre el uso de los resultados del control de calidad, vase
Westgard (2005) y Price & Newman (1997).
Los esquemas externos de la garanta de calidad (EEGC)
intentan aportar informacin sobre la comparabilidad de m-
todos e investigar la validez, va recuperacin del estndar
agregado, linearidad en la dilucin, especicidad, rendimien-
to con el suero bajo antgeno, interferencia y otros factores.
Tales esquemas estn disponibles slo para los ensayos esta-
blecidos, y es comn en los laboratorios que ensayan com-
puestos esotricos, posiblemente con poca frecuencia, para
cambiar muestras para la comparacin y el reaseguramiento.
Especicidad, reactividad cruzada
e interferencia
La alta especicidad del sitio de unin de un anticuerpo
para su antgeno es una ventaja principal de los inmunoen-
sayos. Un solo eptopo en una molcula compleja puede
involucrar aminocidos espacialmente prximos slo en
la estructura terciaria o cuaternaria de la molcula, y un
anticuerpo para tal eptopo, por tanto, no reacciona con las
formas o los fragmentos desnaturalizados. Sin embargo, un
antisuero policlonal contiene anticuerpos de anidades y
de especicidades que dieren. Si la preparacin del ant-
geno que se utiliza para la inmunizacin es impura, enton-
ces el antisuero contiene anticuerpos para las impurezas, y
la falta resultante de especicidad compromete la validez
del ensayo, sobre todo si el calibrante y el marcador son
tambin impuros. La seleccin de los anticuerpos mono-
clonales puede minimizar la reactividad cruzada, pero las
molculas que se relacionan de manera estrecha pueden aun
ser reconocidas por el anticuerpo, en especial en el caso de
molculas pequeas, tales como esteroides y frmacos.
La hiperespecicidad de un ensayo puede ocurrir si un
anticuerpo monoclonal se dirige a un eptopo, que ocurre
en algunas formas biolgicamente activas de un antgeno
heterogneo.
La reactividad cruzada en un ensayo competitivo se de-
ne de manera arbitraria como aquella concentracin del
reactivo cruzado que emite 50% de la seal encontrada en
ausencia del antgeno, que se expresa como porcentaje de
la concentracin del antgeno que emite la misma seal. La
reactividad cruzada medida vara en diferentes puntos de
la curva dosis-respuesta, y tambin con la presencia o la
ausencia del antgeno, y con el formato del ensayo y las con-
diciones de la reaccin, como temperatura y tiempo de in-
cubacin. Es, por tanto, imposible calcular la concentracin
verdadera del antgeno en presencia de una reaccin cruza-
da, aun si la reactividad cruzada se conoce. La interferencia
negativa en ciertos diseos del ensayo de reactivos cruzados
en los que se incluyen varios frmacos de uso corrien-
ESPECIFICIDAD, REACTIVIDAD CRUZADA E INTERFERENCIA 379
te se reconocen hoy como un problema potencial serio en
la vigilancia de la digoxina (Valdes y Jortani, 2002).
En ensayos inmunomtricos con dos sitios es importante
probar los reactivos cruzados potenciales en ausencia y en
presencia del antgeno, puesto que el reactivo cruzado puede
reaccionar con cualquiera de los dos o con ambos anticuer-
pos. La reaccin de stos dar un aumento en la seal, mien-
tras la reaccin con uno puede producir una disminucin en
la seal con altas concentraciones del reactivo cruzado, que
se pueden detectar slo en presencia del antgeno.
La reactividad cruzada de compuestos conjugados o me-
tabolitos con estructuras relacionadas es un problema espe-
cco con los ensayos de esteroides. En algunos casos, por
ejemplo, el cortisol y la testosterona en plasma, un mtodo
directo se utiliza de rutina (aunque las limitaciones deben
considerarse). En otros, con el cortisol en la orina, se requie-
re un paso preanaltico de extraccin en algunos ensayos,
pero hay casos en los cuales esto es esencial, por ejemplo,
para eliminar los reactivos cruzados potenciales cuando se
ensaya la 17-hidroxiprogesterona en los infantes que se sos-
pecha un diagnstico de hiperplasia suprarrenal congnita.
La interferencia de sustancias aparentemente sin relacin
en muestras clnicas puede ocurrir de distintas maneras. La
sustancia, mal caracterizada, denominada inmunorreacti-
va parecida a la digoxina, que se administra en el suero
de pacientes en ciertas condiciones, sin tomar en cuenta la
terapia con digoxina, da resultados falsamente altos en los
ensayos con digoxina, y parece ser una reactividad cruzada
fortuita. Los autoanticuerpos pueden interferir al contribuir
con el antgeno del ensayo el cual in vivo es secuestrado
por el autoanticuerpo y, por tanto, es biolgicamente inac-
tivo, como en el caso de la macroprolactina. De manera al-
terna, los autoanticuerpos pueden participar en la reaccin
del ensayo; el efecto sobre el resultado depende del dise-
o del ensayo (p. ej., antitriyodotironina y antitiroxina en
los ensayos para las hormonas tiroideas libres). Para algu-
nos antgenos, la aparicin de la interferencia de los au-
toanticuerpos es muy frecuente para requerir el tamizaje de
las muestras, por ejemplo, para el ensayo de tiroglobulina,
o el reensayo despus de la eliminacin del autoanticuerpo,
por ejemplo, la prolactina.
La unin del complemento puede conducir a la destruc-
cin del complejo antgeno-anticuerpo. Este efecto puede
prevenirse con la adicin de EDTA para quelar los iones
del calcio. Los anticuerpos antianimal, los de suero huma-
no para inmunoglobulinas de otras especies, por ejemplo,
anticuerpos humanos antirratn (HAMA) y los heterofli-
cos, ahora se conoce que ocurren en una proporcin alta
de pacientes; los HAMA que estn presentes en cantidades
grandes en los pacientes proporcionan anticuerpos mono-
clonales para estudios por imgenes y propsitos teraputi-
cos. Los anticuerpos antianimal y probablemente tambin
el factor reumatoide pueden ligar un solo anticuerpo, re-
duciendo su anidad para su antgeno, o lograr el enlace
cruzado de dos anticuerpos, de tal modo se imita al ant-
geno. Las concentraciones muy altas pueden producir in-
terferencia negativa de una manera anloga al efecto de
gancho por dosis alta. Estos efectos pueden bloquearse
por la adicin de inmunoglobulinas de la misma especie
animal que los anticuerpos reactivos. Los fabricantes de
equipo ahora incluyen de rutina inmunoglobulinas de ratn
y de otra especie y anticuerpos bloqueadores especcos en
formulaciones del reactivo con el anticuerpo.
Una prueba simple para detectar la presencia de un in-
terferente se realiza examinando la linealidad en la dilu-
cin con un diluyente de matriz similar. La falta de linea-
lidad sugiere un problema, aunque la buena linealidad no
excluye alguno.
Para una revisin de todos los tipos de interferencia,
vase Selby (1999).
Efecto de gancho por dosis alta
En un ensayo inmunomtrico de dos sitios con la adicin
simultnea de dos anticuerpos a la muestra (un ensayo de
un solo paso), cuando la concentracin del antgeno es muy
alta y los anticuerpos no son muy superiores, la unin cru-
zada de los anticuerpos de captura y marcados por el ant-
geno decrecen, con los sitios de unin en cada anticuerpo
ocupados por las molculas separadas del antgeno. La se-
al que se observa, por tanto, es dbil. En concentraciones
extremas altas de antgeno, la seal puede caer por debajo
de la del calibrador superior y un resultado falso bajo se
lee (g. 39-3). Este fenmeno se conoce como efecto de
gancho por dosis alta, o respuesta bifsica, y es importan-
te slo para aquellos antgenos que ocurren clnicamente
en un rango de concentracin de varios rdenes de magni-
tud, como se observa para los marcadores tumorales como
la gonadotropina corinica humana, la -fetoprotena y la
prolactina. La posicin de gancho depende de las concen-
traciones de los anticuerpos.
Es difcil mantener la vigilancia constante para la pre-
sencia posible de este efecto, pero como un incorrecto
(quizs en apariencia normal) resultado puede conducir
a que se tome la accin inadecuada y posiblemente perjudi-
cial, cada esfuerzo prctico debe realizarse. La dilucin de
rutina de las muestras con valores en la parte superior de la
curva estndar, o aquellas con la informacin clnica apro-
piada, por ejemplo, tumor hiposario grande, se utiliza a
veces. Los dispositivos individuales, como aquellos para la
prueba de embarazo, son tambin vulnerables. El efecto
de gancho puede evitarse usando un formato de dos pasos,
en el cual la muestra se incuba con el anticuerpo de cap-
tura en fase slida, el exceso del antgeno se elimina con
lavado y el anticuerpo marcado se adiciona despus. En
este formato, las concentraciones muy altas se leen como
ms grande que el calibrador superior, sin la indicacin
de cunto ms grande. Sin embargo, el paso adicional au-
menta la imprecisin total del ensayo, un factor de cierta
importancia para los marcadores tumorales. Los sistemas
que pueden emplear una lectura cintica muy temprana en
el tiempo de reaccin permiten una estimacin del resul-
tado nal, la dilucin automtica y el reensayo, con lo que
se elimina prcticamente este problema.
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Figura 39-3 El efecto de gancho por dosis alta, x = concen-
tracin del calibrador ms alto; y = concentracin arriba de la cual
valores falsos bajos se obtienen en muestras sin diluir.
Introduccin
La mayor parte de las formas convencionales de medicin
de la bioqumica clnica se basan en la produccin de un
compuesto coloreado. La electroqumica diere en que la
medicin est fundamentada en la generacin de un voltaje
(potencial) o corriente, y el sistema que la mide es un volt-
metro o un ampermetro en lugar de un fotmetro.
Un detector electroqumico, que responde especca-
mente a un analito, se llama electrodo ion-selectivo (ISE).
Los primeros electrodos reaccionaron a los iones, de ah el
nombre, pero en los ltimos adelantos, stos se han desa-
rrollado para responder a metabolitos como glucosa y urea
aunque se incluyen normalmente en la misma categora
porque comparten una tecnologa comn. Los sensores de
glucosa que se usan en reas clnicas son con frecuencia
dispositivos de ISE, y todos los analizadores de cuidado
crtico se basan en la tecnologa de ISE.
El fundamento de funcin de los ISE es que ellos pro-
ducen una respuesta potenciomtrica (cambio de voltaje)
o amperimtrica (cambio de corriente) a los cambios en el
analito, es decir, existen dos tipos de electrodos primarios.
Los electrodos secundarios utilizan otras caractersticas,
como las enzimticas, para alcanzar especicidad y liberar
un producto que pueda detectarse con un ISE.
Los electrodos se emplean en varias aplicaciones clni-
cas. Los que se usan con ms frecuencia son para:
Iones: por ejemplo, hidrgeno (pH), sodio, potasio, clo-
ruro, uoruro, calcio, magnesio, litio, amonio (NH
4
+
).
Gases: por ejemplo, oxgeno, dixido de carbono, amo-
niaco (NH
3
).
Electrodos secundarios o complejos: por ejemplo, glu-
cosa, urea, lactato, creatinina.
Las ventajas de los dispositivos ISE en aplicaciones clni-
cas consisten en que:
No son fotomtricos, lo que signica que una solucin
ptica transparente no es necesaria, es decir la sangre
completa puede usarse.
Son rpidos y directos, permitiendo la medicin de la
concentracin verdadera o de la actividad biolgica.
Teora
Una celda potenciomtrica y fuentes de potenciales
Cuatro elementos son requeridos para realizar una medi-
cin con un ISE potenciomtrico:
Una media celda para la medicin.
Una media celda de referencia.
Un puente salino o una conexin elctrica equivalente.
Un dispositivo de medicin.
Una vista esquemtica de este arreglo se muestra en la -
gura 40-1.
Un electrodo funcional (celda) se compone de dos me-
dias celdas, un electrodo medidor y un electrodo de refe-
rencia. Cada media celda produce un potencial, pero un
potencial como tal no puede medirse de manera direc-
ta. Es la diferencia de potencial (es decir voltaje) entre las
40
Electrodos ion-selectivos
Alan D Hirst
382 CAP. 40 ELECTRODOS ION-SELECTIVOS
dos medias celdas lo que produce una seal mensurable.
La media celda de referencia debe disearse para tener un
potencial constante, mientras el electrodo medidor tiene
un potencial, el cual vara con la concentracin de la sus-
tancia que es medida, y as la diferencia de potencial, o el
voltaje, vara en una forma reproducible con la concentra-
cin de la sustancia.
Medicin y medias celdas de referencia
(que dan lugar a potenciales del electrodo)
El potencial de cada media celda se produce a partir de una
separacin de la carga creada por la migracin de iones
como sigue. En la supercie del electrodo, o en cualquier
unin, lquido o slido, habr una tendencia para que los
iones pasen de una fase a otra, por ejemplo, esto es, en la
supercie del electrodo los iones viajan desde el electro-
do, dentro de la solucin. Si stos son iones de hidrge-
no, por ejemplo, para un electrodo de pH, y entran en la
solucin sin un ion con la carga negativa correspondiente,
una separacin de la carga se crea, con una solucin ms
cargada positivamente (con iones hidrgeno) y un electro-
do con ms carga negativa (con electrones). A medida que
este proceso contina, el incremento de la separacin de la
carga produce un aumento en el potencial entre el electrodo
y la solucin, el cual se opone a la migracin inica adi-
cional, hasta que se alcance un equilibrio, en el cual no hay
otro movimiento neto de iones. Este proceso se ilustra con
un electrodo de zinc en la gura 40-2.
Si el electrodo permanece en contacto con una solucin
de concentracin inica baja, se crea una salida grande de
iones desde el electrodo, antes que se alcance el equilibrio,
y un potencial grande se establece. De manera inversa,
una solucin concentrada tiende a oponerse a la migracin
inica desde el electrodo y produce un potencial ms bajo.
En otras palabras, el potencial que se produce vara inver-
samente con la concentracin de iones en la solucin.
V
Media celda para
la medicin
Media celda
de referencia
Electrodo medidor Electrodo de referencia
Milivoltmetro
Solucin para
la medicin
Solucin
de referencia
Puente salino
Figura 40-1 Un electrodo simple consistente en una
media celda para la medicin y una media celda de re-
ferencia conectadas por un puente salino.
Figura 40-2 Una media celda de zinc que consiste en un electro-
do del metal zinc en contacto con una solucin de sulfato de zinc;
los iones zinc emigran desde el electrodo dentro de la solucin,
dejan una pequea carga negativa sobre el electrodo y producen
una solucin con carga ms positiva.
TEORA 383
El electrodo de referencia trabaja de la misma forma
que el electrodo medidor, pero est en contacto con una
solucin de concentracin constante y debe tener un poten-
cial constante.
Puente salino (dando lugar a un potencial de unin)
Para poder medir la diferencia de potencial entre dos me-
dias celdas all debe existir un circuito elctrico, y un con-
tacto elctrico entre la solucin del electrodo de referencia
y la del electrodo medidor. Esto es normal que ocurra por
contacto directo o con un puente salino, como se muestra
en la gura 40-1.
Existe migracin inica entre las soluciones en contacto,
similar a la migracin inica entre electrodos y soluciones.
Si los aniones y cationes en una de las soluciones son de
diferentes tamaos, emigrarn a diferentes tasas, como se
muestra en la gura 40-3, y esto tambin produce una se-
Los electrodos descritos hasta ahora son sistemas sim-
ples, sin el elemento de selectividad, y de resistencia baja,
y son la base de la batera comn. Para los propsitos de
medicin, una membrana selectiva necesita introducirse.
Un sistema de trabajo tpico se muestra en la gura 40-4.
Cuando el electrodo est rodeado por una membrana se-
lectiva cristal en este ejemplo existe una separacin de
carga adicional en la supercie de la membrana. Este es el
potencial de membrana que se describe con ms detalle
en la siguiente seccin.
Potenciales circulantes
El movimiento en una de las soluciones, por ejemplo, que
se inicia con un mezclador mecnico o con un analizador
de ujo continuo, puede tambin producir un potencial cir-
culante. La mayor parte de los instrumentos toma lecturas
estticas para evitar esta fuente de error.
Sistema medidor
La diferencia de potencial se mide con un milivoltmetro,
como se muestra en la gura 40-4. Los voltajes tpicos medi-
dos son de 59 mV para cada cambio de decena (diez veces)
en la concentracin para un ion monovalente como hidrge-
no y sodio, y 29.5 mV para un ion bivalente como calcio. Un
error de medicin de 1 mV, a partir de cualquier fuente (p.
ej., potencial de unin), produce un error de lectura de 4%
para un ion monovalente y de 8% para uno bivalente. Esto
signica que se requieren milivoltmetros sensibles estables
para la medicin.
El circuito debe permitir una corriente mnima, porque
una corriente grande perturba el equilibrio inico en las su-
percies del electrodo. Las membranas del electrodo deben
ser tericamente capaces de conductancia elctrica, pero
en la prctica tienen una resistencia muy alta, del orden
de 10
9
ohmios. De manera similar, el milivoltmetro debe
derivar una corriente mnima a partir del circuito que tiene
una resistencia de entrada muy alta. Esto requiere el diseo
especial del voltmetro, y uno estndar no es el adecuado.
Es innecesario mencionar que en un sistema tal, el cual
requiere resistencia elctrica alta y una corriente insigni-
cante para funcionar, la limpieza es muy importante, y
necesitan sellarse y aislarse cuidadosamente para dar re-
sultados reproducibles.
Calibracin
Para realizar mediciones tiles con un sistema de funcio-
namiento del electrodo, como se muestra en la gura 40-4,
ste debe calibrarse primero. La respuesta de un sistema
Figura 40-3 Ilustracin del potencial de unin. La solucin 1
es una sal que consiste de un ion de metal relativamente pequeo
(M) y un anin grande (X). En la unin lquida, el ion de metal
ms pequeo se difunde dentro de la otra solucin (NY) a una
tasa mayor que el anin, causando una separacin de la carga, el
potencial de unin.
paracin de la carga, que crea un potencial que se opondr
a la separacin adicional de la carga. Todos los sistemas
del electrodo tienen uniones lquidas y, por tanto, poten-
ciales de unin. Una de las caractersticas principales del
diseo de un electrodo de referencia es reducir al mnimo
el tamao y la variabilidad del potencial de unin. Por esta
razn, el electrodo de referencia de calomel es el ms
comn (cloruro mercrico). ste utiliza cloruro de potasio
saturado como solucin del electrodo de referencia, por-
que los iones de potasio y los de cloruro tienen un tamao
inico similar y emigran a una tasa similar. Sin embargo,
esto no elimina por completo el potencial de unin, porque
la solucin desconocida que est en contacto contiene una
composicin variable.
del electrodo es una respuesta logartmica inversa denida
por la ecuacin de Nernst:
EMF (voltaje) = E
referencia
E
desconocido
=
RT
nF
log
e
(A
referencia
)
(A
desconocida
)
donde A = actividad, R = la constante del gas, T = tempe-
ratura absoluta, n = carga de la valencia y F = constante
de Faraday. Puede verse, a partir de sta, que hay una re-
lacin logartmica inversa compleja entre la concentracin
(estrictamente, la actividad) de un ion y el voltaje que
produce un electrodo. Esto signica que la calibracin del
sistema y la produccin de una lectura no es algo fcil,
como lo es, por ejemplo, para un sistema colorimtrico de
glucosa sangunea.
La aproximacin por lo general es medir la pendiente
logartmica del electrodo, y tambin el voltaje a dos con-
centraciones. Idealmente ste debe ser de 59 mV para un
cambio de diez veces en la concentracin. Sin embargo, es
raro que los electrodos sean ideales, y la seal se deteriora
con el tiempo, as que la pendiente necesita comprobarse
regularmente.
Especicidad: cmo los electrodos
se hacen selectivos
Formas de lograr especicidad (cmo mide
lo que se necesita?)
En los electrodos simples, la especicidad para un ion
particular es determinada por una membrana selectiva que
Figura 40-4 Tpico sistema de funcionamiento del
electrodo, consiste de un electrodo de pH de vidrio y
de uno de referencia de calomel (cloruro mercurio-
so), ambos sumergidos en una solucin cuyo pH es
medido. El tapn de cermica poroso forma el puente
salino y controla la prdida de la solucin interna del
electrodo de referencia.
rodea al electrodo, la que acta por intercambio inico se-
lectivo, por ejemplo, el electrodo de pH tiene una mem-
brana de cristal, que acta como intercambiador de ion
hidrgeno. El cristal es un enrejado cristalino de silicona
complejo, que contiene los iones cargados (sodio para el
cristal de sosa). En la supercie hay una capa hidratada
muy delgada donde estos iones pueden intercambiarse por
los iones en el lquido en contacto (g. 40-5). El intercam-
bio inico entre la membrana y el lquido slo ocurre con
la condicin de que el tamao fsico del ion y su carga elec-
trosttica sean compatibles con la estructura del enrejado
cristalino, pero cuando las membranas llegan a ser ms
complejas otros factores tienen una parte ms importante.
Con el cristal estndar de silicato de sodio, se favorece el
intercambio del ion hidrgeno, pero un error alcalino ocu-
rre debido a interferencia de los iones de sodio en pH alcalino.
En las condiciones de pH alcalino, cuando la concentracin
del ion hidrgeno llega a ser muy baja, la contribucin relati-
va a la respuesta del electrodo a partir de los iones sodio llega
a ser ms signicativa hasta que excede la respuesta del ion
hidrgeno. Esto se conoce como el error lcali. Al variar
la composicin del cristal se pueden exagerar estos efectos,
de modo que el cristal se convierta en un electrodo diferente.
Las variaciones comunes en la estructura del cristal se mues-
tran en la gura 40-6.
En la prctica, ningn electrodo es absolutamente es-
pecco para un solo ion, y la preferencia que demuestra
por un ion en particular se llama selectividad. En este
ejemplo, en el pH neutral/cido el electrodo de cristal es un
electrodo de ion hidrgeno con una alta selectividad para
los iones hidrgeno sobre los de sodio, pero en un pH al-
calino tiene caractersticas inversas. El primer objetivo del
V
Electrodo
de referencia
Electrodo
medidor (pH)
Calomel
(Hg2Cl2)
Cloruro
de potasio
saturado
(KCl)
Solucin
desconocida
Platino
cido
clorhdrico
Membrana
de vidrio
Tapn
de cermica
poroso
diseo de la membrana es maximizar la selectividad para
evitar interferencia de otros iones similares. En el caso de
haluros, por ejemplo en el cloruro, esto puede alcanzarse
fcilmente si se usa una membrana cristalina de cloruro
de plata, en la cual slo un ion cloruro puede alojarse con
facilidad en el enrejado cristalino. Problemas ms difci-
les se presentan al intentar medir el calcio en presencia de
magnesio y viceversa (ambos estn presentes en concen-
traciones sanguneas similares), ya que los dos tienen un
tamao similar. An ms difcil es el diseo de un electro-
do para detectar el litio sanguneo en una concentracin de
1 mmol/L contra un fondo de 140 mmol/L del sodio.
Alterando la composicin del cristal, se producen elec-
trodos para que respondan al sodio y al potasio. El mejor
electrodo de sodio tiene una selectividad para sodio sobre
potasio de 100:1, y esto es clnicamente til para los uidos
biolgicos con concentraciones de sodio altas y de pota-
sio bajas. Sin embargo, el electrodo de cristal de potasio
tiene una mejor selectividad para el potasio sobre el so-
dio de 20:1, que no es ideal para uso en sangre, donde la
concentracin normal de sodio es alrededor de 30 veces
la concentracin de potasio. Para estos usos, se necesitan
membranas ms selectivas.
Membranas selectivas a los iones
La paradoja al desarrollar membranas selectivas a los iones
ocurre porque la membrana debe ser impermeable al agua,
de modo que haya una conduccin elctrica insignicante,
lo cual evita el corto circuito en el electrodo, pero los iones
por su naturaleza tienen una preferencia por las solucio-
nes en agua. La membrana necesita tener un componente
por el cual el ion tenga una preferencia equivalente, o por
atraccin electrosttica, como en el caso del intercambio
inico, o por sustitucin de la capa de hidratacin (apor-
tada por el solvente agua), como en el caso de portadores
neutros. Las clulas vivas utilizan con frecuencia tales
portadores para transportar iones y nutrientes otantes a
travs de las membranas celulares, que por lo general son
barreras hidrofbicas, y esto ha generado los modelos para
el diseo de las membranas ISE.
Para tener una membrana funcional que utilice un inter-
cambiador inico o un portador neutro, sta necesita un
apoyo inerte, que debe ser capaz de contener y retener al
ESPECIFICIDAD: CMO LOS ELECTRODOS SE HACEN SELECTIVOS 385
Figura 40-5 Un electrodo de pH opera sobre
el principio del intercambio del ion hidrgeno en
ambos lados de la membrana. No hay transferen-
cia de iones hidrgeno a travs de la membrana
se establece un equilibrio aunque en teora
debe existir conduccin electrnica para que el
electrodo forme parte de un circuito de medicin.
La membrana tiene en la prctica una resistencia
de 10
9
ohmios y una corriente insignicante.
a) Slice puro Si(iv) O Si(iv)
b) Slice
+ metal
lcali
Si(iv) O Selectivo
para H
+
c) Slice
+ almina
R(III) O Si(iv)
Selectivo pa
otros catione
d) Slice
+ tierra rara
Zr (iv) O Si(iv) Selectivo pa
iones divalen
Figura 40-6 Diferentes tipos de vidrio que se usan para los elec-
trodos.
portador inico; esto normalmente signica atrapar el sol-
vente en el cual el portador se disuelve.
En el caso de los sensores de calcio se ha encontrado
que los materiales de intercambio inico se unen al calcio
con una alta selectividad (g. 40-7). El electrodo consiste
de una sal de calcio de un alquil fosfato disuelto en di-n-
octofenil fosfonato, un solvente que no es voltil e in-
soluble en agua. Esto se mezcla con PVC disuelto en un
solvente voltil, y se vierte sobre una supercie plana, lo
que permite al solvente voltil evaporarse. Esto deja una
capa na de PVC en el intercambiador de calcio atrapado
dentro de l.
En un electrodo ideal, el portador es en su totalidad in-
soluble en agua, pero en la prctica es lixiviado a distancia
de manera gradual, conduciendo a una prdida gradual de
la respuesta del electrodo, porque las membranas del elec-
trodo tienen que cambiarse con regularidad.
Los portadores neutros son una alternativa al intercam-
bio inico, y el ms utilizado es la valinomicina para los
electrodos de potasio. Los compuestos teres corona son es-
tructuras anilladas que contienen varios tomos de oxgeno
que pueden imitar la capa de hidratacin de un tomo, como
se muestra en la gura 40-8. La valinomicina (g. 40-9) es
un compuesto similar a un anillo grande complejo que con-
tiene seis tomos de oxgeno dentro de su estructura; puede
tambin acomplejar al potasio, es decir, el ion intercambia
su capa de hidratacin acuosa por la valinomicina y emigra
de una solucin acuosa a una membrana hidrofbica.
Una de las ventajas de los portadores neutros es que
tienden a ser menos solubles en agua que los intercambia-
dores inicos, que deben tener necesariamente solubilidad
leve. Producen membranas, las cuales tienen una vida ms
larga. Se han desarrollado portadores neutros para varios
iones, incluso de sodio, cloruro, calcio, magnesio, litio,
amoniaco (g. 40-10) y carbonato (g. 40-11).
La explicacin precedente est relacionada con los elec-
trodos potenciomtricos, los cuales se utilizan en la ilustra-
cin porque incluyen todos los problemas relacionados con
la electroqumica.
Reacciones electroqumicas
La descripcin de potencial del electrodo mencionada an-
tes es una simplicacin de la situacin real para ayudar
Ionforo
Alquil
Alquil
Alquil fosfato
O O
O O Alquil
P
P
O O Ca O O Alquil
Mediador
C
8
H
17
O O
P
C
8
H
17
C
6
H
5
di-n-octilfenil fosfonato
P
Figura 40-7 Portador de calcio.
O
O
O
O O
O
+
K
+
O
O
O O
O
O
O O
O
O
O
O
H H
H
H
H H
H
H
H
H H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Capa
de hidratacin
interna
Ion potasio
Capa
de hidratacin
externa
K
O
O
O O
O
O
O O
O
O
O
O
H H
H
H
H H
H
H
H
H H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Figura 40-8 a) Un ejemplo de un compuesto ter corona (diciclohexil-18-corona-6) que acta como capa sustituta de hidratacin para
un ion como el de potasio, y es capaz de transportarlo a travs de una membrana hidrofbica. b) Un ion potasio en la solucin rodeado por
una capa de hidratacin interna, una de hidratacin externa y una de hidratacin externa de molculas de agua.
REACCIONES ELECTROQUMICAS 387
Figura 40-10 Un grupo de compuestos ETH usados como ionforos sobre ISE.
(
C
H
3
)
2
C
H
(
C
H
3
)
2
(CH
3
)
2
(
C
H
3 )
2
(
C
H
3
) 2
(CH
3
)
2
(
C
H
3
) 2
(CH
3
)
2
(
C
H
3 )
2
C
H
C
H
CH
C
H
CH
C
H
0
0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0
0
0
0
HC
H
3
C
H
N
H
N
H
3
C
N
H
H
N
C
H
3
0
0
H
C
N
N
H
(
C
H
3
)
2
C
H
(
C
H
3
)
2
(CH
3
)
2
(
C
H
3 )
2
(
C
H
3
) 2
(CH
3
)
2
(
C
H
3
) 2
(CH
3
)
2
(
C
H
3 )
2
C
H
C
H
CH
C
H
CH
C
H
0
0
0
0
0
0
0 0
0
0
0
0
0
0
0
0
HC
H
3
C
H
N
H
N
H
3
C
N
H
H
N
C
H
3
0
0
H
C
N
N
H
Figura 40-9 Estructura de la valinomicina.
Figura 40-11 Ionforos usados en un electrodo de carbonato.
a ilustrar cmo funciona el electrodo. Lo que en realidad
sucede en la supercie del electrodo es una reaccin elec-
troqumica que produce una especie cargada antes de la
separacin de la carga, por ejemplo:
Zn Zn
2e
En un material que conduce como un electrodo de me-

tal, la estructura del electrn es similar a un mar en el
cual los electrones estn libres para moverse a travs del
slido. Las energas de los electrones se llenan a un ni-
vel, llamado de Fermi. En la solucin existe una situacin
diferente. Los iones estn rodeados por una capa de hi-
dratacin (g. 40-8), que los separa con ecacia de otros
iones, y los electrones se restringen a diferentes bandas de
energa (ms bajas). Al instante el electrodo entra en con-
tacto con la solucin, la diferencia en niveles de energa
favorece un ujo de electrones para igualar la energa y
un equilibrio se alcanza rpidamente al estado de energa
libre ms bajo (conocido como el nivel de energa libre de
Gibbs). sta es la base del potencial del electrodo.
Esta reaccin electroqumica ocurre de manera espon-
tnea debido a la propiedad del material del electrodo, que
es capaz de perder un electrn y formar un ion, as que el
uso principal de estos electrodos (potenciomtricos) es la
medicin inica. El concepto de reacciones electroqumi-
cas puede ampliarse para incluir otras reacciones qumicas,
que no ocurren de repente pero se originan por un potencial
aplicado. Esto abre la posibilidad del anlisis de sustan-
cias que no existen necesariamente como iones en solucin
sino que dan lugar a una reaccin electroqumica en cir-
cunstancias convenientes.
Electrodos amperomtricos
Hay otra clase de electrodos, llamados amperomtricos
porque producen una corriente en lugar de un voltaje. Este
tipo de electrodo se disea para medir una reaccin elec-
troqumica una reaccin qumica que produce o consu-
me electrones midiendo una corriente elctrica en vez
de medir el voltaje producido por una separacin de carga.
El ms comn de stos, en uso clnico, es el electrodo de
oxgeno (pO
2
). En el caso del electrodo de oxgeno la re-
accin es:
O
2
2H
2
O 2e
H
2
O
2
2OH
Para el electrodo de perxido relacionado, la reaccin es:

H
2
O
2
2H
O
2
2e
La primera reaccin se utiliza en el electrodo estndar de

oxgeno (pO
2
) (electrodo de Clarke), mientras el segundo
se emplea en algunos electrodos de glucosa, como se des-
cribe ms adelante, para medir el perxido producido por
la enzima glucosa oxidasa.
Puede observarse a partir de estas reacciones electro-
qumicas que las reacciones son facilitadas por un voltaje
aplicado (0.7 V) y ste puede adicionarse a la especicidad
de la respuesta del electrodo. La caracterstica principal de
estos electrodos es que un voltaje constante se aplica a los
electrodos medidores, y la corriente resultante (en micro-
amperios) es proporcional a la cintica de la reaccin. Esta
es una relacin lineal directa, en contraste con la respuesta
logartmica inversa compleja de los electrodos potenciom-
tricos. Ya que se est midiendo la corriente, estos electrodos
(p. ej., un electrodo pO
2
) no necesitan uno de referencia.
Sin embargo, la reaccin y la corriente tambin se rela-
cionan con el rea supercial del electrodo.
Polarografa
Es una aplicacin de la electroqumica. El voltaje aplicado
es polarizante, y la celda electroqumica una celda polaro-
grca.
Para conseguir una medicin del analito involucrado o,
por ejemplo, del pO
2
(la presin parcial del oxgeno no es
en sentido estricto concentracin, pero es equivalente en
..
..
C CF
3
R R
H H
C
OH
OH
CF
3
p-Decil-,,-trifluoroacetofenona
3
OH

O
O
OH
CF C C=O R
R C
H
H
C = O
CF
3
2
..
..
3
H
..
0.7 V
0.7 V
Figura 40-12 Un electrodo de oxgeno de Clarke. ste consiste
en un ctodo de platino de rea muy pequea rodeado por un no-
do anular de plata. Ambos estn en contacto con un amortiguador
interno incluido dentro de una membrana hidrofbica de caucho
de silicona. El oxgeno puede difundirse libremente a travs de
la membrana y disolverse en el amortiguador interno. Se mide la
reaccin electroqumica resultante en el ctodo de platino.
trminos gaseosos), la cintica de reaccin debe ser cons-
tante y, por tanto, el pO
2
tambin. Un requerimiento clave
de este tipo de sistema es que el electrodo no debe consu-
mir el oxgeno en su supercie a una tasa ms rpida de
lo que el oxgeno puede difundirse a travs de la solucin
del electrodo hacia la supercie de ste, de otra forma la
corriente declina cuando el pO
2
en contacto con sta falla.
Para mantener un estado constante que permita la medi-
cin, las celdas que se miden deben disearse de modo que
el electrodo en el cual la reaccin ocurre sea muy pequeo
(p. ej., la punta de una aguja), para consumir una cantidad
mnima del analito en la medicin. Esto signica que un
sistema tpico producir slo una corriente de proporciones
en microamperios, que requiere un ampermetro diseado
especcamente para tal medicin.
Electrodo de oxgeno
Para tener un electrodo funcional, los electrodos en los
cuales la reaccin electroqumica tiene lugar deben estar
en contacto con una solucin constante con una resisten-
cia constante de modo que no ocurra ninguna variacin
en la resistencia, lo cual afecta el voltaje aplicado y en-
tonces la corriente producida. El electrodo de oxgeno de
Clarke consiste de electrodos en contacto con una solucin
electroltica, la cual est contenida por una membrana de
caucho de silicona. El oxgeno gaseoso puede pasar libre-
mente a travs de la membrana, pero sta es hidrfoba y
no permite que el agua o electrlitos disueltos pasen de
un lado a otro y cambien la composicin y resistencia de la
solucin electroltica. Esto se muestra en la gura 40-12.
Electrodos de glucosa
Los electrodos de glucosa emplean una combinacin de
una enzima y de un voltaje de polarizacin especcos para
generar una respuesta especca para la glucosa. En la ac-
tualidad existen dos diferentes enzimas y tres reacciones de
transferencia electrnica distintas en uso comn.
La forma ms simple de formar un electrodo de glucosa
es utilizar la enzima glucosa oxidasa junto con un electro-
do de oxgeno. La glucosa oxidasa cataliza la reaccin:
glucosa O
2
2H
2
O cido glucnico H
2
O
2
El electrodo de oxgeno puede medir la cada dentro del
pO
2
como una medicin de la glucosa consumida en la
reaccin. Desafortunadamente, si la celda est abierta a
la atmsfera, se llena de oxgeno atmosfrico, y tambin
hay problemas si se utiliza sangre entera, por los efectos
que se crean por la unin del oxgeno con la hemoglobina.
Debido a estos problemas, se han desarrollado mejores
aplicaciones:
El electrodo glucosa oxidasa/perxido. ste se utiliza
para detectar el perxido producido por la reaccin, con
un potencial aplicado de +0.7 V.
El electrodo glucosa oxidasa/ferroceno. Este electrodo
utiliza ferroceno como agente de transferencia electr-
nica en la reaccin electroqumica siguiente:
Glucosa
glucosa oxidasa
gluconolactona 80 mv e

ferricinio ferroceno (Fe
2
) ferricinio (Fe
3
)
sta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Medi-
sense
, y se ilustra en la gura 40-13.

El electrodo de glucosa deshidrogenasa/ferricianuro.
Este electrodo funciona de una manera similar, pero con
una enzima diferente y un agente de transferencia elec-
trnica:
Glucosa glucosa deshidrogenasa cido glucurnico 80 mv e
+ + +
Fe(CN)
3
6
Fe(CN)
4
6
Fe(CN)
3
6
Esta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Boehrin-
ger Mannheim Corporation (BMC) Advantage
.
ELECTRODOS DE GLUCOSA 389
Figura 40-13 Ejemplo de un electrodo de glucosa en estado lquido, sistema Medisense. Este sistema tiene tres contactos: un elec-
trodo comn central, uno en contacto con el ferroceno solamente (para las reacciones no especcas) y otro en contacto con la glucosa
oxidasa ms ferroceno. La diferencia en las dos seales proporciona una medicin de la concentracin de glucosa.
Interferencia del frmaco
Los tres tipos de electrodo de glucosa descritos antes son
de uso comn y, en general, aparatos de medicin ecaces,
pero varias sustancias, incluyendo medicamentos comunes
como el paracetamol, pueden interferir y dar una seal con
estos sistemas. Esto ocurre porque casi todos los compues-
tos pueden producir una reaccin electroqumica, dando un
voltaje polarizante bastante elevado, y esta reaccin invo-
lucra la mayor parte de los frmacos. Con base en esto los
frmacos teraputicos y muchos otros compuestos biol-
gicos pueden medirse con cromatografa usando una celda
polarogrca como detector electroqumico.
Detectores electroqumicos
Estos detectores son el resultado de un desarrollo del elec-
trodo polarogrco, para empleo como detectores en cro-
matografa lquida de alta resolucin (HPLC). Una aplica-
cin tpica de estos detectores en el laboratorio mide las
catecolaminas (adrenalina, noradrenalina) para la detec-
cin del feocromocitoma. La reaccin electroqumica se
muestra en la gura 40-14.
Los electrodos descritos funcionan en condiciones es-
tables, por ejemplo, estn en contacto con una solucin
constante. En un sistema cromatogrco, la selectividad se
obtiene con la separacin cromatogrca (es decir, fsica)
HO
R
HO
Adrenalina
+ 0.5 V
O
O
R
+ 2H
+
+ 2e
Figura 40-14 Reaccin electroqumica por catecolaminas.

de compuestos similares, por ejemplo, adrenalina y nor-
adrenalina (en comparacin con el uso de una membrana
selectiva), pero los sistemas solventes que se emplean para
la separacin son variables, as que la resistencia de la so-
lucin en la celda de medicin es variable, y eso afecta el
voltaje aplicado. Para superar este problema, se utiliza un
tercer electrodo en la celda de medicin HPLC, que tiene
la funcin de supervisar el voltaje aplicado y mantenerlo
en un valor constante a travs de un circuito de retroali-
mentacin.
Electrodos complejos
stos consisten de un electrodo dentro de otro, el ejemplo
ms comn es el electrodo pCO
2
(dixido de carbono) en-
contrado en todos los analizadores de gases sanguneos.
Otros electrodos complejos mediados
por las enzimas
Electrodo de lactato
ste es de uso general en unidades de cuidado crtico, y por
atletas para comprobar el estado anaerbico despus del
ejercicio. Funciona de la misma forma que uno de glucosa
(por lo comn es un electrodo de glucosa modicado) em-
pleando un enzima lactato oxidasa diferente:
Lactato + O
2
+ H
2
O piruvato + H
2
O
2
El perxido formado es medido con un electrodo de per-
xido.
Electrodo de urea (Roche Diagnostics)
ste es ms complejo y utiliza la enzima ureasa; descom-
pone la urea para formar dixido de carbono y amoniaco;
el ltimo se convierte en iones amonio, que entonces se
detectan con un electrodo de amonio:
CO
2
H
2
O H
HCO
3
Urea H
2
O
2NH
3
H
2
O NH
4

OH

Al contrario del electrodo de amoniaco, el de amonio
tiene escasa selectividad, pero se utiliza porque la enzima
ureasa puede trabajar slo a un pH bajo, en el cual el amo-
niaco se convierte en iones amonio. El electrodo de amonio
sufre la interferencia del potasio, as que se emplea en serie
con uno de potasio compensador. Esto se muestra en la -
gura 40-16.
Electrodo pCO
2

Este electrodo consiste de un electrodo de pH estndar en
contacto con un amortiguador dbil de bicarbonato y enca-
jonado en una membrana de cloruro de polivinilo (PVC);
se muestra en la gura 40-15.
Figura 40-15 Un electrodo pCO
2
que consiste en uno de pH y
uno de referencia plata/cloruro de plata interno. El CO
2
se difunde
a travs del PVC y cambia el pH del amortiguador interno.
La membrana de PVC es permeable a los gases, por
ejemplo, dixido de carbono, pero impermeable al agua. El
dixido de carbono se difunde a travs de la membrana y
se disuelve en el amortiguador cambiando el equilibrio del
amortiguador de bicarbonato.
CO
2
H
2
O H
2
CO
3
HCO
3

H
Al efectuarse lo anterior el pH del amortiguador cambia, y

se mide con el electrodo de pH.
Los electrodos de amoniaco se hacen de la misma ma-
nera, con un electrodo de pH sumergido en un amortigua-
dor. Las diferencias consisten en que el amortiguador que
se crea es diferente:
NH
3
H
2
O NH
4

OH
y la membrana contiene el portador neutro nonactina (vase

g. 40-10f) para ayudar en la transferencia del amoniaco.
Ureasa
Electrodo
de referencia
Muestra
K
NH
4
Urea
Electrodos
Seal
amplificada
Figura 40-16 Diagrama esquemtico de los principios analti-
cos de un sensor potenciomtrico para la medicin de la urea.
OTROS ELECTRODOS COMPLEJOS MEDIADOS POR LAS ENZIMAS 391
Electrodo de creatinina (Nova Biomedical, UK)
ste usa una serie compleja de enzimas:
Creatinina + H
2
O creatina
Creatina + H
2
O sarcosina
+ urea
sarcosina + O
2
+ H
2
O formaldehdo
+ glicina + H
2
O
2
El perxido se mide con un electrodo de perxido.
Comprobacin en los puntos de cuidado
(POCT)
Los electrodos selectivos a los iones (ISE) son muy utili-
zados en instrumentos POCT, sobre todo porque emplean
sangre completa, en lugar de suero, y pueden producir un
resultado en menos de un minuto.
Glucmetros
stos son empleados por enfermeras y mdicos y por mu-
chos pacientes. Son baratos (~ 20 dlares) y fciles de uti-
lizar. Los principios de los componentes del ISE de tales
sensores son descritos en la pgina 389. La gura 40-17
muestra un glucmetro tpico (Roche Instruments plc) y la
cinta de medicin. La ltima est disponible.
Analizadores de cuidado crtico
stos son instrumentos ms complejos, usados en casi to-
das las unidades de cuidados criticos, por ejemplo, salas de
traumatismos y urgencias, unidades de cuidado intensivo/
terapia, de cuidado especial del beb, de cuidado corona-
rio, y reas de recepcin. Contienen una serie de electro-
dos y de otros sensores, normalmente en grupos, como se
creatinina amidohidrolasa
creatinina amidohidrolasa
sarcosina oxidasa
Figura 40-17 Un glucmetro Roche Advantage.
Electrodos
Electrlito
de referencia (KCl)
Electrodo de Calomel
Unin lquida
Electrodo
de referencia
Tierra (GND) de
la cmara
de medicin
Muestra
Indicador
Na
, pH, K
, Ca
,
Li
, Mg
, CI
-
Membrana
ion selectiva
Capilar
selectivo de cristal
de sodio/H
Amplificador
Figura 40-18 Una serie de electrodos como se
utiliza en un analizador tpico para el cuidado
crtico.
Gases sanguneos: pH, pO
2
, pa CO
2
. Este grupo mide el
estado cido-base de la sangre como un ndice de fun-
cin renal y respiratoria.
Iones: sodio, potasio, cloruro, calcio y magnesio. Este
grupo se usa en las unidades de cuidado crtico para la
valoracin de condiciones como volumen del uido cor-
poral y la funcin renal y cardiaca.
Metabolitos: glucosa, urea, creatinina, lactato. Este gru-
po se usa para la valoracin de condiciones como fun-
cin renal y heptica.
Co-oximetra: hemoglobina, oxihemoglobina, carboxi-
hemoglobina. Estos componentes se miden usando es-
pectrofotometra en lugar de los ISE. Se combina con
otras pruebas porque proporcionan informacin adicio-
nal, en particular sobre la respiracin.
Respaldo
Conexin de la red
Los instrumentos en el lugar de cuidado producen resul-
tados que afectan de manera directa el tratamiento del pa-
ciente. Los primeros instrumentos eran independientes, y
todo el mantenimiento de registros, manual e inconsistente.
Esto se identic como un problema de control de riesgo
mayor, y condujo a una nueva generacin de instrumentos,
que pueden conectarse va una red a un controlador central
de los datos. Esto tiene varias ventajas:
Los datos se recolectan y almacenan centralmente. Esto
incluye los resultados de la prueba, la identicacin del
paciente y del operador, y la fecha/hora, es decir un ras-
treo completo de auditora.
La identicacin del operador puede controlarse de
modo que slo los entrenados utilicen los instrumentos.
El funcionamiento del instrumento puede supervisarse
centralmente.
Es importante que los instrumentos de cuidado crtico sean
siempre operacionales. El control de la red permite aportar
a los laboratorios apoyos las 24 h para estos analizadores.
Uno de los primeros problemas con el control de la red
fue que las compaas estaban utilizando diferentes siste-
mas de comunicacin, los cuales eran incompatibles. Este
problema fue resuelto cuando las compaas de diagnsti-
co formaron CIC (Communications Industry Consortium)
para resolver el problema. El CIC produjo un grupo de es-
tndares de comunicaciones, que adopt el National Com-
mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) como
estndar NCCLS-POCT-IA.
Poltica
Una de las principales aplicaciones de ISE es la comproba-
cin en los puntos de cuidado (POCT), donde las pruebas se-
rn hechas por enfermeras y mdicos sin el entrenamiento de
laboratorio formal. Como existen numerosos problemas que
pueden ocurrir con las mediciones ISE, debe haber respaldos
incorporados en todo el proceso (no slo en el sistema de me-
dicin) para que esta aplicacin sea aceptable, y deben elabo-
rarse por completo dentro de una poltica del hospital sobre
POCT. Sin este respaldo, se coloca en riesgo a los pacientes y
la institucin tiene un problema de control de riesgos.
La entrada de datos principal del laboratorio es la produc-
cin de la especicacin que el instrumento debe satisfacer
(es decir, el desempeo del instrumento). La especicacin
debe tratar problemas como selectividad de los electrodos.
Por fortuna, la tecnologa moderna permite elaborar res-
guardos convenientes, como se perla ms adelante.
Vericacin del instrumento
Los instrumentos modernos son operados por computado-
ras, que verican el desempeo del electrodo sobre fun-
ciones como seal del electrodo (p. ej., pendiente: mV/
decada) y el tiempo de reaccin, y otras vericaciones
como temperatura, burbujas de aire, fugas de la membrana,
etc. Para un laboratorio apoyado en instrumentos, donde el
personal debe entender las caractersticas del electrodo, es
aceptable tener un alto nivel de facilidad en su manejo para
producir mediciones en una situacin de urgencia. Para las
aplicaciones de POCT, si una respuesta del electrodo cae
fuera de los lmites especicados, la prueba debe desacti-
varse hasta que el problema est resuelto.
Existen otras funciones tiles, que estn permitidas con
un instrumento controlado por computadora:
Identicacin del operador. El entrenamiento es una
caracterstica importante de POCT, y una funcin ope-
ratoria slo debe ejecutarse por el personal entrenado y
autorizado para operar el instrumento.
Interrupcin remota. Esta es una instalacin en la que
el instrumento est conectado con la computadora del
laboratorio, que monitorea el requerimiento del control
de calidad del instrumento, y lo bloquea si el CC no
cumple los lmites predenidos. La computadora del
laboratorio entonces alerta al personal del laboratorio
sobre el problema.
RESPALDO 393
Control de calidad (CC) y aseguramiento de la calidad
(AC). El control de calidad es la vericacin, en tiempo
real, del instrumento. Esto implica analizar el material
de composicin conocido y vericar que los resultados
que se obtienen estn dentro de los lmites clnicos sig-
nicativos, segn lo denan los organismos profesiona-
les (como los organismos nacionales del aseguramiento
de la calidad). El control de calidad lo deben realizar
regularmente los operadores (p. ej., enfermeras y m-
dicos) que efectan las pruebas, y una parte esencial de
su entrenamiento se centra en la importancia de realizar
el control de calidad, registrando los resultados, y qu
accin tomar si la vericacin de control de calidad fa-
lla. Este entrenamiento deben ensearlo profesionales
laboratoristas experimentados.
Para asegurar la calidad se realiza un examen retrospec-
tivo del desempeo del instrumento, el cual se hace con
frecuencia como parte de un esquema externo del AC. La
agencia britnica de acreditacin del laboratorio, CPA(UK)
Ltd, requiere que los laboratorios participen en un esquema
reconocido de CC y mantengan un funcionamiento ade-
cuado. Si los instrumentos de POCT estn bajo el control
del laboratorio principal, la acreditacin del laboratorio se
aplica al servicio de POCT, a condicin de que se opere
en un estndar aceptable. Este acercamiento se recomienda
como la mejor manera de aportar calidad al cuidado del
paciente con un riesgo mnimo.
Mantenimiento. Las vericaciones de mantenimien-
to estn normalmente planeadas como mantenimiento
preventivo, por ejemplo, el reemplazo de la tubera, se-
llo, electrodos, etc. Estas pruebas las realizan mejor los
profesionales laboratoristas experimentados, pero si las
hace personal no laboratorista, el entrenamiento riguro-
so sobre la importancia de las vericaciones es vital.
Entrenamiento. El entrenamiento de todos los usuarios
es una caracterstica esencial de una poltica POCT del
hospital. Para los instrumentos modernos, el entrena-
miento no requiere ser de gran profundidad o consumi-
dor de tiempo, con la condicin de que los resguardos
adecuados se hayan realizado sobre el instrumento. El
entrenamiento debe incluir no slo la operacin del ins-
trumento, sino una comprensin de todas las seales de
error, la importancia de los resultados, y la importancia
de registrar resultados y los procedimientos del CC.
Reconocimientos
Quiero agradecer a Roche Diagnostics por su ayuda con el
suministro de un nmero de diagramas, y en particular a
Christoph Ritter, de Nova Biomedical UK, por la informa-
cin sobre los electrodos, y a Andrew St John por permitir-
me el uso de varios diagramas. Muchas gracias tambin a
Janet Gourlay por toda la mecanografa y la preparacin.
Hirst AD, Stevens JF. Electrodes in clinical chemistry. Ann Clin
Biochem 1985; 22: 460-488.
Crompton RG, Sanders GHW. Electrode Potentials. Oxford Uni-
versity Press, Oxford.
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Burnett 2000; 37: 241-243.
Price CP, Hick JM (eds.). Point of care testing. 1999: AACC
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Kost GJ (ed.). Principles and Practice of Point of Care Testing.
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vice Bull 2002; 3. (www.medical-devices.gov.UK).
Annexe D of ISO 15189Medical Laboratories. Particular re-
quirements for quality and competence. ISO (International
Standards Organization), Geneva (Annexe D, wich relates to
quality management of point of care testing, is under discus-
sion at the time of going to press, but should be agreed by the
time of publication).
Structures of ionophores. Fluka catalogue. 2003: Sigma- Aldrich
Company Ltd (www.sigmaaldrich.com).
41
Absorcin de la luz, dispersin y tcnicas
de luminiscencia en bioqumica clnica rutinaria
Bernard F Rocks
Introduccin
Algunos de los constituyentes qumicos de la sangre, plas-
ma u orina pueden medirse en forma directa. Los qumicos
analticos, sin embargo, han desarrollado medios indirec-
tos para detectar y medir de manera cuantitativa muchos
de los componentes de inters clnico. El mtodo implica
con frecuencia aadir a la muestra diluida una sustancia (el
reactivo) que qumicamente reaccione en forma especca
con el componente particular que se quiere cuanticar (el
analito), para formar un producto que pueda medirse con
relativa facilidad. Siempre que sea posible, las condiciones
del ensayo producen un producto cuya cantidad es propor-
cional a la concentracin original del analito.
Cuando la luz incide en la materia de cualquier tipo,
la interaccin puede cambiar la intensidad, direccin, lon-
gitud de onda o la fase de la luz incidente. La absorcin,
dispersin y luminiscencia de la luz son tres de los muchos
efectos pticos que se han explotado con ms frecuencia
con propsitos analticos. La mayor parte de las medicio-
nes cuantitativas hechas en laboratorios de bioqumica
clnica se fundamentan en la elaboracin de productos de
reaccin teidos, as que es muy frecuente que se utilicen
dispositivos fotoelctricos de absorbancia como colorme-
tros o espectrofotmetros. Otros mtodos de amplio uso
basados en la medicin de la luz incluyen la turbidimetra,
nefelometra, uorimetra y la medicin de la quimiolumi-
niscencia. Las caractersticas esenciales de estas tcnicas
se discuten en este captulo.
Tcnicas de absorcin de la luz
La fotometra de absorcin es la base de la mayor parte
de los anlisis cuantitativos realizados en laboratorios de
bioqumica clnica. Las razones primarias para emplear
esta tcnica son la facilidad de la medicin, la exactitud y
la precisin satisfactorias, y la instrumentacin, la cual es
estable, conable y relativamente econmica.
Fotmetros y espectrofotmetros
Los absorcimetros pueden dividirse en dos tipos bsicos:
instrumento de haz sencillo y de haz doble. En cada tipo,
aunque las trayectorias de la luz son diferentes, muchos de
los componentes bsicos son similares. Un fotmetro sim-
ple de una viga se ilustra en la gura 41-1. Los bioqumicos
clnicos se reeren con frecuencia a este tipo de fotmetro
como colormetro.
La fuente de luz provee energa radiante sobre las longi-
tudes de onda de inters. Para trabajar en el rango visible,
ahora es comn utilizar las lmparas de tungsteno-cuarzo-
halgeno. Estas lmparas tambin se utilizan para las medi-
ciones cercanas del infrarrojo y ultravioleta (340 a 800 nm).
Para el trabajo en longitudes de onda UV ms cortas, es
comn que se utilice una lmpara de descarga de deuterio.
Por abajo de 360 nm estas fuentes aportan una continuidad
intensa que, junto con las cubetas de slice fundido, satisfa-
ce casi todas las necesidades en la regin UV. El suministro
de energa a la lmpara debe ser de alta estabilidad.
396 CAP. 41 ABSORCIN DE LA LUZ, DISPERSIN Y TCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUMICA CLNICA RUTINARIA
La longitud de onda apropiada para el ensayo particular se
selecciona con ltros de interferencia de amplitud de banda
estrecha y de alta transmitancia. Los ltros de interferencia
son costosos y algunos colormetros econmicos utilizan l-
tros de cristal coloreado o gelatina teida (intercalada entre
las capas del cristal). Los espectrofotmetros generan luz
monocromtica por medio de un prisma o de un monocro-
mador de rejilla, ms bien que por medio de ltros.
La cubeta es un recipiente transparente que contiene la
solucin que se prev medir. El diseo de la cubeta y los me-
dios de administrar la muestra y posteriormente eliminarla
varan con el tipo de instrumento y de analizador. La solucin
de la muestra, que contiene la cubeta, absorbe una cantidad
proporcional de la radiacin incidente; el resto se transmite a
un detector de luz, donde se genera una seal elctrica.
Muchos tipos de fotodetectores diferentes se emplean en
la actualidad. Ahora, con frecuencia se utilizan varios foto-
diodos en estado slido y series de diodos en instrumentos
de luz visible y cerca del infrarrojo. Estos detectores son re-
sistentes, baratos y tienen una respuesta lineal sobre varias
decenas de intensidad de luz. Sin embargo, dan una res-
puesta inferior a la luz UV. Donde se requiere sensibilidad
alta, y para trabajar con UV, se utilizan tubos fotomulti-
plicadores de vaco. La salida del detector puede necesitar
amplicarse y que se exprese como su logaritmo para que
sea relacionada linealmente con la concentracin. Ambas
operaciones se realizan por medio de un amplicador lo-
gartmico. La seal, despus de algunas transformaciones
necesarias (a menudo de analgicas a digitales), puede ex-
hibirse en el aparato, imprimirse o almacenarse.
Instrumentos de haz sencillo
En los instrumentos de haz sencillo un blanco (p. ej., una
cubeta que contiene agua) se utiliza para jar a cero, enton-
ces los estndares y las muestras son ledas. Interferencias
por variaciones en la turbiedad de la muestra y los cambios
de intensidad de la fuente y otras uctuaciones del instru-
mento no se compensan de manera automtica. En algunos
diseos modernos, un segundo detector se emplea para mo-
nitorear la intensidad de la fuente de luz y compensar elec-
trnicamente la desviacin de la lmpara. Los instrumentos
de haz sencillo estn bien adaptados para las mediciones
cuantitativas de absorcin en una sola longitud de onda. El
fcil mantenimiento y bajo costo son ventajas distintivas de
este tipo de fotmetro, que se encuentra en la mayor parte
de los analizadores automticos de la qumica clnica.
Espectrofotmetros de haz doble
Un instrumento de haz doble tiene dos trayectorias de luz,
ambas se originan a partir de la misma fuente. Un haz pasa
a travs de la cubeta de la muestra y el otro por la cubeta
del blanco o de referencia. Esto normalmente se consigue
dirigiendo el haz de luz desde el monocromador hacia un
espejo que rota muy rpido o hacia un interruptor que diri-
ge la luz de manera alterna hacia la cubeta de referencia y a
la cubeta de la muestra. La luz que emerge de cada cubeta
se reeja hacia el detector. La salida del detector es, por
tanto, una seal que se alterna con una amplitud proporcio-
nal al cociente de las intensidades del haz de la muestra y
del haz de referencia. Las seales elctricas que se produ-
cen se procesan electrnicamente para dar la absorbancia
en un dispositivo de lectura. Sistemas de haz doble auto-
mticos corrigen los cambios en la intensidad de la luz a
partir de la fuente lumnica, uctuaciones electrnicas en
el instrumento y absorcin por el blanco. Un instrumento
de esta clase se consigue con frecuencia con un monocro-
mador impulsado por motor, de modo que la exploracin
y la grabacin automticas de un espectro completo sean
posibles. Esto permite su uso para el anlisis cualitativo (p.
ej., identicacin del frmaco) y el cuantitativo.
Ley de Beer
La base matemtica para las mediciones cuantitativas se
basa en la derivacin experimental de la relacin Beer-
Figura 41-1 Componentes bsicos de un fotmetro.
TURBIDIMETRA Y NEFELOMETRA 397
Lambert. La ley de Lambert indica que la proporcin de
energa radiante absorbida por una sustancia es indepen-
diente de la intensidad de la radiacin incidente. La ley de
Beer indica que la absorcin de energa radiante es pro-
porcional al nmero de molculas en la trayectoria de la
luz. No es posible medir de forma directa la cantidad de
radiacin absorbida por una sustancia y es normal que se
determine midiendo el cociente de radiacin incidente que
cae sobre la muestra, I
0
, y la radiacin transmitida, que al
nal emerge de la muestra, I. Usando estas mediciones, la
ley de Beer-Lambert se puede expresar como:
Log
10
(I
0
/I

) ecI
donde c es la concentracin de la sustancia en moles/litro,
I es la longitud de la trayectoria ptica en centmetros y e
es el coeciente de absorcin molar para la sustancia, ex-
presado en litros/mol/centmetro. Los valores para I y I
0
no
pueden medirse en trminos absolutos y las mediciones se
hacen de una forma ms conveniente expresando I como un
porcentaje de I
0
. Este valor se conoce como transmitancia
porcentual T, y da una relacin lineal con la concentracin
si el logaritmo de su recproco se utiliza. Esta funcin loga-
rtmica recproca de I y de I
0
, se conoce como absorbancia
(A):
%T (I/I
0
) 100
A log
10
(100/T) log
10
(I
0
/I)
La absorbancia es un parmetro ms conveniente puesto
que, a partir de la ley de Beer, es directamente proporcional
a la concentracin de las especies absorbentes.
Los espectrofotmetros son por lo comn lineales sobre
el rango 0 a 2 , y los cromforos pueden medirse en con-
centraciones tan bajas como 10
-6
mol/L. Los valores de la
prueba se calculan comparando las lecturas de absorbancia
de las muestras de la prueba con las que se obtienen en-
sayando una serie de estndares o calibradores de valores
conocidos.
Aplicaciones
En la mayor parte de las determinaciones realizadas en
laboratorios de bioqumica clnica se confa en mtodos fo-
tomtricos. Un laboratorio tpico de hospital provee informa-
cin de casi 5 000 anlisis fotomtricos/da y puede incluir
la medicin de algunos de los analitos siguientes: albmina,
bilirrubina, calcio, colesterol, creatinina, glucosa, hierro,
fosfato, protena total, urea, cido rico y muchas enzimas,
por ejemplo, fosfatasa cida, fosfatasa alcalina, alanina tran-
saminasa, creatina cinasa y lactato deshidrogenasa.
Turbidimetra y nefelometra
Estas tcnicas relacionadas se emplean mucho en los la-
boratorios clnicos como los medios de conducir ciertos
inmunoensayos. Ambas se basan sobre la medicin de la
dispersin de la luz inducida por partculas. Cuando la luz
se dirige a travs de una solucin que contiene partculas
suspendidas, parte de la luz se dispersa, otra se absorbe y
el resto se transmite a travs del lquido. Esta interaccin
puede utilizarse para medir la concentracin de partculas
en la suspensin por la medicin de la luz transmitida (tur-
bidimetra) o midiendo la luz dispersada (nefelometra).
La dispersin de la luz implica una interaccin directa
entre la luz y la partcula que golpea. Cuando un haz de luz
golpea una partcula, su campo elctrico mueve los electro-
nes de la partcula en una direccin prxima al ncleo. Los
electrones se mueven hacia adelante y en reversa en fase con
la frecuencia de la onda de la luz incidente. Esto produce
un dipolo oscilante, cuyo tamao depende de la fuerza del
campo elctrico (relacionado con la frecuencia) y de la po-
laridad de los electrones de la partcula. El dipolo oscilante
se convierte en una fuente de radiacin electromagntica e
irradia luz, de la misma frecuencia que la luz incidente pero
en todas direcciones. La cantidad y distribucin de la luz
dispersada tambin depende del tamao y de la concentra-
cin de la partcula, y de la polarizacin del haz de luz.
Para las partculas ms pequeas que un dcimo de la
longitud de onda de la luz incidente, las ondas de luz re-
irradiadas estn en fase y se refuerzan una con otra, pro-
duciendo un simtrico, aunque no esfrico, patrn de luz
dispersa. Esto se llama dispersin de Rayleigh. Partculas
ms grandes (p. ej., complejos inmunoglobulina-antgeno)
actan como fuentes del punto aleatoriamente espaciadas,
y la interferencia destructiva entre la luz que emerge de
diversos sitios dentro de la partcula ocurre, creando un
patrn mximo y mnimo de la luz reirradiada. Se conoce
como la dispersin de Rayleigh-Debye y, junto con la dis-
persin de Rayleigh, se ilustra en la gura 41-2. Entre ms
luz se dispersa hacia adelante el tamao de la partcula se
incrementa, y la medicin de la dispersin de luz asimtri-
ca se puede utilizar para medir el tamao de la partcula. La
luz de longitud de onda corta (azul) se esparce mucho ms
que la luz de longitud de onda ms grande (rojo).
Aplicaciones
Los inmunoensayos que implican sistemas de deteccin
nefelomtricos o turbidimtricos, o ambos, se utilizan para
medir ciertos analitos para los cuales ningn reactivo colo-
rimtrico especco est disponible, por ejemplo, protena
C reactiva (CRP), componentes C
3
y C
4
del complemento,
e inmunoglobulinas individuales. Se mezclan la solucin
de la protena y el anticuerpo apropiado y se dejan que re-
accionen para formar complejos grandes que dispersan ms
luz que un anticuerpo o la protena. La sensibilidad est por
lo comn dentro del rango bajo mg/L. La dispersin grande
de luz que se produce cuando el cloruro de cetilpiridinio
se agrega a la orina que contiene mucopolisacridos es un
ejemplo de un uso no inmunolgico de la turbidimetra.
Turbidmetros
En teora, la turbidimetra puede medirse por cualquier
fotmetro o espectrofotmetro estndar. Debido a que un
pequeo cambio en la luz transmitida se mide en presencia
de una seal grande del fondo, los instrumentos con un co-
ciente seal:ruido alto son deseables. Un turbidmetro es-
pecializado simple consiste en una fuente de luz halgena
de cuarzo, un ltro de interferencia de banda estrecha, una
pinza de sujecin para la cubeta de la muestra y un foto-
diodo o un fotomultiplicador (g. 41-3) de la cubeta de la
muestra. El uso de la luz de longitud de onda corta ofrece
la ventaja del incremento de la dispersin y por tanto de
una seal ms grande, pero en soluciones biolgicas la ab-
sorcin de luz tambin aumentar. Consecuentemente la
formacin del complejo antgeno-anticuerpo por lo general
se mide en el rango 340 a 400 nm. Para una buena medicin
es necesario una sincronizacin, la adicin, el mezclado y
Figura 41-2 Patrones de la distribucin angular bidimensio-
nales para: a) Dispersin de luz Rayleigh a partir de una partcula
pequea. b) Dispersin de luz Rayleigh-Debye a partir de una
partcula ms grande, inmunoglobulina-antgeno.
Figura 41-3 Componentes bsicos de un turbidmetro, que mide la luz transmitida, y un nefelmetro que mide la dispersin de luz.
LUMINISCENCIA 399
la lectura del reactivo. Cuando el tamao de la partcula
aumenta de manera lenta con el tiempo, la tasa de dismi-
nucin en la luz transmitida se calcula de mejor manera a
partir de mediciones multipuntuales. Los analizadores fo-
tomtricos discrecionales automatizados son utilizados de
manera extensa por inmunoensayos turbidimtricos.
Nefelmetros
Los nefelmetros comprenden una fuente de luz, un ltro
de la luz incidente, un dispositivo de sujecin de la muestra
y un detector en ngulo jo, para evitar la transmisin di-
recta de la luz. Con tal de que los ltros (o los monocroma-
dores) para las luces incidente y emitida se jen a la misma
longitud de onda, pueden usarse uormetros en los cuales
la luz dispersa se mide a 90, aunque con sensibilidad li-
mitada. La dispersin de luz medida a 90 es ms dbil
que la dispersin de luz hacia adelante. En teora, la mejor
sensibilidad se obtiene colocando el ngulo del detector tan
cerca a 180 como sea posible. Esto requiere un haz de luz
incidente enfocado rmemente y una ptica excelente. En
la prctica, los nefelmetros clnicos emplean ngulos del
detector entre 90 y 170 al eje de la luz del incidente (va-
se g. 41-3). Las mediciones nefelomtricas en ngulos,
excepto el de 90 para la luz incidente se mejoran a partir
de cubetas de perl redondo que sustituyen a las de perl
cuadrado. A estos ngulos del detector, las cubetas redon-
das reducen al mnimo la reexin de la luz medida por las
paredes de la cubeta. Los nefelmetros con frecuencia se
ajustan con un ltro de corte para evitar que la luz uores-
cente alcance el detector.
Un bulbo de halgeno-cuarzo-tungsteno, se utiliza con
frecuencia. Las fuentes alternativas incluyen lmparas de
xenn y de arco de mercurio, diodos que emiten luz y lse-
res. El lser de helio-nen es en especial til para la nefelo-
metra porque tiene un haz estrecho de alta intensidad, que
no requiere enfocarse o una ptica para enfocar. Desafor-
tunadamente, la luz roja de longitud de onda larga (632.8
nm), no se dispersa tanto como la luz de longitud de onda
corta. El detector debe blindarse de forma correcta para re-
ducir al mnimo la interferencia a partir de la desviacin
de la luz. Para la sensibilidad mxima, los nefelmetros
especializados emplean detectores fotomultiplicadores de
bajo ruido.
La longitud de onda para la dispersin ptima por com-
plejos anticuerpo-antgeno en su totalidad formados se
acerca a 460 nm. Sin embargo, en inmunoensayos cinticos
se ha demostrado que la longitud de onda ptima cambia
mientras los complejos inmunitarios se elevan. Para estos
ensayos, muy utilizados, la luz monocromtica es indesea-
ble y la luz incidente sobre una banda amplia (entre 450 y
550 nm) aporta tasas mximas ms reproducibles.
El equipo Beckman Immage
es un ejemplo bien esta-

blecido de un nefelmetro del laboratorio clnico. La dilu-
cin automtica de la muestra, la adicin del antisuero y
la vericacin del exceso de antgeno son algunas de las
caractersticas de este tipo de analizador especializado. La
diferenciacin electrnica de la seal de luz se utiliza para
identicar y registrar la tasa mxima de reaccin y, a travs
de una curva de calibracin almacenada, para relacionarla
con la concentracin.
Nefelometra o turbidimetra?
En general, la nefelometra tiene el potencial para ser lige-
ramente ms sensible y proporciona resultados ms rpidos
que la turbidimetra. sta, por otra parte, no requiere un
detector especial y puede realizarse en muchos de los ana-
lizadores clnicos automticos disponibles en la actualidad
que emplean la medicin fotomtrica.
Luminiscencia
La luminiscencia es la emisin de luz o energa radiante que
surge cuando un electrn vuelve desde un nivel de energa
excitado o ms alto a un nivel de energa ms bajo. Exis-
ten varios tipos de fenmenos luminiscentes, que incluyen
la uorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscen-
cia. Aunque los fenmenos luminiscentes se diferencian
en cmo un electrn es activado al estado excitado, produ-
cen emisiones similares de energa radiante.
Fluorescencia
Cuando la luz choca con una sustancia molecular, bastante
energa a una longitud de onda especca puede absorberse
y ocasionar que la sustancia altere su conguracin elec-
trnica colocando algunos de los electrones en un estado
excitado. Esta condicin es de breve duracin y los elec-
trones excitados vuelven rpido al estado fundamental.
Si la sustancia es de una estructura qumica particular, la
transicin puede ser un proceso multietapa, en cuya etapa
principal libera luz emitida con una energa ms baja que
la luz de excitacin. Los otros pasos en la transicin al
estado fundamental son sobre todo la prdida de energa
vibratoria, debido a las colisiones del electrn. La luz emi-
tida que se produce cuando la sustancia pasa de un esta-
do excitado al estado fundamental se llama uorescencia.
Muchas molculas muestran uorescencia (uorforos)
que proporciona la base de un mtodo sensible de cuan-
ticacin. La mayor parte de los compuestos que exhiben
uorescencia contienen por lo general sistemas de unin
mltiple conjugado con electrones sin localizacin re-
lacionados. Casi todos los uorforos que despiden luz
uorescente intensa tienen estructuras planares rgidas y
grupos donadores de electrones. Para soluciones diluidas,
la intensidad de la uorescencia es directamente propor-
cional a la concentracin del uorforo. Los mximos de
longitud de onda de la absorcin y de la emisin son tam-
bin tiles en la identicacin de sustancias. La diferencia
entre los mximos de la longitud de onda de excitacin y
de la emisin es conocida como el cambio de Stokes, y la
eciencia del quanto es una medida de la cantidad de
luz emitida. Si el cambio de Stokes es grande, es ms fcil
medir la luz emitida sin interferencia de la luz incidente.
Tambin, si la eciencia del quanto es alta, la seal es ms
fuerte y el ensayo ms sensible. El anlisis sanguneo y de
orina para porrinas es un buen ejemplo del uso cualitativo
y cuantitativo de la uorescencia.
Fluorescencia en comparacin con fotometra
Las mediciones de la uorescencia son ms sensibles que las
mediciones de la absorbancia y de la dispersin de la luz. La
magnitud de la absorbancia de un cromforo en la solucin es
determinada por su concentracin y la longitud de la trayec-
toria de la cubeta. La magnitud de intensidad de la uores-
cencia de un uorforo es determinada por su concentracin,
la longitud de la trayectoria y la intensidad de la fuente de luz.
Para las soluciones diluidas, la intensidad de la uorescencia
es directamente proporcional a la concentracin del uor-
foro. Con el uso de fuentes de luz ms intensas, de tcnicas
de ltracin de la seal digital y de fotmetros de emisin
sensible, la sensibilidad de las mediciones de la uorescencia
puede ser 100 a 1 000 veces ms grande que la sensibilidad
de las mediciones de la absorbancia.
Aplicaciones de uorescencia
Los ensayos que emplean tcnicas de medicin uorescente
se utilizan de rutina en el laboratorio clnico para determi-
nar porrinas, frmacos, hormonas, protenas especcas y
anticuerpos, y para la fenotipicacin celular. Los mtodos
usados incluyen la medicin directa de la luz emitida y una
variedad de inmunoensayos que usan tcnicas como po-
larizacin uorescente, uorescencia de tiempo resuelto,
uorescencia/citometra de ujo inducida por lser y, en
los laboratorios de serologa, la microscopia uorescente.
Fluormetros
La gura 41-4 ilustra el arreglo ptico en un uormetro
simple. La longitud de onda de excitacin apropiada se l-
Figura 41-4 Componentes bsicos de un uormetro
tra desde la fuente y se dirige dentro de la solucin conte-
nida en la cubeta. La luz uorescente resultante se emite
en todas las direcciones, pero es importante monitorear la
luz que emerge perpendicular al haz incidente, la parte sin
absorber que pasa a travs de la cubeta y entra a una tram-
pa de luz. La emisin de la longitud de onda se selecciona
a partir de luz emitida o secundaria y el haz se dirige ha-
cia el detector, por lo comn un fotomultiplicador. La sali-
da de ste se amplica y procesa tanto como se necesite. Si
el aumento del amplicador y la fuente de excitacin son
constantes, la lectura de la seal uorescente se relaciona
de manera lineal con la concentracin. Un espectrouor-
metro emplea monocromadores en vez de ltros para la
seleccin de la longitud de onda.
Los uormetros de primera generacin empleaban
con frecuencia lmparas de vapor de mercurio. Estas lm-
paras tienen su salida concentrada dentro de una cantidad
relativamente pequea de bandas nas muy denidas que
limitan la seleccin de la longitud de onda de excitacin.
Una fuente de alta intensidad con un espectro casi con-
tinuo es el arco de xenn. Sin embargo, esta fuente ge-
nera ozono y funciona con una temperatura muy elevada.
La mayor parte de los uormetros dirigidos al mercado
clnico usan una lmpara de halgeno-tungsteno o, para
mayor sensibilidad, un tubo de destello de xenn que pro-
yecta rpidamente.
Espectrouormetros de doble haz. En estos instrumen-
tos, el haz de luz de la fuente se divide y se reparte entre
la cubeta de la muestra y una de referencia. La uorescen-
cia que se produce en cada cubeta es monitoreada por un
tubo fotomultiplicador simple colocado elctricamente en
fase con el interruptor. La seal de la diferencia permite la
sustraccin de la uorescencia producida en la cubeta de
referencia y tambin compensa la desviacin y el parpadeo
de la lmpara.
Analizadores de polarizacin uorescente. Estos instru-
mentos son bsicamente uormetros de ltro a los cua-
les se ha incorporado un grupo de polarizadores de luz de
excitacin y de emisin. La intensidad de la uorescencia
se mide tanto en paralelo como perpendicular al plano del
haz de excitacin. El grado de despolarizacin uores-
cente depende de la rotacin molecular, que se relaciona
con el tamao molecular. Esta tcnica se ha aplicado a los
inmunoensayos homogneos (sin separacin). En estas
aplicaciones, por lo comn se realiza un inmunoensayo de
unin competitiva en el cual un antgeno y uno marcado
con uorescena compiten por los sitios de unin sobre
un anticuerpo. El acoplamiento del marcador uorescen-
te al anticuerpo grande, que rota de manera lenta, ocasiona
que la luz uorescente siga con una polarizacin muy alta. Y
en sentido inverso, el antgeno no unido marcado con uo-
rescena est libre para rotar ms rpido y producir uores-
cencia despolarizada.
Algunos uormetros clnicos de este tipo estn espe-
cializados para medir slo una especie uorescente. Por
ejemplo, el sistema del analizador Abbott TDx
usa reac-
tivos de inmunoensayo marcados con uorescena de ma-
nera exclusiva. Debido a que la uorescena se absorbe en
la regin visible, una fuente de luz halgena de tungsteno
puede usarse. Comparado con otras tcnicas uorimtri-
cas, la sensibilidad es baja y es aplicable slo al ensayo de
molculas pequeas. El analizador de polarizacin TDx

es relativamente simple de operar y es muy til para el mo-
nitoreo del frmaco teraputico.
Fluormetros de tiempo resuelto. Un problema encontra-
do con frecuencia en los inmunoensayos fundamentados en
la uorescencia (en particular en los ensayos homogneos)
es la alta uorescencia de fondo causada por algunos de los
componentes en las muestras sanguneas (p. ej., protenas,
bilirrubina y NADH del suero). El uso de mediciones de
tiempo resuelto y marcadores con tiempos largos de de-
caimiento de la uorescencia (> 500 ns) han mejorado esta
limitacin. Cuando se emplea esta tcnica, la uorescen-
cia del analito se monitorea slo despus que la de fondo
ha declinado. Los sistemas automatizados que usan quela-
tos de lantnido con una muy elevada uorescencia estn
disponibles en el comercio para una amplia gama de inmu-
noensayos. En el sistema Perkin-Elmer AutoDELFIA
, la
medicin se realiza con un uormetro de tiempo resuelto
que, por los quelatos de europio, suministra 1 000 pulsos
de luz/segundo. El detector se enciende por 400 microse-
gundos (s) despus de cada emisin de pulso y recolecta
la luz emitida, a 613 nm, por 400 s (g. 41-5). Son posi-
bles lmites de deteccin tan bajos como 10
-14
mol/L de
quelatos de lantnido.
Quimioluminiscencia
La quimioluminiscencia diere de la uorescencia en que
la excitacin es causada por una reaccin qumica o elec-
troqumica y no por fotoiluminacin. El evento fsico de la
emisin de luz es similar a la uorescencia, en que ocurre
de un estado singlete excitado, y la luz se emite cuando el
electrn vuelve al estado fundamental. La quimioluminis-
cencia implica normalmente la oxidacin de un compuesto
orgnico, como luminol, steres de acridinio o luciferina,
por un oxidante (p. ej., perxido de hidrgeno, hipoclo-
rito u oxgeno); la luz la emite el producto excitado que
se forma en la reaccin de oxidacin. Estas reacciones se
realizan por lo regular en presencia de catalizadores como
LUMINISCENCIA 401
enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rbano),
iones metlicos o complejos metlicos.
Luminmetros
Ya que los inmunoensayos quimioluminiscentes dependen
del uso de compuestos luminiscentes que emiten la luz du-
rante el curso de una reaccin qumica, no hay necesidad
de una fuente de luz incidente. La nica seal que ema-
na de las molculas luminiscentes y, por tanto, debido a
la proporcin alta de seal de ruido, estos ensayos son en
potencia muy sensibles. En principio, la instrumentacin
es relativamente simple, consistiendo en una cubeta para la
reaccin y un dispositivo sensible que mide la luz conteni-
da en un compartimiento hermtico a la luz.
Aplicacin de la quimioluminiscencia
La naturaleza de la emisin de luz de ensayos quimiolu-
miniscentes exige adiciones del reactivo exactas y sincro-
nizadas y procedimientos de mezclado muy reproducibles.
Por tanto, su uso, por lo menos en el laboratorio rutinario,
se conna para utilizarlo en analizadores de inmunoensa-
yos automticos especializados. Su uso como marcadores
en inmunoensayos ahora domina este sector importante
del mercado de diagnstico global. Los ejemplos de las
tcnicas quimioluminiscentes especcas disponibles en
el comercio se describen en seguida. Los inmunoensayos
quimioluminiscentes son muy utilizados para medir hor-
monas, protenas especcas y ciertos frmacos. Para una
explicacin de inmunoensayos, vase el captulo 39.
Quimioluminiscencia directa. Los steres de acridinio
son marcadores quimioluminiscentes que pueden unirse de
forma directa a los antgenos o a los anticuerpos e incor-
porarse en diversas estrategias con inmunoensayos. En la
etapa de generacin de la seal del ensayo, el enlace del
ster se rompe bajo condiciones alcalinas para liberar la
N-metilacridona, compuesto inestable, que se descompone
con la emisin de un ash de la luz. La intensidad mxima
ocurre 0.4 seg despus de la iniciacin, y el periodo del
decaimiento a 0.9 seg. ste es el principio que se emplea
en los sistemas Bayer ACS180
y Centaur
.
Quimioluminiscencia realzada. La adicin de ciertos pro-
ductos qumicos puede aumentar mucho la salida de la luz,
por ejemplo, la peroxidasa de rbano, en presencia del pe-
rxido de hidrgeno, causa la oxidacin del luminol con la
emisin de luz. La salida de la luz se aumenta ms de 1 000
veces en presencia de fenoles y de naftoles sustituidos. La
luminiscencia realzada es un resplandor ms bien que un
ash de la luz y persiste por horas, aunque la lectura de la
seal ocurre despus de algunos minutos. Este tipo de ge-
neracin de seal se explota en el sistema de inmunodiag-
nstico Vitros ECi
(Ortho-Clinical Diagnostics).
Inmunoensayos enzimticos quimioluminiscentes. Exis-
ten sustratos que dan lugar a lmites luminiscentes para
todos los marcadores enzimticos de uso general, por
ejemplo, el adamantil 1,2-dioxetano arilfosfato se utiliza
con la fosfatasa alcalina como marcador. La separacin del
enlace del grupo fosfato produce un anin inestable que se
descompone con la emisin de luz, por ejemplo, como
se utiliza en el analizador DPC Immulite
.
Electroquimioluminiscencia. La electroquimioluminiscen-
cia diere de la quimioluminiscencia convencional en que
las especies reactivas que producen las reacciones quimio-
luminiscentes se generan de manera electroqumica a partir
de precursores estables en la supercie de un electrodo. Los
procesos electroquimioluminiscentes se han demostrado
en muchas molculas diferentes por diversos mecanismos,
incluyendo una reaccin tipo oxidorreduccin con rutenio
(Ru
2+
), tris(bipiridil) y tripropilamina. Este principio se em-
plea en los analizadores Roche Elecsys
y E-170
.
Cuando se aplica un potencial elctrico, el marcador de
rutenio se oxida y de forma simultnea la tripropilamina
es tambin oxidada a un catin inestable que pierde de
Figura 41-5 Principio de la uorometra de tiempo resuelto. El
tiempo de declinacin largo del marcador es medido despus de
que la uorescencia de fondo se extingue.
manera espontnea un protn. El radical de tripropilamina
resultante reacciona con el rutenio oxidado, produciendo
un marcador de rutenio excitado que declina con la emisin
de un fotn. La emisin de luz subsiguiente se mide enton-
ces con un fotomultiplicador y se procesa como apropiado
para la cuanticacin.
Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principles of Instrumental
Analysis. 1997: Thomson Learning, Philadelphia, PA.
Wild DG (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001:
Stockton Press, New York.
Introduccin
La espectrometra atmica analtica es el trmino que se
emplea para incluir un nmero de tcnicas que se aplican
de manera extensa para la determinacin de elementos in-
dividuales en los lquidos y tejidos corporales. Las ms im-
portantes son la espectrometra de absorcin atmica y la
de masas por plasma inductivamente acoplado, que con
la de emisin atmica, la de uorescencia atmica y la de
uorescencia de rayos X tambin tienen papeles tiles. Se
aplican sobre todo en la medicin de minerales esenciales
y oligoelementos, por ejemplo, sodio, magnesio, zinc y co-
bre, y en sustancias txicas como aluminio y plomo. Estas
tcnicas consideran las mediciones exactas de concentra-
ciones muy bajas en muestras biolgicas complejas.
Principios
La espectroscopia es el estudio de las interacciones entre
la radiacin de la materia y la electromagntica; cuando se
aplica al anlisis cuantitativo, se utiliza el trmino espec-
trometra. Diferentes tipos de espectrometra conciernen a
varias regiones del espectro electromagntico (p. ej., rayos
X, luz UV, radiacin infrarroja), las propiedades de la ma-
teria con las cuales las interacciones suceden (vibracin
molecular, transiciones del electrn) y las interacciones f-
sicas implicadas (es decir, dispersin, absorcin o emisin
de radiacin).
Las tcnicas espectromtricas atmicas analticas cuan-
titativas incluyen la espectrometra de absorcin atmica
(AAS), de emisin atmica (AES), de uorescencia atmi-
ca (AFS), de masas inorgnicas y la uorescencia de rayos
X (XRF). Las AAS, AES y AFS explotan las interacciones
entre la luz UV y la visible y los electrones de la capa exte-
rior de tomos libres, gaseosos y no cargados. En la XRF,
partculas de alta energa colisionan con los electrones de
la capa exterior de los tomos para iniciar las transiciones
que culminan en la emisin de los fotones de rayos X. En la
espectrometra de masa (MS) inorgnica, un campo mag-
ntico separa los tomos ionizados del analito de acuerdo a
su masa: proporcin de la carga.
Emisin, absorcin y uorescencia atmica
Cada elemento tiene una estructura atmica caracterstica,
con un ncleo con carga positiva rodeado por el nmero
de electrones necesario para mantener una neutralidad. Es-
tos electrones ocupan niveles de energa discreta, pero es
posible para un electrn moverse de un nivel a otro, dentro
del tomo, por la introduccin de energa (gs. 42-1, 42-2 y
42-3). Esta energa puede suministrarse durante colisiones
con otros tomos o con electrones libres, o como fotones a
partir de la luz. Tales transiciones ocurren slo si la ener-
ga disponible es igual a la diferencia entre los dos niveles
(E). Los tomos no cargados pueden existir en el nivel de
energa ms bajo, o estado basal, o en cualquiera de una
serie de estados excitados dependiendo de cuntos elec-
trones se mueven a niveles de energa ms altos, aunque es
normal considerar slo la primera transicin. Los niveles
de energa y las E relacionadas con las transiciones del
electrn son nicas en cada elemento.
La E para los movimientos de los electrones de la capa
exterior en la mayor parte de los elementos corresponde a
la energa equivalente a la radiacin UV visible y son es-
42
Espectrometra atmica analtica
Andrew Taylor
406 CAP. 42 ESPECTROMETRA ATMICA ANALTICA
tas transiciones las que se utilizan en la espectrometra de
AA, AE, y AF. La energa (E) de un fotn se caracteriza
por:
E = hv (1)
donde h = constante de Planck y v = frecuencia de la forma
de onda correspondiente a ese fotn (el concepto dual de
la luz como la forma de onda y partculas discretas no se
considera ms aqu). Adems, la frecuencia y la longitud
de onda estn relacionadas, ya que:
v = c (2)
donde c = velocidad de la luz y = longitud de onda. Por
tanto:
E = hc / (3)
donde se deduce que una transicin especca, E, se rela-
ciona con una longitud de onda nica.
Bajo las condiciones apropiadas, los electrones de la
capa exterior de los tomos del estado basal, vaporizados
dentro del sistema analtico pueden excitarse por energa
trmica (es decir, colisiones con otros tomos). Como estos
tomos regresan al estado basal ms estable, la energa se
pierde, parte de ella en forma de luz emitida, la cual puede
medirse con un detector (g. 42-1). La intensidad de esta
tor se atena. La prdida de luz es proporcional al nmero
de tomos y se entiende como espectrometra de absorcin
atmica (AAS).
Parte de la energa radiante que absorben los tomos
del estado basal puede emitirse como luz cuando los to-
mos retornan al estado basal. Esta emisin se describe
como uorescencia de resonancia y, de nuevo, su intensi-
dad es proporcional al nmero de tomos que estn en la
trayectoria de la luz. La tcnica se conoce como espectro-
metra de uorescencia atmica (g. 42-3).
Figura 42-1 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando la
emisin de energa como luz cuando los tomos descienden desde
un nivel excitado hacia el estado basal.
luz es proporcional al nmero de tomos presentes, y el
proceso es una espectrometra de emisin atmica (AES).
Cuando la luz (energa radiante) de una longitud de
onda caracterstica entra en un sistema analtico, los elec-
trones de la capa exterior de los tomos que estn dentro
de la trayectoria de la luz se excitan cuando la energa se
absorbe (g. 42-2). Por consecuencia, la cantidad de luz
transmitida por el sistema desde una fuente hacia el detec-
Figura 42-2 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando
la absorcin de la energa de luz cuando los tomos se mueven
desde el estado basal hacia un nivel excitado. La luz transmitida
hacia el detector se ha atenuado.
Figura 42-3 Diagrama parcial del nivel de energa mostrando
la absorcin de la energa de luz cuando los tomos se mueven
desde el estado basal hacia un estado excitado, seguido por la
emisin de energa (luz) cuando los tomos vuelven a descender
al estado basal.
De las ecuaciones (1) y (2) se deduce que las longitudes
de onda de la luz absorbida y emitida son las mismas, y
nicas, para un elemento dado. Esto es lo que hace a las
AAS, AES y AFS especcas, de modo que un elemento
puede medirse aun con la presencia de un exceso enorme
de un elemento qumicamente similar.
La ecuacin de Boltzmann (Haswell, 1991) relaciona
las energas con estados diferentes a la estructura atmi-
INSTRUMENTACIN 407
ca y, desde la ecuacin, la proporcin de una poblacin
atmica presente, como tomos excitados, comparada con
los tomos del estado basal puede calcularse. La propor-
cin est inuida por dos caractersticas, la temperatura y
el elemento. En las temperaturas operativas tpicas, la pro-
porcin es al menos de 10
6
:1 para la mayor parte de los
elementos, y las AAS y AFS proporcionan sensibilidad su-
perior a la AES. Con los sistemas que proveen temperatu-
ras ms altas (vase Instrumentacin) la proporcin cambia
y la AES puede ser favorecida. Las estructuras atmicas de
los metales alcalinos (p. ej., sodio, potasio, litio) son tales
que las E son relativamente pequeas, correspondiendo
a longitudes de onda ms largas, y aunque a unos 2 000C
la proporcin de tomos excitados no es alta (de 10
4
a
10
6
:1), las concentraciones de sodio y potasio en las mues-
tras biolgicas son sucientes para que la AES de ama
(tambin denominada fotometra de ama) sea una tcnica
conveniente y bien establecida para medir estos metales en
los laboratorios clnicos.
La espectrometra de absorcin atmica puede utilizar-
se para determinar ms de 60 elementos con instrumentos
que son relativamente econmicos y simples de manejar,
y la cual provee suciente sensibilidad para medir muchos
de estos elementos en las concentraciones presentes en las
muestras clnicas (Haswell, 1991). Un rango similar de ele-
mentos puede medirse con la espectrometra de emisin
atmica. La fotometra de ama es conveniente para los
metales alcalinos en concentraciones altas, pero la AES es
ms til con fuentes de energa de alta temperatura (va-
se Instrumentacin) cuando el anlisis multielemento pue-
de emprenderse. La uorescencia atmica efectiva requiere
fuentes de luz intensa, estable y stas son difciles de cons-
truir ablemente. El mayor xito se obtiene con lmparas
de descarga sin electrodos para los elementos metaloides de
los grupos 4 a 6 de la tabla peridica. Lmites de deteccin
muy bajos se alcanzan para estos elementos con la AFS.
Fluorescencia de rayos X
Cuando los fotones, electrones o protones de alta ener-
ga golpean una muestra slida, un electrn de las capas
interiores (K, L o M) de un tomo constitutivo puede ser
desplazado. La vacante orbital que surge la ocupa un elec-
trn de la capa exterior; con la emisin acompaante de
un fotn de rayos X, esta energa es igual a la diferencia
entre los niveles de energa implicados. Esta emisin se co-
noce como uorescencia de rayos X (XRF). La energa de
emisin, es decir, la longitud de onda, es una caracterstica
del tomo (elemento) a partir del cual se origina, mientras
la intensidad de la emisin se relaciona con la concentra-
cin de los tomos en la muestra. Dependiendo del tipo
de espectrmetro que se emplee para medir la emisin, la
XRF se caracteriza como de longitud de onda dispersiva
(WDXRF) o de energa dispersiva (EDXRF). La XRF por
reexin total (TXRF) se describe como una tcnica, aun-
que es una variacin de EDXRF.
Espectrometra de masas inorgnica
Puesto que las muestras se toman a altas temperaturas, los
componentes orgnicos se destruyen, algunos o la totali-
dad de los elementos inorgnicos se ionizan. Cuando estos
iones se controlan con un espectrmetro de masas, pueden
separarse al pasar por un campo magntico establecido por
un cuadrupolo o algn otro ltro de masa. Estos iones se-
parados de acuerdo a la masa, cociente (m/z) de carga, se
detectan y contabilizan usando un multiplicador de electro-
nes. Este proceso por lo general se describe como espectro-
metra de masas inorgnica o atmica.
Se han empleado varias fuentes de iones, pero para el
manejo ms reciente del anlisis clnico se usa un plasma
inductivamente acoplado (ICP-MS). La tcnica es un ver-
dadero multielemento y provee lmites de deteccin que
estn en el rango de g/L o, en especial para los elementos
con nmero de masa atmica alto, todava ms bajos. Los
elementos que hasta la fecha se han determinado pueden
ahora ser cuanticados con conanza. La otra caractersti-
ca principal de la espectrometra de masas es la capacidad
para medir istopos diferentes del mismo elemento.
Instrumentacin
Absorcin atmica
Un espectrmetro de absorcin atmica consiste de los si-
guientes mdulos:
donde el monocromador, el detector y el visualizador son
similares a los de otros espectrmetros. La caracterstica
esencial de una fuente de luz ptima para la AAS se consigue
suministrando una potencia monocromtica de alta intensi-
dad, con lmparas de ctodo hueco, las cuales se constru-
yen con el elemento a medirse como un componente prin-
cipal del ctodo, de modo que la luz emitida es de la misma
longitud de onda que se requiere para la absorcin atmica
por la muestra. Por consiguiente, se requiere una lmpara
diferente para cada elemento que se mide, y por los costos
implicados, un rango comprensivo de lmparas se mantie-
ne por lo general en pocos laboratorios especializados.
Fuente
de luz
Atomizador Monocromador Detector
Lectura/
visualizador
El atomizador es cualquier dispositivo que genera to-
mos del estado basal como un vapor dentro de la trayec-
toria de la luz instrumental. Si se considera el calcio en una
muestra de suero, el elemento est presente en la solucin,
ligado a la protena, junto con el fosfato y parte del Ca
2
inorgnico. La formacin del vapor atmico (atomizacin)
requiere de los siguientes pasos:
Eliminacin del solvente (secado).
Separacin del anin u otros componentes de la matriz
Ca
2
.
Reduccin: Ca
2
2e

Ca.
La energa necesaria para realizar estos pasos se suministra
como calor, ya sea de una ama o de un horno elctrico.
Al nal, dentro del atomizador hay absorcin de la energa
radiante.
Atomizadores de ama
La disposicin tpica de este atomizador implica un nebu-
lizador neumtico, cmara de premezclado y una ama de
acetileno laminar con una longitud de la trayectoria de 10 cm
(g. 42-4). El ujo de aire de alta velocidad auxiliar causa
Figura 42-4 Diagrama de un nebulizador neumtico, cmara de premezclado y mechero; la imagen inferior muestra el nebulizador con
ms detalle.
la dilucin de la muestra al aspirarse de forma continua por
capilaridad, debido al efecto Venturi. La muestra emerge
del nebulizador, como un aerosol con un amplio rango de
tamaos de gotitas, que se mezcla con los gases de la ama
y se transporta a la ama para la atomizacin. Sin embargo,
slo las gotitas menores de 10 m en realidad entran a la
ama, porque aquellas de tamao ms grande caen hacia los
lados de la cmara de premezclado y se desperdician. Por
consiguiente, menos de 15% de la muestra entra a la ama.
As, con el nebulizador neumtico, la muestra original ex-
perimenta dilucin con los gases de la ama, prdidas en la
cmara de premezclado y considerable expansin trmica
(es decir, dilucin adicional) dentro de la ama. Adems de
la dispersin de la muestra a travs de la ama, hay prdidas
de tomos debido a la formacin de xidos u otras especies
en los mrgenes de la ama. La tasa normal de captacin de
la muestra del nebulizador es de casi 5 ml/min y se necesita
una aspiracin por varios segundos para lograr una seal
constante.
Las ventajas y desventajas del sistema de atomizacin
con nebulizador neumtico de ama se muestran en el
cuadro 42-1. Por su sencillez, velocidad y libertad de in-
terferencias, este planteamiento se preere donde la con-
centracin del analito es apropiada. Las concentraciones
tpicas ms bajas que pueden determinarse se aproximan a
1 g/ml. El aire acetileno se quema a casi 2 000C, en tan-
to que la ama de xido nitroso acetileno es ms caliente,
Muestra
Gas de soporte
Ampliacin de A
Aerosol
Desechos
Muestra
Nebulizador
Combustible y
oxidante auxiliar
Cmara de
premezclado
Mezclado del
aerosol y los
gases de la ama
Mechero
Flama
tiene una temperatura cercana a 3 000C y se utiliza en los
elementos que forman xidos refractarios y no tienen una
atomizacin ecaz en la ama de aire acetileno.
Una mejora en la sensibilidad se obtiene con dispo-
sitivos que superan las limitaciones de los nebulizadores
neumticos listados antes. Estos: a) atrapan tomos para
dar una densidad ms grande dentro de la trayectoria de la
luz, b) circunvalan el nebulizador, de modo que 100% de
la muestra se atomiza, y c) introducen la muestra como un
impulso simple, rpido, ms bien que como un ujo conti-
nuo. Algunos emplean una combinacin de estas caracte-
rsticas. Los dispositivos que se utilizan en una ama, por
ejemplo, el tubo ranurado de cuarzo y la cubeta de Delves,
son ms ecaces con los elementos ms voltiles, como el
zinc, el cadmio y el plomo. Estos tres planteamientos para
mejorar la sensibilidad tambin guran en otros atomiza-
dores utilizados en las AAS, AES, AFS, ICP-MS.
Generacin de hidruros
Ciertos elementos, como arsnico, selenio y bismuto for-
man con facilidad hidruros gaseosos, por ejemplo, la ar-
sina (AsH
3
). Usando instrumentacin adicional simple,
un reductor, como el borohidruro de sodio, se agrega al
matraz de reaccin que contiene la muestra acidicada. El
hidrgeno se forma y ste reacciona con el analito, se de-
sarrolla el hidruro gaseoso y se transere por un ujo de
gas inerte hacia un tubo de slice calentado ubicado en la
trayectoria de la luz. El tubo se calienta con una ama de
aire acetileno o una corriente elctrica y la temperatura es
suciente para causar la disociacin del hidruro y la ato-
mizacin del analito (g. 42-5). As, no hay prdida de la
muestra, todos los tomos entran a la trayectoria de la luz
en unos pocos segundos, y son atrapados dentro del tubo de
slice, que retarda su dispersin. La generacin de hidru-
ros por AAS permite la deteccin de unos cuantos nano-
gramos de analito a partir de cualquier volumen de muestra
que se coloca en el matraz de reaccin. Las variaciones de
la instrumentacin son posibles para procurar una disposi-
cin de ujo continuo, que es ms sencillo de automatizar.
Generacin de vapor de mercurio
El mercurio forma un vapor a la temperatura ambiente y esta
caracterstica es la base para la generacin de vapor fro. Un
agente de reduccin se agrega a la solucin de la muestra
para convertir el Hg
2+
a mercurio elemental. La agitacin o
el burbujeo del gas a travs de la solucin producen la vapo-
rizacin rpida del mercurio atmico, que entonces se trans-
ere a una celda, a travs del ujo, puesta en la trayectoria de
la luz (g. 42-6). Como ocurre en la generacin del hidruro,
el lmite de deteccin es de unos pocos nanogramos y la ins-
trumentacin comn para lograr ambos procedimientos la
han desarrollado algunos fabricantes.
INSTRUMENTACIN 409
Cuadro 42-1 Caractersticas de la nebulizacin neumtica con
atomizacin por ama
Rpida Slo 15% de la muestra entra en la
ama
Reproducible Amplio rango del tamao de las gotitas
Poca interferencia Densidad atmica baja de la muestra
en la ama
Seal constante Las condiciones del mechero imponen
limitaciones sobre el nebulizador
Figura 42-5 Diagrama de un sistema para la generacin del hi-
druro y atomizacin.
Figura 42-6 Diagrama de un sistema para la generacin de va-
por de mercurio.
Trayectoria
de la luz
Tubo de slice
calentado
Hidruro, por
ejemplo, AsH
3
Muestra acidicada
N
2
NaBH
4
Matraz de reaccin
Trayectoria de la luz
Desechos
Aire empujado a
travs del sistema
Trampa fra para
colectar el vapor
de agua
Muestra + agente de reduccin
Hg
2+
+ 2
e
S Hg
Atomizacin electrotrmica
La mayor parte de los sistemas utiliza un tubo de grato
calentado elctricamente; esta tcnica a menudo se deno-
mina atomizacin con horno de grato, aunque se emplean
a veces diversos materiales. El contacto elctrico se hace
con el horno y se aplica un voltaje. La resistencia al u-
jo de corriente provoca el aumento de la temperatura del
horno (como con el elemento de una estufa elctrica). Una
secuencia programada de la temperatura (g. 42-7) puede
ama, el anlisis puede ser automatizado, y los instrumen-
tos modernos se suspenden al nal de una corrida, de modo
que la operacin de toda la noche sin vigilancia es posi-
ble. La atomizacin electrotrmica de la AAS (ETAAS)
est sujeta a mayores interferencias que la AAS de ama
y se requieren varios procedimientos para eliminarlas o
compensarlas. De la misma manera, se utilizan formas
diferentes de materiales de grato (electrograto, grato
pirolticamente recubierto y grato piroltico total), y el di-
seo del horno y el calentamiento pueden optimizarse para
promover la atomizacin y reducir las interferencias. El
establecimiento del detalle metodolgico y de la atencin
cuidadosa cuando el instrumento se suspende cada da es
necesario para obtener resultados correctos y precisos. Los
estudios de funcionamiento del laboratorio demuestran que
tal destreza se encuentra en centros donde el anlisis del
oligoelemento es una actividad principal.
Interferencias
La mayor parte de las tcnicas pueden considerarse razona-
blemente maduras; en ellas las interferencias se subentien-
den y hay procedimientos para superarlas. Los dispositivos
que implican el ujo de soluciones, como en los nebulizado-
res o los sistemas de inyeccin de ujo, proveen resultados
errneos si las muestras y los elementos de calibracin tie-
nen viscosidades desiguales, causando diferentes ritmos de
introduccin en el analizador. Donde ocurre esto, estrate-
gias como la estandarizacin interna, la incorporacin de
estndares o la adicin de reactivos para igualar los ritmos
de ujo proporcionan determinaciones exactas. Las inter-
ferencias qumicas inuyen en el ritmo de la atomizacin.
El calcio ligado al fosfato en el suero no se separa por com-
pleto a 2 000C y enva una seal ms baja que una concen-
tracin equivalente de un calibrante acuoso. La adicin de
un agente de emisin, como el La
3+
, que se liga al fosfato,
evita esta interferencia. Las interferencias qumicas tam-
bin ocurren dentro del horno de grato, como la matriz de
la muestra que causa que los tomos del analito se volatili-
cen y se pierdan durante la fase de incineracin. Los modi-
cantes qumicos se agregan para estabilizar los tomos o
para facilitar la eliminacin de la matriz, o ambas, en una
etapa temprana del ciclo de calentamiento. Las interferen-
cias ms difciles son aquellas que causan la absorcin no
atmica del haz de luz y son por lo comn un resultado de
la naturaleza compleja de los uidos biolgicos. La com-
pensacin para la absorcin no atmica se logra usando
modicantes qumicos para promover la destruccin de la
matriz orgnica, con dispositivos para establecer las condi-
ciones de la atomizacin isotrmica y con las tcnicas de
correccin del fondo (cuadro 42-2).
Figura 42-7 Un ejemplo de un programa de calentamiento sim-
ple para la atomizacin electrotrmica.
establecerse de modo que la solucin puesta dentro del hor-
no se seque cuidadosamente; el material orgnico entonces
se destruye y los iones del analito se disocian de los anio-
nes. Con un aumento rpido en la temperatura, los iones se
reducen a tomos del estado basal por la absorcin de luz.
Un aumento pequeo adicional de la temperatura asegura
que el tubo de grato est limpio para la muestra siguiente.
Las temperaturas de atomizacin que pueden alcanzarse
por esta tcnica, hasta 3 000C, permite que los elemen-
tos refractarios como el aluminio y el cromo sean posible
medirlos. Por lo comn, slo 10 a 50 l de la muestra se
inyecta en el horno, as las muestras muy pequeas pueden
acomodarse, y porque toda la muestra se atomiza dentro
de un volumen pequeo, una poblacin densa del tomo se
produce en la trayectoria de la luz. La tcnica es, por tanto,
muy sensible, lo que permite la medicin de las concentra-
ciones en g/L. Aunque es lento comparado con la AAS de
Emisin atmica
La instrumentacin para la emisin atmica incluye:
INSTRUMENTACIN 411
Las lecturas simultneas es posible hacerlas con el segundo
arreglo, como cuando en cada uno de los monocromado-
res se coloca para transmitir la luz de longitudes de onda
predeterminadas. Un instrumento de lectura secuencial es
menos costoso que un instrumento de lectura simultnea,
pero ms muestras se requieren para tomar una serie de lec-
turas. Para la mayor parte de los elementos, la sensibilidad
analtica del ICP-AES es similar a la que se obtiene con la
AAS de ama.
Cuadro 42-2 Planteamientos para eliminar la absorcin no atmica
Tcnica Motivo Ejemplos
Modicantes qumicos Promover la destruccin de la matriz de la muestra O
2
, Mg(NO
3
)
2
, (NH
4
)
2
HPO
4

Retrasar la atomizacin del analito Pd
2+
, Ru
2+
Atomizacin isotrmica Reducir las interacciones de la fase de vapor retrasando Plataforma LVov, sonda de grato,
la atomizacin hasta que el horno alcance hornos originales
temperatura constante
Correccin del fondo Medir por separado la absorcin total y la no atmica; BC de deuterio, BC efecto de Zeeman,
la diferencia = absorcin atmica BC Smith-Heijfte
Como se indica antes, la fuente de calor para la atomizacin
y la excitacin a un nivel de energa ms alto puede ser una
ama. Las alternativas histricas incluyen arcos y chispas,
pero los instrumentos modernos utilizan el argn o algn
otro gas en un estado ionizado, que se llama plasma.
Plasmas acoplados inductivamente
El plasma se inicia por el sembrado de una chispa de alto
voltaje para ionizar los tomos:
Ar e

Ar

2e
y se sostiene con la energa de una bobina de induccin co-

nectada a un generador de radiofrecuencia. Esto se conoce
como plasma inductivamente acoplado (ICP).
Los plasmas persisten a temperaturas de hasta 10 000C
y en el instrumento tienen el aspecto de una antorcha (g.
42-8). Las muestras pueden introducirse va nebulizador
o, en cuanto a la AAS, por la generacin de hidruro, la
generacin de vapor fro o la vaporizacin electrotrmica
desde un atomizador de grato. La caracterstica principal
de la AES es que permite el anlisis multielemento. Los
sistemas pticos dirigen la luz emitida ya sea va monocro-
mador hacia un solo detector o un conjunto de monocroma-
dores y detectores colocados alrededor del plasma. Con el
primer arreglo, una serie secuencial de lecturas puede ha-
cerse con los monocromadores guiados para proporcionar,
a su vez, cada una de las longitudes de onda de inters.
Figura 42-8 Unidad de la linterna para el plasma inductivamen-
te acoplado.
Atomizador/
fuente de excitacin
Monocromador Detector
Lectura/
visualizador
Interferencias
En las altas temperaturas operativas del ICP, ocurren mu-
chas transiciones de energa, dando lugar al potencial para
las interferencias espectrales, donde la emisin de luz de
elementos diferentes ocurre en longitudes de onda que es-
tn tan juntas que no es fcil que se logre separarlas por
el ancho de banda del espectrmetro. La mayor parte de
stas se documentan, de modo que donde se sospecha una
interferencia puede utilizarse una lnea alternativa de reso-
nancia para la medicin.
Fluorescencia atmica
Pocos instrumentos comerciales para AFS estn disponibles,
y stos se connan a la medicin de elementos que forman
hidruros y mercurio. Los componentes son similares a los
de la AAS. Las lmparas de descarga sin electrodos se uti-
lizan para la fuente de luz y la trayectoria ptica se modi-
ca de modo que slo la luz emitida uorescente alcanza
el detector. Ciertas interferencias son comunes a la genera-
cin del hidruro, cualquiera que sea el detector utilizado. Si
un elemento que forma hidruros est presente en la muestra
en cantidades grandes, consumir el agente de reduccin de
manera que otros elementos no se detecten. Las altas con-
centraciones de los elementos de transicin tambin inhiben
la formacin del hidruro. Donde esto puede ser un problema
el analito puede separarse de la matriz, por ejemplo, por que-
lacin y la extraccin del solvente o por cromatografa.
Fluorescencia de rayos X
Las muestras son irradiadas por fotones de alta energa,
casi siempre el haz policromtico primario de los tubos de
rayos X. Sin embargo, el uso de istopos radiactivos como
244
Cm,
241
Am,
55
Fe y
109
Cd son las fuentes de inters en las
aplicaciones clnicas. El ltimo es en particular importante
como fuente en los instrumentos porttiles desarrollados
para la XRF in vivo (vase adelante, Aplicaciones).
Mientras la matriz de la muestra contribuye de manera
considerable a la intensidad de la seal, la calibracin pue-
de ser difcil, requiriendo por lo general el uso de diferen-
tes materiales de referencia o de estandarizacin interna,
o ambos. Pocos problemas se encuentran si las muestras
son preparadas como frotis muy nos y en la TXRF. Junto
con el efecto de la matriz, la sensibilidad tambin est in-
uida por la longitud de onda, de modo que los elementos
ms ligeros presentan un desafo analtico difcil.
En WDXRF, los rayos X de alta intensidad se utilizan
para inducir la emisin de uorescencia, que es dispersada
en lneas espectrales individuales por la reexin en un
cristal del analizador. Los rayos difractados se enfocan y se
dirigen sobre un detector del fotn. Como con el ICP-AES,
los espectrmetros pueden funcionar en secuencia con un
nmero de cristales intercambiables para permitir la medi-
cin del rango completo de elementos, o en un modo mul-
ticanal (simultneo), normalmente preestablecidos para
los analitos especcos. Los lmites de deteccin para los
elementos ligeros son 10 a 100 veces ms bajos que con la
EDXRF. La resolucin es buena, aunque menor a tales lon-
gitudes de onda ms cortas. Los instrumentos secuenciales
requieren tiempos de anlisis largos para medir varios ele-
mentos, comparados con los instrumentos simultneos o la
tecnologa de la EDXRF.
Para EDXRF, los rayos X emitidos de la muestra se diri-
gen juntos en un detector de cristal. Un pulso de la corrien-
te se genera con una altura que es proporcional a la energa
del fotn de rayos X. Las diferentes energas relacionadas
entre varios tomos (elementos) en la muestra se clasican
electrnicamente; se utilizan fuentes de energa ms bajas
(un tubo de rayos X de bajo poder o una fuente isotpica).
El detector tiene que mantenerse a una temperatura muy
baja y en un vaco limpio. Los tiempos del anlisis son 10
a 30 veces ms largos que con la WDXRF pero, con una
tcnica verdadera multielemento, el tiempo total no es ne-
cesario que sea mayor.
Cuando un haz enfocante de rayos X se dirige contra una
supercie ptica plana en un ngulo de alrededor de 5 (5/60
de un grado), la reexin total ocurrir. ste es el princi-
pio de la TXRF, en la cual la muestra se expone a los rayos
primarios y reejados totales y se excita para uorescencia.
La radiacin emitida se resuelve y se mide como un espectro
ED. Puesto que de hecho no hay absorcin por la matriz, la
medicin y la calibracin son mucho ms simples y las sensi-
bilidades son mayores que con otras tcnicas de rayos X.
Espectrometra de masas inorgnica
Los mdulos requeridos para la espectrometra de masas
inorgnica incluyen:
Fuentes del ion
Segn se menciona antes, hay un nmero de dispositivos
de generacin de ion, pero el ms utilizado es el ICP. Las
muestras se introducen por lo comn al plasma va nebuli-
zador o por vaporizacin qumica (generacin del hidruro
y del vapor fro de mercurio). A veces se utilizan la va-
porizacin electrotrmica y la vaporizacin causada por la
ablacin lser de una muestra slida .
Introduccin
de la muestra/ge-
neracin del ion
Enfocamiento
del ion
Separacin
del ion
Detector
Lectura y
visualizacin
Analizadores de masa
La antorcha del plasma inductivamente acoplado es inter-
conectada al analizador de masas va dos conos metlicos
(colector de la muestra y muestreador), a travs de los
cuales los iones se extraen dentro de la unidad de focali-
zacin del ion, donde un sistema de lentes del ion dirige los
iones al analizador de masas. Varias conguraciones del
analizador estn disponibles en el comercio. Aquellos con
un sistema de cuadrupolo tienen un poder de resolucin
limitado, permitiendo la separacin de la especie sobre una
base de la unidad m/z. Para explotar la capacidad mxima
de la tcnica, la fuente del ICP tiene que ser acoplada a un
analizador de masas de sector del campo de alta resolucin,
que puede alcanzar una resolucin mucho mayor y con una
sensibilidad ms alta que con ICP-MS de cuadrupolo. Los
espectrmetros de masas por tiempo de vuelo son en parti-
cular tiles para el anlisis de seales rpidas, transitorias,
como las generadas por la vaporizacin electrotrmica.
Interferencias
El ICP-MS est sujeto a muchas interferencias espectrales
causadas por el traslape de los istopos, o de diferentes
elementos o iones formados de los componentes de la ma-
triz y del gas del plasma. Ejemplos importantes para los
anlisis clnicos incluyen
40
Ar
+
sobre
40
Ca,
31
P
16
O
+
2
sobre
63
Cu,
40
Ar
+35
Cl
+
sobre
75
As y
40
Ar
+
2
sobre
80
Se. El ICP-MS
del sector de campo no est sujeto a la mayor parte de estas
interferencias, aunque la prdida de sensibilidad se observa
cuando se emplea alta resolucin. Esto puede conducir a
problemas con algunas aplicaciones. Un desarrollo relati-
vamente nuevo de instrumentos cuadrupolo se est usando
en las celdas de colisin, donde una celda llena de gas se
incluye en la unidad de focalizacin. Las colisiones entre
los iones poliatmicos y el gas llenador causa que los pri-
meros se disocien y las interferencias espectrales se reduz-
can mucho. Otro acercamiento implica la separacin de los
iones del analito de aquellos implicados en la formacin
de las especies poliatmicas. La separacin puede lograr-
se con la vaporizacin de la muestra, por ejemplo, con la
generacin del hidruro o la vaporizacin electrotrmica, o
preanalticamente con cromatografa o alguna tcnica si-
milar. La adicin de nitrgeno, de helio o de metano al gas
portador o al solvente orgnico del diluyente reduce algu-
nas de las interferencias basadas en el argn.
Las interferencias no espectrales, relacionadas con la in-
troduccin de la muestra, con las uctuaciones del plasma,
etc., se eliminan de forma ecaz usando un estndar inter-
no. ste debe ser un elemento no presente en la muestra
original, ni sujeto a las interferencias espectrales, y con una
masa y energa de ionizacin prxima a la de los analitos.
Tambin se usa con frecuencia para las muestras biolgicas
en el escandio, para las masas de hasta 80 unidades at-
micas (amu); en el indio, de 80 a 150 amu; e iridio, en las
masas arriba de 150 amu.
Aplicaciones
Se requieren mediciones de minerales y de oligoelemen-
tos para investigaciones clnicas diferentes (Taylor, 1996).
Ciertos grupos pueden tener ingestas nutricionales decien-
tes de los elementos esenciales, por ejemplo, los ancianos,
los nios desfavorecidos y las mujeres durante el embarazo,
y las deciencias de hierro, zinc y de selenio son frecuen-
tes en estos grupos. La deciencia de los oligoelementos
esenciales tambin puede ocurrir durante la alimentacin
parenteral total, por lo que los protocolos para la monito-
rizacin regular de pacientes por lo general se recomien-
dan. En otras situaciones, el envenenamiento yatrognico
puede ocurrir. Las concentraciones sricas de aluminio se
miden de manera regular en pacientes con falla renal crni-
ca, debido al uso de agentes orales ligadores de fosfato que
contienen aluminio y tambin por posible contaminacin de
los uidos de la dilisis. Los uidos de la dilisis pueden
llegar a contaminarse con otros elementos; en este sentido
se han reportado casos txicos relacionados con el cobre
y el zinc. El diagnstico y el monitoreo de errores innatos
del metabolismo del oligoelemento requiere por lo comn
mediciones del elemento implicado.
La exposicin aumentada a los minerales y oligoelemen-
tos puede causar morbilidad; algunos son carcinognicos
(Baldwin y Marshall, 1999). Mientras que las funciones
de muchos rganos se pueden perturbar por la acumula-
cin de metales; los sistemas del rin, del hgado, nervio-
sos, intestinales y hematopoyticos es ms probable que
estn implicados. Las exposiciones accidentales (incluso
suicidas u homicidas deliberadas) a los oligoelementos se
consideran en el diagnstico diferencial al considerar los
signos y sntomas que implican estos sitios. La exposicin
indebida puede ser resultado de las fuentes dentro del am-
biente, o en la casa, relacionado con los pasatiempos, o los
cosmticos y los remedios poco comunes.
En el escenario ocupacional, puede haber exposicin
aumentada a los materiales con potencial txico reconoci-
do. La determinacin de las concentraciones en las mues-
tras adecuadas es un requisito estatutario para el plomo,
y la monitorizacin biolgica es tambin importante en la
implementacin de regulaciones del UK Control of Subs-
tances Hazardous to Health (COSHH).
Las muestras habituales para el anlisis son los uidos
corporales, sangre, suero y orina (Walker, 1998; www.
APLICACIONES 413
sas-centre.org). El pelo y las uas se toman de cuando en
cuando para investigar situaciones de sobreexposicin.
Las condiciones clnicas en las cuales los tejidos es ms
probable que se analicen son la enfermedad de Wilson y la
hemocromatosis, las concentraciones de cobre y hierro,
respectivamente, en el hgado son tales que aun las mues-
tras de biopsia pueden investigarse. Las muestras ms
grandes de tejidos removidos durante la ciruga o post mor-
tem pueden analizarse para investigaciones especiales.
Muchas investigaciones clnicas se relacionan con las
mediciones de apenas uno o dos elementos en una muestra:
o los sntomas son sugestivos de, o hay perturbacin cono-
cida de la exposicin a ese elemento. En estas situaciones
las AAS y AFS son tcnicas ideales sensibles y exactas. Los
panoramas donde los anlisis multielemento son tiles estn
llegando a ser ms comunes hoy. La AES no es a menudo
apropiada para el anlisis de los uidos biolgicos pero s
para el anlisis multielemento en las muestras de tejidos y
alimentos, donde las concentraciones son ms altas. Para los
estudios que requieren el anlisis multielemento de la sangre
u orina, o ambas, por ejemplo, posible insuciencia nutricio-
nal, lanzamiento de implantes prostticos y envenenamien-
tos no identicados, el ICP-MS aporta la tcnica ms simple,
rentable y, con frecuencia, la ms sensible.
Los resultados pueden ser ms informativos cuando se
presentan como concentraciones del elemento en protenas
especcas o algn otro complejo o molcula, ms bien que
como la concentracin total en la muestra. Se han descrito
varias tcnicas para el muestreo; algunas de ellas pueden aco-
plarse de manera directa al espectrmetro en un arreglo tn-
dem para el anlisis. La uorescencia atmica, el ICP-AES y
el ICP-MS se utilizan por lo general para la deteccin.
La facilidad adicional del ICP-MS, para determinar los
istopos estables individuales, se explota en los estudios
metablicos y en las mediciones de la absorcin intestinal.
Las dosis del trazador con un contenido enriquecido de un
istopo pueden administrarse sin exponer a los sujetos a la
radiactividad en potencia daina, como ocurre cuando los ra-
dioistopos se emplean para tal trabajo. En los elementos,
como plomo y estroncio, los istopos se generan de forma
parcial por el decaimiento radiactivo de otros elementos; los
cocientes entre los istopos son caractersticos en diferentes
localizaciones geogrcas. A partir de la medicin de los
cocientes del istopo en los materiales biolgicos y ambien-
tales, las fuentes de la exposicin pueden identicarse.
La XRF no desempea un papel importante en las
mediciones de los oligoelementos en las investigaciones
clnicas, pero los desarrollos recientes abren algunas po-
sibilidades interesantes. Instrumentos convenientes se
disean para utilizarse al analizar tejidos prximos a las
supercies ms externas del cuerpo, tales como los huesos
en la rodilla, los dedos y el crneo. Las mediciones in vivo
del plomo se han emprendido para determinar las exposi-
ciones acumulativas en los trabajadores del plomo, y para
investigar la remocin desde las reservas del hueso dentro
de la circulacin durante el embarazo.
Aseguramiento de la calidad
Aparte del anlisis real, la contaminacin adventicia es el
factor que tiene el impacto ms grande en la calidad de
resultados. La contaminacin puede ocurrir durante la co-
lecta y el almacenaje de las muestras del procedimiento
preparatorio y de la medicin espectromtrica. La aten-
cin escrupulosa en la limpieza y el detalle metodolgico
son esenciales para obtener resultados signicativos. Los
datos de los esquemas de valoracin de la calidad indican
que, mientras algunos laboratorios generales del hospital
obtienen buenos resultados, son los centros especialistas en
oligoelementos los que tienden a mantener los estndares
ms altos de funcionamiento. Esta observacin reeja la
aplicacin continua de prcticas para reducir al mnimo
la contaminacin, y su destreza y experiencia en asegurar
el funcionamiento ptimo del equipo. Tales centros tam-
bin acumulan experiencia con los casos clnicos raros y
estn bien posicionados para proporcionar la asesora y la
interpretacin.
Debido a la estabilidad de los analitos inorgnicos y la pu-
reza con la cual los materiales estndares pueden prepararse,
hay una cantidad razonable de materiales de referencia dispo-
nibles para emplear en la validacin de los mtodos y para el
control de calidad interno y externo. A diferencia de muchos
otros procedimientos clnicos de laboratorio, y en parte como
una consecuencia del uso amplio de los materiales de refe-
rencia certicados, la exactitud es un concepto directo y no se
dene en el contexto de metodologas particulares.
Conclusiones
Con las mejoras recientes en la conabilidad del equipo y
su desarrollo para reducir las interferencias, la ETAAS y el
ICP-MS son las tcnicas ms convenientes para la medicin
de los minerales y de los oligoelementos en las muestras
clnicas. Para ciertas aplicaciones especcas las AES, AFS
y XRF son en particular adecuadas. La importancia clnica
de la fotometra de ama disminuye con la introduccin de
los electrodos selectivos de ion sodio y potasio.
La descripcin de los principios de las tcnicas espec-
tromtricas atmicas y los considerables detalles de la ins-
trumentacin y las aplicaciones se encuentran en muchos
libros de texto (p. ej., Haswell, 1991; Sneddon, 2002). Una
fuente de informacin valiosa que describe los desarrollos
Sneddon J (ed.). Advances in Atomic Spectroscopy, vol. 7, 2002;
Elsevier, Amsterdam.
Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace
elements. Ann Clin Biochem 1996; 33: 486-510.
Taylor A, Branch S, Halls DJ, Patriarca M, White M. ASU: clini-
cal and biological materials, foods and beverages. J Anal Atom
Spectrom 2004; 19, 505-556.
Walker AW (ed.). SAS trace element laboratories. In Clinical and
Analytical Handbook, 3rd edn. 1997: Royal Surrey County
Hospital, Guildford, UK.
actuales en la espectrometra atmica analtica para los ma-
teriales biolgicos y clnicos, los alimentos y las bebidas se
da en una revisin anual, por parte del Atomic Spectrome-
try Update (Taylor et al., 2003).
Referencias
Baldwin DR, Marshall WJ. Heavy metal poisoning and its labora-
tory investigation. Ann Clin Biochem, 1999; 36: 401-407
Haswell S (ed.). Atomic Absorption Spectrometry. Theory, Design
and Applications 1991: Elsevier, Amsterdam.
REFERENCIAS 415
Introduccin
Qumica del reactivo seco, qumica de la capa na, qumica
de la tira reactiva y qumica analtica de soporte slido son
sinnimos. Describen tcnicas basadas sobre la incorpora-
cin de uno o ms reactivo qumicos en una unidad porttil
conveniente, que se puede entonces utilizar para realizar
anlisis qumicos sin la necesidad de preparar y transpor-
tar reactivos en forma lquida. El ejemplo probablemente
ms antiguo y familiar es el papel tornasol, que todava se
emplea en las aulas de qumica de la escuela, laboratorios
analticos y en el campo para comprobar el pH del suelo.
Se elabora incorporando un pigmento vegetal derivado del
musgo (descrito primero en ingls en 1502) en los intersti-
cios entre las bras de celulosa del papel; fue utilizado por
Peacham para colorear el papel azul en 1606 (OED, 1989)
y es probable que se haya usado como indicador (la prue-
ba cida) por lo menos durante 300 aos.
Un estmulo profundo al desarrollo de las tcnicas qu-
micas de la capa na fue la invencin de la fotografa. La
propiedad de los haluros de plata para cambiar de color al
exponerse a la luz, la observa por primera vez Fabricius en
1556, y las fotografas en su fase temprana pudo haberlas
producido Schultze en 1727 (Stenger, 1939). Las primeras
pelculas y papeles fotogrcos prcticos se desarrollaron
en el siglo xix, y hoy una pelcula instantnea moderna
de impresin a color puede tener hasta 15 capas discretas,
cada una incluyendo una reaccin qumica o una funcin
fsica distintas, incorporadas en una sola unidad, estable y
porttil.
La primera aplicacin de estas tcnicas en la bioqumica
clnica aparece a mediados de la dcada de 1950, con el de-
sarrollo de las tiras reactivas para medir la glucosa en orina
(Adams y cols., 1957). Un analista, enfermera o paciente
comparativamente inexpertos podran sumergir la tira reac-
tiva dentro de una muestra de orina, y dentro de un par de
minutos podran obtener una medicin semicuantitativa
de la concentracin de glucosa comparando el color desa-
rrollado por la tira con un patrn de color impreso. Esto,
junto con la aplicacin subsiguiente de tecnologa simi-
lar al anlisis de la glucosa sangunea (Marks y Dawson,
1965), revoluciona la vigilancia en pacientes diabticos.
La cuanticacin exacta se mejora con el desarrollo de
fotmetros simples al medir la luz reejada mediante la
lectura de tiras reactivas para la glucosa sangunea (Maz-
zaferri y cols. 1970), llamadas medidores de glucosa, y con
otros progresos importantes que ocurrieron en la dcada de
1970, cuando la tecnologa de la fabricacin de la pelcula
fotogrca se aplica a los anlisis de la qumica clnica.
Hoy, centenares de anlisis estn disponibles en formato
de pelcula na, y se han desarrollado mquinas capaces de
medir colores u otras seales de una amplia gama de tiras
reactivas y de producir un resultado exacto y preciso en
segundos.
La tecnologa tiene el potencial para revolucionar la
prctica de la qumica clnica, tanto en la reduccin del
requerimiento para las habilidades analticas tradicionales
en anlisis comunes, como en la capacidad para que s-
tos se realicen simple y rpidamente fuera de un labora-
torio analtico, por ejemplo, en consultorios o clnicas, en
las ocinas del mdico de cabecera y en el propio hogar
del paciente. Walter y Boguslawski (1988) han revisado el
campo de estudio y han descrito la gama y la tecnologa de
los anlisis disponibles.
43
Tcnicas qumicas de reactivo seco
JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand
418 CAP. 43 TCNICAS QUMICAS DE REACTIVO SECO
Principios de la metodologa
En su forma ms simple, los anlisis qumicos de capa na
consisten de pigmento u otro reactivo atrapado dentro de
las bras de celulosa de una tira de papel. stos producen
una reaccin visible cuando un analito se difunde dentro
de la matriz, o en forma lquida, por ejemplo, papel torna-
sol y otros papeles indicadores para la valoracin del pH
de un lquido, o en la forma gaseosa, por ejemplo, papel de
hidrxido ferroso para la deteccin del cianuro de hidrge-
no; papel de bromuro mercrico para la deteccin de arsina
(Curry, 1988).
Sistemas ms complejos se forman con una serie de ca-
pas (vanse los ejemplos especcos, ms adelante), cada
una de las cuales contiene una o ms funciones. Bsica-
mente, stas son:
1. Una capa de soporte. sta sostiene los elementos del
reactivo seco. Es por lo general plstico delgado, que
puede transmitir o reejar la luz.
2. Una capa reexiva. Su propsito es reejar de nuevo al
ojo o al detector mecnico tanto cuanto sea posible la
luz emitida por el qumico de las capas reactivas. Puede
incluirse con la capa de soporte usando un plstico re-
exivo. Como una alternativa, puede colocarse una capa
de un pigmento, como el dixido de titanio, o un mate-
rial reexivo, como una lmina de metal.
3. Una o ms capas analticas. stas por lo general con-
sisten de pelculas delgadas porosas de gelatina en las
cuales uno o ms reactivos se han incluido durante la
fabricacin de la pelcula. Los reactivos deben perma-
necer estables una vez que la capa de la gelatina se haya
secado. Una sola capa es adecuada cuando los reactivos
incorporados no interactan uno con otro en ausencia de
un analito. Las capas mltiples (cada una de las cuales
se seca antes que se aplique la siguiente) son necesarias
para separar los reactivos que interactan recprocamen-
te en ausencia de un analito. As es como la gelatina, o
materiales brosos como celulosa, pueden emplearse.
stos suelen funcionar como ltros (p. ej., separar los
eritrocitos del plasma) o como tamices moleculares,
al separar un producto de reaccin de otro. De manera
alterna, los reactivos pueden introducirse sumergiendo
el material broso dentro de una solucin apropiada, y
secarlos de inmediato.
4. Una capa extendida. sta consiste de un material bro-
so o una membrana. Cuando una gota de la muestra se
aplica, separa muy rpido la muestra hacia fuera, de for-
ma lateral, y permite una difusin uniforme en las capas
analticas.
Las tiras reactivas complejas requieren de una fabrica-
cin muy exacta, en particular cuando son para las capas
analticas, en las cuales la concentracin de reactivo en la
gelatina, el tamao del poro de la gelatina, el grueso de cada
capa, y el grado de secado de cada capa deben ser cuidadosa-
mente controlados (Bevan, 1996). Sin embargo, una vez que
est fabricada, cada tira contiene todos los pasos analticos
requeridos para realizar un ensayo. Ninguna reconstitucin
previa de los reactivos se necesita, la tira es porttil y puede
permanecer estable durante semanas o meses, y el analista
slo necesita aplicar la muestra para comenzar el anlisis.
Resultados semicuantitativos pueden obtenerse igualan-
do el color desarrollado, despus de un tiempo jo, con los
patrones de color impresos. Con la luz del da o buena luz
articial, un analista experimentado con visin normal del
color debe generar resultados dentro de 25% del valor ver-
dadero. Para reacciones evaluadas por UV o por deteccin
de uorescencia, y donde es necesaria una cuanticacin
ms exacta, se requiere un medidor para evaluar el color
u otra seal. La mayor parte de los qumicos del reactivo
seco son vigilados y supervisados por la fotometra reec-
tante difusa (Kortum, 1969); la uorescencia frontal (Pesce
y cols., 1971) tambin puede usarse.
Vigilancia de las reacciones
Puede no ser obvio, con excepcin para un artista, fotgrafo
o fsico, que las propiedades de la luz reejada son diferentes
a las de la luz transmitida y absorbida que es muy conocida
por los analistas. Pero los supuestos colores primarios de las
pinturas y de otros pigmentos (rojo, amarillo y azul) no son
iguales que los de la luz transmitida (rojo, amarillo y verde).
En una galera de arte, se mira una pintura de frente, con la
iluminacin desde arriba. Si una pintura se ilumina en forma
directa de frente, el colorante y el detalle se pierden al obser-
vador debido a la luz reejada no coloreada y dispersada de
su supercie. Estas son las leyes de la fotometra reectante.
Algo de la luz que cae sobre una tira reactiva simple-
mente se reeja en su supercie (reexin especular).
Puesto que sta no ha interactuado con cromforos dentro
de las capas analticas, tiene las mismas propiedades que la
luz de origen, y no puede usarse para vigilar una reaccin.
Parte de luz se incorpora en las capas analticas e interacta
con cromforos antes de regresarse debido a la capa reec-
tante en la tira. La dispersin y la reexin de la luz sin la
interaccin con cromforos ocurren tambin dentro de las
capas analticas. La luz que regresa despus de la transmi-
sin a travs de las capas analticas (reexin difusa), que
contiene una mezcla de luz interactuada y dispersada, se
utiliza para vigilar una reaccin. sta se detecta midiendo
la luz que regresa en un ngulo lejos del haz de reexin
especular principal.
EJEMPLOS ESPECFICOS 419
Despus de la reaccin, la concentracin del analito en
una muestra puede calcularse comparando la cantidad de
luz difusa reejada con una estndar. La relacin se rige
por la ecuacin:
R
u
R
s
I
u
/I
s
donde R
u
es la reectividad porcentual de la muestra, R
s
es
la reectividad porcentual del estndar, I
u
es la intensidad
de la luz reejada por la muestra, e I
s
es la intensidad de la
luz reejada por el estndar. Las mediciones de la reec-
tividad porcentual, como la transmitancia, no son lineales
con respecto a la concentracin, y en la prctica los algo-
ritmos linearizantes, como los de Williams y de Clapper
(1953), se emplean para convertir una medicin de reecti-
vidad porcentual a concentracin.
Los productos uorescentes de una reaccin pueden
vigilarse usando la uorimetra frontal. Los monocroma-
dores se utilizan para separar la luz uorescente emitida
por las capas analticas de luz reejada. Si la extincin
dentro de la tira reactiva es despreciable, la medicin de
la uorescencia es lineal con respecto a la concentracin
del uorforo.
Ejemplos especcos
La qumica del reactivo seco puede utilizarse para medir
muchos centenares de analitos urinarios, metabolitos y pro-
tenas sanguneos. Algunas mediciones se realizan usando
una capa analtica, otras requieren capas mltiples o incor-
poracin de estructuras fsicas, o ambas, dentro de las ca-
pas analticas. Incluso cantidades traza de analitos, como
hormonas y frmacos, pueden medirse utilizando tcnicas
de inmunoensayo dentro de las capas analticas. Los desa-
rrollos ms recientes que usan anticuerpos monoclonales y
sistemas de ensayo inmunomtricos son de uso rutinario en
la actualidad. La mayor parte de estos ensayos los han desa-
rrollado las compaas comerciales, y las consideraciones de
la patente han forzado el desarrollo de diversas soluciones
para los mismos problemas: por lo comn en las uniones de
anticuerpos acoplados a soportes slidos; y la eleccin del
reactivo para desarrollar una seal de color nal. Una selec-
cin de ejemplos especcos se describe ms adelante.
Glucosa
La glucosa fue el primer analito biolgico en ser medido
usando las tcnicas del reactivo seco (Adams y cols., 1957;
Marks y Dawson, 1965) debido a su presencia en una con-
centracin comparativamente alta, la simplicidad relativa
de la reaccin usada y su importancia en la vigilancia de
pacientes con diabetes mellitus. Los mtodos modernos de
glucosa confan en los anlisis enzimticos que utilizan por
lo general la enzima glucosa oxidasa. Un ejemplo tpico
es la tira reactiva Dextrostix

de tres capas, ilustrada en
la gura 43-1. Una muestra sangunea se aplica a la capa
supercial, la cual acta como una capa difusora y mem-
brana semipermeable que separa las clulas sanguneas del
plasma. El plasma de la muestra se difunde en la capa ana-
ltica del papel, que contiene el sistema amortiguador de
la reaccin enzimtica, activada por el agua del plasma.
Dentro de la capa analtica, la glucosa y el oxgeno atmos-
frico reaccionan con la glucosa oxidasa para producir per-
xido de hidrgeno y cido glucnico. En presencia de la
peroxidasa, tambin contenida dentro de la capa analtica,
el perxido de hidrgeno oxida a un indicador redox para
producir un cambio de color visible. La capa de soporte
plstico tambin acta en forma reexiva, y despus de que
las clulas sanguneas se retiran de la supercie, el color
desarrollado puede leerse en la parte superior, en forma vi-
sual (comparando con un patrn de color impreso) o usan-
do un medidor de glucosa.
Se han desarrollado muchas alternativas de esta tira
reactiva simple para la glucosa, por ejemplo, la tira de
Fuji
(Kobyashi y cols., 1982) incorpora una capa enmas-

caradora y reexiva que contiene el pigmento blanco dixi-
do de titanio entre las capas dispersora y analtica. La capa
de soporte es transparente, en lugar de plstico reexivo, y
el cambio del color se lee de la parte inferior. Esto elimina
la necesidad de retirar las clulas sanguneas de la tira.
Alanina aminotransferasa
Muchas enzimas plasmticas pueden medirse usando
tcnicas de reactivo seco, aunque los sistemas analticos
son ms sosticados, porque las enzimas son molculas
grandes que no se difunden fcilmente a travs de matri-
ces. Tambin, en la medicin enzimtica se confa con fre-
cuencia en reacciones multietapas que son en s mismas
enzimticas. El control de fabricacin cuidadoso tanto de
Figura 43-1 Estructura de una tira reactiva para glucosa Dex-
trostix (adaptada de Walter y Boguslaski, 1988).
los reactivos enzimticos como de otros reactivos partici-
pantes, como los cofactores, es por consiguiente necesario.
Algunas capas del reactivo seco para el anlisis enzimtico
tienen entretejidos abiertos que permiten que las enzimas
del suero se incorporen en las capas de una tira reactiva,
por ejemplo, Walter y cols. (1983a, 1983b), mientras que
otros han cerrado los entretejidos que retienen las enzimas
sobre la capa supercial de una laminilla.
Un ejemplo tpico de un sistema de entretejido cerrado es
el mtodo de Vitros (antes Ektachem
) (Eastman Kodak Co.,

1992) para la alanina aminotransferasa (ALT). La capa dis-
persante, que es semipermeable y conserva la enzima srica,
tambin contiene sustratos de ALT de L-alanina y -oxogluta-
rato de sodio. La ALT cataliza la transferencia de un grupo
amino desde la L-alanina a la -oxoglutarato para producir
piruvato y glutamato. Los reactivos sin cambio y los pro-
ductos de reaccin se difunden dentro de la capa analtica,
que contiene la lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH. El
piruvato que produce la ALT en la muestra reacciona con la
LDH para producir lactato, mientras la NADH se convierte
a NAD
. El cambio de absorbancia a 340 nm se mide desde

la parte inferior usando la fotometra reectante.
En este sistema, la capa dispersante tambin se utiliza para
iniciar la reaccin, y la actividad de la ALT puede medirse
sin la misma enzima incorporando la capa analtica tradicio-
nal. Aunque el piruvato en la muestra puede participar por s
mismo en la reaccin, la concentracin normal en el suero es
demasiado baja para causar interferencia signicativa.
Creatinina
La creatinina del suero se mide usando una laminilla de
varias capas que tenga un dispersante interno (Sunberg y
Figura 43-2 Estructura de una tira reactiva de creatinina Vitros.
cols., 1983). La estructura de una tpica tira reactiva se
Para esta tira, la capa dispersante contiene dixido de ti-
tanio, que permite que tambin sirva como capa reectante.
Cuando se aplica el suero, la creatinina se incorpora a la pri-
mera capa analtica. Aqu, el amoniaco se produce a partir
de la creatinina por la enzima especca creatinina imino-
hidrolasa, la cual est incorporada dentro de la capa. La
membrana permeable al gas en la parte inferior de la pri-
mera capa analtica permite que el amoniaco se difunda
en la segunda capa analtica, pero los componentes como
amortiguadores y iones hidroxilo, que podran interferir
con la reaccin subsiguiente, no pueden atravesar la mem-
brana y son atrapados en la primera capa analtica. La se-
gunda capa contiene un indicador, el azul de bromofenol,
que cambia de color en respuesta al amoniaco. Visto desde
la parte inferior, el cambio de color del azul de bromofenol
puede relacionarse con la concentracin de la creatinina. El
amoniaco puede interferir, pero la concentracin en suero
es, por lo general, demasiado baja para aportar resultados
errneos.
Potasio
Los electrlitos pueden medirse usando electrodos ion-se-
lectivos (cap. 40) elaborados como tira reactiva. En un t-
pico electrodo ion-selectivo, una membrana elctricamente
conductora separa la muestra de una solucin interna de
composicin constante. Una diferencia en la concentracin
produce un gradiente electroqumico a travs de la mem-
brana, que produce una diferencia potenciomtrica. Un
electrodo de referencia interno, normalmente plata/cloruro
de plata, tambin se sumerge en la solucin llenadora. El
cambio en el potencial en el electrodo de referencia interno
se mide comparndolo con un electrodo de referencia ex-
terno (Russell y Buckley, 1988).
La gura 43-3 muestra la estructura de una tira reactiva
del electrodo ion selectivo Vitros. Como en un electrodo
ion selectivo convencional, la concentracin de un ion se
mide por la diferencia potenciomtrica entre dos electro-
dos; el puente forma una unin lquida estable que conecta
dos electrodos. Al contrario de un electrodo ion selectivo
convencional, una solucin de composicin conocida se
aplica al segundo electrodo (de referencia externa), as que
la muestra se reere directamente a una solucin estndar.
Diversos iones se miden empleando diferentes membranas
selectivas a los iones. Para la medicin del potasio, cada
electrodo incluye una pelcula hidrofbica que contiene
una alta concentracin de valinomicina. sta permite el
paso de los iones del potasio pero excluye otros cationes y
aniones. Una diferencia potenciomtrica, entonces, reeja
cualquier diferencia en la concentracin de potasio entre la
muestra y la solucin estndar.
Los iones potasio tambin pueden medirse usando una
qumica del reactivo seco ms convencional. La capa ana-
ltica contiene una fase orgnica hidrofbica, que excluye
todos los iones excepto aquellos cuyo pasaje es mediado
por un ionforo, como la valinomicina para el potasio. El
ionforo media el intercambio de catin H
+
entre las fases
acuosa (muestra) y orgnica. El cambio resultante en el pH
dentro de la fase orgnica modica el color de un coloran-
te redox incorporado dentro de la capa analtica (Charlton
y cols., 1982). Un acercamiento similar tambin se utiliza
para la medicin de la gravedad especca en tiras reac-
tivas para el anlisis de la orina, en la actualidad una medi-
cin de la actividad inica total.
Gonadotropina corinica humana
Es probable que las tiras de la qumica del reactivo seco
ms usadas sean aquellas que miden la gonadotropina co-
rinica humana (HCG). Diseadas para la lectura visual
y disponibles para venta al pblico, pueden ser bastante
sensibles para permitir el diagnstico del embarazo unos
das despus de la concepcin.
Las tcnicas clsicas para la medicin de las cantidades
traza de hormonas como la HCG conaron en las tcnicas
de inmunoensayo que se desarrollaron en la dcada de 1960.
Tales tcnicas, que conaban en cantidades limitadas de un
anticuerpo y en una diferenciacin posterior entre antgenos
ligados y libres, se adaptaron para la metodologa de capa
na. La estructura de un formato tpico para la medicin hor-
monal, el ensayo de la tiroxina srica total, se muestra en la
gura 43-4 (Nagatoma y cols., 1981). La primera capa ana-
ltica incorpora la tiroxina marcada con peroxidasa, la cual
se transporta con la tiroxina srica dentro de la segunda capa
analtica. Esta ltima consiste de un anticuerpo para la ti-
roxina, covalentemente unido a la matriz. La difusin de la
muestra, a travs de esta capa, proporciona la reparticin
entre la tiroxina en la muestra y la tiroxina marcada con pe-
roxidasa: cuanto mayor es la concentracin de la tiroxina en
la anterior, ms baja resulta la concentracin de la tiroxina
marcada con peroxidasa que est unida, y ms grande es
la concentracin de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
que est disponible para difundir a travs de la tercera capa
analtica (que contiene la glucosa) y dentro de la cuarta, que
incorpora la glucosa oxidasa para generar perxido de hi-
drgeno a partir de la glucosa y del oxgeno atmosfrico.
La peroxidasa de la tiroxina marcada con peroxidasa libre
entonces cataliza la oxidacin de un colorante redox, que
EJEMPLOS ESPECFICOS 421
Figura 43-3 Estructura de una tira de electrodo selectivo a iones de potasio Vitros
reaccionado con la HCG intacta. Esta rea de la tira entonces
daba una reaccin positiva, incluso en ausencia de HCG en
la muestra original.
Versiones ms recientes de la tecnologa del ensayo in-
munomtrico incluyen todos los componentes de las reac-
ciones del anticuerpo monoclonal en un formato de reac-
tivo seco. Algunas han utilizado tcnicas de aglutinacin
de partculas, conando en la capacidad de las partculas,
como aquellas que contienen un solenoide de oro, para
el cambio de color cuando se combinan en presencia de
la HCG. Otras han conado en una regin del anticuerpo
inmovilizado de la HCG unido covalentemente a una tira
reactiva. La orina (que viaja a lo largo de la tira y no a tra-
vs de ella) moviliza las partculas teidas amortiguadas y
ligadas a un anticuerpo diferente de la HCG. En presencia
de la HCG en la muestra de orina, stas forman un empa-
redado y producen una regin coloreada discreta sobre el
anticuerpo inmovilizado. Una vez ms, un control positivo
puede incorporarse dentro de la tira incluyendo una regin
del anticuerpo inmovilizado todava unido a la HCG.
Troponina T cardiaca
La troponina T, llamada marcador cardiaco, es muy emplea-
da en la actualidad para conrmar o descartar el infarto
del miocardio en pacientes que presentan dolor de pecho
(Collinson y cols., 2001). Debido a la velocidad con la cual
se obtienen los resultados y la facilidad para usar en el lugar
de atencin, las tcnicas qumicas de capa na se han adop-
tado ampliamente para su medicin. Un ejemplo tpico es
el inmunoensayo GLORIA
TM
desarrollado por Roche, que
utiliza sangre entera. En este inmunoensayo la capa que se
separa de la bra de vidrio atrapa las clulas sanguneas.
Dos anticuerpos monoclonales para diferentes sitios de la
troponina T se incluyen en la primera capa analtica. Uno
de estos anticuerpos se conjuga con la biotina, el otro, con
las partculas de oro. Los anticuerpos forman un complejo
en presencia de la troponina T. La segunda capa analtica
contiene estreptavidina ligada al soporte, que se une con
la biotina y entonces inmoviliza cualquier complejo de la
troponina T. La acumulacin de las partculas del oro en el
complejo de la troponina T causa la formacin de un color
prpura, que puede evaluarse visualmente o usando un me-
didor de la reexin (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Abuso de frmacos
El urinlisis, el uso de una sola tira reactiva para medir
diferentes componentes urinarios, se ha usado por varias
dcadas. La seleccin de diversas qumicas para usar en
tales tiras reactivas se ha regido ms por realizacin tcnica
Figura 43-4 Estructura de una tira reactiva de tiroxina Fuji.
produce un cambio de color proporcional a la cantidad del
marcador libre, que a su vez se relaciona con la cantidad de
tiroxina en la muestra original.
Tales tiras reactivas son complejas para fabricar, y porque
las tcnicas de inmunoensayo clsicas requieren tiempos de
incubacin largos, la sensibilidad de estos mtodos en for-
matos de reactivo seco (quizs 10 mol/L) es inadecuada
para detectar cantidades traza de hormonas, como la HCG
en los inicios del embarazo. La mayor parte de los equipos
modernos para prueba del embarazo analizan la orina utili-
zando tcnicas inmunomtricas, en las cuales un exceso de
anticuerpo est presente y donde los tiempos cortos de incu-
bacin son posibles. Las primeras versiones emplearon una
mezcla de tcnicas con reactivos hmedos y secos. Aqu un
anticuerpo monoclonal para la subunidad de HCG estaba
covalentemente unido a una matriz. La muestra se agrega-
ba primero; cualquier HCG se presentaba vinculada a la
matriz unida al anticuerpo. Una solucin que contena un
anticuerpo marcado enzimticamente para la subunidad
de HCG se aada e incubaba durante un tiempo corto, per-
mitiendo la interaccin en la cual la HCG intacta se inter-
calaba entre el anticuerpo ligado a la matriz y el marcado.
Despus de adicionar una solucin amortiguadora para lavar
la muestra sobrante y el anticuerpo marcado enzimticamen-
te libre de la tira, una tercera solucin se aada, conteniendo
un sustrato del colorante para el marcador enzimtico que
generaba un producto coloreado. En ausencia de HCG en
la muestra para formar el emparedado, no se desarrollaba
ningn producto coloreado unido a la matriz. Un control
positivo conveniente para la reaccin podra incorporarse
uniendo a un rea de la tira el primer anticuerpo que ya haba
CONTROL DE CALIDAD DE LA QUMICA DE REACTIVO SECO 423
rara vez es obvio a partir de la inspeccin de la propia tira,
que el desempeo analtico sea inaceptable. Un problema
importante para el control de calidad, por tanto, es la iden-
ticacin del desempeo pobre y la determinacin de su
causa. En la prctica, la causa rara vez es la propia tira
reactiva.
Para el fabricante y el analista, las qumicas del reactivo
seco plantean otro problema, porque la estabilidad a largo
plazo de cada lote de tiras puede predecirse slo a partir de
la estabilidad de lotes anteriores. En la prctica, existe cier-
ta variacin de lote a lote en la estabilidad, aun cuando tiras
reactivas se almacenan en condiciones ideales. Como parte
de un programa para el control de calidad es necesario, por
tanto, supervisar tendencias a largo plazo en el desempeo,
para poder tomar la accin apropiada antes de que el con-
trol de calidad llegue a ser inaceptable.
Identicacin del desempeo inaceptable:
ensayos semi-cuantitativos adicionales de laboratorio
En la actualidad, el rea principal del uso clnico para la
utilizacin del reactivo seco semicuantitativo es la com-
probacin de la orina. Una amplia gama de tiras reactivas
est disponible; en ellas pueden incluirse simplemente un
analito (p. ej., para glucosa o protena), o una diversidad
de analitos, los colores de cada soporte del reactivo que tie-
nen que igualarse visualmente dentro de una secuencia de
tiempo estricta con un patrn de color impresa (g. 43-5).
Aunque los ensayos semicuantitativos para la glucosa san-
gunea se han reemplazado en gran parte por el uso de tiras
reactivas ledas en los medidores de glucosa sangunea, es-
tos ensayos plantean problemas similares para el control de
calidad. Adems, se han introducido muchas pruebas nue-
vas de las tiras reactivas de laboratorio adicionales, desde
la medicin de fracciones de lpidos de sangre entera has-
ta la deteccin de frmacos adictivos en orina o saliva. Es-
tos ensayos semicuantitativos pueden realizarse en diversos
sitios: consultorios, clnicas, prcticas clnicas primarias,
escuelas y el hogar. Poca atencin se presta al desempeo,
debido a que existe una creencia extendida que tales en-
sayos son seguros, y en una instalacin hospitalaria estn
delegados con frecuencia al miembro ms subordinado del
personal del consultorio, que puede carecer de experiencia
en la qumica analtica y sin ningn entrenamiento.
La primera inspeccin del desempeo de los anlisis
de orina en las salas hospitalarias (Challand, 1987) mostr
que el resultado correcto (es decir igualando el soporte del
color correcto) slo se obtuvo en casi 50% de los anlisis.
Alrededor de 5% de todas las mediciones dieron valores
absurdos incorrectos. Hallazgos similares se han obtenido
en estudios posteriores a partir de diferentes situaciones.
que por utilidad clnica: un buen ejemplo es la incorpora-
cin de un soporte de la reaccin sensible a la bilirrubina
dentro de tales multitiras. Aunque todava se utilizan mu-
cho, su utilidad clnica dentro de un ambiente hospitalario
es polmica (NICE, 2003).
Una aplicacin moderna de tal tecnologa multitira ocu-
rre en el desarrollo de sistemas para la deteccin de frma-
cos adictivos en la orina. Una fuerza impulsora importante
en la deteccin son los requerimientos para evaluar asun-
tos de preempleo o durante el empleo en un rango muy
amplio de situaciones. Tales sistemas tambin se usan en
departamentos de accidentes y de urgencia hospitalarios,
sobre todo en evaluar la presencia de frmacos adicti-
vos, que contribuyen a una conciencia mental alterada. Mu-
chas variantes de la tecnologa existen, pero todas utilizan
dos anticuerpos monoclonales, como base, para cada fr-
maco o grupo de frmacos; uno de ellos es capaz de unirse
a un soporte slido, y el otro, de generar una seal colorea-
da (Wilding y Ciaverelli, 1999). Un panel tpico de frma-
cos incorporado en una multitira incluye pruebas para los
grupos de frmacos, como barbitricos, benzodiazepinas,
narcticos; aminas simpatomimticas, como anfetaminas y
antidepresivos tricclicos; y frmacos o metabolitos espec-
cos, como cocana, metadona y tetrahidrocanabinol.
Tcnicamente, el desarrollo de esas tiras plantea grandes
problemas. stos incluyen minimizacin de interferencia
por frmacos muy relacionados; asegurar un lmite apropia-
do de la sensibilidad aun cuando se enfrente con uno de un
grupo de frmacos, los cuales pueden tener reactividad cru-
zada diferente con el anticuerpo incorporado (el grupo de
la benzodiazepina es un ejemplo obvio); y la diferenciacin
entre frmacos recetados o prescritos y frmacos adictivos
(p. ej., seudoefedrina y anfetamina). Incluso con controles
positivos y negativos incorporados, tales tiras pueden ser
ledas en forma errnea, en particular cuando son utilizadas
por personal inexperto o sin experiencia en instalaciones
alejadas de un laboratorio analtico. Despus de encontrar
un resultado positivo por este procedimiento de tamizaje
debe continuarse con la vericacin mediante otro mtodo
independiente (Wilding y Ciaverelli, 1999).
Control de calidad de la qumica
de reactivo seco
El control de calidad de los resultados dados por las tiras
reactivas plantea problemas diferentes a aquellos del an-
lisis de la qumica hmeda tradicionales. Para la ltima,
pueden elaborarse reactivos nuevos, y las concentraciones
del reactivo usadas en el anlisis puede modicarlas el ana-
lista. Es, por tanto, fcil cambiar los ingredientes del
anlisis en respuesta al desempeo inaceptable. Pero las
tiras reactivas secas no puede modicarlas el analista, y
Figura 43-5 Patrn de color impreso para una tira reactiva de anlisis urinario de Bayer Multistix 8SG. Reproducida con el permiso
de Bayer Health Care, LLC.
Con ensayos cuantitativos, es comparativamente fcil
denir el desempeo numrico aceptable, o en trminos de
realizacin analtica [la aproximacin de la mayor parte de
los esquemas del aseguramiento de la calidad (QA) exter-
no] o en trminos de utilidad clnica (Fraser y cols., 1993,
1997). Los ensayos semicuantitativos no se prestan a un
acercamiento numrico fcil. No es posible utilizar el valor
medio obtenido de las distribuciones de QA como la mejor
estimacin del valor verdadero porque ste tiene con fre-
cuencia un sesgo introducido por la aproximacin a igualar
el color ms cercano o por deciencias en la tcnica (g.
43-6). Las muestras distribuidas como parte de una inspec-
cin o de un programa de QA son, por tanto, en general
sintticas, con componentes ponderados que denen el va-
lor verdadero (aunque esto es difcil para algunos analitos,
como bilirrubina o eritrocitos). Cuando el valor pondera-
do corresponde a la concentracin requerida para igualar
exactamente un bloque de color impreso para cada analito,
en la prctica slo cerca de la mitad de quienes realizan el
anlisis logra la igualacin correcta; casi 95% alcanza una
igualacin dentro de un bloque de color en forma correcta.
Los resultados fuera de este rango se consideran un des-
empeo inaceptable. Un acercamiento alternativo es pon-
derar cantidades de componentes que produzcan un color
intermedio entre dos bloques del color. Los resultados que
correspondan a cualquiera de los dos bloques adyacen-
tes del color se consideran aceptables; en encuestas en el
consultorio, 10 a 20% de las entregas son inaceptables por
un criterio muy escaso (Tighe P, comunicacin personal).
Cuando se identica el desempeo inaceptable, se requiere
encontrar la causa; algunas de las posibles causas se enu-
meran en el cuadro 43-1. Casi todas se deben a decien-
cias en la comprensin, en el entrenamiento, o en la tcnica
(las cuales pueden remediarse de manera local). Es raro
que la causa se deba a deciencias en la fabricacin de la
tira reactiva, aunque debe mencionarse que las demandas
exageradas para la exactitud probable de estas tiras en la
comprobacin en el lugar de atencin son hechas a veces
por los fabricantes.
Valoracin de las tendencias a largo plazo,
ensayos cuantitativos
Los instrumentos automticos que usan el anlisis qu-
mico de reactivo seco han estado disponibles por varios
aos. stos pueden realizar muchos anlisis diferentes so-
bre cantidades pequeas de suero, con una productividad
y precisin de estudio que igualan a los analizadores ms
tradicionales de qumica hmeda. Las laminillas reactivas
CONTROL DE CALIDAD DE LA QUMICA DE REACTIVO SECO 425
Figura 43-6 Sesgo en ensayos de la tira reactiva de protena en
orina. Seis muestras de orina prepreparadas con concentraciones
proteicas correspondientes a un bloque de color diferente fueron
distribuidas a ciegas a 11 enfermeras analistas. La gura com-
para concentraciones proteicas con el nmero de analistas que
reportan cada bloque de color. As como en la dispersin prevista
de los resultados existe un sesgo sistemtico, los analistas tienden
a subestimar la concentracin verdadera de la protena con un
bloque de color.
Cuadro 43-1 Algunas causas identicadas del pobre desem-
peo en la realizacin de ensayos manuales con tira reactiva
Uso de tiras reactivas caducas
Almacenamiento de tiras reactivas en condiciones que
acortan la vida media
Retiro de la tapa del envase de la tira, o eliminacin del
desecante
Cortar la tira por la mitad para ahorrar dinero
Usar un recipiente inadecuado para la muestra (p. ej., un
recipiente blanqueado para una muestra urinaria)
Error al sumergir la tira completa reactiva para orina en la
muestra
Muestra insuciente aplicada a la tira reactiva para sangre
Realizar la prueba a una temperatura incorrecta
Lectura del soporte de color demasiado pronto, o demasiado
tarde
Lectura del soporte de color equivocado sobre una tira
reactiva multianalito
Condiciones insucientes de iluminacin
Visin defectuosa del analista sobre el color
Transcripcin errnea de un resultado en la forma del
informe
Uso de unidades incorrectas al informar
se compran en sucientes lotes nicos para seis meses.
Si se almacenan en condiciones ideales, cada lote puede
necesitar de una simple calibracin antes de usarse; la es-
tabilidad, que es bastante buena, mantiene la calidad du-
rante la vida media del lote. Sin embargo, en la prctica,
las condiciones de almacenaje pueden no ser las ideales
(la diferencia de temperatura entre el piso y el techo de
una cmara fra, en ocasiones es suciente para cambiar la
estabilidad) y el deterioro muy lento de las tiras reactivas
no es idntico de lote a lote. El control de calidad, por tan-
to, est dirigido a asegurar que la calibracin inicial sea la
adecuada, y vigilar el desvo lento para identicar el punto
en el cual se requiere una segunda calibracin, o qu lami-
nillas sin usar deben desecharse.
Los sueros convencionales para el control de calidad
(QC) pueden utilizarse para ambos propsitos, pero sobre-
llevan desventajas. Son costosos los efectos de la matriz,
en particular los relacionados con la viscosidad y con la
difusin siguiente a travs de las capas de una laminilla;
pueden provocar que su comportamiento sea diferente en
las muestras de los pacientes, y los resultados para algu-
nos analitos cambiar de manera notable en las primeras
horas posteriores a la reconstitucin. Los resultados que
se obtienen de muestras de pacientes pueden proporcionar
informacin QC ms conable. Aunque dichos resultados
estn obviamente ms dispersos que los de un suero QC
convencional, ms datos estn disponibles para el anlisis
estadstico. Para la mayor parte de los analitos, los parme-
tros como el resultado del paciente medio (despus de la
exclusin de valores extremos) y el nmero de resultados
que caen fuera de un lmite preestablecido (como un lmi-
te telfonico automtico para la concentracin del sodio
srico) son sucientemente sensibles y proporcionan casi
toda la informacin QC necesaria. La calibracin inicial
puede calicarse con la comparabilidad de un promedio
diario del paciente posterior a las calibraciones previas. Un
desvo en el promedio diario puede utilizarse para calicar
el punto en el cual la recalibracin o las nuevas laminillas
son necesarias. La gura 43-7 muestra una grca del pro-
medio diario del paciente para los anlisis del sodio srico,
mostrando la recalibracin antes y despus del periodo.
La estadstica para el control de calidad con base en
muestras de pacientes puede emplearse para asegurar la
comparabilidad a largo plazo de los resultados dentro de
un laboratorio, pero no se asegura que los resultados sean
comparables con aquellos producidos por otros laborato-
rios. La participacin en esquemas externos del asegura-
miento de la calidad puede aportar esta informacin, y dar
informacin ms conable que, por ejemplo, los resultados
que se obtienen analizando una muestra por control de ca-
lidad de composicin conocida. Los esquemas externos del
aseguramiento de la calidad estn disponibles ahora para
los anlisis de la qumica de capa na realizados en el lu-
gar de atencin (Bullock, 1999), y son, es probable, los
ms utilizados para los anlisis de glucosa sangunea en
el consultorio; la participacin en tales esquemas ahora se
requiere para la acreditacin del laboratorio en el Reino
Unido (Burnett, 2000).
Las temperaturas de la tira reactiva seca y de la muestra
afectan la velocidad de difusin de la muestra y la veloci-
dad de reaccin dentro de la tira, por ello el buen control de
la temperatura es esencial. El funcionamiento global, segn
lo calicado por datos QA externos, de dos analizadores de
la tira reactiva en un periodo de dos aos se muestra en la
gura 43-8. El control de temperatura en el laboratorio en
el cual estaban situados fue menor que el ideal, y su dete-
rioro en los meses clidos del verano es obvio.
Los analizadores automticos, usando la qumica del
reactivo seco y del hmedo, en ocasiones producen resul-
tados aparentemente correctos pero absurdos. Quiz el pre-
dominio de stos sea < 0.2%. Analizando todas las muestras
por duplicado, es mnimo; y tales errores pueden detectarse
slo comparando los resultados con los previos del mismo
paciente o estando alertas para detectar discrepancias entre
los resultados y la informacin clnica provista.
Figura 43-7 Promedios diarios de pacientes, anlisis de sodio.
La graca muestra valores promedio diarios sucesivos para los
anlisis de sodio srico realizados empleando un analizador Vi-
tros despus de la calibracin. Una cada en los resultados es
evidente, la cual promedia casi 0.04 mmol/L cada da. La recali-
bracin se realiza despus del da 34.
y para el mdico en la velocidad con que los resultados pue-
den obtenerse. El desafo para el fabricante es el desarrollo
continuo, no slo en introducir nuevos anlisis sino tambin
en la simplicacin de los actuales al vericar que son tan
exactos y tan libres de interferencias como sea posible. El
desafo para el laboratorio analtico consiste en asegurar
que dondequiera que esta tecnologa se utilice, el analista
est entrenado en los procedimientos analticos apropiados
y educado para estar consciente tanto de las fortalezas como
de las limitaciones de la tcnica.
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Resumen
La tecnologa de la qumica del reactivo seco en la actuali-
dad ha avanzado al punto en el cual casi todos los anlisis
convencionales de la qumica clnica con reactivos lquidos
se pueden reproducir en formato del reactivo seco. Aun-
que los costos del reactivo son por lo general ms altos
para el ltimo, ofrece ventajas importantes. Los volmenes
de muestra son bajos, las sensibilidades comparables con
las tcnicas convencionales, la precisin puede ser por lo
menos buena, las tcnicas son rpidas y conables, y reali-
zarlas requiere poca destreza analtica especca; por tanto,
son apropiadas en un laboratorio de qumica clnica, don-
de su uso libera los recursos tcnicos y cientcos escasos
para el desarrollo de nuevos ensayos y de nuevas tcnicas.
Tambin se adaptan con facilidad a un ambiente cercano al
paciente, por ejemplo, dentro de las aulas, en clnicas, en
asistencia primaria y para que los usen los pacientes.
A pesar de su evidente simplicidad, esta tecnologa no es
segura. Sin una atencin cuidadosa que asegure la identidad
del paciente, la conveniencia de la muestra, el procedimien-
to correcto del anlisis, incluyendo coordinacin, tempera-
tura y control de calidad, y el registro exacto y apropiado
de la reaccin, los anlisis pueden proporcionar resultados
engaosos. Con una utilizacin cada vez ms amplia de la
tecnologa, existen benecios importantes para el paciente
RESUMEN 427
Figura 43-8 Resultados QA externos globales: tendencias estacionales. Puntaje del ndice de variacin del funcionamiento promedio
global (OMRVIS, un ndice de imprecisin) para dos analizadores Vitros idnticos ubicados en el mismo laboratorio sobre un periodo de
dos aos. La precisin en los meses de verano es deciente en comparacin con los meses de invierno, debido tal vez al control inade-
cuado de la temperatura en el laboratorio.
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graphic colour prints. J Opt Soc Am 1953; 43: 595-599.
Por qu separar?
La mayor parte de los anlisis que se realizan en labora-
torios clnicos implican la deteccin y cuanticacin de
los compuestos individuales en uidos corporales, por lo
comn en sangre u orina. Para este propsito, se utilizan
mtodos qumicos o inmunolgicos especcos en el com-
puesto de inters. Si bien tales ensayos explican la mayor
parte de los anlisis en el laboratorio clnico, a veces una
familia de compuestos muy relacionados requiere una me-
dicin. Aunque ensayos especcos podran desarrollarse
para cada compuesto del grupo familiar, este acercamiento
no es con frecuencia econmico o en la prctica es menos
viable que usar una tcnica que pueda separar y cuanticar
todos los compuestos de manera simultnea. Una variedad
amplia de tcnicas de separacin se utiliza en los laborato-
rios clnicos, pero casi siempre se basa en el principio de
la separacin cromatogrca o electrofortica. La croma-
tografa en todas sus variantes, por ejemplo, de capa na
(TLC), de alto rendimiento (HPLC) o la gaseosa (GC),
puede utilizarse para separar muchos tipos diferentes de
compuestos desde molculas pequeas, como aminocidos
y frmacos hasta protenas como la hemoglobina gluco-
silada. La electroforesis, por otra parte, se emplea para la
separacin de protenas, casi cualquier protena (p. ej., pro-
tenas sricas), o para identicar variantes de una en parti-
cular (p. ej., variantes heredadas de hemoglobina).
Cromatografa
La cromatografa cumpli 100 aos en 2003. M.S. Tswett
de la Universidad de Varsovia describi primero el uso de la
adsorcin para separar los pigmentos de una hoja de planta
en marzo de 1903. El principio de los diferentes tipos de
cromatografa es la interaccin de las molculas de inters
entre una fase mvil (lquida o gaseosa) y una estacionaria
(slida). Esas molculas que interactan con la fase esta-
cionaria se mueven ms lento a travs de una placa, o de
una columna, que las que no interactan y, por consiguien-
te, se produce una separacin de molculas desde el inte-
rior de una mezcla. El control de estas interacciones, y por
tanto de la separacin, se alcanza explotando las diferen-
cias sutiles de ciertas propiedades fsicas de las diferentes
molculas en las muestras, por ejemplo, su solubilidad en
agua o en solventes orgnicos, la carga neta y el tamao. El
cuadro 44-1 detalla las propiedades moleculares que rigen
la separacin en las diversas formas cromatogrcas.
Cromatografa de capa na (TLC)
Principios
La TLC reemplaz a la cromatografa de papel en la dca-
da de 1960 y en la actualidad se le est sustituyendo en una
gran parte por la HPLC. En la TLC la fase estacionaria (por
lo comn almina, gel de slice o celulosa) se ja sobre una
placa de cristal, plstico o metal. Una mezcla solvente (fase
mvil) aplicada a un extremo de la placa viaja a lo largo de
ella por atraccin capilar y produce la separacin cromato-
grca de los solutos en una muestra aplicada a la placa. A
menos que sean uorescentes, la mayor parte de los com-
puestos requieren la derivacin (modicacin qumica)
para que puedan ser visualizados; esto se logra rociando
con, o sumergiendo la placa en, reactivos cromognicos.
44
Tcnicas de separacin
Roy Sherwood
430 CAP. 44 TCNICAS DE SEPARACIN
La informacin cualitativa puede obtenerse observando
simplemente la placa y la identicacin de las manchas
individuales con mediciones del factor de retencin (Rf,
distancia recorrida por la muestra dividida por la distancia
total recorrida por el frente del solvente). La mayor resolu-
cin se obtiene corriendo la placa una segunda vez, pero en
la direccin del solvente a 90 de aquella primera corrida
(TLC bidimensional [TLC 2-D]). La desventaja de la TLC
2-D es que slo una muestra se aplica a cada placa. La
cuanticacin requiere el uso de un densitmetro que pue-
da examinar la placa, o la elucin de la mancha a partir de
la fase estacionaria seguida por una medicin colorimtri-
ca. La TLC 2-D experimenta, sin embargo, un interesante
resurgimiento por los progresos en el campo de los prote-
micos. Despus de la TLC 2-D, el patrn de las manchas
correspondientes a las protenas individuales se compara
entre los individuos con una enfermedad particular y con
los controles, y las manchas que dieran en intensidad en-
tre los grupos son eluidas de la placa para identicar la
protena especca implicada.
Aplicaciones
La TLC se utiliza ahora ms como una tcnica de tamizaje,
ya que es relativamente rpida, econmica y fcil respec-
to a otros mtodos cromatogrcos. Las aplicaciones para
TLC en un laboratorio clnico incluyen ensayos de amino-
cidos, frmacos y carbohidratos.
Aminocidos
Los programas de tamizaje neonatal existen en muchos
pases para la deteccin temprana de nios con fenilceto-
nuria. Aunque los mtodos espectrofotomtricos o HPLC
especcos existen para la fenilalanina, muchos laborato-
rios de tamizaje preeren utilizar un mtodo TLC 1-D que
separe los aminocidos bsicos, neutros y cidos, debido
a que este mtodo tiene el potencial para la identicacin
de otros desrdenes del aminocido, por ejemplo, tirosi-
nemia, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce,
etc. La conrmacin de la identidad de un aminocido
incrementado anormalmente puede conseguirse por TLC
2-D o HPLC, por ejemplo, el patrn caracterstico de los
aminocidos con cadena ramicada incrementados de for-
ma anormal (leucina, isoleucina y valina) en la enfermedad
de la orina con olor a jarabe de arce. Avances recientes en
la tecnologa relacionados con la cromatografa lquida,
en particular en combinacin con espectrometra de masa
(LC-MS; vase ms adelante), condujeron a una reduccin
en el uso de TLC en los programas de tamizaje neonatal.
Frmacos
El tamizaje de frmacos urinarios es complicado por la di-
versidad de frmacos disponibles para uso recreacional
o tomados de manera deliberada o accidental en sobredo-
sis, incluyendo compuestos bsicos, neutros y cidos. En
el paciente inconsciente o no cooperativo, poca informa-
cin puede estar disponible sobre el consumo de frmacos
especcos. La TLC es con frecuencia la tcnica elegida
para el tamizaje inicial, y sistemas comerciales, por ejem-
plo, Toxilab
, estn disponibles. stos tienden a tener pla-

cas separadas y sistemas de solventes para frmacos cidos
y bsicos, incluidos los neutros en cualesquiera de los sis-
temas. La nebulizacin secuencial de diversos reactivos
cromognicos produce colores diferentes que tien a los
diferentes frmacos, permitiendo as una identicacin
ms sencilla. En aos recientes, sin embargo, surge un
movimiento signicativo que se dirige a emplear inmu-
noensayos enzimticos en analizadores automticos para
el tamizaje de primera lnea de frmacos adictivos.
Carbohidratos
La TLC es la tcnica elegida para el tamizaje inicial de
muestras de orina o fecales de infantes sintomticos con
desrdenes metablicos de carbohidratos, por ejemplo,
fructosuria, etc. Slo se requieren resultados cualitativos
para esta aplicacin, pero el desarrollo de pruebas para la
funcin y la integridad del tracto gastrointestinal que usan
azcares administrados por va oral crea la necesidad de
una TLC cuantitativa de los azcares. Ocurre, por ejemplo,
cuando se emplea una mezcla de mono y disacridos (xi-
losa, ramnosa, 3-o-metilglucosa y lactulosa), que cruzan la
pared del tracto gastrointestinal va diversos mecanismos,
para evaluar la permeabilidad del intestino por el diagnsti-
co diferencial de la enfermedad del tracto gastrointestinal.
La reduccin de la supercie intestinal disponible para la
absorcin (p. ej., enfermedad celiaca) conduce a una re-
duccin progresiva en la absorcin intestinal de monosac-
Cuadro 44-1 Propiedades moleculares que gobiernan
la separacin dentro de las varias formas cromatogrcas
Propiedad Tipo de cromatografa
Propiedades de adsorcin TLC, HPLC
Particin GC, HPLC
Interacciones antgeno- Anidad
anticuerpo o enzima-sustrato
Tamao y forma molecular Filtracin en gel
Carga inica Intercambio inico
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN (HPLC) 431
ridos, mientras el dao a la integridad de la pared intestinal
(p. ej., enfermedad de Crohn) se perla como un aumento
en la absorcin de disacridos.
Cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC)
Principios
La HPLC es la forma ms comn de cromatografa que se
emplea en el laboratorio clnico. Un mejor funcionamiento
se logra al contener la fase slida en columnas estrechas
(de 150 5 mm) y bombeando la fase mvil a travs de la
columna bajo presin (de 1.5 a 2.0 presin atmosfrica).
Aunque los mecanismos de intercambio inico o de exclu-
sin por tamao de separacin se utilizan de cuando en
cuando en la HPLC, la mayor parte de los mtodos se basa
en la adsorcin de las molculas en la fase slida. En la
HPLC, en fase normal, los grupos de enlace hidrlos sobre
la supercie de un material de embalaje de silicona atraen
molculas hidroflicas pero no hidrofbicas, lo contrario es
verdad para HPLC en fase inversa. As, en la HPLC en fase
normal una fase mvil de polaridad incrementada remueve
con ms ecacia molculas polares de la fase slida, mien-
tras en la HPLC en fase inversa las fases mviles (orgni-
cas) remueven ms rpido molculas no polares de la fase
slida. La HPLC en fase inversa, por tanto, favorece la se-
paracin de las molculas neutras, que predominan en los
uidos biolgicos.
Equipo para HPLC
Los componentes de un sistema de HPLC comprenden una
bomba o bombas, sistema de introduccin de la muestra (in-
yector de jeringuilla o automuestrador), columna, detector y
un sistema de recoleccin de datos (registrador de grcas
o computadora). Para la mayor parte de las aplicaciones,
una sola fase lquida puede utilizarse todo el tiempo a una
tasa de ujo constante (1 a 2 ml/min), es decir una elucin
isocrtica. Sin embargo, en algunas aplicaciones complejas
donde compuestos que se separan son similares en estruc-
tura, es necesario variar la composicin de la fase lquida
durante el anlisis, es decir, la elucin por gradiente. Un
ejemplo donde ocurre sta es en la separacin de aminoci-
dos en sangre u orina.
La seleccin del mtodo de deteccin para HPLC es
dependiente del tipo de analito con deteccin ultravioleta
(UV), uorescente y electroqumica (EC), la que se utiliza
de rutina. La deteccin UV predomina en la HPLC en fase
inversa pero es raro que se emplee en mtodos de fase nor-
mal, ya que la concentracin alta del solvente orgnico en
la fase mvil produce una absorcin de fondo grande entre
190 y 230 nm. La deteccin uorescente tiene sensibilidad
alta, pero requiere compuestos que tengan uorescencia
natural o que qumicamente se modiquen para inducir
uorescencia. La deteccin electroqumica se basa en la
oxidacin de los compuestos en un electrodo de carbn o
metlico; puede ofrecer sensibilidad y especicidad exce-
lentes para compuestos particulares.
La espectrometra de masa (MS) se utiliza como un
modo de deteccin en combinacin con la cromatografa
gaseosa desde hace muchos aos. Los grandes volmenes
de lquido uyendo a travs de un sistema de cromatografa
lquida (LC) tpico con una velocidad de ujo de 1 ml/min
evitaron la combinacin de LC y de MS al inicio. La in-
troduccin de LC microporo (dimetro interno < 1) y los
avances en la produccin de los aerosoles lquidos muy -
nos (electronebulizacin) han impulsado para que LC-MS
se torne una tcnica viable. La LC-MS o MS en tndem
(MS-MS) es probable que sean las tcnicas de separacin
que crecen ms rpido en el laboratorio clnico.
Preparacin de la muestra para muestras biolgicas
Una complicacin que surge en el anlisis de las muestras
biolgicas usando la HPLC se debe al alto contenido proteico
en muchos uidos corporales (cerca de 70 g/L en plasma y
suero); que puede producir interferencia de fondo y condu-
cir a la obstruccin de la columna, as que alguna forma de
preparacin de la muestra se requiere, por lo regular, antes
del anlisis. La forma exacta de preparacin de la muestra
vara con el uso especco, pero por lo comn, se realiza la
desproteinizacin o la extraccin del compuesto de inters,
o ambas. Las extracciones lquido-lquido y en fase sli-
da se utilizan para los mtodos de HPLC que involucran
muestras sanguneas. Cuando se utiliza orina, la interferen-
cia en los mtodos de deteccin UV o uorescentes suele
ocurrir si pigmentos coloreados o uorescentes estn pre-
sentes, y alguna forma de extraccin es a menudo necesaria,
ya sea lquido-lquido o en fase slida.
Aplicaciones
La mayor parte de las aplicaciones de la HPLC en la medi-
cina de laboratorio cae dentro del campo de la bioqumica
clnica, aunque los hematlogos tambin utilizan la tcni-
ca. Los grupos de compuestos que por lo regular se anali-
zan por la HPLC en el laboratorio clnico incluyen aminas
biognicas, aminocidos, porrinas, frmacos, vitaminas,
hemoglobina y carbohidratos. Se han descrito muchas otras
aplicaciones especcas para propsitos de investigacin,
incluyendo los nuclesidos, productos de degradacin del
colgeno y esteroides, pero stos no se convierten con fre-
cuencia en parte del repertorio de rutina de las pruebas.
Aminas biognicas
Las catecolaminas, adrenalina, noradrenalina y dopamina,
y sus metabolitos, se miden en muestras plasmticas y uri-
narias para la deteccin de tumores. Los feocromocitomas
secretan cantidades grandes de adrenalina o noradrenalina,
o ambas, que se metabolizan con cido 4-hidroxi-3-metil-
mandlico (HMMA). El incremento en las concentraciones
de catecolaminas y HMMA puede detectarse en la orina de
pacientes con feocromocitoma empleando la HPLC en fase
inversa con deteccin electroqumica. Esta tcnica se utili-
za tambin para detectar cantidades anormalmente altas de
dopamina y de su metabolito el cido homovanlico (HVA),
producido por los neuroblastomas en nios.
La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) se sintetiza a
partir del triptfano y se metaboliza a cido actico 5-hi-
droxiindol (5-HIAA) por monoaminooxidasas. Los tumo-
res carcinoides secretan cantidades anormales de 5-HT y
la medicin de las concentraciones de serotonina sangu-
nea/urinaria o de la excrecin urinaria de 5-HIAA es til
en la deteccin de tumores y en la vigilancia de la terapia.
Los mtodos para la determinacin simultnea de HMMA,
HVA y 5-HIAA por la HPLC en fase inversa estn dentro
de los mtodos de rutina en los laboratorios clnicos.
Aminocidos
El uso de la TLC para la identicacin cualitativa de anor-
malidades en el metabolismo de los aminocidos se descri-
bi antes. La cuanticacin de aminocidos especcos es
con frecuencia necesaria, en particular para la vigilancia
teraputica en desrdenes como fenilcetonuria, tirosinemia
o enfermedad de la orina de jarabe de arce. El primer sis-
tema HPLC especializado que se crea es el analizador de
aminocidos, que se fundamenta en la deteccin espectro-
fotomtrica despus de la reaccin poscolumna con ninhi-
drina para producir derivados a color. En la actualidad se
han creado muchos mtodos alternativos de la derivacin
para separar aminocidos por la HPLC en fase inversa con
deteccin UV, uorescente o electroqumica (vanse Lec-
turas adicionales).
Porrinas
Los porrinas son tetrapirroles cclicos que se forman por
oxidacin de los porringenos, intermediarios de la va
biosinttica del hem. Existe una clase de desrdenes he-
Figura 44-1 HPLC de una mezcla estndar usada para el an-
lisis de porrina urinaria. Los picos corresponden a uroporrina
(8COOH), heptaporrina (7COOH), hexaporrina (6COOH),
pentaporrina (5COOH), coproporrina (4COOH) y mesopor-
rina (2COOH). Columna, 0.8 15 cm Hipersil SAS (5 m).
Elucin por gradiente y deteccin UV (400 nm).
redados (porrias) con deciencias especcas enzim-
ticas que conducen a la acumulacin de precursores. La
presentacin clnica de las porrias es diversa, desde fo-
tosensibilidad crnica a dolor abdominal agudo, y aunque
cierta idea del diagnstico exacto puede conocerse por los
sntomas, la caracterizacin del tipo de porria requiere la
identicacin de su patrn en sangre, orina y heces. sta
es posible lograrla por la extraccin lquido-lquido de las
porrinas, seguida por la HPLC en fase inversa con de-
teccin UV o uorescente, puesto que las porrinas tienen
uorescencia natural. Un ejemplo de separacin de porri-
nas por la HPLC se muestra en la gura 44-1.
Frmacos
Las tcnicas de inmunoensayo sustituyen en la actualidad
a la HPLC como mtodo de rutina para muchos de los an-
ticonvulsivos establecidos, por ejemplo, fenitona, feno-
barbital, valproato y carbamazepina. Sin embargo, la ms
nueva generacin de anticonvulsivos, incluyendo lamotri-
gina, vigabatrina, gabapentina, topiramato, leviteracetam
y oxacarbazepina, se mide por la HPLC en fase inversa
con deteccin UV. La vigilancia teraputica del frmaco,
sin embargo, se considera que es menos importante para
Mezcla estndar de porrianas
HPCL sobre Hipersil SAS con deteccin uorimtricas
muchos de los anticonvulsivos ms nuevos respecto de los
ms antiguos, pues tienen amplias vistas teraputicas (la-
motrigina, topiramato y leviteracetam) o su concentracin
plasmtica se correlaciona de manera escasa con la eca-
cia clnica (gabapentina, vigabatrina). La vigilancia, por lo
tanto, se realiza sobre todo si se sospecha inconformidad
con la terapia.
Otros frmacos
Se han desarrollado ensayos para miles de otros frmacos
en uidos biolgicos. Los lectores que buscan informa-
cin adicional deben consultar la seccin Lecturas com-
plementarias al nal de este captulo. El uso de tcnicas
de separacin, que incluyen la LC, tiene una importancia
particular cuando un frmaco contiene un metabolito ac-
tivo que necesite medirse junto al frmaco de origen, por
ejemplo, amiodarona, dotiepina, etctera.
Vitaminas
Las vitaminas son un grupo diverso de compuestos, pero
casi todas se han medido en sangre u orina por la HPLC
(vanse Lecturas adicionales para consultar detalles).
Hemoglobinas incluyendo la hemoglobina glucosilada
Ms de 400 variantes estructurales de la hemoglobina se
conocen, la mayor parte de las cuales no tiene ninguna
secuela clnica para el individuo. Sin embargo, algunas
variantes se relacionan con patologas, por ejemplo, HbS
(hemoglobina de la enfermedad de la clula falciforme).
Un diagnstico denitivo requiere la identicacin de la
variante presente. Recientemente, la separacin de hemo-
globinas se logr por electroforesis, pero han aparecido
varios sistemas comerciales de HPLC especializados con
base en la cromatografa de intercambio inico. stos tie-
nen una ejecucin ms rpida de la muestra y son tiles en
el tamizaje poblacional para hemoglobinopatas. Las mo-
dicaciones a estos sistemas permiten que se les emplee
para cuanticar la fraccin glucosilada de la hemoglobina,
HbA
1c
, con un tiempo analtico cclico de 4 a 8 minutos.
Una versin de la HPLC del mtodo cromatogrco de a-
nidad al gel boronato, tambin disponible, tiene la venta-
ja de que no lo afecta la presencia de variantes heredadas
de la hemoglobina. Un mtodo de referencia establecido
para la medicin de HbA
1c
implica la descomposicin de
la hemoglobina en pptidos que realiza la endoproteinasa
Glu-C, seguida por la separacin y cuanticacin de los
hexapptidos por HPLC-ionizacin por electronebuliza-
cin y anlisis de espectrometra de masas (ESI-MS) o
electroforesis por HPLC capilar.
Carbohidratos
La tamizacin de desrdenes heredados del metabolismo de
los carbohidratos se realiza por lo general por TLC, como
se describe antes. La cuanticacin de carbohidratos espe-
ccos no es con frecuencia necesaria, pero el desarrollo de
estudios de absorcin/permeabilidad intestinal de azcares
hace necesaria la medicin exacta de azcares especcos
en orina, por ejemplo, lactulosa, ramnosa, xilosa, cuando
se requiere la cuanticacin. La separacin puede alcan-
zarse usando la cromatografa de intercambio inico pero
la deteccin es difcil, pues los carbohidratos no tienen pro-
piedades UV ni uorescencias utilizables. La aparicin de
la deteccin electroqumica amperimtrica pulsada mejora
mucho la situacin, aunque el progreso es lento.
Cromatografa de gases (GC)
Principios
En la GC, los compuestos de inters se separan por la parti-
cin entre el soluto en una corriente de un gas transportador
inerte (nitrgeno, argn o helio) y un lquido de volatilidad
baja sujeto a un soporte inerte (de ah su nombre anterior,
cromatografa gas-lquido, o GLC). El soporte inerte es,
por lo general, de microperlas de cristal o polmeros halo-
genados sintticos y un polialcohol derivado o silicona. Por
convencin las columnas de GC son de 1 a 3 m de largo con
un dimetro interno de 2 a 6 mm, pero en la mayor parte
de las aplicaciones clnicas se emplean columnas capilares,
que pueden ser de hasta 40 m de longitud con un dimetro
interno de 0.2 a 0.5 mm. Las ventajas de la GC capilar son
por lo general una resolucin mejorada y tiempos de corri-
da ms cortos. Los sistemas de deteccin disponibles para
GC son ionizacin a la ama (FID), captura de electrones
(ECD) y espectrometra de masas (GC-MS). Una compa-
racin de GC normal contra GC capilar y de los detalles de
la forma de accin de los tipos de detectores se presenta la
en revisin de Lewis y Sampson (1994).
Aplicaciones
Los compuestos que pueden separarse por GC deben ser
voltiles o capaces de convertirse a un estado voltil por
derivacin. stos incluyen alcoholes, esteroides, frmacos,
cidos orgnicos y cidos biliares.
CROMATOGRAFA DE GASES (GC) 433
Alcoholes
El etanol y el metanol son compuestos voltiles que se mi-
den muy rpido por GC con FID. Una columna de GC nor-
mal puede utilizarse, pues la resolucin adicional de la GC
capilar es innecesaria. Las mediciones del glicol de etileno
en toxicidad sospechada son tambin factibles.
Esteroides
El perl esteroideo urinario proporciona informacin sobre
la produccin y metabolismo de esteroides a partir de la
glndula suprarrenal, testculos y ovarios. Es en particular
importante en la evaluacin de nios de gnero incierto o
con desarrollo sexual precoz. Tambin existe considerable
inters en esta medicin para detectar el abuso de esteroi-
des anablicos en los atletas. Usando la GC capilar con
FID despus de la derivacin de los esteroides, hasta 25
esteroides y metabolitos pueden detectarse y cuanticar en
una corrida (g. 44-2). La disponibilidad y la reduccin
ms amplias, por el costo de instrumentos GC-MS condu-
cen hacia el reemplazo de la GC capilar convencional de
esteroides por GC-MS.
Frmacos
Los frmacos que no se miden fcil por HPLC, por ejem-
plo, valproato, antidepresivos tricclicos, etc., su ensayo
se practica con frecuencia por GC, o para la vigilancia de
frmacos teraputicos o para propsitos toxicolgicos. La
mayor parte de los sistemas utiliza columnas normales de
la GC con FID, pero GC-MS tiene un papel particular en la
conrmacin de exmenes positivos de frmacos adictivos
que se obtienen por TLC, EMIT u otros inmunoensayos.
Los mtodos especcos para varios frmacos se pueden
encontrar en el texto de Ghosh (1992).
cidos orgnicos
Las enfermedades heredadas que producen cambios en la
excrecin cida orgnica incluyen enfermedades espec-
cas, por ejemplo, acidemia propinica, y a las relacionadas
con anormalidades del ciclo de la urea. Las mediciones de
cido orgnico urinario se realizan por lo comn usando
GC-MS capilar. La ventaja adicional de MS como detector
es la identicacin positiva de cualquier compuesto poco
comn.
Electroforesis
Principios
La separacin electrofortica se basa en la migracin di-
ferenciada de molculas cargadas bajo inuencia de un
potencial elctrico aplicado. Las molculas que pueden
separarse por electroforesis deben llevar una carga neta
positiva o negativa en su estado natural, por ejemplo, mu-
chas protenas y aminocidos, o deben aceptar una carga,
por ejemplo, carbohidratos acomplejados con iones borato.
El ambiente qumico alrededor de la molcula, la solucin
electroltica, debe ser capaz de conducir una corriente elc-
trica, pero tambin tiene un papel crtico en la determina-
cin del estado de ionizacin y, por tanto, en la carga de
cualquier molcula en contacto con l. La opcin del elec-
trlito y de su pH es crtica para alcanzar movilidad y se-
paracin ptimas. El movimiento de la partcula cargada es
causado por la accin de la fuerza elctrica. La velocidad
de la migracin depende de la relacin entre el potencial
aplicado y la distancia entre los electrodos, la migracin
ms grande puede obtenerse al aumentar el voltaje aplica-
do o al disminuir la distancia entre los electrodos. El paso
Figura 44-2 Cromatograma tpico a partir de un anlisis por
GC capilar de derivados del ter metil oxima-trimetilsilil (MO-
TMS) de esteroides en la orina de una mujer adulta normal. Los
picos mximos son como sigue: A, B, C, estndares internos;
1, androsterona; 2, etiocolanolona; 3, dehidroepiandrosterona;
4, 11-oxo-etiocolanolona; 5, 11-OH androsterona; 6, 11-OH
etiocolanolona; 7, 16-OH dehidroepiandrosterona; 8, pregnane-
diol; 9, pregnanetriol; 10, androstenetriol; 11, tetrahidrocortisona;
12, tetrahidro-11-dehidrocorticosterona; 13, allo-tetrahidrocorti-
costerona; 14, tetrahidrocortisol; 15, allo-tetrahidrocortisol; 16,
-cortolona; 17, -cortolona; 18,-cortol.
de una corriente elctrica genera calor, y las condiciones
ptimas tienen que equilibrarse con la maximizacin de la
separacin. Una fuerza que retarda, la cual est en funcin
del tamao molecular y de la viscosidad de la solucin,
neutraliza la migracin hacia adelante inducida por el cam-
po elctrico. La velocidad de la migracin es, por tanto, di-
rectamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga
neta de la molcula e inversamente proporcional al tamao
de la partcula y a la viscosidad de la solucin.
La separacin electrofortica se puede llevar a cabo en
solucin libre pero por lo general se utiliza alguna forma
de medio de soporte slido, por ejemplo papel, acetato de
celulosa, gel de agar o gel de poliacrilamida. En los ltimos
10 aos, el inters se ha centrado en realizar la electrofo-
resis en tubos capilares estrechos a voltaje alto, es decir,
electroforesis capilar.
Aplicaciones
La electroforesis se emple por primera vez en el laborato-
rio clnico en la dcada de 1950 para la separacin de pro-
tenas sricas. Desde entonces, se desarrollan aplicaciones
para separar protenas del suero, isoenzimas (p. ej., creatina
cinasa, fosfatasa alcalina, etc.), variantes de la hemoglobina
y fragmentos de DNA resultado de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR). En cuanto a la cromatografa, exis-
ten muchas otras aplicaciones, por ejemplo la separacin de
ELECTROFORESIS 435
lipoprotenas, pero stas permanecen en el dominio de la
investigacin y no se emplean como pruebas de rutina.
Electroforesis de protenas sricas
El uso principal de la separacin electrofortica de las pro-
tenas sricas es para la identicacin de gammopatas mo-
noclonales, aunque se contina utilizando para demostrar
los cambios relacionados (no especcos) con una variedad
de condiciones, por ejemplo, el sndrome nefrtico. Los
mtodos iniciales para la electroforesis de protenas sricas
utilizaron acetato de celulosa como medio de soporte, pero
ste produjo resolucin limitada de las protenas sricas y se
han reemplazado en gran parte por la electroforesis en gel
de agarosa. Las protenas sricas se separan en las bandas
principales correspondientes a la albmina,
1
-globulinas,
2
-globulinas, -globulinas (
1
y
2
) y -globulinas. Si se
utiliza plasma en lugar de suero, una banda adicional de -
bringeno est presente, por lo comn entre las regiones -
y -globulina (g. 44-3). La visualizacin despus de teir
con rojo de Ponceau o azul brillante de Coomassie es por lo
general adecuada para detectar alteraciones a grosso modo,
pero la exploracin densitomtrica puede emplearse si se
requieren datos cuantitativos sobre las fracciones indivi-
duales, es decir, si una paraprotena est presente. Incluso la
mayor resolucin se puede obtener usando los geles de po-
liacrilamida, pero este valor es raro en el uso clnico de ru-
Figura 44-3 Electroforesis de protenas sricas en gel de agar: a) patrn normal; b) aumento monoclonal en -globulinas debido a cir-
rosis heptica; c) gammapatas monoclonales (IgG) con paresia inmunitaria.
Albmina
tina. Los sistemas automatizados para la electroforesis de
protenas sricas estn disponibles en la actualidad.
Isoenzimas
Muchas de las enzimas que se miden de rutina en suero
existen como mezclas de isoenzimas, cada una de las cuales
puede producirse por un sistema orgnico diferente en el
cuerpo, por ejemplo, la creatina cinasa (CK) srica es una
mezcla de CK-MM (del msculo esqueltico), de CK-MB
(predominante del corazn) y de CK-BB (del cerebro). Con
la electroforesis puede distinguirse si la causa de una CK
total elevada es un dao del msculo cardiaco o el esquel-
tico. La separacin se consigue usando geles de agar recu-
biertos con un sustrato sinttico para la enzima que produce
un compuesto uorescente visible bajo luz UV cuando es
activado por la CK. Aunque la medicin de las troponinas
especcas del corazn ha sustituido en gran parte las me-
diciones CK-MB en muchos laboratorios, la electroforesis
sigue como el nico mtodo capaz de detectar la presencia
de los complejos macro-CK. La electroforesis tambin se
utiliza para separar la fosfatasa alcalina en formas heptica,
sea, placentaria e intestinal, y para determinar el patrn de
isoenzimas de la lactato deshidrogenasa.
Hemoglobina
Hasta la reciente introduccin de los mtodos de HPLC
para la identicacin de las variantes de la hemoglobina,
los mtodos electroforticos se emplearon con mucha fre-
cuencia, fundamentados sobre la carga global diferente
en la molcula de la hemoglobina causada por las susti-
tuciones del aminocido. El acetato de celulosa se man-
tuvo como el medio de soporte normal para los mtodos
de tamizaje, con la electroforesis del gel de agar citrato
usada para la identicacin positiva de cualquier variante
anormal vista en el tamizaje. La separacin de las varian-
tes de la hemoglobina por electroforesis con gel de citrato
confa en las interacciones de los aminocidos sustituidos
con agaropectina. Las hemoglobinas variables con sustitu-
ciones cerca de la supercie, por ejemplo, HbS y HbC, se
retienen, mientras que en las sustituciones ms profundas
no ocurre, como HbD y HbG. Combinaciones comple-
jas de electroforesis o el enfoque isoelctrico se requieren
para identicar hemoglobinopatas raras.
Fragmentos de DNA obtenidos por PCR
Aunque fuera del alcance de esta seccin, merece la pena
recordar que muchas de las tcnicas moleculares actuales
introducidas en el laboratorio clnico incluyen la separa-
cin electrofortica de fragmentos de la restriccin del
DNA, despus de amplicacin por PCR. El gel de agar es
el medio usado en la mayor parte de las aplicaciones en la
biologa molecular, con la visualizacin por radiomarcaje o
por tincin con bromuro de etidio. Un ejemplo del empleo
de tales tcnicas es la deteccin de las dos mutaciones en
el gen HFE relacionado con hemocromatosis gentica: los
cambios aminoacdicos C282Y y H63D.
Electroforesis capilar (EC)
Aunque la electroforesis en un capilar estrecho se describi
primero en 1937, es desde 1985 que la tcnica se emplea
de manera independiente. Se utilizan capilares de 25 a 100
m de dimetro y de 25 a 100 cm de longitud; sus extre-
mos se colocan en viales con amortiguador, que tambin
contienen los electrodos. Voltajes muy altos (10 a 30 kV)
se aplican para producir el ujo electroendosmtico dentro
del capilar. El tipo pH y la fuerza inica del amortiguador
que llena el tubo capilar son crticos para lograr la separa-
cin deseada.
Existen cuatro formas importantes de separacin por
electroforesis capilar: electroforesis capilar de zona (CZE)
o separacin en solucin libre; cromatografa capilar elec-
trocintica micelar (MECC); enfoque isoelctrico capilar
(CIEF) e isotacoforesis capilar.
Los principios de estas formas diferentes de separacin
y los usos potenciales en la medicina de laboratorio fueron
revisados hace poco. Se ha desarrollado un instrumento
comercial que usa CE para la electroforesis de protenas
sricas (Beckman Instruments). ste utiliza varios tubos
capilares en paralelo para alcanzar un alto rendimiento e
incluye la identicacin de paraprotenas usando la tcnica
de inmunosustraccin. La CE se convirti en la metodolo-
ga dominante en el Proyecto del Genoma Humano, y es
la base para la generacin actual de los secuenciadores de
DNA del banco principal.
Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem
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SECCIN 8
INMUNOLOGA
Introduccin
Las tcnicas cualitativas y cuantitativas para el anlisis pro-
teico son herramientas esenciales en el laboratorio rutina-
rio de inmunologa, cuya remisin incluye el anlisis de
algunas protenas en sangre y en otros uidos corporales.
Entre las protenas de mayor inters especco para el in-
munlogo se incluyen las inmunoglobulinas (anticuerpos),
las protenas del sistema del complemento y, ms reciente-
mente, las citocinas, que tienen una funcin en el sistema
inmunitario. El propsito de este captulo es aportar una
descripcin breve de los principios de los mtodos que se
usan para el anlisis proteico rutinario. Aunque algunos de
los mtodos descritos se utilizan para el estudio de las pro-
tenas del sistema del complemento, la naturaleza de este
sistema exige consideraciones especiales para la interpre-
tacin exacta. Por tanto, los ensayos para las protenas del
complemento se describen con detalle en el captulo 46.
De manera similar, los ensayos para los anticuerpos autoin-
munitarios se tratan en el captulo sobre enfermedades del
complejo inmunitario y crioglobulinas (cap. 48).
El propsito principal de los anlisis rutinarios de labo-
ratorio en inmunologa es detectar, caracterizar y medir la
cantidad de:
1. Deciencias de protenas especcas, como en la de-
ciencia de inmunoglobulinas.
2. Expresin anormal o inadecuada de protenas, por ejem-
plo, en gammapatas monoclonales, enfermedad autoin-
munitaria o atopa.
Los mtodos para el anlisis de protenas confan en una
variedad de principios. Para la mayora de los ensayos ruti-
narios, como los descritos en este captulo, existen, sin em-
bargo, realmente slo dos propiedades bsicas utilizadas:
1. Las protenas individuales tienen una carga elctrica
caracterstica, lo que signica que diferentes protenas
especcas pueden separarse por electroforesis.
2. Cada protena humana especca tiene una estructura
nica, que puede emplearse para generar anticuerpos
contra esa protena, del tipo de los anticuerpos policlo-
nales al inmunizar animales con la protena en cuestin,
o anticuerpos del tipo monoclonal mediante la tecnolo-
ga del hibridoma. Los anticuerpos especcos para una
protena son la base de los ensayos inmunitarios.
La seleccin de un mtodo de ensayo apropiado depen-
de del requerimiento de un resultado cualitativo o cuanti-
tativo. Adems, la concentracin de la protena de inters
es crucial para la eleccin de la prueba, por ejemplo, la
deteccin o medicin de inmunoglobulinas monoclonales
y oligoclonales en lquido cefalorraqudeo (LCR) y orina
puede requerir la concentracin de la muestra o la selec-
cin de un mtodo ms sensible que el elegido para espe-
cmenes del suero.
Una breve perspectiva histrica
Los principios de la electroforesis, el mtodo de separacin
molecular en una carga elctrica, slo se conocieron por al-
gn tiempo cuando el sueco Arne Tiselius, en 1930, sospe-
chando la naturaleza compleja de las protenas sanguneas,
comenz a experimentar con la electroforesis del suero
en un medio lquido con amortiguador. En 1937 identi-
45
Ensayos proteicos
David Burnett
440 CAP. 45 ENSAYOS PROTEICOS
c varias zonas discretas de la protena, que podran verse
despus de la electroforesis del suero; las llam albmina,
-globulina, -globulina y -globulina, teniendo la prime-
ra la movilidad ms rpida hacia el nodo y la -globulina
la ms lenta. Esta nomenclatura bsica sigue vigente (vase
adelante). En la dcada de 1950 desempe un importante
papel como medio de soporte; posteriormente se introdujo
el uso del acetato de celulosa y de los geles como el agar,
la agarosa y la poliacrilamida. En la actualidad, la elec-
troforesis, en fase lquida, se reintrodujo para las pruebas
rutinarias (vase adelante).
Bechhold, en 1905, demostr que un antgeno proteico y
un anticuerpo para ese antgeno pueden formar un precipita-
do. Sin embargo, Oudin, en 1946 describi un desarrollo til
de este principio y en 1948 Elek y Ouchterlony introdujeron
la difusin doble en un gel independiente. Este mtodo
simple, que todava se utiliza (se describe ms adelante),
se contina llamando mtodo de Ouchterlony. Grabar y
Williams, en 1953, combinaron la separacin electrofortica
de las protenas sricas con la inmunoprecipitacin (inmuno-
electroforesis cualitativa), usando anticuerpos policlonales
para suero completo, y lograron que la naturaleza verdadera
de la heterogeneidad de las protenas del suero fuese recono-
cida. Cuando las protenas especcas comenzaron a puri-
carse y los anticuerpos para ellas se crearon en animales, se
logr realizar anlisis inmunitarios cuantitativos especcos.
La inmunodifusin radial (tcnica de Mancini) se introdujo
en 1965 y sta todava se emplea de rutina (vase adelante).
La sensibilidad del ensayo cuantitativo de la protena mejor
desde entonces, con radioinmunoensayos e inmunoensayos
enzimticos que permiten mediciones realistas bajo el orden
de varios ng/ml.
Figura 45-1 a) Electroforesis en agarosa de muestras sricas, teidas para protena. Las muestras fueron cargadas en el ctodo (base).
La banda en el extremo superior de cada carril representa la albmina. Las bandas con teido denso en el extremo del ctodo representan
paraprotenas. b) Escaneo por densitometra de la electroforesis en agarosa del suero de un sujeto sano. El pico alto a la derecha repre-
senta la albmina.
Tcnicas cualitativas
Electroforesis
La electroforesis de la protena del suero, aunque presen-
ta una resolucin limitada, es un mtodo fundamental para
analizar muestras para anormalidades de la protena a gros-
so modo. El medio de soporte para la electroforesis en gel
es, por lo general, una membrana de acetato de celulosa o
gel de agarosa. Los amortiguadores varan pero se basan
en barbitona, con un pH cercano a 8.5. Geles o membra-
nas para la electroforesis rutinaria estn disponibles en
el comercio y se utilizan con frecuencia para minimizar el
tiempo de preparacin y asegurar resultados constantes. La
membrana de soporte se coloca sobre un tanque de electro-
foresis, conectada en cada extremo a la solucin amortigua-
dora. La muestra que se quiere analizar se carga en el extre-
mo del ctodo y se aplica una corriente elctrica de 30 min a
una hora. Las protenas en la muestra migran en la corriente
con velocidades proporcionales a su carga. Al trmino de la
separacin electrofortica, se retira el gel o la membrana y
las protenas se insolubilizan por jacin, por lo general en
una solucin con cido actico, y se visualizan si se tien con
un colorante proteico apropiado (g. 45-1). El gel puede
semicuanticarse por densitometra; es decir, el gel se exa-
mina usando un densitmetro, que mide la densidad del te-
ido (g. 45-1).
Slo las protenas con una concentracin de 0.1 a 0.5
g/L, o mayor, contribuyen a constituir las bandas de las
protenas sricas observadas, de las cuales regularmente se
representan seis. stas se sealan, en orden de movilidad
electrofortica, como:
THE BINDING SITE
(gel de electroforesis
de protenas del suero)
1. Banda de albmina (representada por la albmina del
suero).
2. Banda
1
(se representa por
1
-antitripsina, orosomu-
coide y -lipoprotena).
3. Banda
2
(representada por la haptoglobina y
2
-ma-
croglobulina).
4. Banda
1
(se representa por la transferrina).
5. Banda
2
(representada por protenas y -lipoprotena
del complemento).
6. Banda (se representa por las inmunoglobulinas IgG,
IgM e IgA).
La mayor parte de las protenas del suero, cuando es-
tn presentes en la sangre en concentraciones inferiores
al umbral para este mtodo, no contribuyen a las bandas
observadas. Sin embargo, para el inmunlogo quizs la in-
formacin ms relevante que se obtiene de la electroforesis
es la deteccin de la deciencia de inmunoglobulinas o de
gammapatas monoclonales. Debido a que las inmuno-
globulinas representan diversas molculas del anticuerpo
son, por naturaleza, heterogneas y no estn representadas
por una banda discreta. Ms bien, esta banda se observa
como una banda amplia a menos que exista una banda mo-
noclonal (o M). En casos de gammapata monoclonal,
hay una produccin predominante por un clon expandido
de clulas que producen inmunoglobulinas, de inmunoglo-
bulina de un isotipo (IgG, IgM o IgA) con especicidad
discreta. Estas molculas de inmunoglobulina son idnti-
cas y producen una banda o M discreta (g. 45-1). La
identicacin de la naturaleza de la protena M monoclonal
en el suero y las cadenas ligeras libres (protenas de Ben-
ce-Jones) en orina puede realizarse usando inmunojacin
precipitando la protena en el medio de soporte, despus
de la electroforesis, con un anticuerpo especco para cada
isotipo. Las protenas no precipitadas se eliminan con un
lavado y el precipitado restante se visualiza tiendo con
un colorante proteico (g. 45-2). La protena M tambin se
puede caracterizar por inmunodifusin o inmunoelectrofo-
resis y la concentracin medirse por inmunoensayo cuan-
titativo (estos mtodos se describen ms adelante). Por el
contrario, una banda reducida sugiere una deciencia de
la inmunoglobulina y esto debe investigarse ms a fondo
por ensayo cuantitativo (vase adelante).
Exactamente como la secuenciacin de DNA en geles
se ha sustituido en gran parte por los sistemas capilares,
la electroforesis proteica puede realizarse ahora en tubos
capilares que contienen una fase lquida. El modelo CZE
2000 de Beckman-Coulter es un ejemplo. Se le disea para
permitir el anlisis rpido de muchos especmenes: 70 mues-
Figura 45-2 Inmunojacin y tincin de protenas del suero
despus de la electroforesis. El carril marcado con TSP muestra el
patrn de tincin para todas las protenas. La banda en el extremo
superior es albmina. La banda ms cercana al extremo inferior
es una paraprotena. La inmunojacin con anticuerpos para IgM,
IgA e IgM humanos revela que la paraprotena es IgM. La jacin
con anticuerpos para las cadenas ligeras y muestra que la
paraprotena es IgMk.
tras en 90 min. La resolucin es similar a la de los geles.
En realidad, el resultado, que tiene el formato equivalente a
un escaneo por densitometra del gel, puede ser invertido
para dar la imagen simulada de un gel teido.
Inmunodifusin de Ouchterlony
La inmunodifusin se realiza en geles de agar o de agarosa.
Por lo comn, una roseta de pozos se corta en el gel con
un pozo tambin cortado al centro de la roseta (g. 45-3).
El pozo central se llena con el espcimen de prueba y los
circundantes en la roseta con un antisuero de especicidad
diferente. El gel se incuba en una atmsfera hmeda por
varias horas. Las protenas en el pozo central y aquellas de
la roseta se difunden en el gel. Si el espcimen contiene una
protena para la cual se obtiene uno de los antisueros,
un precipitado comienza a formarse; este precipitado es in-
soluble a concentraciones de equivalencia. Los geles se
pueden lavar, secar y teir para que se archiven. Usando
este mtodo, la presencia de varias protenas puede detectar-
se simultneamente en el espcimen de prueba. Como otra
alternativa, varias muestras de la prueba se analizan para
detectar la presencia de una protena especca colocando
un antisuero especco en el pozo central y una muestra
diferente de la prueba en cada uno de los circundantes. Las
placas de Ouchterlony estn disponibles en el comercio,
por ejemplo, para identicar el isotipo y la subclase que
representa una paraprotena en una muestra srica.
TCNICAS CUALITATIVAS 441
THE BINDING SITE
(gel de electroforesis de protenas del suero)
Figura 45-4 Electroforesis a contracorriente. Este ejemplo es un
equipo comercial diseado para detectar autoanticuerpos. El an-
tgeno blanco est en las secciones cuadradas a la izquierda
(ctodo) y el suero del paciente se aplica en el nodo (lado dere-
cho de la gura). Bajo inuencia de una corriente elctrica, el an-
tgeno y las molculas de inmunoglobulina del paciente emigran
uno hacia el otro. Un inmunoprecipitado, teido con un colorante
proteico, indica la presencia de autoanticuerpos para el antgeno.
Figura 45-3 Inmunodifusin de Ouchterlony mostrando el pa-
trn clsico de la roseta de pozos cortados en el gel de agarosa.
Un anticuerpo (generado en un animal como el conejo o la oveja)
fue puesto en el pozo central y las muestras del suero en los po-
zos satlites circundantes. El suero en el pozo superior contuvo
bien la protena de inters. Las molculas del anticuerpo se han
difundido radialmente a travs del gel y donde encontraron a la
protena que difunda desde el pozo inferior. Las molculas pro-
teicas (antgeno) han sido unidas por molculas del anticuerpo,
produciendo un precipitado visible e insoluble.
Inmunoelectroforesis de contracorriente
La electroforesis de contracorriente es similar, en princi-
pio, a la inmunodifusin, pero el antgeno y el anticuerpo
son electroforizados uno hacia el otro en el gel (g. 45-4).
El uso de la electroforesis en lugar de la difusin asegura
que los resultados se obtengan ms rpido. Se recomien-
da utilizar la inmunoelectroforesis a contracorriente como
un mtodo de tamizaje inicial rpido (p. ej., para detectar
anticuerpos para antgenos nucleares extrables) y los re-
sultados positivos se conrman por otros mtodos, como la
inmunodifusin de Ouchterlony.
Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis cualitativa (descrita originalmen-
te por Grabar y Williams) comienza con la electroforesis en
acetato de celulosa, agar o agarosa. Un canal se corta en la
membrana o en el gel, adyacente al paso de la electrofore-
sis. Despus de la electroforesis, el antisuero se coloca en
el canal y la membrana/gel se incuba en una atmsfera h-
meda por varias horas. Durante este tiempo, las protenas
separadas por electroforesis y las molculas del anticuerpo
a partir del canal difunden a travs del medio de soporte. Si
los anticuerpos para las protenas separadas estn presen-
tes, se forma un inmunoprecipitado en el gel, que es inso-
luble a un punto de concentraciones equivalentes. Estos
precipitados son con frecuencia visibles en el gel hidrata-
do, sin teir, slo que la sensibilidad puede incrementarse
despus de que el gel se lava, se ja y se tie (g. 45-5).
Un antisuero que se obtiene para emplearse como suero
completo revela arcos precipitados que representan todas
las protenas presentes para las cuales hay anticuerpos en el
antisuero. La ausencia de un arco de precipitacin (cuando
se compara a un espcimen de referencia) indica una ca-
rencia de protenas. La paraprotena monoclonal tambin
es evidente debido a los precipitados anormales formados
o pronunciados. La presencia o la identidad de una protena
especca, como una paraprotena, puede conrmarse co-
locando un antisuero especco (p. ej., antisuero especco
para cadenas pesadas IgG, IgA o IgM humanas o para ca-
denas ligeras y ) en el canal.
Mtodos cuantitativos
Inmunodifusin radial (g. 45-6)
Este mtodo tambin se conoce como inmunodifusin
radial nica o mtodo de Mancini. El agar o agarosa,
fundido en un amortiguador conveniente, se deja enfriar al-
rededor de 55C y el antisuero precipitante especco para
la protena que se va a medir se aade en la concentracin
apropiada. El gel que contiene antisuero se vierte sobre una
placa o plato de cristal o plstico y se deja enfriar, despus
de lo cual solidica el gel. Los pozos se cortan en el gel y
cada uno de stos se llena con varios microlitros de suero
de prueba. Una serie de pozos, cada uno lleno con suero de
referencia (o solucin de referencia) contiene concentra-
ciones conocidas de la protena con la que se va ensayar. La
placa se deja en una atmsfera hmeda para permitir que
las protenas dentro de las muestras y de las soluciones de
la referencia difundan en el gel, que contiene antisuero cir-
cundante. Cuando las molculas proteicas que estn en el
ensayo difunden en el gel forman precipitados con las mo-
lculas del antisuero. Estos precipitados son parcialmente
solubles siempre que la concentracin del antgeno (prote-
na) sea superior a la del antisuero. As, algunas molculas
proteicas continan difundiendo radialmente desde el pozo
hasta que la concentracin del antgeno es equivalente a
la de los anticuerpos. En este punto un anillo de precipitado
insoluble se forma alrededor del pozo de la muestra. El rea
(y por tanto el dimetro) del anillo es directamente propor-
cional a la concentracin de la protena en la muestra de la
prueba. Por supuesto, siempre que la concentracin del an-
tisuero en el gel y las concentraciones de la protena en la
muestra estn dentro de los lmites apropiados y el proceso
de la difusin se ha dejado correr hasta la terminacin, el
rea del anillo inmunoprecipitado es linealmente propor-
cional a la concentracin de la protena. sta requiere que
el sistema de la prueba sea titulado por experimentacin.
Tambin signica que es posible que las placas necesiten un
MTODOS CUANTITATIVOS 443
Figura 45-5 a) Diagrama que muestra el principio de la inmuno-
electroforesis cualitativa. La muestra del paciente se coloca en un
pozo cortado en el gel y las protenas se separan por electrofore-
sis. Despus de la electroforesis, el antisuero se pone en un canal
que corre paralelo a las protenas separadas. El gel se deja en
una atmsfera hmeda para permitir que las protenas separadas
y las molculas del antisuero difundan una a otra. La presencia
de protenas hacia las molculas del anticuerpo son resultado de
un precipitado en forma de arco. b) Inmunoelectroforesis de dos
muestras de suero. Los dos pozos con aplicacin de la muestra
estn en el centro del gel; separados por un canal que contuvo el
antisuero de la oveja se incrementan contra las protenas huma-
nas del suero. La electroforesis fue realizada con el ctodo a la
derecha. Los arcos de inmunoprecipitado en el suero de la parte
inferior muestran un patrn normal; aquellos para IgG, IgA e IgM
se marcan. Obsrvese la ausencia de estos inmunoprecipitados en
la muestra superior, esto indica que este paciente era deciente
en las tres inmunoglobulinas.
Figura 45-6 Inmunodifusin radial sencilla. Este ejemplo mues-
tra un gel de agarosa en el cual se disuelva un antisuero para IgG
2

humana. Las muestras de suero humano fueron puestas en po-
zos que se cortaron en el gel. La placa fue incubada para permi-
tir que las protenas en las muestras difundieran a travs del gel.
Las molculas IgG
2
fueron ligadas por anticuerpos para IgG
2
,
que produjo anillos visibles del precipitado insoluble. El rea
de un anillo del precipitado es proporcional a la concentracin de
IgG
2
en la muestra. Obsrvese la ausencia de anillos en algunas
muestras, demostrando la deciencia en IgG
2
.
Figura 45-7 Esquema simplicado que muestra los principios
de la turbidimetra y de la nefelometra (vase el texto para una
explicacin).
tiempo considerable (quizs varios das) para la difusin y la
formacin del precipitado al dejar que la corrida se comple-
te. Estos contratiempos pueden ser inoportunos y demasiado
lentos para algunos laboratorios con trabajo de grandes vol-
menes de muestras, pero las placas de inmunodifusin radial
estn ahora disponibles en sus formas comerciales para la
medicin de protenas clnicamente importantes, incluyendo
isotipos, subclases y cadenas ligeras de inmunoglobulinas.
Estas placas comerciales se producen dentro de tales tole-
rancias para obtener resultados exactos y precisos antes de
que la difusin haya corrido completa (mtodo de Fahey y
McKelvey), aportando resultados en slo algunas horas. De
hecho, las concentraciones del antisuero se incorporan con
tanta exactitud que, con una prdida pequea y normalmente
irrelevante de exactitud, las concentraciones de la protena
pueden ser interpoladas, a partir de los dimetros del anillo,
a las curvas estndares de referencia suministradas con el
equipo, sin usar soluciones estndares de referencia. El lmi-
te de la sensibilidad de un ensayo por difusin radial depen-
de en gran parte de la calidad del antisuero pero est por lo
general en el orden de alrededor de 5 mg/L. Algunas placas
desarrolladas para el comercio pueden medir protenas tan
bajas como 0.2 mg/L.
Turbidimetra y nefelometra
Los mtodos cuantitativos descritos antes confan en la for-
macin de complejos insolubles protena-anticuerpo que
pueden visualizarse por el ojo en medios con soporte de gel.
Si el precipitado se forma con una protena y un anticuerpo
a concentraciones bajas en un medio lquido, un precipi-
tado ms no se forma en la suspensin. Esta propiedad
puede utilizarse para medir la concentracin de la protena.
La presencia de un precipitado impedir que un haz de luz
atraviese la suspensin (turbidimetra). De manera alterna,
la luz dispersada por la suspensin puede detectarse en un
ngulo hacia la luz incidente (g. 45-7). Este mtodo se
llama nefelometra. La cantidad del inmunoprecipitado, a
una concentracin constante del anticuerpo, aumentar en
proporcin con la concentracin de la protena, hasta que
todo el anticuerpo se ha ligado al antgeno. La medicin
de la dispersin de la luz debe, por consiguiente, hacerse
en condiciones de exceso del anticuerpo; se hace como un
punto nal o por un analizador de la velocidad que mida
el aumento en la dispersin como las formas del precipita-
do. Es claro que este acercamiento, a diferencia incluso de
mtodos ms sencillos como la inmunodifusin radial,
requiere aparatos especializados pero ofrece un grado de
automatizacin y un procesamiento alto de los especme-
nes. Algunos laboratorios usan analizadores centrfugos en
los cuales los reactivos son mezclados durante la centrifu-
gacin, reduciendo el tiempo del ensayo. El lmite de sen-
sibilidad de esta metodologa, como en la mayor parte de
los inmunoensayos, depende del sistema especco y, sobre
todo, de la calidad de antisuero, que debe ser policlonal. En
un buen sistema, el lmite es alrededor de 10 mg/L, pero
puede mejorarse a casi dos rdenes de magnitud usando
nefelometra reforzada con partculas, cuando los anti-
cuerpos se ligan a las perlas diminutas del poliestireno. Los
reactivos para la turbidimetra y la nefelometra de prote-
nas clnicamente importantes, como isotipos y subclases de
inmunoglobulina, estn disponibles en el comercio.
Ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
Los ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas
(ELISA), tambin llamados inmunoensayos enzimticos
(EIA), representan un principio verstil y sensible para la
medicin de la protena, que ha reemplazado en gran par-
te a los radioinmunoensayos. Pueden medir protenas por
debajo de concentraciones cercanas a 1 g/L. Son ensa-
yos convenientes que se emplean si la protena de inters
est presente en una concentracin baja. Estos ensayos se
realizan en placas de plstico con 96 pozos y el manejo
del reactivo se hace normalmente por medio de pipetas de
multicanal. ELISA es conveniente para la automatizacin
o semiautomatizacin y, por tanto, incluso para la protena
que se mide en una concentracin alta, haciendo necesaria
la dilucin de la muestra; si una gran cantidad de muestras
est procesando esta tcnica puede ser ms conveniente
que otros mtodos ms simples, como la inmunodifusin
radial. Muchos laboratorios construyen sus propios siste-
mas internos de ELISA, pero los equipos en el comercio
estn disponibles para una amplia gama de aplicaciones,
Fuente de luz
Cubeta
Detector de
turbidez
Nefelmetro
Principio de la nefelometra/turbidimetra
Partculas
dispersas
incluyendo ensayos para medir protenas sricas impor-
tantes, citocinas, antgenos microbianos (p. ej., Chlamydia
trachomatis, antgenos del virus de hepatitis B), anticuer-
pos de IgE para alergenos y anticuerpos para patgenos.
Los diferentes sistemas de ensayo varan en detalles
pero los principios esenciales siguen siendo similares. Las
formas ms simples son ELISA indirectos para detectar
anticuerpos especcos y ELISA directos de empareda-
do para detectar los antgenos.
ELISA indirecto para la deteccin del anticuerpo (g.
45-8a) se basa en la microtitulacin de pozos de la placa
cubiertos con un antgeno blanco apropiado (p. ej., prote-
na de un patgeno). Las muestras que se prueban se aplican
a los pozos, seguidas por un anticuerpo conjugado enzim-
ticamente para la inmunoglobulina humana. La enzima es
por lo comn la peroxidasa de rbano (HRP) o la fosfatasa
alcalina. La eleccin de la inmunoglobulina antihumana
permitir la deteccin de todos los isotipos (usando anti-
suero que se obtiene contra las inmunoglobulinas humanas
IgG, IgA e IgM), o de un isotipo especco (p. ej., anticuer-
pos IgE para alergenos). Despus de un lavado adicional
para eliminar el anticuerpo conjugado no ligado, un sus-
trato conveniente se agrega a los pozos. Un producto colo-
reado se detecta usando un lector de ELISA que recolecta
a la longitud de onda apropiada (450 nm para HRP; 492
nm para la fosfatasa alcalina), la muestra del anticuerpo
blanco en el espcimen original. Estos ensayos pueden ser
cuantitativos.
Para ELISA directo de emparedado para detectar ant-
genos (g. 45-8b), los pozos de microplacas de 96 pozos
(tambin se pueden conseguir como tiras de ocho pozos)
se cubren con un anticuerpo para la protena que se de-
tecta o mide. ste no necesita ser un anticuerpo precipi-
tante, por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se usan
con frecuencia. Cada pozo se llena con una muestra de la
prueba o bien con una gama de soluciones de referencia
de concentracin conocida. Los pozos se incuban por un
tiempo apropiado (cerca de una hora), despus de lo cual
Figura 45-8 a) ELISA indirecto. La gura muestra el principio de esta tcnica para la deteccin de anticuerpos especcos. b) ELISA
directo de emparedado para detectar un antgeno especco en una muestra. c) ELISA competitivo para detectar o medir un anticuerpo
especco para un antgeno conocido. El mtodo confa en un anticuerpo (conjugado enzimticamente), que se obtiene de un animal como
el conejo o la oveja, que reconoce el mismo antgeno como el anticuerpo blanco que se est midiendo. El espcimen se mezcla con el
anticuerpo conjugado que compite para ligar al antgeno utilizado sobre la placa de ELISA. d) ELISA competitivo para detectar o para
medir una protena (antgeno). La muestra que se prueba se incuba con un anticuerpo producido para el antgeno de inters (en este caso
un anticuerpo de conejo). El anticuerpo de conejo se liga al antgeno blanco en la muestra, que evita a aquellas molculas del anticuerpo
al unirse posteriormente al pozo con ELISA cubierto con el antgeno. Cualquier anticuerpo de conejo que no se una al antgeno en la
preincubacin es capaz de unirse al pozo ELISA y se le detecta con la adicin de un anticuerpo conjugado enzimticamente para IgG
de conejo (en este caso, IgG de oveja anticonejo). La cantidad de producto enzima-sustrato medido ser inversamente proporcional a la
cantidad de protena blanco en la muestra original.
MTODOS CUANTITATIVOS 445
enzima-anticuerpo
Anticuerpo blanco
Antgeno
Conjugado
(a )
Conjugado
enzima-anticuerpo
Anticuerpo inmovilizado
Antgeno blanco
(b )
Anticuerpo
animal conjugado
enzimticamente
Antgeno
Anticuerpo humano
contra el antgeno
(c )
IgG de oveja
anticonejo conjugado
enzimticamente
Anticuerpo de conejo
gado al antgeno sobre
la placa
Antgeno
Muestra de
suero que
contiene la
protena de
inters incubada
con anticuerpo
de conejo
para la protena
El anticuerpo de conejo
ligado a protena
no puede hacerlo a la
protena sobre la placa
(d )
se lavan para retirar el material que no es capturado por el
anticuerpo en la supercie del pozo. Los pozos entonces
se llenan de una solucin de otro anticuerpo para la prote-
na que se mide. Es claro que si el anticuerpo primario fue
monoclonal, el mismo anticuerpo monoclonal no puede
ser ecaz en este paso porque la protena blanco podra
tener un antgeno determinante (epitopo) reconocido por
el anticuerpo. Es aqu donde es necesaria una cierta ex-
perimentacin, para identicar un segundo anticuerpo que
reconozca a la protena despus de que la haya captura-
do el antgeno primario inmovilizado sobre los pozos de
la placa. Este segundo anticuerpo est conjugado con la
enzima. La placa se incuba otra vez para permitir que el
segundo anticuerpo conjugado enzimticamente se una con
la protena capturada. La placa se lava de nuevo y el sus-
trato para la enzima conjugante se agrega a los pozos. El
sustrato produce un producto de reaccin soluble y colo-
reado. Puesto que la cantidad de anticuerpo conjugado de
forma enzimtica que se une es proporcional a la cantidad
de protena capturada por el anticuerpo primario, resulta
que la cantidad del producto de la reaccin enzimtica es
proporcional a la concentracin de la protena en la mues-
tra original. La cantidad del producto de reaccin se mide
usando un lector de placas ELISA, el cual pasa la luz a
travs de cada pozo a una longitud de onda que absorbe el
producto de reaccin y, para la cuanticacin, los resulta-
dos se interpolan a partir de aquellos que se obtienen con
las soluciones de referencia.
Otro tipo de ELISA es competitivo. Un ejemplo se
muestra en la gura 45-8c. Esta muestra ELISA de com-
peticin se emplea para la deteccin de anticuerpos espec-
cos. Los pozos se cubren con el antgeno que se reconoce
con la molcula del anticuerpo de inters. Las muestras del
paciente se agregan a los pozos junto con las molculas del
anticuerpo generado en animales experimentales, con es-
pecicidad para el mismo antgeno, como aquella recono-
cida por el anticuerpo que es ensayado. Habr competencia
para unir al antgeno. Entre ms molculas del anticuerpo
estn en la muestra del paciente, menor es la unin de los
anticuerpos conjugados. La gura 45-8d muestra el razo-
namiento para un ELISA competitivo para la deteccin o la
medicin de un antgeno. En este caso, los pozos estn cu-
biertos con el antgeno de inters. La muestra del paciente
se preincuba con, o se aade, junto con un anticuerpo con-
jugado enzimticamente al antgeno. Cualquier antgeno
en la muestra ocupa sitios de unin con el antgeno sobre
el anticuerpo disminuyendo su unin con el antgeno que
cubre el pozo.
Existen muchas permutaciones sobre estos estilos b-
sicos de ELISA y algunas se describen en la lista de Lectu-
ras complementarias, al nal de este captulo.
Conclusin
Los laboratorios que trabajan de manera rutinaria grandes
volmenes de muestras para inmunologa tienen a su dispo-
sicin una gama de mtodos para el anlisis de la protena
de dnde elegir. Los mtodos empleados se determinan a
travs de consideraciones incluyendo la naturaleza de los
especmenes, las identidades de las protenas que son medi-
das y sus concentraciones en los especmenes. Tambin, la
cantidad de especmenes procesados de rutina determinan
si los sistemas automatizados necesitan emplearse. Muchos
de los mtodos usados en la actualidad han cambiado slo
en detalles desde que las protenas especcas comenzaron
a identicarse y medirse, y algunos de ellos es probable que
sigan emplendose por mucho tiempo ms. Otros, como
ELISA, representan tecnologas ms nuevas que desplazan
a aquellas con desventajas tcnicas o prcticas, como los
radioinmunoensayos. Hay muchos progresos en la caracte-
rizacin de la protena, en especial en el campo del anlisis
de datos, como para los protemicos. Cmo y cundo, los
laboratorios que trabajan grandes volmenes de muestras
de protenas lleguen a adoptar mtodos nuevos se tendr
que esperar para descubrirlo.
Reconocimientos
Debo agradecer a Roger Drew de la Binding Site Ltd., por algu-
nas de las guras aqu publicadas.
Chapel H, Haeney M. Essentials of Clinical Immunology, 3rd
edn. 1993: Blackwell Scientic, Oxford.
Crowther JR. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Bio-
logy Series, vol 149. 2002: Humana, Totowa, NJ.
Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 6th edn. 2002: ASM Press, Washington, DC.
Sheehan C. Clinical Immunology. Principles and Laboratory
Diagnosis, 2nd edn. 1997: Lippincott, Philadelphia, PA.
Introduccin
El complemento es un sistema de las protenas del suero
y de los receptores celulares que tiene varias funciones, la
mayor parte de las cuales ayuda al husped a prevenir o lu-
char contra la infeccin. Descrito originalmente como una
sustancia sensible al calor que podra, junto con el anti-
cuerpo especco, lisar ciertas bacterias, ahora se sabe que
las protenas del complemento actan por medio de dos
rutas principales. La activacin de estas rutas conduce a la
deposicin de una opsonina potente en la supercie de los
microorganismos, adems de producir una respuesta ina-
matoria que libera factores vasoactivos y quimiotcticos.
Otros componentes pueden daar las supercies celulares,
pero aun otro grupo controla la activacin espontnea y po-
tencialmente daina de estas rutas.
Los niveles de las protenas del complemento pueden
ensayarse por varios mtodos, y es tambin posible deter-
minar la actividad funcional de la mayor parte de los com-
ponentes. Para apreciar de modo completo las condiciones
requeridas para estos ensayos, es importante entender el
proceso que ocurre. Por consiguiente, una vista general
breve del complemento se describe en la seccin siguiente,
con muchos detalles que se encuentran en las secciones in-
dividuales del ensayo.
La ruta clsica
La primera ruta que se describe aqu se denomina la ruta
clsica, y los componentes en este sistema se prejan con
C y lo comprenden C1q, C1r, C1s, C4 y C2 (los nmeros
son atribuidos al tiempo de denicin de los componentes, no
a la secuencia de activacin). La ruta clsica puede activarse
por IgG o IgM que se han ligado al antgeno. El C1q se liga
a ese anticuerpo y, una vez que est unido, se activa el C1r,
que a su vez activa el C1s. El C1s activado es una proteasa
cuyo sustrato es C4, que es cortada. El C4 cortado (C4b) liga
el C2 y el C1s entonces activa el C2 (para formar C2a) por
protelisis limitada. El complejo activo C4b2a (ruta clsica
C3 convertasa) activa el C3, otra vez por protelisis limitada.
Los iones calcio y magnesio se requieren para la activacin
de la ruta clsica. El C3 activado (C3b) liga covalentemente
a las supercies y acta como ligando de alta anidad para
los receptores de C3b en los fagocitos.
Esta ruta se puede tambin activar con el C1q unido a
la protena C-reactiva, una protena de fase aguda, similar
en forma a la IgM, que se liga al carbohidrato en algunas
bacterias. La lecitina unida al carbohidrato manano (MBL)
es una protena funcionalmente similar que se parece a C1q
por s misma; y la MBL forma un complejo macromolecu-
lar con las proteasas serinas 1 y 2 relacionadas con MBL
(MASP1 y MASP2), que tiene muchas de las mismas pro-
piedades que C1r y C1s. El complejo MBL-MASP puede,
por tanto, activar la ruta clsica a travs de C4 cuando se
liga a un carbohidrato conveniente, como la manosa, la N-
acetilglucosamina, la glucosa o la fucosa.
La ruta alterna
C3, el factor B, el factor D y la properdina son los compo-
nentes de la ruta alterna de activacin del complemento. La
activacin de esta ruta no descansa en alguno de los facto-
res especcos desencadenantes sino en un nivel constante
bajo de activacin espontnea. Una proporcin pequea de
46
Ensayos del complemento
J. North y K Whaley
448 CAP. 46 ENSAYOS DEL COMPLEMENTO
C3 circulante se hidroliza, y esta forma de C3 puede ligar
el factor B en presencia de los iones de magnesio. El factor
B ligado es cortado por el factor D para formar Ba y C3Bb;
ste puede activar ms C3 para formar C3a y C3b. C3b
puede ligarse a las supercies y, una vez unido, liga ms
factor B. El C3b ligado a la supercie de los microorganis-
mos es resistente a la actividad reguladora de los factores
H e I, de modo que se favorece la activacin. Del mismo
modo que el factor B ligado al C3 circulante es cortado, el
factor B ligado a C3b sobre las supercies es cortado por el
factor D para dar C3bBb. Este complejo es estabilizado por
la properdina y tanto C3Bb como C3bBbP pueden cortar
ms molculas C3, amplicando as el proceso. Otra fun-
cin del complejo C3dBbP es que puede ligar y activar el
C5 (vase adelante).
Las dos rutas se muestran en la gura 46-1.
El complejo de ataque de membrana
Los componentes C5, C6, C7, C8 y C9 del complemento
forman la ruta terminal. C5 puede activarse con las enzimas
convertasas de la ruta clsica o de la ruta alterna (C4b2a y
C3bBbP, respectivamente). El C5 activado se liga a C6 y a
Figura 46-1 La ruta clsica y la ruta alterna de la activacin del complemento. Los componentes con actividad de proteasa se muestran
en verde, las colectinas en azul y las analotoxinas en rojo.
Ruta clsica
Patgeno + anticuerpo
Carbohidrato manano en la
supercie bacteriana
Ruta clsica
Convertasa C4
Ruta clsica
Convertasa C5
Autoensamblaje
Complejo de ataque a membrana
C5b C6 C7 C8 C9n
Ruta alterna
Convertasa C5
Activador de supercie
Ruta alterna
ENSAYOS DE LOS NIVELES SRICOS DEL COMPLEMENTO 449
los componentes restantes; C7, C8 y C9, se ligan a su vez.
Seis molculas de C9 ligan a este complejo y forman un
poro en la membrana de una clula en la que est presente.
Esto puede conducir a la lisis de la clula y es una pro-
piedad que se emplea en los ensayos hemolticos descritos
ms adelante.
Productos biolgicamente activos de activacin
del complemento
Una de las funciones principales del sistema del comple-
mento es depositar C3b en la supercie de los microorga-
nismos y, como se describe antes, esto puede ocurrir por
la ruta clsica o por la ruta alterna. El C3b presente en la
supercie de los microorganismos aumenta su captacin de
fagocitos, como los neutrlos, va receptores para C3b, y
tambin estimula las clulas. La activacin de la ruta cl-
sica por los complejos inmunitarios de anticuerpo y ant-
geno aumenta la solubilidad de tales complejos y ayuda
a su eliminacin de la circulacin por los receptores del
complemento en los eritrocitos.
Segn se mencion antes, los complejos de C5b-C9
pueden causar la lisis de los microorganismos por la in-
sercin de los polmeros de C9 en la membrana celular.
La lisis de las clulas presentes puede ocurrir a menos que
sean protegidas por el receptor CR1 de C3, el factor ace-
lerador de la degradacin (DAF), la protena del cofactor
de la membrana (MCP) y el CD59, los cuales previenen la
polimerizacin de C9. La activacin de C4, de C2, de C3,
del factor B y de C5 crea fragmentos relativamente peque-
os que son liberados. Los dos ms importantes son las
analotoxinas C3a y C5a, que son vasoactivas y liberan
la histamina de los mastocitos. C5a es tambin un agente
quimiotctico poderoso que activa los neutrlos y mono-
citos.
Control de la activacin del complemento
La activacin espontnea del complemento necesita con-
trolarse para prevenir una respuesta inamatoria inne-
cesaria. La ruta clsica se regula por el inhibidor de las
protenas C1 del suero (C1-inh), C4bp y el factor I y por
la protena del cofactor de la membrana de las molculas
de la supercie celular (MCP), el factor acelerador de la
degradacin (DAF, CD55) y CR1. La ruta alterna se regula
por los factores H e I y la MCP, el DAF y el CR1. Todos
estos factores aceleran la degradacin de una o ms de las
protenas o de los complejos activados del complemento, y
por tanto la activacin del complemento ocurre slo si los
estmulos activadores pueden generar bastantes productos
activos para superar los mecanismos inhibidores.
Ensayos de los niveles sricos del complemento
Preparacin y almacenaje de la muestra
El almacenaje incorrecto de las muestras para el ensayo
del complemento produce niveles disminuidos, ya que al-
gunos componentes son extremadamente lbiles. Para los
ensayos de los componentes individuales en el suero, las
muestras de sangre deben llegar al laboratorio tan pronto
como sea posible despus de la venopuncin. Debe per-
mitir que la sangre se coagule a la temperatura ambiente
por 30 min, despus se coloca la muestra sobre hielo por
una hora para que la retraccin del cogulo ocurra antes de
separar el suero a una temperatura de 2 a 4C. Las muestras
se alcuotan y almacenan a 70C tan rpido como sea
viable. Para su uso, las muestras se descongelan a 37C,
despus se colocan de inmediato en el hielo: al congelar
y deshielar repetidamente disminuyen la actividad hemo-
ltica de los componentes. La sangre colectada en EDTA
(que previene la activacin adicional del complemento al
quelar el calcio y el magnesio y, por tanto, hace que las
muestras sean convenientes para los ensayos del producto
de activacin) se guarda en hielo el tiempo ms corto po-
sible antes de centrifugarse para producir el plasma escaso
de plaquetas que se almacena, en lo que se reere al suero.
Las muestras del cultivo tisular se benecian de la adicin
de los inhibidores de la proteinasa, como PMSF.
Ensayos inmunoqumicos
Estos ensayos utilizan anticuerpos especcos para los com-
ponentes individuales del complemento, estn disponibles en
formas comerciales y pueden utilizarse en los ensayos ne-
felomtricos, ELISA o de inmunodifusin. La eleccin del
anticuerpo es crtica, ya que los anticuerpos policlonales pue-
den reconocer los productos de desintegracin del compo-
nente bajo investigacin y el valor resultante que se obtiene
puede no reejar el nivel de la protena funcional presente.
El tipo de sistema del ensayo que se emplee depende
del nmero por realizar, del nivel de sensibilidad requerido,
del nivel del analito y de la calidad del anticuerpo disponible.
Por ejemplo, la nefelometra se utiliza en los laboratorios
clnicos rutinarios de inmunologa para medir C3, C4, C1-
inh y C1q en las muestras de pacientes donde los niveles
son de 50 g/ml o ms. Para los estudios del cultivo celular,
sin embargo, los niveles pueden ser tan bajos como 1 ng/ml
y el ELISA, aunque es ms laborioso y requiere ms tiem-
po, es ms prctico. Las tcnicas de inmunodifusin radial
y gel rocket, aunque consumen tiempo y no son especial-
mente sensibles, son relativamente simples y pueden em-
plearse para identicar los productos de degradacin, por
ejemplo, la inmunoelectroforesis rocket de doble difusin
para la deteccin de C3d, y para las formas anormales de
los componentes del complemento, por ejemplo, la inmu-
nodifusin Ouchterlony del suero humano normal (NHS) y
del suero deciente de C8 frente al anti-C8 pueden revelar
las lneas de identidad parcial que sugieren la deciencia
de la cadena C8. Los amortiguadores intermediarios em-
pleados, que se utilizan por lo general en estos tipos de
ensayo, son los ptimos para el anticuerpo de unin y solu-
cin salina amortiguada con fosfato (PBS).
Ensayos hemolticos del complemento
Ensayos CH5O
La lisis de los eritrocitos de la sangre por el complemento
ocurrir si el MAC est montado en la membrana celular y
se insertan los polmeros de C9. Los ensayos dependen de
la presencia de todos los componentes necesarios y de las
condiciones apropiadas para la activacin del complemen-
to. El ms simple de estos ensayos es el CH50 (g. 46-2),
un procedimiento cuantitativo que depende de una muestra
Figura 46-2 Trazo log-log de y/1 y frente al volumen del
suero diluido en un ensayo CH50. En el punto de 50% de hem-
lisis, y(1 y) 1 y el volumen del suero diluido resultante se
muestra en la lnea vertical. y proporcin de las clulas lisadas.
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
Un ensayo similar para la ruta alterna, el APH50, utiliza
los eritrocitos del conejo, que proporcionan una super-
cie para la unin del C3bBb. La adicin de EDTA, para la
quelacin de los iones de calcio pero no los de magnesio,
previene cualquier activacin concomitante de la ruta clsi-
ca mientras permite la activacin de la ruta clsica.
Estos ensayos necesitan controlarse con muestras cono-
cidas que contienen todos los componentes, por ejemplo,
el NHS fresco (control positivo), y por el amortiguador
solo (control negativo) para medir la lisis espontnea de los
eritrocitos. La cuanticacin del ensayo puede realizarse
comparando la cantidad de hemlisis (medida por la densi-
dad ptica del sobrenadante celular, que es proporcional a
la cantidad de hemoglobina liberada) con un NHS normal
conocido en un mtodo de un tubo, o diluyendo toda la
muestra de prueba para obtener un rango del porcentaje de
hemlisis. Usando la ecuacin de von Krogh, que describe
la curva que se obtiene trazando el porcentaje de lisis con-
tra la dilucin de la muestra, se calcula la dilucin de la
muestra requerida para obtener el 50% de hemlisis y, des-
pus de tomar en cuenta la dilucin inicial de la muestra,
este valor se traduce a unidades/ml de CH50. La unidad de
CH50 que se obtiene depende de la cantidad y la naturale-
za del anticuerpo utilizado para sensibilizar las clulas, la
concentracin y fragilidad del eritrocito, la fuerza inica,
la concentracin del catin divalente y el pH del amorti-
guador, el tiempo de reaccin y la temperatura.
Los ensayos CH50 y APH50 se utilizan para determi-
nar si un paciente es o no genticamente deciente en un
componente del complemento. Un valor cero en un ensayo
CH50, pero no en APH50, indica una falta del C1, C4 o de
C2, mientras que para un resultado normal de CH50 y un
APH50 de cero, una deciencia de properdina o el factor
D pueden estar presentes (la deciencia del factor B no se
ha descrito). La ausencia de lisis en ambos ensayos indi-
ca la carencia de C3, C5, C6, C7 o C8. Los niveles bajos
de lisis pueden ocurrir por la deciencia de C9. Los valo-
res bajos cerca de cero sugieren que el nivel de uno o ms
componentes del complemento est disminuido, debido a
la consuncin en un proceso de enfermedad, como el lupus
eritematoso sistmico, o pueden indicar un estado de de-
ciencia heterocigota (aunque los niveles del complemento
pueden ser variables en estos individuos, ya que muchos
componentes son protenas de fase aguda).
Ensayos hemolticos para los componentes individuales
usando sueros decientes del complemento
Los ensayos por la presencia y la actividad funcional de los
componentes individuales se pueden realizar usando el eri-
trocito sensibilizado y un suero deciente en el componente
que contiene todos los componentes clsicos y terminales
del complemento, y de los componentes que son funcional-
mente activos.
El ensayo se realiza en presencia de los iones calcio y
magnesio (requeridos para la activacin de la ruta clsica)
e iniciando la ruta con la presencia de la IgM sobre la su-
percie de los eritrocitos de la sangre de ovejas (EA).
Volumen srico (l).
elegido. Las diluciones seriales de una muestra de prueba
se agregan y la lisis del eritrocito sensibilizado ocurre slo
si el componente que se pretende vericar est presente y es
funcional. Otros componentes estn presentes en exceso,
as que la lisis es proporcional a la cantidad del compo-
nente de prueba. Los sueros decientes pueden obtenerse
en presentaciones comerciales y tambin prepararse en el
laboratorio, si los ensayos se realizan regularmente. Tales
ensayos son de sensibilidad ms baja que los descritos ms
adelante y no son convenientes para los componentes regu-
ladores (C1-inh, factores H e I, properdina).
Ensayos hemolticos para los componentes individuales
usando el eritrocito presensibilizado
Los eritrocitos pueden presensibilizarse con los primeros
componentes de la ruta hasta llegar al que est bajo prue-
ba. Agregando una muestra que contiene un componente de
investigacin, este componente pueden activarlo o ligarlo a
aquellos componentes ya presentes. La adicin de los com-
ponentes restantes da lugar a la lisis si el componente de
prueba est presente y es funcional. Si se asegura que el
resto de los componentes est en exceso, el grado de lisis
es proporcional a la cantidad del componente de prueba.
Los componentes funcionalmente puros pueden preparar-
se en el laboratorio, pero la mayor parte estn disponibles
en presentacin comercial. Los eritrocitos sensibilizados y
presensibilizados que se emplean con ms frecuencia son
EAC1, EAC4 y EAC14. Los EAC1 se preparan agregando
C1 (p. ej., a partir de suero del cerdo de Guinea precipitado
con 5 mM de CaCl) al eritrocito sensibilizado en un amor-
tiguador de fuerza inica baja que contenga calcio y mag-
nesio. La adicin de suero humano en presencia de EDTA
produce la unin de C4 y C2, y la incubacin subsiguiente
a 37C causa la degradacin de C1 y C2 desde las clulas,
dejando EAC4. Las clulas EAC14 se preparan agregando
ms C1, otra vez en presencia de calcio y magnesio.
Las clulas EAC4 se utilizan para ensayar la actividad de
C1 agregando diluciones de la muestra de prueba seguida
por C2 del conejillo de Indias. La hemlisis se logra agre-
gando los componentes restantes, en forma de suero de rata
que contiene EDTA (C
rat
-EDTA). La concentracin de las
molculas ecaces del componente bajo prueba se mide tra-
zando el valor Z [ln(1 % de lisis)] contra la dilucin del
componente bajo prueba (g. 46-3). El trazo de lnea recta
que se obtiene resulta de la Teora de un golpe, en que una
sola molcula ecaz del complemento (C1-C9) resulta en
la lisis celular. Una unidad de complemento se toma como
aquella que proporciona 63% de lisis en un ensayo para
aquel componente. Si un trazo de lnea recta no se obtiene,
entonces la concentracin de uno o ms componentes bajo
prueba es limitada.
C4 se ensaya usando EAC1 agregando diluciones de la
muestra de prueba, C2 del conejillo de Indias y C
rat
-EDTA
en lo que se reere a C1, mientras se mide la actividad C2
usando EAC14. En este caso, el T
mx
para las clulas (tiem-
po para la formacin mxima de C4b2a) debe conocerse.
El T
mx
vara de lote a lote del EAC14 porque depende de
la cantidad de C4b presente en las clulas. Para ensayar la
actividad de C3, es necesario formar EAC142. El complejo
C4b2a en estas clulas es ms inestable que la mayor parte,
por tanto, los EAC14
oxy
2 son preparados para proporcionar
la actividad hemoltica incrementada del C2 (g. 46-4).
EAC14 forma el punto de arranque de los ensayos fun-
ENSAYOS DE LOS NIVELES SRICOS DEL COMPLEMENTO 451
Figura 46-3 El nmero de molculas funcionales por clula (Z)
se traza contra la dilucin del suero en una titulacin hemoltica
tpica de un componente individual del complemento. La concen-
tracin del componente en este caso est dada por y/x 50 000.
Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.
Figura 46-4 Trazo del nmero de sitios hemolticos (Z) contra
el tiempo de incubacin a 30C en un ensayo de T
mx
. T
mx
est
indicado por la echa. Redibujada de Whaley (1985), con el per-
miso de Elsevier.
Dilucin del suero
Tiempo de incubacin (min)
1:16010
4
1:4010
4
1:20x10
4
1:1010
4
1:510
4
mx
cionales de los componentes de la ruta alterna. El C2 y
C3 son agregados a la forma EAC1423, con la eliminacin
subsiguiente de C1 y C2 con la incubacin en el amortigua-
dor EDTA. El EAC43b resultante forma una ruta alterna,
la C3 convertasa, si se agrega el factor B, el factor D y la
properdina. La hemlisis se logra agregando C
rat
-EDTA.
La actividad del factor B, del D o de la properdina se mide
omitiendo el componente puro respectivo y sustituyndolo
con las diluciones de la muestra de prueba aunque este m-
todo no es conveniente para ensayar el factor D srico, slo
las preparaciones puras. Los componentes terminales se
ensayan agregando C3 y los componentes terminales ele-
vados para llegar al que est bajo prueba para el EAC14
oxy

2. El EAC1-8, utilizado para medir la actividad de C9, sin
embargo, experimenta lisis espontnea, as que debe em-
plearse tan pronto como est preparado.
Otros ensayos de la funcin del complemento
La medicin de la actividad de la ruta clsica es posible con
equipos comerciales. Algunos de stos se basan en ELISA,
y el complemento srico es activado por los complejos in-
munitarios presentes en la celdilla. Midiendo la cantidad
de un neoantgeno del componente terminal, normalmente
C9 generado, se valora la actividad. Un sistema automti-
co emplea liposomas que contienen una enzima (G6PDH),
que se libera cuando el anticuerpo reacciona con el antge-
no en el liposoma, slo cuando la ruta clsica entera est
presente. La reaccin de la enzima con un sustrato en la
mezcla del reactivo produce un cambio del color propor-
cional a la actividad de la ruta clsica. Los autores no son
conscientes de cualquier mtodo automtico para APH50.
La MBL puede ensayarse funcionalmente cubriendo los
eritrocitos de ovejas con carbohidratos manano y realizan-
do el resto del ensayo en lo que respecta a un CH50. Se ha
descrito un ensayo funcional alternativo que mide la capa-
cidad de la lectina de unin a mananos (MBL) para activar
el C4. El manano es cubierto en una placa de ELISA y
se mide la cantidad de C4c generada del suero agregado,
una alta concentracin de sal en el amortiguador previene
la activacin de la ruta clsica.
Ensayos funcionales de las protenas de control
del complemento
La actividad del inhibidor C1 puede ensayarse con los
equipos comerciales que utilizan la capacidad del inhibi-
dor C1 para inhibir un C1s anlogo en una reaccin co-
lorimtrica. La actividad del inhibidor C1 puede tambin
medirse examinando la capacidad de la muestra de prueba
para inhibir un nivel dado de C1 exgeno adicionado al eri-
trocito sensibilizado. Si al suero se le examina entonces C1
primero tiene que ser eliminado, por ejemplo, precipitando
todo el C1 usando el amortiguador de fosfato. El inhibidor
C1 puede permitirse ligar a C1, o en la fase uida antes de
agregar a EAC4 con C2 o en EAC14, antes de la adicin
del C2. Para los ensayos hemolticos del componente inhi-
bidor, una reaccin solitaria que no contiene inhibidor se
corre en paralelo. La actividad inhibidora de la muestra de
prueba se expresa en unidades Z y se asume que la inhibi-
cin de la lisis sigue la misma teora de un golpe, como
la lisis. Se toma I como la proporcin de la lisis de C1 que
se inhibe y, por tanto, I 1 e
z
. Por lo tanto Z ln(1
I) o:
Z ln
y en la muestra de prueba
y en solitario
Cuando Z en el tubo solitario est entre 0.5 y 1.5, Z vara
de forma lineal con la dilucin del inhibidor C1. En cuanto
al clculo de Z, Z se calcula de la grca de la dilucin del
suero contra Z, tomando en cuenta la dilucin inicial.
Los niveles del factor H pueden ensayarse midiendo la
capacidad del suero para acelerar la degradacin de la C3
convertasa. EAC4b3bBbP son preparados agregando pro-
perdina, factor B y factor D a EAC4b3b; la cantidad de ac-
tividad hemoltica que permanece despus de degradarse la
C3 convertasa se compara con un tubo solitario. La actividad
del factor I puede ensayarse incubando la muestra de prueba
con el factor H agregado a EAC43 y adicionando los factores
B y D, y examinar para la actividad hemoltica residual.
Deteccin de los productos de activacin del complemento
Varias protenas del complemento srico son de fase agu-
da, por lo que durante la consuncin del complemento,
que puede ocurrir en algunos tipos de infeccin bacteria-
na o enfermedades del complejo inmunitario, los niveles
sricos pueden permanecer normales. El volumen incre-
mentado del complemento puede determinarse al medir
los productos de activacin del complemento, usando los
anticuerpos que distinguen los productos de activacin a
partir de la molcula nativa. Los equipos comerciales estn
disponibles pero los ensayos en el local para los productos
de activacin se establecen de forma fcil, con la condicin
de que los anticuerpos apropiados se utilicen. Las pruebas
ELISA para C3a, C4a y C5a se establecen, a condicin de
que los estndares puedan obtenerse, pero la utilidad cl-
nica de estos ensayos es limitada. De ms ayuda para los
clnicos son los ensayos para C1s-C1-inh, C3bBbP o C5b-
C9, incrementados, niveles que indican la activacin de la
ruta clsica, alterna o terminal, respectivamente.
Los ltimos ensayos utilizan un anticuerpo contra un
componente, por ejemplo, C1s, para ligar el complejo a
una placa de ELISA y a un anticuerpo contra otro compo-
nente del complejo, por ejemplo, C1-inh, para detectar el
complejo.
Deteccin de los receptores del complemento
Los anticuerpos para los receptores del complemento estn
disponibles en formas comerciales y se utilizan en la cito-
metra de ujo para detectar la presencia de los receptores
en suspensiones celulares. Algunos anticuerpos son tam-
bin adecuados para la inmunohistoqumica de los cortes
de tejido o para la preparacin del centrifugado de clulas
si se requiere la morfologa celular.
Whaley K (ed.). Methods in Complement for Clinical Immunol-
ogists. 1985: Churchill Livingstone, Edinburgh. This text book
provides a comprehensive, detailed account of the majority
of complement assays, including the preparation of puried
components.
Dodds A, Sims R (eds). Complement. A Practical Approach.
1997: Oxford University Press, Oxford. This is an up to date
laboratory manual for all aspects of laboratory complement
work.
Phimster GM, Whaley K. Measurement of complement. In Clini-
cal Immunology. A Practical Approach, Gooi HG, Chapel H
(eds) (1990). Oxford University Press, Oxford. This chapter
provides guidance as to clinical indications for complement
assays as well as methodologies.
Introduccin
La inmunologa celular es el estudio de las clulas del siste-
ma inmunitario. Estas pruebas normalmente se realizan en el
contexto de la investigacin de posibles defectos del sistema
inmunitario, por ejemplo, en pacientes con infecciones recu-
rrentes o en infantes con insuciencia en el crecimiento, en
quienes pueden sospecharse inmunodeciencias innatas raras.
Por conveniencia, los leucocitos de la sangre perifrica
se evalan con regularidad, pero tambin pueden usarse c-
lulas de otras fuentes, como ganglios linfticos y biopsias
tisulares (por lo general en el marco de la investigacin).
Linfocitos y neutrlos se estudian con ms frecuencia,
pero otros tipos de clulas, como los baslos, tambin sue-
len analizarse en algunas circunstancias.
Para evaluar las clulas del sistema inmunitario, puede
requerirse la informacin con respecto a las cantidades de
clulas presentes, su fenotipo y sus funciones. Una amplia
gama de herramientas est disponible para estos anlisis, y
muchas tcnicas estn surgiendo en el campo clnico ruti-
nario de las aplicaciones de la investigacin. La inmuno-
loga celular es, por tanto, una ciencia en plena evolucin.
Inversamente, varias pruebas en uso permanecen en gran
parte sin cambios por dcadas. stas han demostrado ser
robustas y conables en la aplicacin clnica, y las tcnicas
ms nuevas son lentas para reemplazarlas.
Pruebas cuantitativas y cualitativas
En el nivel ms simple, la cantidad real de linfocitos y neu-
trlos circulantes proporciona informacin til sobre el
sistema inmunitario. stos se encuentran fcilmente dispo-
nibles a partir de la cuenta diferencial automatizada de las
clulas blancas. La poblacin linfoctica se divide en clu-
las T, B y clulas asesinas naturales (NK), las cuales a su
vez se dividen en subgrupos. Se han descrito alteraciones
y deciencias que afectaban prcticamente a todas estas
poblaciones, y el anlisis del subconjunto y del fenotipo de
linfocito es una herramienta valiosa del diagnstico.
Los subgrupos de linfocitos se miden marcndolos con
anticuerpos monoclonales. Se ha desarrollado una amplia
variedad de anticuerpos que identica una gama creciente de
subpoblaciones de linfocitos. Algunos de los anticuerpos
ms comunes que se emplean para disecar a esas subpobla-
ciones se listan en el cuadro 47-1.
Antes, los subgrupos de linfocitos se enumeraban ma-
nualmente contando las clulas marcadas con anticuer-
pos uorescentes bajo el microscopio. Ahora el citmetro de
ujo proporciona una herramienta ms precisa para exami-
nar una gran cantidad de marcadores linfocticos con gran
detalle.
Citometra de ujo
En un citmetro de ujo, las clulas individuales se condu-
cen en una corriente na de paso uido rpido a travs de
un rayo lser. Los fotomultiplicadores detectan la disper-
sin de la luz lser por la clula y miden la luz emitida por
cualquier marcador uorescente que se haya agregado a la
clula (g. 47-1). A partir de esta informacin, el tamao y
la granularidad de la clula, as como el nivel de expresin
de la supercie celular o de los antgenos citoplsmicos
que se han marcado con anticuerpos uorescentes, pueden
medirse. Millares de clulas por minuto se analizan de esta
47
Inmunologa celular
Aarnoud Huissoon
456 CAP. 47 INMUNOLOGA CELULAR
manera, para que una cantidad grande de datos con res-
pecto a las poblaciones celulares pueda recopilarse muy
rpido.
Linfocitos, monocitos y granulocitos se distinguen por
sus propiedades de la dispersin de la luz, solos o en com-
binacin con la expresin de CD45 (g. 47-2a). Los anti-
cuerpos uorescentes pueden entonces diferenciarse entre
las diversas poblaciones de linfocitos (g. 47-2b).
Es necesario conocer no slo las proporciones de los
subgrupos de linfocitos presentes, sino tambin las canti-
dades absolutas de cada subgrupo en la muestra original.
Adecuados rangos de referencia, relativos a la edad, estn
disponibles para los subgrupos principales. Este resultado
cuantitativo puede derivarse a partir de mtodos de plata-
forma, ya sea dual o bien simple. En el primer mtodo la
cuenta absoluta del linfocito se obtiene de una cuenta dife-
rencial del leucocito por citometra de ujo y de la cuenta
total del leucocito a partir de un analizador estndar de he-
matologa. Un mtodo de plataforma simple puede ser ms
exacto, en especial cuando hay una proporcin muy baja
de la poblacin de inters (p. ej., clulas T CD4
+
en el sn-
drome de inmunodeciencia adquirida, SIDA). La cuan-
ticacin por plataforma simple se logra agregando una
cantidad conocida de perlas a un volumen determinado de
sangre al principio de la prueba. Las perlas y los linfocitos
marcados con anticuerpo se analizan simultneamente con
el citmetro de ujo, y las cuentas absolutas del subgrupo
de linfocitos pueden calcularse. Un acercamiento alterna-
tivo se obtiene contando los linfocitos en un volumen jo
de sangre pasado a travs del analizador, pero ste es de-
pendiente de la conabilidad de los udicos del citmetro
de ujo. Los mtodos de tincin y lisis del anticuerpo en
sangre entera (en lugar de la tincin de los leucocitos se-
parados) deben utilizarse para los anlisis cuantitativos del
linfocito.
Aplicaciones del anlisis del subgrupo de linfocitos
Monitoreo de la infeccin por VIH/SIDA
sta es la indicacin ms comn para el requerimiento de
los subgrupos de linfocitos. Los resultados cuantitativos
exactos son esenciales. Tpicamente, las cantidades de la
clula auxiliar T CD4
+
son bajas, y el cociente de clulas
T CD4
+
a las CD8
+
se invierte (est sobre 1.5:1 en adultos
sanos). Sin embargo, no pueden utilizarse para diagnosti-
car la infeccin por VIH, puesto que los subgrupos de la
Figura 47-1 Presentacin simplicada de un citmetro de u-
jo. Las clulas pasan individualmente a travs de un rayo lser.
Para cada clula, la luz dispersada se mide con sensores de luz
delanteros y laterales. Los anticuerpos uorescentes en la clula
son excitados por la luz lser y emiten luz a longitudes de onda
diferentes, la cual se mide con los fotomultiplicadores (PMT). En
citmetros de ujo ms grandes, dos lseres y varios fotomulti-
plicadores, cada uno midiendo la luz emitida de una longitud de
onda diferente, permiten examinar numerosas molculas celulares
diferentes u otras propiedades simultneamente.
Cuadro 47-1 Marcadores para el subgrupo de linfocito ms usados
Subgrupos principales Otros subgrupos Otros marcadores
Clulas T CD3
Clulas T auxiliares Clula T virgen Antgenos de activacin

CD4
CD45RA
HLA-DR, CD69,CD25
Clulas T citotxicas Clulas T efectoras/ Molculas
CD8
memoria CD45RO
coestimuladoras
CD28, CD134 (OX40)
Linfocitos CD45
+
Clulas NK
CD16/CD56
(CD3)
Clulas B Clula B virgen Clulas B-1 Subgrupos y linfoma de la
CD19
o IgD
/CD27
CD5
clula B
CD2
Clulas B de memoria Clulas B-2 IgM, IgG, /

IgD
/CD27
CD5
cadenas ligeras Ig, CD23

Dispersin frontal
de luz (FS)
Dispersin
lateral de luz (SS)
PMT 1
PMT 2
Fuente de
luz lser
Clulas en fluido
envolvente
PRUEBAS CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS 457
clula T son normales en un individuo infectado por VIH,
y existen tambin muchas otras causas de perturbaciones
de los subgrupos de linfocitos, por ejemplo, estrs, trata-
miento con esteroides, infeccin intercurrente o variacin
diurna normal. Una vez que la infeccin por VIH se diag-
nostique con pruebas serolgicas o de la biologa molecu-
lar, las cuentas CD4 (conjuntamente con las mediciones de
la carga vrica medidas con PCR) son esenciales en el mo-
nitoreo de la enfermedad. Se utilizan para indicar el nivel
de supresin inmunitario, y es cuando el tratamiento con
agentes antirretrovricos y antimicrobianos prolcticos
debe iniciarse. El desempeo del monitoreo de la clula T
CD4
+
para el VIH en el Reino Unido est sujeto al control
de calidad externo por NEQAS.
Investigacin de inmunodeciencia
Muchas enfermedades primarias de inmunodeciencia es-
tn asociadas con anormalidades de los subgrupos de linfo-
citos. Algunos ejemplos se listan en el cuadro 47-2. Mien-
tras una cuenta total baja del linfocito es con frecuencia la
primera pista para el diagnstico de inmunodeciencia gra-
ve, la deteccin del patrn de la deciencia puede ayudar
Figura 47-2 a) Identicacin de poblaciones de leucocitos a travs de la dispersin de la luz y de la expresin de CD45. Cada punto
representa los datos recolectados de una clula. Los linfocitos tienen dispersin frontal moderada (un ndice del tamao), la disper-
sin lateral baja (SS, un ndice de la complejidad o granularidad celular) y expresin CD45 alta. b) Expresin de CD3 y CD4 sobre la
poblacin de linfocitos. Las clulas se han marcado con anticuerpos CD3 conjugados con uorescena, detectados sobre PMT1, y anti-
cuerpos CD4 conjugados con coeritrina, detectados sobre PMT2. Despus de seleccionar la poblacin del linfocito, la expresin de CD3
y CD4 puede verse sola o como histogramas, o bien combinada en un grco de punto. El grco de punto aporta informacin adicional,
demostrando que las clulas CD4
son un subgrupo de clulas CD3
.
DISPERSIN FRONTAL
Granulocitos
Monocitos
Linfocitos
N
m

d
e

c
l
u
l
a
s
al diagnstico, por ejemplo, la ausencia de clulas T y B
con clulas NK preservadas puede sugerir una deciencia
de RAG-1 o de RAG-2 (genes que estn implicados en la
generacin de los receptores del antgeno de las clulas T y
B). Normalmente se requieren estudios funcionales adems
del anlisis del subgrupo de linfocito en la investigacin de
inmunodeciencias congnitas graves (vase adelante).
En algunas enfermedades de inmunodeciencia, los n-
meros absolutos de poblaciones linfocticas son normales,
pero anormalidades sutiles pueden detectarse con anlisis
ms detallados, por ejemplo, muchos pacientes con de-
ciencia primaria de anticuerpos (deciencia inmunitaria
variable comn) tienen nmeros completos normales de
clulas T, B y NK. Sin embargo, sus clulas B muestran
proporciones anormales de poblaciones vrgenes y de me-
moria, sugiriendo un defecto en la maduracin de la clula
B perifrica u homeostasis como la causa para que su falta
produzca un repertorio normal de anticuerpos. Las clulas
T de pacientes con sndrome hiper-IgM no pueden expresar
CD154 (antes llamado ligando CD40). CD154 no se ex-
presa normalmente en la inactividad de clulas T de sangre
perifrica, y es necesario estimular primero las clulas T
in vitro y despus medir la expresin de la molcula por
citometra de ujo.
El defecto en la adhesin leucocitaria (LAD) es causado
por la falla de los neutrlos (y de otros leucocitos) para
expresar integrinas 2 (heterodmeros CD11-CD18). En
consecuencia, los neutrlos del paciente no emigran de la
corriente sangunea al sitio de infeccin, y las infecciones
graves recurrentes (con poco o nada de pus) se producen.
La curacin de la herida tambin se deteriora. Esta condi-
cin puede diagnosticarse simplemente midiendo la expre-
sin neutroflica de CD18 y CD11a, b y c por citometra
de ujo.
Diagnstico de malignidades linfoides
La cuanticacin y el anlisis del fenotipo de los linfocitos
de la sangre perifrica (o mdula) son esenciales en el diag-
nstico de las enfermedades linfoproliferativas de las clulas
B y T. La clonalidad de la clula B en estas condiciones se
detecta con frecuencia por la expresin anormal de la cadena
ligera de la inmunoglobulina sobre la supercie de la clu-
la B. Las clulas T no expresan marcadores clnicos sobre la
supercie celular, de modo que las malignidades se detecten
por la expresin anormal (prdida o expresin aberrante) de
otros marcadores superciales (p. ej., CD7, CD5, CD25).
Mientras que muchas de estas condiciones se caracterizan
por aumentos marcados en las cantidades linfocticas de la
sangre perifrica, algunas (en particular neoplasmas de la c-
lula T) pueden ser clnicamente sutiles en su manifestacin
y mantener una cuenta normal de linfocitos. En todos los
casos, el inmunofenotipo del linfocito tiene que interpretarse
dentro del contexto de otros hallazgos clnicos del paciente
y del fenotipo de las clulas por microscopia.
Otras condiciones inamatorias e infecciones
Anormalidades de subgrupos y fenotipos del linfocito en
sangre perifrica se han descrito en una gama amplia de
enfermedades infecciosas e inamatorias. Sin embargo, es-
tas anormalidades es raro que tengan un diagnstico til, y
nunca especco.
Cuadro 47-2 Ejemplos de algunos sndromes primarios de inmunodeciencia con hallazgos caractersticos del laboratorio
Cantidades de Anlisis de subgrupo
Diagnstico Infecciones Inmunoglobulinas linfocitos de linfocito tpico Estudios funcionales
Agammaglo- Bacterianas Bajas/ ausentes Normales Clulas B ausentes Proliferacin normal
bulinemia unida para mitgenos
a X (de Bruton)
SCID unida a X Vrica, mictica Ausentes Bajas Clulas T y NK Proliferacin ausente
y bacteriana ausentes para mitgenos
Deciencia HLA Vrica, mictica Normales/bajas Normales Clulas CD4
T Proliferacin normal
clase II y bacteriana reducidas para mitgenos,
Expresin HLA-DR pero respuestas
ausente sobre antgeno-especcas
clulas B reducidas
Sndrome hiper- Bacteriana / IgM incrementada/ Normales CD154 ausente Proliferacin normal
IgM unido a X protozoaria normal; IgG, IgA sobre clulas T para mitgenos pero
baja/ausente activadas respuestas antgeno-
especca reducida
Linfocitos a partir de sitios salvo de sangre
y de mdula sea
De cuando en cuando es til analizar linfocitos de otros
sitios, como del lquido cefalorraqudeo y del lquido de
lavado broncoalveolar. En el ltimo caso, las poblaciones
linfocticas predominantes pueden ayudar a distinguir di-
versas enfermedades intersticiales del pulmn. En el pri-
mero, el propsito principal consiste en excluir el linfoma
que involucra al sistema nervioso central.
Estudios funcionales
Linfocitos T
En el curso de una inmunorrespuesta, las clulas T norma-
les exhiben varias funciones que pueden evaluarse in vitro.
stas incluyen la proliferacin, la sobrerregulacin de an-
tgenos de la supercie celular, la produccin de citocina y
la apoptosis.
Proliferacin
La medicin de la proliferacin del linfocito T es un mto-
do bien establecido que evala su competencia inmunitaria.
Antes, se usaron los cambios en la apariencia de las clulas
en la microscopia para evaluar la activacin y respuesta de
la proliferacin a varios estmulos, de ah el trmino trans-
formacin linfoctica que se aplica con frecuencia a esta
prueba. Durante varias dcadas este proceso se ha cuan-
ticado con ms exactitud midiendo la incorporacin de
la timidina
3
H radiomarcada en el DNA de clulas proli-
ferantes. La timidina titulada se agrega al cultivo celular
durante las ltimas 16 h de un cultivo de 2 a 7 das, y las
clulas, entonces, se recolectan en un ltro del papel. La
cantidad de radiactividad incorporada, cuando se detecta
mediante conteo por centelleo, es proporcional a la repli-
cacin del DNA que ocurre en las clulas proliferantes (g.
47-3a). Ambos, la radiactividad incorporada absoluta (en
desintegraciones o cuentas por minuto, despus de la co-
rreccin de las cuentas originales) y el ndice de estimula-
cin (cuentas de clulas estimuladas divididas entre cuentas
de clulas sin estimulacin), deben reportarse.
Tambin se han desarrollado mtodos alternativos que
miden la proliferacin del linfocito, aunque ninguno de s-
tos ha desplazado hasta ahora la incorporacin de timidina
como la tcnica estndar en los laboratorios clnicos. stos
incluyen la deteccin por ujo citomtrico de la expresin
del antgeno de activacin (p. ej., CD25, CD69, Ki67), la
incorporacin de bromodeoxiuridina, o la dilucin del co-
lorante intracelular, carboxiuorescena diacetato succini-
ESTUDIOS FUNCIONALES 459
Figura 47-3 a) Proliferacin linfoctica en respuesta a los mi-
tgenos PHA 250 g/ml (), PWM 100 g/ml (), y OKT3
1 g/ml (). La incorporacin de la timidina 3H se indica en las
desintegraciones/minuto. Reproducida de Huissoon et al. (2002),
con el permiso de Blackwell Publishing Ltd. b) Histograma que
representa el principio de la dilucin de CFSE para medir la pro-
liferacin celular. Las clulas se cargan con CFSE al inicio del
procedimiento. ste es un colorante citoplsmico que no interere
con la funcin celular. Las clulas se incuban con el mitgeno o
el antgeno por un nmero de das y la intensidad CFSE se ana-
liza con citometra de ujo. En la representacin anterior, el pico
derecho describe las clulas que no han experimentado divisin
celular, y por tanto contiene la cantidad inicial completa de CFSE.
Con cada divisin celular la intensidad del colorante se reparte en
dos, de tal forma que cada ciclo de la divisin puede identicarse
como un nuevo pico a la izquierda de las clulas no proliferati-
vas. El bimarcaje de las clulas con los anticuerpos especcos
del linaje puede identicar qu tipos celulares ya respondieron al
estmulo y cules no.
Dilucin del mitgeno
100
1 000
10 000
100 000
I
n
c
o
r
p
o
r
a
c
i
n

d
e

t
i
m
i
d
i
n
a
Blanco 1:10 1:20 1:40 1:80
(a )
Intensidad de CFSE
N
m
e
r
o

d
e

c
l
u
l
a
s
(b)
midil ster (CFSE), por clulas T activadas y proliferantes
(g. 47-3b). Estos mtodos tienen la ventaja de no requerir
el uso y la medicin de radioistopos.
Las clulas T pueden estimularse para que proliferen en
respuesta a una variedad de estmulos, y stos normalmente
se utilizan en una gama de concentraciones para mostrar una
dosis-respuesta (g. 47-3a). La induccin del ujo de calcio
por ionomicina y un ionforo del calcio estimula muchos
tipos de clula, y esta activacin es totalmente independiente
de la clula normal que seala trayectorias. La tohemaglu-
tinina, una lectina de la planta identicada primero por su
capacidad para aglutinar eritrocitos, y la concavalina A, esti-
mula todas las clulas T a travs de varios receptores super-
ciales. Infantes con inmunodeciencia combinada grave
heredada (SCID) fallan en producir una respuesta para estos
mitgenos. El mitgeno de la tolaca (pokeweed) estimula
ambas clulas T y B. Un acercamiento ms siolgico se
consigue imitando la ruta normal de la estimulacin de la
clula T a travs del receptor de la clula T. Esto puede lo-
grarse por el entrecruzamiento del receptor con los anticuer-
pos anti-CD3 (que activa todas las clulas T) o aadiendo
el antgeno al cultivo. Los antgenos son tomados por los
monocitos sanguneos y los pptidos que estimulan la clula
T que se presentan a las clulas T en el contexto de las mo-
lculas MHC clase II. Tal proliferacin antgeno-especca
activa slo una proporcin pequea de clulas T de la sangre
perifrica total (alrededor de 1 en 10
4
), y de acuerdo con la
estimulacin del mitgeno. Extraordinariamente, los pacien-
tes se detectan con la funcin de la clula T normal a grosso
modo pero con defectos sutiles en una comprobacin ms
detallada, por ejemplo, en candidiasis mucocutnea crnica,
las clulas T del paciente responden bien a todos los estmu-
los mitognicos y antignicos, excepto Candida. Este agu-
jero notable en el repertorio inmunitario es inexplicable.
Produccin de citocina
La produccin de citocina en respuesta a estmulos mitog-
nicos y antignicos tambin puede medirse. Debido a que
la produccin de citocina es una funcin importante de las
clulas T, la deteccin de la produccin defectuosa de la ci-
tocina por ciertos estmulos suele tener importancia clnica.
Las enfermedades causadas por la produccin defectuosa
de citocina estn ahora comenzando a ser descritas (p. ej.,
deciencia de IL-12). La produccin de citocina por la c-
lula T se mide en el sobrenadante del cultivo por ELISA,
por la tcnica de Elispot o por deteccin directa de citocinas
intracelulares en clulas T individuales con la tincin del
anticuerpo uorescente. En el ensayo de Elispot, las clulas
T estimuladas se colocan en pozos para cultivo de plstico
de base plana que se han cubierto con anticuerpos contra
una citocina especca (p. ej., interfern-). Cualquier cito-
cina secretada por las clulas T est ligada por el anticuerpo
en el pozo. Despus de un periodo de incubacin, las clu-
las se lavan y la citocina ligada se detecta por un segundo
anticuerpo contra esa citocina. sta es visualizada por una
reaccin enzima-sustrato cromognica, y cada mancha en
el pozo representa una clula T secretora de citocina. La
deteccin intracelular de citocinas por citometra de ujo
es menos sensible que el mtodo Elispot, pero permite la
caracterizacin adicional de clulas productoras individua-
les usando marcadores superciales. Las clulas T son es-
timuladas por el antgeno o el mitgeno, y hacia el nal
de la incubacin, brefeldina A o monensina se agrega para
bloquear el transporte de citocina desde el retculo endo-
plsmico. Esto produce la acumulacin de citocina intrace-
lular suciente para ser detectada por marcaje directo del
anticuerpo. Las clulas entonces se marcan con anticuerpos
uorescentes contra antgenos de supercie apropiados, por
ejemplo, CD3 y CD69, y la membrana celular se ja e im-
permeabiliza. Esto permite que la citocina intracelular sea
marcada con el anticuerpo especco (g. 47-4).
Figura 47-4 Expresin del interfern gamma (IFN-) en clulas
T estimuladas con enterotoxina estaloccica B. CD69 (sobre el
eje vertical) identica clulas T activadas, y cerca de 10% de stas
se observa que expresan IFN-. Reproducida de Huissoon et al.
(2002), con el permiso de Blackwell Publishing Ltd.
Apoptosis
La apoptosis (muerte celular programada) es una funcin im-
portante de las clulas T, en la ontogenia del linfocito y como
parte de la involucin de una inmunorrespuesta normal. Se
ha descrito el sndrome linfoproliferativo autoinmunitario
(ALPS) donde la capacidad de los linfocitos de experimen-
tar apoptosis est daada. Con cada inmunorrespuesta la
proliferacin de linfocitos no es equilibrada por una muerte
correspondiente de linfocitos cuando el estmulo contagioso
desaparece. Tales pacientes tienen inmunoglobulinas sri-
IFN-FITC
C
D
6
9

P
E
cas incrementadas, enfermedades autoinmunitarias con au-
toanticuerpos demostrables, ganglios linfticos agrandados
y una cuenta alta de linfocito de sangre perifrica con una
acumulacin anormal de las clulas T CD4
/CD8
. Exis-
ten varias causas para este cuadro clnico, todas relacionadas
con defectos en la supercie celular o con mediadores in-
tracelulares indicadores de apoptosis. El tipo ms comn de
ALPS es causado por mutaciones en la protena Fas (CD95).
Para detectar defectos en apoptosis mediada por Fas, las
clulas T del paciente primero se estimulan in vitro para
hacerlas susceptibles a la apoptosis mediada por Fas. Un
anticuerpo contra la molcula Fas se agrega al cultivo. En
individuos normales una proporcin alta de clulas T sufre
apoptosis en respuesta a la unin de Fas en este ensayo. En
pacientes con ALPS esto est marcadamente daado. La
apoptosis as inducida puede medirse por varias tcnicas,
pero la ms conveniente es la citometra de ujo. Las carac-
tersticas de las clulas apoptticas, que pueden ser medidas,
incluyen la condensacin nuclear (detectada por tincin con
yoduro de propidio), la unin de la anexina V a la fosfaditil
serina externalizada, fragmentacin nucleosmica del DNA
(detectada por marcacin uorescente del extremo del nu-
cletido terminal), o la activacin de la caspasa usando Phi-
Phi Lux como sustrato uorescente de la caspasa.
Pruebas in vivo
Las pruebas in vivo de la funcin clular T tambin son
posibles. La hipersensibilidad retardada (tipo IV de Gell y
Coombs) para recordar los antgenos es un buen indicador
de la competencia inmunitaria de la clula T. Estas pruebas
son baratas y rpidas, pero inconvenientes para usarse en
nios pequeos. Una cantidad pequea del antgeno se in-
yecta en la dermis, y la reaccin de enrojecimiento y de hin-
chazn despus de 2 a 5 das indica una inmunorrespuesta
positiva a ese antgeno. Esta respuesta es mediada principal-
mente por las clulas T y por macrfagos. Se suprime en la
desnutricin, infeccin por VIH y sarcoidosis, y por cortico-
esteroides u otra terapia inmunosupresiva. Sin embargo, se
realiza rutinariamente slo mediante comprobacin por con-
tacto e inmunidad para la tuberculosis (prueba de Heaf o de
Mantoux). La interpretacin de una prueba negativa es difcil
si la exposicin anterior o estado de la vacunacin BCG no se
conoce. Otros antgenos ubicuos, como de paperas, Candida
y toxoide de ttanos, tambin pueden obtener tales respues-
tas, pero no se emplean en la prctica clnica rutinaria.
Clulas asesinas naturales
La citotoxicidad es una funcin de las clulas T CD8
+
y
de las clulas NK. La citotoxicidad de la clula T CD8
+

ESTUDIOS FUNCIONALES 461
es antgeno especca y no se mide en la prctica clnica
rutinaria. La citotoxicidad de la clula NK puede determi-
narse midiendo la lisis de la lnea celular K562. Las clulas
K562 carecen de expresin HLA clase I, de tal forma que
son un blanco natural para las clulas NK. Las clulas se
cargan con
51
cromo intracelular radiomarcado y se coincu-
ban con los linfocitos del paciente (que contienen clulas
NK efectoras). La lisis citotxica de las clulas blanco es
identicada por la liberacin del cromo en el medio de cul-
tivo. Es tambin posible evaluar la muerte de las clulas
K562 por citometra de ujo. Las clulas blanco tienen que
ser marcadas con un colorante lipoflico uorescente antes
de la incubacin con leucocitos del paciente, de modo que
puedan distinguirse de los linfocitos del paciente. La muer-
te citotxica es identicada por su permeabilidad al yoduro
de propidio, que es excluido por las clulas viables. Con
cualquier mtodo, la muerte debe determinarse sobre un
rango de proporciones blanco: clula efectora. Los defec-
tos de la muerte de NK se observan en inmunodeciencias
raras asociadas con albinismo parcial (p. ej., sndromes de
Chdiak-Higashi y de Griscelli) y en sndromes hemofago-
cticos familiares.
Linfocitos B
La funcin de la clula B es determinada con ms facilidad
midiendo las inmunoglobulinas y anticuerpos sricos del
paciente contra agentes infecciosos especcos o vacunas,
o ambas. Si se encuentran niveles bajos del anticuerpo, la
respuesta a la vacunacin puede aprobarse, lo cual es un
indicador global excelente de la funcin de la clula B. La
proliferacin de la clula B (y T) se estimula con el mit-
geno de tolaca pokeweed, pero esto no da informacin
sobre la produccin de inmunoglobulinas. Esto puede ser
probado con un ensayo de la placa inversa, donde las clu-
las B estimulantes se cubren con agarosa que contiene eri-
trocitos que se unen con la inmunoglobulina. Se adiciona el
complemento y las inmunoglobulinas unidas a eritrocitos
jan el complemento e inducen hemlisis. As, cada clula
productora de inmunoglobulinas puede identicarse por la
placa circundante de hemlisis. Este ensayo consume tiem-
po y ahora es raro que se realice, puesto que aporta poca
informacin adicional que no se obtiene a partir de pruebas
con anticuerpos sricos.
Neutrlos
Los neutrlos son clulas de breve duracin que engullen
y destruyen activamente organismos. El defecto ms co-
mn del neutrlo es la reducida cantidad de estas clulas.
Esto puede ser congnito (p. ej., sndrome de Swachmann
o el de Kostmann), pero con frecuencia se adquiere des-
pus de la insuciencia de la mdula (p. ej., causada por
las drogas o neoplasmas). Los defectos funcionales de los
neutrlos son relativamente raros, pero pueden investigar-
se rpido in vitro.
Para eliminar un organismo invasor, los neutrlos deben
emigrar primero desde la circulacin al tejido. Esto implica
la capacidad de responder a los estmulos quimiotcticos
y de adherirse al endotelio vascular. Pruebas de adhesin
neutroflica y de migracin quimiotctica estn disponi-
bles. La adhesin a materiales como lana de vidrio, placas
de cultivo de plstico y clulas endoteliales cultivadas es
posible medirlas. Sin embargo, los defectos detectados por
tales pruebas se deben a sndromes por defecto en la ad-
hesin leucocitaria y son diagnosticados con ms facilidad
midiendo la expresin de la integrina leucoctica por cito-
metra de ujo (vase antes). La quimiotaxis de neutrlos
se mide por la observacin microscpica del movimiento
del neutrlo hacia estimuladores como casena y el ppti-
do F-met-leu-phe. Esto se realiza empleando una cmara de
Boyden, donde los neutrlos son separados del estmulo
quimiotctico por un ltro microporo, y el frente principal
de los neutrlos que migran a travs del ltro se mide.
Alternativamente, una suspensin del neutrlo y los esti-
muladores quimiotcticos se colocan en pozos adyacentes
cortados en gel de agarosa, y el movimiento de neutr-
los en la agarosa hacia el estimulador tambin se mide. Los
desrdenes de la migracin del neutrlo se han descrito
en estados de deciencia inmunitaria primaria, incluyendo
el sndrome hiper-IgE y el sndrome de Chdiak-Higashi,
as como en algunas otras enfermedades. Sin embargo, las
anormalidades no son diagnsticas o consistentes.
Despus de emigrar al sitio de infeccin, los neutrlos
eliminan sus organismos blanco por fagocitosis y destruc-
cin intracelular. Ambas funciones pueden probarse usando
Candida como el organismo blanco. Las esporas cultivadas
de Candida se incuban con neutrlos aislados y el suero
donador normal (el cual opsoniza a Candida). Se agrega al
cultivo uridina marcada, y sta se incorpora slo por Can-
dida extracelular viable. Los cultivos neutrlo/Candida se
recolectan de los ltros y la uridina
3
H incorporada se mide
con un contador beta. Cuentas altas (comparadas con los
neutrlos del control normal) indican fagocitosis neutro-
flica daada. Si se asume que la fagocitosis es normal, la
destruccin intracelular de Candida puede medirse lisando
los neutrlos y evaluando la viabilidad de Candida por in-
corporacin de
3
H-uridina o por la exclusin del azul de
metileno. Staphylococcus aureus es un blanco alternativo
para los ensayos de la destruccin neutroflica. En este caso,
la destruccin se mide por chapado del sobrenadante de
neutrlos lisados en el medio de crecimiento y contando
las colonias bacterianas producidas. Un ensayo por ujo ci-
tomtrico que mide la fagocitosis de Escherichia coli mar-
cada con uorescena opsonizada tambin se ha descrito.
En gran medida, la causa ms comn del defecto en
la destruccin intracelular neutroflica es la enfermedad
granulomatosa crnica. A pesar de su nombre algo intil,
es un desorden de inmunodeciencia primaria causado por
la deciencia de una de las enzimas de la cadena NADPH
oxidasa, responsable de la generacin de superxidos y
perxidos microbicidas. Estos productos de la explosin
respiratoria se liberan dentro del fagolisosoma neutrof-
lico y destruyen organismos fagocitados. La prueba cl-
sica para la detencin de la integridad de esta funcin es
la prueba de reduccin del nitroazul de tetrazolio (NBT).
El NBT es un colorante amarillo soluble que se adiciona a
la sangre entera. Los neutrlos se estimulan con acetato
forbol miristato (PMA), y la reduccin resultante del NBT
por un producto azul insoluble puede observarse micros-
cpicamente; los neutrlos normales contienen grnulos
azules. La incapacidad de los neutrlos para reducir el
NBT (por tanto, aparecen amarillos) indica un diagnstico
de la enfermedad granulomatosa crnica. Existen otras tc-
nicas para medir la explosin respiratoria neutroflica. La
emisin de luz por sustratos quimioluminognicos, como
luminol y lucigenina, activados por la explosin respira-
toria neutroflica, puede medirse con un luminmetro. Un
mtodo de ujo citomtrico simple basado en la oxidacin
de la dihidrorrodamina est ganando amplia aceptacin,
pues es muy elevada su sensibilidad y detecta con facilidad
portadores de genes defectuosos (g. 47-5).
Baslos
Los baslos ligan anticuerpos IgE va sus receptores FcRI.
El entrecruzamiento de este IgE ligado por alergenos produ-
ce la activacin del baslo, con la induccin de la expresin
de CD63 y la liberacin de la histamina y de otros productos.
Esto forma la base de novedosos medios de diagnstico de
la alergia. Para muchos alergenos, la prueba de piel punzada
y la determinacin de IgE alergnico especco en suero son
apoyos tiles para el diagnstico de la alergia. Sin embargo,
la comprobacin por puncin de la piel y la determinacin
de IgE alergnico especco en suero son tiles para el diag-
nstico de la alergia. Sin embargo, las pruebas en piel no
siempre son posibles, y los ensayos in vitro para IgE espe-
cco no estn disponibles para todos los posibles alergenos
(en especial cuando el alergeno sospechoso es un frmaco).
Por tanto, un medio alternativo para detectar una respuesta
alrgica in vitro es agregar el alergeno sospechoso a la san-
gre del paciente, y medir tanto la liberacin de la histamina
en el supernadante como la expresin de CD63 en baslos
activados. Estos ensayos estn disponibles en el comercio,
pero todava no se han validado con amplitud en la prctica
clnica.
El futuro de la inmunologa celular
ste es un campo que contina amplindose indudablemen-
te. Un nmero creciente de tcnicas aparecen a travs de
las aplicaciones de la investigacin al laboratorio clnico
rutinario. Las aplicaciones del citmetro de ujo continan
aumentando, por ejemplo, los mtodos estn ahora disponi-
bles para combinar las mediciones mediante ujo citom-
trico convencional con la biologa molecular in situ, y los
nuevos reactivos sin anticuerpos aumentan el alcance de las
propiedades celulares que pueden evaluarse por este m-
todo ecaz. Los ensayos celulares funcionales derivan en
particular de los recientes avances de los procesos bsicos
de la inmunologa y de la enfermedad. Como en todos los
mtodos de diagnstico de laboratorio, estas pruebas deben
evaluarse cuidadosamente y controlarse de forma apropiada,
pero la naturaleza de los ensayos funcionales los hace difci-
les de estandarizar. La interpretacin de los ensayos funcio-
nales tambin est saturada de dicultades, y los laboratorios
que ofrecen tales ensayos deben tener suciente experiencia
y eciencia en el trabajo para asegurar calidad. El enlace
cercano con el personal clnico es tambin esencial para en-
tender la importancia de las anormalidades observadas.
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Figura 47-5 Medicin de la explosin respiratoria por la oxidacin de la dihidrorrodamina. Los neutrlos en sangre entera son esti-
mulados por E. coli (B) o por PMA (C), y se agrega dihidrorrodamina (DHR). La explosin oxidativa convierte DHR a rodamina, con
un aumento resultante en la uorescencia medida en FL1 comparado con los neutrlos sin estimular (A). Los neutrlos de pacientes
con enfermedad granulomatosa crnica no oxidan la DHR, y el cambio en la uorescencia de la poblacin no se observa. Los portadores
sanos de genes defectuosos de la ruta NADPH oxidasa muestran generalmente neutrlos normales y anormales, produciendo dos picos
de uorescencia.
EL FUTURO DE LA INMUNOLOGA CELULAR 463
Fluorescencia FL1
48
Enfermedades del complejo inmunitario
y crioglobulinas
Siraj A Misbah
Introduccin
Los complejos inmunitarios (CI) se forman cada vez que el
anticuerpo encuentra el antgeno. ste es un proceso sio-
lgico dinmico que permite que los antgenos exgenos
potencialmente dainos sean depurados por el sistema fago-
ctico mononuclear del husped (MPS). La falla para depu-
rar los complejos con xito puede conducir al depsito del
complejo inmunitario en las membranas basales del capilar
del plexo glomerular, drmico, sinovial y coroideo, donde
desencadenan una respuesta inamatoria. La inamacin in-
ducida por los complejos inmunitarios depende de la capaci-
dad de los complejos para activar el complemento (determi-
nada por el isotipo de inmunoglobulina), con la generacin
consiguiente de los mediadores proinamatorios potentes
(C5a). El C5a es un quimiotctico poderoso que atrae los
leucocitos y monocitos polimorfonucleares circulantes hacia
el sitio de depsito del complejo inmunitario, sirviendo para
amplicar el dao tisular. El sitio de depsito del complejo
inmunitario depende en parte de su tamao, como se ejem-
plica en el rin, donde los complejos inmunitarios peque-
os logran pasar a travs de la membrana basal glomerular
pero los complejos grandes son incapaces de hacerlo y se
acumulan entre el endotelio y la membrana basal.
Varios mecanismos aseguran que el depsito del complejo
inmunitario no incida en la salud. stos incluyen: a) fagoci-
tosis del CI por el MPS, el tamao del complejo inmunitario
es un factor crtico en este sentido, puesto que el MPS slo es
capaz de depurar los complejos pequeos; b) integridad de
la ruta del complemento, las protenas del sistema del com-
plemento juegan un papel vital porque mantienen el IC en la
solucin cubriendo los complejos con C3b (opsonizacin).
Esto previene la formacin de enrejados del complejo inmu-
nitario grande y de la precipitacin inmunitaria; adems, el
CI cubierto con C3b interacta con el receptor de C3b (CR1,
CD35) en las clulas rojas circulantes, que actan como un
transportador eciente de los complejos inmunitarios hacia
el MPS en el hgado y el bazo (g. 48-1). Dado el papel vital
de las protenas del complemento en la depuracin del CI,
no es sorprendente que los pacientes con deciencia primaria
del complemento (en especial de los primeros componen-
tes del complemento C1, C4, C2) tengan una incidencia alta
de la enfermedad del complejo inmunitario.
Otros factores que inuyen en el depsito del complejo
inmunitario incluyen a las propiedades sicoqumicas del
antgeno y del anticuerpo, como carga elctrica, valencia,
avidez de la interaccin antgeno-anticuerpo y el isotipo
de inmunoglobulina, por ejemplo, el CI que contiene ant-
genos catinicos se liga ligeramente a la membrana basal
glomerular aninica, causando lesin tisular.
Aunque los complejos inmunitarios circulantes ocurren
en una gran cantidad de enfermedades (cuadro 48-1), en
la mayora de los casos estos complejos son un hallazgo
tipo epifenmeno o incidental. Este captulo se limita a
aquellas enfermedades donde hay suciente evidencia para
apoyar un papel patognico de los complejos inmunitarios:
enfermedad del suero, lupus eritematoso sistmico (SLE) y
crioglobulinemia mixta.
466 CAP. 48 ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS
Independientemente de la causa subyacente, las enfer-
medades del complejo inmunitario comparten varias carac-
tersticas comunes de importancia clnica: a) participacin
multisistema debido al depsito de los complejos en los ca-
pilares del plexo del rin, de la piel, sinovial y coroideo;
b) hipocomplementemia durante los periodos de la enfer-
medad activa; c) la reduccin en los niveles del complejo
inmunitario circulante por terapia (drogas, plasmafresis)
conduce a la mejora en la actividad de la enfermedad.
Ensayos para los complejos inmunitarios
circulantes
Cerca de 30 ensayos para la deteccin de los complejos
inmunitarios circulantes fueron descritos en la dcada de
1970 con la expectativa (posteriormente insatisfecha) de
que podran ser tiles en el diagnstico clnico y el manejo de la
enfermedad del complejo inmunitario. Estos ensayos fue-
ron divididos ampliamente en mtodos fsicos diseados
para distinguir entre la inmunoglobulina monomrica y los
complejos inmunitarios, y los mtodos biolgicos depen-
dientes de la interaccin de los receptores celulares de la
supercie o del complemento con los complejos inmunita-
rios (cuadro 48-2).
Los problemas inherentes con los mtodos fsicos fue-
ron ejemplicados con el ensayo de precipitacin con po-
lietileno-glicol (PEG). Adems de precipitar los complejos
inmunitarios, el PEG, incluso en concentraciones bajas,
tambin precipita una variedad de protenas sricas, inclu-
yendo IgG, que causa dicultades importantes en la inter-
pretacin de los resultados. Los mtodos biolgicos para
la deteccin de los complejos inmunitarios basados en el
reconocimiento de los complejos en los sistemas humoral
o del receptor celular tambin probaron ser poco ables. El
ensayo en clulas Raji, que utiliza una lnea celular linfo-
blastoide derivada de un paciente con linfoma de Burkitt,
se emple de manera extensa en la dcada de 1970. Puesto
que el ensayo se basa en la capacidad de las clulas linfo-
blastoides (que poseen receptores superciales para C1q,
C3b, C3d, pero ninguna inmunoglobulina supercial) de
ligar los complejos inmunitarios sricos que tambin han
Figura 48-1 Transporte de los complejos inmunitarios por los eritrocitos hacia los fagocitos mononucleares en el hgado y bazo.
Cuadro 48-1 Desrdenes relacionados con los complejos
inmunitarios circulantes
Inmunolgicos Lupus eritematoso sistmico
Artritis reumatoide
Crioglobulinemia mixta
Sndrome de Felty
Espondilitis anquilosante
Esclerodermia
Enfermedad del suero
Infecciones
Bacterianas Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa,
Streptococcus sp.
Micobacterianas M. tuberculosis
Parasitarias Tripanosomiasis, oncocercosis
Malignidad Todas las formas
Fisiolgicos Individuos normales saludables
Embarazo
Receptor Fc
ENFERMEDAD SRICA 467
ligado el complemento, un ndice inaceptablemente alto de
positivos falsos se encontr en los pacientes con anticuerpos
antilinfocitos, como en el SLE. Aunque un grupo de trabajo
conjunto de la Organizacin Mundial de la Salud y la Unin
Internacional de Sociedades Inmunolgicas (IUIS) en 1981
encontr cuatro ensayos analticamente aceptables, ningu-
no ha soportado la evaluacin crtica de su utilidad clnica
por su sensibilidad muy variable, especicidad y valor pre-
dictivo escaso. Adems, la incapacidad de la mayor parte
de los ensayos para detectar el antgeno especco den-
tro de los complejos inmunitarios es una desventaja signi-
cativa. El grupo de trabajo conjunto WHO/IUIS concluy
que la deteccin de los complejos inmunitarios circulan-
tes no es esencial en ninguna enfermedad humana y, ms
importante, que la demostracin de los complejos inmuni-
tarios circulantes no es especca para la enfermedad del
complejo inmunitario. En consecuencia, la mayor parte
de los laboratorios clnicos de inmunologa han abandonado
los ensayos del complejo inmunitario y hasta la fecha no
hay evidencia que sugiera que los ensayos del comple-
jo inmunitario deban reintroducirse en la prctica clnica de
rutina. En aquellos casos donde se sospecha la enfermedad
del complejo inmunitario, la demostracin de depsitos de
inmunoglobulina y del complemento en una biopsia de los
rganos afectados (p. ej., piel, rin) se toma como evidencia
implcita de la presencia de depsitos del complejo inmuni-
tario. Los ensayos de los complejos inmunitarios circulantes
son un sustituto pobre para el examen inmunohistolgico
directo y la enfermedad del complejo inmunitario no debe,
bajo ninguna circunstancia, diagnosticarse principalmente
sobre la demostracin de complejos en el suero.
Enfermedad srica
La enfermedad del suero es un buen modelo para explicar
las enfermedades del complejo inmunitario. Von Pirquet en
1908 deline la enfermedad del suero como una entidad
distinta en los nios con inmunizaciones repetidas con el
suero antidiftrico derivado de caballos. La enfermedad
del suero se manifest de manera clnica como urticaria,
ebre, linfadenopata, artralgia y proteinuria 8 a 12 das
despus de la inyeccin del suero del caballo. El periodo
latente de 8 a 12 das reej el tiempo necesario para los
pacientes para producir los anticuerpos contra las protenas
del caballo. En una concentracin suciente de los comple-
jos del anticuerpo con el antgeno circulante, la carga resul-
tante del complejo inmunitario abruma los mecanismos de
control del cuerpo, conduciendo al depsito del complejo
inmunitario y a hipocomplementemia. La mejora clnica
depende de la depuracin de los complejos circulantes, que
ocurre de manera espontnea en muchos pacientes despus
de dos a tres semanas; una minora puede requerir trata-
miento con esteroides para acelerar la recuperacin.
Ms recientemente, la enfermedad del suero se ha estu-
diado de forma extensa en pacientes con anemia aplsica
que reciben globulina antitimocito de caballo (ATG). El
sndrome clnico descrito en estos pacientes es casi idn-
tico a aquel descrito por von Pirquet, con altos niveles de
complejos inmunitarios circulantes e hipocomplemen-
temia que coinciden con la incidencia de erupcin en la
piel y de artralgia. Los estudios inmunouorescentes de la piel
de una biopsia revelan depsitos abundantes de inmunog-
lobulina y de C3 en las paredes de los vasos sanguneos
pequeos.
Con la declinacin en el uso de la ATG, las reacciones
de hipersensibilidad al frmaco son en la actualidad la causa
ms comn de la enfermedad del suero. Un amplio rango de
frmacos puede actuar como haptenos y ligar a las protenas
del plasma con el subsiguiente complejo frmaco-protena
que desencadena una respuesta inmunitaria, por ejemplo,
penicilina, sulfamidas y tiouracilos. La enfermedad del sue-
ro inducida por frmacos es normalmente autolimitante,
condicionada a que el agente causante se retire.
Cuadro 48-2 Ensayos del complejo inmunitario
Mtodos fsicos (ensayos que dependen de las
propiedades fsico-qumicas del complejo) Precipitacin con polietilen-glicol
Crioprecipitacin
Ultracentrifugacin analtica
Mtodos biolgicos (ensayos que dependen de)
i) Reaccin con las antiglobulinas (sujeta a la Ensayo policlonal del factor reumatoide
interferencia por los factores reumatoides endgenos) Ensayo monoclonal del factor reumatoide*
ii) Interacciones complemento-protena
125
C1q jador*
Ensayo dependiente de la conglutinina (una protena bovina que
liga los complejos inmunitarios)*
iii) Receptores celulares de supercie Radioinmunoensayo en clulas Raji*
*Ensayos que se han encontrado analticamente aceptables por el grupo de trabajo de WHO/IUS.
Investigacin
El diagnstico de la enfermedad del suero es evidente por
la caracterstica presentacin clnica en un paciente con el
antecedente de ingestin del frmaco. Los desafos del fr-
maco no se requieren de manera normal y no deben reali-
zarse de rutina. El papel de la investigacin del laboratorio
es limitado; si bien las mediciones del complejo inmunita-
rio es probable que muestren altos niveles en la circulacin,
esto se realiza o se requiere raras veces. Durante la etapa
aguda de la enfermedad, la hipocomplementemia marcada
(C3, C4 reducidos) es una caracterstica y proporciona un
indicador til del depsito sistmico del complejo inmuni-
tario. Las biopsias del tejido pueden requerirse en los casos
de incertidumbre diagnstica y muestran el depsito de in-
munoglobulina y de C3 en la inmunouorescencia directa
del tejido cutneo y renal.
Lupus eritematoso sistmico
El lupus eritematoso sistmico (SLE) es un desorden hu-
mano comn del complejo inmunitario con una prevalencia
de 200 casos por cada 100 000 en el Reino Unido. En su
forma ms orida, el SLE afecta la piel, los riones, las ar-
ticulaciones y el sistema nervioso central, aunque muchos
pacientes pueden tener slo un rgano implicado al princi-
pio de la presentacin. Los pacientes que se presentan con
enfermedad neurolgica predominante plantean problemas
de diagnstico difciles, los cuales se tratan despus en este
captulo. Mucho del dao que causa el lupus en el rgano
se liga directamente al depsito extenso de los complejos
inmunitarios que ocurre en la piel, los riones y el plexo
coroideo. Como en la enfermedad del suero, la inmunouo-
rescencia de las biopsias de piel y renales muestra depsitos
de inmunoglobulina y de complemento (g. 48-2), mientras
los complejos inmunitarios circulantes se encuentran en una
proporcin elevada de pacientes con enfermedad activa. De
acuerdo con el papel clave del sistema del complemento en
el procesamiento de los complejos inmunitarios, un rango
de alteraciones del complemento se observa en los pacien-
tes con SLE (se resume en el cuadro 48-3).
Investigacin de los pacientes con sospecha
de lupus eritematoso sistmico
El SLE se relaciona con una multitud de anormalidades
de laboratorio, incluyendo hipergammaglobulinemia po-
liclonal, leucopenia, hipocomplementemia y una pltora
de autoanticuerpos en la sangre. Mientras el aumento po-
liclonal en las inmunoglobulinas del suero es un marcador
Figura 48-2 Inmunouorescencia de biopsias renales y de la
piel en un paciente con SLE. a) Depsitos glomerulares de IgA
en una distribucin membranosa. b) Depsitos glomerulares de
C1q en una distribucin membranosa. c) Depsitos granulares
de IgG en la unin dermoepidrmica (banda de lupus). Corte-
sa del Dr. W. Merchant, Leeds General Inrmary. a) y b), cor-
tesa del Dr. P. Harnden, Leeds General Inrmary.
LUPUS ERITEMATOSO SISTMICO 469
no especco de la activacin del sistema inmunitario, se
produce una velocidad de sedimentacin globular (ESR)
elevada que acta como una pista de diagnstico til cuan-
do se combina con una protena C-reactiva (CRP) normal.
Aunque la incapacidad para montar una respuesta de la
protena de fase aguda ante la enfermedad activa se le reco-
noce de manera extensa como una caracterstica del SLE,
sta no es invariable. Los pacientes con serositis activa,
sinovitis crnica e infeccin bacteriana concomitante son
una excepcin en este dictamen.
Autoanticuerpos como marcadores de enfermedad
La presencia de anticuerpos circulantes para los antgenos nu-
cleares es el sello caracterstico del lupus activo. Los prrafos
subsiguientes resumen los principios y la utilidad clnica de
los ensayos que se emplean para detectar estos anticuerpos.
Anticuerpos antinucleares (ANA)
En la prctica clnica, la deteccin de anticuerpos antinu-
cleares (ANA), segn lo demostrado por inmunouorescen-
cia indirecta, es el nico signo ms til para el diagnstico
del SLE. Los ANA son detectados al sobreponer clulas del
tejido de roedor o del cultivo tisular derivado de una lnea
celular epitelial humana (HEp-2) con el suero de prueba,
seguido por un segundo anticuerpo, IgG antihumano con-
jugado con uorescena. Usando el tejido del roedor, cerca
de 95% de los pacientes con enfermedad activa sin tratar
tienen un alto ttulo de ANA (> 1 en 80). Las clulas HEp-2
exhiben un grado incluso ms alto de sensibilidad, con un
aproximado de 98 a 99% de positividad en los pacientes con
enfermedad sin tratar. Las recientes directrices autorizadas
del Colegio Americano de Reumatologa, el Colegio de Pa-
tlogos Americanos, la Sociedad de Inmunologa Clnica y
los Institutos Nacionales de Salud recomiendan el uso de las
clulas HEp-2 como el mejor sustrato para el tamizaje de
ANA (Kavanaugh y cols.). Con el uso generalizado de las
clulas HEp-2, la existencia del lupus ANA negativo como
una entidad de diagnstico se ha puesto en duda (Cross y
cols.). Contrariamente, la probabilidad del SLE sin tratar en
un paciente con ANA negativo en clulas HEp-2 es del or-
den <1%. Un resultado positivo de ANA, sin embargo, no es
especco para el SLE, puesto que ocurre en una variedad
de otras enfermedades (cuadro 48-4).
Varios patrones distintivos de ANA se reconocen en las
clulas HEp-2: homogneo, nucleolar, moteado, perifri-
co y centromrico (g. 48-3). Excepto el anticuerpo del
centrmero, que es un marcador especco del sndrome
CREST (calcinosis, fenmeno de Raynaud, disfuncin
esofgica, esclerodactilia, telangiectasia) y de la esclero-
dermia, ninguno de los otros patrones de ANA es un in-
dicador conable de la especicidad antignica. En vista
de esto y a la incidencia de ANA en muchos otros estados
de enfermedad, es esencial caracterizar un ANA positivo
adicional en trminos de su especicidad antignica. En el
SLE, un ANA positivo por inmunouorescencia indirecta
reeja la presencia de anticuerpos para los antgenos nuclea-
res como DNA, histonas y un grupo de antgenos nucleares
extractables (ENA), conocidos individualmente como Ro,
La, Sm y U1-RNP (uridina protena ribonuclear).
Anticuerpos para los antgenos nucleares extractables (ENA)
Ro, La y Sm fueron nombrados as despus de los pacien-
tes en quienes stos fueron primero caracterizados: Robert,
Cuadro 48-3 Alteraciones del sistema del complemento
en el SLE
Primarias La deciencia total de los primeros compo-
nentes del complemento C1q, C1r-1s, C4, C2
relacionada con la alta incidencia del SLE
La deciencia parcial de C4 con uno a dos
alelos nulos de C4 se observa en cerca de
15% de los pacientes con SLE
Secundarias La expresin reducida de CR1 es una carac-
terstica del SLE avanzado
La actividad incrementada de la ruta clsica y
alternativa se reeja como
hipocomplementemia (TC3, TC4)
Los anticuerpos para C1q se relacionan con
enfermedad grave, en particular
glomerulonefritis
Cuadro 48-4 Causas de ANA positiva
Enfermedad del tejido conectivo
SLE
Sndrome de Sjgren
Polimiositis
Artritis reumatoide
Vasculitis
Enfermedades del hgado
Hepatitis activa crnica autoinmunitaria
Cirrosis biliar primaria
Enfermedad del hgado alcohlica
Frmacos
Infeccin
Malignidad
Individuos sanos
Lane y Smith. Junto con U1-RNP (uridina protena ribonu-
clear), estas protenas son responsables de empalmar y pro-
cesar el mRNA. En contraste con los ANA, los anticuerpos
para los ENA son especcos para el lupus y los desrde-
nes relacionados y son, por tanto, tiles en el diagnstico.
Adems, los anticuerpos individuales tienden a correlacio-
narse con ciertas manifestaciones clnicas; el anti-Ro ocu-
rre en el lupus y el sndrome de Sjgren y se correlaciona
con enfermedad cutnea. Es importante reconocer que los
anticuerpos anti-Ro pueden surgir en ausencia de ANA. El
perl ANA negativo, Ro positivo ocurre en una minora de
pacientes con lupus (<1% en las clulas HEp-2 como sus-
trato); en sustrato de tejido del roedor, sin embargo, esta
gura se eleva hasta 5%, puesto que el antgeno Ro tiene
una representacin pobre en el tejido del roedor. En 5 a
25% de embarazadas con lupus, los anticuerpos anti-Ro
cruzan la placenta para causar lupus cutneo transitorio en
el recin nacido; ms grave resulta que uno a tres bebs
nacidos de madres anti-Ro positivas desarrollan el bloqueo
cardiaco congnito permanente, requiriendo la insercin de
marcapasos. Mientras los anticuerpos anti-Ro ocurren en
aislamiento en cerca de 30% de los pacientes con lupus,
son acompaados por los anticuerpos anti-La en 15% de
los casos. En la ltima situacin los pacientes tienen meno-
res probabilidades de padecer enfermedad renal.
Adems de las correlaciones clnicas discutidas antes, el
perl ANA negativo anti-Ro positivo tambin acta como
un marcador para la deciencia primaria del complemento
Figura 48-3 Patrones de tincin de los anticuerpos antinu-
cleares (ANA) en las clulas HEp-2. a) Homogneo. b) Mo-
teado. c) Nucleolar. d) Perifrico. e) Centromrico (ntese el
aspecto de puntos nos mltiples, representando la tincin de
los cinetocoros de 23 pares de cromosomas). Cortesa del seor
K. Taylor, Leeds General Inrmary.
subyacente que afecta los primeros componentes del com-
plemento. Los estudios de los pacientes con deciencias ho-
mocigotas de C4 y C2 revelan positividad anti-Ro en cerca
de 50 a 70% de los casos. Aunque el mecanismo exacto res-
ponsable de la asociacin del SLE con la deciencia prima-
ria del complemento no se ha establecido, la existencia de
una jerarqua de la gravedad de la enfermedad, en cuanto al
componente faltante del complemento, est bien documen-
tada; la gravedad de la enfermedad es mayor en pacientes
con deciencia de C1q, seguida de cerca por la deciencia
total de C4. La gravedad de la enfermedad en pacientes con
deciencia de C2 es comparable a la observada en pacientes
con las rutas del complemento intactas.
Los anticuerpos anti-Sm tienen una especicidad alta
para el lupus, pero su prevalencia vara con el origen tnico
del paciente; 30% de pacientes afrocaribeos son anti-Sm
positivo, en contraste con el 10% de caucsicos. En vista de
las secuencias compartidas de pptidos entre Sm y U1-RNP,
los anticuerpos para Sm y U1-RNP tienden a surgir juntos.
La presencia de anticuerpos anti-U1-RNP en aislamiento
se pens para identicar a un grupo de pacientes con sn-
dromes de traslape del lupus, con caractersticas adiciona-
les de polimiositis y esclerodermia. Colegas y estudiosos
introdujeron el trmino enfermedad mixta del tejido conec-
tivo (MCTD) para caracterizar a estos pacientes, a quienes
se consider tenan un pronstico mejor en vista del riesgo
ms bajo de enfermedad renal y neurolgica. El seguimiento
a largo plazo de la cohorte original ha cuestionado la exis-
tencia de la MCTD como una entidad benigna distinta, pues-
to que muchos de los pacientes han desarrollado, despus,
enfermedad renal y neurolgica.
Mtodos de deteccin
Ensayos de inmunoprecipitacin Los anticuerpos para
los ENA se pueden detectar por varios mtodos. Inicial-
mente, muchos laboratorios utilizan la inmunoelectrofore-
sis de contracorriente (CIE) o el mtodo de doble difusin
de Ouchterlony para demostrar la presencia de los anticuer-
pos. La CIE se realiza en geles de agar, permitiendo que el
anticuerpo y el antgeno emigren en direcciones opuestas
para encontrarse en el centro del portaobjetos, donde la
inmunoprecipitacin ocurre al pH apropiado (g. 48-4).
La tcnica de doble difusin de Ouchterlony tambin se
basa en la inmunoprecipitacin; el antgeno se coloca en
la celdilla del centro de un portaobjetos de agar, mientras
que los sueros de control y del paciente se colocan en los
pozos que rodean el pozo central. Despus de 24 a 48 h
de incubacin, las lneas de precipitacin se forman, deno-
tando la presencia de una reaccin antgeno-anticuerpo. La
identidad del precipitado se establece por la comparacin
de las lneas de precipitacin producidas por el suero de
referencia previamente caracterizado. Tanto la CIE como
la difusin doble son tcnicas cualitativas adecuadas para
detectar altas concentraciones de anticuerpos especcos
Figura 48-4 Inmunoelectroforesis de contracorriente. Reproducida de Chapel y cols. (1999) con el consentimiento de Blackwell
Scientic.
nodo
Direccin del movimiento
de los anticuerpos
Suero positivo de los
pacientes
Suero negativo de los
pacientes
Direccin del movimiento
de los antgenos
Lnea de precipitacin del complejo
inmunitario especco
Ctodo
Antgeno
Antgeno
(0.1 a 1.0 g/ml). De vez en cuando, los resultados de las
pruebas de doble difusin pueden ser difciles de interpre-
tar. Los resultados negativos falsos pueden ocurrir si la
concentracin del antgeno no se ajusta para producir una
zona de equivalencia con la concentracin del anticuerpo
en el suero del paciente, y las lneas mltiples de precipita-
cin de especicidad desconocida pueden interferir con la
identicacin de los anticuerpos clnicos signicativos. En
contraste con la difusin doble, la CIE exhibe relativamen-
te mayor sensibilidad, velocidad y capacidad de manejar
ms muestras. Sin embargo, es tcnicamente demandante
y los resultados son menos equvocos.
Inmunoensayos enzimticos En los ltimos aos, los in-
munoensayos en emparedado se han desarrollado para de-
tectar los anticuerpos para los ENA. El mtodo implica la
adicin del suero del paciente que contiene el anticuerpo a
los pozos de la placa de microtitulacin cubiertos con ENA
puricado o recombinante individual. Los anticuerpos liga-
dos al antgeno se detectan por la adicin de un anticuerpo
policlonal o monoclonal de inmunoglobulina antihumana
conjugado con una enzima o una molcula luminiscente. La
concentracin del anticuerpo en el suero del paciente est
directamente relacionada con la intensidad del producto co-
loreado o uorescente. Los inmunoensayos enzimticos son
ms sensibles (sensibilidad analtica de 1 a 10 ng/ml) que la
CIE o la difusin doble. Por tanto, los resultados positivos
falsos pueden ocurrir en sueros hipergammaglobulinmicos
como resultado de la unin no especca incrementada.
Inmunotransferencia Un mtodo adicional para la detec-
cin de los anticuerpos para los ENA es la tcnica cualita-
tiva de inmunotransferencia (Western blot) (g. 48-5). Los
antgenos de un extracto nuclear son separados de acuerdo
al peso molecular por electroforesis con dodecil sulfato de
sodio (SDS-PAGE). Los antgenos separados entonces se
transeren (blotting) al papel de nitrocelulosa, que se corta
en tiras simples y se incuba con el suero del paciente (las
tiras comerciales precubiertas con antgenos individuales
estn tambin disponibles en presentacin comercial). Los
anticuerpos ligados se detectan incubando las tiras con una
inmunoglobulina antihumana marcada enzimticamente.
En un ejercicio reciente de control de calidad realizado por
la Fundacin de la Artritis y los Centros para el Control de
Enfermedades, de Estados Unidos, la inmunotransferencia
se emple para reanalizar las especicidades anti-ENA en
los sueros de referencia caracterizados previamente por in-
munouorescencia y difusin doble (Smolen y cols.). Los
resultados de la inmunotransferencia estaban en gran medi-
da de acuerdo con la difusin doble, aunque las diferencias
en laboratorios individuales se observaron en referencia al
reporte de las bandas sin especicar adicionales. Esto es un
fenmeno reconocido con la inmunotransferencia debido a
Figura 48-5 Perles clsicos de los anticuerpos para los antge-
nos nucleares extractables en la inmunotransferencia. Modicada
con permiso de Biodiagnostics Ltd. SS-A y SS-B son trminos
alternativos para los anticuerpos anti-Ro, La, respectivamente.
P1 y P2 se reeren a las subunidades individuales de Ro. Los
anticuerpos adicionales incluidos son anti-Scl 70 (marcador para
la esclerodermia), anti-Jo1 (marcador de polimiositis con el anti-
PCNA de la enfermedad intersticial del pulmn (antgeno nuclear
celular proliferante; visto en 2 a 10% de los casos de SLE).
las diferencias menores en las tcnicas empleadas por los
laboratorios individuales. La inmunotransferencia no se
emplea en la actualidad de rutina en los laboratorios cl-
nicos de inmunologa. En vista de su especicidad, tiende
a reservarse para la investigacin de muestras de pacientes
Marcadores
(MW en kDa)
Tincin
frontal
que producen resultados discrepantes por los ensayos estn-
dares. En aquellos pacientes raros con convincente eviden-
cia clnica de lupus o de desrdenes de traslape de lupus, en
quienes los ensayos convencionales no pueden detectar los
anticuerpos para el DNA y los ENA, la inmunotransferencia
ofrece el potencial de detectar los anticuerpos para los ant-
genos previamente no caracterizados.
Anticuerpos para el DNA de doble cadena (anti-dsDNA)
Los anticuerpos dirigidos contra el DNA de doble cadena
(anti-dsDNA) juegan un papel importante en la patogenia
del dao al rgano en el SLE, en particular en el rin.
Los complejos de los anticuerpos dsDNA e IgG anti-DNA
se han demostrado en los eluidos de biopsias renales. De
acuerdo con este hallazgo, los niveles de anticuerpos anti-
dsDNA tienden a correlacionarse bien con la actividad total
de la enfermedad en el SLE. En la mayora de los pacien-
tes, un aumento en los niveles de anti-dsDNA en el suero
es predictivo de un recrudecimiento de la enfermedad. Una
cada ocasional en los niveles previamente elevados de los
anti-dsDNA puede presagiar nefritis del lupus, un probable
reejo del depsito del complejo inmunitario en el rin.
Mientras los anticuerpos para dsDNA tienen una especi-
cidad alta para el SLE, y ocurren en 75 a 95% de los pacien-
tes con enfermedad sin tratar, los anticuerpos para el DNA
de una sola cadena (ssDNA) no especcos surgen en una
variedad de otros desrdenes (artritis reumatoide, hepatitis
activa crnica, ancianos sanos) adems del lupus.
Mtodos de deteccin
De los muchos mtodos disponibles para detectar los anti-
dsDNA, la mayor parte de los laboratorios clnicos de in-
munologa utiliza uno de los siguientes tres ensayos.
Ensayo de Farr El ensayo emplea dsDNA radiomarcado
(
125
I es el radioistopo ms utilizado) como antgeno. Incu-
bando el suero de prueba que contiene el anti-dsDNA con
125
I-dsDNA se conduce a la formacin de los complejos in-
munitarios, que se precipitan usando una solucin saturada
de sulfato de amonio. La cantidad de anti-dsDNA es directa-
mente proporcional a la cantidad de radiactividad en el pre-
cipitado. La concentracin de anti-dsDNA en las muestras
de prueba se deriva midiendo la cantidad de DNA marcado
con
125
I en la presencia de un suero estndar de referencia
que contiene cantidades conocidas de anticuerpo. Un suero
estndar de la WHO designado Wo/80 est disponible para
la estandarizacin del ensayo. Puesto que el sulfato de amo-
nio interrumpe los complejos inmunitarios que contienen an-
ticuerpos de avidez ms baja, el ensayo de Farr detecta los
anticuerpos de avidez alta que se correlacionan bien con la
presencia de lupus grave relacionado con enfermedad renal.
El ensayo de Farr, sin embargo, no detecta los anticuerpos
anti-dsDNA de baja avidez, que existen en pacientes con lu-
pus relativamente ligero.
ELISA Un nmero de ensayos comerciales ELISA
que utilizan dsDNA puricado (recombinante o a partir de
extracto del timo de becerro) est disponible para la detec-
cin de los anticuerpos DNA. Puesto que el dsDNA no se
liga directamente a los pozos plsticos, la mayor parte de
los ensayos utilizan DNA acomplejado para poli-l-lisina
o protamina para cubrir las placas de microtitulacin. En
contraste con el anlisis de Farr, los ensayos ELISA detec-
tan los anticuerpos DNA de avidez baja y alta. Por tanto,
el ensayo ELISA exhibe un grado ms alto de sensibilidad
para los propsitos de diagnstico que el ensayo de Farr;
sin embargo, su especicidad relativamente ms baja ge-
nera un nmero signicativo de resultados falsos positivos
del anticuerpo del DNA en pacientes sin lupus, por ejem-
plo, infecciones, enfermedad crnica del hgado.
Inmunouorescencia indirecta utilizando Crithidia lu-
ciliae Puesto que la mitocondria grande (cinetoplasto)
del hemoagelado Crithidia luciliae se compone casi por
completo de DNA de doble cadena, los estudios de inmu-
nouorescencia indirecta utilizan Crithidia como el ant-
geno que exhibe un alto grado de sensibilidad y especicidad
para la deteccin de los anticuerpos anti-DNA en el lupus.
Los portaobjetos comerciales que contienen C. luciliae ja
se incuban con el suero de prueba apropiadamente, seguido
por la adicin del anticuerpo inmunoglobulina antihumano
conjugado con uorescena. Las muestras que producen la
uorescencia connada al cinetoplasto se consideran posi-
tivas (g. 48-6). Las muestras ocasionales pueden producir
uorescencia nuclear tambin, pero esto se debe pasar por
alto, puesto que el ncleo contiene muchos otros antgenos
adems del DNA. Aunque algunos laboratoristas han expre-
sado preocupacin, pues el cinetoplasto puede contener his-
tonas (las protenas bsicas que ligan DNA) que conduzcan
a resultados positivos falsos en el suero positivo del anticuer-
po antihistona, esto no se ha conrmado. En la mayor parte
de los casos donde es una preocupacin la contaminacin
con histonas, es posible realizar inmunouorescencia en los
portaobjetos con Crithidia pretratada con cido clorhdrico,
un procedimiento que elimina las histonas. En vista de las
dicultades relacionadas con la estandarizacin de los en-
sayos inmunouorescentes, el ensayo con Crithidia es poco
able para el anlisis serial de los niveles del anticuerpo.
Cul ensayo anti-DNA elegir?
El ensayo ideal debe ser lo suciente sensible y especco
para el diagnstico del lupus y reejar, adems, la actividad
de la enfermedad conablemente. Los tres ensayos descritos
(cuadro 48-5) satisfacen el primer criterio, con sensibilidades
>90% en pacientes con enfermedad activa. Con respecto a es-
pecicidad, los ensayos con Crithidia y el de Farr (especici-
dad >90%) son superiores a ELISA. Los ensayos ELISA, en
virtud de su propensin para detectar anticuerpos de avidez
baja, producen resultados falsos positivos del anticuerpo del
DNA en una minora signicativa de pacientes sin lupus. A
pesar de esta desventaja, los ensayos ELISA se utilizan cada
vez ms en prctica clnica en vista de su alta sensibilidad,
Figura 48-6 a) Fluorescencia connada al cinetoplasto de C. lu-
ciliae usando suero que contiene niveles altos de anticuerpos an-
tiDNA de un paciente con SLE activo. b) Representacin diagra-
mtica de la anatoma de C. luciliae. Reproducido de Rose y cols.
(1992) con permiso de la American Society for Microbiology.
facilidad de la automatizacin, capacidad para cuanticar re-
sultados de manera conable (til para la monitorizacin en
serie) y ausencia de radioistopos en el ensayo.
El ensayo de Farr es adecuado para la monitorizacin
de la enfermedad y puede, en la prctica, superar al ELI-
SA en predecir el desarrollo de la enfermedad recrudecida,
implicando particularmente al rin. En un estudio holan-
ds aleatorio reciente, los pacientes con un incremento de
25% en los niveles de anti-dsDNA que reciben aumentos
preventivos en el tratamiento inmunosupresivo tenan una
disminucin signicativa en las recadas comparada con el
grupo control, a quienes se trataron en forma convencional
(Bootsma y cols.). Una proporcin pequea de pacientes
con lupus puede recaer sin acompaarse de un incremento
en los anticuerpos del DNA; del mismo modo, una minora
de pacientes puede ser clnicamente estable o asintomtico
a pesar de la presencia de niveles persistentemente eleva-
dos del anticuerpo por los tres ensayos.
Lupus y el sndrome antifosfolpido
Los anticuerpos para los fosfolpidos (APA) actan como
marcadores de trombosis (en un tercio de los pacientes con
Cuadro 48-6 Criterios para el diagnstico del sndrome
del anticuerpo antifosfolpido*
Clnicos Trombosis venosa o arterial, o ambas
Prdida fetal recurrente
Trombocitopenia persistente
Laboratorio Elevacin persistente del anticuerpo IgG o
IgM, o ambos, de la cardiolipina (
2
GPI-
dependiente)
Anticoagulante del lupus
*Al menos un criterio de laboratorio y uno clnico deben estar presen-
tes; las pruebas de laboratorio deben ser positivas en al menos dos oca-
siones en un lapso de ms de tres meses separados.
La medicin del anticuerpo de la cardiolipina puede sustituirse pronto
por la medicin directa de los anticuerpos para
2
GPI.
Cuadro 48-5 Comparacin de los tres ensayos anti-dsDNA muy utilizados en el SLE
Farr Crithidia ELISA
Sensibilidad Alta Alta Alta
Especicidad Alta Alta Moderada
Deteccin de los anticuerpos de avidez alta +++ ++ ++
Deteccin de los anticuerpos de avidez baja + ++ +++
Capacidad para identicar los isotipos del anticuerpo individuales (IgG, IgA, IgM) No S S
Conveniencia para la monitorizacin de la enfermedad activa S No S
Ncleo
Flagelo
Cinetoplasto
lupus). El trmino sndrome antifosfolpido (APS) fue for-
jado para delinear a aquellos pacientes con trombosis y nive-
les elevados de los anticuerpos del fosfolpido (cuadro 48-6).
En contraste con otros estados tromboflicos, que resultan en
trombosis venosa predominante, los pacientes con el APS
pueden desarrollar trombosis tanto en los vasos arteriales
como en los venosos. Las manifestaciones clnicas depen-
den de qu rgano se vuelve isqumico (g. 48-7). Los APA
pueden detectarse por ELISA o por la prolongacin de los
ensayos de coagulacin dependientes de fosfolpidos (tiem-
po de tromboplastina parcial activado, APTT). Los APA de-
tectados por ELISA utilizando cardiolipina, un fosfolpido
cido, como antgeno pueden no actuar siempre como un
marcador verdadero de trombosis, puesto que muchos po-
Figura 48-7 a) Oclusin de la rama arterial retiniana en un pacien-
te con SLE y con el sndrome antifosfolpidos; el defecto es ms
pronunciado en el angiograma de sustraccin mostrado en (b).
sitivos falsos se han detectado en pacientes con infeccin
(bacteriana, viral, protozoaria), terapia con frmacos y otras
enfermedades del tejido conectivo. El positivo falso histri-
co VDRL se debe a la presencia de APA dirigida contra la
cardiolipina presente en el reactivo de VDRL. La incapaci-
dad de los ensayos actuales de ELISA para distinguir entre
la trombosis relacionada y la que no lo est con los APA
condujo a dicultades para interpretar el signicado clnico
de los niveles elevados de APA. La distincin es importante,
puesto que los pacientes con trombosis relacionada con APA
requieren terapia intensiva anticoagulante a largo plazo, tal
vez de por vida. La evidencia reciente sugiere que la trombo-
sis relacionada con APA est dirigida, en gran parte, contra
la
2
glucoprotena I (
2
GPI, un cofactor de protena srico
que liga fosfolpidos) ms bien que los fosfolpidos per se.
Dos fuentes de
2
GPI se encuentran en los ensayos actuales:
las muestras de prueba de suero humano y suero bovino uti-
lizadas para bloquear las placas de ELISA. Se piensa que la
interaccin de la cardiolipina inmovilizada con
2
GPI altera
su conformacin, volvindola inmunognica. En vista de
la incapacidad de los ensayos ELISA convencionales para
distinguir entre la trombosis relacionada y la que no lo est
con los APA, hay mucho inters en los ensayos que utilizan
2
GPI puricada como antgeno. Aunque su presencia no
se incluye en la actualidad en los criterios de diagnstico
para el sndrome antifosfolpido, los anticuerpos anti-
2
GPI
son predictores ms fuertes de trombosis que los anticuerpos
para la cardiolipina convencionales detectados por ELISA.
Los APA que intereren con los ensayos de coagula-
cin dependientes de fosfolpidos reconocen un complejo
fosfolpido-protrombina (se les denomina anticoagulantes
del lupus [LAC], en reconocimiento de su incidencia en pa-
cientes con lupus). El trmino LAC es una denominacin
impropia, puesto que se relaciona con la trombosis in vivo
ms bien que con la hemorragia. La presencia de los LAC
se sospecha en un APTT prolongado que no se corrige con
la adicin de plasma normal, sugiriendo as la presencia
de un inhibidor. Puesto que la demostracin de los anti-
cuerpos para los LAC indica el desarreglo funcional de la
coagulacin, estos anticuerpos se correlacionan ms estre-
chamente con la trombosis que los APA demostrados por
ELISA. La mayora de los pacientes con lupus es seguro
que tengan LAC, adems de anticuerpos de la cardiolipina
(70%), aunque en una minora se encuentren anticuerpos
de la cardiolipina o de los LAC (15% en cada categora).
Lupus eritematoso sistmico neuropsiquitrico (NPSLE)
El papel de la investigacin de laboratorio
La implicacin neurolgica en el SLE es un problema im-
portante que afecta hasta dos tercios de pacientes en algn
punto de su enfermedad. Mientras cerca de 20% de estos
pacientes contina en esta condicin sobre un segundo pla-
no de la enfermedad sistmica activa, en la mayor parte de
los casos es pasiva o slo ligeramente activa. El mdico
enfrentado con un paciente con SLE y caractersticas neu-
rolgicas tiene que realizar la distincin importante entre
la enfermedad neurolgica debida al lupus (primario), la in-
feccin oportunista como una causa secundaria y la psicosis
esteroide, puesto que la mayora estn en terapia inmunosu-
presiva en el momento de la presentacin. Un rango diverso
de presentaciones clnicas se observa (cuadro 48-7), ree-
jando mecanismos patognicos subyacentes mltiples. Por
Cuadro 48-7 Manifestaciones neuropsiquitricas del SLE
Sndrome cerebral orgnico (deterioro cognitivo, psicosis*)
Ataques
Neuropata craneal
Neuropata perifrica Orden decreciente
Accidente cerebrovascular de frecuencia
Desorden en el movimiento
Mielitis transversal
*Puede ser inducida por esteroides.
lo menos tres hiptesis se han propuesto para explicar las
diversas presentaciones clnicas: anticuerpos antineurona-
les, trombosis relacionada con anticuerpos de fosfolpidos,
enfermedad conducida por la citocina.
Es lamentable que ninguno de los marcadores actuales
disponibles de laboratorio del SLE sea sucientemente es-
pecco para el diagnstico del lupus neurolgico prima-
rio. Varios estudios han mostrado que las anormalidades en
los niveles de anti-DNA y del complemento (C3, C4) en el
suero o en el lquido cefalorraqudeo (LCR) no discrimi-
nan entre la enfermedad neurolgica y la no neurolgica en
el SLE. El entusiasmo inicial por los anticuerpos dirigidos
contra las neuronas (anticuerpos linfocitotxicos, que reac-
cionan con el tejido cerebral y los anticuerpos directamente
sealados contra los antgenos neuronales) como los mar-
cadores especcos para el lupus neurolgico fue abatido
por los estudios que demostraban su presencia en los pa-
cientes con lupus sin implicacin neurolgica. Las recien-
tes pretensiones de que los anticuerpos dirigidos contra las
protenas ribosmicas P son marcadores especcos de la
psicosis del lupus han sido refutadas por su demostracin
en 50% de los pacientes con SLE sin psicosis.
El examen del LCR es obligatorio en todos los pacientes
con SLE neuropsiquitrico para permitir que los casos de
infeccin que se hacen pasar por NPSLE se diagnostiquen.
En un estudio prospectivo reciente de la implicacin neu-
rolgica en el SLE, la infeccin (criptoccica, tuberculosis
y meningitis pigena) era la causa subyacente en cerca de
50% de los casos. La presencia de bandas oligoclonales ex-
clusivamente en el LCR favorece al NPSLE pero puede tam-
bin ocurrir con la infeccin. En la ausencia de un marcador
especco de laboratorio, el diagnstico del NPSLE sigue
dependiendo mucho de la perspicacia clnica tradicional.
Valoracin de actividad de la enfermedad en el SLE
La medicin exacta de la actividad de la enfermedad es cru-
cial para el manejo correcto del SLE. Varios ndices de la
actividad de la enfermedad se han ideado para simplicar
esta tarea y asegurar uniformidad en los estudios clnicos.
Cuatro sistemas bien validados y en uso en la actualidad son
el ndice de actividad de la enfermedad del SLE (SLEDAI),
medicin de la actividad del lupus sistmico (SLAM), la
escala del Grupo de Actividad del Lupus de las Islas Bri-
tnicas (BILAG) y el ndice de actividad del lupus (LAI).
Junto con la valoracin clnica, los marcadores serolgicos
de la actividad de la enfermedad son una ayuda importante
para el mdico al determinar la necesidad de terapia inmu-
nosupresiva en el SLE.
La enfermedad activa se acompaa en la mayora de los
pacientes por un incremento en los niveles sricos de anti-
DNA y una cada en los niveles del complemento (C3, C4).
En algunos pacientes, sin embargo, las mediciones del com-
plemento no reejan la actividad de la enfermedad. Puesto
que C3 acta como reactivo de fase aguda, un incremento en
la concentracin secundaria a la inamacin o a la infeccin
enmascara la consuncin debida al SLE activo. Los niveles
sricos del C3 son normales en cerca de 50% de los pacien-
tes con enfermedad activa, mientras las mediciones de C4
son de valor limitado en pacientes con alelos nulos de C4.
En consecuencia, varios estudios han valorado el papel de
los productos de degradacin del complemento (C3d, C4d,
C5b-9) como marcadores de la actividad de la enfermedad.
En general, los productos de degradacin del complemen-
to son marcadores ms sensibles de la enfermedad activa (60
a 80% de sensibilidad) que las mediciones convencionales de
C3 y C4. Su carencia relativa de especicidad (45 a 80%
de especicidad), sin embargo, ha impedido su adopcin ex-
tensa en la prctica clnica. En ausencia del marcador serol-
gico ideal de la actividad de la enfermedad en el SLE, el uso
de los niveles del anticuerpo anti-DNA en serie junto con el
complemento (C3 o C4, y/o los productos de degradacin) y
CRP representan el perl ms til de laboratorio para valorar
la actividad de la enfermedad (cuadro 48-8).
El lugar de los ensayos de adhesin de la molcula en la
valoracin de rutina de la actividad de la enfermedad en el
lupus est en la actualidad bajo investigacin. Los estudios
preliminares sugieren que los niveles sricos de VCAM-1
(molcula de adhesin de la clula vascular) estn marca-
dos con niveles elevados en la nefritis del lupus y parecen
relacionarse con la actividad de la enfermedad; los niveles
de E-selectina y de ICAM-I (molcula de adhesin interce-
lular) son intiles. Si la medicin de VCAM-1 es superior
a los marcadores serolgicos existentes de la actividad, de-
pende de los mritos de los estudios prospectivos futuros.
Crioglobulinemia
Introduccin
El trmino crioglobulinemia se utiliza para denotar la
presencia de crioglobulinas en la sangre. Las crioglobu-
linas son inmunoglobulinas que se precipitan de manera
reversible en el fro (4C), y se redisuelven a temperaturas
ms altas (37C). Tres tipos de crioglobulinas se reconocen
segn su inmunoglobulina de composicin y enfermeda-
des relacionadas (cuadro 48-9). Las crioglobulinas tipo I
se componen de inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM)
y constituyen cerca de 25% de todas las crioglobulinas. Las
crioglobulinas tipo II, que se componen de una mezcla de
IgG monoclonal con actividad de factor reumatoide e IgM
policlonal, constituyen otro 25%. Las crioglobulinas tipo
Cuadro 48-8 Cambios en los anticuerpos anti-DNA, C3, C4 y CRP en relacin con la actividad de la enfermedad en el SLE
anti-DNA C3 C4 CRP
Enfermedad activa c T T N o sl c
Enfermedad inactiva N o sl c N N N
Infeccin bacteriana concomitante N o sl c N, c o T N, c o T c
N = normal; sl = ligero.
Cuadro 48-9 Clasicacin de las crioglobulinas
Composicin Enfermedades relacionadas
Tipo I Inmunoglobulina monoclonal, normalmente IgM o IgG Macroglobulinemia de Waldenstrm
Mieloma, enfermedad linfoproliferativa
Tipo II IgM monoclonal factor reumatoide ms IgG policlonal Infecciones
Virales (hepatitis C, hepatitis B, VIH, Epstein-Barr)
Bacterianas (endocarditis)
Espiroquetales (slis, enfermedad de Lyme)
Parasitarias (paludismo)
Fngicas (coccidioidomicosis)
Idiopticas (crioglobulinemia mixta esencial)
Tipo III Factor IgM policlonal reumatoide ms IgG policlonal* Autoinmunitario
SLE, artritis reumatoide, sndrome de Sjgren idioptico
Crioglobulinemia mixta esencial
*Las cantidades traza de las crioglobulinas tipo III pueden encontrarse en algunos individuos normales.
III se componen de una mezcla de IgG e IgM policlonales y
constituyen el 50% restante. Mientras la mayor parte de las
crioglobulinas tienden a precipitarse a temperaturas debajo
de 10C, en ocasiones una crioglobulina termolbil puede
precipitarse en la jeringuilla utilizada para la venopuncin
si no se ha precalentado a 37C. Las razones exactas de la
crioprecipitacin de las inmunoglobulinas no se conoce.
Etiologa
La crioglobulinemia se relaciona en la mayor parte de los
casos con un desorden subyacente bajo la forma de para-
proteinemia maligna, linfoma, enfermedad autoinmunita-
ria o infeccin. La crioglobulinemia tipo I se asocia con
paraproteinemia, slo en una minora de pacientes que no
pueden mostrar evidencia de enfermedad linfoproliferati-
va subyacente en la presentacin. En la crioglobulinemia
mixta (tipos II y III), la investigacin clnica detallada no
puede descubrir la enfermedad autoinmunitaria o la infec-
cin relacionada en hasta un tercio de pacientes. Estos pa-
cientes fueron catalogados originalmente como poseedores
de crioglobulinemia esencial idioptica o mixta. Desde
1992, los estudios de Italia, EUA, Francia y Suiza han pro-
porcionado evidencia convincente de que 60 a 80% de los
CRIOGLOBULINEMIA 477
pacientes con crioglobulinemia tipos II y III tiene infeccin
subyacente de hepatitis C. Aunque algunos pacientes con
crioglobulinemia mixta exhiben caractersticas de la enfer-
medad linfoproliferativa, como poblaciones monoclonales
de la clula B en la mdula sea y rearreglo del gen de la
inmunoglobulina en clones de los linfocitos de la sangre
perifrica, el linfoma ostensible es raro.
La inmunopatogenia de la crioglobulinemia est mal en-
tendida. Un amplio rango de complejos primarios antge-
no-anticuerpo se ha detectado en los crioprecipitados de las
crioglobulinas tipos II y III, adems del complejo del factor
reumatoide y de la IgG. Esto llev a la visin de que la
formacin de crioglobulinas mixtas es el resultado nal de
una secuencia de eventos conducida por una respuesta del
anticuerpo a los agentes infecciosos o a los antgenos end-
genos, como en el SLE.
Caractersticas clnicas
Las manifestaciones clnicas de la crioglobulinemia se de-
ben a una combinacin de la obstruccin vascular y del
depsito del complejo inmunitario. Las crioglobulinas del ti-
po I pueden ocurrir en cualquier sexo y causar principal-
mente hiperviscosidad y obstruccin vascular. En contraste,
las crioglobulinas mixtas (tipos II y III) afectan a las mu-
jeres en particular y se presentan con caractersticas cl-
nicas diversas, por el depsito de complejos inmunitarios
crioprecipitables en los vasos sanguneos, causando vascu-
litis sistmica que afecta la piel, el rin y articulaciones.
Las biopsias de piel de la erupcin purprica caracterstica
observadas en tales pacientes muestran vasculitis leucoci-
toclstica con depsito de inmunoglobulina y del comple-
mento. La implicacin renal debido a la glomerulonefritis
Figura 48-8 Manifestaciones clnicas y de laboratorio de la crioglobulinemia mixta en un paciente con hepatitis C. a) La erupcin prpura
caracterstica en miembros ms bajos; la echa indica un rea prpura palpable. Reproducida de Shakil y Bisceglie (1994), con permiso. b)
Suero almacenado mostrando el crioprecipitado despus de 24 h de incubacin a 4C (derecha), redisolucin por el calentamiento a 37C
(izquierda). c) Electroforesis de la zona del suero colectado a 37C que muestra el crioprecipitado redisuelto como una banda discreta en
la regin gamma, que en la inmunojacin muestra estar compuesta de IgM monoclonal e IgG policlonal. Observe la ausencia de la banda
gamma en la electroforesis de la zona de la muestra colectada a temperatura ambiente (TA) del mismo paciente. d) Biopsia renal mostrando
depsitos glomerulares eosinlos de crioglobulina (seudotrombina) en el examen de H&E de rutina (izquierda) que corresponde a los dep-
sitos gruesos (derecha) de IgG sobre inmunouorescencia. Reproducida de Graham (Arthrit Rehum 1992;35:1107), con permiso.
membranoproliferativa con depsito de la inmunoglobulina
y del complemento ocurre en 50% de todos los pacientes
con crioglobulinemia mixta. Las caractersticas histolgi-
cas distintivas de la glomerulonefritis crioglobulinmica
incluyen la inltracin monoctica glomerular marcada,
los depsitos eosinlos rojo Congo negativos amorfos
en los capilares y una membrana basal glomerular doble
contorneada ocurren por una interposicin de los mono-
citos. La presencia de estas caractersticas en la biopsia
renal en un paciente con la, as llamada, glomerulonefritis
idioptica debe estimular una investigacin para las crio-
globulinas. La funcin heptica deteriorada con un amplio
espectro de anormalidad histolgica, que comprende desde
la hepatitis persistente crnica hasta la cirrosis, ocurre en
70% de pacientes y es de inters en vista de la asociacin
fuerte de la infeccin de hepatitis C y de la crioglobuline-
mia mixta (g. 48-8).
Investigacin de laboratorio de la supuesta
crioglobulinemia
Procesamiento de la muestra
La razn ms comn del fracaso para demostrar la existen-
cia de crioglobulinas circulantes es la coleccin y el proce-
samiento incorrectos de la muestra. La atencin meticulosa
en la coleccin de las muestras sanguneas es esencial. La
sangre debe colectarse en un tubo sencillo sin anticoagu-
lante y sumergirse en un frasco que contenga agua a 37C,
seguido por el traslado inmediato al laboratorio. El fallo
para colectar las muestras a 37C permite a las crioglobuli-
nas precipitarse con el cogulo de sangre y, por tanto, que
escape a la deteccin. La gura 48-9 ilustra los pasos en la
deteccin de las crioglobulinas en el laboratorio.
Otras caractersticas del laboratorio que sugieren
la presencia de crioglobulinas
Los indicadores tiles de la presencia de crioglobulinas
mixtas son la deplecin marcada de los primeros compo-
nentes del complemento del suero (C4, C1q) por la activa-
cin de la ruta clsica de los complejos inmunitarios. La
combinacin de un suero bajo de C4 y del factor reuma-
toide IgG es un rasgo caracterstico de la crioglobulinemia
mixta, que ocurre en ms de 90% de los pacientes. Es una
regla general til que los pacientes con un inexplicable C4
bajo del suero y enfermedad renal o de la piel deben ser
investigados para la crioglobulinemia.
Las crioglobulinas intereren con las mediciones in-
munoqumicas de rutina de las inmunoglobulinas sricas y
llevan a niveles articiales bajos; pueden tambin interferir
con los anlisis de rutina del conteo sanguneo total por los
Figura 48-9 Pasos en la deteccin de las crioglobulinas en el laboratorio.
CRIOGLOBULINEMIA 479
contadores automatizados celulares y conducir a leucocito-
sis y trombocitosis falsas. La coleccin y el anlisis de las
muestras a 37C evitan estos problemas.
Adems de caracterizar la crioglobulina, todos los pa-
cientes se investigan para un desencadenante subyacente.
En el caso de la crioglobulinemia tipo I, las investigaciones
apropiadas para la enfermedad linfoproliferativa deben ins-
tituirse. A los pacientes con crioglobulinemia mixta se les
practica serologa de la hepatitis, incluyendo la PCR para
evaluar el RNA de la hepatitis C, para seleccionar aquellos
que se benecian de terapia con interfern alfa. La investiga-
cin de rutina para otros desencadenantes infecciosos (endo-
carditis, slis, enfermedad de Lyme, paludismo, VIH), se-
gn se informa, relacionados con la crioglobulinemia mixta
no se justica en ausencia de evidencias para lo contrario.
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Introduccin
El trasplante ahora es una terapia mdica aceptada para re-
emplazar rganos enfermos. Sin embargo, la respuesta del
sistema inmunitario del husped al rgano trasplantado es
un obstculo permanente importante para obtener un re-
sultado exitoso. Los trasplantes de rgano son destruidos
por una inmunorrespuesta adaptable, principalmente por
linfocitos T hacia los antgenos ajenos presentes sobre la
supercie del tejido injertado. De los diversos antgenos
donadores presentes en un tejido aloinjertado que pueden
potencialmente obtener una inmunorrespuesta, los antge-
nos que activan el complejo principal de histocompatibili-
dad (MHC) son los ms importantes.
Cuando el donador y el receptor son dispares de MHC,
una respuesta inmunitaria se inicia y se dirige contra una
molcula o molculas MHC no propias en el tejido injer-
tado. Aunque otros sistemas del antgeno pueden invocar
una inmunorrespuesta dirigida al aloinjerto, los antgenos
MHC conocidos como antgenos leucocitarios humanos, o
HLA para abreviar, son los ms inmungenos. Esto suce-
de por la habilidad que poseen para unirse directamente al
receptor del antgeno de la clula T, ligando el proceso del
antgeno normal que se requiere para estimular respuestas
de la clula T; y a la frecuencia alta de clulas T circulantes
en poblaciones perifricas con la especicidad del receptor
para MHC ajenos.
Puesto que las diferencias en antgenos MHC provocan
tal rechazo vigoroso de aloinjertos, una cantidad conside-
rable de trabajo se dirige hacia la compatibilidad MHC
donador:receptor. Deniendo la especicidad HLA, en un
esfuerzo por minimizar el rechazo, a travs de la compa-
tibilidad MHC donante:receptor es un proceso conocido
como tipicacin HLA.
Estructura y funcin de HLA
Los genes HLA del MHC humano consisten de mltiples
sitios clases I, II y III presentes en el brazo corto del cro-
mosoma 6. Ellos comprenden cerca de 4 10
6
pares bsi-
cos, que contienen por lo menos 50 genes.
Las protenas HLA clase I consisten en una cadena alfa
() que tiene tres subunidades, cada una se asemeja a un
dominio tipo inmunoglobulina (Ig). Cuando se expresan
sobre la supercie de la clula, las molculas HLA clase
I estn unidas en forma no covalente al pptido -2-mi-
croglobulina (-2M), que se codica en un cromosoma
separado. Existen actualmente tres genes de cadena bien
denidos, designados HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-
A y HLA-B representan los productos principales de la
clase I y sirven como blancos para las inmunorrespuestas
mediadas por anticuerpos o por clulas contra tejido tras-
plantado. Su expresin es diferencial, dependiendo del tipo
de clula, con clulas de linaje linfoide con la expresin
ms alta y los hepatocitos y los eritrocitos con el conteni-
do ms bajo. La expresin puede alterarse por mediadores
inamatorios como citocinas y esto es en particular impor-
tante en el trasplante, puesto que la sobrerregulacin puede
promover inmunogenicidad del aloinjerto, o aumentar su
susceptibilidad a una inmunorrespuesta preexistente.
Las protenas HLA clase II dieren de las de la regin
clase I en trminos de estructura, funcin y distribucin.
Consisten de dos cadenas, y , y se expresan sobre la
49
Tipicacin de HLA
Mark Hathaway
482 CAP. 49 TIPIFICACIN DE HLA
supercie celular como heterodmeros . Los genes HLA
clase II con cadenas y se designan HLA-DP, HLA-DQ
y HLA-DR, ambas cadenas se codican dentro la regin
clase-II y con dos subunidades que parecen dominios de
Ig. Los grupos del gen HLA-DR contienen uno extra con
cadena , cuyo producto puede aparearse con cualquier ca-
dena DR. Por consiguiente, tres grupos de genes clase II
pueden dar lugar a cuatro tipos de molculas clase II. La
distribucin de protenas clase II est restringida de ma-
nera principal a los linfocitos B y las clulas profesionales
presentadoras de antgenos (APC), aunque la expresin en
otras clulas es inducible despus de la activacin. La fun-
cin de las molculas clase II se considera tradicionalmen-
te en trminos de su habilidad para estimular las respuestas
de la clula T auxiliadora o helper; sin embargo, la ms re-
ciente evidencia muestra respuestas citotxicas importan-
tes de anticuerpos y de la clula T efectora dirigidas contra
determinantes de la clase II.
Tambin se codican dentro del MHC dos genes TAP.
stos se encuentran en la regin clase II, estrechamente
asociados con dos genes que codican las protenas de bajo
peso molecular del proteosoma. Los genes de la regin clase
III codican, entre otras cosas, los componentes C4 (C4a y
C4b), C2 y el factor B, del complemento junto con aquellos
para la citocina que son factor de necrosis tumoral (TNF y
), la enzima 21-hidroxilasa, que sintetiza esteroides, y dos
protenas de choque trmico, Hsp 70 1 y Hsp 70 2.
Gentica del complejo principal
de histocompatibilidad (MHC)
Los genes codicantes para HLA cadenas clase I y ca-
denas y clase II se unen dentro del MHC. Aunque los
genes que codican para cada cadena se encuentran en re-
giones separadas, varios genes que codicaban por cada
cadena se han identicado dentro de cada regin. Porque
los genes HLA estn en proximidad estrecha uno al otro, la
recombinacin gentica es rara. Por lo tanto, la mayora de
los descendientes hereda un grupo intacto de los alelos pa-
rentales, uno de cada padre. Tales grupos de genes unidos
se conocen como haplotipos. Ciertos alelos, en particular
los haplotipos, se forman con mayor o menor frecuencia, lo
que podra esperarse si los alelos estn en equilibrio gen-
tico. Tal fenmeno se conoce como desequilibrio de liga-
miento y puede reejar el origen reciente de algunos alelos,
orgenes geogrcos y patrones de crianza raciales.
Los productos de los genes HLA clase I y clase II son
codominantes expresados y, por tanto, los individuos hete-
rocigotos deben expresar dos especicidades distintas de
HLA para cada sitio (uno materno, otro paterno). Adems,
debido a que hay tres genes para HLA clase I y cuatro posi-
bles grupos para la clase II, se esperara que cada individuo
exprese tres diferentes MHC clase I y cuatro protenas dife-
rentes clase II. El nmero expresado es de hecho mucho ms
alto, debido a la naturaleza polimrca extrema de los genes
clases I y II; incluso, ms de 70 alelos en el mismo sitio
gentico se han identicado para algunas protenas clase I.
Por esta razn, la probabilidad de genes HLA en dos indivi-
duos diferentes que codican el mismo alelo es demasiado
pequea. Porque las protenas HLA son muy inmungenas,
es necesario conseguir en el trasplante la compatibilidad ms
estrecha posible entre el aloinjerto y el receptor, reduciendo
al mnimo el riesgo de prdida del injerto por rechazo. El
proceso tcnico de la identicacin de la protena HLA en
un individuo se conoce como tipicacin HLA.
La mecnica de tipicacin HLA
Tipicacin serolgica
A travs del tiempo, la reaccin mixta del linfocito (MLR)
se utiliz para detectar la variabilidad de HLA. En esta tc-
nica, las clulas de un receptor potencial se cocultivan con
las clulas estimuladoras de origen donante que se han
irradiado de modo que no puedan responder. Las clulas T
del receptor se estimulan para que proliferen y se diferen-
cien en respuesta a los antgenos HLA dispares, general-
mente como un resultado del reconocimiento de la clula T
CD4
+
de los antgenos HLA clase II y de reconocimiento
de los antgenos clase I por clulas T CD8
+
. As, los recep-
tores compatibles pueden identicarse rpido con base
en su insensibilidad. Aunque esta tcnica se correlaciona
bien con el rechazo, es demasiado sensible y reeja de ma-
nera cercana la propia respuesta de rechazo; su aplicacin
en el escenario clnico es limitada o de ningn valor, puesto
que requiere 5 a 10 das para obtener resultados y es inc-
moda, costosa y tcnicamente difcil de realizar.
Hasta hace poco, el mtodo tradicional que se usaba
para distinguir individuos HLA no idnticos emple anti-
cuerpos. Los antgenos de los sitios HLA-A y B fueron los
primeros que se denieron de este modo, usando aloan-
tisueros que se obtienen de los sujetos inmunizados por
transfusiones sanguneas, embarazo o rechazo del aloinjer-
to renal. Usando esta tcnica, llamada ensayo de microci-
totoxicidad, linfocitos T de la sangre perifrica (antgenos
HLA clase I) y linfocitos B (HLA-DR, -DQ) de receptores
potenciales del injerto de tipo HLA desconocido se incuban
con el antisuero que contiene el anticuerpo HLA de espe-
cicidad caracterizada. Estas clulas entonces se exponen
al complemento. Si el anticuerpo reacciona con protenas
HLA expresadas en la supercie celular, el complemento
es activado y las clulas son destruidas, lisis mediada por
el complemento. En ausencia de la reaccin, ninguna lisis
TIPIFICACIN MOLECULAR 483
ocurre. La destruccin se visualiza en general usando un
combinado de bromuro de etidio/naranja de acridina que
colorea las clulas viables de verde y las clulas muertas de
rojo. La destruccin se analiza semicuantitativamente de-
terminando el porcentaje de clulas muertas en cada pozo.
As, donde la lisis ocurre, la especicidad del anticuerpo
identica qu protenas HLA se expresan.
Diferentes tipos de error son posibles con la tipicacin
serolgica. La falla para identicar un antgeno raro o de
reaccin cruzada es un problema frecuente. Esto sucede
principalmente porque el antisuero pertinente no se utiliza
o no est disponible. El desequilibrio de ligamiento, los
orgenes geogrcos y los patrones de casamiento racia-
les tambin son factores que contribuyen. Por otra parte,
algunos antgenos se expresan en una frecuencia ms baja
o nula en ciertas poblaciones. Tales errores ocurren con
ms probabilidad en laboratorios que usan cantidades li-
mitadas de antisuero. Adems, la mala interpretacin de
las reacciones del antisuero produce errores. El antisuero
puede contener ms de un anticuerpo, cada uno con espe-
cicidades de HLA que dieren, e incluso los anticuerpos
HLA monoespeccos con frecuencia reaccionan en forma
cruzada con otros antgenos HLA. Adems, la tipicacin
HLA de antgenos DR que usa la serologa es, en parti-
cular, susceptible a la mala interpretacin, puesto que los
linfocitos B presentan ms reacciones cruzadas con una
amplia gama de antgenos DR y son ms susceptibles a la
lisis no especca mediada por el complemento y producen
resultados falsos positivos. Las variaciones tcnicas tam-
bin explican un 15 a 30% del error entre los laboratorios
en la tipicacin serolgica. La variacin en la actividad
del complemento entre los lotes y la calidad del antisuero
son los factores contribuyentes principales.
La serologa es un mtodo rpido para la tipicacin
HLA; sin embargo, los reactivos que se emplean no son
bastante especcos para determinar la identidad estruc-
tural precisa de las molculas MHC en individuos gen-
ticamente no idnticos. Esto puede alcanzarse slo por el
anlisis directo de los genes MHC.
Tipicacin molecular
Polimorsmo de la longitud de los fragmentos
de restriccin (RFLP)
La clonacin y el mapeo moleculares intensos de la regin
clase II del MHC recientemente se consiguieron. El anli-
sis extenso de la organizacin de las secuencias especcas
del gen, usando una tcnica que se conoce como Southern
blotting, revela la existencia de polimorsmos en los si-
tios de reconocimiento de un grupo de enzimas llamadas
endonucleasas de restriccin. Estos polimorsmos en si-
tios de restriccin o corte son, en la mayor parte de los
casos, especcos de cada alelo. Por tanto, el mapeo y la
aclaracin de los patrones del polimorsmo en la longitud
del fragmento de restriccin (RFLP) asociados con alelos
HLA deben facilitar la identicacin del alelo en cualquier
individuo. La viabilidad de la tipicacin HLA mediante
deteccin de RFLP usando sondas de DNA la sugirieron
primero Wake y cols. (1982), quienes reportaron polimor-
smos en la regin HLA-DR usando la longitud comple-
ta de un cDNA de DR1. La tipicacin RFLP de alelos
HLA-DR y HLA-DQ usando sondas de cDNA de longitud
completa para DR, DQ y DQ se utilizan mucho desde
entonces en un esfuerzo por denir con exactitud la rela-
cin entre RFLP y las especicidades HLA clase II deni-
das serolgica o celularmente.
El anlisis RFLP se realiza sobre muestras de DNA ge-
nmico que por lo comn se obtienen de leucocitos con
cubierta brillante. El DNA de longitud completa se ex-
trae va digestin de los leucocitos con dodecil sulfato de
sodio (SDS)/proteinasa K y se sujeta a la digestin por res-
triccin usando una endonucleasa de restriccin Taq-1 o
MSP-1. El resultado de la restriccin entonces se separa
por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se transere a
una membrana de nitrocelulosa, usando Southern blotting.
Los patrones del fragmento de restriccin se visualizan por
hibridacin de la banda con sondas de cDNA radiomarca-
das en forma correcta, que entonces se exponen a una placa
de rayos-X. Los patrones de la seal de hibridacin que se
generan son entonces comparados con tablas de tamao de
referencia para permitir la identicacin de especicidades
HLA-DR y HLA-DQ que dieren.
Las cualidades de esta tcnica son que las muestras mlti-
ples (>30) pueden procesarse en forma simultnea. Tambin,
las especicidades allicas DR, DQ y DQ es posible
identicarlas a partir de una sola muestra, puesto que los re-
sultados de la restriccin pueden transferirse e hibridarse con
un cDNA especco del gen HLA (p. ej., DR) y la copia
se despega por medio de lavados y se hibrida con un cDNA
de la especicidad HLA diferente (p. ej., DQ o DQ).
Sus desventajas son que RFLP requiere el manejo muy cuida-
doso de la muestra y de la extraccin del DNA. El DNA debe
ser de longitud completa, sin degradacin parcial, puesto que
sta puede alterar radicalmente el patrn de restriccin, crean-
do un bandeo incorrecto. Adems, no puede utilizarse en cir-
cunstancias de un trasplante clnico de donadores cadavricos
tipo HLA por los contratiempos inherentes, ya que es posible
que se requieran hasta tres semanas para obtener los resulta-
dos. Por otra parte, los patrones del bandeo del fragmento de
restriccin son de una complejidad elevada y la hibridacin
cruzada de secuencias compartidas de las sondas de cDNA
signica que esta tcnica requiere experiencia considerable
en la interpretacin. Sin embargo, el ltimo problema puede
evitarse usando sondas de cDNA de regin corta, o especcas
del exn. En trminos tcnicos, el anlisis RFLP no identica
directamente las secuencias del DNA polimrco en la re-
gin codicante para antgenos HLA, sino en sitios de restric-
cin relacionados de manera importante con ellas. Adems,
confa en el desequilibrio de ligamiento entre los alelos HLA-
DR y HLA-DQ para diferenciar entre ciertos alelos HLA-DR
que muestren patrones RFLP similares, por ejemplo, DR3
(DQ2) de DR6 (DQ6) y DR7 (DQ2) de DR9 (DQ9). Tal
ejercicio necesita gran precaucin al analizar poblaciones no
caucsicas, puesto que las asociaciones particulares de HLA-
DR-DQ no son siempre iguales. Una evidencia ms reciente
muestra, desde entonces, que tales asociaciones no son siem-
pre verdades en algunas poblaciones caucsicas.
En la actualidad, el mtodo ms conveniente para identi-
car los alelos MHC emplea una tcnica conocida como
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). ste es un m-
todo rpido de secuencias particulares del DNA genmi-
co que se amplican de manera selectiva. Para amplicar
regiones especcas de DNA, como un exn polimrco
de un gen MHC particular, cebadores oligonucletidos
sintticos, complementarios a la secuencia de DNA que
anquean la regin de inters, tienen que sintetizarse. El
DNA genmico, que se extrae en un procedimiento idnti-
co a aquel para el anlisis RFLP, entonces se desnaturaliza
a temperatura alta en presencia de concentraciones exce-
sivas de dos oligonucletidos sintticos. El enfriamiento
permite que las hebras de DNA se unan nuevamente for-
mando la cadena doble, de tal manera que ambos cebado-
res se unan a su secuencia complementaria sobre el DNA
genmico. La enzima DNA polimerasa termoestable (Taq
polimerasa), que se obtiene de la bacteria Thermus aquati-
cus, agregada a la reaccin, ahora alarga al cebador, usando
DNA genmico entre los dos cebadores como su plantilla.
El DNA replicado es entonces desnaturalizado en hebras
simples por la temperatura alta y la mezcla se enfra para
facilitar nuevos ciclos de templado y replicacin. El primer
producto de la extensin es incierto en longitud, pero todos
los ciclos subsecuentes crean productos de la longitud de-
nida porque la plantilla termina en el primer cebador. Los
ciclos entonces se repiten hasta que suciente DNA est
disponible para la secuenciacin.
Una vez asociado el DNA con un alelo particular de-
nido por la secuencia, se pueden construir sondas del
oligonucletido a partir de regiones donde se presentan
diferencias. Este oligonucletido especco de la secuen-
cia (SSO) o sondas de oligonucletido especco de alelo
(ASO) pueden entonces hibridizarse para el DNA blanco
especco amplicado por PCR Southern blotting, usan-
do una tcnica llamada PCR-SSO/PCR-ASO. Tales tc-
nicas son rpidas, econmicas y una manera sensible de
denir la estructura del gen MHC. Sin embargo, las tcnicas
de tipicacin PCR-SSO/ASO requieren la preparacin de
transferencias mltiples y de sondas marcadas, por lo me-
nos una sonda para cada alelo en cada sitio. La tipicacin
RFLP, en cambio, requiere a lo sumo dos transferencias y
tres sondas. Los contratiempos al emplear PCR-SSO/ASO
son similares a DNA-RFLP pero la preparacin del DNA
blanco es ms rpida (5 a 6 h comparadas con las 24 h); la
transferencia y el sondeo requieren un tiempo similar. As,
como en RFLP, esta tcnica slo se emplea en aplicaciones
clnicas no urgentes y, por tanto, no pueden usarse en do-
nantes cadavricos tipo HLA.
La tipicacin HLA por tcnicas moleculares ha revolu-
cionado por la introduccin reciente de un mtodo mltiple
del cebador especco de secuencia basado en la PCR (PCR-
SSP). La clonacin molecular intensiva de los genes HLA
clases I y II facilita la construccin de una serie completa de
SSP. PCR-SSP mantiene la especicidad allica de cada par
de cebadores, tanto por el rigor de las condiciones de la re-
accin PCR como por el diseo de los cebadores del oligo-
nucletido, que explotan la capacidad de la Taq polimerasa
de amplicar secuencias del DNA blanco que son desiguales
a la secuencia del cebador. En reacciones donde la comple-
mentariedad entre el DNA y el cebador est completa, la
eciencia de la amplicacin es 100% y el DNA blanco se
replica. Cuando hay uno o ms pares de bases desiguales en-
tre el DNA blanco y el extremo 3 del cebador, la eciencia
de la amplicacin es 0% y no hay productos sintetizados.
Este sistema para la tipicacin HLA clase I y clase II utiliza
192 reacciones de PCR para denir genes HLA-A, HLA-B,
HLA-C, DR1, DR3, DR4, DR5 y DQ1. Los produc-
tos de reaccin se separan electroforticamente, usando gel
de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio, y se visua-
lizan sobre un transiluminador de luz UV.
Completos, los tipos HLA pueden identicarse en una
fotografa polaroid, por tanto, a este proceso se le ha llama-
do fototipicacin. Esta tcnica tiene sensibilidad mayor
o igual que la serologa, sin problemas de reaccin cruzada,
y con ella puede distinguirse la mayor parte de las combina-
ciones allicas heterocigotas. Tiene la ventaja sobre DNA-
RFLP y tcnicas de tipicacin basadas sobre PCR-SSO/
ASO en que no se requiere transferencia y sondeo y es por
tanto ms barata y ms rpida de realizar. Por otra parte, la
tipicacin HLA, de sangre completa a los resultados, puede
obtenerse en 3 horas, haciendo esta tcnica comparable a la
serologa y conveniente para la tipicacin HLA de donantes
cadavricos. De hecho, PCR-SSP ahora reemplaza a tcni-
cas serolgicas en muchos laboratorios de comprobacin de
la histocompatibilidad. Otra ventaja de DNA-RFLP es que
la PCR-SSP no confa en el DNA de longitud completa para
producir resultados, por tanto, las muestras parcialmente de-
gradadas pueden utilizarse.
La tipicacin con base en el DNA va amplicacin por
PCR ahora es un procedimiento comn de laboratorio. La
tipicacin HLA requiere un segundo anlisis para identi-
car los alelos amplicados. Segn lo detallado antes, varios
tipos de ensayos pueden utilizarse para efectuar esto, pero
recientemente se desarrollaron nuevos equipos de tipica-
cin SSO que utilizan un sistema multiplex homogneo,
de modo que todos los SSO se analizan simultneamente
y por tanto el ensayo completo se realiza en un tubo con
la adicin de un reactivo. PCR-SSP utiliza concentraciones
equimolares de cebadores directos e inversos, as se produ-
cen productos de doble hebra. Sin embargo, si un cebador
est en exceso, productos de una hebra (as como de doble
hebra) surgen en el agotamiento del cebador limitante. Una
vez desnaturalizados, ambos pueden hibridizar sondas SSO.
El desarrollo ms reciente une sondas SSO biotiniladas a
microesferas que pueden entonces analizarse usando un
uoroanalizador. Cada microesfera tiene una marca nica
que puede distinguirse con el analizador, y cada una lleva un
diferente SSO biotinilado, por tanto una mezcla de la sonda
se distingue en virtud de su asociacin con una microesfera
particular. La unin de la sonda se visualiza usando estrep-
tavidina-PE. La seal relativa de cada sonda se utiliza para
asignar positividad y negatividad con DNA amplicado.
Esto provea la informacin requerida para asignar un feno-
tipo HLA y tena la ventaja de no requerir productos qumi-
cos peligrosos. Sin embargo, sta y otras tcnicas basadas
en PCR no estn desprovistas de problemas. La desviacin
de los protocolos denidos de PCR, DNA de mala calidad
(en trminos de pureza) y las mquinas inadecuadas de PCR
pueden producir fallas individuales de PCR que dan lugar
a la asignacin incorrecta o errnea del antgeno. Adems,
la experiencia molecular de alto nivel de estas tcnicas, no
menos exigente que en la serologa, requiere entrenamiento
y experiencia considerables para realizarse correctamente.
Tipicacin basada en la secuenciacin
Las tcnicas de secuenciacin del DNA se desarrollaron
originalmente en la dcada de 1970, pero ahora han avan-
zado lo suciente para considerarse mtodos rpidos, eco-
nmicos y sencillos para la tipicacin HLA. Dos tcnicas
bsicas han surgido: la tcnica de degradacin qumica
desarrollada por Maxim y Gilbert (1977), y el mtodo en-
zimtico, por Sanger y cols. (1977). Varios informes que
detallaban datos de la secuencia HLA clase I y los de la
clase II se publicaron a mediados de la dcada de 1980.
Sin embargo, en aquel momento, el grado del polimors-
mo de HLA, junto con las tcnicas laboriosas requeridas
para amplicar regiones del DNA, signic que la secuen-
ciacin no podra considerarse realista para la tipicacin
del tejido. Esta consideracin se invierte rpido despus de
la introduccin de mtodos basados en la PCR de ampli-
cacin del DNA. Los acercamientos iniciales utilizaron el
RNA con xito para secuenciar los alelos clases 1 y 2, que
son simples y rpidos de aislar, y simplicaron la ampli-
cacin de las regiones cortas del exn requeridas. Su des-
ventaja al principio era el requerimiento de material viable
para el aislamiento del RNA. Adems, el RNA es inestable,
haciendo la extraccin, en particular del material de archi-
vo, notoriamente difcil. Al mismo tiempo, las tcnicas de
tipicacin por secuenciacin basadas en el DNA tambin
se desarrollaron (stas se emplean en la actualidad en la
mayor parte de los laboratorios que tipican tejido).
El mtodo ms popular para la secuenciacin del DNA
es la tcnica de la terminacin de cadena mediada por di-
deoxi, la cual a su vez se desarrolla a partir de una tcnica
original desarrollada en 1975. De manera breve, esta tcni-
ca implica la amplicacin de la regin que se secuencia,
que entonces se desnaturaliza para producir DNA de cade-
na sencilla (ssDNA). Un cebador que secuencia es entonces
templado para el ssDNA y la cadena del DNA se extiende
en direccin 5 a 3. La extensin termina si un dideoxinu-
cletido 23 se incorpora en lugar de uno convencional. Se
establecen cuatro reacciones, cada una con uno de cuatro
nucletidos dideoxi as como los cuatro deoxinucletidos.
Asimismo, cuatro grupos separados de fragmentos de ca-
dena terminada se producen. Estos fragmentos permanecen
complementarios al ssDNA que ha actuado como planti-
lla y, calentando o usando un agente desnaturalizante, los
fragmentos de cadena terminada se pueden liberar de la
plantilla y separarse empleando electroforesis de alta reso-
lucin en gel desnaturalizante. La secuencia del DNA ori-
ginal entonces se deduce comparando la posicin relativa
de los productos en los cuatro carriles del gel.
Aunque el mtodo bsico permanece inalterado, se han
hecho varias mejoras que elevan la velocidad, simplicidad y
conabilidad de secuenciacin del DNA. stas incluyen el
uso de fragmentos de PCR, como plantillas, que contribu-
yen con un mtodo rpido para obtener cantidades grandes
de material de la plantilla y el uso de un cebador biotinilado,
lo cual signica que el producto PCR marcado con bioti-
na puede extraerse rpidamente usando perlas magnticas
marcadas con estreptavidina. Las mejoras en enzimas que
se emplean para la secuenciacin tambin contribuyen. La
enzima T7 DNA polimerasa se preere ahora sobre la po-
limerasa del fragmento Klenow porque incorpora bases de
DNA en la cadena que se extiende a una tasa ms uniforme.
La DNA polimerasa derivada de Thermus aquaticus se le
disea para que sea ms termoestable, que a su vez crea ms
TIPIFICACIN MOLECULAR 485
productos. Los nucletidos radiomarcados se reemplazan
cada vez ms por mtodos de marcaje uorescente como un
medio de detectar productos secuenciales. Adems, el uso
de colorantes de cuatro colores signica que los productos
pueden correrse en un solo carril del gel. Uniendo cada co-
lorante para separar ddNTPS signica tambin que las reac-
ciones pueden llevarse a cabo en un solo tubo. Tambin est
disponible una gama amplia de secuenciadores automticos
que detectan productos marcados con uorescencia despus
de electroforesis con gel en lmina o capilar vertical. Es
ms, todas estas mquinas transeren datos directos a una
computadora desviando la necesidad de un anlisis manual
de datos brutos, ya que los datos se convierten de manera
automtica en informacin de la secuencia.
Como con la mayor parte de las tcnicas, la secuenciacin
no est libre de problemas. Las combinaciones ambiguas del
alelo son el problema ms grande. Esto sucede en todos los
sitios y ocurre cuando dos alelos producen una secuencia he-
terocigota que es idntica a la secuencia de par de alelos dife-
rente. Pueden existir tambin problemas con PCR y el diseo
del cebador secuenciador. Se pensaba que la secuenciacin
sostena una ventaja sobre la otra tipicacin de DNA, en tan-
to que detecta los alelos previamente no identicados. Esto es
verdad a menos que el nuevo alelo contenga polimorsmos
en las posiciones correspondientes al extremo 3 de la PCR o
cebadores secuenciadores. Adems, la tipicacin basada en
la secuencia debe secuenciar el gen completo bajo estudio,
ya que con secuencias ms cortas, mayores son las oportuni-
dades de que los nuevos polimorsmos sean errados. El uso
de cebadores mltiples para PCR y para la secuenciacin
puede dar lugar a una amplicacin o secuenciacin prefe-
rencial de un alelo particular. Esto conduce a una asignacin
incorrecta de homocigosidad. Las tcnicas de tipicacin con
base en la secuenciacin requieren an intenso trabajo y equi-
po y reactivos costosos. Este es probablemente el obstculo
ms grande para su adopcin como tcnica de lnea primaria
para los laboratorios de HLA. Por otra parte, aunque la tipi-
cacin con base en la secuenciacin aporta una tipicacin de
resolucin muy alta, no hay hasta ahora evidencia que sugiera
que el tal emparejamiento HLA de alta resolucin sea impor-
tante en el trasplante del rgano slido. Para el trasplante de
mdula sea, sin embargo, el cuadro es diferente, con eviden-
cia clara que el emparejamiento afecta el resultado.
Resumen
Las glucoprotenas de la supercie celular del MHC juegan
un papel central en la inmunologa del trasplante. El MHC
se determina originalmente como la barrera principal para
el trasplante debido a la fuerte respuesta de rechazo de los
linfocitos T hacia los antgenos MHC presentes sobre el te-
jido injertado. Las protenas HLA del MHC humano estn
entre las ms polimrcas conocidas, por consiguiente la
probabilidad de dos individuos sin relacin que expresen
los mismos alelos HLA es muy pequea. Puesto que el
reconocimiento del antgeno de la clula T est profunda-
mente inuido por polimorsmo MHC, las protenas HLA
de donadores del trasplante y los receptores potenciales de-
ben identicarse y la posible compatibilidad ms estrecha
se localiza para minimizar el riesgo de prdida del injerto
por rechazo. La tcnica de identicacin del HLA, llamada
tipicacin de tejido, se usa en medicina clnica para la
compatibilidad del donador con el receptor en programas de
trasplante cadavrico, pero tambin es posible usarla para
estudiar el papel del MHC en la determinacin de la suscep-
tibilidad hacia condiciones alrgicas y autoinmunitarias.
La genotipicacin del MHC en humanos se realiz
originalmente por la reaccin linfoctica mixta y despus
por la serologa. Debido a contratiempos metodolgicos
inherentes, esos mtodos se reemplazaron por tcnicas que
analizan el nivel de la expresin gentica. Los genes -DR
y -DQ de la regin MHC clase II son los primeros en tipi-
carse para HLA por DNA-RFLP. Esta tcnica se reem-
plaz, en gran parte, por mtodos con base en la PCR ms
rpidos. La clonacin y el mapeo moleculares del MHC
condujeron al desarrollo reciente de una nueva tcnica ba-
sada en la PCR que tipica los antgenos de las regiones
clases I y II. Al emplear esta tcnica, la genotipicacin
del HLA puede realizarse en una sola muestra usando PCR
mltiple y un solo gel, con resultados que se obtienen a
partir de una fotografa polaroid. Este sistema sustituye,
o est sustituyendo, a todos los anteriores procedimientos
serolgicos/moleculares con base en la tipicacin HLA,
en la mayor parte de laboratorios de pruebas de histocom-
patibilidad. Las tcnicas con base en la secuencia del DNA
aportan un mtodo de tipicacin de alta resolucin muy
empleado en situaciones de trasplante de mdula sea.
SECCIN 9
PATOLOGA MOLECULAR
Los recientes avances en tecnologas moleculares han re-
volucionado los estudios genmicos, transcriptmicos y
protemicos. Sin embargo, un inconveniente potencial
serio en la aplicacin de estas tecnologas es la heteroge-
neidad inherente de tejidos resecados quirrgicamente.
Resultados errneos pueden generarse, causando distor-
sin en los anlisis subsiguientes a menos que el material
de entrada est libre de poblaciones celulares excedentes
para los requerimientos. La microdiseccin por lser de los
cortes de tejido y de las preparaciones citolgicas es un
valioso recurso en sentido ascendente para facilitar la ob-
tencin de poblaciones celulares y superar la barrera de la
complejidad del tejido. Puede acoplarse con una variedad
de tecnologas moleculares en sentido descendente para
generar resultados vlidos y signicativos.
La microdiseccin por lser y captura de tejido (LCM)
es una tcnica que se desarroll originalmente en el Insti-
tuto Nacional de Cncer. Desde sus inicios sufri varias
modicaciones, en la actualidad se dispone de una gama de
instrumentos, los cuales se clasican en dos categoras,
dependiendo del tipo de lser empleado (infrarrojo [IR] o
ultravioleta [UV]).
La LCM puede aplicarse a una variedad de preparacio-
nes tisulares, desde secciones congeladas hasta secciones
jadas e incluidas en parana o preparaciones citolgicas.
La tincin de rutina usando hematoxilina y eosina o azul
de toluidina se utiliza, por lo general, para ayudar en la
identicacin morfolgica del tipo celular de inters y para
facilitar el recorrido alrededor de una seccin tisular. Sin
embargo, las tinciones histoqumicas, inmunohistoqumi-
cas o inmunouorescentes pueden utilizarse tambin para
permitir la seleccin de clulas, segn las caractersticas
fenotpicas y funcionales. Dependiendo del material de ini-
cio y de los requerimientos de los protocolos en sentido
descendente seleccionados, el DNA, mRNA o la protena
pueden extraerse y analizarse con xito. De esta manera
la identicacin de los biomarcadores celulares especcos
de la enfermedad o de blancos teraputicos potenciales se
logra con exactitud.
Esta tecnologa es til en la investigacin de cncer. Una
barrera importante para los investigadores de cncer yace
en la dicultad de caracterizar los cambios moleculares que
se producen durante la progresin del cncer, donde las c-
lulas premalignas progresan para formar un tumor maligno.
La identicacin de protenas de expresin baja o de sobre-
expresin durante la progresin del tumor que pueden ayu-
dar en la deteccin temprana del cncer es obstaculizada
por la subpoblacin celular pequea en la cual estas prote-
nas existen. La microdiseccin por captura lser permite a
los investigadores comparar clulas normales con clulas
enfermas aislando subpoblaciones distintas a partir de sec-
ciones de tejido teidos.
LCM-PixCell y AutoPix de Arcturus
La LCM facilita el incremento de la sensibilidad y de la
exactitud de los ensayos moleculares iniciando con mues-
50
Microdiseccin por lser y captura de tejido
Orla Sheils, Paul Smyth, Esther ORegan, Stephen Finn,
Richard Flavin y John OLeary
490 CAP. 50 MICRODISECCIN POR LSER Y CAPTURA DE TEJIDO
tras de tipo celular homogneo y de estructuras multice-
lulares aisladas a partir de muestras tisulares o citolgicas
completas. Este acercamiento nico a la microdiseccin,
desarrollado en 1996 en los Institutos Nacionales de Salud
(EUA) y disponible exclusivamente de la compaa Arc-
turus, asegura que las molculas biolgicas, como RNA y
DNA, permanezcan indemnes durante el proceso de micro-
diseccin. El anlisis molecular en sentido descendente de
estas molculas produjo resultados exactos y seguros que
condujeron a ms de 300 publicaciones revisadas a fondo
por investigadores independientes.
La LCM tiene gran exibilidad respecto a preparaciones
tisulares y con jacin celular. Extrae clulas con ecacia a
partir de secciones tisulares incluidas en parana, congela-
das y preparadas usando una amplia variedad de colorantes
diferentes, de supercies de laminilla y de protocolos.
Con base en la adhesin de las clulas seleccionadas a
una membrana termoplstica, la LCM utiliza un lser in-
frarrojo de baja potencia para fundir la membrana sobre las
clulas de inters. La parte microscpica del instrumento
PixCell II LCM utiliza una palanca de control para dirigir
su mecanismo. Los conos especiales (g. 50-1) se car-
de milisegundos y forma un compuesto con el tejido. Los
impulsos del lser, por lo general 0.5 a 5.0 ms de duracin,
pueden repetirse mltiples veces a travs de la supercie
entera del capuchn, que permite el aislamiento rpido de
una gran cantidad de clulas. Los fragmentos tisulares se-
leccionados se recoleccionan por la elevacin simple del
capuchn, el cual entonces se transere a un tubo para mi-
crocentrifugado que contiene soluciones amortiguadoras
requeridas para el aislamiento de las molculas de inters.
El dimetro mnimo del rayo lser del microscopio LCM
es actualmente de 7.5 m, el mximo de 30 m. Despus de
este procedimiento, las biomolculas se extraen de las c-
lulas usando cido nucleico propietario o genrico o equi-
po de extraccin de la protena.
El proceso de captura celular es directo y fcil de realizar
y existe una gama de productos optimizados para las aplica-
ciones especcas en sentido descendente. El Sistema PixCell
II LCM (g. 50-2) no utiliza radiacin UV pulsada u otras
tcnicas indirectas de captura, una caracterstica que, los fa-
Figura 50-1 Fotomicrografa electrnica de barrido de un cono
de CapSure LCM con una sola clula capturada con lser sobre el
frotis termoplstico. Cortesa de Arcturus.
gan dentro del montaje, a travs del cual el lser se enfoca
sobre las clulas de inters. Estos conos, cubiertos con una
pelcula termoplstica, son colocados sobre el corte del te-
jido o sobre la muestra citolgica. El cono se suspende en
un brazo de transporte mecnico y se coloca sobre el rea
deseada de la seccin deshidratada del tejido bajo presin
estndar. Despus de la seleccin visual de las clulas de-
seadas, guiada por un haz de posicionamiento, la activa-
cin del lser conduce a la fusin focal de la membrana de
etileno acetato de vinilo (EVA). La formacin de una pro-
tuberancia na del plstico fundido, que tiende un puente
sobre el hueco entre el capuchn y el tejido y se adhiere a
la clula blanco, signica que cuando el capuchn se le-
vanta, las clulas seleccionadas siguen unidas y se captu-
ran por anlisis adicional. El polmero resolidica dentro
Figura 50-2 Instrumento PixCell II de Arcturus.
bricantes arman, reduce la prdida potencial de la muestra o
la introduccin de cargas electrostticas que hacen la muestra
difcil de manejar. La energa baja del lser IR tambin evita
efectos fotoqumicos potencialmente perjudiciales.
Existe un sitio de trabajo que archiva la imagen opcional
disponible con el Sistema de PixCell II LCM. Este dispo-
sitivo provee una interfase de uso fcil para la grabacin y
almacenaje, tanto de las imgenes pre como de las posmi-
crodiseccionadas con anotaciones opcionales del usuario.
Un avance reciente en el repertorio de Arcturus, dentro
de la tecnologa LCM, es el sistema automtico AutoPix

LCM. La ventaja principal de este instrumento (g. 50-3)
sobre el PixCell II es que toda la parte y los mecanismos
pticos, cmaras fotogrcas, ltros y objetivos estn total-
mente controlados por computadora. Esto permite que reas
dentro de numerosos campos del panorama sean visualiza-
das, seleccionadas, y capturadas en forma simultnea. Ade-
ms, la clula y los algoritmos del reconocimiento de la
Figura 50-3 Instrumento AutoPix de Arcturus.
Figura 50-4 Pasos involucrados en LCM.
LCM-PIXCELL Y AUTOPIX DE ARCTURUS 491
Figura 50-5 Principio bsico de LCM de Arcturus.
492 CAP. 50 MICRODISECCIN POR LSER Y CAPTURA DE TEJIDO
caracterstica incorporados permiten al usuario programar
el software para localizar y enfocar clulas o regiones espe-
ccas de inters en varias muestras. El sistema (gs. 50-4,
50-5 y 50-6) tambin tiene la capacidad de agrupar clulas
o regiones microdiseccionadas, a partir de muestras ml-
tiples, en una sesin facilitando la recoleccin de material
microdiseccionado.
Microdiseccin con microrrayo lser
Otra tecnologa avanzada disponible en el comercio de la
microdiseccin lser est disponible bajo la forma de micro-
diseccin con microrrayo lser (LMM; PALM-Mikrolaser
Technologic, Bernried, Alemania). El principio primordial
que distingue entre LCM y LMM es la eleccin del lser. El
sistema PALM utiliza un lser UV con un enfoque muy alto
para cortar o eliminar clulas seleccionadas por ablacin de
estructuras circundantes.
El micro-rayo PALM (g. 50-7) es un microscopio
innovador diseado para el aislamiento y recoleccin de
tejido, clulas u organelos biolgicos no contaminados,
que se cortan directamente de secciones histolgicas o de
cultivos celulares para el anlisis en sentido descendente,
tpicamente para RNA o contenido protenico (g. 50-8).
Un lser UV-A pulsado de nitrgeno a 337 nm se acopla a
la trayectoria epiuorescente o de campo brillante del mi-
croscopio y se programa para trazar cualquier patrn cor-
tante deseado antes de transferir especmenes, ya sea como
fragmentos a partir de portaobjetos histolgicos normales,
clulas intactas en portaobjetos revestidos con membranas
especiales, o como clulas vivas en placas de cultivo re-
vestidas con membranas, directamente dentro de un tubo
Eppendorf para el anlisis adicional.
Varias aplicaciones adicionales estn disponibles con el
sistema PALM
. ste utiliza un lser UV pulsado con ca-

lidad de un haz alto, que se interconecta dentro del micros-
copio y se enfoca a travs de un objetivo a un tamao del
punto del haz <1 m de dimetro. Puede usarse la densidad
del fotn muy alta en el enfoque del lser estrecho para
separar o para eliminar estructuras biolgicas por ablacin,
permitiendo realizar microciruga sobre clulas y molcu-
las o para el micropreparado de clulas nicas y de partculas
subcelulares. El microrrayo es capaz de disecar lamentos
citoplasmticos, agelos o colas del espermatozoide. Ade-
ms, puede realizarse microinyeccin inducida por lser,
por ejemplo, en el rea nuclear de clulas vivas, causando
transporte de material dentro de la clula sin herramientas
mecnicas o vectores virales.
Figura 50-6 Dibujo animado que representa cmo un rayo lser se
enfoca a travs de una pelcula para disecar clulas individuales.
Figura 50-7 Instrumento para microdiseccin con microrrayo
PALM.
Figura 50-8 Fotografas que muestran cmo la LPC se logra a partir de clulas en un ltro hasta cuando las clulas son recoleccionadas.
Los lseres de los sistemas MicroLaser de PALM

se in-
terconectan dentro de un microscopio de investigacin va
trayectoria epiuorescente. Un objetivo de abertura num-
rica alta enfoca los lseres sobre el plano del objeto, lo que
produce tamaos del punto <1 m de dimetro. El sistema
est equipado de una parte motorizada del microscopio,
controlada por computadora o de un micromanipulador, o
ambos (PALM
RoboStage y PALM

CapMover). Los sis-
temas se enfran con aire, la base se opera con interruptor y
se controlan por el ratn de la computadora. Todos los sis-
temas pueden equiparse con uorescencia y con el software
avanzado de Metafer P para el reconocimiento del patrn.
Leica AS LMD
El Leica AS LMD (g. 50-9) es otro sistema que ofrece
microdiseccin exacta por lser de clulas o de grupos de
biolgico, y es un componente invaluable de protocolos
basados en el tejido dentro de las reas genmicas funcio-
nales, protemicas y genmicas.
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Figura 50-9 Instrumento Leica AS para microdiseccin por lser.
clulas dentro de preparaciones para PCR, RT-PCR y pro-
temicos. Este sistema es una plataforma de microdiseccin
de tercera generacin. Fue desarrollado combinando la
arquitectura del microscopio vertical automtico, el con-
trol ptico tridimensional del rayo lser para diseccin y
del rea disecada, el muestreo sin contacto del tejido y el
manejo motorizado posdiseccin.
La LCM contina en desarrollo y se extiende como una
tcnica con avances en la instrumentacin y en el control
computarizado de la funcin bsica. Tcnicas unicelulares
ms precisas crean y se acoplan con protocolos o equipo de
extraccin por proveedores de aplicaciones en sentido des-
cendente. En un tiempo relativamente corto, la LCM se ha
aanzado como una herramienta inestimable para la ob-
tencin de poblaciones celulares puras a partir de material
LEICA AS LMD 493
(b)
51
Anlisis del gen por reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) en tiempo real
Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Introduccin
El anlisis cuantitativo de la reaccin en cadena de la po-
limerasa en tiempo real es una modicacin de la tcnica
original de PCR, que implica la deteccin y la medicin
conables de los productos generados durante cada ciclo
de la reaccin en cadena de la polimerasa. La tcnica con-
fa en la deteccin de productos especcos de PCR, con
base en el uso de una sonda marcada con uorescencia y
diseada para hibridar dentro de la secuencia blanco del
producto de PCR. Durante el ciclo de PCR, la deteccin
de la seal uorescente, que se incrementa, es proporcional
a la acumulacin de los productos de la amplicacin. Por
tanto, la medicin de la uorescencia en una muestra parti-
cular emite una seal que se asocia especcamente con el
blanco amplicado y se relaciona en forma cuantitativa con
la cantidad de producto de PCR.
La PCR en tiempo real se puede realizar usando una
variedad de tecnologas, incluyendo los ensayos con la 5
nucleasa, iniciadores de horquilla, sondas Scorpion, co-
lorantes intercalantes, por ejemplo, verde SYBR y FRET
(tecnologa de la transferencia de energa por resonancia li-
bre), y empleando sistemas de hibridacin por doble sonda
(faro molecular). En este captulo, se discuten los ensayos
de la 5 nucleasa conocida como TaqMan

de reaccin en
cadena de la polimerasa, y sus aplicaciones para el uso en la-
boratorios de patologa.
Qumica de la reaccin en cadena
de la polimerasa en tiempo real
Colorantes de unin a DNA, SYBR green (verde)
La base de los mtodos de deteccin de secuencia no espe-
cca es el uso de colorantes intercalantes, como el verde
SYBR o el bromuro de etidio (g. 51-1a). El colorante li-
bre exhibe poca uorescencia en solucin, pero durante la
etapa de extensin de PCR las cantidades crecientes del
colorante intercalado se unen al DNA naciente de doble
hebra. La incorporacin del verde SYBR dentro de una
reaccin de PCR permite la deteccin de la acumulacin
del producto monitoreando el aumento en la emisin de
uorescencia en tiempo real. ste proporciona mayor
exibilidad eliminando la necesidad de sondas uores-
centes especcas del blanco; sin embargo, es importante
observar que los iniciadores que se emplean determinan
la especicidad total de la reaccin. Adems, debido a la
presencia de cualquier DNA de doble hebra es capaz de ge-
nerar uorescencia, la especicidad del ensayo es similar a
la PCR convencional, y los problemas pueden encontrarse
con la unin del colorante a la amplicacin no especca
y a dmeros del cebador. La especicidad se mejora gene-
rando una curva de disociacin para detectar la amplica-
cin no especca (Ririe y cols., 1997). El anlisis de la
curva de disociacin se realiza despus de una PCR ter-
496 CAP. 51 ANLISIS DEL GEN POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) EN TIEMPO REAL
minada. Esto se logra elevando lentamente la temperatura
de la reaccin de PCR de 65 a 95C (sobre la tempera-
tura de fusin del fragmento amplicado) mientras que
continuamente se recolectan los datos de la uorescencia.
Cuando la temperatura aumenta, el producto de PCR se
desnaturaliza, creando un pico de fusin caracterstico a
temperatura de fusin del amplicn, que es distinguible de
artefactos de la amplicacin que se funden a temperaturas
ms bajas (g. 51-1b).
Faros moleculares y sondas de hibridacin
En este sistema, se emplean dos sondas de hibridacin. Una
sonda lleva una molcula donadora de uorescena en su ex-
tremo 3, cuyo espectro de emisin se traslapa con una son-
da receptora sobre el extremo 5 de una segunda sonda. En
solucin, los dos colorantes estn separados. Sin embargo,
despus de la etapa de desnaturalizacin ellos se hibridan
con la secuencia del blanco durante la complementariedad,
y adoptan una conguracin cabeza-cola. Esto conduce a
las dos molculas uorescentes a una proximidad estrecha,
y el fragmento de la uorescena puede transferir su energa
a la segunda. La energa de la luz emitida por la segunda
molcula se evala y registra, y el aumento en los niveles
de uorescencia corresponde con la cantidad de DNA sin-
tetizada durante la reaccin de PCR. Una ventaja adicio-
nal de este sistema lo aportan las sondas no hidrolizadas,
permitiendo la posibilidad de generar curvas de los puntos
de fusin. stas pueden utilizarse para vigilar la eciencia de
la amplicacin.
Sondas de hidrlisis
El ensayo TaqMan

utiliza la actividad de la exonucleasa 5-
3 de Taq o de la rTth DNA polimerasa para hidrolizar una
sonda de hibridacin unida al fragmento amplicado blanco
(Lyamichev y cols., 1993; Holland y cols., 1991; Lawyer y
cols., 1989). En este sistema, tres oligonucletidos se re-
quieren para unirse al blanco. Dos iniciadores especcos
de la plantilla denen los puntos nales del amplicn y se
emplean como primer nivel de la especicidad. Otro nivel
de la especicidad se alcanza con la inclusin de una sonda
especca, que une internamente a los puntos denidos por
los iniciadores. Las caractersticas de la sonda TaqMan
in-
cluyen una molcula reportera uorescente en el extremo 5,
cuya emisin es extinguida por una segunda molcula en el
extremo 3. La proximidad espacial de la sonda reportera a
la sonda extintora en una sonda intacta asegura que ninguna
uorescencia neta se detecte. La liberacin de uorescencia
ocurre slo si la amplicacin especca del blanco ocurre,
evitando la necesidad de conrmar el fragmento amplica-
do o amplicn despus de la amplicacin.
Qumica de la TaqMan de PCR (ensayo
de la 5 nucleasa)
La tecnologa TaqMan es una tcnica cuantitativa de PCR
en tiempo real, basada en el ensayo de la 5 nucleasa des-
crita primero por Holland y cols. (1991). La tcnica emplea
sondas uorescentes diseadas para hibridar dentro de la
secuencia del blanco y, en la fase de templado/extensin de
PCR, para generar una seal que se acumule durante PCR
al completarse un ciclo en proporcin con la cantidad de la
plantilla, antes de la iniciacin de PCR (Orlando y cols.,
1998; Gibson y cols., 1996).
La base para este sistema consiste en medir continuamen-
te los productos de PCR cuando se acumulan, usando una
sonda oligonucletida uorognica especca doblemente
marcada llamada sonda TaqMan (Livak y cols., 1995; Lee
Figura 51-1 a) El colorante intercalante verde SYBR se une al DNA de doble cadena. b) Disociacin (curva del punto de fusin),
mostrando dmeros del iniciador y el amplicn de PCR en un ensayo con verde SYBR.
QUMICA DE LA TAQMAN DE PCR (ENSAYO DE LA 5 NUCLEASA) 497
y cols., 1993). La sonda TaqMan se compone de un oli-
gonucletido corto (~ 20 a 25 bases) marcada con dos co-
lorantes diferentes, un colorante extintor o quencher en 3,
un colorante reportero en 5, y un fosfato bloqueador en 3
para prevenir la extensin de la sonda durante la PCR (Li-
vak y cols., 1995). El colorante reportero uorescente, por
ejemplo, FAM (6-carboxiuorescena), VIC
o JOE (2,7-
dimetil-4,5,-dicloro-6-carboxiuorescena) est covalen-
temente ligado al extremo 5 de la sonda oligonucletida.
TET (tetracloro-6-carboxiuorescena) y HEX (hexaclo-
ro-6-carboxiuorescena) pueden tambin utilizarse como
colorantes reporteros uorescentes en este sistema. Cada
uno de estos reporteros se extingue por TAMRA (6-car-
boxi-tetrametil-rodamina) (el colorante extintor), un extin-
tor o quencher no uorescente que est unido por un LAN
(nucletido modicado del brazo ligador) al extremo 3 de
la sonda. La sonda est qumicamente fosforilada en su ex-
tremo 3, lo cual previene la extensin de la sonda durante
las aplicaciones de PCR. La secuencia de la sonda oligo-
nucletida es homloga a una regin interna presente en el
producto de PCR. Cuando la sonda est intacta (alineada),
la transferencia de energa del tipo Frster ocurre entre los
dos uorforos y ocasiona la supresin de la uorescencia
del reportero (Gibson y cols., 1996; Livak y cols., 1995).
El ensayo TaqMan utiliza tanto la Taq como la Tth po-
limerasa, aisladas a partir de Thermus aquaticus y Ther-
mus thermophilus, respectivamente, pero cualquier enzima
con actividad 5 nucleasa puede utilizarse. Durante la am-
plicacin, la sonda no extensible es incidida por la activi-
dad de la 5 exonucleasa de la Taq o Tth DNA polimerasa,
de tal modo que libera al reportero a partir del extintor o
quencher oligonucletido y produce un aumento en la in-
tensidad uorescente de la emisin del reportero. Esto se
monitorea en tiempo real durante la fase exponencial de la
amplicacin de PCR, usando el Sistema Detector de Se-
cuencias 7 700 (Applied Biosystems, Lincoln Centre Drive,
Foster City, CA 94404, USA). La incisin elimina la sonda
de la hebra blanco, permitiendo que la extensin del ini-
ciador contine hasta el extremo de la hebra plantilla. Una
apreciacin global del proceso se ilustra en la gura 51-2.
Las molculas adicionales del colorante reportero son in-
cididas desde sus sondas respectivas con cada ciclo, lo que
conduce a un aumento en la intensidad de la uorescencia
proporcional a la cantidad de amplicn que se produce. La
Figura 51-2 Esquema de TaqMan PCR usando una sonda
interna marcada con un reportero y una secuencia del extintor.
Los iniciadores y la sonda de TaqMan templan al DNA des-
naturalizado. Durante la polimerizacin la sonda es incidida,
liberando el colorante reportero del colorante extintor, produ-
ciendo un aumento en la seal uorescente que es proporcio-
nal a la cantidad de producto de PCR que se ha acumulado.
actividad exonucleasa de la Taq polimerasa acta slo si
la sonda uorognica es templada al blanco, puesto que la
actividad es especca de la doble hebra, por tanto la enzima
no puede hidrolizar la sonda cuando est libre en la solucin
y ninguna uorescencia del reportero se detecta.
Puesto que la polimerasa slo incide en la sonda mien-
tras sta permanece hibridada a su hebra complementaria,
las condiciones de temperatura de la extensin de PCR
deben ajustarse para asegurar la unin de la sonda. El sis-
tema de TaqMan utiliza un paso combinado de templado y
de polimerizacin de 60 a 62C para asegurar que la sonda
permanezca hibridada durante la amplicacin. La mayor
parte de las sondas tienen una temperatura de fusin (T
m
) de
alrededor de 10C, o por lo menos de 5C ms arriba que la
de los iniciadores de PCR (Livak y cols., 1995), ya que la
unin de la sonda TaqMan con los iniciadores es crucial para
el xito del proceso. Sin ella, se forman productos de PCR
sin la generacin de uorescencia y, por tanto, no es posible
una deteccin. Esto asegura que la sonda permanezca uni-
da a su blanco durante la etapa de la extensin del iniciador
y tambin garantiza la mxima actividad 5-3 exonucleasa
de las Taq y Tth DNA polimerasas.
Sondas TaqMan de unin al surco
menor del DNA
Recientemente, se han desarrollado sondas uorognicas
TaqMan de unin al surco menor (MGB) que mejoran la
sensibilidad de un ensayo TaqMan. MGB (antibiticos na-
turales y molculas sintticas) pueden entrar en el surco
menor de la hlice que forma el DNA de doble hebra y
estabilizar los DNA dplex, aumentando la discriminacin
del apareamiento mal hecho cuando se une a una sonda
oligonucletida. Las sondas uorognicas TaqMan MGB
tienen varias caractersticas que las hacen superiores a las
sondas uorognicas tradicionales. Una MGB se une a los
extremos 3, 5 o a un nucletido interno del oligonucle-
tido. Las sondas MGB se unen con ms rmeza a su com-
plemento, lo que eleva la temperatura de fusin (T
m
) de
las sondas y permite un diseo ms exible del anlisis.
Los estudios demuestran que la introduccin de una MGB
sobre una sonda 12-mer con una T
m
de 20C aumenta su
T
m
a 65C. Esta T
m
es equivalente a la T
m
de una sonda
27-mer sin una MGB (Kutyavin y cols., 2000). Se reco-
mienda que la T
m
de la sonda sea >10C ms alta que la T
m

del cebador, de manera que la introduccin de una MGB
contribuya signicativamente al diseo del ensayo, permi-
tiendo el uso de una gama ms amplia de iniciadores. El
uso de una MGB permite que sondas ms cortas se em-
pleen y se mejore la discriminacin del apareamiento mal
hecho. Los oligonucletidos MGB muestran una diferencia
incrementada entre la T
m
de oligonucletidos de una sola
base con apareamientos bien hechos y la de oligonucleti-
dos con apareamientos mal hechos, por tanto, aumenta el
poder discriminatorio de los ensayos por hibridacin.
Otra caracterstica de las sondas MGB es la uorescen-
cia baja del fondo y, por consiguiente, un cociente con ma-
yor seal:ruido. La uorescencia del fondo de las sondas
intactas MGB aumenta levemente con la longitud de la son-
da, pero permanece varias veces ms baja en comparacin
con las sondas sin MGB. Las sondas MGB estabilizan enla-
ces A-T ms que los enlaces G-C en un DNA dplex. Esto
reduce la inuencia de la secuencia del blanco sobre T
m

(Kutyavin y cols., 2000). Se ha encontrado tambin que esa
discriminacin del apareamiento mal hecho se mejora cuan-
do se coloca bajo MGB. Tpicamente, un conjugado oligo-
nucletido-MGB se disea de tal forma que MGB reside en
el extremo 3 de un oligonucletido que contiene una regin
rica en A-T con cerca de 6 a 7 bases. Se observ que los
apareamientos mal hechos posicionados dentro de la regin
vinculada a MGB se diferencian mejor, mostrando una dife-
rencia incrementada de la energa libre entre apareamientos
correctos y apareamientos mal hechos para los diversos pa-
res apareados incorrectamente bajo MGB (Kutyavin y cols.,
2000; Orlando y cols., 1998; Gibson y cols., 1996).
Iniciador TaqMan y diseo de la sonda
La especicidad y la sensibilidad de un ensayo TaqMan
PCR se determinan con la eleccin del iniciador y de las
secuencias de la sonda. Los biosistemas aplicados desarro-
llan un programa software especco conocido como Pri-
mer Express, el cual puede utilizarse para disear ensayos
ptimos TaqMan PCR. La longitud ptima para los inicia-
dores TaqMan PCR es de 15 a 20 bases con un contenido
G/C del 30 al 80%, donde los ltimos cinco nucletidos en
el extremo 3 contienen no ms de dos residuos de G y C.
La T
m
de los iniciadores directos e inversos debe ser de 58
a 60C y no diferir en ms de 1 a 2C. Los amplicones PCR
ms cortos tienden a amplicar con ms eciencia que los
amplicones ms largos y aumentan la sensibilidad del en-
sayo. En general, la longitud ptima para los amplicones
TaqMan PCR es de 50 a 150 bp, aunque amplicones ms
grandes se han amplicado con xito.
Las sondas TaqMan se disean normalmente con una
T
m
por lo menos 10C ms alta que la de los iniciadores
PCR. Esto asegura que la sonda se hibridiza antes que los
iniciadores y sigue hibridndose durante la etapa de tem-
plado. Las sondas TaqMan pueden tener 13 a 30 bases
de longitud, con un contenido G/C del 50%. Las sondas
TaqMan deben disearse tan cerca como sea posible, sin
el traslape o conteniendo complementariedad con cual-
quiera de los iniciadores. Adems, las sondas TaqMan no
deben contener una G en el extremo 5, pues una G adya-
DETECCIN DEL AMPLICN 499
cente al colorante reportero extingue la uorescencia in-
cluso despus de la incisin. El uso de las sondas MGB
TaqMan, como se discute antes, reduce mucho la longitud
de la sonda mientras mantienen la T
m
requerida.
Idealmente, la optimizacin del iniciador y de la sonda
deben realizarse para determinar dnde ocurre la fase expo-
nencial, y de la meseta de PCR en cualquier ensayo particu-
lar (g. 51-3). Los iniciadores se utilizan en el rango de 50 a
200 nM, mientras la sonda est en el rango de 100 nM.
Para los blancos del gen del RNA, los ensayos Taq-
Man RT PCR deben disearse idealmente a travs del l-
mite intrn-exn para reducir al mnimo resultados falsos
positivos que se presentan a partir de la amplicacin de
DNA genmico contaminante. Adems, la amplicacin
de RNA/cDNA en presencia de Mn
2+
minimiza problemas
que pueden causarse por la amplicacin de fragmentos de
DNA unido nuevamente (Bauer y cols., 1997).
Deteccin del amplicn
El procedimiento TaqMan es aplicable a la medicin del
punto nal y a la deteccin de la amplicacin por PCR
en tiempo real. El aumento en uorescencia puede detec-
tarse si se emplea un espectrofotmetro de luminescencia,
como los termocicladores de la compaa Applied Biosys-
tems 7900 y 7000, que utilizan una lmpara de halgeno de
tungsteno y un sistema de cmara fotogrca CCD, o los
7700, que usan un formato de escaneo por lser para detec-
tar incrementos en la uorescencia en puntos denidos del
tiempo dentro del protocolo para los ciclos. Estos detec-
tores de la secuencia del DNA se pueden tambin utilizar
para tecnologas con el verde SYBR, con sondas Scorpion
y faros moleculares con pocas modicaciones.
Deteccin del punto nal TaqMan
La deteccin del punto nal se realiza despus de que
TaqMan PCR se ha completado y los datos son recolecta-
dos (es decir en el ciclo 35, 40, etc.). Para la deteccin del
punto nal, el incremento en la uorescencia se compara
a la uorescencia de un control sin plantilla de DNA y
las uctuaciones de la uorescencia interferentes son nor-
malizadas. Esto se consigue dividiendo la intensidad de
la emisin del colorante reportero entre la intensidad de la
emisin del colorante extintor o quencher para denir un
cociente conocido como RQ (reportero: extintor o quen-
50
300
900
300
900
0.8
0.85
0.9
0.95
1
1.05
1.1
1.15
1.2
1.25
1.3
D
e
l
t
a

R
n
[directo], nM
[inverso], nM
0.8-0.85 0.85-0.9 0.9-0.95 0.95-1 1-1.05 1.05-1.1 1.1-1.15 1.15-1.2 1.2-1.25 1.25-1.3
Figura 51-3 Optimizacin del iniciador TaqMan PCR. Los valores R
n
se reducen cuando las concentraciones del iniciador estn
disminuidas.
cher) para cada reaccin. La diferencia entre el RQ de la
muestra (RQ
+
) y el RQ del control sin plantilla (RQ
) es
denido como el RQ e indica la magnitud conable de la
seal generada durante la PCR.
Deteccin por TaqMan en tiempo real
Durante TaqMan PCR en tiempo real, el valor de la uores-
cencia que se mide durante cada ciclo de PCR representa la
cantidad de producto amplicado en ese ciclo. El sistema
de deteccin de la secuencia ABI 7700 recopila la emisin
uorescente a 500 a 600 nm en cada uno de los 96 pozos
del termociclador, una vez cada pocos segundos. Un lser
dirigido a travs de los cables de bra ptica excita los colo-
rantes uorescentes adentro del tubo. Estos cables entonces
llevan las emisiones uorescentes de nuevo a una cmara
fotogrca CCD, donde se detectan de acuerdo a sus longi-
tudes de onda individuales. Un valor llamado R
n
se calcu-
la para cada muestra restando la seal del reportero, antes
de PCR, de la seal normalizada del reportero. El software
tambin calcula un ciclo umbral (C
t
), un ciclo en el cual un
aumento estadstico signicativo en el producto de PCR se
detecta primero. El C
t
es la base de todos los anlisis cuan-
titativos en tiempo real (Higuchi y cols., 1993).
Cuanticacin absoluta
La cuanticacin absoluta de TaqMan PCR se realiza em-
pleando estndares de concentracin conocida y de com-
posicin similar al amplicn blanco. El DNA plsmido y el
RNA transcrito in vitro por lo general se usan como estn-
dares absolutos para los ensayos TaqMan. Para la medicin
de los niveles de la expresin del mRNA, un estndar del
DNA no es la opcin ptima; el cRNA (RNA copia) o el
RNA de concentracin conocida es preferible, pues expli-
ca la ecacia de la reaccin de transcripcin inversa. Los
estndares del RNA copia pueden generarse amplicando
una secuencia levemente ms grande que el amplicn por
TaqMan
PCR, usando un grupo de iniciadores externos.

El amplicn puede despus clonarse dentro de un vector
conveniente y transcribirse dentro del cRNA. Las curvas
estndares se generan amplicando las diluciones seriales
del estndar en el ensayo TaqMan PCR. Las muestras de
la prueba entonces se trazan a lo largo de la curva estndar
para determinar la cantidad de blanco en la muestra.
Cuanticacin relativa
La cuanticacin relativa se emplea por lo general para eva-
luar cuantitativamente las diferencias en las secuencias del
blanco entre diversas muestras. El objetivo de un experimen-
to cuantitativo relativo de TaqMan es determinar el cociente
de una molcula de mRNA o de DNA del blanco a una mo-
lcula diferente del blanco o a s mismo bajo condiciones
diferentes. El resultado puede entonces divulgarse como di-
ferencia doblada, relativa a una muestra del calibrador. Hay
dos mtodos para calcular la cuanticacin relativa de la ex-
presin del gen blanco: el mtodo de la curva estndar, y el
mtodo C
t
comparativo (Applied Biosystems, 1997).
Mtodo de la curva estndar
Para el mtodo de la curva estndar, se generan curvas es-
tndares para los ensayos del blanco y del control endgeno.
Para cada muestra de la prueba, la cantidad del blanco y la
cantidad del control se determinan a partir de la curva estn-
dar apropiada. Entonces la cantidad del blanco es dividida
entre la cantidad del control endgeno para obtener un valor
normalizado del blanco. Para calcular los niveles relativos de
la expresin, los valores normalizados del blanco se dividen
entre los valores del blanco normalizados por calibrador.
Mtodo C
t
comparativo
Para el mtodo C
t
comparativo, los valores relativos de la
cuanticacin se calculan a partir de los valores del ciclo
umbral (C
t
) generados durante la PCR. El valor C
t
es el
ciclo al cual un aumento estadstico signicativo en el pro-
ducto de PCR se detecta primero. El mtodo C
t
compa-
rativo para la cuanticacin relativa calcula la expresin
relativa del gen usando la siguiente ecuacin:
Cantidad relativa 2
Ct
La C
t
se calcula normalizando el C
t
de la muestra del
blanco con el C
t
del control endgeno (C
t
blancoC
t
con-
trol endgeno). La C
t
, entonces se calcula restando la
C
t
media de la muestra del calibrador menos la C
t
media
correspondiente, para la muestra del blanco. Los niveles
relativos de la expresin del gen blanco entonces se ex-
presan como un cambio doblado relativo a la muestra del
calibrador (Livak y cols., 2001). La cuanticacin relativa
usando el mtodo C
t
comparativo depende de las ecien-
cias similares de la amplicacin PCR para el blanco y
para los genes del control endgeno (Livak y cols., 2001;
Giulietti y cols., 2001).
Genes housekeeping
Un aspecto importante del diseo experimental cuantitativo
de PCR es la eleccin de un gen de referencia o housekeep-
ing apropiado. Los genes del control endgeno pueden en-
sayarse por separado o junto con el blanco desconocido y
calcularse su cociente nal. La amplicacin simultnea
del blanco y del gen del control endgeno reduce al m-
nimo los errores que se presentan debido a la estimacin
inexacta de la concentracin total del cido nucleico y de
la calidad en muestras individuales.
Un control endgeno ideal del gen de referencia debe ex-
presarse a un nivel constante entre diferentes tipos de tejido
e individuos y no ser afectado por el tratamiento experimen-
tal. Adems, la expresin del gen housekeeping puede ser
muy alta comparada con aquella del blanco desconocido y,
en tal situacin, la ecacia de la amplicacin entre los dos
blancos puede diferir en forma considerable. Para la cuanti-
cacin exacta en las reacciones que amplican ms de un
blanco en el mismo tubo, es importante que no compitan las
dos reacciones. Esto puede evitarse limitando la concentra-
cin de los iniciadores usados en PCR, que es dependiente
de la abundancia relativa de los diversos blancos.
Normalmente se usan tres genes como controles en-
dgenos para los estudios de la expresin del mRNA.
stos incluyen los mRNA especcos para genes house-
keeping -actina, gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH), y RNA ribosmico (rRNA). El mRNA de -
actina se expresa abundantemente en la mayor parte de los
tipos de clula y codica una protena ubicua del citoes-
queleto. Sin embargo, es importante observar que la pre-
sencia de seudogenes puede interferir con los resultados
cuantitativos (Mutimer y cols., 1998).
El RNA ribosmico (rRNA) constituye 85 a 90% del
RNA celular total y se expresa en todos los tejidos. El
gen housekeeping del rRNA 18S ha demostrado ser re-
lativamente estable en tejidos humanos bajo condiciones
experimentales variables (Schmittgen y cols., 2000). Sin
embargo, el rRNA no puede utilizarse como gen de refe-
rencia al cuanticar blancos que se han enriquecido para
el mRNA, pues el rRNA se pierde durante la puricacin
del mRNA.
El mRNA de la GAPDH (gliceraldehdo-3-fosfato des-
hidrogenasa) tambin se expresa en todos los tejidos y se
usa como control endgeno para los ensayos cuantitativos
de PCR. Sin embargo, existe cierta evidencia que los ni-
veles de la expresin de GAPDH varan durante el cultivo
celular in vitro (Hamalainen y cols., 2001) y entre indivi-
duos (Bustin y cols., 1999), acentuando la importancia de
la validacin cuidadosa de los genes del control endgeno
para la cuanticacin comparativa.
Aplicaciones de TaqMan PCR en patologa
Las potenciales de aplicacin para la tecnologa TaqMan
en el diagnstico mdico son enormes. El ensayo Taq-
Man se ha utilizado con xito para detectar y cuanticar
varios patgenos y el anlisis transcripcional de varios
blancos del mRNA. Se ha detectado y cuanticado pre-
viamente RNA del virus del sarampin en biopsias intesti-
nales frescas congeladas e incluidas en parana del tejido
de nios con una nueva variante de la enfermedad intes-
tinal inamatoria, usando la tecnologa TaqMan RT PCR
(Uhlmann y cols., 2002; Martin y cols., 2002). El grupo
del autor tambin ha utilizado con xito la tecnologa de
TaqMan para detectar y tipicar subtipos del virus del pa-
piloma humano (HPV) en biopsias del tejido cervicales
y preparaciones citolgicas basadas en ThinPrep lquida
(Murphy y cols., 2003). Similarmente, el grupo ha utili-
zado esta tecnologa para estudiar clulas fetales en la cir-
culacin materna en embarazos normales y complicados
(Turner y cols., 2003; Byrne y cols., 2003).
Discriminacin allica y ensayos TaqMan
para el genotipo de SNP
Aparte de la deteccin y cuanticacin de los blancos es-
peccos del DNA y del RNA, la tecnologa TaqMan PCR
que usa sondas MGB y el ensayo 5 nucleasa pueden uti-
lizarse para los ensayos de discriminacin genotipicante
y allica de SNP (polimorsmo de un solo nucletido). En
un sistema de dos alelos, la tecnologa utiliza una aproxi-
macin de sonda dual con dos diferentes colorantes repor-
teros uorescentes, a saber FAM y VIC (Livak, 1999; Lee y
cols., 1993), con los que se disean dos sondas, una espec-
ca para cada alelo o polimorsmo. Los ensayos de discri-
minacin allica se realizan bajo condiciones competitivas,
con la competicin entre las sondas especcas silvestres y
mutantes que se producen en cada ciclo de PCR, pero en
particular ms en las primeras rondas de PCR. Las sea-
les uorescentes a partir de sondas FAM y VIC se gene-
ran slo en presencia de la secuencia complementaria del
blanco (g. 51-4). La uorescencia del punto nal se mide
sobre los detectores de secuencia ABI (7900 HT, 7000, y
los 7700). Los datos entonces se analizan usando el pa-
quete del software integrado, suministrado por Applied
Biosystems, que permite la discriminacin entre genotipos
homocigotos y heterocigotos (g. 51-5).
Assays on demand (banco de secuencias
para ensayos TaqMan)
Applied Biosystems coloc un nuevo servicio, que permi-
te el acceso de usuarios de TaqMan PCR a una base de
datos del genoma, recientemente publicada, y de Celera
Corporation. Los Assays on demand estn disponibles
para ensayos del DNA y del RNA y consisten de grupos
APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGA 501
Figura 51-4 Representacin esquemtica de la discriminacin allica TaqMan PCR que usa el sistema de sondas TaqMan de dos
colores.
Figura 51-5 El ensayo de la discriminacin allica se realiza sobre el detector de secuencia ABI 7000. El software integrado permite
la discriminacin de alelos diferentes y se basa en el nivel de uorescencia detectado.
de iniciadores y sondas TaqMan diseados para todos
los genes de secuencia conocida. Ms de 19 000 ensayos
en humanos especcos del gen y ms de 9 500 ensayos
en ratones especcos del gen estn disponibles para que
los seleccionen los clientes; pueden obtenerse del sitio Web
de Applied Biosystems.
Placas TaqMan de volmenes pequeos
Los avances recientes en la qumica de TaqMan incluyen el
lanzamiento de una versin de 384 pozos de la plataforma
para el anlisis de la expresin del gen de alto rendimien-
Figura 51-6 Placa TaqMan de microvolumen de 384 pozos de
alto rendimiento. Esta placa puede cargarse de forma usual con
productos para la expresin del gen Assays on Demand (Bancos
de secuencia)
validados.
C
a
l
i
b
r
a
d
o
r
M
u
e
s
t
r
a

1
M
u
e
s
t
r
a

2
IL-1
IL-1 Beta
Alfa
I L-2
IL-4
IL-5
IL-8
IL-10
IL-12p35
IL-12p40
IL-15
IFNg
TNF-
ALFA
0.0001
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
1000
C
u
a
n
t
i
f
i
c
a
c
i
n

r
e
l
a
t
i
v
a

d
e

l
a

m
u
e
s
t
r
a
a

c
a
i
b
r
a
r
Muestra
Blanco, expresin de citocinas
Figura 51-7 Anlisis de la expresin del gen de citocina.
to. La placa de volumen pequeo de 384 pozos (g. 51-6)
se disea con la conguracin habitual en serie, usando
productos de expresin del gen Assays on demand (ban-
co de secuencias) validados y el sistema del detector de
secuencia 7900 HT. Estas placas son capaces de evaluar la
expresin del gen de 12 a 384 blancos en hasta ocho mues-
tras de cDNA en una sola corrida de PCR, dependiendo de
la conguracin de la placa.
Otra aplicacin de esta tecnologa es la placa TaqMan
de volumen pequeo con citocina humana para perlar la
expresin del gen de sta, usando el mtodo C
t
compara-
tivo de cuanticacin relativa. La placa TaqMan con cito-
cina humana (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)
consiste de un consumible de 96 pozos divididos en 24 gru-
pos de copias, un grupo para cada anlisis de la citocina. La
placa evala una sola muestra del cDNA generada del RNA
total humano en un experimento RT-PCR de dos etapas.
Este ensayo mide las siguientes 24 citocinas: TNF-,
TNF-, IFN-, TGF-, LT-, IL-1, IL-1, IL-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p35, IL-12p40,
IL-13, IL-15, IL-17, IL-18, G-CSF, GM-CSF y M-CSF.
Cada pozo contiene sondas e iniciadores TaqMan MGB
marcados con FAM liolizadas para un mRNA de la ci-
tocina humana. Un grupo de iniciadores y sondas TaqMan
MGB marcados con VIC para el control endgeno del RNA
ribosmico 18S fue utilizado para los ensayos mltiples.
Los ensayos para la cuanticacin del RNA sobre la pla-
ca con citocina se realizan dentro una reaccin en cadena
APLICACIONES DE TAQMAN PCR EN PATOLOGA 503
con la polimerasa de la transcriptasa inversa (RT-PCR). En
el primer paso, el cDNA es transcrito inversamente del RNA
total, usando hexmeros al azar y la transcriptasa inversa
MultiScribe
. El segundo paso incluye la amplicacin del

producto de cDNA, usando la polimerasa TaqMan Universal
mastermix y AmpliTaq Gold DNA. Los 96 pozos de la placa
se llenan simultneamente con una mezcla de cDNA y del
TaqMan Universal mastermix, a travs de un puerto va de
un sistema de canal. El volumen de la reaccin de cada pozo
es 1 l y el volumen total requerido para llenar la placa es
250 l. La cantidad relativa de citocinas especcas en una
muestra individual se compara despus con una muestra
apropiada del calibrador y se calcula usando el mtodo com-
parativo o para la cuanticacin relativa (g. 51-7).
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Introduccin
En aos recientes numerosos estudios han descrito tcnicas
hbridas que acoplan la PCR con la hibridacin in situ
(Herrington y cols., 1992; Haase y cols., 1990; Bagasra y
cols., 1992, 1993, 1994; Boshoff y cols., 1995; OLeary
y cols., 1994a, 1994b, 1995, 1996, 1998). Las tcnicas no
fueron aceptadas al principio por problemas tecnolgicos
encontrados durante la amplicacin de la secuencia de-
seada del cido nucleico.
Las tecnologas de amplicacin in situ se han exten-
dido para incluir un nmero de modicaciones de la tc-
nica inicialmente descrita de la PCR in situ, para incluir
PRINS (marcaje cebado in situ), PRINS cclico, PCR
del PNA in situ (PCR del cido pptido nucleico), PCR del
PNA in situ, inmuno-PCR in situ, PCR TaqMan in situ y
la amplicacin especca de alelo. Otras tecnologas de
amplicacin en la clula, como la amplicacin base del
cido nucleico (NASBA), pueden tambin utilizarse. stas
emplean tecnologa de RNA polimerasas T3 y T7 y son
metodologas isotrmicas de replicacin para la amplica-
cin del RNA en las clulas y cortes del tejido.
Visin general de la metodologa
Todas las tcnicas de PCR en la clula intentan crear amplico-
nes de DNA/cDNA de doble cadena o de una cadena dentro
de la clula, que se pueden detectar directamente o despus de
un paso de hibridacin in situ (IS). Debe alcanzarse un equili-
brio no entre la digestin adecuada de las protenas celulares
(que permite el acceso de los reactivos de amplicacin) y
el mantenimiento de la localizacin del producto amplica-
do dentro del compartimiento celular y la preservacin de la
morfologa tisular/celular.
Los cambios trmicos cclicos especcos suceden en el
nivel individual celular, parecido a lo que ocurre en la fase
de solucin de la PCR. El primer paso implica la desnatura-
lizacin del DNA de doble cadena (dsDNA) a la forma de
una sola cadena (ssDNA), si se est amplicando un DNA
denido. Para la amplicacin especca de RNA, la plan-
tilla del RNA ya es de una sola cadena y la transcripcin
reversa se lleva a cabo para crear una plantilla del cDNA.
Segundo, los iniciadores se unen anqueando los ex-
tremos de la secuencia objetivo deseada y una enzima ter-
moestable (DNA polimerasa Taq o fragmento Klenow) se
utiliza para extender o para ligar, usando la DNA ligasa,
una reaccin en cadena in situ de la ligasa (IS-LCR), los
iniciadores correctamente colocados. Las Taq polimera-
sas especcas ahora se disean para el uso en los anlisis
de la PCR en la clula, incluyendo la polimerasa IS-Taq,
que tiene una concentracin ms alta y una mayor unidad
de actividad de polimerasa. Las rondas subsecuentes del
termociclado aumentan el nmero de copias de la secuen-
cia blanco, en una reaccin de amplicacin de cido nu-
cleico. Un aumento exponencial en la cantidad de producto
amplicado nunca se logra en las reacciones de ampli-
cacin en la clula, por la amplicacin lineal que ocu-
rre en la mayor parte de las situaciones. Esto ocurre por
la inecacia relativa de las tcnicas, debido a los proble-
mas de accesibilidad de los reactivos de amplicacin para
la secuencia deseada del cido nucleico y a lo compacto
del compartimiento nuclear celular (conteniendo dsDNA
ssDNA pre-mRNA y las protenas histonas).
Una vez que se crea el amplicn (conjunto de fragmen-
tos amplicados), la deteccin debe llevarse a cabo. Si se
52
Reaccin en cadena de la polimerasa en la clula
John OLeary, Cara M Martin y Orla Sheils
506 CAP. 52 REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA EN LA CLULA
utiliza un iniciador o nucletido marcado, entonces el am-
plicn es marcado y puede demostrarse directamente por
tcnicas inmunocitoqumicas. Por lo general, sin embargo,
el nucletido marcado y el iniciador marcado directamente
se han abandonado en gran parte, debido a la generacin no
especca de la seal y a la incorporacin no especca del
marcador dentro del amplicn de la PCR.
Una alternativa es un paso de hibridacin IS (usando
una oligosonda de cadena sencilla o una sonda genmica
de doble cadena) que se lleva a cabo despus de la ampli-
cacin, apegndose a las reglas generales de la hibridacin
IS estndar y aplicando las condiciones de lavado astrin-
gente despus de la hibridacin.
Tecnologas de PCR celular: deniciones
Varias tcnicas (gs. 52-1 y 52-2) se han descrito en la lite-
ratura, incluyendo las siguientes:
PCR in situ del DNA (IS-PCR). Amplicacin por PCR
de las secuencias del DNA celular en las muestras de
tejido usando un nucletido marcado (p. ej., dUTP)
dentro de la mezcla de la reaccin de PCR. El producto
marcado se identica, usando tcnicas estndar de de-
teccin tal y como en la hibridacin in situ convencional
o en la inmunocitoqumica. No se recomienda el uso de
esta tecnologa.
Iniciador marcado manejado en la amplicacin in situ
(LPDISA). Amplicacin de las secuencias de DNA
usando un iniciador marcado dentro de la mezcla de la
reaccin PCR. El producto marcado entonces se detecta
tal y como en la IS-PCR del DNA. No se recomienda el
uso de esta tecnologa.
Hibridacin in situ PCR (PCR-IS). Amplicacin por
PCR de las secuencias celulares del DNA en las mues-
tras de tejido, seguida por la deteccin con hibridacin
in situ del producto amplicado, usando una sonda in-
Figura 52-1 Representacin esquemtica de la PCR
en clula, indicando los pasos crticos implicados en
el proceso desde la adhesin de la clula/tejido al
permeabilizado y jacin para la amplicacin PCR
hasta la deteccin del amplicn.
Figura 52-2 Hibridacin in situ y deteccin PCR-IS del HPV
en una biopsia cervical. a) IS, deteccin inmunocitoqumica de
un solo paso, sensibilidad 20 a 30 genomas/clulas. b) IS,
deteccin de tres pasos, sensibilidad 10 a 20 genomas/clula.
c) PCR-IS con la deteccin de tres pasos, sensibilidad 1 ge-
noma/clula.
TECNOLOGAS DE PCR CELULAR: DEFINICIONES 507
terna marcada o genmica. Los marcadores utilizados
pueden ser isotpicos (p. ej.,
32
P,
35
S) o no isotpicos (p.
ej., biotina, digoxigenina, uorescena).
PCR transcriptasa reversa in situ (RT in situ PCR). Es la
amplicacin de las secuencias del mRNA en las mues-
tras de clulas y tejidos, creando primero una plantilla de
DNA copia (cDNA) usando la transcriptasa reversa (RT)
y entonces se amplica la plantilla de DNA recin creada
tal y como en la IS-PCR del DNA. Esta tcnica de nuevo
tiene problemas inherentes con la incorporacin no espe-
cca del marcador, y no debera utilizarse para el anlisis
de las plantillas de RNA en las clulas y cortes de tejido.
PCR transcriptasa reversa hibridacin in situ (RT PCR-
IS): Es la amplicacin de las secuencias del RNA en
las muestra de clulas y tejidos creando una plantilla de
cDNA con la transcriptasa reversa (RT). El cDNA, crea-
do entonces se amplica y el amplicn se hibrida con un
oligonucletido interno, como en la PCR-IS (g. 52-3).
PRINS (amplicacin in situ) y PRINS cclica. Es la
amplicacin de secuencias genticas especcas en ex-
tensiones del cromosoma en metafase o ncleos interf-
sicos, usando un iniciador para generar un producto de
una sola cadena de la PCR. Si muchos ciclos de ampli-
cacin se utilizan, entonces la tcnica se llama PRINS
cclica (Gosden y cols., 1991).
PCR del PNA in situ (IS-PNA-PCR) y PCR-PNA-IS. IS-
PNA-PCR se reere a la amplicacin de los DNA blanco
usando una molcula imitadora del DNA, el cido pptido
nucleico (PNA). El PNA es una molcula simple, compues-
ta de unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina ligadas
por enlaces amida. Las bases purinas (A y G) y pirimidi-
nas (C y T) se unen a la columna vertebral por enlaces
carbonil metileno. El PNA cuando se utiliza como un inicia-
dor no es alargado por la DNA polimerasa Taq y, por tanto,
puede utilizarse en los ensayos de exclusin del iniciador,
que permite la discriminacin de las mutaciones puntuales
y el haplotipo directo de la clula individual. La segunda
reaccin, que emplea el PNA, es la PCR-PNA-IS; aqu,
una sonda de 15 a 20 nucletidos de PNA se utiliza para el
paso de hibridacin in situ despus de la amplicacin. Los
PNA tienen T
m
ms altas (temperaturas de fusin o mel-
ting) que las sondas oligo de DNA y las mutaciones pun-
tuales simples en un dplex PNA-DNA bajan la T
m
cerca de
15C con respecto al dplex correspondiente DNA-DNA
mal complementado (De-Mesmaeker y cols., 1995).
PCR IS-TaqMan. Es la amplicacin de las secuencias
de DNA usando un par de iniciadores convencionales
como en la PCR estndar. Sin embargo, una sonda Taq
Man interna se agrega a la mezcla de amplicacin. Se
coloca una molcula uorescente reportera (FAM, HEX,
etc.) en el extremo 5 de la sonda y otra en el extremo 3,
una molcula extintor o quencher (otra vez uorescente,
normalmente TAMRA). Una vez que la sonda est en
lnea e intacta, la proximidad de la molcula extintor
a la molcula reportera no permite ninguna uorescen-
cia de la molcula reportera. Las DNA polimerasas Taq
poseen dos caractersticas importantes para la reaccin:
a) desplazamiento de una hebra de la horquilla Y, que
permite que la DNA polimerasa Taq despegue una sola
hebra en la conguracin Y; y b) actividad endonucleasa
5-3, que causa el corte del brazo de unin que une la
molcula reportera al extremo 5 de la sonda TaqMan
(g. 52-4), de tal modo que produce uorescencia slo
si ha ocurrido la amplicacin especca (g. 52-5)
(Lawyer y cols., 1989; Holland y cols., 1991).
Amplicacin especca del alelo in situ (IS-ASA). Esta
tcnica utiliza el sistema de amplicacin refractaria de
la mutacin (ARMS) de PCR, que tiene la capacidad
de detectar polimorsmos puntuales en las secuencias
del DNA humano, usando pares de bases articialmente
creadas y mal apareadas en el extremo 3 de los inicia-
dores de la PCR. Si el polimorsmo se acopla al de la
secuencia del iniciador, la amplicacin de esa secuen-
cia ocurrir preferentemente.
Inmuno-PCR in situ. Los inmunoensayos in situ no
permiten la deteccin de pocas molculas blanco ac-
cesibles con la PCR in situ. La inmuno-PCR in situ es
una reaccin en la cual el marcador de DNA se liga a
Figura 52-3 Deteccin por PCR-IS RT del receptor 2 de la dopa-
mina (DRD 2) en las clulas epiteliales ovricas del hmster (trans-
fectantes) y anlisis en gel y Southern blot del amplicn creado.
las molculas blanco a travs de un puente anticuerpo-
biotina-avidina y es amplicado por PCR in situ. Las
secuencias amplicadas de DNA se detectan in situ
por hibridacin. Los autores arman que la tcnica
puede ser la nica disponible para detectar cantidades
diminutas de macromolculas biolgicas tales como
protenas, carbohidratos y lpidos en las clulas intac-
tas o en los cortes del tejido (Cao y cols., 2000).
Amplicacin del DNA en la clula
Equipo
Existen varios instrumentos para realizar PCR en la clula,
comprendiendo desde un termociclador estndar (usando
modicaciones), de hornos termocclicos y termociclado-
res especcamente diseados (Applied Biosystems Gene
Amp in situ PCR system 1000; Hybaid Omnigene/Om-
nislide y el termociclador MJB para portaobjetos) pueden
usarse en la amplicacin del DNA y RNA en la clula.
Si se emplea un termociclador estndar, entonces debe
crearse una cmara de amplicacin para el portaobjetos.
sta puede hacerse de aluminio (un recipiente de papel
de aluminio). Este recipiente que contiene el portaobjetos
se coloca en el termociclador, se cubre con aceite mineral
y despus se envuelve totalmente. Sin embargo, la opti-
mizacin de la conduccin trmica nunca se alcanza en su
totalidad. El lapso trmico, es decir, las diferencias en
temperatura entre la cara del bloque, el portaobjetos de
cristal y la mezcla de reaccin de la PCR en cada paso
de temperatura del ciclo de la reaccin son frecuentes
(OLeary y cols., 1994b). Este problema se supera con
el uso de mquinas de amplicacin in situ con diseos
especcos que ofrecen curvas de calibracin incorpora-
Figura 52-4 Anlisis de la PCR TaqMan de tiempo casi real del
HHV 8 en una efusin de la lnea celular BC-3 del linfoma. Ob-
serve la disminucin de la uorescencia despus de 25 ciclos, de-
bido a la liberacin de las sondas extintor y del reportero en el es-
pacio del volumen limitado del ncleo en la lnea celular BC-3.
Figura 52-5 Anlisis de la PCR RT del RET/PTC-1 en una lnea celular inmortalizada humana de la tiroides. La transcripcin quimrica
RET/PTC-1 se ve al mximo en la frontera luminal de la clula. a) Canal FITC que muestra transcritos; b) contratincin DAPI.
das de la temperatura del portaobjetos con mayor control
termodinmico.
Material inicial
En 1990, Haase y cols., describieron la PCR in situ en clu-
las sencillas jas intactas, suspendidas en el amortiguador
de la reaccin de la PCR. Despus de la amplicacin, las
clulas se centrifugaron sobre los portaobjetos de cristal y
el producto amplicado se detect utilizando la hibrida-
cin in situ (Haase y cols., 1990). Al inicio algunos inves-
tigadores utilizaron pedazos de portaobjetos de cristal (con
las clulas de preparaciones citocentrifugadas) en tubos
Eppendorf estndares, incubados directamente en el amor-
tiguador de la reaccin PCR (Spann y cols., 1991). Ms
recientemente, se han utilizado tcnicas que usan tejidos y
clulas unidas al portaobjetos del microscopio (Bobroski
y cols., 1995; Cheng y Nuovo, 1994).
Para IS-PCR, PCR-IS, IS-LCR, IS-PNA PCR e IS-Taq-
Man PCR, las clulas y los tejidos jos, incluyendo el ma-
terial en parana, se pueden utilizar para la amplicacin.
Los mejores resultados se obtienen con clulas y tejidos
recin jados, aunque se ha logrado la amplicacin acer-
tada con material almacenado (hasta 40 aos).
Las extensiones del cromosoma jo en metafase y los
ncleos interfsicos se pueden utilizar para la deteccin de
regiones subcromosmicas especcas, usando PRINS y
PRINS cclica (Gosden y cols., 1991). Para un citoesquele-
to celular rgido debe crearse en un microambiente adecua-
do que permita el acceso de los reactivos de amplicacin
con fuga mnima del producto amplicado. Los resultados
satisfactorios se obtienen con los tejidos jados en 1 a 4%
de paraformaldehdo, el formaldehdo amortiguado neutral
(NBF) y 10% formalina (12 a 24 h para biopsia/tejido sli-
do; 10 a 30 min para las preparaciones citolgicas) (Nuovo
y cols., 1993; OLeary y cols., 1994b). Resultados menos
constantes se obtienen con tejidos jados en etanol y cido
actico (Nuovo y cols., 1993).
La jacin celular con jadores de formaldehdo tiene
considerables desventajas. Los grupos aldehdo reaccionan
con el DNA y las protenas de las histonas para formar entre-
cruzamientos DNA-DNA y protena DNA-histona. La ja-
cin del formaldehdo tambin corta la plantilla del DNA
(rompimientos aleatorios en el dsDNA), la cual puede no
concluir el inicio (es decir, los extremos no se traslapan).
Estos cortes pueden actuar despus como sitios potenciales
de cebado para la DNA polimerasa Taq, conduciendo a la
incorporacin y elongacin de los nucletidos marcados y
no marcados (es decir, dATP, etc.) anlogo a la marcacin in
situ del extremo terminal del DNA en la apoptosis. Este pro-
ceso ocurre a temperatura ambiente y conduce a resultados
falsos con la IS-PCR del DNA. sta es la razn predominan-
te por la que la PCR del DNA y del RNA en la clula (sin un
paso de hibridacin) se ha abandonado en gran parte.
Puesto que los ciclos repetidos de calentamiento y enfria-
miento se utilizan durante la amplicacin in situ, las clulas
y los tejidos deben unirse adecuadamente a un soporte slido
(normalmente cristal), de modo que no ocurra la separacin.
Los portaobjetos de cristal se tratan previamente con agen-
tes de recubrimiento para asegurar la adhesin mxima de
la seccin; los ms utilizados son aminopropil-trietoxisilano
(APES), solucin de Denhardt y el pegamento de Elmer.
Permeabilizacin celular y tisular
Las clulas deben digerirse y permeabilizarse adecua-
damente para facilitar el acceso de los reactivos. Esto se
puede alcanzar por el tratamiento con proteinasa (p. ej.,
proteinasa K, pepsina o tripsina) o hidrlisis ligera cida, o
ambas (0.01 a 0.1 N HCl). Los tiempos de digestin y las
concentraciones mximas de proteasa tienen que optimi-
zarse debidamente para cada preparacin tejido/citolgica
utilizada.
Los tiempos largos de digestin comprometen inevitable-
mente la morfologa celular. Los tiempos de digestin cortos
producen la disociacin incompleta de los entrecruzamien-
tos protena histona-DNA, que pueden obstaculizar en ltima
instancia el avance de la DNA polimerasa Taq a lo largo de
plantillas nativas del DNA. La hidrlisis cida acta, proba-
blemente, llevando a tales entrecruzamientos a la disociacin
completa. Alternativamente, la irradiacin de microondas de
las clulas y los cortes de tejido pueden utilizarse para ex-
poner las plantillas del cido nucleico. Los pulsos cortos de
irradiacin de microondas (con o sin protelisis) usando un
amortiguador de citrato, anlogo a la recuperacin del ant-
geno de la inmunohistoqumica, permiten el acceso de los
reactivos de amplicacin a la secuencia objetivo deseada y,
adems, facilitan la posamplicacin inmunohistoqumica.
Despus de esto (si se utiliza un mtodo de marcacin no
isotpico), un paso de bloqueo debe emplearse, dependiendo
del mtodo que se utilice para la deteccin despus de la am-
plicacin del producto, por ejemplo, sistemas de deteccin
con peroxidasa o fosfatasa alcalina. En el primero, la peroxi-
dasa endgena se extingue por la incubacin en una solucin
de 3% H
2
O
2
con azida de sodio, mientras el cido actico
glacial al 20% bloquea la fosfatasa alcalina intestinal.
Protocolos de la amplicacin del DNA
Una amplicacin acertada se logra con: a) la optimizacin
cuidadosa de los parmetros cclicos; b) el diseo apropia-
do de los pares de iniciadores (tomando en cuenta su T
m
, es
decir, la temperatura de fusin especca, su capacidad para
formar dmeros del iniciador y estructuras que se pliegan so-
bre s mismas), y c) la optimizacin de las concentraciones de
Mg
2+
necesarias para conducir la reaccin de amplicacin.
Debido al secuestro de reactivo (vase adelante), concen-
traciones ms altas de los reactivos de amplicacin se re-
quieren durante la amplicacin in situ que para las tcnicas
convencionales solucin-fase, incluyendo los iniciadores,
los dNTP y Mg
2+
. Las concentraciones de Mg, en particu-
lar, tienen que optimizarse cuidadosamente, con la ampli-
cacin satisfactoria en la mayor parte de las aplicaciones a
2.5 a 5.5 mM. Los volmenes del reactivo de amplicacin
normal varan dependiendo del rea de supercie de la pre-
paracin celular/seccin de tejido que se emplee. Esto es
importante, ya que la amplicacin desigual puede ocurrir
sobre la supercie del portaobjetos debido a las variaciones
del volumen consiguientes al fracaso de la amplicacin lo-
AMPLIFICACIN DEL DNA EN LA CLULA 509
calizada. Cuando se usa el sistema Gene Amp in situ PCR
1000, se utilizan volmenes de 25 a 50 l.
La desnaturalizacin inicial del DNA puede alcanzar-
se antes de la amplicacin, ya sea durante la permeabi-
lizacin celular o despus del proceso de jacin. Como
alternativa, puede realizarse al principio del protocolo de
amplicacin mismo. La desnaturalizacin se alcanza
usando calor, calor/formamida o lcali (Bagasra y cols.,
1994). Adems, la mayora de los investigadores aboga por
el uso del Hot Start de la PCR (inicio de los ciclos de
PCR a alta temperatura) para reducir el cebado incorrecto y
la oligomerizacin del iniciador y Nuovo (1994) sugiere la
adicin de la protena de unin a la cadena sencilla (SSB)
derivada de E. coli. El modo exacto de la accin de esta
protena es desconocido pero funciona en la replicacin y
la reparacin del DNA previniendo el cebado incorrecto
y la oligomerizacin del iniciador.
La optimizacin de los parmetros cclicos debe realizarse
en cada ensayo particular. La mayor parte de los protocolos
emplea 25 a 30 rondas de amplicacin, excepcionalmente
llega a los 50 ciclos. Algunos investigadores realizan dos
rondas sucesivas de 30 ciclos con la adicin de reactivos nue-
vos, incluyendo a los iniciadores y la DNA polimerasa entre
cada ronda; una modicacin de esto es la PCR nested o
nidada, donde se agregan los iniciadores internos, anida-
dos dentro del amplicn producido durante la primera ron-
da. Sin embargo, esto no se recomienda para uso rutinario.
La seleccin del iniciador ha evolucionado a partir de
dos estrategias bsicas: un par del iniciador o mltiples
combinaciones de par del iniciador, con o sin colas comple-
mentarias. Los pares mltiples del iniciador se disean para
generar productos que abarcan ms e incluso se pueden
traslapar, con la ventaja obvia de la localizacin de los am-
plicones y de la difusin mnima del producto. Sin embar-
go, si el PCR-hot start se emplea, el par nico de iniciadores
es suciente para asegurar la amplicacin acertada.
Astringencia del lavado, posamplicacin
y jacin del amplicn
La posjacin con 4% de paraformaldehdo o etanol, o
ambos, puede emplearse para mantener la localizacin del
producto amplicado. Si uno est realizando PCR-IS, un
oligonucletido o una sonda genmica se aplica en esta eta-
pa. Slo se alcanza la especicidad mxima usando sondas
que hibridan las secuencias internas del producto ampli-
cado. Las sondas genmicas no se restringen a estas se-
cuencias y parecen proporcionar resultados comparables.
Despus de la amplicacin in situ, la mayor parte de los
protocolos incluyen un paso de lavado posamplicacin,
usando cloruro de sodio, citrato de sodio (SSC), formamida
y variando las temperaturas de lavado, para eliminar el pro-
ducto extracelular difundido, que puede permitir la tincin
no especca y la generacin de resultados positivos falsos.
La astringencia del lavado se dene por el conjunto de
condiciones empleadas (es decir, concentracin del SSC,
del porcentaje de formamida utilizado y la temperatura del
lavado). El investigador intenta alcanzar unas condicio-
nes del lavado donde el cociente seal: el ruido de fondo
es mximo; sin embargo, las condiciones de astringencia
del lavado poshibridacin se derivan empricamente.
Deteccin de los amplicones
Los marcadores no isotpicos (p. ej., biotina, digoxigenina,
uorescena) son muy utilizados, y cuando se emplean junto
con la tcnica de deteccin inmunohistoqumica sndwich,
parecen aportar grados similares de sensibilidad de detec-
cin a la de los marcadores isotpicos. stos pueden variar
en sistemas de deteccin de un solo paso hasta los de cinco
pasos, en cuanto a la inmunohistoqumica convencional. El
producto se visualiza nalmente por una reaccin de color
(p. ej., cromgenos NBT/BCIP o AEC) o por uorescencia.
Nuovo ha descrito en el funcionamiento de la inmuno-
histoqumica convencional posamplicacin que la ventaja
obvia es la colocalizacin del producto con la clula de
inters, por ejemplo, la clula endotelial o el macrfago.
Sin embargo, los intentos para reproducir esto por varios
grupos, incluyendo los propios autores, han sido decepcio-
nantes y es probable que la mayor parte de los eptopos no
resistan completar un ciclo trmico repetitivo.
Reaccin de amplicacin, controles
y deteccin en el tejido para uso en
ensayos de PCR DNA en la clula
La PCR paralela en fase lquida debe incluir los siguientes
controles: la omisin de iniciadores y/o DNA polimerasa
Taq, iniciadores y/o sondas inaplicables, los controles ne-
gativos conocidos y genes de control de referencia. El n-
mero de los controles realizados depende de la cantidad de
tejido/clulas disponibles para la reaccin.
Los controles siguientes se requieren en PCR-IS: a) el
gen de control de referencia de la PCR-IS, por ejemplo,
-globina, -actina, etc.; b) la digestin con la DNasa de
los tejidos/clulas blanco; c) la digestin con RNasa de los
tejidos/clulas blanco; d) iniciadores con la sonda control;
e) iniciadores control con la sonda objetivo; f) iniciadores
control con la sonda control; g) iniciadores del gen de con-
trol de referencia con la sonda blanco; h) slo un inicia-
dor blanco (PCR en la clula asimtrica); i) slo dos ini-
ciadores blanco; j) sin Taq polimerasa; k) sin iniciadores;
l) omitir el paso de la transcriptasa reversa en RT IS-PCR
o RT PCR-IS; m) controles de la hibridacin in situ para
PCR-IS y RT PCR-IS, y n) controles de deteccin para los
sistemas inmunohistoqumicos de deteccin.
Los genes de control de referencia, incluyendo el uso de
una copia del gen mamfero, como PDH, son importantes
para valorar el grado de amplicacin en la preparacin de
la seccin de tejido/seccin de la clula. Al amplicar los
DNA blanco, la adicin de DNAasas debera suprimir la
seal. Si no ocurre esto, la seal pudo haber resultado de
la amplicacin falsa, o puede representar alternativamen-
te cualquier RNA/cDNA. El pretratamiento con RNAasa
es obligatorio en la valoracin de los RNA blanco (PCR
transcriptasa reversa [RT] in situ) y debe incluirse en la
amplicacin de las plantillas del DNA para minimizar las
seales positivas falsas que se originan del RNA celular.
Nuestro grupo ha encontrado que la combinacin de RNA-
asa A y T1 proporciona resultados superiores.
El uso de un par de iniciadores del gen de control de
referencia junto con la sonda especca blanco valora el
grado de capacidad de pegado de la secuencia de la son-
da blanco y de la creacin de un resultado positivo falso.
La adicin de un iniciador en la mezcla de amplicacin
genera una PCR asimtrica, con una reduccin cuantita-
tiva en la cantidad de producto sintetizado. Los iniciadores
inaplicables con la sonda inaplicable no deben generar una
seal. La especicidad del componente de hibridacin in
situ de la PCR-IS se valora empleando una sonda inaplica-
ble con iniciadores blanco especcos.
El papel de la dimerizacin iniciador-iniciador y la oli-
gomerizacin del iniciador en la generacin de seales po-
sitivas falsas se valora excluyendo la DNA polimerasa Taq,
mientras la contribucin de la elongacin no especca del
DNA fragmentado en cortes de tejido se examina con la
exclusin de los iniciadores. Lo ltimo es un control extre-
madamente importante para IS-PCR.
En la valoracin de la RT-IS PCR, la omisin del paso de
la transcriptasa reversa es importante. Como en la hibrida-
cin in situ de rutina, los controles de hibridacin y los con-
troles de deteccin son esenciales para excluir los resultados
falsos positivo/negativo debido a la falla del paso de IS o a la
tincin aberrante de los tejidos por el sistema de deteccin.
Amplicacin del RNA en la clula
Preparacin de las clulas y del tejido
Las tcnicas que se disean especcamente para la ampli-
cacin de los RNA blanco son RT IS-PCR y RT PCR-IS.
En general, los RNA blanco son ms fciles de ampli-
car que los DNA blanco, por el nmero elevado de copias
de inicio del blanco. Una vez que las clulas o los tejidos
se remueven del cuerpo, la degradacin del RNA comienza
casi de manera instantnea. Las RNasas se encuentran pre-
sentes en el ambiente, los dedos, los guantes y en las reas
superiores tipo terrazas; slo por mencionar algunas de sus
muchas fuentes. Las soluciones del jador contienen RNasas
especcas que degradan el RNA, y el tejido en proceso, otra
vez contaminado por RNasas, minimiza la cantidad de RNA
blanco que puede amplicarse.
Debe crearse un ambiente libre de RNasa al iniciar la prepa-
racin. Para la preservacin ptima del RNA en los cortes del
tejido, la jacin inmediata en soluciones libres de RNasa debe
llevarse a cabo. Deben utilizarse alcohol, cido actico:alcohol
y jadores con formaldehdo amortiguado neutro preparados
en agua esterilizada tratada con DEPC (dietilpirocarbonato).
Todos los protocolos para detectar el cido nucleico deben em-
plear otra vez, en lo posible, las condiciones libres de RNasa.
Metodologa y qumica de la amplicacin
Al iniciar, se crea una plantilla de cDNA usando una enzima
transcriptasa reversa, por lo general se utiliza la enzima trans-
criptasa reversa del virus de la leucemia del ratn Moloney
(MMLV), seguido por la amplicacin de la plantilla recin
sintetizada del cDNA. Un paso de hibridacin in situ posam-
plicacin puede emplearse (RT PCR-IS), en cuanto a la DNA
PCR-IS. Estas tcnicas emplean dos pasos, es decir, la trans-
cripcin reversa y despus la amplicacin. El grupo de traba-
jo del autor ha descrito una metodologa de un paso usando la
enzima rTth DNA polimerasa que evita la necesidad de dividir
la reaccin. La rTth polimerasa posee actividad tanto de trans-
criptasa inversa como de DNA polimerasa.
Controles para la amplicacin in situ del RNA
Son los mismos controles que se utilizan en la amplicacin in
situ del DNA. La omisin del paso de la transcriptasa inversa
rinde, obviamente, un resultado dbil o negativo. La digestin
con DNAasa paralela debe llevarse a cabo en todos los ensayos
del RNA en la clula, en particular en la etapa de optimiza-
cin.
Problemas de la amplicacin
por PCR en la clula
Muchos grupos han encontrado problemas con la PCR in situ
(OLeary y cols., 1995, 1996a, 1996b; Teo y Shannak, 1995).
Los factores importantes incluyen la naturaleza del material de
inicio, condiciones de la jacin y la naturaleza conformacio-
nal del blanco que se va a amplicar. La PCR del DNA en la
clula in situ est llena de dicultades, especialmente con
PROBLEMAS DE LA AMPLIFICACIN POR PCR EN LA CLULA 511
el material embebido en parana, donde la incorporacin
no especca de secuencias del nucletido puede ocurrir en
presencia de la DNA polimerasa Taq, y es opinin del autor
que esta tecnologa no debe utilizarse.
La PCR-IS parece ms especca, en especial si se
emplea una modicacin tipo Hot Start o, de manera al-
ternativa, si se utilizan diferentes pares del iniciador simul-
tneamente. Los protocolos de la PCR-IS, en general, son
ms sensibles pero, en contraste con la PCR en solucin, es
menos eciente, slo con la evidente amplicacin lineal. El
grado de amplicacin es difcil de valorar. Nuovo y cols.
(1991, 1992, 1993, 1994, 1995) reportan un aumento de 200
a 300 veces en el producto, en contraste con Embretson y co-
legas (1993), que estiman slo un aumento de 10 a 30 veces.
La experiencia del autor tiende a apoyar al segundo autor.
La limitacin principal con la DNA IS-PCR, como se
menciona antes, es la incorporacin no especca de nucle-
tidos por medio de la DNA Taq polimerasa en sitios del DNA
fragmentado. sta es ciclo-dependiente y DNA polimerasa-
dependiente y puede ocurrir en ausencia de iniciadores y/o
con una modicacin del tipo Hot Start. Por tanto, el uso
rutinario de la PCR in situ del DNA no es an factible, debi-
do al riesgo de generar seales falsas. Gosden y cols. (1991)
reportan en trabajos previos con cromosomas el uso de mto-
dos para unir la cadena de DNA, para eliminar la incorpora-
cin falsa durante la PCR in situ del DNA. El pretratamiento
con dideoxi de obstruccin tambin se ha documentado para
eliminar la incorporacin no especca, pero ste no es siem-
pre acertado. Nuestro grupo ha utilizado la superdesnatura-
lizacin de la hebra, es decir, donde el dsDNA se desnatu-
raliza a temperaturas altas. El DNA entonces se mantiene en
un estado desnaturalizado por un periodo extendido (5 a 10
min) pero, otra vez, esto produce resultados inconstantes.
Secuestro de reactivos en el procedimiento
Concentraciones elevadas de reactivos se requieren para que
se logre la amplicacin acertada (del orden de 2 a 5 veces).
Esto se debe al secuestro de reactivo, ya que los reactivos
se adhieren a los cubreobjetos o a los materiales de recu-
brimiento utilizados. Adems, los reactivos pueden tambin
intercalarse con residuos del jador que permanecen en los
tejidos. El pretratamiento de los portaobjetos con 0.1 a 1% de
albmina srica bovina (BSA) permite una reduccin en la
concentracin del reactivo, que puede funcionar al bloquear
este secuestro (OLeary y cols., 1995).
Difusin y contradifusin del amplicn
La difusin del producto de amplicacin (amplicn) desde
el sitio de la sntesis, que puede ocurrir como un resultado
del permeabilizado o el corte y exposicin del citoplasma
y ncleo de la clula, o ambos, se encuentra en ensayos
de la PCR en la clula. Un acercamiento se logra al re-
ducir el nmero de ciclos. Otra estrategia que se emplea
con frecuencia es jar de manera posterior los portaobjetos
en etanol o paraformaldehdo, para ayudar a mantener la
localizacin del producto amplicado. Los acercamientos
alternativos incluyen la jacin de la seccin del tejido con
agarosa o la incorporacin de nucletidos biotina sustitui-
dos, o ambos (anlogos a PCR in situ). Esta ltima modi-
cacin permite la generacin de productos ms evidentes,
menos probables de difundir.
Amplicacin desigual/amplicacin incompleta
En la amplicacin desigual es frecuente que se localice
30 a 80% de clulas que contienen la secuencia blanco de
inters tindose en cualquier momento. Hay muchas ra-
zones para esto, incluyendo la digestin no uniforme con
variaciones en la permeabilidad de la clula, que falla para
disociar por completo los entrecruzamientos DNA-prote-
na histona, y el corte de la clula. Este ltimo factor es una
consecuencia inevitable del corte por micrtomo donde se
crean semiesferas de la clula. Como resultado, el con-
tenido nuclear se expone, dando lugar a dos posibilidades:
a) la secuencia blanco deseada puede no estar presente; b)
la secuencia blanco puede estar presente pero el producto
pudo haber difundido hacia fuera.
Cuadro 52-1 Usos en la clula de las tecnologas de PCR
en patologa celular
Virus DNA y RNA
HIV 1, 2
HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, etc.
HBV, HCV
CMV
Sarampin
HHV 6, 7 y 8
DNA del HSV
LGV (linfogranuloma venreo)
Oncogenes, genes supresores de tumor y marcadores de
malignidad
Mutaciones p53
Mutaciones ras (H-Ki, N-ras)
Rearreglos de gen (t11; 22, t11; 14)
Mapeo del cromosoma (PRINS y PRINS que completan un
ciclo)
Rearreglos del receptor de la clula T
Metaloproteinasas y sus inhibidores
Expresin del factor EGF
xido ntrico sintasa
Trabajo futuro con los ensayos
basados en la PCR en la clula
Los desarrollos recientes de la PCR TaqMan en la clula
permiten que los investigadores cuantiquen directo las
transcripciones dentro de las muestras de clulas y tejidos.
La capacidad de utilizar sistemas de deteccin a dos colo-
res permite la identicacin simultnea de un gen house-
keeping y de un gen problema.
La PCR TaqMan celular muestra la cintica clsica de
la sonda TaqMan, con quenching o extincin de la uores-
cencia visible despus de determinado nmero de ciclos.
Esto se debe al espacio de volumen limitado del citoplas-
ma/ncleo y a la proximidad de las secuencias de las son-
das extintor y del reportero en exceso molar en el estado
libre, que sigue a la hidrlisis de la sonda.
El descubrimiento de la PCR TaqMan en la clula debe,
en teora, hacer posible que se introduzcan matrices de
TaqMan para el anlisis cuantitativo directo. Esto ofrece una
mayor ventaja sobre las plataformas de la matriz de hibri-
dacin del SNP y del cDNA convencionales, y permite, por
primera vez, la cuanticacin de los genes de loci genticos
mltiples simultneamente. El cuadro 52-1 lista el uso actual
de los anlisis de la clula con PCR en la patologa celular.
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TRABAJO FUTURO CON LOS ENSAYOS BASADOS EN LA PCR EN LA CLULA 513
53
Anlisis de SNP de alta densidad y de arreglos de cDNA
Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth, Jon Sherlock, Stephen Finn,
Esther ORegan, Steve Picton y John OLeary
Introduccin
Cincuenta aos despus del descubrimiento de la doble h-
lice del DNA, la secuencia de referencia para el Homo sa-
piens fue presentada (Venter y cols., 2001; Lander y cols.,
2001; Consorcio IHGS, 2001). El esfuerzo internacional
de secuenciar 3 mil millones de letras de DNA dentro el
genoma humano ha llevado a una apasionante nueva era
genmica. Los microarreglos de DNA aportan un adjunto
importante en la explotacin de un territorio genmico des-
conocido, en particular en el rea de la expresin del gen.
Existe una amplia creencia en que los millares de genes
y sus productos (es decir RNA y protenas) en un organis-
mo viviente dado funcionan de una manera complicada y
orquestada, razonamiento que aloja el potencial para una
variedad de modalidades diagnsticas y teraputicas. Los
mtodos tradicionales en la biologa molecular trabajan por
lo general sobre la base de un gen dentro de un experimen-
to, lo que signica que el rendimiento del procesamiento
es muy limitado y el cuadro completo de la funcin del
gen es difcil obtenerlo.
En los ltimos aos, una nueva tecnologa, llamada mi-
croarreglo de DNA, ha cautivado el inters creciente entre
los bilogos. Esta tecnologa abarca ensayos que generan
simultneamente datos pertenecientes a los niveles de ex-
presin de muchos miles de genes. Esta facilidad represen-
ta un aumento enorme en el rendimiento del procesamiento
(Elkins y Chu, 1999; Lockhart y Winzeler, 2000; Schena y
cols., 1995).
Un ordenamiento es un arreglo de muestras. Provee un
medio para el emparejamiento de muestras conocidas y des-
conocidas de DNA, de acuerdo a reglas de apareamiento de
bases, y para la automatizacin del proceso en la identica-
cin de las muestras desconocidas. Microarreglos de DNA,
o chips de DNA, se fabrican con robtica de alta velocidad,
sobre un microarreglo/sustrato slido, para lo cual se utili-
zan sondas con identidad conocida para determinar la unin
complementaria, y para permitir masivamente los estudios
en paralelo de la expresin y descubrimiento del gen. Las
dimensiones espaciales de una muestra tpica en microarre-
glos son menores a 200 m de dimetro, y contienen nor-
malmente miles de espacios.
El mercado de los microarreglos ha crecido con rapidez
alarmante en los ltimos aos. Como el precio de esta tec-
nologa ha declinado, se presenta una tendencia a cambiar
opciones caseras de Hgalo Usted Mismo (por sus siglas
en ingls DIY) por la gama creciente de dispositivos co-
merciales actuales disponibles.
Tecnologa Affymetrix GeneChip
Se sintetizan matrices de oligonucletidos de Affymetrix
usando un proceso que combina la fotolitografa y una qumi-
ca combinatoria (Pease y cols., 1994). Las matrices se com-
ponen de un fragmento de cuarzo, que se hidroxila de manera
natural. Un grupo de mscaras fotolitogrcas se manufactura
permitiendo la adicin secuencial de nucletidos especcos
516 CAP. 53 ANLISIS DE SNP DE ALTA DENSIDAD Y DE ARREGLOS DE cDNA
para ubicaciones particulares sobre el chip. Cuando la luz
ultravioleta se dirige sobre la mscara en el primer paso de la
sntesis, los grupos de enlace expuestos se desprotegen y es-
tn disponibles para el acoplamiento nucleotdico. La nica
solucin tipo nucletido es entonces lavada sobre la super-
cie del fragmento de cuarzo y se une a los grupos de enlace
activados. En el siguiente paso, otra mscara se coloca sobre
el fragmento de cuarzo para otra ronda de desproteccin y
acoplamiento. El proceso se repite secuencialmente hasta que
las sondas alcanzan su longitud completa, como se ilustra
en la gura 53-1.
Los genes individuales se representan sobre el GeneChip
usando una serie (tpicamente 11-20) de oligonucletidos
25-mer diferentes con apareamiento perfecto. El grupo
HG-U133 contiene 11 pares de sondas por grupo. Los gru-
pos de sondas se localizan dentro de 600 bp de secuencia as-
cendente desde el sitio poli-A, pues esta porcin del mRNA
se convierte ms ecazmente dentro del blanco marcado.
Se seleccionan las sondas con base en su complementarie-
dad con el gen seleccionado o con la marca de secuencia
expresada (EST), individualidad (singularidad especca)
relativa con otros genes relacionados y sus caractersticas
de hibridacin previstas. Para cada grupo de sondas oli-
gonucletidas con apareamiento perfecto (PM), un grupo
pareado de sondas con apareamiento incorrecto (MM) est
tambin presente sobre el microarreglo. La secuencia oligo-
nucletida que se emplea para las sondas MM es idntica a
la de la sonda PM pero con una sola sustitucin nucleotdica
en la posicin central. La seal de hibridacin especca se
determina restando la seal de la uorescencia de las sondas
MM menos la de la uorescencia de las sondas PM, y se
promedia sobre todos los pares de sondas que representan
un gen particular. Esta seal de la uorescencia promedio
es una medida de la cantidad de transcripcin.
El algoritmo de deteccin del software Affymetrix usa
intensidades del par sonda para generar un valor p de la
deteccin y determinar un actual/ausente para cada gen
individual. Cada par sonda en un grupo de sonda tiene
un valor de discriminacin, que se calcula para cada par
sonda y se compara a un umbral predenido, Tau. El va-
lor de discriminacin es una propiedad bsica de un par
sonda que describe su capacidad para detectar su blanco
previsto. Mide la diferencia de la intensidad especca del
blanco del par sonda (PM-MM) relativa a su intensidad de
hibridacin total. Los pares sonda con valores ms altos
que Tau optan por la presencia de transcripcin. Los pares
sonda con valores ms bajos que Tau optan por la ausencia
de transcripcin. Un valor p tambin se genera cuando se
reeja la conanza en la llamada deteccin. Esta estrate-
Figura 53-1 Affymetrix utiliza una combinacin de fotolitogra-
fa y de qumica combinatoria para fabricar microarreglos Gene-
Chip. Imagen suministrada por cortesa de Affymetrix.
Figura 53-2 Diagrama esquemtico del procedimiento para
el anlisis de la expresin del gen usando GeneChips de Affy-
metrix. La imagen aparece por cortesa de Affymetrix.
Agua
Luz
(desproteccin)
Mscara
25-mer
GeneChip
Microarreglo
Repetir
RNA total
GeneChip
Expresin
Microarreglo
Hibridacin
Transcripcin
inversa
Lavar y
teir
cDNA
Transcripcin
in vitro
cRNA marcado
con biotina
Fragmentacin
cRNA
fragmentado
marcado con biotina
Escanear y
cuanticar
SISTEMA DE EXPRESIN CON MICROARREGLO DE APPLIED BIOSYSTEMS 517
gia permite alta sensibilidad a concentraciones bajas del
blanco y preserva la capacidad para discriminar entre las
secuencias con relaciones muy estrechas.
En contraste con las matrices de cDNA, que utilizan una
aproximacin por hibridacin de dos colores en la cual el
blanco marcado y el control se hibridizan para el mismo
microarreglo, cada GeneChip de Affymetrix se disea para
analizar una sola muestra de RNA (g. 53-2). El mRNA se
convierte a cDNA de doble hebra mediante transcripcin
inversa, usando un cebador oligo d(T) diseado para con-
tener un sitio promotor T7 RNA. Los nucletidos marca-
dos con biotina son incorporados directamente al blanco del
cRNA por transcripcin in vitro con una T7 polimerasa.
El cRNA marcado se corta en fragmentos <200 bp y se hi-
bridiza para GeneChip. La seal uorescente se obtiene des-
pus de teir el GeneChip con estreptavidina-coeritrina.
Perl de SNP y matrices de DNA
Las enfermedades genticas complejas requieren muchos
miles de marcadores y centenares de muestras para pro-
porcionar suciente poder para identicar regiones del ge-
noma y genes responsables de un fenotipo mensurable. Se
ha estimado que los polimorsmos de un solo nucletido
(SNP) ocurren en promedio cada 1 000 bases en el genoma
humano. Estos polimorsmos tienen gran potencial para
utilizarse como marcadores genticos en muchas aplica-
ciones, incluyendo ligamiento, asociacin y prdida de he-
terocigosidad en el cncer.
La genotipicacin por SNP actual implica el uso de
iniciadores especcos del sitio, una prctica que potencial-
mente aumenta el costo y limita el nmero de marcadores
del SNP que pueden ensayarse en un solo experimento. Sin
embargo, Affymetrix ha lanzado GeneChip

Mapping 10
K Array. Este sistema puede ensayar ms de 10 000 SNP
en un solo experimento escalable que no se basa sobre la
PCR especca del sitio (Mei y cols., 2000; Sellick y cols.,
2003). La compaa propone lanzar una serie de dos se-
cuencias (Centurion) en un futuro prximo para analizar
ms de 100 000 SNP por muestra, permitiendo estudios
completos de la asociacin del genoma.
GeneChip

Mapping 10 K Array, y microarreglos subse-
cuentes de Centurion, confan en el ensayo del muestreo del
genoma completo (WGSA). Este esquema es una aproxi-
macin genrica para la reduccin de la complejidad del
genoma completo y permitir la hibridacin ecaz a un mi-
croarreglo que contiene ms de 10 000 SNP (Cutler y cols.,
2001). El ensayo trabaja en cuatro pasos simples: digestin
por restriccin del DNA genmico; unin de un adaptador
especco; amplicacin con un cebador de PCR, y frag-
mentacin del DNA, seguido por el marcaje y la hibridacin
para el microarreglo (Kennedy y cols., 2003).
Para las matrices Centurion, la etapa de amplicacin
por PCR usa la enzima Pfx para amplicar fragmentos de
500 a 2 000 bp reduciendo la complejidad del genoma a un
total cercano a 300 Mb. Esta reduccin de la complejidad
permite la genotipicacin exacta por hibridacin del alelo
especco para ms de 50 000 SNP en cada microarreglo,
con requerimientos de entrada del ensayo de slo 250 ng de
DNA humano por microarreglo, o 500 ng por serie.
Sistema de expresin con microarreglo
de Applied Biosystems
El sistema de expresin con microarreglo de Applied Bio-
systems se basa en un diseo de microarreglo que repre-
senta el genoma humano completo, utiliza datos actuales
de transcripcin y confa totalmente en anotaciones del gen
que han sido validadas por expertos en salud humana. Cada
sonda es parte de una base de datos correlativa que incluye
tanto la informacin de Celera Genomics como aquellas
del dominio pblico. Combinado con qumicos quimio-
luminiscentes especialmente desarrollados, este sistema
completo aporta mayor sensibilidad de sonda y de detec-
cin que las generaciones anteriores de sistemas de mi-
croarreglo. Adems, la informacin de la anotacin para
todos los 31 097 genes humanos que se representan so-
bre el microarreglo se incluye en la base de datos Oracle

que se proporciona con el sistema 1700. Los fabricantes
sugieren que el resultado sea un sistema completo capaz
del anlisis rpido y exacto de los datos del microarreglo
para la investigacin de la expresin gnica. Los experi-
mentos continuos de microarreglos pueden lograrse por
unin con ensayos cuantitativos de PCR TaqMan
basados
en sondas para tiempo real, que permiten la validacin de
datos del microarreglo, la cuanticacin absoluta de la
produccin de transcripcin y la investigacin de eventos
alternativos que se traslapan.
El sistema expresin con microarreglo de Applied Bio-
systems (gs. 53-3 a 53-6) consiste de un analizador (ana-
lizador quimioluminiscente 1700 de Applied Biosystems)
que puede registrar microarreglos bajo quimioluminiscen-
cia, para examinar y medir la expresin gnica a niveles
muy bajos y en uorescencia, para localizar caractersticas
puntuales del cuadriculado automtico. Diseado para in-
corporar una cmara fotogrca CCD avanzada, el sistema
1700 registra precisamente la seal quimioluminiscente
que se produce cuando las transcripciones marcadas se
hibridan para un microarreglo. Adems, el sistema 1700
registra el microarreglo en un modo uorescente y lo re-
presenta cuadriculado, normaliza e identica caractersti-
cas con exactitud para localizarlas con precisin, incluso
en ausencia de productos con expresin gnica que se unen
a sondas del microarreglo.
Figura 53-3 Representacin a color de la formacin y
disposicin del cuadriculado 1700 de Applied Biosystems.
seales uorescentes (usadas para el cuadriculado y la
cuanticacin); control; sonda/blanco.
Figura 53-4 rea magnicada de un microarre-
glo 1700, mostrando la escala cuantitativa quimio-
luminiscente (echa).
Figura 53-5 Sistema Microarreglo 1700 de Applied Biosystems.
Figura 53-6 Microarreglos de Applied Biosystems sellados den-
tro de un contenedor de plstico desechable.
ILUMINA, MICROARREGLO DE ORDENAMIENTOS 519
El sistema expresin con microarreglo de Applied
Biosystems utiliza los datos genmicos ms recientes, combi-
nados con qumicas sensibles de deteccin, para proporcionar
un anlisis comprensivo de la expresin gnica. Una variedad
de equipos complementarios est disponible e incluye:
Equipo de etiquetas RT quimioluminiscentes, que con-
vierte el mRNA de las clulas en cDNA marcado con
digoxigenina.
Equipo de etiquetas RT-IVT quimioluminiscentes, que
convierte el mRNA de las clulas en cRNA marcado con
digoxigenina, mientras entra el RNA simultneamente y
amplicando linealmente. El cDNA o el cRNA marcado
con digoxigenina resultante se hibrida especcamente
para el microarreglo Applied Biosystems.
Equipo de deteccin quimioluminiscente, que se utiliza
para visualizar las caractersticas que tiene el cDNA o el
cRNA marcado con digoxigenina acoplada a sondas nu-
cleotdicas. La visualizacin se logra incubando el mi-
croarreglo con un conjugado antidigoxigenina-fosfatasa
alcalina. La fosfatasa alcalina hidroliza un sustrato qui-
mioluminiscente y emite la luz a una longitud de onda
de ~ 458 nm. La intensidad de la seal es proporcional
al nivel del mRNA expresado en las clulas.
Los fabricantes arman que las seales quimioluminiscen-
tes que se producen sobre el microarreglo proporcionan
una sensibilidad ms alta y una mayor gama dinmica que
los microarreglos uorescentes convencionales anteriores,
y adems sugieren que puedan obtenerse datos de alta cali-
dad con el sistema expresin con microarreglo de Applied
Biosystems a partir de material inicial tan escaso como 100
ng del RNA total.
Los microarreglos para investigar el genoma humano
de Applied Biosystems se disean usando datos pblicos
y de Celera para todos los genes conocidos (31 097). Es-
tos microarreglos contienen oligonucletidos con un di-
metro caracterstico <180 m y un espacio >45 m (borde
a borde) entre cada caracterstica. Los oligonucletidos se
disean para evaluar transcripciones de cada gen del geno-
ma humano. Las sondas oligonucleotdicas se sintetizan en
Applied Biosystems y se disean para asegurar la especi-
cidad mxima. Antes de la fabricacin del microarreglo,
todas las sondas se analizan con un anlisis por espectro-
metra de masas para el control de calidad. Los microarre-
glos de Applied Biosystems se sellan dentro de un cartucho
preensamblado, que contiene un puerto cargante que pueda
ser resellado fcilmente despus de que se hayan agregado
las muestras del cDNA o del cRNA marcado. Cuando la
hibridacin naliza, el cartucho se desmonta y se desecha.
Los microarreglos entonces se procesan en lotes y se lavan
las sondas hibridadas.
La base de datos Oracle para la anotacin del blanco
(expresin gnica), que es parte del sistema expresin con
microarreglo de Applied Biosystems, contiene datos re-
cientes de informacin gnica esenciales para todos los la-
boratorios contratados para estudios de expresin gnica
en la actualidad y provee el acceso para el almacenaje y
consulta completos para todos los datos experimentales. La
base de datos incluye, por ejemplo, las siglas del gen, los
nombres del gen, las referencias cruzadas para la identi-
cacin del gen, las ontologas pblicas (GO) y de Celera
(Panther
) del gen, y otra informacin relevante. Adems,

los fabricantes prometen poner al da la informacin con los
datos ms recientes sobre transcripciones dirigidas por mi-
croarreglos.
Illumina, microarreglo de ordenamientos
Las matrices de expresin ofrecidas por la compaa Illumi-
na son una manera fundamental de matrices: el autoensam-
blaje aleatorio de perlas dentro de sustratos de micropozos
estandarizados. stas utilizan los avances tecnolgicos en
bra ptica y las industrias con sistema microelectrome-
cnico (MEMS) para construir los sustratos que contienen
mltiples miles de pozos en sus supercies (g. 53-7).
Figura 53-7 Diseo de una sonda Illumina e inmovilizacin de
la perla. Imagen cortesa de illumina.com
El almacenaje cuantitativo de las perlas que se colectan
se autoensamblan dentro de sustratos grabados en micro-
pozos para producir una plataforma del microarreglo de
alta densidad. Dos formatos de microarreglo de matrices
diferentes, el microarreglo de ordenamientos de Sentrix,
y BeadChip de Sentrix, estn actualmente disponibles.
El microarreglo de ordenamientos utiliza paquetes -
bropticos que contienen casi 50 000 lamentos individuales
de bras conductoras de luz que estn qumicamente grabadas
para crear un pozo de 3 m en el extremo de cada lamento.
Los paquetes del microarreglo se agrupan en una congura-
cin de 96 matrices que se emparejan en el pozo espaciando
las placas de microtitulacin estndares. Este formato nico
permite que los usuarios conduzcan experimentos simples y
rpidamente sobre 96 matrices de forma simultnea. Por otra
parte, la plataforma puede incorporarse de manera fcil en
rutinas automticas empleando equipo robtico estndar, que
minimiza los errores, trabajo y requerimientos de recursos.
El formato BeadChip es una plataforma de tamao es-
pecco sobre un portaobjetos que permite el procesamien-
to de ocho muestras a la vez y puede examinarse en un
escner de lser estndar.
Independientemente del formato del microarreglo, cada
perla contiene cientos de miles de sondas oligonucleot-
dicas unidas en forma covalente. Hasta 1 500 tipos ni-
cos de perla que contienen secuencias diferentes de sonda
se representan en cada microarreglo, con un promedio de
30 veces de redundancia de cada tipo de perla. Despus del
ensamble de la perla, un procedimiento basado en hibrida-
cin se utiliza para descifrar el microarreglo, determinn-
dose qu tipo de perla reside en cada pozo. Este proceso
nal valida el funcionamiento de cada tipo de perla.
Microarreglos de DNA de doble color (g. 53-8)
Con esta tecnologa, cantidades pequeas de sondas se ti-
en sobre una laminilla de cristal usando una impresora
robtica. Las sondas pueden consistir en cDNA, oligonu-
cletidos o productos PCR, cada una complementaria de
un gen especco. El protocolo para el marcaje e hibrida-
cin del blanco para microarreglos es diferente al usado en
la tecnologa GeneChip de Affymetrix. Para comparar la
abundancia relativa de cada gen en dos muestras diferen-
tes de RNA, se realiza un experimento de hibridacin de
dos colores. El RNA total se extrae de las dos muestras, se
marcan empleando dos uorforos diferentes. Los repor-
teros uorescentes se seleccionan con espectros sin trasla-
pe, Cy3 (emisin verde a 540 nm) y Cy5 (emisin roja a
650 nm). Estas marcas uorescentes pueden incorporarse
directamente por transcripcin inversa con un cebador oli-
go-dT en presencia de los nucletidos uorescentes Cy3-
dUTP, o Cy5-dUTP, o en forma indirecta en una etapa de
amplicacin del T7 RNA. El cDNA o el cRNA marcado
de la muestra de la prueba y de la referencia se mezclan,
los colorantes que no se incorporan se eliminan y la mezcla
se hibridiza para el microarreglo. El cociente Cy3:Cy5 se
determina y alterna la abundancia relativa de esa secuencia
especca en las dos muestras.
Microarreglos de MWG (g. 53-9)
Los microarreglos MWG se marcan con grupos de oligonu-
cletidos diseados a partir de la base de datos CodeSeq
.
La base de datos CodeSeq
es una base de datos MWG

Extracto de mRNA
Enfermedad
Mezcla
Marca roja Marca verde
Extracto de mRNA
Normal
Transcripcin
inversa
para cDNA
Desnaturalizar
Hibridar
Oligos marcados sobre el cristal
Oligos sintetizados sobre el cristal
Productos cDNA-PCR
Figura 53-8 Perl de la expresin gnica usando microarreglos.
Figura 53-9 Diseo de la sonda MWG.
relacionada con protenas no redundantes derivada de las
secuencias pblicas para cada gen; las secuencias redun-
dantes y parciales se eliminan para cada transcripcin. Los
genes y las transcripciones especcas en las secuencias se
representan por oligonucletidos de 50-bases especcos,
que son apareados en contenido GC y TM y estn libres de
estructuras secundarias.
Manejo de datos y anlisis secundario
Las cantidades extensas de datos que emanan de investi-
gaciones con microarreglos aplicados al genoma humano
pueden ser impresionantes, pero sin la interpretacin que
todo esto contiene, es una masa de datos. La funcin del
gen es uno de los elementos clave que los investigadores
desean extraer de experimentos con microarreglos, y una
variedad de herramientas analticas secundarias est dispo-
nible con este n.
Quizs debido a la novedad relativa de la tecnologa del
microarreglo, o el paso acelerado al cual la tecnologa
se est expandiendo, la presentacin del anlisis secunda-
rio de datos sufre de carencia de estandarizacin. Los estu-
dios de expresin con microarreglos son capaces de produ-
cir cantidades inmensas de datos del transcriptoma. Tales
datos pueden generar incursiones en la funcin y la inte-
raccin del gen en las diversas rutas metablicas (Young,
2000; Lockhart y Winzeler, 2000) pero slo si se persigue
una aproximacin estandarizada para la presentacin de los
datos (Simon y cols., 2002; Barrett y Kawasaki, 2003).
Los datos de la expresin del gen son complicados por
su naturaleza. Deben analizarse en el contexto de una serie
de parmetros, tales como el tipo de microarreglo que se
usa, la naturaleza del material biolgico que se examina,
los protocolos empleados con la muestra de RNA y la natu-
raleza del calibrador elegido. Este ltimo factor es particu-
larmente importante, dado que los microarreglos actuales
no miden ni cuantican la expresin per se; ms bien se
calculan cambios relativos o dobleces comparados con una
muestra del calibrador. La carencia de estandarizacin en-
tre los genes de referencia o controles usados es una de las
fuentes ms importantes de confusin al intentar comparar
los datos generados por diferentes fuentes. Diversas pla-
taformas del microarreglo y el diseo experimental tam-
bin contribuyen con datos no estandarizados, produciendo
comparaciones directas difciles o imposibles.
Brazma y cols. (2001, 2002) recientemente propusieron
un sistema con objeto de estandarizar los datos del microarre-
glo. Estos autores aspiraron a denir la informacin mni-
ma que debe reportarse para asegurar la interpretacin de
los resultados generados, as como su potencial validacin
independiente. Su sistema lleva las siglas MIAME (infor-
macin mnima sobre un experimento con microarreglo).
Con el sistema MIAME, los datos y las anotaciones de un
experimento con microarreglos necesitan conformarse con
las siguientes restricciones: la informacin registrada so-
bre cada experimento debe ser suciente para interpretar el
experimento y con bastantes detalles para permitir compa-
raciones con experimentos similares y la replicacin, y la
informacin debe estructurarse de una manera que permita
la consulta til y el anlisis y extraccin de los datos autom-
ticamente. Otro principio que sostiene MIAME es la con-
cesin de que el rea se desarrolla rpido. Sugiere que los
estndares simplemente requieren la descripcin de da-
tos con detalle y anotaciones sucientes para facilitar que
las partes interesadas entiendan cmo se alcanzaron las
conclusiones. El programa detalla los componentes varia-
bles esenciales de un experimento con microarreglo e indica
los puntos que necesitan incluirse en cualquier manuscrito
que se reera a esta rea. Por ltimo, el sistema reconoce
el uso de la tecnologa con microarreglo para propsitos
diferentes al anlisis de la expresin (p. ej., perlamiento
de SNP) y otras versiones de los sistemas se planean para
acomodar este aspecto.
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54
Anlisis por microarreglo de la hibridacin
genmica comparativa de los tejidos humanos
Esther ORegan, Paul Smyth, Stephen Finn, Cara M Martin, Orla Sheils y John OLeary
Antecedentes de hibridacin genmica
comparativa (CGH) y de su microarreglo
Histricamente, el anlisis citogentico de tumores slidos
ha resultado difcil, y aunque hay muchas tcnicas que se
usan en la deteccin de cambios genticos implicados en tu-
mores slidos, todas tienen sus limitaciones. La citometra
de imagen, que se utiliza para detectar clones aneuploides, no
es muy sensible para detectar cambios genticos pequeos,
mientras la cariotipicacin presenta sus propias dicul-
tades, es muy especializada, consume tiempo y requiere
cultivos tisulares de tumores slidos, los cuales pueden ser
inestables. Los estudios de prdida de heterocigosidad y de
hibridacin in situ uorescente (FISH) proveen informacin
muy detallada sobre uno o una cantidad pequea de genes
o regiones cromosmicas especcas a la vez; sin embargo,
impide una apreciacin global del genoma entero.
En 1992, Kallioniemi y cols. desarrollaron un mtodo ci-
togentico molecular, la hibridacin genmica comparativa
capaz de detectar y mapear la variacin relativa de la canti-
dad de la copia de la secuencia de DNA a travs del genoma
completo en un solo experimento. Esta tcnica revoluciona-
ria, que utiliza una cantidad pequea de DNA, permite que
se investigue el genoma completo y se detecten prdidas y
ganancias en todos los cromosomas de modo simultneo, sin
la necesidad de cultivos celulares (Hermsen y cols. 1996).
El grupo de Kallioniemi en la Universidad de Califor-
nia, San Francisco, us inicialmente CGH para detectar
aberraciones cromosmicas novedosas en 11 variedades de
clulas cancergenas, y desde entonces la literatura sobre el
uso de esta tcnica para detectar alteraciones genticas est
en crecimiento y desarrollo muy rpido (Forozan y cols.,
2000). La ventaja de esta tcnica es su capacidad de tami-
zaje genmico amplio, que requiere menos tiempo y traba-
jo que la FISH convencional. Las aplicaciones de CGH en
la investigacin del cncer incluyen el tamizaje de tumores
para aberraciones genticas, y el anlisis de los perles
de alteracin gentica dentro de tumores para ampliar la
comprensin de la progresin y el pronstico del tumor.
Aunque es una poderosa herramienta en el diagnstico y
la investigacin, CGH tiene la limitacin de emplear cro-
mosomas metafsicos en estado condensado para la visua-
lizacin, haciendo difcil distinguir las seales traslapadas
de genes en estrecha proximidad uno al otro, dicultando
la localizacin precisa de una secuencia de inters. La re-
solucin para detectar la prdida del nmero de copias es
mayor o igual a 10 MB, y para las ganancias del nmero de
copias, es no menos de 2 MB. Otra dicultad que se pre-
senta en CGH es la necesidad de personal tcnico experi-
mentado con entrenamiento en citogentica, con capacidad
de identicar y determinar sitios de cambios en el nmero
de copias.
En 1995, Schena y cols. desarrollaron el microarreglo,
en el cual los clones de cDNA de blancos con hibridacin
especca del gen de plantas se usaron para medir de mane-
ra cuantitativa la expresin de los genes correspondientes
de la planta. El xito de esta herramienta cientca novedo-
sa condujo al uso de los microarreglos para el anlisis del
genoma humano, permitiendo colocar una representacin
completa de ste sobre una sola laminilla. Los microarre-
524 CAP. 54 ANLISIS POR MICROARREGLO DE LA HIBRIDACIN GENMICA COMPARATIVA DE LOS TEJIDOS HUMANOS
glos o chips, como se conocen, son arreglos ordenados
de muestras individuales de cido nucleico, que se inmo-
vilizan bajo la forma de rejilla sobre una supercie sli-
da como el cristal, cromo, silicio, etc. (Maughan y cols.,
2001). El anlisis con microarreglos ahora es una tecno-
loga elemental que permite el anlisis de la variacin de
la secuencia del DNA, de la expresin gnica, niveles pro-
teicos, tejidos y las clulas en un formato paralelo extenso
(Stears y cols., 2003). Desde el desarrollo de los microarre-
glos, las limitaciones reconocidas de CGH convencional se
han superado al acoplarlas a la tecnologa del microarreglo.
En vez de usar cromosomas metafsicos, la CGH se aplica
a secuencias genmicas del DNA unido a las laminillas.
Este sistema aumenta de forma signicativa la resolucin
para detectar regiones de desequilibrio, y tambin evita que
se requieran citogenetistas experimentados.
Apreciacin global de la hibridacin
genmica comparativa
La CGH implica el uso de DNA especco de la enferme-
dad o del tumor marcado con un uorocromo verde, mez-
clado (1:1) con DNA normal (diploide) marcado con un
uorocromo rojo. Esta mezcla se hibrida para preparacio-
nes humanas metafsicas normales sobre una laminilla de
cristal. Los fragmentos de DNA marcados compiten por la
hibridacin hacia su sitio de origen, en la extensin metaf-
sica de los cromosomas; la hibridacin del DNA del tumor
se representa con uorescencia verde, mientras la del DNA
normal, con uorescencia roja. Las cantidades relativas
del tumor y del DNA de referencia unidas a cualquier sitio
dado son dependientes de la abundancia relativa de esas
secuencias en las dos muestras de DNA. El cociente de
la uorescencia verde:roja resultante es la representacin
cuantitativa de la prdida o ganancia del material gentico.
En resumen, la ganancia en el nmero de copias del gen
(amplicacin) produce un cociente verde:rojo elevado, y
la prdida del nmero de copias (disminucin) en un sitio
especco produce un cociente verde:rojo reducido.
Las laminillas metafsicas normales se preparan a partir
de cultivos linfocticos de sangre perifrica estimulados con
tohemaglutinina de un humano con un cariotipo normal.
Las clulas se aprisionan dentro de la mitosis, se tratan con
KCl hipotnico, se jan en metanol o cido actico y se
montan sobre laminillas, prestando atencin para reducir al
mnimo el nmero de cromosomas traslapados. Para prepa-
raciones de alta calidad debe existir poco citoplasma, para
mantener los niveles del fondo a un mnimo; los cromo-
somas son oscuros cuando se observan bajo un microscopio
de contraste de fases; y tambin deben tener una longitud
adecuada (cerca de 400 a 500 bandas) (Kahru y cols., 1997).
Por supuesto, como alternativa a este trabajo consumidor
de tiempo, existen laminillas con cromosomas en metafase
completamente preparadas disponibles en el comercio.
Ventajas
La CGH permite detectar y mapear incrementos y decre-
mentos en el nmero de copias de la secuencia de DNA en
cualquier lugar del genoma, aportando informacin sobre
la frecuencia total de ganancias y prdidas; cualquier grupo
de stas cambia las subregiones cromosmicas, y el tamao
y el nmero de las regiones afectadas en cualquier mues-
tra dada del tumor. La capacidad para investigar el genoma
completo en un experimento es la ventaja distintiva que po-
see sobre los estudios de prdida allica, que se dirigen slo
a un sitio a la vez. La CGH no requiere preparacin de ex-
tensiones metafsicas de las clulas que se analizan, lo cual
puede resultar muy difcil en el anlisis de bandeo de tumo-
res slidos, as la CGH es ideal para el uso en el anlisis de
tumores slidos, sobre todo desde que se mejor la tcnica
de extraccin de DNA; y la amplicacin de PCR universal
permite la adquisicin de producciones ms altas de DNA a
partir de casi cualquier clase de espcimen clnico, incluso
de tejido jado en formalina e incluido en parana.
Como ninguna sonda especca o conocimiento previo
de alteraciones genmicas son requeridos, la CGH es muy
conveniente para la identicacin y mapeo de las aberracio-
nes desconocidas, las cuales han conducido a localizaciones
de genes muy importantes (Mertens y cols., 1997).
Limitaciones
La CGH ha demostrado ser una herramienta crtica; sin em-
bargo, tiene un nmero de limitaciones. Primero, slo pue-
de detectar ganancia y prdida de copias. No puede detectar
cambios cromosmicos estructurales que no impliquen ga-
nancia o prdida de copias, por ejemplo, translocaciones o
inversiones equilibradas. Es, por tanto, ms conveniente en
el anlisis de tumores epiteliales, en los cuales el tipo prin-
cipal de inestabilidad gentica es el desequilibrio cromos-
mico, mientras que no es tan til en anlisis hematolgico
o del tumor mesenquimatoso. En segundo lugar, porque el
DNA blanco dentro del cromosoma est supercompactado,
el tamao mnimo de la aberracin de DNA que puede de-
tectarse presenta un problema, es decir, la resolucin es 10
Mb para la prdida, y porque este nivel de la detectabilidad
es una funcin del tamao de la aberracin y del nmero
de copias excesivas, la resolucin de la ganancia es 2 Mb.
Estas limitaciones evitan la localizacin precisa de secuen-
cias de inters. Debe tambin observarse que en el anli-
sis del tumor slido es difcil detectar cambios pequeos
del nmero de copias debido a la contaminacin de clulas
MICROARREGLOS 525
del tumor con clulas normales. El aislamiento de las po-
blaciones celulares puras por microdiseccin se recomienda
para reducir la contaminacin, y, de esta forma, aumentar la
sensibilidad de la deteccin.
Tambin, debido a un nmero alto de secuencias repe-
titivas en las regiones cromosmicas 1p32, 16p y 19p, el
anlisis de estas regiones puede ser inestable (Weiss y cols.,
1999). Finalmente, los patrones de tincin no homognea
o granular pueden surgir de preparaciones del DNA de la
muestra contaminada con altas cantidades de protena o de
fragmentos marcados que son demasiado cortos o largos.
Aplicaciones clnicas
Las aplicaciones de la CGH abarcan desde la gentica
del cncer al diagnstico prenatal. En el cncer, las dele-
ciones y amplicaciones contribuyen a alteraciones en la
expresin de genes y oncogenes supresores del tumor. La
alteracin extensa del nmero de copias de DNA, que tie-
ne un efecto directo sobre los patrones de expresin del
gen global, apoya la teora de que existe un grado alto de
expresin dependiente del nmero de copias en tumores
slidos. Los estudios sobre cncer de mama y cncer renal,
entre otros, han demostrado que el nmero de aberraciones
puede relacionarse con tasas de supervivencia total y con
resultados de los pacientes; por tanto, el nivel de inestabi-
lidad gentica puede ser un indicador til del pronstico
(Isola y cols., 1995; Moch y cols., 1996). La CGH es un
mtodo de tamizaje sensible para la deteccin y el mapeo
de estos genes crticos asociados con el cncer; tambin se
le utiliza para identicar los patrones persistentes de las al-
teraciones genticas de clonas comunes que se encuentran
en muchos tumores, por ejemplo, prdida en el cromosoma
13 y ganancia de 8q (Mertens y cols., 1997).
Las anormalidades de desarrollo, por ejemplo, sndro-
mes de Down, Prader-Willi y cri-du-chat, resultantes de la
ganancia o prdida de una copia de un cromosoma o una
regin cromosmica y, aunque la citogentica convencio-
nal se utiliza para identicar aberraciones cromosmicas
en estos desrdenes, una CGH tiene el valor adicional de
permitir la deteccin de material extragentico desconoci-
do o de aberraciones desequilibradas que pueden conducir
a la identicacin de regiones y genes novedosos respon-
sables del fenotipo de los pacientes.
Microarreglos
El desarrollo del microarreglo en 1992 por Schena y cols.
ha revolucionado la aproximacin a la investigacin bio-
lgica y, desde 1992, se ha convertido muy rpido en una
herramienta estndar en muchos laboratorios de investiga-
cin genmica, con amplias aplicaciones en reas inclu-
yendo las de tamizaje gentico, protemicas, de valoracin
de la seguridad y de diagnstico (Stears y cols., 2003; So-
linas-Toldo y cols., 1997).
En los ltimos aos se introdujo la principal CGH fun-
damentada sobre microarreglos (Pinkel y cols., 1998) y
renado (Mantripragada y cols., 2003). En esta tcnica,
los cromosomas metafsicos de la tcnica CGH clsica se
reemplazan por un microarreglo de alta densidad de clones
genmicos en la forma de cromosomas articiales bacte-
rianos (BAC), cromosomas articiales de levadura (YAC)
o csmidos sobre una supercie slida. Esta combinacin
novedosa de la CGH sobre un chip ha evadido algunas de
las limitaciones de la CGH convencional.
Primero, debido a la carencia de resolucin espacial de
la CGH convencional la resolucin permanece al nivel del
bandeo cromosmico. Sin embargo, combinando CGH y
la tecnologa del microarreglo; esta limitacin se supera,
mejorando la resolucin y permitiendo la identicacin de
desequilibrios genmicos que no se observan al usar CGH
convencional (Mantripragada y cols., 2003). Sin embargo,
es importante anotar que la resolucin se determina por el
tamao de la insercin del DNA clonado y, por tanto, esto
puede variar desde 100 KB hasta 40 MB.
La capacidad para el anlisis simultneo de centenares
de lugares genmicos mejora mucho la precisin de los da-
tos y reduce el costo cuando se compara con mtodos se-
riales. Los microarreglos de CGH aportan una plataforma
para la deteccin de la aberracin que tiene sensibilidad
mejorada, resolucin mejorada, mejor reproducibilidad y
un rendimiento de procesamiento ms alto.
Un microarreglo es un arreglo ordenado de muestras y
tiene dimensiones del punto que son por lo general meno-
res de 200 m de dimetro. Pueden encargarse (Phimister,
1999) o emplearse los tipos disponibles en el comercio.
El microarreglo se fabrica con robtica de alta velocidad
sobre una supercie que debe permitir la unin estable de
los elementos del microarreglo y minimizar las seales
del fondo. La instrumentacin para el microarreglo y la
proyeccin de imagen pueden ensamblarse en el local o
comprarse entre diversos vendedores.
En la gura 54-1 la plataforma microarreglo 300 de
Vysis Genosensor

utiliza la qumica de unin nica que
permite insertar 287 clones grandes como cromosomas ar-
ticiales bacterianos (BAC) y cromosomas P1-articiales
(PAC) para que sean teidos sobre una supercie chapa-
da con cromo. Tres puntos representan cada clon y com-
prenden oncogenes conocidos, genes supresores del tumor,
reas conocidas con prdida de heterocigosidad, microdis-
minuciones comunes, subtelmeros y clones de marcador.
La resolucin depende del tamao del clon y puede variar
entre 100 kb y 40 Mb.
Figura 54-1 Salida del informe nal del sistema matriz 300 de Genosensor
.
MICROARREGLOS 527
El Spectral Genomics SpectralChip
se basa en un
acoplador qumico propietario nico de los fragmentos de
DNA en las supercies de cristal sin tratar, eliminando la
unin no especca de las sondas en las supercies carga-
das positivamente. Esto reduce el ruido y la uorescencia
de fondo. El equipo del microarreglo de SpectralChip in-
cluye dos matrices con 1 003 clones BAC sin traslape que
se extienden sobre al genoma en intervalos cercanos a 3
Mb y se tien por duplicado. Con esto se obtiene una reso-
lucin mayor de 3 Mb.
Es importante observar cierta discrepancia en la nomen-
clatura literaria respecto a los trminos sonda y blanco.
Se siguen las recomendaciones de Phimister y cols., en que
sonda se reere al cido nucleico unido a la secuencia
conocida, mientras que blanco implica la muestra libre
del cido nucleico que se trata de identicar (Emmert-
Buck y cols. 1996).
Material iniciador
Al aislar DNA para el anlisis de la CGH es imprescindible
que el DNA sea de alta calidad. El DNA de tumores slidos
debe obtenerse de tejido fresco o congelado, as se evita
la degradacin extensiva; sin embargo, la adquisicin del
tejido en estos estados no siempre es factible.
El DNA que se extrae de tejido jado en formalina e
incluido en parana se entrecruza y consiste de DNA con
elevada fragmentacin, convirtindolo en subptimo para
el marcaje. Para reducir al mnimo la degradacin, un pe-
riodo de jacin en formalina menor a 24 h es recomen-
dable, y preferible el uso de formalina amortiguada con
un pH neutro. La dilucin del DNA tumoral por DNA del
estroma normal/contaminante circundante puede condu-
cir a cambios en el cociente de DNA tumoral entre DNA
normal, produciendo fallas para detectar aberraciones cro-
mosmicas.
Para minimizar el problema de la heterogeneidad en los
tejidos de tumores slidos, es importante obtener una pobla-
cin pura de las clulas tumorales previo a la extraccin del
DNA. Lo anterior se logra por medio de la microdiseccin
de la muestra, ya sea de manera manual o mediante la tcni-
ca de microdiseccin con lser y captura (LCM).
Con el sistema 2 Arcturus PixCell
, un lser infrarrojo
no perjudicial funde un polmero con temperatura de fu-
sin baja sobre las clulas elegidas, permitiendo que las
clulas se adhieran, aislando las poblaciones celulares de
inters identicadas por medios morfolgicos (Telenius y
cols., 1992).
Sin embargo, el uso de esta herramienta valiosa para
obtener DNA tumoral puro tiene algunas limitaciones. La
tcnica consume tiempo, requiere la captura lser de las
clulas a partir de secciones mltiples para recoleccionar
suciente nmero de clulas que permitan el aislamiento
adecuado del DNA.
La mayor parte de los estudios de la CGH involucran el
uso de los equipos de extraccin de DNA disponibles en
el comercio, de aislamiento de DNA basados en colum-
nas de anidad, y extracciones fenol/cloroformo. Al usar
muestras jadas en formalina e incluidas en parana como
material de inicio, las modicaciones tendrn que reali-
zarse para protocolos de extraccin genricos. Debido al
entrecruzamiento extenso, es aconsejable un periodo de
incubacin prolongado de hasta tres das en la solucin
de lisis celular y la adicin repetida de proteinasa K duran-
te este periodo (Weiss y cols., 1999).
Para un experimento con microarreglo de CGH, se requie-
ren de 0.1 a 0.5 g de DNA. Esto puede ser difcil de obtener,
sobre todo a partir de muestras pequeas de tejido jado en
formalina e incluido en parana. Para mejorar la produccin,
se puede amplicar el genoma completo de manera no espe-
cca. La reaccin en cadena de la polimerasa preparada de
oligonucletido degenerado (DOP-PCR; Speicher y cols.,
1993; Kuukasjarvi y cols., 1997) es una tcnica completa de
amplicacin del genoma eciente y conable.
Este tipo de PCR emplea un oligonucletido que con-
tiene iniciadores degenerados. El procedimiento de la am-
plicacin se divide en dos pasos. La primera parte im-
plica cinco ciclos de PCR realizados a temperaturas bajas
de templado (32C), que permiten la unin frecuente del
iniciador DOP. Esto genera un depsito de secuencias de
DNA a partir de sitios uniformes dispersos dentro de un ge-
noma dado. El segundo paso tiene una temperatura de tem-
plado ms rigurosa de 62C para 35 ciclos, ocasionando un
inicio ms especco. El resultado de este procedimiento
de dos etapas es la amplicacin exponencial de todas las
secuencias que se han sintetizado en el primer paso, pro-
duciendo una cantidad grande de DNA. Varios grupos que
ya han publicado sus investigaciones alteraron de alguna
manera el protocolo DOP-PCR original, en un esfuerzo
para mejorar la produccin de DNA y la conabilidad del
mtodo (Huang y cols. 2000).
Para probar el funcionamiento del mtodo, se puede
usar como control positivo una mezcla de DNA que se ex-
trae a partir de lneas celulares tumorales. Vysis usa CoSH,
una mezcla de las siguientes variedades de clulas: COLO
320 HSR (adenocarcinoma colnico), 35%; SJSA-1 (os-
teosarcoma), 40%, y BT-474 (carcinoma de mama), 25%,
con ganancias y prdidas conocidas del nmero de copias
en sitios especcos.
Marcaje e hibridacin del DNA
Para obtener hibridacin uniforme, intensa en los mi-
croarreglos, el tamao del fragmento de la sonda del DNA
debe ser de 200 a 400 bases, y esto se logra con un marcado
aleatorio del DNA y recolectando esta longitud ptima de
fragmento. En el mtodo de marcaje directo recomendado
por Vysis y Spectral Genomics, los uorforos Cy3 y Cy5
se unen de manera directa al DNA de la muestra y al DNA
genmico de referencia completo respectivamente.
Los DNA se mezclan y se cohibridan en una micromatriz
en presencia del DNA Cot-1 humano sin marcar. El DNA
Cot-1 es DNA placentario de 50 a 100 pares de bases de
longitud, que se enriquece para las secuencias repetidas del
DNA, y su funcin es bloquear la unin del DNA marcado a
las regiones centromricas y heterocromticas, que contie-
nen secuencias de repeticin polimrcas elevadas. El blo-
queo de estas regiones previene su inclusin en el anlisis,
permitiendo la amplitud ptima del cociente rojo:verde.
Despus de la hibridacin de 2 a 4 das a 37C en una
incubadora hmeda, los chips se lavan para eliminar cual-
quier sonda sin hibridar. Despus se aplica 4,6 diamidino-
2-fenilindol (matriz DAPI) como contratincin.
El tiempo de captura y almacenaje de la imagen para
cada laminilla es cercano a una hora. Un sistema de pro-
yeccin de imagen uorescente captura una imagen del
chip hibridado en planos de tres colores: Cy3, Cy5 y
azul DAPI. La matriz 300 de Vysis Genosensor
utiliza
una cmara fotogrca CCD y una fuente de ilumina-
cin de xenn de 175 W para capturar tres imgenes de
cada microarreglo, especca para la contratincin DAPI
(azul), para el DNA de la prueba (verde) y para el DNA
de referencia (rojo). La imagen azul se emplea para iden-
ticar y localizar los puntos del blanco en la rejilla. Una
vez identicados, los puntos pueden analizarse de manera
cuantitativa con el software especializado, que integra las
intensidades uorescentes verdes y rojas, restando el fondo
local, y se calcula el cociente de la intensidad de la prueba
entre la intensidad de la referencia (T:R) para cada punto
(triplicar los puntos para cada gen del blanco). En la gura
54-2, por supuesto, los cocientes T:R promediados tienen
que normalizarse respecto al punto de control o a un grupo
de puntos. El sistema Vysis tambin detecta los puntos que
parecen normales y divide todos los cocientes T:R entre el
cociente T:R de los blancos normales.
Como la representacin sobre microarreglos, en parti-
cular arreglos de expresin, se incrementa en densidad, el
almacenaje de los datos y la bioinformtica se convierten
en una recoleccin ms desaante e impecable; el anlisis
y los mtodos de interpretacin son de suprema importan-
cia si se previenen los datos daados que pudieran conducir
a conclusiones incorrectas. En un esfuerzo para evitar este
suceso, la estadstica y la bioinformtica se estn convir-
tiendo rpido en los componentes ms prominentes en el
entrenamiento de bilogos moleculares.
Conclusin
Hay un cambio en la biologa molecular desde el desarro-
llo de la tecnologa del microarreglo, y el acoplamiento de
esta tecnologa con la hibridacin genmica comparati-
va ha surgido como herramienta poderosa, permitiendo la
evaluacin de mltiples blancos en una sola prueba con
la capacidad de detectar cambios en la copia nica. Esta
tcnica inestimable ha acelerado la deteccin de genes no-
vedosos que pueden desempear un papel en la patognesis
de tumores y en el desarrollo del control de la enfermedad
con perl genmico.
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Figura 54-2 Visualizacin de la micromatriz que
muestra una disminucin de 9p2l.3 (MTAP) (roja) y
una amplicacin de 17q2l (BRCA1) (verde).
Disminucin de 9p21.3 (MATP)
Amplicacin de
17q21 BRCA1
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LECTURAS COMPLEMENTARIAS 529
Introduccin
La identicacin del cido desoxirribonucleico (DNA) qu-
mico a mediados de la dcada de 1940 por Avery, MacLeod
y McCarty mostr por primera vez que el DNA es el mate-
rial de la herencia, la tan llamada sustancia de la vida. Este
solo descubrimiento puso el fundamento para permitir a la
ciencia el establecimiento de la gentica molecular, de la te-
rapia de genes, del asesoramiento gentico y de la manipu-
lacin de la expresin gentica in vitro. Ha aportado la base
para las tcnicas que ahora conducen al escndalo de los
peridicos sensacionalistas inspirados por la publicacin de
las ltimas aplicaciones de las tcnicas del DNA recombi-
nante, como la clonacin de la oveja Dolly en el Instituto
Roslin, Edimburgo, en Escocia, y facilitado el esfuerzo in-
ternacional para secuenciar los 3 mil millones de bases del
DNA en el genoma humano, a principios de esta dcada.
James Watson y Francis Crick en 1953 desentraan y pu-
blican la estructura tridimensional de la molcula del DNA
de doble cadena. El resto es historia. Desde que la identidad
y la estructura de la molcula responsable del cambio here-
dado se descubrieron, se ha establecido el lenguaje del cdi-
go gentico, con las cuatro bases, adenina (A), citosina (C),
guanina (G) y timina (T). El ujo de esta informacin desde
la secuencia base del DNA a las protenas ahora est elucida-
do y claricado ms all de cualquier duda cientca.
De los acontecimientos clave crticos para el nacimiento
y la maduracin exitosa de la biologa molecular aplicada, el
descubrimiento de los mtodos para determinar la secuencia
base individual de los cidos nucleicos debe gurar entre los
ms importantes. La tecnologa de secuenciacin se utiliza
en la actualidad a travs de un nmero diverso de discipli-
nas, comprendiendo desde la ciencia mdica y forense hasta
la gentica de poblacin, la logentica y la gentica de la
conservacin. Ya que es una era de genmicos comparati-
vos, de descubrimiento de frmacos, y de tamizaje gentico,
la demanda para las tecnologas de alto rendimiento de se-
cuenciacin es mayor que nunca. La capacidad para deter-
minar rpidamente secuencias del DNA ha revolucionado la
ciencia de la gentica molecular. Las secuencias del DNA se
obtienen de diversas fuentes, y los depsitos o bancos de in-
formacin son extensos, como las bases de datos de EMBL,
DDBJ y GenBank, que existen como reservas internacionales
de las secuencias del cido nucleico. Estos bancos de datos
sirven como una biblioteca del cido nucleico a la cual los
cientcos tienen acceso electrnico para estudiar la evolu-
cin, las mutaciones, la logenia y aplicar, en ltima instan-
cia, la informacin de la secuencia para la caracterizacin de
sistemas biolgicos completos. El propsito de este captulo
es resear esta tecnologa de secuenciacin y sus aplicacio-
nes, particularmente en el Proyecto del Genoma Humano.
Historia de la secuenciacin del cido
desoxirribonucleico
Los intentos iniciales en las tcnicas de secuenciacin fue-
ron realizados sobre plantillas cortas de tRNA por el grupo
de Robert Holley a mediados de la dcada de 1960. Este
mtodo implic digerir el RNA con RNasas de secuencia
especca y separar los ribonucletidos resultantes por cro-
matografa de intercambio inico. A principios de la dca-
da de 1970 la secuenciacin del DNA rutinaria se convirti
en una realidad con el descubrimiento y el aislamiento de
las enzimas de restriccin del DNA, esencialmente tije-
ras moleculares que cortan hasta plantillas complejas del
55
Secuenciacin de cidos desoxirribonucleicos
Cara M Martin, Steven J Picton, Orla Sheils y John OLeary
532 CAP. 55 SECUENCIACIN DE CIDOS DESOXIRRIBONUCLEICOS
genoma, y las DNA polimerasas que permitieron que los
fragmentos de la plantilla se copiaran in vitro. Estas en-
zimas hicieron posible que fragmentos pequeos de DNA
se aislaran de secuencias mucho ms grandes y despus se
utilizaran como plantillas para la sntesis in vitro de nuevo
DNA marcado o etiquetado.
En 1980 a tres cientcos se les concedi el premio Nobel
en qumica por el desarrollo independiente de dos mtodos
de secuenciacin del DNA. stos son Maxam & Gilbert,
que desarrollaron un mtodo qumico de secuenciacin del
DNA, y Fred Sanger, quien describi un mtodo enzimtico
para la secuenciacin del DNA. Ambas tcnicas, y las modi-
caciones de ellas, son la espina dorsal de la mayor parte de
las tecnologas de secuenciacin actuales, con predominio
del mtodo de terminacin de cadena dideoxi (Sanger).
Secuenciacin qumica del cido
desoxirribonucleico
Uno de los mtodos ms tempranos para determinar la se-
cuencia nucleotdica de una seccin de DNA aislada fue la
secuenciacin qumica de la hebra del DNA, referida con
ms frecuencia como la tcnica Maxam-Gilbert, que se pu-
blic en 1977 (Maxam y Gilbert, 1977). En este mtodo,
un fragmento aislado de DNA se radiomarca en un extremo
y despus se degrada parcialmente sometiendo la plantilla
marcada a una serie de reacciones de divisin especca de
la base. Estas reacciones de divisin generan cinco poblacio-
nes de molculas radiomarcadas que se extienden desde un
punto comn (el trmino radiomarcado) hasta el sitio de la
divisin qumica. Las condiciones se disean de tal manera
que, en promedio, slo una base blanco en cada molcula se
modica dentro de una hebra de DNA dada, y estas reaccio-
nes se llevan a cabo en dos etapas: a) las bases especcas
o los tipos de bases experimentan modicacin qumica, y
b) la base modicada se remueve de su azcar y los enlaces
fosfodister 5 y 3 de la base modicada se cortan. Cinco
modicaciones qumicas diferentes ocurren en los tubos de
reaccin separados, que dividen el DNA en las bases espe-
ccas. Despus de cada una de las reacciones qumicas es-
peccas, la plantilla en el tubo se trata con piperidina, que
divide los enlaces fosfodister adyacentes al DNA daado.
El conjunto resultante de las molculas marcadas del
extremo, cuyas longitudes pueden comprender de uno
hasta varios cientos de nucletidos, pueden utilizarse para
identicar la posicin de las bases individuales proporcio-
nando una escalera de fragmentos que varan de tamao
uno del otro por una sola base. Estos fragmentos se separan
por electroforesis en un gel de poliacrilamida, y la secuen-
cia se lee de una autorradiografa del gel de secuenciacin.
El rango de este mtodo Maxam-Gilbert es menor que el
del mtodo Sanger, con 600 pb de la secuencia, genera-
das a partir de un solo conjunto de reacciones. El uso de
este mtodo se redujo en estos ltimos aos, en gran par-
te debido a las mejoras enormes en los acercamientos de
secuenciacin enzimtica, incluyendo la automatizacin y
las DNA polimerasas hechas a la medida. No obstante, este
acercamiento contina desempeando un papel crucial en
muchos laboratorios y se utiliza para establecer las secuen-
cias del oligonucletido, y en la diseccin funcional de las
seales del control transcripcional (Carey & Small, 2000).
El mtodo dideoxi de secuenciacin del DNA
El mtodo Sanger (Sanger y cols., 1977) o de terminacin de
cadena de secuenciacin del DNA es el acercamiento utili-
zado en las principales iniciativas del genoma. El principio
de este mtodo es simple; un fragmento aislado de DNA o
el plsmido entero, el csmido o el producto de PCR es des-
naturalizado a su forma de una sola cadena por el calor o
la alcalinizacin. Un cebador oligonucletido sinttico corto
se une a su secuencia complementaria, codicada en una de
las plantillas de una sola cadena. El extremo 3 del dplex
cebador/plantilla entonces se utiliza como el sitio de inicia-
cin para la accin de la DNA polimerasa y una cadena de
DNA complementaria se sintetiza usando dNTP como pre-
Figura 55-1 Qumica de la secuenciacin Sanger o de termi-
nacin de cadena que emplea iniciadores marcados con colorante
uorescente. Cuatro diferentes iniciadores marcados con coloran-
te (terminacin A, C, G y T) se utilizan en cuatro reacciones sepa-
radas de extensin y de terminacin. En el nal de las reacciones,
los contenidos de los cuatro tubos se renen y se cargan sobre
un carril de un gel de poliacrilamida. La escalera de productos
marcados con colorante se separa por electroforesis y se detecta
en tiempo real.
EL MTODO DIDEOXI DE SECUENCIACIN DEL DNA 533
cursores. La qumica de la terminacin de cadena se utili-
za junto con los cebadores oligonucletidos marcados (g.
55-1) o por la incorporacin de nucletidos marcados durante
la reaccin de extensin (g. 55-2). En la secuenciacin con
cebadores con colorante, cuatro reacciones de secuenciacin
separadas se realizan por cada muestra (cada reaccin con-
tiene un cebador marcado con colorante). Este mtodo est
bien adaptado para los proyectos de secuenciacin que uti-
lizan cebadores universales; sin embargo, aquellos que em-
plean cebadores personalizados llegan a ser ms engorrosos
y costosos, ya que cada cebador debe modicarse en cuatro
reacciones separadas de marcaje con colorante.
En el acercamiento de la secuenciacin de terminacin de
cadena estndar, se requieren cuatro reacciones de sntesis
separadas. Cada una de las reacciones individuales contiene
una cantidad pequea de uno de los cuatro 2,3 dideoxinu-
cletido trifosfato (ddNTP), que diere de los deoxinucle-
tidos por tener un tomo de hidrgeno unido en vez de un
grupo OH (g. 55-3). Cuando la hebra de DNA creciente
sintetizada incorpora un ddNTP especco, la reaccin de
elongacin se termina, puesto que el ddNTP carece del gru-
po 3-hidroxilo requerido por la polimerasa para formar un
enlace fosfodister con el siguiente dNTP. Por el control cui-
dadoso del cociente de ddNTP a dNTP en cada una de las
cuatro reacciones, una alcanza una incorporacin aleatoria,
pero baja, de cada uno de los ddNTP en las hebras crecientes
del DNA y crea una matriz de fragmentos con un extremo
5 comn, denido por el cebador, pero terminando en cada
posicin posible donde el ddNTP especco puede haberse
incorporado. La longitud promedio de tales cadenas puede
manipularse alterando los cocientes ddNTP:dNTP para ase-
gurar que todos los productos puedan resolverse fcilmente
por electroforesis en gel de poliacrilamida o capilar.
Realizando las cuatro reacciones individuales, con cada
uno de los ddNTP presentes, y despus resolviendo las cua-
tro reacciones, A-, C-, G- y T-terminaciones, una al lado de
la otra en un gel de resolucin o por electroforesis capilar,
se produce otra vez la escalera caracterstica de fragmen-
tos que permite que la secuencia se lea. Las estrategias
de marcaje comunes incluyen la incorporacin de dNTP
uorescentes o radiomarcados, seguidos por electroforesis
capilar, autorradiografa o deteccin quimioluminiscente
de los productos terminados. Se han logrado avances im-
portantes en esta tcnica, y se debe, en gran parte, a las me-
joras en la qumica del uorforo. Es posible ahora marcar
cada ddNTP, con diferentes colorantes, que permiten que la
reaccin de secuenciacin se lleve a cabo con un cebador
en un solo tubo, ahorrando tiempo y costo considerables.
Hay actualmente dos tipos de terminadores de colorante
disponibles, uno incorpora los colorantes diclororrodamina
(dRhodamine Terminator, Applied Biosystems) y el otro,
BigDyes (BigDye terminator, Applied Biosystems).
Las primeras reacciones qumicas de secuenciacin em-
plearon polimerasas como el fragmento Klenow de la DNA
polimerasa I, o la DNA polimerasa derivada del bacterifago
T7 o sus variantes. En pocas ms recientes las polimerasas
termoestables, como la DNA polimerasa AmpliTaq y sus va-
riantes, se explotan para llevar a cabo la qumica de la termi-
nacin de cadena por la unin de la terminacin de cadena
y del proceso de PCR. Tal acercamiento se llama secuen-
ciacin de ciclo (g. 55-4). El enganchamiento de la PCR
al mtodo dideoxi en la secuenciacin de ciclo (Carothers
y cols., 1989) mejor mucho la sensibilidad de la secuen-
ciacin. La secuenciacin de ciclo es, de diversas maneras,
similar a la reaccin de secuenciacin estndar del DNA.
Comienza con una mezcla de reaccin de secuenciacin es-
tndar del amortiguador, de la plantilla, del cebador, de los
dNTP y de los ddNTP. Una DNA polimerasa termoestable
sustituye a la polimerasa estndar. Esta mezcla se somete a
las rondas normales de los pasos de desnaturalizacin, de
alineamiento y extensin de una reaccin de amplicacin.
A diferencia de una amplicacin normal del DNA, que uti-
liza dos cebadores para amplicar en forma exponencial la
Figura 55-2 Qumica de la secuenciacin Sanger o de terminacin
de cadena que emplea terminadores dideoxi marcados con colo-
rante. Los terminadores dideoxi, con cada uno de los cuatro ddNTP
posibles que se marquen con un colorante uorescente diferente, se
incorporan con una polimerasa durante la fase de extensin de la
reaccin de secuenciacin. La escalera de productos marcados con
colorante se separa por electroforesis y se detecta en tiempo real.
Figura 55-3 Estructuras qumicas de los dideoxinucletidos y de
los deoxinucletidos. El reemplazo del grupo hidroxilo por un hi-
drgeno evita que los dideoxinucletidos experimenten extensin
adicional de la cadena durante la sntesis del DNA.
plantilla, la secuenciacin de ciclo utiliza un cebador slo
para amplicar de manera lineal los productos de extensin.
Debido al ciclado repetido de la reaccin, menos plantilla se
requiere para la secuenciacin de ciclo que para los mto-
dos dideoxi ms viejos. Adems, desnaturalizando la planti-
lla de cadena doble antes de cada paso de alineamiento del
iniciador durante la ronda de temperatura cclica, se elimina
la necesidad de preparar plantillas de una sola cadena para la
secuenciacin del DNA. Las plantillas de doble cadena tie-
nen la ventaja de permitir la secuenciacin de ambas hebras
de DNA. Este acercamiento de secuenciacin es tambin
mucho ms favorable a la automatizacin que los acerca-
mientos de secuenciacin tradicionales.
Secuenciacin automatizada
El rendimiento de la tecnologa de secuenciacin era el
principal paso limitante de la velocidad en los proyectos de
secuenciacin a gran escala, como el Proyecto del Genoma
Humano. El avance ms signicativo en las tecnologas de
secuenciacin del DNA es la automatizacin de la tcnica.
Esto parte de tres reas principales, como se menciona an-
tes: las mejoras en las qumicas del uorforo, el descu-
brimiento de cada vez ms polimerasas termoestables y el
desarrollo de la tcnica de PCR. Al principio de la secuen-
ciacin de los cidos nucleicos, slo existan los marcadores
radioisotpicos como el nico mtodo para la deteccin de
los fragmentos; estos fragmentos marcados se separaban por
geles de acrilamida y las bandas isotpicas se visualizaban
despus de la autorradiografa. Cuatro reacciones, A, C, G y
T, se requeran por cada plantilla y las reacciones se cargaban
en carriles adyacentes en el gel. Despus de la separacin
y de la autorradiografa, la secuencia se determinaba por la
lectura del patrn de banda desde el fondo hasta la parte
superior de la autorradiografa, representando los fragmentos
de la longitud cada vez mayor hasta que el poder de resolu-
cin del gel llega a ser el limitante. El requisito para utilizar
cuatro carriles para cada reaccin de la plantilla se converta
en una limitacin importante en el nmero de las muestras
que podan procesarse simultneamente en un gel, y los altos
niveles adicionales requeridos de la plantilla. La lectura ma-
nual de las autorradiografas, como en los das de la preau-
tomatizacin dieron testimonio de que era un muy largo y
tedioso trabajo. La lectura manual es tambin muy propensa
al error humano, tanto en la interpretacin de los datos sobre
la pelcula de rayos X como en los errores en la transcripcin
de la secuencia sobre la autorradiografa para la secuencia en
una pieza de papel o mecanograado directamente sobre una
computadora. En muchos casos las pelculas de radiografa
resultantes las leyeron dos personas para hacer la verica-
cin, y la secuencia del DNA fue requerida y comparada des-
de las reacciones realizadas en ambas hebras del DNA, dando
tanto la secuencia con sentido hacia adelante como la cadena
reversa para la comparacin.
Los mtodos automticos actuales son capaces de gene-
rar hasta 2 millones de bases al da, comparado con un mxi-
mo de 300 a 500 bases/da por electroforesis manual en gel
Figura 55-4 Secuenciacin de ciclo de la terminacin de cadena. En una combinacin del mtodo Sanger, terminacin de cadena,
y del proceso de PCR, el DNA original sirve como una plantilla para una reaccin lineal de la PCR. En cada una de las 25 rondas del
ciclo de PCR, una escalera de fragmentos terminados marcados con colorante se produce a partir de las plantillas. Despus del paso de
extensin, la desnaturalizacin subsiguiente entonces permite que las mismas molculas de DNA sirvan otra vez como una plantilla para
la produccin de ms productos marcados con colorante.
de poliacrilamida (PAGE). La qumica de secuenciacin, en
particular la metodologa Sanger por terminacin de cadena,
ha llegado a ser ms importante porque los requisitos de la
plantilla del DNA para las reacciones son menos demandan-
tes. El desarrollo vital para la automatizacin del proceso de
secuenciacin surgi del uso de los colorantes uorescentes
reporteros como molculas para la deteccin de la escalera
de secuenciacin. Junto con la excitacin lser de los colo-
rantes, cuando emigran a travs del gel, y la deteccin p-
tica directa de los fragmentos uorescentes en tiempo real,
la automatizacin completa de la adquisicin de datos lleg
a ser posible.
En este marco surgen dos estrategias principales de auto-
matizacin para la separacin de los fragmentos del DNA;
la electroforesis en gel no y la capilar en gel. La primera
generacin de secuenciadores automticos consisti de ge-
les de poliacrilamida verticales largos corridos en un tan-
que de electroforesis con sistemas uorescentes integrados
de deteccin. Los fragmentos marcados uorescentemente
son excitados por un rayo lser, que pasa a travs de una
ventana estrecha en el fondo del gel de secuenciacin. Los
datos uorescentes entonces se colectan y una imagen vir-
tual del gel se construye (g. 55-5). Los tiempos de separa-
cin en la electroforesis en gel pueden reducirse de manera
signicativa si se utilizan voltajes ms altos y los geles ul-
tranos se emplean como un medio de separacin.
La segunda, y en la actualidad la estrategia ms utiliza-
da, que sustituye la secuenciacin basada en gel, utiliza tu-
bos capilares nos llenos de polmero lquido. Los capilares
de paredes delgadas de dimetros y de longitudes variantes
permiten la separacin rpida de los fragmentos del DNA
marcados, reduciendo los periodos de separacin hasta por
un factor de 25 cuando se comparan con las tcnicas elec-
troforticas estndar en gel. Los secuenciadores capilares
automticos funcionan de la siguiente manera: un conduc-
tor automtico de jeringuilla llena lentamente el capilar con
polmero, la bandeja automatizada de la muestra que con-
tiene reacciones de secuenciacin mueve el capilar que est
sumergido en una muestra especca en la bandeja, y una
alcuota pequea de la reaccin de secuenciacin se aspira
dentro del capilar. Una corriente entonces se aplica hasta
que todos los fragmentos del DNA se resuelven y pasan por
la ventana ptica del extremo del capilar. Un lser excita
los fragmentos marcados uorescentemente y una cmara
SECUENCIACIN AUTOMATIZADA 535
Figura 55-5 Imagen virtual de un gel de secuenciacin. Esta imagen electrnica representa la escalera de secuenciacin uorescente
de plantillas mltiples que fueron cargadas y separadas de manera simultnea en un instrumento de un carril, con cuatro colorantes.
CCD colecta los datos de la uorescencia para su anlisis
subsiguiente (g. 55-6). Entre las muestras, el capilar se re-
llena con polmero fresco antes de continuar el proceso para
la reaccin de secuenciacin siguiente.
Los secuenciadores capilares tienen un mayor rendi-
miento que los de gel plano y eliminan los pasos tediosos
de la preparacin y carga de gel. Los primeros secuencia-
dores capilares comerciales llegaron a estar disponibles a
principios del ao 2000. Un secuenciador actual tiene 96
capilares, que funcionan en paralelo para el anlisis de se-
cuencia de alto rendimiento. Este sistema es capaz de ana-
lizar hasta 2 millones de bp del DNA en 24 horas.
Proyecto del Genoma Humano
Los avances principales en la tecnologa de secuenciacin en
la ltima dcada generaron la terminacin exitosa del Pro-
yecto del Genoma Humano (HGP) en 2003, dos aos antes
de lo programado. Este proyecto representa uno de los prin-
cipales logros en la historia de la ciencia. El esfuerzo inter-
nacional comenz formalmente en 1990 con 3 mil millones
de dlares, esfuerzo de 15 aos, para secuenciar 3 mil millo-
nes de pares de bases en el genoma humano. Es considerada
por muchos una de las empresas cientcas ms ambiciosas
de todos los tiempos, incluso se compara con el aterrizaje
sobre la Luna. En el 2001, antes de lo programado, el primer
proyecto del funcionamiento del genoma humano se public
en ediciones especiales de Science (Venter y cols., 2001) y
Nature (Lander y cols., 2001). Desde entonces, los investi-
gadores trabajan para convertir este proyecto de la secuencia
en una terminada, o una con menos de un error por cada 10
000 bases y una contigidad alta.
El acercamiento de la secuenciacin que tom el Con-
sorcio HGP fue adoptar un mtodo de secuenciacin ba-
sado en mapeo o escopetazo jerrquico (g. 55-7). En
este acercamiento, el DNA genmico se fragmenta en
segmentos con gran traslape cercanos a 150 Mb y se in-
sertan en un tipo especial de vector, llamado cromosoma
articial bacteriano (BAC). Esto se logr por la digestin
parcial con enzimas de restriccin, con sitios comunes de
reconocimiento. Los vectores de BAC que se producen se
transforman dentro de E. coli para crear una biblioteca o
(almacn) de BAC. Los clones del BAC individuales son
completamente digeridos, usando enzimas adicionales de
la restriccin, para producir un patrn o una marca digital
nica. Las inserciones del BAC se aslan y mapean pos-
teriormente para determinar el orden de cada fragmento
clonado. Una vez mapeados, los clones del BAC indivi-
duales se fragmentan de forma aleatoria en ms pequeos
(~ 2 000 bp de largo), que a su vez se clonaron dentro de un
vector del plsmido (clon de escopetazo) y secuenciados
sobre ambas hebras. Usando programas de computadora
avanzados, estas secuencias se alinean de tal forma que las
Figura 55-6 Electroferograma generado sobre un secuenciador capilar del DNA automatizado. Las cuatro bases del DNA estn codi-
cadas con color, con picos que representan cada base. C, azul; A, verde; G, negro; y T, rojo.
Figura 55-7 Acercamiento de la secuenciacin de escopetazo
jerrquico adoptada por el Consorcio HGP.
idnticas se traslapan, y los fragmentos contiguos se en-
samblan en la secuencia terminada, despus de que cada
hebra se ha secuenciado por lo menos cuatro veces.
La estrategia desarrollada por Celera Genomics, quien
inicia su bsqueda mucho antes que el Consorcio HGP, se
conoce como secuenciacin de escopetazo completo del ge-
noma (g. 55-8). sta involucra el corte aleatorio del DNA
genmico en fragmentos pequeos (2 000 a 10 000 bp de
largo), los cuales se clonan directo en los plsmidos y fue-
ron secuenciados al azar sobre ambas hebras, eliminando la
etapa del BAC utilizada por el acercamiento HGP. El desa-
fo con este acercamiento fue el ensamblaje de las secuen-
cias. Celera puso en servicio superordenadores capaces de
manejar ms de 80 terabytes de datos y de realizar quinien-
tos mil millones de comparaciones secuenciales requeridas
para el ensamblaje inicial. Las ventajas para Celera fue que
ya tena acceso a datos de la secuencia HGP, que aportaron
la secuencia de referencia para trabajar con ella.
La informacin que se tiene a partir de la secuencia del
genoma humano es enorme y algo de la ms relevante se
menciona enseguida. El genoma es ms heterogneo muy
lejos de lo que se buscaba al principio, y el nmero total
de genes humanos es menor de lo que se esperaba, con un
consenso actual cercano a 30 000 genes.
reas que avanzan en la secuenciacin
de los cidos nucleicos
La importancia de la secuencia humana del genoma no pue-
de exagerarse; sin embargo, el genoma humano representa
slo una fuente de informacin que se requiere para aclarar
mecanismos biolgicos complejos. La comprensin de los
genomas de otros organismos debe desempear un papel
enorme en el entendimiento de los genes que causan enfer-
Figura 55-8 Acercamiento de la secuenciacin por escopetazo
del genoma completo adoptada por Celera Genomics.
medades, sus mecanismos reguladores y la siopatologa de
las enfermedades. La secuenciacin reciente del genoma del
ratn, el modelo animal ms importante de la enfermedad
humana, tambin representa un logro signicativo en el rea
genmica. En un futuro prximo, la secuenciacin a gran
escala continuar desempeando un papel enorme facilitan-
do el progreso de la comprensin de los cientcos en los
procesos patolgicos. Tambin se estn realizando esfuerzos
para la resecuenciacin de los genomas. Al respecto, se re-
quieren niveles ms altos de automatizacin, que permitan
a los investigadores realizar la preparacin de la muestra, la
secuenciacin y el anlisis de datos en la misma plataforma.
Aparte del requerimiento de sistemas muy automatizados,
otras aproximaciones secuenciales que actualmente estn en
prctica como mtodos alternativos de separacin y detec-
cin incluyen la espectrometra de masas de tiempo de vuelo
con desorcin/ionizacin por lser asistida por microarreglos
(MALDI-TOF-MS) y la secuenciacin por hibridacin o la
que est basada sobre el chip. Los avances en estas reas sir-
ven para reducir el costo de la secuenciacin y para permitir
que los investigadores centren sus esfuerzos de secuenciacin
en las regiones funcionales ms importantes del genoma.
La secuenciacin por MALDI-TOF-MS es un mtodo
para la separacin de los fragmentos de DNA que se gene-
ran al usar la tcnica de Sanger. Los fragmentos de DNA se
mezclan con una matriz portadora, como el cido 3-hidroxi-
picolnico (Wu y cols., 1993), y se pintan sobre la super-
cie de desorcin del blanco (una placa de acero inoxidable).
Despus de que el material orgnico pequeo cristaliza, la
placa se coloca dentro de un espectrmetro de masas para el
anlisis. Un lser desorbe y ioniza los fragmentos de DNA,
mientras la aceleracin en un espectrmetro de masas permi-
te la determinacin de la longitud del fragmento mediante la
deteccin del tiempo de vuelo. Las ventajas al usar este tipo
de tcnica incluyen mayor velocidad de secuenciacin y la
secuenciacin de fragmentos ms cortos de DNA. Tambin
es una tcnica de libre marcacin, as que el costo es consi-
derablemente ms bajo que el de las tecnologas de secuen-
ciacin existentes. Con el descubrimiento rpido de genes
nuevos y de mutaciones relacionadas con la enfermedad, la
espectrometra de masas podra ser una herramienta valiosa
y econmica para aplicaciones de resecuenciacin para com-
plementar las tecnologas de secuenciacin existentes.
La otra estrategia que est surgiendo es la secuenciacin
por hibridacin o la secuenciacin basada en el chip. sta
puede realizarse inmovilizando varios miles de fragmentos
cortos de DNA de secuencias conocidas (oligonucletidos)
en una supercie de cristal o de silicn en sitios denidos.
El DNA blanco cuya secuencia ser determinada se marca
uorescentemente y despus se hibrida en el chip. La se-
cuencia del blanco se deduce a partir del subconjunto de
sondas oligonucleotdicas que se han unido al DNA blanco.
REAS QUE AVANZAN EN LA SECUENCIACIN DE LOS CIDOS NUCLEICOS 537
Uno de los contratiempos principales con este acercamien-
to para la generacin de un chip secuenciador universal es
que el nmero total de variantes combinatorias para un oli-
gonucletido 15 bp de longitud requerido para representar
el genoma entero es demasiado grande para colocarse so-
bre un solo chip de DNA, el cual en la actualidad es capaz
de sostener cerca de 400 000 oligonucletidos (Fedrigo y
cols., 2004). No obstante, este acercamiento puede ser til
para resecuenciar experimentos o para secuenciar genes in-
dividuales con puntos mutantes recientes.
Para concluir, los avances en tecnologas de secuencia-
cin y anlisis del DNA, a travs de la automatizacin y la
integracin con otras tecnologas relacionadas, continuarn
revolucionando la investigacin biolgica.
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ndice alfabtico
A
absorcin de la luz, 395-7
actividad del agua, 132
adenovirus, 185
Affymetrix GeneChips, 515-17
aglutinacin
ltex, 199
partculas, 199
agregacin plaquetaria inducida por la
ristocetina, 283-4
alanina aminotransferasa, 419-20
aminocidos, cromatografa, 430, 432
amplicacin
16S rRNA, 155
basada en la secuencia del cido
nucleico, 218-19
mediada por transcripcin, 218
por desplazamiento de la cadena,
219
seal de la tiramina, 39
anaerobios, 143-4
anlisis
endonucleasa de restriccin, 286-7
gen por TaqMan PCR, 495-504
secuencia, 531-8
automatizado, 534-5
factor de von Willebrand, 286-7
hibridacin basada en el chip,
537
MALDI-TOF-MS, 537
mtodo dideoxi, 532-4
qumico, 532
tipicacin HLA, 485-6
virologa, 220
analizadores de cuidado crtico, 392-3
anemia
de clulas falciformes, 326
hemolticas, 255, 257
leucoeritroblsticas, 258
megaloblsticas, 254-5
por deciencia de hierro, 257
anticuerpos
de inclusin, 175
monoclonales, 40-1
policlonales, 40-1
antitrombina III, 340
aplicaciones, 48-54
aspiracin, 97
astrovirus, 185
AutoPix, 490
avidez del anticuerpo, 202
avidina-biotina, 38-9
B
bacilos, 141
cido alcohol-resistentes, 23
aerobios gramnegativos, 142-3
grampositivos, 141
BacT/Alert, 146, 149
bacteriologa
colorantes, 23, 125-8
cultivo, 129-34
identicacin, 135-44
mtodos moleculares, 136, 139-40,
151-7
microscopia, 123-8, 135
pruebas automatizadas, 145-50
bandeo
con quinacrina, (Q) 347-8
DA-DAPI, 350
Giemsa (G), 346-7
heterocromatina constitutiva (C),
348-9
replicacin, 350-2
reverso (R), 348
baslos, 249, 462
bioterrorismo, 187-8
C
cambios maligos relacionados, 78-9
cncer
citogentica, 360-2, 525
pecho, clasicacin, 77
captura hbrida, 219
carbohidrato
colorantes, 22-3
cromatografa en capa na, 430
cromatografa lquida de alta
resolucin, 433
metabolismo bacteriano, 138
clulas
asesinas naturales, 461
blancas, 249, 268-70
desgastadas, 96
exfoliadas, 95-6
multinucleadas gigantes, 175
plasmticas, 261
citologa
automatizacin, 119
basada en lquido, 99, 101-3, 118
citodiagnstico, 104-5
citomorfologa, 105-12
colorantes, 103-4
concentracin celular, 99
exactitud y limitaciones, 112-13
jacin, 99
tipos de espcimen, 95-8
citometra de ujo
hematologa, 303-7
immunologa celular, 231-2, 455-6
plaquetas, 292-3, 307
proliferacin, 87
citoplasma
citologa, 107-9
tincin, 24-5
clasicacin de Lanceeld, 138
clonalidad, 308-9
Clostridium spp.,141
cobalamina, 313-17
cociente
internacional normalizado, 334-5
probabilidad, 370
cocos
gramnegativos, 141
grampositivos ,140-1
colorantes, 18-19, 230
amiloideos, 24
uorescentes, 18-19
para elastina, 22
para brina, 24
para lpidos, 24
colorantes (continuacin)
Romanowsky, 20, 247
van Gieson, 21
complejos inmunes
agentes ligadores, 163
antgeno-especcos, 162-3
ataque a membrana, 448-9
ensayos, 465-7
principales de histocompatibilidad
(MHC), 481, 482
complemento, 447-53
APH50, 450
CH50, 450
ensayos
especmenes, 449
jacin, 160, 199-200
hemolticos, 450-2
inmunoqumicos, 449-50
productos de activacin, 449, 452-3
protenas de control, 452
comprobacin en el punto de cuidado,
392-3
concentracin celular, 99
congelar-fracturar/congelar-grabado, 59
control anticoagulante, 334-5
Corynebacteria spp., 141
creatina cinasa, 436
creatinina
electrodo, 392
reactivos secos, 420
crioglobulinemia, 477-80
cromatografa, 163-4, 429
capa na, 429-30
gas, 433-4
lquida de alta resolucin, 227-8,
431-3
microcolumna, 275-7
cromosoma
bandeo y anlisis, 345-55
Filadela, 308
pintura, 358-9
cuenta mittica, 83-4
cultivo
bacteriologa, 129-34
micologa, 235-6
parasitologa, 241-2
virologa, 191-6
D
datos bioqumicos, 365-71
deciencia
de G6PD, 328
piruvato cinasa, 328
densitometra, 73-4
descalcicacin, 7
desrdenes linfoproliferativos
crnicos, 305-7
detectores electroqumicos, 390
Dextrostix
, 419
dicromato de potasio, 6
diferencias crticas, 369
difraccin electrnica, 59
DNA de cadena ramicada 219
E
efecto citoptico, 179, 193-4
efecto de gancho por dosis alta, 380
electrodos
amperomtricos, 388-9
dixido de carbono (pCO
2
), 390-1
ion-selectivos, 381-94
lactato, 391
oxgeno (pO
2
), 388, 389
urea, 391
electroforesis, 274-5, 434-6, 440-1
capilar, 436
elementos traza, 413-14
lite de Mastascan, 139, 147-8
elucin, 300
enfermedad
falciforme, 327
HbC, 327
HbSC, 327
hemoltica del recin nacido, 330
Hirschsprung, 33
residual mnima, 309-10
srica, 467-8
ensayo
5nucleasa, 496-8
APH50, 450
CH50, 450
citotxico, 2 31
Crithidia, 473
D-dmero, 339
factor, 339-40
Farr, 473, 474
enterococos, 141
enzimas, 27-34, 137-8
eosinlos, 25, 249
epidemiologa, 156
eritrocitos, 247-9
cuerpos de inclusin, 278
mediciones, 265-8
eritroleucemia, 257
eritropoyesis, 254
esferocitosis, hereditaria, 327
espectrouormetros, 401
espectrofotmetros, 395-7
espectrometra
absorcin atmica, 406, 407-11
atmica analtica, 405-15
emisin atmica 406, 411-12
uorescencia atmica, 406, 412
masas, 140
masas inorgnicas, 407, 412-13
espiroquetas, 24
esputo, 127
estados
aplsicos, 257
hipoplsicos, 257
estalococos, 141
esteroides, 434
estreptococos, 141
exploracin cervical, 77-8, 113-19
F
factor de von Willebrand, 281-7
frmacos adictivos, 422-3, 430, 432-3,
434
fenotipo de la cromatina, 78-9
feocromocitoma, 432
ferritina, 318, 320
bringeno, 338-9
brinlisis, 340
jacin en alcohol, 6-7
uorescencia, 241, 399-401
rayos X, 407, 412
uormetros, 400-1
folato, 313-17
formaldehdo, 6
fosfatasa alcalina, 38
fotmetros, 395-7
fototipicacin, 484
frotis, 99
vaginales, 128
G
glucosa
electrodos, 389-90
540 NDICE ALFABTICO
glucmetros, 392
reactivos secos, 419
glutaraldehdo, 6
gonadotropina corinica humana,
421-2
grnulos
celulares de Paneth, 25
clulas mastoides, 24-5
grosor del melanoma, 76
H
hemaglutinacin, 198
hemanticos, 313-22
hematoxilina
alumbre, 19
fosfotngstica cida (PTAH), 19, 21
hierro, 19
hemoglobina
cromatografa lquida de alta
resolucin, 227-8, 433
electroforesis, 436
inestable, 278
medicin, 265
hemoglobinopatas, 273-9, 310
hemlisis, 323-32
inmunitaria, 328-30
hemostasis, 333-41
hepatitis, 186
hibridacin, 358
cromosoma Filadela, 308
genmica comparada, 523-9
in situ uorescente (FISH), 354-5,
357-62
oligonucletido especco del alelo,
287
sondas, 357-8
hierro, 317-21
hiperplasia/carcinoma endometrial, 77
histoqumica ultraestructural, 58
hongos, 24, 233-8
hueso
biopsia, 76
descalcicacin, 7
secciones sin descalcicar, 14
I
iluminacin
campo brillante, 63
Khler, 63
impregnacin con plata, 21
ndice
actividad mittica, 83-4
marcado con timidina, 86-7
marcaje por bromodeoxiuridina,
86-7
infeccin animal, 242
inhibicin de la hemaglutinacin, 198
inmunoabsorbente ligado a enzimas
(ELISA)
anticuerpos, 161-2
complejos inmunitarios antgeno-
especcos, 163
dsDNA, 473-4
procesadores automatizados, 207-8,
209
protena, 444-6
virologa, 200-1
inmunodeciencia, 457-8
inmunodifusin radial, 440, 443-4
inmunoelectroforesis, 442-3
contracorriente, 442
inmunoensayos, 373-80
competitivos/no competitivos, 373
control de calidad, 378-9
en lnea, 202
homogneos, 376
marcadores, 375-6
mtodos de separacin, 376-7
miniaturizacin, 377
inmunoourescencia, 126, 177-8, 202
inmunohistoqumica, 35-42
cuantitativa, 79-80
proliferacin, 85-6
sistemas reporteros, 37-9
inmunologa celular, 231-2, 455-63
inmunomtrico, 373-4
inmunotransferencia, 227, 472
intervalos de referencia, 367-9
isoelectroenfoque, 275
isoenzimas, 436
K
Koch, R., 129
L
LCM de Arcturus, 489-91
Leica AS LMD, 493
leucemia
linfoblstica aguda, 261, 305
linfoctica crnica, 262
mieloide aguda, 258-9, 304-5
mieloide crnica, 259
leyes
Beer, 396-7
Lambert, 397
lmites de accin, 369
linfocitos, 249, 261
B, 461
subgrupos, 456-9
T, 459-61
linfomas, 262
lquido cefalorraqudeo, 124
Listeria monocytogenes, 141
luminiscencia, 399-403
luminmetros, 401 -2
lupus eritematoso sistmico, 468-77
anticuerpo antinuclear, 469
anti-dsDNA, 473-4
antgenos nucleares extractables,
469-72
ndices de actividad de la enfermedad,
476
neuropsiquitrico, 475-6
sndrome antifosfolpido, 474-5
M
malignidades linfoides, 458
manejo del tejido, 47-8
marcadores de la coagulacin, 340
Matriz de Matrices de Illumina, 519
matriz de Vysis Genosensor
TM
, 525,
527-8
mediciones
espaciales nucleares, 74-5
HbF, 277
interactivas auxiliadas por
computadora, 70
mdula sea, 249-51
megacariocitos, 260-1
megacariopoyesis, 258
membranas ion-selectivas, 385-6
metacromasia, 18
mtodos
cuantitativos, 69-81
diazo, 30-1
moleculares
NDICE ALFABTICO 541
542 NDICE ALFABTICO
mtodos, moleculares (continuacin)
amplicacin, 152-3, 213-20
bacteriologa, 136, 139-40, 151-7
hematologa, 307-10
hemoglobinopatas, 278-9, 310
parasitologa, 243
tipicacin HEA, 483-6
virologa, 213-23
Ouchterlony, 440, 441
micobacterias, 149-50
micologa, 24, 233-8
microanlisis de rayos X, 59
microangiopatas, 330-2
microarreglos
Affymetrix GeneChips, 515-17
bacteriologa, 155
doble color, 520
hibridacin genmica comparativa,
525-8
matriz de Matrices
TM
de IIlumina,
519
matriz de Vysis Genosensor
TM
, 525,
527-8
MWG, 520
perl de SNP, 517
sistema expresin con matriz de
Applied Biosystems, 517-19
sistema MIAME, 521
SpectralChip, 525-6
microbiologa cuntica, 134
micrococos, 141
microdiseccin
microrrayo lser, 492-3
por lser y captura, 489-93
microfotografa, 66
microorganismos
colorantes, 23-4
microscopia electrnica, 51
microrrayo PALM, 492-3
microscopia
campo oscuro, 65, 125
confocal, 66
contraste de fase, 65
contraste diferencial de
interferencia de Nomarski, 66
de luz, 61-7
bacteriologa, 123-8, 135
hongos, 234-5
parasitologa, 239-40
polarizada, 65-6
virologa, 175-80
electrnica, 43-60
electrnica de barrido, 54-5, 182
uorescente, 63-4, 123
inmunoelectrnica, 57-8
microtoma, 11-13
mielomas, 262
mielopoyesis, 258
minerales, 413-14
monitoreo
HIV, 456-7
SIDA, 456-7
monocitos, 249
muestras
bioqumicas, 366-7
histopatolgicas, 3-15
jacin, 5-6
inclusin, 9
procesamiento del tejido, 7-1 1
recepcin y manejo, 4-5
sistemas de control, 4
msculo
biopsia, 76-7
colorantes, 21-2
enzimas, 31-3
N
nefelometra, 397-9, 444
neuroblastoma, 432
neutralizacin, 200
neutrlos, 249, 461-2
norovirus, 185-6
O
orina
microscopia, 124-5
tamizaje automatizado, 148-9
urinlisis, 422-3
virus, 187
oro-plata, 38
P
parasitologa, 239-44
parvovirus BI9, 186
PCR en la clula, 505-13
perl del polimorsmo de un solo
nucletido, 517
peroxidasa del rbano, 37-8
pigmentos, 23
PixCell, 490
plaquetas, 249, 260-1, 289-93
adhesin, 291
agregacin, 291-2
anticuerpos, 291
citometra de ujo, 292-3, 307
conteo, 270-1, 290-1
liberacin, 292
PFA-100, 292
polarografa, 388-9
policitemia, 257
polietilenglicol, 163
polimorsmo en la longitud del
fragmento de restriccin, 483-4
porrinas, 432
portaobjetos digital, 80-1
potasio, 420-1
principios, 44-8
priones, 225-8
procesador de manejo lquido, 207
proliferacin, 83-92, 231, 459-60
protenas
C, 340
electroforesis, 435-6, 440-1
ensayos, 439-46
ensayos de sntesis, 230
metabolismo bacteriano, 138
S, 340
protoporrina zinc, 318-19, 320-1
proyeccin de imagen digital, 70-2
Proyecto del Genoma Humano, 536-7
pruebas
aglutinacin, 160
aglutinacin con partcula de
gelatina, 199
anticuerpos, 135-6, 159-62, 297-
300
anticuerpos uorescentes, 161
antgenos, 135-6, 138, 162
catalasa, 137
coagulasa, 138
Coombs directa, 328
Elek, 139
embarazo, 421 -2
estabilidad al isopropanol, 278
indirecta de antiglobulina, 298
inestabilidad al calor, 278
optocina, 138
oxidasa, 137-8
precipitacin, 160
respiracin, 164
NDICE ALFABTICO 543
sensibilidad, 168-9
susceptibilidad, 138, 146-8, 149-50,
228-31
ureasa, 138
pus, 127-8
Q
qumica del reactivo seco, 417-27
quimioluminiscencia, 401-3
quimioterapia antimicrobiana
control, 165-71
resistencia, 155-6
R
radioinmunoensayos, 162, 202
rangos normales, 367-9
reaccin
cido perydico de Schiff (PAS), 22
en cadena de la ligasa, 219-20
en cadena de la polimerasa, (PCR)
automatizacin, 217
clonalidad de la clula B, 308-9
en clula, 505-13
hemoglobinopatas, 278-9
identicacin bacteriana, 136
TaqMan, 495-504
tiempo real, 216-17, 495-6
tipicacin HLA, 44-5
virologa, 213-17
electroqumica, 386, 388-9
receptor de transferrina, 318, 319, 321
reduccin de placa, 228-30
reestructuracin del gen receptor de la
clula, T 309
regin organizadora nucleolar, 84-5,
349-50
reporteros uorescentes, 37
resistencia antibitica, 166
rotavirus, 185
S
sales de tetrazolio, 31
sangre
agrupamiento, 295-7
compatibilidad cruzada, 300
contadores celulares, 265-71
frotis, 247
morfologa, 247-9
servicio de transfusin hospitalario,
295-301
sistemas de cultivo, 145-6
transfusin incompatible, 330
cortes histolgicos, 14-15, 48, 181-2
cera de parana, 13
de macrobloques, 13
secciones congeladas, 13-14
secuenciacin de DNA, vase anlisis
secuencial
segmentacin automtica de la
imagen, 72-3
sensibilidad al metronidazol, 138
Sensititre ARIS, 147
serologa
fngica, 237-8
parasitologa, 243
tipicacin HLA, 482-3
virus, 197-205
serotonina, 432
sndromes
antifosfolpidos, 474-5
mielodisplsicos, 257, 260
sistemas
API, 139
BACTEC, 146, 147, 149-50
expresin con matriz de Applied
Biosystems, 517-19
MIAME, 521
Phoenix, 139, 147
rhesus, 296
Vitek, 139, 147
sntesis de DNA, 230
solubilidad falciforme, 275
SpectralChip, 525-6
susceptibilidad antivrica, 228-31
T
talasemias, 274, 327
tcnicas
especializadas, 54-9
jacin, 5-6, 99
Mancini, 440, 443-4
Maxam-Gilbert, 532
Sanger, 532-4
separacin, 429-36
terminacin de cadena, 532-4
tetrxido de osmio, 6
textura, 73-4
tiempo
parcial tromboplastina activada,
335, 337
protrombina, 333-5
reptilasa, 338
sangrado, 291
trombina, 337-8
tinciones, 17-25, 103-4, 125-8, 181,
247
Gram, 125
hematoxilina, 19-20
hematoxilina y eosina (H&E),
20
Ziehl-Neelsen, 23, 126
tipicacin, 156
H , 138
HLA, 481-6
O, 138
tira de Fuji
, 419
tricromos, 21
trombocitopenia, 260
trombocitosis, 261
tromboelastograma, 293
troponina T, 422
turbidimetra 397-9, 444
U
UF*100, 149
unin VWF/FVIII, 284-5
V
valores
blanco, 369
corte, 369
VDRL, 199
virologa, 181-9
colorantes, 23-4
crecimiento del virus, 193-6
cultivo, 191-6
diagnstico rpido, 176-7
inmunidad mediada por la clula,
231-2
mtodos moleculares, 213-23
microscopia de luz, 175-80
microscopia electrnica,
181-9
muestras, 176
544 NDICE ALFABTICO
virologa (continuacin)
pruebas automatizadas, 207-12
serologa, 197-205
susceptibilidad antivrica,
228-31
virus que emergen nuevamente,
188
viruela, 187-8
vitamina B
12
, 313-17
W
western blot, 202
X
xenodiagnstico, 242-3

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Cocos aerobios grampositivos

, que contienen gradientes antimicro-

, que utilizan reacciones y uo-

se aaden a la mezcla de reaccin. stos se

). La hibridacin de las sondas

(g. 22-5). Un capilar de cristal

3) se une a la secuencia Arg-Gli-Asp (RGD) indicada en el dominio C1.

. Reproducida con permiso de

C en fro, aunque existe, a veces, un peque-

, por ejemplo, en la hemorragia

C, despus se tien con Giemsa o con naranja de acridi-

, tcnica de inmunoensayo multiplicado

En un material que conduce como un electrodo de me-

Para el electrodo de perxido relacionado, la reaccin es:

La primera reaccin se utiliza en el electrodo estndar de

, y se ilustra en la gura 40-13.

Figura 40-14 Reaccin electroqumica por catecolaminas.

Al efectuarse lo anterior el pH del amortiguador cambia, y

y la membrana contiene el portador neutro nonactina (vase

es un ejemplo bien esta-

y se sostiene con la energa de una bobina de induccin co-

(Kobyashi y cols., 1982) incorpora una capa enmas-

) (Eastman Kodak Co.,

. El cambio de absorbancia a 340 nm se mide desde

, estn disponibles. stos tienden a tener pla-

Clulas T auxiliares Clula T virgen Antgenos de activacin

Clulas B de memoria Clulas B-2 IgM, IgG, /

cadenas ligeras Ig, CD23

son un subgrupo de clulas CD3

. ste utiliza un lser UV pulsado con ca-

PCR, usando un grupo de iniciadores externos.

. El segundo paso incluye la amplicacin del

) del gen, y otra informacin relevante. Adems,

es una base de datos MWG

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