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FACULDADE DE FARMÁCIA
FARMÁCIA
LABORATÓRIO DE MICOLOGIA
MICOLOGIA CLÍNICA
MICOLOGIA CLÍNICA
2003
ÍNDICE
MICOLOGIA GERAL 01
MICOLOGIA CLÍNICA 14
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS 24
ASPERGILOSE 48
BLASTOMICOSE NORTE-AMERICANA 50
BLASTOMICOSE QUELOIDIANA [LOBOMICOSE] 52
CANDIDÍASE 53
COCCIDIOIDOMICOSE 55
CRIPTOCOCOSE 57
CROMOMICOSE 59
DERMATOFITOSE 61
ESPOROTRICOSE 63
FEOHIFOMICOSE 65
HIALOHIFOMICOSE 66
HISTOPLASMOSE AMERICANA 67
HISTOPLASMOSE AFRICANA 69
MICETOMA 71
PARACOCCIDIOIDOMICOSE 73
PITIRÍASE VERSICOLOR 75
RINOSPORIDIOSE 77
ZIGOMICOSE 78
BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA 82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
ANEXO: MODELO DE LAUDO MICOLÓGICO 98
MICOLOGIA GERAL
1. CONCEITO
Os fungos têm existência bastante difusa. Eles são considerados ubiquitários por estarem
presentes no solo, na água e no ar e cosmopolitas por serem encontrados em todas as partes do
planeta.
Estes microrganismos necessitam de matéria orgânica para a obtenção de carbono e de
energia para o seu metabolismo, por isso, estarão sempre associados ao material orgânico
como sapróbios ou decompositores, simbiontes, comensais e parasitas. São os efeitos
decorrentes destas manifestações que, dependendo do sentido, poderão ser considerados úteis
ou prejudiciais.
• Líquens: os líquens são resultantes da associação de fungos com algas. São importantes
na colonização da rocha núa, transformando-a em solo aproveitável. Elaboram enzimas e
ácidos que são liberados sobre a rocha, quebrando-a em suas estruturas formadoras e
produzindo uma espécie de solo que permitirá a implantação dos vegetais.
• Micorrizas: são estruturas formadas pela associação de raízes não lenhosas de vegetais
superiores e fungos especializados do solo. As micorrizas aumentam a absorção de água e
nutrientes; fornecem proteção contra ataques de pragas; aumentam a tolerância dos vegetais a
excessos de metais, a condições extremas de acidez, aridez e temperatura do solo.
1
• Controle biológico de vetores: muitos fungos parasitam e matam diversos insetos que
constituem verdadeiras pragas de culturas, dentre eles: Metharizium anisopliae que parasita
a cigarrinha da cana-de-açúcar, Beauveria bassiana que parasita a broca da cana-de-açúcar, a
broca da batata doce e a broca do coqueiro.
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micotoxicoses são: Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp. As endotoxinas
fazem parte da própria estrutura dos fungos, não sendo liberadas para o meio ambiente. Para
que ocorra intoxicação (micetismo) é necessário a ingestão do próprio fungo e não apenas da
toxina, como no caso das micotoxicoses. Os fungos incriminados como produtores de
micetismos são os chamados cogumelos venenosos: Amanita verna, Amanita muscaria,
Amanita phalloides, Amanita pantherina, Coprinus atramentarius, Cantharellus
auratialus, Lactarius tormentosum, Russula emetica, Lepiota helveola, Entoloma
lividum, Gyromitra esculenta, Cortinarius orelanus, Psilocybe sp., Stropharia sp.,
Conocybe sp. e Tricholona sp. A ingestão de ambos os tipos de toxinas leva à produção de
variado quadro anátomo-patológico como: vômitos, tremores, diarréias, hemorragias e
neoplasias.
A célula fúngica é menor e mais simples do que a célula dos vegetais e animais, porém
apresenta basicamente os mesmos componentes encontrados nestas células eucariontes:
• Parede Celular: pode ser fundamentalmente de quitina, celulose ou composta de uma
mistura das duas substâcias. Alguns fungos durante um período de seu ciclo de vida perdem a
parede (esporos dos fungos aquáticos).
• Lomassoma: estrutura formada a partir da membrana celular e que se localiza entre a
parede e a membrana plasmática. Apresenta as seguintes funções:
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Secreção e formação de parede celular.
Proliferação de citomembranas.
Micropinocitose.
Síntese de glicogênio.
Manutenção do turgor celular.
Funções de complexo de Golgi.
Estrutura de resposta a tensões, sendo produzida em momentos de parasitismo ou
traumatismo.
• Membrana Celular : apresenta permeabilidade seletiva, segue o modelo do mosaico
fluido e, em alguns fungos que perdem a parede durante parte de seu ciclo biológico, dá a
forma e protege a célula.
• Núcleo: com membrana nuclear e fuso acromático intra-nuclear (durante a divisão celular
por mitose não há desorganização da membrana nuclear).
• Vacúolos: existem basicamente dois tipos, o de reserva que contém glicogênio e o
digestivo que contém enzimas digestivas, semelhantemente ao lisossoma.
• Septos: são projeções da parede celular que divide transversalmente a hifa. Os septos
podem ser falsos ou verdadeiros. Os septos falsos são aqueles que apresentam um poro central
que permite a passagem do citoplasma de um compartimento para o outro da hifa. Os septos
verdadeiros não apresentam poro e são formados em dois momentos: no traumatismo para
evitar o estravasamento do material citoplasmático para o meio ambiente e na reprodução
quando um septo é formado para isolar a área reprodutiva do restante do corpo vegetativo.
• Flagelo: nas células móveis (esporos de fungos aquáticos) encontram-se dois tipos, o
Tinsil ou Penado que apresenta um diâmetro uniforme ornamentado externamente por fibrilas
e o Whiplash ou Chicote que afila progressivamente para a extremidade livre e não é
ornamentado.
Os fungos podem ser divididos de acordo com a sua morfologia vegetativa em:
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ou são transparentes e demáceas quando apresentam cores escuras. Também podem ser
divididas em septadas e asseptadas.
• Leveduriformes: as células têm formato arredondado ou ovalado e são chamadas de
leveduras.
Os esporos são as unidades reprodutivas dos fungos e se caracterizam por também apresentar
formas e colorações variadas. Os principais tipos de esporos são:
As estruturas que formam e dão sustentação aos esporos são genericamente conhecidas como
esporóforos. Estas estruturas apresentam denominações específicas de acordo com o tipo de
esporos que produzem. Assim, quando produzem conídios, são denominados de conidióforos;
quando produzem esporângios com esporângiosporos, são denominados de esporângióforos;
quando produzem zoosporângios com zoosporos, são chamados de zoosporângióforos. Os
esporóforos podem ser ainda simples ou compostos. Conidióforos e esporangiosporos
exemplos de esporóforos simples que dão origem a esporos assexuados, enquanto que
sinêmios, esporodóquios, soros e acérvulos e picnídios são exemplos de esporóforos
compostos e que também dão origem a esporos assexuados (conídios). Os esporóforos
compostos que dão origem a esporos sexuados são chamados de ascocarpos quando ascos e
ascosporos são produzidos em seu interior e de basidiocarpos (basidióforos) quando
basidiosporos são produzidos sobre as suas estruturas (basídias). Os ascocarpos podem ser
divididos em peritécios, apotécios, cleistotécios e gmnotécios de acordo com seu modo de
comunicação com o meio exterior.
5
5. FISIOLOGIA DOS FUNGOS
5.1 Nutrição
5.1. Respiração
• Aeróbios.
• Respiração celular: Ciclo de Krebs, Cadeia Respiratória e Fosforilação Oxidativa.
5.3. Fermentação
5.4. Dimorfismo
5.5. Reprodução
O ciclo biológico dos fungos começa e termina no esporo, que pode ser oriundo de
reprodução sexuada e/ou assexuada e ainda pode ser endógeno (quando produzido no interior
de células ou hifas especializadas) e exógeno (quando produzido no exterior de células ou
hifas especializadas). As formas conhecidas de reproduções nos fungos são:
• Assexuada (Imperfeita ou Anamórfica): divisão nuclear por mitose. Ocorre puramente por
transformações do sistema vegetativo. É importante para a propagação da espécie porque
produz grande número de esporos, porém, a variabilidade genética é baixa e dependente de
mutações.
6
Esta reprodução produz baixo número de esporos (ocorrendo apenas após um período de
“stress” ambiental), mas com grande variabilidade genética.
• Ciclo Parassexuado: divisão nuclear por mitose. Não ocorre em um período ou ponto
específico do ciclo biológico do fungo e não há formação de estruturas de reprodução. É
composto pelas seguintes fases: plasmogamia; cariogamia.; mitose (com eventual crossing-
over mitótico).
Este ciclo fornece algumas vantagens que só seriam obtidas no ciclo sexuado. Desta forma,
um certo grau de variabilidade genética é conseguido. O Ciclo Parassexuado é muito
importante para aqueles fungos que não se reproduzem sexuadamente e que dependem
exclusivamente de mutações para que haja alguma variação em seu código genético. O
homem utiliza este ciclo, aliado a mutações artificiais, fazer melhoramento genético, ou seja ,
obtenção de novas linhagens em fungos de interesse comercial, industrial e médico cuja
reprodução sexuada não se conhece.
A exata posição dos fungos com relação aos outros organismos tem sido motivo de muita
discussão. Inicialmente, os fungos foram tratados como pertencentes ao reino vegetal.
Todavia, quando comparadas, as características dos fungos se chocavam com as
características dos demais representantes deste reino. Somado a isso, algumas características
observadas nas células animais eram compartilhadas pelos fungos. Com o objetivo de
minimizar as diferenças, os fungos foram então separados em um reino particular.
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Tradicionalmente, o reino Fungi tem sido dividido em dois filos (ou divisões): o
Myxomycota, para as forma plasmodiais, e o Eumycota (fungos verdadeiros), para as forma
não plasmodiais que são usualmente miceliais ou leveduriformes. Os fungos verdadeiros, por
sua vez, têm sido classificados a partir de suas relações filogenéticas e estruturas de
reprodução sexuada nos subfilos (ou subdivisões): Basidiomycotina, Ascomycotina,
Zygomycotina e Mastigomycotina. A exceção fica por conta do subfilo (ou subdivisão)
Deuteromycotina que não é formada a partir de graus de parentesco e nem a partir de formas
sexuadas de reprodução. Nele são colocados todos aqueles fungos cuja reprodução sexuada é
inexistente ou desconhecida, independentemente de sua origem filogenética (evolutiva). Na
maioria das vezes, os deuteromicetos são formas assexuadas de ascomicetos ou
basidiomicetos.
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Com o avanço das técnicas de estudo, muitos organismos anteriormente considerados fungos
foram retirados do reino Fungi por apresentarem características que conflitiam com aquelas
reconhecidas para este grupo. Assim, o reino Fungi foi reestruturado e atualmente passou a
conter os Filo Basidiomycota, Ascomycota, Zygomycota e Chytridiomycota. O antigo
Sbufilo Mastigomycotina foi retirado do reino Fungi, pois muitos organismos considerados
neste taxon tinha pouca relação com os fungos verdadeiros, ficando apenas a antiga classe
dos Chytridiomycetes como filo Chytridiomycota. O subfilo Deuteromycotina foi extinto por
não ser uma unidade monofilética e seus componentes passaram a ser designados como
“fungos mitospóricos”. Recentemente, o termo “fungo mitospórico” foi substituído pelo o
termo “fungo anamórfico”. É importante ressaltar que estes termos não correspondem a uma
classificação taxonômica, mas sim, apenas a uma designação sob a qual estão agrupadas as
formas assexuadas de alguns fungos.
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Outra classificação proposta inclui os filos Basidiomycota, Ascomycota, Zygomycota e
Deuteromycota. Nesta, nenhum dos membros do antigo subfilo Mastigomycotina é
considerado fungo verdadeiro e, mesmo não sendo uma unidade monofilética, o antigo subfilo
Deuteromycotina foi mantido como filo Deuteromycota.
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Esquema taxonômico dos principais grupos de fungos
Zygomycota
Zygomycetes Entomophthorales Entomophthoraceae Basidiobolus
Conidiobolus
Mucorales Mucoraceae Absidia
Mortierella
Mucor
Rhizomucor
Rhizopus
Cunninghamellaceae Cunnighamella
Syncephalastraceae Syncephalastrum
Blastomycetes Aureobasidium
Cryptococcus
Candida/Torulopsis
Malazzesia/Pityrosporum
Rhodotorula
Trichosporon
Sporobolomyces
Deuteromycota
Hyphomycetes Moniliales Moniliaceae Acremonium/Cephalosporium
Aspergillus
Blastomyces
Chrysosporium
Coccidioides
Epidermophyton
Geotrichum
Gliocladium
Histoplasma
Microsporum
Paecilomyces
Paracoccidioides
Penicillium
Sepedonium
Scopulariopsis
Sporothrix
Trichoderma
Trichophyton
Dematiaceae Alternaria
Cladosporium
Curvularia
Drechslera
Exophiala
Fonsecaea
Helmintosporium
Madurella
Nigrospora
Phialophora
Rhinocladiella
Ulocladium
Wangiella
Tuberculariaceae Epicoccum
Fusarium
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A classificação dos fungos está apoiada na micromorfologia das estruturas reprodutivas.
Como alguns fungos podem se reproduzir tanto sexuada quanto assexuadamente, estes
irão apresentar duas denominações, uma em função da morfologia sexuada e outra em
função da morfologia assexuada. Isto ocorre por que as estruturas de reprodução
sexuada e assexuada são morfologicamente diferentes. Assim, um mesmo fungo poderá
ser conhecido pelo seu nome sexuado (perfeito ou teleomórfico) ou pelo seu nome
assexuado (imperfeito ou anamórfico). Taxonomicamente, quando a reprodução
sexuada for conhecida, deve se dar preferência de uso para o nome teleomórfico.
Contudo, na prática, os fungos são tratados por seu nome anamórfico, já que as culturas
são manipuladas, no laboratório clínico, na fase assexuada.
12
Continuação
Zigomicose
Absidia spp.
Cunninghamella spp.
Mucor spp.
Rhizopus spp.
Syncephalastrum spp.
Basidiobolus sp.
Conidiobolus sp.
13
MICOLOGIA CLÍNICA
1. DEFINIÇÃO: MICOSE
A patogenicidade dos fungos tem sido relacionada com a sua capacidade de
desenvolvimento nos tecidos do hospedeiro. A ação espoliativa dos fungos patogênicos
pode levar a um variado quadro mórbido, genericamente, denominado de micose.
1. TERMINOLOGIA
3. CLASSIFICAÇÃO
4. FATORES PRÉ-DISPONENTES
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• Fungo: fatores indutores de fase tecidual (dimorfismo); Afinidade tecidual
(equipamento enzimático); presença de cápsula; parasitismo intracelular; toxicidade
(exo e endotoxinas); poder invasor (orgãos perfurantes: ação mecânica)
• Clima: de maneira geral as micoses são mais freqüentes em climas quentes do que
em climas temperados e frios. Há, porém, algumas micoses em que a influência
climática é predominante. Neste casos, o fungo só sobrevive no ambiente em condições
climáticas estritas.
• Meio Social: considera-se o solo e os vegetais como sendo o principal habitat dos
fungos patogênicos, assim, compreende-se que a incidência das micoses seja maior no
meio rural do que no meio urbano.
15
5. DINÂMICA DAS MICOSES
• Solo
• Vegetais
• Animais
• Homem.
• Hematogênica
• Linfática
• Contiguidade
16
Continuação
6. TRANSMISSÃO
6.1. Micoses superficiais: a transferência de agentes fúngicos ocorre por contacto direto
entre indivíduos.
6.1. Micoses subcutâneas e profundas: a doença adquirida por contacto direto é pouco
freqüente. Na realidade, nestas o agente fúngico é transmitido de maneira indireta, ou
seja, pelo contacto com solo, ambientes e objetos contaminados.
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e reação de hipersensibilidade cutânaea aos antígenos do Aspergillus spp. Elevada
concentração sérica de Ig G anti-Aspergillus;
18
• Lesão nodular subcutânea no sítio de infecção com espalhamento ascendente e
evolução secundária de úlceras cutâneas no trajeto dos vasos linfáticos: Sporotrix
schenckii;
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7.7. Micoses dos seios paranasais
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8.5. Granuloma histiocítico
• Parede fibrosa espessa envolvida por células epitelióides, micorganismos dentro das
células gigantes de Langhans localizadas no centro da lesão, frequentemente ocorre
calcificação: Histoplasma capsulatum
8.10. Fibrose
8.11. Granuloma esclerosante por corpo estranho (em seios paranasais ou após
infecção viral)
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9. IMUNOLOGIA DAS MICOSES
A imunidade natural contra as micoses é muito elevada, por isso, a infecção fúngica
depende da exposição maciça de microrganismos e da resistência geral do hospedeiro.
Esta situação está bem demonstrada por duas categorias principais de enfermidade
micótica. A primeira, infecção por fungos patogênicos verdadeiros, ocorre em pacientes
que se encontram em áreas endêmicas particulares e que inalam uma quantidade
elevada de elementos fúngicos em suspensão no ar. A maior parte dessas infecções são
assintomáticas ou resolvem com rapidez e normalmente ocorre resitência à reinfeção.
Somente em raras ocasiões, a enfermidade chega ser grave. Por outro lado, as infecções
oportunistas são causadas por microrganismos presentes de maneira universal que
possuem virulência muita baixa. O estabelecimento de uma enfermidade depende
exclusivamente da resistência do hospedeiro. Neste casos, se o paciente se recupera
desta situação, incluindo a infecção fúngica, se observa a ocorrência de resistência não
específica à reinfecção.
Na atualidade, até onde se sabe, os anticorpos desempenham um papel muito pequeno
na defesa frente as infeções micóticas. A imunidade celular parece ser a única
resistência eficaz contra a invasão dos fungos. Esta situação está bem ilustrada pelos
dois tipos de infecção que ocorrem em pacientes portadores de enfermidades
linfomatosas ou que apresentam defeitos genéticos da função linfocitária. Em pacientes
que apresentam discrasias ou defeitos da função do linfócito T são freqüentes as
infecções fúngicas oportunistas. Se o defeito só ocorre em células B, raramente ocorrem
enfermidades causadas por fungos, todavia, são comuns as infecções bacterianas, em
particular, as causadas por cocos Gram positivos. A importância dos mecanismos
celulares de defesa também se refletem nas manifestações histológicas. No hospedeiro
normal, os fungos patogênicos produzem reações piogênicas seguidas de reação
granulomatosas. A resposta gerada por organismos oportunistas se traduz por necrose e
supuração e o hospedeiro não é capaz de conter os microrganismos.
Os fungos são fracamente antigênicos. Por esta razão, na maior parte dos casos, a
sorologia não é um bom auxílio diagnóstico ou prognóstico. Além disso, a ocorrência de
reações cruzadas e a falta de padronização dos antígenos tornam os procedimentos
sorológicos de emprego limitado.
A hipersensibilidade e alergia aos fungos se manifestam de diversas formas. Uma
alergia intensa pode ser devido a inalação de conídios. Estes podem provocar asma,
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enfermidades asmatiformes, fibrose e consolidação pulmonar. Os estados alérgicos
também podem manifestar-se como processos secundários (“micedes” ou “ides”) à
focos de infecção cutânea por dermatófitos (dermatofítides) ou candida (levedurídes).
As lesões de “ide” ocorrem pela liberação de alérgenos fúngicos circulantes, os quais,
em pessoas sensíveis, são capazes de provocar erupções cutâneas distantes do foco
primário. As reações alérgicas como eritema nodoso podem ser parte da infecção
primária de alguma enfermidade sistêmica como histoplasmose e coccidioidomicose.
Com freqüência, a hipersensibilidade, segundo se tem demonstrado por reações
cutâneas positivas, está relacionada a uma boa resistência à infecção ou reinfecção.
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PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
1.1. Escarro: três amostras matutinas devem ser coletadas após levantar, mas antes do
café da manhã. Os pacientes são instruidos para lavar a cavidade bucal com água
imediatamente antes da obtenção do escarro. A produção de escarro pode ser induzida
por nebuliação com salina se um adequado espécimen não for produzido. O espécimen
de escarro deve ser colocado em um frasco estéril e enviado ao laboratório no máximo
até duas horas após coletado. Se demoras são inevitáveis, o espécimen clínico deve ser
refrigerado a 4o C.
1.3. Fluido cerebroespinhal: fluido cerebroespinhal deve ser coletado sempre que se
suspeita de infecções do sistema nervoso central. Se o processamento não for imediato,
a amostra deve ser deixada a temperatura ambiente e não refrigerada, já que o fluido
cerebroespinhal é um adequado meio de cultura no qual os elementos fúngicos podem
sobreviver até serem subcultivados.
1.4. Urina: amostras matutinas são preferidas. Estas devem ser coletadas em frascos
estéreis e transportadas imediatamente para o laboratório. Demoras no processamento
não devem exceder 1 horas, todavia, se atrasos forem inevitáveis, a amotra deve ser
mantida a temperatura de 4o C.
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1.6. Exudatos: a pele sobre as lesões pustulares deve ser desinfectada e o exudato
aspirado, usando uma seringa e agulha estéreis. A seringa pode servir com recipiente de
transporte. Biópsias das lesões podem ser necessárias, se o aspirado falhar na
recuperação dos fungos.
1.7. Pele, pêlos e unhas: a lesão deve ser higienizada com gaze embebida em álcool
70% para remover as bactérias contaminantes. As amostras de pele devem ser obtidas
por raspados das margens das lesões com uma lâmina de bisturi ou com bordo cortante
da lâmina de microscopia. O material de unhas infectadas deve ser coletado por
raspagem profunda das áreas quebradiças, distróficas e descoloradas da lâmina ungueal
e/ou dos depósitos subungueais. Os espécimens de cabelo devem ser coletados por
arrancamento com pinça, já que o foco infeccioso se encontra no bulbo piloso, técnica
da escova de cabelo, técnica do quadro de cabelo ou lampada de Wood.
1.8. Tecidos: biópsias de sítios suspeitos devem ser transportadas em gaze estéril
umedecida em salina ou em frasco estéril contendo salina. Os espécimens de biópsia
devem apresentar uma área de tecido são e lesado. O material não deve estar congelado,
desidratado ou formolisado.
1.9. Sangue: coleta de sangue venoso feita por punção com seringa e agulha estéreis.
Frasco de hemocultura bifásico (agar BHI-caldo BHI) ventilados devem ser empregados
para cultura.
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Critérios de recusa de amostras clínicas para cultivo micológico
Sem identificação no recipiente que contém o Devolver a quem enviou para esclarecimentos
material clínico ou discrepância de informação
sobre o paciente na requisição do exame e na
etiqueta de identificação do material clínico
Esfregaço de escarro corados pelo Gram com 15 Quando se suspeita de uma infecção de trato
células epiteliais por campo microscópico respiratório baixo, a presença de grande quantidade de
células epiteliais em amostras de escarro indica
contaminação com secreções orais; isto não é
necessariamente um critério de recusa já que se pode
recuperar fungos patogênicos particularmente se são
empregados meios seletivos; cada caso deve ser
analisado individualmente
Swab seco ou material insuficiente Pedir uma nova amostra se a condição clínica justifica;
se uma nova amostra é viável, mas não é possível obtê-
la por e técnicas não invasivas, pode ser necessário a
coleta por biópsias
Amostras de urina ou escarros de 14 horas Notificar que as amostras de 14 horas são inaceitáveis e
pedir o envia de amostras matinas com no máximo 1
horas de colhidas
1.1. Pré-tratamento
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d. Tecido: trituração com gral e pistilo ou cortes em pequenos fragmentos (zigomicetos)
com bisturi ou tesoura estéreis. É necessário para melhorar a recuperação dos fungos
agentes de micoses profundas.
a. Azul de Alciano
Uso: detecção de Cryptococcus neoformans
Tempo requerido: 1 minutos
Vantagem: quando positivo em LCR é diagnóstico
Desvantagem: não é comumente empregado, como a tinta da china não detecta todos os
casos
b. Álcool-ácido resistência
Uso: detecção de Mycobacteria e Nocardia spp.
Tempo requerido: 11 minutos
Vantagem: cora Nocardia spp e Blastomyces dermatitidis
Desvantagem: espécimens de tecido são difíceis de interpretar poe causa da forte
coloração de fundo
c. Branco de Calcoflúor
Uso: detecção específica de fungos
Tempo requerido: 1 minuto
Vantagem: pode ser misturado ao KOH; detecta fungos rapidamente como resutado de
fluorescência brillhante (reação específica com a quitina da parede fúngica)
Desvantagem: requer microscópio de fluorescência; prominente fundo
fluorescente’porém o fungo apresenta uma fluorescencia mais intensa; secreções
vaginais são difíceis de interpretar
d. Giemsa
Uso: exame de medula óssea ou esfregaço de sangue periférico
Tempo requerido: 15 minutos
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Vantagem: detecção de Histoplasma capsulatum intracelular
Desvantagem: detecção usualmente limitada ao Histoplasma capsulatum
e. Gram
Uso: detecção de bactérias
Tempo requerido: 3 minutos
Vantagem: empregado no exame bacterioscópico do espécimen clínico; permite a
identificação da maioria dos fungos
Desvantagem: alguns fungos se coram bem, outros, por exemplo o Cryptococcus
neoformans, coram-se fracamente e exibem apenas um aspecto pontilhado. Alumas
Nocardia isoladas falham em corar ou coram fracamente. Artefatos mimetizam as
leveduras
f. Tinta da China
Uso: detecção de Cryptococcus neoformans
Tempo requerido: 1 minuto
Vantagem: quando positivo no LCR é diagnóstico de meningite
Desvantagem: negativo em muitos casos de meningite, não confiável
g. Hidróxido de Potássio
Uso: detecção clarear o espécimen para tornar o fungo mais visível
Tempo requerido: 5 minutos, se o clareamento não é completo, um tempo maior é
necessário (10 minutos)
Vantagem: rápida detecção de elementos fúngicos
Desvantagem: requer experiência, já que os artefatos podem confundir o analista. O
clareamento de alguns espécimens pode ser demorado (unha)
h. Azul de Metileno
Uso: detecçãodetecção do fungo em escamas de pele
Tempo requerido: 1 minutos
Vantagem: usualmente adicionado ao KOH, fornece contraste para a detecção dos
elementos fúngicos
Desvantagem: o contraste das células pode ser difícil
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l. Gromori Metanamina Silver (impregnação pela prata)
Uso: detecção detecção de fungos em cortes histológicos
Tempo requerido: 1 hora
Vantagem: cora especificvamente os elementos fúngicos
Desvantagem: método de coloração fúngica que não está usualmente disponível no
laboratório de micologia clínica
m. Papanicolaou
Uso: exame de secreção vaginal para a presença de células malígnas
Tempo requerido: 30 minutos
Vantagem: citotécnico pode identificar elementos fúngicos
Desvantagem: requer coloração especializada e analista familiarizado com essa
coloração
o. Wright
Uso: exame de medula óssea ou esfregaço de sangue periférico
Tempo requerido: 7 minutos
Vantagem: detecta Histoplasma capsulatum
Desvantagem: detecção limitada ao Histoplasma capsulatum
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Característica dos elementos fúngicos vistos em exame direto dos espécimens clínicos
30
Continuação
31
Continuação
32
Continuação
3. CULTURA
a. Isolamento primário
• Agar de Sabouraud 1% (SDA): recuperação primária de fungos sapróbios e
patogênicos (não aconselhável)
• Agar infusão de cérebro-coração (BHIA): recuperação primária de fungos sapróbios
e patogênicos
• Agar infusão de cérebro-coração com cloranfenicol e cicloheximida: recuperação
primária de fungos sapróbios e patogênicos, excluindo-se os dermatófitos
• Agar de Sabouraud e Agar BHI (SABHI): recuperação primária de fungos
sapróbios e patogêncios
• Agar mycosel: principal meio de recuperação primária de dermatofitos
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• Frasco de hemocultura bifásico (agar BHI e caldo BHI): recuperação primária de
fungos do sangue
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Antimicrobianos adicionados aos meios micológicos
Antibacterianos
Cloranfenicol 16µg/ml
Gentamincina 5µg/ml
Antifúngico
Cicloheximida 500µg/ml
b. Isolamento secundário
• Agar milho com tween 80: identificação de Candida albicans por produção de
clamidosporos; identificação de outras leveduras por micromorfologia
• Agar base nitrogênio-leveduras (YNB): identificação de leveduras por
determinação de assimilação de açúcares
• Agar base carbono-leveduras (YCB): identificação de espécies de Cryptococcus
pela redução de nitratos
• Agar semente de niger: recuperação e identificação de Cryptococcus neoformans
• Agar ascosporos: detecção de ascosporos em leveduras ascosporogênicas
• Agar uréia: detecção de espécies de Cryptococcus neoformans; diferenciação de
Trichophyton mentagrophytes e Trichophyton rubrum; detecção das espécies de
Trichosporon
• Agar batata dextrosado: demontração da produção de pigmentos por Trichophyton
rubrum
• Meio de arroz: identificação de Microsporum audoiunii
• Agares “tricofitons” 1-7: identificação dos membros do gênero Trichophyton
• Agar Czapeck: recuperação e identificação diferencial de espécies de Aspergillus e
Penicillium
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Meios aconselháveis para subcultura de fungos
Taxa de Crescimento
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Distinção entre fungos contaminantes e patogênicos
a. Equipamentos
• Alça em “L” (dobrada em ângulo reto): fungos filamentosos
• Alça em “gota” (bacteriológica): fungos leveduriformes
• Alça de Drigalski: espalhamento sobre o meio de cultura
• Alça de Hockey: espalhamento sobre o meio de cultura
b. Técnicas de inoculação
• Esgotamento sobre a superfície do meio: fungos leveduriformes
• Perfuração do meio: fungos filamentosas
4. PROCEDIMENTOS GERAIS
37
homogeneizar pela adição de NALC; NAOH e outros agentes de digestão química,
usados para o processamento de espécimens suspeitos de tuberculose, não devem ser
empregados. Prepare uma montagem úmida da amostra para realização de exame direto
e inocule 0,5ml no meio de cultura empregado; como as secreções são freqüentemente
contaminada com bactérias, meios contendo antibióticos devem ser empregados; uma
cobinação de meios seletivos, tal como BHIA com cloranfenicol e cicloheximida, e não
seletivos, tal como SABHI, devem ser utilizada.
4.3. Urina: entorno de 10 ml de urina deve ser centrifugado e 0,5 ml de sedimento deve
ser inoculado tanto em agar não seletivo (SABHI) quanto em meios seletivos (BHIA
com cloranfenicol e cicloheximida); montagens diretas podem ser preparadas e
examinadas microscopicamente para a presença de leveduras e hifas.
4.4. Pele, pêlos e unhas: escamas de pele, fragmentos de unha e fios de cabelos
arrancados podem ser examinados em preparações microscópicas com KOH; o
propósito do KOH é clarear ou macerar as estruturas proteináceas e escleróticas que
podem dificultar a visualização dos elementos fúngicos (a maceração pode ser acelerada
pelo rápido aquecimento da lâmina sobre a chama do bico de Bunsen); uma lamínula é
aplicada e os espécimens são examinados para a presença de hifas estreitas e regulares
que caracteristicamente se quebram em artrosporos; a visualização da hifa é melhorada
pela adição de calcoflúor ao KOH (microscópio de fluorescência); em pêlos o arranjo
dos esporos na superfície do pêlo (ectotrix) e intrapilarmente (endotrix) podem ser
vistos; fragmentos de hifas podem ser também encontrados dentro dos pêlos; escamas
de pele, fragmentos de unha e pêlo devem ser colacados diretamente sobre a superfície e
dentro do agar mycosel com uma alça em “L”; as áreas inoculadas devem ser
38
examinadas em intervalos freqüentes para o desenvolvimento de colônias; as culturas
devem ser mantidas por pelo menos 30 dias antes de descartar como negativas.
4.5. Tecido: o processamento dos espécimens de tecido pode ser feito a partir da
trituração com gral e pistilo (não recomendável) ou a partir de cortes com tesoura ou
bisturi estéreis; os fragmentos (1mm3) devem ser inoculados diretamente sobre o meio
de cultura e abaixo de sua superfície; homogeneizados de tecido, medula óssea ou
centrifugados de espécimens clínicos (5-10 ml) devem ser depositados sobre meios não
seletivos (SABHI), já que esses espécimens são normalmente estéreis e meios com
antimicrobianos não são necessários.
a. Exame Macroscópico:
A morfologia colonial deve ser interpretada com cautela, pois fatores como tipo de meio
de cultura, temperatura de incubação e tempo de incubação interferem no aspecto
macroscópico das culturas fúngicas. As características a serem investigadas são:
• Coloração: negra; cinza; branca; marrom; amarela; creme; laranja; verde; violeta ou
vermelha
b. Exame microscópico
39
direto é de preparação fácil e rápida e normalmente é suficiente para a identificação de
muitos fungos isolados no laboratório. A principal desvantagem do método é a
desorganização das estruturas morfológicas durante a preparação da montagem
microscópica.
40
Continuação
Assimilação de Nitrato Permite diferenciar a Wangiella spp. das Wangiella dermatitidis: negativo
outras espécies de fungos dematiáceos Exophiala jeanselmei: positivo
Tolerância ao Cloreto de Sódio Permite diferenciar alguns fungos Exophiala werneckii: positivo
dematiáceos quando cultivados na Exophiala jeanselmei: negativo
presença de 15% de NaCl
41
5.1. Identificação dos fungos leveduriformes
a. Exame Macroscópico
É menos distintivo para as espécies de levedura. Também aqui a morfologia colonial
deve ser interpretada com cautela, pois os mesmos fatores (tipo de meio de cultura,
temperatura de incubação e tempo de incubação) que interferem no aspecto
macroscópico das culturas filamentosas influenciam as características
macromorfológicas das colônias levedudriformes. Normalmente, essas colônias têm
uma aparência mucóide ou pastosa e uma topografia lisa ou rugosa. Como nas colônias
filamentosas, diversas cores podem ser descritas, todavia, as colônias de coloração
esbranquiçadas são as mais frequentemente encontradas.
b. Exame Microscópico
Por terem poucas estruturas micromorfológicas que permitam a identificação das
espécies, o exame microscópico deve ser acompanhado de estudo do pefil biquímico.
Empregando-se microscópico óptico, objetivas de 10x e 40x e luz de baixa intensidade,
a observação microscópica pode ser procedida em preparações diretas e/ou em
microcultivos corados com azul de algodão. Células de levedura, blastosporos,
pseudohifas, clamidosporos, artrosporos e hifas vedadeiras são as estruturas
visualizadas.
42
Continuação
43
Continuação
44
Fungos Leveduriformes
(Cultura Pura)
Tubo Germinativo
+ -
Assimilação de Ascosporos
Candida spp. Trichosporon Geotrichum
Inositol
(presença de (ausência de
+ - + - blastosporos) blastosporos)
Candida spp.
Cryptococcus spp. Cryptococcus Assimilação de
(identificação final) neoformans Carbohidratos
Cryptococcus spp.
(identificação final)
5.3. Diagnóstico histopatológico
Hematoxilina & Eosina Rosa a rosa azulado Mostra a resposta tecidual; cora alguns Muitos fungos são pobremente corados ou não se
fungos; não mascara a coloração natural coram
fúngica; revela o fenômeno de Splendore-
Hoppli
Gormori-Grocott Marron escuro sobre um fundo Os fungos são mais prontamente detectados Mascara a coloração fúngica natural e pode encobrir
verde claro detalhes internos dos fungos; a resposta tecidual pode
ser detectada
Colorações Especiais para Fungos
Ácido Periódico de Rosa avermelhado sobre um Os fungos são mais prontamente detectados Mascara a coloração fúngica natural e pode encobrir
Schiff fundo verde detalhes internos dos fungos; a resposta tecidual pode
ser estudada; muitos elementos teciduais também se
coram
Gridley Vermelho púrpura sobre um Os fungos são mais prontamente detectados; Mascara a coloração fúngica natural; fungos não
fundo amarelo detalhes morfológicos dos fungos são viáveis no momento da fixação tecidual podem não ser
visíveis corados
Mucicarmin de Mayer Cápsula de Cryptococcus Permite a diferenciação do C. neoformans das Não é específica para C. neoformans e algumas células
neoformans vermelha sobre um outras leveduras podem não se corar; o Rhinosporidium seeberi e o
fundo púrpura Blastomyces dermatitidis podem ser corados
46
5.4. Diagnóstico imunológico
Fixação de Complemento
Contraimunoeletroforese
Ensaio imunoenzimático
Anticorpo Fluorescente
Teste de Ssensibilidade
Aglutinação em Látex
Precipitação em Tubo
Aglutinação em Tubo
Prova do Ácido Nucléico
Radioimunoensaio
Imunodifusão
Exoantígeno
Cutânea
(DNA)
Micoses Sistêmicas
Aspergilose X X X X X X X
Blastomicose X X X X X X X X
Candidíase X X X X X X
Coccidioidomicose X X X X X X X X
Criptococose X X X X X
Histoplasmose X X X X X X X X X
Paracoccidioidomicose X X X X X X X
Esporotricose X X X X X X X X
47
ASPERGILOSE
49
BLASTOMICOSE NORTE AMERICANA
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: o material clínicos, tais como fluídos prostáticos, escarros
ou tecidos, são examinadso ao KOH a 10%. O fungo usualmente ocorre como uma levedura
globosa de paredes espessas e refringentes que mede de 8 a 15µm de diâmetro, contudo,
algumas leveduras podem apresentar um diâmetro de até 30µm. O fungo pode apresentar
também células de levedura que têm menos do que 8µm. Cada blastosporo está ligado à célula
mãe por uma base larga. Pelo seu tamanho, o Blastomyces dermatitidis, sob certas
circunstâncias, pode ser confundido com o Coccidioides immitis ou Cryptococcus
neoformans. Isolamento: inocular o material clínico em SDA com cloranfenicol, em agar
50
infusão de cérebro coração com cloranfenicol (BHIA), em agar extrato de levedura-fosfato e
em um meio com cicloheximida e incubar a 30o C. As culturas devem ser mantidas por pelo
menos 4 semanas antes de serem despresadas como negativas. O Blastomyces dermatitidis
cresce melhor em agar extrato de levedura. Confirmação Laboratorial: a conversão da forma
filamentosa à leveduriforme é necessária para assegurar que o fungo suspeito é o
Blastomyces dermatitidis e não outro fungo similar, tal como o Chrysosporium ou o
Sepedonium. A conversão do fungo pode ser prontamente acompanhada no agar de Kelley
ou em agar sangue suplementado com vitaminas. Incubar os tubos inoculados a 37o C. A
forma de levedura irá crescer dentro de alguns dias.
51
BLASTOMICOSE QUELOIDIANA
52
CANDIDÍASE
53
germinativos e clamidosporos são observados em C. albicans. Isolamento: incubar o material
clínico em SDA com cloranfenicol. Muitas espécies de candida (C. krusei, C. parapsilosis e
C. tropicalis) são sensíveis à cicloheximida. Meios com cicloheximida devem ser usados com
cautela. Incubar a 30o C. O crescimento está presente em 1 a 5 dias. Fluido espinhal e sangue
devem ser processados por filtração. Identificação: baseada na produção de tubo
germinnativo, pseudohifas, hifas verdadeiras, clamidosporos, zimograma e auxanograma de
carbohidratos, auxanograma dos compostos nitorgenados.
54
COCCIDIOIDOMICOSE
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: espécimens clínicos, tais como flúidos, escarro e tecidos,
são examinados em KOH a 10%. Esférulas com paredes espessas (entorno de 1µm) de 30 a
60µm de diâmetro e endosporos de 1 a 5µm de diâmetro são característicos de Coccidioides
immitis. Os endosporos são liberados quando a parede da esférula é rompida. Confusões
55
podem ser feitas com o Blastomyces dermatitidis se os endosporos não estão em grande
quantidade dentro das esférulas. Isolamento: inocular o material clínico em SDA com
cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol e incubar a 30o C. As
culturas devem ser mantidas por 4 semanas antes de serem descartadas como negativas. O
fungo cresce muito rápido e prontamente produz artrosporos em forma de “barri” de 1,5 a
4µm e 3 a 6µm com uma célula dijuntora (sem contúdo citoplasmático) entre cada artrosporo.
O C. immitis é um fungo perigoso e deve ser manipulado todo o tempo em cabine de
segurança biológica classe II ou III. Confirmação Laboratorial: a confirmação laboratorial
com C. immitis é necessária porque outros fungos, tais como os membros da família
Gymnoascaceae, podem desenvolver anamorfos semelhantes ao C. immitis. Procedimentos
laboratoriais incluem meios especiais para a conversão e também técnica de exoantígenos.
Estudos com modelos animais podem ser necessários, em alguns casos.
56
CRIPTOCOCOSE
57
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: células de leveduras globosas são facilmente visualizadas
na maioria dos materiais clínicos (Líquido cérebro-epinhal e tecidos) montado em KOH a
10% ou em tinta da china (coloração de fundo). A cápsula pode estar ou não presente.
Isolamento: inocular aspirados e tecidos (processado em homogeneizador) em SDA com
cloranfenicol e incubar a 30o C. O C. neoformans é sensível à cicloheximida. O crescimento
está presente em 1 a 5 dias. O líquido céfalo-raquidiano pode ser processado pela técnica da
filtração ou centrifugação. Identificação: baseada na presença de cápsula, prova da urease,
assimilação de acúcares e nitratos, crescimento a 37o C e patogenicidade para animais.
58
CROMOMICOSE
59
curetagem ou biópsia de tecido subcutâneo e pele contêm corpúsculos muriformes que são
arredondados, demáceos, de parede espessa e com 5 a 11µm de diâmetro. Isolamento:
inocular os espécimens clínicos em SDA com cloranfenicol e em meio contendo
cicloheximida e cloranfenicol. Incubar a 30o C e descartar como negativas somente depois de
4 semanas.
60
DERMATOFITOSE
c. FORMAS CLÍNICAS: tinea capitis; tinea barbae; tinea corporis; tinea manuum; tinea
pedis; tinea cruris; tinea unguium; tinea favosa; tinea dos animais e favo dos animais.
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pele, pêlos e unhas, são
montados em KOH a 10%. Hifas septadas e grande número de artrosporos estão presentes. O
parasitismo dos pêlos pode apresentar um padrão ectotrix, endotrix ou endo-ectotrix de acordo
com a localização extra ou intrapilar das estruturas fúngicas. Isolamento: Os espécimens são
inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol
61
(mycosel) e incubados a 30o C. Colônias são observadas nos meios de culturas depois de 5 a
10 dias de incubação, mas são frequentes períodos mais prolongados. As culturas negativas
devem ser descartadas somente após 4 semanas. Identificação: baseada em características
morfológicas, prova da urease, provas nutricionais e perfuração do pêlo.
62
ESPOROTRICOSE
63
com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida e cloranfenicol. Incubar o meio a
30o C. O crescimento ocorre usualmente em três dias. Confirmação Laboratorial: a
conversão da forma filamentosa em leveduriforme é necessária, já que outros fungos são
morfologicamente semelhantes. O fungo deve ser transferido para o agar infusão de cérebro
coração e incubados a 37o C em ambiente com 5 a 10% de CO1.
64
FEOHIFOMICOSE
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pús e tecidos, são montados
em KOH a 10% para exame. A natureza demácea do elemento hifálico é a chave para o
diagnóstico da feohifomicose. A hifa pode ser variável ou regular em sua forma. Isolamento:
os espécimens são inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio contendo
cicloheximida e cloranfenicol e incubados a 30o C. Todavia, muitos dos seus agentes
etiológicos são sensíveis à cicloheximida. As culturas são descartadas como negativas em 4
semanas. O fungo isolado deve ser compatível com a doença clínica e a morfologia no tecido
(demáceo).
65
HIALOHIFOMICOSE
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: materiais clínicos, tais como pús e tecidos, são montados
em KOH a 10% para exame. A natureza hialina do elemento hifálico é um aspecto
importamte para o diagnóstico. A hifa pode apresentar uma forma variável ou regular.
Isolamento: os espécimens são inoculados em SDA com cloranfenicol e em um meio
contendo cicloheximida e cloranfenicol e incubados a 30o C. Todavia, muitos dos seus
agentes etiológicos são sensíveis à cicloheximida. As culturas são descartadas como negativas
em 4 semanas. O fungo isolado deve ser compatível com a doença clínica e a morfologia no
tecido (hialino).
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HISTOPLASMOSE AMERICANA
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: a detecção do fungo no material clínico, tal como medula
óssea, escarro e tecidos, é usualmente difícil. O material corado pela técnica do PAS, Giemsa,
ou GMS são superiores às preparações com KOH. Isolamento: inocular o material em SDA
com cloranfenicol, em agar extrato de levedura-fosfato com cloranfenicol, em um meio
contendo cicloheximida e cloranfenicol, em Sabhi com cloranfenicol e em agar sangue com
cloranfenicol. Incubar as culturas a 30o C e não descartar com menos de 11 semanas.
67
Confirmação Laboratorial: a conversão das formas filamentosas em leveduriformes é
necessária para assegurar que o fungo não é uma espécie de Chrysosporium ou
Sepedonium. Transferir o fungo para um tubo teste contendo agar infusão de cérebro
coração com vitaminas e incubar a 37o C. Técnicas de exoantígenos podem ser empregadas.
h. HABITAT NATURAL: solo com altos teores de nitrogênio (cavernas habitadas por
morcegos e deltas de rios).
68
HISTOPLASMOSE AFRICANA
e. PATOLOGIA: pequena reação celular ao fungo é notada, com excessão do grande número
de células gigantes (com até 80µm) e macrófagos. Neutrófilos estão usualmente presentes,
especialmente durante a necrose. O fungo apresenta paredes grossas, são globosos a ovóides,
têm de 7 a 15µm de diâmetro e podem formar pseudohifas rudimentares com 3 a 5 células.
Grandes agregados de leveduras podem ser prontamente visualizados dentro das células
gigantes e no espaço extracelular, juntamete com necrose do tecido do hospedeiro.
Diferentemente do Blastomyces dermatitidis, os blastosoporos não estão unidos à célula mãe
por uma base de inserção larga.
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: espécimens clínicos, tais como tecidos, são examinados
em KOH a 10%. Grandes células de levedura são prontamente observadas. Frequentemente o
Blastomyces dermatitidis é confundido com o agente a histoplasmose africana, já que ambas
ocorrem na África. Isolamento: inocular o material em SDA com cloranfenicol, em agar
extrato de levedura-fosfato com cloranfenicol, em meio contendo cicloheximida e Sabhi com
sangue e cloranfenicol. Incubar as culturas a 30o C e descartar como negativas depois de 11
semanas. Confirmação Laboratorial: a conversão da forma filamentosa à leveduriforme é
requerida para assegurar que o fungo recuperado não é do gênero Chrysosporium ou
69
Sepedonium. Os agentes etiológicos da histoplamose clássica e da histoplasmose africana
são morfologicamente idênticos a 30o C. A conversão das fases é feita em agar infusão de
cérebro coração com vitamina, incubado a 37o C.
70
MICETOMA
d. PATOLOGIA: as úlceras e tratos sinuosos abertos são envolvidos por bordas planas ou
elevadas. Os abscessos são preenchidos com material piogênico e grânulos que
freqüentemente são cobertos por um exudato. A parede do abscesso é formada por reação
granulomatosa, inflamação crônica e tecido de granulação.
71
f. MICOLOGIA: (principais fungos):
72
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
f. LABORATÓRIO: Exame Direto: escarro, material de biópsia (base e margem externa das
úlceras), crosta e pus (linfonodos supurativos) contêm as células de levedura. O material é
montado em KOH a 10% para o exame. O fungo é caracterizado por múltiplas gemulações de
pequenas células globosas (1 a 10µm de diâmetro) observadas entorno de uma célula madura
globosa (30µm de diâmetro) de paredes espessas e refringentes, formando figuras
denominadas de “roda de leme” ou “chapéu de mickey”. Isolamento: inocular o material
clínico em BHIA com cloranfenicol e em um meio contendo cicloheximida. Incubar as
células a 30o C e não descartar o material com menos de 4 semanas. As colônias podem
necessitar de 10 ou mais dias para alcançarem 1cm de diâmetro. Confirmação Laboratorial: a
73
conversão da fase filamentosa à fase leveduriforme é necessária, já que o Paracoccidioides
brasiliensis é geralmente estéril na forma filamentosa. Além disso, os conídios quando
formados são muito semelhante àqueles encontrados no gênero Chrysosporium e
Sepedonium. Inocular o fungo em Agar infusão de cérebro coração suplementado com
sangue e vitaminas e incubar a 37o C.
74
PITIRÍASE VERSICOLOR
75
Os achados histopatológicos revelam sinais de dermite crônicas, hiperqueratose com
penetração folicular, hipergranulose com vacuolização e acantose. Nas lesões
hipopigmentadas registram-se incontinência de melanina. Por vezes há inflamação
perifolicular, outra vezes, há inflamação perivascular.
76
RINOSPORIDIOSE
e. PATOLOGIA: grande número de cistos bem definidos estão logo abaixo do epitélio
hiperplásico. O estroma é denso com infiltração crônica e microabscessos purulentos
ocasionais. As esférulas alcançam um tamanho de 300µm de diâmetro e contêm grande
número de endosporos que variam de 7 a 10µm de diâmetro na maturidade. A liberação dos
endoporos produz uma reação inflamatória polimorfonuclear, formação de abscessos e algum
tecido necrótico. Tecidos de granulação são normalmente proeminentes.
77
ZIGOMICOSE
1. Entomoftoromicose
d. PATOLOGIA: as hifas são regularmente septadas com 4 a 10µm de diâmetro. Uma bainha
eosinofílica com um arranjo digitiforme semelhante àquela encontrada na esporotricose,
coccidioidomicose, blastomicose, paracoccidioidomicose e mais raramente na candidíase é
observada. Invasão vascular está ausente. A reação celular pode ser aguda e/ou crônica. As
reações inflamatórias crônica são granulomatosas com infiltrados contendo células gigantes
do tipo corpo estranho e hifas fagocitadas. A reação aguda consiste de eosinófilo, linfócitos e
células plasmáticas. Os eosinófilos podem originar abscessos eosinofílicos.
78
g. HABITAT NATURAL: solo
e. LABORATÓRIO: Exame Direto: o exame de biópsia em KOH a 10% deve revelar hifas
refringentes, septadas e largas. Isolamento: deve-se proceder como indicado para o isolamento
do Conidiobolus coronatus.
1. Mucormicose
79
doença esta associada com o diabetes descompensado em acidose (alteração na migração e
fagocitose), má nutrição, pacientes gravemente queimados e outras doenças tais como
leucemia e linfoma, ou terapia imunossupressora com o uso de citotoxinas e corticóides. Os
fungos mostram uma predileção pelos vasos (artérias). A invasão resulta em embolias e
necrose do tecido adjacente. Reações piogênicas supurativas podem ocorrer. As infecções são
tipicamente agudas e fulminantes. A doença rinocerebral em pacientes com acidose
usualmente leva à morte em poucos dias.
80
f. MICOLOGIA: Absidia corymbifera; Rhizomucor pusillus; Rhizopus oryzae; Rhizopus
arrhizus; Cunninghamella bertholetiae; Syncephalastrum racemosum.
81
BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA CLÍNICA
Profa. Cintia de Moraes Borba,
FIOCRUZ
Nunca se deve assumir que as pessoas que trabalham em laboratório tenham conhecimento
adequado sobre as práticas de segurança, individual ou coletiva, sendo portanto necessário
treinamento constante. Mimica, 1997 descreve que a infecção adquirida a partir de materiais
no laboratório pode não somente comprometer os funcionários do mesmo, mas também seus
familiares, estudantes e outras pessoas que visitam suas dependências, e, às vezes, até mesmo
de pessoas de laboratórios ou locais vizinhos. Assinala ainda que não é conhecida a real
incidência de infecção adquirida no laboratório clínico. Nos Estados Unidos a incidência
anual estimada é de 1,4 a 3,5 infecções adquiridas no laboratório em cada 1000 funcionários
por ano.
Como neste capítulo trataremos especificamente de fungos, toda a atenção será voltada a estes
microorganismos. No caso de um acidente envolvendo fungos vivos, as seguintes normas
gerais de segurança deverão ser cumpridas (McGinnis, 1980):
a) Prenda a respiração e deixe a sala imediatamente, fechando a porta;
b) Avise todas as pessoas do laboratório e não permita a entrada na área contaminad
c) Descontamine o local do acidente (veja “O que se deve fazer em caso de acidentes”).
82
Collins, 1983 descreve que a exposição aos microorganismos, inclusive os fungos, pode
ocorrer por:
1. Inalação de partículas fúngicas - pelo ar; após derramamento ou quebra de vidrarias; após
remoção de buchas de algodão ou tampa de rosca;
1. Ingestão - por pipetagem com a boca; pela falta de lavagem das mãos após manuseio de
culturas e/ou animais infectados;
3. Inoculação direta como resultado de acidentes com - agulhas; quebra de vidrarias; contato
com a pele e subsequente entrada no organismo através de cortes e arranhões.
83
14- Fungos perigosos, tais como, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis,
Histoplasma capsulatum entre outros, devem ser manipulados em cabines de segurança
biológica Classe II ou III.
Segundo McGinnis, 1980 acidentes envolvendo espécimens clínicos e fungos podem ocorrer
dentro ou fora da cabine de segurança. Um acidente fora da cabine de segurança é mais difícil
de administrar.
84
3. Acidentes ocorrendo em uma centrífuga:
3.1. Prenda a respiração e desligue a centrífuga imediatamente e deixe a sala fechando a porta;
3.1. Comunique ao pessoal do laboratório e feche a ventilação da área;
3.3. Espere aproximadamente por 1h;
3.4. Vista roupa protetora, entre na sala e desinfete a centrífuga com hipoclorito de sódio a 5%
diluído a 1:10 ou fenol a 5%;
3.5. Limpe os equipamentos e desinfete a sala;
3.6. Autoclave o material contaminado.
85
c) Classe de risco 3- (elevado risco individual e risco limitado para a comunidade) - patógeno
que geralmente causa doença grave ao homem ou aos animais e pode representar sério risco a
quem o manipula. É um risco se disseminado na comunidade, mas usualmente existem
medidas de tratamento e de prevenção;
d) Classe de risco 4- (elevado risco individual e elevado risco para a comunidade) -
patógeno que representa grande ameaça para o ser humano e para os animais. Grande risco de
contaminação para quem o manipula e com grande poder de transmissibilidade de um
indivíduo a outro.
Os fungos conhecidos se enquadram nas classes de risco 1, 1 e 3. Não existem fungos classe
de risco 4. Os níveis de biossegurança (NB) de um experimento serão determinados segundo
o organismo de maior classe de risco envolvido no experimento.
Laboratório NB-1: é adequado ao trabalho que envolva agentes de menor grau de risco.
Normas de biossegurança a serem seguidas:
• treinamento específico do pessoal;
• proibido comer, beber, fumar, aplicar cosméticos;
• proibido guardar alimentos nas áreas de trabalho;
• uso de pipetadores: é proibido pipetar com a boca;
• uso obrigatório de roupas de proteção;
• acesso restrito ao laboratório;
• descontaminação das superfícies de trabalho e dos resíduos antes do descarte;
• descontaminação dos resíduos, produzidos durante os trabalhos, antes do descarte;
• retirada de materiais contaminados em recipientes rígidos e à prova de vazamentos;
• superfícies resistentes a água, ácidos, álcalis, solventes orgânicos, e ao calor moderado;
• espaço suficiente entre as bancadas, cabines e equipamentos para permitir fácil acesso à
limpeza;
• controle rotineiro de insetos e roedores;
• existência obrigatórioa de pia para lavar as mãos;
• lavar as mãos antes de deixar o laboratório;
86
Laboratório NB-2: é adequado ao trabalho que envolva agentes de risco moderado. Deve-se
seguir as indicações para NB-1 e as normas específicas para NB-1 descritas abaixo:
• além de treinamento específico, deve haver supervisão competente einformação
específica do risco;
• acesso limitado durante procedimentos operacionais;
• procedimentos que podem originar aerossóis infecciosos devem ser efetuados em
contenção (cabines de segurança biológica);
• usar roupas apropriadas (jalecos, gorros, máscaras, etc.);
• a roupa protetora deve ser retirada antes de sair do laboratório e deixada na área de
trabalho;
• laboratório sinalizado com: agente de risco, possibilidades de contato, aviso dos
requisitos necessários para a entrada na área de trabalho, pesquisador responsável e endereço;
• proibida a entrada de animais não correlacionados ao trabalho;
• obrigatório o uso de luvas;
• descontaminação obrigatória do lixo antes do descarte;
• evitar o uso de objetos perfuro/cortantes; nunca separar agulha/seringa, bisturi/suporte;
alocá-los em recipiente apropriado para descontaminação antes
do descarte;
• cuidados especiais obrigatórios para evitar a formação de aerossóis;
• derramamento e acidentes devem ser imediatamente comunicados para manutenção de
registro. Providências adequadas devem ser tomadas (descontaminação, atendimento médico,
vigilância);
• quando apropriado, amostras de soro referência do pessoal de laboratório devem ser
mantidas e amostras adicionais colhidas periodicamente;
• manual de biossegurança específico deve existir e estar disponível;
• equipamentos de contenção devem ser usados (cabines de segurança biológica classe I ou
II) sempre que houver o risco de produção de aerossóis (centrifugação, trituração,
homogeneização, agitação vigorosa, ruptura por sonicação, abertura de recipientes contendo
material sob pressão diferente da ambiental, inoculação intranasal em animais e em cultura de
tecidos infectados);
• normas específicas para a manipulação de volumes grandes (maiores de 10 litros) existem
e devem ser seguidas;
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• autoclave deve estar disponível para a descontaminação no interior ou próximo do
laboratório.
Laboratório NB-3: é aplicável aos locais onde são desenvolvidos trabalhos com agentes
infecciosos classe de risco 3. Seguir as indicações para NB-1 e as normas específicas para
NB-3 descritas abaixo:
O laboratório deverá ter instalações específicas para o trabalho com agentes de NB-3. Para
alguns casos, quando não existirem condições específicas para NB-3, particularmente em
instalações laboratoriais sem área de acesso específica, ambientes selados ou fluxo de ar
unidirecional, as atividades de rotina e operações repetitivas podem ser realizadas em
laboratório com instalações NB-1, acrescidas das práticas recomendadas para NB-3 e o uso de
equipamentos de contenção para NB-3. Cabe ao pesquisador principal a decisão de implantar
essas modificações, comunicando-as a CIBio e CTNBio;
• menores de 18 anos não poderão entrar no laboratório;
• devem ser usadas toalhas absorventes com uma face de plástico voltada para baixo,
recobrindo as superfícies de trabalho;
• roupas de proteção de uso limitado ao laboratório devem ser usadas e descontaminadas
antes de lavadas ou descartadas;
• devem ser usadas máscaras faciais ou respiradores nas salas de manipulação de animais;
• animais de laboratório em NB-3 devem ser mantidos em sistemas de confinamento parcial
(sistemas de caixas com filtros e paredes rígidas ou sistemas de contenção de caixas
equipados com radiação ultravioleta e refletores);
• os sistemas convencioanais de caixas só poderão ser usadas quando todo o pessoal utilizar
dispositivos e roupas protetoras;
• todo o pessoal deve tomar banho ao deixar as áreas de trabalho;
• as linhas de vácuo devem estar protegidas com filtro de ar com elevada eficiência (filtros
HEPA-high efficiency particulated air) e coletores com líquido desinfetante;
• cabines de segurança biológica (classes I, II, III) ou outra combinação apropriada de
dispositivos de proteção pessoal e contenção física devem ser usadas para a manipulação de
culturas e de material clínico ou ambiental, operações de desafio de animais, cultivo de tecido
ou fluidos infectados de animais ou ovos embrionados, necrópsia de animais infectados;
• o laboratório deverá estar separado de áreas de acesso comum. Deve ter sistema de dupla
porta a partir de áreas contíguas;
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• o laboratório com superfícies lisas e resistentes deve ser selado e sem reentrâncias;
• próximo a saída deve existir uma pia com torneira de sistema automático de acionamento
ou pedais;
• as janelas do laboratório devem ser fechadas ou lacradas;
• as portas devem possuir fechamento automático;
• deve existir autoclave para descontaminação de resíduos, localizada no interior do
laboratório ou em áreas contíguas, preferencialmente com sistema de dupla porta;
• o laboratório deve ter um sistema de ar independente, com ventilação unidirecional, onde o
ar penetre pela área de entrada. Não deve existir exaustão do ar para outras áreas do prédio. O
ar exaurido não pode ser circulado e deve ser filtrado por filtro HEPA antes de eliminado ao
exterior do laboratório. Deve haver verificação constante do fluxo de ar no laboratório;
• o ar de saída das cabines de segurança biológica após passar por filtros HEPA deve ser
eliminado para o exterior do edifício por sistema de exaustão;
• o ar de saída das cabines pode recircular no interior do laboratório se a cabine for testada e
certificada anualmente.
Laboratório NB-4: é aplicável aos locais onde são desenvolvidos trabalhos com agentes
infecciosos classe de risco 4. Seguir as indicações para NB-3 e as normas específicas para
NB-4 descritas abaixo:
• nenhum material deverá ser removido do laboratório de contenção máxima, a menos que
tenha sido autoclavado ou descontaminado, exceção para materiais que tenham que sair
viáveis;
• material a serem usados no laboratório devem ser descontaminados em autoclave de dupla
porta, câmara de fumigação, ou sistema de ante-câmara pressurizada;
• material viável a ser removido de cabines classe III ou do laboratório deve ser
acondicionado em recipeinte inquebrável e selado. Este, por sua vez, deve ser colocado dentro
de um segundo recipiente que será desinfetado ou fumigado;
• equipamentos que não resistam a temperaturas elevadas devem ser descontaminados por
gases ou vapor em câmara específica;
• somente os trabalhadores do laboratório podem ter permissão para entrar;
• as portas devem ser hermeticamente fechadas e a entrada deve ser controlada;
• deve-se avisar a todos aqueles que entrarem no laboratório do potencial risco e as medidas
de segurança;
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• deve haver um registro de entrada e saída de pessoal, com data, horário e assinaturas;
• protocolos definidos para situações de emergência devem ser elaborados;
• a entrada e a saída de pessoal do laboratório deve ocorrer após uso de chuveiro e troca de
roupa. A roupa protetora utilizada para o trabalho deve ser descontaminada antes do descarte;
• deve se organizar um sistema de notificação de acidentes e vigilância médica;
• todos os procedimentos laboratoriais devem ocorrer em cabine de segurança classe III, ou
classes I ou II usadas em associação com roupas de proteção pessoal com pressão positiva,
ventiladas por sistema de suporte de vida;
• o laboratório de contenção máxima deve estar localizado em prédio separado;
• as paredes, tetos e pisos do laboratório devem ser construídos com sistema de vedação
interna, para aumentar a eficiência da fumigação e evitar o acesso de animais e insetos;
• as superfícies internas do laboratório devem ser resistentes a líquidos e produtos químicos;
• sistema de drenagem do solo deve conter depósito com desinfetante químico eficaz,
conectado a um sistema coletor de descontaminação. O sistema de esgoto e ventilação deve
estar acoplado a filtros HEPA;
• sistema de luz, dutos de ar e linhas utilitárias devem estar posicionados verticalmente para
evitar acúmulo de poeira;
• os líquidos liberados de chuveiros ou de sanitários devem ser descontaminados
quimicamente ou pelo calor;
• deve haver sistema de ar com pressão diferencial e fluxo direcional para assegurar o
diferencial de pressão não permitindo a saída do agente de risco. Deve estar acoplado ao
sistema manômetros com alarmes.
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Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 nas instalações laboratoriais e no
trabalho com espécimens clínicos; identificação de isolados; processamento de tecidos
animais e no manuseio de dejetos de animais, pois a urina pode conter o fungo. Nível de
biossegurança 3 no trabalho com a fase filamentosa esporulada ou processamento de solo
com suspeita de conter artroconídios.
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. Nicho ecológico: solo e restos orgânicos contaminados com fezes de galinha, morcego e
pássaros.
A histoplasmose pode ser uma micose pulmonar aguda, subaguda, crônica ou sistêmica.
Riscos laboratoriais: manuseio de culturas na fase filamentosa, processamento de solo
contaminado e de material biológico.
Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 no manuseio de espécimens clínicos e
no trabalho com tecidos animais. nível de biossegurança 3 na manipulação de culturas
filamentosas identificadas como H. capsulatum e processamento de solo contendo conídios.
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Riscos laboratoriais: respingos de materiais de culturas nos olhos, arranhão ou injeção de
material infectado na pele ou mordidas de animais infectados experimentalmente,
manipulação de culturas ou necrópsia de animais.
Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 no trabalho com culturas e animais.
Luvas deverão ser usadas.
FUNGOS EM GERAL
Segundo o CDC vários fungos têm causado sérias infecções em hospedeiros
imunocompetentes que inalaram ou se inocularam acidentalmente por via subcutânea de
fontes ambientais. Os agentes são: Cladosporium trichoides, C. bantianum, Penicillium
marneffei, Exophiala dermatitidis e outros. Além destes, existem os Aspergillus fumigatus,
A. flavus e Candida albicans que podem causar sérios problemas em humanos. Atualmente
uma série de fungos estão surgindo como patógenos oportunísticos (Torres-Rodriguez, 1996).
Precauções recomendadas: nível de biossegurança 1 ao se trabalhar com fungos que estejam
esporulando ou ao se inocular animais experimentais.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERGER, & WINN Jr.,
W. C. COLOR ATLAS AND TEXT BOOK OF DIAGNOSTIC MICROBIOLOGY.
5a ED. PHILADELPHIA. LIPPINCOTT, 1997.
94
BIOSSEGURANÇA NO LABORATÓRIO DE MICOLOGIA CLÍNICA
95
HOEFEL, H. H. K. & SCHNEIDER, L. O. O PROFISSIONAL DA SAÚDE NA CADEIA
EPIDEMIOLÓGICA. IN: RODRIGUES, E.A.C., MENDONÇA, J.S.DE, AMARANTE,
J.M.B., FILHO, M.B.A., GRINBAUM, R.S. & RICHTMANN, R. (ORG.) INFECÇÕES
HOSPITALARES PREVENÇÃO E CONTROLE. SÃO PAULO, SARVIER, 1997 P. 351-
366.
96
TEIXEIRA, P. & VALLE, S. BIOSSEGURANÇA - UMA ABORDAGEM
MULTIDISCIPLINAR. EDITORA FIOCRUZ, RJ, 1996.
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ANEXO: MODELO DE LAUDO MICOLÓGICO
Laudo No.:
RESULTADOS
Material
Cultura de Fungos
________________________
Prof. Paulo Murillo Neufeld
Chefe do Laboratório de Micologia Clínica
Faculdade de Farmácia – UFRJ