METODO PARA LA PRODUCCION Y PURIFICACION DE LOS CRISTALES

PROTEICOS INTRACELULARES DE BACILLUS THURINGIENSIS

PRODUCCIN DE LOS CRISTALES.
Los cristales fueron producidos creciendo las bacterias en agar nutritivo en
botellas, con una superficie de 22 por 23 cm. a pH 7 e incubadas por 72 h. a 96 h. a 30
. !e determin" la presencia de esporas # cristales # escasas c$lulas vegetativas, al
te%ir un frotis con cristal violeta &ver ap$ndice' # su posterior observaci"n al
microscopio "ptico.
5. OBTENCIN DE LOS CRISTALES.
(l comple)o de esporas # cristales crecidos en el agar nutritivo, fue cosechado
de acuerdo al m$todo de *elafield # col., en +96,, de la siguiente manera-
(l crecimiento de cada botella fue obtenido con .0 mls. de una soluci"n de
lavado + / &ver ap$ndice'. Los cristales # esporas & la muestra ', fueron lavados 2
veces con la misma soluci"n, una ve0 con soluci"n de lavado 0.+ /. # una ve0 con
1rit"n 23+00, 0.0+4, # finalmente una ve0 con agua destilada est$ril pH 7.
La pasta cremosa de cristales # esporas se mantuvo en un volumen m5nimo de
agua destilada est$ril pH 7 hasta su purificaci"n. (sta muestra no se debe de congelar
#a 6ue esto dificulta la purificaci"n, adem7s, durante los lavados, se centrifug" cada
ve0 a +0,000 rpm8+0 min a 9.
6. PURIFICACIN DE LOS CRISTALES.
Los cristales fueron purificados en un sistema acuoso bif7sico, en base a los
traba)os de !ac:s # ;lderton en +96+< =oodman # col. en +967 # de =uereca # col. en
+999 # adaptado en nuestro laboratorio de la siguiente manera-
++.+, gr. de polietilenglicol 33.0 &>=' # 39.+ ml. de soluci"n de fosfatos +/
&ver ap$ndice' se agregaron en un tubo de centr5fuga de .0 mls., el 6ue se agit"
vigorosamente para solubili0ar el >=.,. *espu$s 6ue se formaron 2 fases, se
me0claron . ml. de la muestra en el tubo # se centrifug" a +000 rpm por 3 min. Los
cristales libres de esporas fueron concentrados en la interfase del sistema # son
cosechados cuidadosamente con una pipeta >asteur. !e ti%eron con cristal violeta # se
observ" al microscopio "ptico .!i persiste la presencia de espora, el proceso se repite
una ve0 mas o las 6ue sean necesarios hasta no observar esporas contaminantes. Los
cristales son lavados 2 veces con agua destilada pH 7 est$ril, centrifugando a +0,000
rpm por +0 min. ?pcionalmente se hi0o una observaci"n de los cristales al microscopio
electr"nico de barrido para confirmar su pure0a. @inalmente los cristales fueron
concentrados en un volumen m5nimo de agua destilada est$ril, liofili0ados #
congelados a 3 20 hasta su uso.
II. Purificacin de los Cristales
+. !oluci"n de @osfatos 3/
A2H>?9 +.76 moles
AH2>?9 +.29 moles
Bota- ; partir de esta soluci"n 3 /. se prepara por diluci"n la soluci"n
+/.
2. >ol#etilenglicol 33.0 &!igma hem. o. >3690'
!e toman ++.+, g del polvo,
!e agregan en un tubo de centrifuga de .0 ml.
se adicionan al tubo 39.+ ml de soluci"n de @osfatos +/