Mara Jos Salas L.

Mc Asesora comercial Biociencia

Qu son las membranas?

Membrana es

una barrera fina que pueden separar componentes de fluidos

Para qu filtramos?
Separar partculas de fluidos o soluciones Recolectar y/o concentrar una muestra para anlisis. Clarificar un fluido (lquido o gas) Esterilizar Proteger de partculas o lquidos la instrumentacin crtica

Que significa filtrar?

RETENCION (separacin) DE PARTICULAS PRESENTES EN UN FLUIDO (lquido o gas) A TRAVES DE UN MATERIAL POROSO, FIBROSO O GRANULAR (permeable).

Filtracin Microporosa
Flujo

0.45 micras 0.45 micras

Unidades de medida
Un Micrmetro es una millonsima parte de un metro. O una milsima de milmetro.

Tambin denominada como Micra.

1mm = 0,39 diez milsima de una pulgada.

El mnimo visible del ojo humano es alrededor de 40 mm.

Cabello Humano de 60-80 mm Clulas rojas de la sangre 10-30 mm

TAMAOS TIPICOS
14 mm 5 mm 3 mm 1.2 mm 0.45 mm 0.22 mm

Partculas visibles al ojo humano >50 mm

Clulas de levaduras de 5-10 micrones

Humo de Cigarrillo

La bacteria ms pequea

0.1 mm

Virus

0.025 mm

ultrafiltracin

Tamaos moleculares

Tamao de Poro

Profundidad Superficie Absolutos

Retencin

Clasificacin de los filtros

Composicin Qumica.

Hidrofbicos Naturaleza Hidroflicos

Segn su naturaleza
HIDROFOBICOS No son afines con el agua Se humedecen con lquidos de baja tensin superficial Amplia compatibilidad con solventes orgnicos Se utilizan tambin como filtros de venteo Gran variedad de materiales Trabajan a bajas presiones

Segn su naturaleza
HIDROFILICOS Se humedece con soluciones acuosas Es compatible con soluciones acuosas La compatibilidad con solventes orgnicos es limitada dependiendo del material Gran variedad de materiales Trabajan a altas presiones

Tamao de Poro

Profundidad Superficie Absolutos

Retencin

Clasificacin de los filtros

Composicin Qumica.

Hidrofbicos Naturaleza Hidroflicos

Segn su Retencin
Filtros de Profundidad
Fibras entrelazadas Tamao de poro nominal Son gruesos por lo que pueden ser adsorbentes Alta capacidad de retencin Baja eficiencia < 95% Trabajan a bajas presiones Son econmicos (fibra de vidrio, polipropileno etc.)

Segn su Retencin
Filtros de Superficie
Su estructura ms compacta Mayor eficiencia 99.9% Tamao de poro nominal Son ms delgados que los de profundidad (ligeramente adsorbentes) Retienen las partculas en la superficie y en la matriz Polipropileno, celulosa

Segn su Retencin
Filtros Absolutos o de Membrana
Tienen estructura geomtrica producida por moldeo Su retencin es en la superficie Son delgados por lo que no adsorben el producto Su eficiencia es del 99,9999999% Hidroflicos o Hidrofbicos Celulosa, PVDF, Nylon, PES

http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/

Bacteria Tipo Coco, Staphylococcus sp

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Bacillus megabacterium (Bacteria con forma de bastn largo)

http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/

Bacteria Tipo Bacilo, E. coli (division)

Remocin relativa por tamao y eficiencia

Filtros de profundidad, superficie y absoluto.
Micrn
100 m 1 m Sub micrn 0.05 m

Filtros de profundidad
<95% eficiencia de retencin Filtros de superficie >95% eficiencia de retencin Filtros Absoluto. 99.9999999% eficiencia de retencin

Segn tamao de poro

TAMAO DE PORO

Partculas a retener

Poro nominal /profundidad

Absolutos

Clarificacin

Microfiltracin

Ultrafiltracin

Partculas mayores a su tamao de poro

100 % retencin de todas las partculas mayores a su tamao de poro.

Mayores a 10 micras

0.025 a 10 micras

0.001 a 0.100 micras

SEGN COMPOSICION QUIMICA

Acrlico CA (Acetato de celulosa) NC (Nitrocelulosa) MCE (Mezcla de esteres de celulosa) Nylon Polietersulfona Policarbonato Polipropileno PTFE (Tefln (Polytetrafluoroethylene) PVC (Polivinil clorido) PVDF (Fluoruro de polivinilideno))

Factores a tener en cuenta para la eleccin de una unidad de filtracin

Compatibilidad Qumica Tipo de Muestra. Volumen a filtrar o tamao de la muestra Aplicacin. Extractables Nivel de contaminacin. Si se necesita una filtracin fina o filtracin esterilizante.

COMPATIBILIDAD QUIMICA Y TIPO DE MUESTRA

Solucin Acuosa Acuosa con protenas Acosa ligeramente orgnica Orgnica

Membrana Mezcla de esteres de Celulosa Durapore (PVDF) Durapore (PVDF),PTFE, Nylon PTFE Hidrfobo e Hidroflicos

Jerarqua de Seleccin

Compatibilidad = MATERIAL Retencin = TAMAO DE PORO Flujo (Volumen) = POROSIDAD, TIPO Capacidad = AREA SUPERFICIAL

Introduccin
Introducida hacia finales de los 1950s como alternativa al procedimiento de NMP para el anlisis microbiolgico de agua. Aceptada por la US EPA para el anlisis de agua potable en la edicin 11 del Standard Methods for Examination of Water and Wasterwater. Hacia 1978 en la publicacin Mtodos Microbiolgicos para el monitoreo Ambiental, la EPA declar que la tcnica de Filtracin por Membrana (MF) es la preferida para el examen del agua pues permite el anlisis de un gran nmero de muestras en menos tiempo.

Indicadores Biolgicos

E. coli

Indicadores Biolgicos ideales

Fciles de aislar, cultivar e identificar en el laboratorio.

Su presencia debe estar relacionada cualitativa y cuantitativamente con la de otros microorganismos patgenos y/o de aislamiento ms difcil La densidad microbiolgica esta directamente relacionada con el grado de contaminacin Mejor sobrevivencia que la de los patgenos. Manipulacin segura.

Tipos de anlisis

CUANTITATIVOS:

SIEMBRA EN PLACA, CAMARA AL MICROSCOPIO, FILTRACIN POR MEMBRANA, INMUNOLGICAS, GENTICAS O SU COMBINACIN, AUTOMATIZADAS (BIOQUMICA, IMPEDANCIA, ELECTROQUMICA).

Metodologas NO APROBADAS
A partir del 1 de enero del 2001

NMP

RECUENTO EN PLACA

TIPOS DE ANLISIS
CUANTITATIVOS: Algunos facilitan la posterior identificacin de gnero y especie por el aislamiento de los microorganismos Facilitan el seguimiento y elaboracin de estadsticas para realizacin de planes de accin y estandarizacin de procedimientos

Filtracin por membrana

Metodologa sencilla, fcil de trabajar

Muestras pequeas y grandes volmenes Tiempo de incubacin relativamente corto Tambin puede indicar presencia ausencia Ofrece el aislamiento de colonias y su conteo. Verstil para laboratorios con baja frecuencia de muestras as como aquellos con altas frecuencias

Ventajas y Limitaciones

VENTAJAS

Desventajas

Filtrar Muestras completas Lavar cualquier sustancia inhibidora Sensitividad para 1 CFU Estadsticamente mas vlido Cuadrcula en la superficie hace el conteo ms fcil

Slidos grandes pueden taponar la membrana. (realizar diluciones o prefiltrar) Algunas soluciones no pueden ser filtradas (emulsiones con incremento de temperatura)

Principios bsicos
Seleccin del equipo y Material adecuado
Preparacin del Material Toma y Conservacin de las Muestras

Esterilizacin del Material

Seleccin del Volumen a Filtrar Placas, Filtracin, Incubacin y Examen

Interpretacin de Resultados
Identificacin de Problemas

1.Seleccin del material y equipo adecuado

Material de Toma de Muestras:

Vidrio
Plstico (No txicos y Resistentes al calor)

Bolsas
Toma Muestras: vlvulas sanitarias

Portafiltros desechables y reutilizables

BOMBAS DE VACIO, INCUBADORAS, MEMBRANAS

MEMBRANAS
Distribucin homognea de poros 0.45 mm ( bacterias) / 0.8 mm (Hongos y/o levaduras) Buena Humectabilidad Cuadricula con tinta no txica Estable durante la esterilizacin Retencin de microorganismos en la superficie Sin interferencias qumicas que puedan alterar el crecimiento bacteriano Esters de celulosa

Medios de Cultivo

Medios Lquidos
Mayor Permeabilidad de Nutrientes

Cajas Petri, Pads y Otros Materiales

Cajas petri desechables son ideales. Tambin hay de vidrio. Pads Pipetas, pinzas, recipientes, mecheros, lupa.

2. PREPARACION DEL MATERIAL Y REA Material de Toma de Muestras:

Limpio y estril Adicionado o no con Tiosulfato (10%) antes de auto clavar. No apretar tapones. Envuelto en papel kraft, autoclavar durante 20 min. 121C, 15lb. Calor hmedo. Calor seco. Horno 1h 180C.

Continuacin...Preparacin del Material y del rea

rea:
Protocolo de desinfeccin Orden y funcional Material, muestras, medios, desecho (identificado).

Cabina de Flujo laminar

Escogidas de acuerdo con el tipo de anlisis a realizar y clase de microorganismos que se puedan encontrar.

3. TOMA Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS Primer paso crtico

Protocolo normalizado de trabajo

Dnde, cmo y frecuencia. Archivo documental: punto de toma, fecha, tamao de la muestra, recuento. Permitir conocer los niveles de contaminacin, su evolucin en el tiempo y controlar la eficiencia de los mtodos de descontaminacin usados.

Continuacin...Toma y Conservacin de las Muestras

Debe ser representativo del momento en que se recolect y de todo el producto que se quiera controlar. Mantener condiciones aspticas. No contaminar boca del frasco. Dejar un espacio vacio de 2-3 cm para facilitar la agitacin de la muestra.

Ideal vlvulas sanitarias (ss, facil instalacin, sanitizacin, circulacin interior, no punto muerto).
Grifos: dejar correr.

No recolecte muestras de una fuga anterior al punto de muestreo (arrastra contaminacin exterior).

= Marcar bien = Analizar de Inmediato. = Max. 1h. =Conservar 4C-10C = Antes de 6h.

4. ESTERILIZACION DEL MATERIAL

SOLUCIONES BUFFER, AGUA PURIFICADA,

STERIVEX

5. SELECCIN DE VOLUMEN A FILTRAR

Normatividad existente para el tipo de muestra. Volumen total de la fuente o lote. Agua envasada 250 ml. Superficiales y sin tratar menores volmenes (muestras diluidas) Generalmente en agua 100ml Muestras entre 30ml y 250ml directo al embudo Mas de 200ufc por membrana, Datos errneos. Mal conteo: hacinamiento Mezcla de colonias: interferencia color Menos de 10 20 ufc baja fiabilidad

OTROS VOLUMENES DE MUESTRA ORIENTATIVOS

Tipos de agua
Manantiales Lagos, depsitos De playas De rios Residuales sin tratar

Coliformes totales
15,60,100ml 4,15,60,100ml 0,08; 0,15; 0,5; 1,4ml 0,003; 0,01: 0,02; 0,08ml 0,0001; 0,0003, 0,001; 0,003; 0,01ml

Coliformes fecales
30, 100ml 10, 30, 100ml 0,1; 0,3; 1,3; 10ml 0,1; 0,03; 0,3; 1ml 0,1; 0,03; 0,3; 1ml 0,0003; 0,001, 0,003; 0,01; 0,03ml

Residuales cloradas 0,003;0,01; 0,02; 0,08ml

6. PLACAS,FILTRACION,INCUBACION Y EXAMEN

Placas: Flamear las pinzas en la manipulacin de pads. Marcar las cajas adecuadamente. Medio: Distribuirlo en toda la superficie del pad.

Continuacin..placas, filtracin, incubacin y examen.

Filtracin:
Verificar el montaje adecuado. Recipiente de seguridad adicional. Portafiltros estril y frio. Pinzas sumergidas en alcohol y flamearlas antes de manipular la membrana. Agitar la muestra en su propio recipiente, aadir el volumen con precisin al Portafiltros. Menos de 100ml agitar suavemente el Portafiltros. Cierre vlvulas, desconecte vaco, retire embudo, membrana cuadricula arriba sin bolsas de aire.

Continuacin..placas, filtracin, incubacin y examen.

Incubacin: Invertidas para evitar que el condensado caiga sobre la superficie de la membrana.

Lleve a la temperatura y tiempo adecuado.

Examen: Solo cuente las colonias con aspecto caracterstico de acuerdo con el medio y cada tipo de microorganismo. Utilice lupa para una mejor apreciacin de la morfologa. Esterilice desinfecte los portafiltros antes de colocar una nueva membrana y filtrar la siguiente muestra. Al filtrar diluciones filtre las muestras por orden de la mas diluida a la mas concentrada aplicando un lavado con solucin tampn al portafiltro entre muestra y muestra.

7. INTERPRETACON DE RESULTADOS

Los tiempos y temperaturas (composicin de los medios) son diferentes, cada fabricante establece los ptimos de crecimiento para sus medios.

Coliforms
Medio de cultivo Selectivo y Diferencial
Lactosa: Los coliformes la fermentan formando el complejo cido/aldehdo Peptonas: Nutrientes formadores Fosfato de Potasio: Equilibrio osmtico

Non-coliforms

Sulfito de sodio y Fuchina bsica: Inhiben Gram positivas

Coliformes: Color Rojo con brillo color verde

Selectivo y Diferencial Lactosa: Coliformes fermentan la lactosa Peptonas/Extracto de levadura: Nutrientes Cloruro de Sodio: Equilibrio Osmtico Sales Biliares: Inhiben Gram (+) Acido Rosalico: Inhibe Bacteria no Coliformes 44.5 C: Temperatura Selectiva Anilina Azul: Indicador cido

Coliformes Fecales

Los coliformes fecales son de color azul, otras colonias presentan un color de gris a crema

IDENTIFICACIN DE E.COLI Y CF EN 24 HRS CON UN SOLO PASO DE T 35c

E. Coli forma colonias azul y para recuentos de Coliformes totales hay que sumar las colonias azules mas las rojas

E. coli.

M-ColiBlue contiene un indicador enzimtico selectivo para E.Coli y por ello no requiere de confirmacin El medio contiene inhibidores que minimizan el crecimiento de bacterias no Coliformes

Coliforme Total

T o t a l B a c t e r i a

Las levaduras forman colonias grandes opacas de color verde. Las colonias de mohos son verdes y filamentosas Temperatura de incubacin, C: 2832 Tiempo de incubacin, horas: 4872

Conteo Completo

Otros microorganismos de inters sanitario

Microorganismo
Grupo Enterococo (Enterococo intestinal y fecales) (ISO 7899-2:2000)

Aplicacin
Aguas potables, Aguas de piscinas, en todo tipo de aguas, excepto aquellos con interferencias y materia en suspencin Agua mineral natural, , aguas envasadas Aguas envasadas,

Medio de Cultivo
Slanetz-Bartley y agar biliar-esculina-azida. Fecales: agar KF

Grupo Pseudomona (EN 12780-2002) Salmonella Y Shigella(standard Methods) Staphylococcus aureus

Pseudomona sp, medio que contiene cetrimide. Agar Rambach

aguas de piscina

Taphylococcus(Piruvato y glicina)

8. Identificacin de Problemas

Se citan los problemas ms tpicos que suelen encontrar los usuarios. Se toma principalmente un ejemplo ilustrativo del recuento de coliformes totales sobre el medio endo.

No hay Crecimiento

PROBLEMA
Alto pH de la muestra Presencia de Inhibidores Almacenamiento del medio Manipulacin de la muestra Volumen de medio insuficiente Temperatura de incubacin incorrecta Tiempo de incubacin insuficiente Evaporacin del medio durante la incubacin

SOLUCION Determinar previamente el pH Lavado de la membrana Refrigeracin Control de Calidad GPM Verificar el volumen 1.8-2 ml Verificar y calibrar los equipos

Demasiadas colonias con aspecto de coliformes (incontables)

Incontable (mala dilucin de la muestra)

Improper Distribution of Sample

Improper Rinsing

Zona seca sin crecimiento

Distortion of colonies due to particles

Hair Particle