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Botucatu
2003
Andrey Borges Teixeira
Introdução:
A eletroforese em géis de agarose ou poliacrilamida pode ser usada
para separar, identificar e purificar fragmentos de DNA. A técnica é simples,
rápida e capaz de determinar fragmentos de DNA que não podem ser
separados adequadamente por outros processos, como pela centrifugação
através de um gradiente de concentração. Além disso a localização do DNA no
gel pode ser determinada diretamente pela coloração através de fluoróforos
como por exemplo o Brometo de Etidium. Bandas que contenham ao menos
20pg de fita dupla de DNA podem ser diretamente detectadas em gel sob
exposição de luz ultravioleta (UV).
O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resolução e é mais
efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base).
Além disso, fragmentos de DNA num mesmo gel que diferem por apenas 1 bp
em comprimento ou por 0,1% de suas massas, podem ser separados neste
gel. Esse gel também pode acomodar maiores quantidades de DNA sem perda
de resolução, até 10µg, comparado ao de agarose que pode acomodar bandas
que contenham até aproximadamente 10ng de DNA com boa resolução.
Também é muito utilizado para recuperação e purificação de DNA. Contudo o
gel de poliacrilamida comparado com o de agarose, é mais difícil de ser
preparado e muito tóxico quando em pó ou em solução. Sua corrida se faz
numa cuba vertical mediante campo elétrico constante.
O gel de agarose tem menor capacidade de resolução, porém apresenta
maior extensão de separação. Longos fragmentos de DNA (50-20.000 bp)
podem ser separados em gel de agarose com diferentes concentrações. O
tamanho dos poros do gel de agarose é diretamente proporcional ao tamanho
do fragmento que se deseja separar. O tamanho do poro, ou a porosidade do
gel de agarose, é definido pela concentração do gel: quanto menor for a
concentração do gel maior será a porosidade e portanto maior o fragmento de
DNA que poderá ser separado. Contudo, quanto menor a concentração do gel,
mais frágil ele se torna. Geralmente se trabalha com géis de agarose de 1 a
1,5%, dependendo do fragmento de DNA esperado.
Andrey Borges Teixeira
A - GEL DE AGAROSE
B - GEL DE POLIACRILAMIDA
C – SOLUÇÕES E REAGENTES
4 - PREPARO
4.1. TBE 10 X e 1 X
4.1.1. TBE 10x:
Componente Quantidade Concentração
Tris base 121,1g 1M
Ácido Bórico Anidro 55,6g 0,9M
Na2EDTA 2H2O 3,7g 10mM
H2O deionizada ou Milli-Q 1 litro pH = 8,3 a 25oC
4.2.2. Poliacrilamida:
- 30% (p/v) glicerol (H2O DEPC)
- 0,25% (p/v) azul de bromofenol
- 0,25% (w/v) xileno cianol FF(xylene cyanol FF)
- em um Becker colocar 3 mL de glicerol + 7 mL de água DEPC
- acrescentar 25mg de azul de bromofenol + 25mg de xileno cianol FF
homogeneizar novamente e aliquotar (1 mL) em 10 microtubos (1,5 mL).
- armazenar a temperatura de 4oC.
Andrey Borges Teixeira
5. Coloração do gel:
5.1. Brometo de etidium (BE):
- BE estoque - 10mg/ml
- 1 pastilha de BE contém 100mg, portanto, diluir 1 pastilha em 10 ml de
H2O Milli-Q.
5.1.1. Corando o gel antes da corrida (agarose):
− BE no gel - 0,5 µg de BE por mL de gel
5.1.2. Corando o gel depois da corrida (agarose e poliacrilamida):
− fazer o gel sem BE
− preparar solução corante de BE/TBE 1X (1µl de BE estoque / 10ml
TBE 1X)
− manter essa solução no tupeware por no máximo 3 dias (o BE
acaba perdendo sua ação pela ação da luz solar)
− preparar solução suficiente para cobrir o gel e colocá-la no
tupeware
− após a corrida colocar o gel imerso na solução corante por 30
minutos (gel de agarose) ou 15 minutos (gel de poliacrilamida)
− após aguardar o tempo necessário para cada gel, este estará pronto
para fotodocumentação ou captura de imagem do gel.
Andrey Borges Teixeira
7. Referência Bibliográfica: