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Tipos de PCR
Eduardo Paulino Castan
Tipos de PCR
Tipos de PCR
•PCR-RFLP •Competitive
• RAPD • Multiplex
• AFLP • Long
• PCR-colony • Touchdown
• In situ • RT-PCR *
• Nested
Tipos de PCR
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Tipos de PCR
Normal Mutante
Tipos de PCR
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• Variabilidade genética
• Identificação de espécies
R. lalandii R. porosus
Rhizoprionodon lalandii
Digestão SspI
Rhizoprionodon porosus
Tipos de PCR
• Mapeamento genômico
• Análise de doenças
ç g genéticas
Fator V Leiden humano
Raias 2 e 3: pacientes que não apresentaram a mutação analisada; raias 4 e 6: pacientes com a
mutação Fator V Leiden em heterozigose; raia 5: paciente com a mutação Fator V Leiden em
homozigose.
Tipos de PCR
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DNA Genômico Primers randômicos
Tipos de PCR
Tipos de PCR
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Brycon cephalus (matrinchã da Amazônia)
Tipos de PCR
(a) Preparação de AFLP
Enzimas de
restrição (EcoR1
e Mse1) e DNA
ligase
DNA genômico Adaptadores
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(b) Restrição e ligação
Tipos de PCR
(c) Amplificação seletiva com um nucleotídeo
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(c) Amplificação seletiva com três nucleotídeo
Tipos de PCR
Alburnus alburnus
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PCR Colony
Tipos de PCR
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• Técnicas manuais
Tipos de PCR
In Situ PCR
• PCR que ocorre dentro da célula em uma lâmina. Pode ser realizada em células
ou tecidos fixados
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PCR Inversa
• Limitação da PCR convencional: as regiões 5' e 3' que flanqueiam seu fragmento
de DNA de interesse devem ser conhecidas
• Inverse PCR permite a PCR quando você possui informação de apenas uma
seqüência interna
EcoR1 Digestão enzimática EcoR1
DNA ligase
Tipos de PCR
PCR Inversa
Região codificadora do gene da MyoD
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Long PCR
• PCR cuja extensão é mais longa que as PCR convencionais (acima de 5 Kb);
Tipos de PCR
PCR Multiplex
• PCR com dois ou mais conjuntos de primers para amplificar diferentes fragmentos
de uma mesma amostra
• Um tubo
• Um template
• Dois pares de primers
• Dois fragmentos amplificados
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Nested PCR
• Variação da PCR
convencional, na qual são
utilizados dois pares de
primers (ao invés de um),
para amplificar um mesmo
fragmento
Tipos de PCR
Competitive PCR
• Usada para quantificação
• Densitometria de imagem
• Adiciona-se à reação, uma quantidade conhecida de um fragmento de DNA
(competidor). Esse competidor deve conter sequências para os mesmos primers
utilizados para amplificar o alvo
Quantidade de DNA alvo pode ser determinada pela razão Alvo (T) /competidor (C)
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Touchdown PCR
• Modificação da PCR convencional, que pode resultar na diminuição de amplificações não-específicas
• Temperatura de anelamento:
• Após atingir temperatura específica (touchdown), ela é mantida nos ciclos restantes
‐ 95° 30 s
‐ 95
95° 30 s, 60
30 s, 60° 30 s, 72
30 s, 72° 1min (3 ciclos)
1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 56° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 53° 30 s, 72° 1min (3 ciclos)
‐ 95° 30 s, 50° 30 s, 72° 1min (25 ciclos)
‐ 72° 5 min
‐ 4° infinito
Tipos de PCR
Degenerate PCR
Exemplos: A+C+G V
A+C+G+T N
5’-TCG AAT TCV CCY AAY TGR CCN T-3’ A+T+G D
T+C+G B
5’-TCB AAT TCG CHC AAA TKA CCG T-3’ A+T+C H
A+T W
C+G S
T+G K
A+C M
C+T Y
A+G R
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Degenerate PCR
Aplicações:
Tipos de PCR
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