Determinacion Coliformes Totales y Fecales Metodo Recuento Dilucion Tubo NMP

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Determinacin de bacterias, Coliformes Totales y Fecales, Mtodo de recuento por dilucin en tubo: NMP
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Introduccin Materiales Procedimiento Resultados Conclusiones Preguntas Referencias PRCTICA N 05
Introduccin
Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP). El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores de enfermedades. I. Objetivos: - Familiarizarse con los mtodos de recuento, especialmente con el de NMP. - Detectar bacterias coliformes totales y fecales. - Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano.
Materiales
Muestra: Leche Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey, agar Endo, EMB, CB. Caldo EC Tubos de dilucin Pipetas Bombilla de aspiracin Placas de Petri Mechero Bunsen Bao Mara Estufa Gradillas
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Anzas microbiolgicas calibradas
Procedimiento
a. Mtodo para coliformes totales: Preparamos diluciones hasta 10-3. Sembramos dos, tres o cinco tubos por cada dilucin, segn sea el caso.
Diluciones
3 mL de muestra + 27 mL agua pept.
9 mL AP
9 mL AP
Mtodo para alimentos Lquidos
10-1
1 mL
10-2
1 mL
10-3
1 mL
Caldo Brila
Los resultados se dan en por gr o mL En el caso de agua se sigue de la otra forma: Muestra de agua total 10 mL 1 mL
Aqu no se realizan diluciones
1 mL
10-1
Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL.
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Luego, incubar a 35 C 1 por 24 h. Realizar la 1ra lectura (determinar la presencia de gas). sta se observa en las campanas. Los tubos que no sean positivos se incuban por otras 24 h ms. b. Mtodos para coliformes fecales: Para coliformes fecales se utilizan dos mtodos: En el Primer Mtodo se cogen los tubos positivos del caldo Lauril Sulfato Triptosa y se lleva una asada al caldo EC utilizando una asa que tenga 3 mm de dimetro. Luego, estos tubos se incuban a 45.5 C 0.2, en bao Mara con agitacin constante por 24 h. Si hay gas a las 24 o 48 h. es positivo para coliformes fecales. El Segundo Mtodo es la llamada prueba de Mackenzie. En esta se usa el caldo Brila mas agua Peptonada. Se parte del caldo MacConkey, los tubos positivos de la prueba de coliformes totales se siembran en este caldo, si aqu vuelve a salir positivo se le realizan las dos pruebas sgtes:
Tubo Positivo Caldo MK
Caldo Brila
Caldo Peptonado
10 mL
10 mL
Slo se tomar esta prueba como positiva si los dos tubos (caldo Brilla y caldo Peptonado) resultan positivos. Al tubo con caldo peptonado se le agrega el reactivo de Kovacs para hacer la prueba de Indol. Para ver coliformes termorresistentes, de los tubos que hayan salido positivos se siembra una asada en agar MacConkey y se aslan las colonias caractersticas. De los tubos positivos se los siembra en otros tubos en caldo EC con campana de Durham.
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Resultados
De los tubos sembrados en el caldo Brilla (prueba presuntiva), se obtuvo los sgtes. resultados (a las 24 horas) para coliformes totales:
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Para realizar la prueba confirmativa se sembr en agar MacConkey, luego de la incubacin por 24 horas, se obtuvo los sgtes. resultados:
Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms probable es: 2 22. Para este resultado las tabla de NMP con un lmite de confianza de 95% para la prueba de fermentacin utilizando 3 diluciones con dos repeticiones (2 tubos), nos da un valor de >1100 bacterias/mL de leche.
Conclusiones
Los valores mnimos permisibles usados en Mxico, por ejemplo, nos dan los sgtes. valores de referencia para diversos alimentos: Especificaciones microbiolgicas establecidas para diversos alimentos.
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*NOM-093-SSA1-1994 ; ** NOM-121-SSA1-1994; *** Lmites microbiolgicos de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods). La muestra trada por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que La Norma Venezolana para Lcteos da como valores lmites los sgtes. valores:
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Vemos que el lmite dado para Coliformes Totales en leche cruda est dada en UFC/ml, entonces, comparando nuestra muestra de leche, trada de un puesto lechero del sector Santa Rosa Chiclayo con las muestras dadas en el cuadro, la podemos calificar como una leche DE TERCERA.
RESUL T ADO S CO L IF O RME S F EC AL ES Para la prueba de coliformes fecales se utiliz como mtodo la prueba de Mackenzie, aunque, al no tener todos los medios necesarios, se hicieron algunas modificaciones. - De los tubos positivos del Caldo Brilla si inocul, de cada uno, a tubos con Caldo E-C. - Luego se incub los tubos a 44 C 0.1 por 24 h. - Pasado el tiempo se ley los resultados. - De los tubos positivos se pas a placas con agar MacConkey, estas se incubaron por 24 h a 37 C (se debi pasar a dos tubos uno con caldo peptona y otro con caldo Brilla). - Pasado el tiempo, se leen las placas y se realizan las pruebas bioqumicas para las colonias lactosa positivas (L+). RESULTADOS: - Como todos los tubos del caldo Brilla salieron positivos, se sembraron en tubos con caldo EC (seis tubos). - Despus de la incubacin de los tubos con caldo EC se obtuvieron los sgtes. resultados: -
De los tubos positivos se sembr en agar MacConkey, de ellas todas salieron lactosa positivas:
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De las colonias lactosa positivas se escogi una y se le realiz las sgtes. pruebas bioqumicas: IMViC + descarboxilacin de la lisina (LIA) + prueba de fermentacin de carbohidratos (TSI). Se obtuvieron los sgtes. resultados:
De los resultados obtenidos se puedo identificar a Klebsiella azaenae. Entonces, como Klebsiella pertenece al grupo de las coliformes fecales, podemos decir que la muestra tratada (leche cruda) tenia presencia de estas en un nmero de (resultado NMP 2-2-0): NMP de coliformes fecales = 210 bacterias/ mL.
Algunas sp. del gnero Klebsiella junto con otras de los gneros Citrobacter y Enterobarter se cree que son las causantes de enfermedades gastrointestinales agudas y crnicas. Estos microorganismos pueden ser recolectados de ambientes naturales tales como los bosques, el agua fresca as como tambin de los productos provenientes de la agricultura (vegetales) donde residen normalmente como microflora. Tambin pueden ser recolectados de las heces de individuos saludables que no presentan sntomas de la enfermedad. Tambin pueden ser recolectadas a partir de los productos lcteos, los mariscos crudos y los vegetales frescos y crudos. Estos organismos al contaminar las aguas pueden estar presentes en el suelo usado para la produccin de cultivos y en las aguas de pesca de mariscos; como resultado stos pueden constituir un peligro para la salud.
Preguntas
Cules son los diferentes mtodos para coliformes totales? o Para el conteo de coliformes totales se tienen tres mtodos principalmente. o El primero se basa en la tcnica del nmero ms probable (NMP), utilizando caldo Lauril Sulfato Triptosa seguido de la confirmacin de los tubos positivos de formacin de gas en caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. La incubacin es a 35 C. o El segundo mtodo emplea nicamente el caldo McConkey. La incubacin es a 37 C.
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El tercer mtodo usa el caldo Lactosa Bilis Verde Brillante a 35 37 C, seguido de confirmacin en agar Bilis Rojo-Violeta o en agar Endo. Qu caractersticas tienen las colonias de coliformes en agar Endo y en agar Eosina Azul de Metileno? o El medio Eosina Azul de Metileno (EMB) es un medio de plaqueo diferencial que puede usarse en lugar del agar MacConkey en el aislamiento y deteccin de Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras con bacterias mixtas. Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias Gram positivas y a las Gram negativas exigentes. Se combinan para formar un precipitado a pH cido y, de este modo, sirven tambin como indicadores de la produccin de cido. Las colonias lactosa (+) dan colonias de color violeta, las de E. coli presentan un caracterstico brillo verde metlico, las de Enterobacter presentan un color violeta sin brillo metlico (ojo de buey). Las colonias de Klebsiella son siempre mucosas, grande y ligeramente rosadas. o El medio Endo es un medio selectivo para demostracin de E. coli fecal y coliformes en los ms diversos materiales. El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias Gram (+). E. coli y coliformes utilizan lactosa con formacin de aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera fucsina a partir de la combinacin: fucsina sulfito, lo que da lugar a la coloracin roja de las colonias. En este medio las colonias lactosa (+) presentan una coloracin roja, p.ej. E. coli es de color rojo con brillo metlico estable. Enterobacter aerogenes y otros presentan colonias rojas hasta rojizas, semiesfricas y mucosas. o
Referencias
ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA (2005) Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ubu.es/investig/aulavirtual/trabajos_05/Analisis_microbiologico_del_agua.pdf ANALISIS MICROBIOLOGICOS (2004) Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS (1989). Medios de Cultivo en Microbiologa: Manual de Laboratorio. Editora Tricelm S.A. 3 Edic. Lima. FUENTES, A. F. y otros (2005). Calidad Sanitaria de Alimentos Disponibles al Pblico de la Ciudad de Sonora, Mxico. Revista Salud Pblica y Nutricin. Vol. 6 N 3. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.respyn.uanl.mx/index.html L. ORTIZ, M. (2003) Material didctico de Microbiologa de Alimentos: Recuento de enterobacterias. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de_microlimentos.htm MICROBIOLOGIA APLICADA: Manual de Laboratorio (2006) Coliformes totales y Fecales en agua de consumo humano. Obtenido el 07 de febrero de 2008 en http://www.ine.gob.mx/publicaciones/libros/509/analisis2.pdf THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis Microbiolgico de los Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza. VARGAS, T. (2005) Calidad de la Leche: Visin de la Industria Lctea. Obtenido el 01 de febrero de 2008 en http://www.avpa.ula.ve/docuPDFs/xcongreso/P297_CalidadLeche.pdf TABLA NMERO MS PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOS Nmero de tubos positivos con ndice NMP el inculo indicado 0 0 0 <3,0 0 0 1 7 0 1 0 11 0 1 1 14 0 2 0 16 1 0 0 9 1 0 1 14 1 0 2 20 1 1 0 21 1 1 1 35 1 2 0 29
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1 2 2 2 2 2 2 2 2 2
2 1 36 0 0 23 0 1 38 0 2 75 1 0 43 1 1 150 1 2 240 2 0 210 2 1 470 2 2 >1100 Adaptado de Ortiz, 2003 y Fuentes, 2005.
Autor: Rmulo Aycachi Inga ASIGNATURA : Microbiologa de los Alimentos I DOCENTE :Dra. Graciela Albino Cornejo CICLO :2007 - II Enviado por: Mireya
mireeya_sy@hotmail.com
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PR CT ICA N 0 5 L a m b a ye qu e , 1 4 d e f eb r e ro d e 20 0 8 .
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Cuando se trate de aguas, los resultados se darn por 100 mL.

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