EXTRACCION DE ADN CON ALTAS CONCENTRACIONES DE SALES Y ELECTROFORESIS LINA CHAMORRO ANAYA1, VIVIANA MEJIA ACOSTA1, JUAN MEDINA

PAYARES1.
1

ESTUDIANTES DE BIOLOGIA. UNIVERSIDAD DE SUCRE, DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA, FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS. DOCENTE: YOSED ANAYA

RESUMEN Se realiz una extraccin de ADN utilizando el mtodo de salting out como se indica en el procedimiento, el cual consiste en agregar a la muestra procesada altas concentraciones de sales con el fin de separar las protenas del ADN. De este procedimiento se obtuvieron unas muestras en tubos eppendorf que contenan el ADN extrado. Ms tarde, mediante la elaboracin de un gel de agarosa y el respectivo corrido electrofortico como se indica en el procedimiento, se obtuvieron cuatro bandas (figura 2) correspondientes a cada muestra, las cuales eran muy similares y presentaban la misma distancia de migracin. De esta manera confirmamos la presencia de ADN de ratn en las muestras procesadas. Palabras clave: salting out, electroforesis, agarosa, extraccin de ADN.

1. INTRODUCCION La extraccin de del otros ADN implica

remocin de protenas y finalmente se precipita el ADN

[1].

Existen varios

mtodos de extraccin de ADN, como por ejemplo el mtodo de extraccin orgnica, pero el empleado en esta prctica fue el mtodo de altas concentraciones de sales (saltingout). Este la mtodo consiste de en las

separarlo

componentes

celulares. Para lograrlo es necesario realizar una sucesin de pasos que se cumplen independientemente del tipo de muestra: iniciando por una lisis celular, seguido por una

disminuir

solubilidad

protenas,

las

cuales

terminan

con ms rapidez que las grandes con la misma carga neta [2]. Las molculas de ADN son atradas al polo positivo debido a la carga neta

precipitando. Posteriormente el ADN es recuperado por precipitacin con alcohol [3]. Despus de extraer el ADN es necesario visualizarlo. Una tcnica muy utilizada es la electroforesis en gel de agarosa que consiste en someter a las molculas de ADN a campos elctricos proporcionados por electrodos de cargas opuestas que causarn el movimiento del ADN a travs de un gel poroso. La rapidez con que una molcula cargada se desplaza en un campo estable (su movilidad electrofortica) depende de dos factores especficos de la

negativa

de

ambas

cadenas

resultante de sus grupos fosfato. Las molculas ms pequeas migran ms rpido que las grandes al verse menos frenadas por el gel de agarosa en su desplazamiento
[1].

Despus del corrido electrofortico, las molculas se han trasladado a travs del gel, y este se ilumina con luz UV. Como resultado se observan unas bandas que corresponden a molculas de ADN. En esta prctica se utiliz gell star que tiene afinidad por el ADN, el cual, se intercala entre las pares de bases y que tiene la particularidad de presentar

molcula: uno consiste en el signo y la magnitud de su carga elctrica neta, y el otro est constituido por su tamao y forma. Si se mantienen iguales todos los dems factores, cuando las molculas son de igual tamao, la que tenga carga neta ms elevada rapidez se desplaza por el con mayor elctrico

fluorescencia cuando est unido a l. Por lo tanto, al iluminar el gel de agarosa con luz UV se aprecian bandas de ADN fluorescentes [3]. El objetivo de esta prctica fue familiarizarnos con el mtodo de extraccin de ADN mediante el uso de altas concentraciones de sales, utilizando como fuente de ADN los tejidos pertenecientes al rin de

campo

formado a causa de las propiedades de cribado molecular resaltar del medio las

slido.

Cabe

que

molculas pequeas se desplazan

ratn. Adems, se realiz un corrido electrofortico con el objetivo de identificar y asegurar la presencia de ADN en las muestras extradas

se agit la mezcla vigorosamente. Luego, se centrifug (a 12000 rpm por 10 minutos a 4C) para transferir el sobrenadante a un

mediante los diferentes pasos del protocolo realizado. 2. METODOLOGIA Los mtodos empleados para esta prctica fueron dos: extraccin de ADN y electroforesis en gel de agarosa. a. Extraccin de ADN: como

nuevo vial. El volumen obtenido fue de 0.5 ml al cual se le adiciono 1 ml de etanol absoluto para precipitar el ADN a 20 C durante toda la noche. Siguiendo con el protocolo de extraccin, se centrifug la

muestra a 12000 rpm por 10 minutos a 4 C descartando el sobrenadante. Luego se lav con 500 uL de etanol al 70% y nuevamente se centrifug a 12000 rpm por 10 minutos a 4C. Al cumplirse este tiempo, se

material de estudio se utilizo rin de ratn 150 tomando mg de

aproximadamente

tejido y depositndolo en un tubo eppendorf para macerar con 500 ul de buffer de lisis (tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM, SDS 0.1%). Posteriormente, a la muestra

descart el sobrenadante, y se realiz nuevamente el proceso de lavado. Por ltimo, se dej secar el precipitado de ADN a

macerada se adicion 5 L de proteinasa K (500 ug/mL), y se incub a temperatura de 55C por dos horas, mezclando por

temperatura ambiente- Tambin se resuspendi en 80ul de buffer TE (tris-HCL 10 mM, EDTA 0.1 mM) y se almacen a -20 C hasta su uso. b. Electroforesis: se prepar un buffer TBE 5x (volumen 50 ml) agregando los reactivos: 2.7

inversin del tubo. Transcurrido el tiempo, se inactiv la proteinasa K incubando la muestra a 94C por un minuto. Inmediatamente se adicionaron 150 uL de NaCl 6M y

gramos

de

Tris-

Base,

1.37

se le adicionaron 2 l de gell star. La solidificacin del gel demor aproximadamente 30 minutos. Transcurrido dicho tiempo se

gramos de cido Brico y 1 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0. Con la concentracin de trabajo de 5X se realizo la dilucin a una

concentracin de 0.5X para ser utilizado en la cmara de

coloco el plato con el gel en el tanque de electroforesis que

electroforesis y la preparacin del gel de agarosa fue de 35 ml de la concentracin 5x ms 315 ml de agua destilada. Para la preparacin del gel, se pes 0.45 gramos de agarosa, y en una probeta se midi un

contena buffer TBE 0.5x y se retir el peine, asegurndose que el buffer cubriera por lo menos un milmetro por encima del gel. A continuacin, se llevaron a vortex las muestras y se mezclaron (8l) con el azul de bromofenol (2 l) en el papel parafinado, para luego sembrar cada una de las muestras en el pozo correspondiente. Se conectaron los electrodos de la cmara de electroforesis a la fuente de poder de acuerdo a los colores indicados y se corrieron las muestras a un voltaje de 75 V durante 45 minutos. Finalmente, se adicion agua destilada sobre la superficie del transiluminador para trasladar el gel e iluminarlo con luz ultravioleta para visualizar los resultados y tomar una

volumen de 45 ml de TBE a la concentracin de trabajo 0.5 X.

Se colocaron estos reactivos en un recipiente de vidrio de 200 ml y se calent la solucin hasta que se disolvi la agarosa evitando la formacin anterioridad de se grumos. ensambl Con la

cmara de electroforesis y el peine donde solidificara el gel de agarosa. Dicho proceso implic esperar a que el recipiente que contena la agarosa bajara de temperatura para dispersar la

fotografa del corrido; ms tarde, se desech el gel en el

agarosa en la cmara con el peine. Cabe mencionar que antes de depositar el gel en la cmara,

contenedor para este fin.

plstico

destinado

3. RESULTADOS Para la extraccin de ADN se sigui el mtodo de altas concentraciones de sales, con el cual se logro obtener el ADN a partir de rin de ratn (Figura 1). Tras la electroforesis, los patrones de bandas obtenidos (Figura 2), mostraron que el ADN extrado presenta bandas de alta calidad, es decir, bien definidas. Por lo tanto la muestra obtenida es adecuada para efectuar posteriores amplificaciones por PCR. En la figura 2 se muestra la banda del pozo 3. Esta es menos intensa que las dems, lo que podra deberse a que el protocolo no fue realizado tan eficaz o eficientemente como en los dems ensayos. Las muestras se depositaron en el gel de agarosa a partir del pozo 3, intercalando las muestras de tal forma que quedaran lo suficientemente separadas con el fin de tener una mejor vista del corrido electrofortico. Figura 2. Electroforesis del ADN extrado a partir de rin de ratn. Se muestra el corrido electrofortico de los 4 productos obtenidos en la extraccin de ADN por los diferentes grupos de trabajo. Pozo 3: ensayo del grupo 1, pozo 5: ensayo del grupo 2, pozo 7: ensayo del grupo 3, pozo 9: ensayo del grupo 4. Figura 1. Eppendorf conteniendo precipitado de ADN extrado

mediante el protocolo de extraccin de ADN utilizando altas

concentraciones de sales.

4. DISCUSIN Los resultados obtenidos mediante la extraccin de ADN por el mtodo de salting out ponen en evidencia la gran efectividad de este protocolo que resulta de gran ayuda al momento de obtener ADN perteneciente a tejidos animales. Para nuestro proceso de extraccin utilizamos una cantidad pequea de rin de ratn. Este tejido conformado por renocitos

como es el caso de la enzima proteinasa K, que es capaz de destruir e inactivar protenas como por ejemplo las enzimas de

restriccin que podran daar el ADN. Por otra parte, de provocan la el

rompimiento

membrana

plasmtica de las clulas, permitiendo que el ADN quede libre en el medio de reaccin. Adems de esta

eliminacin de protenas, el mtodo de salting out permite eliminar al resto de protenas que estn adheridas directamente al ADN. Este mtodo se basa principalmente en la sensibilidad que presentan las protenas en

representa una buena opcin para la extraccin de ADN porque al igual que el hgado, el rin presenta una gran sntesis de por la cidos gran

desoxirribonucleicos

cuanto a la solubilidad en presencia de concentraciones de sales

cantidad de clulas presentes. Por lo tanto, a partir de este tipo de tejido logramos obtener un buen resultado que se ve reflejado en el corrido electrofortico. Debido a que existen ciertas barreras que impiden la obtencin de ADN puro necesario para algunos tipos de estudios, se han desarrollado varias tcnicas que permiten extraer el ADN lo suficientemente Por libre de

disueltas. Ms exactamente, las altas concentraciones de sales disueltas provocan una disminucin en la las protenas que

solubilidad de

cubren, empaquetan y protegen al ADN (histonas). Por lo tanto, a bajas concentraciones de sal, la solubilidad de las protenas usualmente

incrementa ligeramente, pero a altas concentraciones de sal, la solubilidad de las protenas disminuye de

contaminantes.

ejemplo,

protocolos que incluyen la utilizacin de enzimas que degradan protenas,

manera brusca. Esto se debe a que las protenas tienen en su estructura

aminocidos

hidrfilos

que

separacin de las protenas del ADN utilizando procedimientos como la centrifugacin. Como resultado se obtuvo una pequea muestra donde se encontraba el ADN listo para ser corrido en un gel de agarosa. Para asegurarnos de que la muestra contena el ADN que pretendamos extraer, se realiz un corrido gel de

interactan con las molculas de agua formando enlaces de hidrogeno. Esto deja de manifiesto que si la protena presenta sus aminocidos hidrfobos hacia el interior de su estructura y muchos aminocidos hidrfilos en la superficie, la protena se puede disolver en agua. Pero si se aumentan las concentraciones de sal, algunas molculas de agua son

electrofortico

utilizando

atradas por los iones salinos, lo que disminuye el nmero de molculas de agua disponibles que podran

agarosa. Esta tcnica es de vital importancia porque sirve para

identificar la presencia y tipo de ADN, adems de que permite separarlo y purificarlo para un mejor estudio. Esta tcnica de electroforesis se basa principalmente en la migracin de las partculas cargadas bajo la influencia de un campo elctrico. Debido a que el ADN presenta cargas negativas por la presencia de grupos fosfatos, estos tienden a migrar a travs del gel de agarosa en direccin al campo

interactuar con las partes hidrfilas de la protena. De esta forma, las molculas de solvente se tornan insuficientes para disolver otros

solutos que no sean la sal, como las protenas. As que, la actividad del solvente se reduce lo suficiente para que las interacciones soluto-soluto aumenten y las interacciones solutosolvente disminuyan, provocando as que la unin de las protenas y el ADN tambin se reduzcan.

elctrico positivo del nodo. Otro factor importante en la migracin de las molculas de ADN es la masa que estas tienen. Por lo tanto, entre ms pequeos sean los fragmentos de ADN ms distancia de migracin presentaran, debido a que los poros del gel a cierta concentracin solo

Finalmente, las protenas precipitan gracias a la formacin hidrfobas ellas.[4] de que Esto las se es la

interacciones generan importante

entre

porque

permite

permiten el paso con mayor rapidez de fragmentos de tamao

La importancia de la utilizacin de un tampn de carga como el azul de bromofenol reside en que se necesita aumentar la densidad de las

determinado. Uno de los componentes de la electroforesis utilizados en la prctica fue la agarosa, un coloide natural que se extrae de las algas y que puede presentar grandes poros que sirven para separar molculas grandes. Este material permite una electroforesis rpida que como lo pudimos realizar en el laboratorio, se vierte en solucin en un molde para gel y se deja enfriar hasta que se forma un gel rgido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad depende de su concentracin. Otro componente utilizado en la prctica fue una solucin tampn que es muy importante para la movilidad electrofortica del ADN, porque en ausencia de iones la conductancia elctrica es mnima y el ADN migra lentamente o no migra. Por lo tanto, la utilizacin de un tampn con elevada fuerza inica provoca una conductancia elctrica elevada que ayuda al ADN a migrar con mayor rapidez.

muestras para que las gotas de ADN caigan uniformemente en los pozos. Adems de esto, es necesario para darle color a las muestras. De esta manera se incorpora un colorante que, en un campo elctrico, se desplace hacia el nodo a una velocidad previsible. [5] Con respecto en a la los resultados

obtenidos

electroforesis

realizada, se pueden observar las cuatro bandas correspondientes a las diferentes muestras procesadas por los grupos de trabajo. Las bandas se encuentran a la misma distancia de migracin y con intensidades muy parecidas, lo que quiere decir que en cada una de las muestras

efectivamente se encuentra el mismo tipo de ADN extrado en el protocolo de extraccin realizado con

anterioridad. Una vez asegurada la presencia de ADN en las muestras se puede proceder a amplificar el ADN implementando tcnicas como la de PCR, que nos permitir obtener

muchas copias de nuestro ADN hasta niveles mucho ms detectables. 5. CONCLUSIONES El mtodo de salting out se basa en la disminucin de la solubilidad de las protenas utilizando altas concentraciones de sales que

La agarosa es un gel natural que presenta poros que sirven para separar molculas que, adems de la concentracin del gel, la velocidad de migracin depender de la carga y tamao que tengan las molculas.

Una

solucin

tampn

con

disminuyen la disponibilidad de molculas del solvente haciendo que aumenten las interacciones protena-protena y ocurran sus respectivas precipitaciones. La proteinasa K es capaz de destruir e inactivar protenas

suficiente fuerza inica permite que el ADN migre con mayor rapidez durante una electroforesis. El tampn de carga (azul de bromofenol) aumenta la densidad de las muestras para que las gotas de ADN caigan

enzimticas y de provocar el rompimiento de la membrana

uniformemente en los pozos, y permite muestras darles para color la a las

plasmtica de las clulas. La electroforesis se basa en la migracin de las partculas

posterior

visualizacin de bandas. En el corrido electrofortico

cargadas bajo la influencia de un campo elctrico. El ADN tiene cargas negativas conferidas por los grupos fosfatos y viajan en direccin al nodo. La electroforesis es un proceso que sirve para asegurarnos de que la muestra procesada

realizado, se observaron bandas a la misma distancia de migracin y con intensidades muy parecidas, lo que quiere decir que se trata del mismo ADN en las cuatro

muestras. 6. REFERENCIAS 1. Luisa I. Falcn y Aldo Valera .Extraccin de cidos nucledos

contiene el ADN que pretendemos extraer.

2. kubi. Inmunologa. 2008. Edicin sexta. Editorial Mc Graw Hill. Madrid Espaa 3. Lisandro Alvarado. Decanato de ciencias de la salud. Biologa celular. Extraccin de ADN. Universidad centroccidental. 4. Voet. Voet. Bioqumica. 2004. 3 edicin. Editorial medica panamericana S.A. Montevideo, Uruguay. Pginas web consultadas.

5. M. Somma, M. Querci. Electroforesis en gel de agarosa. En lnea [Consulta: 24 de Octubre de 2013] Disponible en la web:
http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manual s/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n5.pdf