Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Farmacia y Bioqumica Departamento de Bioqumica

I CURSO NACIONAL DE ACTUALIZACION DE ANALISIS

CLINICOS - 2009

ELISA FUNDAMENTOS, PROCEDIMIENTOS EN LOS ANALISIS CLINICOS

Q. F. GLORIA GORDILLO ROCHA 26/09/09

TCNICAS INMUNOLGICAS

 Los ensayos inmunolgicos son procedimientos en los

cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes especficos.

Tienen aplicacin universal para la determinacin o cuantificacin de frmacos teraputicos y no teraputicos, diversas sustancias biolgicas, sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del husped en el suero, en la orina, en el lquido cefalorraqudeo en saliva y en cualquier lquido biolgico donde se encuentre la sustancia a investigar.

Antecedentes
El RIA desarrollada en 1959 por Yalow y Berson, son los precursores de los ensayos Inmunoenzimticos El uso de material radioactivo ha limitado el uso de la tcnica radioinmunoensayo. Y a la vez a popularizado el empleo del inmunoensayo enzimtico (EIA), del que hay dos tcnicas principales: el - ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y el - ensayo inmunolgico multiplicado por enzimas (EMIT).

Tipos de Interaccin
INTERACCION PRIMARIA: FORMACION DE COMPLEJOS Ag-Ac
Ag-Ac Ag-Ac Ag-Ac Ag-Ac

Ag + Ac
Ag-Ac

Ag-Ac

INTERACCION SECUNDARIA: INTERACCIN ENTRE COMPLEJOS

Ag-Ac Ag-Ac Ag-Ac Ag-Ac Ag-Ac

Aglutinacin

Ag-Ac

TCNICAS INMUNOLGICAS IN VITRO IH O TCNICAS SEROLGICAS

A) Pruebas que se basan en la interaccin primaria y secundaria entre Ags y Acs o de lectura directa.
* De Aglutinacin

* De Precipitacin

TCNICAS INMUNOLGICAS IN VITRO O TCNICAS SEROLGICAS

B) Pruebas que se basan en la interaccin primaria entre Ags y Acs o de lectura indirecta.

PRUEBAS DE INMUNOMARCACIN

Dispositivos empleados en ELISA

Micropipetas

Fase solida

Micropocillo

CONJUGADO

Antgeno + Enzima Anticuerpo + Enzima Anti-Ig + Enzima

ENZIMA - SUSTRATO
Enzima Sustrato OPD
o-fenilendiamina

Tampn 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30%

HRP (peroxidasa de rbano)

TMB

2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30%
5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio

AP (Fosfatasa alcalina)
beta-G

PNPP
Para-nitrofenilfosfato onitrofenil-beta-Dgalactopiransido

ONPG

2.5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol

La prueba ELISA se basa en varias teorias:

1)El antgeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie

portadora insoluble y retener su reactividad inmunolgica;

2) Las enzimas tienen actividad especfica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto

detectable (permite detectar [ ]s muy bajas del ligando);

3) La actividad enzimtica o reactividad inmunolgica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el

anlisis y el almacenamiento; y
4) Las enzimas no estn presentes en el lquido biolgico que se va a analizar.

Las diferencias de sensibilidad,

especificidad, capacidad de utilizacin a

gran escala, etc. son algunos de los

conceptos ms importantes a la hora de

seleccionar una u otra tcnica.

FUNDAMENTO
LA PRUEBA DE

ELISA, es un tcnica de

diagnstico que pertenece al grupo de

TCNICAS INMUNOLGICAS basadas

en una INTERACCION PRIMARIA.

FUNDAMENTO

La tcnica inmunoenzimtica ELISA forma

parte de aquellas reacciones serolgicas que

utilizan conjugados para poder visualizar

la reaccin ANTIGENO-ANTICUERPO.

FUNDAMENTO
1.- Al estar uno de los componentes (antgeno anticuerpo) inmovilizado sobre una placa (fase slida), se permite la captura de un anticuerpo o antgeno respectivamente (Ag-Ac), que fcilmente puede ser revelada mediante la adicin del sustrato.

FUNDAMENTO

Sobre el que acta la enzima y se producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante un colormetro.

PROCEDIMIENTOS GENERALES DE UNA TCNICA ELISA: Dispensar muestras Dispensar conjugado Incubar a 37C o a temperatura ambiente Lavar los pozos Dispensar cromgeno/sustrato Incubar a 37C o a temperatura ambiente Dispensar solucin de parada Leer en lector de tiras placas de ELISA

ELISA

Antgeno (Fijo al soporte) Anticuerpo (Suero del Paciente) Anti-Ig + Enzima (Conjugado)

Suero Paciente

Soporte

Conjugado

S
L A V A D O S U S T R A T O
(TMB) INCOLORO

(HCl)

S S

COLOR
COLOR COLOR

S
S

S T O P I N G

C O L O R
(ESTABLE)

Reaccin de color ELISOMETRO

LECTORES DE ELISA
Son

espectrofotmetros capaces de realizar lecturas

seriadas de cada uno de los pocillos de la placa

ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda, que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms

comnmente utilizados.

Lector de ELISA

FILTROS COMUNMENTE UTILIZADOS

Standard: 405, 450, 492, and 630nm

405, 450, 492, 545, 600, and 630nm

340, 405, 450, 492, 545, and 630nm

TIPOS DE TCNICAS ELISA:

Tcnicas cualitativas:

Nos indican la ausencia presencia de un antgeno o

anticuerpo determinando. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar esta presencia o ausencia de antgenos. Ejemplo: HIV, Hepatitis, etc.

TIPOS DE TCNICAS ELISA:

Tcnicas cuantitativas:
Nos indican la cantidad de antgeno anticuerpo

presente en la muestra. Los kits incluyen +/-6 standards

(sueros de diferentes concentraciones del antgeno objetivo) con los cuales se realiza una curva para as poder determinar la concentracin de la muestra. Ejemplo: Hormonas, Marcadores tumorales, etc.

TIPOS DE TCNICAS ELISA:

Tcnicas semi-cuantitativas:
Nos dan un indicio de la cantidad de antgeno anticuerpo presente en la muestra con la utilizacin de un standard calibrador Ejemplo: ANA, nDNA, etc.

TIPOS DE ELISA
ELISA Sndwich DAS (Directo )
(Double Antibody Sandwich).

ELISA Sndwich HADAS.

ELISA Sndwich HADAS.

ELISA Sndwich HADAS.

PRUEBA INDIRECTA DE ELISA

ELISA COMPETITIVO

INTERPRETACIN
DETERMINACIN DE CURVA DE CALIBRACIN

DETERMINACION DEL CUTOFF O PUNTO DE CORTE

Es mas sensible que el resto de los ELISA. Tambin debemos realizar una curva patrn con cantidades conocidas de antgeno y anticuerpo.

Clculo del cut off (punto de corte).

Luego de la lectura, se deber calcular el valor de

cut off a partir de los valores de absorbancia de los

pocillos correspondientes a los controles positivos y

negativos.
El cut off se determina utilizando la siguiente

ecuacin:
Cut off = (promedio controles positivos + promedio controles negativos) x 0,35

Clculo del cut off (punto de corte).

Ejemplo de clculo:
Promedio de controles positivos =1,032 Promedio de controles negativos =0,085

Cut off = (1,032 + 0,085) x 0,35 = 0,391

Clculo del cut off (punto de corte).

Determinacin de resultados

Una muestra ser positiva cuando su absorbancia sea mayor que el cut off.
Un suero ser negativo cuando su absorbancia sea menor que el

cut off.
Las muestras cuya absorbancia se encuentre en un rango de cut

off 10%, deben considerarse dudosas y debern ser analizadas nuevamente en duplicado.
Si al menos uno de los replicados mantiene una lectura en esta zona,

considere la muestra como positiva.

Clculo del cut off (punto de corte).

En casos excepcionales en los que no se cuente con un

lector colorimtrico, se puede realizar un lectura visual.

Los pocillos positivos sern de color amarillo y podrn

diferenciarse de los pocillos negativos, los que sern

incoloros o presentarn una leve coloracin amarilla. Este tipo de lectura no permite verificar los criterios de validacin, por lo que se recomienda slo en situaciones excepcionales.