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vector
vera, c) tomate transgénico; hibridando con una sonda
de cDNA de longitud completa.
2) ¿Por qué habrá elegido tomate y no tabaco, por
ejemplo?
3) Analizando la expresión de los mRNAs de aloeve-
rina en distintos tejidos del tomate transgénico por la
técnica de Northern, usando como sonda al cDNA de
aloeverina de longitud completa, se observó lo si-
guiente:
Respuestas esperadas a) Activador a) ¿Cuáles son los tamaños del mRNA I y mRNA II?
b) La comparación entre la actividad de p3 y b) En el primer esquema ubique (con flechas) la pro-
p3Rv es lo que permite determinar que Rv es un bable ubicación del codón de iniciación y la del de
elemento activador (o represor si lo hubiese sido). terminación.
pJEM15 es un control negativo.
c) Porque es fácil de detectar enzimáticamente y los RNA de RNA de tomate transgénico
resultados no son afectados por la expresión de los Aloe vera: hoja raíz hoja raíz fruto flor
genes mce endógenos (cromosómicos) de las mico- _
bacterias tranformadas. mRNA I
d) 100-200
e) Porque necesito extraer de una célula que exprese
mRNA II
la proteína Rv, porque si no, nunca podría estudiar
su efecto.
2) El Dr. Cureta, en su eterna búsqueda de la pócima
de la juventud eterna, estudió la estructura y expre-
+
sión del gen de la aloeverina que produce una proteína c) ¿Por qué el Dr. Cureta reemplazó en su experimen-
de maravillosas propiedades curativas y rejuvenecedo- to el promotor de la aloeverina por el de la actina de
ras en Aloe vera (planta no comestible). Este gen da tomate? ¿Le parece que eligió el promotor más ade-
origen a dos proteínas diferentes en las hojas y las raí- cuado para sus propósitos? ¿Por qué?
ces de la planta por splicing alternativo. Sin embargo, d) ¿Qué conclusiones saca a partir de los resultados
la única que tiene propiedades especiales es la de la del Northern en cuanto a la especificidad tisular del
hoja que se produce en cantidades muy pequeñas. splicing del RNA del gen de la aloeverina?
Además, su purificación es ineficiente, con el agra- e) ¿Qué sugerencias experimentales le haría al Dr.
vante de que sus propiedades se ven afectadas por las Cureta para mejorar la performance de sus experimen-
fenoloxidasas que se liberan de los lisosomas cuando tos y así obtener los resultados deseados?
estas organelas se rompen en el proceso de homogeni- Respuestas 1) tomate, no da nada. Aloe vera: 3 ban-
zación. Esta es la estructura del gen de la aloeverina: das de 7, 3 y 12 kpb. Tomate transgénico: ídem. 2)
Porque el tabaco tampoco es comestible. El toma-
7 kb 3 kb 12 kb
te, sí. Respuesta alternativa: Si la idea es la de
mejorar la productividad, el tabaco (por su alta
E1 E2 E3 E4 producción de biomasa) podría haber sido una
promotor
210 pb 370 pb 8 0 pb 1 30 pb alternativa interesante. 3) a) 790 y 710, b) ATG:
Una flecha un poco a la derecha del extremo del
Las flechas indican sitios para la enzima HindIII. Los
exón 1 (no en el extremo porque siempre hay un ex-
dos mRNAs difieren porque en uno está presente y en
tremo 5´ de mRNA no codificante) o al principio del
el otro está ausente el exón E3 de 80 pb. El Dr. Cureta
exón 2. Stop: una flecha un poco a la izquierda del
decidió obtener tomates transgénicos transfectando
extremo derecho del exón 4 (siempre hay un segmento
con un plásmido recombinante con el gen clonado de
3´ no codificante a 3´ del codón de terminación), c) El
la aloeverina en el que había reemplazado al promotor
promotor nativo es poco eficiente y lo reemplaza por
nativo de la aloeverina por el de la actina de tomate,
uno constitutivo fuerte, pero podría haber elegido me-
con el fin de analizar la expresión de mRNAs de aloe-
jor el promotor: por ej. uno específico de fruto de to-
verina en los distintos tejidos:
mate, que es el tejido de interés para alimentación. d)
1) Sabiendo que los tomates no tienen ningún gen
Aparentemente, el sistema que permite reconocer al
endógeno homólogo al de la aloeverina, dibuje el
exón 3 como tal, es específico de hoja y de especie y,
patrón de bandas de hibridación que esperaría obtener
tal vez, de gen (pero eso no lo podemos determinar
en un Southern de DNAs genómicos digeridos con
con estos datos). e) Usar una construcción SIN intro-
HindIII provenientes de: a) tomate normal, b) Aloe
nes para evitar el procesamiento incorrecto.
3
3) Para el operón lactosa de Escherichia coli, indique vez identificado el clon se subclona y secuencia el
el genotipo de al menos uno de los diploides parciales inserto para ver si hay ORFs candidatos, los cuales
posibles capaces de producir beta-galactosidasa (codi- son testados funcionalmente de la misma manera.
ficada por el gen Z) constitutivamente y permeasa
4) La Dra. Romántica está intentando encontrar genes
(codificada por el gen Y) en forma normal (es decir
que aceleren la floración. Con este objetivo en mente
inducible con análogos de la lactosa) usando la no-
procede a transformar plantas de Arabidopsis thaliana
menclatura practicada en las clases de problemas.
mediante la utilización de Agrobacterium, con la si-
Respuesta: lacI+ lacOc lacZ+ lacY- / lacI+ lacO+
guiente construcción:
lacZ- lacY+ (en alguno de los 2 genotipos lacI puede
ser lacI-)
3) En la película Blade II, el héroe (Blade) es un “se-
mi”vampiro que lucha a favor de la humanidad con
los vampiros “malos” que quieren dominar el mundo. LB y RB: bordes izquierdo y derecho del T-DNA,
En una escena trascendental de la película, Blade es 35S: enhancer fuerte y constitutivo, nptII: gen de re-
capturado para poder extraer su sangre (y su ADN) sistencia a kanamicina Pnos: promotor constitutivo, t-
porque los vampiros estaban diseñando nuevas varian- nos: terminador
tes transgénicas clonadas con mejor adaptación. Si
Entre las miles de plantas generadas encuentra una
bien ya habían logrado obtener vampiros resistentes a
mutante
la plata modificando el gen de la metalotionina, quer-
ían extraer de Blade un gen de resistencia a la luz so- (M) que florece en la mitad de tiempo que las plantas
lar. Ud. ha sido contratado por los vampiros para salvajes (wild type = wt). A partir de una hoja de esta
hacer este trabajo (le han prometido vida eterna como planta extrae DNA, lo digiere con BamHI, lo corre en
forma de pago) y dispone de un laboratorio de inge- un gel de agarosa, transfiere a una membrana y lo re-
niería genética excelentemente equipado que le permi- vela con una sonda radiactiva correspondiente al T-
te, entre otras cosas, cultivar in vitro vampiroblastos DNA completo. Cuando cruzó esta planta con una
(células equivalentes a los fibroblastos humanos). Los planta salvaje, dentro de la descendencia, algunas
vampiroblastos extraídos de vampiros comunes se plantas presentaron floración temprana y otras no. Al
lisan en presencia de luz solar, mientras que las célu- repetir el Southern blot con 10 plantas de la F1 se ob-
las extraídas del cuerpo de Blade son luminoresisten- tuvieron los siguientes resultados:
tes. No se dispone de información alguna sobre la se-
cuencia del gen a clonar, ni anticuerpos, ni secuencias
parciales de aminoácidos de la proteína. Tampoco se
pueden planear cruzamientos genéticos de Blade con
vampiresas para estudiar su progenie porque llevaría
mucho tiempo. Inspirándose en el ejemplo histórico
del clonado molecular de los primeros oncogenes
¿qué estrategia de clonado y caracterización funcional
del gen de resistencia a luz solar propondría?
Respuesta: En caso de seguir los pasos históricos a) ¿Para qué se incluyó el gen quimérico npt II en la
descriptos en el Recombinant DNA de Watson y col.: construcción?
se extrae ADN total de Blade (sólo o con una “etique- b) ¿Cuál fue el objetivo de introducir un enhancer
ta” –tag- de secuencia nucleotídica conocida ligada) y “suelto” no acompañado de un promotor o de una se-
se lo usa para transfectar vampiroplastos por la técnica cuencia estructural?
de coprecipitación con fosfato de calcio. Después se c) ¿Cree que el hecho de que se observen dos bandas
exponen los vampiroblastos a la luz y se extrae ADN en el mutante parental se deba a que BamHI corte de-
total de las células transgénicas resistentes y se fabrica ntro del T-DNA o a qué se insertaron dos T-DNAs (en
una genoteca en fago lambda. Se releva (“screenea”) lugar de uno) en más de un lugar en el genoma? Ana-
la genoteca con ADN repetitivo de Blade (el equiva- lice teniendo en cuenta los resultados obtenidos con la
lente a secuencias Alu) o con la sonda para el tag para F1.
identificar el ADN procedente de Blade. Se confirma d) ¿Qué plantas de la F1 seguiría analizando? Justifi-
la identidad del clon de lambda por transfección de que. El hecho de conocer la secuencia de la construc-
vampiroblastos que se convierten en luminoresisten- ción utilizada le permitió a la Dra. Romántica median-
tes. te PCR, secuenciación y finalmente comparación con
Con técnicas más modernas se aislaría el ADN de la base de datos del genoma de Arabidopsis, identifi-
Blade y se lo clonaría en BACs (se puede aceptar que car el sitio exacto de inserción del T-DNA. Este sitio
sea en otros vectores como cósmidos o en fagos de inserción se encuentra 1 kpb río arriba (5’) de un
lambda). Con mezclas (“pooles”) de clones recombi- marco de lectura abierto aún no estudiado (ORF4329).
nantes se transfectan vampiroblastos para identificar e) ¿Qué efecto cree que tiene la inserción del T-DNA
células luminoresistentes (por electroporación o usan- sobre el ORF4329? ¿Qué experimento haría para
do liposomas). A las mezclas que producen clones comprobarlo? Muestre mediante un diagrama los re-
positivos se las separa en clones individuales hasta sultados esperados.
identificar el clon conteniendo el gen de interés. Una
4
f) ¿Cree que el ORF4329 es un gen inductor o repre- combinación homóloga y sí saben que para hacer un
sor de la floración? Diseñe un experimento comple- knock out dirigido se requiere recombinación homó-
mentario al realizado por la Dra. Romántica que, me- loga.
diante ingeniería genética, le permita comprobar su h) Haría un Southern usando como sonda al
hipótesis, indicando los resultados esperados. Recuer- ORF4329 y condiciones de baja rigurosidad en la
de que en la transformación mediante Agrobacterium hibridación. Para clonarlo haría una genoteca y locali-
el T-DNA no se integra mediante recombinación zaría el gen homólogo mediante hibridación con la
homóloga (en biobalística tampoco). sonda de Arabidopsis.
g) Como Arabidopsis es un yuyo y sus flores son bas- 5) Los ritmos circadianos que corresponden a ciclos
tante feas, un estudiante de doctorado de la Dra. de aproximadamente 24 horas permiten a los orga-
Romántica está interesado en ver si los rosales tam- nismos regular su actividad con la alternancia día-
bién tienen un gen homólogo al ORF4329. ¿Cómo lo noche. Aunque estos ritmos son autónomos, algunos
haría experimentalmente sabiendo que el genoma del estímulos externos, tales como la luz, pueden “poner
rosal no está secuenciado? En caso de que haya un en hora” este reloj interno. En mamíferos, existe un
gen homologo al ORF4329 presente, ¿cómo clonaría marcapasos central, ubicado en el núcleo supra-
el gen homólogo completo? quiasmático (NSQ) del hipotálamo anterior. Varios
Respuestas esperadas genes están involucrados en el mecanismo molecular
a) Como gen marcador selectivo que permite selec- del reloj interno, existiendo entre ellos lazos de retroa-
cionar las plantas transgénicas de las no transgénicas limentación positiva y negativa a nivel de la expresión
durante la regeneración de plantas en un medio conte- y de la actividad de las proteínas que codifican. Se
niendo el antibiótico kanamicina sabe que la fase de este marcapasos central se puede
b) Porque el objeto del experimento es que este en- adelantar con un estímulo lumínico durante la “noche”
hancer estimule constitutiva y fuertemente los promo- relativa que es captado en la retina y llevado al NSQ a
tores cercanos al sitio de inserción del segmento T con través del tracto retino-hipotalámico (que libera el
la esperanza de que alguno de ellos estimule la flora- neurotransmisor glutamato) y que este cambio de fase
ción temprana. está asociado a un aumento rápido de la expresión del
c) No puede haber ocurrido que haya sólo un sitio de gen Per1. Río arriba (hacia 5’) de este gen se encuen-
inserción y que BamHI corte dentro del DNA-T pues tra una secuencia cre (elemento de respuesta a
en la F1 las dos bandas segregan independientemente. cAMP), a la cual se puede unir en ciertas condiciones
Seguramente el DNA-T se insertó en dos sitios distin- el factor de transcripción CREB. Se realiza el siguien-
tos. te experimento: a un cultivo sincronizado de células
d) Seguiría analizando alguna de las siguientes plan- del NSQ de ratón se lo estimula durante la noche rela-
tas: 1, 6 o 9 ya que presentan floración temprana, pero tiva con concentraciones adecuadas de glutamato
no heredaron el inserto del T-DNA no relacionado con (provoca el mismo efecto que la luz provoca in vivo) o
la inducción temprana de la floración. El descartar las db-cAMP (dibutiril cAMP: análogo del cAMP que
plantas 4, 7 y 10 facilita los pasos siguientes de identi- puede atravesar la membrana celular) o con solución
ficación del sitio de inserción. salina (control). Después de 30 minutos se extraen
e) Dado que el T-DNA no interrumpe un gen ni el RNA y proteínas.
promotor mínimo, pero sí se ubica cercano al promo- Northern Blot con sonda para Per1:
tor, la inserción del DNA-T estaría aumentando la
Control Glut db-cAMP
transcripción del ORF4329 mediante los enhancers
35S. Para comprobar esta hipótesis habría que realizar
un Northern partiendo de mensajeros de plantas nor-
males y mutantes (sería interesante comparar también
tejidos florales y no florales ya que el enhancer 35S es Relación entre CREB fosforilado (P) y no fosforilado
constitutivo) utilizando una sonda complementaria al
ORF4329. Relación Control Glut. db-cAMP
f) Es un inductor de la floración pues al aumentar su CREB-P/CREB 0,3 4,2 2,2
expresión se adelanta la floración. Para comprobarlo
se podría hacer un antisense del ORF4329 y espero Esta relación se determinó realizando Western Blot
ver un retraso o ausencia de floración. Si repito el con anticuerpos anti-CREB y anti-CREB-P.
Northern vería menos mensajero que en el normal. Para poder confirmar el rol de CREB se construyó el
g) Otra respuesta alternativa que pueden pensar los siguiente sistema indicador (reportero) y se transfectó
alumnos sería realizar un knock out de ese ORF. En en células del NSQ en cultivo.
realidad teóricamente no sería correcto pues en plan- Prom: promotor del gen Per1.
tas no suelen realizarse knock outs, pero ellos proba-
blemente no lo sepan (conceptualmente no importa, Prom Sec estr.gen luc
cre
técnicamente, lo knock outs en la actualidad, salvo en
bacterias, se hacen por interferencia transformando
transitoriamente con RNAi o establemente con cons- La luciferasa (codificada por la secuencia estructural
trucciones que expresen iRNA). Además está la acla- del luc) es una enzima que reacciona con el agregado
ración de que la integración del T-DNA no es por re- de luciferina produciendo luminiscencia. Se ensaya la
5
actividad de estas células en las siguientes condicio-
nes:
+ inhibidor de AC - (baja expresión)
- glutamato - sin inhibidor - (baja expr.)
+ inhibidor de AC + (expr. media)
+ glutamato - sin inhibidor +++ (alta expr.)
AC (adenilato ciclasa): enzima que sintetiza cAMP a
partir de ATP, responsable del aumento de cAMP du- b. ¿Cómo se evaluó la relevancia relativa de cada una
rante la transducción de señales de diversos estímulos. de las regiones del promotor? (indique el gen reporte-
Interpretar estos resultados. ro y la obtención de los individuos utilizados para rea-
Se sospecha que el glutamato ejerce su acción vía lizar esta medición). ¿Qué cree usted que representa
cAMP pero que esta podría no ser la única vía en que en el esquema la región pintada de negro? ¿Qué in-
lo hace. ¿Qué opina acerca del rol de CREB en los dos formación brindan, con respecto a la estructura del
tipos de estímulo? Justificar. promotor, los resultados que se presentan en el es-
Respuestas a) Esta respuesta implica un mínimo de quema?
detalle de descripción de para qué se hicieron los 3 c. Finalmente, los investigadores se preguntaban cómo
experimentos y qué datos aporta cada uno. Conclusio- validar sus resultados, tanto con respecto a la función
nes: tanto glutamato como cAMP inducen la expre- del gen (efecto sobre el comportamiento) como a su
sión de Per1. La inducción por glutamato es más fuer- regulación. Elija una de estas dos opciones, y detalle
te que por cAMP. Además, el glutamato es capaz de al menos una metodología para poner a prueba su
activar el promotor de CREB aún en presencia de in- hipótesis.
hibidores de la AC. Rta a. Marcadores, genoteca dif, o arrays (por cual-
b) La contestación a esta pregunta puede tener algunas quiera que lo encaren esta bien, mientras que este bien
variantes de respuesta y se evaluará en función de la explicado)
coherencia del razonamiento que se emplee. La res- b. Deben mencionar un gen reportero (idealmente lu-
puesta esperada es que puede deberse a que el gluta- ciferasa, proque ese es el que vieron para insectos) y
mato activa la misma vía de señal del cAMP y además deben explicar brevemente como transfectar insec-
otra (u otras) o a que activan vías totalmente separa- tos con estas construcciones. luego los deben exponer
das que terminan en el mismo efecto (siendo la de glu- al olor para medir actividad. Parte pintada de negro:
tamato una vía más fuerte). En cuanto a CREB, se ve prom. minimo, siemrpe debe estar. regulacion: deben
que la fosforilación de CREB se corresponde con una decir qué regiones de importancia se detactan en cada
alta expresión, por lo que podría pensarse que CREB parte (2 reg positivas, 1a en la primera, 1a en la terce-
está implicado en la activación de Per1. El menor ra)
efecto de cAMP también se ve en este caso, lo que c. Función del gen: knockout, transposon-tagging,
lleva a pensar en principio que la menor expresión antisense. Funcion de las regiones regulatorias: apun-
vista con cAMP se debería a una menor activación de tamos a que se acuerden del ejemplo de footprinting
CREB y no a que falte activarse otro factor de trans- de la guia.
cripción además de CREB que sí se active con gluta- 7) Un grupo de criadores de caballos de Tennessee
mato. están interesados en el fenotipo champagne del pelaje
6) Ciertos individuos de la abeja Apis mellifera pre- de sus animales, que es controlado por un gen au-
sentan un comportamiento particular en cuanto a la tosómico dominante CH, pero resulta muy difícil dis-
limpieza de las celdas que contienen a las larvas para- tinguirlo del efecto producido por dilución de otros
sitadas por el ácaro Varroa destructor (llamado com- genes relacionados con la síntesis de melanina. Re-
portamiento higiénico). Este comportamiento se debe suelto a revelar las bases moleculares de este fenotipo
a la capacidad de las abejas de percibir un compuesto acude al Departamento de Genética de la Universidad
químico volátil producido por el ácaro. Con el fin de de Tennessee donde le proveen los siguientes datos de
establecer si dicho comportamiento tiene una base cruzamientos prueba en los cuales estaba involucrado
genética, se llevaron a cabo una serie de estudios y uno de los genes candidatos (llamado P de pigmento)
experimentos que permitieron identificar algunos ge- y obtiene la siguiente segregación genotípica:
nes candidatos (es decir, genes responsables del com- CHch Pp = 40 % CHch pp = 10 %
portamiento higiénico). chch pp = 40 % chch Pp = 10 %
a. ¿Qué metodología/s puede/n haber sido empleada/s a) ¿A qué distancia genética se encuentran CH y P?
para la detección de estos genes candidatos? b) Dada la implicancia del gen P en la pigmentación,
A continuación, los investigadores se interesaron por ¿qué técnica utilizaría Ud. para verificar la expresión
la regulación de uno de los genes de interés, y enten- de dicho gen si conociera al menos un par de primers
der así la relación entre la expresión de los mismos y que amplifiquen alguno de sus exones? Puntualice de
la presencia de los volátiles emitidos por el ácaro, se qué tejido partiría, qué aislaría y qué técnica emplear-
realizaron las siguientes construcciones: ía ¿Qué control positivo realizaría?
(en blanco se indica la región del promotor que ha Para dilucidar las bases moleculares implicadas en el
sido delecionada). mecanismo de pigmentación y dado que el gen P es un
miembro de la familia de proteínas transportadoras
6
que cumplen un rol importante en el desarrollo del le unen factores de transcripción y regulatorios y al
color del pelaje en mamíferos, Ud. decide investigar la correr los complejos en un gel nativo y revelar por
regulación de la expresión de esta proteína. Según la autoradiografía, la marca de 32P aparece retrasada en
bibliografía esta proteína había sido referida previa- la calle con extracto porque pesa más por tener los
mente como proton/amino acid transporter en huma- factores unidos. Estos resultados apoyan los obtenidos
nos y en ratón. Para comenzar sus estudios clona la en el punto anterior donde se verifica la actividad
región promotora (p) ubicada a 5´del gen YFP (Yellow transcripcional en el caso de existir factores específi-
Fluorescent Protein). Luego, realiza los siguientes cos para la región promotora de P.
experimentos de transfección: 8) En un laboratorio se obtuvieron protoplastos (célu-
Línea celular Plásmido Fluorescencia las vegetales sin pared) a partir de células de mesófilo
YFP de tabaco. Los mismos fueron electroporados (trans-
Melanocitos M3 p/YFP +++ formados en forma transitoria, es decir, sin buscar in-
tegración estable) con tres plásmidos recombinantes
Queratinocitos Q8 p/YFP ---- distintos (uno por vez y en distintas células). Los 3
c) ¿Cómo interpreta estos resultados en términos de plásmidos portan la secuencia codificante para la beta-
mecanismos de regulación de la expresión génica y glucouronidasa (GUS) proveniente de un gen bacte-
especificidad de tejidos? riano llamado uid A (cuya expresión transitoria puede
Para confirmar lo anterior, decide realizar un ensayo detectarse mediante una reacción que da color azul, en
de EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Para una forma muy similar a la que se puede detectar al
ello, utiliza nuevamente la región promotora de este producto del gen lac Z) y un terminador adecuado pa-
gen y la marca en uno de sus extremos 5´ con 32P. In- ra plantas. Lo que varía en los distintos plásmidos es
cuba la preparación con y sin proteínas nucleares ex- el promotor (acompañado del respectivo enhancer en
traídas de tejido cutáneo de los animales y corre un los casos 1 y 2, en el caso 3 no lo hay) que controla la
gel nativo de agarosa. Luego revela por autoradiograf- expresión de las secuencias estructurales.
ía.
1 Promotor secuencia estructu- terminador
Calle 1: Región promotora del Rubisco ral para GUS rubisco
gen P marcada con 32P e incu-
bada sin extracto nuclear.
Calle 2: Región promotora del 2 Promotor 35S secuencia estructu- terminador
gen P marcada con 32P e incu- ral para GUS rubisco
bada con extracto nuclear.
20 0 0 50 503
25 0 0 59 498 c+ StrR
30 20 30 80 501
a) El experimento anterior se aprovechó para mapear
los genes involucrados en la síntesis de biotina.
Ubique en el mapa genético el gen bio. a+ StrR
Se aclara la posición donde está
integrada la secuencia del b+ StrR
plásmido F en esta cepa F
Hfr, y además la del gen
his, previamente mapeado. 4 8 12 16 20 24 t (min)
b) Un amigo suyo, his a) ¿En qué medios se seleccionaron cada uno de los
estudiante de Biología, le genotipos de bacterias del gráfico anterior?
cuenta que hizo un b) ¿A qué distancia del origen de transferencia de la
experimento de conjugación - cepa Hfr utilizada mapean los genes a, b y c?
mientras miraba videoclips de c) Grafique y explique los resultados que hubiera te-
Britney Spears- con una cepa Hfr diferente a la nido en el experimento de conjugación interrumpida si
anterior, la cual, al conjugar con la misma F- que en el el genotipo de la cepa dadora hubiese sido:
experimento anterior, le transfiere el gen his a los 20 i) Hfr a+b+c+ StrR
min y el gen bio a los 40 min. ¿Le creería a su amigo ii) F+ a+b+c+ StrS
o pensaría que se distrajo mientras hacía los iii) Si el origen de transferencia de la cepa Hfr
experimentos? se encontrara entre el gen b y el c.
c) Un fago que hace transducción generalizada puede El hecho de que a y b mapearan juntos y formaran
encapsidar fragmentos de DNA genómico de una parte de una misma vía metabólica le sugirieron al
cepa bacteriana infectada y lisada que tengan un investigador que a y b pertenecen a un mismo operón.
tamaño de hasta 30.000 pb. Si ese fago es usado para Con el objeto de estudiar esta posibilidad realizó el
infectar una cepa de E. coli salvaje, y el lisado siguiente experimento:
resultante es usado, a baja multiplicidad de infección, A) Se digirió ADN genómico de una cepa salvaje con
para infectar a la F- mencionada antes. ¿Esperaría la ER Alu I (de corte frecuente) en cantidades limitan-
observar colonias en MM? Justifique (1 min equivale tes. Luego los fragmentos se ligaron en uno de los
a 20 kpb aprox) vectores que se muestran.
e) ¿Usaría Ud. la cepa F- en MM para testear la muta- B) Luego se transformaron bacterias a- b- c+ AmpS con
genicidad de una sustancia en un test de Ames? uno de los vectores y se plaquearon las bacterias
R a) El gen bio entra a los 10’ y el his a los 30’, por lo transformantes en ágar + MM + ampicilina + un ami-
tanto el gen bio se encuentra a 1/3 de la distancia entre noácido. Cada una de las colonias que crecieron en
F e his. b) Le creo, seguramente tiene un Hfr distinto estas placas fueron luego cultivadas en ágar + MM +
con el F integrado apuntando al revés y en otra posi- ampicilina obteniéndose los siguientes resultados:
ción. Nótese que la distancia entre his y bio es de 20’
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Vector 1: Todas las bacterias que crecieron en e) De las bacterias transformadas con el vector 1
MM+Amp+Leu crecieron también en MM+Amp. todas las bacterias b+ también eran a+, pero sólo el
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val el 60% de las a+ eran b+.
60% crecieron en MM+Amp. En cuanto a las bacterias transformadas con el vector
Vector 2: De las bacterias que crecieron en 2 el 55% de las bacterias b+ también eran a+, y el
MM+Amp+Leu+Lac, el 55% crecieron en MM+Amp 50% de las a+ eran también b+.
+Lac. La diferencia en los resultados obtenidos con ambos
vectores radica en que el vector 1 no contiene un pro-
Alu I Alu I motor por lo que la expresión de los transgenes se
P dará solo si vienen acompañados de su promotor. El
hecho de que todas las bacterias b+ sean también a+
nos indica que b se transcribe utilizando el promotor
de a sugiriendo que a y b forman parte de un operón.
En el caso del vector 2 dado que aporta un promotor
(y éste está encendido debido a la lactosa) sí se obtie-
nen bacterias a-b+.
AmpR AmpR f) Dado que, cuando se transformó con el vector 1, no
se obtienen bacterias a-b+ pero sí a+b- esto nos sugie-
P = promotor del operón re que no se necesita que se transcriba b para que se
Vector 1 lac Vector 2 transcriba a (pero sí al revés). Esto indicaría que a se
-De las bacterias que crecieron en MM+Amp+Val+ encuentra más próximo al promotor que b.
Lac, el 50% crecieron en MM+Amp+Lac. g) RT-PCR usando primers de la región 5´ del gen a y
d) ¿Cuáles son los genotipos de las bacterias que cre- de la región 3´ del gen b. Si amplifico es porque hay
cen en cada uno de los 3 medios? transcriptos que contienen al gen a y al b. Hay otras
e) ¿Cómo interpreta los resultados de este experimen- posibilidades que se evaluarán caso por caso…
to? Demuestre que estos resultados son compatibles 5) Se realiza un experimento
con la hipótesis de que a y b están en el mismo de transformación con una Antibióticos Nº colonias
operón. cepa bacteriana donante re- A 1.156
f) ¿Cuál de los genes está más cerca del promotor: a o sistente a cuatro antibióti- B 1.148
b? Justifique. cos: A, B, C y D. La cepa C 1.161
g) ¿Cómo haría, utilizando la técnica de PCR, para receptora es sensible a las D 1.139
demostrar que a y b pertenecen al mismo operón? In- cuatro drogas. La población AB 46
dique los resultados esperados tanto si a y b forman de células receptoras tratada AC 640
parte de un operón como si se transcriben indepen- se divide y se siembra en AD 942
dientemente. placas de medios suplemen- BC 51
Respuesta a) a+ StrR = MM + Str + Val + Ile tados con varias combina- BD 40
b+ StrR = MM + Str + Leu + Ile ciones de las drogas. Los CD 786
c+ StrR = MM + Str + Leu + Val resultados fueron: ABC 30
b) a y b mapean a 12 min del OriT y C mapea a 6 min. a) Uno de los genes está cla- ABD 42
c) i) Se hubieran seleccionado a las bacterias dadoras ramente alejado de los otros
ACD 630
por lo que no hubiera habido diferencias entre los dis- tres, los cuales parecen estar
BCD 36
tintos medios ni tampoco entre los distintos tiempos. estrechamente ligados.
ii) Se hubieran obtenido muy pocas recombinantes ABCD 30
¿Cuál es el gen distante?
(aquellas en las que el plásmido F+ se hubiera incor- b) ¿Cuál es el orden de los Total 7.877
porado en la cepa dadora y luego los marcadores a, b tres marcadores que están ligados?
o c se hubieran transferido a la cepa aceptora). Rta: a) B es el gen distante; b) A D C.
iii) Dependiendo de la orientación del OriT hay dos 1) El Dr. Watson está estudiando un fago temperado
posibilidades: -que a y b salgan primero y bastante descubierto en su laboratorio (P26) con el objeto de
tiempo después salga c -que c salga primero y bastan- determinar si durante el ciclo lisogénico éste se inserta
te tiempo después salgan a y b. en el cromosoma bacteriano, y si lo hace en qué sitio.
En el gráfico tienen que quedar claro esto, y además Para ello infecta una cepa Hfr salvaje AmpS StrS con
que la frecuencia de recombinantes para los genes que un fago deficiente en el cual se ha reemplazado al gen
salen primero debe ser bastante mayor que la de los X (esencial para que el fago entre en ciclo lítico, pero
genes que salen al final. no para que entre en ciclo lisogénico) por un gen de
d) MM+Amp+Leu = a- b+ AmpR y a+ b+ AmpR. Es resistencia a ampicilina bajo el control del promotor
decir, b+ AmpR Lac (con su región operadora).
MM+Amp+Val = a+ b- AmpR y a+ b+ AmpR. Es a) ¿En qué medio de cultivo selecciona a las bacte-
decir, a+ AmpR rias Hfr que presentan el fago?
MM+Amp = a+ b+ AmpR Luego de seleccionar en medio sólido 15 clones Hfr
La lactosa no importa, sólo se usa para inducir la ex- lisogénicos y con el objetivo de determinar si el fago
presión mediada por el promotor lac. defectivo está integrado en el cromosoma y en qué
sito lo hace, conjuga, por separado, a cada Hfr lisogé-
17
nica con una cepa F- gal- leu- arg- AmpS StrR obte- más cerca (o más lejos) del sitio de integración del
niendo, en todos los casos, el mismo resultado: fago. Lo que sí debería ocurrir, es que en todos los
clones el gen de resistencia a ampicilina mapee cerca
Gal+
del gen leu.
Nº de recomb
Posición genética en cM
32
c) A cada RIL se les midió el peso corporal, El si- distribución poblacional de los distintos genotipos:
guiente esquema muestra el cromosoma 3 de las líneas ¿Cuál es la frecuencia del alelo apoE2?
W y L) y más abajo resume las RIL más informativas Genotipo E2E2 E2E3 E2E4 E3E3 E3E4 E4E4 Total
para localizar QTL. ¿Dónde están los QTL a lo largo N° indiv 2 64 7 684 169 11 937
del cromosoma (en cM) y cuál es el número mínimo a) 0,002 b) 0,040 c) 0,076 d) 0,175
de genes del cromosoma 3 que afectan al peso corpo-
Respuesta:b) [f(E2)= (2x2)+(64)+(7)/(937x2)=0,040]
ral? Pueden haber más QTLs en otros cromosomas –
Justifique brevemente. 2) Hagamos un poco de ciencia-ficción. Supongamos
que la ciencia médica avanzase hasta el punto de que,
14 con un tratamiento aplicado a lo largo de toda la vida,
13
12 la especie humana dejase de sufrir nuevas mutaciones.
11
10
Admitamos también que tal tratamiento se aplica a
9 toda la humanidad en el intervalo de una sola genera-
LOD 8
7 ción, y se mantiene así en lo sucesivo. ¿Qué ocurriría
6
5
con la variabilidad genética en las sucesivas genera-
4 ciones? ¿Aumentaría? ¿Desaparecería? ¿Se mantendr-
3
2 ía? Explíquese tanto como pueda.
1
0
Respuesta: Suponiendo panmixia, ausencia de selec-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
ción y el alto número poblacional de la especie, la va-
Posición en cM
riabilidad debería mantenerse constante (en equilibrio
de HW). Por lo tanto, se mantendría. Lo que se impe-
d) Dibuje una posible curva LOD en función de cM
que esperaría obtener, de acuerdo a su respuesta en diría es el surgimiento de potenciales nuevos alelos
“c”, en el siguiente gráfico si aplicara un método bio- inexistentes en la población actual.
informático tal como hicimos en el trabajo práctico 4) Según algunos las rubias (no teñidas) están conde-
sobre QTL. Considere que la línea horizontal es el nadas a la extinción cuando la población humana
umbral de significación (LOD = 3). mundial llegue a total panmixis. El alelo determinante
R) a) S = 2400 ug – 2000 ug = 400 ug del color rubio del principal gen involucrado en el
h2 = 10000 / 40000 = 25% color del cabello es de expresión recesiva.
R = h2 * S = 0.25 * 400 = 100 ug Si mediante un cálculo arbitrario estimamos que la
media esperada X1 = 2000 ug + 100 ug = 2100 ug cantidad de rubias/os es de 22 millones sobre una po-
b) VA = VP – VA = 40000 – 10000 = 30000 ug blación mundial de 6.600 millones y hay 50 millones
Como VG = VA, entonces H2 = h2 = 0.25 de heterocigotas.
c) Hay un solo QTL aproximadamente a 40 cM. Por a) ¿Cuál será la proporción de rubios cuando la pobla-
lo tanto el número mínimo de genes que afectan al ción llegue a equilibrio de Hardy-Weimberg?
carácter es 1. Deben haber más QTLs e otros cromo- b) ¿Qué proporción de rubios de la población tendrán
somas ya que este QTL no explica toda la diferencia los dos padres no rubios?
entre las líneas parentales W y L (4000 – 1000 ug). Rta: p=R+1/2H= 22/6600 +50/6600*1/2= 0,0071
d) Una posible curva esperada seria la siguiente. Lo q=1-p=0,9929
unico importante es que el LOD seria significativo En equilibrio H-W la población de rubios será
solo en el “intervalo” aproximado que consideraron p2=5*10-5
que era un QTL en la respuesta“c”. b) NO era necesario contestar. La respuesta era q2
14
2pq=0,014. La proporción de matrimonios (0,014)2=
13 2*10-4
12
11
Hijos ¼ * 2*10-4 = 5.10-5
10 1) Un investigador está estudiando una población de
9 peces que habita en una laguna ubicada en un oasis en
LOD 8
7 el desierto del Sahara. Se propone estudiar dos loci
6 correspondientes a dos enzimas en 1000 individuos:
5
4 Locus 1: A1A1: 640, A1A2: 320, A2A2: 40
3 Locus 2: B1B1: 400, B1B2: 580, B2B2: 20
2
1 a) Determine si los loci antes mencionados se encuen-
0 tran en equilibrio de Hardy-Weinberg. Evalúe estadís-
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ticamente su hipótesis.
Posición en cM b) En caso de que alguno/algunos de los loci no se
Genética de poblaciones encuentre en equilibrio, ¿cuál/cuáles pueden ser las
1) La apolipoproteína E (apoE) fue implicada como causas: falta de panmixia, selección o mutación? Justi-
un factor de riesgo en las enfermedades cardiovascu- fique tanto su elección como aquellas causas que des-
lares y en el Alzheimer. Se describieron 3 alelos co- carta.
munes: apoE2, apoE3 y apoE4. La tabla muestra la Respuesta:
a) Locus 1:
33
Frecuencias alélicas: A1=0,8, A2=0,2 razonable de por qué no existe el equilibrio en esta
Frecuencias genotípicas esperadas: población.
A1A1 = (0,8)2 x1000 = 640
A1A2 = 2x0,8x0,2 x 1000 = 320
A2A2 = (0,2)2 x 1000 = 40
X2 = 6402 / 640 + 3202 / 320 + 402 / 40 = 0 No re-
chazo Ho, por lo que este locus está en equilibrio de
H-W
Locus 2:
VC (valor crítico)=3,84 para 1 GL; VC=5,99 para 2
Frecuencias alélicas: B1=0,69 y B2=0,31
GL; VC=7,82 para 3 GL.
Frecuencias genotípicas esperadas:
b)¿Qué supuestos me permitirían a mí calcular, a par-
Frecuencias genotípicas esperadas:
tir de esta población, cuáles serían las frecuencias
B1B1 = (0,69)2 x1000 = 476
génicas dos generaciones después? ¿Y las genotípi-
B1B2 = 2x0,69x0,31 x 1000 = 428
cas? Explique su razonamiento. Aclaración: No se
B2B2 = (0,31)2 x 1000 = 96
pretende que esas sean realmente las frecuencias que
X2 = (476 - 400)2 / 476 + (428 – 580)2 / 428 + (96 –
va a tener la población en esa generación, sólo que
20)2 / 96 = 126,3
indique qué necesitaría un investigador para poder
Como este valor es mayor al valor crítico rechazo Ho
afirmar cuáles serían.
este locus no se encuentra en equilibrio de H-W.
1) a) observado
b) Falta de panmixia: es poco probable que esta sea la
a1a1 a1a2 a2a2
causa ya que el locus 1 está en equilibrio y si no
100 120 80
hubiera panmixia también afectaría las frecuencias
p= 0,53333333
genotípicas de este locus.
q= 0,46666667
Selección: Es posible. Por ejemplo, el genotipo B2B2
Esperado bajo H-W
podría estar desfavorecido frente a los otros dos geno-
a1a1 a1a2 a2a2
tipos ya que su frecuencia es mucho menor de la espe-
85,33 149,33 65,33
rada. 2
X = 11,5752551
Migración: no puede ser ya que se trata de un oasis
No está en equilibrio (VC=3,84)
aislado en el desierto.
Posible explicación: lo más probable es que no exista
Mutación: Poco probable ya que para que las frecuen-
panmixia y que haya algo de endogamia (por ejemplo,
cias genotípicas observadas se deban a mutación
porque las plantas poseen algún grado de autofecun-
aproximadamente 80 de los 620 alelos B2 estudiados
dación facultativa, o porque sus semillas no se disper-
deberían haber mutado a B1, es decir que se requerir-
san tanto). Esto se justifica porque hay exceso de
ían tasas de mutación muy altas (más del 10%). Sin
homocigotas. Otras explicaciones menos probables:
embargo, no podemos descartar una mínima contribu-
diferencia entre sexos. (en este caso, si hubiera pan-
ción de las mutaciones a las frecuencias observadas.
mixia, sólo se tardaría dos generaciones en alcanzar el
5) Un estudioso de las plantas Florecitus lindus, des-
equilibrio, sería raro que el investigador justo hubiera
cubre una población silvestre en una apartada región y
encontrado la población en ese punto)
decide investigar sus características.
b) En ausencia de mutación, migración, selección y
Primero decide realizar un muestreo al azar de la po-
deriva, las frecuencias génicas serían las mismas que
blación, para lo que extrae ADN de 300 plantas. En-
ahora. Si además, hubiera panmixia, las frecuencias
tonces, entre otros estudios, analiza un carácter de im-
genotípicas serían las del equilibrio.
portancia ornamental, la presencia de un patrón de-
6) En 1960 el cacique de una tribu localizada en una
terminado de coloración en la flor. Por estudios pre- lejana isla del pacífico, preocupado por la gran canti-
vios en el género, sabe que ese carácter está determi- dad de enfermedades de origen genético presentes en
nado por un único gen autosómico y bialélico (siendo la población de la isla recurrió al Dr. Boyd. Éste estu-
la presencia del patrón de coloración dominante sobre dió la distribución de alelos de grupos sanguíneos MN
su ausencia). Como la planta florece cada tres años, y (los individuos son MM, MN o NN), obteniendo los
aún no está en floración, decide utilizar un marcador siguientes resultados: MM: 520, MN: 160, NN: 320
molecular RFLP localizado en el gen. Obtiene tres a) ¿Se encuentra la población en equilibrio de Hardy-
tipos de patrón de bandas. El primero, que por sus es- Weinberg con respecto a los grupos sanguíneos MN?
tudios está asociado con el patrón de color, aparece en Verifique estadísticamente.
100 individuos. El segundo patrón lo tienen 120 indi- b) ¿Hay mayor, menor o igual homocigosis que la es-
viduos y el tercero, sólo 80. perada por Hardy-Weinberg?
a) ¿Esta población se encuentra en equilibrio de Har- Sorprendido por estos resultados el Dr. Boyd decidió
dy-Weinberg para este carácter? Si la respuesta es averiguar un poco más sobre esta tribu, y encontró que
afirmativa, explique por qué cree usted que se mantie- la misma está dividida en 5 castas. Los matrimonios
ne en ese equilibrio. Si no lo es, dé una explicación entre personas de distinta casta estaban terminante-
mente prohibidos. Reanalizando sus datos, ahora te-
34
niendo en cuenta las castas a las que pertenecían las
personas, notó que dentro de cada casta se cumplían
las frecuencias de H-W.
c) ¿Cómo explica este último resultado en relación a
su respuesta de la pregunta “a”? ¿Qué supuestos no se
cumplen en la población total?
d) ¿Por qué le parece que hay tantas enfermedades
genéticas en la población?
Debido a estos hallazgos el Dr. Boyd recomendó al
cacique que quitara toda restricción en cuanto a los
matrimonios, lo cual el cacique acató inmediatamente. ¿Cuál es el tipo de herencia más probable para la
En 1980 el Dr. Boyd regresó a la tribu y notó que a
NOHL en la especie humana? Explique su razona-
pesar de que la población general no se encontraba en
equilibrio de Hardy-Weinberg, si sólo analizaba las miento.
muestras de sangre de los menores de 20 años ajusta- Según su hipótesis complete la 2° genealogía indican-
ban perfectamente a dicho equilibrio. do los individuos afectados.
e) ¿Cómo puede explicar este último resultado?
R) a) M = (520 + 160 /2) / 1000 = 0,6
N = (320 + 160/2) / 1000 = 0,4
Si la población se encontrara en equilibrio de H-W las
frecuencias genotípicas deberían ser:
MM = 0,62 * 1000 = 360
MN = 2 * 0,6 * 0,4 * 1000 = 480
NN = 0,42 * 1000 = 160
X2 = (520-360)2 /360 + (160-480)2 / 480 + (320-160)2
/ 160 = 444,4
Como es mayor que X21,0,05 entonces rechazamos la
hipótesis. Es decir la población no se encuentra en Respuesta: Observamos que todos los descendientes
equilibrio de H-W. independientemente de su sexo, muestran el fenotipo
b) Dado que los homocigotas esperados son 520 mien- de la madre. [Esto no podemos explicarlo si el carác-
tras que los observados son 840 podemos decir que ter estuviera en los cromosomas sexuales, ya que el
hay mayor homocigosis que la esperada por H-W. fenotipo de la descendencia no depende de si el carác-
c) Dado que están prohibidos los matrimonios entre ter es dominante o recesivo, o de la dirección del cru-
castas no hay panmixia. Por lo tanto aunque cada cas- zamiento, sino sólo del fenotipo de la madre]. Por lo
ta se encuentre en equilibrio de H-W la población to- tanto podríamos asegurar que este carácter es un caso
tal no lo está. Esto también explica la mayor homoci- de herencia materna.
gosidad respecto de lo esperado por H-W ya que están En B se sombrean: II 2, 3, 5; III 1, 3, 4, 8,10,11; IV
favorecidos los matrimonios co-sanguíneos. todos
d) La alta homocigosidad debida a la endogamia hace 2) El siguiente árbol muestra una familia que hereda
que sea más probable que una persona sea homocigota una forma severa de hidrocefalia causada por una mu-
para alelos recesivos responsables de una enfermedad tación en el gen L1CAM (localizado en el cromosoma
hereditaria. X) y que presenta una herencia recesiva. Utilizando
e) Al quitar la restricción en la elección de pareja, y un marcador intragénico que tiene tres alelos (12, 8 y
suponiendo que a partir de dicho momento hubo pan- 7) se hace el diagnóstico del propósito (nombre que
mixia, las frecuencias genotipicas de aquellos que na-
reciben los “pacientes” por parte de los genetistas
cieron bajo el nuevo régimen (los menores de 20
años) se ajustarán a H-W. Sin embargo, en la pobla- médicos y que se indica con una flecha).
ción general no sucede los mismo debido a que el
grupo de personas que nacieron antes (y que todavía
están vivos al realizar el análisis poblacional) presenta
las proporciones genotípicas que no ajustaban a H-W.
Genéticas no Mendelianas
1) La neuropatía óptica hereditaria de Leber (NOHL)
es una enfermedad rara en la especie humana que pro-
duce una rápida atrofia del nervio óptico y que genera
ceguera en adultos jóvenes. Esta enfermedad está ca-
racterizada por una pérdida bilateral de la visión cen-
tral mientras que se mantiene la visión periférica. La
1° genealogía muestra la herencia de esta enfermedad
en una familia bastante amplia: ¿Cuál fue el resultado del diagnóstico?
a) La propósito es portadora del alelo mutante
b) La propósito es heterocigota no portadora
35
c) La propósito es homocigota para el alelo normal monoploide)]. Por lo tanto, las frecuencias alélicas
d) El resultado no permite dar un diagnóstico preciso son iguales a las genotípicas f(LHON) = 0,3%
sobre el genotipo. F(normal) = 0,97%
Respuesta: b) b) A las mujeres (y no a los varones) porque se trata
3) En el antiguo testamento, Dios dispuso que los de una herencia materna, no hay necesidad de evitar la
hijos de Isaac y su mujer constituirían la nación judía. reproducción de los varones dado que no transmiten la
Sin embargo, la esposa de Isaac era bastante mayor y enfermedad
supuestamente infecunda. Según las costumbres loca- c) Después de la selección negativa la segregación
les de la época, ella eligió una mujer alternativa con la somática de los heteroplásticos y la aparición constan-
que Isaac tuvo un hijo: Esaú. Un día, la anciana mujer te de nuevas mutaciones similares llevarían la enfer-
le comentó a Isaac que estaba encinta y tuvo un hijo: medad genética a las mismas cifras actuales (después
Jacobo. Posteriormente, Jacobo se casó con 5 herma- de algunas pocas generaciones)
nas (de otra familia) y tuvo 13 hijos y varias hijas. 5) El señor señalado con un círculo rojo tiene una rara
Suponiendo que pudiera acceder a muestras de tejido enfermedad genética y le pregunta: -Vos que hiciste
de Isaac, Esaú, Jacobo y de los hijos de Jacobo y, un curso rápido de genética ¿me podrás averiguar qué
además, pudiese extraer DNA y analizarlo: probabilidad tengo de transmitirle esta enfermedad a
a) ¿Cuántos haplotipos o secuencias nucleotídicas di- mis futuros hijos?
ferentes en la región del cromosoma Y en la región
del gen Sry obtendría? Justifique.
b) ¿Cuántos tipos de secuencias nucleotídicas diferen-
tes del D-loop de DNA mitocondrial obtendría? Justi-
fique.
Solución: a) Uno sólo: el que proviene de Isaac
(herencia ligada al sexo, etc….)
b) 4: el de Isaac (donado por su madre), el que provie-
ne de la madre de Esaú, el que proviene de la madre
de Jacobo y el que proviene de la madre de las 5 her-
manas (herencia materna...)
4) Aproximadamente el 0,3% de la humanidad tiene
una enfermedad genética leve llamada LHON produ-
cida por una mutación que substituye una Asn por una Mi señora no posee esta enfermedad pero ¡con la
Asp en el complejo NADH mitocondrial. genética nunca se sabe!. ¿Me tendré que hacer un aná-
a) ¿Cuáles son las frecuencias genotípicas para este lisis yo o mi señora?
carácter? ¿Serían distintas a las frecuencias alélicas? ¿Le podrá contestar sin necesidad de pedirle un análi-
¿por qué? sis genético detallado (pedigrí) a la señora? Justifique
b) Si apareciese una corriente eugenésica que preconi- brevemente.
ce “mejorar” la raza humana que proponga eliminar Rta: La probabilidad es nula porque se trata de un
las enfermedades genéticas por métodos drásticos claro ejemplo de herencia materna. No requiere de
¿deberían prohibir tener hijos a todos los individuos más análisis.
con síntomas de LHON?¿por qué? Atención: ignore Respuestas alternativas válidas a esta pregunta (no
los datos que se enumeran a continuación para contes- pedidas):
tar esta pregunta. a) Imprinting materno
Gracias a los conocimientos adquiridos en genética I y b) podría ser un gen autonómico recesivo
para buscar argumentos científicos para enfrentar al En el caso b), SÍ debería hacer análisis genéticos.
movimiento eugenésico a Ud se le ocurre hacer 2 6) En la siguiente genealogía los símbolos en negro
estudios: i) diagnóstico molecular confirmatorio y ii) denotan la condición patológica de una enfermedad
cuantificación de la frecuencia de aparición espontá- con baja incidencia en la población, que afecta ma-
nea de esta mutación. En el primer caso encontró que, yormente a hombres. Justifique todas sus respuestas.
además de los enfermos, existen individuos con la a) ¿Cuáles de los siguientes tipos de herencia puede
mutación pero asintomáticos (debidos a heteroplas- descartar: herencia mendeliana, ligada al sexo, li-
mia: presencia de mitocondrias con genotipo normal y gada al cromosoma Y, limitada por el sexo, in-
mutante en una única célula) y en el segundo que la fluenciada por el sexo, herencia materna, influen-
misma es significativa. cia materna?
c) Argumente por qué estos estudios demostrarían la b) De las posibilidades que no descartó, ¿cuál le pare-
inutilidad práctica de encarar la selección negativa ce más probable?
propuesta por los eugenésicos. c) asumiendo como cierta la hipótesis que esco-
Respuestas: a) Este es un carácter mitocondrial por lo gió en el punto b), ¿cuál sería el genotipo de los
que, salvo algún caso raro de heteroplasmia, el alelo distintos individuos de la genealogía? Tenga en
está presente o ausente (como si fuera una especie
36
cuenta que en algunos casos puede haber más de dos diferentes, apareciendo animales con un fenoti-
una opción posible. po en mosaico llamado “carey”, formado por pelos
d) Si los individuos que poseen el asterisco se negros y naranjas distribuidos en forma aleatoria en
casan, cuál es la probabilidad que tengan un todo el cuerpo
hijo que porte el alelo enfermo? Hembras F1 Machos F1
I Cruza- Hem- Ma- negro naranja carey negro naranja
miento bras chos
II 1 negro negro 48 46
2 naranja negro 16 20
III 3 carey naranja 47 43 38 54
4 carey negro 12 21 29 35
IV * a) ¿De qué tipo de herencia se trata?
b) ¿Por qué sólo aparecen hembras carey y no así ma-
V * chos?
Respuesta: c) ¿Cuál es la relación de dominancia entre los genes
a) Herencia mendeliana: no la puedo descartar, podría que condicionan estos colores?
tratarse de una enfermedad recesiva. 2) a) Que los dos cruces recíprocos den resultados
Ligada al sexo: puede ser diferentes indica, en principio, herencia en relación
Ligada al Y: No puede ser porque sino el hijo varon II con el sexo. Fijándonos en los machos de la F1; su
debería ser enfermo y el V no debería serlo. fenotipo es igual al de su madre, típico deherencia
Limitada por el sexo: no puede ser porque según el cruzada. Los hijos reciben el cromosoma X de la
enunciado en la población también hay mujeres en- madre con el alelo para negro o para
fermas. naranja, sin embargo, las hijas presentan el mismo
Influenciado por el sexo: puede ser fenotipo «carey» en ambos cruces. De acuerdo con la
Herencia e influencia materna: no porque las madres hipótesis de herencia ligada al sexo, las hijas del pri-
de los enfermos no están enfermas y el que introdujo mer cruce tienen que ser heterozigotas, con un cro-
el alelo que da la enfermedad fue el padre de las gene- mosoma X materno portador del alelo para negro y
ración I un cromosoma X paterno con un
b) Es un gen ligado al cromosoma X. Podría ser un alelo para naranja. En las hembras heterozigotas se
gen autonómico recesivo, pero eso sería posible si expresarían los dos alelos, produciendo dicho fenoti-
todos los matrimonios se dieron con personas hetero- po en mosaico. Esto se debe al fenómeno de inactiva-
cigotos para la enfermedad y si ésta es rara como dice ción aleatoria de uno de los dos cromosomas X de la
el enunciado esta alternativa es muy poco probable. hembra, que se produce en fases tempranas del desa-
También podría ser influenciado por el sexo. rrollo (Lionización).
c) b) El resultado de los cruces 3 y 4 nos ayudará a con-
firmar la hipótesis. Una hembra «carey», será hetero-
I A a a zigota para negro y naranja (X neXna), y tendrá hijos
X X XY
tanto negros (XneY) como naranjas (XnaY), que es lo
que ocurre en los dos cruces. Una hembra «carey» cru-
II
XAXa XAY XAXa XAY XAXa zada con un macho naranja tendrá hijas tanto «carey»
como naranja:
ne na
III a a aX X x XnaY = XneXna + XnaXna + XnaY + XneY
X Y XAXa XAY XAX-- A X Y
XAY X Y X X
A a
XAXa X Y carey naranja = carey + naranja+ naranja
IV +negro
XAY XAXa XAXa XAYXAX-- XAY XaY XAXX *
-- A XaY
Y Xa
Y En el cruce hembra «carey» con macho negro la dife-
? rencia es que en lugar de hijas naranjas aparecen, lógi-
V * camente, hijas negras, siendo todo lo demás igual.
XaY XAX-- XAX-- Los machos, al ser hemizigotos, serán siempre X naY
?
ne
d)La probabilidad de que la mujer sea heterocigota es (naranjas) o X Y (negros), pero nunca podrán ser
½ (dado que recibió XA del padre y existe ½ de proba- «carey».
bilidad que haya recibido Xª de la madre) y la proba- c) Aunque negro y naranja son alelos del mismo gen,
bilidad de que siendo heterocigota transmita el alelo no se puede hablar estrictamente o deducir relaciones
enfermo es ½. Por lo tanto la probabilidad de que un de dominancia/recesividad, de herencia intermedia o
hijo varón porte un alelo enfermo es ¼. de codominancia, ya que en cada célula que produce
9) El Dr. Visen publicó hace años los resultados de la pelo se manifiesta uno u otro alelo, en los machos de-
herencia del color del pelaje de los gatos. Su primera bido a la hemizigosis y en las hembras heterozigotas
observación fue que el pelaje puede ser de color negro debido a la inactivación de uno de ellos.
o naranja, entre otros. Posteriormente al cruzar gatos 10) En plantas de maíz con citoplasma de tipo T se ha
con estos colores los cruces recíprocos dieron resulta- identificado un gen (urf13) cuya expresión induce la
37
androesterilidad. Asímismo para este tipo de plantas nominó alz) mapea en el cromosoma 3, flanqueado
se han identificado dos genes restauradores nucleares a 10 cM y 13 cM por dos marcadores RFLP humanos
dominantes (Rf1 y Rf2) cuya expresión concertada denominados hs3 y hs1, respectivamente (Fig. 1) (No-
restaura la fertilidad, no habiendo restauración si sólo ta: fue posible usar sondas humanas ya que muchas
se expresa uno de estos genes. El gen Rf1 fue el pri- sondas de esta especie hibridan con DNA de ratón
mer gen restaurador aislado y caracterizado molecu- debido a su alto grado de parentesco). Recientemente,
larmente. Si se dispone de una planta con citoplasma un grupo de investigación, clonó molecularmente en
T, homocigota para el gen Rf1 dominante, descono- humanos, un gen (gdm) involucrado en la regulación
ciéndose su constitución genética para el locus Rf2,
de la producción de mielina a nivel cerebral y lo ma-
a) Indique cual/es de las siguientes líneas de maíz
peó en el cromosoma 8, flanqueado a 12cM y 15cM,
utilizaría en sus experimentos para determinar la
composición alélica del locus Rf2 en la planta incóg- por los mismos marcadores hs3 y hs1. En la publica-
nita. Justifique su respuesta, indicando qué planta ción de dicho trabajo, los autores reportaron la locali-
usaría como padre y como madre en sus experimentos zación cromosómica del gen y su secuencia completa.
de cruzamiento, cómo espera que sea la descendencia Al leer este trabajo, se sospechó (y con fundamento)
en caso de que la planta a la que se le quiere determi- que el gen de ratón podría ser un homólogo del gen
nar el genotipo sea rf2rf2, Rf2rf2 o Rf2Rf2 y por qué humano. Lamentablemente ambos grupos nunca cola-
descarta las plantasno elegidas. boraron para que esto se pudiera demostrar.
i. T rf1 rf1 Rf2 Rf2 iv. N Rf1 Rf1 rf2 rf2 a) ¿Cuáles fueron los fundamentos de la sospecha?
ii. N rf1 rf1 Rf2 Rf2 v. T Rf1 Rf1 b) ¿Qué estrategia utilizaría usted para clonar, al me-
Rf2Rf2 nos parcialmente, al gen supuestamente homólogo de
iii. T Rf1 Rf1 rf2 rf2 vi. N Rf1 Rf1 Rf2 ratón (recuerde que el gen de ratón está mapeado pero
Rf2 no está secuenciado y no se sabe si la similitud de se-
Nota: N corresponde a citoplasma normal, T corres- cuencia es alta, ni tampoco si hibridan entre sí)?
ponde a citoplasma androestéril. c) ¿Cómo verificaría, funcionalmente, si el gen de
b) Un mejorador recibe una planta con una nueva humanos cumple la misma función que su homólogo
fuente de androesterilidad citoplasmática y al cruzarla en ratones? Diseñe un experimento recordando que
con una línea restauradora para los genes Rf1 Rf2 ob- los genes y las proteínas humanas son funcionales en
tiene toda la descendencia estéril ¿Cómo explica este
ratones y viceversa.
resultado?
R) a) Utilizaría la planta iv como padre que es fértil Fig. 1
cM
(citoplasma normal) y aparte es homocigota dominan- cM
te para RF1 (este locus no está en estudio pero es ne-
cesario para restaurar fertilidad) y rf2 doble recesivo
para evaluar la composición de la descendencia al
cruzarlo por la planta incógnita (T Rf1Rf1 -- --) hs3
Si la descendencia es 100% estéril, la planta era T hs3 12
10
Rf1 Rf1 rf2 rf2 (Rf1 solo no restaura la fertilidad) gdm alz
13 15
Si la descendencia es 100% fértil la planta era T
Rf1Rf1 Rf2Rf2 hs1 hs1
Si la descendencia es 50% esteril, 50% fértil, la planta
era T Rf1Rf1 Rf2rf2
Las otras líneas no darían resultados conclusivos
i), iii): no dan polen viable
ii) , v), vi): toda la descendencia es fértil pero no se
puede establecer que alelos Rf2/rf2 componen el lo- Humano Ratón
cus incógnita Respuesta: a) La sintenia evolutiva (conservación
b) Es portadora de un gen de androesterilidad distinto filogenética de mapas genéticos entre especies empa-
al urf13 para el cual la línea retauradora no posee el
rentadas) y, tal vez, las características de los genes en
gen restaurador necesario
cuanto a su rol fisiológico.
Genómica b) Clonado posicional (cualquiera de sus variantes es
1) Mediante el uso de marcadores moleculares se correcta). Otras alternativas de clonado ingeniosas
construyó un mapa de ligamiento del ratón, usando pueden llegar a aceptarse.
como genotipos parentales de la población de mapeo a c) Hacer estudios de complementación en ratones
dos líneas endocriadas que presentan una marcada transgénicos (alz/alz, es decir homocigotas recesivos)
diferencia respecto a su predisposición a contraer usando el gen humano como transgén. Espero que a
Alzheimer experimental (enfermedad caracterizada ninguno se le ocurra hacer humanos transgénicos para
por una acelerada desmielinización a nivel cerebral). Alzheimer…..
Se localizó en dicho mapa de ligamiento, además, un 2) El clonado molecular de genes de resistencia (R) a
locus (gen de expresión recesiva) involucrado en di- enfermedades en plantas es un viejo objetivo de los
cha predisposición. El mencionado gen (al que se de- fitopatólogos que trabajan en interacción huésped-
38
patógeno. A fines de los ’90 se clonaron los primeros especiales? ¿Se requiere, dentro de lo anterior, mo-
genes R por estrategias de clonado posicional (ver dificar el promotor y el terminador? ¿Por qué? ¿Se
figura) y en la actualidad ya hay decenas de estos ge- debe tener alguna consideración acerca del genotipo
nes en el GeneBank y otras bases de datos. Ud se in- que se va a transformar? Es decir ¿se puede usar un
volucra en un proyecto de este tipo para su tesis y tie- clon de la misma planta que se usó para clonar el gen
ne que resolver un número de cuestiones: de resistencia?
En el último paso (el ) se secuencian los insertos, se
identifican las ORF (secuencias abiertas de lectura)
presentes, las que se constituyen en candidatos a ge-
nes R.
f) ¿Cómo se identifica una secuencia ORF en un in-
serto?
g) ¿y si hay más de una, cómo me doy cuenta de la
correcta?
h) Bioinformáticamente ¿de qué manera puedo asig-
narle una posible función al gen?
Rta: a) Genómicos porque tengo representada una
copia exacta del segmento cromosómico que estoy
identificando, incluyendo regiones no codificantes
que me van a servir para empalmar (identificar sola-
pamientos entre clones) las secuencias con las que se
arma el mapa físico de la región. Si usara clones de
cDNA, no podría empalmar un clon con otro porque
no habría secuencias comunes entre ellos.
b) BACs o YACs porque son los que me permiten
contener insertos más grandes y así poder tener re-
prensada la región cromosómica en el menor número
de clones posible.
c) Las sondas utilizadas para RFLP pueden utilizarse
En el paso se identificaron marcadores moleculares
como sondas para inspeccionar (“screenear”) la geno-
ligados al locus a distancias genéticas del orden de los
teca y así identificar los clones que se corresponden al
10 cM. En el paso se obtuvieron marcadores más
segmento cromosómico en estudio. El ordenamiento
cercanos de forma tal de disminuir las distancias físi-
de los insertos lo puedo deducir de estas hibridacio-
cas para que en el paso poder trabajar con un
nes. Sé que el orden deducido del mapa genético es
número no muy grande de clones.
M1-M3-M4-M2. El mapa físico, en cambio, sólo me
a) ¿Con qué tipo de colecciones (libraries) de clones
permite ubicar M3 y M4 porque no tengo clones que
se trabaja para hacer esto?
abarquen a M1 y M2 (+ el gen que quiero clonar) y
i) genómicos
sean contiguos a M3 y M4. Por lo tanto, el inserto del
ii) o de cDNA
clon 1 (que sólo hibrida con M3) tiene que estar ubi-
y ¿por qué?
cado en un extremo y así sucesivamente. La ocurren-
b) ¿Qué tipo de vectores se utilizan (plásmidos, fagos,
cia de insertos que hibridan un marcador y al gen
cósmidos, BAC o YAC) y porqué?
(clones 3 y 4) facilitan este ordenamiento.
c) Suponiendo que los marcadores moleculares em-
d) 600-700 kpb / 0,2 cM = 2000 – 3500 kpb
pleados (M1, M2, M3 y M4) son RFLPs ¿Cómo se
Porque uma proviene del mapeo genético que se reali-
hace (metodológicamente) para identificar los clones
za mediante cruzamiento y recuento de recombinantes
1, 2, 3 y 4 de la figura y su ordenamiento posicional
(unidades de recombinación o cM) y la otra por ma-
(mapa fisico)?
peo de restricción donde se comparan los tamaños de
d) ¿Cuál es el tamaño físico aproximado (en kilo-
los insertos com estándares de tamaño molecular en
pares de bases) de 1 unidad de mapa genético (1 cM)
kilo pare de bases.
en el ejemplo de la figura?
e) Si se decide utilizar transformación mediada por
¿Por qué esta diferencia de unidades? ¿Cómo se mide
Agrobacterium tumefaciens, se requiere subclonarlo
cada una de ellas?
en un vector Ti. En el caso de usar biolística (cañón
Una vez identificados los clones correspondientes a
génico), no haría falta subclonar en ningún vector es-
esta región cromosómica, sus insertos se subdividen
pecial. No se requiere cambiar secuencias regulatorias
en tamaños más chicos (paso ) para su subclonado y
porque estamos trabajando con genes y secuencias
transferencia a plantas (paso ) para evaluar a estas
nativas y el experimento no requiere cambiar la regu-
últimas fenotípicamente como R (resistentes) o S
lación de su expresión. No se puede elegir un clon de
(sensibles) a la enfermedad.
la planta de la cual se clonó el gen porque sería resis-
e) Para introducir los segmentos de ADN en plantas
tente independientemente del inserto que se le intro-
¿se requiere de algún paso de subclonado en vectores
39
duzca. Debería elegirse un genotipo susceptible a la M2 separados entre sí por 0,3 cM (aproximada-
enfermedad. mente 600.000 pb). Después, el Dr. Lirón construyó
f, g y h) Identificando codones de iniciación (ATG) y una genoteca de BAC y encontró 4 BACs solapantes
terminación (alguno de los 3 codones STOP) con pro- (A-D) que abarcaban toda la región entre los marcado-
gramas informáticos. Esto se podría complementar res M1 y M2:
mediante la identificación de secuencias consenso de 100 kpb
promotores, terminadores, splicing, etc.Mediante el
uso de BLAST y comparación con otras secuencias ya
publicadas. M1 M2
3) Dos variedades puras de maíz (A y B) pueden ser
distinguidas por una serie de RFLPs, los cuales dan
los siguientes patrones:
A
B
C
D
Con estos BACs (que habían sido obtenidos utilizando
DNA genómico de un ratón sleepy homocigota) el Dr.
Lirón generó 4 líneas transgénicas (una para cada
BAC: LA, LB, LC y LD respectivamente) transfec-
Un consorcio internacional de secuenciación del ge-
tando células de un ratón salvaje. Los ratones de las
noma del maíz de otra variedad, le pide que usted le líneas LB y LC tuvieron un sueño reducido de 2
envíe sondas para poder “anclar” una colección de horas, igual a la de sleepy mientras que los ratones de
BACs al mapa genético. Usted conoce la localización las líneas LA y LD presentaban duraciones de sueño
en el mapa genético de los 7 RFLPs de la figura y sa- similares a los normales.
be, además, que las enzimas utilizadas no cortan de- c) ¿Qué características deberían tener los marcadores
ntro de los fragmentos utilizados como sonda. ¿Cuáles moleculares utilizados por el Dr Lirón para realizar
sondas enviaría y por qué? este mapeo? ¿De qué tipo de marcadores se trataría,
Rta: Enviaría las sondas correspondientes a los probablemente? ¿Cómo explica los resultados obteni-
RFLPs 213, 48 y la 1112 dado que parecen ser de co- dos? ¿En qué región del mapa que se presenta se en-
pia única. Evitaría las demás porque parecen hibridi- cuentra el gen mutado?
zar con más de una región del genoma y por lo tanto d) ¿Hubiera obtenido los mismos resultados transfec-
podrían inducir al error al hibridizar con BACs que tando ratones sleepy con BACs procedentes de ratones
no son contiguos. salvajes? ¿Por qué?
4) El Dr. Lirón estudió la duración de la fase alfa en el Durante el tiempo que le tomó realizar todos estos
sueño de ratones y encontró un mutante, al que llamó experimentos, salió publicado el borrador del genoma
sleepy, cuya fase alfa duraba 2 horas, mientras que en de ratón (salvaje) por lo que, basado en la secuencia
los ratones salvajes la misma es de 4 horas. Al cruzar de la región en la que determinó que estaba su gen
un sleepy con otro ratón salvaje, la mitad de los des- mutante, encontró 3 posibles genes.
cendientes resultó mutante y la mitad salvaje. MM_213: secuencia homóloga a un gen de Danio re-
a) El ratón analizado ¿era homocigota o heterocigota rio (pez cebra) pero careciendo promotor.
para el gen sleepy? ¿Se trata de un alelo dominante, MM_437: gen constitutivo involucrado en la glucóli-
recesivo, codominante o semidominante? Justifique su sis.
respuesta. MM_854: gen de función desconocida que presenta
Al concurrir a un congreso internacional de sonambu- enhancers propios de genes que se expresan en el sis-
lismo, Lirón se encuentra con un colega que encontró tema nervioso central.
otro mutante similar. El investigador decide verificar e) ¿Cómo se hizo, bioinformáticamente hablando, pa-
si el gen involucrado es el mismo que él encontró. ra adjudicar estas funciones hipotéticas a estos 3 ge-
Para ello, utiliza una línea homocigota para el gen nes? Explique, si resulta pertinente, si debe emplear
sleepy y la cruza con los ratones, también homocigota técnicas moleculares adicionales y programas in-
para el gen en cuestión, del colega. Todos los ratones formáticos.
de la F1 tuvieron sueño alfa reducido. Luego cruzó la f) ¿Cuál o cuáles elegiría como genes candidatos a
F1 con ratones salvajes. De los 200 descendientes que estar relacionados con el sueño?
obtuvo, 180 presentaron sueño alfa reducido mientras Respuestas esperadas:
que 20 presentaban sueño normal. a) Heterocigota. Si estas mutaciones se pueden detec-
b) Los alelos mutantes encontrados ¿pertenecían am- tar fenotípicamente es porque son dominantes.
bos al mismo gen? Justifique su respuesta. En caso b) Si se tratara del mismo gen la F1 tendría ambos
que los genes fueran distintos ¿estarían ligados? ¿a alelos del mismo gen mutantes (homocigota). Al rea-
qué distancia? lizar la cruza de la F1 con una cepa salvaje, todos los
El siguiente objetivo del Dr. Lirón decidió mapear el ratones (salvo que haya recombinación intragénica
gen mutado. Para ello, utilizando 200 marcadores mo- que es muy poco probable) resultarán heterocigotos:
leculares, logró ubicarla entre dos marcadores M1 y -la mitad para la mutación de la línea sleepy
40
-la otra mitad para la mutación de la línea del colega de hecho posiblemente dicha mutación sea letal en
Dado que ambas mutaciones son dominantes, todos homocigosis.
los ratones de la descendencia deberían tener sueño El MM_854 es un buen candidato porque es un gen
reducido. Dado que éste no es el caso (hay un 10% de que posiblemente se exprese diferencialmente en sis-
ratones salvajes) podemos descartar que se trate del tema nervioso central.
mismo gen. 5) Carol Martinson recibió unas muestras de aránda-
Si el gen mutado es el C/c y el mutado en la otra línea nos de un productor que aducía que las plantas que
es el R/r entonces la F1 de la cruza será CcRr. Al cru- había comprado en la empresa Truchex (SRL, Socie-
zar con ratones salvajes (ccrr), si los genes no están dad de responsabilidad MUY limitada) no rendían ni
ligados tendremos ¼ CcRr, ¼ Ccrr, ¼ ccRr y ¼ ccrr tenían la calidad prometida. Para genotipificar, Carol
donde todos los genotipos salvo el ccrr (que tiene comparó los patrones de marcadores moleculares con
memoria normal) tienen memoria reducida (algunos la muestra problema (número 2, supuestamente perte-
genotipos más que otros). Es decir que si los genes no neciente a la variedad O’Neil) con muestras de mate-
están ligados esperaríamos tener ¼ de ratones con rial de multiplicación del INTA Concordia de O´Neal
memoria normal, lo cual no es el caso. Por lo tanto, y de otra variedad muy usada (Misty), tanto de mate-
los genes están ligados. rial in vitro como de las plantas derivadas de micro-
CCrr x ccRR propagación puestas a campo, obteniendo el siguiente
C r x c r electroforetograma:
c R c r
Las gametas parentales del cruzamiento prueba son Cr
y cR mientras que las recombinantes son CR y cr. Da-
do que en la descendencia del cruzamiento prueba 20
individuos son ccrr, entonces un 10% de las gametas
producidas por la F1 son cr. Un porcentaje equivalen-
te debe ser CR que es el producto complementario de
recombinación. Es decir que el 20% de las gametas
son recombinantes con lo que la distancia entre los
genes es de 20 u.m.
c) Debió utilizar marcadores STS, es decir marcadores
de localización única.
Si un BAC porta el alelo mutante al generar la línea
transgénica, ésta tendrá insertado en algún lugar del
genoma. Como el alelo mutante es dominante se va a
poder expresar aún en presencia de uno (suponiendo
reemplazo alélico) o dos (suponiendo integración
ectópica) copias del alelo salvaje.
Dado que los BACs B y C presentan el fenotipo mu-
tante ambos BACs contienen al gen completo. Por
este motivo podemos localizar al gen en la zona de
solapamiento de los BACs B y C (de aproximadamen- Fig Patrones de amplificación de RAPDs. Las diferen-
te 100 kpb). tes calles representan los productos de amplificación
d) No, si hubiese usado BACs procedentes de ratones obtenidos para las distintas muestras: 1 (O’Neal, certi-
salvajes para transfectar ratones sleepy, los ratones ficado, in vitro), 2 (supuesto O’Neal), 3 (O’Neal de
transfectados hubiesen sido todos con fenotipo sleepy campo), 4 (Misty de campo) y 5 (Misty, certificado, in
ya que este alelo es dominante sobre el alelo normal. vitro).
e) Se secuenció la región de solapamiento de los clo- a) ¿Qué significan las bandas marcadas con flechas
nes BAC B y C, subclonados en vectores plasmídico, negras que Carol dibujó sobre la foto? ¿En qué se di-
se realizó un ensamblado de los mismos y los contigs ferencian de las bandas marcadas con flechas blancas?
obtenidos fueron analizados para la detección de mar- ¿Cuáles de los 2 tipos de bandas fueron útiles para
cos de lectura abiertos y se compararon los mismos este análisis?
con secuencias en bases de datos, utilizando progra- b) ¿Pertenecía la muestra 2 a la variedad O´Neal o no?
mas de comparación local como BLASTX y Computando las bandas y armando una base de datos,
BLASTN pudiendo predecir en base a la similitud de Carol calculó la similitud entre las muestras y obtuvo
las secuencias contenidas en esa región con secuen- el siguiente dendrograma:
cias de función conocida disponibles en bases de datos c) Ubique las muestras 2, 3 y 4 en los casilleros en
f) El MM_213 no es un buen candidato porque como blanco del dendrograma.
le faltan secuencias presentes en los promotores, posi- d) En las comparaciones, Carol incluyó material mi-
blemente no se transcriba (y sea un pseudogen). cropropagado in vitro y de campo ¿Existe alguna
El MM_437 tampoco es un buen candidato porque es razón por la cual podrían ser diferentes y explicar lo
un gen constitutivo y fundamental para la glucólisis. que pasó?
Su mutación debería afectar más cosas que el sueño y
41
a) Describa brevemente las diferencias observadas
entre transgénicas y normales.
b) ¿Cómo interpreta que, en la transgénica, la sonda
detecta mRNA de nos en la parte anterior (izquierda)
del embrión (además de en la parte posterior)?
c)¿Por qué el transgénico con la construcción 1 pre-
senta el fenotipo mutante bicoid?
d) Brevemente ¿qué resultados esperaría con la cons-
trucción 3?
e) ¿Eesperaría resultados diferentes si, en la construc-
ción 1, se reemplaza el promotor nos por el promotor
bcd? ¿Por qué?
Rta: a) Las flechas negras indican las bandas polimór- 3) a) fenotipos: normal y bicoid. Hibridación in situ
ficas (variables) y las blancas indican bandas mono- con sonda nos: hibrida en la parte posterior en el nor-
mórficas. Las negras fueron las útiles porque permiten mal, anterior y posterior en el transgénico. Con la
establecer DIFERENCIAS además de similitudes. sonda bcd, no se detectan diferencias.
b) No c) 3, 4 y 2 b) Porque la secuencia 3’UTR es la responsable de la
d) Para los brillantes: podría haber variación somaclo- unión a proteínas del citoesqueleto. La secuencia
nal (mutación causada por el hecho de cultivar in vi- 3’UTR bcd es diferente a la nos y “pega” el mRNA
tro) del transgén nos a la parte anterior. Debe recordarse
Desarrollo, epigenética, etc. que el transgén se adiciona y no reemplaza a los genes
1) Las etapas más tempranas del desarrollo en moscas normales presentes en la mosca. Por eso se detecta,
se explican, en parte, por la distribución subcelular de como era de esperar, mRNA de nos en la parte poste-
los transcriptos de genes maternos como el bicoid rior igual que en el normal.
(bcd) y el nanos (nos), dado que los mismos están ad- c) Es consecuencia de la expresión, en la parte ante-
heridos al citoesqueleto. Con el objeto de estudiar por rior, del relocalizado producto del transgén nos, que
donde se une un ARN mensajero al citoesqueleto, se interfiere con la del bcd y el resultado es un embrión
realizaron una serie de construcciones quiméricas: con 2 colas (bicoid)
1 Promotor 5’UTR nos Codif. 3’UTR d) Todo daría igual que en el normal porque la región
nos nos bcd 5´ no codificante, no tiene función en la localización
2 Promotor 5’UTR nos Codif. 3’UTR subcelular.
nos bcd nos e) No, porque ambos genes son del mismo tipo (ma-
3 Promotor 5’UTR bcd Codif. 3’UTR terno) y se expresan en forma relativamente sincroni-
nos nos nos zada y similar.
UTR (untranslated región) simboliza el DNA que es- 2) Muchos tipos de cáncer humano tienen su causa en
pecifica los extremos 5’ y 3’ no codificantes del la hipometilación del ADN. Para estudiar este fenó-
mRNA. meno se generaron ratones transgénicos conteniendo
Como puede observarse, se reemplazaron 3 segmentos alguna de estas construcciones:
de nos (de a uno por vez) por los respectivos segmen- i) Vector conteniendo un promotor de SV40 (constitu-
tos de bcd. tivo, proveniente de un adenovirus) controlando la
Con los mismos, se transformaron genéticamente expresión de la secuencia estructural de la metiltrans-
moscas silvestres y se analizaron los embriones tem- ferasa 1 (Dnmt1) en orientación antisentido
pranos por hibridación in situ de mRNAs en el em- ii) Vector conteniendo un promotor de SV40 (consti-
brión utilizando como sonda un cDNA de nos (segun- tutivo, proveniente e un adenovirus) controlando la
da fila) o bcd (tercera fila). En la primera fila, se ob- expresión de la secuencia de la metiltransferasa 1
serva el aspecto del embrión en una etapa más avan- (Dnmt1) en orientación sentido
zada. La figura siguiente muestra el resultado que se iii) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-
obtuvo con la construcción 1 en moscas silvestres veniente del fago controlando la expresión de la se-
(primera columna) y moscas transgénicas (segunda cuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
columna). orientación sentido.
iv) Vector conteniendo el promotor constitutivo pro-
veniente del fago controlando la expresión de la se-
cuencia estructural de la metiltransferasa 1 (Dnmt1) en
orientación antisentido
Se sabe que la enzima Dnmt1 controla la metilación
del ADN en ratones y que su sobre-expresión permite
metilar exhaustivamente todo potencial ADN metila-
ble y que su disminución causa una sustancial hipo-
metilación del ADN en todos los tejidos.
a) ¿Cuál de los 4 vectores usaría? ¿Por qué?
42
b) En base al vector elegido, ¿cómo espera que sea el metilados para así comparar ambos patrones, dado
grado de metilación general del ratón transgénico? que usar sólo una enzima que sí reconoce sitios meti-
Explique el mecanismo lados, no es capaz de diferenciarlos de los no metila-
c) ¿Con cuál de las siguientes técnicas corroboraría dos. Una complicación (que no es necesario explicitar
que el ADN está hipometilado? Justifique: en la respuesta correcta) es que los genes metilados
i) digestión con sendas ER que reconocen sitios meti- por imprinting tienen una copia (epialelo) metilado y
lados y no metilados, respectivamente, seguido de otro no metilado.
Southern Blot con la sonda Dnmt1 d) Cruzaría 2 homocigotas: por ej. ♂ homocigotas
ii) ensayo de protección a la digestión por ADNasaI para Tm1 y ♀ Tm2. Después, analizaría en la F1 la
iii) preparación de ARN de ratón salvaje y ratón correspondencia entre metilación (por ej. por secuen-
transgénico, seguida de Northern Blot con la sonda ciación bisulfítica que, además, me revelará la presen-
Dnmt1 cia/ausencia del sitio EcoRI en el epialelo metilado).
iv) digestión con ER que reconocen sitios metilados, (La otra alternativa es una doble digestión con ER
seguido de Southern Blot con la sonda de igf2 (insu- sensible/insensibles a metilación + EcoRI seguido de
lin-like growth factor-2, conocido gen que sufre im- Southern). En base a cual alelo aparezca metilado de-
pronta génica) terminaré si el imprinting es paterno o materno. La
v) secuenciación bisulfítica genómica directa de confirmación del imprinting se puede hacer realizando
Dnmt1y/o igf2 un cruzamiento “prueba” con el parental que no metila
vi) secuenciación bisulfítica del cDNA de Dnmt1y/o sus gametas. Debería ver un 50% de la progenie con
igf2 metilación para cada alelo.
Para la/s técnica/s elegida/s indique los controles que e) 25% de individuos Tm1 homocigotas con una copia
haría. de las 2 metiladas (Tm1m/Tm1), 25% Tm2 homocigo-
El ratón transgénico desarrolló tumores en varios teji- tas ídem (Tm2m/Tm2), 25% de heterocigotas con meti-
dos. Se determinó que el gen Tm, candidato a causar lación en Tm1 (Tm1m/Tm2) y 25% de heterocigotas
tumores en hígado, se encontraba hipometilado en con metilación en Tm2 (Tm2m/Tm1).
estos ratones. Ud. sabe que Tm presenta dos alelos, 3) Los genes fushi-tarazu (ftz) y engrailed (en) codifi-
Tm1: sin sitio para EcoRI y Tm2 con sitio para EcoRI. can factores de transcripción con homeodominio y
d) ¿Cómo haría para probar que Tm sufre impronta pueden producir la expresión de otros genes. Ambos
(imprinting) en ratones salvajes? Ud cuenta tanto con genes actúan aproximadamente en el mismo momento
ratones homocigotas como con heterocigotas. durante el desarrollo y en la misma región para espe-
e) Suponiendo que realmente existe impronta de Tm cificar destinos celulares en los segmentos corporales.
en el macho ¿cómo sería la proporción de Tm1 y Tm2 Estudios experimentales de mutantes evidenciaron
metilados y no metilados en la F2, es decir los nietos que en embriones ftz (-), no hay proteína engrailed
de un cruzamiento entre ratones ♂ homocigotas para mientras que en embriones en (-) la expresión de ftz es
Tm1 y ♀ Tm2? normal.
Respuesta a) El i) porque es el único que tiene un i) ¿Regula engrailed la expresión de fushi-tarazu o
promotor que se expresa en células eucarióticas y tie- sucede lo contrario?
ne potencialidad de reducir la actividad de mutilación ii) Indique cuando se expresan estos genes y cual es la
bloqueando la traducción del gen que codifica la en- función principal de cada uno de ellos.
zima Dmnt 1. Contestación no necesaria: Podría venir iii) ¿Se expresan estos genes durante toda la vida del
bien usar al vector ii) pero sólo como CONTROL organismo? En caso afirmativo justifique.
contrastante del experimento. Las construcciones de Rta:
los vectores iii) y iv) no se expresarían en células eu- 4) Durante el desarrollo de la mosca Drosophila me-
carióticas porque sólo funciona en bacterias. lanogaster participan varias moléculas conocidas co-
b) Altamente reducida. El RNA antisentido (comple- mo morfógenos, siendo en las primeras etapas, de
mentario) de Dmnt 1 formará una doble cadena de origen materno (los mRNAs que codifican para dichos
RNA con el mensajero nativo dificultando su traduci- morfógenos se traducen en el huevo, pero provienen
bilidad. Al reducirse la cantidad de enzima, se reduce de las células nutricias maternas). Ejemplo de esto y
también el efecto de la misma. responsables del establecimiento del eje antero-
c) La v) dado que este tipo de secuenciación permite posterior son:
detectar nucleótidos metilados. Se debe secuenciar un -en la parte anterior del embrión, BICOID (bcd) y
gen ya caracterizado como metilado. No sabemos si más tardíamente HUNCHBACK (hb), productos de
éste es el caso del gen Dmnt1 y lo más probable es los respectivos mRNA maternos.
que no lo sea. En todo caso, Dmnt1 puede servir como -en la parte posterior del embrión, NANOS (nos) y
control (no metilado). En realidad, el control más im- más tardíamente CAUDAL (cd), productos de los res-
portante es comparar con la secuenciación común pectivosmRNA maternos. Se demostró también que:
(que es insensible a la metilación) y (como se indica -la proteína bcd reconoce el 3’UTR del mRNA de
después) ratones transgénicos vs no transgénicos. La cd y enla región promotora del gen hb
iv) sirve si se compara el patrón de restricción de -la proteína nos reconoce el 3’UTR del mRNA de
ratón transgénico vs no transgénico. También podría hb. I) ¿Qué tipo de acción presentan bcd y nos según
ser aceptada como válida si se explica que se usa ER lo comentado anteriormente? Para contestar complete
que NO reconocen sitios metilados, además de los el siguiente esquema con flechas de unión: (conven-
43
ciones: activación, ---| inhibición). perimentos de la Fig asignando en cada caso, alguna
de las 4 opciones que se muestran debajo de la figura,
en donde se ha ensayado el agregado de mRNA bcd
en embriones con diferentes fondos genéticos En la
Figura siguiente, complete (con flechas) el esquema
de los resultados de inyección de mRNA de bcd.
II) Con toda la información que tiene acerca de bcd,
complete los fenotipos que espera observar en los ex-
Rta I)
bcd nos
? ? ?