UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CCBS CURSO DE FARMCIA

RELATRIO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE ESTGIO SUPERVISIONADA EM ANLISES CLNICAS ESTGIO IV (7 SEMESTRE)

THAIS ARAGO
TIA: 406.8440-7 TURMA: A11

SO PAULO / SP NOVEMBRO/2009

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CCBS CURSO DE FARMCIA

RELATRIO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS DURANTE O ESTGIO IV REALIZADO POR THAIS ARAGO NO LABORATRIO DE ANLISES CLNICAS LAURYE

SO PAULO / SP NOVEMBRO/2009

SUMRIO

1. 2. 3. 4. 5.

DADOS PESSOAIS .......................................................................................... 3 DADOS SOBRE A EMPRESA ......................................................................... 3 DADOS SOBRE O ESTGIO ........................................................................... 3 INTRODUO ................................................................................................. 4 DESCRIO DO LABORATRIO DE ANLISES CLNICAS LAURYE .......... 4 5.1. 5.2. 5.3. Organograma .................................................................................... 4 Planta Baixa ...................................................................................... 5 Fluxograma de Atividades Laboratrio do Laboratrio Laurye .......... 6

6.

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ..................................................................... 7 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. 6.6. 6.7. Coleta ................................................................................................ 7 Coleta de Sangue ............................................................................. 7 Hematologia ...................................................................................... 9 Bioqumica Clnica .......................................................................... 17 Imunologia....................................................................................... 43 Parasitologia ................................................................................... 56 Microbiologia ................................................................................... 65

7.

REFERNCIAS .............................................................................................. 73

1. DADOS PESSOAIS Nome: Thais Arago Data de Nascimento: 03/05/1987 RG:44008521-4 Endereo: Rua Alcatifa, 111 Jardim Braslia - So Paulo - SP Tel.:(11) 2741-8711/ Cel.:(11) 9412-5819 e-mail: arago.thais@uol.com.br

2. DADOS SOBRE A EMPRESA rea do Estgio: Anlises Clnicas Local: Laboratrio de Anlises Clnicas Laurye CNPJ: 43.783.943/00001-40 Representante legal: Irene Loureno Pereira Tel.: (11) 2093-2530 E-mail: laurye.diagnosticos@terra.com.br Endereo: Rua Winifred, 62Vila Carro - So Paulo - SP Brasil

3. DADOS SOBRE O ESTGIO Perodo: 04/02/2009 18/05/2009 Carga Horria: 150horas

Supervisor do estgio: Eliana A. Santos CRBM n: 3865

4. INTRODUO As instalaes nas quais se fazem os exames qumicos e microscpicos do sangue, outros lquidos do organismo e tecidos so chamados de laboratrios clnicos. (Walters, et al., 1998) O laboratrio clnico pode ser grande, oferecendo servios sofisticados e empregando muitos profissionais habilitados, ou pode ser pequeno, com apenas um empregado. (Walters, et al., 1998) Dentro do laboratrio clnico pode existir vrias reas como, por exemplo, Hematologia, Parasitologia, Microbiologia, Bioqumica Clinica, Urinlise, Sorologia, Enzimologia, Toxicologia, Micologia e Citologia. Todas de igual importncia no diagnstico e tratamento de vrias patologias. 5. DESCRIO DO LABORATRIO DE ANLISES CLNICAS LAURYE 5.1. Organograma

Irene Loureno Pereira Diretora

Eliana A. Santos Biomdica

Edna Sgorlon Enfermeira

Gilberto Almeida Custdio Tcnico de laboratrio

Maurcio Lopes Tcnico de Laboratrio

Thais Arago Estagiria

Fig. 1 - Organograma do Laboratrio Semi-Industrial

5.2. Planta Baixa

Fig. 2- Planta Baixa do Laboratrio de Anlises Clnicas Laurye

5.3. Fluxograma de Atividades Laboratrio do Laboratrio Laurye

Cadastramento do paciente no sistema

Liberao do convnio/pagamento

Coleta

Laboratrio de anlise clnicas

Triagem

Exames de Parasitolgicos

Exames Bioqumicos

Exames Imunolgicos

Exames Hematolgicos

Fig. 3 - Fluxograma das Atividades Gerais no Laboratrio de Anlises Clnicas Laurye

6.

ATIVIDADES DESENVOLVIDAS No laboratrio Laurye tive a oportunidade de entrar em contato com vrias

atividades do dia a dia de um laboratrio clnico. Essas atividades so divididas em setores de acordo com o tipo de tcnica a ser usada, do que quer se pesquisar e do tipo de material que tem-se disponvel. Abaixo sero relatadas e discutidas as atividades realizadas em cada setor: Hematologia, Bioqumica, Imunologia, Parasitologia e Microbiologia. 6.1. Coleta Para realizar um exame laboratorial pode-se utilizar os seguintes tipos de amostras: Sangue Urina Fezes Secrees Raspados Esperma Liqudos cavitrios.

Para cada tipo de amostra deve-se observar as condies em que devem ser coletadas e armazenadas para garantir que no sejam somados mais fatores de erros a anlises. Deve-se orientar adequadamente o paciente quanto ao preparo a ser realizado antes da coleta, o qual especfico para cada tipo de anlise. Por exemplo, se h necessidade de jejum, de quantas horas; realizao de exerccio fsico; ingesto de bebidas alcolicas ou estimulantes. Antes da coleta tambm necessrio obter informaes sobre aspectos referentes ao paciente que podem interferir nos resultados, como por exemplo: idade, sexo, etnia, gravidez, perodo do ciclo menstrual, uso de medicamentos,

presena de doenas concomitantes, tabagismo, alcoolismo, etc. 6.2. Coleta de Sangue O sangue tipo de amostra muito utilizado para anlises hematolgicas, bioqumicas e imunolgicas . Para cada finalidade deve-se separar a frao do sangue mais indicada (soro, plasma ou sangue total).

6.2.1. Fluxograma coleta de sangue

Identificao do paciente Exames a serem realizados Medicamentos que utiliza

Recepo

Flebtomista

Preparo e orientao do paciente na rea de coleta Verificar exames a serem realizados Confirmar nome do paciente com a ficha Perguntar quanto tempo est em jejum (se necessrio);Se houve consumo de lcool

Flebotomista

Antissepsia das mos Colocao das luvas de procedimento Preparao dos materiais a serem utilizados

Paciente

Apoiar o brao sobre suporte Fechar a mo para que a veia se torne palpvel

Flebotomista

Sentir a veia do paciente Garrotear Antissepsia do local da puno com lcool 70% e algodo; esperar o lcool secar

Flebotomista

Fazer a venopuno com material adequado Liberar o garrote quando o sangue comear a fluir

Flebotomista

Retirar o tubo de sangue Homogeneizar por inverso lentamente

Flebotomista

Retiraro sistema de coleta Pressionar o local de coleta com algodo 1-2min Colocar curativo (se necessrio) Identificar o Tubo

Aps a coleta, o tubo enviado para cada setor de acordo com o tipo frao necessria para anlise.

6.3. Hematologia Hematologia o ramo da biologia que estuda o sangue. A palavra composta pelos radicais gregos: Haima (de haimatos), "sangue" e lgos, "estudo, tratado, discurso". A Hematologia estuda os elementos figurados do sangue: hemcias (glbulos vermelhos), leuccitos (glbulos brancos) e plaquetas. Estuda, tambm, a produo desses elementos e os rgos onde eles so produzidos (rgos hematopoiticos): medula ssea, bao e linfonodos. A seo de hematologia primariamente responsvel pelo exame dos elementos figurados do sangue. Estes podem ser qualitativos, como a observao da aparncia das clulas sanguneas. Ou os testes podem ser quantitativos, com na execuo das contagens de clulas. O laboratrio de hematologia executa testes para detectar e monitorar tratamentos de anemias, leucemias e desordens hereditrias do sangue, como a hemofilia. Os efeitos de certos tratamentos, como a quimioterapia contra o cncer, podem ser determinados por testes hematolgicos. Os exames utilizados na investigao hematolgica incluem:

Hemograma Mielograma Velocidade de hemossedimentao (VHS) Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) Tempo de protrombina (TP) Fibrinognio Dmeros-D dosagens de fatores de coagulao, entre outros. A coleta para anlise hematolgica em geral realizada, seguindo os

procedimentos de coleta j conhecidos, em tubos contendo EDTA como anticoagulante (tampa roxa). A coleta de sangue deve ser feita com o paciente em jejum de pelo menos 12 horas, 24 horas sem pratica de exerccios fsicos e 48 horas sem consumo de bebida alcolica. As amostras previamente identificadas so encaminhadas ao laboratrio que procede com as anlises dos exames hematolgicos.

6.3.1. Hemograma Hemograma um exame realizado que avalia as clulas sanguneas de um paciente. As clulas circulantes no sangue so divididas em trs tipos: clulas vermelhas (hemcias ou eritrcitos), clulas brancas (ou leuccitos) e plaquetas (ou trombcitos). O hemograma uma combinao de teste que usualmente inclui: Contagem de hemcias Contagem de leuccitos Hemoglobina Hematcrito ndice de hemcias Contagem diferencial de leuccitos Avaliao do nmero de plaquetas Observao morfolgica das clulas do sangue
Amostra de Sangue colhida com EDTA

Identificao das Amostras

Encaminhar ao Laboratrio

Fazer Esfregaos e Identific-los

Preparar amostras para Determinaes na Automao

Preparar Amostras para a realizao de Hematcrito e Hemoglobina manuais

Corar Utilizado Corante Pantico

Anotar Resultados

Anotar Resultados

Anlise Microscpica da Srie Vermelha

Contagem Diferencial

Fig. 4- Fluxograma da realizao do Hemograma

Contagem Manual de Hemcias e Leuccitos

Contagens manuais do nmero de hemcias e leuccitos podem ser feitas em cmara de Neubauer (Fig. 7), aps uma diluio prvia do sangue. A contagem realizada utilizando-se apenas um retculo da cmara, portanto para uma mesma amostra pode-se utilizar apenas uma cmara, onde um retculo ser ocupado para os glbulos vermelhos e um para os glbulos brancos. Cada um constitudo por nove quadrados de 1mm de rea e com a profundidade de 0,1mm. Esses quadrados so ainda subdivididos. Os quatro externos possuem dezesseis quadrados cada e o central possui vinte e cinco quadrados subdivididos em novos dezesseis quadrados cada (Fig. 8). O mtodo dificilmente usado, sendo usado em poucos casos de dvidas da metodologia automtica . Para contagem de hemcias faz-se a seguinte diluio: 20L do sangue so transferidos para um tubo de ensaio com 3980L de soluo de Gower. A mistura homogeneizada por inverso por dois minutos (Fig. 5). 10L so ento transferidos para a cmara onde se deve aguardar trs minutos para a contagem.
3980L de sol .Gower 20L de sangue Agitar por inverso 2 minutos

Fig. 5 - Diluio do sangue para contagem de hemcias

Para contagem de leuccitos faz-se a seguinte diluio: 20L de sangue so transferidos e homogeneizados por inverso com 380L de soluo de Turk em um tubo de ensaio durante dois minutos (Fig. 6).

380L de sol. Turk

20L de sangue

Agitar por inverso 2 minutos

Fig. 6 - Diluio do sangue para contagem de leuccitos

Transferem-se essas diluies com auxlio de pipeta ou capilar cada uma para um retculo (Fig. 7).

Fig. 7- Enchendo a Cmara com sangue diludo

A cmara de Neubauer ento colocada no microscpio com a objetiva de menor aumento (10x). Focam-se as reas quadriculadas como observado na Fig. 8. Realiza-se a contagem das hemcias e leuccitos as reas especficas, como indicado na figura abaixo:

Fig. 8- rea de contagem de hemcias (E) e leuccitos (L).

A contagem total de hemcias deve ser multiplicada por 10000 para encontrar no nmero de hemcias por mm3. A contagem de leuccitos deve ser multiplicada por 50 para encontrar o nmero de leuccitos por mm3. Hematcrito

Com a amostra original, um capilar (heparinizado para sangue capilar ou no heparinizado para sangue de tubos com anticoagulante) preenchido at mais de trs quartos de seu volume. O capilar limpo e a extremidade no preenchida fechada por chama. Colocado ento na microcentrfuga, com a extremidade fechada voltada para fora, rotacionado a 11000rpm por cinco minutos. A leitura realizada pela comparao do hematcrito com uma rgua especfica. O resultado obtido em porcentagem (Fig. 9).

Fig. 9 - Leitura do hematcrito

Hemoglobina baseada na leitura espectrofotomtrica em 540nm da

Determinao

oxihemoglobina formada pela transformao da hemoglobina atravs da lise dos eritrcitos da amostra com soluo hipotnica. Para isso 20L de sangue so diludos em 6mL de gua. Uma gota de soluo de NH4OH a 1% (soluo hipotnica) acrescida e a soluo homogeneizada por inverso. A leitura ento feita no espectrofotmetro com o comprimento de onda correto. Para a soluo branca, necessria para a calibrao, utiliza-se apenas gua. Se o aparelho j estiver programado, o resultado sair em concentrao. Contagem diferencial de leuccitos

Necessria para a diferenciao dos glbulos brancos. Aps a preparao do esfregao, este deve ser mergulhado por cinco segundos em cada corante pertencente ao Pantico. O excesso retirado com gua e a lmina quando seca levada ao microscpio para a observao. As clulas devem ser contadas sendo segregadas pelos tipos at resultarem nmero 100. O valor final a porcentagem do tipo de leuccito na amostra de sangue. So diferenciadas em: neutrfilo segmentado (Fig. 10), neutrfilo bastonete(Fig. 11), eosinfilo (Fig. 12), moncito (Fig. 13), basfilo (Fig. 14) e linfcito (Fig. 15).

Fig. 10 - Neutrfilo Segmentado

Fig. 12 Eosinfilo

Fig. 11 - Neutrfilo Bastonete

Fig. 13- Moncito

Fig. 14 Basfilo

Fig. 15 - Linfcito

6.3.2. Velocidade de Hemossedimentao (VHS) A velocidade de hemossedimentao baseada

no

princpio

da

sedimentao, o processo no qual as partculas slidas tendem a depositar no fundo de um lquido. Em uma amostra de sangue anticoagulado e deixado em repouso as hemcias vo gradualmente separar-se do plasma e depositam-se no fundo do recipiente. A velocidade com que as hemcias se depositam ou caem sob condies controladas de laboratrios conhecida como velocidade de hemossedimentao. Em amostras de sangue da maioria das pessoas sadias, a sedimentao ocorre lentamente. Em muitas doenas, particularmente as inflamatrias, o VHS rpida. Em alguns casos, a velocidade proporcional gravidade da doena. Para fazer uma VHS, uma amostra de sangue anticoagulado colocado em um tubo graduado de dimenses padro, e incubado em uma posio vertical por exatamente uma hora. Ao final dessa hora, a distncia que os eritrcitos caram do menisco do plasma (na marca zero) medida em milimetros (mm) e reportado (Fig. 16).

Fig. 16 - Leitura do VHS no tubo graduado

6.3.3. Testes de Coagulao Para a realizao dessa determinao, o tubo a ser utilizado na coleta contm citrato de sdio, que seqestra o clcio presente, inibindo a coagulao. A coagulao um processo do organismo que, em caso de leso, impede o extravasamento sangneo atravs da formao do cogulo de fibrina. Ela envolve inmeras substncias conhecidas como fatores de coagulao que esto envolvidas em trs fases bsicas, a formao da tromboplastina, a converso da protrombina em trombina e a transformao do fibrinognio em fibrina. Ela pode ser ainda dividida em duas vias, a extrnseca e a intrnseca. Para a anlise da sua funcionalidade no sangue realiza-se a Determinao do Tempo de Protrombina (TP) que consiste em adicionar tromboplastina em excesso ao plasma (descalcificado pelo citrato de sdio presente no tubo) e recalcific-lo com quantidades conhecidas de cloreto de clcio padronizado. O tempo levado para que o coagulo se forme o TP. Esse sistema escolhido para a investigao da via extrnseca, pode demonstrar deficincia dos fatores de coagulao I, II, V, VII e X e ainda auxiliar no controle da teraputica anticoagulante. A determinao feita de maneira automatizada pelo aparelho da Human, para isso, deve-se selecionar o programa PT e deixar o reagente no aparelho em praquecimento por 5 minutos. 25L de plasma so ento pipetados na cubeta e colocados em pr-aquecimento por 1 minuto. A cubeta ento transferida para a posio de medio, o sistema ptico ativado e 50L do reagente (tromboplastina) so adicionados. Selecionar a ampulheta para que a leitura seja feita (mximo de 300 segundos). O resultado mostrado no visor. Aconselha-se realizar o teste em duplicata, se a diferena entre elas for maior que 5% necessrio repetir o teste. Pode-se realizar a Determinao do Tempo de Tromboplastina Ativado (TTPA), onde se adiciona ao plasma, clcio e cefalina (substituto das plaquetas), o tempo consumido para a coagulao representa o TTPA. um mtodo importante para a investigao das alteraes do mecanismo de coagulao envolvendo a via Intrnseca, com exceo das plaquetas e fatores VII e XIII. Para a sua realizao utiliza-se o mesmo aparelho do TP. O programa TTPA ento selecionado e 25L de plasma e de TTPA so pipetados na cubeta. Esta incubada por 5 ou 3 minutos (dependendo do kit do reagente. Aps a incubao

transferida para a posio de medio e o sistema ptico ativado. Adiciona-se ento 25L de CaCl2 pr-aquecido. O cronmetro ativado e o instrumento far a leitura em at 300 segundos. Se nenhum coagulo for formado o display mostrar +++.+s. Quando o tempo de processamento de 35-45 segundos considerado normal, se for encurtado (abaixo desse valor), no h relevncia clnica, mas se o resultado for prolongado (acima desse valor), possui uma grande importncia diagnstica e pode ocorrer por deficincia dos fatores VIII, IX, V, X, XI, XII, II e I ou quando existem anticoagulantes circulantes. 6.4. Bioqumica Clnica

6.4.1. Protena A dosagem das protenas pode fornecer informaes que refletem os estados de doena em muitos sistemas de rgos. A dosagem das protenas totais fornece uma informao importante sobre o estado geral do paciente, referente nutrio ou a doenas orgnicas severas. Os fracionamentos adicionais contm informaes clinicamente mais teis. - Aumento de protenas totais: mieloma mltiplo, macroglobulinemia, artrite reumatide, lupus eritematoso, endocardite bacteriana subaguda e linfogranuloma. - Diminuio de protenas totais: desnutrio grave, hiperhidratao, nefrose, insuficincia renal, deficincia de clcio e vitamina D. Finalidade: Sistema para determinao colorimtrica das protenas totais em amostras de sangue e lquidos pleural, sinovial e asctico por reao de ponto final. Princpio: Os ons cobre (Cu2+) em meio alcalino (Reagente de Biureto) reagem com as ligaes peptdicas das protenas sricas formando cor ppura que tem absorbncia mxima em 545 nm, proporcional concentrao de das protenas da amostra. Referncia em adultos: 6 a 8g/dL 6.4.2. Albumina A albumina a protena mais importante do plasma humano, representando 40 a 60% do total de protenas. Os nveis plasmticos de albumina, devido a sua relao com o aporte de protenas e a produo no fgado, so frequentemente usados com parmetros para avaliao do estado nutricional e funo heptica

Diminuies da albumina ocorrem na cirrose e outras doenas hepticas incluindo alcoolismo crnico, na gravidez associado ao uso de contraceptivos orais, em muitas doenas crnicas incluindo neoplasias, sndrome nefrtica, enteropatias com perda proteca (doena Chron, colite ulcerativa), doenas inflamatrias como as doenas autoimunes, imobilizao prolongada, falncias cardaca e outros estados catablicos crnicos. A elevao da albumina srica encontrada somente na desidratao. Finalidade: Sistema para determinao da albumina em amostras de soro por reao de ponto final. Princpio: A albumina tem a propriedade de se ligar uma grande variedade de nions orgnicos e molculas complexas de corantes. O sistema de medio se baseia no desvio do pico de absortividade mxima de um corante complexo (verde de bromocresol) quando este se liga albumina. A cor formada medida colorimetricamente entre 620 e 640 nm, sendo proporcional quantidade de albumina na amostra at a concentro de 6,0 g/dL. O verde de bromocresol possui especificidade para a albumina e no sofre interferncia de valores elevados da bilirrubina e hemoglobina, permitindo tambm que valores elevados dos triglicerdeos possa ser corrigida utilizando o branco da amostra. Referncia para adultos: 3,5 a 5,5 g/dL 6.4.3. Mucoprotenas As mucoprotenas so uma frao heterognea de glicoprotenas solveis que podem ser separadas por eletroforese em 5 subfraes, conhecidas pelo nome genrico de protenas de fase aguda. Por definio protena de fase aguda aquela cuja concentrao aumenta ou diminui em resposta ao estmulo inflamatrio. A maioria executa funes especficas o que as torna muito importantes durante o processo inflamatrio. O aumento das mucoprotenas ocorre em vrios processos inflamatrios spticos ou asspticos, agudos ou crnicos, localizados ou sistmicos como neoplasia, doena do colgeno, tuberculose e outras doenas infecciosas, diabetes mellitus, cirrose heptica, psorase, gota, etc. A falta de especificidade limita muito o seu uso em termos de diagnstico. As dosagens seriadas das mucoprotenas tm sido usadas com relativo sucesso para acompanhar a resposta ao tratamento.

Lembramos que no existe correlao entre os nveis sricos de mucoprotenas, protena C-reativa e antiestreptolisina. Finalidade: Determinao quantitativa da Mucoprotenas em amostra de soro com reao de ponto final. Princpio: Precipitao seletiva com cido Perclrico.. As mucoprotenas (seromucides) so separadas das protenas coagulveis pelo calor por precipitao seletiva com soluo de cido perclrico. Realiza-se em seguida precipitao das mucoprotenas do filtrado com cido fosfotngstico e dosagem com o reagente de Folin-Ciocalteau atravs do contedo em tirosina. Referncia: 1,9 a 4,9 mg/dL em tirosina. 6.4.4. Amilase A determinao da amilase em amostras de sangue, urina e outros lquidos biolgicos so testes teis no diagnstico da pancreatite aguda e suas complicaes. A amilase sangunea provm de duas fontes principais: pncreas e glndulas salivares. Outras fontes potenciais de amilase srica so os rgos de reproduo e o fgado. A elevao da amilase srica no um achado especfico da pancreatite e causas no pancreticas de hiperamilasemia podem dificultar a interpretao dos resultados em alguns casos. Estes incluem leses inflamatrias envolvendo as glndulas salivares, tais como a parotidite epidmica, lcera pptica perfurada, envolvendo ou no o pncreas, infarto ou obstruo intestinal, colelitase, peritonite, apendicite aguda, cetoacidose diabtica, carcinoma extrapancretico (especialmente de esfago, pulmo e ovrio), gravidez ectpica rota, insuficincia renal e macroamilasemia. Nesta ltima condio, a amilase no se encontra elevada na urina. A determinao da amilase srica e urinria so os testes mais teis para o diagnstico da pancreatite e em muitos casos a relao entre as depuraes da amilase e da creatinina pode ser til no diagnstico da pancreatite aguda e pancreatite recorrente. Neste caso, o valor da relao se encontra entre 7,0 e 15,0%. Finalidade: Determinao quantitativa da Amilase em amostra de soro, plasma e urina com reao cintica de tempo fixo.

Princpio: A amostra incubada com um substrato de amido e a diminuio da cor azul, aps a adio de iodo, comparada com um controle, sendo proporcional atividade da amilase na amostra. Referncia: Soro: 60 a 160 U/dL; Urina: 50 a 140 U/hora

6.4.5. Glicohemoglobina um teste normalmente utilizado para o monitoramento da diabetes mellitus. Hemoglobina glicada uma hemoglobina com glicose ligada no terminal amino de uma das cadeias da hemoglobina, portanto quanto mais glicose no plasma, mais hemoglobinas estaro glicadas. Embora muitas outras protenas tambm sejam glicadas, a hemoglobina apresenta maior tempo de circulao (meia-vida longa de aproximadamente 90 dias dos eritrcitos) e esto presentes em concentraes suficientes para as determinaes. Fornecem um ndice de controle de glicemia de 8 a 12 semanas anteriores alguma medicao que o paciente possa ter administrado. Finalidade: Determinao quantitativa da Hemoglobina glicada em amostra de sangue. Mtodos: Troca inica em tubos para determinao da glicohemoglobina. Princpio: A determinao do percentual de glicohemoglobina no sangue feita atravs da troca catinica em tubos, sem a necessidade do uso de padres secundrios internos. Baseia-se em dois tubos, um contendo uma suspenso de resina de troca catinica fraca capaz de ligar todas as fraes da hemoglobina exceto as fraes glicadas e outro contendo a mesma resina na mesma concentrao mas em condies no ligantes de nenhuma das fraes. Aps adio de um hemolisado ao primeiro tubo e separao mecnica das fraes ligadas e no ligadas, estas ltimas contidas no sobrenadante, procede-se leitura espectrofotomtrica desta frao, em 415 nm, que corresponder glicohemoglobina. Devido s condies no ligantes da resina, a adio do hemolisado ao segundo tubo fornecer, aps as mesmas operaes, uma leitura espectrofotomtrica que corresponder hemoglobina total. A relao entre as duas leituras fornecer o percentual de glicohemoglobina na amostra. O hemolisante empregado contm concentraes elevadas de ons borato, visando a eliminao rpida da frao lbil da glicohemoglobina (aldimina). Referncia:

Entre 5 e 7 % : Indivduos sadios ou com diabetes bem controlado. Nesta faixa podero ser encontrados indivduos com glicose de jejum com alguma alterao, mas sem descontrole metablico. Entre 7 e 8 % : Indivduos intolerantes. Nesta faixa so encontrados indivduos com glicemia de jejum alterada ou mesmo normal, mas com curva de tolerncia diminuda. Acima de 8 % : Diabetes descontrolado, com desequilbrio metablico. 6.4.6. Glicose sangunea A glicose um carboidrato altamente importante do ponto de vista laboratorial, pois suas concentraes no sangue so controladas dentro de limites estreitos por vrios hormnios, sendo os mais importantes os produzidos pelo pncreas: insulina, glucagon e somatostatina. Os testes so realizados em amostras de plasma colhidas em tubos contendo fluoreto, um inibidor da gliclise. Os resultados so classificados em hipoglicmicos ou hiperglicmicos e so determinados para o rastreamento da diabetes mellitus. Finalidade: Determinao da glicose no sangue e lquidos cfalo raquidiano, pleural, asctico e sinovial. Princpio: A glicose da amostra sofre a ao da glicose oxidase (GOD) em presena de oxignio produzindo perxido de hidrognio, segundo a seguinte reao: Glicose + O2 + H20 a ao da peroxidase
GOD

acido glucnico + H202 um composto rseo-avermelhado

O Perxido de Hidrognio em presena de fenol e de 4-aminoantipirina, sofre produzindo

(antipirilquinonimina) com mximo de absoro em 505 nm. Conforme reao abaixo: 2 H2O2 + 4-aminoantipirina + fenol
POD

antipirilquinonimina + 4H2O

Referncia: Plasma : 70 a 99 mg/dl ( para pacientes com jejum noturno). Lquido cfalo-raquidiano : 2/3 da glicemia. 6.4.7. Uria A uria formada a partir da amnia formada pelo catabolismo protico e desaminao dos aminocidos, que liga-se ao CO2 e forma a uria. A uria sofre filtrao glomerular, sendo que 50% reabsorvida e 50% excretada na urina.

A concentrao de uria srica no to til como medida da funo glomerular, pois afetada pela ingesto de protenas da dieta (alta ingesto aumenta a uria), pelo teor do catabolismo protico (alto catabolismo, aumenta a amnia e a produo de uria) e por sangramento gastrointestinal (aumenta uria). medida juntamente com a creatinina, pois a razo entre elas til na investigao de distrbios renais, para determinar a causa do distrbio. Finalidade: Sistema enzimtico-colorimtrico para a determinao da uria em amostras de sangue e urina, por reao de ponto final. Somente para uso diagnstico in vitro. Mtodo: Cintica enzimtica de tempo fixo, UV. Princpio: A uria hidrolisada pela urease, gerando amnia e dixido de carbono. Urease Uria + H2O 2 NH3 + CO2

A amnia reage com o 2 cetoglutarato e NADH em uma reao catalisada pela glutamato desidrogenase (GLDH), ocorrendo oxidao da NADH a NAD. A consequente reduo da absorbncia, medida em 340 ou 365 nm, proporcional concentrao de uria na amostra. GLDH 2 cetoglutarato + NH3 + NADH Referncia: Soro ou Plasma: 15 a 40 mg/dL. Urina: 26 a 43 g/24 horas. 6.4.8. Creatinina K A determinao da creatinina em amostras de sangue e urina so testes de avaliao da funo renal. A determinao da concentrao de creatinina no lquido amnitico um dos parmetros laboratoriais para a avaliao da maturidade fetal. A creatinina sintetizada pelo fgado, rim e pncreas e totalmente excretada pelos rins. Como 100% excretada, a depurao da creatinina est diretamente relacionada funo glomerular (FG) dos rins. A determinao pode ser feita em amostra de urina coletada por 24h. S ser vlida se a amostra for cronometrada com exatido e no haja proteinria intensa (embora no seja alterada pela dieta, quando a protena est em grande quantidade pode atrapalhar a determinao). L-Glutamato + NAD

FG = [creatinina_urina] x Vol. Urina em 24h [creatinina_soro] A concentrao da creatinina no soro usada como medida da funo glomerular, mas no precisa, pois a funo glomerular tem que diminuir pela metade para que a concentrao de creatinina plasmtica seja alterada. Os intervalos de referncia variam com a massa muscular, portanto, homens tm valores mais altos que mulheres e idosos, pois possuem valores mais baixos que os jovens. Finalidade: Determinao quantitativa da Creatinina em amostra de soro, plasma e urina com reao de ponto final. Princpio: Baseado na reao de Jaff - Pricato alcalino. A creatinina e outros componentes do soro reagem com a soluo de picrato em meio alcalino, formando um complexo de cor vermelha que medico fotometricamente. A adio de um acidificante abaixa o pH para 5,0, promovendo a decomposio do picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos cromognios, que tambm medida fotometricamente. A diferena entre as duas leituras fornece o valor da creatinina. Referncia:
Tabela 1-Valores de Referncia de Creatinina em mg/dL em soro/plasma

Recm-nascido 0,50 - 1,20 <1 ms 0,40 - 0,70 1 - 12 meses 0,70 1 - 3 anos 0,70 4 - 7 anos 0,80 8 - 10 anos 0,90 11 - 12 anos 1,00 13 - 17 anos 1,20 Adulto (mulheres)* 0,53 - 0,995 Adulto (homens)* 0,70 - 1,20 * 18 a 70 anos; valores corrigidos com o ndice de correo;

6.4.9. Creatina quinase A determinao da creatina quinase (CK) em amostras de sangue til na abordagem laboratorial do infarto agudo do miocrdio e de doenas musculares esquelticas. A creatina quinase um dmero composto de subunidades B e M, e ocorre em trs formas de isoenzimas: MM (CK3), MB (CK2) e BB (CK1). A enzima

encontrada em concentraes elevadas no msculo esqueltico, msculo cardaco, crebro e trato gastrointestinal. Os estudos de distribuio tissular indicam que o msculo esqueltico quase que completamente composto da isoenzima MM com quantidades mnimas da isoenzima MB. O crebro e o trato gastrointestinal contm primariamente a isoenzima BB enquanto que o msculo cardaco consiste aproximadamente de 80% da isoenzima MM e 20% da MB. A CK total comea a se elevar 6 horas aps o incio do infarto agudo do miocrdio (IAM) e chega a um pico mximo aps 12 a 24 horas, permanecendo elevada at 72 horas quando no ocorre um novo infarto. Os valores no pico mximo podem chegar a mais de 10 vezes o limite superior dos valores de referncia. Em pacientes submetidos teraputica tromboltica a elevao da CK pode ocorrer mais precocemente por aumento da isoenzima MB consequente reperfuso do miocrdio isqumico. Alm do IAM a CK est elevada nos casos de necrose do msculo cardaco produzidas por miocardite grave. As causas de elevao da CK consequentes a necrose ou atrofia aguda do msculo estriado so: cirurgia torcica ou cardaca (os valores retornam linha basal em 24-48 horas), cardioverso, distrofia muscular progressiva, esclerose lateral amniotrfica, poliomiosite, distrofia miotnica, traumas e queimaduras, rabdomilise extensa, hipertermia maligna, hipotermia, status epiltico, miopatia endcrina (hipotireoidismo, acromegalia, miopatia do hipoparatireoidismo) e uso de cocaina. Finalidade: Sistema para determinao quantitativa da atividade da Creatina Quinase Total (CK) em modo cintico em soro ou plasma. Princpio: A atividade da CK na amostra, aps reao enzimtica, medida fotometricamente atravs da reduo de NADP a NADPH. A creatina quinase total determinada de acordo com as seguintes reaes: CK Creatina Fosfato + ADP HK ATP + Glicose Glicose-6-Fosfato + NADP ADP + Glicose-6-Fosfato G-6-PDH 6-PG + NADPH Creatina + ATP

A CK catalisa a desfosforilao da creatina fosfato para produzir adenosina trifosfato (ATP), a qual reage com a glicose na presena da hexoquinase (HK) formando glicose-6-fosfato. A glicose-6-fosfato na presena de glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PDH) oxidada a fosfogluconato(6-PG) e reduz o NADP a NADPH. A velocidade de incremento na absorbncia em 340 nm proporcional atividade da CK na amostra. Referncia: Mulheres Homens 6.4.10.Clcio O clcio o 26 155 U/L; 26 189 U/L

quinto

mineral

mais

abundante

no

corpo

humano.

Aproximadamente 98% do clcio proveniente da dieta esto estocados no esqueleto, dentro do ossos. O clcio no osso no esttico, diariamente parte do osso reabsorvida (devolvendo o clcio ao lquido extracelular, o LEC) e outra parte do osso formada (retirando clcio do LEC). Sendo mantido este equilbrio dentro dos limites fisiolgicos pela ao combinada do paratohormnio e vitamina D, atravs de seus efeitos sobre os ossos, intestinos e rins. O clcio ionizado representa a poro fisiologicamente ativa do clcio srico e corresponde a metade do clcio total. Na maioria das vezes a hipercalcemia indica a presena de

hiperparatireoidismo ou de doenas malignas. A hipercalcemia encontra-se tambm associada ao uso de drogas como os tiazdicos, vitaminas A e D, anticidos alcalinos e carbonato de ltio. A imobilizao (fraturas), doena de Paget e doenas granulomatosas (sarcoidose) so causas de hipercalcemia. As causas mais comuns de hipocalcemia so: (1) hipoparatireodismo idioptico ou cirrgico, (2) pseudo-hipoparatireoidismo, (3) insuficincia renal, (4) desordens do metabolismo da vitamina D, (5) deficincia de magnsio, (6) drogas (uso agudo de diurticos, uso de corticosterides e insulina), (7) tetania neonatal, (8) pancreatite aguda e (9) transfuses sanguneas mltiplas. Concentrao srica de clcio inferior a 7,0 mg/dL considerada crtica, pois pode levar tetania. Tambm so considerados crticos resultados superiores a 12,0 mg/dL, pois podem induzir ao coma. A calciria pode aumentar com o uso de acetazolamida, cloreto de amnio, corticosterides, vitamina D e diurticos (efeito inicial). Esta diminui com o uso crnico de diurticos, bicarbonato, estrgenos, ltio e anovulatrios.

A determinao do clcio em amostras de sangue e urina til no diagnstico e seguimento dos distrbios do metabolismo do clcio e fsforo. Princpio: O clcio reage com a prpura de ftalena em meio alcalino, formando um complexo de cor violeta que medido em 570 nm. Referncia: Clcio (soro ou plasma): 8,8 a 11,0 mg/dL Clcio Ionizado : 4,6 a 5,4 mg/dL Clcio (urina) : at 200 mg/24 horas (com dieta restrita de clcio: 500 mg/24 horas) Clcio (amostra de urina): <0,16 mg/100 mL de FG 6.4.11.Fsforo A determinao do fsforo inorgnico em amostras de sangue, urina e lquido amnitico til na avaliao do balano clcio/fsforo do organismo. Embora a insuficincia renal crnica e o hipoparatireoidismo sejam as duas causas mais comuns de hiperfosfatemia, vrias condies podem causar hiperfosfatemia transitria e assintomtica. Como o msculo representa um grande reservatrio de fosfato evidente que a rabdomilise produz severa hiperfosfatemia. Outras condies que promovem a liberao do fosfato intracelular e levam hiperfosfatemia incluem a hipertermia maligna e a quimioterapia antiblstica. A hiperfosfatemia pode ocorrer aps administrao de laxativos e enemas de reteno contendo fosfato. Nveis diminudos de fsforo so encontrados no hiperparatireoidismo, na intoxicao pelo chumbo e na alimentao parenteral. Observa-se discreta reduo do fsforo srico no ltimo trimestre de gravidez. Finalidade: Determinao quantitativa do Fsforo inorgnico em amostra de soro e urina com reao de ponto final. Princpio: O fsforo inorgnico (Pi) reage com o molibdato de amnio na presena de cido sulfrico, resultando na formao de um complexo fosfomolibdato no reduzido. A absorbncia em 340 nm do complexo formado proporcional concentrao de fsforo na amostra.

Pi + H2SO4 + Molibdato de amnio

Complexo fosfomolibdato no reduzido

6.4.12.Magnsio O magnsio ativa inmeras enzimas e a maioria dos aspectos da bioqumica intracelular dependente de magnsio. As propriedades eltricas das membranas celulares e de conduo do impulso nervoso so afetadas por qualquer reduo da concentrao extracelular de magnsio. A deficincia de Magnsio uma desordem comum que pode ser causada por desnutrio, m-absoro, perda renal e distrbios endocrinolgicos. Complicaes associadas com decrscimos de concentraes de Magnsio so irritabilidade neuromuscular (ex. tremor, convulso) e sintomas cardacos (ex. taquicardia, arritmia). Decrscimos de concentraes de Magnsio esto sempre relacionados com decrscimos de nveis de Clcio e Potssio, levando-se em conta que a Hipomagnesia pode ser a causa primria da hipocalcemia. Valores elevados de Magnsio podem ser observados na desidratao e desordens renais e aps ingerir grandes quantidades de anticidos e pode estar associado com a reduo dos reflexos e baixa presso sangnea. Portanto, A determinao do magnsio em amostras de sangue, urina e lquor til na avaliao de distrbios metablicos. Finalidade: Determinao quantitativa do Magnsio em amostra de soro, plasma e urina com reao de ponto final. Mtodo: colorimtrico. Princpio: Reao Magon sulfonado. Os ons magnsio reagem com o magon sulfonado (cor azul) em meio alcalino formando um complexo de cor rsea que proporcional quantidade de ons magnsio na amostra. 6.4.13.Ferro srrico O ferro essencial para a maioria dos organismos vivos, pois participa de numerosos processos vitais, desde os processos oxidativos celulares ao transporte de oxignio para os tecidos. A hemostasia do ferro regulada principalmente pela absoro e no pela excreo. O ferro transportado no sangue por uma protena, a transferrina, e armazenado nos tecidos ligado a outra protena chamada ferritina. A deficincia de ferro consequncia de: (1) suprimento inadequado; (2) aumento da demanda; (3) perda sangunea ou a combinao destes. O suprimento inadequado caracterstico das crianas alimentadas com leite. J o aumento de demanda caracterstica da gravidez e das crianas nos primeiros 5 anos de vida. Menstruao abundante, hemorragias gastrointestinais, hemorridas, carcinoma de

clon e parasitoses so causas comuns de deficincia de ferro srico por perda sangunea no adulto. Transfuses repetidas, hemocromatose idioptica, cirrose, talassemia e anemia sideroblstica so as causas mais comuns de aumento do ferro srico. A determinao do ferro em amostras de sangue til na abordagem laboratorial das anemias hipocrmicas e microcticas. Finalidade: Determinao quantitativa do Ferro em amostra de soro com reao de ponto final. Princpio: Mtodo tampo acetato-Ferrozine. Em meio cido o ferro ligado transferrina se dissocia em on frrico que reduzido forma de on ferroso por ao da hidroxilamina. Aps a adio de Ferrozine forma-se um complexo magenta brilhante cuja absorbncia, medida a 560 nm, proporcional quantidade de ferro na amostra. Referncia: 50 a 150 g/dL 6.4.14.Bilirrubina A bilirrubina o principal produto do metabolismo do heme da hemoglobina. Cerca de 70% a 80% da bilirrubina so provenientes da destruio dos eritrcitos velhos, 15% de fontes hepticas, e o restante proveniente da destruio de hemcias defeituosas na medula ssea e nos citocromos. A destruio prematura das hemcias anemia hemoltica e a eritropoiese ineficaz so importantes causas de hiperbilirrubinemia, com predomnio de bilirrubina no-conjugada, na ausncia de qualquer anormalidade heptica. Algumas doenas adquiridas e hereditrias e diversos medicamentos so capazes de afetar uma ou mais etapas envolvidas na produo, captao, armazenamento, metabolismo e excreo da bilirrubina. Dependendo do distrbio, a bilirrubina no-conjugada (indireta), a conjugada (direta) ou ambas (total), so as principais contribuintes da hiperbilirrubinemia. A forma mais comum de aumento da bilirrubina indireta aquela vista em recm-nascidos e referida como ictercia fisiolgica. Este aumento causado por uma produo aumentada de bilirrubina como resultado da hemlise das hemcias e da maturao incompleta dos mecanismos do metabolismo e excreo da bilirrubina. Em 5% dos neonatos, os valores de bilirrubina no-conjugada so

maiores que 15 mg/dL e podem desencadear o quadro de encefalopatia bilirrubnica (Kernicterus). Dentre as causas hereditrias de hiberbilirrubinemia no-conjugada,

destacam-se as sndromes de Crigler-Najjar e de Gilbert que esto associadas deficincia da enzima uridina difosfato (UDP) glicuroniltransferase. A Sndrome de Gilbert mais comum e parece haver, tambm, defeito no transporte da bilirrubina atravs da membrana do hepatcito. Normalmente h somente uma pequena quantidade de bilirrubina no sangue. As causas mais comuns de aumento da bilirrubina direta so as doenas hepatobiliares e obstruo da rvore biliar (colestase). Na realidade, ambas as bilirrubinas esto aumentadas e pode-se observar uma variao ampla das concentraes sricas de cada forma de bilirrubina. Hepatite e cirrose so exemplos de doenas que podem causar colestase intra-heptica. A colestase pode tambm ser induzida por medicamentos e hormnios esterides. A obstruo extra-heptica da rvore biliar devido a carcinoma ou fibrose de cabea do pncreas, carcinoma ou constries do canal biliar comum e coledocolitase, produzem concentraes sricas aumentadas de bilirrubina direta. Quando o nvel da bilirrubina se eleva, faz com que a pele e a parte branca dos olhos tornem-se amarelados. Esta mudana para o amarelo chamada ictercia. Assiml, a determinao da bilirrubina em amostras de sangue til na avaliao de doenas hepatobiliares e hematolgicas que cursam com alterao no metabolismo da bilirrubina. Sua dosagem no lquido amnitico auxilia na avaliao da eritroblastose fetal Finalidade: Sistema para a determinao das bilirrubinas direta e total em amostras de sangue por reao de ponto final. Somente para uso diagnstico in vitro. Princpio: A bilirrubina dosada por diazotizao e formao de azobilirrubina vermelha com absoro mxima em 525 nm. A bilirrubina direta (diglicurnide) dosada em meio aquoso, enquanto a total (direta e indireta) dosada por ao de potente solubilizador de ao catalisadora. Referncia: Soro: Bilirrubina total - at 1,2 mg/dL; Bilirrubina direta - at 0,4 mg/dL

As

6.4.15.TGP(ALT) e TGO (AST) enzimas aspartato aminotransferase

(AST

ou

TGO)

alanina

aminotransferase (ALT ou TGP) so enzimas que catalisam determinadas reaes. A AST uma enzima presente em altas concentraes no citoplasma e nas mitocndrias do fgado, msculo esqueltico, msculo cardaco, rins, eritrcitos e pncreas. Quando h alguma leso em um desses tecidos, essa enzima liberada no sangue. A ALT uma enzima presente em altas concentraes exclusivamente no fgado, o que torna seu aumento mais especfico de leses hepticas. O aumento das aminotransferases podem estar ligadas problemas hepatobiliares, do miocrdio, pancretico, muscular, pela ingesto de lcool, pela obesidade, pela diabetes, entre outros. O teste realizado em conjunto, AST com a ALT e normalmente avaliam problemas hepticos. TGP/ALT

Justificativa: A determinao da alanina aminotransferase ou transaminase glutmico pirvica (ALT/GPT) em amostras de sangue til na avaliao da funo heptica, sendo mais sensvel na deteco de leso hepatocelular que de obstruo biliar.

Princpio: A ALT catalisa a transferncia de grupos amina da alanina para o cetoglutarato, com formao de glutamato e piruvato. ALT L-Alanina + Cetoglutarato Piruvato + L-Glutamato Este reduzido a lactato por ao da lactato desidrogenase (LDH), enquanto que a coenzima NADH oxidada a NAD LDH Piruvato + NADH L-Lactato + NAD . A conseqente reduo da absorbncia em 340 ou 365 nm, monitorizada espectrofotometricamente, diretamente proporcional atividade da enzima na amostra.
Tabela 2 - Valores de Referncia de ALT/TGP

Idade

1 - 30 dias 1 - 6 meses 7 - 12 meses 1 - 3 anos 4 - 11 anos 12 - 15 anos Adultos

Masculino (U/L) 20 - 54 26 - 55 26 - 59 19 - 59 24 - 49 24 - 59 11 - 45

Feminino (U/L)

21 - 54 26 - 61 26 - 55 24 - 59 24 - 49 19 - 44 10 - 37

TGO/AST

Justificativa: A determinao da aspartato aminotransferase ou transaminase glutmico oxalactica (AST/GOT) em amostras de sangue til na avaliao da funo heptica. Princpio: A AST catalisa a transferncia de grupos amina da alanina para o cetoglutarato, com formao de glutamato e oxalacetato. Este reduzido a malato por ao da malato desidrogenase (MDH), enquanto que a coenzima NADH oxidada a NAD. AST L-Aspartato + Cetoglutarato Oxalacetato + L-Glutamato

MDH Oxalacetato + NADH L-Malato + NAD A conseqente reduo da absorbncia em 340 ou 365 nm, monitorizada espectrofotometricamente, diretamente proporcional atividade da enzima na amostra.
Tabela 3 - Valores de Referncias de AST/TGO

Idade

Masculino (U/L)

Feminino (U/L)

1 - 7 dias 8 - 30 dias 1 - 6 meses 7 - 12 meses 1 - 3 anos 4 - 6 anos 7 - 15 anos Adultos

26 - 98 16 - 67 16 - 62 16 - 52 16 - 57 10 - 47 10 - 41 11 - 39

20 - 93 20 - 69 16 - 61 16 - 60 16 - 57 10 - 47 5 - 36 10 - 37

6.4.16.Gama GT A GGT tem aplicao principal no estudo das doenas hepatobiliares e est distribuda em quase todo o tecido humano. O rim contm a mais elevada concentrao, seguido pelo pncreas e fgado. A GGT um sensvel indicador de doenas inflamatrias e leso heptica e est significativamente elevada nas doenas obstrutivas das vias biliares. A GGT tem maior especificidade que a fosfatase alcalina (ALP) e a transaminase oxalactica para avaliar doena heptica. Ela no est elevada na doena ssea e durante a gravidez como a fosfatase alcalina, nem nas doenas do msculo esqueltico como a transaminase oxalactica. A GGT auxilia diferenciar colestases mecnica e viral das induzidas por drogas. Nas duas primeiras, a GGT e ALP esto

igualmente elevadas. Nas colestases induzidas por drogas a GGT est muito mais elevada. Valores elevados de GGT em pacientes anictricos com cncer so um seguro indicador de metstases hepticas. Est demonstrado que no alcoolismo crnico os nveis sricos da GGT diminuem com a retirada do lcool e se elevam com a exposio ao mesmo. Com base nesta observao a determinao da GGT est sendo usada nos centros de tratamentos de alcolatras para documentar o sucesso da terapia e identificar os pacientes que retornam ao alcoolismo aps a alta. Finalidade: Sistema para determinao quantitativa da atividade da y-glutamil transferase (Gama GT) no soro ou plasma (EDTA) por fotometriaemmodo cintico. Somente para uso diagnstico in vitro. Princpio: A -Glutamil Transferase catalisa a transferncia do grupamento Glutamil da L- Glutamil-p-nitroanilide para a glicilglicina, formando

Glutamilglicilglicina e p-nitroanilina segundo a reao seguinte: GGT L--Glutamil-p-nitroanilide + Glicilglicina Glutamilglicilglicina + p-nitroanilina. A quantidade de p-nitroanilina liberada, que tem elevada absorbncia em 405 nm, diretamente proporcional atividade da GGT na amostra.
Tabela 4 - Valores de Referncia de GGT

Faixa etria 0 6 meses 6 12 meses 1 12 anos 12 18 anos Adultos

Mulheres 15 132 U/L 1 39 U/L 4 22 U/L 4 24 U/L 5 27 U/L

Homens 12 122 U/L 1 39 U/L 3 22 U/L 2 42 U/L 7 45 U/L

6.4.17.Fosfatase Alcalina A fosfatase alcalina produzida por muitos tecidos, principalmente pelos ossos, fgado, intestinos e placenta e excretada pela bile. A dosagem srica desta enzima particularmente til na investigao das doenas hepatobiliares e sseas. Nveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem em pacientes com doenas sseas caracterizadas por aumento da atividade osteoblstica como a osteite deformante, raquitismo, osteomalcia, hiperparatireoidismo, metstase ssea, sarcoma osteognico e doena de Paget.

Nveis elevados de fosfatase alcalina ocorrem tambm em pacientes com doenas obstrutivas das vias biliares, metstases hepticas, doenas

granulomatosas e na cirrose heptica. Nas doenas hepatocelulares como a hepatite aguda viral, em geral ocorre um ligeiro aumento da enzima. Nveis diminudos da fosfatase alcalina so encontrados na desnutrio crnica, na hipofosfatasemia e, ocasionalmente, no hipotireopidismo e anemia perniciosa. A determinao da fosfatase alcalina em amostras de sangue til na avaliao de doenas hepticas e sseas. Princpio: A fosfatase alcalina do soro hidrolisa a timolftalena monofosfato liberando timolftalena, que tem cor azul em meio alcalino. A cor formada, diretamente proporcional a atividade enzimtica, medida em 590 nm. O produto final da reao se constitui de uma mistura de cor azul e a cor prpria do substrato. Referncia: Adultos: 13 a 43 U/L. Crianas at 12 anos: 56 a 156 U/L. 6.4.18.Colesterol total, HDL, LDL, VLDL Os lipdeos so substncias insolveis em meio aquoso e so associados com protenas para serem transportados at os tecidos, sendo chamados de lipoprotenas. Os triglicerdeos so formados pela esterificao do glicerol a trs cidos graxos, constituindo-se em um dos lipdeos de interesse na avaliao do metabolismo lipdico As principais lipoprotenas que transportam o colesterol e so quantificveis no exame laboratorial so: VLDL (very low density lipoprotein muito baixa densidade), LDL (low density lipoprotein baixa densidade), HDL (high density lipoprotein alta densidade). As determinaes na pesquisa de distrbios lipdicos determinam apenas a concentrao de colesterol e triglicerdeos presentes nas classes de lipoprotenas. O perfil lipdico definido pelas determinaes do colesterol total (CT), HDL-C (HDL colesterol), triglicerdeos (TG) e do LDL-C, aps jejum de 12 horas a 14 horas, pela frmula de Friedewald, sendo a determinao direta de LDL-C: LDL-C = CT (HDL-C TG/5*) (se TG 400mg/dL) *TG/5 = VLDL-C

O perfil lipdico dever ser realizado: Dieta habitual; No realizar atividade fsica vigorosa nas 24 horas antecedentes; Evitar a ingesto de lcool nas 72 horas que antecederem a coleta de sangue,

para no gerar liplise; Levar em considerao que aps qualquer doena ou cirurgia em geral, o perfil
Tabela 5 - Valores recomendados para as fraes de colesterol em mg/dL

lipdico do paciente poder estar temporariamente comprometido.

Colesterol LDL < 100 timo 100 129 Limiar timo 130 159 Limiar Elevado 160 189 Elevado 190 Muito Elevado

Colesterol Total < 200 Desejvel 200 239 Limiar Elevado 240 Elevado

< 40 60

Colesterol HDL Baixo Elevado (desejvel)

Colesterol Total (CT)

Mtodo: Colesterol oxidase - Reao de Trinder. Finalidade: Determinao quantitativa do Colesterol em amostra de soro com reao de ponto final. Princpio: O colesterol total determinado de acordo com as seguintes reaes:
Colesterol Esterase

steres de colesterol
Colesterol Oxidase

Colesterol + cidos graxos

Colesterol + O2 2H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina

Colest-4-en-ona + H2O2
Peroxidase

Antipirilquinonimina + 4H2O

A intensidade da cor vermelha formada diretamente proporcional concentrao de colesterol na amostra.

HDL

Mtodo: Inibio seletiva com detergente. Finalidade: Sistema para precipitao das lipoprotenas de baixa e muito baixa densidade (LDL e VLDL) e determinao do Colesterol HDL no sobrenadante, com reao de ponto final.

Princpio: As lipoprotenas de muita baixa densidade (VLDL) e as lipoprotenas de baixa densidade(LDL) so quantitativamente precipitadas e aps centrifugao, o colesterol ligado as lipoprotenas de alta densidade (Colesterol HDL) determinado no sobrenadante. Como somente o colesterol HDL fica sujeito ao das enzimas no sobrenadante, a cor resultante da segunda reao diretamente proporcional concentrao do colesterol HDL na amostra. Triglicerdeos

A dosagem de triglicrides pode ser realizada com as seguintes finalidades: avaliar o metabolismo lipdico; calcular o VLDL-colesterol; calcular o risco de pancreatite; avaliar eventual hipertrigliceridemia secundria ao uso de drogas antihipertensivas; avaliar eficincia de tratamentos que visam reduzir os nveis de triglicrides. Considerando que h grande variao biolgica, cerca de 20%, importante que o raciocnio clnico no se baseie em dosagens isoladas. Variaes na dieta, na atividade fsica e o uso de bebidas alcolicas so causas mais freqentes de grandes variaes nos nveis de triglicrides. Mtodo: Glicerol fosfato oxidase. Finalidade: Determinao quantitativa do Triglicrides em amostra de soro com reao de ponto final Princpio: Os triglicerideos so determinados aps hidrlise enzimtica com lipases. O indicador a quinoneimina formada a partir do perxido de hidrognio, 4aminoantipirina e 4-clorofenol sob a influncia cataltica da peroxidase. De acordo com as seguintes reaes:
Lipase da lipoprotena

Triglicrides
Glicerolquinase

Glicerol + cidos Graxos Glicerol-3-Fosfato + ADP

Mg +2 Glicerol-3-fosfato

Glicerol + ATP

Glicerol-3-Fosfato + O2

Dihidroxiacetona + H2O2
Oxidase Peroxidase

2 H2O2 + 4 Aminoantipirina + 4-Clorofenol

Quinoneimina + 4 H2O

A intensidade da cor vermelha formada diretamente proporcional concentrao dos Triglicrides na amostra. Referncia:

Tabela 6 - Valores de Referncia de Triglicerdeos

Triglicrides (mg/dL) Desejvel Limiar Alto Elevado Muito Elevado < 150 150 - 199 200 - 499 > 500

6.4.19.Urinlise A urinlise corresponde ao exame fsico, qumico e microscpico da urina. O exame de urina fornece uma ampla variedade de informaes teis no que se relaciona as doenas envolvendo os rins e o trato urinrio inferior, bem como sobre algumas molstias extra-renais. Pode ser utilizado para avaliao diagnstica de distrbios funcionais (fisiolgicos) e estruturais (anatmicos) dos rins e trato urinrio inferior, bem como para acompanhamento e obteno de informaes prognsticas. um dos exames de rotina mais simples e valiosos de auxlio diagnstico. Os tipos de coleta da urina so: amostra de 24 horas amostra colhidas por cateter puno suprapbica jato mdio de mico espontnea amostras peditricas (uso de coletores de plstico).

Cuidados que devem ser observados na coleta do material: O recipiente para a coleta da amostra deve ser limpo e seco; A amostra dever ser entregue imediatamente ao laboratrio, e analisada dentro

de 1 hora, caso isto no seja possvel, deve-se manter a amostra refrigerada, por no mximo 24 horas; O recipiente contendo a amostra dever estar corretamente identificado,

contendo: nome, data e horrio; As amostras obtidas por sonda ou puno suprapbica, podem conter hemcias

devido ao trauma durante a coleta da amostra; Deve-se coletar uma amostra de 20 a 100 ml;

Ao coletar a amostra por jato mdio, os pacientes devem ser orientados para

realizar a assepsia antes de coletar a amostra e sempre desprezar a 1 poro da urina. EXAME FSICO (Cor, Aspecto)

COLORAO: A cor da urina devido a um pigmento denominado urocromo, que um produto do metabolismo endgeno, produzido em velocidade constante. A colorao indica de forma grosseira, o grau de hidratao e o grau de concentrao de solutos. Procedimento:Observar macroscopicamente a colorao da urina. Colorao da urina normal: amarelo-claro; amarelo-citrino; amarelo-escuro; mbar Condies que alteram a colorao da urina: -Presena anormal de bilirrubina: amarelo-escuro ou mbar (com espuma amarela) -Doenas hepticas: amarelo-esverdeado, castanho ou esverdeado. -Urina com hemcias: desde rosa, vermelho ( observar em urinas de mulher, se a paciente no se encontra no perodo menstrual). -Urina com hipria ou quilria: branco (est relacionado com a obstruo linftica e ruptura dos vasos linfticos). -Medicamentos: Laranja fanazpiridina, (pirydium), fenindiona (hedulin) Vermelha sene e ruibarbo (laxantes a base de antraquinona), L-dopa) , fenolsulfonftalena (corante para teste de funo renal), Castanho nitrofurantona (furadantin), metronidazol (flagyl), sorbitol de ferro, furazolidona ( furaxone), Verde metocarbamol (robaxin), ASPECTO: Refere-se a transparncia da amostra de urina. A urina normal, recm eliminada geralmente lmpida, podendo apresentar certa opacidade devido a precipitao de cristais, presena de filamentos de muco e clulas epiteliais na urina de mulher. Procedimento:Observar ambiente de boa iluminao. visualmente a amostra homogeneizada num levodopa (

Aspecto da urina: limpo; ligeiramente turvo; turvo; acentuadamente turvo. Substncias que provocam turvao: cristais, leuccitos, hemcias, bactrias, smen, linfa, lipdios, clulas epiteliais, muco, e contaminantes externos (talcos, medicamentos). EXAME QUMICO

A determinao do exame qumico realizado em fita reativa que determina semi-quantitativamente a presena de protenas, glicose, corpos cetnicos, sangue/ hemoglobina, bilirrubina, urobilinognio, densidade, nitrito, pH e leuccito.

Fig. 17 - Teste de Fita Reativa para Urina

Fig. 18 - Tabela de Resultados do Teste de Urina pela Fita Reativa

Reao de pH : Os pulmes e os rins so os principais reguladores do equilbrio cido-bsico do organismo. A determinao do pH urinrio importante por ajudar a detectar possveis distrbios eletrolticos sistmicos de origem metablica ou respiratria, tambm pode indicar algum distrbio resultante da incapacidade renal de produzir ou reabsorver cidos ou bases. O controle do pH feito principalmente da dieta, embora possam ser usados alguns medicamentos. O conhecimento do pH urinrio, importante tambm na identificao dos cristais observados durante o exame microscpico do sedimento urinrio, e , no tratamento de problemas urinrios que exija que a urina esteja em um determinado pH.

Procedimento: A reao da urina verificada pelas fita-reagente, que medem o pH em variaes de 1 unidade entre 5 e 9. Os fabricantes utilizam um sistema de indicador duplo de vermelho de metila azul de bromotimol que fornecem uma variao de laranja, verde e azul medida que o pH aumenta. Referncia: 4,5 a 8,0 Protena: A urina normal contm quantidades muito pequena de protenas, em geral, menos de 10 mg/dl ou 150 mg por 24 horas. Esta excreo consiste principalmente de protenas sricas de baixo PM (albumina) e protenas produzidas no trato urogenital (Tamm Horsfall ). Procedimento: O mtodo da fita reagente utiliza o princpio do erro dos

indicadores pelas protenas, dependendo do fabricante , a rea para determinao de protenas na tira contm tetrabromofenol ou tetraclorofenol e um tampo cido para manter o pH em nvel constante. Mergulha-se a fita na urina homogeinizada; A leitura feita aps 60 segundos.

Resultado: Negativo ou Traos ( +1, +2, +3 ) Cetonria: Engloba trs produtos intermedirios do metabolismo das gorduras : acetona (2%) , cido acetoactico (20%) e cido beta-hidroxibutrico (78%). A presena de cetonria indica deficincia no tratamento com insulina no diabete melito, indicando necessidade de regular a sua dosagem, provoca o desequilbrio eletroltico, a desidratao e se no corrigida a acidose, que pode levar ao coma. Procedimento: O teste com fita, utiliza a reao do nitroprussiato de sdio que ir reagir com cido acetoactico e a acetona em meio alcalino produzindo colorao, no detecta o beta-hidroxibutrico. O resultado positivo, pode ser confirmado pelo teste de Imbert. Mergulhar a fita na urina homogeinizada; Ler aps 60 segundos.

Resultado: Negativo ou Positivo (+1, +2, +3)

Bilirrubina: A bilirrubina, um produto da decomposio da hemoglobina , formado nas clulas retculo-endoteliais do bao, fgado, medula ssea e transportado ao sangue por protenas. A bilirrubina no conjugada no sangue, no capaz de atravessar a barreira glomerular nos rins. Quando a bilirrubina conjugada no fgado, com o cido glicurnico, formando o glicurondeo de bilirrubina, ela se torna hidrossolvel e capaz de atravessar os glomrulos renais, na urina. A urina do adulto contm, cerca de 0,02mg de bilirrubina por decilitro, que no detectada pelos testes usuais. A presena de bilirrubina conjugada na urina sugere obstruo do fluxo biliar; a urina escura e pode apresentar uma espuma amarela. A bilirrubinria est associada com um nvel srico de bilirrubina(conjugada) elevado, ictercia, e fezes aclicas(descoradas, pela ausncia de pigmentos derivados da bilirrubina). Procedimento:O teste para bilirrubina baseado numa reao diazotizao, a reao baseia-se na conjugao da bilirrubina com o sal diazico em meio cido. Mergulhar a fita na urina homogeinizada; Ler aps 60 segundos.

Resultado: Negativo ou Positivo(+1, +2, +3) Bilirrubinria: obstruo do ducto biliar, leso heptica (hepatite, cirrose), cncer, doenas na vescula biliar. Glicose: Em circunstncias normais, quase toda a glicose filtrada pelos glomrulos reabsorvida pelo tbulo proximal, atravs de transporte ativo, e por isso a urina contm quantidades mnimas de glicose. O limiar renal de 160 a 180 mg/dl. Um paciente com diabetes mellitus apresenta uma hiperglicemia, que pode acarretar uma glicosria quando o limiar renal para a glicose excedido. Procedimento: Teste com fitas reativas utiliza o mtodo da glicose oxidase, peroxidase, e tampo, para produzir uma reao enzimtica dupla sequencial. As fitas diferem em relao ao cromgeno utilizado. O teste de glicose oxidase especfico para a glicose, no reage com lactose, galactose, frutose ou metablicos redutores de drogas. mergulhar a fita na urina homogeinizada; a leitura feita aps 60 segundos.

Resultado: normal (pode aparecer glicose em concentrao de at 35mg/dl em 24 h.) ou traos ( +1, +2, +3 ). Urobilinognio: Pigmento biliar resultante da degradao da hemoglobina. produzido no intestino a partir da reduo da bilirrubina pela ao das bactrias intestinais. A bilirrubina livre no intestino, reduzida em urobilinognio e estercobilinognio, e a maioria do pigmento excretado nas fezes como estercobilinas. Uma pequena quantidade de urobilinognio, absorvida pela circulao portal do clon e dirigida ao fgado onde excretado novamente, no conjugado, na bile. Normalmente, uma pequena quantidade chega aos rins, porque enquanto o urobilinognio circula no sangue, passa pelos rins, e filtrado pelos glomrulos. A excreo normal de urobilinognio de 0,5 a 2,5 mg ou unidades/24 horas. Procedimento: O teste com fita regente, utiliza um sal de diaznio estvel, que produz em presena do urobilinognio um composto azico que varia de rosa vermelho. O resultado positivo deve ser confirmado pelo mtodo de Erlich. mergulhar a fita na amostra homogeneizada; ler aps 30 segundos.

Resultado: Normal ou positivo Nitrito: til na deteco da infeco inicial da bexiga ( cistite ), pois muitas vezes os pacientes so assintomticos, ou tem sintomas vagos, e quando a cistite no for tratada, pode evoluir para pielonefrite, que uma complicao frequente da cistite, que acarreta leso dos tecidos renais, hipertenso e at mesmo septicemia. Pode ser usado para avaliar, o sucesso da antibioticoterapia, para acompanhar periodicamente as pessoas que tem infeces recorrentes, diabticos, e mulheres grvidas que so considerados de alto risco para infeco urinria. Procedimento: A base bioqumica do teste a capacidade que tm certas bactrias de reduzir o nitrato, constituinte normal da urina, em nitrito, que normalmente no aparece na urina. Para a determinao de nitrito, a urina deve permanecer na bexiga, por pelo menos 4 horas, para que a populao vesical converta o nitrato urinrio em nitrito, e o tratamento com antibitico deve ser suspenso pelo menos trs dias antes do teste.

Para se evitar, reaes falso-positivos de amostras

contaminadas, a

sensibilidade do teste padronizada para corresponder aos critrios da cultura bacteriana que exigem que uma amostra positiva de urina, contenha 100.000 organismo/ml. Emergir a fita reagente na urina homogeneizada; Ler aps 60 segundos.

Resultado: Negativo ou Positivo Presena de Nitrito: cistite, pielonefrite, avaliao da terapia com antibiticos, seleo da amostras para culturas. Sangue: O sangue pode estar na urina na forma de hemceas ntegras (hematria) ou de hemoglobina livre produzida por distrbios hemolticos ou por lise de hemceas no trato urinrio (hemoglobinria). O exame microscpico do sedimento urinrio, mostrar a presena de hemceas ntregas, mas no de hemoglobina, portanto, a anlise qumica o mtodo mais preciso para determinar a presena de sangue na urina. Procedimento: As anlises qumicas da fita para deteco de sangue, utilizam as atividade da peroxidase da hemoglobina. Existem duas escalas cromticas separadas para hemceas e hemoglobina. Na presena de hemoglobina livre, aparecer cor uniforme, em contraposio, as hemceas ntegras, so lisadas ao entrarem em contato com a rea da tira que determina a presena ou ausncia de sangue, e a hemoglobina liberada, produz uma reao isolada, que resulta na formao de pequenas manchas( traos ). A anlise da fita, estabelece a diferena de hemoglobinria e hematria e no sua quantificao. Quando for positivo para hemceas, sua quantificao realizada na cmara de Newbauer. Imergir a fita na amostra homogeneizada; Ler aps 60 segundos.

Resultado: Negativo, Positivo +1, +2, +3 ou positivo para hemoglobina. Hematria: clculos renais, glomerulonefrite, tumores, traumatismos,

pielonefrite, exposio a drogas. Hemoglobinria: lise das hemcias no trato urinrio, hemlise intravascular (transfuses, anemia hemoltica, queimaduras graves, infeces).

Leuccitos: Indica uma possvel infeco do trato urinrio. Procedimento: O teste com fita reagente, utiliza as esterases presentes nos granulcitos. Possui uma sensibilidade de 81% a 94%, e uma especificidade de 69% a 83%. Quando a fita apresentar resultado positivo para leuccitos, a sua quantificao ser realizada na cmara de Newbauer. Emergir a fita na urina homogeneizada; Ler aps 60 segundos.

Resultado: Negativo ou Positivo +1, +2, +3. Piria: Todas as doenas renais e do trato urinrio. Tambm podem estar aumentados transitoriamente durante estados febris, e exerccios severos. 6.5. Imunologia A imunologia a cincia que estudo o sistema imunolgico, sistema este que responde aos patgenos e/ou agresses que o corpo sofra. Esta resposta mediada por uma srie de anticorpos que reagem com os antgenos e formam o complexo antgeno-anticorpo. Baseado na formao desse tipo de complexo que se desenvolveu uma srie de mtodos afim de diagnosticar uma molstia de forma menos invasiva. Existem diversas tcnicas de imunodiagnstico, como vem sendo chamado o diagnstco por meio de tcnicas imunolgicas, entre eles temos: testes de imunoprecipitao, aglutinao, fixao do complemento, neutralizao ou imunos ensaios que utilizam sinalizadores da interao Ag-Ac com conjugados ligantes, como imunofluorescncia, radioimunoensaio, imunoenzimtico, imunofluotico, imunofluorimtricotrico e quimioluminescncia. (Vaz, et al., 2007) A seguir descreve-se alguns testes imunolgicos realizados durante o estgio em anlises clnicas: 6.5.1. Elisa O ensaio ELISA o mais comumente utilizado nos laboratrios e baseia-se na imobilizao de um dos componentes, antgeno ou anticorpo, em fase slida, e na utilizao de um conjugado, que tambm pode ser antgeno ou imunoglobulina, ligado a uma enzima. (Vaz, et al., 2007)

Como o substrato forma um produto colorido, a alterao de cor monitorada visualmente ou por meio de espectroftometro, que determina a relao entre a intensidade da cor e a quantidade do que est sendo analisado na amostra. (Vaz, et al., 2007) A amostra, preferencialmente soro ou plasma, deve ser processada na diluio em que uma pequena variao resulte em um grande aumento da densiade ptica. A amostra ideal deve ser lmpida, sem hemlise e no lipmica,conservada por at sete dias entre 2 a 8C ou congelada a -20C, desde que evitados processos de congelamento e descongelamento frequentes. (Vaz, et al., 2007) Teste de HIV

Amostras so incubadas em poos da microplaca recobertos com antgenos recombinantes de HIV-1 e HIV-2 (1). Se a amostra contiver anticorpos anti-HIV1/2/O, estes se ligaro aos antgenos adsorvidos na placa (2). Aps a lavagem para retirar o excesso de amostra (3), so adicionados antgenos recombinantes de HIV-1 e HIV-2 marcados com enzima (conjugado) (4). O conjugado se ligar aos anticorpos na etapa anterior (5). Aps novo procedimento de lavagem para remover o excesso de conjugado (6), adicionada soluo contendo o substrato da enzima e o cromgeno(8). A intensidade da cor formada proporcional concentrao de anti-HIV-1/2/O presente na amostra (9). (Labtest Diagnstica, 2007) Isto est esquematizado na figura abaixo.

Amostra

1
P Substrato Lavagem Ag conj. P P Lavagem P P cromogeno e P P

3 2

4 5

6 7

8 9

Fig. 19-Esquema das reaes imunoenzimticas do Elisa

= antgenos recombinantes de HIV-1 e HIV-2 = Anticorpos anti-HIV-1/2/O

P

= Antgenos recombinantes de HIV-1 e HIV-2 marcados com enzima (conjugado)

Abaixo est representada uma placa de Elisa aps adio da soluo de parada responsvel por parar a reao entre o substrato e a enzima para realizar a leitura da intensidade da cor.

Fig. 20-Placa de Elisa (Fonte: http://www.cnpgc.embrapa.br/publicacoes/naoseriadas/babesia/babesia.html)

Para a leitura no espectroftometro deve-se ajustar o zero da leitora com o poo do branco a 450 nm e medir a absorbncia em cada um dos poos no prazo mximo de 30 minutos. (Vaz, et al., 2007) Para diferenciar as amostras positivas das negativas necessrio determinar o limite de reatividade ou cut off . Normalmente esse cut off determinado pelo valor das mdias das absorbncias dos controles negativos multiplicado por uma constante. A positividade ou negatividade da amostra avaliada pela proporo entre o seu valor de absorbncia e o cut off, por exemplo, o teste de HIV da Labtest considerada o seguinte quadro para avaliar as amostras:
Tabela 7- Limites de resultados para teste de HIV do Kit ref.: 419 da Labtest (Fonte: Labtest, 2007).

Amostra REATIVA ou POSITIVA NO-REATIVA ou NEGATIVA INCONCLUSIVA ou INDETERMINADA

Relao absorbncia/cut-off 1,10 < 0,90 0,90 e < 1,10

Um resultado positivo indica infeco pelo vrus HIV-1 ou HIV-2. Entretanto, para que um indivduo seja diagnosticado como portador do vrus HIV, outros testes confirmatrios devem ser realizados, como a Imunofluorescncia Indireta (IFI), ImunoBlot (IB) ou Western Blot (WB). (Labtest Diagnstica, 2007)

6.5.2. Elisa-Immnunoblot A tcnica um ensaio imunoenzimtico realizado sobre a superfcie de uma membrana de nitrocelulose sobre a qual so imobilizados imungenos especficos (poliprotenas antigncias) atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida. (Mackenzie-LAC, 2009) (Vaz, et al., 2007) Para realizar o teste a amostra contendo anticorpos incubada com a membrana de nitrocelulose contendo as protenas especficas para o que se pretende diagnosticar, separadas por tamanho molecular. Aps a lavagem para a retirada dos componentes no-fixados, adicionado o conjugado enzimtico antiimunoglobulina humana, que se fixa imunoglobulina da amostra. Uma nova lavagem realizada para a retirada do excesso de conjugado, seguida a adio do substrato cromognico para o desenvolvimento de cor insolvel. A reao interrompida pela retirada do substrato e lavagem da membrana com gua, e a leitura realizada visualmente. Essa sequencia de eventos est esquematizado na Fig. 21 abaixo. (Vaz, et al., 2007) A interpretao do resultado feita pela anlise da presena de bandas (desenvolvimento de cor sobre antgeno fixado) que revelam a presena de anticorpos especficos. (Vaz, et al., 2007)

Fig. 21-Esquema das reaes que ocorre no teste de Immunoblot (Fonte: Yoshimi, 2009)

Deteco de anticorpos Anti-HCV

A Hepatite todo processo inflamatrio que envolva o fgado, pode ser causada por vrus, bactria, parasitas, auto-imunidade, drogas e lcool. A Hepatite C causada pelo vrus HCV, transmitida via parenteral Aps a exposio, o RNA do HCV pode ser detectado dentro de 1 a 3 semanas. No incio dos sintomas, quando presentes , alm de viremia, anticorpos anti-HCV podem ser detectados em 50-70% dos casos, chegando a 90% aps 3 meses de infeco. Assim sendo, pode-se fazer o diagnstico laboratorial atravs dos seguintes imunoensaios: deteco de anticorpos anti-HCV e deteco quali e quantitativa do antgeno do core do HCV. (Vaz, et al., 2007) Para a deteco de anticorpos anti-HCV realiza-se a tcnica de Immnunoblot utilizando imungenos especficos codificados pelo genoma do HCV imobilizadas sobre uma membrana suporte. (Mackenzie-LAC, 2009) Os imungenos utilizados so antgenos recombinantes HCV codificados e peptdeos sintticos HCV codificados. Os dois antgenos recombinantes (c33c e NS5) e os peptdeos sintticos (c100p e 5-1-1p) so derivados de regies virais no estruturais, enquanto o 3 peptdeo (c22pn) corresponde ao nucleocapsdeo (core) de natureza estrutural. Na figura abaixo (Fig. 22) esto representados os antgenos utilizados para as reaes sorolgicas.

Fig. 22 Organizao genmica do HCV e as principais protenas utilizadas como antgenos para as reaes sorolgicas (Fonte: Vaz, et al,2007)

Aps o contato da amostra que seja positiva para HCV, formam-se bandas coloridas nas regies especficas da fita teste, cuja intensidade lida em escala de

1+ a 4+. Os resultados so expressos como positivo, negativo ou indeterminado, segundo critrio de interpretao recomendado pelo fabricante. (Vaz, et al., 2007) 6.5.3. PSA O Antgeno Prosttico Especfico (PSA) uma glicorpotena, com peso molecular de aproximadamente 34kDa, produzida pelas clulas prostticas e um componente normal do smen. Quando eventos anormais ocorrem na prstata podem resultar em elevao nos nveis de PSA no sangue, os quais so teis para o diagnstico do Cncer de Prstata e da Hiperplasia Benigna da Prstata. Processos inflamatrios como prostatitis tambm alteram os nveis de PSA, os quais retornam rapidamente ao normal aps o tratamento. Vrios autores tm demonstrado a deteco de cncer de prstata por bipsia em 25% dos casos que apresentam nveis de PSA entre 2,5 a 4,0ng/ml, de 30% quando entre 4 a 10ng/ml e 65% quando acima de 10ng/ml, em homens acima de 50 anos. Como a concentrao sangunea de PSA aumenta com a idade, o cut-off de 2,5ng/ml deveria ser sempre considerado em indivduos abaixo de 50 anos. Principo do mtodo: O PSA presente na amostra liga-se ao anticorpo antiPSA conjugado ao ouro coloidal, mistura migra por capilaridade pela membrana ligando-se aos anticorpos anti-PSA fixos na membrana gerando uma banda colorida na rea teste T. Na ausncia de PSA na amostra no h aparecimento de uma banda colorida na rea teste T. Um reagente de controle imobilizado na membrana determinar o aparecimento de uma segunda banda na rea de controle C, demonstrando que os reagentes esto funcionando corretamente.

Fig. 23 - Placa de teste de PSA onde T a rea teste, C a rea controle.

Resultado negativo: Somente uma banda

colorida aparecer na rea controle (C).

Resultado

positivo:

Aparecero

duas

bandas, uma na rea teste (T) e outra na rea controle (C).

6.5.4. Teste de gravidez (Imunocromatografia) A deteco imunolgica do hormnio gonadotrofina corinica (HCG) universalmente reconhecida como um teste diagnstico da gravidez. (Wama Diagnstica, 2008) O Imuno-RPIDO HCG um teste imunocromatogrfico, em uma nica etapa, que identifica seletivamente o HCG na amostra. (Wama Diagnstica, 2008) O teste consiste em pipetar amostra de soro ou urina (sem bolhas de ar) na cavidade da amostra na placa-teste (Fig. 24). O HCG presente na amostra liga-se ao conjugado anticorpo monoclonal antiHCG-corante formando um complexo antgeno-anticorpo. Este flui pela rea absorvente da tira-teste / placa-teste indo se ligar aos anticorpos anti-HCG na rea da reao positiva (T), determinando o surgimento de uma banda colorida rosa clara. (Wama Diagnstica, 2008) Na ausncia de HCG no haver o aparecimento da banda colorida na rea T. A mistura da reao continua a fluir atingindo a rea controle (C). O conjugado no ligado ao antgeno une-se aos reagentes desta rea produzindo uma banda colorida rosa-clara, demonstrando que os reagentes esto funcionando

corretamente. (Wama Diagnstica, 2008) (Mackenzie-LAC, 2009)

Fig. 24 Placa de teste de HCG onde T a rea teste, C a rea controle. (Fonte:WAMA Diagnstica)

Resultado negativo: Somente uma banda

colorida aparecer na rea controle (C).

Resultado positivo: Aparecero duas bandas, uma na rea teste (T) e outra na rea controle (C). 6.5.5. Aglutinao de Ltex Na aglutinao em ltex tem-se um dos componentes (antgeno ou anticorpo) est na forma insolvel, em suspenso, adsorvido artificialmente a micropartculas de ltex. (Vaz, et al., 2007) Caracteriza-se pela formao de agregados suficientemente grandes, resultantes da interao por pontes moleculares de anticorpos especficos (ou determinantes antgnicos) e as micropartculas insolveis sensibilizadas com

determinantes antgnicos (ou anticorpos, respectivamente). (Mackenzie-LAC, 2009) (Vaz, et al., 2007) Ocorrem em 2 estgios onde o 1 conssite na ligao das molculas do anticorpo aos antgenos (que se encontram na superfcie da partcula de ltex) atravs de ligaes no covalentes. O 2 resulta na coliso entre as partculas formadas, resultando em pontes entre as partculas, formando agregados. Pode ser direta ou indireta. (Mackenzie-LAC, 2009) Esses agregados facilitam a visualizao do imunocomplexo, que pode ocorrer em questo de minutos ou algumas horas, e a leitura pode ser visual a olho nu ou com auxlio de lupa contra luz indireta. (Vaz, et al., 2007) PCR

A Protena C-reativa (PCR) uma protena da fase aguda que quando alterada caracteriza atividades inflamatrias inespecficas, auxiliando o diagnstico e o controle evolutivo da inflamao. (Mackenzie-LAC, 2009) (Wama Diagnstica, 2008) A PCR aparece muito precocemente no soro de pacientes afetados por uma variedade de processos inflamatrios e necrose de tecidos, tais como infeces bacterianas, doena reumtica aguda, infarto de miocrdio, certas doenas virais, tuberculose pulmonar ativa, artrite reumatide e neoplasia maligna. (Wama Diagnstica, 2008)

O PCR muito importante porque se observa seu aumento antes mesmo da elevao da VHS, mantendo-se elevado posteriormente e no processo de cura, a PCR volta normalidade antes da VHS. (Mackenzie-LAC, 2009) O Imuno-LtexPCR utiliza partculas de ltex cobertas com anticorpo monoclonal anti-PCR, quando o soro contendo PCR misturado a essas partculas, ocorre aglutinao visvel a olho nu. (Wama Diagnstica, 2008) (Mackenzie-LAC, 2009) Pode-se fazer um acompanhamento do processo inflamatrio pelo teste de PCR realizando o teste quantitativo, onde se faz uma srie de diluies da amostra e procede-se com todas as diluies da mesma forma que no teste qualitativo. O ttulo da amostra corresponder a maior diluio em que ocorrer aglutinao. Obtm-se a concentrao de PCR na amostra multiplicando esse ttulo pela sensibilidade do mtodo. (Wama Diagnstica, 2008) O monitoramento dessas concentraes oferece indicaes sobre a evoluo do processo inflamatrio e a efetividade da terapia, por exemplo, a doena est em fase inicial a concentrao de PCR plasmtica aumenta mais rapidamente do que a velocidade de hemossedimentao e desaparece imediatamente aps a

recuperao. (Wama Diagnstica, 2008) Entre as molstias reumticas tem na febre reumtica sua melhor utilizao, especialmente na fase inicial, com alta porcentagem de positividade. Seu reaparecimento, nos casos, sob tratamento, expressa um reagravamento do processo, sendo interessante pesquis-la em intervalos regulares. (Wama Diagnstica, 2008) A monitorao ps-cirrgica da PCR bastante til como indicador de complicaes inflamatrias ou spticas. Ela pode tambm estar aumentada no primeiro trimestre da gravidez e permanecer assim at o parto, bem como aumentar em mulheres que fazem uso de contraceptivos orais. (Wama Diagnstica, 2008) ASLO

A estreptolisina O, produzida por quase todas as cepas de Streptococcus hemoltico do grupo A, tem potente antigenicidade. Estimula o organismo a produzir anticorpos antiestreptolisina O (ASLO), por isso tem se tornado o indicador de infeces estreptoccicas e suas complicaes, tais como a febre reumtica e a glomerulonefrite aguda. (Mackenzie-LAC, 2009) (Wama Diagnstica, 2008)

O teste utiliza partculas de ltex revestidas com estreptolisina O, purificadas e estabilizadas que mostram ntida aglutinao quando misturadas, com um soro contendo nveis elevados de anticorpos antiestreptolisina. (Wama Diagnstica, 2008) A monitorao dos nveis de ASLO pode-se fazer til para acompanhamento da efetividade do tratamento j que a instituio precoce de antibiticos e corticosterides at 12 a 15 dias aps a infeco estreptoccica pode diminuir a resposta imunolgica do indivduo, com conseqentes baixos ttulos de ASLO. (Wama Diagnstica, 2008) Para essa monitorao realiza-se o teste quantitativo, onde se faz uma srie de diluies da amostra e procede-se com todas as diluies da mesma forma que no teste qualitativo. O ttulo da amostra corresponder a maior diluio em que ocorrer aglutinao. Obtm-se a concentrao de PCR na amostra multiplicando esse ttulo pela sensibilidade do mtodo. (Wama Diagnstica, 2008) Embora considerado como um importante teste, a ASLO representa apenas uma resposta a uma prvia infeco estreptoccica e a sua elevao no significa um reumatismo. (Wama Diagnstica, 2008) Fator reumatide (FR)

O fator reumatide (FR) um dos mais teis marcadores clnicos da artrite reumatide no soro. (Wama Diagnstica, 2008) Fator reumatide o termo usado para descrever uma variedade de anticorpos (IgM, IgG, IgA e IgE) que podem se ligar ao fragmento Fc de uma imunoglobulina G. So, portanto, uma antiimunoglobulina. (Wama Diagnstica, 2008) O Imuno-Ltex FR um teste bastante sensvel, que utiliza partculas de ltex revestidas com IgG humana altamente purificada, estabilizada e suspensa. (Wama Diagnstica, 2008) A artrite reumatide uma doena auto-imune de evoluo lenta, que tende cronicidade, podendo em 15-20 anos de doena caracterizar-se por um quadro de deformidades e limitaes de movimento, decorrentes da destruio de cartilagens, as quais podem calcificar e fragmentar. (Mackenzie-LAC, 2009) O valor diagnstico da prova do ltex de cerca de 85-95% dos casos. Uma pequena parcela de pacientes pode desenvolver a doena sem apresentar FR no

soro. Da mesma forma h casos de pessoas clinicamente normais e que apresentam ttulos baixos de FR. (Mackenzie-LAC, 2009) O aumento do titulo reflete a progresso da doena, desta forma a quantificao super importante. Pode haver resultados falsos positivos em outras doenas do colgeno, como LES e outras como a sfilis e outras doenas hepticas. (Mackenzie-LAC, 2009) 6.5.6. Tipagem ABO O sistema ABO apresenta

os antgenos expressos na membrana das

hemcias e anticorpos naturais circulantes contra o antgeno ausente. (Vaz, et al., 2007) Por esses antgenos classifica-se o sangue do homem em grupos ABO. de grande importncia identificar a que grupo um paciente pertence em casos de transfuso de sangue, transplante de rgos, questes de paternidade,

investigaes forenses e estudos genticos. (Walters, et al., 1998) A tipagem direta do grupo sanguneo ABO realizada com as hemcias do paciente suspensas em soluo fisiolgica contra soros comerciais anti-A, anti-B e anti-AB, seguindo o princpio da aglutinao (Fig. 26 e Fig. 25). (Vaz, et al., 2007) (Walters, et al., 1998)

Fig. 25 - Tipagem ABO em lmina misturando antisoros com sangue

Fig. 26 Lmina com anti-soros e sangue

Se o antgeno presente nas clulas corresponde ao anticorpo do anti-soro, o anticorpo ir se ligar ao antgeno e formar grumos que sero visualizados. Se o antgeno no est presente nas clulas, no haver aglutinao (Fig. 27). (Walters, et al., 1998)

Fig. 27 - Aglutinao de clulas sanguneas com anti-A no campo A.

6.5.7. Floculao (Teste para Sfilis) O teste de floculao, variante da aglutinao indireta, ocorre quando a interao direta de cardiolipina, cristais de colesterol e lecitina, preparada em salina tamponada, funciona como antgeno para anticorpos anticardiolipina, chamados de reaginas, frequentes na sfilis. (Vaz, et al., 2007). OS anticorpos anticardiolipina presentes na amostra interagem com a cardiolipina da suspenso antignica. Os imunocomplexos formados ficam depositados sobre os cristais de colesterol, que refringente, formando grumos que so visveis no miscroscpio ptico ou utilizando-se uma lupa contra luz indireta (Fig. 28). (Vaz, et al., 2007)

Fig. 28 Ilustrao da Reao de Floculao (VDRL) Fonte: (Vaz, et al., 2007)

Faz-se titulao de uma sria de diluies do soro desconhecidos e o soro positivo. O soro negativo testado sem diluio (Mackenzie-LAC, 2009) A leitura feita observando-se a aglutinao a olho nu ou ao micrscpico com pequeno aumento. A ltima diluio que apresenta grumos de aglutinao representa o ttulo do soro. (Vaz, et al., 2007) (Mackenzie-LAC, 2009)

Para evitar o efeito de pr-zona, o teste deve ser feito na triagem com a amostra sem diluir e diluda a 1:10, simultaneamente. Esse fenmeno acontece quando h elevada concentrao (ttulos muito elevados) de anticorpos que proporcionam resultados falso-negativo em ensaios com amostra pouco diluda (Fig. 29). (Vaz, et al., 2007)

Fig. 29 Fenmeno de pr-zona observado quando h excesso de anticorpos, ou seja, h anticorpos, mas os imunocomplexos formados no alcanam tamanho visualizvel, como ocorre na zona de equivalncia. Fonte: (Vaz, et al., 2007)

Como a reao de V.D.R.L pode apresentar resultados falso-positivos em vrias molstias que no a sfilis recomenda-se a realizao de um teste treponmico (FTA-Abs) ou (MHTP) para confimar diagnstico. 6.5.8. Hemaglutinao Na Hemaglutinao so utilizadas hemcias formolizadas com protenas antignicas adsorvidas em sua superfcie. Essas hemcias, que podem ser chamadas sensibilizadas, quando expostas ao anticorpo anti a protena adsorvida em sua superfcie, ficam em suspenso, observando-se a formao de um manto ou tapete, formado pela malha de imunocomplexos Ag-Ac, que impede o depsito das hemcias, pela fora da gravidade, no fundo da placa. (Vaz, et al., 2007) (Mackenzie-LAC, 2009) O teste pode ser semi-quantitativo, titulando a presena de anticorpos utilizando diluies seriadas da amostra.

Fig. 30 - Hemaglutinao indireta: o antgeno adsorvido permite a deteco semiquantitativa de anticorpos especficos (A) com a formao de um tapete (B), mostrando em (C) a interao especfica do anticorpo com o antgeno adsorvido na hemcia. O teste negativo se apresenta como um boto sedimentado no fundo da placa (D). O teste controle (E) mostra a interao inespecfica de anticorpos da amostra com antgenos da clula, o que invalidaria o teste.

A leitura observada geralmente aps perodo de 30 a 90 minutos de incubao, tempo suficiente para que as hemcias no-aglutinadas sedimentem no fundo da placa. Em paralelo ao ensaio-teste, deve ser realizado teste-controle, que o teste utilizando clulas no-sensibilizadas. A finalidade do ensaio-controle verificar se na amostra h anticorpos heterfilos que interagem com antgenos da clula e no com os antgenos ligados a clula, resultando em falso-positivos. 6.6. Parasitologia Parasitologia clnica o estudo dos parasitas ou doenas parasitrias, dos mtodos de diagnstico, dos controles das doenas parasitrias e a relao ntima e duradoura entre os indivduos de duas espcies distintas a nvel histolgico. Na maioria dos casos um organismo (o hospedeiro) passa a constituir o meio ecolgico que vive o outro organismo (o parasito). A parasitologia engloba: os filos Protozoa (protozorios), do reino Protista e Nematoda (nematdes), Annelida (aneldeos), Platyhelminthes (platelmintos) e Arthropoda (artrpodes), do reino Animal. Os principais mecanismos de transmisso de parasitoses so: fecal-oral, penetrao ativa pela pele, vetorial ou por hospedeiros intermedirios, contato pessoal e congnito.

Assim, a maioria dessas parasitoses poderiam ser controlados atravs de aes educativas sobre higiene, tcnicas de saneamento melhoradas e medidas de controe de insetos. Todavia, em muitas partes do mundo, principalmente aquelas onde as condies sanitrias so precrias, os parasitas continuam sendo o maior causa de doenas e mortes. Na clnica a amostra mais frequentemente examinada so as fezes, nas quais encontra-se, mais comumente as seguintes formas: Nematodas Ascaris lumbricoides Larva: macho mede de 20 a 30cm de comprimento com extremidade posterior

recurvada, fmea de 30 a 40 cm e apresenta extremidade reta. Parasita o

posterior

intestino delgado.

Ovo frtil: cerca de 55 x 40m, camada mamelonada e embrio hexacanto no

desenvolvido.

Ovo infrtil: cerca de 90 x 40m e apresenta uma massa amorfa com casca fina.

Ovo frtil embrionado: cerca de 55 x 40m e apresenta camada embrio. mamelonada com

Trichuris trichiura Ovo: Casca grossa, embrio hexacanto no desenvolvido, tampos hialinos nas regies polares.

Ancylostoma duodenale e Necator americanus

Ovo:

formato

ovalado

presena de blastmeros no interior e tamanho de 50x 30 m.

Enterobius vermicularis. Ovo: formato grosseiro de D por apresentar um lado achatado e outro cncavo, casca fina e transparente, e tamanho de 55 por 25 m.

Strongyloides stercoralis

Larva rabdtide: presena de esfago rabdtide, bulso esofagiano, boca e vestbulo bucal. Seu tamanho chega a 300 m.

Protozorios Entamoeba histolytica

Cisto: apresenta de 1 a 4 ncleos, cariossoma central, tamanho de 10 a 20m e corpos cromatides em forma de bastonetes.

Trofozoto: irregular, um

formato ncleo com

cariossoma central, tamanho de 20 a 40 m.

Entamoeba coli Cisto: apresenta de 1 a 8 ncleos com cromossoma

excntrico, tamanho de 10 a 15 m e presena de corpos cromatides.

Trofozoto: formato irregular, um ncleo com cariossoma

excntrico, tamanho de 20 a 50 m

Iodamoeba butschlii Cisto: apresenta 1 ncleo com cromossoma central,

tamanho de 10 a 15 m e presena de vacolo de

glicognio caracterstico.

Trofozoto: irregular, um

formato ncleo com

cariossoma central.

Endolimax nana

Cisto: Ovide ou elptico, membrana cstica, com at 4 ncleos, cariossomo grande e irregular

Trofozoto: irregular, um

formato ncleo com

cariossoma grande e irregular.

Giardia lamblia Cisto: ovalado possui com 4 formato ncleos, 4

axonemas, 4 corpos parabasais , tamanho de 10 a 12 m. Encontrado em fezes formadas

Trofozoto: possui formato periforme com 2 ncleos, 2 axonemas, 2 corpos

parabasais, 4 pares de flagelo e 1 disco adesivo. Encontrado em fezes diarricas

Cestoda Hymenolepis nana Ovo: casca transparente,

embrio hexacanto, 3 pares de acleos, filamentos proticos e tamanho de 50 por 30 m.

Taenia solium e Taenia saginata Ovo: presena de embrio hexacanto radiais, interno, casca estrias protetora

(embriforo) e tamanho de 30mm Trematoda Schistosoma mansoni

Ovo: presena de espculo lateral, camada externa e

interna e massa celular O exame parasitolgico de fezes existe no sentido de identificar essas formas parasitrias nas fezes e, por seguinte, diagnosticar os parasitos intestinais causadores de doenas. Para isso conta com inmeros os mtodos existentes para a anlise de parasitas intestinais. Todavia de um modo geral, executa-se, de rotina, no setor de parasitologia clnica, alguns mtodos de concentrao de ovos e cistos, que possibilitam a identificao de cistos de protozorios e ovos de helmintos, tais como: mtodo de Faust e colaboradores, mtodo de Ritchie e mtodo de Hoffmann Pons e Janer. Algumas delas aprendidas durante o estgio de anlises clnicas e sero descritas abaixo. 6.6.1. Exame Macroscpico Observa-se a consistncia das fezes (slidas, pastosas, lquidas), odor, presena de elementos anormais, como muco ou sangue, e de vermes adultos ou proglotes.

6.6.2. Exame Direto (Exame a Fresco) As preparaes a fresco so preparadas de fezes frescas ou fixadas (preservadas). Nas fezes a fresco de amostras fixadas possvel observar cistos, ovos e larvas, mas no trofozotos. Para isso usa-se fezes frescas onde possvel observar a mobilidade dos trofozotos mveis. Preparo e Exame de Lminas a Fresco

Lminas

Microscpio

Fezes (frescas ou fixadas)

Gota de salina e Lugol

Fig. 31- Preparo e Exame de Lminas a Fresco

6.6.3. Hoffman, Pons e Janer (Sedimentao espontnea) Este mtodo, na realidade foi descrito por Lutz em 1919 no Brasil e padronizado por Hoffmann, Pons e Janer em 1934 em Porto Rico. Indicado para pesquisa de ovos e larvas de helmintos e, sobretudo, para a pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni. De fcil execuo o mais empregado nos laboratrios clnicos. uma tcnica de concentrao de fezes so usadas para concentrar os parasitas em uma amostra e aumentar a probabilidade de detectar os parasitas ao mesmo tempo que diminui a quantidade de resduos das fezes. A tcnica consiste em: A. Triturar bem com basto de vidros, aproximandamente 2g de fezes, em um frasco plstico descartvel, acrescentar 20mL de gua; B. Filtrar a suspenso para um clice cnico de 200ml de capacidade, por

interdio de tela metlica ou de nalon, ou gaze cirrgica dobrada em quatro ou parasito filtro; os detritos retidos so lavados com mais 20 mL de gu, agitando-se constantemente com o basto de vidro, devendo o lquido da lavagem ser recolhido no mesmo clice; Completar o volume do clice com gua; C. Deixar essa suspenso em repouso durante duas a 24 horas

Fig. 32 - Mtodo de Hoffman, Pons e Janer (HPJ): A. frasco plstico com fezes, gua e basto; B. Clice com a gaze e metodo de transferir as fezes dissolvidas na gua; C. Clice com o sedimento pronto para o exame e o lquido sobrenadante. Fonte: (Neves, et al)

6.6.4. Mtodo Faust e colaboradores Este mtodo de centrfugo- flutuao em sulfato de zinco a 33% com densidade 1,18g/mL foi desenvolvido por Faust e cols. em 1938, sendo o primeiro procedimento desenvolvido para diagnstico dos cistos de protozorios e de ovos leves de helmintos. Considerado simples e eficiente para a concentrao tanto de ovos de helmintos (no to indicado) como de cistos de protozorios, possibilitando ainda a flutuao de eventuais larvas de estrongilides ainda vivas. uma tcnica de flutuao que fundamenta-se no princpio da diferena da densidade especfica entre cistos de protozorios e o material fecal, a fim que as formas flutuem na superfcie dos reagentes com densidade especfica. Realizada como descrito abaixo: 1. Diluir 10g de fezes em 20mL de gua filtrada; 2. Homogeneizar bem; 3. Filtrar atravs de gaze dobrada em quatro ou parasito filtro, num copo plstico, e transferir para um tubo de ensaio; 4. Centrifugar por um minuto a 2500rpm; 5. Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua; 6. Repetir a operao 4e 5 mais duas ou trs vezes, at que o lquido sobrenadante fique claro; 7. Desprezar a gua sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma soluo de sulfato de zinco a 33%, densidade 1,18g/mL; 8. Centrifugar novamente por um minuto a 2500rpm;

9. Recolher a pelcula com ala de platina, colocar numa lmina, acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamnula; 10. Examinar com as objetivas de 10x e/ou 40x.

Fig. 33 - Tcnica de Faust. Fonte: (Neves, et al., 2005)

6.7. Microbiologia A Microbiologia clnica abrange o estudo dos vrus, fungos, bactrias e parasitas. Incluem-se tambm os testes para isolar e identificar estes

mircroorganismos. (Walters, et al., 1998) A cultura de bactrias o crescimento de colnias de microorganismos induzida pelo homem para se conseguir um elevado nmero de microorganismos, para estudar as caractersticas culturais da bactria como, a capacidade de crescer em meio selectivo e o aspecto das colnias. Realizada em meios de culturas que fornecem os princpios nutritivos indispensveis ao seu crescimento das bactrias. Entre os principais componentes de um meio de cultura esto s fontes de carbono e energia como os acares, as fontes de nitrognio, fsforo e sais minerais. Outros componentes mais especficos podem ser encontrados em um meio para determinados organismos, estes so os fatores de crescimento como as vitaminas, aminocidos, etc. Alm disso, preciso fornecer condies ambientais para o desenvolvimento dos microorganismos, como pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), etc. Um meio de cultura pode ser slido, semi-slido ou lquido, em relao a consistncia. Animados ou Inanimados quanto natureza. E so ainda classificados quanto a finalidade, sendo classificados em:

rimrios: aquele no qual o material coletado do paciente primeiro inoculado. A escolha do meio baseado na local da infeco. Seletivos: contem ingredientes que inibem o crescimento de certos microorganismos, enquanto deixa outros se desenvolverem. Por exemplo, meio EMB e MacConkey.

Indicadores: contm substncias que visivelmente mudam com resultado da atividade metablica de um microorganismo particular. H diferentes tcnicas para se efetuar uma semeadura, com ala de platina,

com swab, com ala calibrada, tcnica de isolamento, tcnica para antibiograma Para anlise de morfologia, estudo e identificao da espcie e gnero da bactria, faz-se a tcnica de isolamento em meio de cultura que consiste em isolar as colnias para que no haja interferentes e contaminaes cruzadas aps a incubao (Fig. 34).

Fig. 34 - Tcnica de isolamento de bactria

Para a tcnica de antibiograma e urinocultura faz se a semeadura preenchendo a placa inteira.

Fig. 35 - Tcnica de Semeadura e Antibiograma

6.7.1. Cultura de Urina A cultura de urina um dos mais freqentes testes pedidos no laboratrio de bacteriologia. Os mdicos requisitam uma cultura de urina quando o paciente tem sintomas de infeco do trato urinrio como: freqncia de mices, dor e sensao de ardncia quando urinando, sangue na urina, s vezes febre e dor nos rins. As infeces do trato urinrio ocorrem quando bactrias migram uretra acima para a bexiga, ou at mais adiante, aos rins. O microorganismo mais comumente responsvel Escherichia coli. Outros microorganismos encontrados so

Pseudomonas, Proteus, Klebsiella e Staphylococcus saprophyticus. Coletando a Amostra

A amostra a ser semeada deve ser coletada por jato mdio; Rotular frasco com identificao do paciente e a hora da coleta. Semeando a Placa para Contagem de Colnias

Flambar a ala calibrada e esfriar

Mergulhar na urina

Fazer estria vertical sobre o centro da placa de gar sangue (Fig.36)

Fazer de quinze a vinte estrias na horizontal cruznado a estria vertical (Fig. 36)

Flambar ala e guard-la

Incubar a placa por uma noite a 35-37C

Fig. 36 - Semeando uma placa de cultura de urina

Interpretando a cultura de urina

Aps o perodo de incubao as placas so removidas da estufa e observado o crescimento. Quaisquer caractersticas especficas do crescimento, assim como cor da colnia ou morfologia, hemlise no agar sangue, devem ser amotadas. Contar as colnias e multiplicar por 1000 se foi utilizdo ala de 0,001 mL ou multiplicar por 100 se foi utilizado ala de 0,01mL. Uma contagem de 100000/mL ou maior evidncia de infeco urinria, tenha ou no o paciente sintomas. Identificando o microorganismo.

Fazer um Gram dos organismos da placa de Agar sangue, segundo o fluxograma abaixo:
Selecionar uma colnia e tocar esta com uma ala previamente flambada e resfriada

Secar uma lmina e pingar soluo fisiolgica

Homogeneizar a colnia sobre a soluo fisiolgica

Proceder a colorao

Analisar em microscpio

Cocos Gram Positivos

Fig. 37 - Visualizao de Bactrias Gram Positivas por Microscopia

Se observar um organismo Gram positivo como na figura acima (Fig. 37), necessrio fazer um teste de catalase para diferenci-lo entre Streptococcus e Staphylococcus.

Borbulha Coletar uma poro da colnia com ala ou palito de madeira Staphylococcus Lmina de microscpio limpa Gotejar perxido de hirognio No-Borbulha Streptococcus

Se a bactria catalase positiva, cocos Gram positivos arranjados na forma de cachos de uva, observados na microscopia, deve ser feito um teste de coagulase para diferenciar Staphylococcus aureus de outros estafilococos.
Formao de grumos Coletar uma poro da colnia com ala ou palito de madeira Lmina de microscpio limpa Plasma comercial para coagulase Staphylococcus aureus No Forma grumos Staphylococcus sp.

Cocos Gram Negativos

Fig. 38 - Visualizao de Cocos Gram Negativos por Microscopia

Se observado cocos Gam negativos na microscopia com colorao de Gram deve ser feito semeadura das colnias em Agar EMB ou MacConkey, incubado por uma noite. Fazer colorao de Gram da bactria crescendo no Agar EMB ou MacConkey, o que confirmar a bactria Gram negativa, j que ambos inibem crescimento de organismos Gram positivos. Pelas caractersticas das colnias pode-se identificar o microrganismo pois muitas bactrias Gram negativas tem morfologia de colnia distinta em meios seletivos ou indicadores. As espcies de Klebsiella tm colnias caractersticas, rseas, mucides. E. coli forma um brilho verde metlico no EMB. 6.7.2. Teste de suscetibilidade aos antibiticos (Antibiograma)

Suspenso padronizada do organismo a ser testado

Swab umedecido na suspenso

Semear na placa de MuellerHinton como indicado na Fig. 39

Colocar os discos impregnados com antibitico (Fig. 40)

Incubar por uma noite a 35-37C

Fig. 39 - Semeando a placa de Mueller-Hinton

Fig. 40 - Colocando os discos de antibiticos sobre agar Mueller-Hinton

Interpretando o Teste de Suscetibilidade aos Antibiticos

As placas so lidas para inibio de crescimento em torno dos discos de antibiticos. As zonas de inibio podem ser medidas usando paqumetos ou rgua transparente (Fig. 41).

Fig. 41 - Medindo a zona de inibio usando uma rgua

Cada antibitico produz um tamanho especfico para cada organismo. O tamanho da zona ou halo de inibio classificar o organismo como sensvel (S), resistente (R) ou intermedirio (I). Esta informao fornecida nas istrues de uso dos discos de antibiticos. (Walters, et al., 1998) Um antibitico que produza uma zona sensvel dever ser prescrito para a infeco. (Walters, et al., 1998)

7. REFERNCIAS NOVALGINA: dipirona sdica. So Paulo: Hoechst, [ 199?]. Bula de remdio.

KATAL BIOTECNOLGICA: Lactato. Minas Gerais: Rezende, Leonides Jr., 2007. Bula de Kit. KATAL BIOTECNOLGICA: Glicoteck-glicohemoglobina. Minas Gerais: Rezende, Leonides Jr., 2007. Bula de Kit. KATAL BIOTECNOLGICA: Glicose. Minas Gerais: Rezende, Leonides Jr., 2007. Bula de Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Albumina. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit ref. 170309. LABTEST DIAGNSTICA: ALT/GTP Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: ALT/GTP Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: ALT/GTP Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: AST/GOT Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Amilase. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Bilirrubina Total. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Clcio Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit ref. 310809. LABTEST DIAGNSTICA: CK NAC Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Colesterol Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Creatinina. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Ferro srrico. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Fosfatase alcalina. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Fsforo UV. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Gama GT. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: HDL LE. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Hemoglobina Glicada. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit.

LABTEST DIAGNSTICA: Magnsio. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Mucoprotena. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit ref. 20. LABTEST DIAGNSTICA: Triglicrides Liquiform. Vista Alegre. 2008. Bula do Kit. LABTEST DIAGNSTICA: Protenas Totais. Vista Alegre. 2009. Bula do Kit ref. 170309. LABTEST DIAGNSTICA: Uria UV Liquiform. Vista Alegre. 2009. Bula do Kit ref. 261009. Neves, David Pereira, et al. 2005. Parasitologia Humana. 11 ed. So Paulo: Atheneu, 2005. WAMA DIAGNSTICA: HCV. Minas Gerais. 2007. Bula do Kit. WAMA DIAGNSTICA: HIV 1+2. Minas Gerais. 2007. Bula de Kit. WAMA DIAGNSTICA: Imuno-rpido PSA. Minas Gerais. 2009. Bula de Kit. WAMA DIAGNSTICA: Imuno-Ltex ASLO. Minas Gerais. 2008. Bula de Kit. WAMA DIAGNSTICA: Imuno-Ltex FR. Minas Gerais. 2008. Bula de Kit. WAMA DIAGNSTICA: Imuno-Ltex PCR. Minas Gerais. 2008. Bula de Kit. WAMA DIAGNSTICA: Imuno-Rpido HCG. Minas Gerais. 2008. Bula de Kit. 8. BIBLIOGRAFIA LABTEST DIAGNSTICA. 2007. HCV. Minas Gerais : s.n., 2007. Bula do Kit ref.:060608. Labtest Diagnstico S.A. 2007. HIV-1+2. 2007. Mackenzie-LAC. 2009. Deteco de Anticorpos Anti-HCV pelo mdodo Immunoblot. 2009. Roteiro de Aula de Estgio no LAC-MAC: Mdulo Imunologia. . 2009. Hemaglutinao. 2009. Roteiro de aula de estgio no LAC-MAC: mdulo imunologia. . 2009. Reao de V.D.R.L (Aglutinao para diagnstico do sfilis). 2009. Roteiro de aula de estgio no LAC-MAC: Mdulo Imunologia . . 2009. Testes de Aglutinao. 2009. Roteiro de Aula de Estgio no LACMAC: Mdulo Imunologia. Neves, David Pereira, et al. 2005. Parasitologia Humana. 11 ed. So Paulo : Atheneu, 2005.

Universidade Presbiteriana Mackenzie. Laboratrios. Site da Universidade Mackenzie. [Online] [Citao: 2 de 06 de 2009.]

http://www.mackenzie.br/farm_labs.html. Vaz, Adelaide J., Takei, Kioko e Bueno, Ednia Casagrande. 2007. Imunoensaios: Fundamentos e Aplicaes. Rio de Janeiro : Guanabara Koogan, 2007. Walters, Norma J., Estridge, Barbara H. e Reynolds, Anna P. 1998. Laboratrio Clnico: Tcnicas Bsicas. Porto Alegre : Artmed, 1998. Wama Diagnstica. 2008. Imuno-Ltex ASLO. 2008. VI edio. Bula do Kit ASLO da Wama. . 2008. Imuno-Ltex FR. 2008. VI edio. Bula do kit de FR da Wama. . 2008. Imuno-Ltex PCR. 2008. VI edio. Bula do Kit de PCR da Wama. . 2008. Imuno-rpido HCG. 2008. VI edio. Bula do Kit de HCG da Wama.

DECLARAO

Declaro, para os devidos fins, que o acadmico THAIS ARAGO, RG:44008521-4, realizou estgio nessa empresa, no perodo de 01 de julho 2009 07 de agosto de 2009 perfazendo 150horas.

So Paulo,_____ de _________________de ________

____________________________________ Responsvel tcnico Nome: ______________________________ C.R.B.M:_______________________________

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE Centro de Cincias Biolgicas e da Sade. Curso de Farmcia

Aluno: Thais Arago Estgio em: Anlises Clnicas (Estgio IV) Parecer da Comisso: Aprovado ( Reprovado ( Nota: ) )

Observao: