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DIAGNOSTICO VIRICO

Ronny Ramos Ramos. MICROBIOLOGIA

.En algunas enfermedades v rales !omo elsaram" #n$ el d agn#s% !o "uede es%a&le!erse so&re &ases !l'n !as. .En la mayor'a de nfe!! ones v'r !as$ es ne!esar o llegar a un d agn#s !o def n % vo$ en el la&ora%or o$ med an%e m(%odos directos e indirectos, )ue re)u eren el a slam en%o del v rus en an males o en !ul% vos de %e* dos$ la den% f !a! #n del v rus o la de%e!! #n de an%'genos es"e!'f !os del v rus o de los +! dos nu!le !os v rales ,d re!%os-. o la demos%ra! #n de res"ues%as serol#g !as es"e!'f !as , nd re!%os-

La Mues%ra/

La "resun! on !l'n !a$ la e" dem olog'a or en%an so&re la "rue&a ade!uada Las me*ores mues%ras$ en el es%ad'o %em"rano de la enfermedad ,"r meras 01 2orasDes"u(s de 0 d'as no real 3ar !ul% vos v rales en nmuno!om"e%en%es O&%en! #n as("% !a y volumen suf ! en%e Med o de %rans"or%e ,es%a& l dad- al&4m na de &ov no$ gela% na$ an% & #% !os$ an% f4ng !os Trans"or%e a 56C. S la no!ula! #n es en%re el 76 y 56 d'a se guardan en nevera 56a 896C

S la no!ula! #n es des"u(s de 5 d'as se !ongela a 80:6C Re! " en%es ade!uados$ %a"a 2erm(% !a$ !on%enedor me%+l !a$ %a"a ros!a$ ro%ulado de "el gro & ol#g !o.

METODOS DIRECTOS :VISUALIZACION DE LA PARTICULA VIRAL

Microscopa de !".8 T n! ones es"e! ales !on ;r g2% o G emsa$ e<%end dos de les ones ves !ulares$ se v sual 3an n!lus ones o !am& os !elulares$ !(lulas g gan%es mul% nu!leadas Microscopa ! tra#io eta$% T n! #n de an% !uer"os fluores!en%es de v rus en !(lulas nfe!%adas Microscopa e ectr&nica$% De%e!%an "ar%'!ulas v'r !as ,%ama=o y morfolog'a-. Sales de me%ales "esados !omo el uran o$ "la%a$

Ais a'iento #ira en c! ti#o/ In%ra!elulares$ s s%emas &asados en l'neas !elulares )ue "erm %an su desarrollo. Invas #n v ral se ev den! a a %rav(s de !am& o !elular o efe!%o ! %o"+% !o ,EC- y med an%e "rue&as !om"lemen%ar as >ro!eso len%o ,d'as a semanas-$ la&or oso$ !aro O&%en do de e<"lan%es de #rganos o em&r ones de an males. C(lulas se d so! an !on %r "s na$ en re! " en%es$ ad2 eren$

Mono!a"as !re!en en med o de !ul% vo !om"le*o ,+l&um na$ v %am nas$ sales$ glu!osa$ &uffer$ an% & #% !os-. Tam& (n !ul% vos en sus"ens #n$ #rganos Los c! ti#os ce ! ares se d v den en/ .Cul% vos "r mar os/ A "ar% r de !(lulas$ %e* dos u #rganos$ %omados del organ smo. ,r =#n em&r onar o 2umano.L'neas !elulares d "lo des/ De %e* dos normales$ n4mero !romosom !o d "lo de or g nal ,f &ro&las%os-

L'neas !elulares !on%'nuas/ C(lulas nmor%al 3adas en el la&ora%or o$ res s%en ,nn4meros de "ases$ se der van de %e* dos normales o %umorales$ !(lulas Vero ,r =on de mono verde afr !ano-$ ?eLa y ?e"81 de !(lulas 2umanas mal gnas$ son 2e%ero"lo des La 'onocapa se no!ula !on una mues%ra$ del nd v duo nfe!%ado$ el v rus se des!u&re "or el desarrollo de un e(ecto citop)tico ,@ a 5 d'as-$ s n! ! os$ ves'!ulas$ n!lus ones$ redondeam en%o

Cuando los v rus no "rodu!en efe!%o ! %o"+% !o$ se "uede re!urr r a %(!n !as )ue "onen en ev den! a la "resen! a del v rus/ *e'adsorci&n, el v rus nfe!%an%e$ n!or"ora "ro%e nas v rales ,2emaglu% n nas- en la mem&rana !elular$ )ue "rovo!a la adsor! #n de er %ro! %os ,or%om <ov rus$ "aram <ov rus-

Dis'in!ci&n en a prod!cci&n de )cido por as c+ ! as in(ectadas$ med an%e un !am& o de !olor en el ro*o fenol , nd !ador de "2- del !ul% vo. >erma!e ro*o ,al!al no- en "resen! a de !(lulas nfe!%adas. v ra a amar llo en "resen! a de !(lulas normales$ de& do a la "rodu!! #n de +! do ,en en%erov rus-

ant,enos:T+cnicas in'!no &,icas, -io o,a 'o ec!in'!no ar &,icas/ T+cnicas

.In'!no( !orescencia directa .ID/$%Detecci&n de ant,eno$ med an%e u% l 3a! #n de an% !uer"o mar!ado !on fluoro!romo ,!on*ugado- )ue es es"e!'f !o "ara el an%'geno a des!u&r r. An e<%end do en "la!a de la mues%ra$ del %e* do en mono!a"a !elular no!ulada !on la mues%ra$ se f *a$ se agrega el !on*ugado !on fluores!e'na$ n!u&a! #n y lavado$ se o&serva !on m !ros!o" o de fluores!en! a

En el d agn#s% !o r+" do de nfe!! ones v rales de %ra!%o res" ra%or o$ nfluen3a$ s n! % al res" ra%or o$ "aro% d % s$ saram" #n$ !oronav rus. En & o"s as de !ere&ro$ en!efal % s "or 2er"es s m"le$ ra& a Es la&or osa$ re)u ere m !ros!o" o de fluores!en! a$ de una "ersona !on e<"er en! a

Test de a, !tinaci&n$% M(%odo s m"le de un solo "aso$ "ara la detecci&n de ant,enos #ira es en mues%ras !l'n !as. B *a! #n n ! al de an% !uer"os an% v rales es"e!'f !os so&re er %ro! %os o "ar%'!ulas de l+%e<$ se n!u&an$ !on an%'genos !on var os e"'%o"os y an% !uer"os mul% valen%es$ se "rodu!e un en%ramado ,aglu% na! #n v s &leB+! l de real 3ar$ se lee a s m"le v s%a$ desven%a*a )ue da rea!!'ones !ru3adas$ n%erferen! as , "ro3ona $ en e<!eso de an% !uer"os-. Ro%av rus$ adenov rus

Radioin'!noan) isis .RIA/$% Se f *an los an% !uer"os es"e!'f !os en su"erf ! e de ma%r 3$ %u&o o m !ro"la!a$ luego se agrega la mues%ra )ue !on% ene el an%'geno )ue se )u ere demos%rar$ des"u(s de la rea!! #n an%'geno8an% !uer"o$ se lava$ se agrega un an% !uer"o mar!ado !on un s#%o"o rad oa!% vo ,yodo-$ an% IgG. Se m de la rad oa!% v dad med an%e un !on%ador de !en%elleo.

In'!noan) isis en"i')tico so-re (ase s& ida .ELISA-.8 Se &asa en la !a"%ura del an%'geno "or an% !uer"os es"e!'f !os un dos a una fase s#l da ,"o! llo de una m !ro"la!a-. El an%'geno v ral "resen%e en la mues%ra !l'n !a se !om& na !on el an% !uer"o f *ado a la fase s#l da y el an%'geno v ral se de%e!%a med an%e ad ! #n de o%ro an% !uer"o es"e!'f !o !on*ugado a una en3 ma ,"ero< dasa de r+&ano$ fosfa%asa al!al na-. El sus%ra%o "ara es%as en3 mas var'a ,"er#< do de 2 dr#geno$

La !uan% f !a! #n se real 3a !on un es"e!%rofo%#me%ro. T(!n !a r+" da y au%oma% 3ada$ no re)u ere o&servador e<"er men%ado$ en m+s o&*e% va )ue la %(!n !a de RIA

T+cnicas de 0io o,a Mo ec! ar.8 .? &r d 3a! #n !on sondas.8 Se e<%raen se!uen! as es"ef'!as de un fragmen%o de ADN$ "or med o de endonu!leasas de res%r !! #n. Luego es%as se!uen! as se desna%ural 3an y mar!an !on una en3 ma o so%o"o rad oa!% vo. A es%as !adenas mar!adas$ !on se!uen! a !ono! da se llaman sondas de +! dos nu!le !os. >or !lona! #n$ u% l 3ando el "lasm do !omo ve!%or y 2ongos o &a!%er as !omo 2u(s"edes$ es "os &le

Se %ra%a la mues%ra !on rea!% vos )ue solu& l 3an y desna%ural 3an los +! dos nu!le !os. >os%er ormen%e se a=ade un DNA mar!ado$ !om"lemen%ar o del DNA del v rus$ se n!u&a "ara )ue se "rodu3!a la 2 &r da! #n. Se "asa "or una !olumna )ue !on% ene un gel )ue se"ara la sonda l gada al ADN v ral 2 &r dado de la no 2 &r dada. De"end endo de !#mo es%e mar!ada la sonda se de%e!%a la 2 &r da! #n , so%o"o rad oa!% vo8 !on%ador gamma$ R<$ en3 ma8 evalua! #n !olor m(%r !a

Am"l f !a! #n de +! dos nu!le !os v rales$ med an%e rea!! #n en !adena de la "ol merasa ,>CRIn!remen%a el n4mero de mol(!ulas de DNA &lan!o en las mues%ras$ gra! as a la am"l f !a! #n sele!% va y re"e% % va de una se!uen! a de nu!le#% dos de un m !roorgan smo de%erm nado. Cons%a de @ "asos/ a/Desna%ural 3a! #n del ADN en la mues%ra ,CD6C- se"arar las !adenas$ --? &r d 3a! #n

a "ar% r de los !uales se n ! a la s'n%es s$ es%os son es"e!'f !os de la se!uen! a del agen%e a des!u&r r$ c/La e<%ens #n de es%os !e&adores "or la en3 ma ADN po i'erasa ,016C%ermoes%a&le$ )ue "rodu!e !adenas deADN den% !as a la &anda &lan!o or g nal. Deo1in!c e&tidos tri(os(atos !omo ladr llos Es%as rea!! ones se real 3an en forma au%oma% 3ada en %ermo! !lador. Se mul% "l !a $ 2as%a )ue se ev den! a en un gel de agarosa !on % n! #n !on &romuro de e% d o ,lu3 ul%rav ole%a-$ o 2 &r da! #n !on sonda

L m %a! ones $ !omo ne!es dad de !e&adores es"e!'f !os ,!ono! m en%o de ade!uado de la se!uen! a de nu!le#% dos del agen%e-$ nfraes%ru!%ura y en%renam en%o No nd !a nfe!! #n a!% va Ven%a*a$ )ue "uede ev den! ar nfe!! #n$ en ven%ana nmunol#g !a.

M+todos indirectos
Re!ono!en la res"ues%a nmune$ "or "ar%e del 2ues"ed En una "r mera fase "redom nan las IgM$ luego d sm nuyen aumen%an las IgG Las IgM son 4% les "ara el d< de nfe!! #n re! en%e/ Ru&eola$ ! %omegalov rus$ 2e"a% % s A$ e%! Las IgG$%omar mues%ra en el "er odo agudo$ luego a los 7D a 17 d'as ,!onvales!en! a-$ sero!onvers #n ,d agn#s% !o re%ros"e!% vo-

B *a! #n del !om"lemen%o.8En dos e%a"as. 7-Se u% l 3a un ant,eno conocido$ "ara de%erm nar s el suero de un "a! en%e !on% ene an% !uer"os !on%ra ese an%'geno$ se a=ade !an% dad !ono! da de !om"lemen%o ,!o&ayo-. S el Ag y A! se re!ono!en mu%uamen%e se !om& naran y !a"%ar+n el !om"lemen%o 1-Se a=ade un s s%ema nd !ador formado "or glo&ulos ro*os sens & l 3ados ,glo&ulos ro*os !on an% !uer"os !on%ra glogulos ro*os

S el Ag8A! en la "r mera e%a"a f *aron el !om"lemen%o$ y no )ueda$ y los er %ro! %os no se l saran en la segunda e%a"a$ en%on!es a pr!e-a es positi#a

?emaglu% na! #n nd re!%a/8 Los er %ro! %os se "ueden sens & l 3ar !on d versos an%'genos y se "ueden u% l 3ar !omo s s%ema nd !ador. S se ev den! an los an% !uer"os$ la rea!! #n revelar+ una 2emoaglu% na! #n )ue se adv er%e a s m"le v s%a Agu% na! #n de l+%e<.8 El an%'geno !ono! do se en!uen%ra f *o a la "ar%'!ula de l+%e<$ se es"era des!u&r r los an% !uer"os )ue se en!uen%ran en la mues%ra. Inmune ,s es "os % vo-$ sus!e"% &le ,s es nega% vo-

Neu%ral 3a! #n v ral.8 Demues%ra an% !uer"os "or su efe!%o n2 & %or o en la nfe!% v dad v ral. >ueden u% l 3arse en !ul% vos !elulares ,an+l s s de n2 & ! #n de efe!%os ! %o"+% !os- o en 2os"edadores an males ,"rue&a de "ro%e!! #n de ra%ones-. Dengue In2 & ! #n de la 2emaglu% na! #n.8 Algunos an%'genos v rales % enen !a"a! dad "ara aglu% nar er %ro! %os de d versas es"e! es$ s n em&argo la "resen! a de an% !uer"os es"e!'f !os en el suero del "a! en%e ev %an la aglu% na! #n de er %ro! %os "or %ales an%'genos$

Inmunofluores!en! a nd re!%a ,IBI- r+" do y !onf a&le. An #n de an% !uer"os an% v rales "resen%es en el suero del "a! en%e a los an%'genos v rales e<"resados en la su"erf ! e y ! %o"lasma de !(lulas nfe!%adas$ )ue 2an s do f *adas a un "or%ao&*e%o de v dr o. Lavado y agregado de an% !uer"o an% IgG 2umana !on*ugada !on so% o! ana%o de fluores!e'na. La "resen! a de A! se ev den! a "or la a"ar ! #n de fluores!en! a en el ! %o"lasma y su"erf ! e de las !(lulas nfe!%adas

En3 mo nmunoan+l s s nd re!%o ,ELISALos an%'genos v rales se nmov l 3an so&re una fase s#l da ,esfer %a$ "ol !u&e%as$ u o%ros elemen%os de "l+s% !o-$ se agregan los sueros en es%ud o ,an% !uer"os-$ se n!u&an$ se lavan y se revela la rea!! #n Ag8A!$ "or el agregado de una nmunoglo&ul na an% es"e! e !on*ugada !on una en3 ma$ !on el sus%ra%o a"ro" ado$ los resul%ados se leen !on es"e!%ofo%#me%ro o en forma v sual

Inmuno&lo% o ;es%ern &lo%.8 a-V rus de mues%ra$ son %ra%ados "ara d sgrega! #n e na!% va! #n$ an%'genos del l sado v ral se se"aran "or ele!%rofores s en gel de "ol a!r lam da &-Se real 3a %ransferen! a ,&lo%% ng- de los Ag se"arados a mem&ranas de n %ro!elulosa !-Se !olo!a el suero del "a! en%e so&re la mem&rana. >os%er ormen%e se a=aden an% !uer"os an% 8 nmunoglo&ul na 2umana un da a en3 ma ,"ero< dasa o fosfa%asa-$ se agrega el sus%ra%o$ "ara v sual 3ar las &andas

Ele!! #n de una "rue&a d agn#s% !a


Tres "ar+me%ros$ sens & dad$ es"e! f ! dad y valor "red !% vo Sens & l dad.8 >ro"or! #n de "ersonas !on la nfe!! #n )ue rea!! onan "os % vamen%e !on la "rue&a real 3ada. E*m. Ana "rue&a es m+s sens &le !uando de%e!%e un mayor n4mero de "ersonas nfe!%adas Es"e! f ! dad.8>ro"or! #n de "ersonas s n la nfe!! #n )ue rea!! onan !omo nega% vos. E*m Ana "rue&a es m+s es"e!'f !a !uando % ene menos rea!! ones "os % vas en%re las

Valor "red !% vo.8 Es la "ro&a& l dad de %ener la enfermedad dado el resul%ado del %es% Valor "red !% vo "os % vo/ Es la "ro&a& l dad de %ener la nfe!! #n o enfermedad s el resul%ado del %es% es "os % vo Valor "red !% vo nega% vo/ Es la "ro&a& l dad de no %ener la nfe!! #n s el resul%ado del %es% es nega% vo An %es% de al%o valor "red !% vo nega% vo ser+ a)uel )ue %enga una al%a es"e! f ! dad y no ne!esar amen%e una al%a sens & l dad

>or el !on%rar o un %es% de al%o valor "red !% vo "os % vo %endr+ )ue %ener una gran es"e! f ! dad An %es% deal de%e!%ar'a el 7::E de las "ersonas nfe!%adas y e<!lu r'a el 7::E de las "ersonas s n la enfermedad$ no dando nun!a resul%ados falsos "os % vos o falsos nega% vos Se de&e %ener en !uen%a$ !os%os$ !om"le* dad$ % em"o$ d s"on & l dad