DAVID G.

QUISPE ARANDA

2013
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PREFACIO

El presente manual de Parasitologa Clnica tiene la finalidad de funcionar como gua de trabajo en la experiencia educativa del curso de Parasitologa Clnica, la cual se encuentra curricularmente establecida en la formacin del estudiante de TECNOLOGA MDICA. Mediante este Manual el estudiante conocer, comprender y analizar sus conocimientos de Parasitologa, aplicando y desarrollando sus saberes; en el laboratorio donde se trabaja en un ambiente de respeto, responsabilidad y tica, haciendo uso de sus habilidades en el manejo de equipos as como en el desarrollo de metodologas, previo sustento terico. Al final del curso y desarrollo de esta gua el alumno aprender la forma correcta de reportar los resultados en el mbito laboral e integrar sus conocimientos tericos con los prcticos, consiguiendo as mantener un alto nivel de confiabilidad y satisfaccin en su futura labor. Espero que los alumnos encuentren en este manual un formato de fcil lectura y que los mtodos sean de utilidad para el diagnstico y reconocimiento de los parsitos ms frecuentes en nuestro medio y ms aun de nuestro pais, para plantear la solucion de los mismos.

El autor Lic. T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA Esp. Laboratorio Clinico y Anatomia Patologica

INDICE
Pag . REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PARASITOLOGA GENERALIDADES TECNICAS DIRECTAS Diagnstico de enteroparasitos Diagnstico de hemoparasitos e histoparasitos Diagnstico de artrpodos TECNICAS INDIRECTAS Diagnstico de enteroparasitos Diagnstico de hemoparasitos e histoparasitos 12 RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS Heces Conservacin y transporte (Persevantes) Test de Graham Gusanos y otros parsitos macroscpicos Contenido duodenal Sangre Suero Lquido Cefalorraqudeo Muestras de tejido Biopsia Exudado borde ulcera Aspirado de lesin Orina Muestras para prueba de PCR REPORTE DE RESULTADOS (enteroparasitos) Cualitativo Semicuantitativo 3 19 19 20 17 17 17 17 18 18 18 13 13 12 9 9 11 7 8

Ejemplo de reporte de Examen parasitolgico PRACTICAS DE LABORATORIO Practica n 1. Examen directo de Heces Elementos No parasitarios PROTOZOARIOS Practica n 2. Observacin de Amebas - Rizpodos Practica n 3. Observacin de Flagelados Procedimiento para diagnstico de Trichomonas Practica n 4. Observacin de Histoparasitos Y Hemoparasitos I Tcnicas y procedimientos en Leishmaniosis Tcnicas y procedimientos en Tripanosomiasis Practica n 5. Observacion de Ciliados Practica n 6. Observacion de Hemoparasitos II: Plasmodium Extensin de sangre Gota gruesa Coloracin Determinacin de parasitemia Caractersticas morfolgicas de especies de Plasmodium Practica n 7. Observacion de Coccideos intestinales Mtodo Kinyoun HELMINTOS Practica n 8. Observacion de Nematodes Practica n 9. Observacion Trichuris trichiura Practica n 10. Observacion de Uncinarias Observacion Strongyloides stercoralis Practica n 11. Observacion Enterobius vermicularis Mtodo de Graham Practica n12. Observacion de Cestodos I Practica n13. Observacion de Cestodos II Practica n14. Observacion de Cestodos III Practica n15 .Observacion de Trematodos ARTROPODOS

21 22 23 26

33 38 39 42 42 45 50 52 52 53 55 58 62 65 65

71 73 74 76 78 78 81 84 86 88

Practica n16. Observacin de insectos de importancia medica

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Practica n17. Examen Coprofuncional Examen Macroscpico Examen Fsico-Qumico Examen Microscpico Caractersticas de los Sndromes Digestivos Modelo de reporte de examen coprolgico funcional ANEXOS Mtodos de concentracin Sedimentacin Sedimentacin por Centrifugacin Mtodo Ritchie Mtodo Telemann Mtodo Charles-Barthelemy Concentracin por centrifugacin Concentracin por Formalina-Acetato etilo Sedimentacin Simple Mtodo Sedimentacin simple en copas Sedimentacin espontanea en tubo Tcnica Baerman Modificada Mtodo de Lumbreras Modificado Flotacion Metodo Faust Metodo Willis Metodo Sheater Mtodos Cuantitativos para el recuento de huevos y larvas Mtodo Dilucin Stoll Mtodo Kato-Katz Mtodo Directo Tcnica de Ferreira

94 96 99 107 113 115

117 117 118 118 120 121 122 123 125 125 127 127 128

128 131 132 135 136 140 142 143 5

Tcnica Mac Master Tcnicas Especiales Mtodo Harada-Mori Mtodo de Baerman Migracin de Larvas en Agar Procedimientos para Fijar Helmintos Mtodos de coloracin para Helmintos Coloracin Carmn clorhdrico Coloracin de Bonilla,Naar y Beloy Coloracin hematoxilina frrica de Delafield Mtodo de la tinta china Coloraciones Especiales para Protozoarios Hematoxilina frrica Tricromica de gomori Reaccin Inflamatoria en Heces Modelo de reporte de reaccin inflamatoria Control de Calidad Interno en Parasitologa Diagnstico Inmunolgico de Enfermedades Parasitarias Cuadros Comparativos - Resumen Examen de Biopsias del Tubo digestivo Preparacin de Reactivos GLOSARIO DE TRMINOS PARASITOLGICOS ALGORITMOS DIAGNOSTICOS PUZZLE ATLAS DE PARASITOS BIBLIOGRAFIA

144 145 145 147 149 152 153 153 154 154 155 157 157 161 163 164 165 172 178 185 186 192 198 206 208 215

REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

1. El alumno deber llegar puntual en su horario de clase. 2. El alumno debe de ingresar al laboratorio con una bata o mandiln de manga larga. 3. El alumno debe de asistir al laboratorio con su Manual de Practicas 4. Libros y cuadernos deben mantenerse en la mesa de trabajo, solo bajo la indicacin del docente 5. El alumno debe contar con su material necesario para la prctica de laboratorio correspondiente. 6. El alumno debe limpiar su rea de trabajo con hipoclorito de sodio antes y despus de la prctica de laboratorio. 7. Durante la prctica de laboratorio el alumno debe usar guantes y mascarilla. 8. Queda estrictamente prohibido comer, beber, llevarse cosas a la boca y fumar en el Laboratorio. 9. Una vez terminada su prctica, las muestras sern desechadas por el alumno en los depsitos correspondientes. 10. En caso de romperse o derramarse muestra fecal deber verterse fenol o hipoclorito sobre l y dejarlo cuando menos 10 minutos antes de limpiar y avisar al Docente o personal de laboratorio.

GENERALIDADES
El parasitismo es una modalidad de asociacin que ha evolucionado con bastante xito; los organismos que han optado por esta forma de vida tienen, en general un potencial bitico mayor. Incluso se argumenta que existen ms parsitos, como especies y como individuos, en relacin a seres de vida libre, ya que son raros los ltimos que no albergan una o ms especies de parsitos. La prevalencia de las parasitosis est estrechamente vinculada a diferenciales climticas, fenmenos demogrficos y al desarrollo socioeconmico de las diferentes zonas del planeta. No es de extraar que los protozoos y helmintos patgenos sean parte de la vida cotidiana en los trpicos, sin ser privativos de ellos. Las enfermedades parasitarias afectan a diversos grupos de poblacin de todas las edades y razas, representando un elevado riesgo para la salud y la vida de extensos sectores. Por sus caractersticas peculiares, afectan de preferencia a los grupos jvenes y de mayor productividad, que viven en zonas suburbanas de las grandes ciudades o en zonas rurales. El ciclo de cada parsito expresa la complejidad del fenmeno biolgico. Las variables agente, husped y ambiente (trada ecolgica) son fundamentales para orientar el diagnstico parasitario. Se debe tomar en consideracin el estado parasitario buscado (huevo, quiste, larva, etctera.), tanto en el husped como en el ambiente, para seleccionar el tipo y caractersticas de la muestra (orina, deposicin, ambiente, etc.) as como escoger el mejor procedimiento o tcnica para su diagnstico. Debido a la existencia de infecciones transmitidas en forma natural desde animales vertebrados al hombre y viceversa (zoonosis), la bsqueda de los parsitos se extiende incluso al reservorio animal. Por ejemplo, en toxocariasis y equinococosis se puede solicitar colaboracin a los laboratorios de medicina veterinaria para estudiar las deposiciones de las mascotas (perros). Tambin se pueden estudiar fuentes infectantes, como carnes (triquinosis, sarcocistosis), tierras en el caso de geohelmintiasis (ascariasis, tricocefalosis, toxocariasis) y aguas en el caso de las enteroparasitosis que se transmiten por contaminacin fecal. El objetivo de las tcnicas diagnsticas es pesquisar e identificar al parsito (en cualquiera de sus estados) lo que se realiza con tcnicas directas, o a travs de tcnicas indirectas que evalan la respuesta inmune del husped .El hallazgo de una forma parasitaria en cualquiera de sus estados es considerado un diagnstico patognomnico, en cambio la evidencia de la respuesta inmune positiva hacia un agente parasitario slo hace posible un diagnstico presuntivo.

Las tcnicas para diagnosticar PARASITOS se pueden dividirse:

I. TECNICAS DIRECTAS permiten observan al parsito ya sea como trofozoito, quiste, larva, gusano adulto, ninfa, etc. II. TECNICAS INDIRECTAS detectan antgenos del parsito o anticuerpos generados en el hospedero producto de la infeccin (pruebas serolgicas) y de otro tipo, que unido a la clnica dan un diagnostico probable.
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TCNICAS DIRECTAS
Diagnstico de enteroparasitos
Se basan en el diagnstico morfolgico de los distintos estados de los parsitos. Tiene como objetivo pesquisar e identificar distintas formas de protozoos (trofozoitos, quistes, ooquistes) y helmintos (progltidas y huevos). Su sensibilidad depende de las caractersticas de las tcnicas, de la carga infectante, de la biologa de los parsitos, del transporte y preparacin de la muestra, de la implementacin de equipos adecuados y de la disponibilidad de tiempo y experiencia de los observadores. Las tcnicas de uso ms habituales son los mtodos de Teleman.modificado y el de Burrows o PAF. este ltimo tiene la ventaja de permitir un apropiado diagnstico de trofozotos, lo que tiene particular importancia en el estudio de la amebiasis intestinal. Ambas son de gran utilidad para el clnico, pues pueden informar la presencia de varios parsitos y comensales al mismo tiempo. El reconocimiento de Cryptosporidium spp. como un importante agente etiolgico de diarrea, principalmente en pacientes inmunocomprometidos, hizo necesaria la incorporacin de la tcnica modificada de Ziehl Neelsen a la rutina en el laboratorio. Ella debe ser solicitada en forma explcita por el clnico. El estudio de enteroparsitos generalmente se realiza con muestras de deposiciones, pero puede efectuarse en forma excepcional en el lquido biliar, y aspirado duodenal. El examen parasitolgico de deposiciones puede ser seriado (1 a 3 muestras), o de slo una muestra (examen directo o en fresco).Este ltimo se utiliza para el diagnstico de urgencia, frente a cuadros diarreicos y disentricos en nios y adultos, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. La muestra se enva inmediatamente al laboratorio, en donde se da prioridad a su anlisis, por lo que la respuesta puede ser entregada antes de una hora. Otro examen de gran utilidad es el test de Graham, que se utiliza, especialmente para la pesquisa de huevos de helmintos (Enterobius vermicularis) en las mrgenes de la zona perianal. El diagnstico de tricomoniasis urogenital habitualmente se realiza por examen de una muestra de flujo vaginal, la que se observa directamente al microscopio. Existen tcnicas especficas de cultivo e inmunodiagnstico (imunofluorescencia) que se emplean en investigacin clnico-epidemiolgica.

Diagnstico de hemoparasitos e histoparasitos

Estos mtodos se utilizan en la bsqueda de parsitos circulantes en pacientes que estn en fase aguda de la infeccin. Son de utilidad en el diagnstico de Tripanosomiasis americana (Enfermedad de Chagas) malaria y filariasis. Se emplean las siguientes tcnicas:

Examen de sangre al fresco. Una gota de sangre recin extrada se observa entre lmina y laminilla, directamente al microscopio.

Frotis de sangre. Se extiende una gota de sangre recin extrada, sobre un portaobjeto, se tie con May Grunwald Giemsa o Wright. Gota gruesa. Se colocan tres gotas de sangre en un portaobjeto, se mezcla con movimientos concntricos con un alfiler o con el extremo de un portaobjeto, se extrae la fibrina. se seca a temperatura ambiente y luego se tie Microstrout o microhematcrito. Se toma una muestra de sangre en tubo de microhematcrito y se centrifuga a 100 rpm por tres minutos. Se fractura el capilar en el lmite de la capa leucocitaria. Se deposita sobre un portaobjeto la capa de leucocitos y plasma y se observa al microscopio. Xenodiagnstico. Esta tcnica slo se utiliza para enfermedad de Chagas. Se emplean ninfas de Triatoma spp. libres de infeccin, las que se alimentan con sangre del paciente. Los resultados se obtienen a los 30, 60 y 90 das. Esta tcnica slo es utilizada en algunos centros de investigacin y puede ser reemplazada por PCR para T cruzi.

PCR Trypanosoma cruzi. Se basa en la pesquisa de fracciones del parsito a partir de secuencias conocidas de su ADN. la tcnica se basa en la ampliacin de un segmento del ADN del parsito, para luego caracterizarlo e identificarlo.

El Pneumocystis carinii actualmente se diagnostica por el examen de muestras de lavados broncos alveolares o expectoracin, que son teidas con Giemsa o Gomori. Se estn implementando tcnicas de apoyo diagnstico complementarias (IFI, y PCR). El diagnstico de triquinosis slo excepcionalmente se realiza mediante una biopsia muscular. Habitualmente se realiza mediante los antecedentes clnicos epidemiolgicos, los que pueden ser apoyados por la presencia de eosinofilia en el hemograma y tcnicas serolgicas (ELISA Trichinella spiralis), la que se ha hace positiva en la fase de invasin. El diagnstico directo de la presencia de la larva de Taenia equinococcus se realiza por el estudio histolgico de piezas quirrgicas, en el cual se identifica claramente la capa cuticular (escleroproteica anucleada), patognomnica de esta parasitosis. Tambin se puede estudiar el contenido del quiste, siendo posible encontrar la arenilla hidatdica, que est constituida por diferentes formas del parsito, entre ellas protoesclices; es patognomnico el hallazgo de "ganchitos" que son parte estructural de este cestodo. La biopsia est contra indicada en pacientes en quienes se sospecha hidatidosis, por el riesgo de romper el quiste y provocar un shock anafilctico o una siembra de parsitos. 10

Diagnstico de artrpodos
Tienen como objeto identificar el gnero y la especie y estn basadas en la observacin con lupa o microscopio del artrpodo en algunos de sus estados. Las muestras pueden ser trasladadas en seco o en agua al laboratorio y pueden ser tomadas del husped (ectoparsitos permanentes) o del ambiente (ectoparsitos temporales). Entre los artrpodos que ms afectan al hombre se encuentran los caros de la piel (Sarcoptos scabiei y Demodex folliculorum). La tcnica de toma de muestra, denominada Acaro test, es la ideal para obtener el parsito. Otro artrpodo de alta prevalencia es el arcnido Loxoceles laeta (Araa del rincn), cuyo diagnstico especfico se realiza al examinar su morfologa y especficamente la distribucin de sus ojos (tres pares distribuidos en forma de tringulo). El diagnstico de miasis primarias y secundarias, especficas o accidentales se realiza al visualizar el estado de la larva de estos insectos, que desarrollan una metamorfosis incompleta, as como su tamao y morfologa. ARTROPODOS DE INTERES MEDICO

CLASE

ORDEN
Dpteros Blattaria

EJEMPLOS
Moscas Mosquitos Cucarachas Triatomdeos Pulgas Piojos Araas Escorpiones Acaros Garrapatas Cyclops

Insectos

Hemptero Siponaptera Anoplura Scorpionida

Arcnidos Acarina Crustceos Copepodo

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TCNICAS INDIRECTAS
Diagnstico de enteroparasitos
En la Amebiasis la tcnica de ELISA podra ser utilizada para el diagnstico de absceso heptico, pero hasta el momento no ha dado buenos resultados, por la alta prevalencia de la infestacin que hace que existan muchas personas infectadas asintomticas con anticuerpos contra E histolytica.Si bien se han descrito han descrito tcnicas ELISA para pesquisa de antgeno de Giardia lamblia en deposicin, la presencia de poliparasitismo hace que los mtodos de Teleman y PAF sean de eleccin, pues son de menor costo y mayor rendimiento.

Diagnstico de hemoparasitos e histoparasitos

Las tcnicas de inmunodiagnstico son herramientas de gran valor para evaluar la infeccin por ciertos agentes patgenos, especialmente histoparasitos, pues no requieren de una interpretacin subjetiva, de detalles morfolgicos o de la toma de muestra invasiva para evidenciar el agente patgeno, como biopsias por ejemplo. La deteccin de anticuerpos sricos (IgG e IgM), se utiliza para el diagnstico de diversas histoparasitos Se debe recordar que algunas son enfermedades crnicas, en las cuales los parsitos permanecen en los tejidos en estado latente, por lo que la IgG permanecer positiva por el resto de la vida, motivo por el cual es muy importante considerar el ttulo de IgG. La presencia de IgM, en cambio refleja una etapa aguada y primo infeccin de la parasitosis. Se est estudiando la aplicacin clnica de rutina de IgE e IgA . Para determinar la presencia de anticuerpos (IgG, IgM, IgA, IgE) se pueden emplear una variedad de tcnicas, entre ellas CIEF (contrainmuno-electroforesis), ELISA (ensayo de inmunoanlisis) e IFI (inmunofluorescencia indirecta). cada una de estas tcnicas puede emplear distintos tipos de antgenos del parsito: somticos (crudos o purificados), metablicos (secretor - excretor), de superficie (parsito completo o secciones de ste).Para el diagnstico de patologas parasitarias crnicas se sugiere el uso de dos tcnicas complementarias. En clnica es de mucha utilidad que el anlisis de una curva serolgica, que se obtiene evaluando en dos momentos la concentracin de inmunoglobulinas para determinar la evolucin de la respuesta inmune. Es de especial importancia en infecciones cuando se desea objetivar una fase aguda. Por ejemplo se emplea para determinar primo infeccin en toxoplasmosis, enfermedad de Chagas y toxocariasis. Actualmente se dispone de ELISA Cisticercosis (Cisticercus cellulosae) ELISA Toxocara (Toxocara spp.).ELISA Fasciola (Fasciola heptica),ELISA Triquinosis (Trichinella spiralis) ELISA Hidatidosis (Taenia equinococcus).Las intradermoreacciones, tcnicas para medir inmunidad celular, actualmente no se estn utilizando de rutina. Se han comenzado a implementar tcnicas de biologa molecular para algunas parasitosis, entre ellas la PCR (reaccin en cadena polimerasa) dirigida a fragmentos del ADN del parsito. Este mtodo sirve como indicador de la presencia de parsito en la sangre y en tejidos. Se estn haciendo esfuerzos por montar PCR Amebiasis (Entamoeba histolytica), que sera de utilidad en casos de invasin tisular (abscesos hepticos).

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RECOGIDA Y TRANSPORTE DE MUESTRAS CLINICAS

HECES
Recogida. Se deben recoger 3 muestras, preferentemente en das no consecutivos ya
que la expulsin de parsitos no es constante. Se recomienda recogerlas en un periodo de 10 das ya que la excrecin de protozoos intestinales es cclica y al hacerlo as es ms probable coincidir con los das de mxima excrecin. La probabilidad de detectar parsitos en una sola muestra puede ser tan baja como 50%-60% pero es >95% si se analizan 3 muestras. En la estrongiloidiasis crnica la rentabilidad diagnstica del examen de heces es menor.

Cantidad. En cada recipiente de transporte se debe incluir una cantidad de heces del
tamao de una nuez o unos 10 ml en el caso de heces lquidas. Cantidades muy escasas reducen la sensibilidad del examen. Con cantidades excesivas de heces los fijadores no alcanzan la proporcin adecuada para conservar los posibles protozoos presentes y las heces fermentan y al aumentar la presin en el frasco pueden derramarse durante el transporte o apertura. En los quince das previos a la recogida de las heces no se deberan tomar antibiticos (especialmente tetraciclina o metronidazol) ni sales de bismuto. En los cuatro das previos se deben evitar los contrastes radiolgicos, laxantes oleosos y antipaldicos ya que interfieren en la deteccin de protozoos.

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Conservacin y transporte. Si el procesamiento se va a demorar es necesario

utilizar productos fijadores que mantengan la morfologa (especialmente de los protozoos) e impidan la evolucin de huevos y larvas de helmintos sin necesidad de refrigeracin de la muestra, tambin disminuyen el riesgo de infeccin y el hedor en el laboratorio de microbiologa. Las alternativas ms habituales son: - Formol en un tampn de acetato de sodio y cido actico (SAF): puede ser utilizado para concentracin, tinciones y con la mayora de inmunoensayos. - Formol al 10%. - Mertiolato-yodo-formol (MIF) - Alcohol Polivinilico (PVA) En determinados casos las heces deben necesariamente remitirse conservantes, ejemplo de ello son: sin

*Deteccin de antgeno de Entamoeba histolytica. Si no se va a procesar en el momento es necesario refrigerar en nevera (2-8 C) *Cultivo de larvas de Strongyloides y Uncinarias (mtodos de Baermann, de Harada-Mori, cultivo en placa de agar etc.). Adems, para mantener viables estos helmintos no deben refrigerarse, conservndose mejor entre 22C y 35C. *Estudio de viabilidad de los huevos de Schistosoma spp. No refrigerar. *PCR. Si se va a demorar su realizacin, deben congelarse.

a. Muestra en formol al 10%: se recogen durante 7 u 8 das. Se realiza el examen directo, debe tener una relacin de una parte de heces y 3 partes de conservante. Las heces se concentran por el mtodo de sedimentacin (acetato de etilo) Se utiliza el sedimento para realizar los extendidos para su posterior coloracin. Se deposita una gota de ese sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo de dientes se distribuye, en ambos sentidos, hasta lograr un extendido fino. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos. Se procede a realizar la coloracin permanente. Ventajas: Buen fijador. Fcil de preparar. Buena preservacin de la morfologa de huevos de helmintos, larvas, quistes de protozoos y coccidios. Adecuado para las tcnicas de concentracin y de la microscopa de epifluorescencia Adecuado para las coloraciones cido-alcohol resistentes (safranina). Compatible con inmunoensayos y microscopa de epifluorescencia. 14

Desventajas: No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricromica. Conservante inadecuado para la morfologa de trofozoitos. Puede interferir con PCR, especialmente luego de un tiempo prolongado de fijacin. b. Muestra con SAF: se trabaja de la misma manera que el anterior. Debe tener una relacin de una parte de heces y 3 partes de conservante. Antes de depositar la gota de sedimento sobre el portaobjeto para realizar los extendidos para su posterior coloracin, se coloca una gota de albmina de Mayer para fijar las heces al preparado por la escasa capacidad de fijacin que tiene el conservante SAF. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos Ventajas: Los componentes fijan y colorean al mismo tiempo. Fcil de preparar. til para trabajos de campo. Vida media prolongada. Adecuado para tcnicas de concentracin. Desventajas: No es aconsejado para coloraciones permanentes como Tricrmica Conservante inadecuado para la morfologa de trofozoitos. c. Muestra con PVA: debe tener una relacin de una parte de heces y 3 partes de conservante. Mezclar inmediatamente. Deben recogerse 6 muestras en das no consecutivos, en recipientes individuales. Las heces con PVA se filtran con una gasa en un tubo de centrfuga (preferentemente de plstico). Se centrifugan 10 minutos a 1500 rpm. Se descarta el sobrenadante que contiene el exceso de conservante. Se secan las paredes del tubo con gasa. El sedimento se utiliza para realizar los extendidos para su coloracin posterior. Se deposita sedimento sobre un portaobjeto y con un cepillo una gota del

de dientes se

distribuye, en ambos sentidos, hasta lograr un extendidos fino. Se realizan por lo menos 3 a 5 extendidos. Se procede a realizar la coloracin permanente (Tricrmica o Hematoxilina frrica) Ventajas Buen conservante de la morfologa de trofozoitos y quistes. Fcil de preparar las coloraciones permanentes como Tricrmica. Las muestras conservadas permanecen estables por mucho tiempo. 15

Desventajas: Inadecuado para la conservacin de la morfologa de huevos, larvas, coccidios y microsporidia. Contiene compuestos mercuriales. Difcil de preparar en el laboratorio. Difcil y caro de eliminar. No sirve para tcnicas de concentracin. No puede usarse para tcnicas de ELISA. No es adecuado para coloraciones cido-alcohol resistente

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TEST DE GRAHAM
Consiste en una muestra de los mrgenes del ano recogida con papel celo al levantarse por la maana, y se debe recomendar al paciente que no se lave la zona perianal antes de realizar la toma. Se debe utilizar celofn transparente (translcido tipo Scotch) que se colocar sobre un portaobjetos. Es necesario recoger tres muestras en tres das consecutivos que deben ser transportadas al laboratorio en un sobre de papel cerrado o en un frasco, y nunca sueltos ya que los huevos de E. vermicularis ya son infectivos a las 4-6 horas de haber sido puestos.

GUSANOS Y OTROS PARSITOS MACROSCPICOS

La mayora de los gusanos adultos o fragmentos eliminados espontneamente son scaris lumbricoides que pueden ser expulsados por el ano, por la boca o por la nariz y Enterobius vermicularis y progltides de cestodos que pueden verse en la superficie de las heces. Raramente se detectan otros como Trichuris trichiura y Dipylidium caninum. Las progltides de T. saginata, migran activamente atravesando el ano, por lo que se las puede encontrar en los mrgenes del mismo o en la ropa. Ocasionalmente se remiten larvas de mosca, Anisakidae, y otros elementos con aspecto de parsitos (incluyendo restos alimentarios y moldes mucosos intestinales). Cualquiera de ellos se debe enviar al laboratorio en un recipiente limpio, con agua o suero salino y conservar refrigerado.

CONTENIDO DUODENAL
La obtencin de contenido duodenal puede ser til en algunas parasitosis pero pocas veces se realiza slo para este fin. Se puede recoger mediante sonda, endoscopia gastrointestinal til en la bsqueda de coccidios intestinales (proctoscopas y colonoscopas sirven para la bsqueda de Entamoeba histolytica.) o cuerda encapsulada (Enterotest) o por La cpsula de Beal. Aumenta la sensibilidad en el diagnstico de parsitos que habitan en el duodeno como Giardia lamblia y Strongyloides stercoralis, Ancylostoma o Necator y Fasciola heptica o cuyos huevos se eliminan por va biliar. La cpsula entrica (Enterotest) es un sistema comercializado compuesto por una cpsula de gelatina que contiene un cordn de nailon, con un peso en el extremo y un indicador de pH para comprobar que ha pasado del estmago. Uno de los extremos del cordn se fija a la cara del paciente y la cpsula se deglute, llegando hasta el duodeno, la gelatina se disuelve y el cordn se libera y se impregna de bilis y moco duodenal. Se retira tirando del extremo oral y se analiza el material adherido.

SANGRE
Plasmodium spp. La sangre debe extraerse en cuanto se sospeche malaria, haya o no fiebre en ese momento. Puede ser necesario extraer muestras cada 6-12 horas durante 48 horas para descartar por completo la infeccin con microscopa, sobre todo en pacientes no inmunes, pacientes que han recibido frmacos antipaldicos como profilaxis o tratamiento o cuando no se disponga de pruebas rpidas de deteccin antignica (PRD). Estudios recientes indican que los resultados de la microscopa y las PRD son similares con sangre capilar obtenida por puncin digital o con sangre venosa anticoagulada recogida en tubos con EDTA, siempre que las extensiones se preparen en menos de 30 minutos desde la extraccin para evitar el deterioro de la morfologa parasitaria. 17

Trypanosoma spp. Para el mtodo de Strout se necesita sangre recogida sin anticoagulante. Si la parasitemia es elevada se puede detectar el parsito a partir de sangre anti coagulada, suero o plasma. Para observar los parsitos en movimiento, o conseguir su aislamiento en cultivo, es necesario enviar la muestra al laboratorio inmediatamente y analizarla en un plazo ptimo de menos de 4 horas despus de su obtencin, para ello se puede conservar refrigerada o a temperatura ambiente. En el diagnstico parasitolgico de la infeccin congnita, se recomienda la utilizacin de sangre perifrica obtenida del taln. La utilidad de la sangre del cordn es discutida por la posible contaminacin con sangre materna. En las infecciones crnicas la parasitemia puede ser indetectable o fluctuante, por lo que se aconseja procesar volmenes de sangre de al menos 10 ml en adultos y 5 ml en nios.

SUERO
Hay que desinfectar la piel y extraer sangre en un tubo seco, sin anticoagulante que se mantendr refrigerado a 2C-6C o congelado si su procesamiento se va a demorar unas horas. Algunos ensayos serolgicos y de PCR se pueden realizar a partir de muestras de sangre secas en papel absorbente que pueden remitirse por correo. Algunas pruebas serolgicas pueden realizarse empleando sangre anticoagulada.

LQUIDO CEFALORRAQUDEO
Cuando se sospecha una enfermedad del sueo, un Chagas cerebral o una meningoencefalitis amebiana se deben priorizar las pruebas a realizar y es esencial contactar con el laboratorio para realizar de inmediato un examen en fresco del LCR.

MUESTRAS DE TEJIDO
Para las sospechas de leishmaniasis cutneas y de chancros de inoculacin de tripanosomiasis son adecuadas las siguientes muestras: - Biopsia: con un sacabocados (biopsy punch), estril de 3-4 mm de dimetro se toma un cilindro de tejido del reborde indurado de la lesin. Nunca se debe tomar del fondo de la lcera que suele estar infectado secundariamente siendo difcil la visualizacin de los parsitos. Se deposita en un tubo con unas gotas de suero salino fisiolgico o de tampn NET 10 (NaCl 10 mM, EDTA 10 mM, Tris. HCl, pH 8,0, 10 mM). - Exudado del borde de la lcera: se realiza una incisin con un bistur y se raspan los mrgenes de dicho corte. El material obtenido se introduce en un tubo de las caractersticas anteriores para cultivo y otra parte del material se extender en un portaobjetos para examen microscpico. - Aspirado de la lesin: con una jeringuilla de 1 ml, se puede inocular un pequeo volumen de solucin salina en el borde de la lcera y aspirarlo comprimiendo la lesin. Parte del material se deposita en un tubo estril y se realiza un frotis con el resto. Las muestras se mantendrn a temperatura ambiente hasta su procesamiento. Este sistema se emplea tambin para aspirar adenopatas en caso de sospecha de tripanosomiasis africana. En el caso de sospecha de leishmaniasis visceral, las muestras de eleccin son el aspirado o biopsia de mdula sea y la sangre 18

anticoagulada. Se mantendrn a temperatura ambiente hasta su transporte al laboratorio. La sangre preferentemente se debe procesar inmediatamente para la separacin de las clulas mononucleares de sangre perifrica y en su defecto se puede conservar hasta 24 horas a 4C. La puncin esplnica no se recomienda por el riesgo de ruptura. Las muestras de piel para deteccin de Oncocerca spp. se deben remitir en un tubo con unas gotas de suero salino a temperatura ambiente o bien realizar la toma en el laboratorio.

ORINA
Para detectar Schistosoma haematobium en orina se debe enviar al laboratorio un volumen de ms de 100 ml de orina incluso toda la orina de 24 horas. La rentabilidad aumenta si la muestra se recoge entre las 10 y las 15 horas del da y si se realiza ejercicio antes de recogerlo. Se enva al laboratorio en un recipiente limpio y se refrigera o se aade aproximadamente un 1% de formol.

MUESTRAS PARA PRUEBAS DE PCR

Para la deteccin de cidos nucleicos por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es conveniente que la muestra no sufra muchos cambios de temperatura y es preferible que se conserve a 4C. Para tiempos de conservacin prolongados conviene congelarlo a 20C. Dependiendo de la prueba a realizar, la adicin a la muestra de proteinasa K o guanidina-EDTA puede mejorar la sensibilidad del ensayo.

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REPORTE DE RESULTADOS (Enteroparasitos)

Los resultados indicarn el(los) mtodo(s) empleado(s), el gnero o la especie del parsito observado y su estadio evolutivo. La densidad parasitaria puede expresarse como el nmero de formas parasitarias observadas por campo de microscopio con objetivo de 10X y 40X. Todo formato de respuesta de resultados debe contener los siguientes datos: Nombre paciente , edad, sexo, fecha, Caractersticas organolpticas de las heces : consistencia, color Presencia de sangre y moco Observacin microscpica (presencia de leucocitos, eritrocitos, levaduras, fibras musculares no digeridas y parnquima de clulas vegetales en cantidad considerable),

Esta informacin facilitar un mejor diagnstico clnico

Resultado positivo
El informe debe contener el nombre del paciente, los agentes observados y su estadio o forma evolutiva: quistes (q) ooquistes (o) trofozotos (t) esporas (e) huevos (h) larvas (l)

Cualitativo Escaso Regular Buena cantidad Semicuantitativo Contando las formas parasitarias. Si se observan 1 2 elementos en toda la lmina, escribir el nombre del agente y su estadio evolutivo (+) Si se observan de 2 a 5 elementos por campo microscpico 10X 40X.
(++) Si se observan de 6 a 10 elementos por campo microscpico 10X 40X.

(+++) Si se observan >10 elementos por campo microscpico 10X 40X.

Resultado negativo
Informar que no se observaron quistes, trofozotos, ni huevos de parsitos .

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EJEMPLO DE REPORTES DE EXAMEN PARASITOLOGICO

LABORATORIO X
NOMBRE EDAD : xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx : xxxxxx CODIGO :xxxxx

Muestra Metodo

: :

Heces Directo

1 era muestra : Se observan Quistes de Entamoeba histolytica + 2 da muestra : Se observan Quistes de Entamoeba histolytica ++ 3 era muestra : Se observan Quistes de Entamoeba histolytica ++

FIRMA RESPOSANBLE

FECHA : xx/xx/xxxx

LABORATORIO X
NOMBRE EDAD : xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx : xxxxxx CODIGO :xxxxx

Muestra Metodo

: :

Heces Directo No se observaron quistes, trofozotos, ni huevos de parsitos

1 era muestra : 2 da muestra :

No se observaron quistes, trofozotos, ni huevos de parsitos

3 era muestra :

No se observaron quistes, trofozotos, ni huevos de parsitos

FECHA : xx/xx/xxxx

FIRMA RESPOSANBLE

21

22

PRACTICA N 1. EXAMEN DIRECTO (Observacin de elementos no parasitarios en las heces)

El mtodo del EXAMEN DIRECTO de las heces, sigue siendo el Gold standard para el diagnstico de la enfermedades parasitarias, es una tcnica simple, rpida y econmica. Se usa principalmente para observar las caractersticas morfolgicas de los protozoos y detectar la movilidad de los mismos en su forma de trofozoito. El preparado directo se realiza con una pequea cantidad (una gota) de heces entre porta y cubreobjeto; no debe ser mayor porque resultara demasiado espesa para el examen, ni menor porque disminuira la posibilidad de encontrar parsitos. La observacin se realiza utilizando un objetivo de 10x aumentos y ante un elemento sospechoso se examina con 40x aumentos. Los trofozoitos y quistes de protozoos, huevos o larvas de helmintos y ooquistes de Isospora belli pueden ser identificados en el extendidos directo. Los ooquistes de Cryptosporidium difcilmente son observados, salvo en grandes infecciones, al igual que las esporas de Microsporidium que son muy pequeas y de forma semejante a restos de materia fecal.

Examen General de Heces

- Examen Macroscpico: Donde se observan las caractersticas de las heces como: Olor y Color Consistencia (Lquida, Slida, Semislida, Pastosa). Aspecto (presencia de mucus, sangre). Presencia de nematodos adultos (scaris, oxiuros), estructuras de tenias, larvas u otros.

- Examen Microscpico: En general se emplean dos mtodos: Mtodo directo: Este mtodo permite observar formas vegetativas de protozoarios (trofozoitos de amebas) ,ooquistes de coccideas y algunas larvas. Es til en las necropsias, para analizar el contenido intestinal. Cuando al agregado se le agrega 1 gota de lugol, se observa los quistes.

Mtodo de enriquecimiento o concentracin: Sirve para concentrar las formas parasitarias (huevos, larvas) en las heces, de manera que puedan ser diagnosticadas, aun cuando existan pequeas cantidades. Se recomiendan para la demostracin de quistes, ooquistes, huevos o larvas Pueden ser: Cualitativos (mtodos de flotacin, mtodos de sedimentacin) o cuantitativos (Mtodo de Stoll, etc.)

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Requisitos para la toma de muestras de heces: la recoleccin y el manejo

adecuado de las muestras fecales son indispensables para la identificacin correcta de los parsitos en el laboratorio, es as que se debe de tomar en cuenta lo siguiente: Sirven las heces recin emitidas y evacuadas espontneamente Materia fecal del tamao de una aceituna. Deben recogerse en un recipiente limpio y seco. No debe mezclarse con orina. En los lactantes se recomienda tomar la muestra de heces directamente del paal o estimular la evacuacin mediante una sonda rectal. - Debe transcurrir el menor tiempo posible entre la toma de muestra y el examen - Debido a la eliminacin irregular de los elementos parasitarios, el examen parasitolgico de una sola muestra de heces puede ser insuficiente. Objetivos Materiales

Anlisis y procesamiento correcto de la muestra. Diferenciar un parsito de un elemento general de las heces. Conocer y diferenciar algunas estructuras parasitarias. Porta-objetos, 7.5 X 2.5 cm (3 X 2 pulgadas) limpio y seco Cubre-objetos, 22 X 22 mm Aplicadores de madera-bajalenguas Solucin salina fisiolgica (0.85% cloruro de sodio) Solucin de Lugol Frasco con desinfectante para descartar material (lejia, fenol, etc)

Procedimiento Con suero fisiolgico (SSF): Para observar trofozoitos de protozoos y larvas de nematodos, todas en movimiento y elementos que aparecen en situaciones anormales, tambin es utilizada para ejecutar cuenta de huevos de algunos helmintos (estimar intensidad de la infeccin) 1. Con un aplicador de madera, tome una pequea cantidad de heces y disulvala en suero fisiolgico sobre una lmina portaobjetos. 2. Cubra la preparacin con una laminilla cubreobjetos y observe al microscopio con objetivo de 10 y 40X. Con lugol: Para observar la morfologa de los parsitos. Colorea en forma temporal trofozotos y quistes de protozoos, adems de huevos de helmintos e Inmovilizar larvas 1. Repita el mismo procedimiento anterior usando lugol parasitolgico. 2. Examine en un microscopio con objetivo de 10X y 40X.

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Forma de cargar la muestra de heces

Forma de observar la lmina con muestra en el microscopio

C O D I G O

SSF

LUGOL

Resultados Visualizar la presencia o ausencia de parasitos: quistes, trofozoitos, larvas, etc Informar otras estructuras, cuando estn presentes, ya que indican alguna patologa: leucocitos, eritrocitos, macrfagos, cristales de Charcot-Leyden. Despus de la observacin , descarte las lminas colocndolas en la mezcla sulfocrmica o hipoclorito de sodio (leja 10%)

25

ELEMENTOS NO PARASITARIOS
En un anlisis parasitolgico los restos o elementos no parasitarios deben diferenciarse de los parsitos. Hay muchos y diferentes elementos microscpicos de restos alimenticios o restos no parasitarios, de origen endgeno o exgeno que estn presentes en las heces. Podemos citar varios ejemplos: -Tejido conjuntivo: las fibras se entrecruzan en una red muy fina. -Carne: las fibras musculares estn unidas por trabculas. Las fibras de carne insuficientemente digeridas son de tamao variable, de forma rectangular, de ngulos bien marcados, de color marrn con una neta estriacin doble, longitudinal y transversal; las fibras de carne bien digeridas presentan formas ms redondeadas, de color marrn ms claro a amarillo plido y sin estras. -Grasas: grasas neutras se ven como gotas muy refringentes y los cidos grasos con aspecto de finas agujas a veces agrupadas. -Elementos vegetales: los grnulos de almidn estn agrupados en masas celulsicas. El grado de digestin del almidn se determina por la coloracin que toma con el lugol, violeta oscura cuando el almidn est intacto, rosa plido cuando est totalmente digerido y tonos de marrn para los distintos grados de degradacin. -Celulosa no digerible: los vasos espiralados de legumbres verdes aparecen como resortes cuando estn de perfil y de frente se presentan como elementos redondeados de doble contorno cuyo interior puede estar lleno o vaco, los pelos vegetales, alargados, que tienen un polo irregular y el otro agusado, muy refringentes y en el medio un canal que puede confundirse con el intestino, restos de plenes y esporas de hongos con estructuras semejantes a huevos de parsitos de los que hay que distinguir; tejidos de revestimiento de los vegetales aparecen con formas complejas como son las clulas en empalizada, etc. -Cristales: de oxalato de calcio, de fosfato amnico-magnsico, de Charcot-Leyden o agujas de brjula. -Clulas endgenas: leucocitos, que pueden estar aislados o en grupos denominados piocitos, hemates, clulas epiteliales, clulas rectales, bacterias, etc.

EXISTEN MUCHSIMAS FIGURAS MICROSCPICAS DE RESTOS QUE NO PUEDEN SER IDENTIFICADAS CON PRECISIN Y SERA UNA TAREA INTIL TRATAR DE RECONOCERLAS. LO MS IMPORTANTE ES PODER DIAGNOSTICAR CORRECTAMENTE LOS DIFERENTES PARSITOS QUE PUEDEN HALLARSE EN EL INTESTINO HUMANO. 26

ELEMENTOS NO PARASITOS EN LAS HECES

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15. 1. gotas de grasa

16.

17.

18.

19.

20.

11) acido rico 12) fosfato calcico neutro 13) leucina 14) cidos grasos 15) oxalato de calcio 16) colesterol 17) cristales de charcot leyden 18) carbonato de calcio 19) fosfato amonio magnesio 20) cistina ELEMENTOS DE ORIGEN MINERAL

2. clulas vegetales en empalizada 3. pared de clula vegetal 4. hongos levaduras 5. pelo vegetal 6. grano de polen 7. fibra de algodn 0 8. granos de almidn 9. estructura vascular vegetal 10. clulas vegetales ELEMENTOS DE ORIGEN VEGETAL

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CUANDO LA MUESTRA ES DIARREICA O LQUIDA Debe tomarse una muestra del fondo del frasco, o centrifugar una porcin y examinar el sedimento. Si la muestra contiene moco, hacer otra preparacin tomando muestra del moco con o sin sangre, ya que aqu podran encontrarse los elementos patgenos en mayor cantidad. Ejemplo: larvas de S. stercoralis, trofozotos o quistes de G. lamblia, ooquistes de apicomplexa intestinales, trofozotos de E. histolytica en caso de disentera, trofozotos y quistes de Balantidium coli o huevos de T. trchiura atrapados en el moco. Notas Causas de error o resultados poco satisfactorios: Esperar ms de una hora antes de buscar trofozotos de protozoos Preparacin muy gruesa o muy fina Demasiada fibra, arenilla, burbujas Demasiada iluminacin, poca iluminacin Solucin de Lugol muy fuerte o muy diluida No examinar la preparacin en forma sistemtica Preparacin reseca Informe incompleto El no encontrar trofozotos en una muestra lquida, diarreica o con moco y sangre que no es fresca, no tiene ningn significado.

Para asegurar un control de calidad: Verificar que la solucin salina est limpia, sin contaminacin de bacterias, hongos o protozoos de vida libre. Verificar que la solucin de Lugol tenga la concentracin adecuada.

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ESQUEMATICE LO QUE OBSERVA EN EL MICROSCOPIO

. Aumento : x

. Aumento : x

. Aumento : x

. Aumento : x 29

ESQUEMATICE LO QUE OBSERVA EN EL MICROSCOPIO

. Aumento : x

. Aumento : x

. Aumento : x

. Aumento : x 30

Cuestionario 1. Cules son las caractersticas de las heces en cantidad, color, olor y nmero de evacuaciones diarias? 2. A qu se debe el color y olor de las heces? 3. Cul es el examen de laboratorio de eleccin para la bsqueda de huevos, quistes o larvas en heces?: 4. Cul es el examen de laboratorio de eleccin para la bsqueda de trofozotos en heces?: 5. Cules son las indicaciones para el uso de la cucharilla rectal?: 6. Por qu se recomienda qu en los exmenes coproparasitologicos se estudien tres muestras seriadas de materia fecal?: 7. Cul es la funcin de las sustancias conservadoras como el alcohol polivinlico o el merthiolate-iodo-formol en los estudios coproparasitologicos?: 8. Qu entiende por examen coproparasitologico cualitativo?:

31

32

PRACTICA N 2. OBSERVACION DE AMEBAS - RIZOPODOS Entamoeba histolytica

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Tamao : Forma : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caractersticas :

Quiste Tamao : Forma : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 33

Entamoeba coli
Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Tamao : Forma : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caractersticas :

Quiste Tamao : Forma : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : 34

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Endolimax nana - quiste

Iodamoeba butschlii - quiste

Tamao : Forma : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caractersticas : Tamao : . Forma : .... Ncleos : .... .. Vacuola : .. . Otras caracteristicas : .. .. .. ..

Esquematice las formas parasitarias que :observa en el microscopio Tamao Forma : .. Metodo : .. Ncleo : . Nucleolo : .. Otras caracteristicas : OOQUISTE Tamao : .. Forma : .... Aumento : x Esporozoitos Aumento : x :. Otras caracteristicas.. 35

** Blastocystis hominis(forma vacuolar) **

Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria FORMA VACUOLADA Tamao : .. Forma : .... Ncleos : .... . Vacuola : .. : Otras caractersticas : .. . . . Tamao : Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Forma : .. Ncleo : . Metodo : .. Nucleolo : .. Otras caracteristicas : OOQUISTE Tamao : .. Forma : .... Esporozoitos :. Aumento : x Otras Aumento : x caracteristicas.. .. .. 36

Cuestionario 1. Qu caractersticas son importantes para diferenciar Entamoeba histolytica de Entamoeba coli? 2. Qu recursos de laboratorio son esenciales para identificar las amebas comensales? 3. Aun cuando Entamoeba coli, Endolimax nana no son amebas patgenas, en qu radica la relevancia de su hallazgo? 4. Al observar al microscopio a partir de cuantas formas de blastocystis hominis por campo se considera como patgeno? 5. Realice un cuadro con las diferencias estructurales entre E. coli e histolytica 6. Esquematice el ciclo biolgico de E. histolytica

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PRACTICA N 3. OBSERVACION DE FLAGELADOS Giardia lamblia

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Tamao : Forma : .. Ncleo : . Flagelos : .. Otras caracteristicas :

Quiste Tamao : Forma : .. Ncleo : . Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 38

PROCEDIMIENTO PARA DIAGNOSTICO DE TRICHOMONA vaginalis

Materiales: Material Biolgico (Secreciones) NaCl 0.85 % Agua destilada Colorante Wright Pipeta Pasteur con bulbo Cubreobjetos Portaobjetos Microscopio

Procedimiento: 1.- Se coloca a la paciente en posicin ginecolgica. 2.-Introducir con cuidado el espejo vaginal. 3.- Con un hisopo tomar la muestra de secrecin vaginal 4.- Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido. 5.- La segunda toma depositarla en un tubo con solucin salina conservando a 37C. 6.- Una vez seco el extendido se tie con el colorante de Wright . 7.- Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a ste ltimo aceite de inmersin. 8.- Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensayo y se deposita en un portaobjetos y se cubre. 9.- Examinar con objetivos de 10X y 40X. Coloque las partes a la siguiente forma parasitaria Trofozoito Tamao : Forma : .. Ncleo : . Flagelos: .. Otras caractersticas : 39

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 40

Cuestionario 1. Mencione dos liquidos o secreciones biolgicos tiles para realizar el diagnstico de la giardiasis 2. Indica los diferentes tipos de Trichomonas existen y cual es la ms comn en el hombre. 3. Indica las diferencias que existen entre la T. vaginalis y Giardia Lambia 4. Realice un esquema o flujograma para diagnstico de laboratorio de tricomoniasis 5. Esquematice el ciclo biolgico de Giardia lamblia

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PRACTICA N 4. OBSERVACION DE HISTOPARASITOS y HEMOPARASITOS I

TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS EN LEISHMANIASIS a. Frotis directo
El examen directo puede realizarse de dos maneras: haciendo un raspado del borde interno de la lcera o haciendo una incisin y raspando el borde activo de la lesin. La primera metodologa tiene la ventaja de ser menos dolorosa, sangrar menos y ser ms fcil, rpida y econmica que la segunda. La sensibilidad de ambas metodologas es comparable. Si existen dos o ms lesiones debe escogerse para el examen directo la que tenga un menor tiempo de evolucin.

b.Frotis (raspado) del borde interno de la lcera

Guantes de ciruga, alcohol, algodn, solucin salina, jabn quirrgico, gasa estril, lminas porta-objetos, lancetas u hojas de bistur, colorante de Giemsa o Wright, microscopio ptico, aceite de inmersin. 1. Con manos enguantadas realice limpieza del sitio de la lesin utilizando algodn impregnado en alcohol o solucin salina y jabn quirrgico. Si hay costra remuvala cuidadosamente. 2. Sobre la cara interna del borde de la lcera realice un raspado con el borde romo de una lanceta u hoja de bistur. Hgalo de manera tal que no sangre mucho. 3. El material as obtenido se extiende en forma suave sobre una lmina portaobjetos previamente limpiada, desengrasada y debidamente rotulada. 4. Tome otras tres muestras de la misma manera colocando dos muestras por lmina en dos lminas portaobjetos. 5. Deje secar las muestras a temperatura ambiente. Fije con metanol y deje secar. 6. Tia las lminas con colorante de Giemsa al 10% en solucin amortiguada de fosfatos pH 7,2 durante 10 minutos, o con colorante de Wright. Para evitar la formacin de precipitados de colorante es aconsejable realizar la tincin con las lminas invertidas sobre una superficie que tenga el colorante. 7. Observe al microscopio de luz con un aumento de 100 X (objetivo de inmersin), para buscar los amastigotes que pueden encontrarse intra o extracelularmente. Para identificar un amastigote como tal debe observarse las formas ovaladas o redondeadas caractersticas y distinguirse claramente el ncleo del cinetoplasto.

c.Incisin y raspado del borde activo de la lesin.

1. Con manos enguantadas realice limpieza del sitio de la lesin utilizando algodn impregnado en alcohol o solucin salina y jabn quirrgico. Si hay costra remuvala 2. Previa infiltracin con una pequea cantidad de xilocana (0.1 a 0.2 ml), sobre el borde activo de la lesin realice una pequea incisin con la hoja de bistur de 3 a 6 mm de longitud por 1 a 3 mm de profundidad. La hemostasia se debe lograr haciendo presin en pinza con los dedos. 42

3. Con gasa estril, limpie la sangre que emana de la incisin y con la misma gasa presione el borde de la lesin para hacer hemostasis y evitar el sangrado. 4. Con el borde romo de la hoja del bistur levante la piel de la parte superior de la incisin y raspe tejido del interior de la incisin desde la profundidad hacia la superficie. 5. El material as obtenido se extiende en forma suave sobre una lmina portaobjetos previamente limpiada, desengrasada y debidamente rotulada. 6. Tome otras tres muestras de la misma manera colocando dos muestras por lmina en dos lminas portaobjetos. 7. Deje secar, fije, tia y observe al microscopio en la misma forma que para el frotis interno del borde interno de la lcera.

Interpretacin: Se interpreta como positivo cuando se encuentran uno o ms amastigotes. Se considera como negativo cuando no se encuentran amastigotes despus de haber recorrido un mnimo de 100 campos. Si el primer examen es negativo, debe repetirse el procedimiento en la misma forma sealada. Si dos exmenes directos tomando en cada uno dos lminas con dos muestras por lmina son negativos, y persiste la sospecha clnica de leishmaniasis, debe practicarse biopsia

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Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Amastigote Tamao : Forma : .. Cinetoplasto : .. Otras caracteristicas :

Promastigote Tamao : Forma : .. Flagelo : Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

44

TECNICAS Y PROCEDIMIENTOS EN TRYPANOSOMIASIS

a.Examen de sangre en fresco
Materiales Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Procedimiento: 1. Deposite una gota de sangre sobre un portaobjetos 2. Cubra la gota con un cubreobjetos, observe directamente la preparacin al microscopio con el objetivo de 40X con el condensador bajo y con una abertura reducida del diafragma del condensador. Los tripanosomas pueden ser reconocidos por su movimiento entre los hemates inmviles

b.Extensin de sangre
Esta tcnica resulta especialmente til para confirmar la identidad de la especie de tripanosoma detectada con las tcnicas precedentes. Materiales: 2 portaobjetos Cubreobjetos Microscopio Solucin de Giemsa Procedimiento: 1. Coloque portaobjetos. 2. Con un segundo porta objetos haga el una gota de sangre sobre un

extendido de sangre como se indica en la figura. 3. Cubrimos el frotis con metanol durante 3 minutos (con esto procedemos a fijar el frotis) .Escurrimos y lo dejamos secar al aire. 4. Diluimos en un tubo de ensayo 0,2 ml de giemsa con 2 ml de solucin tampn pH 7,2. Es importante realizar esta dilucin en el momento de la tincin, ya que el colorante precipita y no es vlido para otro da. 45

4. Cubrimos el frotis con la dilucin de colorante, dejndolo actuar durante 25 minutos. Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampn pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en posicin vertical. Este mtodo permite identificar las especies de trypanosoma por sus caractersticas morfolgicas.

c.Semiextensin de sangre (gota gruesa)

1. Se coloca una gota grande de sangre sobre un portaobjetos y utilizando el borde de otro portaobjetos, se extiende sobre un rea circular de unos 2 cm de dimetro. 2. Se secar rpidamente abanicando el portaobjetos en el aire y sin fijar

previamente, se tie durante 30 minutos con una solucin de colorante Giemsa al 4% en agua corriente. Considerando que el tiempo y la dilucin de tincin pueden variar en funcin del fabricante del colorante y del protocolo concreto que se utilice, se recomienda empezar siguiendo las indicaciones del fabricante y, posteriormente, modificar el tiempo de coloracin y la concentracin de colorante hasta obtener resultados ptimos. 3. Tras la tincin, el portaobjetos se lava suavemente con agua corriente y se observa al microscopio, usando para ello el objetivo de inmersin de 100X.Es fcil reconocer a los tripanosomas por su morfologa general. Resultado frotis y gota gruesa : Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.

d.Centrifugacin en tubos de hematocrito

Muchos parsitos inducen en la mayora de sus hospedadores evoluciones benignas o subclnicas de la enfermedad. En tales condiciones, la parasitemia es baja y la Identificacin del parsito difcil. Ello hace indispensable la aplicacin de tcnicas de

concentracin de parsitos como la diseada por Woo Materiales: Capilares heparinizados Plastilina Microscopio Microcentrifuga 46

Procedimiento 1. Llene partes (aproximadamente 70 l) de un tubo capilar heparinizado con sangre. 2. Selle uno de los extremos del tubo capilar con plastilina. 3. Coloque el capilar en la centrfuga y centrifugue a 10000 rpm durante 5 minutos 4. Coloque el capilar en microscopio y examine la franja que separa el plasma de la zona leucocitaria(franja blancuzca), en esta zona se deben encontrar los tripanosomas. Plasma Zona en la que debe observar. Plastilina

e.Concentracin de STROUT
Esta tcnica se basa en la concentracin de los parsitos en la muestra sangunea por centrifugacin y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes mviles de Trypanosoma cruzi. Es una tcnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congnitos. El suero se debe conservar para ser examinado por tcnicas inmunolgicas. Equipos y materiales - Microscopio. - Centrfuga. - Jeringa hipodrmicas estril o sistema de tubos al vaco sin anticoagulante. - Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. - Tubos de centrfuga. - Lminas portaobjetos. - Laminillas cubreobjetos. - Asas microbiolgicas. Procedimiento 1. Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante 2. Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule. 3. Separar el suero. 4. Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los glbulos rojos. 5. Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm), durante diez minutos. 6. Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 C para el anlisis serolgico. 7. Colocar una alcuota del sedimento obtenido en una lmina portaobjetos. 8. Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura. Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes mviles de Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X 40X de aumento. Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas mviles del parsito. 47

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Amastigote Tamao : Forma : .. Ncleo : . Cinetoplasto : .. Otras caracteristicas :

Tripomastigote Tamao : Forma : .. Ncleo : . Flagelo : Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 48

Aumento : x Cuestionario: 1.- Cmo se manifiesta el mal de chagas en el humano? 2.- Cul son otros reservorios del tripanosoma cruzi? 3.- Esquematic el ciclo de vida del tripanosoma cruzi?

Aumento : x

4.- En qu forma se encuentra el tripanosoma Cruzi en la sangre humana? 5.- En que forma se encuentra el tripanosoma cruzi en la vinchuca o chinche? 6.- En que consiste el xenodiagnostico explique? 7.- Esquematic el ciclo de vida de leishmania 8.- En qu forma se encuentra la leishmania en el humano? 5.- En que forma se encuentra la leishmania en el vector?

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PRACTICA N 5. OBSERVACION DE CILIADOS Balantidium coli

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Trofozoito Tamao : ... Forma : ...... Macrocleo : . Micronucleo: .. Otras caracteristicas : .

Quiste Tamao : ... Forma : ...... Macrocleo : . Micronucleo: .. Otras caracteristicas : .

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Mtodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 50

Cuestionario: 1.- Que regin del cuerpo humano invade el Balantidium coli? 2.- Cul es la va de entrada para el ser humano y cul es la fase infectante del ciliado? 3.- Cules son las manifestaciones clnicas ms frecuentes de la Balantidiosis? 4.- Esquematic el ciclo de vida del Balantidium coli

51

PRACTICA N 6. OBSERVACION DE HEMOPARASITOS II PLASMODIUM

EXTENSIN DE SANGRE ( FROTIS) Materiales: Laminas Portaobjetos Microscopio Solucin de Giemsa Procedimiento: 1. Coloque una gota de sangre sobre una lmina portaobjetos. 2. Tomar una segunda lmina del laminero y colocar sobre la primera en ngulo de 45, por delante de la gota de sangre pero contactando con ella. Dejar que se extienda sin que llegue a los bordes e iniciar un movimiento suave y uniforme en direccin al dedo pulgar izquierdo, con lo cual se obtendr el extendido. El extendido debe tener unos 35 milmetros de largo por 20 mm. de ancho aproximadamente. 3. Inmediatamente de realizado el extendido, agitar al aire, para obtener una rpida desecacin de la sangre y evitar la deformacin de los glbulos rojos. Por este motivo es necesario obtener el extendido antes que la gota gruesa.

Fijacin de extendido Tiene por finalidad conservar la morfologa de los elementos celulares y por lo tanto, poder realizar el diagnstico de especie del parsito 1. Colocar sobre el extendido unas gotas de alcohol metlico y dejar actuar por 2 minutos cuando el extendido tiene 24 horas ms de haber sido tomado y por 30 segundos si es reciente. 2. Quitar el exceso de alcohol metlico, inclinando la lmina en direccin contraria a la gota gruesa para evitar que se ponga en contacto con ella y la fije. 3. Colocar la lmina en el porta-lmina con la gota gruesa hacia arriba y dejar que se seque al aire. 52

SEMIEXTENSIN DE SANGRE (GOTA GRUESA) 1. Se coloca una gota grande de sangre sobre un portaobjetos y utilizando el borde de otro portaobjetos, se extiende sobre un rea circular de unos 2 cm de dimetro.

Deshemoglobinizacin
Tiene por finalidad romper los glbulos rojos, extraer la hemoglobina y evidenciar los parsitos malricos que pueden estar dentro de ellos y que queden adheridos a la lmina. 1. Colocar en un vaso de precipitado de 50 ml solucin buffer pH 7.2 en cantidad suficiente para cubrir la gota gruesa. 2. Introducir la lmina con la gota gruesa hacia abajo, verticalmente, para que quede completamente cubierta por el buffer pero sin llegar al extendido. 3. Deshemoglobinizar durante 5 minutos; si la gota gruesa es de reciente recoleccin, menos de 24 horas, se omite este proceso. Puede necesitarse ms tiempo para lograr la deshemoglobinizacin completa, si tiene ms de 24 horas de recoleccin. 4. Sacar la lmina y dejarla secar en el porta-lminas. 53

54

Coloracin
Luego de fijado el extendido, y deshemoglobinizada la gota gruesa, se procede a la coloracin con la finalidad de diferenciar las distintas especies de parsitos malricos y los dems elementos celulares de acuerdo a la afinidad por el colorante (Giemsa). El colorante Giemsa debe prepararse en el momento de usarlo, de la siguiente manera: Colorante Giemsa............................................................... 3 gotas Buffer pH 7.2....................................................................... 1 ml Esta solucin, debe prepararse en un vaso de precipitado previamente lavado con agua destilada y seco, de la siguiente manera: con un gotero se toman 20 gotas de buffer pH 7.2 o se mide 1 ml con pipeta (1 ml equivale a 20 gotas) y se colocan en el vaso de precipitado, se le agregan 3 gotas de colorante Giemsa, que se tomarn con un gotero totalmente seco. Agitar suavemente el vaso de precipitado hasta completar la dilucin. Si se agita fuertemente, se puede producir la precipitacin del colorante. Coloracin Sucesiva Primero se colorea la gota gruesa, si est positiva a malaria, se colorea el extendido. 1. Medir con una pipeta graduada 2 ml de buffer pH 7.2 y aadir 6 gotas de colorante. 2. Agitar suavemente para evitar la precipitacin del colorante. 3. Colocar la lmina en la bandeja de coloracin y cubrir la gota gruesa y se deja actuar el colorante por un tiempo de 20 minutos. 4. Terminando el tiempo, lavar con buffer pH 7.2. 5. Dejar secar la lmina en el porta-lmina. Coloracin Simultnea Se colorea la gota gruesa y extendido al mismo tiempo; se utilizan 5 ml de buffer pH 7.2 para cubrir una lmina. 1. Se prepara la dilucin del colorante de la misma forma, dicha anteriormente (3 gotas de colorante y 1 ml de buffer pH 7.2; para 5 ml se toman 15 gotas de colorante. Agitar suavemente. 2. Cubrir totalmente el extendido y la gota gruesa, con la solucin colorante y dejar actuar por 20 minutos. 3. Lavar con buffer pH 7.2 estando la lmina en posicin horizontal en el soporte sobre la cubeta, para impedir que se deposite sobre la lmina, una fina pelcula metlica, que flota sobre la disolucin del Giemsa. Despus puede continuarse el lavado con la lmina en posicin inclinada, hasta que el agua del lavado no arrastre color. 4. Dejar secar.

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OTRA TECNICA DE COLORACION

1. Preparar en un tubo de ensayo una solucin con una proporcin de 1:9 con Giemsa y tampn PBS (1ml Giemsa y 9 ml PBS). 2. Sumergir la muestra de forma vertical en la solucin preparada durante 10 minutos. 3. Tras la tincin, el portaobjetos se lava suavemente con agua corriente y se observa al microscopio, usando para ello el objetivo de inmersin de 100X. Es fcil reconocer a los hemoparasitos por su morfologa general. Examen microscpico de la gota gruesa El examen de rutina de la gota gruesa requiere observar 100 campos microscpicos ptimos a un aumento final de 1000 X, con lente de inmersin. Una lmina puede declararse como negativa, slo despus de observar 100 campos microscpicos sin haber encontrado parsitos. Si se encuentran parsitos, deben examinarse tambin los 100 campos microscpicos; esto asegura detectar la posibilidad de infeccin mixta (ms de una especie presente en una muestra de sangre). En lo posible, debe identificarse la(s) especie(s) a la(s) que pertenecen los parsitos. Procedimiento 1. Verificar el nmero de la lmina que va examinar en la hoja de registro de datos. 2. Colocar la lmina entre los soportes de la platina mecnica y verificar que est sostenida firmemente al momento de mover el carro, de lo contrario se pueden perder de vista objetos sospechosos antes de que puedan ser ubicados. 3. Examinar la gota gruesa completa con el objetivo de 10X, hasta localizar una zona conveniente para la bsqueda de los parsitos (que se observen leucocitos numerosos y bien coloreados). 4. Colocar aceite de inmersin sobre la zona seleccionada de la gota gruesa y girar el objetivo de 100X hasta ponerlo en posicin sobre ella. 5. Bajar el objetivo hasta ponerlo en contacto con el aceite de inmersin. 6. Verificar que la parte seleccionada de la lmina sea ptima (leucocitos de 10 a 20 por campo microscpico). 7. Examinar 100 campos. Desplazar la lmina que contiene la muestra de sangre siguiendo el patrn mostrado. Recuerde usar el ajuste fino para enfocar, accionando el tornillo micromtrico hacia delante y atrs, con el fin de observar el mayor nmero posible de capas sanguneas. 8. Anotar el nmero de parsitos observados y la especie a la que pertenecen (si le fue posible identificarla).

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Examen microscpico del extendido de sangre Este examen requiere mayor tiempo de observacin en comparacin con la gota gruesa, debido a que la concentracin de los elementos sanguneos es mucho menor. Se debe realizar en las siguientes circunstancias: a. Cuando no es posible examinar la gota gruesa por alguna razn (Ejemplo: por ser muy pequea). b. Cuando no es posible identificar en la gota gruesa la(s) especie(s) de Plasmodium. El aspecto que debe presentar esta preparacin al microscopio debe ser: a. Fondo limpio y libre de residuos los eritrocitos deben estar teidos de color rosa plido. b. El ncleo de los leucocitos, de color morado oscuro y grnulos bien definidos. c. Los grnulos de Schffner deben verse como un moteado en los eritrocitos que contienen P. vivax. d. La cromatina de los plasmodios se tie de color rojo grosella intenso y el citoplasma de azul violceo o azul cielo. Procedimiento 1. Colocar la lmina sobre la platina mecnica entre los soportes de esta. 2. Enfocar con el objetivo de 10X el extremo menos denso del frotis, donde los glbulos rojos estn dispuestos en una sola capa. 3. Bajar el objetivo de inmersin hasta poner en contacto con el aceite de inmersin. 4. Enfocar y examinar la pelcula de sangre siguiendo el patrn mostrado. 5. Examinar el mayor nmero de campos microscpicos (300) para determinar si la muestra de sangre es positiva o negativa para malaria. Si el diagnstico es dudoso deber examinar de 400 a 500 campos microscpicos

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Determinacion de parasitemia Mtodo a partir de Gota gruesa: Sistema de cruces recomendado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), Metodo a partir de Gota gruesa y Extendido fino (frotis) : mtodo semicuantitativo que permite estimar la parasitemia y que se informa como nmero de parasitos en 100 leucocitos (gota gruesa) o porcentaje de eritrocitos parasitados (extendido fino). El clculo inicial se puede traducir a nmero de parsitos por microlitro (ul) de sangre, unidad estandarizada que permite comparaciones. Sistema de cruces La estimacin de la parasitemia se debe realizar con la observacin de 100 campos microscpicos. En el Cuadro siguiente se describe la densidad parasitaria correspondiente al sistema de cruces.

Sistema semicuantitativo Gota Gruesa: Se cuentan leucocitos y parsitos simultneamente. El conteo se detiene cuando se llega a 100 leucocitos y se han identificado dos o ms parsitos. Por ejemplo 40 parsitos en 100 leucocitos. Si solamente se identific un parsito, el conteo sigue hasta que se identifica un parsito ms y se informa como tal, por ejemplo, "2 parsitos en 320 leucocitos". Si no se identifican ms parsitos, el conteo se detiene en 500 leucocitos y la densidad se informa como "1 parsito en 500 leucocitos".

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Extendido Fino: Se localiza una porcin del extendido en que los campos contengan cantidades similares de eritrocitos y se cuenta el nmero de eritrocitos en un campo. Luego se cuentan simultneamente eritrocitos parasitados y campos, hasta llegar a un nmero de campos equivalentes a 10,000 eritrocitos. Los eritrocitos infectados por ms de un parsito se cuentan como uno. Por ejemplo, si el rea escogida contiene 280 eritrocitos por campo, se deben contar los parsitos presentes en 36 campos. Si el conteo arroja un resultado de 40 parsitos en 10,000 eritrocitos, la parasitemia se informa como 0.4%. Una parasitemia de 1% es una densidad parasitaria elevada. Densidad parasitaria estimada por microlitro de sangre Se debe disponer de conteo de eritrocitos y de leucocitos. Si no se cuenta con un hemograma, se asumen concentraciones constantes de 5,000,000 eritrocitos/ul y 8,000 leucocitos/ul de sangre. Gota Gruesa: si se contaron 40 parsitos en 100 leucocitos, entonces 40 x 8000/100 = 3,200 parsitos/ul de sangre. Extendido fino: Si se estim una parasitemia de 0.4%, entonces 0.4 x 5,000,000/100 = 20,000 parsitos/ul de sangre.

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Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Plasmodium vivax
TROFOZOITO Tamao : .. Forma : ... Otras caracteristicas : . . .. .. .. .. .. ESQUIZONTE Tamao : .. Forma : .... Esporoquiste.: .. Esporozoitos :. Otras caracteristicas.. .. .. .. .. .. GAMETOCITO Tamao : .. Forma : ... ESQUIZONTE Otras caracteristicas : . Tamao : .. . Merozoitos ... .. Otras caracteristicas : . .. . .. .. .. .. .. .. .. 60

61

62

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x 63

Cuestionario 1.- Menciona las diferencias que existen en los diferentes tipos de plasmodium. 2.- Dibuja el ciclo vital del plasmodium 3.- En qu etapa de la fiebre se debe obtener la muestra de sangre para el diagnstico? 4.- Describe el mtodo de diagnstico de la malaria o paludismo

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PRACTICA N 7. OBSERVACION DE COCCIDEOS INTESTINALES

Mtodo Acido Resistente Modificado (KINYOUN) Se realiza para poner en evidencia por medio de una coloracin, los ooquistes de Cryptospordium spp. excretados por individuos infectados. Ooquistes de otros apicomplexa como Isospora belli, Cyclospora cayetanensis tambin pueden colorearse con este mtodo. Muestra a examinar Heces frescas o fijadas en formalina al 10%, por lo general de pacientes con gastroenteritis, nios inmunonormales entre 0-5 aos de edad y pacientes de cualquier edad que presenten diarrea crnica y deficiencia inmunolgica por cualquier razn. En algunas circunstancias {personas con SIDA), puede utilizarse esputo, bilis, impronta de biopsia de mucosas. Reactivos Carbol-fucsina Fucsina bsica 4 g Etanol al 95% 20 mL Fenol (lquido o cristales) 8 g Agua destilada 100 mL Disolver los cristales de fucsina bsica en el alcohol etlico, en un matraz de 250 mL de capacidad, agitar con una varilla de vidrio hasta disolucin completa de la fucsina. Aadir el fenol, seguir mezclando y completar a 100 mL con agua destilada. Guardar en frasco tapado y rotulado. Solucin lista para trabajar. Alcohol etlico al 50% Alcohol etlico puro 50 mL Agua destilada 50 mL Mezclar y guardar en frasco tapado y rotulado. Diferenciador. Solucin de alcohol-cido 3% cido clorhdrico concentrado 3,00 mL Etanol al 95% 97,00 mL Azul de metileno alcalino Azul de metileno en cristales 0.3 g Alcohol etlico al 95% 30 mL Mezclar hasta disolucin de los cristales. Para alcalinizar, mezclar con 100 mL de solucin acuosa de hidrxido de potasio (KOH) al 0.01%. Guardar en frasco tapado y rotulado. Solucin lista para utilizar. Materiales Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 1 pulgada) Aplicadores de madera Pipetas Pasteur con perilla Metanol puro 65

 Gasa quirrgica en cuadrados o papel absorbente Aceite de inmersin Papel para limpiar lentes de microscopio Procedimiento Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar Heces formadas o blandas, sin moco: tomar una porcin cualquiera de las heces con un aplicador y hacer un extendido fino en el tercio medio del porta-objetos. Dejar secar Heces diarreicas con moco: - tomar del moco para hacer el extendido fino.Dejar secar Heces lquidas: - si hay moco, tomar de ste para hacer un extendido fino. Si no hay, mezclar las heces con una pipeta Pasteur y tomar una pequea cantidad para hacer un extendido fino sobre un portaobjetos. bien sin mezclar, aspirar una porcin pequea del sedimento y extender. Dejar secar Heces fijadas en formalina: al 10% mezclar las heces y hacer un extendido fino sobre un porta-objetos. Dejar secar 1. 2. 3. 4. Fijar con metanol puro 30 segundos. Dejar secar Introducir en carbol fucsina 5 minutos Enjuagar en agua corriente Introducir en alcohol acido durante 8-10 segundos. Este es un paso crtico, por lo que debe asegurarse del tiempo necesario segn sus reactivos 5. Lavar en agua corriente por ambos lados, escurrir sobre gasa 6. Introducir en azul de metileno alcalino 1 minuto Lavar, dejar secar y observar al microscopio ptico. 7. Para examinar la lmina, algunos autores recomiendan colocar una pelcula muy fina de aceite sobre la coloracin para buscar ooquistes rpidamente con el objetivo 40 X. Una vez que se encuentren cuerpos parecidos a ooquistes teidos, asegure el diagnstico cambiando para el objetivo de inmersin. Caractersticas de la coloracin Los ooquistes de Cryptosporidium se tien de rojo brillante, que se destacan sobre un fondo azul en coloraciones adecuadas. Su tamao (4-6 m) y su forma redonda son uniformes. A menudo se observa una vacuola y un granulo denso dentro del ooquiste, otras veces no se observa esto. Se diferencian de levaduras porque estas son ms pequeas, redondas o alargadas, a veces se observa la gemacin y se tien de azul oscuro denso o de rosado. Los ooquistes del. Isospora belli miden entre 18-25 m, tienen forma de cigarro o de huso, el esporoblasto se colorea de rojo intenso, pero no siempre. Los ooquistes de C. cayetanensis miden de8-10 m, son redondos, no se colorean uniforme ni intensamente, algunos permaneces sin color, su contenido aparece granuloso o no revela ninguno; en ocasiones la pared del ooquiste se observa arrugada. Observaciones La expulsin de ooquistes en pacientes infectados es intermitente, por lo que es necesario repetir el examen durante algunos das. La cantidad de ooquistes presente puede ser escasa, por lo que se hace necesario concentrar la muestra y colorear el concentrado ( mtodo de Weber). Heces de cualquier consistencia pueden contener ooquistes, no solamente las diarreicas o lquidas. Guardar las lminas positivas, debidamente rotuladas, para referencia y control. 66

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Isospora belli
OOQUISTE Tamao : .. Forma : ... Esporoquistes : Esporozoitos :.. Otras caracteristicas : .......................... .. . . . .

Cryptosporidium parvum
OOQUISTE .. Tamao : .. .. Forma : ... Esporozoitos :.. Otras caractersticas : .......................... .. . . .. .. . . .

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio 67

Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x Cuestionario

Aumento : x 68

1. Cul es la fase de Isospora belli en el ser humano? 2. Cul es la va de infeccin de Isospora belli? 3. Qu tcnica se emplea para el diagnstico de la Isosporiosis? 4. Esquematice ciclo biolgico de Isospora Belli 5. Cul es la fase del Criptosporidium parvum en el ser humano? 6. Cul es la va de infeccin de Criptosporidium parvum? 7. Qu tcnica se emplea para el diagnstico de la Criptosporidium parvum? 8. Esquematice ciclo biolgico de Criptosporidium parvum 9. Realice un cuadro de diferencias de las Coccideas intestinales

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70

PRACTICA N 8. OBSERVACION DE ASCARIS LUMBRICOIDES

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias HUEVO GRAVIDO ( FERTIL ) MAMELONADO ( CORTICADO ) Tamao : .. Forma :.. Cubiertas ( capas ) : .. ... ... .. Otras caractersticas : .. .. .. HUEVO INGRAVIDO ( INFERTIL ) MAMELONADO ( CORTICADO ) Tamao : .. Forma :.. Cubiertas ( capas ) : .. ... ... Otras caractersticas : .. .. .. ..

HUEVO LARVADO Tamao : .. Forma :.. Cubiertas ( capas ) : .. ... ... Otras caractersticas : .. .. .. .. .. 71

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x

Cuestionario 1. Que es el ciclo de Looss ? 2. Dibuje un Ascaris adulto macho y hembra indicando sus partes 3. Esquematice el ciclo biolgico de Ascaris lumbricoides

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PRACTICA N 9 : OBSERVACION TRICHURIS TRICHIURA

Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria HUEVO Tamao : .. Forma :.. Cubiertas ( capas ) : .. ... ... Otras caractersticas : .. .. .. .. Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio .. Metodo : ..

Aumento : x Cuestionario

Aumento : x

1. Dibuje un Trichuris adulto macho y hembra indicando sus partes 2. Esquematice el ciclo biolgico de Trichuris trichiura 73

PRACTICA N 10. OBSERVACION DE UNCINARIAS

Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria HUEVO Tamao : .... Forma :.... Cubierta : ......... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... .... Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

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Cuestionario 1. Esquematice ciclo biolgico de Ancylostoma duodenale y Necator americanus 2. Realice un cuadro de diferencias entre Ancylostoma duodenale y Necator americanus 3. Dibuje los huevos y regin bucal de gusano adulto de Ancylostoma duodenale y Necator americanus

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STRONGYLOIDES STERCORALIS
Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria LARVA RHABDITOIDE Tamao : .... Forma :.... Cubierta ( capas ) : ....... ....... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x

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Cuestionario 4. Esquematice ciclo biolgico de Strongyloides stercoralis 5. Esquematice una larva rhabtiotoide y coloque sus partes 6. Esquematice una larva filariforme y coloque sus partes

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PRACTICA N 11. OBSERVACION ENTEROBIUS VERMICULARIS

MTODO DE LA CINTA TRANSPARENTE ADHESIVA (TEST DE GRAHAM) Recobrar huevos de Taenia sp. o de Enterobius vermicularis de la regin anal y perianal de individuos infectados. Hembras de E. vermicularis migran del ciego e intestino grueso a la regin exterior del ano, adonde depositan huevos casi infectantes, razn por la cual casi nunca se ven en las heces. Los progltidos grvidos de Taenia saginata y a veces de T. solium que se desprenden de la estrbila y fuerzan el esfnter anal, dejan rastros de huevos en la regin perianal mientras tienen movimientos de extensin o retraccin. Para diagnosticar infecciones por E. vermicularis, la cinta transparente adhesiva es el mtodo indicado; para identificar individuos infectados con Taenia sp. este mtodo, en combinacin con otros mtodos y la observacin clnica, aumenta la probabilidad de diagnstico. Preparacin del paciente La toma de esta muestra es fcil de realizar an por personas de poca preparacin o analfabetas, siempre que se provea una explicacin clara y sencilla. Para este o cualquier otro mtodo que se utilice, la muestra debe tomarse antes que el paciente se lave, bae o defeque, durante la noche o inmediatamente al levantarse por la maana o en cualquier momento (Taenia) antes del examen. NOTA: En ocasiones se pueden ver los gusanos adultos al separar los glteos o sobre las heces a! defecar. Si esto sucede, debern llevarse al laboratorio para la confirmacin morfolgica. Como instruccin a la madre, se le indica de recogerlos y colocarlos en alcohol o vinagre en un bote limpio y llevarlos al laboratorio. Materiales Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm Baja-lenguas o palo de paleta Cinta transparente adhesiva de 2 cm de ancho Etiquetas Xilol Pipeta Pasteur y bulbo o perilla de goma Frasco con desinfectante para descartar material Procedimiento 1. Colocar una tira de cinta transparente adhesiva sobre un porta-objetos limpio y seco, dejando un extremo doblado por debajo de la lmina y en el otro pegar una etiqueta y escribir la identificacin del paciente 2. Al momento de tomar la muestra, pelar la cinta suavemente del porta-objetos, tomndola por la parte etiquetada. 3. Colocar el porta-objetos sobre un baja-lenguas o palo de paleta y doblar la cinta sobre un extremo de ste, con la parte adhesiva hacia fuera 4. Con el paciente en decbito, apartar los glteos con una mano y apretar la cinta adhesiva firmemente a un lado y otro de los pliegues perianales 5. Volver a colocar la cinta sobre el porta-objetos y descartar el baja-lenguas 78

6. La muestra puede transportarse o guardarse protegida, hasta el momento del examen. 7. Para examinar, desprender la cinta transparente hasta la parte expuesta agregar 12 gotas de xilol a la lmina y apretar de nuevo la cinta en su lugar. El xilol (puede ser tolueno) aclara la preparacin, elimina las burbujas de aire y hace ms visibles los huevos. Examinar inmediatamente al microscopio.

Caractersticas de los huevos de taenia y de enterobius vermicularis Los huevos de Taenia se reconocen por su forma redonda, de igual tamao (31 a 43 m), pero se ven caf, densos y en unos pocos ejemplares se pueden visualizar los ganchos de la oncsfera. Utilizar mayor aumento para ver detalles. Los huevos de Enterobius vermicularis se observan de cscara transparente, alargados u ovoides, con un lado ms aplanado; tienen un embrin en su interior y miden entre 50-60 m por 20-30 m.

Resultados (observaciones):

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Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria HUEVO Tamao : .... Forma :.... Cubierta : ......... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... .... Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x Cuestionario

Aumento : x

1. Esquematice el ciclo biolgico de Enterobius vermicularis 2. Diferencias entre parasito adulto macho y hembra 80

PRACTICA N12 .OBSERVACION DE CESTODES I

TENIA sp
Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias HUEVO Tamao : .... Forma :.... Cubierta : ......... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... CISTICERCO Tamao : .... Forma :.... Cubierta : ......... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... ....

Proglotide - Tenia ....

Proglotide - Tenia ....

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ESCOLEX Tenia .... Forma :.. Ganchos : . Ventosas :... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... ....

ESCOLEX Tenia . Forma :.. Ganchos : . Ventosas :... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... .... Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 82

Cuestionario 1. Esquematice ciclo biolgico de Tenia solium 2. Esquematice ciclo biolgico de Tenia saginata 3. Realice un cuadro de diferencias de las dos tenias 4. Existe alguna diferencia entre huevos de estas dos tenias? Cules son?

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PRACTICA N13. OBSERVACION DE CESTODES II

Hymenolepis nana
Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria HUEVO Tamao : .. Forma :.. Cubierta : ......... Otras caractersticas : ... ...... ... ...

Escolex

Proglotide

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 84

Cuestionario 1. Esquematice ciclo biolgico de Hymenolepis nana 2. Realice un cuadro de diferencias entre Hymenolepis nana y diminuta 3. Existe alguna diferencia entre huevos de estas dos tenias? Cules son?

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PRACTICA N14 .OBSERVACION DE CESTODES III

Diphyllobothrium sp.
Coloque las partes de la siguiente forma parasitaria HUEVO Tamao : .... Forma :.... Cubierta : ......... ....... Otras caractersticas : .... ....... .... .... .... .... Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x

Aumento : x 86

Cuestionario
1. Esquematice ciclo biolgico Diphyllobothrium sp. 2. Realice un cuadro de diferencias entre Diphyllobothrium latum y pacificum 3. Existe alguna diferencia entre huevos de estas dos tenias? Cules son?

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PRACTICA N15 .OBSERVACION DE TREMATODES Fasciola hepatica

Coloque las partes de las siguientes formas parasitarias

Huevo Tamao : Forma : .. Otras caracteristicas :

Adulto Tamao : Forma : .. Ncleo : . Otras caractersticas :

Esquematice las formas parasitarias que observa en el microscopio Metodo : ..

Aumento : x 1.

Aumento : x 88

89

PRACTICA N16 . OBSERVACION DE INSECTOS DE IMPORTANCIA MEDICA

Material necesario Insectos Lupa binocular. Objeto de la prctica Estudio de los insectos: Artrpodos, antenados con el cuerpo dividido en cabeza, trax y abdomen, con tres pares de patas. Se pretende que los alumnos observen y dibujen las caractersticas que son comunes a todos los insectos de inters medico. Adems pueden observar las caractersticas que diferencian a los principales rdenes. Desarrollo de la prctica: 1. Cada alumno aporta un pequeo insecto (mosca, avispa, pulga, etc.), deben observarlo a la lupa, dibujarlo y clasificarlo. 2. Con las caracteristicas de insectos deben localizar un ejemplo de cada uno de los siguientes rdenes y clasificarlo asi como describir sus caractersticas.

Coloque las partes de los siguientes insectos

Anopheles sp.

Caractersticas : .. . . . . . . .

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Caractersticas : ..

Musca domestica

. . . . . . .

Periplaneta americana

Caractersticas : .. . . . . . . .

Pulex irritans

Caractersticas : .. . . . . . . . . .

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Sarcoptes scabiei

Caractersticas : .. . . . . . . . . .

Pediculus humanus

Caractersticas : .. . . . . . . . . .

Phthirus pubis

Caractersticas : .. . . . . . . . . . 92

Demodex folliculorum

Caractersticas : .. . . . . . . . Caractersticas : ..

Triatoma infestans

. . . . . . . . . . .

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PRACTICA N17 .EXAMEN COPROFUNCIONAL

El examen coprolgico funcional es un conjunto de pruebas que brindan informacin oportuna y de fcil acceso sobre la fisiopatologia digestiva, especialmente dirigida a patologas relacionadas con: prdida de peso, diarreas crnicas, desnutricin malnutricin, pancreopatias, procesos inflamatorios intestinales, anemia macro microcticas y hemorragias Las heces tienden a ser blandas y voluminosas cuando se sigue una dieta alta en vegetales, escasa y seca con comidas en que se ingiere mucha carne. El 75% del contenido de las heces es agua mientras que el 25% restante es materia fecal. El 30% de este 25% va a ser de desechos celulares y bacterianos. Entre un 30 y un 50% dependiendo de la dieta va a ser de residuos de esta, aproximadamente entre un 10 y 15% va a ser grasa y el 5% restante va a estar formado por sustancias inorgnicas, principalmente fosfatos y carbonatos El estudio coprofuncional muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve para determinar: 1.- La situacin del funcionalismo digestivo. 2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.- Infecciones causadas por parsitos intestinales. La prueba se realiza en tres fases: La fase Macroscpica consiste en reportar las caractersticas fsicas u organolepticasde la muestra (forma, consistencia, color, aspecto, presencia de sangre o moco) La fase Qumica consiste en analizar varios parmetros como el pH, sustancias reductoras, sangre oculta, grasas, entre otras. La fase Microscpica, la muestra es analizada para identificar y cuantificar clulas inflamatorias (leucocitos), bacterias, hongos, el tipo de fibras que predominan como producto del metabolismo del aparato digestivo u otros elementos anormales que pueden estar presentes en la muestra ALIMENTACIN PREVIA AL ANLISIS Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas, pero hay que aadir aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnstico, como son: Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo ms cruda posible..cuidado con este dato Patatas: Se investiga la digestin de almidn. Grasa: Se tomar en forma de leche, mantequilla o carne. Este plan se sigue durante 3 das y luego se recoge la muestra de heces.

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Se le pide al paciente que lleve al laboratorio una muestra de heces (debe ser una evacuacin completa), con una dieta mnimo de tres das sin ingerir carnes rojas y sus derivados (chorizos, embutidos, etc.), antes de su estudio. NO COMER: coliflor, pepinos betabel, meln y toronja. RECOLECCIN DE MUESTRA Recibir la deposicin en un recipiente limpio; no es necesaria la esterilidad., evitando que se contamine con orina. Escoger una porcin caracterstica de las heces (con moco o sangre si hubiese) y colectar con una esptula aproximadamente una muestra equivalente a 1/4 del frasco (no lo llene). Coloque en cada etiqueta su nombre completo, fecha y hora de la obtencin. Muestras No Adecuadas *Muestras con mas de 2 horas de haber sido obtenidas. *Muestras obtenidas del inodoro. *Muestras en cantidad insuficiente o excesiva. *Muestras contaminadas con orina Las muestras inadecuadas no sern analizadas y se solicitar una nueva muestra. MATERIALES Portaobjetos. Cubreobjetos. Tubos de ensayo. Gradillas Pinzas Bajalenguas Mechero cido actico al 10%. Kit reaccin de thevenon Reactivo benedict Lugol Tiras reactivas para medir Ph Agua destilada Microscopio.

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PROCEDIMIENTO

EXAMEN MACROSCOPICO ( ORGANOLPTICO )

OLOR:Tiene un olor en particular debido a ciertos productos aromticos originados en el intestino por la accin de microorganismos de fermentacin o de putrefaccin que actan sobre hidratos de carbono y protenas. El escatol (3-metil-indol), es qumicamente muy similar al indol y es otro de los constituyentes de las fermentaciones intestinales que le dan a las heces su olor caracterstico.

a) Fecaloide. normal. b) Ptrido (olor a amoniaco). Debido a la flora proteoltica aumentada. Provoca diarreas de putrefaccin (heces alcalinas y gases). c) Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacaroltica aumentada. Provoca diarreas de fermentacin (heces cidas y gases). d) Nauseabundo . Debido a la descomposicin de tejidos, ocasionada por carcinoma, lceras. COLOR: La coloracin parda habitual se deben a urobilina y estercobilina, el color es segn la alimentacin. a) Marrn: Es el color habitual. b) Verde: Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la presencia de biliverdina (rapidez del trnsito intestinal, diarreas infantiles). c) Rojo: Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias prximas al ano. d) Negro: Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos e) (carbn, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas, melenas). f) Blanco - grisceo. : Debido a la ingesta (leche, bario -peptobismol, caoln...) o a la ausencia de bilis fundamentalmente. (ictericias obstructivas, hepatitis) g) Amarillo: Debido a la ingesta (rgimen lcteo - Lactantes) o a diarreas de fermentacin hidrocarbonada (ingesta de Pan o papas), tambin pueden indicar que el paciente sufre una infeccin conocida como giardiasis. Sndrome de Gilbert. Esta enfermedad est condicionada por brotes de ictericia y de hiperbilirubinemia y ocurre cuando hay un exceso de bilirrubina en la sangre. h) Castao oscuro caf: Ingesta de carnes

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En los seres humanos la primera vez que los bebs vacan su intestino echan unas deposiciones, espesas y pegajosas que se denominan MECONIO. El meconio es de color verde oscuro a negro compuesta por clulas muertas y secreciones del estmago e hgado, que reviste el intestino del recin nacido. Su formacin comienza en el periodo fetal. El trmino meconio, deriva de la palabra griega mekoni, que significa jugo adormecedor u opio. Desde que Aristteles observara una relacin entre la tincin por meconio del lquido amnitico y un estado de sueo fetal o la depresin neonatal, los obstetras se han interesado por el bienestar del feto cuando se presenta meconio en el lquido amnitico. A veces, las parturientas al romper aguas, observan la presencia de meconio en el lquido amnitico. Esto es sntoma de que el beb tiene dificultades antes del parto. El meconio se expulsa durante las primeras 24 horas de vida, gracias a la accin laxante del calostro, pero puede tardar hasta 48 horas en ser expulsado por el beb. Despus las deposiciones sern ms slidas y de color amarillo. Si el beb no realiza sus deposiciones tras ese periodo, debe acudir urgentemente a su pediatra para su valoracin

CONSISTENCIA: Normalmente es pastosa-dura. Puede modificarse en distintas circunstancias. En las diarreas la consistencia es lquida, en cantidad abundante cuando se deben a patologa intestino delgado y escaso y mucosas si proceden del intestino grueso. Las deposiciones semiblandas indican un trnsito rpido por el intestino delgado o son propias de las afecciones pancreticas o biliares. En el estreimiento son duras, en forma de grandes bolos en la atona, y acintadas en las obstrucciones mecnicas. Las deposiciones caprinas son propias de los estados espsticos acentuados. CONSISTENCIA Agua de arroz Pur de lentejas Papilla Pegajosa Pegajosa oscura Pastosa espumosa Restos gruesos de alimentos RELACIONADA CON: Clera Tifoidea Insuficiencia gstrica Esteatorrea origen biliar, pancretico Melenas Dispepsia (Indigestion) Insuficiencia pancretica 97

FORMA: Vara con la consistencia a) Cilndrica: Es la normal. La superficie presenta depresiones y relieves, b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas. c) Bolitas secas y duras: Estreimiento. d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis. e) Bola maleable del tamao de un puo: Se presenta en la atona del recto (personas ancianas).

MUCUS: Su presencia en las heces es propia de los estados inflamatorios del intestino principalmente el colon. (enteritis y colitis), pero tambin se presenta en los estados espsticos, an sin Inflamacin. La presencia de mucus es indicio de irritacin compatible con la existencia de un parasitismo. El procedimiento es utilizar un aplicador de madera para buscar la presencia de mucus en la muestra. Mezclado con las heces, aspecto brillante procede del intestino delgado. Moco visible proviene del colon. Transparente: como catarro alrgico (colon irritable), estrs. Opaco con clulas epiteliales: proceso inflamatorio agudo. Moc sanguinolento: neoplasma, amebas o bactrias. Moc sanguinolento y pus: colitis ulcerosa, carcinoma, desinteria basilar, diverticulitis aguda o tubrculos intestinales. La presencia de moco es importante, salvo en los recin nacidos, y siempre deber resaltarse en el informe. Resultados: Se expresa en (+), (++), (+++). Para distinguir entre tejido conjuntivo y moco se agregan unas gotas de cido actico glacial 1:3, y se observa al microscopio, colocando en un portaobjetos con una pipeta de pasteur una gota de la dilucin y cubriendo con un cubreobjetos; el tejido conjuntivo se aclara, mientras que el moco se hace ms compacto.

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EXAMEN FSICO-QUMICO
pH La apreciacin de la reaccin de las heces se hace con papeles indicadores de pH. El valor normal es de 6.9 a 7.2, Vara dependiendo del rgimen alimenticio. no es valida la determinacin si el paciente est en tratamiento con antibiticos orales. El pH de las heces es un dato orientador sobretodo en diarreas infantiles, cuando es cido es de origen bacteriano. El pH fecal depende en parte de la fermentacin de los azcares. La fermentacin en el colon de una cantidad normal de carbohidratos y de produccin de cidos grasos explica un pH normal ligeramente acidificado. Si se sospecha intolerancia a los disacridos, se realiza un simple test de screening Se emplea una tira de papel indicador universal, sobre el cual se aplica una pequea cantidad de materia fecal, se espera unos minutos y se compara con la escala de colores. Se van a modificar segn el proceso digestivo. pH cidos indican EDA de tipo BACTERIANO y viral. pH alcalinos indican EDA invasivas.

pH ligeramente alcalinos, se dan en casos de diarreas secretorias sin ingesta de alimentos, colitis, adenoma velloso, y posiblemente con el uso de antibiticos. Un pH fecal menor de 6.0 es evidencia sugestiva de malabsorcin de azcares. En nios y en algunos adultos se nota que sus heces tienen un olor dulce como resultado de cidos grasos voltiles y la presencia de intolerancia a la lactosa. pH fecales bajos tambin contribuyen a escoriaciones de la piel de la regin perianal, frecuentemente acompaadas de diarrea. La determinacin de sustancias reductoras en la materia fecal es un test ms confiable la deficiencia de disacaridasa. Un pH fecal alto puede ser un factor de riesgo de cncer colo-rectal. La ingesta de cereales con fibra (75-100g/das x 14 das) demuestra la capacidad de reducir el pH fecal en 0,4 unidades. Sin embargo, esto significa que un pH alto se relaciona en segunda instancia con el riesgo de cncer. 99

SANGRE OCULTA Tambin se llama este anlisis investigacin de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante. Cuando proviene de hemorragias gstricas, duodenales, cncer de colon, etc., la sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante. Para este anlisis es importantsimo que el paciente durante los 2-3 das anteriores a la toma de muestras se someta a un rgimen riguroso (blanco), sin carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, pltanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deber tomar medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar prdidas sanguneas como salicilatos o esteroides. La alimentacin permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche. La mayora de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinacin de peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. a. THEVENON PRUEBA EN PAPEL FILTRO 4. Sobre un papel de filtro manchado de heces y unas gotas de acido acetico, 5. Se ponen unas gotas de piramidon ,disolucin etanlica y 6. Se agregan unas gotas de agua oxigenada de 10 volmenes. 7. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formar un halo de color morado en torno a la mancha PRUEBA EN TUBO 1. Con una varilla de vidrio se colocan en un tubo de ensayo heces del tamao de un maiz 2. Se agregan 2 ml de agua destilada y 2ml de acido acetico al 50 % y 1 ml de agua oxigenada, adicionando por zona 5 gotas de Agua Oxigenada (3%) 3. La presencia de sangre se pone de manifiesto por un halo de color violeta .

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b. REACCIN DE LA BENCIDINA: Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10 volmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formar un halo de color verde-azulado en torno a la mancha. c. REACCIN DE WEBER O DEL GUAYACO: La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se pone guayaco. La reaccin es la siguiente: HEMOGLOBINA + H2O2 H2O + O2 BENCIDINA O2 + o Color Azul-verdoso d. PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO: No se basa en la peroxidasa: Tiene ms sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la capacidad del Cr radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hemates y por el hecho de no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. As pues, es excretado por las heces en las que puede ser medido por espectrofotometra de rayos. e. HEMA SCREEN TEST. La prueba se realiza empleando el TEST de Hema Screen, es una prueba en placa para la deteccin cualitativa de sangre oculta. El Hema Screen est compuesto de un papel impregnado de guaiaco encerrado en una tarjeta, con lo que se permite la aplicacin de la muestra en un lado y el desarrollo e interpretacin al reverso. El Hema Screen, est basado en la oxidacin de los compuestos fenoliticos presentes en el guanaco con la produccin de compuestos quinonas de color azul. Debido a su similitud con los grupos proteicos de la peroxidasa, la porcin hematina de la molcula de hemoglobina puede funcionar en una manera pseudoenzimtica, catalizando la oxidacin del guaiaco. Nota: La reaccin de color ocurrir despus de 30 segundos. El Hema Sceen incluye un lado para el monitoreo, el cul proporciona un sistema de control de calidad para cada prueba. Procedimiento 1. Abra la tapa frontal, utilizando un extremo del aplicador, colecte una pequea cantidad de muestra. Aplique una capa muy delgada en la ventana 1. 2. Utilice el otro extremo del aplicador para obtener una segunda muestra a partir de una porcin diferente de la muestra de heces. Aplicar una capa muy delgada en la ventana 2. 3. Permitir que las muestras se sequen al aire, despus cierre la cubierta. 4. Habr la ventana perforada en la parte trasera de la placa. 101

5. Aplicar dos gotas de revelador Hema Screen en la parte trasera de las ventanas 1 y 2. 6. lea el resultado despus de 30 segundos y antes de 2 minutos. 7. Registre los resultados cualquier traza de color azul, dentro o fuera del margen de la muestra, indica un resultado positivo para sangre oculta. POSITIVO NEGATIVO : : INDICA UN COLOR AZL UN COLOR INCOLORO

Fuentes de error Falsos positivos: la peroxidasa de frutas y vegetales crudos. Falsos negativos: la ingestin de ac. Ascrbico (Vit. C) en altas dosis.

Nota: Los medicamentos orales (como aspirina. Indometacina, reserpina, fenilbutazona, corticosteroides), y el consumo fuerte de alcohol puede causar irritacin o sangrado del tracto intestinal y deben ser descontinuados por siete das antes y durante el periodo de la prueba. Resultados y valores de referencia. Todos los parmetros del estudio de Coprolgico funcional se reportan en cruces siempre y cuando sea positivo, de acuerdo a la siguiente tabla y criterio del analista. CRITERIO ABUNDANTE MODERADO ESCASO CRUCES 4 3a2 1

AZUCARES REDUCTORES a. TEST DE BENEDICT Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar ms de una hora desde que son emitidas hasta que se realiza el examen. 1. Con una varilla de vidrio se colocan en un tubo de ensayo heces del tamao de un maiz 1 gramo de heces (pastoso). 2. Se agregan 2 ml de agua destilada se homogeneiza 3. Se agrega 2ml de reactivo de benedict 4. Se somete al calor hasta la ebullicin. Moviendo el tubo lentamente. 5. Dejar en reposo y evaluar en cruces.

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Azul verdoso: vestigio o trazas. Amarillo verdoso: (+). Amarillo intenso: (++). Naranja ladrillo: (+++).

b. CLINITEST, 103

La determinacin de cuerpos reductores (lactosa o glucosa sacarosa, maltosa, etc.) en las heces. Se recogen las heces lquidas en un paal de plstico, se hace una mezcla con 2 partes de agua y 1 de heces. Se toman 15 gotas de la mezcla en un tubo al que se aade un comprimido de clinitest. Cuando finaliza la reaccin se compara el color con una escala contenida en dicho mtodo y se valora la concentracin de sustancias reductoras, segn la coloracin obtenida. Se considera anormal la presencia de 0,5% (dos cruces) o ms. Si sospechamos diarrea por sacarosa la prueba nos dar negativa, por lo que debemos hacer otro tipo de prueba separando la fructosa y glucosa. Nota: Las heces de los nios con intolerancia a los azucares son generalmente acuosas, y quienes tienen intolerancia a la lactosa, son generalmente cidas.

GRASAS a. Metodo de Saathoff - cualitativo 1. Sudan III 2 gramos 2. Alcohol 96 10 ml. 3. cido actico glacial 90 ml. Se realiza una dilucin de la muestra fecal con solucin salina, se toma 1.0 ml. Ms una gota de reactivo de Saathoff en un tubo de ensayo, se agita y se coloca una gota de la suspensin entre portaobjeto y cubreobjeto y se lee al microscopio, se observan gotas rojas, de 2 a 3 por campo son de grasas neutras y es normal. Ms de 3 gotas por campo son patolgicas. Lo cul puede deberse a: Transito acelerado, deficiencia enzimtica en absorcin.

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b. Reaccin de azul de nilo para grasa fecal - cuantitativo 1. Diluir en un tubo de ensayo una porcin de muestra con 9 volmenes de agua. 2. Aadir: 1 ml. de esta suspensin fecal. 1 ml. de agua. 3 gotas de ClH al 10%. 3 gotas de Oxalato amnico saturado. 3. Calentar a ebullicin durante unos segundos. Enfriar. 4. Echar el lquido en un vaso de precipitado. 5. Lavar el tubo de ensayo con 2,5 ml. de solucin de CO3Na2 al 20% y aadirlos al contenido del vasito. 6. Agregar 15 ml. de agua y 1 ml. de solucin de Azul de Nilo (0,05% en agua) dejando resbalar por las paredes. 7. Leer los resultados inmediatamente: NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./da) POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./da) Cuando la reaccin de azul de Nilo es negativa, la grasa fecal no excede nunca de 5% en peso. Una reaccin claramente positiva corresponde a ms del 5% de grasa. c. Mtodo de van de kamer - cuantitativo Se separan los lpidos de las heces mediante tratamiento de estas con una solucin de hidrxido potsico alcohlico y que contenga pequeas cantidades de alcohol amlico. De sta manera se produce la formacin de jabones. Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en cidos grasos, extrayndose estos a continuacin con ter de petrleo. Por ltimo se titulan los cidos grasos con NaOH 0,1 N Peso total de heces x Vol. cc. NaOH g. de grasa = Peso de la muestra PIGMENTOS BILIARES La presencia de bilirrubina y estercobilingeno en heces mediante 2 mtodos: a) Prueba del Sublimado: Sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: Dilucin de heces.................................... 5 ml. Sublimado (ClHg).................................... 5 ml. Se agita y se incuba a 37oC durante 1 - 2 horas y se observan los resultados: ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINGENO VERDE............................ BILIRRUBINA. BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos. 105

b) Prueba de grigaut: Sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo: ClH concentrado...................................... 5 ml. Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas. (Tricloruro de monohierro) Dilucin de heces.................................... 5 ml. Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados: VERDE..................................... BILIRRUBINA. ROJO........................................ ESTERCOBILINGENO. Las 2 pruebas se hacen simultneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los resultados se interpretan as: SUBLIM GRIGA ESTERCOBILINOGENO BILIRRUBINA ESTERCOBILINGENO BILIRRUBINA + + + + + +Heces normales Trnsito intestinal acelerado Trnsito intes. medianamente acelerado Obstruccin biliar

ENZIMAS PROTEOLTICAS Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales (hasta una dilucin 1/100) licuan la gelatina. La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de la heces a estudiar de heces sobre una pelcula de gelatina. Se considera un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en hora. Positivo hasta una dilucin 1/100........................... Digestin normal. Positivo hasta una dilucin 1/50............................. Digestin media. Positivo hasta una dilucin 1/10..............................Digestin deficiente.

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EXAMEN MICROSCOPICO (CITOLOGICO)

Nos aporta datos ms fidedignos acerca de los trastornos de la digestin. Para ello habr que instaurar la alimentacin explicada anteriormente, si no se hace as la significacin del estudio es muy limitada. Para este estudio se hace una suspensin de heces en suero fisiolgico. 1. Se coge una cantidad de heces, del tamao de una castaa, y se coloca en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo. 2. Se aade agua o suero fisiolgico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homognea y fina, ni muy fluida ni muy espesa. 3. Se coloca una gota de esta suspensin en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa delgada, homognea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre. Se observar con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visin de conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos. Cuando se trata de heces lquidas, se debe hacer una mezcla homognea y se coloca una gota directamente al portaobjeto. a) LEUCOCITOS: Se mejora la observacin agregando una gota de cido actico al 10% (o lquido de turk), mas una gota de materia fecal, se realiza una suspensin en un tubo de ensayo. Su presencia indica infeccin bacteriana. Si hay ms de 10 leucocitos por campo debe realizarse una diferencial de la muestra fecal por medio de la tcnica de Wrigth , y se debe diferenciar entre Polimorfonucleares (PMN) y Mononucleares (MN). Mayor cantidad de PMN la infeccin es causada por bacterias o amebas y en la enfermedad inflamatoria crnica del colon., mayor cantidad de MN la infeccin es viral.

Aumento : x

Aumento : x 107

b) PIOCITOS: Se presenta en pequeas cantidades en la enteritis y colitis de cualquier etiologa. Pero la presencia brusca de pus abundante es indicio de la evacuacin a la luz intestinal de un absceso prximo. c) HEMATIES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Los glbulos rojos tienen un dimetro de 7,5 m. Su presencia en las heces puede indicar ulceracin a nivel del tacto intestinal bajo u otro problema hemorrgico o una evacuacin muy rpida, tambin pueden aparecer en infecciones por parsitos, bacterias, virus, etc.

Aumento : x

Aumento : x

d) CRISTALES: Indican una excesiva irritabilidad. Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario. Cristales de Oxalato de Calcio: Normal en insuficiencia gstrica. Cristales de Colesterol: Clculos vesiculares Cristales de Hamatoidina: Agujas amarillas, se presentan en y aumentada su presencia

grupos, aparecen despus de hemorragias. Cristales de Charcot Leyden: Presentes Isospora belli, por son cristales octadricos en amibiasis, diarreas por alargados, producidos

la degradacin

de eosinfilos.} 108

Aumento : x

Aumento : x

e) HONGOS LEVADURAS: Clulas ovoides de 4 a 6 m y que pueden encontrarse en forma de levaduras o hifas. Son altamente hepatotxicos y lesionan la mucosa gastrointestinal (agravando el problema de hiperpermeabilidad). Junto con los hongos, erradican al resto de la flora.

Aumento : x

Aumento : x 109

f) CLULAS EPITELIALES: Mucosa intestinal. Indican una excesiva irritabilidad. Las clulas epiteliales o clulas escamosas pueden estar presentes en las heces, ms an si la muestra se obtiene por sigmoidoscopa. El tamao de estas clulas son semejantes al de las amebas, la coloracin es verde plido con apariencia uniforme no granular cuando se les colorea con Tricomico-Gomori. Normalmente de las ltimas porciones del intestino. g) PRASITOS: Es un anlisis de la materia fecal para verificar la presencia de un parsito o de una infeccin del intestino causada por organismos similares a gusanos. Los huevos se refieren a la primera etapa del ciclo de vida del parsito. Algunos parsitos son organismos unicelulares como la Amebiasis, la Giardia y las Tricomonas, etc., mientras que otros tienen apariencia de gusanos. h) FIBRAS Fibras musculares: Se pueden observar de diferentes formas dependiendo del grado de digestin: a) Mal digeridas: Fragmentos rectangulares estriados, amarillos. Las estras son transversales y longitudinales. Los bordes del rectngulo son rectos. b) Parcialmente digeridas: Trozos ms pequeos con los bordes redondeados y las estras longitudinales. c) Bien digeridas: Trozos muy pequeos con los bordes redondeados y sin estras. La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una insuficiencia gstrica o pancretica Fibras vegetales: Se caracterizan por ser de doble pared, contienen clorofila y poseen un canal central muy marcado (se observan como resortes o espirales).

Aumento : x

Aumento : x

Aumento : x 110

i) LPIDOS: Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este colorante se mezclar con una gota de la suspensin fecal. Los lpidos o grasas se encuentran en las heces en forma de: a) cidos grasos: Tienen aspecto cristalino, en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas. Difcilmente se tien. b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja Si la temperatura es fra (< 20 C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas. El aumento patolgico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (cidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-anaranjado (con Sudam III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados.

Aumento : x

Aumento : x

j)

ALMIDN: Los grnulos de almidn tomarn un u otro dependiendo del grado de digestin. Tambin podrn estar dentro de clulas o aislados: a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro. b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa. c) Digeridos: Amarillos o color arenilla. El tejido muscular, al aadir almidn a la preparacin toma un color rojo-caoba. La presencia de almidn no digerido en las heces se llama AMILORREA. 111

Aumento : x

Aumento : x

k ) TEJIDO CONJUNTIVO: Se observa como fibras o filamentos que se renen en fascculos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriacin. Se podra confundir con el moco, pero se distinguen porque se transparentan al aadirle cido actico al 30 %. RESULTADO DEL EXAMEN MICROSCOPICO La presencia de clulas epiteliales, eritrocitos y dems estructuras microscopicas se reporta en cruces de la siguiente manera: ABUNDANTES MODERADAS ESCASAS (+++) (++) (+)

Se pueden reportar por campo : leucocitos 10-15 por campo, hemates: 5-1 por campo

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CARACTERSTICAS EN LOS DISTINTOS SNDROMES DIGESTIVOS

1) Trnsito global ultrarrpido. Diarrea verde. Lienteria y microscpicamente grasas, fibras musculares y almidn sin digerir. Sublimado verde. 2) Insuficiencia gstrica. Heces pastosas o lquidas ("diarrea gastrgena") si est descompensada, de color pardo y alcalinas. Tejido conjuntivo, abundante, en fieltros y fibras arborescentes que constituyen el dato ms caracterstico. Fibras musculares en manojos y a veces trozos groseros de carne. Grumos de almidn y clulas de patata. 3) Insuficiencia biliar. Heces aclicas arcillosas, blancogrisceas en la obstruccin total, con sublimado blanco; hipocoloreadas si es parcial. Esteatorrea con abundantes cidos grasos y jabones, y escasa grasa neutra. 4) Insuficiencia pancretica. Deposicin voluminosa, maloliente y de color amarillento brillante, con reaccin alcalina habitualmente. Creatorrea, en forma de fibras musculares sueltas bien conservadas, con estriacin, angulosas y nucleadas; no se observa tejido conectivo, a no ser que coexista una insuficiencia gstrica. Esteatorrea en forma de gotas de grasa neutra. Amilorrea, menos aparente, representada por granos de almidn. 5) Trastornos de absorcin (sprue, celiaquia). Heces muy voluminosas, de aspecto cremoso y de color ocre o como mantequilla, con superficie brillante y con burbujas. Esteatorrea a base, sobre todo, de cidos grasos y jabones. No existe, por lo general, creatorrea y apenas almidn. 6) Dispepsia de fermentacin. Heces pastosas, en torta, amarillentas, espumosas y de olor rancio, con reaccin cida y abundante fermentacin en la prueba de Strasburger. Abundante almidn sin digerir, flora iodfila y clostridias. 7) Heces de putrefaccin (etiologa diversa). Color oscuro, aspecto lquido o pastoso, olor ftido y reaccin alcalina. 8) Enteropatas alrgicas. Abundante moco transparente. Cristales de Charcot-Leyden. Eosinfilos. 9) Enteropatas inflamatorias. Moco opaco en cantidad, con sangre o pus frecuentemente. Albmina disuelta. A menudo heces de putrefaccin. Clulas epiteliales abundantes, y grmenes.

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DIAGRAMA COPROLGICO FUNCIONAL

Llevar una muestra de excremento debe de ser una evacuacin completa y no haber ingerido carnes rojas y de vitamina C o cido acetil como mnimo tres das antes de tomar la muestra, cuidando que no haya contaminacin con las heces.

Realizar estudio macroscopico: cantidad, consistencia, forma, color restos alimenticios, fcula, tejido conjuntivo, moco. Diluir las heces en solucin salina en una caja Petri.

Realizar estudio microscpico: fibras musculares, vegetales, grasas, clulas epiteliales, leucocitos, azucares reductores, sangre oculta en heces, pH.

Reportar y registrar los resultados

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MODELO : REPORTE DE EXAMEN COPROLOGICO FUNCIONAL

EXAMEN MACROSCOPICO :

COLOR CONSISTENCIA OLOR MOCO

: : : :

MARRON PASTOSO FETIDO NEGATIVO

EXAMEN QUMICO :

PH THEVENON GRASAS ( SUDAN III )

: : :

7.0 POSITIVO 1+ No hay esteatorrea Negativo

SUSTANCIAS REDUCTORAS:
EXAMEN MICROSCOPICO :

GRANULOS DE ALMIDON FLORA YODOFILA

LEUCOCITOS
HEMATIES

: :
:
:

ESCASOS ESCASAS
10 12 POR CAMPO
10 12 POR CAMPO

SE OBSERVAN QUISTES DE Entamoeba histolytica

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EXAMEN COPROLOGICO FUNCIONAL

EXAMEN MACROSCOPICO :

COLOR CONSISTENCIA OLOR MOCO

: : : :

EXAMEN QUMICO :

PH THEVENON GRASAS ( SUDAN III )

: : :

SUSTANCIAS REDUCTORAS:
EXAMEN MICROSCOPICO :

GRANULOS DE ALMIDON FLORA YODOFILA LEUCOCITOS HEMATIES

: : : :

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ANEXOS
METODOS DE CONCENTRACION
La concentracin de huevos, larvas y quistes en heces ha llegado a ser un procedimiento de rutina como parte de un examen completo para la deteccin de los parsitos intestinales y se puede realizar como complemento del examen directo. Los procedimientos de concentracin permiten la deteccin de protozoos y/o helmintos emplendose dos mtodos: de sedimentacin y flotacin, o una combinacin de ambos, para separar los protozoos y los huevos de helmintos de las heces, utilizando las diferencias en el peso especfico. Se deben emplear cuando la cantidad de muestra fuera pequea, en un control de tratamiento o cuando se deba transportar poca cantidad de muestra a un lugar distante.

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SEDIMENTACION POR CENTRIFUGACION

MTODO DE RITCHIE: Formol ter
Examen coproparasitoscpico cualitativo de concentracin por sedimentacin con centrifugacin. Se utiliza para huevos, quistes y larvas. Elimina bastantes delitrus orgnicos como el ter. Debido a que se utilizan varios reactivos y tubos cnicos, resulta poco econmico. Las preparaciones quedan muy sucias porque con la sedimentacin, aparte de concentrase formas parasitarias, se concentran otros materiales Materiales Tubos de ensaye cnicos de 15 ml Embudo de cristal Vaso de precipitados 50 ml Gasa cortada en cuadro Bajalenguas Pipetas Pasteur con bulbo Portaobjetos Cubreobjetos Gradilla Centrifuga Microscopio . Reactivos Solucin salina isotnica Solucin de formaldehdo al 10% ter etlico Solucin de yodo-lugol Procedimiento 1. Tomar con el batelenguas aproximadamente 1 gr de materia fecal y colocar en el vaso de precipitados, aadir 10 ml de solucin salina y homogeneizar 2. Se filtra la suspensin a travs de la gasa doblada en cuatro partes y colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cnico. 3. Centrifugar el filtrado a 2000 rpm por 2 minutos 4. Decantar el lquido sobrenadante y resuspender con el aplicador de madera el sedimento con solucin salina. Centrifugar nuevamente, decantar y resuspender dos veces ms. 5. Al ltimo sedimento se agregan 5 ml de solucin de formaldehdo al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos en la gradilla 6. Se aaden 0.5 ml de ter, se tapan los tubos y se agitan enrgicamente durante 30 segundos. 7. Centrifugar durante 2 minutos a 2000 rpm 8. Despus de centrifugar se observan cuatro capas (se hablara de ellas mas adelante) 9. Decantar el sobrenadante 10. Introducir la pipeta Pasteur hasta el sedimento, extraer con cuidado una gota del sedimento y colocarla en el portaobjetos 11. Aadir una gota de lugol y con uno de los ngulos del cubreobjetos homogeneizar, y cubrir con el mismo 12. Observar la preparacin con al microscopio con objetivos 10x y 40x 118

De la soluc. filtrada anteriormente vaciamos a un tubo una pequea cantidad

Luego agregamos 2/3 partes de formol y 1/3 de ter (en este caso xilol)

Mezclar por inversin

Centrifugar a 3000 rpm x 1 min.

Eter

Tubo, despus de la centrifugacin

Restos Lp. disueltos

Se elimina el sobrenadante y se observa el sedimento al microscopio

Formol

Se observ huevos de Hymenolepis

Sedimento Parsitos

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MTODO DE TELEMANN
Se usa para concentracin de huevos, quistes y larvas, sobre todo para aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y cidos grasos libres. En 1908, Telemann describe su mtodo, el cual es modificado por Rivas en 1928, quien cambio el cido clorhdrico por cido actico. En esta seccin se describir el original. La utilidad es para concentracin de huevos, quistes y larvas, sobre todo aquellas muestras que tienen elevadas concentraciones de grasas neutras y cidos grasos libres . Reactivos

ter etlico cido clorhdrico concentrado Agua destilada Solucin de cido clorhdrico al 15%

Materiales Vaso de precipitado Tubos cnicos Pipeta pasteur Portaobjetos Cubreobjetos Microscopio compuesto Centrifuga Aplicadores Tapn de goma o caucho Gasa o algodn Gradilla Procedimiento

1. Se coloca un fragmento de heces del tamao de un frjol ( aprox. 1 g)

2. Se le agrega en el vaso de precipitados cido clorhdrico al 15%, y se homogeneiza con el aplicador cuidadosamente 3. Se pasa la suspensin por dos capas de gasa o algodn previamente humedecido. 4. Se aade ter en cantidades iguales y se coloca un tapn de caucho o se tapa con el pulgar. 5. Se agita vigorosamente y se afloja el tapn o el dedo para disminuir la presin y se destapa. 6. Se centrfuga a 1500 rpm durante 1.

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7. Se saca de la centrifuga y se observan cuatro capas: 1) ter; 2) Tapn de restos fecales; 3) Capa de cido; 4) Sedimento inferior que contiene la forma parasitaria. 8. Se mantiene en el tubo horizontal y con un aplicador de madera y con un movimiento circular, se despega el tapn de restos fecales. 9. Rpidamente, pero con cuidado se vierten el ter, tapn y capa de asido, de manera que quede el sedimento en el tubo. 10. Se mantiene el tubo en posicin horizontal, para evitar que los restos de extracto graso y de tapn fecal bajen por las paredes al sedimento. 11. Se introduce un aplicador con hisopo de algodn y se limpian las paredes del tubo. 12. Con el tubo vertical, se toma parte del sedimento con una pipeta. 13. Se coloca en un portaobjetos y se coloca encima el cubreobjetos. 14. Se examina con el microscopio con los objetivos 10X y 40X.

MTODO DE CHARLES - BARTHELEMY

Bueno no hay mucho que decir pero su utilidad es para hacer una buena concentracin de quistes, huevos y larvas. Pero como todo buen mtodo tiene una limitacin que es por resulta antieconmico por los reactivos que utilizan. Reactivos

Formaldehdos Q.P. Cloruro de sodio cido ctrico cristalizado Agua destilada ter etlico

Soluciones

Solucin salina formolada Solucin ctrica formulada Lugol

Materiales

Tubos de ensay Portaobjetos Cubreobjetos Pipeta Pasteur Microscopio compuesto Centrifuga Cpsula de porcelana Tela metlica de malla fina o gasa Tapones de caucho 121

Metodo 1. Suspender 1 a 2 g de materia fecal en 10 ml aprox. En la solucin salina formulada, utilizando la cpsula de porcelana para homogenizar. 2. Pasar la suspensin a travs de la malla o gasa. 3. Centrifugar a 1,8000 rpm durante 60 4. Decantar y agregar el sedimento de solucin ctrica formulada, hasta llenar unos dos tercios de tubos. 5. Agitar con fuerza y aadir el ter hasta del borde. 6. Tape el tubo con el tapn de caucho y agite violentamente hasta lograr la homogenizacin de las sustancias que contiene.

7. Destapar con cuidado el tubo, para evitar la proyeccin de la mezcla y centrifugar durante 30 a 1,800 rpm. 8. Con un aplicador, se rompe el tapn de las heces, gasas y otros restos, agitando ligeramente con el aplicador. 9. Se vuelve a centrifugar durante 30 10. 11. 12. 13. 14. Se rompe nuevamente el tapn superior de restos fecales, desprendindolo de las paredes del tubo con cuidado, ayudndose con el aplicador. S decanta de una sola vez, procurando que quede una pequea cantidad de 2 a 4 gotas liquidas junto con el sedimento. Agrega al sedimento una gota de lugol y agitar el tubo ligeramente para homogenizar. Con la pipeta, se toma una gota de la suspensin coloreada del fondo del tubo y se coloca en el porta y se cubre. Se observa en el microscopio con objetivos 10X y 40X.

TCNICA DE SEDIMENTACIN POR CENTRIFUGACIN

1.Emulsionar la muestra de heces en agua S.S.F. 2. Filtrar a travs de un colador. 3. Colocar el filtrado en un tubo de centrfuga y centrifugar a 2,000 rpm durante 2 minutos. 4. Eliminar el sobrenadante, agregar agua y volver a centrifugar. Esto puede repetirse hasta que el lquido sobrenadante sea transparente. Observar el sedimento al microscopio.

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CONCENTRACIN POR FORMALINA - ACETATO DE ETILO

Esta tcnica se basa en concentrar huevos y larvas de helmintos, ooquistes y quistes de protozoos de las heces. Se recurre a este mtodo cuando el examen directo es negativo, cuando la excrecin de quistes/ooquistes es baja e intermitente o para descartar infecciones leves en general, sobre todo si otros mtodos (sulfato de zinc por Ej.) no han ofrecido resultados esperados. El mtodo original utilizaba ter, pero esta sustancia se ha sustituido por acetato de etilo por ser menos inflamable y explosiva que el ter. Algunos sugieren centrifugar por 10 minutos en vez de dos minutos para recobrar ooquistes de apicomplexa, pero encontramos que se forma demasiado sedimento que impide realizar el examen parasitolgico. Puede utilizarse con heces frescas o heces fijadas previamente en formalina o en MIF; los quistes de protozoos no se deforman; puede demorarse en examinar el sedimento ms que en mtodos por flotacin; es adecuado tanto para huevos de nemtodos como de cstodos y tremtodos; produce menos errores tcnicos que otras concentraciones. Desventajas Los huevos infrtiles de Ascars y en ocasiones quistes de Giardia pueden flotar y descartarse inadvertidamente con el tapn de detritus; utiliza tubos de ensayo de vidrio (cuando se usa ter), ya que los tubos de plstico son daados por ste; no es adecuado para concentrar trofozotos de protozoos. Muestra a examinar Heces frescas recolectadas en frasco limpio y seco, de boca ancha, identificado correctamente. Reactivos Formalina al 10% Formaldehdo 10 mL Solucin salina 0.85% 90 mL (Puede usar agua destilada )

Materiales -Vasitos de plstico o cartn (30 ml de capacidad) -Tubos de centrfuga de ensayo 13 X 100 mm - Marcadores - Embudos de 5 cm de dimetro -Gasa quirrgica en rectngulos de 16 X 16 cm en 2 dobleces -Parafilm o tapones de hule -Solucin de formalina al 10% -Acetato de etilo -Aplicadores con algodn en un extremo 123

-Porta-objetos de 7.5 X 2.5 cm (3 X 1 pulgada) o de 7.5 X 5 cm (3 X 2 pulgadas) -Cubre-objetos -Gradilla para tubos -Pipeta graduada de 5 mL -Balanza de 2 platos para equilibrar tubos -Solucin de Lugol -Acetato de etilo -Frascos con desinfectante para descartar material Procedimiento 1. Identificar frascos, tubos y lminas con la muestra a examinar. 2. Transferir 1-2 g de heces a un vaso de plstico o cartn y agregar 10 mL de formalina. 3. Desmenuzar y suspender completamente las heces con ayuda de aplicadores. 4. Descartar aplicadores. Dejar fijar mnimo 30 minutos. 5. Filtrar por 2 dobleces de gasa a un tubo cnico o de ensayo ayudado por embudo. 6. Descartar gasa. Tapar tubos 7. Equilibrar los tubos en balanza de 2 platos junto con los tapones. 8. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos; destapar. 9. Descartar el sobrenadante. 10. Agregar ms formalina al sedimento, agitando ste con un aplicador, hasta la mitad del tubo. 11. Agregar 2-3 mL de acetato de etilo. 12. Tapar el tubo con parafilm o tapn de hule y agitar vigorosamente 15 segundos. 13. Centrifugara 1,500 rpm por 2 minutos. 14. Al final de la centrifugacin se obtienen 4 capas : sedimento, formalina, tapn de detritus y acetato de etilo. Destapar con cuidado y con un aplicador desprender el tapn de detritus todo alrededor y decantar el sobrenadante de un solo movimiento. 15. En el fondo quedar el sedimento a estudiar 16. Con un aplicadorcon algodn limpiar las paredes interiores del tubo 17. Transferir el sedimento a un porta-objetos , cubrir con un cubre-objetos y examinar toda preparacin con objetivo 10X. Pasar a mayores magnificaciones cuando sea necesario. 18. Para colorear quistes, agregar una gota de solucin de Lugol. 19. Descartar material utilizado en desinfectante 124

SEDIMENTACIN SIMPLE
Los parsitos se concentran por accin de la gravedad, suspendiendo las heces en agua corriente, agua destilada o solucin salina y dejando que sedimenten naturalmente o por centrifugacin. Estos mtodos son principalmente tiles para la concentracin de quistes, ooquistes y huevos. Ventajas: es fcil de realizar, no requiere observacin microscpica inmediata y se puede aplicar a la concentracin de la mayora de los parsitos intestinales. Desventajas: la observacin microscpica puede dificultarse por concentracin de elementos no parasitarios

MTODO DE SEDIMENTACIN SIMPLE EN COPAS

Este procedimiento de decantacin en copas es una tcnica conocida desde muchos aos en el cual se utiliza un procedimiento fsico para la separacin de mezclas. Este mtodo tambin es utilizado para el diagnostico de aquellas muestra de heces fecales sospechosas de contener huevos de Fasciola hepatica; el mtodo ha demostrado ser bondadoso para otro tipo de huevos de helmintos e incluso para quistes de protozoario. Las ventajas que tiene, sobre otro, es que hace una concentracin de volmenes considerablemente grandes de materia fecal. Reactivos

Verde de malaquita Agua de la llave Agua destilada Solucin de detergente al 5% ( Se pasan 5 g de detergente de cualquier marca y se
disuelve en 1000 ml de agua; el detergente que no se alcance a disolver, se sedimenta y decanta el sobrenadante o se deja en el frasco donde se guarda la solucin, pues no interfiere en el proceso)

Solucin de verde de malaquita al 1% ( Se disuelve el verde de malaquita en los 100

ml de agua y se guarda la solucin en frascos con tapn esmerilado). Materiales

Copas crnicas Pipeta pasteur Portaobjetos Cubreobjetos. Embudo Microscopio compuesto Aplicadores de madera Bulbos de caucho Gasa

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Procedimiento 1. En el recipiente donde se llevo la muestra al laboratorio se homogeneiza la muestra con agua de la llave y se hace pasar a travs de la gasa previamente colocada en un embudo y recibiendo la suspensin en la copa. 2. Se colocan 5 ml de colorante y se agita con un aplicador 3. Se agregan 5 ml de la solucin de detergente y se agita nuevamente 4. Se completa el volumen de la copa y se deja reposar durante 15 min. 5. Se decanta el sobrenadante y se agrega mas agua, mezclando con el aplicador y se deja reposar otros 15 min. Se decanta nuevamente el sobrenadante. 7. Con la pipeta con bulbo, se toma del sedimento la muestra que se coloca en el portaobjetos y se pone el cubreobjetos. 8. Se observa con el microscopio, usando objetivos de 10X y 40X, cuando sea necesario.

9. Se hacen tres preparaciones de cada sedimento para asegurar la positividad de la muestra. Cuando se tiene suficiente practica se puede utilizar la lupa del microscopio, sobre todo cuando se busca la F. hepatica. Es un mtodo lento y de poca concentracin para los protozoos intestinales. Los huevos de helmintos sedimentan en el fondo del recipiente en un estado viable y sin deformacin.

Dejar reposar por 10 min.

Emulsionar la muestra en 10 a 20 vol. de agua de cao Repetir los pasos anteriores (x 2 veces ms)

Filtrar el preparado y completar el vol. con agua

Observar

Eliminar sobrenadante

Huevo de Ascaris

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TCNICA DE SEDIMENTACIN ESPONTNEA EN TUBO

1. Homogenizar 2.5 g de heces con 10 - 20ml de solucin salina fisiolgica. 2.Verter la mezcla en un tubo cnico de centrifuga de 50 ml de capacidad filtrndola a travs de gasa. 3. Completar el volumen del tubo con ms solucin salina y tapar el mismo hermticamente. 4. Agitar y dejar reposar por 45 minutos, como mnimo. 5. Tomar con una pipeta dos alcuotas: una de la mitad del sedimento y otra del fondo del tubo, colocarlos en portaobjetos diferentes y a la alcuota del fondo agregarle gotas de lugol, luego cubrirla con laminilla. Observar al microscopio.

TCNICA DE BAERMAN MODIFICADA

1. Emulsionar la muestra de heces en agua corriente. 2. Homogenizar y filtrar la muestra a travs de un colador hacia una copa cnica. Agregar agua corriente hasta completar su capacidad. Dejar en reposo por 24 horas. 3. Eliminar el sobrenadarme. 4. Con una pipeta Pasteur, tomar una parte del sedimento y observar al microscopio

Dejar en reposo 24 horas

Homogenizar la muestra

En la coladera agregar la muestra y verter SSF a 37 hasta cubrirla

Observar

Huevo de Ascaris

Eliminar sobrenadante

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MTODO DE LUMBRERAS MODIFICADO

Se utiliza para la bsqueda de huevos de Fasciola heptica en heces o bilis. No se puede utilizar un mtodo de centrifugacin porque los huevos se rompen ni de flotacin porque son muy pesados. 1- Colocar 2 ml de la muestra (heces o bilis) en una copa de Lumbreras o tubo de centrfuga. 2- Agregar 5 ml de solucin detergente al 10% para emulsionar las grasas. 3- Agregar 0,5 ml de alumbre frrico al 1% para favorecer el gradiente de densidad. 4- Homogeneizar suavemente. 5- Dejar en reposo 30 minutos. 6- Sacar con pipeta pasteur una gota del fondo de la copa. 7- Observar con microscopio.

TCNICAS DE FLOTACIN
Los mtodos de flotacin fecal se utilizan para separar los parsitos en todos sus estadios (huevos, ooquistes, quistes, larvas) de otros objetos, basados en sus diferentes densidades, pues se emplea un medio lquido ms pesado que los parsitos permitiendo que los mismos suban a la superficie y puedan ser recuperados de la pelcula superficial. La densidad es el peso de un parsito u otro objeto por unidad de volumen, se expresa en forma de gravedad especfica. Para obtener un resultado preciso al realizar una flotacin fecal, es necesario utilizar la solucin correcta. La densidad (gravedad especfica) de las diferentes soluciones est determinada por la cantidad de sal o azcar que contienen. La densidad de la mayora de las soluciones est entre 1.18 y 1.20; y la densidad de la mayora de los parsitos comunes es menor a 1.18. Ventajas: el preparado es ms lmpido, facilitando la observacin microscpica. Desventajas: debe hacerse la observacin microscpica en menor tiempo debido a que la pelcula superficial puede destruirse y los parsitos caer al fondo del tubo, a su vez, los parsitos de mayor peso que la solucin empleada no flotarn. Existen varios mtodos de flotacin, el ms utilizado es el mtodo de Faust

MTODO DE FAUST (sulfato de zinc)

Examen cualitativo de concentracin que incluye centrifugacin y flotacin. Hace que se concentren los quistes, huevos y larvas. Es eficaz para separar e identificar huevos pesados como Ascaris lumbricoides, Taenia sp. y Fasciola heptica.cuando las infecciones son muy leves y no se detectan en preparaciones directas. Muestra requerida Heces frescas recolectadas en frasco {vidrio, plstico o cartn) de boca ancha, con tapadera, limpio, sin contaminantes (agua del inodoro, orina, tierra etc.) debidamente identificado.

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Reactivos Disolver 330 g de cristales de sulfato de zinc en 670 mL de agua destilada. Para verificar la densidad, verter dentro de un cilindro de 1,000 mL de capacidad e introducir el hidrmetro, dejndolo flotar libremente, sin tocar las paredes del cilindro. Debe leerse 1.18. Agregar ms agua si est ms denso, o ms cristales si est menos denso. Se recomienda verificar la densidad cada vez antes de usar o una vez por semana. Cuando la muestra de heces fue fijada, usar una solucin con densidad 1.20 Materiales Hidrmetro (Curtis Matheson Scientific Inc) para medir gravedad especifica, rango 1,000-2,000) Solucin de sulfato de zinc, densidad 1.18 (para heces frescas) Cuadrados de gasa de 16 X 16 cm, en 2 dobleces Embudos de 5 cm de dimetro Tubos de ensayo, vasos de papel o vasos plsticos pequeos para hacer una suspensin de heces Porta objetos, 7.5 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) 7.5 x 5 cm (3 X 2 pulgadas) Cubre-objetos 22 X 22 mm, No. 1 No. 2 Solucin de Lugol Asa bacteriolgica de 5-7 mm de dimetro Gradilla para tubos Solucin salina fisiolgica Procedimiento 1. Identificar la muestra con el vaso y el tubo de ensayo a trabajar. 2. Con un aplicador, tomar 1-1.5 g de heces y hacer una suspensin en unos pocos ml de agua destilada* en un vaso o tubo. 3. Filtrar a travs de gasa humedecida a un tubo de ensayo. 4. Centrifugar a 1,500-2,000 rpm por 2 minutos. Descartar el sobrenadante. 5. Agregar 2-3 mL de solucin de sulfato de zinc y agitar con un aplicador hasta suspender totalmente el sedimento. Agregar ms solucin de sulfato de zinc hasta 1 cm abajo del borde del tubo de ensayo, sin dejar de agitar. 6. Centrifugar a 2,000 por 2 minutos. Los tubos deben tener posicin vertical en la centrfuga, no inclinada. 7. Sin sacar el tubo de la centrifuga, remover varias asadas de la pelcula superficial y colocarlas sobre un porta-objetos. Esterilizar el asa por flameo. 8. Cubrir con un cubre-objetos. Examinar sistemticamente la preparacin. Para colorear los quistes, remover con cuidado el cubre-objetos y aadir una gota pequea de Lugol. 9. Para identificar los quistes se procede a examinarlos con el objetivo X100, para lo cual debe colocarse antes una pequea gota de aceite sobre el cubre-objetos. 10. Puede ejecutarse este mtodo cuando se reciben heces fijadas, para lo cual la solucin de sulfato de zinc debe tener una densidad de 1.20. Para trabajar la muestra, mezclar bien las heces fijadas, filtrar si necesario y continuar con el procedimiento como se ha descrito. 129

Causas de error o resultados poco satisfactorios En general, si no se sigue el mtodo fielmente Solucin de sulfato de zinc de otra gravedad especfica Esperar mucho tiempo despus de preparar la muestra, antes de observarla al microscopio (ms de 20 minutos) Deformacin de los quistes de protozoos, que dificulta su identificacin A veces no flotan los huevos infrtiles de Ascaris No es el mtodo adecuado para huevos de cstodos ni de trematodo. Nota: Las larvas se encogen y no se puede reconocer su morfologa especfica

Agua Eliminar sobrenadante Filtrado Centrifugar 2 a 5 min. Centrifugar x 2 a 5 min. y luego eliminar sobrenadante

Repetir procedimiento una vez ms

Pelcula superficial

Despus de eliminar sobrenadante, agregar el sulfato de Zinc Observar al microscopio

Sulfato de cinz

Sedimento

Huevo de Hymenolepis

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MTODO DE WILLIS
El mtodo de Willis es cualitativo de concentracin por flotacin simple. Se usa para la bsqueda e identificacin de formas parasitarias como huevos, quiste o larvas. La densidad elevada de la salmuera donde se introducen las muestras, hacen que las formas parasitarias se distorsionen, y se puedan observar fcilmente bajo el microscopio. Esta tcnica requiere solucin saturada de sal, la cual se obtiene mezclando 38g de sal de cocina en 100 ml de agua caliente o calentar la mezcla a fin de homogenizarla. 1. Desmenuzar con la ayuda de una baqueta 1 2 g de heces en un tubo de ensayo o en un frasco vaco (vial) que contenga aproximadamente 4 mL de solucin saturada de sal. 2. Adicionar la misma solucin hasta formar un menisco sobre el borde del tubo o frasco. 3. Cubrir el menisco del tubo o frasco con una laminilla evitando la formacin de burbujas. 4. Dejar en reposo durante 15 a 20 minutos para que los huevos y quistes de parsitos floten y se adhieran por viscosidad a la laminilla. 5. Depositar una gota de lugol en una lmina portaobjetos y sobre ella colocar la laminilla. 6. Observar al microscopio.

Dejar en reposo x 15 a 20 min.

Del filtrado se adiciona una pequea porcin + la sol. sat. de sal

Adicionar hasta forma un menisco, luego cubrirlo con una laminilla

Observar al microscopio

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METODO DE SHEATHER
Separar, concentrar y recobrar ooquistes de Isospora belli de las heces para facilitar el diagnstico de isosporiasis en el laboratorio. Ooquistes de Cryptosporidium spp. Y Cyclospora cayetanensis pueden tambin concentrarse; sin embargo, para asegurar el diagnstico de estas dos especies es preferible adems, procesar la muestra por otros mtodos (coloracin, concentracin por Webery medicin de ooquistes). Importancia del diagnstico El hallazgo de Isospora belli ha cobrado importancia desde 1983 en que se recobr de 3 homosexuales con diarrea crnica, prdida de peso y una inmunodeficiencia severa. Aunque se le ha informado en el pasado en brotes de gastroenteritis en personas inmunonormales, cada vez ms se le relaciona con estados inmuno-deficientes y SIDA. El hallazgo de Isospora belli requiere informe inmediato al mdico. El Servicio de Parasitologa del Hospital-Escuela, Tegucigalpa, Honduras, acostumbra agregar una nota diciendo: 'Investigar causa de posible inmunocompromiso". Muestra requerida Heces frescas recolectadas en frasco {vidrio, plstico, cartn) de boca ancha, con tapadera, limpio y debidamente identificado. Aspirado duodenal. Heces lquidas a) Tomar una muestra del fondo del frasco con una pipeta Pasteur; o b) Mezclar las heces con la pipeta Pasteur y aspirar una cantidad; o c) Mezclar las heces, verter 2-3 mL en un tubo de ensayo rotulado, centrifugar, descartar el sobrenadante al frasco con la muestra original de heces o en un recipiente con desinfectante y continuar trabajando con el sedimento. Heces con moco a) Tomar una porcin del moco y examinar al microscopio como frote directo; o, b) Utilizar un mucoltico (10 gotas de KOH al 10%) para disolver el moco y liberar ooquistes que estuvieran atrapados. Dejar actuar el mucoltico a temperatura ambiente durante 15 minutos, agitando con un aplicador. Una vez disuelto, agregar agua destilada, mezclar, centrifugar, decantar y continuar la tcnica utilizando el sedimento. Reactivos Solucin concentrada fenolada de azcar Azcar en cristales 500 g Agua destilada 320 mL Fenol en cristales. 6.5 g Disolver el azcar en el agua destilada, usando calor sin dejar llegar a ebullicin. Filtrar por gasa. Agregar el fenol y agitar hasta disolucin. Guardar en frasco tapado y rotulado. Para trabajar es ms fcil mantener la solucin de trabajo en un frasco con dispensador.

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Materiales Vasitos de plstico para preparar suspensin Tubos de ensayo de 13 X 100 mm Cubre-objetos 22 X 22 mm, No.1 No.2 Porta-objetos de 3 X 1 pulgadas (7.5 X 2.5 cm) o de 3 X 2 pulgadas (7.5 cm X 5 cm) Asa bacteriolgica, 5-7 mm de dimetro Marcador Aplicadores sin algodn Gasa quirrgica Solucin fenolada de azcar Mechero de gas o lmpara de alcohol Embudo de 5 cm de dimetro Agua destilada Frasco con desinfectante para descartar material Parafilm o tapn de hule para tubos de ensayo Procedimiento 1. Identificar los tubos de ensayo con la muestra a examinar. 2. Hacer una suspensin de una pequea porcin de las heces (1 mL 1 g) en un vasito plstico o tubo con la ayuda de un aplicador. 3. Colocar gasa en 2 dobleces dentro del embudo introduciendo ste en otro tubo de ensayo rotulado y filtrar la suspensin de heces para remover fibras y partculas grandes. Tapar con parafilm o tapn de hule. 4. Equilibrar el tubo en balanza de 2 platos. 5. Centrifugar a 1,500 rpm por 2 minutos. Destapar. Decantar el sobrenadante. 6. Aadir un poco de solucin fenolada azucarada al sedimento y agitar vigorosamente con un aplicador. Completar con ms solucin hasta 2 cm bajo el borde del tubo sin dejar de agitar. Tapar con parafilm o tapn de hule. 7. Equilibrar el tubo en balanza de 2 platos. 8. Centrifugara 1000 rpm durante 10 minutos. 9. Remover el tapn con sumo cuidado para no agitar. Tomar 2-3 asadas de la superficie del menisco y colocar sobre un porta-objetos. Flamear el asa en el mechero. 10. Cubrir la preparacin con un cubre-objetos y examinar en el microscopio ptico toda la preparacin. 11. Buscar los ooquistes con objetivo 10X a diferentes profundidades; a menudo flotan y se colocan justo debajo del cubre-objetos. 12. Para confirmar, utilizar mayor magnificacin. Puede usar esta preparacin para colorear; basta remover el cubre-objetos, dejar secar y colorear. 13. Descartar el material utilizado en frasco con desinfectante. Caractersticas de la flotacin Los ooquistes de apicomplexa pueden deformarse un poco; pueden tomar un color rosa plido en su interior. Habr que diferenciar de levaduras, Blastocystis hominis, otras estructuras. Existen otros mtodos de flotacin en los que se utiliza un detergente (Tween 80) y gradientes discontinuos de solucin de azcar de densidades 1:2 y 1:4 o Percoll 133

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MTODOS CUANTITATIVOS PARA RECUENTO DE HUEVOS Y LARVAS

Estos metodos tiene con propsito, evaluar la efectividad de tratamiento teraputico pues se asume que la produccin de huevos estar en relacin directa con el nmero de hembras fecundas que deponen huevos. Una variable importante es el propsito para determinar esta intensidad: puede ser clnica, para encuestas, evaluar teraputica, etc. Se fundamenta en la estimacin de la intensidad de una infeccin intestinal por Ascars lumbricoides, Trichuris trichiura y uncinarias u otros nematodos del humano en forma prctica, en una cantidad conocida de heces. La intensidad de las infecciones se determina contando el nmero de huevos por gramo de heces. Este dato permite clasificar la infeccin en leve, moderada o intensa, aspecto muy importante ya que aunque el paciente sea asintomtico, debemos tomar en cuenta que sigue siendo un importante foco de contaminacin para las dems personas en la comunidad. El conocer la intensidad de la infeccin tambin nos ayuda cuando se trabaja con limitaciones de fondos. En estos casos generalmente no podemos dar tratamiento a toda la comunidad. Utilizando este parmetro podemos tomar una decisin y dar tratamiento a los pacientes con mayor riesgo de ser focos de contaminacin para la comunidad

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MTODO DE DILUCIN DE STOLL

Este mtodo se basa en el estudio de una cantidad conocida de heces, que se diluye en un volumen determinado. La cantidad de heces es medida por desplazamiento; al final del proceso se cuentan los huevos en una alcuota de la dilucin. El diluyente, hidrxido de sodio, saponifica la grasa de las heces y ayuda a liberar los huevos de impurezas. La mayor desventaja es el equipo que requiere y el tiempo de preparacin. Imprctico en encuestas. No se ha estandarizado y ha cado en desuso. Reactivos Solucin de Hidrxido de sodio Hidrxido de sodio 4 g Agua destilada 1,000 mL Disolver inicialmente el hidrxido de sodio en un volumen pequeo del agua destilada. Completar despus a 1,000 mL. Guardar en frasco tapado y rotulado. Materiales Frasco de Stoll, marcado 2 veces: a 56 mL de volumen y a 60 mL de volumen; en su defecto, probeta graduada con tapn de hule, que tenga las dos marcas, a 56 mL y a 60 mL. Solucin de hidrxido de sodio Pipetas graduadas a 0.15 mL (dispensador automtico para serologa) Porta-objetos 7.5 X 2.5 cm 7.5 X 5 cm Cubre-objetos 22 X 40 mm Aplicadores de madera Frascos con desinfectante para descartar material Perlas de vidrio Contador manual Marcador Frascos con desinfectante para descartar material sucio. Procedimiento 1. Identificar el frasco de Stoll con la muestra a examinar 2. Aadir hidrxido de sodio hasta la marca 56 mL en el frasco para ello 3. Con cuidado agregar heces hasta subir el nivel del lquido a la marca 60 mL 4. Agregar las perlas de vidrio, tapar y agitar vigorosamente. Si las heces son muy duras, deber dejarse 24 horas agitando espordicamente 5. CUENTA DE HUEVOS DE NEMTODOS TRASMITIDOS POR EL SUELO 6. Con la pipeta Stoll remover 0.15 mL del centro de la suspensin inmediatamente despus de agitar y antes que los huevos comiencen a sedimentarse 7. Colocar sta suspensin sobre un porta-objetos y cubrir con un cubre-objetos 8. Contar todos los huevos presentes en toda la preparacin. Multiplicar el resultado por 100 y reportar No. de huevos/g o No. de huevos/ mi de heces, sin factor de correccin 9. Para reportar con factor de correccin, debe considerarse la consistencia de las heces y multiplicar por 2 para heces blandas; por 3 para heces diarreicas. Cuentas en heces lquidas no son confiables.

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MTODO DE KATO (VARIACIN KATZ)

El mtodo Kato Katz para el conteo de huevos de helmintos intestinales permite determinar los niveles y la intensidad de la infestacin parasitaria en los individuos muestreados. Consiste en el examen microscpico de una cantidad fija de material fecal lo que permite un diagnostico semi cuantitativo basado en el nmero de huevos en las heces, En una medida indirecta de la carga parasitaria, generalmente a mayores conteos de huevos mayores nmero de hembras adultas presentes. El mtodo, originalmente introducido por japoneses para hacer encuestas epidemiolgicas de schistosomiasis, ha sido mejorado y modificado varias veces. La variacin KATZ entrega una cantidad conocida de heces, que depende del tamao del templete utilizado, con la condicin quesean heces formadas. El tamao del templete varia; para asegurar resultados comparables, el templete debe estandarizarse en el pas a una sola medida. El que se describe aqu entrega 41.7 mg de heces. Huevos de Taenia sp o de Hymenolepis nana se informan sin contar. La Organizacin Mundial de la Salud considera este mtodo como el de eleccin y el ms adecuado en encuestas, monitoreo y evaluacin de programas de control de nemtodos transmitidos por el suelo y schistosomiasis. Ventajas Las heces no se diluyen, se utiliza materiales baratos y accesibles, puede transportarse una vez preparado en el campo, puede guardarse varios meses para verificar resultados, puede estandarizarse para encuestas en diferentes regiones geogrficas por diferentes investigadores. Desventajas Tiene varias limitantes: slo puede utilizar heces frescas; no es adecuada para heces diarreicas, lquidas o mucoides; no se aplica para la deteccin de protozoos ni larvas de nemtodos; huevos frgiles como los de uncinaria y a menudo de Hymenolepis nana se vuelven irreconocibles en pocas horas; no es indicado para heces que contengan mucha fibra o grasa. Reactivos Glicerina pura 100 mL Agua destilada 100 mL Verde de malaquita al 3% 1 mL (Solucin acuosa) Mezclar bien en frasco de boca ancha con tapadera e introducir los cuadrados de celofn para sumergir en esta solucin 24 horas o ms antes de usar. (El verde de malaquita no es indispensable en caso que no se cuente con l). Un armazon de 9 mm X 1 mm entrega 50 mg de heces. El factor de multiplicacin para determinar huevos por gramo ser de 20. Un arm azon de 6 mm de dimetro X 1.5 mm de grosor entrega 41.7 mg de heces. El factor de multiplicacin ser de 24. Materiales Cuadrados de celofn que miden 22 X 30 mm. Sumergir durante 24 horas o ms en la solucin de glicerina Esptulas plsticas de madera o palos de paletas o de helados 138

 Templete de plstico del tamao seleccionado, en este caso de 6 mm de dimetro x 1.5 mm de grosor Cuadrados de 4 cm X lado de tela metlica o nylon de trama 210 o de nitrel de 250/rni Papel absorbente Papel de peridico Pinzas Frasco con desinfectante para descartar material Porta-objetos 7.2 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) 7.5 x 5 cm (3 X 2 pulgadas) Marcador Baja-lenguas o palo de paleta o de helados, que es ms barato Contador manual Procedimiento 1. Extender el papel peridico o de estraza sobre la mesa de trabajo 2. Identificar el porta-objetos con la muestra a examinar. Colocar sobre ste el templete de plstico 3. Con el palo de paleta tomar una cantidad de heces y colocarla sobre una superficie plana (tapadera del frasco, papel peridico) 4. Colocar sobre estas heces un cuadrado de tela metlica, plstica o nylon que hace las veces de colador 5. Raspar la superficie de la tela con el esptula plstica tomando suficientes heces coladas para llenar el agujero del templete. Descartar el esptula si es de madera 6. Remover el templete, descartar ste y la tela en desinfectante y cubrir el redondel de heces con un cuadrado de celofn empapado en glicerina 7. Invertir el porta-objetos con esta preparacin sobre una hoja de papel absorbente y hacer presin con el pulgar hasta extender las heces por todo el cuadrado. 8. Darle vuelta y colocar sobre una superficie protegida de insectos (mosca, cucaracha) y agua. Esperar que aclare. Esto depender de la temperatura y humedad del ambiente, entre 30 min y 45 min. Si se desea interrumpir el aclaramiento, invertirla lmina sobre una superficie plana lo necesario hasta continuar el proceso. 9. Observar al microscopio ptico con objetivo de 10 X. Contar sistemticamente y en forma individual todos los huevos de Ascaris, Trichuris, uncinaria en toda la preparacin 10. Multiplicar el resultado por 24 e informar Numero de huevos/gramo de heces. Descartar material usado en desinfectante 11. Los huevos de Taenia se confirmarn si se observan los ganchos de la oncsfera con objetivo X40 .

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METODO DIRECTO en Frote de heces

Este mtodo es una simplificacin del mtodo estndar de Beaver en 2 mg de heces en el que se utiliza una clula foto-elctrica adaptada y calibrada que mide con precisin 2 mg de heces en una preparacin en solucin salina. La simplificacin deriva del conocimiento que las preparaciones directas que se utilizan en la rutina para el examen de heces contienen entre 1.5 mg y 2.5 mg.

Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plstico o cartn) limpio, de boca ancha, sin contaminacin de agua, orina, tierra etc. Preparacin de reactivos Solucin salina fisiolgica Cloruro de sodio 0.85 g. Agua destilada 100 mL Mezclar hasta disolucin completa de los cristales. Guardar en frasco rotulado. Para uso diario mantener en frasco gotero rotulado. Materiales Porta-objetos de 3 X 1 pulgada (7,5 x 2.5 cm) 3 X 2 pulgadas {7.5 x 5cm) Cubre-objetos de 22 X 22 mm, #1 #2 Aplicadores de madera Solucin salina fisiolgica (0.85%) Marcador Contador manual Frasco con solucin desinfectante para descartar material Procedimiento 1. Identificar el porta-objetos con la muestra de heces a examinar 2. Colocar 1 - 2 gotas de solucin salina en cada extremo del porta-objetos 3. Con un aplicador, tomar una porcin de heces y emulsificar en cada una de las gotas de solucin salina 4. Cubrir cada preparacin con un cubre-objetos 5. Contar en forma individual los huevos segn la especie: de Ascaris, Trichuris y/o uncinaria presentes en cada preparacin. Sacar la media 6. Informar por especie de parsito: No. de huevos/frote de heces o bien No. de huevos/2 mg de heces 7. Descartar material usado en el frasco con desinfectante. Causas de error 1. Preparacin muy gruesa o muy fina 2. Observacin no sistemtica de la preparacin 3. Huevos no distribuidos al azar en la preparacin, o aglomerados por la presencia de mucho moco 4. Heces lquidas 142

TCNICA DE FERREIRA
El mtodo fue descrito por Biagi y Cols. En 1959 y fue puesto en practica por Ferreira y Abreu. Mtodo cuantitativo es til para el recuento de huevos y larvas de todos los parsitos considerados metazoarios y adems hace una buena concentracin de los protozoarios: quistes y ooquistes. Debido a la utilizacin del tamiz y a los lavados aplicados, se logra una materia fecal fina que facilita su estudio microscpico Esta tcnica se basa en la utilizacin del formol como preservador y desinfectante y de la diferencia de densidades con el empleo del sulfato de zinc con una densidad de 1.192, que har que los parsitos existentes en las muestra floten. Tiene como limitante que el material a utilizar no se consigue fcilmente. Reactivos *Sulfato de Zinc *Formaldehdo *Sol. Salina *Lugol

35% 10% 0.9%

500 ml 300 ml 500 ml 50 ml

Materiales *Microscopios *Centrifuga *Balanza granataria *Campana de Ferreira *Frasco de Gerber *Aplicadores *Tubos de ensaye de 100 x 25 mm *Portaobjetos *Embudo *Tubos de ltex de 15 cm de largo Tcnica o procedimiento 1. Pesar un frasco de ancha junto con un abate lenguas 2. Depositar materia fecal en el frasco ayudndose con el abate lenguas 3. Medir 36 ml de la solucin de formaldehdo, vaciar en el frasco 4. Homogeneizar la materia fecal con la solucin de formol hasta una suspensin. 5. Pasar la mezcla por malla previamente colocada en un embudo y recibir la suspensin en un tubo colocado en una gradilla. 6. Centrifugar a 2000 rpm. Durante 1 minuto. 7. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento con sol. Salina. 8. Volver a centrifugar bajo las condiciones anteriores. 9. Decantar nuevamente el sobrenadante y agregar 2 a 3 ml de sulfato de zinc, mezclar hasta hacer una nueva suspensin. 10. Introducir la campana de Ferreira en el tubo de ensaye. 143

11. Llenar el tubo con ms solucin para que el menisco suba. 12. Centrifugar a 2000 rpm. Durante 1 min. 13. Sacar el tubo de la centrfuga y con el pulgar y el ndice se comprime fuertemente el trocito de manguera de caucho del extremo anterior de la campana y de un golpe se saca este del tubo. 14. Lavar el exterior de la campana. 15. Invertir la campana sobre el portaobjetos y poner 2 a 3 gotas de lugol, de tal manera que arrastren el contenido de la parte estrecha de la campana, que es donde se encuentran las formas parasitarias. 16. Homogeneizar la suspensin con el ngulo de un cubreobjetos colocar este sobre el portaobjetos 17. Examinar la preparacin con el microscopio seco dbil y seco fuerte. Contar todos los huevos de la totalidad de la preparacin

Tcnica de Mac. Master Modificado: Homogenizar 3g de heces en 42 ml de agua. Tamizar y colocar 15 ml del filtrado en un tubo de prueba. Dejar sedimentar por 30 minutos o centrifugar a 1,000 r.p.m. durante 1 minuto. Eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con la solucin saturada de cloruro de sodio. Homogenizar y con el gotero tomar una muestra y llenar la cmara de Mac. Master. Esperar 2 minutos. Observar y contar los huevos ubicados dentro del recuadro de lectura

Recuento En Cmara De Malassez: Esta cmara de recuento se utiliza entre otras para recuento de clulas en lquido lumbar o para recuento de nemtodes. 144

TECNICAS ESPECIALES

MTODO DE HARADA-MORI
Para estudiar la distribucin regional o geogrfica de las uncinarias de humanos Necator americanus y Ancylostoma duodenale; para la diferenciacin entre larvas de uncinaria ybde los huevos parecidos a los de uncinaria (Trichostrongylus, Temidens, Strongyloidesbfulleborni); en la diferenciacin entre larvas de uncinaria y otras larvas, para determinar la viabilidad de los huevos y/o larvas en estudios sobre efectividad antihelmntica, para cultivar estadios de vida libre de Strongyloides, para embrionar huevos de tremtodos (Paragonimus y Fasciola) y de cstodos (Diphyllobothrium y Spirometra), para estadios similares en parasitologa veterinaria. Estas preparaciones pueden transportarse del campo al laboratorio, cuidando de no agitarlos, derramarlos ni permitir que se sequen. Muestra requerida Heces frescas, sin refrigerar, recolectadas en frasco (vidrio, plstico o cartn) limpio, de boca ancha, con tapadera, debidamente identificado, sin contaminacin. Variaciones Existen 2 variaciones: una en tubo de ensayo y otra en preparacin inclinada en caja de Petri. Se describir la original en tubo de ensayo y se mencionar lo ms importante en la que utiliza caja de Petri. Nota: Las larvas recobradas pueden ser infectantes. Aplicar medidas de seguridad: usar guantes, limpiar inmediatamente cualquier cultivo derramado con una solucin de clorox, Lugol o fenol, descartar material en frascos con desinfectante. Materiales Tubos de ensayo de preferencia cnica, de 15 mL de capacidad, en su defecto, tubos de ensayo de 25 X 175 mm Tiras de papel filtro (Whatman #2 u otro similar) cortadas 2 mm menos anchas que el dimetro del tubo y 2 cm ms largas, con un extremo ms afinado. Agua destilada, en una pizeta 145

Baja-lenguas, palos de paleta o aplicadores de madera Gradilla o soporte para tubos Guantes Lente de aumento o lupa de mano (opcional) Pipetas Pasteur Bulbo de goma o perilla para pipetas Lpiz de grafito Cajas de Petri de 5 cm de dimetro Porta-objetos de 7.5 x 2.5 cm (3 X 1 pulgada) Cubre-objetos 22 X 22 No.1 No.2 Frasco con desinfectante para descartar material

Procedimiento en tubo de ensayo 1. Con un lpiz de grafito, escribir la identificacin de la muestra en el extremo ms delgado de la tira de papel filtro. 2. Con un aplicador o palo de paleta tomar y extender unos 0.5-1.0 g de heces sobre el tercio medio de la tira; descartar aplicador. 3. Insertar esta tira con la parte escrita dentro del tubo de ensayo. Quedar una porcin extendida fuera del tubo por la que pasarn elementos solubles de las heces. 4. Con todo cuidado agregar agua destilada hasta que el nivel llegue por debajo del extendido de heces. Tener cuidado de no mojar las heces. 5. (Aunque no es necesario tapar los tubos, en lugares muy calientes se prefiere hacerlo para evitar la evaporacin rpida del agua). 6. Colocar los tubos as preparados en una gradilla y mantener en lugar seguro a temperatura ambiente. 7. Revisar diariamente el nivel de agua. Reemplazar aqulla perdida por evaporacin, con mucho cuidado. Para verificar si hay larvas mviles en el sedimento: 8. Colocarse los guantes. 9. Obtener una porcin del sedimento con una pipeta Pasteur, colocarlo en la caja de 10. Petri y observar al microscopio estereoscpico. 11. Para estudiar la morfologa diferencial, deber aspirar larvas con la pipeta y colocar las larvas entre porta y pubre, calentar suavemente o agregar solucin de Lugol para inmovilizarlas; observar al microscopio ptico. Identificar por morfologa. 12. Descartar material en frasco con desinfectante. Descartar guantes.

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Procedimiento en caja de petri El propsito es el mismo que el mtodo en tubo de ensayo, excepto que aqu puede utilizar mayor cantidad de heces y puede observar el sedimento directamente al microscopio, para determinar la presencia de larvas. La identificacin especfica requiere observar en detalle la morfologa de las larvas. Puede utilizar una caja de Petri de 9 cm, o una de 14 cm de dimetro, segn cuanto material desee obtener y una tira de papel filtro del tamao de un porta objetos de 3 X 2 pulgadas u otro soporte conveniente para heces. La identificacin especfica requiere observar en detalle la morfologa de las larvas. Procedimiento 1. Extender las heces sobre la tira de papel, la que se coloca sobre el porta-objetos u soporte. 2. Colocar esta preparacin en la caja de Petri soportada en un extremo poraplicadores por una varilla de vidrio para lograr una inclinacin. 3. Agregar agua destilada a la caja de Petri asegurando que el agua ascienda por capilaridad en la tira de papel con heces. 4. Tapar y dejar a temperatura ambiente por 2-3 das. Asegurar que la preparacin no se seque. 5. Al cabo de 2-3 das, colocarse los guantes. 6. Colocar la preparacin en el microscopio estereoscpico y buscar larvas en el agua. 7. Si no se observan, Con una pipeta Pasteur obtener una porcin del agua de la caja y examinar entre porta y cubre en un microscopio ptico buscando larvas. O bien, verter el lquido en un tubo de ensayo, centrifugar y recobrar las larvas del sedimento. Identificarlas segn caractersticas morfolgicas especficas. 8. Todo material se descarta en la solucin desinfectante. 9. Consultar con los diagramas provistos para identificar larvas.

MTODO DE BAERMANN
Recobrar larvas de nemtodos y en algunos casos gusanos adultos, de las heces, suelo, tejidos, etc. Es el mtodo de eleccin ms eficiente para recobrar larvas de infecciones por Strongyloides stercoralis. Existen 2 variaciones: una que utiliza un embudo de vidrio y otra que utiliza un vaso de sedimentacin. El principio del mtodo es exactamente igual en ambos: recobrar larvas sedimentadas en el fondo del embudo o del vaso. Se considerar aqu el mtodo en vaso de sedimentacin. Detectar una estrongiloidiasis latente en aquellos pacientes en riesgo a quines se les provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohlicas, quemadas severas, que recibirn radiaciones. Para verificacin teraputica. Se aumenta la probabilidad de diagnstico con exmenes repetidos durante varios das o semanas. Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plstico, cartn), limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se deben refrigerar, ya que esto inmoviliza las larvas y les impide migrar al agua.

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Materiales Vaso de sedimentacin de 250 mL de capacidad Crculo o cuadrado de papel filtro Crculo o cuadrado de gasa quirrgica en 4 dobleces Baja-lenguas o palos de paleta Pipetas Pasteur, tallo de 9 cm de largo Bulbo de hule para las pipetas Agua corriente a 37 C Cajas de Petri de 5 cm de dimetro Porta-objetos de 7.5 X 5 cm (3 X 2 pulgadas) Cubre-objetos de 22 X 22 mm No. 1 o No. 2 Frasco con desinfectante para descartar material Procedimiento 1. Identificar el vaso con la muestra a examinar. 2. Verter el agua a 37C dentro del vaso de sedimentacin ms o menos hasta 3 cm antes del borde. 3. Tomar un redondel de papel filtro y con un baja-lenguas o palo de paleta, extender unos 5 g de heces frescas en capa delgada sobre ste, descartar baja-lenguas. 4. Cubrir esta preparacin con la gasa. 5. Colocar esta preparacin con la gasa hacia abajo, dentro del vaso, procurando que las heces queden sumergidas en el agua 6. Esperar una hora. Las larvas migrarn de las heces al agua y caern al fondo del vaso. 7. Despus de la hora, preparar la caja de Petri identificndola. Colocar el bulbo de hule en la pipeta Pasteur. Con un aplicador de madera apartar suavemente la gasa, apretar el bulbo entre ndice y pulgar e introducir la pipeta hasta el fondo del vaso. 8. Absorber sedimento del fondo sin removerlo. 9. Colocar este sedimento en la caja de Petri. Esta operacin puede repetirse 2-4 veces. 10. Examinar bajo microscopio estereoscpico, buscando larvas en el fondo de la caja. 11. Para identificarlas especficamente, aspirar algunas con la pipeta Pasteur, colocarlas sobre un porta-objetos, cubrir con un cubre-objetos y buscarlas con objetivo 10X primero. Si estn muy mviles, calentar suavemente la preparacin o agregar por capilaridad una gota de solucin de Lugol. Para determinar los detalles morfolgicos, utilizar objetivo de 40X. 12. Reconocer las caractersticas: Cpsula bucal corta, primordio genital grande. 13. Descartar material en frasco con desinfectante. 148

MIGRACIN DE LARVAS EN AGAR

Aumentar la sensibilidad de deteccin por mtodos no agresivos una infeccin por Strongyloides stercoralis. Incidentalmente podran recobrarse larvas de Necator americanus y Ancylostoma duodenale si la infeccin est presente. Detectar una estrongloidiasis latente en aquellos pacientes a riesgo a quienes se provoca o desarrollan una inmunodeficiencia; en personas desnutridas, alcohlicas, quemadas severas, cirrticos, que reciben radiacin, estudios epidemiolgicos. Ventajas Sensibilidad de diagnstico aumentada, adecuado en casos problema o para diagnosticar la infeccin en nios en quienes no puedan realizarse exmenes ms agresivos (aspirado duodenal, bopsia). Desventajas Necesidad de ms equipo de laboratorio, ms tiempo para preparar el mtodo, mayor tiempo de espera antes de ofrecer un resultado, menor cantidad de heces de donde se podran extraer las larvas, necesidad de personal de laboratorio muy calificado, trabajo laborioso, impropio en lugares con una rutina voluminosa y pocos empleados poco calificados, material potencialmente infectante. Muestra requerida Heces frescas, recolectadas en frasco (vidrio, plstico, cartn) limpio, de boca ancha, con tapadera, correctamente identificado. No se debe refrigerar la muestra, ya que esto inmoviliza las larvas. Materiales Cajas de Petri de vidrio o plstico, tamao estndar (10 cm de dimetro) Cajas de Petri de 5 cm de dimetro Agar simple Extracto de res Peptona Cloruro de sodio Erler-Meyer de capacidad segn la cantidad de medio a preparar Mechero de gas Bolsas plsticas Baja-lenguas de madera o palos chatos de paleta o aplicadores de madera Formalina al 10% en una pizeta Porta objetos de 7.5 X 5.0 cm (3 X 2 pulgadas) Cubre-objetos de 22 X 22 mm Pipetas Pasteur tallo corto Bulbo de goma o perilla Incubadora (opcional) a 37C Microscopio estereoscpico Microscopio ptico Guantes desechables Tubos de centrfuga de 13 X 100 mm Centrfuga Cuaderno para anotar y lpiz Frascos con desinfectante para descartar material 149

Preparacin del medio (suficiente para 10 placas): Agar 1.5 g Peptona 1.0 g Extracto de res 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g Agregar 100 mL de agua destilada. Llevar a bao Mara hasta completa disolucin de las sustancias. Esterilizaren autoclave a 121C, 21 libras de presin, durante 15 minutos. Verter en capa fina (10 mL/caja de Petri), dejar endurecer toda la noche y guardar en bolsa plstica sellada a 4o C. Antes de usar cada placa, dejar un rato a temperatura ambiente. Preparacin del campo de trabajo Tener a mano y listo: Microscopio estereoscpico Pipetas Pasteur y bulbo o perilla Cajas de Petri de 5 cm de dimetro Formalina al 10% en una pizeta Tubos de ensayo de 13 X 100 mm, previamente rotulados Solucin desinfectante: clorox, solucin yodada, etc Cuaderno para anotar y lpiz Nota: Material potencialmente infectante. Utilizar guantes durante todo momento de la observacin de las muestras. La literatura japonesa ofrece otras ideas, pero en nuestra experiencia el uso de guantes y el tener solucin desinfectante a mano es adecuado. Limpiar con desinfectante inmediatamente cualquier lquido derramado. 5e necesita determinar circunstancias de bioseguridad en la adecuacin del mtodo para estudios epidemiolgicos. Procedimiento 1. Identificar la placa de agar con la muestra de heces a examinar. 2. Con la ayuda de baja-lenguas, palo de paleta o aplicadores de madera, colocar 1 g 3. de heces en el centro de la placa. Si las heces estn duras o formadas, ablandar con unas gotas de agua destilada estril. Tratar de que las heces queden extendidas lo ms posible y en contacto con el medio de agar. 4. Tapar la placa. 5. Incubar a 37C. Pueden asimismo dejarse en un lugar protegido a temperatura ambiente, pero el tiempo de observacin se prolonga. 6. Incubar 24 horas. 7. Antes de sacar las placas de la incubadora, ponerse los guantes. Sacar las placas y llevar a la mesa de trabajo. 8. Colocar una placa en el microscopio estereoscpico y sin destapar buscar caminos de larvas y/o larvas en la superficie del medio. Si se forma agua de condensacin en la tapadera, limpiar sta con papel absorbente y descartar en desinfectante. 9. Volver a tapar y continuar. 10. Si no se observan caminos ni larvas, dejar en incubacin otras 24 h. Al cabo de ese tiempo, volver a examinar en microscopio estereoscpico. 11. Anotar resultados. Verter formalina al 10% sobre la superficie del agar, sin verterla sobre las heces. 12. Inclinar la placa y con una pipeta Pasteur aspirar la formalina y colocar en un tubo de ensayo previamente identificado. 13. Centrifugar a 1,500 rpm durante 2 minutos. 14. Decantar o extraer cuidadosamente el sobrenadante. 150

15. Recobrar el sedimento con otra pipeta y colocaren un porta-objetos, cubrir y observar al microscopio ptico. 16. Identificar larvas presentes por morfologa especfica bajo objetivo 40 X: cpsula bucal corta y primordio genital grande para larvas rabdiformes; esfago largo y punta de la cola en forma de M para larvas filariformes de S. stercoralis. 17. En ocasiones se han observado larvas dentro del medio. Enfocar bien al buscar para no perderlas en caso que no se encuentren en la superficie. 18. No basta con observar la presencia de surcos. Es necesario recobrar las larvas y diferenciarlas.

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PROCEDIMIENTO PARA FIJAR HELMINTOS

Procedimiento para fijar tremtodos Para no daar la morfologa de los metazoarios, stos se manipularn extremando cuidados, y antes de fijarlos hay que someterlos a una fase de relajacin: a) Para relajarlos los trematodos se colocan en agua destilada durante 5 a 10 minutos (no dejar ms de 20 minutos debido a que las estructuras internas se destruyen por la lisis osmtica). La incubacin de los tremtodos adultos en agua tambin favorecen la salida de huevo, lo cual es benfico debido a que se observarn mejor las estructuras internas. b) El espcimen se coloca entre dos portaobjetos en posicin dorsoventral y se presionan con cuidado sin macerarlo. c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el otro extremo se aade el fijador (AFA :Alcohol, formaldehdo, cido actico) y se deja reposar 10 minutos. d) Los trematodos se separan de los portaobjetos y se colocan en el fijador (AFA) durante 48 horas e) Se transfieren a un recipiente con etanol al 70%; en estas condiciones, los trematodos se pueden almacenar en forma permanente o quedan listos para la tincin. Procedimiento para fijar cestodos Los cestodos, igual que los tremtodos, primero se relajan. a) Se colocan en agua destilada o solucin isotnica a 37C durante 5 a 30 minutos (ms tiempo ocasionar lisis osmtica de varios rganos internos). Otra opcin es utilizar etanol al 5.0% a temperatura ambiente. b) Si el parsito es de un tamao medio, se coloca entre dos portaobjetos en posicin dorsoventral y se presionan con cuidado sin macerarlo. c) Por un extremo de los portaobjetos se seca el exceso de agua con una gasa; por el otro extremo se aade el fijador (AFA) y se deja reposar 30 minutos. d) El ejemplar se retira y se coloca en un recipiente con el fijador (AFA) durante 24 horas. e) Los cestodos se transfieren a un recipiente con etanol al 70%. Procedimientos para fijar nemtodos. Para hacer una buena observacin de las estructuras internas de los nematodos, stos necesitan tinciones. Basta con un procedimiento adecuado para aclararlos y fijarlos. a) Debido a que el fijador puede contraer la estructura de los nematodos vivos, stos se colocan durante 30 segundos en cido actico glacial fro y despus en etanol al 70%. b) Los nematos pueden almacenarse de manera permanente en etanol alo 70% con 5% de glicerol (que suaviza y aclara). Si se desean preparaciones fijas, entonces se usa el glicerogel. 152

METODOS DE COLORACIN PARA HELMINTOS

Coloracin Carmn clorhdrico Coloracin de estructuras internas de especmenes adultos o segmentos de ste. Se usa de preferencia para el estudio de cstodes y tremtodes, ya que los nemtodes suelen deformarse con el montaje. La muestra debe ser lo ms fresca posible. Materiales - Lminas portaobjetos. - Laminillas cubreobjetos. - Pinza de punta fina. - Cytoseal o blsamo de Canad. - Alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto. - Creosota de la Haya o xilol. - Colorante Carmn (Anexo C). - Acido clorhdrico. - Agua destilada. - Pabilo. - Placas petri conteniendo colorante, decolorante, alcoholes de 70%, 85%, 95% y absoluto. Procedimiento. 1. Los progltidos de cstodes y los adultos de tremtodes son lavados y aplanados, colocndolos entre dos lminas, sujetndolos con pabilo o usando pesas sumergindolos en formol al 10%. 2. En caso de estar fijados en formol 10%, se lavan con agua corriente durante 10 a 30 minutos y luego se realiza el aplanamiento del vermex o gusano. 3. Colocar el gusano en alcohol 70% durante 10 a 20 minutos. 4. Pasar por el colorante Carmn durante 5 a 10 minutos. 5. Pasar por alcohol cido controlando la coloracin al estereoscopio. 6. Deshidratar el espcimen pasando por alcohol 85%, 95% y absoluto, durante 10 minutos en cada uno. 7. Pasar por la creosota o xilol, controlando al estereoscopio o microscopio la coloracin apropiada. 8. Secar el exceso de creosota con papel filtro y realizar el montaje con blsamo de Canad. Observacin. La observacin y estudio de la morfologa del ejemplar se realiza macroscpicamente e incluso slo usando el estereomicroscopio

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Coloracin de Bonilla, Naar y Beloy Utilidad. Las larvas de los nemtodes absorben el colorante, permitiendo diferenciar sus estructuras internas. Materiales - Lminas portaobjetos. - Laminillas cubreobjetos. - Alcohol 25%, 30%, 70%, 85% y 95%. - Solucin rojo de Congo (Anexo C). - Solucin de salicilato de metilo (Anexo C). - Lminas excavadas. - Blsamo de Canad o cytoseal. - Pipeta Pasteur. - Placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los alcoholes. Procedimiento 1. Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm conteniendo los reactivos correspondientes y colocar las larvas en alcohol 25% - 30% con unas gotas de solucin de rojo de Congo por 20 a 30 minutos. 2. Controlar por la observacin microscpica el color de las larvas. 3. Deshidratar la muestra, pasndola por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 20 a 30 minutos en cada uno. 4. Colocar en solucin de salicilato de metilo durante 3 minutos. 5. Colocar los especmenes en cytoseal, blsamo de Canad o Permount y observar al microscopio. Lectura Los especmenes y sus estructuras internas se tien de color rojo. Coloracin hematoxilina frrica de Delafield Utilidad Se usa en casos de cstodes y tremtodes. Permiten colorear estructuras internas de especmenes adultas o fragmentadas del mismo. Materiales - Lminas portaobjetos. - Laminillas cubreobjetos. - Alcohol de 25%, 30%, 70%, 85% y 95%. - Hematoxilina frrica. - Blsamo de Canad o cytoseal. - Pipeta Pasteur. - Placas Petri 150 x 100 mm conteniendo los alcoholes. 154

Procedimiento 1. Preparar un set de placas Petri 60 x 90 mm o 100 x 150 mm conteniendo los reactivos correspondientes, dependiendo de los especmenes a colorear. 2. Los tremtodes y cstodes fijados con formol 10% se lavan en agua corriente. 3. Diluir el colorante stock de 8 a 10 gotas en agua destilada y colocar los especmenes (35 mL por placa) por 12 horas. 4. Lavar con agua corriente y pasar por agua (segundos), dependiendo del espcimen. 5. Pasar por alcohol 50%, 30% y 10% por 10 minutos en cada uno y pasar por agua corriente el tiempo necesario para sacar el exceso de colorante. 6. Deshidratar en alcohol 10%, 30%, 50%, 70%, 85%, 95% y 100% cada uno, por 10 minutos. 7. Pasar dos veces por xilol, montar con blsamo de Canad y observar al microscopio. Lectura La observacin de los especmenes se realiza en forma microscpica o con el uso del microscopio estereoscopio.

MTODO DE LA TINTA CHINA

Identificar especficamente progltidos de Taenia expulsados por individuos infectados. No se puede enfatizar suficiente la importancia de identificar infecciones por T. solium, por el peligro que representa para el individuo, su familia y la comunidad la diseminacin de los huevos de este parsito y el riesgo de adquirir una csticercosis, tanto humana como animal. Aunque cualquier expulsin de progltidos debe considerarse como si fueran de T. solium mientras no se identifique la especie, es necesario identificar, registrar y tratar los casos verdaderos. Muestra requerida Progltidos grvidos sin fijar, colocados en un frasco tapado e identificado con el nombre, edad, sexo y procedencia del individuo. Pueden mantenerse en refrigeracin por un fin de semana, pero deben llevarse al laboratorio lo ms pronto posible. Ventajas Se ofrece un diagnstico rpido; pueden guardarse sellados e identificados para demostracin y referencia. Desventajas Material infectante al humano cuando es T. solium; requiere manipulacin cuidadosa, puede contaminar fcilmente el rea del laboratorio. Puede no inyectarse bien el progltido, o ste puede estar semimacerado y no revelar claramente el nmero de ramas uterinas necesarias para diagnstico. Alternativa: Los progltidos lavados y limpios sin fijar, se pueden aclarar en alcohol al 70% y glicerina o bien con Lactofenol. El resultado demora mientras los progltidos se aclaran. Para la diferenciacin entre especies, puede decirse que si las ramas uterinas son muchas es Taenia saginata y si son pocas es T. solium. 155

Materiales Jeringa y aguja de tuberculina Tinta china Papel absorbente Agua destilada Aplicadores Caja de petri Porta-objetos de 7.5 x 5 cm {3 x 2 pulgadas) Cinta adhesiva opaca Frasco con desinfectante o agua hirviendo Procedimiento 1. Si el o los progltidos estn sucios con heces, colocarlos con ayuda de aplicadores en una caja de Petri y lavar por agitacin suave con agua destilada. 2. Colocar un progltido sobre 3-4 dobleces de papel absorbente y secarlo por ambos lados. 3. Aspirar algunas gotas de tinta china en la jeringa de tuberculina. 4. Inyectar el progltido afianzado sobre el pape! absorbente, introduciendo la aguja en la rama uterina central del progltido como si fuera inyeccin subcutnea. 5. Secar con otro papel el exceso de tinta y humedad y colocar el progltido entre 2 porta-objetos. 6. Ejercer presin para apretar el progltido al mismo tiempo que otra persona sella alrededor de la preparacin con cinta adhesiva. 7. Contar las ramas uterinas coloreadas con la tinta china con una lente de aumento. 8. Nmero de ramas para 7. solium: 5, 7, 9 13. Nmero de ramas para 7. saginata: ms de 15. 9. Cuando hay duda en situaciones de cuenta intermedia solicitar ms progltidos sin 10. fijar o el parsito que se expulsar con tratamiento especfico, recolectado directamente en una bolsa plstica o en un frasco grande limpio y seco. 11. Cuando los progltidos se reciben fijados, se colorean con carmn, que es una coloracin permanente. 12. Descartar todo material utilizado en frasco con desinfectante o en agua hirviendo. 13. Desinfectar la mesa de trabajo. Lavarse bien las manos.

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COLORACIONES ESPECIALES PARA PROTOZOARIOS

La deteccin y la correcta identificacin de la mayora de los protozoos intestinales dependen del examen de estos extendidos observados con un aumento de 100x. La utilizacin de extendidos permanentes no solamente nos proporciona un archivo durable de los protozoos, sino que pueden ser utilizados, cuando la identificacin es dificultosa, para consultar con especialistas. El mtodo ms clsico es la hematoxilina frrica de Heidenhain, pero la generalidad de los laboratorios seleccionan tcnicas ms breves como la coloracin Tricrmica. Es importante mencionar que la mayora de las dificultades en las coloraciones de trofozoitos y quistes se deben a una fijacin inadecuada, al uso de preparados muy densos o por heces muy viejas.

COLORACIN CON HEMATOXILINA FRRICA DE HEIDENHAIN

Mtodo clsico para colorear e identificar estadios de protozoos comunes en heces del humano, sobretodo cuando slo hay trofozotos y las infecciones son mixtas. Las descripciones en los libros sobre la morfologa y caractersticas de cada estadio y de cada especie estn basadas en organismos coloreados por este mtodo. Ventajas y desventajas Es un mtodo caro porque exige reactivos de primera clase, sobre todo el fijador y los deshidratantes (alcohol, xileno); requiere un tiempo de preparacin y coloracin de las muestras (mnimo 2 horas) y exige un personal de laboratorio con conocimiento slido sobre principios celulares y morfologa diferencial de los organismos. Sin embargo, para la especiacin de protozoos es la ms adecuada, la preparacin puede guardarse para control, referencia, confirmacin por terceras personas y material de estudio. NOTA: Desde la dcada anterior, con la redescripcin de las especies de Entamoeba histolytica y de Entamoeba dispar, la identificacin por morfologa de Entamoeba histolytica no es aceptada. Se prefiere utilizar mtodos inmunolgicos o de biologa molecular. Podra hacerse una excepcin en presencia de trofozotos hematfagos recobrados de casos clnicos agudos (disentrica o amebiasis extraintestinal). Por otra parte, esta coloracin en manos adiestradas ofrece la diferenciacin ms confiable de otras especies de protozoos patgenos y no patgenos del humano. Hay 3 momentos claves en la ejecucin de este mtodo: 1. Fijacin 2. Diferenciacin 3. Deshidratacin 157

Al final los resultados dependern de que se haya hecho una pronta y correcta recoleccin y fijacin de la muestra. No se debe perder tiempo examinando una muestra mal fijada y peor teida. Para una discusin ms completa y acertada sobre el tema, consultar las referencias citadas. Para una coloracin rpida (8-10 minutos) consultar la referencia de Flournoy y colaboradores. Muestra requerida Evitar purgantes de aceite mineral o la administracin de medios radiolgicos de contraste por lo menos 2 semanas antes de tomar la muestra. Cualquier terapia con antibiticos reduce la posibilidad de encontrar organismos. Heces recolectadas en un frasco (vidrio, plstico, cartn) limpio, seco, con tapadera, sin contaminacin (agua, tierra, orina). Cuando haya moco y sangre, recoger de esta parte. Evitar colocar la muestra a temperaturas extremas. Deben ser fijadas al momento de evacuarlas o llevarlas al laboratorio en los prximos 30-60 minutos. Reactivos Shaudinn modificado Solucin saturada acuosa de cloruro de mercurio 62.5 mL Alcohol etlico al 95% 31.2 ml cido actico glacial 5.0 ml Glicerol 1.5 ml Mezclar la solucin saturada de cloruro de mercurio con el alcohol etlico. Puede guardarse en frasco rotulado. El cido actico y el glicerol slo se mezclan al momento de usar el fijador. Fijar una muestra de heces en este fijador en relacin de 10:1 (10 mi de fijador para 1 g 1 mi de heces). Las heces deben estar totalmente suspendidas en el fijador, para lo cual se utiliza un aplicador. Albmina de Mayen Mezclar una clara de huevo en partes iguales con glicerol. Guardar en frasco tapado, rotulado, en el refrigerador. Para preparar las lminas, agregar en partes iguales al sedimento del centrifugado de heces. Alcohol yodado. Solucin madre: Agregar suficientes cristales de lodo a un volumen X de alcohol al 70% en un frasco oscuro con buen tapn. Se obtendr una solucin oscura. Rotular y guardar. Para trabajar, agregar un poco de esta solucin a un volumen X de alcohol al 70%, hasta obtener una solucin color t o color coac (mbar). Mordiente: Cristales de sulfato frrico amnico (Fe2(SO4)3 (NH4)2 SO4 + 24H2O) 2 g. Agua destilada 100 mL. Mezclar, preparar fresco cada da. No puede guardarse. Colorante de hematoxilina. Solucin madre. Cristales de hematoxilina 10 g Alcohol etlico de 95% 100 mL Mezclar y dejar madurar varias semanas (entre 5-6) en un frasco con tapn de algodn, a la luz, a temperatura ambiente. Para trabajar: agregar 0.5 mL de esta solucin a 95 mL 158

de agua destilada. cido Pcrico: cido pcrico en cristales 2 g Agua destilada 100 mL Mezclar y agitar, dejar reposar varios das en un frasco rotulado, agitando de vez en cuando. Si todos los cristales se disuelven, aadir ms cristales de cido pcrico. Utilizar del lquido sobrenadante para diferenciar, tomando a cantidad necesaria con una pipeta. Alcohol al 70% Materiales Porta-objetos 7.5 X 2.5 cm. ( 3 X 2 pulgadas) Cubre-objetos 22 X 30 mm 22 X 22 mm No.1 Tubos de ensayo para centrifugar ( 1 3 X 1 000 mm} Viales para fijar las heces Gasa quirrgica Lpiz de diamante para rotular porta objetos Embudos de 5 cm de dimetro Aplicadores Albmina de Mayer Fijador Schaudinn modificado Alcohol yodado Mordente Colorante de hematoxilina Solucin de diferenciacin Alcohol etlico al 70%, 80%, al 95% Alcohol absoluto Xileno o tolueno Permount Frascos con desinfectante para descartar material. Procedimiento 1. Fijar una muestra de heces o de moco con sangre recin obtenida en el fijador en relacin 10:1 (10 mL de fijador para 1 g 1 mL de heces). Las heces deben estar totalmente suspendidas en el fijador, para lo cual se mezcla con un aplicador. 2. Antes de proceder con la coloracin la muestra debe permanecer 6 horas como 3. mnimo en el fijador. El examinar lminas mal fijadas y peor teidas es una prdida de tiempo. 4. Identificar tubos y lminas con la muestra a procesar. 5. Agitar el frasco conteniendo la muestra fijada y verter 1 mL a un tubo de centrfuga. 6. Si hubiere partculas muy gruesas, en este momento puede filtrarse por un embudo con gasa en 2 dobleces. Descartar la gasa y poner el embudo en solucin desinfectante. 7. Llenar el tubo con agua destilada y centrifugar 2 min. a 2,000 rpm. 8. Descartar el sobrenadante. Este paso puede repetirse otra vez para eliminar fijador en exceso. Agregar al sedimento un volumen igual de albmina de Mayer, mezclar 159

y extender finamente 1-2 gotas de esto sobre un porta-objetos rotulado. Tambin puede colocar sobre el porta-objetos 1-2 gotas de sedimento de heces, agregar 1-2 gotas de albmina de Mayer, mezclar y extender finamente. Permitir que la preparacin se seque unos minutos, dependiendo de la temperatura ambiente. Si no lo seca suficiente, el extendido se desprende; si lo deja secar demasiado, los protozoos se deforman. Introducir en las siguientes soluciones por el tiempo indicado: 1. Alcohol 50% 5 min 2. Alcohol 70% yodado 2- 5 min 3. Alcohol 70% 2-5 min 4. Alcohol 50% 3-5 min 5. Lavar en agua corriente 3-10 min 6. Solucin mordente sulfato frrico amnico 10 min 7. Lavar en agua corriente 3 min 8. Hematoxilina acuosa 10 min 9. Lavar en agua corriente 2 min 10. cido pcrico saturado 10-15 min 11. Lavar en agua corriente 15-30 min 12. Deshidratar por una batera de alcohole en incremento 70%, 95%, y 2 cambios en 100% 2 min en c/uXilol 2 min 13. Colocar 1-2 gotas de permount, cubrir con cubre-objetos, dejar secar y observar con objetivo de inmersin. Problemas y su correccin Para mantener las soluciones lo ms limpias posibles, escurrir la lmina tocando brevemente un papel absorbente o una gasa con el extremo inferior de la misma antes de pasar a otra solucin. Presencia de numerosos cristales amarillos u oscuros indica que el alcohol yodado no removi los cristales y que requiere ms tiempo en dicha solucin. Evitar la evaporacin de los alcoholes manteniendo los frascos bien tapados. Si el xilol se pone lechoso al introducir una lmina, esto indica que la lmina todava contiene agua. Los pasos anteriores no han deshidratado correctamente. Debe cambiar por lo menos el alcohol del paso anterior y el xilol y secar bien los frascos coplin antes de verter el nuevo. El extendido no debe dejarse secar en ningn momento durante la coloracin. Los extendidos pueden permanecer toda la noche en cualquier cambio de alcohol al 70% o xilol. Para los otros cambios mantener el tiempo indicado.

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TINCIN TRICRMICA DE GOMORI-WHEATLEY

Al principio la tincin de Gomori se utiliz en tejidos y Wheatley la uso en parsitos. Este mtodo es ms rpido que el de hematoxilina frrica. Es til para diferenciar protozoarios intestinales en donde se pueden ver algunos detalles del citoplasma y el ncleo. La tincin se puede hacer en frotis de muestra previamente preservadas en PVA o en frotis con muestras frescas y fijas con Schaudinn. Esta tcnica combina un colorante plasmtico (Cromotropo 2R) y un colorante de fibras conectivas (verde luz/azul de anilina) en una solucin de cido fosfotngstico y cido actico glacial. El cido fosfotngstico favorece la coloracin roja de citoplasmas. Colorante de Gomori: 2R cromotropo SF verde claro cido fosfotngstico cido actico glacial Agua destilada 0.6 g 0.3 g 0.7 g 1 ml 100 ml

Agregar 1 ml de cido actico glacial a los componentes secos. Dejar reposar de 15 a 30 minutos y luego agregar 100 ml de agua destilada Procedimiento 1. La preparacin de las laminillas y la fijacin se realizan de manera similar al descrito en la tincin de hematoxilina. 2. Para eliminar el exceso de cloruro de mercurio del fijador de Schaudinn, las laminillas se colocan el alcohol 70%-yodo durante un minuto 3. Se lavan dos veces con etanol al 70%, durante minutos. 4. Las laminillas se colocan en solucin concentrada durante 5 a 10 minutos 5. Se transfieren a etanol al 90% con un 1% de cido actico (10-15 segundos) 6. Se sumergen dos veces en etanol absoluto. 7. Se ponen en etanol absoluto durante 30 segundos 8. Se meten en xileno durante un minuto. 9. Las preparaciones se cubren con resina o blsamo de Canad, se les coloca un cubre objeto de numero 1 y se dejan secar. 161

Resultados Los protozoarios adquieren diferentes tonalidades. El fondo se ve sobre todo rojo o verde, en tanto que los protozoarios toman un color ms neutro, casi siempre gris o verde plido. Los cuerpos cromatoides y eritrocitos toman tanto el color rojo como el colorante verde con lo que se genera un fuerte contraste con el citoplasma. Por lo regular los elementos nucleares se tien de un color ms oscuro.

Cuestionario 1. Por qu es necesario usar colorantes para teir a los protozoarios parsitos? 2. Cul es la diferencia entre tinciones efmeras y tinciones permanentes? En qu circunstancias se recomienda se cada una de ellas? 3. Por qu es necesario fijar las estructuras parasitarias? 4. Cul es la solucin fijadora que se utiliza con mayor frecuencia para las preparaciones permanentes del frotis de heces

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REACCIN INFLAMATORIA Y DIFERENCIACIN CELULAR

Los procesos inflamatorios se caracterizan por el reclutamiento y activacin de clulas inflamatorias, constituidas por leucocitos, macrfagos y linfocitos que se desplazan atradas por citoquinas pro-inflamatorias y se concentran en sitios donde existe injuria tisular. Diversos agentes de naturaleza fsica, qumica o biolgica pueden provocar alteraciones en algunas de las estructuras hepticas desencadenando seales de peligro que son captadas por el sistema inmunolgico y hematolgico. Las citoquinas pro-inflamatorias son sintetizadas y secretadas por casi todos los tipos de clulas. En la prctica, las enfermedades parasitarias son muy tiles por permitir la observacin, de manera muy grfica, de todas las variantes del proceso inflamatorio y aun de sus secuelas. Hay algunos hechos curiosos en patologa parasitolgica. Usualmente en la inflamacin se busca la presencia de exudado, con determinado tipo de clulas predominantes; sin embargo, en la hepatitis o encefalitis paldica, se sabe que no hay reaccin leucocitaria en el tejido: solo se observa al componente alternativo y algunos trastornos circulatorios, como el edema. Es muy fcil demostrar en muchos casos, como en la amebiasis heptica o en la toxoplasmosis enceflica, que es el parsito, como ente extrao, el que desencadena el proceso inflamatorio; pero hay situaciones, como sucede a veces en la miocarditis chagsica y en la toxoplsmica, especialmente en las formas crnicas, en que cerca de una colonia de parsitos no se aprecia reaccin inflamatorio; en cambio, sta puede ser importante lejos del sitio en que el parsito est, lo que hace suponer que est, lo que hace suponer que hay sustancias antignicas, producidas por el parsito, que provocan reaccin a distancia.

Objetivos El propsito de la prctica es que el estudiante establezca la diferencia en el laboratorio entre la infeccin intestinal que ocasiona diarrea infamatoria y la no inflamatoria. Esta diferencia puede establecerse determinando la presencia de Leucocitos en materia fecal. Los Leucocitos se encuentran asociados a moco y su presencia indica una diarrea tipo inflamatoria lo cual sugiere bacteriana o parasitaria

Materiales Muestra fecal Laminas portaobjetos y cubreobjetos Colorante azul de metileno Colorante Wright Aceite de Cedro Microscopio

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA Procedimiento 1. Colocar una pequea porcin de materia fecal sobre una lmina portaobjeto, agregarle una gata de azul de metileno, cubrirla con una laminilla y observar al microscopio en busca de leucocitos. Para un estudio cuantitativo contar 200 clulas con objetivo de 40x. La interpretacin es la siguiente: o Positivo + : menos de 10 leucocitos /campo. o Positivo ++ : de 10 a 30 leucocitos/campo. o Positiva +++: ms de 30 leucocitos/campo Procedimiento 2. Hacer una extensin de materia fecal sobre una lmina portaobjeto dejar secar y colorear con wrigth. Observar al microscopio y observar los leucocitos coloreados. Realizar un conteo de 200 leucocitos, diferenciando los mononucleares y polimorfonucleares y expresarlo en porcentaje (%).

FORMA DE REPORTE: Reportar el porcentaje de leucocitos encontrados con el predominio del que tenga mayor porcentaje. Polimorfonucleares por ciento.Mononucleares por ciento. Interpretacin: Predominio de polimorfonucleares se asume que existe un proceso infeccioso de origen bacteriano. Predominio de Mononucleares se asume que el proceso infeccioso es de origen viral.

MODELO: REPORTE DE EXAMEN - REACCION INFLAMATORIA

REACCION INFLAMATORIA :

POSITIVO LEUCOCITOS : 25 - 30 POR CAMPO

DIFERENCIACIN :

POLIMORFONUCLEARES MONONUCLEARES

: 80 % : 20 %

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MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA

CONTROL DE CALIDAD INTERNO EN PARASITOLOGA CLNICA

FASES DEL PROCESO DE LABORATORIO

PRE ANALITICA Es la que insume mayor tiempo, solicitud,obtencin, almacenamiento, transporte, recepcin y la que est sujeta a mayor porcentaje de errores.

ANALITICA corresponde a la realizacin del procedimiento diagnstico. Incluye validacin de las tcnicas, calibracin de equipos, ejecucin de controles de calidad, etc.

POS ANALITICA
Clculos, interpretacin de resultados, validacin, emisin del informe.

El diagnstico parasitolgico es fundamentalmente morfomtrico y la identificacin de los parsitos de modo fiable y exacto, requiere: i) ii) iii) iv) utilizar muestras satisfactorias; preparar y conservar adecuadamente los reactivos; realizar cuidadosamente los procedimientos tcnicos seleccionados; examinar meticulosamente las preparaciones realizadas.

No obstante, existen procedimientos diagnsticos alternativos, no excluyentes, complementarios de los procedimientos convencionales, y en algunos casos imprescindibles para el diagnstico, que deben ser controlados por el laboratorio y por lo tanto sujetos a los controles internos de calidad, como son los cultivos especficos, los estudios serolgicos y las tcnicas de diagnsticos moleculares. Estas recomendaciones tienen como finalidad describir como se debe efectuar el control de calidad interno de las tcnicas de laboratorio relacionadas con el diagnstico de las parasitosis humanas. Estos procedimientos se aplicarn a los diferentes ensayos que se realicen en los laboratorios de Microbiologa, encaminados al diagnstico de las parasitosis humanas. En los laboratorios debe existir un supervisor del control de calidad y el personal debe rellenar los registros de control de calidad en los formularios preparados para tal efecto. El supervisor de calidad debe: i) revisar mensualmente los datos generados por el control interno de calidad; ii) clasificar los registros para facilitar su inspeccin; iii) conservar los registros durante un periodo mnimo de dos aos. Los anlisis deben ser realizados por personal TECNOLOGO calificado con experiencia en Parasitologa, adems de supervisar el proceso diagnstico. Dadas las peculiaridades de la Parasitologa Clnica, sera aconsejable que el personal tuviese una formacin adicional especfica en esta materia. 165 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA Las caractersticas del laboratorio requeridas para realizar el diagnstico de las parasitosis humanas son similares a las de cualquier laboratorio del rea de Microbiologa. Debe disponer de programas de seguridad, de limpieza y de eliminacin de residuos, que pueden ser los generales del laboratorio, y de los equipos necesarios (microscopios, lupas, centrfugas, refrigeradores, congeladores, incubadores, pHmetros, etc) para realizar los procedimientos diagnsticos. As como, del correspondiente Manual de Procedimientos de Diagnstico Parasitolgico, que debe de recoger los procedimientos y los correspondientes algoritmos diagnsticos. Requerimientos para un adecuado control de calidad interno Dado que a diferencia de las otras reas de la especialidad no existen cepas de control, de todas las especies parsitas que afectan al hombre, el laboratorio: Debe disponer de una coleccin propia de muestras fecales conservadas, con los parsitos prevalentes en su rea geogrfica, adecuadamente identificadas. Debe disponer de fuentes documentales propias (libros, atlas) y de acceso online, para poder efectuar las consultas pertinentes. Debe conservar las preparaciones positivas teidas con tinciones permanentes. Debera disponer de concentrados fecales de parasitosis exticas en su medio. As como, de preparaciones permanentes de los principales hemoparsitos, especialmente de las diferentes especies plasmodios que afectan al hombre, y de las tinciones diferenciales utilizadas en los exmenes coproparasitolgicos. El material de referencia (coleccin de especimenes de helmintos, huevos, larvas y quistes de protozoos preservados en formol; tinciones fecales con ooquistes, quistes y trofozotos de protozoos y tinciones sanguneas positivas; atlas; manuales y libros de referencia) debe ser clasificado y almacenado de forma adecuada, de modo de que su consulta con fines diagnsticos, de entrenamiento y adiestramiento, sea fcil. Recomendaciones para el control de calidad de la fase pre-analtica La adecuada programacin de la fase pre-analtica es de capital importancia para el buen funcionamiento de los laboratorios clnicos, por ello consideramos que el laboratorio: Debera disponer de una solicitud propia de anlisis en la que, adems de los datos demogrficos del paciente y del estudio solicitado, debera de estar recogida la informacin clnica y teraputica necesarias para la adecuada implementacin de la fase analtica, que en el caso del diagnstico parasitolgico debera de incluir, entre otros: * Tipo de proceso y tiempo de evolucin * Datos biolgicos concomitantes (esosinofilia, anemia, etc) * Estancia en otros lugares y otros datos epidemiolgicos de inters Debe facilitar la informacin necesaria para la adecuada obtencin, conservacin y transporte de las muestras. En el caso de los exmenes coproparasitolgicos el laboratorio debe facilitar contenedores con conservantes que permitan la realizacin de tinciones diferenciales . Recomendaciones para el control de calidad en la fase analtica Control del equipamiento: El personal del laboratorio debe controlar el equipamiento del mismo. CENTRIFUGA.se comprobara que la velocidad es correcta, calibrndose una vez al ao. Se verificara la eficacia de la calibracin procesando una muestra positiva (por ejemplo con quistes de guardia) por el mtodo de concentracin y 166 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA comprobando que el nmero de quistes es al menos cinco veces mayor que el examen en fresco. REFRIGERADORA, CONGELADOR, ESTUFAS. Se controlara la temperatura a diario, anotando los resultados en una hoja de control, se limpiaran mensualmente por dentro y por fuera MICROSCOPIO. Se limpiara tras cada uso y de forma ms exhaustiva al terminar la jornada laboral, utilizando papel lente o servilletas de papel, nunca tela. Se revisara y limpiara semestralmente por un tcnico especializado y se calibrara una vez al ao. Control de los reactivos: La adecuada preparacin y conservacin de los reactivos es de capital importancia en el control interno de la fase analtica, por lo cual: En los correspondientes Procedimientos de Diagnstico Parasitolgico debe figurar la composicin, preparacin, conservacin y vida media de los reactivos. Todos los reactivos deben estar adecuadamente identificados y en la correspondiente etiqueta deben figurar las fechas de preparacin y de caducidad. El personal del laboratorio debe comprobar la fecha de caducidad de los reactivos antes de su utilizacin, y proceder en su caso a su sustitucin. Cada vez que se proceda a la sustitucin de un reactivo, o se introduzca uno nuevo, debe realizarse el correspondiente control de eficacia.

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MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA

DIAGNSTICO INMUNOLGICO DE ENFERMEDADES PARASITARIAS

Desde principios de este siglo, cuando Landsteiner inici la era de la inmunologa hasta nuestros das, se han realizado muchos hallazgos que comprometen al husped en la reaccin antgeno-anticuerpo y al modo de realizar la investigacin de dicho proceso. Actualmente la inmunologa interviene en la mayora de las disciplinas mdicas y la parasitologa no es la excepcin a esta afirmacin, adems desde hace cincuenta aos las pruebas inmunolgicas se utilizan en esta rea. En la actualidad el diagnstico inmunolgico de las enfermedades parasitarias tiene ciertas limitaciones para su aplicacin en la mayora de los laboratorios clnicos asistenciales o en los centros de docencia, sin embargo estas pruebas se realizan con cierta frecuencia en los laboratorios de referencia nacionales seccionales o en unidades docentes con recursos econmicos amplios. El uso clnico de las pruebas de inmunodiagnstico parasitolgico est restringido a pocas entidades nosolgicas en nuestro medio, debido a los escasos recursos econmicos que tienen nuestras Instituciones, al hecho de existir otros anlisis menos costosos y ms dicientes de una infeccin actual y quiz lo ms importante, es el comportamiento biolgico del parsito, el cual es diferente al de la bacteria y el virus, por lo tanto su papel como antgeno tiene otras! caractersticas. De lo anterior se puede deducir que la utilizacin de estas pruebas en el diagnstico debe limitarse a aquellos casos en los cuales los resultados conlleven una informacin sobre el estado de infecciosidad del agente. Los otros empleos de estas pruebas, estn destinados a obtener datos seroepidemiolgicos que impliquen una anterior exposicin al parsito, por ende tiene alto valor en el estudio de la prevalencia de las enfermedades parasitarias. Las pruebas ms importantes en el diagnstico inmunolgico de enfermedades parasitarias son las siguientes: Precipitacin: Esta reaccin se realiza cuando un antgeno soluble reacciona con su anticuerpo y forma un precipitado. Aglutinacin: Es una prueba en donde el antgeno celular o particulado se halla en suspensin, este antgeno aglutina con su anticuerpo especfico. FIoculacion: Esta prueba es una variante de la precipitacin pero la reaccin se manifiesta por formacin de grumos. Hemaglutinacin indirecta: Con algunos antgenos parasitarios se sensibilizan glbulos rojos, como resultado estos glbulos rojos sensibilizados son aglutinados por anticuerpos especficos. Fijacin de complemento: Se realiza cuando un antgeno se pone en contacto con un anticuerpo especfico en presencia de complemento. Doble difusin: Consiste en poner en una serie de pozos los posibles anticuerpos contra un antgeno determinado. Al difundiisen antgeno y anticuerpo, forman al encontrarse especficamente una banda de precipitado. 168 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA Contrainmunoelectroforesis: Llamada tambin electroinmuno-difusin, la cual consiste en hacer reaccionar antgeno y anticuerpo en un gel sometido a campo elctrico. Inmunoelectroforesis: Esta prueba es una combinacin de mtodos fisioqumicos e inmunoqumicos, el material a investigar (antgeno) inicialmente es sometido a una separacin por electroforesis y posteriormente se enfrenta al antgeno fraccionado con el suero (anticuerpo) a examinar, de tal manera que los antgenos y anticuerpos se difunden en un medio apropiado (gel) el uno hacia el otro para evidenciar la formacin de bandas de precipitacin al encontrarse. Anticuerpos fluorescentes (Mtodo indirecto): En el cual un suero desconocido (anticuerpo) se pone en contacto con antgenos conocidos, luego se aade antigamaglobulina marcada con fluoresceina y posteriormente se observa en microscopio de fluorescencia. Esta prueba ha sido modificada para obtener un antgeno soluble adherido a una base de acetato de celulosa y su lectura se realiza en un fluormetro. Anlisis Inmunoenzimtico: Es una prueba creada en esta dcada, consiste en ligar a un tubo o placa de poliestireno el antgen el cual se pone en contacto con suero (anticuerpo), posteriormente se nace contactar esta unin (antgeno-anticuerpo) con antiglobulina marcada con enzima y luego esta enzima se hace reaccionar sobre un substrete dando una reaccin de color. Intradermorreaccin: Es una prueba consistente en la aplicacin intradrmica de un antgeno determinado y la posterior reaccin celular por la presencia de anticuerpos especficos.

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MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA Seleccin La seleccin de la prueba depende de las caractersticas de cada una de ellas en relacin al estado de la enfermedad y al parsito que la produce, sinembargo, cada laboratorio debe estar familiarizado con un grupo de tcnicas cuyo uso est estandarizado y cumplan los objetivos para lo cual son empleadas y que sean de utilidad para el mdico. Caracteristicas Una prueba inmunolgica tiene las siguientes caractersticas:

Especificidad: La especificidad de una prueba est dada por la relacin de individuos no infectados que den prueba positiva, de tal manera que hay dos tipos de especificidad: alta y baja. Alta especificidad significa que en presencia de individuos no infectados la posibilidad de que la prueba sea positiva (detecte anticuerpos) es mnima. La baja especificidad se refiere a que en presencia de los mismos individuos no infectados se puede hallar positiva la prueba en muchos individuos. Sensibilidad: La sensibilidad es la relacin entre los individuos infectados que den una prueba positiva (detectar anticuerpos), generalmente se expresa como las otras caractersticas en porcentaje, as un 95% de sensibilidad quiere decir que la prueba es altamente sensible y que de cada 100 individuos infectados 95 dan la prueba positiva y 5% de sensibilidad significa que la prueba tiene baja sensibilidad y por lo tanto de cada 100 individuos infectados, 5 dan la prueba positiva. Reactividad La reactividad se relaciona con la cantidad de anticuerpos infectados, as una prueba de alta reactividad es aquella que detecta una mnima cantidad de anticuerpos y al contrario, una prueba de baja reactividad es la que detecta el nivel de anticuerpos cuando estos han llegado a cifras o diluciones altas. Por lo tanto la eleccin de la prueba es aquella que cumple con una alta especificidad y sensibilidad y se acompaa de una baja reactividad, lo que elimina en lo posible la determinacin de anticuerpos cruzados o residuales de una infeccin previa. En general se considera la calidad de la reactividad para las siguientes pruebas, as: Alta Reactividad: Hemaglutinacin / Intradermorreaccin Baja Reactividad: Fijacin de complemento / Inmunoelectroforesis / Doble difusin /Contrainmunoelectroforesis Aplicacion Aunque existen aproximadamente 24 entidades en donde es posible aplicar el inmunodiagnstico, solo se utiliza en 18 enfermedades a nivel asistencial en los laboratorios clnicos y en nuestro medio la existencia y utilizacin de tales pruebas se reducen a no ms de seis entidades. 170 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

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PROTOZOARIOS AMEBIASIS Aunque la amibiasis en nuestro medio es frecuente, su diagnstico se realiza por las tcnicas parasitoscpicas corrientes, sin embargo hay que considerar que si la amibiasis es invasiva las pruebas serolgicas son de mayor valor que cuando la amiba est limitada a luz intestinal; entre estas dos presentaciones existen lesiones intermedias en las cuales es inflamatoria o ulcerativa y la utilizacin de las pruebas no sigue una norma general. Las pruebas ms usadas para la amibiasis son: Contrainmunoelectroforesis: Cuya positividad alcanza el 92% en personas con amibiasis invasiva y 7% en portadoras asintomticos. Hemaglutinacin indirecta: El ttulo se considera positivo cuando alcanza valores de 1:128, pero en Colombia este ttulo debe ser considerado como bajo, ya que esta prueba es de alta reactividad, sin embargo es una prueba muy especfica, ya que solo es positiva en 1.2% de los pacientes sin evidencia de amibiasis. La prueba ms especfica pero de ms bala reactividad que la Contrainmunoelectroforesis es la inmunodifusin. Actualmente se usa con cierta frecuencia una prueba a base de latex sensibilizado con antigeno, esta prueba tiene importantes restricciones por lo tanto su uso es muy limitado tanto por las reacciones cruzadas como por el mismo comportamiento biolgico de la amiba. Una prueba moderna es la utilizacin de anlisis inmunoenzimtico la cual tiene mayor sensibilidad que la fluorescencia. Sinembargo deben esperarse otros estudios para completar la informacin sobre el uso clnico de la prueba. Tambin se ha descrito su utilidad para ei diagnstico de enfermedad de Chagas, malaria y triquinosis. Hay consenso general de que la presencia de anticuerpos no refleja una infeccin activa y que su papel como protectores es dudoso. TOXOPLASMOSIS Con los nuevos descubrimientos desde 1969, sobre el ciclo vital del toxoplasma y la implicacin de felinos que como el gato entraron activamente en el ciclo evolutivo del toxoplasma y dada la importancia que este hecho reviste dentro de la epidemiologa y la clnica, cada vez se recurre ms al diagnstico inmunolgico de toxoplasma para completar el estudio epidemiolgico o clnico, para aplicar el tratamiento y posteriormente para un control adecuado de los posibles riesgos para el paciente o su descendencia. La tradicional prueba del colorante denominada de Sabin y Feldman, la cual es muy sensible y especifica, ha sido reemplazada en la actualidad por otras pruebas menos peligrosas para el personal del laboratorio y de iguales caractersticas. Esta prueba se vuelve positiva en un perodo de dos semanas a partir de la infeccin 171 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA aguda y quiz la positividad perdura a travs de la vida del individuo. La inmunofluorescencia es una de las pruebas que ha reemplazado satisfactoriamente a la prueba del colorante y est indicada en casos de toxoplasmosis aguda congnita porque puede determinar la IgM. As, cuando un nio nace con defectos congnitos se hace la prueba al momento de nacimiento, si sta da un resultado positivo se presentan dos alternativas: o que el nio tiene toxoplasmosis congnita activa o que los anticuerpos pasaron a travs de una grieta placentaria, por ello se debe hacer una nueva prueba 3 o 4 semanas despus y si sta es positiva indica que hay una toxoplasmosis activa. Un resultado negativo indica que los anticuerpos pasaron a travs de la placenta mecnicamente. Un ttulo de 1:64 o superior tiene importancia clnica segn algunos autores pero la mayora acepta slo como indicador de infeccin activa una cifra igual o superior a 1:128. La fijacin del complemento: Es la prueba que ms tarda en dar resultados positivos y ms tempranamente se vuelve negativa. Asi, cuando un suero es negativo por este mtodo y presenta un ttulo de 1:64 a 1:256 con las otras pruebas, quiere decir que se trata de una infeccin reciente o de anticuerpos residuales de una infeccin pasada. La Hemaglutinacin indirecta: Es similar en sus resultados a la del colorante y se usa sobre todo en estudios epidemiolgicos. Como da positiva ms tardamente que la de Sabin y Feldman tiene el problema de no poder determinar anticuerpos en la fase aguda de la enfermedad. En la interpretacin de la prueba se deben tener en cuenta los siguientes ttulos: 1:64. Refleja experiencia toxoplasmsica pasada, incluso de aos atrs o una muy reciente exposicin al parsito. 1:256 1:1024 Reciente exposicin, debe observarse evolucin del paciente. Es una cifra significativa y nos indica probable toxoplasmosis.

La inmunidad conferida por el toxoplasma es muy slida, si se adquiere la enfermedad durante los dos primeros trimestres del embarazo es muy posible que tenga un hijo con toxoplasmosis congnita, pero un segundo hijo ya no presentar la enfermedad debido a la inmunidad conferida a la madre.

ENFERMEDAD DE CHAGAS Aunque recientemente en nuestro medio no se ha cuantificado la magnitud de este problema, hay zonas del pas como los Llanos orientales en donde se presentan estos casos y los individuos que emigran a diversas partes del pas introducen el problema diagnstico. Las pruebas ms utilizadas en el diagnstico de este padecimiento son la hemaglutinacin indirecta, la fijacin de complemento y la inmunofluorescencia. Con la utilizacin de las tres tcnicas en forma simultnea se obtiene una mayor sensibilidad y especificidad. En un perodo de 4-24 meses el 81% de los pacientes que han sido 172 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA sometidos a tratamiento, la prueba positiva retorna negativa. Se considera como ttulos positivos las siguientes cifras: Hemoglutinacin indirecta Fluorescencia indirecta Fijacin de complemento 1:128 1:64 1:8

Recientemente se ha adaptado la AGLUTINACION DIRECTA, la cual es una prueba muy sensible a sueros de pacientes con infeccin aguda porque en estos casos se eleva la IgM, la cual es detectada por este mtodo, al contrario de lo que sucede en los casos crnicos donde hay ms IgG, la cual es determinada por la prueba de hemaglutinacin. La fijacin de complemento determina las dos inmunoglobulinas. Para la prueba de aglutinacin directa se usa un antgeno preparado con epimastigotes (critidia) de T. Cruzi fijados y tripsinizados, habindose encontrado que la prueba es muy sensible y relativamente muy especfica en relacin a las reacciones cruzadas con leishmaniasis, se considera que un ttulo de 1:512 o ms alto es especfico para la enfermedad de chagas, los sueros con ttulos de 1:128 y 1:256 son dudosos y deben ser analizados por otras pruebas como la fijacin de complemento y la inmunofluorescencia. Los ttulos altos de anticuerpos no parecen limitar la infeccin en el hombre, sinembargo se ha descrito inmunidad para cepas virulentas obtenidas con infecciones previas de cepas poco virulentas. LEISHMANIASIS Las pruebas serolgicas para diagnsticos de la leishmaniasis son utilizadas segn el tipo de leshmanias que ataca al individuo y por ende segn la forma clnica que presenta en el paciente, aunque en la actualidad una clasificacin exclusivamente clnica de la enfermedad es ms difcil y ofrece dificultades de determinacin etiolgica. . El tercer tipo de leshmania es la L.trpica, la cual produce la leishmaniasis cutnea; en este tipo hay divergencias en cuanto a si presentacin en Colombia. Recientemente se han realizado clasificaciones de los diferentes tipos de leishmaniasis las cuales incluyen varios subtipos, que presentan una patologa especial en una rea determinada. Se utilizan pruebas como la fijacin de complemento, la hemaglutinacin indirecta y la fluorescencia indirecta, cada una de es tas pruebas tiene una muy buena aplicacin en el diagnstico de la leishmaniasis visceral causada por L.donovani. La hemaglutinacin indirecta se ha aplicado a pacientes con leishmaniasis cutnea y se efecta con antgenos de las tres leishmanias, sinembargo su sensibilidad es baja. La inmunofluorescencia se realiza con un angeno en la forma de amastigote y los resultados para la leishmaniasis cutnea son buenos, los ttulos decrecen con la quimioterapia. Una variante es utilizar el promastigote como antgeno y aunque los resultados son satisfactorios es una prueba muy compleja de realizar. Recientemente se ha utilizado la prueba de aglutinacin, empleando las formas de promastigote de las tres especies de leishmaniasis; la prueba es ms sensible que la 173 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA Inmunofluorescencia para la leishmaniasis americana. Los ttulos de aglutinacin directa que se consideran positivos para cada uno de los tipos de leishmanias son: 1. L.braziliensis 2. L.donovani 3. L.trpicalis 1:32 1:64 1:128

MALARIA La inmunologa parece brindar una esperanza y apoyo esencial al problema de la malaria, tanto para su prevencin como para su diagnstico seroepidemiolgico. Dos pruebas han sido utilizadas para el diagnstico de la malaria, una de ellas, la fluorescencia indirecta, tiene una sensibilidad del 95%. Sin embargo se deben usar los antgenos homlogos debido al comportamiento del Plasmodium. Se sabe que ttulos de 1:16 para esta tcnica son considerados como positivos. Otro mtodo es la hemaglutinacin indirecta, la cual emplea antgenos de P. cynomolgy el ttulo considerado positivo para esta prueba es superior o igual a 1:16.

HELMINTIASIS

CISTICERCOSIS La cisticercosis es tanto un problema en medicina humana como veterinaria, ya sea por las lesiones que en s causa la trasmisibilidad accidental a que se est expuesto o a las prdidas econmicas. Varias pruebas son usadas para el diagnstico de la lesin: la fijacin de complemento, la hemaglutinacin indirecta, la doble difusin y la contrainmunoelectroforesis. La mayora de ellas carecen de sensibilidad y especificidad comprensible complejidad morfolgica del estado larvatorio. por la

Quiz la prueba que mejor correlacin ofrece entre el estado clnico del paciente y los resultados del laboratorio es la contrainmunoelectroforesis. TOXOCARIASIS Las pruebas para toxocariasis han tenido una sensibilidad que no sobrepasa el 70% y adems su especificidad es baja. Las pruebas ms utilizadas son la hemaglutinacin indirecta y floculacin con bentonita. Otros Helmintos Para otras helmintiasis como son las esquistomiasis, equinococosis, triquinosis, paragominiasis o ascariasis existen pruebas immunolgicas para su diagnstico, pero o estas enfermedades no se presentan hasta el momento en Colombia o como en el caso de 1a ascariasis que aunque se presenta en Colombia, estas ayudas diagnsticas 174 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA son menos tiles que los mtodos tradicionales.

INTRADERMORREACCION Captulo aparte son las pruebas intradrmicas que se utilizar en clnica para diagnstico o evolucin epidemilgica de alguna de las enfermedades ya mencionadas y para otras patologas, las cuales tienen el carcter experimental. En las siguientes enfermedades las pruebas intradrmicas han sido evaluadas y tienen alguna aplicacin: Leishmaniasis Toxoplasmosis Clonorchiasis Equinococosis Paragonomiasis Esquistosomiasis Triquinosis. En forma experimental se han desarrollado pruebas por las siguientes entidades: Amibiasis Ancylostomiasis Ascariasis Toxocariasis Filariasis Fascioliasis En nuestro medio la utilizacin de las pruebas intradrmicas son de muy poco inters, no solo por las condiciones epidemiolgicas del pas, sino por su utilidad en comparacin con otras pruebas y otros anlisis de prctica comn.

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CUADRO COMPARATIVOS

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PARASITOSIS MAS COMUNES

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DIAGNOSTICO SEGN LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE PARASITOS

TECNICAS DE DIAGNOSTICO DE CHAGAS

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EXAMEN DE BIOPSIAS DEL TUBO DIGESTIVO

Las biopsias que son tiles para la bsqueda de parsitos son las obtenidas del antro pilrico, duodeno y recto mediante endoscopas. Los parsitos diagnosticados frecuentemente en biopsias del antro-pilrico y del duodeno son Strongyloides stercoralis y Giardia lamblia, menos frecuente es la observacin de coccidias intestinales como Cryptosporidium y Cyclospora. Las biopsias de ulceraciones del intestino grueso muestran Entamoeba histolytica o Balantidium coli. Las piezas operatorias que son objeto de examen histolgico pueden demostrar la presencia de parsitos intestinales, por ejemplo: Enterobius vermicularis adultos en la luz del apndice o Ascaris lumbricoides en una obstruccin mecnica de intestino, vas biliares o conducto pancretico.

Recomendaciones
La bsqueda de parsitos intestinales en cortes histolgicos obtenidos por biopsia o necropsia no requiere, en general, de tcnicas de coloracin especiales. La coloracin de hematoxilina-eosina es til, aunque generalmente no es posible reconocer la morfologa del parsito, pues el corte microscpico afecta su integridad. Las piezas anatmicas pueden conservarse en formol al 10% para ser usadas como piezas de museo o muestras de referencia.

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PREPARACION DE REACTIVOS
Ac. actico 5% Se disuelven 5 ml de acido actico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Acido actico 36% Se disuelven 36 ml de acido actico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Ac. fnico 75% Se disuelven 5 ml de acido fnico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Acido tricloroactico 5% Se disuelven 5 ml de acido tricloacetico e se llevan a 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Alcohol cido cido clorhdrico (HCl) Etanol (95%9 3.0 ml 97.0 ml

Primero se vierte el etanol y se le agrega despus el HCl; la reaccin provoca calor.

Alcohol, formaldehdo, cido actico (AFA) Reactivos Etanol (95%) Formaldehdo Agua destilada cido actico glacial 30.0ml 10.0 ml 50 ml 10.0ml

La mezcla de etanol, formaldehdo y agua destilada dura varios meses. Cuando se agrega el cido actico dura un mes.

Azul de metileno alcalino de Loffler Solucin A Azul de metileno Etanol (95%) Solucin B Hidrxido de potasio (0.10% peso) 100ml 0.3g 30.0 ml

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Buffer fosfato (PBS) 0.01 M pH 7.2 Na2HP0412 H20 ...................................................... 2,60 g Na Na2P04 H20 ....................................................... 0,38 g NaCl....................................................................... 8,38 g Completar el agua a ..................................... 1000,00 mL Carbolfucsina Solucin A Fucsina bsica Etanol (95%) Solucin B Fenol (cristales fundidos) 5.0g Agua destilada 95.0ml 0.3g 10.0 ml

Se mezclan las dos soluciones y antes de su uso se dejan reposar una semana Cloruro de sodio 2% Se pesan 20 g NaCl, se disuelven en agua destilada y se completa el volumen a 1000 ml en matraz volumtrico Cloruro frrico 3% Se disuelven 3 ml de cloruro frrico en 100 ml agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Colorante de wright Reactivos: Colorante de wright en polvo Alcohol metlico absoluto, libre de acetona. Procedimiento: Se pesan 0.60 grs. de colorante de wright y se disuelven en 360 ml de alcohol Fijador de Shaudinn Alcohol etlico 95%......................................1 parte Solucin saturada cloruro mercurio( disolver 9 gramos de cloruro de mercurio en 205 ml de agua destilada)...2 partes. Antes de usar agregue 5 ml de acido actico glacial a 100 ml de la solucin fijadora. Formaldehdo 10% Se disuelven 10 ml de formaldehdo en 90 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Formaldehdo 40% Se disuelven 40 ml de formaldehdo en 60 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. 187 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

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HCl 5% Se disuelven 5 ml de acido clorhdrico en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Hematoxilina frrica Solucin concentrada A Hematoxilina Etanol absoluto 1000.0ml Solucin concentrada B Sulfato ferroso de amonio Sulfato frrico de amonio cido clorhdrico Agua destilada 10.0g 10.0g 10.0 ml 1000.0 ml 10.0 g

Soluciones se almacenan a temperatura ambiente y su vida media es 6 meses. Solucin de trabajo Solucin concentrada A Solucin concentrada B 15ml 15ml

La solucin de trabajo tiene vida media de 7 da Hidrxido de sodio NaOH 3% Se pesan 3 g de hidrxido de sodio lo ms rpido posible para evitar la hidratacin y la alteracin del peso, se lleva 100 ml de agua destilada, se agita para homogenizar la solucin. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE CAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidrxidos de sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Hidrxido de sodio - NaOH 10% Se pesan 10 g de hidrxido de sodio lo ms rpido posible para evitar la hidratacin y la alteracin del peso, se agregan 100 ml de agua destilada, se agita para homogenizar la solucin. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE CAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidrxidos de sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Lugol parasitolgico Solucin madre Se disuelven 10 g de yoduro de potasio en 100 ml de agua destilada y en seguida se agregan 5 g de yodo cristaloide, se agita constantemente para que se disuelva la mayor cantidad posible, se guarda en frasco mbar. No importa que quede exceso de yodo en el fondo; esto se hace para que la solucin permanezca con la concentracin deseada durante mucho tiempo e inclusive se puede reintegrar el volumen con adicin de agua destilada. Solucin de trabajo de lugol. Se mezclan volumen a volumen solucin madre de lugol y agua destilada. Se sugiere evitar los frascos goteros con bulbo de caucho porque el lugol los destruye rpidamente, es mejor utilizar frascos goteros especiales con tapn esmerilado 188 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

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Merthiolate-yodo-formaldehdo (MIF) Solucin concentrada: Tintura de merthiolate Formaldehdo USP Glicerina Agua destilada Solucin de yodo (lugol): Yoduro de potasio Yodo cristaloide Agua destilada Solucin de trabajo: Solucin concentrada Solucin de yodo 2.35 ml 0.15 ml 10.0g 5.0g 100.0ml 200.0ml 25.0 ml 5.0 ml 250.0 ml

La solucin de trabajo se prepara en el momento en que se va a preservar la muestra. En un recipiente se mezcla la muestra de matera fecal con la solucin de trabajo, pero conservando una relacin de 1:3-5 (muestra: MIF). PVA (alcohol polivinilico) PVA Alcohol etlico Cloruro de mercurio,acuoso saturado Cloruro de Mercurio Agua destilada cido actico glacial Glicerina Preparacin 1 - Mezclar los ingredientes lquidos. 2Agregar el PVA (no agitar) 110 g 1000 ml 10 ml 3 ml 10 g 62,5 ml 125 ml

3- Cubrir el erlenmeyer con papel aluminio, dejarlo toda la noche en contacto. 4- Al da siguiente calentar hasta 75 C. Luego agitar hasta obtener una solucin homognea ligeramente lechosa (30 segundos) 189 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

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Reactivo de Benedict: solucin de 17.3 g de sulfato de cobre cristalizado, 173 g de citrato de sodio o potasio, 200 g de carbonato de sodio en 1.000 ml de agua destilada. SAF Acetato de sodio cido actico glacial Formaldehdo al 40% Agua destilada 1,5 g 2 ml 4 ml 92,5 ml

Soluciones alcohlicas a partir de alcohol de 95%. El alcohol del comercio viene a una concentracin de 95%; como resulta demasiado caro el uso de alcohol absoluto para hacer soluciones alcohlicas de concentraciones variables, se puede partir de 95%, si se toma en consideracin la siguiente regla. Es necesario recordar que el alcohol tiene qu ser puro de caa, pues el desnaturalizado, por contener sustancias que lo hacen tener mal sabor, hay interferencia en los procesos de tincin. Alcohol 70%: Se mezclan 70 volmenes de alcohol de 95% y 30 volmenes de agua destilada. Solucin buffer de fosfatos Reactivos: Fosfato monopotsico Fosfato disdico Procedimiento: Se pesan 0.49 grs. de fosfato monopotsico y 1.14 de fosfato di sdico, se mezclan y se disuelven hasta completar un volumen de 1000 ml en un matraz volumtrico. Solucin de trabajo Giemsa Reactivos: Colorante de Giemsa en polvo Glicerina QP. Alcohol metlico Solucin buffer de fosfato Procedimiento: Primero se va a realizar la solucin madre de giemsa. Se pesan 3.8 grs. de giemsa en polvo, se coloca en un mortero de 500 ml, se agregan 250 ml de glicerina, mientras que con el pistilo se mezcla con mucho cuidado hasta que

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MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA homogeneice y no haya grumos. Se agregan 250 ml de alcohol metlico absoluto libre de acetona. Se dejan 100 ml de alcohol sin incorporar La mezcla se vaca en un frasco oscuro, con el resto del alcohol se enjuaga el mortero y el pistilo de tal manera que no queden restos del colorante. Despus de haber realizado la solucin madre de giemsa, se mezcla volumen a volumen con la solucin buffer de fosfato. Solucin de piramidn 3% Se disuelven 3 ml de piramidon en 100 ml destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. Sol. Salina 0.9% Se pesan 9 g NaCl, se disuelven en agua destilada y se completa el volumen a 1000 ml en matraz volumtrico. Solucin de verde de malaquita y glicerina Se mezclan 1 ml de solucin de verde de malaquita, 100 ml de glicerina pura y 100 ml de agua, se homogenizan y se guarda la solucin, que es estable durante mucho tiempo, en un frasco mbar de boca ancha y tapa de baquelita. Se recomienda cortar los cuadros de celofn y mantenerlos dentro del frasco con la solucin de trabajo y as, siempre tendremos el material listo Solucin 0.1 N de hidrxido de sodio Se pesan 4 g de hidrxido de sodio lo ms rpido posible para evitar la hidratacin y la alteracin del peso, se coloca en un matraz volumtrico de un litro. Se agregan unos 100 a 200 ml de agua y se disuelve. Se afora el matraz a la marca y se agita para homogenizar la solucin. Se guarda en un FRASCO CON TAPON DE GAUCHO. NO SE DEBE UTILIZAR FRASCO CON TAPON ESMERILADO, pues los hidrxidos de potasio y sodio disuelven el vidrio y se sellan los frascos. Sulfato de zinc 33% Sulfato de zinc 33 grs. Agua destilada.aforar a 100 ml. Disolver el sulfato de zinc en el agua destilada en un matraz de vidrio adecuado utilizando un agitador magntico. Ajustar a la gravedad especfica () a 1.18 por la adicin de sulfato de zinc o agua destilada, segn sea el caso. En el caso de muestras frescas formalinadas usar sulfato de zinc con gravedad especifica () de 1.20. Aforar y guardar el frasco de vidrio con tapn de rosca. Marcar el nombre del reactivo, la concentracin y la fecha de caducidad de doce meses posterior a la fecha de elaboracin. Almacenar a 4 C. Checar la gravedad especifica ante de usar. Verde de malaquita 3% Se disuelven 3 g de verde de malaquita en 100 ml de agua y se guarda en frasco mbar con tapn esmerilado. Xilol 25% Se disuelven 25 ml de xilol en 100 ml de agua destilada y se guarda en frascos con tapn hermtico no metlico. 191 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

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GLOSARIO DE TRMINOS
AGENTE ETIOLOGICO: Factor o elemento de naturaleza viva o inerte, que inicia o perpeta un proceso morboso. AGENTE INFECCIOSO: Organismo (bacteriano, rickettsioso, viral, mictico, protozoario o helmntico) capaz de producir una infeccin o una enfermedad infecciosa. ANTROPOFILIA: Apetencia selectiva de ciertos artrpodos por la sangre humana. (Ej.: Pediculus capitis). ARACNIDO: Artrpodo con 4 pares de patas. ARTROPODOS: Invertebrado con patas articuladas y esqueleto quitinoso. AXOSTILO: Estructura rgida de posicin axial que constituye el sostn de algunos protozoos flagelados. BIOTOPO: Lugar o rea donde vive una especie. Est caracterizado por factores del suelo, climticos y biolgicos. BOTRIUM: Surco longitudinal que sirveun como elemento de fijacin en el esclex de cestodos seudofilideos. Plural: botria. CALCIFICACION METASTASICA: Calcificacin patolgica que se produce en tejido necrosado. CICLO EVOLUTIVO: Etapas secuenciales del desarrollo de un parsito. Si existen fases sexuales, comprende desde el cigoto hasta la generacin de gametos, o desde el huevo hasta el estado adulto. CICLO DE TRANSMISION: Etapas por las cuales pasa un parsito desde el husped infectado hasta un husped susceptible. COLONIA: Grupo de organismos unicelulares que viven en asociacin, a menudo derivado de una sola clula. COMENSALISMO: Relacin simbitica en la cual una especie, el comensal, vive a expensas de otra especie, el hospedero, sin ocasionarle ningn dao. CONTAMINACION: Presencia de agentes infecciosos en objetos (ropa, instrumentos, juguetes), sustancias inanimadas (agua, leche, alimentos) o en la superficie de organismos vivos. CTENIDIO: Peine caracterstico de la cabeza y porcin anterior del trax en las pulgas. CONTACTO: Individuo (humano o animal) que ha estado en asociacin con un individuo infectado, teniendo la oportunidad de adquirir la infeccin. CONTAGIO: Transferencia directa del agente infeccioso desde la fuente de infeccin al nuevo husped. CONTROL: Conjunto de medidas para reducir la prevalencia o incidencia de una enfermedad o infeccin. DEPOSICION: Evacuacin intestinal. 192 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA DEYECCION: Descarga o deposicin de materias excrementicias, especialmente fecales. DIARREA: Eliminacin de deposiciones con mayor contenido de agua que lo normal (contenido normal de agua: 85%). DISENTERIA: Evacuacin frecuente de deposiciones, generalmente en escasa cantidad las cuales contienen sangre y mucosidades. Por lo general traduce inflamacin del colon y se acompaa de dolor abdominal, pujo y tenesmo. ECTOPARASITO: Parsito que vive en la superficie externa del hospedero. EMBRIOFORO: Cubierta que rodea a la oncsfera de los platelmintos. ENDOPARASITO: Parsito que vive en el interior del hospedero. ENFERMEDAD: Conjunto de fenmenos que se producen en un organismo a consecuencia de la accin de una causa patgena, reaccionando contra ella. ESCOLEX: Organo de fijacin o "cabeza" de un cestode. ESTROBILA: Conjunto de progltidas de un cestode. EXUVIA: Muda resultante de las ecdisis. ECOLOGIA: Estudio de las relaciones recprocas entre los organismos y las regiones donde viven. EMBRIOFORO: Membrana (s) que envuelve (n) al estado embrionario de los cestodes (oncosfra), cuyo conjunto constituye el huevo. ENCUESTA: Conjunto de acciones destinadas a lograr una informacin sobre un objetivo determinado. ENCUESTA EPIDEMIOLOGICA: Conjunto de mtodos usados para obtener datos que sirvan para caracterizar un fenmeno en una comunidad. Orienta y permite obtener informacin sobre la prevalencia de casos clnicos, portadores, contactos y susceptibles, o bien, sobre el factor o factores causales o vinculables al proceso que se investiga. ENDEMIA: Prevalencia elevada y mantenida de una enfermedad humana determinada dentro de un rea geogrfica. ENZOOTIA: Prevalencia elevada y mantenida de una enfermedad animal determinada dentro de un rea geogrfica. EPIDEMIA: Produccin, en una comunidad o regin, de casos similares en un determinado perodo, en nmero claramente superior a la frecuencia habitual y derivados de una fuente comn o por diseminacin. EPIZOOTIA: Lo mismo que epidemia, pero referido a animales. INESPECIFICIDAD. Porcentaje de casos en que la reaccin resulta falsamente positiva. ESPOROGONIA: Fase de reproduccin sexuada de los esporozotos. ESPOROZOO: Protozoo parsito que se reproduce por esporogonia. 193 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA ESPOROZOITO: Elemento resultante de la esporogonia de los esporozoos. ESQUIZOGONIA: Ciclo de reproduccin asexuada de los esporozoos. ESQUIZONTE: Elemento resultante del ciclo esquizognico. ESTROBILA: Conjunto total de progltidas que constituyen el cuerpo de un cestode. EXCRETAS: Productos de desperdicios lquidos y slidos procedentes de seres humanos y de animales. FOMITE: Objeto (agua, aire, toalla, etc.) que contiene elementos infectantes y pasivamente puede ser vehculo mecnico en su transmisin indirecta. FORMA INFECTANTE: Fase del parsito capaz de infectar el husped. FRECUENCIA: Nmero de veces que se ha verificado o registrado un suceso o una caracterstica determinada en una poblacin. FUENTE DE INFECCION: Persona, animal, vegetal o sustancia desde la cual el agente infeccioso pasa al husped. GAMETOGONIA: proceso de reproduccin sexuada de los esporozoos. GEOHELMINTIASIS: Infecciones trasmitidas por helmintos que requieren del suelo y ciertas condiciones ambientales favorables para llegar a ser infectantes. HABITAT: Lugar donde en forma natural vive un ser biolgico. HECES: Materias fecales. HELMINTO: Nombre genrico de los vermes parsitos y que abarca acantocfalos, nematodos, cestodos y trematodos. HUESPED: Persona o animal que alberga a un agente o comensal. Tambin suelen utilizarse los trminos hospedador, hospedero y mesonero. HUESPED DEFINITIVO: Hospedero en el cual el parsito alcanza su madurez sexual. HUESPED INTERMEDIARIO: Hospedero en el cual el parsito desarrolla parte de su ciclo evolutivo, sin alcanzar su madurez sexual. ICTIOFAGO: Animal que se alimenta de peces. IMAGO: Artrpodo adulto. Se usa especialmente en el caso de insectos. INFECCION: Entrada y desarrollo o multiplicacin de un agente infeccioso en el organismo de una persona o animal. INFESTACION: Alojamiento, desarrollo y reproduccin de artrpodos en la superficie del cuerpo, pelos, ropas objetos e incluso ambientes. Se emplea tambin en el caso de roedores. INSECTO: Artrpodo con 3 pares de patas. INCIDENCIA: Nmero de casos nuevos de una enfermedad que se presentan durante un perodo determinado, en relacin con la poblacin donde ocurren. Generalmente se expresa en forma de tasa. 194 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA INSECTICIDA: Sustancia qumica, natural o sinttica, utilizada en el exterminio de artrpodos. Se puede aplicar en forma de polvo, lquido, pulverizado, o aerosol. LARVA: Forma inmadura en el ciclo evolutivo de helmintos y artrpodos. LIENTERIA: Diarrea que contiene alimentos sin digerir. LETALIDAD: Relacin entre el nmero de casos mortales y el nmero total de casos de una determinada enfermedad. LETRINA: Instalacin para la recepcin de excretas humanas. MECANISMO DE TRANSMISION: Las circunstancias mediante las cuales el parsito pasa de un husped a otro. MEROZOITO: Clula resultante del proceso de esquizogonia o divisin mltiple que presentan algunos protozoos. METAZOO: Animal Pluricelular. MORBILIDAD: Relacin entre el nmero de afectados de una enfermedad determinada y la poblacin total de una zona. MORTALIDAD: Relacin entre el nmero de muertos por todas las causas y la poblacin total de una zona. MUDA: (ECDISIS): Vaina o tegumento que envuelve a artrpodos y a algunos gusanos (nematodos) y que en las etapas juveniles, de crecimiento, se desprende dando lugar a una nueva envoltura que puede desprenderse a su vez o ser definitiva. MUTUALISMO: Tipo de simbiosis en la cual se benefician recprocamente hospedero y simbionte. MYASIS: Parasitacin de rganos o tejidos humanos o animales por larvas de mosca. NEMATELMINTO: Son gusanos de seccin redonda (algunos son parsitos). NINFA: Estadios juveniles tanto de insectos con metamorfosis incompleta como de caros y garrapatas. ONCOSFERA: Larva con seis ganchitos que emerge de los huevos de los eucestodos. Tambin se llama hexacanto. OOQUISTE: Forma qustica que contiene el cigoto resultante de la esporogonia en los Apicomplexa y los cuales pueden estar cubiertos por una envoltura translcida (Isospora) o estar desnudos (Plasmodium). OOTECA: Receptculo elaborado por las hembras de algunos artrpodos en cuyo interior depositan sus huevos (Ej.: cucarachas y araas). OPERCULO: Cubierta o tapa de los huevos de algunos platelmintos e insectos. PARASITO: Ser que vive a expensas de otro de distinta especie llamado husped y al cual puede producir dao de magnitud variable. PARASITO ACCIDENTAL: Parsito que se encuentra en un husped no habitual.

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MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA PARASITO FACULTATIVO: Es aquel que desarrolla algunos protozoarios y hongos que viven sobre materias orgnicas en descomposicin, pero en ocasiones parasitan sobre heridas, ulceraciones, etc. PARASITO OBLIGADO: Es aquel que necesariamente en alguna etapa o permanentemente ejerce su accin parasitaria. PARASITO PERIODICO: Parsito que cumple parte de su ciclo en el ambiente y en el husped. PARASITO PERMANENTE: Parsito que vive toda su existencia en o sobre su hospedero. PARASITO TEMPORAL: Parsito que intermitentemente depende de un hospedero para subsistir y luego lo abandona. PERIODO PREPATENTE: Etapa de la infeccin parasitaria comprendida desde el momento de la infeccin hasta la aparicin de la sintomatologa o la presencia del parsito. PLATELMINTO: Gusano de seccin plana, todos son parsitos (excepcin planarias). PORTADOR (INFECTADO ASINTOMATICO): Individuo que alberga un agente infeccioso especfico, sin presentar manifestaciones de enfermedad y que puede ser fuente de infeccin para otros individuos. PROGLOTIDA: Segmento de la estrbila de los cestodos, la cual contiene los rganos reproductores masculinos y femeninos. PROTISTA: Agente biolgico con caracteres del reino vegetal y animal (hongos, bacterias y virus). PROTOZOO: Animal unicelular. PERIODO DE INCUBACION: Intrvalo que transcurre entre la infeccin de un sujeto susceptible (persona o animal) y el momento que presenta las primeras manifestaciones de la respectiva enfermedad. PESTICIDAS: Sustancias qumicas que se usan para combatir distintas plagas (Ej.: insecticidas, rodenticidas, moluscocidas, herbicidas). PREDADOR: Ser que ataca y destruye animales o plantas para obtener alimento; habitualmente organismos ms pequeos y ms dbiles que constituyen su presa. PREVALENCIA: Nmero de casos de una infeccin o enfermedad que existe en un grupo especfico de poblacin en un momento determinado. PREVENCION: Medidas para proteger al hombre o animales contra una enfermedad. Pueden ser independientes de las destinadas al control. PROFILAXIS: Conjunto de medidas que sirven para prevenir o atenuar enfermedades o dolencias, o sus complicaciones o secuelas. PUPA: Etapa en la metamorfosis de los dpteros, caracterizada por la existencia de un pupario en cuyo interior se producen importantes cambios que culminan con la formacin del imago o insecto adulto. 196 LIC.T.M. DAVID G. QUISPE ARANDA

MANUAL DE PRACTICAS DE PARASITOLOGIA QUISTE: Forma inmvil de resistencia y de multiplicacin, envuelta por una doble membrana formada por los protozoos. RESERVORIO (DE AGENTES INFECCIOSOS): Hombre, animal, planta, suelo o materia orgnica inanimada, en los cuales el agente infeccioso vive y se multiplica, y de los que depende principalmente para su subsistencia, de manera que pueda ser transmitido a un husped susceptible. RESISTENCIA: Conjunto de mecanismos que algunas especies tienen para defenderse de la invasin o multiplicacin de agentes patgenos, o contra los efectos nocivos que pueden causar los productos txicos, ya sea producidos por stos o de otra procedencia. (Ejs.: resistencia del hombre a algunos microorganismos; resistencia de algunos microorganismos a antibiticos y quimioterpicos; resistencia de algunos artrpodos a insecticidas). SANEAMIENTO: Aplicacin de procedimientos especiales para procurar que los factores del medio resulten impropios para mantener o vehiculizar agentes o causas de enfermedades. SANEAMIENTO AMBIENTAL BASICO: Adecuado suministro de agua potable, disposicin de excretas y eliminacin de basura. SENSIBILIDAD (DE UNA REACCION INMUNODIAGNOSTICA): Porcentaje de resultados positivos encontrados en individuos afectados por una determinada infeccin. SEROLOGIA (REACCION): Reaccin inmunodiagnstica de laboratorio que se practica en el suero de un sujeto sospechoso con el objeto de detectar anticuerpos y/o antgenos producidos frente a una determinada infeccin. SIMBIOSIS: Condicin en la cual dos seres vivos de diversas especies, habitualmente (pero no necesariamente) viven juntos, con beneficio para uno o para ambos. SUSCEPTIBLE: Persona o animal que carece de resistencia contra un agente patgeno y que en consecuencia puede contraer la enfermedad si se expone a la infeccin por dicho agente. TROFOZOITO: Forma vegetativa activa y que se alimenta, entre los protozoos. VECTOR: organismo animal, generalmente artrpodo, que puede transportar activamente un agente desde la fuente infectante hasta un susceptible. VECTOR MECANICO: Es el vector que lleva en el exterior de su cuerpo o en interior agentes patgenos. VIA DE INFECCION: Sitio (s) a travs de los cuales se introduce el agente etiolgico en el organismo del husped. XENO: Husped. ZOONOSIS: Infeccin que se transmite en forma natural entre el hombre y animales vertebrados y viceversa

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ALGORITMOS DIAGNOSTICOS

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ALGORITMO DIAGNOSTICO TRYPANOSOMIASIS

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DIAGNOSTICO TRYPANOSOMIASIS CONGENITA

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PUZZLE PARASITOLOGIA

m o a m s a l p o x o

n m a x j s l e v o t

a u t r i c h u r i s

b i r s a a n a n t i

e d i r g r q r e e n

o o a r a i g r c n i

m m t d h s c t a i m

a t n e v s s a l p i t o m a l v r i a a a a o c r u m x n o c z b q g l v i l u y i l m i i l t o r a s o a y e v t l o h c s e d

entamoeba plasmodium quiste cruzi huevo nana toxoplasma hominis tenia trichuris

necator triatoma coli strongyloides chagas giardia ascaris vivax lamblia stercoralis

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EXAMEN PRACTICO:.
COLOQUE EL NOMBRE DE LA ESTRUCTURA(s) PARASITARIA(s) QUE OBSERVA EN EL MICROSCOPIO ( CAMPO O PUNTERO ) Y/O METODO O COLORACION UTILIZADA (SEGN INDIQUE EL DOCENTE) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. NOMBRE ALUMNO : .. FECHA :

NOTA

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ATLAS PARASITOS

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