INSTITUTO TECNOLGICO DE MORELIA JOSE MARA MORELOS Y PAVON

ANALISIS INSTRUMENTAL INGENIERIA BIOQUIMICA IV SEMESTRE PRACTICA INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA ANALISIS CROMATOGRAFICOS DE AMINOACIDOS PROFESORA: ELIA PEREZ HERNANDEZ

NOMBRE DE LOS ALUMNOS: Juan francisco bocanegra Lpez Fedra Navarrete Irra

FECHA: 26 DE NOVIEMBRE DEL 2013

INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA ANLISIS CROMATOGRFICO DE AMINOCIDOS A. Introduccin En el anlisis instrumental qumico es necesario previamente separar los componentes de la mezcla de sustancias presentes en nuestra muestra para as obtener un analito libre de interferencias, por lo que es necesaria la aplicacin de una serie de mtodos y tcnicas eficientes que nos permitan obtener nuestros analitos de inters en el mayor grado de pureza e integridad. Una tcnica ya clsica es la Cromatografa que se define como un mtodo de separacin basado en la distribucin selectiva de los diferentes componentes entre dos fases inmiscibles. La separacin ocurre segn el tipo de interaccin entre los componentes de la muestra con respecto a las fases, una estacionaria y otra mvil. Esta interaccin puede ser de diversos tipos y esto da a lugar a las diferentes categoras de cromatografas: de absorcin, reparto, intercambio inico, afinidad, etc. En la presente prctica se aplica la tcnica ms sencilla, la cromatografa de particin ascendente, donde una hoja de papel de celulosa funciona como soporte de la fase estacionaria, las fases mvil y estacionaria son una mezcla de solventes y agua. En todas las separaciones cromatografas, las molculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una mvil. Dependiendo del tipo de fase estacionaria podemos distinguir: cromatografa en papel, cromatografa en capa fina, o cromatografa en columna. La separacin depende de la tendencia relativa de las molculas en la mezcla de asociarse con ms fuerza a una o a otra fase.

B. Competencias especficas Conoce un mtodo de separacin cromatografa til para la separar e identificar pequeas molculas orgnicas como los aminocidos. C. Objetivos Describir y aplicar un protocolo de cromatografa en papel para separar e identificar una mezcla de aminocidos. D. Material y Reactivos Papel Whatman No. 1 Aminocidos a 3mg/mL 1 Pipeta Pasteur Ninhidrina 0.1% con piridina 0.2% en etanol Tijeras Butanol c. Actico: agua 3:1:1 Soporte universal Vaso de pp. de 600 mL Pipeta de 10 mL Lpiz Regla de 30 cm Atomizador Vidrio de reloj Plstico autoadherible Horno Pinzas de madera Guantes de ltex

E. Desarrollo experimental. 1. Corte una hoja de papel filtro con el alto de la base interna del vaso de precipitados de 600 mL a 0.5 cm de la boca del vaso. El ancho se debe considerar el permetro interno del vaso ya que se realizar un cilindro con el papel como se muestra en la figura 3. 2. Encienda el horno y ajuste a 805C la temperatura de revelado. 3. Trace con lpiz una fina lnea de inicio a 1 a 2 cm del volumen de solvente en el extremo inferior de la hoja de papel (ver fig. 3A). 4. Divida a equidistancias y con marcas muy finas la posicin para la aplicacin de cada muestra a lo largo de la lnea con el lpiz. 5. Con el apoyo de pipetas Pasteur vierta una alcuota de 3 mm de dimetro de cada uno de los aminocidos, deje secar por aeracin. 6. Una los extremos verticales del papel con las manchas ya secas y engrpelos para formar un cilindro con las muestras hacia el exterior y quedando en la parte inferior (ver fig. 3B). 7. Vierta una alcuota de 25 mL de la mezcla eluyente en el vaso de precipitados de 600 mL, y en seguida tape el vaso con el plstico autoadherible y el vidrio de reloj. 8. Coloque el cilindro con las muestras aplicadas en un solo movimiento y sin que entren en contacto el papel y las muestras con la pared del vaso o la tapa. Enseguida se tapa la cmara y se deja estar hasta que el solvente haya migrado hasta el extremo superior. 9. Una vez terminada la corrida, se remueve el cilindro y se transfiere al horno por 5 min para su secado con el apoyo de las pinzas de madera. 10. Se retira y se transfiere el cilindro con el apoyo de las pinzas de madera a una campana de extraccin donde por medio del atomizador se aplica la solucin reveladora de ninhidrina, cubriendo la cara externa y sin exceso. 11. Transfiera al horno por 5 min para su secado con el apoyo de las pinzas de madera. 12. Una vez reveladas las manchas se miden las distancias de migracin respecto a la distancia de aplicacin y el centro de la mancha, as como la distancia de la marca de lpiz y la migracin del solvente (en mm).

13.Anote sus resultados y observaciones.

F. CUESTIONARIO 1. Usando la cromatografa terminada introduzca la informacin requerida en la siguiente tabla, considerando el clculo de los valores de Rf (frente de referencia) para cada uno de los aminocidos componentes. (mm) solvente por el migrada Distancia

Rf=

(mm) aminocido por el migrada Distancia

AMINOACIDOS

DISTANCIA MIGRADA (mm) 17 45 36 52

Fenilalanina Alanina Glicina Lisina

DISTANCIA MIGRADA POR EL SOLVENTE (mm) 100 100 100 100

Rf

6.32 2.073 2.453 2

2. Cul es la relacin entre la solubilidad de los aminocidos y la distancia que viajan en la cromatografa en papel? La relacin entre la distancia recorrida por una aminocido con la distancia que viaja el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicacin de la mezcla de aminocidos, se designa como valor Rf (movilidad relativa con el solvente) de ese aminocido. Rf = Distancia corrida por la muestra 3. El fundamento y generalidades de la reaccin de revelado de la ninhidrina con los aminocidos. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminocidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formacin de amoniaco y anhdrido carbnico, con reduccin del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina (Figura 1). La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molcula de ninhidrina para dar un compuesto de adicin doble que presenta una coloracin azul-prpura, con la excepcin de la prolina que da una coloracin amarillenta (recordar que en la prolina el grupo amino est sustituido). El derivado coloreado presenta mximo de absorcin en torno a 570 nm. La reaccin se lleva a cabo en caliente y a valores de pH comprendidos entre 4 y 8. Las aminas primarias (R CH2-NH) dan tambin positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera

CO2. La tcnica es muy sensible, por lo que es ideal para detectar concentraciones bajas de aminocidos, utilizndose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras tcnicas de separacin. La presencia de aldehdos resultantes de la degradacin de la ninhidrina por reaccin con los aminocidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminocido.

4. Tcnicas instrumentales para la separacin de aminocidos. Tcnicas para aislar aminocidos Los a.a. son liberados de las protenas mediante una hidrlisis. Un hidrolizado proteico, obtenido por coccin con HCl 6N, presenta una mezcla de a.a. Para el conocimiento proteico es muy importante identificar y cuantificar los a.a., lo que es hoy en da logrado por mtodos cromatogrficos. Cromatografa:

En todas las separaciones cromatografas, las molculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una mvil. Dependiendo del tipo de fase estacionaria podemos distinguir: cromatografa en papel, cromatografa en capa fina, o cromatografa en columna. La separacin depende de la tendencia relativa de las molculas en la mezcla de asociarse con ms fuerza a una o a otra fase.

Cromatografa en papel Aunque es sustituda en gran parte por tcnicas ms sofisticadas, esta tcnica todava encuentra aplicacin en la separacin de a.a. Las muestras se aplican en un punto marcado aprox. A 5 cm del extremo de una tira de papel filtro, y sta se suspende en un recipiente sellado que contiene el solvente cromatogrfico (para a.a. son mezclas de agua, alcoholes y cidos o bases, constituyendo la fase mvil). La fase movil asciende por capilaridad. Cuando ha avanzado hasta el otro extremo, la tira se seca y se trata para permitir la visualizacin de las molculas de inters (ej.: para a.a. se trata con ninhidrina al 0.5% en acetona, seguida de calentamiento de 90-100 C durante unos minutos). Los a.a. con grandes cadenas laterales no polares (Leu, Ileu, Fen, Trip, Val, Met, Tir) migran ms que que aquellos con cadenas laterales ms cortas no polares (Pro, Ala, Gli) o con cadenas laterales polares (Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lis, Cis). Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las molculas polares en la fase estacionaria hidroflica, y de las molculas no polares en solventes orgnicos. La relacin entre la distancia recorrida por un a.a. con la distancia que viaja el solvente, medidas ambas desde el sitio marcado para la aplicacin de la mezcla de a.a., se asigna como valor Rf (movilidad relativa con el sustrato) de ese a.a. La movilidad puede expresarse en relacin a la de un estndar. Cromatografa en capa fina Es muy similar a la cromatografa en papel, pero se utiliza como fase estacionaria unos soportes adsorbentes como celulosa pulverizada o gel de slica, incorporados en capa fina sobre una placa de vidrio. La cromatografa en capa fina de adsorcin se aplica a sustancias apolares, como lpidos, no as a a.a. ni la mayora de los peptidos. Cromatografa de intercambio inico En el anlisis de los residuos de a.a. despus de la hidrlisis de un polipptido, se utiliza generalmente la cromatografa de intercambio inico. Esta tcnica explota principalmente las diferencias en el signo y en las magnitudes de las cargas elctricas netas de los a.a. a un determinado valor de pH, las cuales son predecibles a partir de los valores de pK a o de sus curvas de titulacin. La columna cromatogrfica consiste en un tubo largo relleno de partculas de una resina sinttica, que contiene grupos cargados fijos; las que contienen grupos aninicos se denominan resinas de intercambio catinico (ej.: resina con grupos SO3-) y las que contienen grupos catinicos, resinas de intercambio aninico. La afinidad

de cada a.a. por la resina est afectada por el pH (que determinar el estado de ionizacin de la molcula) y la concentracin de iones salinos, que pueda competir con la resina por asociacin con el a.a. Se puede, por lo tanto, conseguir la separacin ptima de los a.a. mediante un cambio gradual del pH o de la concentracin salina de la solucin que se pase a travs de la columna, de manera que se cree un gradiente de pH o de sal. Una mejora moderna de sta y otras tcnicas cromatogrficas se denomina cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC). Esta tcnica aprovecha una resina ms fuerte y un aparato mejorado diseado de forma tal, que permite la cromatografa a alta presin, lo que conduce a mejores separaciones en un tiempo mucho ms corto. En el caso de los a.a. todo el procedimiento est automatizado, de modo que la elucin, coleccin de fracciones, anlisis de cada fraccin y registro de los datos se lleva a cabo de manera automtica en un analizador de a.a. 5. Casos de sustancias separadas e identificadas por cromatografa de papel y de capa fina (Investigue artculos cientficos). Una placa de CCF es una lmina de vidrio, metal o plstico recubierta con una capa delgada de un slido adsorbente (gel de slice o almina). Se deposita una pequea cantidad de la muestra problema en disolucin en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta cromatogrfica, de forma que slo la parte inferior de la placa queda sumergida en el lquido. Este lquido o eluyente es la fase mvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad. A medida que el eluyente pasa por el lugar donde est la mancha de la mezcla problema se establece un equilibrio entre las molculas de cada uno de los componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que se encuentran en disolucin. En principio, los componentes se diferenciarn en solubilidad y en la fuerza de su adsorcin, de forma que unos componentes se desplazarn ms que otros. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa, esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.
Si los compuestos son coloreados se pueden observar las manchas a simple vista. Si no es as, hay varios mtodos para visualizar las manchas correspondientes a cada componente de la mezcla.

1. Utilizar luz ultravioleta (UV254) para observar la placa. Normalmente se adiciona un colorante fluorescente al adsorbente, de forma que la placa sea fluorescente en todas partes excepto donde haya una mancha correspondiente a un compuesto orgnico. 2. Utilizar reveladores, por ejemplo, vapores de yodo que es un reactivo inespecfico. 3. Emplear reactivos especficos para desarrollar coloracin en las manchas. Esto se puede hacer sumergiendo la placa de CCF en una disolucin que los contenga o en forma de spray.

Cromatografa en columna Es una tcnica de purificacin, puesto que permite aislar los compuestos deseados de una mezcla. Procedimiento La cromatografa en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un soporte slido adsorbente (fase estacionaria: los ms utilizados son gel de slice (SiO2) y almina (Al2O3)). La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase mvil) que, por efecto de la gravedad, hace mover la muestra a travs de la columna. Se establece un equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecer interacciones diferentes con la fase estacionaria y la mvil, sern transportados a diferentes velocidades y se conseguir su separacin. As, de manera similar a otros tipos de cromatografa, las diferencias en las velocidades de desplazamiento a travs del medio slido se corresponden con diferencias en los tiempos de elucin por la parte inferior de la columna para cada uno de los componentes de la muestra original, que se recogern en fracciones diferentes. La polaridad del eluyente afecta las velocidades relativas con las que los diferentes componentes de la mezcla se mueven en la columna. Los disolventes polares compiten ms eficientemente con las molculas polares de una mezcla por los lugares polares del adsorbente. Por lo tanto, un disolvente polar desplazar las molculas, incluyendo las ms polares, rpidamente a travs de la columna. Si el disolvente es muy polar la elucin ser muy rpida y generalmente habr poca separacin de los componentes de la mezcla. Si por el contrario el disolvente es muy apolar, no eluirn los compuestos de la columna. Por lo tanto, la eleccin del eluyente es crucial para el xito de la cromatografa en columna. A menudo se utiliza un gradiente creciente de polaridad para la elucin. La CCF se utiliza para determinar y elegir el sistema solvente adecuado para cada separacin.

BIBLIOGRAFIA: http://acemucsc.galeon.com/articulos/Bioquimica/aminoacidos.htm http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdfht tp://www.buenastareas.com/ensayos/Cromatografias/2877389.html