Universidade Federal da Paraba Centro de Cincias Agrrias Programa de Ps-Graduao em Cincia Animal

ISOLAMENTO E CULTIVO CELULAR

Ayodhya Ramalho

HISTRICO DA CULTURA CELULAR

Tcnica desenvolvida para estudar o comportamento de

clulas animais fora do organismo.

1907 Harrison Provar que fibras nervosas eram formadas a partir de clulas

1912 Carrel Clulas cardacas Descobriu a necessidade da troca da fonte de nutrientes

1951 George Gey HeLa 1962 Nakamura et. al VERO

SISTEMAS BIOLGICOS

ISOLAMENTO VIRAL
OVOS ANIMAIS EMBRIONADOS SUSCEPTVEIS

CULTIVOS CELULARES

SISTEMAS BIOLGICOS
VANTAGENS
SENSIBILIDADE MTODO PADRO DE

DESVANTAGES
LENTO CUSTO REALIZAO COMPLEXA

DIAGNSTICO
DETECO DE VRUS

DESCONHECIDO
CONTROLE DAS

NO APLICVEL A

ALGUNS VRUS CONDIES AMBIENTAIS

AMOSTRA CLNICA - COLETA

AMOSTRA CLNICA ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE

LABORATRIO

Identificao Recipientes estreis Refrigerao a 4C (maiores perodos: -70 C ou gelo

seco) Manter as amostras midas em meios apropriados

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
INCIO DO ISOLAMENTO VIRAL

FINALIDADES: AMPLIFICAO DO AGENTE; PRODUO DE VACINAS; CONHECER A FORMA CLNICA DA DOENA; TESTAR A SEGURANA DE VACINAS.
Incio do sculo: bovinos eram inoculados com o vrus da febre aftosa no epitlio lingual.

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
DESVANTAGENS:
ALTO CUSTO DE

MANUTENO;
BAIXA

REPRODUTIBILIDADE DA ENFERMIDADE;
IMUNIDADE PRVIA DOS

ANIMAIS;
USO DESNECESSRIO DE

ANIMAIS ANTITICO

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
CAMUNDONGOS
PROVA BIOLGICA PARA

O DIAGNSTICO DA RAIVA
OCASIONALMENTE

UTILIZADOS PARA DIAGNSTICO DO VRUS DA FEBRE AFTOSA

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
VIA DE INOCULAO DEPENDE DO TIPO DE VRUS

QUE SE PRETENDE ISOLAR

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
VIA DE INOCULAO DEPENDE DO TIPO DE VRUS

QUE SE PRETENDE ISOLAR

ANIMAIS SUSCEPTVEIS
EFEITOS DA REPLICAO VIRAL

OVOS EMBRIONADOS
o INCIO DO SC. 20
o VRUS DA GRIPE E VAROLA

o GRANDE DIFUSO ANTES

DO DESENVOLVIMENTO DOS CULTIVOS CELULARES

o VRUS DA INFLUENZA A E A

MAIORIA DOS VRUS AVIRIOS

OVOS EMBRIONADOS
VIAS DE INOCULAO

OVOS EMBRIONADOS
EVIDNCIAS DO EFEITO:
MORTE; POUCO

DESENVOLVIMENTO;
FORMAO DE

VESICOPSTULAS NA MEMBRANA CARIOALANTIDE

OVOS EMBRIONADOS
EVIDNCIAS DO EFEITO

Vrus da laringotraquete de galinhas Poxvrus avirio em um flamingo Vrus ectromelia - varola murina

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

1948 Primeiro isolamento de vrus em cultura (Weller & Enders) 1990 Avanos nos mtodos de cultivo celular in vitro.

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ISOLAMENTO E IDENTIFICAO COM FINS DIAGNSTICOS

USO EM TESTES SOROLGICOS

PRODUO DE VACINAS

PRODUO DE ANTGENOS PARA IMUNIZAO DE ANIMAIS

PRODUO DE ESTOQUES VIRAIS PARA ESTUDOS DA PATOGENIA

OBTENO DE ESTOQUES VIRAIS PARA CARACTERIZAO BIOLGICAE MOLECULAR

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS
VERO - clulas de rim de macaco verde;

ESCOLHA DO MELHOR TIPO CELULAR A SER USADO DEPENDE DE:

Especificidade viral;

SK 6 - clulas de rim de suno PK15 - clulas de rim de suno MDBK clulas de rim de bovino; MDCK clulas de rim de co; BHK clulas de rim de Hamsters Baby.

Linhagem celular; Nmero de passagem dentro da

linhagem.

CRIB clulas resistentes infecco com

vrus da diarreia bovina

CRFK clulas do rim felino Crandell RK-13 - clulas do rim de coelho HeLa clulas de tecido tumoral

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

Clulas HeLa

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS
MDBK, SK-6, PK15, BT, CULTIVOS PRIMRIOS DE PULMO, CORNETO NASAL, RIM E TESTCULO DE BOVINO
BVDV

BOVINOS

ADENOVRUS BOVINO, HERPESVRUS BOVINO TIPO 1 E 5, PARAINFLUENZA BOVINA, VRUS DA FEBRE AFTOSA . . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS
BTV

OVINOS E CAPRINOS

BHK-21, VERO

ECTIMA CONTAGIOSO, ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA, PNEUMONIA PROGRESSIVA DOS OVINOS MAEDI-VISNA . . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS

ED, PBMC EQUINO, FIBROBLASTOS DA DERME EQUINA

EQUINOS

EIAV

ENCEFALOMIELITE EQUINA, INFLUENZA EQUINA, ARTRITE VIRAL EQUINA . . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS

PK-15, SK6, MDBK, CULTIVOS PRIMRIOS DE ORIGEM SUNA

SUNOS

PRV

ADENOVRUS SUNO, PESTE SUNA CLSSICA, PARVOVRUS SUNO . . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS
CV-1, BHK-21, VERO, HeLa E CULTIVOS DE FIBROBLASTOS DE EMBRIO DE GALINHAS
BabV

CANINOS E FELINOS

PARVOVRUS CANINO, CORONAVRUS CANINO, ROTAVRUS CANINO. . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ESCOLHA DAS CLULAS UTILIZADAS GALINHAS E OUTRAS AVES
CULTIVOS PRIMRIOS DE RIM DE EMBRIO DE GALINHAS E DE FIBROBLASTOS DE GALINHAS E BHK-21
NDV

DOENA DE GUMBORO, VRUS DA DOENA DE MAREK, POXVRUS AVIRIO. . .

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

RECIPIENTES

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

MEIOS DE CULTIVO BME Basal de Eagle EMEM Mnimo de Eagle MCDB fibroblastos humanos

SUPLEMENTAO SORO FETAL BOVINO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

INCLUIR SEMPRE O CONTROLE CULTIVO PRIMRIO
RGO FRESCO DE UM EMBRIO OU FETO

SUBMETIDO A UM PROCESSO MECNICO E ENZIMTICO

FRACIONAMENTO DO TECIDO E INDIVIDUALIZAO CELULAR

CULTIVO EM FRASCOS OU GARRAFAS

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

CULTIVO PRIMRIO
ADESO, MULTIPLICAO E FORMAO DE UMA MONOCAMADA

Clulas aderentes Clulas no aderentes

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

CULTIVO PRIMRIO
CULTIVO EM MEIO NUTRITIVO + PROMOTORES DO CRESCIMENTO (37)

SUBCULTIVOS PERIDICOS

INDIVIDUALIZAO DA MONOCAMADA PELA AO ENZIMTICA, RESSUSPENSO E SEMEADURA EM NOVOS FRASCOS DE CULTIVO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

CULTIVO PRIMRIO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

CULTIVO PRIMRIO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

CULTIVO PRIMRIO SUBCULTIVOS

PASSAGENS

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

LINHAGENS CELULARES / LINHAGENS CONTNUAS
DERIVADAS DE CLULAS TUMORAIS OU TECIDOS NORMAIS

QUE SOFRERAM TRANSFORMAO IN VITRO

Pode ser mantido em cultura por um grande perodo de tempo (quando

comparado s clulas primrias)

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

INOCULAO

DEPOSIO DO MATERIAL SUSPEITO SOBRE AS MONOCAMADAS

INCUBAO

MONOCAMADA LAVADA

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

REPOSIO DO MEIO DE CULTIVO

INCUBAO

OBSERVAO DIRIA DAS MONOCAMADAS

AVALIAO DO EFEITO CITOPTICO (ECP)

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

PRESERVAO
Risco de contaminao Perda das caractersticas Alteraes genticas

Contaminao cruzada
Alto custo

CRIOPRESERVAO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ECP
A PRESENA DE ALGUNS VRUS

PODE SER REVELADA PELAS ALTERAES DEGENERATIVAS QUE ELES INDUZEM NAS CLULAS INFECTADAS

HEMADSORO
ALGUNS VRUS ALTERAM A

SUPERFCIE DA CLULA INFECTADA CONFERINDO-LHE AFINIDADE PARA HEMCIAS

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

INTERFERNCIA VIRAL
VRUS QUE NO INDUZEM ECP SO POSTOS EM EVIDNCIA

RECORRENDO SUA CAPACIDADE DE INTERFERIR COM A REPLICAO DE UM SEGUNDO VRUS (INDICADOR), QUE POSSUI ECP CARACTERSTICO

HEMAGLUTINAO
VRUS QUE PRODUZEM PROTENAS HEMAGLUTINANTES

PODEM SER POSTOS EM EVIDNCIA ADICIONANDO SUSPENSO DE HEMCIAS

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ECP
FORMAO DE CLULAS GIGANTES MULTINUCLEADAS (SINCCIOS)

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ECP
ARREDONDAMENTO CELULAR
Adenovrus

(a) Clulas de camundongo no infectadas (b) As mesmas clulas 24h aps infeco com o vrus da estomatite vesicular superposio

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

ECP
FORMAO DE CORPSCULOS DE INCLUSO

ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

OUTROS ECP
LISE CELULAR VACUOLIZAO CITOPLASMTICA PICNOSE

VRUS NO-CITOPTICOS CIRCOVRUS SUNO (PCV 2)

INTRODUO
Influenza / gripe aviria (Orthomyxovirus) diferentes

tipos de epitlios que expressam o receptor de hemaglutinina

Transmisso Epitlio respiratrio avirio estudos especficos sobre

a funo so escassos obteno de culturas primrias/ausncia de linhas celulares especficas

INTRODUO
Peru epitlio de revestimento da traqueia ou clulas da

traqueia em cultura primria:

CILIADO, PODEM SER INFECTADOS POR VRUS E MONTAR UMA RESPOSTA IMUNE

CLULAS DIFCEIS DE MANTER IN VITRO PERDA DAS CARACTERPISTICAS CELULARES

INTRODUO
OBJETIVO
PREPARAR E MANTER EM CULTURA CLULAS EPITELIAIS DO

PARNQUIMA DO PULMO DE GALINHA E COMPARAR AS SUAS PROPRIEDADES COM PNEUMCITOS TIPO II DOS MAMFEROS

MATERIAIS E MTODOS
VRUS
INFLUENZA AVIRIA A DE PATOGENICIDADE

H6N2 H9N9 H1N1 H5N9

ESTOQUES VIRAIS FORAM PREPARADOS EM OVOS

EMBRIONADOS

MATERIAIS E MTODOS
LINHAGENS CELULARES DE AVES
FIBROBLASTOS DF1 DE EMBRIES E HEPATCITOS LMH

ISOLAMENTO DE CLULA EPITELIAL DE PULMO

REMOO DOS PULMES 5-7 SEMANAS BRONQUIOS DESCARTADOS PICADO EM PEDAOS MANUTENO EM MEIO ADEQUADO UTILIZAO DA CLULAS ADERENTES

MATERIAIS E MTODOS
1. 2.

COLORAO HISTOLGICAS

COLORAO DE IMUNOFLUORESCNCIA
3. 4.

MICROSCOPIA ELETRNICA

TIPAGEM DE MHC gentipo do locus

5.

EXPRESSO DE COLECTINAS E RNAm TLR

6.

CURVA DE CRESCIMENTO DO VRUS (produo)

7.

QUANTIFICAO DE RNAsm DE CITOCINAS CELULARES

RESULTADOS E DISCUSSO
CLEC213

MICROSCOPIA DE LUZ

COLORAO COM ANTICORPOS MONOCLONAIS DE RATO, ESPECFICOS PARA E-CADERINA E PAN-CITOQUERATINA

RESULTADOS E DISCUSSO
Vacolos

citoplasmticos
Vacolos corados

(corante peridico de Schiff) - contedo polissacardico ou mucopolissacardico

Atividade da FA

RESULTADOS E DISCUSSO
Clulas cubides Superfcie celular

irregular com microvilosidades

Clulas com estreito

contato e junes apertadas

Corpos lamelares

RESULTADOS E DISCUSSO
Fenotipagem do MHC Passagens 30, 91 e 141 apresentaram resultados semelhantes As clulas epiteliais de mamfero podem expressar vrias

TLRs que lhes permitem responder a diferentes tipos de agentes patognicos.

Encontrados nas clulas epiteliais do pulmo de frango Deteco de genoma RNA viral ou intermedirios da replicao

Deteco da protena no estrutural NS1 antagonista

da viral da resposta antiviral celular

RESULTADOS E DISCUSSO
Presena da NS1 do vrus foi revelada pela tcnica de

imunofluorescncia.

RESULTADOS E DISCUSSO
H6N2 Induo de citocinas Expresso muito elevada do gene de IFN- Expresso elevada do gene de IL-8 Expresso do gene para o TGF - 4 Expresso mais baixos para LITAF ( via TNF ) e os receptores de quimiocinas CCL5. A expresso de IL-1 e o gene CCL4 foi ligeiramente induzida pela infeco viral

A resposta imune foi caracterizada por uma elevao substancial a expresso no gene de IFN

O padro de expresso de citocinas foi em boa concordncia com o que observado no epitlio do pulmo de mamferos

RESULTADOS E DISCUSSO
Ainda no se sabe se o epitlio respiratrio das aves

esto crucialmente envolvidos na iniciao da resposta imunolgica como nos mamferos.

Expresso de genes que codificam colectinas para a

galinha (CLL e CSPA) identificados como os anlogos de protenas surfactantes pulmonares.

Vacolos cheios de polissacridos uma atividade secretria do

CLEC213.

CONCLUSES
Clulas epiteliais de pulmo infectados com o vrus da

gripe deve ser capaz de participar ativamente na resposta imunitria.

Conseguimos estabelecer uma nova linha de clulas

epiteliais de pulmo de galinha.