EXTRACCIN Y VERIFICACION DE EFECTO HIPERCROMICO DE ADN OBTENIDO A PARTIR DE TEJIDO VEGETAL Y ANIMAL Gelen Adriana Ruiz Rodrguez, e-mail:

gruizr@unadvirtual.edu.co Tutora: Patricia Joyce Zorro Reacciones qumicas naturales Universidad Nacional Abierta y a Distancia Resumen Este reporte seala la forma en que se extrae ADN de dos tejidos vegetales, banano y cebolla, y de hgado como tejido animal, muestras de ADN a partir de las cuales se explora su comportamiento ante la interaccin con temperatura, solucin cida como HCl y solucin bsica dada por el reactivo Biuret, para ello se compara la reaccin de cada caso con la interaccin que tiene la clara de huevo que conserva la globulina ante las mismas situaciones. En las comparaciones se aprecia como el ADN, de varios fuentes tanto de tejido animal como vegetal, debe verificar la ausencia de protena luego del proceso de extraccin. El desarrollo de la prctica se lleva a cabo como parte del componente prctico del curso reacciones qumicas naturales que apoyado en cursos como biologa y bioqumica nos permiten consolidar temticas relacionadas con la estructura de la molcula de ADN, su conformacin dada a partir de los pares organizados por las bases nitrogenadas adenina, timina, guanina y citosina que definen la 2 hlices que se mantienen enrolladas entre s por puentes de hidrogeno para conformar la molcula cuyo proceso de extraccin nos permite observar la fragilidad que conlleva, inicialmente, el tratamiento mecnico que llega a definir la eficacia del procedimiento para la obtencin de la hebras sobre las cuales se aplican las pruebas de caracterizacin que permiten la comparacin entre la protena albumina del huevo y el ADN extrado que presupone la eliminacin, durante la extraccin, de su carcter proteico. El proceso de extraccin inicia con la seleccin y separacin aproximada de 5 cm3 de cada uno de los tejidos que para el desarrollo de la prctica fueron banano, cebolla cabezona e hgado, para cada uno de los cuales se lleva a cabo el proceso mecnico de rompimiento del tejido por licuado, proceso que con el hgado se realiza por un minuto de forma intermitente con el fin de abrir el tejido evitando que llegue a romperse el ADN mientras que para los tejidos vegetales debido a que debe romperse la pared celular, propia de las clulas vegetales, los tiempos de cambio entre el encendido y el apagado de la licuadora pueden ser mayores en comparacin al tejido animal. En todos los casos el objetivo inicial es obtener pur sobre el cual se agrega una cantidad proporcional de buffer carbonato, previo enfriamiento en bao de hielo, mientras se mezcla suavemente con agitador de vidrio por cerca de 2 minutos para luego ser llevado a centrifuga por 3 minutos, proceso del cual se utiliza una porcin de 5ml de la mezcla que se lleva a un tubo de ensayo con adicin de 10 gotas de acetato de sodio 3M y de 10mL de etanol frio, teniendo precaucin de hacerlo deslizando el solvente por las paredes del tubo, generando la formacin de dos capas en cuya interfase se depositan las hebras de ADN del respectivo tejido tratado que se extraen con un elemento delgado y puntiagudo que minimice el riesgo de romperlo al ser llevado a tubos de ensayo para la realizacin de las pruebas de caracterizacin cuyos resultados son

comparados con el comportamiento que muestra la albumina presente en la clara de huevo, sin embargo por el bajo material obtenido se procedi a disponer del ADN de banano para la pruebas de caracterizacin frente a una solucin de carcter cido como el HCl y la prueba a bao mara, con el fin de observar su comportamiento frente al aumento de temperatura. El ADN de cebolla cabezona se utiliza para la observacin de su comportamiento frente a una solucin de carcter bsico como el reactivo Biuret. El material obtenido del hgado se dispuso para la medicin de la absorbancia. El desarrollo de las dos primeras pruebas, medio cido y temperatura, se lleva a cabo distribuyendo el ADN obtenido del banano en 2 tubos de ensayo, ms 2 ml de agua en cada uno, tubos que llamo A1 y A2, mientras que en otros 2 tubos de ensayo, que llamo B1 y B2 se agrega aproximadamente 0.5 ml de clara de huevo en cada uno. A los tubos 1 se agrega 2ml de HCl 0.1M, mientras se procede a prestar atencin a las reacciones que se produzcan, as, en el tubo A1 con ADN, las hebras que se lograron sacar para la prueba se disolvieron completamente en el cido mientras que en el tubo B1 la solucin adquiere un color blanco, en forma de un gran granulo, que se debe a la desnaturalizacin que sufre la protena albumina. Por su parte, los tubos de la serie 2 se llevan a bao mara en agua invierno por 2 minutos, tiempo en el que se observa que en el tubo A2 la forma del ADN como minsculos grnulos, perdieron la consistencia gelatinosa que tenan las hebras en la solucin mientras que en el tubo B2 no hay parte lquida visible, se observa al fondo del tubo de ensayo la albumina de consistencia slida.

A1
a

B1

B2

A2

b Figura 1a. Prueba con HCl 1b. Prueba bao mara

Por su parte, en la serie 3 de los tubos de ensayo se utiliza uno para la ubicacin del extracto de ADN de la cebolla y en el otro, B3, los 0.5 ml de albumina ms 5 gotas de
reactivo de Biuret en cada tubo, tapndolos y agitndolos durante un minuto, tiempo en el que en el tubo A3 la coloracin de la solucin se

mantiene azul-verdosa, indicando que la prueba es negativa, al tiempo que en el tubo B2 al aplicar Biuret la solucin adquiere una coloracin Violeta, es decir la prueba es positiva para la existencia de protenas.

A3

B3

Figura 2. Prueba Biuret

Precisamente, la anterior descripcin de los resultados evidenciados en las figuras 1a, 1b y 2 por la comparacin entre la clara de huevo y los extractos demuestra el desprendimiento proteico de las molculas de ADN aunque ello implique la obtencin de un mnimo de producto, para el caso ADN, indicando que para pruebas de mayor nivel el manejo del tejido inicial podra ser mayor.

En una ltima prueba se utiliza el extracto de ADN del hgado para analizar otro efecto de la temperatura, ahora respecto al efecto hipercrmico, es decir a la capacidad que tiene el ADN de absorber luz a 260nm debido al rompimiento de los puentes de hidrogeno que provoca la separacin de las hebras por el aumento de la temperatura, sin embargo debido a que no fue posible la medicin de dicha absorbancia para la verificacin del efecto hipercrmico, por inconsistencia con el equipo, se utilizan datos tericos para el desarrollo del presente informe:
Medio Tubo a temperatura ambiente Tubo calentado a 90C y enfriado en un bao de hielo. Tubo a 90C y enfriado lentamente. Absorbancia (260 nm) 0.456 0.598 0.472

proceso en el que observar el comportamiento, en este caso de los tejidos, del extracto de ADN, del solvente y de la temperatura, se convierten en indicadores de la correcta ejecucin de la prctica.
Referencias
Torres, Golda. Mdulo: bioqumica I. Captulo 5: cidos nucleicos. Universidad nacional abierta y a Distancia. Escuela de ciencias bsicas tecnologa e ingeniera. Duitama. Enero de 2013. Zorro, Patricia. Mdulo: Reacciones qumicas naturales. Universidad nacional abierta y a Distancia. Escuela de ciencias bsicas tecnologa e ingeniera. Bogot. Junio de 2012. La extraccin y purificacin del ADN para el anlisis por PCR. Formato PDF. Consultado el 25 de septiembre de 2013. Disponible en http://www.microbialsystems.com/web/docs/Newsletter_Microbial_03.pdf M. Somma. Anlisis de la Presencia de Organismos Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesin n 4: Extraccin y Purificacin de ADN. Consultado el 25 de septiembre de 2013. Disponible en http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manual s/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell. Bioqumica. Desnaturalizacin del ADN. Pg 245. Formato PDF. Disponible en books.google.com.co

Tabla 1. Resultados evaluacin efecto hipercrmico en extracto de ADN de higado

Los datos de la tabla 1 permiten deducir los cambios que se dan entre las hlices que conforman la hebra de ADN, debido a que tericamente luego de calentar, lo que produce el rompiendo los puentes de hidrogeno, estos se reestablecen cuando la solucin madre regresa a su temperatura de equilibrio, sin embargo este restablecimiento se afecta con un choque trmico como lo es enfriar el tubo con un bao de hielo luego de haberlo calentado a 90C, es decir que aun cuando no ocurra en un 100% el re-establecimiento de la molcula de ADN, esta se beneficia con un proceso de enfriamiento lento, el choque trmico producido por el hielo no permite que se reestablezcan los puentes de hidrogeno por tanto hay ms absorcin de luz. As, los resultados y el desarrollo de los diferentes pasos en el procedimiento permiten al estudiante llevar a cabo un