Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
COLECCIN Textos Universitarios Publicaciones Vicerrectorado Acadmico Manual prctico de bacteriologa clnica Primera edicin, 2008
Lster Rodrguez Herrera Humberto Ruiz Caldern Mario Bonucci Rossini Nancy Rivas de Prado PUBLICACIONES VICERRECTORADO ACADMICO Humberto Ruiz Caldern Luis Ricardo Dvila Yelliza A. Garca A. Toms Bandes Asdrbal Baptista Rafael Cartay Mariano Nava Romn Hernndez Gregory Zambrano COLECCIN Textos Universitarios Mara del Carmen Araque Raquel Flores Bernardo Fontal Hebert Lobo Josena Pea Marlene Pealoza Iris Perdomo Jos Villalobos
Vicerrector Acadmico
Vicerrector Administrativo
Secretaria
Judith Velasco, Mara del Carmen Araque, Emma Araujo, Aurora Longa, Beatriz Nieves, Ana Carolina Ramrez, Kiralba Snchez, Elsa Velazco.
Concepto de coleccin y diseo de portada
Director
Katalin Alava
Coordinacin editorial
Asistencia editorial
Consejo editorial
Editorial Venezolana C. A.
HECHO EL DEPSITO DE LEY
Depsito Legal: LF23720085891416 ISBN: 978-980-11-1157-3 Prohibida la reproduccin total o parcial de esta obra sin la autorizacin escrita del autor y el editor Universidad de Los Andes Av. 3 Independencia Edicio Central del Rectorado Mrida, Venezuela publicacionesva@ula.ve http://viceacademico.ula.ve / publicacionesva Los trabajos publicados en la Coleccin Textos Universitarios han sido rigurosamente seleccionados y arbitrados por especialistas en las diferentes disciplinas. Impreso en Venezuela Printed in Venezuela
Comit editorial
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES Autoridades Universitarias Rector Mario Bonucci Rossini Vicerrectora Acadmica Patricia Rosenzweig Vicerrector Administrativo Manuel Aranguren Rincn Secretario Jos Mara Andrez PUBLICACIONES VICERRECTORADO ACADMICO Direccin editorial Patricia Rosenzweig Coordinacin editorial Vctor Garca Coordinacin del Consejo editorial Roberto Donoso Consejo editorial Rosa Amelia Asuaje Pedro Rivas Rosalba Linares Carlos Baptista Tomasz Surez Litvin Ricardo Rafael Contreras Produccin editorial Yelliza Garca A. Produccin libro electrnico Miguel Rodrguez Primera edicin digital 2011 Hecho el depsito de ley Universidad de Los Andes Av. 3 Independencia Edificio Central del Rectorado Mrida, Venezuela publicacionesva@ula.ve publicacionesva@gmail.com www2.ula.ve/publicacionesacademico
Los trabajos publicados en esta Coleccin han sido rigurosamente seleccionados y arbitrados por especialistas en las diferentes disciplinas
Prefacio
Las enfermedades infecciosas en los ltimos tiempos han mantenido un lugar preferencial en el rea mdica, sobre todo por la aparicin de enfermedades virales como el SIDA y el resurgimiento de cuadros infecciosos que se crean controlados como la tuberculosis. Por otra parte, el uso indiscriminado de antibiticos de amplio espectro ha incrementado la resistencia a los antimicrobianos y la circulacin de cepas multirresistentes en los ambientes hospitalarios, situacin que diculta el manejo de pacientes hospitalizados. Es por ello, que el clnico recurre al laboratorio de Microbiologa con el nico propsito de obtener resultados conables y en el menor tiempo posible. En tal sentido, el presente manual se ha diseado de manera que sirva de texto gua para los estudiantes de Bioanlisis que cursan la asignatura Microbiologa clnica y aplicada e, igualmente, de texto de consulta rpida de los profesionales del laboratorio de Microbiologa. Tiene por objetivo mostrar los recursos y tcnicas convencionales para el diagnstico de algunas de las enfermedades infecciosas ms frecuentes; se hace nfasis en los procedimientos a seguir de acuerdo a la impresin clnica inicial, aislamiento, identicacin, pruebas de susceptibilidad de los microorganismos involucrados, interpretacin y reporte de los resultados. Las metodologas descritas se presentan en una forma clara y sencilla, su presentacin grca en forma de guras a color facilita la comprensin global de las tcnicas utilizadas para el diagnstico microbiolgico. La elaboracin del presente manual es producto del conocimiento y experiencia de varios profesionales del rea de microbiologa adscritos al Departamento de Microbiologa y Parasitologa de la Facultad de Farmacia y Bioanlisis de la Universidad de Los Andes. Es importante mencionar, que en los ltimos aos se han desarrollado nuevas tecnologas que escapan al objetivo de este manual, pero que pueden ser consultadas en otras bibliografas especializadas.
prctica 1
Objetivo general
Introducir al estudiante en la aplicacin de conocimientos tcnico-cientcos para el diagnstico microbiolgico de las enfermedades infecciosas.
Objetivos especficos
1. Describir la importancia clnica y microbiolgica de las diferentes etapas que conforman el procesamiento microbiolgico de una muestra clnica y su relacin con el xito o fracaso en el diagnstico de las enfermedades infecciosas. 2. Reforzar las destrezas prcticas adquiridas en Microbiologa general, en cuanto a la realizacin de tcnicas de coloracin e inoculacin de medios slidos para aislamientos primarios.
Aspectos tericos
El diagnstico de las enfermedades infecciosas se realiza sobre la base de los signos y sntomas clnicos que presenta el paciente, los datos epidemiolgicos y la demostracin del agente causal o las huellas que ste ha dejado en el sistema inmunolgico del individuo. (1) El papel del laboratorio de microbiologa clnica consiste en determinar la presencia de patgenos potenciales en los tejidos, los lquidos corporales o las secreciones de los pacientes, e identicarlos en caso de que estn presentes. Este servicio es indispensable para el mdico tratante, porque la informacin acerca de la identidad del patgeno
PRctica 1
es de importancia primordial para predecir el curso de la infeccin y orientar o decidir la conducta teraputica ms apropiada. Esta informacin puede obtenerse por medio de cuatro formas posibles: (1,2) El cultivo y la identicacin de los microorganismos a partir de muestras clnicas. El examen microscpico de la muestra clnica. La medicin o cuanticacin de la respuesta inmune especca para el patgeno en el paciente. La deteccin de molculas especcas de los patgenos en las muestras de los pacientes.
La extensin y la conabilidad de la informacin que puede proporcionar el laboratorio varan de acuerdo con la naturaleza del patgeno. Algunos de ellos son fciles de detectar, cultivar, identicar y caracterizar (Escherichia coli); otros requieren medidas extraordinarias tan slo para detectar su presencia (Helicobacter pylori). Sin embargo, las capacidades del laboratorio de microbiologa clnica se estn ampliando y perfeccionando aceleradamente, gracias a los avances tecnolgicos y cientcos en el campo de la biologa molecular, han permitido introducir, cada vez ms rpido, nuevos mtodos diagnsticos en la prctica clnica. La principal conexin entre el mdico y el laboratorio de microbiologa clnica es la muestra que se recolecta y se enva para su procesamiento.(1-3) Es por ello, que la recoleccin correcta de una muestra clnica para su cultivo es la etapa ms importante en el aislamiento exitoso de un microorganismo responsable de una determinada enfermedad infecciosa (Fig. 1).
10
Figura 1. Estudio microbiolgico de una muestra clnica Tomado de: Mims y col., 1995
11
PRctica 1
Una muestra decientemente recogida puede ser motivo de confusin al momento de aislar el agente etiolgico. La recuperacin de grmenes contaminantes puede conducir a un diagnstico microbiolgico equivocado y, en consecuencia, a la instalacin de una terapia incorrecta, que en algunos casos puede agravar el cuadro clnico del paciente. Por otro lado, se debe tener en cuenta que la piel y todas las supercies de las mucosas estn normalmente colonizadas por una ora habitual. Sin embargo, con frecuencia estas supercies pueden adquirir una ora transitoria o, incluso, ser colonizadas por patgenos potenciales provenientes del medio ambiente. En consecuencia, se deben emplear procedimientos especiales que permitan distinguir los verdaderos microorganismos implicados en un proceso infeccioso, de aquellos provenientes de la ora saprta y/o de los que son colonizadores anormales que no estn causando ninguna infeccin (Tablas 1 y 2).
TABLA 1. Algunos sitios de infeccin y sus posibles fuentes de contaminacin con flora saprfita
Sitio de infeccin Vejiga Sangre Cuello uterino y endometrio Fstula Odo medio Infecciones subcutneas y heridas superciales Tracto respiratorio superior Fuente de contaminacin Uretra y perineo Sitio de puncin Vagina Tracto gastrointestinal Piel del conducto auditivo externo Piel y mucosas Cavidad oral y nasofarnge
Para orientarnos a resolver este problema debemos considerar lo siguiente: (1-4) 1. La obtencin de lquidos normalmente estriles (sangre, LCR, etc.) por aspiracin con aguja percutnea debern ser precedidos siempre por una exhaustiva descontaminacin de la piel. Por lo tanto, se debern extremar los cuidados de asepsia y antisepsia en aquellas reas normalmente contaminadas. El alcohol al 70% es satisfactorio para la piel, sin embargo, debe dejarse actuar, por lo menos, 2 minutos. El yodo (2%) y la povidona yodada son muy efectivos y de actividad rpida (1 minuto) contra todos los microorganismos, incluso, los formadores de esporas. 2. Realizar cultivos cuantitativos que permitan determinar que el microorganismo aislado es el responsable de la patologa infecciosa (contaje de colonias, Ej: urocultivos). Una cuanticacin menos rigurosa puede ser adoptada como rutina, mediante la implementacin de una escala que oscile entre 0 a 4 cruces, o simplemente, expresar el desarrollo de microorganismos como crecimiento escaso, moderado o abundante.
12
3. Considerar la posibilidad de recolectar la muestra en forma seriada y evaluar los cultivos de acuerdo al criterio anterior.
TABLA 2 . Muestras que no deben ser procesadas debido a su cuestionable informacin microbiolgica
Tipo de muestra no adecuada Exudados de heridas por quemaduras Exudados de lceras de decbito Alternativa o comentario Biopsia o aspirado Biopsia o aspirado
Descarga de colostoma No procesar Punta de catter de Foley No procesar Aspirado gstrico en recin nacidos No procesar Loquios No procesar Exudados de absceso perirectal Exudado de lesin gangrenosa Exudado de lesin periodontal Exudado de lesin varicosa Biopsia o aspirado Biopsia o aspirado Biopsia o aspirado Biopsia o aspirado
Vmitos No procesar
Normas bsicas para la recoleccin correcta de muestras biolgicas 1. La muestra para cultivo debe proceder, de ser posible, del verdadero sitio de la infeccin y deber recogerse con un mnimo de contaminacin de tejidos, rganos o secreciones adyacentes. 2. Se establecern los perodos ptimos para la recoleccin de las muestras de acuerdo al proceso natural de la enfermedad y del microorganismo posiblemente involucrado. Esto se realiza con la nalidad de aumentar las posibilidades de recuperar y aislar el agente etiolgico. 3. Obtener la suciente cantidad de muestra para llevar a cabo todas las pruebas y tcnicas de cultivo solicitadas. 4. Utilizar dispositivos de recoleccin, recipientes para las muestras y medios de transporte adecuados para asegurar el ptimo aislamiento de los microorganismos. 5. Siempre que sea posible, se debern obtener las muestras clnicas antes de la administracin de antibiticos. 6. El envase o los dispositivos de recoleccin de muestras clnicas debern estar correctamente rotulados y fechados.
13
PRctica 1
Localizacin del proceso infeccioso. Tcnica y material utilizado para colectar la muestra. Medio de transporte en el cual la muestra es colocada. Tiempo transcurrido entre la toma de muestra y su procesamiento en el laboratorio. Transporte de muestras biolgicas
El principal objetivo del transporte de muestras clnicas dentro y fuera de un hospital, es la preservacin del material biolgico lo ms semejante a su estado original, con un mnimo de deterioro y sin riesgos de contaminacin para quien manipula estas muestras (Tabla 3).
Sin preservar
Lquido abdominal, lquido amnitico, lquido biliar, aspirado transtraqueal, material profundo de heridas, aspirado sinusal, biopsia, orina, aspirado suprapbico. Raspado corneal, hemocultivo, secrecin uretral y humor vtreo. Tejido seo, hisopado cervical, hisopado conjuntival, secrecin de odo externo, hisopado vaginal, hisopado nasofarngeo, exudado de tracto respiratorio superior.
Medio de transporte
Biopsia de heridas, secrecin de odo externo, muestras de heces en donde se sospecha la presencia de Shigella sp., Vibrio sp. y Yersinia sp.
En la actualidad se dispone de una variedad de recipientes para la recoleccin y transporte de muestras clnicas tales como: placas de Petri, jeringas y agujas para aspiracin, tubos o viales con medio de transporte, sistema de tubo plstico con medio
14
de transporte e hisopo para bacterias aerobias y anaerobias (Culturette SystemR BBL), sistema de bolsas biolgicas para bacterias microaerlas estrictas y anaerobios (Pouch SystemR Difco), entre otras. Sin embargo, el equipo de recoleccin de muestras ms utilizado es el hisopo de madera con punta de algodn, alginato o dacrn. La seleccin del tipo de hisopo estar determinada de acuerdo al microorganismo en sospecha en la muestra clnica. Una vez recolectada la muestra, el hisopo es introducido en el medio de transporte. Este procedimiento suministrar la humedad suciente a la muestra hasta por 72 horas. Los medios para el transporte de muestras ms utilizados y que permiten la viabilidad de la mayora de los patgenos son: el medio de Stuart, Cary-Blair y el de Amies. Estos medios semislidos tienen un ph regulado y son esencialmente una mezcla de sustancias tamponadas que carecen de factores de crecimiento. Se les adiciona un agente reductor como el tioglicolato de sodio para mejorar la recuperacin de bacterias anaerobias. En otros casos, se aconseja agregar borato de sodio para preservar el transporte de muestras donde se sospecha la presencia de micobacterias. Es importante destacar que aunque los hisopados son la forma ms comnmente utilizada para el envo de muestras, se preere que la muestra sea enviada en la mayor cantidad posible (una jeringa o en un vial), de manera que se pueda garantizar su procesamiento para la mayor cantidad estudios y tcnicas bacteriolgicas. Asimismo, si se sospecha que los microorganismos son escasos, cuanto mayor sea la muestra, mejores sern las probabilidades de aislar el patgeno involucrado.(5) En los captulos subsiguientes que conciernen a la actividad prctica de laboratorio, se describen los mtodos de recoleccin y el manejo de las muestras clnicas de acuerdo al proceso infeccioso y al rea anatmica involucrada. Procesamiento de las muestras clnicas Toda muestra que se recibe en el laboratorio de microbiologa se debe examinar visualmente o microscpicamente a n de evaluar si es adecuada para su posterior procesamiento. Si hay evidencia de que la muestra ha sido recogida incorrectamente, si hay cantidad insuciente de material, si el recipiente es inadecuado o si hubo excesiva demora en el envo, se debe recomendar la recogida de una segunda muestra. El examen microscpico de las muestras clnicas es de gran importancia. No slo puede convalidar la calidad de las muestras, sino tambin, identicar algunos patgenos por sus caractersticas morfolgicas, movimientos o propiedades de tincin particular. En ciertas infecciones el diagnstico microscpico es altamente sensible y especco (Tabla 4). Tambin representa una tcnica rpida que permite que el mdico inicie un tratamiento sin tener que esperar los resultados del cultivo.
15
PRctica 1
Angina de Vincent. Bronconeumona o neumona bacteriana. Tuberculosis. Micosis pulmonar. Celulitis bacteriana, furunculosis. Heridas quirrgicas infectadas, lceras de decbito, entre otras. Mionecrosis. Micetoma. Meningitis bacteriana. Meningitis criptocccica. Infeccin urinaria bacteriana. Leptospirosis. Gonorrea. Infeccin no gonoccica. Candidiasis.
Secrecin uretral o cervical purulenta Exudado de lcera en genitales (chancro) Secrecin ocular o raspado corneal Raspados de piel, fragmentos de uas o pelos
Slis.
El examen en fresco de materiales clnicos sin colorear, por microscopa de contraste de fase o campo oscuro, es til para demostrar la presencia y movilidad de bacterias como las espiroquetas (Treponema pallidum). Muchos patgenos fngicos tambin tienen aspectos morfolgicos caractersticos. De manera notable, la meningitis por Cryptococcus neoformans se diagnostica con mayor rapidez por el hallazgo de la levadura encapsulada en lquido cefalorraqudeo. Mediante la tincin de fondo con tinta china se visualiza la cpsula transparente de la levadura. Si bien los virus no pueden verse con el microscopio ptico, los cambios inducidos por ellos en la morfologa de las clulas hospederas pueden ser diagnsticos. Ejemplos de ello son las clulas gigantes multinucleadas observadas en el material
16
de raspado de las lesiones producidas por el virus herpes simple o el virus de la varicella zoster (frotis de Tzanck) y los cuerpos de inclusin intracelular especcos observados en los tejidos activamente infectados por citomegalovirus. Los patgenos bacterianos pueden ser visualizados y agrupados de forma morfolgica y funcional utilizando tinciones especiales como la de Gram o la coloracin de Ziehl Neelsen. La tincin de Gram es rpida y simple de llevar a cabo y puede emplearse en casi todos los lquidos o tejido corporal (el fundamento y los pasos de la tincin pueden consultarse en el Manual prctico de microbiologa general). Esta tincin proporciona tres tipos de informacin bsica: Puede conrmar la presencia de bacterias en un lquido o tejido corporal normalmente estril (LCR, sangre, entre otros). Las propiedades tintoriales y la morfologa de los microorganismos en la muestra o en el cultivo permiten establecer las estrategias de identicacin denitiva del patgeno y la seleccin de los antibiticos a probar en el antibiograma. La observacin de algunos tipos morfolgicos puede ser diagnstica en algunos casos por ejemplo; diplococos gramnegativos intracelulares en polimorfonucleares en muestras de secrecin uretral es altamente sugestivo de Neisseria gonhorroeae.
Las micobacterias poseen una pared celular gruesa y cerosa, de manera que cuando son teidas, por ejemplo, con la coloracin de Ziehl Neelsen, estas son resistentes a la decoloracin al someterse al tratamiento con potentes solventes orgnicos tales como el alcohol cido. En consecuencia, los microorganismos que tienen esta propiedad se llaman acidorresistentes. Un ejemplo caracterstico de este grupo de bacterias son las pertenecientes al gnero Mycobacterium. Aislamiento e identificacin bacteriana por mtodos convencionales El crecimiento e identicacin del agente etiolgico in vitro casi siempre es el recurso diagnstico ms sensible y especco, y por eso es el mtodo ms usual. Casi todas las bacterias de importancia mdica pueden cultivarse fuera del hospedador, en medios articiales de cultivo. Las muestras destinadas al cultivo de microorganismos se pueden dividir en dos tipos, segn su procedencia de sitios estriles o de lugares normalmente contaminados con ora saprta. Es importante tener un conocimiento profundo de los microorganismos aislados comnmente en muestras clnicas no estriles y de los contaminantes frecuentes en muestras provenientes de sitios estriles, para asegurar que todas esas muestras sern tratadas adecuadamente y los resultados interpretados correctamente.
17
PRctica 1
Es posible cultivar la mayora de las especies de bacterias y hongos de importancia clnica en medios articiales, pero no existe un medio de cultivo universal que permita el crecimiento de todas ellas, y hay algunas especies que slo pueden cultivarse en animales de experimentacin (Mycobacterium leprae y Treponema pallidum). Otras bacterias son imposibles de cultivarlas en medios articiales (Chlamydia sp. y Rickettsia sp.) pero se desarrollan muy bien en lneas celulares. Una vez que se detecta el crecimiento bacteriano en un medio de cultivo para aislamiento inicial o primario, debe determinarse la importancia real de la bacteria que se ha aislado. Luego, se continuar con el proceso de obtener cultivos puros a partir de colonias aisladas y la aplicacin de pruebas diseadas para la caracterizacin e identicacin denitiva de la bacteria. Las pruebas exactas y la estrategia metodolgica a seguir varan con los distintos grupos bacterianos, y el nivel taxonmico (gnero, especie o subespecie) de identicacin requerido estar en relacin con la utilidad o importancia clnica que se le d a esa informacin. En la seccin de anexos se describen las pruebas claves requeridas para identicar los principales grupos y especies bacterianas de importancia mdica.(2-5) Los mtodos convencionales para la identicacin de los microorganismos se fundamentan principalmente en: 1. Pruebas bioqumicas: evalan la capacidad metablica de un microorganismo relacionado con: Los sustratos que puede utilizar la bacteria para crecer (hidratos de carbono, aminocidos, entre otros). Las enzimas que posee la bacteria (descarboxilasas, ureasas, peroxidasas, entre otras). Los productos metablicos producidos por las bacterias (cido frmico, succnico, butrico, entre otros). La capacidad para metabolizar azcares por oxidacin o fermentacin. La capacidad de reducir ciertos iones (ferroso a frrico). La capacidad de movilidad por la presencia de agelos. La produccin o no de hemolisinas. El requerimiento o no de ciertos factores especiales para el crecimiento bacteriano (vitamina K, isovitalex, factor V y/o X, entre otros). La produccin o no de algunas toxinas con capacidad virulenta. 2. Pruebas de tolerancia: se reere a la capacidad que pueda tener la bacteria para crecer a distintos tipos de temperaturas, atmsfera, pH, sales presentes en el medio, antibiticos, entre otras. Existen mtodos que utilizando los fundamentos del diagnstico convencional se han diseado para proporcionar resultados rpidos. Entre los ms conocidos tenemos:
18
Sistema API: es, entre los sistemas de identicacin ms rpidos, el ms conocido. Posee un gran nmero de pruebas bioqumicas, las cuales se presentan como sustratos liolizados en una galera de pozos y se requiere slo de un inculo estandarizado a partir de cultivos puros y frescos, y un tiempo de incubacin posterior que depende de la galera de pruebas que se haya escogido. La identicacin se realiza partiendo de un sistema de cdigos que se introducen en una computadora cargada con un software especco y que identica la bacteria mediante un banco de datos. Sistema Sens-Ident: este sistema utiliza placas de microtitulacin y en sus pocillos tienen sustratos liolizados. Este sistema tambin utiliza un inculo estandarizado. Requiere de un tiempo mnimo de incubacin (16 a 18 h) y la lectura se realiza mediante un lector automatizado. Sistema VITEK: el sistema VITEK consta de un mdulo de vaco-sellador, un incubador-lector, un computador, el monitor y la impresora. Permite identicar bacterias hasta en 3 horas. Se utilizan sustratos liolizados y se requiere de un inculo estandarizado, y es en los mdulos del equipo donde se realiza el llenado y sellado de las tarjetas, la incubacin y la lectura. El software proporcionado con el computador es el que analiza las lecturas en cada una de las tarjetas comparndolas con una base de datos, generando de esta forma el resultado de acuerdo con el teorema de Bayes. Sistema MicroScan: este sistema consiste en placas plsticas de microtubos, que llevan incorporados sustratos reactivos para la identicacin de bacterias aerobias, anaerobias y levaduras. Algunas placas tambin incluyen microdilucin en caldo de ciertos antibiticos, lo que permite realizar estudios de sensibilidad. Las placas o paneles de MicroScan contienen sustratos y antibiticos deshidratados. Los microtubos son inoculados con una suspensin del microorganismo estandarizado e incubados a 36 0C por 15 a 18 horas, despus de este perodo puede realizarse una lectura en forma visual a los paneles o usar un sistema automatizado de lectura. En este ltimo caso, el equipo detecta el crecimiento bacteriano o los cambios de color suscitados en los microtubos por diferencias en la transmisin de luz. Las diferencias en las pulsaciones electrnicas son analizadas automticamente por un microcomputador que compara los patrones de reaccin con un programa interno para determinar la probabilidad de identicacin.
Mtodos no convencionales para el diagnstico microbiolgico Inmunodiagnstico. Tambin conocido como serologa diagnstica. Se utilizan pruebas que permiten la interaccin antgeno anticuerpo para diagnosticar enfermedades infecciosas, as como para identicar microorganismos. En el caso de que se realice el diagnstico de infeccin en el hospedero susceptible, este mtodo basado en la serologa presenta una desventaja, que es su carcter retrospectivo, ya que deben transcurrir de 2 a 4 semanas an-
19
PRctica 1
tes de que puedan detectarse en el suero del paciente las IgG producidas como respuesta a la infeccin. Por otra parte, un resultado positivo slo indica que el paciente ha estado en contacto con la infeccin en algn momento del pasado. Sin embargo, las IgM se pueden detectar en perodos ms tempranos de la infeccin (7-10 das), indicando infeccin activa. En este contexto, es importante destacar que la respuesta inmunolgica observada en un paciente depender de la integridad de su sistema inmunolgico. El inmunodiagnstico es el principal mtodo utilizado para el diagnstico de laboratorio de enfermedades virales. Las pruebas para la deteccin de antgenos son como pruebas serolgicas invertidas, en lugar de emplear antgenos microbianos para capturar los anticuerpos especcos en el suero de un paciente, en este caso se emplean anticuerpos de captura para detectar en las muestras clnicas antgenos especcos del microorganismo. En la mayor parte de estas pruebas los anticuerpos de captura se encuentran unidos a un soporte slido, tal es el caso del uso de bolitas de ltex recubiertas con anticuerpos especcos (aglutinacin con ltex) para detectar el material capsular de los meningococos, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus inuenzae y Cryptococcus neoformans, entre otros (Fig. 2). En muchas ocasiones, este panel de pruebas es utilizado en muestras de lquido cefalorraqudeo para establecer el diagnstico precoz de meningitis.(1,4,5) Las pruebas serolgicas usadas ms frecuentemente en el laboratorio para el diagnstico de enfermedades infecciosas son:
20
Mtodos moleculares de diagnstico en enfermedades infecciosas. El uso de la biologa molecular para el diagnstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas se basa en las caractersticas de los cidos nucleicos como cdigos nicos de identicacin de todo ser viviente. El primer paso en el desarrollo de metodologas basadas en tcnicas de biologa molecular se sustent en la deteccin de los cidos nucleicos del microorganismo mediante una sonda. La sonda gentica es una molcula de cido nucleico que, una vez en estado monocatenario y marcada, se puede usar para detectar una secuencia complementaria de ADN hibridndola con ella. Las sondas de oligonucletidos se obtienen a partir de ADN natural, mediante clonacin de fragmentos de ADN en vectores plsmidos apropiados y aislando posteriormente el ADN clonado. Sin embargo, si se conoce la secuencia del gen que interesa, es posible sintetizar la sonda especca que corresponde. Las sondas se pueden marcar con istopos radiactivos o con sustancias que produzcan reacciones de color en condiciones adecuadas.(5-7) La construccin de sondas de virulencia como las toxinas, permite detectar los organismos que portan esos genes en las muestras clnicas, sin necesidad de cultivarlos. Un ejemplo de ello, es la sonda para las enterotoxinas de Escherichia coli o para la toxina de Vibrio cholerae, las cuales se pueden aplicar directamente en muestras de material fecal. En la actualidad el desarrollo de sondas comerciales para el diagnstico de enfermedades infecciosas va en aumento, pero la deteccin de un pequeo nmero de organismos o pocas copias de gen en la muestra clnica es un factor limitante en esta tcnica. Sin embargo, la combinacin de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RCP) con la hibridacin con sondas puede convertirse en el mtodo de eleccin, especialmente para microorganismos cuyo cultivo en el laboratorio resulta lento o difcil.(6,7) La RCP es una tcnica de amplicacin que permite detectar y replicar en forma selectiva una porcin determinada del genoma. La tcnica usa polimerasas de ADN especiales que pueden manipularse mediante cambios alternos en las condiciones de prueba (temperatura) para que se inicie la replicacin en direccin 3 o 5. La especicidad la establecen los cebadores que reconocen sitios especcos en la cadena de ADN, de tal forma que el segmento intermedio entre los cebadores puede replicarse mediante ciclos repetidos de las condiciones de prueba. Cada fragmento recin sintetizado sirve como molde para su propia replicacin, por lo tanto, la cantidad de ADN se duplica en cada ciclo (Fig. 3). Otras tcnicas moleculares utilizadas en el diagnstico de enfermedades infecciosas son: Ribotipicacin PCR ngerprinting
21
PRctica 1
Figura 3. Amplicacin del ADN mediante la reaccin en cadena de la polimerasa Tomado de: Engleberg NC., 1994
1 Actividad prctica
1. Realizar la tincin de Gram en frotis de muestras clnicas asignadas a cada equipo de trabajo. 2. Observar e interpretar los frotis coloreados. 3. A partir de las muestras clnicas asignadas a cada equipo de trabajo, los estudiantes realizarn la inoculacin de las mismas en medios de cultivo slidos para aislamiento primario. 4. En el segundo perodo de prctica, el estudiante evaluar e interpretar los resultados obtenidos en los cultivos primarios.
22
Autoevaluacin
1. Por qu se considera importante conocer la ora habitual del organismo en el momento de realizar estudios microbiolgicos? 2. Existen circunstancias en las que la ora habitual se convierte en patgena? 3. Cules consideraciones previas deberan tenerse en cuenta a la hora de realizar la toma de una muestra clnica? 4. Cul es la importancia estratgica que tiene el examen directo al momento de procesar una muestra clnica? 5. Cul es el fundamento de las pruebas convencionales en el diagnstico de enfermedades infecciosas? 6. Cules son las ventajas y desventajas que tienen los mtodos no convencionales en el diagnstico de las enfermedades infecciosas?
Bibliografa
(1) Drew LW., Cockerill FR, Henry NK. In: Wilson Wr, Sande MA. Current. Diagnosis & treatment in infectious diseases. International Edition. United States: McGraw-Hill Companies; 2001. p. 43-64. (2) Engleberg NC. Principios diagnsticos. En Schaechter M, Medoff G, Eisenstein BI, Guerra H. Mecanismos de las enfermedades infecciosas. 2 ed. Argentina: Editorial Mdica Panamericana; 1994. p. 691-708. (3) Mims CA, Playfair JHL, Roitt IM, Wakelin D, Williams R, Anderson RM. Microbiologa mdica. Espaa: Mosby/Doyma; 1995. p. 17.1-18.15. (4) Murray PR, Rosethal KS, Kobayashi GS, Pfaller MA. Microbiologa mdica. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002. p. 153-170. (5) Montiel F, Lam M. Seleccin, recoleccin y transporte de muestras para el estudio microbiolgico. En Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Tcnicas Mediterrneo; 2001. p. 17-52. (6) Podest O, Sturba E, Casimir L. Mtodos moleculares de diagnstico y seguimiento. En Stamboulian D. Temas de infectologa clnica. Colombia McGraw-Hill Interamericana; 2002. p. 139-58. (7) Ryan KJ, Ray, CG. Principios de diagnstico por laboratorio de las enfermedades infecciosas. En Ryan KJ, Ray CG. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: McGraw-Hill Interamericana; 2004. p. 251-82.
23
prctica 2
Objetivo general
Determinar la importancia clnica y microbiolgica de las pruebas de susceptibilidad.
Objetivos especficos
1. Elaborar correctamente un antibiograma de acuerdo al mtodo de difusin del disco. 2. Conocer los criterios que permiten la escogencia adecuada de los discos de antibiticos a probar en un antibiograma. 3. Interpretar y elaborar correctamente el reporte de un antibiograma.
Aspectos tericos
El aislamiento e identicacin de un agente infeccioso a partir de una muestra clnica proveniente de un paciente, no es suciente para impartir una terapia antiinfecciosa adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han desarrollado mltiples mecanismos que les permiten resistir a la accin de los ms nuevos y potentes agentes antimicrobianos. Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios mtodos para determinar el patrn de susceptibilidad de una bacteria a los antibiticos. Entre los mtodos ms utilizados podemos mencionar: (1) 1. Mtodo de difusin del disco en agar (prueba de Kirby-Bauer). 2. Antibiograma ATB Rapid (bioMrieux). 3. Mtodo de dilucin en caldo o en agar (Concentracin Inhibitoria Mnima [CIM]). 4. Mtodo de la cinta o Epsilmetro EtestR (AB BIODISK).
25
PRctica 2
Otro aspecto importante que se debe tener en cuenta en la realizacin de las pruebas de susceptibilidad, es la eleccin correcta de los antibiticos a probar. A continuacin se sealan algunos criterios que pueden ayudar a seleccionar adecuadamente dichos agentes: (1-3) 1. Microorganismo aislado. 2. Mecanismo de accin del antibitico. 3. Espectro de accin del antibitico. 4. Biodisponibilidad del antibitico en rganos y sistemas (localizacin de la infeccin). 5. Origen o fuente de la infeccin (hospitalaria o extrahospitalaria). 6. Estados siolgicos del paciente (edad, embarazo, entre otros). 7. Estados patolgicos subyacentes (inmunosupresin, tratamiento previo con antibiticos, insuciencia renal o heptica, entre otros). La prescripcin de algunos medicamentos est sujeta en muchas ocasiones a factores o circunstancias inherentes al hospedero. Los antibiticos no son la excepcin. Es por ello, que el microbilogo deber conocer las restricciones que tiene el uso clnico de algunos antibiticos, con el n de elaborar pruebas de susceptibilidad que proporcionen una valiosa informacin. A continuacin, se muestran algunos de los casos en los que el uso clnico de los antibiticos debe evitarse:
El reporte de los resultados de una prueba de susceptibilidad bien realizada, es un instrumento que le permitir al clnico elaborar un plan antibacteriano ecaz contra el
26
patgeno, seleccionando la droga menos txica para el paciente, y con las caractersticas farmacocinticas ms apropiadas segn la naturaleza y gravedad de la infeccin.(4) Fuentes de error ms comunes en la realizacin de un antibiograma 1. Falta del control de calidad de los medios de cultivo a utilizar, patrn de McFarland y los discos de antibiticos. 2. Trabajar con cepas bacterianas que no estn puras. 3. Inadecuada estandarizacin de la concentracin del inculo. 4. Utilizacin de un nmero excesivo de discos de antibiticos por placa. 5. Utilizacin de medios de cultivo no aptos para las pruebas de susceptibilidad. 6. Lectura prematura o extempornea de las pruebas de susceptibilidad. 7. Medicin incorrecta de los halos de inhibicin por una iluminacin deciente o reglilla inadecuada. 8. Incubacin en atmsfera inadecuada. 9. Error en la transcripcin de los resultados en la hoja de reporte.
2 Actividad prctica
El antibiograma El mtodo utilizado con mayor frecuencia para evaluar la sensibilidad de las bacterias a los agentes antimicrobianos es el denominado prueba de difusin del disco. Esta tcnica fue estandarizada por Kirby y Bauer en 1966, de all que dicho mtodo tambin se le conozca con el nombre de prueba de Kirby-Bauer. Es un mtodo sencillo y fcil de realizar en los laboratorios de rutina que slo brinda informacin cualitativa o semicuantitativa sobre la sensibilidad de un microorganismo a un antibitico determinado. Sin embargo, los resultados obtenidos son de gran valor clnico para iniciar, mantener o modicar una antibioticoterapia.(1-3, 7)
Materiales
Placas con agar Mueller Hinton Solucin salina estril Patrn 0.5 del estndar de McFarland Pinzas Asa de platino
Discos de antibiticos Regla milimetrada Tablas de los criterios estandarizados del CLSI. Hisopos estriles
27
PRctica 2
Procedimiento
1. Cepa bacteriana a estudiar: Debe provenir de un cultivo fresco, preferiblemente de un cultivo en agar, de manera que podamos comprobar la pureza de la cepa. 2. Inculo: Se transferirn una o dos colonias del cultivo a un tubo que contenga solucin siolgica estril. En el caso de bacterias exigentes (Ej: especies de Haemophilus, especies de Streptococcus, etc.), las colonias se transferirn a un tubo que contenga caldo Mueller Hinton. En cualquiera de los casos, el crecimiento bacteriano se ajustar a la turbidez del patrn 0.5 del estndar de McFarland. 3. Se introducir un hisopo de algodn estril dentro del tubo que contiene el inculo estandarizado en el paso anterior. El exceso de lquido se eliminar haciendo rotar suavemente el hisopo contra las paredes del tubo. 4. Con el hisopo debidamente humedecido, se inocular en tres o cuatro direcciones toda la supercie de una placa con agar Mueller Hinton, girando sucesivamente dicha placa en ngulos de 900. Se deja secar el inculo a temperatura ambiente durante algunos minutos (no ms de 20 minutos). Nota: El agar Mueller Hinton se suplementar con 5% de sangre de carnero en los casos que se est estudiando la sensibilidad en especies de Streptococcus o Corynebacterium. En cepas de Neisseria y Haemophilus se tendrn en cuenta las recomendaciones del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI, 2007). Nunca utilice agar sangre, agar chocolate, agar tripticasa soya, agar nutriente, agar Luria Bertani, BHI entre otros, para la realizacin de antibiogramas convencionales.
5. Se colocarn con una pinza estril hasta un mximo de 6 discos de antibiticos en forma equidistantes, presionndolos suavemente contra la supercie de agar. 6. Se colocarn las placas a 36 0C, en atmsfera aerbica durante toda la noche. 7. Lectura: Se realizar despus de 18 horas de incubacin. Con una regla milimetrada, se medir la zona clara alrededor del disco de antibitico, el cual se corresponde con la inhibicin del crecimiento bacteriano. Estos datos se compararn con los dimetros de zona establecidos para cada antibitico en las tablas de interpretacin internacional.(6) La interpretacin de los halos de inhibicin nos permitirn expresar los resultados como sensible, sensibilidad intermedia o resistente. Estas categoras indican lo siguiente: Sensible (S): la infeccin debida al microorganismo aislado puede ser tratada apropiadamente con el antibitico a la dosis recomendada, de acuerdo a la gravedad de la infeccin. Sin embargo, para la prescripcin denitiva del medicamento, el
28
mdico tratante tendr en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del antibitico en el tejido o sistema afectado, presentacin del medicamento, edad del paciente, condiciones patolgicas subyacentes o siolgicas, entre otras. Intermedia (I): indica que el antibitico tiene aplicabilidad clnica en sitios corporales donde el antibitico alcance concentraciones teraputicas adecuadas, como es el caso de -lactmicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles de toxicidad pero que garanticen actividad teraputica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la categora intermedia cuando sea posible. Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibitico a las concentraciones teraputicas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que evaden la actividad del antibitico, por lo tanto, la ecacia clnica de ste no es conable. Es recomendable que ante el aislamiento de un microorganismo multirresistente clnicamente signicativo se ensayen otras pruebas de susceptibilidad adicionales (CIM), tal es el caso de cepas de Staphylococcus resistentes a la vancomicina. 8. El reporte de los resultados del antibiograma debe ser realizado en forma clara y precisa y enviados en forma inmediata al mdico tratante. Utilice la siguiente tabla para registrar los resultados obtenidos en el antibiograma: Microorganismo aislado: ________________________________________________________
Disco de antibitico Dimetro en milmetros Interpretacin
Autoevaluacin
1. De acuerdo a los datos suministrados por el profesor y los registrados en la tabla anterior, elabore el reporte del antibiograma:
29
PRctica 2
2. Cul es la nalidad de las pruebas de susceptibilidad? 3. Que signica sensibilidad y resistencia cuando se interpreta un antibiograma? 4. En que casos, las pruebas de susceptibilidad requerirn de medios de cultivos distintos al de Mueller Hinton?
Bibliografa
(1) Baquero E. El antibiograma: bases microbiolgicas para su interpretacin. [serie en lnea] disponible en http//www.OCENETmedicinaysalud.com. Cdigo de documento: 1015491. (2) Cona E. Condiciones para un buen estudio de susceptibilidad mediante test de difusin en agar. Rev Chil Infect 2002; 19 (Supl.2): S77-81. (3) Garca JA, Cantn R, Garca JE, Gmez-Lus ML, Martnez L, Rodrguez-Avial C, Vila J. Mtodos bsicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos 2000. [serie en lnea] disponible en http://www.seimc.org/protocolos/cap11.htm#A. (4) Linares N.C., Devoto F.M., Estrn M.A., Serra H.A., Tessler J. Quimioantibioticoterapia. 2 ed. Argentina: Editor Luis Mara Zieher; 2002. (5) Martnez-Martnez L. El futuro de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21 (supl. 2): 64-71. (6) Clinical Laboratory Standards Institute CLSI (formerly National Committee Laboratory Standards NCCLS). M2-A5 Performance standards for antimicrobial disk susceptibility test. Approved Standard. NCCLS, Wayne. 17 (17), 2007.
30
prctica 3
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico microbiolgico de infecciones del tracto respiratorio superior
Objetivos especficos
1. Reconocer los microorganismos de la ora habitual y los principales patgenos del tracto respiratorio superior. 2. Esquematizar los pasos para la obtencin y procesamiento de muestras del tracto respiratorio superior. 3. Obtener y procesar muestras de exudado farngeo y secrecin nasal. 4. Identicar los patgenos implicados en procesos infecciosos del tracto respiratorio superior. 5. Detectar la presencia de eosinlos en moco nasal. 6. Registrar y reportar los resultados.
Aspectos tericos
El tracto respiratorio (TR) est en contacto directo con el medio ambiente y se encuentra expuesto continuamente a los microorganismos suspendidos en el aire que respiramos. El aparato respiratorio est divido anatmicamente en superior (TRS) e inferior (TRI). EL TRS comprende: la boca, fosas nasales, orofaringe, nasofaringe y senos paranasales. Otra clasicacin incluye al odo medio por la comunicacin estrecha que existe entre ste y la nasofaringe a travs de la trompa de Eustaquio, sin embargo, los procesos infecciosos de odo medio sern considerados en un captulo separado.(1) Diversos mecanismos no especcos protegen el tracto respiratorio de las infecciones, entre ellos, se sealan: los pelos, pasaje contorneado, mucus, inmunoglobulina
31
PRctica 3
A secretora y sustancias antibacterianas como la lisozima presente en las secreciones respiratorias. Los reejos mecnicos como la tos, el estornudo y la deglucin contribuyen con la eliminacin de agentes extraos; por otra parte, la microbiota normal de la nasofaringe y orofaringe previene la colonizacin del tracto respiratorio por microorganismos patgenos (Tabla 6). (2) Las infecciones de vas respiratorias superiores (ITRS) afectan a la poblacin en general, son causa frecuente de consulta mdica, sobre todo en la edad peditrica, provocando ausentismo escolar y laboral. Las ITRS involucran a la cavidad nasal, faringe y senos paranasales. El 80% de estas infecciones son de etiologa viral, en segundo lugar son producidas por bacterias y un reducido nmero de casos son de origen mictico.(2)
Manifestaciones clnicas Rinitis: es la manifestacin clnica caracterstica del resfro comn, se presenta con aumento de la secrecin nasal, la cual suele ser clara y acuosa al inicio, conforme avanza el cuadro puede sobreagregarse una infeccin bacteriana; en estos casos la secrecin se vuelve espesa o purulenta, requiriendo tratamiento con antibiticos. La rinitis alrgica cursa igualmente con aumento de secrecin nasal, necesitndose el diagnstico diferencial que oriente el tratamiento adecuado.(3) Faringitis o amigdalitis: se maniestan con dolor farngeo, eritema y edema de los tejidos afectados; puede existir exudado, petequias hemorrgicas y placas de clulas inamatorias, presentes frecuentemente en la infeccin bacteriana. La observacin de vesculas y lesiones ulcerativas son comunes en las infecciones virales y la
32
Kiralba Snchez
formacin de aftas o placas blanquecinas con base erosionada son compatibles con candidosis farngea.(3) Sinusitis: Posterior a una infeccin nasofarngea, por contigidad puede afectarse una o mas cavidades paranasales. La sintomatologa cursa con obstruccin nasal, rinorrea, dolor facial, cefaleas y ebre. En los nios el sntoma caracterstico es la rinorrea, que simula un resfriado comn. Se debe sospechar de una sinusitis cuando los sntomas perduran por ms de 10 das.(1) Epiglotitis: es una inamacin difusa de la epiglotis y de las estructuras adyacentes, de progresin rpida; en nios la obstruccin es brusca, completa y fulminante de la va area (en un lapso de 30 min.), se acompaa de disnea y cianosis que pone en riesgo la vida del paciente. La epiglotis se visualiza edematosa y de color rojo cereza.(1) Otras manifestaciones menos frecuentes incluyen la formacin de pseudomembranas, constituidas por tejido necrtico, clulas inamatorias y bacterias. Estas formaciones pueden orientar el diagnstico de la difteria farngea o hacia una Angina de Vincent.(3) Etiologa de las infecciones del tracto respiratorio superior El 80% de las ITRS son de etiologa viral. El resfriado comn es causado principalmente por el grupo de los rinovirus y coronavirus. La faringitis aguda en su gran mayora es causada por rinovirus, adenovirus, parainuenza y coxsackie. La causa bacteriana ms frecuente de faringoamigdalitis y, por lo tanto, susceptible de ser tratada con antimicrobianos es Streptococcus pyogenes, responsable de 15 a 30% de las faringitis agudas en nios y de 5 a 10% en adultos.(1) En la tabla 7 se sealan otras bacterias causantes de faringitis, entre stas tenemos a los Estreptococos beta-hemolticos de los grupos C y G que se han asociado a brotes epidmicos de faringitis transmitidas por alimentos, a faringitis endmica en comunidades cerradas donde concurren jvenes y adultos.(4) Otros agentes etiolgicos poco frecuentes lo constituyen: Arcanobacterium haemolyticum, Yersinia enterocolitica, Franciscella tularensis y Neisseria gonorrhoeae, esta ltima debe ser considerada entre los jvenes y adultos como consecuencia del contacto buco-genital.(1) Existen microorganismos que forman parte de la microbiota habitual de la faringe, algunos participan en la etiologa de infecciones del tracto respiratorio bajo, sin embargo, no se consideran patgenos en faringoamigdalitis aguda en pacientes inmunocompetentes; es el caso de H. inuenzae, S. pneumoniae, M. catarrhalis y S. aureus. H. inuenzae es un agente causal de faringitis en nios.(1) En pacientes inmunocomprometidos, se debe informar el hallazgo de Candida sp., bacilos gramnegativos y S. aureus.(1) Tanto en la sinusitis como en otitis media, entre los microorganismos etiolgicos
33
PRctica 3
frecuentemente implicados se seala a: S. pneumoniae, H. inuenzae y, en menor proporcin M. catarrhalis.(1) La Angina de Vincent es producida por una mezcla de bacterias anaerbicas y espiroquetas. Estos cuadros son muy raros y se producen en adultos jvenes.(4)
Rinitis
Faringitis o amigdalitis
Streptococcus pyogenes Estreptococos beta hemolticos grupos B,C,G, Neisseria gonorrhoeae, Arcanobacterium haemolyticum Streptococcus pneumoniae Haemophilus inuenzae Moraxella catarrhalis Streptococcus pyogenes Bacterias anaerbicas Corynebacterium diphtheriae Fusobacterium nucleatum y Borrelia vincenti Haemophilus inuenzae serotipo b Especies de Candida Fusobacterium sp, espiroquetas Streptococcus pyogenes Anaerobios bucales como Fusobacterium sp. Staphylococcus aureus. Bordetella pertussis
Sinusitis
Raros
Pseudomembranas farngeas
Ninguno
Epiglotitis Estomatitis
Ninguno
34
Kiralba Snchez
Diagnstico El objetivo primordial del diagnstico de los ITRS consiste en distinguir los casos de etiologa viral (80-90% de los casos) de los producidos por bacterias para los que se dispone de tratamiento. La investigacin de agentes virales involucrados en ITRS no se practica de rutina, debido a los altos costos y como no son susceptibles de tratamiento no se justica su diagnstico, el cual se reserva para la investigacin de brotes epidmicos.(5) En la tabla 8 se presentan las muestras tiles para el diagnstico de los diferentes cuadros respiratorios.
Se recomienda la toma de hemocultivos Epiglotitis Sangre seriados (3 muestras) Est contraindicada la toma de muestras farngeas o nasofarngeas. Exudado farngeo Difteria y Angina de Raspado de Vincent pseudomembrana Se cultivarn si existe las caractersticas clnicas y epidemiolgicas que orienten a su investigacin
Son muy raros los casos, por lo tanto, Tosferina Hisopado nasofarngeo no se practica de rutina su investigacin, salvo solicitud clnica.
35
PRctica 3
Etapa pre-analtica Los antecedentes del paciente y los factores epidemiolgicos son tiles para orientar el diagnstico etiolgico. Entre stos se deben considerar los datos liatorios: nombre, edad, ocupacin, residencia; la evolucin clnica del proceso (ver manifestaciones clnicas), estado inmunolgico del paciente, procedencia (hospitalizacin o de la comunidad), condiciones socio-econmicas, estilo de vida, exposicin reciente a caso clnico de ITR, tratamientos previos con antimicrobianos, entre otros.(5) Etapa analtica La validez de los resultados del diagnstico microbiolgico depende entre otros factores, de que se sigan correctamente las normas de obtencin y transporte de la muestra y que la solicitud del estudio, sea acompaada de un breve informe con los datos clnicos y epidemiolgicos, que orienten al bioanalista en la seleccin de las tcnicas ms adecuadas, segn el microorganismo que se vaya a investigar. Tanto la obtencin como el transporte de las muestras al laboratorio constituyen un punto clave para conseguir un resultado satisfactorio.
1. Elevar la punta de la nariz con el dedo pulgar. 2. En caso de ausencia de secrecin, humedecer la punta del hisopo en solucin salina estril e introducirlo hasta la base de la fosa nasal, donde se rota suavemente. 3. Retirar el hisopo con cuidado de evitar la contaminacin del mismo con las bacterias de la piel, proceder a realizar los extendidos nos sobre lminas portaobjetos nuevas y limpias para teir con Gram y Hansel. 4. Proceder de igual forma con un segundo hisopado para la siembra en medios de cultivo: agar sangre (AS) y agar manitol salado (AMS) (Fig. 4).
36
Kiralba Snchez
5. Incubar los medios de cultivo a 36 C, en condiciones de aerobiosis por 18 a 24 horas. Observacin: Para la obtencin de secrecin nasofarngea, se sugiere utilizar hisopos exibles de alginato de calcio. Esta muestra es til para la deteccin de portadores de patgenos como: N. meningitidis, C. diphtheriae y B. pertussis.(5)
Interpretacin del examen directo:
Gram: no es til para el diagnstico, ya que no es representativo del proceso infeccioso en nasofaringe ni en senos paranasales. Informar la cantidad de leucocitos o clulas inamatorias presentes: 1-4xc escaso; 5-10xc moderado; >10xc abundantes.(6) Hansel: esta coloracin es muy til para la investigacin de eosinlos en moco nasal, la cual permite conrmar el diagnstico de una rinitis alrgica. Para ello se realiza un recuento diferencial con objetivo de 40X, se cuentan 50 clulas por campo, si se observan 10 eosinlos se considera la prueba positiva. Es importante tener presente que la ausencia de eosinlos no descarta el cuadro alrgico ya que hasta el 70% de los pacientes puede mostrar recuentos menores de eosinlos o ausencia de stos, segn el momento en que se recolecte la muestra y la severidad de la rinitis.(7)
La siembra realizada en los medios de cultivo AS y AMS se revisarn en busca de colonias sugestivas de S. aureus, y se proceder a la identicacin bioqumica y determinacin de la susceptibilidad antimicrobiana por el mtodo de Kirby-Bauer (Anexo 3 y 4).
37
PRctica 3
Exudado nasal
AS Gram Hansel
AMS
Gram
Reporte
El paciente no debe haber recibido antibiticos en los ltimos 8 das, previos a la obtencin de la muestra. El paciente debe acudir en ayunas al laboratorio. Debe cepillarse los dientes y no practicar gargarismo.
38
Kiralba Snchez
Procedimiento
1. Inspeccin de la faringe: ubicar al paciente en una posicin cmoda y con buena iluminacin, deprimir la lengua con el baja lengua, visualizar la fosa amigdalina y faringe en busca de exudado posterior, presencia de pseudomembrana o placas. 2. Indicar al paciente que abra la boca y que pronuncie un largo ah, el cual sirve para elevar la vula y evitar las nuseas. 3. Introducir el hisopo y frotar enrgicamente ambas amgdalas y la pared posterior de la faringe con movimientos de barrido. 4. Retirar el hisopo cuidando de no tocar las paredes laterales de orofaringe, vula, lengua, encas y dientes. 5. Extender la muestra con suaves movimientos sobre la supercie de los portaobjetos para realizar los frotis que sern teidos al Gram y con la tcnica de Hansel. 6. Obtener un segundo hisopado de fauces para la siembra en AS de carnero, siguiendo la tcnica de estriado sobre supercie, realizando siembras de profundidad con el asa para la deteccin de hemolisinas estreptoccicas (Fig.5). 7. Incubar el AS a 36C, en condiciones de 5-7% CO2, por 24-72 horas. Observacin: En caso de ser necesario, la muestra se podr transportar en medio de Stuart o Amies, realizando el cultivo de la misma en el menor tiempo posible (menos de 2 horas).
Interpretacin del examen directo
Gram: describir los hallazgos de clulas inamatorias y de alteracin de la ora habitual, como es el caso del aumento de bacilos gramnegativos fusiformes y espiroquetales que orientan el diagnstico hacia una Angina de Vincent; as mismo reportar la presencia de clulas levaduriformes, hifas y pseudohifas. Hansel: observacin de eosinlos, permite el diagnstico diferencial de una faringitis alrgica, muy comn en pacientes alrgicos.(7)
Inspeccionar las placas de AS en busca de colonias pequeas de 1 a 1,5 mm de dimetro, rodeadas de un halo de hemlisis completa (beta-hemlisis). A partir de las colonias sugestivas realizar extendidos para teir al Gram; si se observan cocos grampositivos dispuestos en cadenas, se repican de 4 a 6 colonias en AS y en tubos de caldo Todd-Hewitt e incubar a 36 C por 24 h.
39
PRctica 3
Del cultivo en Tood-Hewitt o AS practicar coloracin con el mtodo de Gram, para conrmar morfologa, reaccin y disposicin caractersticas de los Streptococcus. Realizar pruebas de identicacin (Anexos 3, 7, 8 y 9)
Exudado farngeo
Gram
Identicacin (anexos 3, 7 y 8)
Reporte
Para diferenciar S. pyogenes de otros beta-hemolticos, se pueden utilizar diferentes pruebas, siendo la de uso comn la prueba de la bacitracina (Anexo 7). Esta prueba se basa en la susceptibilidad de S. pyogenes frente a una concentracin relativamente baja de bacitracina. Para ello se inocula la cepa pura en AS, mediante hisopo estril extendiendo en cuatro direcciones; se coloca el taxo A (bacitracina 0,04 U) y el disco de trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) sobre el cultivo. Al cabo de 18-20 h de incubacin a 36C, se detectar la presencia de un halo de inhibicin del crecimiento de cualquier tamao, que indica la susceptibilidad del microorganismo.(7)
40
Kiralba Snchez
Esta tcnica tiene un 5% de falsos negativos y entre 10 y 20% de falsos positivos ya que otros Streptococcus (grupos C y G) tambin pueden dar sensibles.(1) Otra prueba disponible en muchos laboratorios es la hidrlisis del PYR, sta se fundamenta en la actividad de la enzima pirrolidonil aminopeptidasa producida por S. pyogenes, sobre un sustrato el L-pirrolidonil-beta-naftilamida (PYR), con formacin de beta-naftilamida libre, que se combina con el reativo cinamaldehdo formando un producto nal de color rojo.(6) Los laboratorios que utilizan las pruebas bacitracina o PYR deben informar: Hubo desarrollo presuntivo de Streptococcus pyogenes La identicacin denitiva se lleva a cabo mediante la deteccin del antgeno especco de grupo, tambin llamado carbohidrato de Lanceeld; sta se realiza a travs de mtodos de aglutinacin con partculas de ltex o coaglutinacin, directamente sobre la colonia aislada. Solo los estreptococos beta-hemolticos, A , B , C , F , G y los alfa o no hemolticos del grupo D pueden clasicarse con esta prueba. Para su realizacin se procede a una extraccin previa de los antgenos de pared, que dependiendo del mtodo, se emplear: cido, calor o enzimas. Luego se hace reaccionar la cepa pura de 24 h de desarrollo con cada uno de los antisueros para cada serogrupo. La reaccin positiva se evidenciar dependiendo de la interpretacin de cada protocolo: ya sea por aglutinacin, coaglutinacin, entre otros.(6)
Deteccin directa de Streptococcus del grupo del A en hisopado de garganta
Estas pruebas permiten detectar directamente el carbohidrato de la pared de S. pyogenes, a partir de un hisopado farngeo, con la ventaja de obtener resultados inmediatos. La mayora de las pruebas rpidas tienen excelente especicidad (> 95%) comparado con el cultivo, sin embargo, la sensibilidad alcanza entre 80 y 90%. Por lo que se recomienda que una prueba negativa sea conrmada con el cultivo.(1,2) Entre los mtodos de deteccin rpida de antgenos se emplean las pruebas de aglutinacin con ltex y los mtodos de enzimoinmunoanlisis (ELISA), estos ltimos con una mayor sensibilidad y especicidad. Actualmente se ha desarrollado la prueba de inmunoensayo ptico y sondas de ADN quimioluminiscentes. Los datos sugieren que son ms sensibles aunque ms costosos, por lo cual no estn disponibles para uso rutinario.(1) Las desventajas de estos mtodos de deteccin directa se basan en: Solo detectan Streptococcus grupo A, no detecta otros serogrupos. Bajo valor predictivo positivo, esto es, que no diferencia ecientemente los portadores de un individuo infectado con un reducido nmero de S. pyogenes. El elevado costo, sobre todo de los ltimos mtodos.
41
PRctica 3
1. Bsqueda de Arcanobacterium haemolyticum: Se recomienda el uso de AS humana o de caballo para el aislamiento primario a partir de exudado farngeo. En su defecto se puede utilizar el AS de carnero convencional con incubacin hasta por 72 h para lograr evidenciar la beta-hemlisis. Realizar Gram a todas las colonias - hemolticas aisladas sospechosas de S. pyogenes para hacer diagnstico diferencial con A. haemolyticum que se presenta como un bacilo corto pleomrco grampositivo.(5) Para su identicacin remtase al Anexo 21. 2. Investigacin de Corynebacterium diphtheriae: Se solicitar cuando exista la sospecha clnica y epidemiolgica de un caso de difteria, el cual debe ser orientado por el mdico (Anexo 24). 3. Cuando la historia clnica y el examen fsico orienten hacia una faringitis por N. gonorrhoeae, debe seleccionarse el medio Thayer-Martin, adems del AS. Otras especies de Neisseria tambin pueden estar presentes en cultivos de garganta y deben diferenciarse bioqumicamente de N. gonorrhoeae, tales como: N. meningitidis y las especies no patgenas.(1) Las colonias sospechosas son pequeas, traslcidas y brillantes, a las cuales se les practicar la tincin al Gram, prueba de la oxidasa y fermentacin de azucares (Anexo 12,13).(5,6) 4. La investigacin de B. pertussis, se practicar en caso de sospecha clnica de tos ferina. El cultivo se lleva a cabo en medio enriquecido de Bordet-Gengou con el agregado de 10% de sangre de caballo y como agente inhibidor meticilina (2,5ug/ mL) o cefalexina (40ug/mL) (Anexo 25).(5,8) Etapa post-analtica El informe al mdico tratante debe incluir la identicacin del paciente, tipo de muestra recolectada, estudio microbiolgico realizado, fecha de recepcin de la muestra, emisin de los resultados y cualquier otro dato que el bioanalista considere necesario, por ejemplo, las condiciones en que se traslad la muestra o las caractersticas de la misma, hora de llegada al laboratorio, entre otros (Anexo 2). En Examen directo. Indique la tcnica utilizada y describa la morfologa, reaccin al Gram de los diferentes morfotipos con importancia clnica, tomando en cuenta los aspectos mencionados anteriormente, dependiendo del tipo de muestra y el o los patgenos a investigar. Sealar en forma semicuantitativa la presencia de clulas inamatorias.(6)
42
Kiralba Snchez
En el tem Cultivo: Registre el microorganismo aislado tomando en cuenta su signicancia clnica y los aspectos relacionados con el paciente, considerados en el contenido terico de esta prctica. Si estn presentes microorganismos indgenas y se ha determinado que son contaminantes para el caso, incluir el siguiente comentario Desarrollo de microbiota habitual de la regin. En el caso de cultivos negativos, indicar No hubo crecimiento bacteriano en 48 ( 72) horas de incubacion Reporte el Antibiograma (en los casos que aplique). En Observaciones, se debe sealar la lista de microorganismos investigados y otros datos que se consideren de inters para la interpretacin clnica del resultado. Datos y rma de la persona encargada de la investigacin: Nombre y apellido en forma legible. Nmero de registro ante el Ministerio de Salud y ante el Colegio de Bioanalistas. Firma y sello del laboratorio o institucin de adscripcin.
3 Actividad prctica
Primer perodo: Obtencin y siembra de secrecin nasal y exudado farngeo
Materiales
Hisopos estriles Bajalenguas estriles Lminas porta objetos Medios de cultivo: Agar Sangre de carnero (AS) y agar manitol salado (AMS)
Procedimiento
1. Elaborar la cha clnico-epidemiolgica del paciente (Anexo 1). 2. Preparar todo el material necesario para la obtencin y siembra de las muestras. Rotule las placas, caldo de cultivo y las lminas portaobjeto con el cdigo asignado al paciente. 3. Obtener las muestras de exudado nasal y farngeo como se explic previamente. Observe la demostracin del docente. 4. Practicar la siembra de las muestras en los medios respectivos: secrecin nasal en AS y AMS, el exudado farngeo en AS (Fig. 4 y 5) 5. Incubar los medios de AS, a 36 C, en microaerolia por espacio de 24 a 48 horas. Con revisin peridica cada 24 h y el AMS en aerobiosis.
43
PRctica 3
6. Realizar 2 frotis con cada muestra: uno para teir con la tcnica de Gram y el otro para la coloracin de Hansel. Prepare el frotis, aplicando al hisopo movimientos rotativos sobre la lmina portaobjeto, procurando que el extendido quede no. Deje secar al aire. 7. Fijar los extendidos y siga los pasos para las tcnicas de Gram y Hansel. Observar al microscopio. Coloracin de Hansel
Fije la lmina con metanol absoluto por 3 minutos Cubrir la lmina con el colorante durante 1 minuto. Agregar agua destilada sobre el colorante por 30 segundos Lavar con agua destilada Decolorar ligeramente con metanol (dos a tres gotas) Dejar secar y examinar el extendido con objetivos de 10X y 40X (no utilice aceite de inmersin)
Lminas portaobjeto Asa de platino Gotero con solucin salina siolgica Placas de AS y caldo Tood-Hewitt (TH) o infusin cerebro corazn (BHI) Agua oxigenada 3%
Procedimiento
1. Evaluar cada placa de cultivo segn las caractersticas morfolgicas de las colonias, la presencia o no de hemlisis y valorar el desarrollo bacteriano en escaso, moderado o abundante. En el caso de AMS observe si hubo la fermentacin del manitol. Registre todas las caractersticas observadas. 2. Realizar el anlisis microscpico de las colonias de inters microbiolgico, segn el tipo de muestra. Para ello preparar frotis con las colonias a investigar y teir con la coloracin de Gram. Observar y registrar los resultados. 3. Las colonias de valor diagnstico deben ser puricadas, en AS y en caldo TH o BHI.
44
Kiralba Snchez
4. A partir del crecimiento en AMS, se procede a la investigacin de S. aureus, siguiendo el esquema de identicacin propuesto (Anexos 3,4). 5. Incubar los medios AS, TH y las pruebas bioqumicas inoculadas.
Placas de AS Placas de Mueller Hinton sin sangre y con 5% sangre de carnero Solucin salina siolgica estril Patrn de Mc Farland 0.5 Viales con discos de antibiticos
Asa de platino Agua oxigenada al 3% Palillos de madera Lminas portaobjeto Taxos de bacitracina Coloracin de Gram
Procedimiento
1. Revisar y vericar la pureza de los repiques realizados en el perodo anterior mediante la tcnica de Gram. 2. A partir de este repique realizar un inculo con las colonias sospechosas de S. pyogenes sobre un AS fresco. Aplicar un taxo de bacitracina sobre la siembra e incubar en microaerolia. 3. Realizar la prueba de la catalasa a partir del caldo TH. Registre el resultado. 4. Interpretar las pruebas bioqumicas inoculadas en el perodo anterior e identicar el microorganismo. 5. Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana, en el caso que aplique.
45
PRctica 3
Autoevaluacin
1. Por qu en el cultivo de un exudado farngeo se debe utilizar sangre de carnero? 2. Clasique los medios de cultivo empleados en la prctica segn su utilidad en el laboratorio. 3. Cul es la importancia de los portadores nasales de S. aureus? 4. Enumere los patgenos respiratorios y los cuadros clnicos que producen. 5. Explique el fundamento de las pruebas: catalasa, coagulasa y PYR. 6. Cul es la utilidad de la coloracin de Hansel en una faringitis? 7. Mencione las pruebas no convencionales para el diagnstico de una faringitis estreptoccica y discuta sus ventajas y desventajas.
Bibliografa
(1) Braun S. Estudio microbiolgico del tracto respiratorio superior. Rev Chil Infect 2003; 20:193-198. (2) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. Texto Atlas Color. 4 ed. Espaa: Mosby Elsevier Science; 2002. (3) Ryan K, Ray C. Sherris Microbiologa mdica. 4 ed. Mexico: McGraw-Hill Interamericana; 2004. (4) Mandell G, Bennett J, Dolin R. Enfermedades infecciosas. Principios y prctica. 5 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 2002. (5) Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnstico microbiolgico. Texto y Atlas Color. 5 ed. Espaa: Mdica Panamericana; 2001. (6) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Mediterrneo; 2001. (7) Reyes M. Rinitis alrgica en nios. Su relacin con alergenos en el ambiente. (serial on line) 1996 (citado 17 may 2005). Disponible en: http://colombiamedica.univalle.edu. co/Vol27no3-4/rinitis.pdf. (8) Universidad Central de Venezuela. Gua de Trabajos prcticos de microbiologa. Caracas: FEPUVA-UCV; 2000.
46
prctica 4
Objetivo general
Aplicar el procesamiento microbiolgico de las diferentes muestras para el diagnstico etiolgico de las infecciones de las vas respiratorias inferiores ocasionadas por bacterias.
Objetivos especficos
1. Mencionar los principales agentes etiolgicos causantes de infecciones del tracto respiratorio inferior. 2. Relacionar los datos epidemiolgicos y clnicos necesarios para la orientacin del diagnstico microbiolgico (etapa pre-analtica). 3. Realizar los diferentes pasos que comprende la etapa analtica del procedimiento para el cultivo de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior. 4. Analizar, interpretar y reportar los resultados obtenidos (etapa post-analtica).
Aspectos tericos
El aire que inhalamos contiene millones de partculas suspendidas, incluidos algunos microorganismos que en su mayora son inocuos, sin embargo, el aire constituye un vehculo para la transmisin de patgenos importantes.(1) Aunque la va respiratoria es un todo continuo desde la nariz a los alvolos, es conveniente distinguir entre infecciones de las vas respiratorias superiores e inferiores. En esta seccin estudiaremos estas ltimas, las cuales tienden a ser infecciones ms graves y la eleccin de un tratamiento antimicrobiano adecuado es importante para salvar la vida del enfermo.(1) El tracto respiratorio inferior es un rea normalmente estril, la afeccin puede ocurrir por extensin de una infeccin de las vas respiratorias medias, aspiracin
47
PRctica 4
de microorganismos patgenos que rebasan las defensas de las vas respiratorias superiores o, menos a menudo, por diseminacin hematgena desde un sitio distante, como un absceso o una vlvula cardiaca infectada. Cuando hay infeccin a travs de las vas respiratorias, muchas veces se observa alguna alteracin de los mecanismos de ltrado o eliminacin de agentes infecciosos inhalados de las vas respiratorias inferiores.(3,4) Las infecciones de las vas respiratorias inferiores se presentan con invasin y afeccin del pulmn, produciendo neumona y alveolitis o pueden afectar la trquea y bronquios ocasionando: traquetis, bronquitis y bronqueolitis (Fig. 6); estos cuadros se pueden presentar en forma aguda o crnica.(1,2,3)
Figura 6. Sndromes que incluyen las infecciones respiratorias bajas Tomado de: Va salud, 2001.
La bronquitis aguda es una inamacin del rbol traqueobronquial, que se caracteriza desde el punto de vista clnico por tos, grado de ebre variable y produccin de esputo. Este ltimo (material expulsado desde los bronquios, pulmones y trquea, por la boca) a menudo es lmpido al comienzo, pero puede tornarse purulento si la enfermedad persiste. La bronquitis puede manifestarse como crup (cuadro clnico caracterizado por una tos perruna o ronquera, o ambas).(5)
48
La neumona es un proceso inamatorio que se caracteriza por la presencia de un inltrado exudativo y celular en el parnquima pulmonar. La mayora de las neumonas son de causa infecciosa y tienen una evolucin aguda. Ocasionalmente, pueden tener un origen no infeccioso como en el caso de enfermedades autoinmunes, neoplasias o exposicin a agentes txicos.(2) Las neumonas pueden ser causadas por una gran variedad de microorganismos: bacterias, virus, micobacterias, hongos y levaduras. En la Tabla 10 se muestran los signos, sntomas y los patgenos aislados en adultos, y en la Tabla 11 se muestran los patgenos aislados en los nios de acuerdo a la edad.
Parsitos:
49
PRctica 4
respiratorio (VSR)
Raros Virus:
Citomegalovirus Rubola
Las neumonas pueden clasicarse segn distintos criterios: a) de acuerdo a la etiologa (segn el microorganismo causal); b) segn el lugar de adquisicin (dentro o fuera del hospital), este ltimo criterio es el ms til a la hora de establecer el tratamiento inicial de un paciente determinado.(2) Los sntomas que sugieren neumona son ebre, escalofros, dolor en el pecho y tos con produccin o no de esputo, dolor torcico, disnea, consolidacin pulmonar: estertores, ruidos respiratorios disminuidos, inltrados radiogrcos y empiema. Es importante tener en cuenta que algunos pacientes con neumona no muestran signos y sntomas relaciona-
50
dos con el tracto respiratorio. Por lo tanto, el examen fsico del paciente, los hallazgos en la radiografa de trax, los antecedentes del paciente y los resultados del laboratorio clnico son importantes. Del 10 al 30 % de los individuos con neumona, adems de los sntomas respiratorios, maniestan dolor de cabeza, nuseas, vmitos, dolor abdominal, diarrea y mialgias.(5) Una vez establecido el diagnstico clnico-radiogrco de infecciones del tracto respiratorio inferior es recomendable precisar el diagnstico etiolgico mediante pruebas de laboratorio adecuadas que permitan establecer la terapia antimicrobiana adecuada.(5) El diagnstico etiolgico puede efectuarse de diferentes maneras: en forma directa, con la identicacin del agente causal; indirectamente, a travs del hallazgo de un metabolito en particular y, ms recientemente, utilizando tcnicas inmunolgicas y de biologa molecular como herramientas en reacciones consideradas rpidas no convencionales.(6,7) Etapa pre-analtica a) Datos epidemiolgicos: Las infecciones del tracto respiratorio inferior se presentan a cualquier edad, aunque son ms frecuentes en nios y ancianos. Estn especialmente predispuestas las personas que viven con un bajo nivel socioeconmico y en condiciones de hacinamiento. Los factores que intereren con las defensas normales del husped son alteracin de la conciencia, humo de cigarrillo, hipoxemia, acidosis, alcoholismo, inhalaciones txicas, edema de pulmn, desnutricin, infecciones virales previas, uremia, obstruccin mecnica y utilizacin de agentes inmunosupresores (corticoides y drogas citotxicas). Asimismo, pueden interferir con las defensas normales, enfermedades de base como diabetes, brosis qustica, enfermedad pulmonar obstructiva crnica, enfermedad cardiaca congestiva y enfermedades inmunosupresoras como el SIDA. Estos datos son fundamentales para orientar al microbilogo hacia la bsqueda de determinados agentes, (2,4) por ejemplo: Fibrosis qustica: P. aeruginosa, S. aureus, H. inuenzae y en menor medida Burkholderia cepacia y otros bacilos gramnegativos. Infecciones virales previas: S. aureus. Contacto con aves: Chlamydophila psittaci. Viajes a reas endmicas: C. immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Legionella pneumophila, Francisella tularensis. Riesgo ocupacional y/o contacto con animales: C. burnetti, Bacillus anthracis, Brucella sp., Yersinia pestis. Antecedente de macroaspiracin: anaerobios Epidemias de inuenza: Inuenza, S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes, H. inuenzae.
51
PRctica 4
Bajo nivel socioeconmico: M. tuberculosis. Alcoholismo: S. pneumoniae, anaerobios, bacilos gramnegativos. Pacientes infectados con HIV: Pnemocistis carinii, M. tuberculosis, S. pneumoniae, H. inuenzae. EPOC/fumadores: S. pneumoniae, H. inuenzae, M. catarrhalis, Legionella sp. Exposicin a murcilagos o materia fecal de los mismos: H. capsulatum. Exposicin a conejos: F. tularensi.(4)
b) Datos clnicos del paciente: signos y sntomas, enfermedades subyacentes y, adems, en la orden debe sealarse la impresin diagnstica del mdico tratante. Etapa analtica a) Tipo de muestras: esputo o expectoracin, aspirado transtraqueal, muestras obtenidas por broncobroscopia, lavado bronquial, cepillado bronquial, lavado broncoalveolar y biopsia pulmonar. En algunas oportunidades las infecciones pulmonares se acompaan de derrame pleural por lo que es necesario recolectar y estudiar una muestra de lquido pleural obtenida por puncin.(7) b) Toma de muestra: independientemente del mtodo a escoger para el procesamiento microbiolgico, la muestra a seleccionar juega un papel importante en el xito esperado, ya que toda informacin diagnstica que el laboratorio pueda proporcionar, depende de la calidad de la muestra recibida.(6,7,8,9) El esputo o expectoracin en las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una muestra representativa de la situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con secreciones procedentes de todo el rbol traqueo-bronquial y con la ora saprta de la orofaringe. No obstante, es una muestra de fcil obtencin cuya utilidad o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa depende en gran medida de su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado.(10) La recoleccin de esta muestra es sencilla y consiste en solicitar al paciente seguir las siguientes indicaciones: Colocar en las paredes exteriores del envase la identicacin del paciente (nombre). Cepillarse los dientes con agua (no usar pasta de dientes). Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal. Para ello, debe inspirar profundamente, reteniendo por un instante el aire de los pulmones y expelindolo violentamente por un esfuerzo de tos, repetir la operacin hasta obtener no menos de tres esputos. Este procedimiento deber realizarlo en un lugar ventilado.
52
La recoleccin la realizar en un envase que debe ser de boca ancha con tapa de rosca, con capacidad para 30 50 mL, transparente porque permite ver la cantidad y la calidad de la muestra y desechable (Fig. 7). De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero siolgico estril (15 mL durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje postural o sioterapia respiratoria. Enviar de inmediato al laboratorio, y si esto no es posible, conservar a 4 C.(10,11)
Las tcnicas de recoleccin de muestras obtenidas por mtodos invasivos no sern objeto de estudio en este captulo ya que son recolectadas por mdicos especialistas y son trasportadas al laboratorio para su procesamiento.
Figura 7. Envase para la recoleccin de esputo c) Examen directo de esputo: para la realizacin del frotis se debe seleccionar la partcula til de la muestra, constituida por la parte ms densa o purulenta. Si hay varias porciones purulentas, se deben mezclar cuidadosamente con los aplicadores y tomar una porcin de la mezcla. En caso de observarse solo pequeas partculas purulentas, escoger tres o ms de ellas y mezclarlas en el mismo portaobjeto para homogeneizarlas.(11) A cada muestra se le realiza un extendido para colorear con Gram y otro para Ziehl-Neelsen. 1. Coloracin de Gram: se usa para el tamizaje del esputo antes de la realizacin del cultivo, por lo tanto, esta coloracin va a permitir controlar la calidad del esputo, lo cual es importante para evaluar el grado de contaminacin con bacterias del tracto respiratorio superior y si la muestra realmente proviene del tracto respiratorio inferior o si se obtuvo de la faringe o por aspiracin de secreciones nasales o si es saliva solamente.(11,12) Uno de los sistemas utilizados es el de Murray y Washington el cual se muestra en la Tabla 12, segn este sistema, la observacin de gran nmero de clulas epiteliales en los grupos 1 al 4 indica contaminacin con secreciones orofarngeas e invalida la muestra. Slo las muestras del grupo 5 son consideradas clnicamente signicativas. Es importante destacar
53
PRctica 4
que el sistema de graduacin del esputo no puede ser empleado si se sospecha de infecciones pulmonares causadas por micobacterias, la mayora de los hongos y virus.(8)
TABLA 12. Sistema de graduacin Murray y Washington para el ensayo de calidad de muestra de esputo
Grupo 1 2 3 4 5 Clulas epiteliales por campo bajo de aumento 25 25 25 10-25 < 10 Leucocitos por campo bajo de aumento 10 10-25 25 25 25
2. Coloracin de Ziehl-Neelsen: este examen directo se denomina baciloscopa, la cual es una tcnica fundamental para la investigacin bacteriolgica de la tuberculosis, tanto para el diagnstico como para el control del tratamiento. Esta observacin microscpica debe cumplir dos objetivos: a) determinar si en el extendido hay bacilos cido resistentes (BAR) y b) establecer su nmero aproximado, esto tiene importancia ya que orienta sobre la ecacia del tratamiento.(11,13)
La baciloscopa es una tcnica rpida, econmica, que permite lograr una amplia cobertura de la poblacin, por lo cual constituye un aporte importante para los programas de control de la tuberculosis, sin embargo, la visualizacin de BAR en esputo no es armativa de M. tuberculosis porque otras micobacterias pueden tambin causar enfermedad pulmonar, as como especies del gnero Nocardia que tambin pueden ser cido alcohol resistentes. Sin embargo, una baciloscopa positiva en conjuncin con la clnica y hallazgos radiolgicos puede utilizarse para un diagnstico presuntivo de micobacteriosis.(7,13) La lectura de la baciloscopa debe ser hecha de manera sistemtica, leyendo de izquierda a derecha el extendido, tomando en cuenta slo los campos microscpicos tiles que son aquellos en los que se observan elementos celulares de origen bronquial (leucocitos, bras mucosas y clulas ciliadas); en aquellos campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la lectura.(11) El nmero de campos que se debern observar vara segn la cantidad de bacilos que contenga la muestra:
54
Si no se encuentran BAR o se observa menos de un bacilo por campo promedio deben examinarse mnimo 100 campos microscpicos tiles. Si se encuentran de uno a diez BAR por campo promedio, es suciente observar 50 campos. Si se encuentran ms de diez BAR por campo promedio, basta con la observacin de 20 campos.(11,12)
Para anotar el recuento de bacilos se utilizar la hoja de recuento semicuantitativo (Fig. 8) en la cual cada cuadro representa un campo microscpico til y se colocar el nmero de BAR observados, luego en la columna 11 se anotar la sumatoria correspondiente a cada lnea y el recuento de bacilos corresponder a la suma de los resultados registrados en la columna 11.
Columna 11 LMINA N RESULTADO N
TOTAL
Figura 8. Hoja de recuento semicuantitativo Tomado de: Armengol R., Guilarte A, 1998.
Es importante tener en cuenta que la no observacin de BAR en una muestra clnica no descarta el diagnstico de tuberculosis, ya que es una tcnica de sensibilidad limitada. Se ha demostrado que son necesarios de 5.000 a 10.000 bacilos por mL de esputo para el reconocimiento en la microscopa directa, en estos casos el cultivo detecta de 10 a 100 colonias de micobacterias viables.(12). 3. KOH al 10%: para descartar la presencia de estructuras fngicas. d) Cultivo de esputo: entre los medios de cultivos primarios tenemos: agar sangre, agar chocolate, agar Mac Conkey y para investigar micobacterias se puede utilizar: Agar
55
PRctica 4
Lwenstein-Jensen, Ogawa Kudoh o Middlebrook 7H10-7H11; dependiendo de la orientacin diagnstica se incluirn medios especcos para hongos dimorfos tales como: agar infusin cerebro-corazn, as como agar infusin de corazn de Sabouraud (SABHI) con sangre de oveja y tambin Micobiotic o Mycosel, en caso de sospecha de infeccin por Legionella se usa el agar extracto levadura carbn con pH regulado (BCYE) y tincin especca para P. carinni.(15, 16) En la Figura 9 se representa esquemticamente el procedimiento para el cultivo de la muestra de esputo o expectoracin.
Muestra de esputo
Examen directo
Gram
Cultivo
Agar Lowenstein-Jensen
KOH 10%
AS ACH AMK Incubar hasta 6 semanas a 36C
Positivo Identicacin
Positivo
Pruebas bioqumicas
Prueba de susceptibilidad
Para el aislamiento de micobacterias antes de realizar la siembra en el medio de cultivo se debe realizar un proceso de descontaminacin debido a que es necesario eliminar de las muestras los microorganismos contaminantes que intereren en el desarrollo de estas bacterias. Tambin es importante conseguir la licuefaccin de los restos orgnicos (tejidos, moco y otros materiales) que rodean a los microorganismos, para que los agentes descontaminantes puedan destruir las bacterias no deseadas. Pero si stas no se utilizan adecuadamente pueden afectar, tambin la viabilidad de las micobacterias presentes en la muestra y dar lugar a falsos cultivos negativos (por
56
exceso de descontaminacin) o a un nmero elevado de contaminaciones (por defecto de descontaminacin). Entre los mtodos de descontaminacin utilizados tenemos de NaOH 4%, Petroff, Tacquet y Ticcson, Kubica modicado por Krasnow y N-acetil-L cistena-Hidrxido Sdico (NALC-NaOH). La eleccin de cualquiera de estos mtodos depender del tipo de muestras que se descontamine y, sobre todo, de la utilizacin de determinados medios de cultivo y realizacin de tcnicas moleculares a partir del sedimento de las muestras descontaminadas, ya que algunos reactivos utilizados en estos mtodos pueden retrasar el crecimiento de las micobacterias o interferir en las reacciones de amplicacin.(14) Todas las muestras clnicas sospechosas de contener micobacterias se deben sembrar en medios de cultivo adecuados por las siguientes razones: Los cultivos son mucho ms sensibles que los exmenes microscpicos, pudiendo detectar una cantidad tan pequea como 10 bacterias por mL de muestra clnica digerida y concentrada. Los aislamientos en cultivo puro son necesarios normalmente para poder identicar las especies de las cepas aisladas. Si la baciloscopa es un ndice de la ecacia del tratamiento, el cultivo permite asegurar la negativizacin y curacin del paciente.(14)
g) Identificacin: de acuerdo a la correlacin obtenida en el Gram directo de la muestra y el cultivo se procede a la identicacin, realizando la seleccin de las pruebas de acuerdo con la orientacin preliminar. En los anexos 4, 6, 7, 14, 22, 23, 25, 26 y 27 se muestran los esquemas de identicacin de algunos los agentes etiolgicos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior.
Procedimiento para el cultivo de otros tipos de muestras provenientes del tracto respiratorio inferior
a) Examen directo: se realizar la coloracin de Gram para el tamizaje de la muestra al igual que el esputo, en el caso de aspirados bronquiales se usan los criterios de Murray y Washington; mientras que en las muestras obtenidas por mtodos broncoscpicos la presencia de ms del 1% de clulas escamosas signica contaminacin orofarngea signicativa. Adems, estos especmenes no deben mostrar menos de un 10% de neutrlos.(14)
57
PRctica 4
b) Cultivo: se utilizan los mismos medios primarios que para esputo. Para estos tipos de muestras se recomienda cultivos cuantitativos que son imprescindibles para poder comprender el signicado del o de los patgeno/s aislado/s.(14) Catter telescopado: El volumen de secreciones respiratorias que se recoge con este dispositivo es de aproximadamente 0,01 a 0,001 mL. Despus de obtener la muestra, el cepillo se coloca en 1 mL de suero siolgico estril, consiguindose de esta forma una solucin de secreciones respiratorias diluidas entre 100 y 1.000 veces. Posteriormente, se realizar un cultivo cuantitativo de esta solucin. Cuando la neumona es clnicamente maniesta, habitualmente las secreciones respiratorias contienen al menos 104 UFC por gramo de tejido y 105 o ms bacterias por mililitro de exudado.(14) Lavado broncoalveolar (LBA): en este caso, el volumen de secreciones respiratorias recuperadas se estima en algo ms de 1 mL diluido en el lquido que se aspira (entre 10 y 100 mL), lo que viene a suponer un factor de dilucin de 1/10-1/100 de las secreciones respiratorias originales. Los puntos de corte han variado entre 103 y 105 UFC/mL. No obstante, el umbral diagnstico generalmente aceptado es el de 104 UFC/mL de al menos uno de los microorganismos aislados en el cultivo.(14) Tcnicas ciegas: en el caso del aspirado bronquial ciego y mini lavado broncoalveolar se han considerado como signicativas concentraciones entre 103 y 104 UFC/mL. Para el catter telescopado no broncoscpico se acepta el mismo punto de corte que para el procedimiento guiado.(14) Aspirado endotraqueal: El umbral diagnstico mayoritariamente aceptado es de 106 UFC/mL. Algunos autores han recomendado un valor de 105 UFC/mL como mejor punto de corte para esta muestra.(14)
Factores a considerar en la interpretacin de los cultivos cuantitativos de muestras respiratorias
A pesar de establecer estos umbrales diagnsticos para cada una de las muestras respiratorias, la carga bacteriana debe interpretarse en el contexto clnico especco de cada paciente. No obstante, el anlisis de los recuentos bacterianos requiere tener en cuenta la existencia de factores que puedan inuir en la concentracin de microorganismos en las muestras respiratorias: 1. Tiempo de evolucin de la infeccin: Un recuento bajo de microorganismos puede representar un estadio evolutivo precoz de la infeccin respiratoria. 2. Antibioterapia previa: La exposicin previa a antibiticos es la variable ms importante y la que ms a menudo reduce la concentracin bacteriana en las muestras
58
respiratorias, particularmente en pacientes que han iniciado un tratamiento antibitico en las 24 horas previas a la recogida de muestras. 3. Existen subgrupos de pacientes con recuentos bacterianos relativamente altos pero sin los cambios inamatorios que denen la existencia de una neumona, como ocurre con frecuencia en pacientes con Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crnica. 4. Variabilidad de las tcnicas: Aunque la reproducibilidad cualitativa es alta, se puede observar una variabilidad en el recuento bacteriano que supone un cambio en la categora diagnstica (por encima o por debajo del punto de corte) de un 25-30%, tanto en LBA como en catter telescopado. 5. Factor dilucional: Cambios en el volumen en el que se introduce el cepillo del catter telescopado (universalmente admitido de 1 mL) pueden producir variaciones dilucionales de la muestra respiratoria recogida e inuir en el recuento de colonias. En el caso del LBA el problema es mayor debido a la falta de estandarizacin de la tcnica, en la que se usan distintos volmenes segn los autores. Se desconoce el efecto del volumen de lquido instilado y del porcentaje recuperado sobre el recuento bacteriano. 6. Otros aspectos tcnicos: Errores en la toma de muestras o retrasos en el envo de las mismas al laboratorio de microbiologa pueden ser causa de descensos signicativos en los recuentos bacterianos o de sobrecrecimientos inespeccos.(15) Etapa post-analtica Una vez realizado el anlisis e interpretacin de los resultados, se procede al reporte de los mismos: a) Baciloscopa: (-): No se encuentran BAR en 100 campos observados. (+): Menos de 1 BAR por campo en 100 campos observados. (++): 1 a 10 BAR por campo en 50 campos observados (+++): Ms de 10 BAR por campo en 20 campos observados. En caso de encontrar slo uno a cuatro bacilos en cien campos observados debe ampliarse la lectura a otros 100 campos utilizando una nueva lnea. Al examinar 200 campos y persistir el nmero de bacilos en 1 a 4, realizar un nuevo extendido y si persiste el nmero de bacilos, reportar el nmero de bacilos observados y solicitar otra muestra. (11,12) b) Cultivo: se realiza el reporte como se seala en el anexo 2.
59
PRctica 4
4 Actividad prctica
Materiales
Guantes Tapaboca Aplicadores de madera Lminas portaobjetos Equipo para coloracin de Gram y Ziehl-Neelsen
Procedimiento
Asa en aro Placas: agar sangre, agar chocolate y agar Mac Conkey. Frasco para microaerofilia Reactivos para catalasa y oxidasa.
Etapa pre-analtica
El estudiante recibir dos hojas de solicitud de examen con los datos clnicos y epidemiolgicos del paciente.
Etapa analtica
Cada grupo de trabajo recibir un frotis para la realizacin de baciloscopa y una muestra de esputo, el profesor dar las indicaciones y condiciones de trabajo necesarias para el procesamiento.
Primer perodo
Esputo
a) Colocar sobre la mesa de trabajo papel absorbente humedecido con fenol al 5 %. b) Realizar los frotis de la siguiente manera: Dividir un aplicador de madera estril en dos y con los extremos irregulares seleccionar la partcula til de la muestra. Colocarla sobre la lmina portaobjeto y extenderla con el aplicador hacia el extremo opuesto. Una vez terminado el extendido, desechar los aplicadores en un recipiente con cloro al 2%. Dejar secar al aire y fijar al calor. c) A uno de los frotis realizar la coloracin de Gram, y al otro, Ziehl-Neelsen. d) Sembrar por estra en supercie las placas de AS, ACH y AMK.
60
e) Incubar a 36 C durante 18 24 h, las placas de AS y ACH en microaerolia y AMK en aerobiosis (Fig. 9). Frotis entregado a) Fijar al calor. b) Realizar la coloracin de Ziehl-Neelsen y dejar secar al aire. c) Observar con objetivo de inmersin y realizar la lectura como se explic en el marco terico. d) Realizar el recuento semicuantitativo y registrar los resultados en la hoja destinada para tal n.
Segundo perodo
a) Evaluar la ora bacteriana. b) Practicar anlisis microscpicos utilizando la coloracin de Gram de las colonias sospechosas de inters clnico. c) Seleccionar la(s) colonia(s) de inters y puricarlas en el medio de cultivo utilizado en el aislamiento primario e incubar en las mismas condiciones. d) Realizar algunas pruebas preliminares como catalasa, oxidasa, etc., de acuerdo a lo observado en los cultivos y examen microscpico.
Tercer perodo
a) Realizar la identicacin de el o los microorganismos de inters clnico utilizando los esquemas de identicacin (ver anexos) de acuerdo a la orientacin. b) Realizar el antibiograma por el mtodo de Kirby-Bauer.
Cuarto perodo
a) Lectura de las pruebas bioqumicas y pruebas de susceptibilidad.
Etapa post-analtica
Cultivo
61
PRctica 4
Frotis
Autoevaluacin
1. Seale la utilidad de la coloracin de Gram en el procesamiento de una muestra de esputo. 2. Seale tres agentes etiolgicos bacterianos ms frecuentemente implicados en infecciones del tracto respiratorio inferior. 3. Seale los objetivos de la baciloscopa. 4. Si en una baciloscopa se observan de 1 a 4 bacilos en promedio por campo. Seale la conducta a seguir. 5. Qu conducta se debe seguir si al procesar una muestra de esputo se observan 25 clulas epiteliales y 10-25 leucocitos por campo de bajo aumento (10X)? 6. Cmo se explica el siguiente resultado: Baciloscopa: Negativa (no se observan BAR en 100 campos observados); Cultivo: Positivo para M. tuberculosis? 7. Se puede establecer el diagnstico etiolgico cuando se observan BAR en el examen directo de esputo? 8. Seale la importancia del proceso de decontaminacin para el cultivo de micobacterias. 9. Al procesar una muestra de esputo se obtienen los siguientes resultados: Examen directo (Coloracin de Gram): 5-10 clulas epiteliales y 25-30 PMN por campo de bajo aumento. Se observ predominio de cocos grampositivos en pares y cadenas cortas. Coloracin de Zielh-Neelsen: No se observaron BAR en 100 campos observados. Cultivo: colonias pequeas, circulares, transparentes, brillantes, -hemolticas hasta el tercer cuadrante. Catalasa negativa, LAP negativa y al Gram se observa la misma morfologa observada en el examen directo. a) Seale las pruebas que se le realizaran para hacer la identicacin denitiva del microorganismo. b) Qu valor diagnstico Ud. le dara a los hallazgos obtenidos?
62
Bibliografa
(1) Mims C, Playfair J, Roitt I, Wakelin D, Willians R. Microbiologa mdica 2 ed. Espaa: Harcourt Brace; 1999. (2) Va salud [en lnea] 2001 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL disponible en: http://www.viasalud.com/documento.asp? (3) Ryan K, Ray G. Sherris. Microbiologa mdica. Una introduccin a las enfermedades infecciosas. Mxico: McGraw-Hill Interamericana; 2004. (4) Lopardo H, Hernndez C, Soloaga R. Diagnstico microbiolgico de las Infecciones Respiratorias Bacterianas [en lnea] 1999 [fecha de acceso 18 de Abril de 2005]; URL disponible en www.ifcc.org/ria/div/britanis/az_19.htm (5) Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scout diagnstico microbiolgico.11a ed. Argentina: Editorial Panamericana; 2004. (6) Jimnez P, Calvo M. Diagnstico microbiolgico en neumona comunitaria [en lnea] 2005 [fecha de acceso 18 de abril de 2005]; URL disponible en: www.scielo.ch/ Manual prctico de bacteriologa. Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia, Escuela de Bioanlisis, Departamento de Microbiologa y Parasitologa, Ctedra de Bacteriologa Clnica. 1.999. (8) Koneman E, Allen S, Jandon W, Schreckenberger P, Winn W. Diagnstico microbiolgico. Texto y atlas a color. 5 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 1999. (9) Ballows A, Hausler W, Herrmann K, Isenberg H, Shadomy H. Manual of clinical Microbiology. 5 ed. Washington D.C.: American Society for Microbiology; 1991. (10) Pinzn J. (Ed). Recogida, transporte y conservacin de las muestras. Protocolos de Sociedad Espaola de Enfermedades infecciosas y Microbiologa Clnica [en lnea] 1993 [fecha de acceso 10 de Abril de 2005] URL disponible en: http://www.seimc. org/protocolos/cap1.htm (11) Ministerio de Salud y Desarrollo Social. Divisin de tuberculosis y enfermedades pulmonares. Laboratorio de Referencia Nacional de Bacteriologa de la Tuberculosis. (12) Armengol R, Guilarte A. Norma ocial venezolana del programa nacional integrado de control de la tuberculosis. Caracas: Ministerio de Salud y Desarrollo Social; 1998. (13) Programa continuo de actualizacin en el laboratorio. Examen de esputo [en lnea] 2005 [fecha de acceso 15 de Abril de 2005] URL disponible en: http://www.mamut.com/tecmed (14) Casal M., Guerrero A., Martn N., Moreno S., Nogales M. Diagnstico microbiolgico de las infecciones por micobacterias [en lnea] 1999 [fecha de acceso de Abril 2005]; URL disponible en: http://www.seimc.org/protocolos/cap9.htm#intro (7) Vizcaya L. En: Araque M, Nieves B, Snchez K, Velsquez A, Velazco E, Vizcaya L.
63
PRctica 4
(15) lvarez, F., Torres A., Rodrguez F. Recomendaciones para el diagnstico de la neumona asociada a ventilacin mecnica [en lnea] 2000 [fecha de acceso 15 de Abril de 2005]; URL disponible en: http://www.ceimc.org/geih/doc3.htm (16) Finegold S., Baron E. Bailey Scout diagnstico microbiolgico. 7 ed. Argentina: Mdica Panamericana; 1989.
64
prctica 5
Objetivo general
Aplicar los mtodos convencionales para el diagnstico microbiolgico de las infecciones ticas.
Objetivos especficos
1. Describir las condiciones adecuadas para la toma de muestra en los sitios anatmicos relacionados con el cuadro clnico. 2. Analizar macroscpicamente y microscpicamente la muestra en estudio. 3. Cultivar la muestra obtenida para el aislamiento de los agentes patgenos. 4. Valorar el crecimiento obtenido en los distintos medios de cultivo. 5. Identicar los microorganismos de inters clnico. 6. Realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana a los agentes etiolgicos bacterianos. 7. Analizar los resultados obtenidos. 8. Elaborar el reporte de los resultados.
Aspectos tericos
La mayor parte de las infecciones del odo afectan el conducto auditivo externo (otitis externa) o la cavidad media (otitis media) que contiene los huecesillos y est rodeada por otras estructuras seas y la membrana timpnica. La otitis es una enfermedad del odo caracterizada por inamacin de la mucosa del odo externo, medio o interno (mastoides), perforacin de la membrana timpnica y otorrea. Esta patologa se puede clasicar sobre la base de consideraciones clnicas o histopatolgicas. Segn su duracin se puede subdividir en fase aguda y crnica. La fase aguda se reere a la inltracin
65
PRctica 5
de polimorfonucleares y a los signos clsicos de inicio brusco y duracin breve y la fase crnica se reere a procesos prolongados y con menos signos inamatorios.(1) Otitis externa: se dene como la infeccin aguda o crnica del odo externo. Los factores de importancia en la patogenia de la otitis externa incluyen: traumatismo local, furunculosis, cuerpos extraos, o humedad excesiva, que causa maceracin del epitelio del odo externo (odo del nadador). Algunas veces se desarrolla otitis externa como extensin de una infeccin del odo medio, con drenaje purulento a travs de la membrana timpnica perforada.(1) Otitis media: el trmino de otitis media se reere a la inamacin del odo medio e incluye no solo a esa cavidad sino tambin a la trompa de Eustaquio y mastoides. Se produce inltracin por polimorfonucleares y se observan los signos clsicos de inamacin aguda. Segn la duracin, puede dividirse en aguda y crnica.(2) La trompa de Eustaquio, que comunica el odo medio con la nasofaringe y realiza tres funciones: ventilacin, proteccin y limpieza a travs del transporte mucociliar, parece tener una participacin importante en la predisposicin de los pacientes a este tipo de infeccin. Las infecciones virales respiratorias superiores o los trastornos alrgicos pueden causar inamacin y edema de la trompa de Eustaquio o su oricio alterando sus funciones, la ms importante puede ser la ventilacin, cuando sta se pierde se absorbe oxgeno del aire hacia el odo medio y se genera presin negativa. La presin a su vez permite la entrada de bacterias potencialmente patgenas de la nasofaringe hacia el odo medio y el fracaso de su eliminacin normal puede ocasionar colonizacin e infeccin. Otros factores que pueden llevar a afecciones de la funcin de la trompa de Eustaquio son anomalas anatmicas, como hipertroa tisular o cicatrizacin alrededor del oricio, disfuncin muscular vinculada con paladar hendido y falta de rigidez de la pared de la trompa. Esta ltima, es frecuente en la lactancia y la niez temprana, mejora con la edad y puede explicar en parte por qu la otitis media aparece ms a menudo en lactantes de seis a 18 meses de edad y despus disminuye de frecuencia al establecerse la permeabilidad de la trompa de Eustaquio.(1) Otitis media aguda (OMA): es una inamacin de la cavidad del odo medio asociada a una infeccin aguda, con acmulo de lquido generalmente purulento y que se asocia a signos como: membrana timpnica opaca o hipermica, que puede estar abombada y con poca movilidad a la neumatoscopia y sntomas como: otalgia, ebre, irritabilidad, anorexia, vmito y disminucin de la audicin. Es una complicacin frecuente (30%) de las infecciones agudas de las vas respiratorias en nios de 3 meses a 3 aos de edad, que se incrementa en aquellos que asisten a guardera. Existen varias entidades nosolgicas dentro de la otitis media
66
aguda y del adecuado reconocimiento de cada una de ellas depender el manejo apropiado del paciente. Otitis media serosa: es la presencia de un trasudado lquido en la cavidad del odo medio en un paciente asintomtico (sin datos de infeccin aguda). Con frecuencia es posible visualizar un trasudado de color mbar o ligeramente azulado a travs de una membrana timpnica translcida intacta. Sin embargo, el hallazgo ms frecuente es una membrana timpnica opaca. Otitis media aguda recurrente: es la presencia de episodios repetidos de OMA con periodos de completa recuperacin (sin secrecin) del odo medio entre cada uno de stos. Para que un nio sea diagnosticado con OMA recurrente debe haber tenido tres o ms episodios de OMA en los ltimos seis meses, o cuatro durante el ltimo ao. Otitis media aguda no complicada: es la presencia de OMA en un nio sin la presencia simultnea de otras complicaciones tales como bacteremia, mastoiditis, meningitis, sinusitis o absceso cerebral.(3) Otitis media crnica (OMC): El nombre de otitis crnica se aplica a la inltracin del mucoperiostio por clulas esfricas, es decir, las de inamacin crnica. Suele ser producto de infeccin aguda que no se ha resuelto de modo apropiado, ya sea por tratamiento inadecuado en la fase aguda o por factores del husped que perpetan el proceso inamatorio (ej. disfuncin continua de la trompa de Eustaquio por factores alrgicos, anatmicos o inmunodeciencia). Las secuelas incluyen destruccin progresiva de las estructuras del odo medio y riesgo signicativo de sordera permanente. La patognesis de la OMC no es bien conocida. Las causas de la OMC son complejas y varan de un paciente a otro; entre ellas se incluyen defectos del desarrollo, como en el caso de la sura palatina, movilidad disminuida del extremo farngeo de la trompa de Eustaquio (adenoides grandes, tumores), infecciones de adenoides o de los senos paranasales con estasis linftica en la trompa, tumefacciones alrgicas de la mucosa tubotimpnica. Tambin se han descrito condiciones anatomofuncionales locales predisponentes como la disfuncin tubaria y escasa neumatizacin mastoidea. Puede ser supurada o no, en el primer caso hace referencia a una infeccin clnica activa.(1, 2) Epidemiologa
La otitis media serosa (secretoria) se reconoce como la patologa mas frecuente de la edad peditrica y una de las patologas sobre la que ms inters, discusiones y controversias se producen, debido fundamentalmente a las especiales caractersticas que la acompaan. La ms importante es, sin duda, que usualmente no produce los sntomas que esperamos encontrar en una patologa que puede ocasionar complicaciones
67
PRctica 5
tan serias, anatmicas y funcionales, en el paciente que la padece. Es por esto que se le denomina sndrome silencioso. Por este motivo gran cantidad de episodios de otitis medias secretorias pasan sin ser diagnosticadas con las consecuentes alteraciones fsicas y de desarrollo intelectual como: retraso en la adquisicin del lenguaje, retraso escolar y alteraciones del comportamiento. Todas estas caractersticas hacen que la incidencia real de la enfermedad sea desconocida, aunque muchos autores han tratado de establecer porcentajes aproximados.(4) La OMA es una de las enfermedades que se diagnostican con mayor frecuencia en nios menores de 5 aos en todo el mundo. Un reporte mostr que se identica desde 22,7% de los nios durante el primer ao de vida hasta 40% en nios de 4 a 5 aos de edad.(3) La prevalencia de infecciones recurrentes del odo medio parece ir en aumento debido a una asistencia cada vez mayor de nios a guarderas, o a problemas alrgicos. Algunos estudios prospectivos han demostrado que en nios de 3 meses a 3 aos de edad con infecciones agudas de vas respiratorias superiores, una tercera parte llegan a complicarse con OMA, y que los nios menores de 2 aos que asisten a guarderas tienen episodios de OMA y sntomas de vas respiratorias persistentes con una frecuencia aun mayor. Otros factores de riesgo conocidos para el desarrollo de OMA temprana en nios son el tabaquismo pasivo, el uso del chupn y la alimentacin con bibern en posicin horizontal.(3) En algunos casos hay persistencia de secrecin estril posterior a la resolucin de la infeccin aguda, sta puede variar entre 1 y 3 meses. Existen factores de riesgo implicados en esta persistencia como: bajo peso al nacer y prematuridad, sexo masculino, condiciones socioeconmicas desfavorables, asistencia a guarderas, polucin y tabaco, tipo de lactancia, la edad del primer episodio, factores genticos e inmunitarios y cambios en la climatologa; adems, inuyen en la aparicin, recurrencia y evolucin de la enfermedad. Estas mltiples causas van a dar lugar a una disfuncin de la trompa de Eustaquio, esta situacin es tambin favorecida por las diferencias entre la trompa infantil y la adulta.(4) Una de las complicaciones ms frecuentes de la OMA es el desarrollo de OM serosa con la consiguiente disminucin de la audicin. Cuando sta se prolonga, se acompaa de una afectacin potencial en el aprendizaje y en la expresin del lenguaje. Otras menos frecuentes, que si no son reconocidas a tiempo pueden poner en riesgo la vida de los nios, son la mastoiditis y los abscesos intracerebrales. Aunque estudios con controles histricos indican que estas complicaciones supurativas parecan ocurrir con mayor frecuencia en la era preantibitica, 13 de los casos reportados en la era postantibitica con frecuencia se asocian a un manejo inapropiado del episodio de OMA. De acuerdo con una estimacin de la Organizacin Mundial de la Salud en pases en vas de desarrollo, el nmero de muertes asociadas a las complicaciones de la OMA en nios menores de cinco aos llega a 50.000 al ao. Esto podra estar asociado a un reconocimiento tardo de dichas complicaciones o al efecto de un estado nutricional precario.(3)
68
Manifestaciones La otitis externa se caracteriza por inamacin del conducto auditivo y drenaje purulento, que puede ser muy doloroso con extensin de la celulitis a los tejidos blandos adyacentes. Una forma frecuente se vincula con la natacin en agua tal vez contaminada por microorganismos aerobios gramnegativos como especies de Pseudomonas. La otitis externa maligna es una forma considerablemente ms grave de infeccin del conducto auditivo externo, que puede llevar a la invasin del cartlago y hueso adyacentes y en ocasiones a la parlisis de nervios craneales y la muerte. Se observa con mayor frecuencia en ancianos con diabetes mellitus y en pacientes de cualquier edad con inmunosupresin. El agente patgeno causal ms frecuente es P. aeruginosa. La otitis media aguda, casi siempre producida por bacterias, suele ser una complicacin de las enfermedades virales agudas de las vas respiratorias superiores. Se maniesta frecuentemente con ebre, irritabilidad y dolor agudo y el estudio otoscpico revela protrusin de la membrana timpnica, mala movilidad y ocultamiento de los puntos de referencia anatmicos normales por la presencia de lquido y clulas inamatorias bajo presin. En algunos casos la membrana timpnica est inamada de manera aguda y presenta ampollas en su supercie externa (miringitis). Si se trata de forma inadecuada, la infeccin puede avanzar hasta afectar estructuras adyacentes, como las clulas areas mastoideas (mastoiditis), o causar la perforacin con drenaje espontneo a travs de la membrana timpnica. Las posibles secuelas supurativas agudas incluyen extensin hacia el sistema nervioso central y septicemia. Como ya se haba mencionado antes, la otitis media crnica suele ser producto de una infeccin aguda que no se resolvi de modo apropiado. La otitis media serosa puede representar una forma de otitis media o inamacin relacionada con alergia crnica. Tiende a ser crnica, produce dcit auditivo y se vincula con secreciones espesas en el odo medio que por lo general no son purulentas.1 Flora habitual del odo externo La microbiota general del odo externo es similar a la de la piel, predominando Staphylococcus (coagulasa-negativo) y miembros del gnero Corynebacterium. Con menos frecuencia se observan especies de Bacillus, Micrococcus y Neisseria. En esta localizacin se han aislado tambin otros microorganismos que colonizan la piel en forma transitoria como Streptococcus pneumoniae, P. aeruginosa y especies de la familia Enterobacteriaceae, entre ellos, los gneros Proteus, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella. Estudios micolgicos demuestran que los siguientes gneros de hongos pertenecen a la microbiota normal: Aspergillus, Alternaria, Penicillium, Candida y Saccharomyces.(5,6)
69
PRctica 5
Agentes causales comunes Desde hace dcadas, los patgenos bacterianos asociados a OMA han permanecido sin cambios signicativos, en los distintos grupos de edad as como en reas geogrcas (Tabla 13). Despus de los primeros tres meses de vida, S. pneumoniae es el agente causal ms aislado de otitis media aguda y representa 35 a 40% de los casos. H. inuenzae tambin es comn (14-27%), en particular, en pacientes menores de cinco aos de edad. Casi ningn tipo de H. inuenzae aislado del odo medio se puede identicar; por tanto, no cabra esperar que la vacuna actual contra la cepa de tipo b redujera de manera notoria la incidencia de otitis media aguda.
Sin embargo, slo en el 58 a 75% de los casos se logra aislar alguna bacteria. Estudios realizados para la identicacin de agentes virales en el lquido del odo medio de pacientes con OMA han demostrado su presencia en 41% de ellos, pudiendo coexistir hasta tres virus de manera simultnea, que por orden de frecuencia son: Virus sincicial respiratorio, virus parainuenza e inuenza. La coexistencia bacterias-virus en el lquido del odo medio es una causa de otitis media aguda persistente y un retraso de 2 a 4 das en la esterilizacin del lquido por los antimicrobianos.(1,3)
70
Diagnstico El diagnstico de las infecciones ticas se establece con base a la exploracin clnica. En casos de sospecha de otitis media se puede hacer timpanometra para detectar la presencia de lquido en el odo medio y valorar la funcin de la membrana timpnica. La causa especca de la otitis externa puede determinarse por cultivo de material obtenido del conducto auditivo afectado; no obstante, debe tenerse en cuenta que la contaminacin supercial y la ora cutnea normal pueden originar cultivos mixtos que son origen de confusin. Por ello, es recomendable tomar muestra del material de ambos conductos auditivos. En la otitis media, el mtodo diagnstico ms preciso es la aspiracin cuidadosa con una aguja estril a travs de la membrana timpnica, despus de descontaminar el conducto auditivo. La tincin de Gram y el cultivo de tales aspirados son muy conables; empero, dichos procedimientos se reservan para pacientes en los que las posibles causas son muy variadas, como en lactantes pequeos o cuando existe inadecuada respuesta clnica al tratamiento antimicrobiano usual. No se puede conar en los cultivos del aparato respiratorio ni en los de nasofaringe para emitir un diagnstico causal.(1) Para el anlisis de secrecin tica, se debe tomar en cuenta el tipo de otitis que presente el paciente: otitis externa, otitis media serosa con o sin ruptura timpnica. Una vez hecho esto se tomar la muestra dependiendo del caso. Si se trata de una otitis externa se limpia el canal externo con solucin salina siolgica estril y se introduce un hisopo estril en el conducto auditivo externo. Los cultivos de canal auditivo externo generalmente no reejan la causa bacteriana de la otitis media, a menos que haya habido una ruptura reciente de membrana del tmpano. Con respecto a la secrecin tica de odo medio, sta es una muestra que debe ser obtenida a travs de un procedimiento mdico; posterior a la limpieza del canal auditivo externo con un antisptico suave, se recolecta la muestra mediante aspiracin, desde el tmpano o ms atrs.(7) Si las muestras no son tomadas en el laboratorio stas pueden ser transportadas en frasco estril o en medio de transporte Stuart, mantenindose a temperatura ambiente hasta 2 horas luego de la toma. Para investigar hongos es necesario incluir exmenes en fresco que permitan observar sus estructuras caractersticas as como medios de cultivo que permitan su desarrollo y posterior identicacin. Si se requiere la realizacin de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana tener en cuenta la eleccin del agar Mueller Hinton (Mueller Hinton bsico, Mueller Hinton con 5% de sangre y Mueller Hinton con 2% de cloruro de sodio) dependiendo del microorganismo identicado.
71
PRctica 5
Tratamiento
Excepto en casos graves, la otitis externa puede tratarse mediante limpieza suave con soluciones tpicas. Las bacterias gramnegativas ms a menudo referidas son susceptibles a un ambiente cido y suelen ser ecaces las soluciones ticas amortiguadas a un pH bajo (3.0 o menos), como aquellas con cido actico al 0,25%. Se dispone de varios preparados, de los cuales un gran porcentaje de los mismos tambin contienen antimicrobianos. La otitis media aguda requiere de antimicrobianos y vigilancia cuidadosa de la evolucin para asegurar su resolucin. La seleccin del antimicrobiano suele ser emprica, ideada de forma especca para cubrir a los patgenos bacterianos ms frecuentes, porque la aspiracin directa para nes diagnsticos casi nunca es necesaria. En el caso habitual, esos microorganismos patgenos son S. pneumoniae y H. inuenzae. Si hay presin extrema con dolor intenso, tal vez sea necesario el drenaje de los exudados del odo medio mediante incisin cuidadosa de la membrana timpnica. En pacientes con otitis media serosa o crnica, el tratamiento tal vez sea ms complejo y suele aconsejarse buscar interconsulta otorrinolaringolgica para determinar procedimientos diagnsticos adicionales, as como planear posibles medidas teraputicas mdicas y quirrgicas.(1)
5 Actividad prctica
Etapa pre-analtica
Aspectos a considerar del paciente Se debe tomar en cuenta tipo de otitis que presenta. Nombre, edad, sexo, cdula de identidad, ocupacin, procedencia Signos y sntomas, impresin diagnstica Historia clnica del paciente Si est recibiendo o recibi algn tipo de tratamiento Aspectos a considerar de la muestra Si el laboratorio est en capacidad de tomar y procesar la muestra para el examen requerido. Si la muestra no fue tomada en el laboratorio se debe tener en cuenta: si viene bien rotulada, transportada de forma adecuada, tiempo de toma de la muestra, si es apta para el tipo de anlisis a realizar, si est en suciente cantidad.
72
Etapa analtica
Primer perodo Materiales
Hisopos estriles KOH al 10% Solucin salina fisiolgica estril (SSF) En caso de haber observado estructuras fngicas: Agar saboraud dextrosa con y sin Medios de cultivo: agar sangre, agar antibiticos, agar actidione, bilis-agar. chocolate suplementado, agar Mac En caso de que la muestra sea tomada Conkey y agar manitol salado. a distancia del laboratorio debe trans Equipos para tincin de Gram portarse en el medio Stuart. Lminas y laminillas Procedimiento Toma de muestra del conducto auditivo externo: 1. Limpiar el canal auditivo externo con un hisopo impregnado con SSF. 2. Humedecer varios hisopos estriles con solucin salina igualmente estril y tomar la muestra del conducto auditivo externo de cada odo. Introducir el hisopo siguiendo una direccin oblicua de atrs hacia delante y de abajo hacia arriba. Obtener la muestra del margen activo, incluyendo la secrecin fresca de reas profundas. 3. Realizar un examen directo y colorearlo con la tincin de Gram con muestra proveniente de cada odo, los hisopos se descartan una vez utilizados. 4. Preparar exmenes en fresco con SSF y KOH si se sospecha de hongos. Describa lo observado: Gram de odo derecho Gram de odo izquierdo
SSF
KOH 10%
73
PRctica 5
5. Sembrar la muestra de cada odo por separado en una misma placa. Hacer este procedimiento con cada uno de los agares (Fig. 10). 6. Diseminar e incubar bajo condiciones de microaerolia a 37 oC por 24-72 horas los medios de agar sangre y agar chocolate suplementado y en aerobiosis el agar MacConkey y el agar manitol salado
Muestra (Conducto auditivo externo)
SSF KOH al 10 % *
Gram
AS
ACH
AMK
AMS
Sembrar en agar Sembrar en agarSaboraud Saboraud dextrosa con yysin dextrosa con sinantibitico, antibitico, bilis esculina, agar actidione. agar bilis, agar actidione.
Identificacin
Segundo perodo
Materiales Hisopos estriles Solucin salina fisiolgica estril (SSF) Medios de cultivo: Agar Mueller Hinton, agar Mueller Hinton ms 5% de sangre.*, Mueller Hinton ms 2% de cloruro de sodio*
* Depende del microorganismo aislado.
Patrn de McFarland. Discos de antibiticos. Equipos para tincin de Gram Lminas Pruebas bioqumicas dependiendo de la bacteria en estudio.
74
Procedimiento 1. Revisin de los cultivos sembrados cada 24 horas hasta las 72 horas de incubacin. Describa las caractersticas observadas en cada medio de cultivo: Agar sangre
2. Hacer un extendido para la coloracin Gram y observar microscpicamente los diferentes tipos de colonias encontrados en el cultivo. Describa lo observado:
3. Hacer una suspensin en caldo BHI de la bacteria en estudio, si fuere necesario. 4. Realizar las pruebas bioqumicas dependiendo de la bacteria aislada por identicar e incubar dichas pruebas a temperatura y tiempo adecuado.
75
PRctica 5
Tercer perodo
Materiales Reactivo para prueba de oxidasa. Reactivo para prueba de catalasa. (Perxido de hidrgeno). Papel de filtro. Palillos de madera.
Etapa post-analtica
Realizar el reporte nal (Anexo 2).
Autoevaluacin
1. Cules son los diferentes tipos de muestra para el diagnstico microbiolgico de una infeccin tica? 2. Qu medios de cultivo utilizara usted en una secrecin tica?
76
3. Qu factor contribuye a que en un nio de corta edad se instalen con mayor facilidad grmenes de la regin rinofarngea? 4. Describa detalladamente los pasos a seguir para realizar una toma de muestra de secrecin tica del conducto auditivo externo. 5. Qu medios de transporte utilizara usted para trasladar una muestra tomada a distancia? 6. Nombre las diferentes bacterias patgenas que originan problemas ticos. 7. Por qu se incluye examen en fresco con SSF y KOH 10%? 8. Por qu los nios menores de 5 aos son ms propensos a sufrir de OMA? 9. Describa los pasos a seguir al realizar el informe de un paciente con secrecin tica.
Bibliografa
(1) Ryan K, Ray C. Sherris. Microbiologa mdica. 4 ed. Mxico: Mc Graw Hill; 2004. (2) Bernldez P, Morales G, Quantin L, Hernndez C, Litterio M. Otitis media crnica supurada en nios. Arch. Argent Pediatr 2004; 102(3):174-179. (3) Villaseor Sierra, A. Actualidades en el diagnstico, tratamiento y prevencin de la otitis media aguda. Enferm Infec Microbiol 2004; 24 (3). Disponible en red: www.amimc.org.mx/revista/2004/vol_24-3/actualidades.htm (4) Prez-Piero B, Campos M, Castro-Conde J, Lpez-Aguado D. Otitis media serosa. Canarias Peditrica 2000; 24 (1): 65-76. (5) Murray P, Rosenthal K, Kobayashi G, Pfaller M. Microbiologa mdica. 4 ed. Espaa: Mosby; 2004. (6) Prescott L, Harley J, Klein D. Microbiologa. 4 ed. Madrid: McGraw-Hill; 2000. (7) Montiel F, Lam M. Manual de microbiologa clnica. Chile: Publicaciones Mediterrneo; 2001.
77
prctica 6
Objetivo general
Desarrollar la estrategia metodolgica para el diagnstico de infecciones oculares.
Objetivos especficos
1. Enumerar los microorganismos de la ora habitual y los principales patgenos del rgano de la visin. 2. Describir los principales cuadros infecciosos que afectan al rgano de la visin. 3. Describir las condiciones del paciente y la tcnica adecuada para la obtencin de secrecin y raspado conjuntival. 4. Obtener y procesar muestras de secrecin y raspado conjuntival para la investigacin de agentes productores de conjuntivitis. 5. Identicar los microorganismos de inters clnico segn los esquemas convencionales del diagnstico microbiolgico. 6. Distinguir un proceso infeccioso de un proceso alrgico a travs de la deteccin de eosinlos.
Aspectos tericos
El rgano de la visin en su conjunto cuenta con un sistema altamente especializado para hacerle frente a las injurias del medio ambiente externo, como una capa resistente de colgeno que recubre las estructuras intraoculares y membranas conjuntivales que tapizan los prpados y se extienden sobre la supercie del globo ocular. Las pestaas previenen la entrada de cuerpos extraos en el ojo durante el parpadeo (aproximadamente de 5 a 20 veces por minuto). Las secreciones de las
79
PRctica 6
glndulas lagrimales y de las clulas caliciformes arrastran las bacterias y materiales extraos. Por otra parte, la lisozima y la Ig A son secretadas localmente coadyuvando en la defensa natural del ojo.(1) En el saco conjuntival existe una microbiota habitual relativamente escasa. Entre los microorganismos que se encuentran con mayor frecuencia se citan: Staphylococcus epidermidis, Lactobacillus sp. y Corynebacterium sp. Entre 0-30% de las personas son portadores de S. aureus y Haemophilus inuenzae no tipicables en 0,4-25%. En un pequeo porcentaje de individuos se presentan Moraxella catarrhalis, algunas Enterobacterias, S. pyogenes, S. pneumoniae, otros alfa y beta-hemolticos.(2)
La conjuntivitis aguda es la presentacin clnica ms comn, segn su etiologa se clasica en:(3,4,5) Conjuntivitis no gonoccica: ocasionada frecuentemente por S. aureus, S. pneumoniae y H. inuenzae biogrupo aegyptius, Moraxella lacunata; stos se adquieren por inoculacin mano-ojo y por fmites.
80
Kiralba Snchez
Conjuntivitis gonoccica: producida por N. gonorrhoeae, afecta principalmente a los adultos que se contagian por un contacto sexual con sujetos con gonorrea o por autoinoculacin (genital-mano-ojo). El neonato puede infectarse durante el paso por el canal de parto de la madre con infeccin gonoccica. Conjuntivitis de inclusin: causada por Chlamydia trachomatis serotipos D hasta la K, se produce en los adultos (por autoinoculacin) y en los neonatos (durante el paso por el canal de parto infectado). Conjuntivitis alrgica: producida por una reaccin de hipersensibilidad tipo I o analctica frente a determinados antgenos, como plenes que son transportados por el aire. La conjuntivitis crnica: se caracteriza por exacerbaciones y remisiones durante meses o aos. Los sntomas son similares a los de la conjuntivitis aguda, aunque menos intensos, puede presentarse hiperemia conjuntival con secrecin acuosa, mucoide o sin ella. Las causas son variadas: infecciosas, alrgicas, iatrognicas, entre otras.(3) El tracoma: es un tipo de conjuntivitis crnica producida por C. trachomatis serotipos A, B, Ba y C; cursa con hipertroa folicular conjuntival, neovascularizacin corneal y cicatrizacin grave de la conjuntiva, crnea y prpados, que pueden conducir a una prdida irreversible de la visin.(5) Otros cuadros clnicos menos frecuentes se citan a continuacin: Queratitis: es la inamacin de la crnea producto de la aplicacin de medidas quirrgicas con nes curativos o correctivos y del uso indiscriminado de ciertos medicamentos tipo corticoesteroides o antibiticos, as mismo estn implicados en un 60-90% las infecciones bacterianas producidas por: Pseudomonas aeruginosa, S. aureus o Streptococcus del grupo viridans, tambin levaduras como Candida albicans.(6) Blefaritis: es una inamacin del borde palpebral con hiperemia, engrosamiento y formacin de escamas o costras o lceras superciales. Las de origen infeccioso son producidas principalmente por S. aureus. La blefaritis crnica es causada por Demodex folliculorum, especies de Corynebacterium y Staphylococcus sp.(3,6) Orzuelo: induracin redondeada y dolorosa localizada en el folculo de la pestaa o en una o ms glndulas de Zeis, Moll o de Meibomio. El microorganismo implicado generalmente es S. aureus.(3)
81
PRctica 6
Diagnstico
El diagnstico etiolgico de las infecciones oculares requiere de un cuidado minucioso en el momento de la obtencin de la muestra. Es de resaltar que la muestra a seleccionar juega un papel muy importante para la deteccin de algunos microorganismos fastidiosos y complejos para su deteccin.
Etapa pre-analtica
El estudio epidemiolgico del paciente incluye, adems de los datos liatorios del paciente, la impresin diagnstica, evolucin clnica del proceso infeccioso (ver cuadros clnicos), antecedentes de traumatismos, enfermedades subyacentes, usos de lentes de contacto, uso de corticoesteroides tpicos, entre otros.(2)
Etapa analtica
La obtencin de la muestra constituye un punto clave para la consecucin de un resultado conable. En la tabla 15 se especican los tipos de muestras que son requeridos segn el cuadro clnico, asimismo, los microorganismos patgenos y potencialmente patgenos que se asocian a cada caso.(3,7)
82
Kiralba Snchez
Para la investigacin de C. trachomatis obtener raspado conjuntival. En pacientes inmunocomprometidos. Muestras obtenidas por el especialista en oftalmologa. En pacientes que usan lentes de contacto blandos. En pacientes con antecedentes de traumatismo. Slo para la bsqueda de Demodex folliculorum.
Tomado de: Beers y Berkow, 1999; Mandell y col., 2002; Ryan y Ray, 2005.
83
PRctica 6
Procedimiento
En el caso de conjuntivitis, la muestra se obtendr del ngulo interno del ojo. 1. Utilizar hisopos estriles de algodn o alginato de calcio 2. Humedecer el hisopo en solucin salina siolgica estril 3. Rotar suavemente el hisopo en el ngulo interno del ojo 4. Cultivar cada ojo por separado en una misma placa AS y ACHs (Fig. 11). 5. Incubar a 36 C, bajo condiciones microaerlas por 24 h hasta 72 h. 6. Obtener muestras de cada ojo para realizar los preparados directos en lminas para teir con Gram y Hansel. 7. Obtener raspado conjuntival del borde interno del prpado superior e inferior para la investigacin de C. trachomatis, realizar el frotis siguiendo las instrucciones del docente y teir con la coloracin de Giemsa. Observacin: Para la investigacin de otros microorganismos poco frecuentes en infecciones oculares se recomiendan los siguientes medios de cultivo:(2) Anaerobios: caldo tioglicolato, agar sangre con base Schaedler Micobacterias: Lowestein-Jensen Corynebacterium diphtheriae: medio inclinado de Loefer, agar telurito de potasio Hongos: Saboraud-glucosa con y sin antibiticos, agar bilis semislido.
84
Kiralba Snchez
Revisin de los cultivos 1. Revisar los cultivos cada 24 horas, hasta las 72 horas 2. Inspeccionar las placas de AS y ACH, estimar el nmero de cada microorganismo en cada placa. El desarrollo de moderado o abundante crecimiento bacteriano, tercer o cuarto cuadrante de la placa respectivamente, podra indicar una etiologa bacteriana de la infeccin. Al crecimiento de escasas colonias de algn patgeno, se le debe dar importancia. Estos hallazgos deben correlacionarse con el examen directo (Gram).
Muestra Secrecin ocular y Raspado conjuntival Medio AMIES
AS
ACH
Incubacin
36 C
AMS
TM
CO2 24-48 h
CO2 4 das
aerobiosis x 24 h X
CO2 24-48 h
Reporte