Microbiologia de Alimentos Dra Adenilde R Nascimento

UNIVERSIDADE PR-REITORIA CENTRO
FEDERAL DO MARANHO
DE PESQUISA E PS-GRADUAO
DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DE TECNOLOGIA QUMICA
DEPARTAMENTO
CURSO DE ESPECIALIZAO
EM
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
P ROF . D RA . A DENILDE R IBEIRO N ASCIMENTO
SO LUS - MA 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHO CURSO DE PS-GRADUAO LATO SENSU ESPECIALIZAO EM TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
Reitor Fernando Antonio Guimares Ramos Pr-Reitor de Pesquisa e Ps-Graduao Joo Elias Mouchrek Filho Diretor do Depto. de Ps-Graduao Lauro Gomes de Oliveira Diretora da Diviso de Cursos de Ps-Graduao dila de Queiroz Soares Idealizador do Curso Gilson de Sousa Mendona Coordenador do Curso Pedro Jafar Berniz Chefe do Depto. de Tecnologia Qumica Victor Elias Mouchrek Filho Consultores Adenilde Ribeiro Nascimento Victor Elias Mouchrek Filho Colaboradores Andr Gustavo L. de A. Martins Silvio Carvalho Marinho
possibilidade de acesso da populao ao alimento, mas tambm em funo da qualidade sanitria desse alimento. Os profissionais da rea de alimentos devem, portanto, estar atentos aos riscos de transmisso de microrganismos patognicos causadores de doenas veiculadas por alimentos. Este profissionais trabalho da rea tem de como objetivo e afins, fornecer a estudantes bsicas e de
tualmente uma das grandes preocupaes dos estudiosos e das organizaes no governamentais a questo da segurana alimentar, no s em relao disponibilidade e
alimentos
informaes
microbiologia de alimentos (teoria e prtica). O material apresenta contedo moderno, incluindo um texto claro e objetivo (Parte I) e tcnicas atualizadas de anlise de alimentos (Parte II).
So Lus, fevereiro de 2005. Adenilde Ribeiro Nascimento

D o u to r a e m Ci n c ia d o s A lim e n to s M ic r o b io lo g ia d e A lim e n to s
PARTE I: 9
CAPTULO I 1 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
1 HISTRIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS ................................................................... 1 2 IMPORTNCIA DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS ............................................................ 1 3 CLASSIFICAO DOS MICRORGANISMOS ................................................................................... 2 4 FONTES PRIMRIAS DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS NOS ALIMENTOS ............................. 2 5 CAUSAS DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS .......................................................................... 6
CAPTULO II 7 MICRORGANISMOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 7
1 BACTRIAS ............................................................................................................................... 7 1.1 MORFOLOGIA ........................................................................................................................ 7 1.1.1 CARACTERSTICAS MORFOLGICAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DOS ALIMENTOS ...8 1.2 CARACTERSTICAS DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ........11 1.3 MEIOS DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTRIAS .......................................................... 11 1.3.1 CARACTERSTICAS DO MEIO DE CULTURA ......................................................................... 12 1.3.2 CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA ......................................................................... 12 1.4 CICLO DE CRESCIMENTO MICROBIANO ................................................................................. 13 1.5 GNEROS DE BACTRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS ....................... 13 2 FUNGOS .................................................................................................................................. 19 2.1 BOLORES ............................................................................................................................. 20 2.1.1 CARACTERSTICAS GERAIS................................................................................................ 20
2.1.2 PRINCIPAIS GNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS ..................................... 21 3 LEVEDURAS ............................................................................................................................ 22 3.1 CARACTERSTICAS GERAIS................................................................................................... 22 3.2 PRINCIPAIS GNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS ................................... 24
C A P T U L O I I I 26 PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS DOS A L I M E N T O S Q U E A F E T A M O C R E S C I M E N T O M ICROBIANO 26
1 FATORES INTRNSECOS ........................................................................................................... 26 1.1 EFEITOS DO PH .................................................................................................................... 27 1.2 ATIVIDADE DE GUA (AW) ................................................................................................... 29 1.3 POTENCIAL DE OXI-REDUO .............................................................................................. 32 1.4 NUTRIENTES ........................................................................................................................ 33 1.5 CONSTITUINTES ANTIMICROBIANOS .................................................................................... 34 1.6 ESTRUTURAS BIOLGICAS OU SUBSTNCIAS INIBIDORAS .................................................... 35 2 FATORES EXTRNSECOS .......................................................................................................... 36 2.1 TEMPERATURA AMBIENTAL ................................................................................................. 36 2.2 UMIDADE RELATIVA ............................................................................................................ 38 2.3 PRESENA E CONCENTRAO DE GASES DO AMBIENTE........................................................ 39 3 COMBINAO DOS PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS ............................................. 40
C A P T U L O I V 41 A FLORA MICROBIANA DOS ALIMENTOS E M I C R O R G A N I S M O S D E T E R I O R A N T E S 41
1 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS.......................................................... 43 2 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NO-FORMADORES DE ESPOROS ......... 44 3 MICRORGANISMOS DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE ESPOROS ................. 44 4 BOLORES E LEVEDURAS DETERIORANTES ............................................................................... 44 5 DETERIORAO DE PRODUTOS LCTEOS ................................................................................ 46 6 DETERIORAO DE CARNE BOVINA E AVES ............................................................................ 47 7 DETERIORAO DE PESCADOS ................................................................................................ 48 8 DETERIORAO DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL .............................................................. 49 9 DETERIORAO DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS............................................................ 52 10 DETERIORAO DE PRODUTOS DE PANIFICAO .................................................................. 52 11 DETERIORAO DE ALIMENTOS DOCES ................................................................................. 53 12 INDICADORES DA VIDA DE PRATELEIRA ................................................................................ 53
C A P T U L O V 55 DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR
55
1 BREVE HISTRICO................................................................................................................... 55 2 TAMANHO DO PROBLEMA DAS DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR .......................................... 56 3 INTOXICAES ALIMENTARES ................................................................................................ 59 4 CONTROLE DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS ................................................................... 60 4.1 PROGRAMA DE VIGILNCIA ................................................................................................. 60 5 CAUSAS DA CONTAMINAO DE ALIMENTOS .......................................................................... 61 6 DOSE INFECTANTE .................................................................................................................. 62 6.1 VARIVEIS DO HOSPEDEIRO................................................................................................. 63 7 MICRORGANISMOS CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR ....................... 64 7.1 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTRIAS ............................................................... 64 7.2 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS ............................................................. 74 7.3 PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VRUS ........................................................................ 78 7.4 INTOXICAES CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS............................................. 80
C A P T U L O V I 84 MICRORGANISMOS INDICADORES
84
1 INDICADORES DE CONTAMINAO FECAL OU DA QUALIDADE HIGINICO-SANITRIA DO

ALIMENTO .................................................................................................................................. 86
1.1 COLIFORMES TOTAIS ........................................................................................................... 87 1.2 ENTEROCOCOS..................................................................................................................... 88 2 INDICADORES GERAIS DE CONTAMINAO DO ALIMENTO ....................................................... 89 3 CONTAGEM
PADRO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS (CONTAGEM PADRO EM PLACAS)..................................................................................................................................... 90
4 CONTAGEM DE BACTRIA PSICROTRFICAS E TERMFILAS .................................................... 91 5 CONTAGEM DE BACTRIAS ANAERBIAS ................................................................................ 91 6 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS .................................................................................. 91 7 OUTROS INDICADORES ............................................................................................................ 92
PARTE II: 94 C A P T U L O V I I 95 MTODOS DE ANLISES
95
1 CUIDADOS NA INTERPRETAO DOS RESULTADOS.................................................................. 96 2 AMOSTRAGEM ........................................................................................................................ 97 3 PREPARO DA AMOSTRA PARA ANLISE MICROBIOLOGICA ....................................................... 98 3.1 COLETA DA AMOSTRA ......................................................................................................... 98 3.2 RETIRADA DA AMOSTRA ...................................................................................................... 98 3.3 PREPARO DAS DILUIES ..................................................................................................... 99 3.4 SOLUES DILUENTES ......................................................................................................... 99
CAPTULO VIII 101 ESTIMATIVA DA POPULAO DE COLIFORMES TOTAIS, A 45C E ESCHERICHIA COLI ATRAVS DO NMERO MAIS P R O V V E L ( N M P ) 101 C A P T U L O I X 106 CONTAGEM PADRO EM PLACAS (CPP) DE M I C R O R G A N I S M O S A E R B I O S M E S F I L O S V I V E I S 106 C A P T U L O X 109 C O N T A G E M D E S T A P H Y L O C O C C U S A U R E U S 109 C A P T U L O X I 112 CONTAGEM DE BACILLUS CEREUS 112
1 MTODO COLIFORMES TOTAIS .............................................................................................. 102
1 TCNICA DE ANLISE............................................................................................................ 106
1 TCNICA DE ANLISES .......................................................................................................... 110
1 TCNICA DE ANLISE............................................................................................................ 112
C A P T U L O X I I 115 C O N T A G E M D E C L O S T R D I O S S U L F I T O R E D U T O R E S 115 CAPTULO XIII 118 P E S Q U I S A D E S A L M O N E L L A S P P . 118
1 TCNICA DE ANLISE............................................................................................................ 116
1 TCNICA DE ANLISE............................................................................................................ 118
CAPTULO XIV 121 CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
121
1 TCNICA DE ANLISE............................................................................................................ 121
C A P T U L O X V 122 TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL
122
1 MTODOS ............................................................................................................................. 123
A P N D I C E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125 R E F E R N C I A S .......................................................................
139
PARTE I:
CAPTULO I MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
1 HISTRIA
DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS
cientistas. Havia epidemias devastadoras, cujas causas no se conhecia. Os alimentos estragavam freqentemente e no se podia controlar esse processo; famlias inteiras morriam. Na Idade Mdia, milhares de pessoas morriam de ergotismo sem que se soubesse que se tratava de um fungo ( Claviceps purpurea ). Possivelmente a primeira pessoa a sugerir a existncia da relao entre os microrganismos e a deteriorao dos alimentos foi A. Kircher (1658), que examinou carne, leite e outras substncias e verificou a presena de vermes invisveis a olho nu. Contudo suas observaes no foram aceitas. Em 1765, L. Lpallanzanii derrubou a teoria da gerao espontnea com os seus experimentos. Apesar da importncia das contribuies mencionadas, foi o mdico francs L. Pasteur, o primeiro cientista a compreender o papel dos microrganismos nos alimentos. Em 1857, ele mostrou que o azedamento do leite cru era devido ao crescimento de microrganismos e em 1860, empregou o calor para destru-los, processo hoje chamado de Pasteurizao.
tualmente sabemos que os microrganismos so encontrados praticamente em todos os lugares. Antes da inveno do microscpio, os microrganismos eram desconhecidos dos
2 IMPORTNCIA
DOS MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS
As interaes entre os microrganismos e alimentos implicam em modificaes desagradveis. enzimticas e conseqentemente em sabores e odores
Especializao em Tecnologia de Alimentos
Adenilde Ribeiro Nascimento
O advento de alimentos preparados tem ocasionado problemas relacionados com doenas transmitidas pelos alimentos. A deteriorao devido conservao inadequada dos alimentos.
3 CLASSIFICAO
DOS MICRORGANISMOS
Os microrganismos so classificados em trs grupos distintos, dependendo do tipo de interao existente entre microrganismos e alimentos, conforme descrito a seguir. 1) Os microrganismos nos alimentos so causadores de alteraes qumicas prejudiciais resultando na deteriorao microbiana. Essas alteraes so conseqncias da atividade metablica dos microrganismos. 2) Os microrganismos presentes nos alimentos podem representar riscos sade intoxicao. 3) Os microrganismos presentes nos alimentos causam alteraes benficas em um alimento, modificando suas caractersticas originais de forma a transform-lo em um novo alimento fabricao de alimentos fermentados. microrganismos utilizados na patognicos doenas de origem alimentar infeco ou
4 FONTES
PRIMRIAS DE MICRORGANISMOS ENCONTRADAS NOS ALIMENTOS
Gneros e espcies mais importantes presentes nos produtos alimentcios so encontrados em oito fontes, descritas a seguir. a) Solo: O solo contm a maior variedade de microrganismos procedentes de todas as fontes de contaminao. Organismos do solo entram na atmosfera pela ao dos ventos e depois nos corpos dgua que so arrastados para alcanar o interior ou a superfcie dos alimentos.
So especialmente importantes alguns bolores, leveduras e algumas espcies dos gneros bacterianos Bacillus , Clostridium , Enterobacter , Escherichia , Micrococcus , Alcaligenes , Flavobacterium , Chromobacterium , Pseudomonas , Proteus , Streptococcus , Leuconostoc , Acetobacter . b) gua: As guas naturais no s contm sua prpria microbiota, como tambm microrganismos procedentes do solo e possivelmente de microrganismos procedentes de animais e de guas residuais. As espcies bacterianas existentes nas guas naturais so principalmente espcies dos gneros Pseudomonas , Chromobacterium , Proteus , Micrococcus , Bacillus , Enterococcus , Enterobacter e Escherichia coli . provvel que as trs ltimas bactrias sejam contaminantes. Para a microbiologia de alimentos dois aspectos so importantes: o aspecto de sade pblica e o aspecto econmico. c) guas residuais: Quando so utilizadas guas residuais
domsticas sem tratamento existe a possibilidade de contaminao por microrganismos patognicos para o homem (doenas do trato intestinal). As guas naturais contaminadas com guas residuais aportam os microrganismos nos mariscos, pescados e outros alimentos de origem marinha. Bactrias do grupo coliforme, Enterococos , Vibrio , outras bactrias intestinais e vrus so as principais contaminantes. d) Ar: A contaminao dos alimentos pelo ar pode ter importncia tanto por razes higinicas quanto econmicas. Os microrganismos patgenos, em especial os que so responsveis por infeces respiratrias podem ser transmitidos pelo ar que possivelmente contamina os alimentos. Os microrganismos que alteram os alimentos podem ter sua origem do ar (fermentaes). Os esporos de fungos do ar podem representar um inconveniente para alguns tipos de alimentos, como por exemplo, queijo, carnes, po, leite condensado etc. Um dos grupos de bactria que so particularmente bem adaptadas so Actinomycetos , especialmente aquelas do gnero Streptomyces , produz
Especializao em Tecnologia de Alimentos Adenilde Ribeiro Nascimento
esporos que sobrevivem muito bem no ar. Algumas espcies podem ser responsveis pelo odor e sabor desagradvel em gua potvel. e) Animais: Todos os animais saudveis possuem uma microbiota complexa, que pode ser transitria (microbiota normal de alguns indivduos) e patognica (capazes de matar seus hospedeiros). Grande quantidade de microrganismos freqentemente encontrada em: pele reas midas especialmente virilha ou entre os dedos; trato respiratrio nariz e orofaringe; trato digestivo boca e intestino grosso; trato urinrio parte anterior da uretra; trato genital vagina; A superfcie da pele dos humanos e outros animais exposta ao ar, solo e gua que contamina os alimentos e equipamentos. Os microrganismos so caractersticos de cada espcie do animal e nos humanos a microbiota normal da pele predominante so bactrias gram positiva dos gneros Staphylococcus , Corynebacterium e Propionibacterium . Para os animais produtores de carne so predominantes os Micrococos, Staphylococcus e Enterococos. O nariz humano e as mos so habitats primrios do Staphylococcus aureus , eles residem na mucosa do nariz. As secrees nasais contm um grande nmero de bactrias, em algumas pessoas, a maior parte de Staphylococcus que contaminam suas mos. As fezes e os alimentos de origem animal contaminados podem conter diversos microrganismos entricos, inclusive do gnero Salmonella .
f) Manipulao e tratamento: Outras contaminaes podem ter origem no equipamento que entra em contato com os alimentos nos materiais utilizados e nas pessoas. O pessoal que trabalha nas plantas de indstrias que fabricam alimentos pode contamin-los durante sua manipulao e tratamento. Alguns pesquisadores citam que os seres humanos eliminam de 10 3 a 10 4 microrganismos vivos por minuto. O nmero e tipo de microrganismos eliminados possuem uma relao ntima com o ambiente de trabalho. A microbiota das mos e roupas dos manipuladores de alimentos pode ser oriunda do solo, gua, poeira e outros ambientes. Outras fontes importantes so as fossas nasais, a boca e a pele. Em condies muito precrias de higiene tambm os microrganismos do trato gastrintestinal podem contaminar as mos dos manipuladores e, conseqentemente, os alimentos por eles preparados. As mos podem veicular vrios microrganismos importantes,
dependendo do tipo de alimento manipulado ou do momento da coleta das amostras para anlise. Os manipuladores de alimentos tm um importante papel na preveno das toxinfeces alimentares e das demais doenas de origem alimentar. As mos raramente esto livres de bactrias, que podem ser transitrias ou semipermanentes no interior ou na superfcie da pele. A microbiota das mos geralmente consiste de estafilococos. Eles aderem superfcie da pele e persistem nos folculos capilares, poros, cavidades e leses causadas por rachadura na pele, e eles no so facilmente removidos. g) Rao animal: Animais confinados, bovinos e sunos, assim como as aves, esto expostos a infeces provenientes de raes. Parte de amostras de raes base de peixes, ossos e carnes apresentam salmonelas. O consumo pode levar a uma excreo temporria e s vezes a doenas. Raes produzidas a partir de sobras do comrcio de carnes, reciclam as salmonelas de volta aos animais.
A ingesto de midos crus ou inadequadamente tratados pelo calor, provenientes de ovinos, aves, bovinos e outros animais levar inevitavelmente uma infeco por Salmonella . h) Utenslios Contaminao cruzada: Utenslios como recipientes, bandejas, facas, tbuas, moedores etc., tm papel importante como fonte de contaminao. As contaminaes cruzadas causam contaminaes ps-
processamento do alimento (ou seja, aps a etapa de cozimento). Podem ser evitadas por meio de: planejamento cuidadoso do ambiente e distribuio de
equipamentos da fbrica; controle do movimento de pessoal; hbitos adequados dos manipuladores quanto higiene.
5 CAUSAS
DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS
Existe um grande nmero de fatores que contribuem para tornar um alimento inseguro, causando toxinfeces quelas pessoas que o ingerem. As principais causas podem ser resumidas como: controle inadequado de temperatura durante o cozimento,
resfriamento e a estocagem; higiene pessoal insuficiente: contaminao cruzada entre produtos crus e processados; monitoramento inadequado dos processos.
CAPTULO II MICRORGANISMOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
participarem da elaborao de alimentos ou por serem responsveis por toxinfeces alimentares.
D
As
entre os microrganismos existentes, as bactrias e os fungos tm interesse para a microbiologia de alimentos por serem responsveis por processos de deteriorao, por
1 BACTRIAS caractersticas alimentos so das bactrias em relao no sua origem, das
reservatrios e o conhecimento a respeito de sua habilidade em sobreviver e crescer nos fatores importantes controle tanto toxinfeces alimentares como na deteriorao dos alimentos. A preveno est diretamente relacionada com a destruio da bactria e com a inibio de seu crescimento.
1.1 M O R F O L O G I A As bactrias podem ser encontradas sob forma de bacilos (em forma de basto), cocos (forma esfrica) e espirilos (forma de saca-rolhas ou curvadas). As bactrias individuais podem formar pares, grupos, cadeias ou outros agrupamentos; tais formaes so usualmente caractersticas de um gnero particular ou de uma espcie de bactria. A forma de uma bactria determinada por hereditariedade. Geneticamente, a maioria das bactrias monomrfica, isto , elas mantm uma nica forma. Entretanto, uma srie de condies ambientais pode
modificar sua forma, a qual, quando alterada, dificulta sua identificao. Algumas bactrias so pleomrficas, o que significa que elas podem ter vrias formas, e no apenas uma. Invisveis ao olho humano, as bactrias so normalmente medidas em micrmetros (m), que so equivalentes a 1/1000mm (10 - 3 mm). As clulas bacterianas variam em tamanho dependendo da espcie, mas a maioria tem aproximadamente de 0,5 a 1m em dimetro ou largura. O tamanho, a forma e o arranjo das bactrias constituem sua morfologia, sua aparncia externa.
1.1.1 C A R A C T E R S T I C A S
DOS ALIMENTOS
MORFOLGICAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA
Para identificao das bactrias de um determinado alimento so necessrios sua observao no microscpio com a finalidade para se determinar a forma, tamanho, tipo de agrupamento, estruturas e reaes de colorao das bactrias existentes nos alimentos. As estruturas de importncia so as seguintes: Produo de cpsula: O glicoclise bacteriano um polmero viscoso e gelatinoso que est situado externamente parede celular e composto de polissacardeo, polipeptdeo ou ambos. Sua composio qumica varia amplamente com as espcies. Na maioria dos casos, ele produzido dentro da clula e excretado para a superfcie celular. As cpsulas servem para aumentar a resistncia das bactrias s condies desfavorveis do meio, como a sua resistncia temperaturas elevadas e aos agentes qumicos. Em certas espcies, as cpsulas so importantes na virulncia bacteriana (o grau com que um patgeno causa doena). Para o prprio microrganismo podem ser teis como fonte de nutriente e reserva.
Produo de endsporos: As bactrias dos gneros Bacillus e Clostridium so de importncia de grande interesse para a microbiologia de alimentos, esses gneros formam clulas especializadas de repouso denominadas endsporos, clulas desidratadas altamente durveis, com paredes espessas e camadas adicionais. Eles so formados dentro da membrana celular bacteriana. Quando liberados no ambiente, podem sobreviver a temperaturas extremas, falta de gua e exposio a muitas substncias qumicas txicas e radiao. O processo de formao de endsporos dentro de uma clula-me vegetativa leva vrias horas e conhecido como esporulao. Os endsporos so importantes do ponto de vista clnico e na indstria alimentcia, pois so resistentes a processos que normalmente eliminam as clulas vegetativas. Estes processos incluem o aquecimento, o congelamento, a dessecao. Enquanto a maioria das clulas vegetativas eliminada temperatura acima de 70C, os endsporos podem sobrevier em gua fervente por vrias horas ou mais. Os endsporos de bactrias termoflicas podem sobreviver na gua fervente por 19 horas. As bactrias formadoras de endsporos so um problema na indstria de alimentos, pois podem sobreviver ao subprocessamento e, se ocorrerem condies para o crescimento, algumas espcies produziro toxinas e doenas. Alguns mtodos so utilizados para controlar os organismos que produzem endsporos. Parede celular: A parede celular de uma clula bacteriana uma estrutura complexa, semi-rgida, responsvel pela forma da clula. A principal funo da parede celular pr evenir a ruptura das clulas bacterianas quando a presso da gua dentro da clula maior que fora dela. A composio qumica da parede celular usada para diferenciar os principais tipos de bactrias. A parede celular permite a diviso das bactrias em dois grupos: bactrias gram positivas bactrias gram negativas
10
Colorao de Gram Christian Gram, microbiologista, queria visualizar as bactrias e descobriu o que atualmente o mundo conhece como Colorao de Gram. Christian Gram notou que as bactrias podiam ser coradas tanto de azul escuro (violeta) quanto de vermelho. Isso acontecia devido precipitao do cristal violeta com o lugol no interior do citoplasma da clula; precipitao essa que no podia ser extrada de certos organismos (gram positivos) com a utilizao de solventes como o etanol ou a acetona, porm poderia ser extrada de outros (gram negativos). Por essas ltimas clulas descorarem-se aps a utilizao de lcool ou acetona, uma colorao de contraste foi necessria, utilizando safranina ou fucsina. Os organismos gram positivos possuem uma parede celular grossa envolvendo a membrana citoplasmtica. Essa composta por peptdeo glicano e cidos teicicos. Os organismos gram negativos possuem uma parede celular mais fina que envolvida por uma outra membrana externa. Portanto, os organismos gram negativos possuem duas membranas. Membrana plasmtica: uma estrutura fina situada no interior da parede celular, revestindo o citoplasma da clula constituda de lipdeos, protenas e alguns carboidratos. A mais importante funo da membrana servir como uma barreira seletiva atravs da qual os materiais entram e saem da clula. Tambm so importantes para a digesto de nutrientes e a produo de energia. A membrana plasmtica vital para a clula bacteriana, ela o stio de ao de vrios agentes antimicrobianos. Alm das substncias qumicas que lesam a parede celular e assim expem indiretamente a membrana leso, muitos compostos lesam especificamente a membrana plasmtica. Estes compostos incluem certos lcoois e compostos de amnio, usados como desinfetantes.
11
1.2 C A R A C T E R S T I C A S
ALIMENTOS
DOS CULTIVOS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE
O crescimento bacteriano tanto no interior como na superfcie dos alimentos apresentam um aspecto desagradvel ou prejudicial. As bactrias que produzem pigmentos modificam a cor da superfcie dos alimentos, a superfcie dos lquidos podem ser cobertos por uma pelcula devido ao crescimento bactrias, tambm podem apresentar viscosidade, turbidez ou um sedimento no desejveis aos alimentos. Muitos fatores podem ser utilizados como uma srie de obstculos para prevenir o crescimento microbiano. Cada obstculo representa uma barreira que deve ser ultrapassada pela bactria para que ela possa contaminar e degradar os alimentos. As embalagens com atmosfera modificada, altas presses hidrostticas, luz ultravioleta e bacteriocinas so exemplos de um mtodo secundrio de conservao. O conceito dos obstculos deu origem tecnologia dos obstculos, que se baseia na utilizao simultnea de mais de uma forma de controle microbiano nos alimentos, como salga, acidificao, processamento trmico, adio de conservantes qumicos etc. O objetivo a obteno de produtos alimentcios estveis, de prolongada vida de prateleira, e seguros sade dos consumidores.
1.3 M E I O S
DE CULTURA PARA O CULTIVO DE BACTRIAS
O meio de cultura denominado o material nutriente preparado no laboratrio para o crescimento de microrganismos. Algumas bactrias podem crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e existem aquelas que no so capazes de crescer em nenhum meio de cultura j desenvolvido. Os microrganismos que crescem e se multiplicam nos meios de cultura so denominados cultura. Para o crescimento de microrganismos no laboratrio h uma grande variedade de meios de cultura. Muitos desses meios so disponveis em forma
12
comercial e contm todos os componentes desejados sendo necessrio somente a adio de gua para posterior esterilizao. Os meios de cultura esto constantemente sendo desenvolvidos ou mesmo atualizados para o isolamento e a identificao de bactrias, principalmente nas reas de pesquisa de alimentos, gua e microbiologia clnica. Para permitir o crescimento, o meio de cultura dever conter uma fonte de energia, uma fonte de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo e todos os fatores orgnicos que o organismo no capaz de sintetizar.
1.3.1 C A R A C T E R S T I C A S
DO MEIO DE CULTURA
O meio de cultura deve ser preparado de acordo com o tipo nutritivo do microrganismo que se pretende cultivar; Devero conter quantidade de gua necessria; pH ajustado; O meio de cultura dever inicialmente ser estril.
1.3.2 C L A S S I F I C A O
DOS MEIOS DE CULTURA
I. Quanto consistncia: lquido agar. II. manuteno. III. Quanto natureza: sinttico sinttico. Quanto funo:
caldo; semi-slido; slido
enriquecimento;
seletivo;
diferencial;
quimicamente definido; no-
13
1.4 C I C L O
DE CRESCIMENTO MICROBIANO
O ciclo de crescimento microbiano formado por seis fases, descritas a seguir. 1. Fase lag : As clulas no esto se multiplicando, mas sintetizando as enzimas apropriadas para o ambiente. 2. Fase de acelerao : Uma proporo crescente de clulas est se multiplicando. 3. Fase exponencial (ou log) : A populao est duplicando. O nmero de clulas cresce de maneira tal que, para visualizao grfica, melhor seria utilizar valores exponenciais (logartmicos). O grfico logartmico desta fase de crescimento uma linha reta devido a este tempo de gerao constante. Esta fase o perodo de maior atividade metablica da clula. No entanto, nesta fase de crescimento os microrganismos so particularmente sensveis s mudanas ambientais, s radiaes ou mesmo muitos dos compostos antimicrobianos. 4. Fase de desacelerao : Uma crescente proporo de clulas no est mais se multiplicando. 5. Fase estacionria : A taxa de nascimento igual de morte, resultando em um nmero igual de clulas em um dado tempo. A morte causada pelo esgotamento de nutrientes, pela acumulao de produtos finais txicos e/ou outras mudanas no ambiente. 6. Fase de morte : O nmero de clulas mortas maior do que o de clulas vivas.
1.5 G N E R O S
ALIMENTOS
DE BACTRIAS IMPORTANTES NA MICROBIOLOGIA DE
Os gneros bacterianos importantes para alimentos so agrupados nestas categorias:

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1. Bactrias gram negativas, aerbias e microaerbias; 2. Bactrias gram negativas aerbias estritas; 3. Bactrias gram negativas anaerbias facultativas; 4. Cocos gram positivos; 5. Bacilos gram positivos produtores de esporos; 6. Bacilos gram positivos no esporulados; 7. Outros.
1. Bactrias gram negativas, aerbias e microaerbias: Neste grupo, apenas o gnero Campylobacter tem importncia para os alimentos. So oxidase positivas, crescem em meios de cultura com baixa tenso de oxignio. As espcies importantes so C. jejuni , C. coli e C. lari que so patgenos causadores de gastrenterites humana.
2. Bactrias gram negativas aerbias estritas: Neste grupo so includos os seguintes gneros: Pseudomonas , Xanthomonas , Acinetobacter , Halobacterium , Alcaligenes , Halococcus , Alteromonas , Acetobacter , Brucella , Gluconobacter , Flavobacterium ,
Moraxella , Paychrobacter e Shewanella . Gnero Pseudomonas : Algumas espcies de Pseudomonas podem alterar os alimentos, estas bactrias so amplamente distribudas na natureza, podem ser encontradas em alimentos de origem animal e vegetal. Algumas Pseudomonas so patognicas para plantas. P. aeruginosa produz substncias txicas e so patgenos humanos oportunistas. Alguns casos de doena de origem alimentar foram causados por algumas espcies de Pseudomonas . So encontradas em alimentos refrigerados e congelados. Devido a sua baixa
15
resistncia trmica, s so encontradas em alimentos processados que sofreram contaminao ps-processamento. Gnero Halobacterium : So bactrias halfitas, encontradas
freqentemente em alimentos salgados, como pescados e carnes, produzem odor desagradvel e colorao vermelha devido ao pigmento. Gnero Acetobacter : Estas bactrias oxidam o lcool etlico a cido actico. So encontradas em frutas e hortalias e so responsveis pela deteriorao de sucos de frutas e bebidas alcolicas (vinhos, cervejas). Gnero Acinetobacter : So bacilos curtos, importantes agentes de deteriorao de alimentos, tanto crus como processados, incluindo carnes e carcaas de aves. Gnero Alcaligenes : So largamente distribudas na natureza, tm sido causadores de deteriorao de alimentos proticos (leite cru, carnes, ovos e laticnios). Produz viscosidade no leite. Gnero Alteromonas : So bactrias marinhas, causam deteriorao em pescados. Gnero Flavobacterium : As espcies deste gnero so produtoras de pigmentos amarelos ou vermelho em superfcie de carnes, aves, pescados (mariscos). Algumas espcies so psicrfilas e so encontradas em hortalias. Podem ser isoladas de gua, solo, animais, humanos e diversos alimentos. Gnero Brucella : Algumas espcies so patognicas: B. abortus , para o gado bovino e B. suis , patognica para os sunos. So espcies que podem causar brucelose no homem. As fontes de infeco so o leite cru, laticnios, carnes no cozidas ou derivados de carne.
3. Bactrias gram negativas anaerbias facultativas: Neste grupo esto includas as famlias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae.
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Gnero
Enterobacter :
So
bacilos
imveis,
fazem
parte
da
microbiota intestinal do homem e pertencem ao grupo dos coliformes. Estas bactrias so muito abundantes na natureza, podem causar deteriorao dos alimentos. Gnero Citrobacter : Pertencem ao grupo dos coliformes, so bactrias intestinais e podem ser encontradas em muitos alimentos, causam deteriorao nos alimentos. Gnero Escherichia : A principal espcie E. coli . Pertence ao grupo dos coliformes de origem fecal, faz parte da microbiota intestinal do homem e animais, so indicadoras de contaminao fecal de alimentos e gua, alguns sorotipos so patognicos para o homem e animais. Gnero Klebsiella : Fazem parte do grupo dos coliformes. Muitas bactrias deste gnero so capsuladas, se encontram com freqncia nas vias respiratrias e no trato intestinal do homem. Gnero Hafnia : So bacilos mveis, importantes na deteriorao de carnes refrigeradas e vegetais. Gnero Salmonella : As espcies destes patgenos so entricos. Seu principal reservatrio o trato gastrintestinal do homem e de animais, principalmente aves e sunos. So responsveis pelas infeces alimentares. Gnero Proteus : So bacilos mveis. So patgenos de origem alimentar, importantes na deteriorao dos alimentos. Gnero Shigella : So bacilos no esporulados. So encontrados no trato gastrintestinal do homem. Sua importncia nos alimentos deve-se sua patogenicidade. So os agentes causadores da shigelose (desinteria bacilar), que pode ser de origem alimentar. Gnero Aeromonas : So bacilos mveis e oxidase e catalase positivos. So anaerbios facultativos e podem ser psicrfilos, so bactrias aquticas, sendo habitantes naturais do intestino de peixes. A espcie A. hydrophila patognica para o homem e animais aquticos.
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Gnero Vibrio : So bactrias pertencentes famlia Vibrionaceae. So bacilos pequenos curvos ou retos. Algumas espcies so incapazes de multiplicar na ausncia de NaCl. As espcies V. cholerae , V. vulnificus e V. parahaemolyticus so patgenos importantes em alimentos. V. cholerae encontrado no trato gastrintestinal de humanos, na gua e ocasionalmente em alimentos.
4. Cocos gram positivos: Neste grupo esto includas as bactrias aerbias e anaerbias facultativas da famlia Micrococcaceae ( Micrococcus e Staphylococcus ) e os cocos pertencentes aos gneros Aerococcus , Enterococcus , Lactococcus , Leuconostoc , Streptococcus , Pediococcus e Vagococcus . Gnero Micrococcus : So clulas bacterianas esfricas. So
comumente encontradas no solo, gua, p e pele do homem e dos animais. Algumas espcies so termodricas, resistem ao tratamento de pasteurizao, outras com freqncia nos utenslios e nos equipamentos utilizados pelos manipuladores dos alimentos insuficientemente lavados e sanitizados. Gnero Enterococcus : O enterococcos so um grupo de
micorganismos que vm-se destacando nos ltimos anos como patgenos oportunistas. A distribuio de enterococos na natureza ampla e eles fazem parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato intestinal. A maioria relativamente resistente ao congelamento. As espcies mais encontradas em alimentos so Enterococcus faecalis e E. faecium . Gnero Staphylococcus : Uma das causas mais freqentes dos surtos de intoxicaes est relacionada com a presena de toxinas produzidas por espcies de Staphylococcus aureus . Os S. aureus so encontrados em leses de pele e nas vias nasais do homem, sendo facilmente transferidos para os alimentos.
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5. Bacilos gram positivos produtores de esporos: Neste esporos. Gnero Bacillus : As diferentes espcies podem ser mesfilas ou termfilas. Pode ser encontrado no solo, gua, material fecal e diversos alimentos. Este grupo abriga espcies patognicas como B. cereus , que causam gastrenterites de origem alimentar, numerosas espcies capazes de deteriorar os alimentos ( B. subtilis , B. coagulaus ) e espcies empregadas na produo de alimentos. Gnero Clostridium : A principal fonte de clostrdio o solo. So encontrados no trato intestinal do homem e de animais e nos alimentos. Este gnero contm duas espcies patognicas que podem ser veiculadas pelos alimentos: C. botulinum e C. perfringens . grupo esto os gneros Bacillus , Clostridium e
Desulfotomaculum , que apresentam a caracterstica comum de produzir
6. Bacilos gram positivos no esporulados: Pertencem a este grupo as bactrias do gnero Brochothrix , Carnobacterium , Kurthia , Lactobacillus e Listeria . Gnero Listeria : A espcie mais importante deste gnero a Listeria monocytogenes associada com doena de origem alimentar devido a sua patogenicidade, esta espcie causa a listeriose, que pode apresentar diversas manifestaes clnicas: septicemia, que pode resultar em aborto, endocardite, conjuntivite, meningite etc. Gnero Lactobacillus : So bactrias que fermentam carboidratos produzindo cido ltico, podendo ser homo ou heterofermentativos. Devido a essa propriedade, os lactobacilos pode ser bastante teis na produo de alimentos, mas podem causar tambm a sua deteriorao.
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7. Outras bactrias de interesse: Mycobacterium ; Propionibacterium ; Brevibacterium ; Corynebacterium .
2 FUNGOS Os organismos do Reino dos Fungos podem se unicelulares ou multicelulares. Os fungos multicelulares grandes, tais como cogumelos, podem parecer algumas vezes como plantas, mas no so capazes de realizar a fotossntese, como a maioria das plantas. Os fungos verdadeiros possuem parede das clulas composta principalmente de uma substncia chamada de quitina. As os bolores. Ao ocorrendo longo dos ltimos dez anos, e a incidncia de infeces formas unicelulares dos fungos, as leveduras, so
microrganismos ovais, maiores que as bactrias. Os fungos mais tpicos so
importantes causadas por fungos tem aumentado. Estas infeces esto como infeces nosocomiais em indivduos com sistema imunolgico comprometido. Os fungos tambm so benficos, so utilizados pelos homens como alimentos (cogumelos), para a produo de comida (po) e drogas (lcool). Das mais de 100.000 espcies conhecidas de fungos, apenas cerca de 100 so patognicas dos homens e dos animais. O estudo dos fungos chamado de micologia.
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Os fungos tm sido utilizados na biotecnologia h muitos anos. Tambm podem ser usados pela engenharia gentica, no controle biolgico de pragas.
2.1 B O L O R E S 2.1.1 C A R A C T E R S T I C A S
GERAIS
Os bolores formam uma massa visvel (chamada de miclio, composta de longos filamentos as hifas) que se ramificam e se expandem. O crescimento semelhante a algodo, algumas vezes encontrado sobre o po e as frutas, so miclios de fungos. Eles obtm seus alimentos absorvendo solues de matria orgnica de seu ambiente que pode ser o solo, a gua do mar, a gua doce, um animal ou uma planta hospedeira. O aspecto macroscpico de todo bolor que cresce na superfcie de um alimento pode indicar a classe e a ordem a que pertence. Em geral a maioria dos bolores necessita de uma menor quantidade de umidade disponvel. Pode ser calculada a quantidade total de umidade de um determinado alimento que limita o crescimento dos bolores, por exemplo 14 a 15% nas farinhas e alguns frutos secos impedir ou retardar o crescimento dos bolores. Os bolores, a maioria, so considerados mesfilos (25-30C), alguns podem crescer entre 35-37C ou a temperaturas superiores. Alguns so psicrfilos, crescem em temperaturas de refrigerao, -5 a -10C. So aerbios, necessitam de oxignio para crescer (crescem na superfcie dos alimentos). Quase todos os bolores so capazes de crescer dentro de um amplo intervalo de pH (entre 2 e 8,5), ainda que a maioria cresa melhor em pH cido.
21
Eles utilizam muitos tipos de alimentos, desde o mais simples at o mais complexo. Alguns bolores produzem substncias que inibem outros
microrganismos. Determinados compostos qumicos se comportam como micostticos por inibir o crescimento de bolores (como por exemplo, o cido srbico, os propionatos e os acetatos), outros so especificamente fungicidas por destruir os bolores. O incio do crescimento dos bolores lento quando comparado com as bactrias e as leveduras.
2.1.2 P R I N C I P A I S
GNEROS DE BOLORES DE INTERESSE EM ALIMENTOS
Gnero Aspergillus : So bolores muito abundantes, compreendem mais de 100 espcies. Algumas espcies como A. glaucus e A. repens , so importantes agentes de deteriorao de alimentos. Muitas espcies como A. orizae e A. soyae , so utilizados na produo de alimentos. A. niger utilizado para produo comercial de cidos ctrico, glucnico etc. Algumas espcies, como A. flavus e A. parasiticus , so produtoras de micotoxinas (aflatoxinas, ocratoxina A). Gnero Mucor : Esse gnero de bolor pode ser encontrado no solo, esterco, frutas, vegetais, gros e outros alimentos. Muitas espcies de Mucor so utilizadas na produo de queijos e alimentos fermentados orientais. As espcies mais encontradas nos alimentos so M. pusillus , M. racemosus e M. rouxii . Gnero Alternaria : Os bolores deste gnero so, com freqncia, causadores de deterioraes nos alimentos (tomates, pimentes, mas e frutas ctricas), causando o escurecimento dos tecidos. So encontrados tambm em carnes vermelhas; algumas espcies so produtoras de micotoxinas.
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Gnero Neurospora : A espcie N. crassa produz esporos que permanecem viveis no ambiente por muitos anos; a espcie N. sitophila produz pigmentos de colorao rsea e comum em pes, crescem tambm em bagao de cana-de-acar e diferentes alimentos. Gnero Penicillium : Este gnero de bolores freqente e possuem incidncia de grande importncia para os alimentos. Vrias espcies como P. expansum , P. digitatum e P. italicum so responsveis pelos processos degradativos de frutas ctricas, as espcies P. cyclopium e P. viridicatum causam deteriorao de gros e cereais. Muitas espcies de Penicillium so empregadas na produo de alimentos, especialmente queijos. A espcie P. camembertii , utilizado para fabricao de queijos camembert e brie e a espcie P. roquefortii , empregado na fabricao dos queijos roquefort e gorgonzola. Algumas espcies so produtoras de antibiticos e outra de micotoxinas. Gnero Fusarium : Os bolores pertencentes a este gnero crescem com freqncia na superfcie dos alimentos com aspectos algodonosos nas frutas ctricas, abacaxis e figos. Algumas espcies so produtoras de micotoxinas. Gnero Rhizopus : So agentes deteriorantes comuns em alimentos de origem vegetal, por serem termorresistentes, estas enzimas no so eliminadas durante o processamento trmico dos vegetais, o que pode causar a podrido mole ps-processamento.
3 LEVEDURAS 3.1 C A R A C T E R S T I C A S As
GERAIS
leveduras
so
fungos
unicelulares,
no-filamentosos,
caracteristicamente esfricos ou ovais, so amplamente distribudos na natureza: so freqentemente encontradas como um p branco cobrindo frutas e folhas.
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As leveduras que se encontram nos alimentos podem ser benficas ou prejudiciais. As fermentaes produzidas pelas leveduras intervm da elaborao dos alimentos como po, cerveja, diferentes tipos de vinhos, vinagre e os queijos maturados. As leveduras so prejudiciais quando produzem alteraes nos sucos de frutas, xarope, melao, mel, carnes, vinhos, cerveja e outros alimentos. As leveduras se classificam principalmente baseada nas suas caractersticas morfolgicas, ainda que para a microbiologia dos alimentos, suas propriedades fisiolgicas tm maior importncia. As caractersticas morfolgicas das leveduras so determinadas mediante observao microscpica. A forma pode ser desde esfrica a ovide, alimonada, cilndrica e triangular. O crescimento das leveduras se verifica atravs de um vu na superfcie do meio lquido e produo de um pigmento carotenide. O aspecto do crescimento desse microrganismo tem importncia quando este produz pigmento na superfcie dos alimentos. Nos cultivos em Agar difcil diferenciar as colnias de leveduras de colnias de bactrias, a observao microscpica dos microrganismos a nica forma segura que existe para a diferenciao. A maioria das colnias jovens das leveduras mida e mucosa, so colnias brancas, cremes ou rosadas. So oxidativas, fermentativas. Na superfcie de um lquido, as leveduras oxidativas podem crescer em forma de pelcula, de vu, ou de espuma; so denominadas leveduras formadoras de pelcula. As leveduras fermentativas crescem em toda massa do lquido e produzem dixido de carbono. A maioria das leveduras cresce em substratos com elevadas concentraes de acar e de sal, necessitam de mais umidade do que os bolores. O intervalo de temperaturas de crescimento da maioria das leveduras
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semelhante dos bolores com a temperatura tima em torno de 25-30C e uma temperatura mxima de 35-47C. Algumas espcies so capazes de crescer temperatura de 0C ou inferiores. Uma reao cida prxima de pH 4 a 4,5 estimula o crescimento da maioria das leveduras. As leveduras crescem melhor em aerobiose; algumas espcies do tipo fermentativo so capazes de crescer, lentamente em anaerobiose. Em geral, os acares so fontes de energia mais apropriada para as leveduras, mesmo as oxidativas.
3.2 P R I N C I P A I S
GNEROS DE LEVEDURAS DE INTERESSE EM ALIMENTOS
Gnero Candida : Algumas espcies crescem em pelcula e so capazes de alterar os alimentos com acidez e concentrao de sal elevada, so mais encontradas em carnes, manteiga, margarinas. Estas leveduras tm sido envolvidas em processos de deteriorao de vrios tipos de alimentos: como frutas frescas, vegetais, bebidas alcolicas e refrigerantes. Gnero Torulopsis : Estas leveduras fermentativas causam problemas nas fbricas de cervejas e alteram vrios tipos de alimentos. A espcie T. sphaerica fermenta a lactose, capaz de alterar os produtos lcteos. Outras espcies so capazes de alterar leite condensado, frutas e os alimentos cidos. Gnero Pichia : Estas leveduras crescem em superfcie dos lquidos (cervejas e vinhos) em forma de pelcula. Gnero Rhodotorula : Estas leveduras de cor vermelha, rosa ou amarelo podem produzir manchas na superfcie dos alimentos, manchas de diferentes cores na superfcie de carnes. Gnero Debaromyces : As espcies de Debaromyces tm elevada tolerncia ao sal (18-20%) e pertencem ao grupo das leveduras formadoras de
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pelculas na superfcie de alimentos salgados ou mantidos em salmoura. Tambm crescem nos queijos e embutidos. Gnero Schizosaccharomyces : Essas leveduras tm intensa atividade fermentativa, associadas requerendo deteriorao vitaminas de frutas para e sua multiplicao. Algumas Tm sido so vinhos. espcies
xerotolerantes, crescendo em mel, balas, caldo de cana etc. Gnero Saccharomyces : A espcie do tipo S. cerevisae muito empregada na indstria de alimentos, com vrias finalidades: fermentao de pes, bebidas (cervejas, vinhos), fermentao de lcool, glicerol e outras aplicaes em processos tecnolgicos. As leveduras de superfcie so fermentadoras muito ativas e crescem rapidamente a 20C. Essas espcies esto freqentemente envolvidas em alteraes indesejveis em muitos alimentos como frutas, laticnios (leite, manteiga etc) maioneses, mel, vinagres e produtos fermentados. A espcie S. cerevisae uma mistura de inmeras linhagens, muito especialmente selecionadas e exploradas para fins industriais. A maioria das leveduras que utilizada na indstria de alimentos pertence ao gnero Saccharomyces .
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CAPTULO III PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS DOS ALIMENTOS QUE AFETAM O CRESCIMENTO MICROBIANO
podem estar relacionados s caractersticas do alimento (intrnsecos) ou ao ambiente em que este alimento se encontra (extrnsecos).
xistem muitos fatores que afetam o crescimento bacteriano e, portanto, podem aumentar a probabilidade de ocorrncia de enfermidades transmitidas por alimentos. Esses fatores
1 FATORES
INTRNSECOS
Esses fatores so aqueles relacionados com as caractersticas prprias do alimento que podem estimular ou retardar o crescimento microbiano. Esses fatores so os seguintes: pH; Atividade de gua; Potencial de oxi-reduo; Nutrientes; Constituintes antimicrobianos; Estruturas biolgicas; Cada microrganismo tem um pH mnimo, timo e mximo de crescimento.
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Em geral, as leveduras e os bolores toleram melhor a acidez do que as bactrias. O pH intrnseco dos alimentos diferente em cada um deles, mesmo que a maioria tenha um pH neutro ou cido. Os alimentos cujo pH baixssimo (valores inferiores a 4,5) no so alterados facilmente pelas bactrias, sendo mais sensveis s alteraes por leveduras e bolores. Todo alimento que tem um pH intrinsecamente baixo tende a ser mais estvel, do ponto de vista microbiolgico do que um alimento neutro. Os bolores so capazes de crescer dentro de uma escala mais ampla de valores de pH do que as leveduras e as bactrias. O crescimento das leveduras fermentativas estimulado por um pH de aproximadamente 4,0 a 4,5. O crescimento da maioria das bactrias estimulado por um pH prximo da neutralidade, embora algumas como os acidificantes cresam em pH mdio, enquanto que outras, como por exemplo as bactrias com atividade proteoltica, so capazes de crescerem em pH elevado (bsico), as bactrias da clara dos ovos armazenados.
1.1 E F E I T O S
DO PH
O efeito adverso do pH tem pelo menos dois aspectos: afeta principalmente a respirao dos microrganismos por ao em suas enzimas e no transporte de nutrientes para dentro da clula microbiana. o pH desfavorvel provoca um aumento na fase lag da
multiplicao microbiana. A membrana citoplasmtica dos microrganismos relativamente impermevel aos ons H + e OH - . De acordo com o pH, os alimentos so subdivididos em trs grupos: alimentos de baixa acidez, que tm pH superior a 4,5. alimentos cidos, tm pH entre 4,0 e 4,5;
28
alimentos muito cidos, tm pH inferior a 4,0. Os alimentos de baixa acidez (pH > 4,5) so os mais sujeitos multiplicao microbiana espcies patognicas e deteriorantes.
Para os alimentos cidos (pH entre 4,0 e 4,5), h predominncia de crescimento de leveduras, bolores e de algumas poucas espcies bacterianas, como as bactrias lcticas e algumas espcies de Bacillus . J para os alimentos muito cidos (pH < 4,0), o desenvolvimento microbiano fica restrito quase que exclusivamente a bolores e leveduras (Figura 1 e Tabela 1).
pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Bolores Leveduras Alicyclobacillus spp. S a lm o n e lla s p p . A c e to b a c te r s p p . L is te r ia m o n o c y to g e n e s Y e r s i n ia e n t e r o c o l i t i c a Escherichia coli Clo s tr id iu m b o tu lin u m Bacillus cereus Ca m p y lo b a c te r s p p . S h ig e lla s p p . V ib r io p a r a h a e m o ly tic u s V ib r io c h o le r a e Clo s tr id iu m p e r fr in g e n s F o n te : J a y ( 2 0 0 0 )
Figura 1 . pH aproximado para o crescimento de alguns microrganismos de origem alimentar.

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Tabela 1 . Valores de pH de diversos alimentos. Faixa de pH Leite Carne vermelha Baixa acidez (pH 7,0-5,5) Peixe Po Manteiga Vegetais fermentados Mdia acidez (pH 5,3-4,5) Queijo Cottage Bananas Vagem cido (pH 4,5-3,7) Maionese Tomates Picles em conserva e Sucos de fruta Muito cido (<pH 3,7) Chucrutes Frutas ctricas Mas
F o n te : F o r s yth e ( 2 0 0 2 )
Alimento
pH 6,3-6,5 6,2-5,4 6,6-6,8 5,3-5,8 6,1-6,4 5,1-3,9 4,5 4,5-5,2 4,6-5,5 4,1-3,0 4,0 3,9-3,5 3,3-3,1 3,5-3,0 2,9-3,3
1.2 A T I V I D A D E
DE GUA (AW)
Um dos mtodos mais antigos de preservao dos alimentos a secagem. A preservao dos alimentos pela secagem uma conseqncia direta da remoo da gua sem os quais os microrganismos no crescem. A quantidade exata de gua necessria para o crescimento dos microrganismos varivel. Define-se atividade de gua de um alimento ou de uma soluo qualquer como sendo a relao existente entre a presso de vapor da gua contida na soluo ou no alimento.
30
Para a gua pura a atividade de gua 1,00. Os microrganismos no se multiplicam em gua pura, o limite mximo para o crescimento microbiano ligeiramente menor do que 1,00. A atividade de gua da maioria dos alimentos frescos acima de 0,99. Os valores mnimos para o crescimento de alguns microrganismos nos alimentos so apresentados na Tabelas 2 e 3. Tabela 2. Principais grupos de alimentos e seus valores de a w . Valores de a w Alimentos Carne e pescado frescos 0,98 Frutas e hortalias frescas Leite Hortalias enlatadas em salmoura Estrato de tomate 0,93-0,98 Carnes curadas enlatadas Embutidos fermentados Queijo submetido a tratamento industrial Embutidos secos ou fermentados 0,85-0,93 Leite condensado Queijo Frutas secas 0,60-0,85 Farinha Cereais Compotas e gelias Chocolate Mel 0,60 Biscoito Batata inglesa Ovos e hortalias desidratados Leite em p
F o n te : F r a z ie r e W e s th o f f ( 2 0 0 3 )
31
Tabela 3 . Valores de a w para multiplicao de microrganismos importantes em alimentos. Microrganismos Pseudomonas spp. Escherichia coli Enterobacter aerogenes Clostridium botulinum tipos A e B Vibrio parahaemolyticus Mucor spinosus Rhizopus spp. Candida spp. Staphylococccus aureus Aspergillus spp.
F o n te : F r a z ie r e W e s th o f f ( 2 0 0 3 )
aw 0,97 0,96 0,95 0,94 0,94 0,93 0,93 0,90 0,86 0,70
Geralmente, as bactrias possuem valores mais altos de a w para o crescimento do que os fungos. Nas bactrias, a a w tima e seu limite inferior para o seu crescimento, so distintos para cada espcie, variando tambm em funo do tipo de alimento, da temperatura, do pH e da presena de oxignio e de inibidores, seus valores so menores para as bactrias capazes de crescer em meios com elevadas concentraes de acar e de cloreto de sdio. Os efeitos da baixa a w exercem influncia sobre: diminuio da velocidade de multiplicao; diminuio da produo mxima de clulas;
32
quanto mais desfavorvel a a w do substrato, tanto menor a demora (fase lag) com que se inicia o crescimento dos microrganismos ou a germinao dos esporos.
1.3 P O T E N C I A L
DE OXI-REDUO
O poder oxidante e redutor do prprio alimento influi no tipo de microrganismo e nas modificaes que ocorrem. O potencial de oxi-reduo de um alimento definido pela capacidade de compensao do alimento, afirmar sua resistncia a modificar seu potencial pela presso do oxignio da atmosfera existente em torno do alimento. Os microrganismos so classificados em: aerbios quando
necessitam de oxignio livre, anaerbios quando crescem melhor na ausncia de oxignio livre e facultativos quando crescem bem tanto em aerobiose quanto em anaerobiose. Os bolores so aerbios; a maioria das leveduras cresce melhor em anaerobiose, enquanto que as bactrias das diferentes espcies podem ser aerbias, anaerbias ou facultativas. Do ponto de vista do potencial de oxi-reduo, um potencial elevado (oxidante) favorece o crescimento dos microrganismos aerbios, ainda que permita o crescimento dos facultativos, enquanto que um potencial baixo (redutor) favorece o crescimento tanto dos microrganismos anaerbios como os facultativos. O crescimento de um determinado microrganismo pode modificar o potencial de oxi-reduo de um alimento o suficiente, como para impedir que cresam outros. possvel que os anaerbios, reduzam o potencial de oxireduo at um valor que iniba o crescimento aerbio. O potencial de oxi-reduo (E h ) pode ser medido com instrumentos sendo expresso em milivolts (mV). Um substrato muito oxidado tende a um E h positivo, enquanto que o E h de um substrato reduzido ser negativo.
33
A maioria dos alimentos frescos, tanto os de origem vegetal quanto os de origem animal, tm em seu interior um potencial de oxi-reduo baixo e bem equilibrado os de origem vegetal porque contm substncias redutoras (por exemplo, cido ascrbico e acares redutores) e os tecidos animais porque contm radicais sulfdrico (SH) e outros grupos redutores.
1.4 N U T R I E N T E S A quantidade de nutrientes existentes no alimento de grande importncia para o crescimento dos microrganismos e os principais so: gua fonte de energia fonte de nitrognio vitaminas minerais A importncia da gua para o crescimento dos microrganismos segue em ordem, os bolores (necessitam de menor quantidade), leveduras e bactrias. Como fonte de energia os microrganismos podem utilizar acar, lcool e aminocidos. Poucos microrganismos so capazes de utilizar carboidratos complexos, como os amidos e celulose, como fonte de energia, primeiro eles degradam esses compostos para acar simples, as gorduras so usadas tambm pelos microrganismos como fonte de energia, esses compostos so ligados, portanto, apenas pequenos nmeros de microrganismos nos alimentos. As fontes de nitrognio mais importantes para os microrganismos so os aminocidos, mas uma grande variedade de outros compostos nitrogenados tambm pode ser utilizada por vrios tipos de microrganismos,
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por exemplo, so capazes de metabolizar nucleotdeos e aminocidos, outros so capazes de utilizar peptdeos e protenas. As vitaminas so importantes fatores de crescimento de
microrganismos, uma vez que fazem parte de diversas coenzimas envolvidas em vrias reaes metablicas. Entre as vitaminas, as mais importantes so as do complexo B, biotina e o cido patotnico. Entre os microrganismos, verifica-se que as bactrias gram positivas so mais exigentes em suas necessidades de vitaminas que as bactrias gram negativas, que juntamente com os bolores, so capazes de sintetizar todos os seus fatores de crescimento, conseqentemente esses dois grupos de microrganismos podem ser encontrados nos alimentos com baixo teor de vitamina B. Embora necessrios em quantidades muito reduzidas, os minerais so indispensveis para o crescimento dos microrganismos, pois esto envolvidos em muitas reaes enzimticas. Entre esses minerais, destacam-se o sdio, potssio, clcio e magnsio. Outros como ferro, cobre, mangans, zinco, cobalto, fsforo e enxofre podem ser igualmente importantes.
1.5 C O N S T I T U I N T E S A
ANTIMICROBIANOS
estabilidade
de
alguns
alimentos
contra
ao
ataque
dos
microrganismos devido presena de algumas substncias naturalmente presentes nos alimentos com atividade antimicrobiana, com a capacidade de retardar ou at mesmo impedir a multiplicao dos microrganismos. Algumas espcies de plantas so conhecidas por apresentarem compostos antimicrobianos (leos essenciais) como, por exemplo, os condimentos, so um bom exemplo, pois vrios leos essenciais com atividade antimicrobiana, eugenol no cravo, alicina no alho, timol no organo etc. O ovo, em especial a clara tem diversos agentes antimicrobianos naturais; rica em lisozima, enzima capaz de destruir a parede celular bacteriana, sendo especialmente ativa em bactrias gram positivas.
35
leite
bovino
tambm
contm
numerosas
substncias
antimicrobianas naturais, que podem agir especificamente ou no. Entre os compostos de ao especfica esto as imunoglobulinas, o fator complemento, os macrfagos e os linfcitos. A lactoferrina do leite tambm possui atividade antimicrobiana. Trata-se de uma protena que inibe a multiplicao atravs da retirada de ons ferro do leite. Outras substncias como a lisozima, naturalmente presente no leite e a nisina, produzida por bactrias lcticas no leite, tambm so importantes no controle do desenvolvimento microbiano. Os derivados do cido hidroxicinmico, encontrados em frutas e vegetais, so importantes agentes antimicrobianos, com ao predominantemente sobre bactrias e alguns fungos, assim como os taninos presentes em frutas e sementes. As frutas contm cidos orgnicos e leos essenciais importantes na inibio da multiplicao microbiana.
1.6 E S T R U T U R A S
BIOLGICAS OU SUBSTNCIAS INIBIDORAS
A cobertura natural de alguns alimentos responsvel pela excelente proteo contra a entrada e subseqente perda causada pelos organismos deteriorantes. Estas estruturas funcionam como barreiras mecnicas para a penetrao de microrganismos, impedindo o crescimento de determinadas espcies. Nessa categoria esto a casca de nozes, das frutas e dos ovos, a pele de animais e pelcula que envolve as sementes. Todo microrganismo que cresce em um alimento pode produzir uma ou mais substncias inibidoras para outros microrganismos, como por exemplo, cidos, lcoois, perxidos, antibiticos. O cido propinico produzido pelas bactrias propinicas no queijo suo, inibe os bolores.
36
A nisina produzida por determinadas cepas de Streptococcus lactis , pode inibir os clostrdios. Cada um dos fatores prprios da composio dos alimentos, a w , pH, potencial de oxi-reduo etc., podem influenciar de forma importante no tipo da microbiota resultante. Alguns destes fatores podem interagir entre si. Com a finalidade de impedir ou retardar o crescimento dos microrganismos, podemos manipular vrios desses fatores em vez de ajustar apenas um.
2 FATORES
EXTRNSECOS
Os fatores extrnsecos dos alimentos so aquelas propriedades ambientais de armazenamento que afetam os alimentos e os microrganismos. So os seguintes: temperatura ambiental; umidade relativa; presena e construo de gases do ambiente.
2.1 T E M P E R A T U R A
AMBIENTAL
O fator ambiental mais importante que afeta a multiplicao dos microrganismos a temperatura. Os microrganismos podem multiplicar-se em uma faixa bastante ampla de temperatura, sendo -34C a menor temperatura e 110C a maior. Os temperaturas: psicrfilos; psicrotrficos;
microrganismos
so
classificados
de
acordo
com
as
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mesfilos; termfilos (termdicos). Os microrganismos psicrfilos -0 e 20C crescimento 10 e 15C. Os microrganismos psicrotrfilos -0 e 7C europsicrotrfilos e estenopsicrotrfilos: europsicrotrfilos so aqueles que tipicamente no formam colnias visveis entre 6 a 10 dias a 0C e 7C (por exemplo, Enterobacter cloacae , Hafnia alvei e Yersinia enterocolitica ); estenopsicrotrfilos so aqueles que tipicamente formam colnias visveis em 5 dias nessa faixa de temperatura (por exemplo, Pseudomonas fragi e Aeromonas hydrophila crescem muito bem at 7C em 3-5 dias, mas no crescem a 40C) As espcies de bactrias e cepas que podem crescer a 7C ou abaixo dessa temperatura so largamente distribudas entre as gram negativas e bem distribudas entre as gram positivas. A menor temperatura registrada de crescimento dos microrganismos nos alimentos -34C (leveduras e bolores), devido a atividade de gua. Para as bactrias tem sido registrado o crescimento em torno de 20C. Os alimentos que provavelmente suportam o crescimento como nem todos os temperatura tima de
psicrotrfilos crescem na mesma temperatura eles foram classificados em:
microbiano a essas temperaturas so: suco de frutas concentrado, bacon, sorvete e certos tipos de frutos. Os microrganismos psicrfilos e psicrotrfilos multiplicam-se bem em alimentos refrigerados, sendo os principais agentes de deteriorao de carnes, pescado, ovos, frangos etc. Nesse grupo podem ser includos os
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seguintes gneros: Pseudomonas , Alcaligenes , Flavobacterium , Micrococcus e outros. Microrganismos mesfilos: temperatura tima de multiplicao entre 25 e 40C, mnima entre 5 e 25C e mxima entre 40 e 50C. Os microrganismos mesfilos correspondem grande maioria de importncia em alimentos, incluindo a maior parte dos patgenos de interesse. Microrganismos termfilos: temperatura tima de multiplicao entre 45 e 65C, mnima entre 35 e 45C e mxima entre 60 e 90C. A maioria das bactrias termfilas importantes em alimentos pertencem aos gneros Bacillus e Clostridium , incluindo tanto espcies deteriorantes quanto perfringens ). Alguns membros do grupo Archaea apresentam uma temperatura tima de crescimento em torno ou superior a 80C. estas bactrias so denominadas termodricas, ou, algumas vezes de hipertermfilos. A maioria destes organismos vive em fontes de guas quentes associadas atividade vulcnica. A temperatura mais alta conhecida que suporta o crescimento bacteriano de 100C. ( Bacillus coagulaus , Clostridium thermosaccharolyticum ), botulinum , Clostridium espcies patognicas ( Clostridium
2.2 U M I D A D E
RELATIVA
A umidade relativa influencia diretamente a atividade de gua do alimento. Se um alimento com baixa atividade de gua est armazenado em um ambiente com alta umidade relativa, a atividade de gua deste alimento aumenta, permitindo a multiplicao de microrganismo. A combinao entre umidade relativa e temperatura no pode ser desprezada. Geralmente, quanto maior a temperatura de armazenagem, menor
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a umidade relativa, e vice-versa. Alterando o gs da atmosfera possvel retardar a multiplicao de microrganismos sem diminuir a umidade relativa. Alimentos que passam por processos de deteriorao causados por bolores, leveduras e certas espcies de bactrias devem ser estocados sob condies de baixa umidade relativa.
2.3 P R E S E N A
E CONCENTRAO DE GASES DO AMBIENTE
A composio gasosa do ambiente que envolve um alimento pode determinar os tipos de microrganismos que podero predominar. A presena de oxignio favorecer a multiplicao de microrganismos aerbios, enquanto que sua ausncia favorecer aos anaerbios, embora haja bastante variao na sensibilidade dos anaerbios ao oxignio. Modificaes alimento. Atmosferas modificadas como recurso tecnolgico para correspondem a ambientes nos quais o aumentar a vida til dos alimentos. na composio gasosa so capazes de causar
alteraes na microbiota que sobrevive ou que se multiplica em determinado
oxignio total ou parcialmente substitudo por outros gases, so empregadas Embalagens contendo diferentes combinaes entre oxignio, nitrognio e gs carbnico so as mais empregadas industrialmente, embora outros gases possam tambm ser utilizados (monxido de carbono, xido nitroso e dixido de enxofre). A embalagem a vcuo tambm bastante empregada em especial para carnes. O dixido de carbono (CO 2 ) o gs atmosfrico mais importante usado para o controle de microrganismos nos alimentos. O efeito antimicrobiano depende de inmeros fatores. O mais importante a temperatura, sendo que o efeito mais intenso quanto mais baixa for a temperatura. Portanto, o armazenamento do alimento em temperatura inadequada pode cancelar a ao biosttica do CO 2 . Alm disso, a ao do
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CO 2 dependente do pH e da a w do alimento, dos tipos e das condies metablicas dos microrganismos presentes e da concentrao do CO 2 . Atmosferas contendo 10% de CO 2 so utilizadas, h muito tempo, para prolongar o tempo de armazenamento de frutas, especialmente mas e pras. Atmosferas contendo CO 2 vm sendo empregadas tambm para prolongar o tempo de armazenamento de carnes vermelhas. Oznio (O 3 ) outro gs atmosfrico que tem propriedades
antimicrobianas, e tem sido usado para prolongar a vida til de certos alimentos e tem sido efetuado contra uma variedade de microrganismo.
3 COMBINAO
DOS PARMETROS INTRNSECOS E EXTRNSECOS
O conhecimento dos fatores intrnsecos e extrnsecos que agem sobre determinado alimento permite prever sua vida de prateleira, sua estabilidade microbiolgica, conhecer a capacidade de crescimento e/ou produo de toxinas por microrganismos patognicos. Vrios fatores ou tcnicas so empregados para controlar os efeitos dos microrganismos nos alimentos; barreiras tecnolgicas, combinao de mtodos de preservao.
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CAPTULO IV A FLORA MICROBIANA DOS ALIMENTOS E MICRORGANISMOS DETERIORANTES
volteis durante seu metabolismo, os quais o olfato e o paladar humano podem detectar. Esses microrganismos no causam intoxicaes. Os termos deteriorados e no-deteriorados so subjetivos a aceitao do alimento depende do consumidor e no est relacionada com a segurana alimentar. Por exemplo: o leite azedo utilizado na fabricao de doces inaceitvel para beber. A produo de cido actico durante a estocagem de vinhos inaceitvel. A deteriorao dos alimentos pode ocorrer devido a diversos fatores: danos causados por insetos; danos fsicos devido a batidas, presso, congelamento, secagem e radiao; atividades de enzimas dos prprios tecidos animais e vegetais; alteraes qumicas que no so induzidas por microrganismos ou por enzimas de ocorrncia natural; atividade de bactrias, fungos e leveduras. Os alimentos podem ser contaminados com uma grande variedade de microrganismos durante a colheita, o processamento e manipulao.
s alimentos deteriorados so aqueles que tm sabor e odor desagradveis. A deteriorao resultado do crescimento indesejvel de microrganismos produtores de compostos
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Durante a distribuio e estocagem, as condies sero favorveis para a multiplicao de microrganismos especficos, ocasionando a deteriorao. Essas deterioraes dependem dos parmetros intrnsecos e
extrnsecos dos alimentos. A deteriorao pode ser retardada por meio da diminuio da temperatura de estocagem. Para alimentos frescos, as principais alteraes na qualidade podem ocorrer devido: ao crescimento e metabolismo bacteriano, resultando em
possveis alteraes do pH e formao de compostos txicos, odores desagradveis e formao de gs e camadas limosas; oxidao de lipdeos e pigmentos contidos em alimentos gordurosos, resultando na liberao de sabor indesejvel e na formao de compostos que possuem efeitos biolgicos adversos ou que favoream a descolorao. a vida de prateleira dependente do crescimento da microbiota contaminante, que pode ser inibida por meio de estocagem a frio ou tcnicas de embalagem (embalagem vcuo e embalagens com atmosfera modificada). Quanto maior a carga da microbiota inicial, menor a vida de prateleira devido ao aumento das atividades microbianas. Uma grande variedade de microrganismos pode estar presente nos alimentos se as condies forem favorveis. De acordo com a facilidade com que se deterioram os alimentos eles podem ser classificados em: 1) Alimentos estveis ou no perecveis So grupos de alimentos que no se deterioram a no ser que sejam manipulados sem o devido cuidado,
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esto includos: acar e farinhas, que so produtos que possuem baixa atividade de gua; 2) manipulados Alimentos e semiperecveis de forma Quando apropriada, os alimentos so sem
conservados
permanecem
deteriorao durante bastante tempo; as batatas, mas etc; 3) Alimentos perecveis Este grupo de alimentos so aqueles mais importantes para o consumo cotidiano, os quais se deterioram com facilidade a no ser que sejam utilizados mtodos de conservao especficos. Exemplos: as carnes, o pescado, a maioria das frutas e hortalias, ovos e leites. A maioria dos alimentos se enquadra em um dos grupos citados, alguns se encontram bem prximo ao limite que separa uns dos outros, portanto, chega a ficar difcil a classificao.
1 MICRORGANISMOS As
DETERIORANTES GRAM NEGATIVOS
Pseudomonas ,
Alteromonas
Aeromonas
spp.
deterioram
produtos lcteos, carne vermelha, carne de frango, peixe e ovos durante a estocagem a frio. Esses alimentos possuem atividade de gua alta e pHs neutros, alm de serem estocados sem atmosfera modificada (isto , com nveis normais de oxignio). Existem diversos mecanismos de deteriorao incluindo a produo de proteases e lipases termoestveis, as quais produzem aromas e sabores desagradveis no leite mesmo aps a morte dos microrganismos pela pasteurizao. Eles produzem pigmentos na deteriorao de ovos. A Erwinia spp. e vrias Pseudomonas spp so responsveis por aproximadamente 35% das deterioraes vegetais.
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2 MICRORGANISMOS
ESPOROS
DETERIORANTES GRAM POSITIVOS NO-FORMADORES DE
As bactrias cido-lcticas so bastonetes gram positivos que causam deterioraes tpicas em carnes estocadas em embalagens com atmosfera modificada ou embalagens a vcuo. Acetobacter e Pediococcus spp podem gosto produzir amargo. uma camada limosa cido espessa lctico em em cervejas. cerveja, Esses tambm microrganismos podem produzir, ainda cido lctico em vinhos, causando Acetobacter produz resultando em sabor amargo ao produto.
3 MICRORGANISMOS
ESPOROS
DETERIORANTES GRAM POSITIVOS FORMADORES DE
Os microrganismos formadores de esporos tais como Bacillus spp. e Clostridium spp. podem ser importantes deteriorantes de alimentos processados termicamente, uma vez que seus esporos podem sobreviver ao processamento. Os B. cereus podem crescer em leite pasteurizado a 5C e produzem coalho doce. O B. stearothermophilus causa a deteriorao cida sem estofamento ( flat sour ) em alimentos enlatados. Ele cresce no interior da lata, produzindo cidos, isto , sem produo de gs e, portanto, a lata no incha. O Clostridium thermosacharolyticum deteriora alimentos enlatados, produzindo gases e, portanto, a lata estufa. O Desulfotomaculum nigrificans produz sulfito de hidrognio, o qual causa estufamento de latas e mau cheiro. Esse fenmeno conhecido como deteriorao com cheiro de enxofre.
4 BOLORES
E LEVEDURAS DETERIORANTES
Os bolores e leveduras so mais resistentes a baixas atividades de gua e pHs cidos do que as bactrias. Deterioram alimentos como vegetais e produtos de panificao. Produzem enzimas pectnlicas, que amaciam os
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tecidos vegetais, causando putrefao. Estima-se que 30% da deteriorao de frutas ocorre devido ao fungo Penicillium . O po deteriorado por Rhizopus nigricans (bolor preto, manchas pretas), Penicillium (bolor verde). As leveduras so capazes de crescer em altas concentraes de acar (65-70%) e deterioram gelias, xaropes e mel. Os fungos podem produzir tambm diversos tipos de deteriorao de carnes devido aos microrganismos Mucor , Rhizopus (Tabela 4).
Tabela 4 . Fungos deteriorantes de alimentos. Microrganismos Aspergillus versicolor A. flavus A. niger Fusarium oxysporum Mucor spp Neurospora sitophila Penicillium roqueforti P. expansum P. discolor Penicillium spp Rhizopus nigricans Rhizopus spp Saccharomyces spp Trichoderma harzianum
F o n te : F o r s yth e ( 2 0 0 2 )
Produtos tipicamente afetados Po e produtos lcteos Cereais e castanhas Temperos Fruta Carne Po Carne, ovos e queijos Fruta e vegetais Queijo Po Po Carne Refrigerantes, gelias, xaropes e mel Margarina
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Os mtodos de preservao usualmente empregados para controlar o crescimento de fungos so: altas temperaturas; conservantes cidos fracos (cido srbico); antibiticos. OBS: Alguns fungos j desenvolveram resistncia ao cido srbico, produzindo pentadieno, de odor desagradvel.
5 DETERIORAO
DE PRODUTOS LCTEOS
O leite um meio ideal para o crescimento de bactrias, deve sempre ser mantido sob refrigerao. A deteriorao do leite conseqncia de microrganismos psicrfilos, que produzem lpases e proteases que no so desnaturadas durante a pasteurizao. Os microrganismos que produzem essas enzimas so: Pseudomonas , Aeromonas , Serratia e Bacillus spp. Essas enzimas hidrolisam as protenas do leite, produzindo
peptdeos que azedam o produto. Portanto, altas contagens microbianas antes da pasteurizao so indesejveis. Entre as bactrias indesejveis podemos mencionar os Estreptococos lcticos, as bactrias do grupo coliforme, os bacilos psicrfilos gram negativos e as bactrias termodricas. Quando o leite contm quantidade mnima de microrganismo, sobretudo aqueles que crescem com facilidade, sua qualidade ou conservao melhor. O tipo de microrganismo existente no leite extremamente importante, em geral, quanto menor a sua carga microbiana inicial, melhor a sua qualidade de conservao. O nmero de bactrias presentes no leite indicativo das condies higinicas adotadas, assim como os cuidados empregados na manipulao durante a sua obteno.
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6 DETERIORAO
DE CARNE BOVINA E AVES
As carnes so produtos altamente perecveis com atividade de gua suficiente para o crescimento da maioria dos microrganismos. Por ser um produto nutritivo, a carne pode ser deteriorada rapidamente por causa do crescimento de microrganismos e at ser prejudicial sade devido contaminao de patgenos. A carne por si s, estril quando no corpo do animal. Entretanto, pode ser contaminada facilmente durante o abate, a eviscerao, a manipulao no processamento e estocagem inadequada. Como conseqncia das distintas procedncias dos microrganismos so muitas as espcies microbianas que provavelmente contaminam as carnes. Sendo as mais importantes: Pseudomonas , Acinetobacter , Micrococcus , Sarcina , Leuconostoc , Lactobacillus , Proteus , Bacillus , Clostridium , Alcaligenes , Escherichia , Campylobacter e Salmonella . Muitas destas bactrias so capazes de crescer a temperaturas de refrigerao. Tambm existe a possibilidade da contaminao por microrganismos patgenos para o homem (bactrias entricas). A pele de aves pode carregar diversos organismos deteriorantes: Pseudomonas spp., Enterobacter spp. etc. O patgeno C. jejuni tambm pode estar presente na pele e, conseqentemente, ser transferido para a superfcie de trabalho. Os patgenos como Salmonella Enteritidis podem infectar os ovrios e os ovodutos de galinha e conseqentemente, os ovos, principalmente durante a formao da casca. As cascas dos ovos tornam-se contaminadas com bactrias intestinais durante a passagem pela cloaca e com o contato com a superfcie das incubadoras. As bactrias encontradas em carne de frango incluem: S. aureus , L. monocytogenes e Cl. botulinum do tipo C (no patognico para adultos saudveis). As linhagens de S. aureus encontradas em aves no so patognicas ao homem. Os alimentos base de frango com Staphylococcus so normalmente contaminados aps coco por manipuladores infectados.
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As carcaas, em temperaturas maiores que 20C, sero prontamente deterioradas por bactrias provenientes do intestino dos animais, as quais contaminam a carne durante a eviscerao. A microbiota deteriorante dominada por microrganismos mesfilos tais como Escherichia coli , Aeromonas spp., Proteus spp. Em temperaturas abaixo de 20C, a microbiota deteriorante ser constituda por psicrfilos como Pseudomonas spp. A temperatura de refrigerao de 5C ou menor a microbiota deteriorante ser predominante de Pseudomonas . Essas bactrias so aerbias e, portanto, somente crescem na superfcie dos alimentos at uma profundidade de 3 a 4mm.
7 DETERIORAO
DE PESCADOS
O termo pescado se refere a todas as espcies comestveis de gua doce e marinha, compreendendo os peixes, crustceos, moluscos, anfbios e quelnios. A variedade de produtos derivados do pescado muito ampla e inclui alimentos preparados por vrios mtodos tecnolgicos tradicionais e modernos. Como os pescados so de grande importncia para a nutrio humana mundial, muitos pases os utilizam na sua dieta como parte principal de protenas de alto valor biolgico, uma vez que estas possuem todos os aminocidos essenciais, especialmente lisina. A carne do pescado um excelente substrato para o crescimento da maioria das bactrias heterotrficas. De acordo com Jay (2000), as bactrias responsveis pela deteriorao do pescado so, principalmente, as gram negativas, tais como as Pseudomonas , capazes de crescer a menos 3C. A maioria do pescado tanto mais rica em espcies microbianas quanto mais poludas forem as guas das quais advm. Outro ponto importante a ser considerado a espcie do pescado, pois sua composio qumica tambm determinar a predominncia de diferentes espcies de microrganismos.
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A temperatura da gua outro fator significativo no nmero e espcie de bactrias na superfcie do pescado, a carga microbiana do pescado aps a captura est relacionada s condies ambientais, qualidade microbiolgica da gua, temperatura, teor residual de sal, distncia entre a localizao da captura e reas poludas com dejetos humanos e animais, origem dos alimentos consumidos pelo pescado e suas condies de resfriamento. As bactrias patognicas associadas a pescados so caracterizadas em trs grupos: 1) as que normalmente esto presentes em ambientes marinhos e estuarinos (bactrias do gnero Vibrio , Listeria monocytogenes , Clostridium botulinum e Aeromonas hydrophila ); 2) as enterobactrias (devido a contaminao fecal); 3) as bactrias que contaminam o produto durante o processamento. O consumo de moluscos bivalves est freqentemente associado a elevado nmero de doena e, de origem alimentar em funo de suas de propriedades filtradoras conseqentemente, bioacumuladores
microrganismos. Pertencentes famlia Vibrionaceae, o Vibrio alginolyticus , V. cholerae no O1, V. parahaemolyticus e V. vulnificus esto entre os principais patgenos associados com ostras, sururus encontrados em ambientes marinhos poludos.
8 DETERIORAO
DE PRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL
As alteraes das hortalias e de frutas frescas podem ser conseqncia de causas fsicas, atividade de suas prprias enzimas, atividades de microrganismos, ou de combinaes de todos esses fatores.
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As
condies
ambientais
inadequadas
durante
sua
colheita,
transporte, armazenamento e comercializao, podem favorecer sua alterao. As enfermidades ou defeitos das hortalias e das frutas podem ser devido a multiplicao de um microrganismo que obtm seus nutrientes. As alteraes microbianas das frutas e das hortalias podem ser devidas: microrganismos patgenos que atuam sobre os talos, folhas, flores ou razes da planta, frutos ou ainda em determinadas partes da planta, utilizadas como alimento. Por exemplo: razes ou tubrculos, ou sobre vrias destas partes da planta. microrganismos saprfitas os quais so ditos invasores, penetram nas frutas e hortalias sadias, como o caso dos diferentes tipos de podrido. Um dos gneros mais freqentemente envolvidos com a deteriorao de vegetais a Erwinia . A podrido mole bacteriana causada por Erwinia carotovora , Pseudomonas spp., Xanthomonas , Clostridium e Bacillus . Os microrganismos hidrolisam a pectina provocando o amolecimento do vegetal, produzindo odor desagradvel e aparncia mida. Alguns dos vegetais atacados so aspargo, cebola, alho, cenoura, alface, salso, batata, espinafre, repolho, melancia, pepino, brcolis, couve-flor. O gnero Erwinia pertence famlia Enterobacteriaceae. So capazes de crescer a 10C e so microrganismos produtores de protopectinase. Alm disso, muitas espcies de Erwinia so capazes de fermentar acares e lcoois existentes em certos vegetais, como ramanose, celobiose e manitol; esses so compostos que no so utilizados pelas bactrias mais comuns. Os agentes fngicos so mais importantes do que as bactrias na deteriorao de alimentos de origem vegetal. Os principais gneros so: Rhizopus , Botrytis , Aspergillus , Cladosporium , Fusarium , Alternaria etc.
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A composio das frutas e das hortalias influi no provvel tipo de alterao. Portanto, a podrido ocasionada pelas bactrias acontece com maior freqncia nas hortalias cuja acidez no muito elevada e nas frutas aparecem somente naquelas que no so muito cidas. A deteriorao fngica dos vegetais freqentemente resulta em reas de amolecimento, enquanto que as podrides fngicas de frutas secas, como mas e pssegos, mostram reas marrons ou de cor creme, devido ao crescimento do miclio do bolor. Alguns tipos de fungo apresentam rea infectada seca, dura e freqentemente descolorida. Os bolores so mais comuns em frutas e vegetais cidos, deficientes em vitamina B e que apresentam superfcie moderadamente seca. Os sucos das frutas e hortalias possuem uma variao de pH 2,4 para o suco de limo, at 4,2 para o de tomate, e todos eles apresentam acares com variao entre 2% a 17%. O alto teor de gua favorece o crescimento de leveduras e bactrias; os bolores so capazes de crescer na superfcie quando em contato com o ar. O desenvolvimento das leveduras e bactrias depender mais da temperatura de armazenamento do que da composio do suco. A temperatura entre 15 e 35C favorece o crescimento das leveduras. As alteraes que ocorrem em sucos de frutas armazenadas temperatura ambiente so decorrentes da fermentao alcolica, por leveduras formadoras de pelcula ou por bolores que crescem na superfcie, ou da oxidao do lcool a cido actico quando bactrias acticas esto presentes. Os concentrados de sucos de frutas e hortalias, devido a acidez e teores de acares elevados, favorecem a multiplicao das leveduras e das espcies acidotolerantes e sacarotolerantes dos gneros Leuconostoc e Lactobacillus .
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9 DETERIORAO
DE CEREAIS E PRODUTOS DERIVADOS
A microbiota do trigo, centeio, milho, farinha e outros produtos formada por espcies de bolores dos gneros Aspergillus e Penicillium e algumas espcies de bactrias do gnero Bacillus , Sarcina , Serratia e do grupo coliforme. A contaminao pode ser formada do solo, do ambiente no qual so armazenados e aquelas adquiridas durante o processamento. Alguns microrganismos aerbios formadores de esporos, como os Bacillus , so produtores de amilase, o que permite que utilizem farinhas e derivados como fonte de energia, desde que a umidade seja suficiente. Do ponto de vista de sade pblica, a contaminao por bolores nos gros de cereais e dos produtos derivados tm merecido muito interesse devido a produo de micotoxina. O isolamento freqente das espcies de bolores como Aspergillus flavus e A. parasitucus produtores de aflatoxinas, avalia a necessidade da reduo da contaminao.
10 D E T E R I O R A O
DE PRODUTOS DE PANIFICAO
Os bolores constituem a causa mais importante de alterao do po e da maioria dos seus produtos. As temperaturas elevadas durante a coco geralmente so suficientes para eliminar os esporos dos bolores no interior e na superfcie do po, de forma que os bolores que ocasionalmente contaminam chegam superfcie ou penetram no interior depois da coco. Os bolores procedem do ar durante o esfriamento e posteriormente da manipulao ou das embalagens. Os principais bolores responsveis pelas alteraes so Rhizopus stolonifer (aspecto algodonoso, de cor branca e negra), Penicillium expansum (de cor verde) e Aspergillus niger (de cor negra, produz pigmento amarelo). Os produtos de panificao, manuseados de maneira adequada, raramente so afetados por microrganismos, uma vez que apresentam baixa umidade.
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11 D E T E R I O R A O
DE ALIMENTOS DOCES
A maioria dos alimentos doces raramente est exposta s alteraes microbianas devido seu elevado teor de acar e sua umidade relativamente baixa; e assim, quando preparados, processados e armazenados com os devidos cuidados. As bactrias contaminantes mais importantes dos acares de cana pertencem aos gneros Bacillus e Clostridium . A deteriorao ocorrer caso os acares sejam armazenados sob condies de extrema umidade, sendo os microrganismos mais envolvidos: Torula spp. e cepas de Saccharomyces spp., que provoca a inverso do acar. Entre as balas, confeitos, bombons e outros produtos recheados com creme, podem sofrer deterioraes caracterizadas por exploses causadas por bactrias pertencentes ao gnero Clostridium , principalmente C. sporogenes . A contaminao por essa bactria ocorre atravs do acar, amido e, provavelmente, outros ingredientes.
12 I N D I C A D O R E S
DA VIDA DE PRATELEIRA
O tempo de vida de prateleira um atributo importante de todos os alimentos. Pode ser definido como o tempo que se passa desde a produo e a embalagem do produto at o ponto em que ele se torna inaceitvel para o consumo. relacionado, ento, com a qualidade total do alimento e diretamente ligado ao planejamento da produo, s especificaes dos ingredientes, ao processo de manipulao e estocagem (no varejo e na casa do consumidor). A vida de prateleira depende do alimento (Tabela 5) e essencial que os produtores identifiquem os parmetros intrnsecos e extrnsecos que limitam esse perodo.
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Tabela 5 . Produtos alimentcios e seus tempos de prateleira. Produtos alimentcios Po Molhos, temperos Pepino Alimentos resfriados Alimentos congelados Alimentos enlatados
F o n te : F o r s yth e ( 2 0 0 2 )
Vida de prateleira esperada At 1 semana temperatura ambiente 1 a 2 anos temperatura ambiente 2 a 3 anos temperatura ambiente At 4 meses entre 0 e 8C 12 a 18 meses no congelador Latas no-envernizadas, 12 a 18 meses Latas envernizadas, 2 a 4 anos
A vida de prateleira pode ser determinada pela combinao de anlises microbiolgicas e qumicas de amostras dos alimentos.
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CAPTULO V DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR
1 BREVE
HISTRICO
A
ratos, lagartos, salmonelas.
ntigamente, acreditava-se que as doenas, infeces e at mesmo indisposies fsicas eram causadas por maus espritos.
Segundo registros encontrados, h cerca de 2000 a.C., Moiss elaborou leis para proteger seu povo contra doenas infecciosas. As mos deveriam ser lavadas aps o sacrifcio dos animais e antes das refeies. Leis foram estabelecidas para animais comestveis de todos os tipos. Animais eram proibidos os quais incluram os sunos, hoje conhecidos como freqentes excretores de salmonelas, assim como reservatrios de parasitas, como a Trichinella spiralis e Taenia solium e pequenas criaturas como macacos, cobras e caracis, todos conhecidos hospedeiros de
A descrio de intoxicaes alimentares registradas na histria antiga est geralmente associada a toxinas qumicas. As bactrias causadoras de intoxicaes alimentares foram
primeiramente descritas por Gaertner em 1888. Elas foram isoladas do organismo de um homem que havia morri do durante um surto de gastrenterites que atingiu 59 pessoas na Alemanha. Em 1896, E. van Ermengem, na Blgica, descreveu o Clostridium botulinum , o organismo responsvel pelo botulismo. Entre os anos 1909 e 1923 muitas das bactrias hoje conhecidas como responsveis por um grande nmero de intoxicao alimentar. Apesar dos extensivos ensinamentos sobre a higiene dos alimentos para a preveno de doenas de origem alimentar a incidncia de surtos e casos espordicos continua a crescer.
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2 TAMANHO
DO PROBLEMA DAS DOENAS DE ORIGEM ALIMENTAR
Muitos casos de doenas ou enfermidades causadas por alimentos no so notificados, pois seus sintomas so geralmente parecidos com gripes. sabido que apenas um pequeno nmero de casos de enfermidades causadas por alimentos notificado aos rgos de inspeo de alimentos, de controle e s agncias de sade. Isso se deve, em parte, ao fato de que muitos patgenos presentes em alimentos causam sintomas brandos, e a vtima no busca auxlio mdico. Portanto, o nmero de casos notificados pode ser definido como a ponta do iceberg , tendo em vista o nmero real de toxinfeces causadas por alimentos (Figura 2).
Casos notificados
Casos avaliados por mdicos de hospitais, mas no notificados. Doentes que no procuram aconselhamento mdico.
Enfermidade branda ou assintomtica.
F o n te : F o r s yth e ( 2 0 0 2 )
Figura 2 . Pirmide que ilustra a notificao dos casos: ponta do iceberg .
A quantidade de produtos disponveis no mercado oferece ao consumidor a oportunidade de ampla escolha. Entretanto, apesar do progresso na medicina, na cincia e tecnologia de produo de alimentos, as enfermidades causadas por patgenos alimentares continuam apresentando problemas significativos para a sade e para a economia.
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As estatsticas brasileiras no so definidas, portanto, acredita-se que incidncia de doenas ou enfermidades microbianas de origem alimentar em nosso pas seja bastante elevada. Vrios agentes causadores de doenas no homem podem ser transmitidos pelos alimentos: produtos qumicos (metais pesados, pesticidas); toxinas naturais de plantas e animais (alcalides, histamina); parasitas (amebas, helmintos); bactrias patognicas; fungos toxignicos. A ocorrncia de toxinfeces de origem bacteriana depende do conjunto de circunstncias peculiares e de alguns ou todos os seguintes fatores: 1) o organismo infectante (agente causador) em gneros
alimentcios, nos manipuladores de alimentos e nos animais; 2) as mos dos manipuladores de alimentos transmitindo os organismos dos alimentos crus para os alimentos cozidos e para os equipamentos, roupas e outros utenslios de cozinha, ou, provavelmente, do prprio manipulador de alimento para os alimentos cozidos; 3) superfcies contaminadas por alimentos crus; 4) alimentos favorveis ao crescimento bacteriano; 5) condies favorveis para estocagem temperaturas mornas por um perodo de 2 horas ou mais; 6) pessoas susceptveis. A Organizao Mundial de Sade define enfermidade transmitida por alimento como sendo aquela de natureza txica ou infecciosa causada por
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agentes que invadem o organismo por meio da ingesto de alimentos contaminados. As enfermidades de origem alimentar ocorrem quando uma pessoa contrai uma doena devido ingesto de alimentos contaminados com microrganismos ou toxinas indesejveis. Essa condio , freqentemente, denominada como toxinfeco alimentar. Toxinfeces alimentos compreendem: infeces alimentares; intoxicaes alimentares. As infeces alimentares so decorrentes da ingesto de alimentos contaminados com agentes infecciosos com reaes provocadas pela sua presena e seus metablitos. As infeces alimentares so divididas em dois tipos: 1) aquelas em que os microrganismos patgenos no alimentares ou enfermidades transmitidas por
necessariamente se multiplicam no alimento; o alimento s atua como veiculador. Exemplo: microrganismos patgenos como os que produzem a tuberculose, a difteria, as disenterias, a febre tifide, a clera, hepatite infecciosa etc; 2) aquelas em que os alimentos podem servir de meio de cultura para que os microrganismos patgenos se multipliquem e alcancem nveis capazes para ocorrer uma infeco nos consumidores de alimentos. Exemplo: enfermidades produzidas por Salmonella , Vibrio parahaemolyticus , Escherichia coli . provvel que os surtos de infeces alimentares do segundo tipo sejam mais severos que os surtos originados por outros patgenos intestinais.
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3 INTOXICAES
ALIMENTARES
As intoxicaes alimentares so causadas pela ingesto de toxinas pr-formadoras nos alimentos devido multiplicao dos microrganismos. Estas toxinas so produzidas no durante alimento. a intensa Pertencem proliferao a este dos microrganismos patognicos grupo:
Clostridium botulinum , Staphylococcus aureus , Bacillus cereus e fungos produtores de micotoxinas. Essas doenas podem ocorrer de forma individual ou em surtos, quando um grande nmero de pessoas acometido por sintomas semelhantes. As doenas alimentares de origem microbiana so consideradas como o mais srio problema no mundo contemporneo e, conseqentemente, como uma causa importante na reduo econmica da produtividade. O grupo de indivduos mais afetado pelas Doenas Veiculadas por Alimentos (DVAs) so as crianas, mulheres grvidas, idosos e pessoas com sistema imunolgico imunodeprimido, como nos casos de pacientes com Aids, cncer, diabetes ou os que esto sob tratamentos com quimioterpicos. Segundo a Organizao Panamericana de Sade (OPS, 2003), a segunda causa mais comum de bitos em crianas de 0 a 5 anos, no mundo todo, a diarria, com estimativa de 12% dos bitos. Nas ltimas dcadas, a epidemiologia de doenas de origem alimentar sofreu mudanas com o aparecimento de novos importantes microrganismos e patgenos emergentes que em alguns casos no oferecem riscos para os indivduos, porm, em outros, ameaa-lhes a vida. Essas mudanas podem ser atribudas a vrios fatores: estatstica populacional; estilo de vida dos consumidores; desenvolvimento do processamento de alimentos; preparao e prticas de manipulao dos alimentos.
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Dados do ano de 2003 da OPS confirmam que mais de 70% dos casos de enfermidades transmitidas pelos alimentos tm origem no seu manuseio inadequado pelo consumidor final. A contaminao cruzada pelos patgenos microbianos pode ter um importante papel nos casos espordicos de doenas epidmicas de origem alimentar. Durante a manipulao e preparao, as bactrias podem ser transferidas dos alimentos crus para os manipuladores e, subseqentemente para outras superfcies pelas mos contaminadas. As mos so tambm um ponto crtico para contaminao cruzada.
4 CONTROLE Os inevitvel
DA CONTAMINAO DOS ALIMENTOS
microrganismos produtos crus
patognicos utilizados
esto como
presentes
no
solo
e,
conseqentemente, nas colheitas, no gado, nas aves e nos peixes. Portanto, que ingredientes carreguem contaminao patognica. Dessa forma, para evitar toxinfeces alimentares, os patgenos de ingredientes devem ser identificados e controlados. Os programas de controle devem ser implantados, sendo monitorados quanto sua eficcia, alm de serem revisados e modificados, sempre que necessrio.
4.1 P R O G R A M A
DE VIGILNCIA
Um programa de vigilncia para enfermidade de origem alimentar parte essencial de um programa de segurana alimentar. A vigilncia se refere coleta sistemtica e utilizao de
informaes epidemiolgicas para o planejamento, a implementao e a avaliao do controle de enfermidades. A vigilncia global de problemas de doenas de origem alimentar pode ter um papel importante na deteco precoce e na advertncia, assim como na rpida investigao e controle dos problemas.
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5 CAUSAS
DA CONTAMINAO DE ALIMENTOS
Existe um grande nmero de fatores que contribuem para tornar um alimento inseguro, causando toxinfeces quelas pessoas que os ingerem. As principais causas podem ser resumidas como: controle inadequado da temperatura durante o cozimento, o resfriamento e estocagem; higiene pessoal insuficiente; contaminao cruzada entre produtos cruz e processados; monitoramento inadequado dos processos. Esses fatores podem ser reduzidos consideravelmente por meio de treinamento adequado da equipe e implementao do sistema APPCC combinado com a avaliao de riscos (Tabela 6). Tabela 6 . Fatores que contribuem para a ocorrncia de surtos de doenas de origem alimentar*. Fatores de contribuio
F a to r e s r e la c io n a d o s a o c r e s c im e n to m ic r o b ia n o E s t o c a g e m t e mp e r a t u r a a mb i e n t e R e s f r i a me n t o i n a d e q u a d o P r e p a r a o d o a l i me n t o mu i t o lo n g e d o l u g a r o n d e s e r s e r v i d o E s p e r a e m a mb i e n t e e t e mp e r a t u r a i n a d e q u a d a Utilizao de sobras D e s c o n g e la me n to in a d e q u a d o e e s to c a g e m s u b s e q e n te imp r p r ia P r o d u o d e a l i me n t o e m e x c e s s o F a to r e s r e la c io n a d o s s o b r e v iv n c ia m ic r o b ia n a A q u e c ime n to imp r p r io Co z ime n to in a d e q u a d o F a to r e s r e la c io n a d o s c o n ta m in a o Ma n ip u la d o r e s d e a lime n to s A lime n to s p r o c e s s a d o s c o n ta min a d o s n o - e n la ta d o s A l i me n t o s c r u z c o n t a mi n a d o s C o n t a mi n a o c r u z a d a L i mp e z a i n a d e q u a d a d o s e q u i p a me n t o s F o n te s d u v id o s a s A l i me n t o s e n l a t a d o s c o n ta mi n a d o s
a
Percentagem a
43 32 41 12 5 4 22 17 13 12 19 7 11 7 5 2
A p e r c e n ta g e m e x c e d e o to ta l d e 1 0 0 , p o is o s f a to r e s q u e n o r ma lme n te c o n tr ib u e m p a r a a o c o r r n c i a d e e n f e r mi d a d e s d e o r i g e m a l i me n t a r s o m l t i p l o s . F o n te : F o r s yth e ( 2 0 0 2 )
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A chave para a produo de alimentos seguros produzir alimentos microbiologicamente estveis. Isto quer dizer que nenhum microrganismo do alimento vai se multiplicar at doses infecciosas. De maneira ideal, importante que estejam inativados e que no haja toxinas.
6 DOSE
INFECTANTE
dose
infectante
refere-se
ao
nmero
de
microrganismos
necessrios para causar a enfermidade, mas, para a maioria das bactrias, a questo sobre a dose infectante mnima no pode ser respondida facilmente. Em primeiro lugar, deve-se ter em mente que os consumidores existem grupos especiais de risco crianas, idosos, mulheres grvidas e pessoas imunodeprimidas que podem adoecer quando expostas a um nmero menor de microrganismos patognicos do que o necessrio para causar enfermidade em um adulto sadio (Tabela 7). Tabela 7 . Resposta clnica de adultos a diferentes doses de desafio com patgenos entricos. Organismo Shigella dysenteriae Shigella flexneri Vibrio cholerae Salmonella Typhi Salmonella spp. Escherichia coli patognica Clostridium perfringens Yersinia enterocolitica
F o n te : H A CCP ( 2 0 0 1 )
Dose de desafio (clulas) 10 1 -10 4 10 2 -10 9 10 3 -10 9 10 4 -10 9 10 5 -10 1 0 10 6 -10 1 0 10 8 -10 9 10 9
Alm disso, h vrios fatores fisiolgicos que influenciam a dose infectante mnima, como grau de acidez gstrica, contedo gstrico,
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microbiota intestinal, e, no menos importante, o estado imunolgico da pessoa. Este estado, por sua vez, influenciado pela imunidade de infeces prvias, pelo estado nutricional e pelo estresse.
6.1 V A R I V E I S
DO HOSPEDEIRO
Idade; Estado geral de sade; Gravidez; Uso de medicamentos com ou sem prescrio mdica; Distrbios metablicos; Alcoolismo, cirrose, hemocromatose; Quantidade de alimento ingerido; Variao de acidez gstrica: uso de anticidos, variao natural, acloridria; Distrbios genticos; Estado nutricional; Imunocompetncia; Histria pregressa cirrgica; Ocupao.
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7 MICRORGANISMOS 7.1 P A T G E N O S
CAUSADORES DE ENFERMIDADES DE ORIGEM ALIMENTAR
DE ORIGEM ALIMENTAR: BACTRIAS
1 Campylobacter jejuni, C. coli . Os Campylobacter so bastonetes gram negativos, reconhecidos como patgenos animais, sendo considerados como patgenos humanos somente h 15 ou 20 anos. So encontrados em aves domsticas, gado, sunos, ovinos, roedores e pssaros. As rotas da infeco passam pela gua contaminada, leite e carne. Os fungos so as maiores fontes potenciais de Campylobacter infeciosos. As caractersticas de enterites causadas por Campylobacter so: doena semelhante gripe, dores abdominais, febre e diarria. O perodo de incubao de 2 a 10 dias, perdurando por cerca de uma semana. O Campylobacter pode facilmente causar contaminao cruzada em alimentos processados. A dose infecciosa de apenas mil clulas. O C. jejuni rapidamente destrudo por um cozimento a 55 a 60C, por vrios minutos.
2 Salmonella spp. O gnero Salmonella pertence famlia Enterobacteriaceae. So gram negativos, anaerbios facultativos, no formam esporos e tm forma de bastonetes curtos. A temperatura tima de crescimento de aproximadamente 38C e a temperatura mnima de 5C. Como no formam esporos, so relativamente termosensveis, podendo ser destrudos a 60C por 15 a 20 minutos. Existem mais de 2.5001 sorotipos de salmonelas, dentre os quais 1.478 pertencem subespcie I, incluindo Salmonella sorotipo Typhi. Mudanas significativas ocorrem na nomenclatura e taxonomia das salmonelas nos ltimos anos, baseadas, principalmente, nas suas caractersticas
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bioqumicas. O gnero Salmonella est dividido em duas espcies Salmonella enterica e Salmonella bongori , sendo a primeira subdividida em seis subespcies. Essas enterobactrias so transmitidas ao homem, principalmente, por meio de consumo de alimentos contaminados por fezes de animais ou humanas. Os sintomas caractersticos de doenas de origem alimentar
causadas por Salmonella so: diarria, nuseas, febre branda e calafrios, algumas vezes, vmitos, dor de cabea e fraqueza. O perodo de incubao antes da doena de cerca de 16 a 72 horas. A enfermidade , normalmente, autolimitante e persiste durante 2 a 7 dias. A pessoa infectada excretar grandes quantidades de Salmonella pelas fezes durante o perodo da doena. A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a sade da vtima, com o alimento e ainda com a linhagem da Salmonella . As doses infecciosas podem variar de 20 at 10 6 clulas. Uma ampla variedade de alimentos contaminados associado s salmoneloses, incluindo carne bovina crua, aves domsticas, ovos, leite e derivados, peixes, camares, perna de r, fermentos, cocos, molhos, temperos para salada etc. A contaminao do alimento ocorre devido ao controle inadequado de temperatura, de prticas de manipulao ou por contaminao cruzada de alimentos crus com alimentos processados. O microrganismo se multiplica no alimento at atingir a dose infecciosa.
3. Shigella spp. A Shigella uma bactria altamente contagiosa que coloniza o trato intestinal. bastante similar a E. coli , mas pode ser diferenciada por no
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produzir gs a partir de carboidratos e por ser lactose negativa. A Shigella se propaga por contato direto e indireto com indivduos infectados. O alimento ou a gua podem ser contaminados por contato direto ou indireto com material fecal de pessoas infectadas. A Shigella causa surtos freqentemente em creches e asilos. Os principais sintomas da shigelose so: diarria branda ou grave, aquosa ou sanguinolenta, febre, nuseas, podem ocorrer vmitos e dores abdominais. Os sintomas aparecem dentro de 12 at 96 horas aps exposio Shigella ; o perodo de incubao de, normalmente uma semana. O nmero necessrio de microrganismos para causar a infeco em adulto de 10 a 10 2 . As medidas de controle e preveno da shigelose de origem alimentar esto relacionadas com a boa higiene pessoal e educao dos manipuladores de alimento. A contaminao de alimentos ou gua com Shigella spp indica contaminao recente com fezes humanas, devido a fragilidade desse microrganismo.
4 Escherichia coli Escherichia coli a espcie predominante entre os diversos microrganismos anaerbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal de animais de sangue quente. Pertence famlia Enterobacteriaceae e entre suas principais caractersticas destacam-se: bacilos gram negativos no esporulados, capazes de fermentar glicose com produo de cido e gs. A maioria fermenta tambm a lactose, com produo de cido e gs. As linhagens patognicas de E. coli so divididas de acordo com os sintomas clnicos nos seguintes grupos. E. coli enterotoxignica (ETEC) E. coli enteropatognica (EPEC)
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E. coli enterohemorrgica (EHEC) E. coli enterogregativa (EAggEC) E. coli enteroinvasora (EIEC) E. coli difusamente adesiva (DAEC) A importncia da E. coli como patgeno humano tem sido reconhecida desde seu descobrimento, 1885, pelo Dr. Theodor Escherich. Est relacionada com casos de diarrias, principalmente infantil, com colites hemorrgicas, disenterias, infeces da bexiga, dos rins, infeces de feridas cirrgicas, septicemia, sndrome urnico-hemoltica. Algumas destas enfermidades terminam em bitos. Recentemente, a importncia da E. coli foi relacionada com a presena de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O 1 5 7 :H 7 que tem ocasionando surtos de toxinfeces alimentares com morbilidade e mortalidade. A E. coli O 1 5 7 :H 7 uma cepa entero-hemorrgica (EHEC) implicada em surtos de DVAs, quando se ingerem alimentos mal cozidos e por transmisso de pessoa a pessoa. Os principais sintomas da enfermidade so dores abdominais, diarria sanguinolenta, edema da mucosa do clon, aps um a dois dias de incubao. A enfermidade dura aproximadamente oito dias. O gado um reservatrio natural de EHEC, razo pela qual os alimentos de origem animal, principalmente a carne bovina, parecem ser o principal veculo desse patgeno. Diversos surtos de colite hemorrgica ocorridos nos Estados Unidos, Canad e Japo foram claramente associados com consumo de hambrgueres.
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5 Listeria monocytogenes A Listeria uma bactria gram positiva, que no forma esporos, cresce entre 0 e 42C. A pasteurizao suficiente para destruir o organismo. O gnero dividido em oito espcies, dentre as quais a L. monocytogenes a que causa maior preocupao com enfermidades causadas por alimentos. J foi encontrada em uma variedade de alimentos, tanto crus como processados, onde pode sobreviver e se multiplicar rapidamente durante a estocagem. Entre esses alimentos, incluem-se leite e queijo supostamente pasteurizados, carnes, vegetais crus, frutos do mar e peixes. Sua capacidade de crescer em temperaturas to baixas quanto 3C permite multiplicao em alimentos refrigerados. A L. monocytogenes responsvel por infeces oportunistas, infectando, mulheres grvidas, recm-nascidos e idosos. Os sintomas da listeriose so: meningite, encefalite e septicemia; pode levar ao aborto, nascimento de feto morto ou prematuro quando a mulher grvida infectada no segundo e terceiro trimestres. A dose infectiva de L. monocytogenes desconhecida. O perodo de incubao excessivamente longo: de 1 a 90 dias.
6 Staphylococcus aureus A espcie Staphylococcus aureus um microrganismo muito conhecido pela sua patogenicidade ao homem e outros animais. Foi estudada pela primeira vez por Denys em 1894 e, posteriormente por Barber, em 1914. Somente em 1930 foi definitivamente reconhecida a importncia dos estafilococos na intoxicao alimentar. O gnero Staphylococcus possui mais de trinta espcies. A produo de enterotoxina est associada principalmente espcie S. aureus , embora
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outras espcies como S. intermedius e S. hyicus tambm tenham sido reconhecidas como produtoras. O S. aureus um dos agentes patognicos mais comuns, e responsvel por severas infeces em humanos. Est amplamente distribudo na natureza e os humanos e os animais so seus principais reservatrios. So cocos gram positivos, pertencentes famlia Micrococaceae. So facultativos anaerbios, com maior crescimento sob condies aerbias, quando ento, produzem catalase. S. aureus causa intoxicao provocada pela ingesto do alimento que apresenta a toxina pr-formadora. O perodo de incubao de um surto varia, geralmente, de 30 minutos a oito horas, sendo a mdia de duas a quatro horas, aps a ingesto do alimento contaminado. Os principais sintomas so: nuseas, vmitos, cibras abdominais (geralmente bem dolorosas), diarrias e sudorese, dores de cabea, calafrios e a queda de presso arterial. Os Staphylococcus esto presentes nas vias nasais e na garganta, alm do cabelo e pele. Apesar dos manipuladores de alimentos serem normalmente as principais fontes de contaminao dos alimentos, quando h surtos, os equipamentos e as superfcies tambm podem ser a fonte das contaminaes. Os alimentos normalmente associados s intoxicaes so carnes e produtos de carne, frangos e produtos de ovos, saladas como as de atum, galinha, batata e macarro, produtos de panificao como creme, tortas de creme, leite ou produtos lcteos.
7 Clostridium perfringens O Clostridium perfringens um bastonete anaerbio, gram positivo, formador de esporos. amplamente distribudo no ambiente e freqentemente encontrado no intestino de humanos e de animais.
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As caractersticas de intoxicaes causadas por Cl. perfringens so: dor abdominal, nusea, diarria aguda, sintomas que aparecem de 8 a 12 horas aps a ingesto do microrganismo. A forma mais comum da intoxicao caracterizada por dores abdominais intensas e diarrias que iniciam 8 a 12 horas aps o consumo do alimento contendo grande quantidade do microrganismo, o qual produz as toxinas causadoras da enfermidade. As carnes, os produtos crneos e os molhos so alimentos mais freqentemente implicados. Os esporos germinam e a bactria se multiplica at nveis causadores de enfermidades durante os perodos de refrigerao e estocagem. O controle desse microrganismo atingido principalmente por meio de coco e do resfriamento.
8 Clostridium botulinum O Clostridium botulinum um bastonete gram positivo, anaerbio estrito. Causa uma doena de origem alimentar denominada botulismo. Trata-se de uma intoxicao alimentar causada pela ingesto de neurotoxinas pr-formadoras. O microrganismo encontrado por toda a natureza. Existem quatro espcies clinicamente importantes: Cl. botulinum , Cl. perfringens causam enfermidades relacionadas ingesto de alimentos. Existem sete tipos basicamente pela antigenicidade da toxina. Os tipos A, B, E e F so os principais cau sadores de botulismo humano (tipos C e D em animais). Vrias neurotoxinas foram identificadas e esto entre as toxinas mais potentes conhecidos pelo homem. O microrganismo forma esporos, os quais podem ser transmitidos pelo ar e contaminar jarras abertas ou latas. Uma vez fechadas, as condies anaerbias favorecem o crescimento dos esporos e a produo de toxinas.
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Os sintomas do botulismo so: viso dupla, nusea, vmito, fadiga, tonturas, dor de cabea, garganta e nariz secos, falhas respiratrias. O botulismo associado com alimento enlatado de baixa acidez (principalmente aquele de produo caseira), vegetais, peixe e produtos de carne. Tambm associado com mel. O botulismo infantil mais brando do que a verso adulta. Essa bactria no pode crescer em alimentos cidos ou acidificados com pHs menores que 4,6.
9 Bacillus cereus O B. cereus um patgeno alimentar formador de esporos que foi isolado pela primeira vez em 1887. Os esporos podem sobreviver a muitos processos de coco. O microrganismo cresce bem em alimentos cozidos devido inativao da microbiota competidora. O B.cereus um bastonete gram positivo, aerbio facultativo, encontrado por toda a natureza, sendo isolado do solo, da vegetao, gua e dos plos de animais. comumente encontrado em baixos nveis nos alimentos (<10 2 UFC/g), os quais so considerados aceitveis. As intoxicaes alimentares iniciam quando o alimento sujeito a abusos de tempo-temperatura, propiciando que um nvel baixo de organismos se multiplique at nveis (>10 5 UFC/g) significativos (necessrios para intoxicao). Existem dois tipos reconhecidos de intoxicaes alimentares
causadas por B. cereus : o diarrico e o emtico. Ambos so autolimitantes e a recuperao ocorre dentro de 24 horas. O B. cereus produz toxinas diarricas durante o crescimento no intestino delgado humano, enquanto as toxinas emticas so pr-formadoras no alimento. Os sintomas da intoxicao alimentar causada por B. cereus so: nuseas, vmitos, dores abdominais e possvel diarria. Uma grande variedade de alimentos, incluindo carnes, leite,
vegetais e peixes, foi associada ao tipo diarrico de intoxicao. Os surtos do tipo emtico so geralmente associados com produtos de arroz, no entanto,
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outros alimentos ricos em amido, como batatas, massas e produtos de queijos. As misturas para alimentos como molhos, pudins, sopas, massas folhadas e saladas, so freqentemente relacionadas a surtos alimentares. A presena de um grande nmero de B. cereus (>10 6 organismos/g) em alimentos um indicativo do crescimento ativo e proliferao do microrganismo e um perigo potencial sade.
10 Vibrio parahaemolyticus Este microrganismo foi isolado pela primeira vez em 1951. atualmente reconhecido como o maior causador de gastrenterites de origem alimentar no Japo. Isso porque o microrganismo associado com o consumo de alimentos marinhos. Os sintomas tpicos de doenas alimentares causadas por V. parahaemolyticus so: diarrias, dores abdominais, nuseas, vmitos, dores de cabea, febre e tremores. O organismo est presente, normalmente, em quantidade inferior a 10 3 UFC/g em peixes e frutos do mar, exceto em guas mornas, onde a contagem pode aumentar para 10 6 UFC/g. As infeces causadas por esse microrganismo foram associadas ao consumo de peixes e frutos do mar crus, mal cozidos ou cozidos e recontaminados. A refrigerao inadequada de frutos do mar contaminados com esse microrganismo permite a sua proliferao, o que aumenta a possibilidade da infeco. O organismo bastante sensvel ao calor, e os surtos devem-se, freqentemente, a processos de manipulao inadequados e a abusos de temperaturas. O controle desse microrganismo pode ocorrer por meio da preveno da sua multiplicao aps a pesca pelo resfriamento (25C) e pela coco com temperatura interna maior do que 65C. O isolamento de qualquer espcie de Vibrio a partir de alimentos cozidos indica prticas de higiene inadequadas, j que o microrganismo destrudo rapidamente pelo calor.
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11 Vibrio vulnificus O V. vulnificus foi relatado pela primeira vez em 1976 como vbrio lactose positivo. O V. vulnificus significa causador de feridas, o que reflete a habilidade do microrganismo em invadir e destruir. O microrganismo , portanto, associado com infeces que originam feridas e septicemias fatais. Os sintomas tpicos da doena alimentar so: febre, tremores, nuseas, leses da pele. O incio dos sintomas ocorre cerca de 24 horas (a partir de 12 horas at vrios dias) aps a ingesto de frutos do mar cruz contaminados (especialmente ostras) por pessoas vulnerveis. Os indivduos mais susceptveis s infeces incluem idosos, pessoas imunocomprometidos e aqueles que sofrem de distrbios crnicos do fgado e de alcoolismo crnico. A mortalidade ocorre em 40 a 60% dos casos. O V. vulnificus isolado a partir de moluscos e guas litorneas. O microrganismo raramente isolado de guas do mar com temperaturas inferiores a 10 a 15C, mas os nmeros aumentam quando a temperatura da gua superior a 21C. A principal rota de infeco a ingesto seguida de feridas e septicemia. A principal forma de preveno evitar o consumo de moluscos crus, em particular ostras, por indivduos imunocomprometidos.
12 Brucella melitensis , Br. Abortus e Br. suis A Brucella um cocobacilo gram negativo, estritamente aerbio, o qual causa a brucelose. Esse microrganismo encontra-se em animais e causa infeces acidentais em humanos. As quatro espcies que causam infeces em humanos so denominadas a partir do animal em que so comumente isoladas: Br. abortus (gado), Br. suis (suno), Br. melitensis (bodes) e Br. canis (ces). O gado e as indstrias de laticnios so a principal fonte de contaminao. A Brucella pode entrar no corpo pela pele ou pelos tratos respiratrio ou digestivo.
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No mundo, a brucelose mantm-se como uma das principais fontes de distrbios em humanos e animais domsticos. A preveno da brucelose depende da sua erradicao ou do controle em animais hospedeiros, precaues higinicas para limitar a exposio a infeces por meio de atividades ocupacionais e tratamento trmico de produtos lcteos e outros alimentos potencialmente contaminados.
13 Aeromonas hydrophila , A. caviae e A. sobria Essas espcies esto presentes em ambientes de gua doce e em guas salgadas. Tm sido freqentemente encontradas em peixes e frutos do mar e em amostras de carne vermelha (gado, porco e ovelha) e de frango no mercado. Crescem em temperaturas que variam de 0 a 45C, sendo que espcies eu determinam patogenia humana (mesfilos) crescem entre 10 e 42C. Algumas espcies so capazes de causar doenas em peixes e anfbios, bem como em humanos, os quais adquirem infeces atravs de feridas abertas ou pela ingesto de organismos presentes em alimentos ou gua, podem causar gastrenterites em indivduos saudveis de septicemia em indivduos com o sistema imunolgico debilitado. Os sintomas gerais de gastrenterites causadoras so: diarrias, dores abdominais, nuseas, tremores e dores de cabea, doenas similares a disenteria, colite, sintomas adicionais que incluem septicemia, meningite, endocardite e lceras crneas.
7.2 P A T G E N O S
DE ORIGEM ALIMENTAR: EUCARIOTOS
1 Cyclospora cayetanensis Esse parasita ocorre em guas tropicais no mundo todo e causa uma diarria aquosa e explosiva em humanos. Os primeiros casos reportados em
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humanos ocorreram em 1979. Inicialmente, esse agente foi associado gua contaminada, mas tambm foi associado ao consumo de alface, framboesa e manjerico fresco. O perodo de incubao de uma semana aps o consumo do alimento infectado. O Cyclospora infecta o intestino delgado. Os sintomas tpicos de intoxicaes causadas por Cyclospora so: diarria aquosa, perda de apetite, substancial perda de peso, inchao, aumento de flatulncia, dores abdominais, nuseas, vmitos, dores musculares, febre baixa e fadiga.
2 Cryptosporidium parvum O modo de transmisso do patgeno pela rota fecal-oral, incluindo alimentos e gua. Os hospedeiros incluem humanos e animais domsticos, inclusive o gado. Podem sobreviver no ambiente por longos perodos, onde permanecem infecciosos e resistem a qumicos usados para purificar gua para uso humano. Podem, contudo, ser removidos do sistema de gua tratada por meio de filtragem. Os principais sintomas em humanos so febre, diarria, dores abdominais e anorexia. A doena, geralmente, ocorre por menos de 30 dias, mas pode se prolongar em indivduos imunodeficientes e levar morte.
3 Taenia saginata e T. solium As infeces por vermes achatados em humanos so causadas devido ingesto de vermes na carne de boi ( Taenia saginata ) e na carne de porco ( T. solium ). Ambos os organismos so, obrigatoriamente, parasitas do intestino humano. Tais vermes tm um ciclo de vida complexo. A forma larval ingerida atravs de carnes de boi ou porco infectado e se desenvolve at a forma adulta (podendo alcanar vrios metros de comprimento). Interromper o ciclo de vida do organismo a principal medida de controle, o que pode ser feito pela inspeo completa da carne e do cozimento adequado (>60C).
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4 Toxoplasma gondii O T. gondii o agente causador da toxoplasmose que pode ser encontrado em carnes mal cozidas e cruas tais como porco, cordeiro, carne de boi e de aves. Os hospedeiros primrios so os gatos, sendo que a infeco humana se d quando h contato com as suas fezes. A infeco tambm ocorre pela ingesto de carne mal cozida ou crua de hospedeiros intermedirios tais como roedores, sunos, gado, cabra, galinha e pssaros. O microrganismo causa hidrocefalia e cegueira em crianas, enquanto, em adultos, os sintomas so menos graves. Em indivduos imunodeprimidos, pode causar hepatite, miocardite ou combinaes dessas doenas. O cozimento apropriado das carnes destri o microrganismo.
5 Micotoxinas As micotoxinas so produtos txicos de certos fungos microscpicos os quais, em algumas circunstncias, desenvolvem-se sobre ou em produtos alimentcios de origem animal ou vegetal. Centenas de micotoxinas foram identificadas e so produzidas por cerca de 200 variedades de fungos. As micotoxinas so metablitos secundrios que foram responsveis por grandes epidemias em humanos e animais. As micotoxinas so produzidas pelos gneros de fungos Aspergillus , Fusarium e Penicillium . Esses fungos so encontrados no ambiente e fazem parte da flora normal das plantas. H quatro tipos de toxicidade: Aguda, resultando em danos aos rins ou fgado; Crnica, resultando em cncer de fgado; Mutagnica, causando danos no DNA; Teratognica, causando cncer em crianas por nascer.
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Aflatoxinas:
As
aflatoxinas
so
compostos
txicos
que
so
produzidos por certas linhagens dos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus sob condies favorveis de temperatura e umidade. Esses fungos crescem em certos alimentos e raes, resultando na produo de aflatoxinas. Tm sido encontradas em nozes, amendoins e outras sementes oleosas, milho e semente de algodo. As aflatoxinas de maior interesse so caracterizadas como B 1 , B 2 , G 1 e G 2 . A aflatoxina B 1 a mais comumente encontrada e a mais txica. As aflatoxinas produzem necrose aguda, cirrose e carcinoma no fgado em diversas espcies animais. A toxicidade pode ser influenciada por fatores ambientais, nvel de exposio e durao exposio, idade, sade e estado nutricional. Ocratoxinas: As ocratoxinas so produzidas por Penicillium
verrusocum e Penicillium viridicatum . So encontradas principalmente nos cereais, porm nveis significativos de contaminao podem ocorrer em suco de uva, vinho tinto, caf, cacau e frutas secas. As ocratoxinas so potencialmente nefrticas e carcinognicas, sendo a sua potncia varivel de acordo com as espcies e o sexo. Fumosina: As fumosinas so um grupo de micotoxinas produzidas pelo Fusarium , as quais tm ocorrncia mundial no milho e produtos derivados. As fumosinas so bastante estveis durante o processamento de alimentos. Zearalenona: A zearalelona um metablito fngico produzido principalmente por Fusarium graminearium e F. culmorum , os quais colonizam milho, cevada, trigo, aveia e sorgo. Estes compostos podem causar graves problemas de reproduo infertilidade em animais, especialmente em sunos. O controle de micotoxina muito difcil, uma vez que se deve prevenir a invaso atravs das sementes pelo fungo, do solo ou mesmo do ar antes da colheita. A secagem e a estocagem adequadas so processamentos
78
muito teis, mostrando boas prticas de gerenciamento dos locais de produo. A seleo de gros com luz ultravioleta (para evidenciar as aflatoxinas) utilizada na produo de milho, semente de algodo e figo. Prons: As encefalopatias espongiformes transmissveis em animais e humanos so causadas por prons (partcula de protena infecciosa). Os prons so formas modificadas de uma protena norma. Essas protenas acumulam-se no crebro, causando buracos ou placas e os subseqentes sintomas clnicos, levando morte. Na encefalopatia espongiforme bovina (doena da vaca louca) h evidncias de que o agente infeccioso se trata de um pron.
7.3
PATGENOS DE ORIGEM ALIMENTAR: VRUS
1 Vrus Norwalk e semelhantes ao Norwalk Os vrus Norwalk e os semelhantes causam diarria e vmitos. So patgenos humanos. As gastrenterites devidas aos vrus Norwalk so autolimitantes e moderadas. As caractersticas dessas gastrenterites so: nuseas, vmitos, diarrias, dores abdominais, tambm podem ocorrer dores de cabea, febre, tremores, dores musculares e fraquezas. A dose infecciosa desconhecida, mas presumivelmente
pesqueira. Um moderado e curto mal-estar geralmente se desenvolve dentro de 24 a 48 horas aps a ingesto de alimentos ou gua contaminada e dura de 24 a 60 horas. As gastrenterites devidas aos vrus Norwalk so transmitidas por via fecal-oral atravs de gua e alimentos contaminados. A gua a fonte mais comum de surtos, que podem ser provenientes de origem municipal, poos,
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lagos de recreao e piscinas. Os moluscos e os ingredientes para salada so os alimentos mais comumente infectados. O controle feito evitando que alimentos sejam contaminados com gua contaminada e manipuladores infectados.
2 Hepatite A O vrus da hepatite A (HAV) tem sido isolado e coletado de vrias partes do mundo. O perodo de incubao para o HAV varia de 10 a 50 dias (com mdia de 30 dias). O perodo de comunicabilidade se estende do comeo da incubao at por volta de uma semana do incio do desenvolvimento de ictercia. O maior perigo de transmisso da doena ocorre durante a metade do perodo de incubao at bem antes dos primeiros sintomas. Sintomas tpicos da hepatite A so: febre, arrepios, mal-estar, perda de apetite, nuseas, ictercia, urina de cor escura, fezes de cor mais clara, dores abdominais na rea do fgado. O HAV excretado nas fezes de pessoas infectados e poder produzir doena quando indivduos susceptveis consomem alimentos ou gua contaminados. As frutas e suco de frutas, leite e produtos lcteos, vegetais, saladas, moluscos e as saladas so as fontes mais freqentes. A contaminao de alimentos por intermdios de manipuladores infectados comum. O HAV possui uma distribuio mundial, ocorrendo tanto de maneira epidmica quanto espordica. transmissvel principalmente por meio de contato pessoa-pessoa por contaminao fecal, porm tambm podem ocorrer fontes epidmicas como alimentos ou guas contaminadas. As condies higinico-sanitrias deficientes e a superpopulao facilitam a transmisso. Os surtos de HAV so comuns em instituies, casas superlotadas e prises.
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3 Rotavrus Os rotavrus so classificados como pertencentes famlia
Reoviridae. Seis grupos sorolgicos foram identificados, trs dos quais (A, B e C) infectam humanos. As gastrenterites causadas por rotavrus so autolimitantes, variam de brandas a graves e so caracterizadas por vmitos, diarria aquosa e febre baixa. Resume-se que a dose infecciosa deva ser de 10 a 100 partculas virais infecciosas. Como uma pessoa com diarria causada por rotavrus excreta grandes quantidades de vrus (10 8 -10 1 0 partculas infecciosas/mL de fezes), doses infecciosas podem ser facilmente adquiridas pelo contato com mos, objetos e utenslios contaminados. Os rotavrus so transmitidos por rota fecal-oral. A contaminao pessoa-pessoa disseminada por mos contaminadas e, provavelmente, o meio mais importante pelo qual esse vrus transmitido em pequenas comunidades tais como clnicas geritricas e peditricas, berrios e residncias. Os manipuladores contaminados podem contaminar alimentos que no sero posteriormente cozidos como, por exemplo, saladas, frutas e aperitivos. Os rotavrus so bastante estveis no ambiente e tm sido encontrados em amostras estuarinas. A incidncia de infeco de rotavrus similar em pases com nveis altos e baixos de padres de sade. Os rotavrus do grupo A so endmicos no mundo inteiro. Ele o causador de diarrias graves em crianas e inclui cerca da metade dos casos que necessitam de hospitalizao.
7.4 I N T O X I C A E S
CAUSADAS POR FRUTOS DO MAR E MOLUSCOS
Existem muitas intoxicaes originadas a partir do consumo de frutos do mar e moluscos. Podem ser causadas por ciguatera, uma toxina proveniente de microalgas, as quais ficam acumuladas na carne do peixe. Outro caso a intoxicao escombride, que se deve ao consumo de carne de peixe contendo altos nveis de histamina. Esse composto proveniente da
81
ao da histidina desidrogenase bacteriana de peixes como a cavala. As bactrias envolvidas so Morganella morganis , Proteus spp., Hafnia e Klebsiella pneumoniae . As enfermidades relacionadas aos moluscos so causadas por um grupo de toxinas produzidas por algas (dinoflageladas), na maioria dos casos, da qual os moluscos se alimentam. As toxinas so acumuladas e, algumas vezes, metabolizadas pelos moluscos. A ingesto de moluscos contaminados resulta em uma ampla variedade de sintomas que dependem das toxinas presentes, das suas concentraes contaminado. caracterizadas no As do molusco que as e da quantidade consumida molusco Todos do so os molusco melhor moluscos intoxicaes paralisantes por
intoxicaes
diarricas.
(alimentados por filtrao) so potencialmente txicos. As do tipo paralisante so geralmente associadas a mexilhes, moluscos e vieiras.
1 Intoxicaes Causadas por Ciguatera Esse tipo de intoxicao caracteriza-se por: irritao nos lbios, lngua e garganta, dor de cabea, dor forte nos braos, pernas e olhos, viso dupla, leses na pele (bolhas, coceiras e eritema). A maioria dos casos apresenta recuperao que leva de dias a semanas, sendo a mortalidade baixa.
2 Intoxicaes Escombride Os sintomas desse tipo de enfermidade so: gosto metlico, picante ou agudo na boca, dor de cabea intensa, tonturas, nuseas e vmitos, suor facial e vermelhido, dor epigstrica, pulsao rpida e fraca, coceira na pele, queimao na garganta e dificuldade para engolir.
82
Normalmente predisposio.
recuperao
ocorre
dentro
de
12
horas.
As
fatalidades so raras e, geralmente, so devidas a outros fatores de
3 Intoxicaes Paralisantes Causadas por Moluscos Os neurolgicos sintomas e desse tipo de intoxicao so principalmente fala
incluem
formigamentos,
queimao,
sonolncia,
incoerente e paralisia respiratria. A intoxicao paralisante causada por moluscos se deve a 20 toxinas produzidas por dinoflagelados.
4 Intoxicaes Diarricas Causadas por Moluscos Essa intoxicao , normalmente, um distrbio gastrintestinal brando, caracterizado por nuseas, vmito, diarria e dor abdominal seguida por tremores, dor de cabea e febre. Seu incio pode ocorrer entre 30 minutos at trs horas, dependendo da dose da toxina ingerida. Os sintomas podem durar de 2 a 3 dias. A recuperao completa, sem efeitos posteriores, sendo que a doena, geralmente, no impe riscos vida do infectado.
5 Intoxicaes Neurotxicas Causadas por Moluscos Esse tipo de intoxicao causa sintomas tanto neurolgicos quanto intestinais, incluindo formigamentos e entorpecimento dos lbios, lngua e garganta, dores musculares, tonturas, sensaes intercaladas de calor e frio, diarria e vmitos. O incio dos sintomas pode ocorrer desde alguns minutos at poucas horas. A durao da enfermidade razoavelmente pequena, de algumas horas a vrios dias. A recuperao completa com poucos efeitos posteriores: nenhuma fatalidade foi registrada. A intoxicao ocorre devido exposio a polisteres chamados de brevetoxinas, produzidas por dinoflagelados.
83
6 Intoxicao Amnsica Causada por Moluscos Esse gastrintestinais tipo de intoxicao diarria, caracterizado abdominais) por e desordens problemas
(vmitos,
dores
neurolgicos (confuso e perda de memria, desorientao, coma). Os sintomas gastrintestinais ocorrem dentro de 24 horas, enquanto os de carter neurolgico ocorrem em 48 horas. A toxinose particularmente sria em pacientes idosos, incluindo sintomas remanescentes Doena de Alzheimer. Todas as fatalidades, at agora, envolveram pacientes idosos. A intoxicao causada pela presena de um aminocido incomum, o cido dimico, o qual contamina os moluscos por meio de diatomceas.
84
CAPTULO VI MICRORGANISMOS INDICADORES
uma evidncia indireta referente a uma caracterstica particular do histrico da amostra. Normalmente, intestinal. Outros so associados podem ser a microrganismos como de origem em
termo microrganismo indicador pode ser aplicado a qualquer grupo taxonmico, fisiolgico ou ecolgico de microrganismos, cuja presena ou ausncia proporciona
grupos
usados
indicadores
determinadas situaes. Por exemplo, a presena de bactrias gram negativas em alimentos tratados termicamente um indicativo de tratamentos trmicos inadequados. Microrganismos indicadores vm sendo utilizados na avaliao da qualidade microbiolgica da gua h longo tempo e mais recentemente na de alimentos devido s dificuldades encontradas na deteco de microrganismos patognicos, como, por exemplo, Salmonella . Microrganismos indicadores so grupos ou espcies de
microrganismos, que, quando presentes em um alimento, pode fornecer informaes sobre a ocorrncia da contaminao de origem fecal, sobre a provvel presena de patgenos ou sobre a deteriorao do alimento, alm de poderem indicar condies sanitrias inadequadas durante o processamento, produo ou armazenamento. O temo microrganismo indicador foi sugerido por Ingram, em 1977, para um organismo marcador cuja presena indicasse a possvel presena de um patgeno. Os microrganismos indicadores so mais comumente utilizados para avaliar a segurana e a higiene alimentar do que a qualidade.
85
De
forma
ideal,
um
indicador
de
segurana
alimentar
deve
apresentar certas caractersticas importantes: ser detectvel de forma fcil e rpida; ser facilmente distinguvel de outros membros da microbiota do alimento; possuir um histrico de associaes constantes com o patgeno cuja presena visa a indicar; estar sempre presente quando o patgeno de interesse estiver presente; no deve estar presente como contaminante natural do alimento, pois assim sua deteco no indicar, necessariamente, a presena de matria fecal ou dos patgenos; estar ausente dos alimentos que so livres de patgenos, com exceo, talvez, de nmeros mnimos; possuir caractersticas e taxas de crescimento equivalentes s do patgeno. No entanto, nem sempre todas essas caractersticas so observadas. Os microrganismos indicadores usualmente utilizados so:
coliformes, Escherichia coli , enterobactrias, enterococos. Os coliformes so bactrias gram negativas, anaerbias facultativas em forma de bastonetes. Os critrios utilizados para identificao so a produo de gs proveniente da glicose e outros acares e a fermentao da lactose at a produo de cido e gs em perodo de 24 a 48 horas a 37C. o grupo dos coliformes inclui espcies do gnero Escherichia , Klebsiella , Enterobacter e Citrobacter , alm de E. coli . Os coliformes foram historicamente utilizados como
microrganismos indicadores para servir como uma medida de contaminao

86
fecal e, assim medir a presena potencial de patgenos entricos em gua. Contudo, como a maioria dos coliformes encontrada no meio ambiente, essas bactrias possuem limitada relevncia higinica. Devido ao fato de os coliformes serem destrudos com certa facilidade pelo calor, sua contagem pode ser til em testes de contaminaes ps-processamento.
1 INDICADORES
DE CONTAMINAO FECAL OU DA QUALIDADE HIGINICO-
SANITRIA DO ALIMENTO
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal presente em gua foi proposto em 1892, uma vez que esse microrganismo tem seu habitat no trato intestinal de humanos e animais. Muitas cepas da bactria so inofensivas, contudo algumas so patognicas e causam doenas diarricas. Atualmente, seis tipos principais de E. coli so classificados em grupos especficos baseados nos fatores de virulncia, mecanismos de patogenicidade, sndrome clnica e distintos sorotipos O:H. Essas categorias so E. coli enteropatognica (EPEC), enterotoxignicas (ETEC), enteroinvasiva (EIEC), difuso aderente (DAEC), enteroagregativa (EAEC) e entero-hemorrgica (EHEC). Recentemente, a importncia da E. coli foi relacionada com a presena de cepas produtoras de citotoxina Vero (VTEC), do sorotipo O 1 5 7 :H 7 que tem ocasionado surtos de toxinfeces alimentares com morbilidade e mortalidade. O indicador ideal de contaminao fecal deveria preencher, alm dos requisitos anteriormente citados, os seguintes: ter como habitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros animais; deveria ocorrer em nmeros muito altos nas fezes;
87
deveria haver tcnicas rpidas, simples e precisas para a sua deteco e/ou contagem.
1.1 C O L I F O R M E S
TOTAIS
Este grupo composto por bactrias da famlia Enterobacteriaceae , so capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando incubados a 35-37C por 24-48 horas. So bacilos gram negativos no esporulados. Fazem parte desse grupo as bactrias do gnero Escherichia , Enterobacter , Citrobacter e Klebsiella , alm de serem encontrados nas fazes, tambm podem persistir longos perodos e se multiplicar em ambientes no fecais, como vegetais, solo. A presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente, contaminao fecal recente. O ndice de coliformes totais utilizado para avaliar as condies higinicas, sendo que as altas contagens significam contaminao ps-processamento, limpezas e sanificaes deficientes, tratamentos trmicos ineficientes ou multiplicao durante o processamento ou estocagem. Coliformes a 45C e Escherichia coli as bactrias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando incubadas temperatura de 45C. Nessas condies, em torno de 90% das culturas de E. coli so positivas. O ndice de coliformes a 45C ou de E. coli nos alimentos empregado como indicador de contaminao fecal, ou seja, condies higinico-sanitrias, visto que se estima que a populao deste grupo constituda de uma alta proporo de E. coli , que tem seu habitat exclusivo no trato intestinal do homem e de outros animais. Assim, sua presena pode indicar a possibilidade de ocorrerem outros microrganismos entricos na amostra. Em alimentos como vegetais frescos, o nico indicador vlido de contaminao fecal a E. coli , j que os demais indicadores de contaminao fecal so encontrados naturalmente nesse tipo de alimento. Em alimentos
88
frescos
de
origem
animal,
ocorrncia
de
nmeros
elevados
de
Enterobactrias pode indicar manipulao sem cuidados de higiene e/ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presena de um nmero considervel de coliformes ou de Enterobactrias pode indicar: processamento processamento, inadequado sendo as e/ou causas recontaminao mais freqentes psaquelas
provenientes da matria-prima, equipamento sujo ou manipulao sem a devida higiene; proliferao microbiana que poderia permitir a multiplicao de microrganismos patognicos.
Diferenciao dos coliformes A enumerao dos coliformes pode ser efetuada utilizando mtodos convencionais e mtodos rpidos. O mtodo convencional ainda muito empregado o mtodo dos tubos mltiplos que pode ser utilizado para estimar o nmero de coliformes pela tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP). Para diferenciao entre os coliformes fecais dos no-fecais so necessrios testes bioqumicos para identificao das espcies. Esses testes so coletivamente designados como reaes IMVic I indol; M vermelho de metila; Vi reao de Voges-Proskauer e C citrato. Outros testes tambm so sugeridos como os
carboidratos e aminocidos.
1.2 E N T E R O C O C O S A distribuio de Enterococos na natureza ampla e eles fazem parte da microbiota normal do homem e de animais, particularmente, do trato intestinal. So freqentemente utilizados como indicadores complementares
89
do grupo de coliformes na determinao de contaminao fecal. A relao existente entre as contagens de coliformes fecais e enterococos fecais pode indicar se a contaminao recente de origem humana ou animal. Apesar das amplas aplicaes dos coliformes como indicadores de poluio fecal, existem controvrsias sobre sua utilizao e estudos epidemiolgicos sugerem a contagem de Enterococos como uma alternativa, principalmente pelo fato destes microrganismos resistirem a vrias condies adversas como salinidade elevada, desidratao, detergentes e desinfetantes, congelamento, pH cido e tratamento trmico moderado. Os enterococos so um grupo de microrganismos que vm se destacando nos ltimos anos como patgenos oportunistas. Sua biologia e taxonomia tm passado por alteraes significativas ao longo do tempo. O gnero foi criado em 1984, com a transferncia de Streptococcus faecalis e S. faecium para Enterococcus faecalis e E. faecium . Os enterococos so cocos gram positivos, anaerbios facultativos. As espcies mais encontradas em alimentos so Enterococcus faecalis e E. faecium . Apesar das limitaes do uso desses microrganismos como
indicadores de contaminao fecal, sua presena em nmeros elevados em alimentos indica prticas sanitrias inadequadas ou exposio do alimento a condies que permitiram a multiplicao dos microrganismos. Para determinao de Enterococcus usada a tcnica dos tubos mltiplos e contagem em placa.
2 INDICADORES
GERAIS DE CONTAMINAO DO ALIMENTO
So grupos de microrganismos que, quando presentes em nmeros elevados nos alimentos podero causar a deteriorao e/ou a reduo da vida
90
de
prateleira.
Essas
contagens
fornecem
informaes
gerais
sobre
as
condies durante o processamento do alimento. As contagens de bactrias viveis baseiam-se no nmero de bactrias que se desenvolvem em placa com meios de cultura nos quais foram inoculadas quantidades previamente conhecidas do alimento diludo e, posteriormente, inoculadas sob determinadas condies ambientais.
3 CONTAGEM
PADRO DE BACTRIAS AERBIAS MESFILAS (CONTAGEM
PADRO EM PLACAS)
Esta contagem detecta, em um alimento, o nmero de bactrias aerbias ou facultativas e mesfilas presentes tanto sob forma vegetativa quanto esporulada. A contagem padro em placas (PCA) tem sido usada como indicador da qualidade higinica dos alimentos, fornecendo tambm idia sobre seu tempo til de conservao. Sua presena em grande nmero indica: matrias-primas excessivamente contaminadas; limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; higiene inadequada na produo; condies inadequadas de tempo/temperatura durante a produo ou a conservao dos alimentos, ou uma combinao destas circunstncias. A deteriorao de alimentos pode ser causada pelo crescimento de microrganismos que levariam a alteraes organolpticas. Neste caso, nmeros elevados so esperados e variam com o tipo de alimento e microrganismo presente. A maioria dos alimentos apresenta, quando essas alteraes so detectveis, nmeros superiores a 10 6 UFC/g ou mL do alimento.
91
4 CONTAGEM
DE BACTRIA PSICROTRFICAS E TERMFILAS
Essas contagens avaliam o grau de deteriorao de alimentos refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento trmico.
5 CONTAGEM
DE BACTRIAS ANAERBIAS
Alguns
sistemas
para
contagem
de
bactrias
anaerbias,
desenvolvidos recentemente, ajudaram essas contagens. Entre esses sistemas, pode-se citar as jarras especiais que comportam vrias placas de Petri em uma atmosfera livre de oxignio (anaerobiose). A presena de bactrias anaerbias indicativa de que houve condies favorveis para a multiplicao, como por exemplo, por Clostridium botulinum e Clostridium perfringens .
6 CONTAGEM
DE BOLORES E LEVEDURAS
O crescimento de bolores e leveduras mais demorado do que o de bactrias em alimentos de baixa acidez e alta atividade de gua. Portanto, dificilmente sero responsveis pela deteriorao desses alimentos. Em alimentos cidos e de baixa atividade de gua, no entanto, o crescimento de fungos maior, provocando deteriorao com grande prejuzo econmico em frutas frescas, vegetais e cereais. So tambm responsveis pela deteriorao de sucos de frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva como picles, quando armazenados em condies inadequadas. A presena de fungos filamentosos (bolores) e leveduras em ndice elevado nos alimentos pode fornecer vrias informaes: condies higinicas deficientes de equipamentos; multiplicao no produto em decorrncia de falhas no
processamento e/ou estocagem;

92
matria-prima com contaminao excessiva. A presena desses microrganismos pode tornar-se um perigo sade pblica devido produo de micotoxinas pelos bolores. Algumas la: boas prticas de higiene levam reduo da carga de esporos; esses alimentos devem chegar o mais rapidamente possvel ao consumidor; o armazenamento de alimentos congelados deve ser a medidas devem ser tomadas por manipuladores de
alimentos suscetveis a essa contaminao, na tentativa de reduzir ou elimina-
temperaturas inferiores a -12C; eliminar ou reduzir o contato com o ar atravs de embalagens, por exemplo; adicionar cidos ou conservadores qumicos como benzoatos ou sorbatos, para retardar o crescimento fngico. Baixas contagens de bolores e leveduras so normais em alimentos frescos e congelados, no sendo, portanto, significativas. Somente quando o crescimento de bolor for visvel ou o alimento apresentar um nmero elevado de leveduras, o consumidor ser capaz de reconhecer a deteriorao. Esta deteriorao por leveduras no prejudicial sade.
7 OUTROS
INDICADORES
Staphylococccus produz uma enterotoxina
a presena de nmeros elevados de S. aureus nos alimentos, chamada de enterotoxina
uma indicao de perigo potencial sade pblica, esse microrganismo estafiloccica.
93
Clostrdios
esses
microrganismos
foram
sugeridos
como
indicadores de contaminao fecal, mas no so especficos de fezes humanas. Por serem formadores de esporos, podem persistir nos alimentos quando a maioria dos microrganismos entricos foi destruda. Contudo, C. perfringens e C. botulinum so importantes em toxinfeces de origem alimentar. Contagem de esporos de termfilos eficincia de sanificao de certos vegetais. Contagem de bolores em equipamentos tem sido usada como usada como indicadora da
indicadora da sanificao de operaes de processamento de alimentos. Esses bolores crescem rapidamente em alimentos que aderiram superfcies dos equipamentos e contaminam os alimentos que passam por esse local contaminado.
94
PARTE II:
95
CAPTULO VII MTODOS DE ANLISES
do alimento. A
nalisar
amostras
de
alimentos
quanto
presena
de
bactrias patognicas ou deteriorantes, fungos e toxinas uma prtica padro para garantir a segurana e a qualidade
anlise
dos
alimentos
para
se
verificar
quais
quantos
microrganismo esto presentes fundamental para se conhecer as condies de higiene em que esse alimento foi preparado, os riscos que esse alimento pode oferecer sade do consumidor e se o alimento ter ou no a vida til pretendida. Alm disso, a anlise laboratorial permitir determinar o agente etiolgico mais provvel no caso de um surto de toxinfeco alimentar. Essa anlise indispensvel tambm para verificar se os padres e especificaes microbiolgicas, adequadamente. A anlise microbiolgica de um produto alimentcio pode ser conduzida para investigar a presena ou a ausncia de microrganismo nesse produto, para qualificar os microrganismos presentes e para identificar e caracterizar as diferentes espcies microbianas Inmeras mtodos laboratoriais de anlises podem ser utilizados em cada um desses mtodos so comumente divididos em mtodos convencionais e mtodos rpidos. Os mtodos devem ser confiveis e certificados e so encontrados em varias fontes consideradas de referencia, internacionalmente aceitas. Esses mtodos esto descritos: Association of Official Analytical Chemist, Bacteriological nacionais ou internacionais, esto sendo atendidos
Analytical Manual (AOAC), 1992);
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Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (Vanderzant & Splittstoesser , 1992); Pratical Food Microbiology (Rorberts et al ., 1995); Microorganisms in foods enumeration, publicado their significance and methods of pela International Commission on
Microbiological Specification for Foods (ICMSF).
1 CUIDADOS
NA INTERPRETAO DOS RESULTADOS
1. Os microrganismos esto em um ambiente dinmico no qual a multiplicao e a morte de diferentes espcies ocorrem em taxas diversas. Isso significa que os resultados de um teste so vlidos apenas para o momento da amostragem; 2. As contagens das clulas viveis por meio de plaqueamento de diluies de alimentos em um meio agar podem ser mal conduzidos, no permitindo o crescimento de microrganismos; 3. A homogeneidade de um alimento rara especialmente com alimento slidos, portanto, os resultados para uma amostra podem no ser representativos para o lote inteiro. Co m tudo, no possvel submeter um lote inteiro de alimentos anlise microbiolgica, porque no haveria produto restante para vender; 4. As contagens de colnias so vlidas apenas dentro de certas faixas e tm limites de confiana; 5. Existem diversas questes relacionadas recuperao de
microrganismos de alimentos que devem ser mencionadas em qualquer procedimento de isolamento: a) No caso de alimentos slidos, deve ser feita a homogeneizao por meio de liquidificao para fins de diluio;
97
b) O organismo alvo normalmente esta em minoria na populao microbiana; c) O organismo - alvo est presente em pequenas quantidades; d) O organismo - alvo pode estar fsica e metabolicamente lesado; e) O organismo alvo pode no estar uniformemente distribudo no alimento; f) O alimento pode no apresentar composio homognea.
2 AMOSTRAGEM A obteno correta das amostras, seu transporte para o laboratrio e sua preparao para anlise so etapas fundamentais para o sucesso de uma anlise microbiolgica. Seguir as seguintes etapas: A amostra deve ser representativa, os produtos prontos para consumo devem ser coletados em suas embalagens originais fechadas, com especificaes de dados que o identifique como, nmero do lote, data de fabricao, etc. Quando embalagens abertas precisam ser analisados, importante que sejam para evitar contaminao com acondicionadas adequadamente
outros alimentos, manipuladores, e com o ambiente. Os produtos acondicionados em embalagens, de difcil transporte para o laboratrio podem ser amostrados in loco, com a mxima assepsia. Alimentos perecveis refrigerados devem ser mantidos entre O e 44C at o incio da anlise. Quando se tratar de alimentos congelados, as amostras devem ser descongeladas somente para a realizao da anlise. Como regra geral, toda amostra deve ser
98
analisada at 36 horas aps sua obteno. Produtos perecveis que no puderem ser analisados nesse perodo podem ser refrigerados ou ainda congelado, dependendo do tipo de produto, objetivo da anlise e tipo de microrganismo a ser pesquisado. O nmero de unidades a serem coletadas para anlise e dos critrios adotados para aprovao ou reprovao de um produto define um plano de amostragem.
3 PREPARO
DA AMOSTRA PARA ANLISE MICROBIOLOGICA
3.1 C O L E T A
DA AMOSTRA
Tcnicas asspticas devem ser utilizadas em todas as etapas; Deve-se proceder limpeza e a desinfeco da embalagem do alimento a ser analisado com lcool a 70%; A quantidade analisada do alimento muitas vezes na faixa de 25g (ou mL) 50g A mostra precisa ser homogeneizada com diluente apropriado, a escolha do diluente depende do tipo do produto e dos microrganismos a serem pesquisados; A homogeneizao das amostras com o diluente pode ser feita em liquidificadores ou homogeneizadores de laboratrio denominados stomacher .
3.2 R E T I R A D A A
DA AMOSTRA
operao
de
retirada
da
amostra
deve
ser
efetuada,
preferencialmente, dentro de uma capela de fluxo laminar, ou prxima de um bico de Bunsen, com a chama a meia altura.
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As embalagens devem ser desinfetadas antes de sua abertura que dever ocorrer de maneira assptica. Amostras de alimentos lquidos devem ser retirados com pipeta estril, e os alimentos slidos ou semi-slidos devem ser pesados assepticamente.
3.3 P R E P A R O
DAS DILUIES
No preparo das diluies sucessivas, podem ser utilizados diversos diluentes; soluo salina-peptonada, salina a 0,85% ou gua estril e outros. Para obteno da diluio inicial (1/10) procede-se do seguinte modo: a) Retirar assepticamente pores de 25g ou 25 mL da amostra, colocandose em homogeneizadores esterilizados ; b) Adicionar 225 mL do diluente; c) Homogeneizar por alguns minutos em velocidade reduzida, para no danificar as clulas microbianas. d) A partir da diluio inicial (1/10), proceder s diluies seguintes (1/100); (1/1000), etc. (Apndice A).
3.4 S O L U E S a)
DILUENTES
Soluo salina peptonada
Cloreto de Sdio.......................8.5g Peptona....................................1,0g gua destilada..........................1000mL
Dissolver os componentes em gua destilada. Distribuir em tubos de ensaio (9mL).Esterilizar em autoclave a 121C/15min.
100
b)
Soluo salina 0,85%
Cloreto de Sdio......................0,85g gua destilada.........................100mL
Dissolver o cloreto de sdio em gua destilada. Distribuir em tubos de ensaio e esterilizar em autoclave a 121C/15min.
101
CAPTULO VIII ESTIMATIVA DA POPULAO DE COLIFORMES TOTAIS, A 45C E ESCHERICHIA COLI ATRAVS DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)
esporulados, de metabolismo aerbio ou facultativo anaerbio, da famlia das Entenobacteriaceae. O grupo dos coliformes totais (CT) apresenta a caracterstica de fermentar a lactose com produo de gs dentro de 48 horas a 35C. Mais de 20 espcies de bactrias podem ser classificadas como coliformes, originrias tanto do trato gastrintestinal do homem e de animais, como tambm de outros ambientes. O grupo de coliformes a 45C formado pelos coliformes que fermentam lactose, com produo de gs dentro de 24-48 horas, em temperatura de 45C, normalmente em caldo EC. Podem ser Citrobacter freundi , Enterobacter ssp, (incluindo E. aerogenes e E. cloacae ), Kleblsiella etc. Entretanto, Escherichia coli a nica espcie cujo habitat o trato gastrintestinal do homem e de animais. Enterobacter , Klebsiella e Citrobacter podem desenvolver-se fora do trato intestinal tal como nos vegetais e no solo. Quando se determina a populao dos coliformes a 45C, 90% corresponde populao de Escherichia coli . A tcnica mais usada nos laboratrios para determinao de
radicionalmente, as bactrias do grupo coliformes tm sido consideradas como indicadoras de poluio fecal em alimentos e guas. So bastonetes gram negativos, no
coliformes (totais e a 45C) a do nmero mais provvel (NMP) dos tubos mltiplos, onde se estima quantitativamente este grupo, utilizando-se a Tabela de Hoskins (Apndice B). Outras tcnicas so utilizadas para determinao de coliformes como membrana filtrante e simplate .
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1 MTODO
COLIFORMES TOTAIS
Prova Presuntiva Visa detectar a presena de microrganismos fermentadores de lactose, especialmente o grupo coliforme. Clulas estressadas por tratamentos trmicos, pelo congelamento ou outro motivo, podem ser recuperados nessa fase.
Procedimento Selecionar trs diluies adequadas da amostra e inocular uma srie de trs tubos de ensaio contendo, em cada tubo, 10 mL de caldo lauril sulfato e tubos de Durhan invertidos com cada uma das diluies decimais preparadas. Colocar, em cada tubo com o caldo lauril, 1,0 mL de do inoculo. Incubar em estufa de bacteriologia a 35-37C por 24 a 48 horas. Aps as 48 horas, retirar os tubos de ensaio da estufa. So considerados positivos aqueles que apresentarem turvao do meio e presena de gs (bolhas de ar) no interior dos tubos de Durhan. Em seguida contar o nmero de tubos positivos correspondentes a cada diluio (Apndice C).
Prova Confirmatria (Coliformes totais) O meio utilizado, o caldo verde brilhante Lactose Bile 2%, contm dois inibidores (Bile e Verde Brilhante) do crescimento da microbiota acompanhante, especialmente bactrias gram-positivas. Assim, a produo de gs nos tubos, nas condies do teste, indica que houve desenvolvimento ou bactrias gram-negativas que fermentaram lactose, caractersticas do grupo coliforme.
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Procedimento Riscar os tubos de ensaio positivos no caldo lauril sulfato para os tubos de caldo verde brilhante a 35-37C por 24 a 48 horas. Os tubos positivos apresentam turvao e formao de bolhas de gs nos tubos de Durhan. Anotar os resultados de consulte a tabela para NMP (nmero mais provvel) para coliformes totais por grama ou mL.
Coliformes a 45C Para a qualificao dos coliformes a 45 0 risque os tubos de ensaio positivos no caldo lauril sulfato e/ ou dos tubos positivo do caldo verde brilhante para os tubos de caldo EC e coloque no banho-maria por 24 ou 48 horas. Os tubos positivos apresentam positividade semelhante nos caldo lauril e verde brilhante. Anotar os resultados consultando a tabela do NMP para coliformes a 45C por grama ou mL.
Identificao de Escherichia coli A parti de cada tubo de ensaio positivo com caldo EC riscar (estriar) placas de Petri para agar EMB (Eosina Azul de metileno) com auxilio de ala de nquel cromo e incubar a 35C por 18 a 24 horas. Ter o cuidado de, durante a inoculao, no colocar muito material da amostra, afim de no superlotar as placas, este proporcionando verificar o s colnias crescimento crescimento de isolado, com transcorrido tempo, colnias
caractersticas de E. coli , ou seja, 2 a 3 cm de dimetro, com brilho metlico esverdeado ou com centro escuro (Apndice D). De cada placa correspondente a cada tubo, repicar de 2 a 3 colnias caractersticas para tubo com Agar Triptona de Soja (TSA) inclinado e incubar por 18-24 horas a 35-37C.
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Efetuar em cada cultura em TSA, as provas bioqumicas descritas a seguir.
1 Produo de indol A partir das culturas em TSA inclinado inocular tubos contendo o meio SIM (meio Sulfeto Indol Motilidade) ou gua triptonada e incube a 35C por 24 horas. Para o teste do indol, acrescentar de 0,2 a 0,3mL de reagente Kovacs. O aparecimento de um anel vermelho indica positividade do teste. O meio SIM usado tambm para prova de motilidade e, portanto, a inoculao deve ser feita com agulha, introduzindo-a e retirando-a em linha e sem tocar o fundo do tubo de ensaio. Interpretar a prova de motilidade antes da adio do reagente de Kovacs, observando se h crescimento difuso a partir da linha de inoculao.
2 Teste de Voges-Proskauer A partir das culturas em TSA inclinado, inocular tubos de ensaio com MR-VP e incube a 35C com 48horas. Transferir 1mL do crescimento para um tubo de ensaio, acrescente 0,6mL de uma soluo de -naftol e 0,2ml de uma soluo de KOH a 40%. Agitar vigorosamente aps a adio de cada reagente. Deixar em repouso por at 2 horas. O teste positivo com o surgimento de uma colorao vermelha ou rsea.
3 Teste de Vermelho de Metila Reincubar os tubos de ensaio com MR-VP por mais 48 horas e realizar o teste aps 96 horas de incubao. Adicionar 4 gotas de uma soluo de Vermelho de Metila. O desenvolvimento de uma cor vermelha indica que o teste positivo.
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4 Teste de Citrato A partir das culturas em TSA inclinado estriar a superfcie inclinada dos tubos com Agar Citrato de Simmons e proceder a incubao a 35C por 96 horas. O desenvolvimento de uma cor azul indica a positividade do teste. Para evitar resultados falso-positivos, o Agar Citrato deve ser estriado primeiro, para impedir a transferncia de protenas ou carboidratos dos outros meios. Se um inculo for muito pesado, aps a morte bacteriana, compostos da parede celular podero liberar carbono e nitrognio suficiente para tambm produzir resultados falso-positivos.
5 Interpretao dos resultados Este grupo de testes denominado IMViC. Considerar a cultura positiva para E.coli , quando forem obtidos os seguintes resultados para o IMViC (Tabela 8).
Tabela 8 . IMVic Indol + VM + + VP Citrato Tipo E. coli tpica E. coli atpica
OBS: 1- Outros testes bioqumicos podem ser adicionados, como os testes de carboidratos e aminocidos. 2- Tabela do NMP (Apndice B).
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CAPTULO IX CONTAGEM PADRO EM PLACAS (CPP) DE MICRORGANISMOS AERBIOS MESFILOS VIVEIS
vez que clulas estressadas podem no se desenvolver no meio, mesmo estando presente no alimento. uma metodologia muito usada para indicar a qualidade higinica dos alimentos, fornecendo tambm idias sobre o seu tempo til de conservao. Sua presena em grande nmero indica: a) Matrias-primas excessivamente contaminadas; b) Limpeza e desinfeco de superfcies inadequadas; c) Higiene inadequada na produo; d) Condies inadequadas de tempo/temperatura durante a produo ou a conservao dos alimentos ou uma combinao destas circunstncias. As tcnicas utilizadas para se quantificar as bactrias so: Pour Plate, Spread Plate. O mtodo CPP baseia-se na premissa de que cada clula vivel, isolada, homogeneizada em um meio slido (agar), dar origem a uma colnia uma vez que teoria biolgica que uma colnia provm de uma nica clula microbiana.
mtodo da Contagem Padro em Placas (CPP), estima o nmero de clulas viveis contidas em um alimento qualquer. Entretanto, um mtodo passvel de erros, uma
1 TCNICA
DE ANLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar diluies sucessivas.
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Pipetar alquotas de 1mL de cada diluio para placa de Petri esterilizadas; Adicionar a cada placa 15-20mL de agar padro para contagem, previamente fundido e resfriado a temperatura de 45C. Homogeneizar em movimentos suaves em forma de oito (cerca de dez vezes) e deixar a temperatura ambiente, at a completa solidificao do Agar; Aps a solidificao, incubar as placas em posio invertida a 3537C/48 horas (Apndice E).
Resultados Transcorrido o tempo de incubao, considerar para contagem, somente as placas da mesma diluio que apresentarem de 30 a 300 colnias; o resultado deve ser expresso seguindo a formula: N de unidades formadoras de colnias/mL ou g = N de colnias x diluio. Sempre que quiser trabalhar com segurana, o mtodo CPP exige o uso de placas de Petri em duplicatas. Muitos erros podem ser cometidos na execuo do mtodo: erros de pesagem, erros da amostra, erros na medida dos volumes dos diluentes e nas alquotas a serem distribudas nas diluies, erros no espalhamento do inoculo, contaminao nas operaes e erros na homogeneizao das amostras. A contagem padro poder expressar nmeros de unidades
formadoras de colnias (UFC) de diferentes microrganismos que crescem em diferentes temperaturas. Por exemplo: psicrfilos, mesfilos, psicrotrfilos e termfilos. Para isto necessrio que a temperatura de incubao favorea estes diferentes grupos de microrganismos. Assim, para bactrias psicrfilas, recomendada uma incubao de dez dias a temperaturas de 7C para Pour
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Plate, ou sete a oito dias a 7C para Spread Plate; para psicrfilas, incubao de cinco dias nas temperaturas de 23-25C; para mesfilas, o tempo de incubao menor, de 24-48 horas em temperaturas entre 35-37C e para termfilas, incubao a 24 horas a 55C. A tcnica de semeadura em superfcie mais adequada para microrganismos psicrtroficos do que a semeadura em profundidade. Esta ultima poder causar injurias ou morte das clulas se a temperatura do agar vertido nas placas for maior que 45C. Prepare previamente as placas e estoque a 5C por vrios dias ou semanas, desde que, acondicionadas em sacos plsticos bem fechados, para prevenir a desidratao do meio. No resultado, informe o grupo de microrganismos pesquisados e as condies de incubao. Por exemplo: Contagem de bactrias = 36; Diluio = 10 - 3 ; N UFC = 36 x 10 3 UFC/g ou mL ou 36000 = 3,6 x 10 4 UFC/g ou mL.
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CAPTULO X CONTAGEM DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
so termoresistentes, isto , suportam temperaturas de ebulio por at 30 minutos. A origem das cepas toxignicas o homem manipulador de alimentos, o qual abriga essa bactria em suas fossas nasais, garganta, cabelo e pele. Muitos de ns podemos ser portadores de S. aureus . A determinao de S. aureus em alimentos pode ser feita pelo mtodo de contagem direta em placa ou pelo mtodo de Nmero Mais Provvel (NMP). Geralmente utiliza-se a Contagem Padro em Placas (CPP). Para contagem em placas, o meio de cultura utilizado o agar Baird Parker (BP), no qual as colnias tpicas de S. aureus assumem colorao negra, so brilhantes, apresentando zona de precipitao em torne de sua borda, a qual circulada por um halo claro. Para a identificao de S. aureus so necessrios, alm da observao bioqumicos de tais suas caractersticas coagulase, morfolgicas termonuclease, e tintoriais, testes como: catalase, utilizao
ma das causas mais freqentes dos surtos de intoxicaes est relacionada com a presena de toxinas produzidas por cepas de Staphylococcus aureus . Estas exotoxinas
anaerbica de glicose e manitol. Entretanto, a atual legislao para alimentos (ANVISA, 2001), estabelece apenas o teste de coagulase positiva.
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1 TCNICA
DE ANLISES
Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL, e preparar diluies decimais sucessivas. Retirar de cada diluio alquotas de 0,1mL e semear pela tcnica Spread Plate em placas de Petri com BP, previamente secas com auxlio da ala de Drigalsky. Inverter as placas e incuba-las por 48horas a 35C. Verificar a presena de colnias tpicas com as seguintes
caractersticas: circular, com 2 a 3mm de dimetro, de colorao negra, geralmente com borda brilhante, circundada por dois halos apresentando uma zona opaca mais prxima colnia e outra zona, mais externa, transparente. Selecionar placas com 20 a 200 colnias e contar as colnias tpicas de S. aureus . Eventualmente, colnias atpicas podem apresentar-se cinzentas, sem um ou ambos halos tpicos. Isolamento: Transferir cada colnia suspeita para tubos de ensaios com 0,3mL de BHI e inocular uma alada desta suspenso em tubo com TSA inclinado, para manuteno da cultura. Inocular os tubos com BHI e TSA por 24horas a 35C. Prova de coagulase: Adiconar a cada tubo de ensaio com BHI, 0,25mL de plasma de coelho e agitar. Incubar a 35C e examinar a formao de cogulo periodicamente durante 6 horas. Considerar positivo um cogulo firme e compacto, que no se despende quanto o tubo inclinado ou invertido (Apndice F).
Colorao de Gram A partir de cultura de 24 horas em TSA inclinado realizar a colorao de Gram.
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Devem ser identificadas bactrias gram positivas em forma de cocos, arranjados caracteristicamente em forma de cacho de uva. Clculo do resultado: Calcular o nmero de UFC/g ou mL em funo do nmero de colnias tpicas contadas, diluio inoculada e percentagem de colnias confirmadas. Por exemplo: Diluio 10 - 2 , 30 colnias tpica, 5 submetidas confirmao, 3 confirmadas (60%): UFC/g ou mL = 30 x 10 2 x 10 x 0,6 = 1,8 x 10 4 .
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CAPTULO XI CONTAGEM DE BACILLUS CEREUS
a polimixina como agente seletivo, a gema de ovo e o manitol como agentes diferenciais. A colnia caracterizada por um grande halo de precipitao. A confirmao das colnias tpicas inclui duas sries de provas bioqumicas; a primeira objetivando verificar se a cultura isolada pertence ao grupo do B. cereus (teste de utilizao anaerbia da glicose, teste de decomposio da tirosina, teste de VP e teste de nitrato, com provas opcionais de hidrlise da gelatina e resistncia lisozima) e a segunda objetivando diferencias B. cereus dos demais bacilos do grupo (verificao da produo de cristais de toxinas intracelulares, que distingue B. Thuringiensis , verificao da caracterstica de motilidade, que diferencia B. antrhacis ).
contagem de Bacillus cereus em alimentos pode ser feita pelo mtodo de plaqueamento direto. O meio utilizado o Agar manitol gema de ovo polimixina (MYP), que combina
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DE ANLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL e preparar as diluies sucessivas. Pipetar, de cada diluio, alquotas de 0,1mL e colocar nas placas contendo o meio Agar seletivo para B. cereus . Semear o inculo com ala de Drigalsk. Incubar as placas invertidas a 30C por 24horas. Aps a incubao, contar as colnias tpicas de B. cereus e transferir algumas destas colnias (3 a 4) para Agar triptona de soja (TSA) e incubar a 30C por 24horas (Apndice G).
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Realizar as seguintes provas bioqumicas: caldo nitrato, caldo carboidrato vermelho de fenol, Agar amido, Agar gelatina e Voges-Proskauer (Apndice H).
Teste de reduo de nitrato (caldo nitrato) Inocular uma alada com inoculo da cultura nos tubos de caldo nitrato e incubar a 35C por 24 horas. Aps incubao adicionar aos tubos de cultura 0,25mL de cada um dos reagentes para teste de nitrato. Soluo A (soluo de cido sulfanlico); soluo B (soluo de naftol). Observar o desenvolvimento de uma cor avermelhada em no mximo 10 minutos (teste positivo) e, em caso negativo, a cor do meio fica inalterada.
Teste de utilizao anaerbia da glicose (caldo vermelho de fenol 1% glicose) Inocular uma alada da cultura no meio previamente desaerado (fervura por 15 minutos em banho, e em seguida resfriar imediato em banho de gelo). Cobrir a superfcie do caldo com leo mineral ou vaselina lquida estril e incubar a 35C por 24 horas. Observar se h ocorrncia de viragem cida do indicador, alterando a cor do meio de vermelho para amarelo (teste positivo) ou se o meio permanecer com a cor inalterada (teste negativo). As cepas de B. cereus utilizam a glicose anaerobicamente.
Teste de hidrlise de amido Transferir uma alada da cultura para as placas de Agar amido, fazendo duas estrias na superfcie do meio. Incubar a 30C por 24 horas. Aps a incubao adicionar gotas de lugol na superfcie das estrias.
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O resultado positivo quando aparecem zonas claras ao redor do inoculado no corado pelo iodo; o resultado negativo quando h ausncia destas zonas claras.
Teste de Voges-Proskauer Inocular uma alada com inoculo da cultura nos tubos de caldo MRVP e incubar a 35C por 48 horas. Adicionar para cada tubo contendo a cultura 0,6mL de soluo de -naftol 5%, 0,2mL de soluo de KOH 40%. Agitar, deixar em repouso e observar periodicamente por at 1 hora o aparecimento de uma colorao vermelha no meio de cultura (teste positivo). A permanncia do meio na cor amarela indica teste negativo. As cepas de B. cereus so VP positivas.
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CAPTULO XII CONTAGEM DE CLOSTRDIOS SULFITO REDUTORES
homem e de animais. Estas bactrias tm sido freqentemente associadas a surtos de DVAs, quando uma populao de, no mnimo 1 milho de bactrias, contamina estes alimentos. A deteco de clostrdios sulfito redutores se faz por contagem em placas, em meio contendo sulfito de sdio e sais de ferro, alm de antibitico. A reduo de sulfito, produzindo sulfeto, detectada por sua reao com ferro, provocando o aparecimento de colnias negras, dentre aquelas redutoras de sulfito. Podem ser utilizados dois meios seletivos, o Agar seletivo sulfito polimixina sulfadiazina (SPS) e o Agar triptose sulfito cicloserina (TSC) com emulso de gema de ovo, usado para plaqueamento em profundidade. Uma outra bactria sulfito redutora de grande importncia . C. botulinum que, se presente, ser igualmente detectada. Muitos casos de surtos de toxinfeces relacionados a bactrias produtoras de toxinas de elevada potncia em conservas enlatadas tm sido relatados. A pesquisa de determinadas espcies, como C. perfringens ou C. botulinum , se faz a partir da estimativa em meio de cultura, pela amostragem de colnias suspeitas e pelas respectivas provas bioqumicas.
bactrias
do
gnero
Clostridium
esto
amplamente
distribudas na natureza, podendo ser encontradas no solo, ar, poeira, gua, alimentos e at no trato intestinal do
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DE ANLISE
Pesar assepticamente 25g ou medir 25mL da amostra e preparar diluies sucessivas. Pipetar alquotas de 1mL de dada diluio em placas com Agar (SPS) ou TSC, previamente fundido e resfriado a 50C. Aps a absoro do inoculo, adicionar uma sobrecamada cerca de 10mL do meio fundido e resfriado e permitir mais uma vez a sua solidificao. Incubar em jarra anaerbica a 46C por 24 horas permitir mais uma vez a sua solidificao. Contar o nmero total de colnias negras, observando o limite entre 20 e 200 colnias negras com ou sem halo por placa. Contar todas as colnias negras e calcular a mdia das duas placas (Apndice I).
Confirmao das colnias tpicas de clostrdios sulfito redutores Selecionar vrias colnias tpicas e transferir para tubos de caldo infuso crebro corao (BHI), previamente desaerados. Incubar os tubos inoculados a 35C/24 horas, preparar um esfregao da cultura para colorao de gram e utilizar o caldo remanescente para teste de catalase.
Teste de catalase Adicionar ao tubo de BHI 1,0mL de perxido de hidrognio 3% e observar se ocorre borbulhamento imediato (teste positivo) ou no (teste negativo). Os clostrdios sulfito redutores so bastonetes gram positivos, catalase negativos.
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Clculo dos resultados Considerar como confirmadas todas as culturas de bastonetes gram positivos catalase negativos. Calcular o nmero de UFC/g ou mL em funo do nmero de colnias tpicas, diluio inoculada e percentual de colnias confirmadas. Por exemplo, para plaqueamento em profundidade, diluio 10 - 2 , 25 colnias tpicas, 10 submetidas confirmao, 8 confirmadas (80%) UFC/g ou mL = 2,5 x 10 2 x 0,8 = 2,0 x 10 3 .
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CAPTULO XIII PESQUISA DE SALMONELLA SPP.
animais, Salmonella eliminada pelas fezes. A possibilidade de contato de fezes contaminadas com guas, superfcies e manipuladores, torna iminente a sua veiculao por alimentos. Existem vrios mtodos para o isolamento de Salmonella , nenhum completamente satisfatrio para isolar todos os sorotipos presentes em qualquer alimento. Eles compreendem as seguintes etapas: prenriquecimento, enriquecimento seletivo, isolamento em Agar seletivo e diferencial e seleo de colnias suspeitas, com as quais realizam-se provas bioqumicas, sorologia e fagotipagem, que definiro, finalmente, o sorotipo.
almonella um gnero da famlia Enterobacteriaceae, gram negativo, no esporulado. Vrias espcies so patognicas ao homem e aos animais. Habitando o trato intestinal de
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DE ANLISE
A) Pr-enriquecimento: Pesar 25 g ou medir 25 mL da amostra e adicionar 225mL de caldo lactosado ou gua peptonada tamponada. Incubar a 35-37C por 24 horas. B) Enriquecimento seletivo: Agitar o caldo pr-enriquecimento e inocular 0,1mL em 10mL do meio Rapapport e 1,0mL em 10mL do caldo tetrationato. Incubar os meios a 37C e 42C/24 horas. C) Plaquemento em meio seletivo e diferencial: Agitar os tubos de caldo Rapapport e tetrationato e estriar uma alada de cada cultura em placas nos seguintes meios de cultura: Agar Hektoen, Agar Rambac e Agar XLD, identificando a origem das culturas (Rapapport e tetrationato). Incubar as placas invertidas a 35C por 24 horas.
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D) Seleo de colnias suspeitas: Transcorrido o perodo de incubao do plaqueamento seletivo, observar as colnias suspeitas de Salmonella com auxlio de manuais especializados (Apndice J). E) Provas bioqumicas de triagem: Transferir duas ou mais colnias suspeitas de cada placa para tubos inclinados, contendo Agar TSI e LIA. Com auxlio de agulha de inoculao, tocar levemente o centro da colnia, estriar na superfcie inclinada (pice) do TSI e dar uma picada na base. Sem flambar a agulha, dar duas picadas na base do meio LIA e estriar na superfcie. Rotular os tubos, identificando a origem das culturas e incubar a 35C por 24 horas. Reaes tpicas de Salmonella nos tubos de TSI e LIA, so as seguintes: TSI pice alcalino (vermelho) e base cida (amarela), com ou
sem produo de gs (bolha) e de H 2 S (escurecimento do meio). LIA base alcalina (prpura), a maioria produz H 2 S. Colorao
vermelho-tijolo no pice do meio LIA no tipo de Salmonella . Submeter todas as culturas com reaes tpicas no meio LIA (base alcalina) e/ou no meio TSI (alcalina/cida) a testes bioqumicos e sorolgicos. Descartar apenas as culturas pice/base cidas no meio TSI e aquelas com base cida no meio LIA (Apndice K).
Provas bioqumicas de confirmao Teste da urease: Inocular com ala, tubos de ensaio com caldo uria. Incubar a 35C por 24 horas. Reao positiva: alterao da cor do meio para rosa escuro, pela viragem alcalina do indicador. A maioria das cepas de Salmonella urease negativa (no altera a colorao do meio). Para os testes posteriores, renovar as culturas urease negativas em meio TSI inclinado e incubar a 35C por 24 horas.
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Teste de fermentao do dulcitol: Inocular uma alada em tubos de ensaio com caldo prpura de bromocresol com 0,5% de dulcitol. Incubar a 35C por 48 horas. Reao positiva: acidificao do meio (amarelo). Reao negativa: colorao prpura do meio. A maioria das cepas de Salmonella fermenta dulcitol. Teste de utilizao do malonato: Inocular cultura para tubos de ensaio com caldo malonato e incubar a 35C por 48 horas, mas examinar aps 24 horas. Incubar um tubo controle no inoculado. A maioria dos sorotipos de Salmonella malonato negativo (colorao verde). malonato positivo (alterao de cor verde para azul). Os testes de indol, vermelho de metila, Voges-Proskauer e citrato de Simmons, j foram descritos para identificao de Escherichia coli . As culturas de Salmonella spp. apresentam o seguinte quadro: Teste Citrato de Simmons Malonato Vermelho de metila Voges-Proskauer Indol Urease Lisina Acares; lactose Acares; glicose Acares; dulcitol Motilidade (meio SIM) Resultado + + _ + + + +
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CAPTULO XIV CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
comum de deteriorao de alimentos estocados em ambientes domsticos, alm disso, alguns bolores produzem micotoxinas.
s bolores so fungos com estruturas filamentosas. As leveduras so fungos unicelulares de forma esfrica, ovide, cilndrica. Os fungos so talvez a causa mais
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DE ANLISE
Retirar assepticamente 25g ou 25mL da amostra e preparar as diluies sucessivas. Pipetar alquotas de 1mL de cada diluio para placas de Petri, fazendo de cada diluio placas em duplicatas. Adicionar a cada placa 15mL do agar batata dextrose, previamente fundido, resfriado a 45C e acidificado com o cido tartrico. Homogeneizar com movimentos em forma de oito. Deixar solidificar a temperatura ambiente. Incubar as placas a 25C por 3 a 5 dias.
Resultados Aps o perodo de incubao, considerar para contagem somente as placas da mesma diluio que apresentarem de 30 a 300 colnias. Em seguida, multiplicar a mdia das duas placas pelo fator de diluio correspondente, expressando o resultado em Unidades Formadoras de Colnias por grama ou mililitros (UFC/g ou mL) (Apndice L).
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CAPTULO XV TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL
Microrganismos viveis podem, normalmente, ser recuperadores de alimentos processados pelo calor e comercialmente esterilizados sob trs condies gerais: 1) quando so termfilos obrigatrios, formadores de esporos e a temperatura de estocagem do produto est abaixo da faixa termoflica; 2) quando so cido-tolerantes, podendo estar presentes, mas so incapazes de crescerem pelas condies cidas impostas ao produto, ou seja, pH < 4,6; 3) quando so termoflicos e mosoflicos, formadores de esporos, podendo ser recuperados de alimentos enlatados nos quais foram usados processos combinados de calor e atividade de gua, para prevenir as conseqncias da deteriorao. normal encontrar microrganismos nessas trs condies e o produto considerado comercialmente esterilizado. O ponto de inibio de pH do crescimento de Clostridium botulinum de 4,6, razo pela qual os enlatados devem estar abaixo deste pH. O teste de esterilidade comercial deve ser feito nos enlatados aparentemente normais, por meio da observao dos recipientes incubados e por determinao do vcuo, odor e pH do produto.
teste
de
esterilidade enlatados
comercial em
tem
por
objetivo normais.
comprovar a ausncia de microrganismos viveis em alimentos condies
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1 MTODOS Pr-incubao Incubar as amostras seguindo um plano de amostragem
representativa para o lote, por 14 dias a 35C, sobre papel de filtro para verificar se h vazamentos. Se qualquer das latas apresentar sinal de anormalidade, anotar este fato. Retirar as embalagens da estufa, quando apresentarem sinais externos de crescimento microbiano, visualizado pelo vazamento ou estufamento. Aps a incubao abrir a embalagem e observar se h odor anormal, alterao na consistncia e formao de espuma. Determinar o pH. No deve ser usado papel de pH. Comparar com as embalagens controle e observar se h alguma anormalidade. Em caso positivo, isto significa que o produto no est normalmente esterilizado.
Pesquisa de anaerbios Usar ambiente o mais assptico possvel, quando proceder a abertura das latas. Lav-las com gua quente e sabo. Sec-las. Limpar a superfcie das latas com a soluo de iodo e lcool e depois enxugar com toalha de papel. Nunca flambar as latas. Inoculao: Homogeneizar o contedo da embalagem e retirar, do centro da massa de alimento, pores de aproximadamente 2g ou 2mL e inocular em quatro tubos de ensaio contendo caldo de carne cozida aquecido a 100C e resfriado rapidamente. Inocular os tubos em profundidade e fechar fortemente as tampas. Tambm inocular quatro tubos com caldo prpura de bromocresol. Incubar os dois primeiros tubos de caldo de carne cozida em 35C e os outros dois em 55C. Nos primeiros, observar o crescimento aps um perodo de 96 a 120 horas e nos segundos, de 24 a 72 horas. Incubar os quatro tubos de caldo prpura de bromocresol nas mesmas temperaturas anteriores (35 e 55C) e incubar por 24 a 48 horas e 96 a 120 horas, respectivamente.
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Leitura dos resultados: Aps a incubao, observar todos os tubos inoculados quanto ocorrncia de crescimento (turvao do meio), formao de pelcula superficial e/ou produo de gs. Os tubos de caldo de prpura de bromocresol tambm devem ser observados quanto produo de cido (alterao da cor do meio para amarelo). Interpretao dos resultados: 1) Ausncia de alterao em todos os tubos inoculados produto comercialmente estril; 2) ocorrncia de pode ser crescimento e/ou alterao em qualquer dos tubos inoculados no laboratrio (Apndice M).
indicativa da ausncia de esterilidade comercial de contaminao da amostra
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APNDICES
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Apndice A . Esquema das diluies sucessivas.
Alimento (25g)
225mL de H2O peptonada, 0,85% 10-1
1mL
Diluio
Homogeneizar 1mL 10-2 10-3
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Apndice B . Tabela do Nmero Mais Provvel (NMP), para sries de trs tubos (NMP/g ou mL).
Nmero de tubos positivas nas diluies 10-1 10-2 10-3 NMP
Nmero de tubos positivos nas diluies 10-1 10-2 10-3 NMP
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
0 1 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
0 0 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
3 3 6 9 3 6.1 9.2 12 6.2 9.3 12 16 9.4 13 16 19 3.6 7.2 11 15 7.3 11 15 19 11 15 20 24 16 20 24 29
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3 0 0 0 0 1 1 1 1 2 2 2 2 3 3 3 3
0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3
9.1 14 20 26 15 20 27 34 21 28 35 42 29 36 44 53 23 39 64 95 43 75 120 160 93 150 210 290 240 460 1100 2400
128
Apndice C . Enumerao de coliformes totais e a 45C.
10-1
10-2
10-3
1ml
1ml
1ml Caldo Lauryl (CL)
ESTUFA 35C/24-48h
2 aladas Teste Confirmativo coliformes a 45C (Caldo E.C.)
2 aladas Teste Confirmativo coliformes totais (Caldo VB)
BANHO-MARIA 45C/24h
ESTUFA 35C/24-48h
Gs (+) Presena de coliformes a 45C
Gs (-) Ausncia de coliformes a 45C
Gs (+) Presena de coliformes totais
Gs (-) Ausncia de coliformes totais
TESTE BIOQUMICO Teste API-20E
129
Apndice D . Identificao de Escherichia coli.
Caldo E.C., presena de gs (+) para coliformes a 45C.
Agar Eosina Azul de Metileno (Agar EMB) com crescimento de E. coli.
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
Srie Bioqumica
INDOL
E. coli (+)
130
Apndice E . Esquema da tcnica de anlise de Contagem Padro em Placas de bactrias mesfilas.
10-1 1mL
10-2 1mL
10-3 1mL
10-4 9 mL sol. salina 0,85% NaCl
Amostra (25g)
225mL soluo salina estril
Plate Count Agar (PCA)
1mL
1mL
1mL
1mL
Incubao 37C/48h
Contagem das placas contendo 30 a 300 colnias
131
Apndice F . Contagem de Staphylococcus coagulase positiva.
10-1
10-2 1ml 1ml
10-3 1ml
10-4 9 ml soluo salina
ALIMENTOS 25g ou 25 ml
225ml soluo salina estril 0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml
Agar Baird Parker (Agar BP)
ESTUFA 35C/24 horas
Caldo Infuso Crebro Corao (BHI) Agar Tripticase Soja (Agar TSA) ESTUFA 35C/24 horas
Agar BP com crescimento de Staphylococcus spp.
TESTES BIOQUMICOS
Teste de Coagulase
Teste de Catalase
(+)
(-)
(-)
(+)
132
Apndice G . Contagem de Bacillus spp.
10-1 ALIMENTO 25g ou 25ml

225ml salina 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4
9 ml sol. salina
soluo estril
0,1ml
0,1ml
0,1ml
0,1ml
Espalhamento (ala de Drigaslk)
ESTUFA 35C/48 horas
Contagem das colnias tpicas
Isolamento em Agar Tripcase Soja (Agar TSA)
TESTES BIOQUMICOS
133
Apndice H . Identificao de Bacillus cereus .
Agar TSA (Cultura)
(+)
(-)
Fermentao da Glicose
Voges-Proskauer
(-)
Hidrolise do Amido Hidrolise da Gelatina
(+)
134
Apndice I . Contagem de Clostridium spp.
10-1 ALIMENTO 25g ou 25ml 225ml salina 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4 9 ml sol. salina
soluo estril 1ml 1ml 1ml 1ml
ESTUFA 46C/48 horas (Em Anaerobiose)
Contagem das colnias tpicas de Clostridium spp. em Agar SPS
Isolamento em Agar Tripticase Soja (Agar TSA)
TESTES BIOQUMICOS
135
Apndice J . Pesquisa de Salmonella spp.
ALIMENTO 25g ou 25ml
225ml de gua Peptonada Tamponada
ESTUFA A 35C/24 horas
1mL 10mL de Caldo Tetrationato

ENRIQUECIMENTO
0,1mL 10mL de Caldo Rapapport
ESTUFA A 35C/24 horas
Agar Hektoen
Estrias INCUBAO 35C/24H
Agar Rambach
Agar Tripcase Soja
Testes Bioqumicos
136
Apndice K . Identificao de Salmonella spp.
Testes Preliminares ( 1 Etapa )

a
Agar TSI
Uria
Agar LIA
Testes Finais ( 2 a Etapa )
Vermelho de Metila
Indol
Vogues-Proskauer
Citrato de Simmons
Fermentao de Lactose
Fermentao de Sacarose
Caldo Malonato
137
Apndice L . Contagem de Bolores e Leveduras.
10-1 ALIMENTOS 25g ou 25 ml 1ml
10-2 1ml
10-3 1ml
10-4 9 ml sol. salina
225ml soluo salina estril 1ml 1ml 1ml 1ml Agar Batata Dextrose adicionado cido Tartrico
ESTUFA B.O.D. 25C/ 5 dias
Contagem das placas que contenham entre 30 e 300 colnias (UFC/g ou ml)
138
Apndice M . Esterilidade Comercial.
Abertura Assptica
(Lavagem com gua quente e sabo ou desinfetar com lcool a 70%)
Caldo de Carne Cozida
INOCULAO
Caldo Prpura de Bromocresol
ESTUFA 35C/96 a 120h
ESTUFA 55C/24 a 72h
ESTUFA ESTUFA 35C/96 a 120h 55C/24 a 72h
INTERPRETAO DOS RESULTADOS: 1. Ausncia de alteraes em todos os tubos inoculados produto comercialmente estril; 2. Ocorrncia de crescimento e/ou alterao em qualquer dos tubos inoculados pode ser indicativa da ausncia de esterilidade comercial de contaminao da amostra no laboratrio.
139
REFERNCIAS
140
ADAMS, M. R.; MOSS, M. O. Food microbiology . 2. ed. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2002. ANVISA, Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Ministrio da Sade. Resoluo n. 12 de 2 de janeiro de 2001. Dirio Oficial da Unio , janeiro de 2001. DAOUST, J. Y.; MAURER, J.; BAILER, J. S. Food microbiology : fundamentals and frontiers. 2. ed. Washington: ASM, 2001. Cap. 8, p. 141178. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurana alimentar . Porto Alegre: Artmed, 2002. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos . So Paulo: Atheneu, 1996. 182 p. FRAZIER, W.C.; WESTHOFF, D.C. Microbiologia de los alimentos . 4.ed. Zaragoza: Acribia, 2003. HACCP. Instrumento Essencial para a inocuidade de alimentos . So Paulo: OPAS, 2001. HOLT, J.G.; KRIEG, N.R.; SNEATH, P.H.A; STALEY, J.T; WILLIAMS, S.T. Bergeys Manual of Determinative Microbiology . 9th . ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994. INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS - ICMSF. Tcnicas de las anlises microbiolgicas . Zaragoza-Espaa: Acribia, 1983. 430 p. INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS - ICMSF. Microbiologia de los alimentos : caractersticas de los patgenos microbianos. Zaragoza-Espaa: Acribia, 1996. JAY, J. M. Modern Food Microbiology . 6. ed. Gaithersburg: Aspen, 2000.
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MAZA, L.M.; PEZZLO, M.T.; BARON, E.J. Color Atlas of Diagnostic Microbiology . St. Louis: Mosby, 1997. PELCZAR, M.J. Microbiologia . So Paulo: McGrall-Hill, 1996. V.1. PELCZAR, M.J. Microbiologia . So Paulo: McGrall-Hill, 1996. V.2. SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N.C.; EISENSTEIN, B.I.; MEDOFF, G. Microbiologia . Mecanismos das doenas infecciosas. 3.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. SILVA, N.; JUNQUEIRA, V.C.A.; SILVEIRA, N.F.A. Manual de mtodos de anlise microbiolgica de alimentos . So Paulo: Varela, 1997. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia . 6.ed. Porto Alegre: Artes Mdicas Sul, 2000. VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESSER, D. F. Compendium of methods for the microbiological examination of foods . 3. ed. Washington: American Public Health Association (APHA), 1992.

Microbiologia de Alimentos Dra Adenilde R Nascimento

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UNIVERSIDADE PR-REITORIA CENTRO

DE CINCIAS EXATAS E TECNOLOGIA DE TECNOLOGIA QUMICA

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So Lus, fevereiro de 2005. Adenilde Ribeiro Nascimento

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