Inhibicin de la Actividad de la Ureasa y el Succinato Deshidrogenasa

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PRCTICA DE LABORATORIO N 03 INHIBICIN DE LA ACTIVIDAD DE LA UREASA ( E.C. 3.5.1.5) Y DEL SUCCINATO DESHIDROGENASA (E.C. 1.3.99.1) I. INTRODUCCIN. En la presente experiencia de prctica investigaremos la inhibicin de la actividad enzimtica por productos qumicos especficos, los llamados Inhibidores. El inhibidor especfico usado ser bisulfato de sodio y el malonato. Se conoce que el bisulfito se combina con la ureasa inhibiendo la actividad enzimtica de modo reversible. Una molcula inhibidora afecta la actividad enzimtica de dos modos: por Inhibicin competitiva e inhibicin no competitiva. La inhibicin competitiva tiene lugar cuando una molcula que es estructuralmente similar al sustrato para una reaccin particular, compite por una posicin en el sitio activo de la enzima. Esto hace que la enzima no est disponible al sustrato. La inhibicin competitiva puede invertirse si se eleva la concentracin del sustrato a niveles suficientemente altos mientras la concentracin del inhibidor se mantiene constante. En la inhibicin no competitiva, el inhibidor se une a la enzima en un sitio que no es el sitio activo. Siendo as, cambia la naturaleza de la enzima para que pierda sus propiedades catalizadoras. Esto sucede de dos maneras. El inhibidor no competitivo bloquea fsicamente el acceso al sitio activo, o causa un cambio conformacional en la protena, inactivndola. Porque las molculas del sustrato no pueden invertir la posicin de un inhibidor no competitivo y aumentar la concentracin del sustrato no invertir la inhibicin. El objetivo de la presente experiencia es demostrar el efecto inhibidor de algunas sustancias sobre la velocidad de reaccin enzimtica, utilizando para ello bisulfito de sodio y malonato, como inhibidores de la ureasa y succionato deshidrogenasa, respectivamente. II. MATERIALES. Gradillas. Bao Mara a 37C. Tubos de ensayo 15x 125 mm. Tubos de ensayo 13 x 100 mm. Juego de pipetas 10, 5, 2 y 1 ml.
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III.

Espectrofotmetro. Fotocolormetro. Buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7. 2.6 diclorofenolindofenol 0.02%. Succinato 0.1M.

Malonato 0.1M. Homogenizado heptico Buffer Tris 0.05M pH 7. rea 0.1M en buffer Tris 0.05 pH 7. Bisulfito de Sodio 0.1M. Ureasa 0.1%.

PROCEDIMIENTO.

Prepare el siguiente esquema de tubos y siga las indicaciones que se muestra a continuacin: A. INHIBICIN DE UREASA. 1. SISTEMA DE INCUBACIN.

COMPONENTES (mL) Y PROCESO Buffer Tris 0.05 M PH 7.0 rea 0.1 M en buffer Tris 0.05 M pH 7.0 Bisulfito de Sodio 0.1 M Pre Incubar a 37C por 5 minutos. Ureasa 0.1% Incubar a 37C por 15 minutos.

TUBO 1 2.0 2.0 ----

TUBO 2 1.0 2.0 1.0

TUBO 3 ---3.0 1.0

TUBO 4 1.0 2.0 1.0

0.5

0.5

0.5

----

Aadir dos gotas de HgCl2 a cada tubo para detener la reaccin. Ureasa 0.1% ----------0.5 Mezclar, preparar y seguir con el siguiente sistema.

2. Evaluacin del efecto inhibidor del bisulfito de sodio: Cuantificacin del producto formado por colorimetra (Reaccin de Nessler). Transferir 0.1 mL de cada uno de los tubos de ensayo de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2.

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COMPONENTES TUBO 1 (Parte 1) TUBO 2 (Parte 2) TUBO 3 (Parte 3) TUBO 4 (Parte 4) Agua destilada Reactivo de Nessler

BLANCO ------------4 0.5

I 0.1 ---------3.9 0.5

II ---0.1 ------3.9 0.5

III ------0.1 ---3.9 0.5

IV ---------0.1 3.9 0.5

Dejar en reposo por 5 minutos. Leer en fotocolormetro con filtro verde o bien en espectrofotmetro a 540 nn. Restar la lectura del tubo 4 de las lecturas de los otros tubos. Determinar la actividad enzimtica en cada uno de los tubos de incubacin. Para lo cual deber multiplicar la lectura de cada tubo por un factor: FR = 37 mg NH3 / ml, para espectrofotmetro y 0.006 mg NH3 / ml, para fotocolormetro. B. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA. 1. SISTEMAS DE INCUBACIN Y EVALUACIN DEL EFECTO INHIBIDOR DEL MALONATO. COMPONENTES (ml) Buffer fosfato de Sodio 0.1 M pH 7.4 2.6 diclorofenolindofenol Succinato 0.5 M Malonato 0.1 M Homogenizado heptico TUBO 1 1.5 1.0 ---------TUBO 2 1.2 1.0 ------0.5 0.5 0.5 0.5 TUBO 3 1.0 1.0 ---TUBO 4 0.8 1.0 ---TUBO 5 0.3 1.0 0.7

Mezclar y dejar en reposo a temperatura ambiente. Observar y anotar los resultados segn el color de cada un de los tubos.

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IV.

CUESTIONARIO.

1. Qu se entiende por modificadores de la actividad enzimtica? MODIFICADORES DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Tipos: a) Temperatura: Las enzimas son inactivadas por e calor a temperaturas de 50C60C inactivan rpidamente la mayor parte de las enzimas. Esta inactivaron es irreversible, pues al enfriar no se obtiene actividad otra vez. Esto explica que casi todos los organismos resulten muertos a una exposicin a temperatura elevada: Sus enzimas se inactivan y resultan incapaces de reanudar su metabolismo. Las Enzimas no son inactivadas por la congelacin; las reacciones que producen tienen a lugar muy lentamente a temperaturas bajas, o se detienen, pero la actividad cataltica reaparece si la temperatura vuelve a su estado normal b) Acidez: Las enzimas son sensibles a los cambios de PH o sea de acidez o alcalinidad en el medio. La mayor parte de enzimas intracelulares tienen PH ptimos cerca de la neutralidad, por lo que no actan en medios cidos ni alcalinos, los cidos y bases enrgicos las inactivan irreversiblemente. c) Concentracin de Enzima, substrato y Cofactor: Si el PH y la temperatura de un sistema enzimtico se mantiene constante pero hay exceso de substrato, la intensidad de la reaccin es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente. d) Venenos Enzimticos: Algunas enzimas resultan muy sensibles a ciertos venenos como el acido cianuro fluoruro lewisita etc. Resultan inactivadas aun frente a concentraciones bajas de estos venenos Aun las enzimas pueden actuar como venenos si se encuentran en lugar in adecuado. Varios tipos de venenos que vienen de los animales como la de la serpiente abeja y escorpin deben su poder letal a las enzimas que destruyen glbulos rojos y otros tejidos. e) PH: Los cambios de PH alteraran considerablemente la naturaleza inica de los enzimas se sabe poco de las variaciones del PH en las enzimas.

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2.- Qu se entiende por un inhibidor? Cul es su mecanismo general de accin? Los Inhibidores enzimticos son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Sin embargo, no todas las molculas que se unen a las enzimas son inhibidoras; los activadores enzimticos se unen a las enzimas e incrementan su actividad. El mecanismo de accin de los inhibidores enzimticos consiste en inhibir o bloquean la enzima para y disminuyen su actividad. 3. Qu relacin hay entre los desnaturalizacin de una enzima? trminos inhibicin, inactivacin y

La relacin es que en la inhibicin est relacionado con la actividad enzimtica y en la inactivacin y desnaturalizacin no hay actividad enzimtica; ms bien se relaciona con la velocidad de la reaccin enzimtica. 4. Qu se entiende por sitio alostrico? Los sitios alostricos son zonas de la enzima con capacidad de reconocer y unir determinadas molculas en la clula. Las uniones a las que dan lugar son dbiles y no covalentes, y generan un cambio en la conformacin estructural de la enzima que repercute en el sitio activo, afectando as a la velocidad de reaccin de la enzima. Las interacciones alostricas pueden tanto inhibir como activar enzimas, y son una forma muy comn de controlar las enzimas en las clulas. 5. Qu es un inhibidor competitivo? El inhibidor es una molcula que presenta un cierto parecido estructural con el sustrato, de manera que puede competir con l por acceder al centro activo, pero que no posee ningn enlace susceptible de ser atacado por el enzima. 6.- Que efecto tiene el aumento de la concentracin del sustrato sobre la inhibicin competitiva de una reaccin enzimtica? Los principios generales de la cintica de las reacciones qumicas son aplicables a las reacciones catalizadas por los enzimas, pero estos muestran tambin una rasgo caracterstico que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin con el sustrato.
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En general, podemos decir que al aumentar la concentracin de sustrato en el medio, la velocidad de reaccin de un enzima aumenta; por tanto, la influencia de la concentracin de sustrato tiene un efecto positivo en la catlisis enzimtica. Esto es debido, simplemente, a que al aumentar el nmero de sustratos en el medio, ser mayor la cantidad de producto producido por la reaccin enzimtica. Sin embargo, llega un momento en que la velocidad de la reaccin enzimtica no aumenta aunque aumentemos la concentracin de sustrato, lo cual es debido a que en ese momento todos los enzimas presentes estn actuando a pleno rendimiento y ya no pueden aumentar la produccin de producto. En ese momento se dice que el enzima est saturado por el sustrato. 7.- Cmo se explica que la inhibicin competitiva sea reversible? La inhibicin reversible puede ser descrita cuantitativamente en trminos de la unin del inhibidor a la enzima y al complejo enzima-sustrato, y sus efectos en las constantes cinticas de la enzima. En el esquema clsico de MichaelisMenten mostrado abajo, una enzima (E) se une a su sustrato (S) para formar el complejo enzima-sustrato (ES). En la catlisis, este complejo se rompe para liberar el producto (P) y la enzima (E). El inhibidor (I) puede unirse tanto a (E) como a (ES) con las constantes de disociacin Ki o Ki', respectivamente

8.- Existe corrientemente algn tipo de relacin entre la estructura qumica del sustrato y del inhibidor competitivo de una reaccin enzimtica. Es esta una condicin necesaria para este tipo de inhibidores? El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como es mostrado en la figura de la izquierda.

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Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima donde el sustrato tambin se une; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del substrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores competitivos tienen comnmente Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al substrato verdadero 9.- Cmo puede reconocerse experimentalmente que la inhibicin de una reaccin enzimtica es competitiva? Por ello este tipo de inhibicin se caracteriza en que puede disminuirse considerablemente aumentando la concentracin de sustrato. En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muy parecidas al sustrato y que por lo pueden ocupar el lugar que ocupara el mismo sobre la enzima pero que no pueden ser atacas por la misma. Este tipo de inhibicin es el de la inhibicin de la succinato deshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el cido succnico, por otras sustancias estructuralmente parecidas al cido succnico, como el cido malnico, el cido oxlico, y el cido glutrico 10.- De que factores depende el grado de inhibicin logrado por un inhibidor competitivo? El inhibidor slo se une al complejo enzima - sustrato, que ya no formar producto, por lo que la velocidad bajar. El inhibidor no se une al centro activo sino a cualquier otro sitio, lo que hace que cambie la conformacin y el enzima ya no es tan efectivo.
KI = [E]. [I]/ [ESI]

No se puede superar la inhibicin aumentando la concentracin de sustrato. La V con inhibidor (VI) ser ms pequea.

El Km ser ms pequeo, como si tuviera ms afinidad:

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El resultado es una recta nueva que corta en un valor ms grande de ordenadas y con pendiente igual. Si aumentamos la concentracin de inhibidor obtenemos una familia de rectas con pendiente igual y corte en ordenadas ms grande.

11. En que circunstancia puede el sustrato de una enzima actuar como inhibidor competitivo de la misma enzima? El sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura de la derecha. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que tambin se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibicin se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competicin al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato. 12.- Qu tipo de inhibidor es el bisulfito de sodio 0.1M? Es un inhibidor no competitivo 13.- Qu tipo de inhibidor es el malonato 0.1M? Es un inhibidor competitivo 14. Que se entiende por inhibidor no competitivo? Inhibicin no competitiva: Es una forma de una inhibicin mixta donde la unin del inhibidor con la enzima reduce su actividad pero no acepta la unin del sustrato. El grado de inhibicin depende de su concentracin.
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Tienen afinidades idnticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La inhibicin no competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a la unin del sustrato) pero disminuye la Vmax (es decir, la unin del inhibidor obstaculiza la catlisis).

15. Qu efecto tiene el aumento de la concentracin del sustrato sobre la inhibicin no competitiva de una reaccin enzimtica? No tiene ningn efecto. Cmo puede explicar este fenmeno? El grado de inhibicin en este caso depende solamente de la concentracin de inhibidor y no de la concentracin del sustrato. Este tipo de inhibicin no es reversible cuando aumenta la concentracin del sustrato. 16.- Que podra decir respecto a la especificidad de los inhibidores no competitivos. Las molculas del sustrato se unen a un sitio particular en la superficie de la enzima, denominada sitio activo, donde tiene lugar la catlisis. La estructura tridimensional de este sitio activo, donde solo puede entrar un determinado sustrato (ni siquiera sus ismeros) es lo que determina la especificidad de las enzimas. El acoplamiento es tal que E. Fisher (1894) enunci: "el sustrato se adapta al centro activo o cataltico de una enzima como una llave a una cerradura"

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17. Existe corrientemente algn tipo de similitud entre la estructura qumica del inhibidor no competitivo y la del sustrato natural de la enzima? sta es una condicin necesaria para este tipo de inhibidores?

Como se observa en la imagen no existe similitud entre la estructura qumica del inhibidor no competitivo y el sustrato de la enzima, a diferencia del inhibidor competitivo que en relacin a l si existe una similitud entre ambos sta si es una condicin necesaria para los inhibidores no competitivos, ya que el sustrato se enlaza a la enzima en un lugar diferente del centro activo. 18.- Cmo puede reconocerse experimentalmente que la inhibicin de una reaccin enzimtica es no competitiva? Los inhibidores no competitivos tienen afinidades idnticas por (E) y (ES) (Ki = Ki'). La inhibicin no competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a la unin del sustrato) pero disminuye la Vmax (es decir, la unin del inhibidor obstaculiza la catlisis).3 El mecanismo de la inhibicin parcialmente competitiva es similar al de la inhibicin no competitiva, excepto que el complejo EIS tiene actividad cataltica, la cual decrece o incluso aumenta (activacin parcialmente competitiva) en comparacin al complejo enzima-sustrato (ES). Esta inhibicin suele exhibir un valor ms bajo de Vmax, pero un valor de Km inalterado.

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19.- Anotar sus observaciones en la seccin Resultados, y explicarlos en la Discusin. INHIBICION DE LA UREASA

TUBO Tubo Blanco Tubo 01

COLOR Amarillo claro blanco

EXPLICACIN No hubo reaccin Si hubo reaccin por ausencia de inhibidor No hubo reaccin por inhibidor

Tubo 02

blanco

Tubo 03

Blanco

Si hubo reaccin por mayor concentracin de sustrato No hubo reaccin por inhibidor

Tubo 04

Blanco

Al analizar los resultados utilizando el mtodo de colorimetra observamos diferencia de color en las muestras 1 y 3. En el primer caso el color indica formacin de producto debido a que no hay presencia de inhibidor; en el otro caso tambin se produce reaccin pues al aumentar la cantidad de sustrato no se desplaza al inhibidor, solo se disminuye la velocidad de reaccin. Los tubos 2 y 4 presentan el mismo color que el tubo blanco debido a que en el segundo tubo el inhibidor bloquea la reaccin impidiendo as la formacin de producto; en el tubo no hay formacin de producto debido a que no hay presencia de enzima durante la reaccin.

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INHIBICION DE SUCCINATO DESHIDROGENASA

TUBO Tubo 01 Tubo 02 Tubo 03

EXPLICACIN Solo presenta el color del indicador no hay variacin Solo observa el color del indicador no hay cambio. Este tubo presenta sustrato, enzima y el indicador y se observa cambio de color Este tubo presenta sustrato, enzima e indicador pero el color no varia ya que se presenta un inhibidor que bloquea y hace que el color se mantenga igual al indicador Este tubo presenta sustrato enzima e indicador pero tambin presenta el inhibidor pero es muy bajo comprado con el Succinato y no existe un bloqueo por eso el color varia

Tubo 04

Tubo 05

Podemos observar cambio de color en las muestras 3 y 5: En el primer caso la muestra no contiene malonato (inhibidor), por lo tanto se ha producido reaccin; en la segunda muestra se increment la concentracin de sustrato y se produce flujo de e- que son absorbidos por el indicador, el inhibidor es desplazado debido a que es competitivo. En los tubos 1,2 y 4 las muestras mantienen el color azul del indicador lo cual indica que no se produjo reaccin debido a que en el tubo 1 no hay sustrato, el segundo tubo no contiene enzima y en el tubo 4 la reaccin es bloqueada por la presencia del inhibidor.

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V.

ANEXOS. A. INHIBICIN DE UREASA.

Fig. 1 Sistema De Incubacin

Fig. 2 Se transfiri 0.1 mL de c/u de los tubos de la parte 1 a sus correspondientes en la parte 2

Fig. 2 Tubo blanco: 4 ml. de Agua destilada y 0.5 de Reactivo de Nessler

Fig. 4 Se le aadi 3.9 ml de Agua destilada y 0.5 ml de Reactivo de Nessler y se dej reposar por 5 min.

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A. INHIBICIN DE SUCCINATO DESHIDROGENASA.

Fig.5 Sistema de incubacin y evaluacin del efecto inhibidor del malonato

Fig. 6 Se le aade el Homogenizado Heptico por eso el tubo 3 y 5 cambian de color

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