Uvm - Manual de Prácticas

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE MEXICO
Campus Toluca
MANUAL DE PRCTICAS
LABORATORIO INTEGRAL DE QUIMICA ORGANICA

Para el Plan de Estudios de
QUIMICO FARMACEUTICO BIOTECNOLOGO

Autor: Davir Gonzlez Caldern
Marzo de 2013
Laboratorio de Qumica Orgnica
Qumico Farmacutico Biotecnlogo
ndice Temtico
SESIN PRIMERA 3 ENCUADRE DEL CURSO.
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PLAN DE PRACTICAS
PRACTICA 1 EXTRACCIN DE LA TRIMIRISTINA A PARTIR DE LA NUEZ MOSCADA: SEPARACIN DE COMPUESTOS ORGNICOS POR EXTRACCIN Y DESTILACIN Y CRISTALIZACIN. OBTENCIN Y SEPARACIN DE LOS PIGMENTOS VEGETALES DE HOJAS DE ESPINACA: PARTE 1. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (TLC) OBTENCIN Y SEPARACIN DE LOS PIGMENTOS VEGETALES DE HOJAS DE ESPINACA: PARTE 2. CROMATOGRAFA EN COLUMNA EXTRACCIN DE ADN DE FRUTAS, VERDURAS Y TEJIDO ANIMAL: EXTRACCIN DE BIOMOLCULAS POR PROCESOS QUMICO-ENZIMTICOS SNTESIS DE LA CAFENA A PARTIR DE LA TEOBROMINA: PARTE 1: EXTRACCIN DE LA TEOBROMINA DEL POLVO DE COCOA SNTESIS DE LA CAFENA A PARTIR DE LA TEOBROMINA: PARTE 2: SUSTITUCIN NUCLEOFLICA BIMOLECULAR (SN2). MONITOREO DE UNA REACCIN QUMICA POR TLC SNTESIS DE SABORIZANTES FRUTALES: ESTERIFICACIN DE FISHER 17
PRACTICA 2
24
PRACTICA 3
33
PRACTICA 4
38
PRACTICA 5 PRACTICA 6
46 54
PRACTICA 7
63
PRACTICA 8
SNTESIS DE LA ERITROSINA B: UN COLORANTE ARTIFICIAL ALIMENTICIO PARTE 1. OBTENCIN DE LA FLUORESCENA COMO INTERMEDIARIO SNTESIS DE LA ERITROSINA B: UN COLORANTE ARTIFICIAL ALIMENTICIO PARTE 2. YODACIN DE LA FLUORESCENA SNTESIS DE UN CONSERVADOR ALIMENTICIO: REACCIN DEL HALOFORMO SNTESIS DE LA VAINILLINA: UN SABORIZANTE NATURAL SNTESIS DE LA ADENINA: REPRODUCCIN DE LOS ACONTECIMIENTOS PRIMITIVOS DE LA TIERRA (REACCIN EN MODELO PREBITICO) SNTESIS DE UNA CHALCONA: OBTENCIN DE UNA CETONA ,INSATURADA MEDIANTE LA CONDENSACIN ALDOLICA DE CLAISEN-SCHMIDT OBTENCIN DE JABONES A PARTIR DE GRASAS ANIMALES Y VEGETALES: REACCIN DE SAPONIFICACIN
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PRACTICA 9
80
PRACTICA 10 PRACTICA 11 PRACTICA 12
85 91 102
PRACTICA 13
111
PRACTICA 14
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BIBLIOGRAFIA GENERAL
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Sesin Primera:
ENCUADRE del CURSO:
PLAN DE TRABAJO FORMA DE EVALUACION INTRODUCCION AL USO DE EQUIPO DE MICROESCALA MANEJO DEL SOFTWARE CHEMOFFICE NORMAS DEL LABORATORIO (SEGURIDAD E HIGUIENE) SUSTANCIAS PELIGROSAS CLASIFICACION DE RESIDUOS QUIMICOS
Srvase el siguiente modelo como una propuesta (misma que ha sido tomada de otros cursos de laboratorio). El Profesor de la asignatura puede considerar las modificaciones pertinentes en base a sus criterios de evaluacin.
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FORMA DE EVALUACION
A) TRABAJO ESCRITO: Consta de dos partes Plan de Trabajo y Reporte de Trabajo. PLAN DE TRABAJO: Se debe presentar en hojas blancas. Este deber presentar los siguientes puntos. 1) Cartula (se anexa el formato) en donde se asentar la calificacin de acuerdo con los rubros siguientes: 2) Objetivo 3) Hiptesis 4) Fundamento terico con superndices para referenciar.
5) 6) 7) 8) 9) 10)
Monografa del producto (Cuando se tenga que obtener un producto). Materiales y Reactivos. Toxicologa de los reactivos qumicos que se utilicen. Metodologa por pasos. Rendimiento terico y mecanismo. Un diagrama de eliminacin o tratamiento de residuos
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Importante: Bibliografa, anotada correctamente, de por lo menos tres fuentes (uno de orgnica, uno de toxicologa y uno de ecologa)
LABORATORIO DE QUIMICA ORGANICA

PLAN DE TRABAJO
EQUIPO No.___
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PLAN DE LA PRCTICA No.___ TITULO: INTEGRANTES: FECHA: PUNTOS A CALIFICAR Presentacin Objetivo Hiptesis Marco Terico referenciado Monografa del producto Toxicologa de reactivos Metodologa bloques Material y reactivos Rendimiento Terico Mecanismo de reaccin Bibliografa Disposicin o tratamiento de residuos TOTAL OBSERVACIONES CAL
REPORTE DE TRABAJO: El alumno deber fotocopiar esta pgina para ser usado como formato estndar. Esta puede ser llenada de forma manuscrita.
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GRUPO .
EQUIPO
FECHA
REPORTE DE LA PRACTICA No.
CONTRASTE DEL OBJETIVO:
CONTRASTE DE HIPOTESIS:
RESULTADOS:
DISCUSION DE RESULTADOS:
CONCLUSIONES:
CONTESTAR CUESTIONARIO AL REVERSO. OBSERVACIONES: CALIFICACION REPORTE:
B) BITACORA DE TRABAJO: Es el documento fehaciente de los experimentos realizados durante el curso, y cuya escritura conducir a la reproduccin exacta del experimento. Cada experimento escrito deber ser fechado y firmado por un integrante del equipo de trabajo, el cual lo deber entregar a su compaero de equipo, este ltimo en caso de entender lo escrito en la bitcora, firmar de ledo y entendido. Esta ser revisada por el profesor al trmino de cada prctica. Fotocopiar la siguiente pgina para ser usado como formato estndar. Esta deber ser llenada de forma manuscrita.
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LABORATORIO INTEGRAL DE QUIMICA ORGANICA
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NOMBRE: TITULO: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 EXPERIMENTO No.: FECHA:
34 35 FIRMA: FECHA:
LEIDO Y ENTENDIDO: FECHA:
C) EVALUACION ESCRITA: Sern dos exmenes parciales los cuales tienen la finalidad de evaluar el aprendizaje del alumno durante las sesiones de laboratorio.
D) SEMINARIOS: En cada una de ellas se presentar un seminario el cual ser desarrollado por parte de un equipo de acuerdo al rol asignado por el profesor.
NORMAS DE SEGURIDAD E
HIGIENE EN EL LABORATORIO En cualquier curso de laboratorio particularmente aquel que involucre el uso de reactivos qumicos, siempre existe el peligro de un accidente. Los compuestos qumicos (orgnicos e inorgnicos) son a menudo txicos e inflamables, el material de vidrio se puede romper e infringir cortaduras severas y los reactivos pueden causar quemaduras e inflamacin. Cualquier persona que entre a un laboratorio qumico sin el conocimiento de la seguridad en el laboratorio est jugando con su salud, de ah le necesidad de seguir algunas reglas de seguridad, para la prevencin de accidentes. Normas personales 1) Cada grupo se responsabilizar de su zona de trabajo y por su material. 2) La utilizacin de bata es obligatorio, ya que evita que posibles proyecciones de sustancias qumicas lleguen a la piel. 3) Es importante que si tiene el cabello largo llevarlo recogido. 4) En el laboratorio no se podr fumar, beber, ni comer. 5) Usar lentes o gogles de seguridad en el laboratorio todo el tiempo. Si se requieren lentes de aumento se sugiere que los cristales sean endurecidos o de mica. Tambin debe evitarse el uso de lentes de contacto debido a la generacin de vapores y reactivos corrosivos que pueden causar un dao ocular. 6) Los zapatos de trabajo (no sandalias, ni tenis, ni de tacn) siempre se llevarn cerrados para tener proteccin adecuada contra salpicaduras qumicas y vidrio roto. 7) Debe de utilizar guantes todo el tiempo para evitar que los reactivos tengan contacto con la piel. Normas referentes a la utilizacin de productos qumicos 1) Antes de utilizar un determinado compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita; para ello leeremos, si es preciso un par de veces, la etiqueta que lleva el frasco. 2) Como regla general, no tocar con la mano y menos con la boca, ningn producto qumico. 3) No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar al profesor. 4) No pipetear con la boca los disolventes. Utilizar la perilla o una jeringa. 5) Los cidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos, nunca echaremos agua sobre ellos; siempre al contrario, es decir, cido sobre el agua. Siempre trabajarlos en la campana. 6) Colocar los desechos en el contenedor adecuado y de la manera indicada por el instructor. Los desechos qumicos, por razones de seguridad y proteccin al
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ambiente, no se debern tirar en la tarja de lavabo, previa autorizacin del instructor del laboratorio. Normas en el laboratorio. 1) Nunca trabajar solo en el laboratorio o ejecutar experimentos no autorizados. Si se considera necesario trabajar en el laboratorio fuera del horario establecido, se deber obtener el permiso necesario y asegurar que se estar acompaado por otra persona mientras el interesado est trabajando. 2) Cualquier accidente serio que involucre envenenamiento o dao corporal deber ser tratado con un mdico competente, pero para minimizar los efectos de tales accidentes los estudiantes y docentes debern estar familiarizados con los procedimientos bsicos de primeros auxilios. Si por desgracia ocurre un accidente que requiera tomar acciones rpidas para prevenir daos permanentes (lavados de quemaduras qumicas con agua, etc.), se deber informar al profesor de inmediato y seguir la accin apropiada segn se describe a continuacin. 3) Si ocurriese la entrada de reactivos qumicos a los ojos, deber lavarlos inmediatamente con los prpados abiertos y corriente de agua. Si utiliza lentes de contacto deber removerlos antes de la irrigacin. La irrigacin deber ser continua por lo menos durante 15 minutos y enseguida acudir al oftalmlogo para ser examinados. El uso de cido brico o cualquier otra solucin neutralizante no se recomienda para lesiones oculares, pues en algunos casos causa ms dao que cuando se irriga. Si llegarn a penetrar partculas de vidrio o de otra clase en los ojos, deber recibir atencin mdica de inmediato, remover cualquier partcula de vidrio es trabajo de un especialista. 4) El rea afectada por una quemadura con reactivos qumicos deber ser enjuagada de inmediato con agua, usando una ducha de seguridad si el rea lesionada es extensa, o una llave de agua si el rea es pequea. La rapidez del lavado es el factor ms importante para reducir la extensin de la lesin. El agua deber fluir continuamente por un mnimo de 20 minutos y el rea afectada se deber cubrir con gasas esterilizadas o pao limpio. La quemadura deber ser examinada por un mdico a menos que la piel solo presente un ligero enrojecimiento y sea un rea pequea. El uso de soluciones neutralizantes, ungentos y grasas no se recomiendan en casos como estos a menos que se indique especficamente. En estos casos el lavado con agua siempre ser primero antes del uso de cualquier agente. Si la quemadura es extensa o severa, la vctima deber acostarse con la cabeza y el pecho un poco ms abajo que el resto del cuerpo. Si la vctima est consciente y es capaz de tragar, se le dar de beber abundantes lquidos no alcohlicos hasta llegar al mdico.
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Normas referentes a la instalacin 1) 2) 3) 4) 5) Ubicar los lava-ojos en el laboratorio y aprender a utilizarlo. Ubicar la regadera de emergencia y aprender su uso. Ubicar las campanas de trabajo. Ubicar rea de pesado. Ubicar las puertas de emergencia.
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Normas referentes a la utilizacin del material de vidrio. 1) Cuidado con los bordes y puntas cortantes de tubos u objetos de vidrio. Alisarlos al fuego. Mantenerlos siempre lejos de los ojos y de la boca. 2) El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar quemaduras, dejarlo enfriar antes de tocarlo (sobre ladrillo, arena, planchas de material aislante. 3) Las manos se protegern con guantes o trapos cuando se introduzca un tapn en un tubo de vidrio. Normas referentes a la utilizacin de balanzas 1) Cuando se determinen masas de productos qumicos con balanzas, se colocar papel de filtro sobre los platos de la misma y, en ocasiones, ser necesario el uso de un "vidrio de reloj" para evitar el ataque de los platos por parte de sustancias corrosivas. 2) Despus de realizar el pesado debe de dejarse limpia y apagada la balanza. Normas referentes a la utilizacin de gas 1) El uso del gas butano requiere un cuidado especial: si se advierte su olor, cerrar la llave y avisar al profesor. 2) Si se va a utilizar un producto inflamable, cierre inmediatamente la llave general de gas y ventilar muy bien el local.
SUSTANCIAS QUMICAS PELIGROSAS

Las sustancias qumicas se clasifican, en funcin de su peligrosidad, en: 1) 2) Explosivos: Sustancias y preparados que pueden explosionar bajo el efecto de una llama. Comburentes: Sustancias y preparados que, en contacto con otros, particularmente con los inflamables, originan una reaccin fuertemente exotrmica.
3) 4)
Extremadamente inflamables: Sustancias y productos qumicos cuyo punto de ignicin sea inferior a 0C, y su punto de ebullicin inferior o igual a 35C. Fcilmente inflamables: Se definen como tales: Sustancias y preparados que, a la temperatura ambiente, en el aire y sin aporte de energa, puedan calentarse e incluso inflamarse. Sustancias y preparados en estado lquido con un punto de ignicin igual o superior a 0C e inferior a 21C. Sustancias y preparados slidos que puedan inflamarse fcilmente por la accin breve de una fuente de ignicin y que continen quemndose o consumindose despus del alejamiento de la misma. Sustancias y preparados gaseosos que sean inflamables en el aire a presin normal. Sustancias y preparados que, en contacto con el agua y el aire hmedo, desprendan gases inflamables en cantidades peligrosas. Inflamables: Sustancias y preparados cuyo punto de ignicin sea igual o superior a 21C e inferior a 55C. Muy txicos: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan entraar riesgos graves, agudos o crnicos, e incluso la muerte. Nocivos: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan entraar riesgos de gravedad limitada. Corrosivos: Sustancias y preparados que en contacto con los tejidos vivos puedan ejercer sobre ellos una accin destructiva. Irritantes: Sustancias y preparados no corrosivos que por contacto inmediato, prolongado o repetido con la piel o mucosas pueden provocar una reaccin inflamatoria. Peligrosos para el medio ambiente: Sustancias y preparados cuya utilizacin presente o pueda presentar riesgos inmediatos o diferidos para el medio ambiente. Carcingenos: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan producir cncer o aumento de su frecuencia. Teratognicos: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan inducir lesiones en el feto durante su desarrollo intrauterino. Mutagnicos: Sustancias y preparados que por inhalacin, ingestin o penetracin cutnea puedan producir alteraciones en el material gentico de las clulas.
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5) 6) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13)
Algunas de estas sustancias se reflejan en el etiquetado de los productos qumicos mediante un smbolo o pictograma, de manera que se capte la atencin de la persona que va a utilizar la sustancia. En el caso de incendio grave, la primera reaccin deber ser localizar las rutas de evacuacin lo ms rpido posible. Si el fuego es pequeo o dentro de un contenedor tal como un vaso o una cubeta, se extinguir fcilmente colocando una tela mojada con agua
sobre la tapa del contenedor. Si se considera conveniente se deber recurrir al extintor del tipo adecuado (fuegos A, B, C o D) e intentar apagar el incendio apuntando el extintor a la base del fuego manteniendo una prudente distancia. Se debe estar preparado para llamar a los bomberos si el fuego se tornar incontrolable. Si el cabello o las ropas son alcanzados por el fuego de inmediato recurra a las regaderas que se encuentran en cada laboratorio o la manta antifuego para sofocarlo.
MICRO Y MACROESCALA EN
UN LABORATORIO DE QUMICA La actividad en un laboratorio de qumica orgnica se puede desarrollar a tres niveles, segn la cantidad de sustancia que se emplee: macro escala, mini escala y micro escala. La qumica a nivel micro o mini escala en el campo de la investigacin y la docencia ha tenido un desarrollo muy vigoroso en las reas de la qumica general y qumica sinttica (inorgnica y orgnica) para mostrar la reactividad de diversos sistemas de inters bsico, ambiental, industrial, etc. Con un gran impacto en la disminucin de costos, tiempo de operacin y tratamiento de residuos. Algunos fundamentos y conceptos bsicos a considerar sobre la qumica a estos niveles son: Los experimentos se pueden llevar a cabo con cantidades de reactivo comprendidas entre 0.005 y 0.5 g, por lo que las pesadas deben realizarse en balanzas con al menos dos cifras decimales, tres cifras decimales sera lo mejor. Tngase en cuenta que con estas cantidades una desviacin de 0.1 g en un reactivo supone porcentualmente un error muy significativo en las proporciones adecuadas de los reactivos empleados. Las cantidades de disolvente suelen estar por debajo de los 100 microlitros y cinco mililitros. Por ello se deben usar pipetas, micro pipetas, dosificadores o jeringas con la graduacin y precisin adecuada para cada experimento. El material empleado requiere una adaptacin a las cantidades usadas, especialmente cuando estas son inferiores a los 100 miligramos. Las ventajas del uso de tcnicas a nivel mini y micro escala en el laboratorio son muy evidentes. Entre las ms importantes podemos citar las siguientes. Reducir los costos por alumno en cada experimento. Posibilitar el aumento del nmero y variedad de experimentos con el mismo presupuesto. Permitir la realizacin de experimentos que impliquen la utilizacin de reactivos costosos. Reducir la cantidad de reactivos empleados y consecuentemente los residuos generados. Minimizar el tiempo de reaccin y experimentacin, por lo que se puede dedicar ms tiempo al anlisis de resultados. Optimizar el aprovechamiento de de los laboratorios. Permitir el desarrollo de nuevas tcnicas. Requerimiento de un menor espacio de almacenamiento para reactivos y materiales
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Promover el principio de las tres r: reducir, reciclar y recuperar. Perfeccin en la formacin de los alumnos, ya que los obliga a ser ms cuidadosos en todas las etapas de la experimentacin. A continuacin se muestra de manera general el material que se encuentra en un equipo Corning o Microescala. Figura 1.
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Figura 1. Material general de vidrio que se encuentra en un maletn de microescala o macroescala. Otros materiales de laboratorio se encuentran especificados en cada una de las Practicas de este manual.
CLASIFICACIN DE RESIDUOS
CDIGO A CARACTERSTICAS DE LA SUSTANCIA EJEMPLO Disolventes orgnicos y soluciones de sustancias Acetona. orgnicas que no contienen halgenos Disolventes orgnicos y soluciones de sustancias Cloroformo orgnicas que contienen halgenos Residuos slidos orgnicos Soluciones salinas (inorgnicas) cido acetil saliclico Sulfato de cobre
C D
Residuos inorgnicos txicos, as como las sales de y Sales de plomo, talio, sus soluciones de metales pesados selenio Compuestos combustibles txicos Mercurio y sales de mercurio Sales metlicas regenerables Slidos inorgnicos Benceno Sulfato de mercurio Cloruro de plata Carbonato de bario
F G H I
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Residuos de vidrio, plstico, metal, columna y cartuchos Recipientes rotos, papel para HPCL. pH, slica gel, etc.
Prctica 1:
EXTRACCION de la TRIMIRISTINA a partir de la NUEZ MOSCADA:
SEPARACION DE COMPUESTOS ORGANICOS POR EXTRACCION Y DESTILACION Y CRISTALIZACION.
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INTRODUCCION
na separacin es el proceso, por el cual una mezcla se divide en al menos dos fracciones de diferente composicin. Para lograr una separacin se aprovecha el hecho de que los diversos componentes de una mezcla tienen diferentes propiedades fsicas y qumicas. Algunas tcnicas de separacin que aprovechan diferentes propiedades, se resumen en la siguiente tabla.
Tabla 1: Fundamento de las diferentes tcnicas de separacin de compuestos qumicos. Tcnicas de separacin FILTRACIN DESTILACIN SUBLIMACIN EXTRACCIN CRISTALIZACIN CROMATOGRAFA Principio Baja solubilidad Diferencia en punto de ebullicin Diferencia en punto de sublimacin Diferencia de solubilidad en dos disolventes inmiscibles Diferencia de solubilidad en disolventes fros y calientes Diferencia de movilidad de una sustancia que migra a travs de un soporte
LA EXTRACCIN: Es una operacin que contiene por objeto separar una sustancia deseada del material solido o lquido que la contiene, haciendo uso de disolventes, de tal forma seleccionados que permitan la disolucin de dicha sustancia sin disolver a otras que estn presentes. En el laboratorio, la extraccin se aplica en general para efectuar separaciones y purificaciones de productos naturales y de productos de sntesis orgnica.
La extraccin est basada tanto en la polaridad de los compuestos por separar como en la del disolvente empleado. Es decir, sustancias polares disuelven sustancias polares y las no polares son disueltas por las sustancias no polares, de ah se dice que lo semejante disuelve a lo semejante. La extraccin puede llevarse a cabo entre fases: SlidoLquido o Lquido Lquido. En la extraccin SlidoLquido, el slido contenido en una mezcla puede ser extrado por un disolvente polar o no polar dependiendo de su naturaleza. Posteriormente el slido es eliminado y el slido separado es recuperado. En la extraccin LquidoLquido, el compuesto (solido o liquido) se encuentra disuelto en un disolvente A y para extraerlo se emplea un disolvente B (A y B deben ser inmiscibles). Despus que el sistema es agitado, el compuesto deseado pasa de A a B. Los extractos obtenidos a partir de diluciones acuosas, son generalmente desecados antes de eliminar el disolvente, emplendose diversas sustancias higroscpicas tales como: Sulfato de sodio anhidro, sulfato de magnesio anhidro o cloruro de calcio anhidro. LA DESTILACIN: Es una operacin unitaria, que contiene por objeto la separacin de los componentes de una mezcla lquida mediante la diferencia de volatilidades relativas existentes en el sistema. Para nuestro caso, en esta prctica el uso de la tcnica de destilacin se basa en el inters de eliminar el disolvente empleado y as concentrar el extracto obtenido, el disolvente tiene un punto de ebullicin menor al del extracto, esto permitir que el extracto siempre permanezca en el contenedor inicial. La Cristalizacin: La cristalizacin es considerada como un mtodo de purificacin de los compuestos slidos (nicamente) y est basada en las propiedades de solubilidad en disolventes a diferentes temperaturas. En realidad, el termino cristalizacin se refiere al ordenamiento uniforme de los tomos o molculas capaces de formar cristales slidos, pero a veces el mismo trmino se usa para las sustancias amorfas (donde los tomos o molculas se encuentran en forma desordenada) y evitar ser confundidas con la Precipitacin. La Precipitacin se fundamente en la sobresaturacin y/o insolubilidad de una sustancia sin importar la temperatura, la Cristalizacin depende meramente de la temperatura. Hoy en da se conoce la composicin qumica de todos los alimentos; este hecho se debe en gran parte a la aplicacin de las tcnicas de separacin antes
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mencionadas. En esta sesin se llevara a cabo la separacin de biomolculas de frutos secos por la tcnica de extraccin y destilacin.
OBJETIVO GENERAL
Aislar el triglicrido trimiristina (Fig. 1) de la nuez moscada mediante la tcnica de Extraccin, Destilacin y Cristalizacin.
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Fig. 1: Estructura qumica de la Trimiristina.
OBJETIVOS PARTICULARES
1) Conocer las partes del equipo de microescala as como adquirir la habilidad para ensamblar este dispositivo. 2) Comprender el fundamento del mtodo de extraccin, destilacin y cristalizacin en la separacin de compuestos orgnicos de frutos secos. 3) Comprender las caractersticas fsico-qumicas que deben cubrir los disolventes usados en los procesos de extraccin, destilacin y cristalizacin.
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Los puntos a calificar en el Marco Terico son:
1) Fundamento de los mtodos de Filtracin, Extraccin y Destilacin. 2) Fundamento de las caractersticas fsico-qumicas de los disolventes usados en los procesos de extraccin y destilacin. Explicacin de solubilidad como fenmeno fsico. Relacin entre solubilidad y estructura molecular. Polaridad y solubilidad. Efecto de las fuerzas intermoleculares en la solubilidad. Solvatacin e hidratacin. Disolventes prticos y aprticos 3) Fundamento y uso de la filtracin por embudo Buchner y Matraz kiatasato. 4) Generalidades de la Nuez Moscada y de la Trimiristina. 5) Generalidades de los Triglicridos.
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MATERIAL Y REACTIVOS
Bata y lentes de seguridad.
3 nueces moscada enteras Equipo de microescala Termmetro Cinta Tefln Sal de mesa Esptula de calibre fino Franela Probeta de 50 mL 3 Mangueras de latex (80 cm) 2 soportes universales 3 pinzas de tres dedos con contrapinza o nuez. 2 vasos de precipitado de 50 mL 2 vaso de precipitados de 100 mL Embudo de tallo corto Papel filtro Matraz kitasato de 100 mL Escobilln, zacate y detergente.
Cloroformo Cloruro de calcio Etanol ---------------------------------------------- Parrillas de calentamiento Embudos buchner Matraces kitazato ____________________________ Equipo expositor: 1 bolsa de hielo
CONSIDERACIONES PREVIAS
1) Durante el tiempo del reflujo, el Equipo Expositor comenzar su seminario correspondiente. 2) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 3) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y guantes ltex es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
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PROCEDIMIENTO
Extraccin de la Trimiristina. 1) Con asesora del profesor, armar el sistema de reflujo. 2) Haga un bao de sal a una temperatura de 65-70 C: Coloque 1/3 de sal de mesa en el vaso de precipitados de 100 mL. Para calentar la sal contenida en el vaso de precipitados use la parrilla de calentamiento. Use termmetro para monitorear constantemente la temperatura del bao de sal. Nota: Nunca infiera la temperatura del sistema por el lector o indicador de la parrilla de calentamiento, use siempre termmetro. 3) Moler 2.0 g de nuez moscada y colocarlos en el matraz redondo de 10 mL del equipo de microescala y adicionar 4.0 mL de cloroformo. 4) Asegure el matraz redondo en el refrigerante (condensador). Nota: En la experiencia se ha observado que cuando el equipo de microescala presenta desgastes de uso, las juntas, empaques y roscas no sellan eficientemente el sistema lo que puede provocar fuga constante del disolvente evaporizado. Si esto llegase a ocurrir, se recomienda usar cinta
tefln para sellar la junta del matraz de bola con el refrigerante, esto evitara cualquier fuga en el sistema. 5) Someter la mezcla de reaccin a reflujo constante durante 30 min manteniendo siempre constante la temperatura de 65-70 C (las temperaturas elevadas podran sobresaturar de vapor el sistema de reflujo y llevar a su proyeccin). 6) Pasado este tiempo se enfra y se adiciona 0.3 g de cloruro de calcio.
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7) Filtrar en embudo buchner/matraz kitazato con ayuda de alto vacio. Destilacin: concentracin de la Trimiristina. 8) Montar el sistema de destilacin.* 9) El extracto clorofrmico se destila hasta tener un lquido oleoso. Cristalizacin: Purificacin de la Trimiristina. 10) En un vaso de precipitados de 50 mL enfriar 10 mL de etanol (usar bao de hielo). Espere hasta que el etanol se encuentre totalmente frio. 11) El lquido oleoso se vierte en el etanol frio. Por enfriamiento cristaliza la trimiristina. 12) Sobre un papel filtro previamente pesado, filtre al vacio el triglicrido obtenido en embudo buchner/matraz kitazato. 13) El slido se lava tres veces con 5.0 mL de etanol frio, mantenga el producto sobre el embudo aproximadamente 5 min hasta que el etanol se haya eliminado por completo. 14) Se formara un polvo fino, se pesa el producto sobre el papel filtro y por diferencia de pesos obtener el rendimiento de la trimiristina. Prueba de solubilidad: Condiciones necesarias para una cristalizacin.
En esta sesin evitar el uso del Rotavapor, esto con la finalidad de que el alumno aprenda el montaje del sistema de destilacin convencional y comprenda el principio del mismo.
*
15) Coloque 0.01 g de Trimiristina en un tubo de ensaye. Agrege1.0 mL de etanol a temperatura ambiente, agite vigorosamente la muestra La muestra se disuelve? Anote sus observaciones. 16) Entonces caliente ligeramente el tubo sobre el bao de sal previamente usado. La muestra se disuelve? Anote sus observaciones. 17) Deje enfriar el tubo a temperatura ambiente. Observe lo que pasa. Entonces sumerja nuevamente el tubo de bao de hielo. Anote sus observaciones. 18) Discuta sus observaciones en su Reporte de Resultados.
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CUESTIONARIO
1) Porque el agua fra en un refrigerante debe circular en sentido ascendente? 2) Qu funcin tiene el cloruro de calcio en la extraccin? 3) Por qu precipita la trimiristina cuando se usa etanol frio? 4) Por qu se lava al final del proceso la trimiristina con etanol frio? 5) Discuta el fundamento fisicoqumico de lo que ocurre en los pasos 15-17.
Prctica 2:
OBTENCION y SEPARACION de los Prctica 2 PIGMENTOS VEGETALES de HOJAS de ESPINACA.
PARTE 1: CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)
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INTRODUCCION
n la sesin anterior se describi la separacin de un compuesto orgnico (trimiristina) del resto de los componentes originales del fruto seco. En principio, el alumno no observ alguna otra dificultad de mezcla de productos significativos ya que, por una parte, el uso de disolventes adecuados y las tcnicas adecuadas de separacin llevaron al aislamiento del triglicrido con cierta pureza aceptable. Este hecho no siempre es as, ya que en otras ocasiones, un sustrato puede contener dos o ms componentes con propiedades fisicoqumicas semejantes en las mismas proporciones, esto significara que en una extraccin se obtendran dos o ms productos, que al presentar semejanzas entre s, sera muy difcil una separacin de estas por una simple cristalizacin. En esta y prxima sesin estudiaremos la Cromatografa en Capa Fina (TLC, Thin Layer Chromatography por sus siglas en ingles) y Cromatografa en Columna (CC), que en principio, resolvera el problema antes mencionado.
Los mtodos cromatogrficos son considerados sumamente eficaces en la purificacin de sustancias, ya que tienen como finalidad la separacin de una mezcla en sus constituyentes individuales. El estudio de los mtodos cromatogrficos (Esq. 1) es muy amplio e imposible de cubrir en su totalidad en pocas sesiones de laboratorio. Por lo tanto, se cubrirn en este curso nicamente las cromatografas en placa fina y en columna por ser estas las tcnicas ms usadas en la purificacin de sustancias en el laboratorio.
Mezcla de Productos METODOS CROMATOGRAFICOS
SIMPLES
INSTRUMENTALES
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PLACA COLUMNA
GASES LIQUIDOS
Compuesto Puro
Esq. 1: Clasificacin de los mtodos cromatogrficos
Todas las separaciones cromatogrficas se logran mediante la distribucin de los constituyentes de una mezcla entre dos fases, de las cuales una es fija y se llama Fase Estacionaria y la otra que se desplaza se denomina Fase Mvil. CROMATOGRAFA EN PLACA: La Cromatografa en Placa es un mtodo que consiste en separar mezclas de compuestos, empleando como fase estacionaria un adsorbente adherido a placas de vidrio, platico o aluminio, y como fase mvil un determinado disolvente o mezcla de varios segn sea el caso, dependiendo del enfoque que tenga la separacin. La cromatografa en placa se puede efectuar de dos formas: en Placa Fina (TLC) con fines analticos y en Placa Prepara con el objeto de preparar compuestos puros, el principo de funcionamiento en ambas es el mismo, la diferencia en el enfoque y en las especificaciones de la placa. ADSORBENTES EMPLEADOS: El adsorbente que constituye la fase estacionaria es de naturaleza variada dependiendo del tipo de cromatografa que se lleve a cabo. Por ejemplo, en los casos de cromatografa en placa y en columna se emplean como adsorbentes almina (Al2O3) y gel de slice (SiO2), siendo este ltimo el ms usado (empleado en este curso). El gel de slice o slica gel, es un slido blanco que puede encontrarse
pulverizado en diferentes tamaos (nmero de mallas) que de acuerdo al tipo de cromatografa en placa o en columna, es el gel de slice que se emplea. DISOLVENTES EMPLEADOS: Estos son tambin de naturaleza variada y su empleo va a depender del tipo de compuesto o compuestos por separar y su polaridad. El xito de una buena separacin por cromatografa depender tanto de la polaridad tanto de la sustancia por separar como de los disolventes empleados para su separacin. En trminos prcticos se dice que un compuesto es polar cuando es fuertemente adsorbido en la fase estacionaria y no polar cuando no es retenido. En cuanto a los disolventes, se consideran polares aquellos que son muy eficientes en desplazar sustancias adsorbidas y no polares aquellos que desplazan con mayor dificultad (lentitud) a las sustancias adsorbidas (Fig. 1).
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La polaridad del disolvente modula la separacion de los compuestos. A mayor polaridad mayor es el "arrastre" de los componentes y viceversa.
Compuestos menos polares. Sufren menor retencion en la fase estacionaria.
Compuestos ms polares. Sufren mayor retencion en la fase estacionaria.
Fig. 1
Dependencia en la polaridad de los compuestos y del disolvente en la TLC.
Existe una relacin razonable entre las constantes dielctricas de un disolvente y su polaridad, por lo tanto, se pude enlistar una serie de disolventes con polaridad creciente que pudiera ser utilizada segn se requiera (Tabla 1).
Tabla 1:
Constantes dielctricas cromatografa.
de
disolventes
comunes
en
Disolvente Constante dielctrica* Disolventes no polares Hexano 2,0 Benceno 2,3 Tolueno 2,4 ter dietlico 4,3 Cloroformo 4,8 Disolventes polares aprticos 1,4-Dioxano 2,3 Acetato de etilo 6,0 Tetrahidrofurano 7,5 Diclorometano 9,1 Acetona 21 Acetonitrilo 37 Disolventes polares prticos cido actico 6,2 n-Butanol 18 Isopropanol 18 n-Propanol 20 Etanol 24 Metanol 33 cido frmico 58 Agua 82 * La Constante dielctrica es una medida de la capacidad del solvente para solventar a los iones. Polaridad creciente
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La importancia de la TLC en el laboratorio radica en que esta permite de una manera relativamente sencilla y con pocos recursos desde explorar y controlar la separacin de una mezcla hasta seguir el avance de una reaccin, incluso aun en casos donde se cuente con instrumentos de anlisis, es recomendable explorar previamente mediante una TLC.
OBJETIVO GENERAL
Extraer y separar los carotenos, xantofilas, clorofila , clorofila y lutenas de mediante la tcnicas de Cromatografa en Capa Fina (TLC).
1) Comprender el concepto de cromatografa y aplicarlo en la separacin de pigmentos vegetales. 2) Comprender el concepto de polaridad en cromatografa y su influencia en la separacin exitosa de una mezcla de compuestos. 3) Calcular el RF de cada uno de los compuestos e interpretar este valor. 4) Comprender el uso y funcionamiento del equipo de Rotavapor.
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MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Los puntos a calificar en el Marco Terico son: 1) Fundamento de los distintos mtodos cromatogrficos. 2) Disolventes ms usados y orden de polaridad de los mismos. 3) Clculo del Rf en la TLC y su significado. 4) Generalidades de los pigmentos fotosintticos y su orden de polaridad. 5) Fotosntesis. 6) Uso de los pigmentos vegetales como colorantes naturales en productos alimenticios.

6 hojas de espinaca Bata y lentes de seguridad. Tijeras Lpiz 1 pinzas de cirujano Papel filtro Capilares de vidrio boca pequea. 1 frascos Gerber grande limpio. Un frasco color mbar con taparrosca 1 vaso de precipitados de 100 mL Matraz erlenmeyer de 100 mL Esptula delgada. Franela. 3 mangueras de ltex (80 cm de largo) Escobilln, zacate y detergente.
Metanol Acetato de etilo Hexano Placas de Cromatografa en Capa Fina
_____________________________ (cromatofolios)
Parrillas de calentamiento. Rotavapor con matraz redondo de 250
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mL
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) El equipo expositor deber preparar la mezcla de elucin para la TLC Hexano-Acetato de etilo (7:3): Con ayuda de una probeta de 50 mL medir 35 mL de hexano, verterlos en un matraz erlenmeyer de 100 mL. Posteriormente medir 15 mL de acetato de etilo y mezclarlos con agitacin moderada en el matraz erlenmeyer. Tapar con papel aluminio la boca del matraz para evitar la evaporacin. 3) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata y lentes de seguridad es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
PROCEDIMIENTO
Extraccin de los Pigmentos de las hojas de espinaca: 1) Lavar perfectamente 6 hojas verdes y tiernas de espinacas con agua y despus separar los peciolos y venas grandes de las hojas. 2) Cortar las hojas de espinacas con tijeras en trozos los ms finamente posible. 3) Colocar los trozos de espinaca en un vaso de precipitados de 100 mL y adicionar aproximadamente 50 mL de metanol. Calentar moderadamente en la parrilla de calentamiento hasta que el disolvente adquiera una coloracin verde intensa. 4) El disolvente se decanta en un matraz erlenmeyer de 100 mL. 5) Se repite el paso 3 y 4 para obtener una mayor cantidad de pigmento. Cromatografa en Capa Fina (TLC) 6) Con asesora del profesor colocar la muestra pigmentada en la TLC: Se marca la placa de TLC con ayuda de un lpiz (grafito) los puntos en donde se va a aplicar la muestra (tres puntos). Con un capilar, tomar un poco de la disolucin orgnica que contiene los pigmentos y pinchar la TLC en los tres puntos con concentraciones diferentes. Para evitar que la mezcla difunda por la placa mientras es pinchada, vaciar el contenido del capilar poco a poco sobre el punto y soplar suavemente en cada pinchada para secar el disolvente. Las diferentes concentraciones es para que el alumno observe la relacin entre la concentracin con la intensidad, abultamiento y altura de las manchas una vez corrida en el disolvente.
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1 2 3
Mayor concentracin
Menor concentracin
Mediana concentracin
7) A un frasco de Gerber grande se adicionan unos mililitros de una mezcla hexano/acetato de etilo 7:3; as mismo se coloca un papel filtro soportado
en la pared del frasco. Agite ligeramente el frasco de forma circular para que esta se sature de los vapores del disolvente. 8) Con ayuda de unas pinzas de cirujano se coloca la placa de TLC dentro del frasco Gerber teniendo cuidado de que el disolvente del frasco no toque las aplicaciones del pigmento (en caso de que esto ocurra, elimine un poco del disolvente del frasco, tape y vuelva a agitar). Tapar el frasco Gerber. Se observar como por efecto de capilaridad el disolvente comenzar a subir por la placa.
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9) Antes de que el disolvente llegue al tope de la placa sta se saca del frasco con ayuda de las pinzas, marque rpidamente con un lpiz el nivel alcanzado por el disolvente en la placa (frente del disolvente), sople sobre la placa para permitir que el disolvente se evapore. 10) Se observar la posicin de las manchas separadas en el siguiente orden: carotenos (mancha superior amarilla-naranja), feofitina (ligeramente visible en la TLC), clorofila (mancha color verde militar), clorofila (mancha color verde olivo) y por ltimo, en la parte inferior de la TLC tres fracciones correspondientes a las xantofilas (manchas amarillasligeramente verdes). Note como la concentracin de las aplicaciones afecta el desplazamiento y uniformidad de las mismas. Se dice que una mancha muy concentrada y abultada no es confiable para una cierta interpretacin. 11) Calcule el Rf de cada uno de los pigmentos, tome como manchas de lectura aquellas que correspondan a la aplicacin con concentracin moderada, no tome lecturas de una y otra aplicacin, solo elija una de las tres.
Frente del disolvente
a Rf (A)= x b R f (B)= x
A
x
B b
a
Linea base Punto de aplicacin
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Concentracin del pigmento en Rotavapor y almacenamiento. 12) En un matraz redondo de rotavapor de 250 mL (asignado por el laboratorio) y con asesora del profesor, colocar la solucin con el extracto de pigmentos y evaporar el disolvente a sequedad. 13) El concentrado del pigmento se raspa del matraz redondo con ayuda de la esptula y se coloca en un frasco color mbar, se tapa y se guarda para la siguiente prctica. Se deber tener cuidado que el pigmento permanezca siempre guardado en la oscuridad.
CUESTIONARIO
1) Investigue la estructura qumica de cada uno de los pigmentos, en base a esta informacin discuta su polaridad y de una explicacin de por qu tuvieron cierto desplazamiento en la TLC. 2) Por qu cuando introducimos la TLC a la cmara de cromatografa (frasco Gerber) se debe tener cuidado que las aplicaciones del pigmentos en la TLC no toque la mezcla de elucin? 3) Qu significa el Rf de cada sustancia en la TLC? 4) Por qu debe cerrarse el frasco mientras est corriendo la placa? Cmo afecta esto en los resultados? 5) Qu otros disolventes pudieran sustituir los usados para correr la TLC? Por qu?
Prctica 3:
OBTENCION y SEPARACION de los PIGMENTOS VEGETALES de HOJAS de ESPINACA.
PARTE 2: CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
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INTRODUCCION
a en la sesin anterior abordamos parte del fundamento de la Cromatografa, en particular de la TLC. Pero como el estudiante se habr dado cuenta, la TLC tiene una limitante: la separacin de los compuestos es posible pero solo para unos cuantos microgramos de la muestra, es decir, hasta ahora no hemos podido separar la cantidad total del extracto vegetal, por lo tanto, la TLC es solo analitica. Aun as, es posible separar el extracto vegetal mediante una Placa Preparativa (2525 cm y 0.5 cm de espesor) pero su uso tambin es limitado a una cantidad no mayor de 200 mg de muestra. Un mtodo ms convencional para lograr este propsito es la Cromatografa en Columna (CC) que obedece al mismo principio de la TLC, pero a diferencia de esta ltima, la CC es capaz de separar cantidades mucho mayores de muestra; la CC no trabaja por capilaridad sino por gravedad.
OBJETIVO GENERAL
Purificar cada uno de los pigmentos vegetales obtenido de las hojas de espinacas por Cromatografa en Columna.
1) Comprender el fundamento de la CC mediante la separacin total de cada uno de los pigmentos obtenidos de las hojas de espinacas. 2) Cuantificar el contenido de clorofila del extracto vegetal. 3) Comprender la relacin entre la TLC y la CC, similitudes y diferencias. 4) Conocer los factores que afectan y determinan la separacin exitosa de una mezcla por CC.
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MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Puntos a calificar en el Marco Terico. Fundamento de la Cromatografa en Columna (CC) Los otros puntos como: Disolventes ms usados y orden de polaridad de los mismos, y Generalidades de los pigmentos fotosintticos y fotosntesis ya han sido descritos en el Plan de Trabajo anterior por lo que se prescindirn de ellos.
Concentrado del pigmento (recolectado en
la prctica anterior) Bata, lentes de seguridad y cubrebocas. Algodn una cuchara de platico desechable 3 pipetas pasteur con bulbo (microperilla) 15 tubos de ensaye con gradilla. Matraz erlenmeyer de 100 mL Embudos de tallo corto. Esptula. Franela. 1 manguera de ltex (80 cm de largo) 1 soporte universales 2 pinzas de tres dedos con contrapinza o
_______________________________ Buretas Rotavapor y matraz redondo de 25 mL
Bureta Slica gel Metanol Acetato de etilo Hexano Sulfato de Sodio anhidro (Na2SO4)
Escobilln, zacate y detergente.
nuez.
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto. 3) PRECAUCIN, la slica gel es altamente peligrosa si es ingresada a vas respiratorias causando cncer de pulmn a largo plazo, por lo que este paso deber realizarse en la campana de extraccin usando siempre cubrebocas.
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PROCEDIMIENTO
Preparacin de la Columna de Cromatografa (asesora del profesor): 1) A la parte inferior de una bureta se le coloca un tapn (no muy ajustado) de algodn por la parte interior, esto podr hacerse con la ayuda del vaco. 2) Se agrega un poco de sulfato de sodio anhidro al interior de la bureta. 3) Posteriormente agregar slica gel a la bureta haciendo uso de la cuchara desechable. El volumen ocupado por la slica gel ser de 40% del volumen total de la bureta sersiorandose que sta quede bien empacada con ayuda de LIGEROS golpecitos a la columna (cuidado de no golpear fuertemente la columna para no causar fracturas en ella) esto para compactar la slica gel en la misma. Posteriormente se le adiciona nuevamente un poco de sulfato de sodio anhidro a la parte superior de la columna.
4) Monte la bureta en un soporte universal ajustando el mismo con 2 pinzas de tres dedos. Es importante que la columna se encuentre en forma vertical (90), la mnima inclinacin podra echar a perder la cromatografa. Corrimiento de la muestra: 5) Preparar 100 mL del sistema de elucin identificada para la TLC (hexano/Acetato de etilo 7:3). Usar probeta para medir cantidades auxilindose de un matraz erlenmeyer para homogenizar la solucin.
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6) La muestra se suspende con unos mililitros del sistema de elucin y con ayuda de una pipeta pasteur se coloca en el interior de la columna. Tener cuidado que al verter la solucin sta no toque las paredes de la columna, en caso de que esto ocurra, enjuagar las paredes con un poco del sistema de elucin usado. 7) Una vez que todo el pigmento este dentro de la columna agregue lentamente por las paredes de la misma sistema de elucin suficiente para un aforo del 90% de la columna. 8) Por gravedad, se observa como los distintos pigmentos se van separando. 9) Recolectar en el inferior de la columna, mediante los tubos de ensaye, las fracciones de la cromatografa. 10) Identificar los diferentes tonos de colores en los tubos de ensaye recolectados: las primeras fracciones naranjas-amarillas corresponden a los carotenos, las siguientes de color verde militar a la clorofila , despus la clorofila (verdes olivo, pigmento ms abundante) y por ltimo las fracciones correspondientes a las xantofilas (amarillos). La intensidad de los colores puede variar en base la concentracin de las diluciones en los tubos de ensaye. (haga uso de cmara fotogrfica para el reporte de sus resultados). 11) Seleccionar las fracciones de la clorofila , destilar el disolvente en el equipo de rotavapor y obtener el rendimiento en base al peso de las espinacas trituradas (practica anterior).
CUESTIONARIO
1) Por qu es necesario llevar a cabo primero la Cromatografa en Capa Fina (TLC) antes que la Cromatografa en columna? 2) Qu es mejor? Tomar fracciones con cantidades pequeas o grandes de recoleccin? Por qu? 3) Qu es mejor? Qu la altura de slica gel en la columna sea corta o alta? Por qu? 4) Qu funcin tiene el sulfato de sodio anhidro en la columna? 5) En el paso 4, Por qu es importante que la columna permanezca en forma vertical?
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Prctica 4:
EXTRACCION de ADN de FRUTAS, VERDURAS y TEJIDO ANIMAL:
EXTRACCION DE BIOMOLCULAS POR PROCESOS QUIMICOENZIMTICOS
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INTRODUCCION
n las sesiones anteriores, hemos realizado la separacin de compuestos qumicos presentes en algunos alimentos, esto con el fin de demostrar las tcnicas de separacin usados cotidianamente en el laboratorio de qumica orgnica; aunque cabe mencionar que los procesos anteriores tienen su fundamento en procesos ms fsicos que qumicos. Hoy abordaremos los mtodos de extraccin que van ms all de una simple solubilidad ante un cierto disolvente o capacidad de adhesin a una fase estacionaria.
Los cidos nucledos son los portadores qumicos de la informacin gentica de un organismo. Una diminuta cantidad de cido desoxirribonucleico (ADN) en un huevo fertilizado determina casi todas las caractersticas fsicas del animal en su desarrollo completo. La diferencia entre una rana y un ser humano esta codificada en una parte relativamente pequea de este ADN. Cada clula lleva un juego completo de instrucciones genticas que determina el tipo de clula, su funcin, cuando crece y se divide, y como sintetiza todas las protenas, enzimas, carbohidratos y dems sustancias que la clula y el organismo necesita para sobrevivir. El ADN lo aisl por primera vez, durante el invierno de 1869, el mdico suizo Friedrich Miescher mientras trabajaba en la Universidad de Tubinga. Miescher realizaba experimentos acerca de la composicin qumica del pus de vendas quirrgicas desechadas cuando not un precipitado de una sustancia desconocida que caracteriz qumicamente ms tarde. Lo llam nuclena, debido a que lo haba extrado a partir de ncleos celulares. Se necesitaron casi 70 aos de
investigacin para poder identificar los componentes y la estructura de los cidos nuclicos. Hoy se sabe que el ADN es un largo polmero formado por unidades repetitivas de nucletidos, los cuales son nuclesidos (Adenina, Guanina, Timina y Citosina) fosforilados unidos por enlaces glicosdicos. Una doble cadena de ADN mide de 22 a 26 angstroms (2,2 a 2,6 nanmetros) de ancho, y una unidad (un nucletido) mide 3,3 (0,33 nm) de largo. Aunque cada unidad individual que se repite es muy pequea, los polmeros de ADN pueden ser molculas enormes que contienen millones de nucletidos. Por ejemplo, el cromosoma humano ms largo, el cromosoma nmero 1, tiene aproximadamente 220 millones de pares de bases. Watson, Crick y Wilkins recibieron conjuntamente, en 1962, despus de la muerte de Rosalind Franklin, el Premio Nobel. Sin embargo, el debate contina sobre quin debera recibir crdito por el descubrimiento.
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OBJETIVO GENERAL
Extraer ADN de clulas vegetales y animales.
1) Extraer ADN de fresas, guisantes e hgado de pollo mediante procesos bioqumicos. 2) Observar las diferencias y similitudes de tcnicas de extraccin (para la presente practica con las realizadas anteriormente) 3) Ampliar el conocimiento del estudiante en los diferentes mtodos de extraccin orgnica.
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Bata, lentes de seguridad y guantes de latex Fresas, guisantes o higado de pollo (segn sea el
caso) Sal de mesa Ablandador de carne en polvo Jabn liquido sin aditivos Varillas de madera Matraz erlenmeyer de 100 mL Recipiente casero (1/2 L de capaciad) Vaso de precipitados de 100 mL Vaso de precipitados de 50 mL Tela de algodn 3030 cm Esptula delgada Papel filtro y tijeras Agitador de vidrio Probeta de 50 mL Pipetas de 5 y 10 mL 2 pipetas pasteur con bulbo. Vidrio de reloj Franela, escobilln y detergente.
Etanol 98%
------------------------------------------------------------- Embudos buchner Matraces kitazato _______________________________________ Equipo expositor: 1 bolsa de hielo Batidora manual
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) El equipo expositor ser el responsable de proporcionar una batidora porttil. 3) Es recomendable que el alumno se cerciore que las fresas sean de invernadero y no silvestres. Las fresas silvestres son diploides, es decir, que contienen dos copias de cada cromosoma. Las fresas producidas comercialmente son octoploides, pues contienen ocho copias de cada cromosoma lo que las hacen particularmente buenas para este experimento. Las fresas que se comercializan de forma congelada pueden ser tambin tiles. 4) Es recomendable que el hgado de pollo sea lo ms fresco posible. 5) Es preferible usar un jabn lquido claro, libre de aloe, perfumes, colorantes y otros aditivos. 6) Es importante que el alcohol etlico no sea menor al 90% ya que los resultados no sern los esperados. 7) Durante toda la prctica, el alumno deber usar guantes de ltex para evitar cualquier contacto con el material biolgico, pues las manos secretan continuamente grasa. 8) El uso de las diferentes fuentes biolgicas ser de la siguiente manera: Equipos 1-4: Fresas. Equipos 5-7: Guisantes Equipos 8-10: Hgado de pollo.
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PROCEDIMIENTO
1) En un matraz erlenmeyer de 100 mL coloque 50 mL de etanol al 90%. Deje enfriar en bao de hielo para ser usado ms adelante. 2) En un contenedor casero de 1/2 litro de capacidad coloque un hgado, 50 g de guisantes o 12 fresas (segn sea el caso) (las fresas debern estar previamente lavadas sin la capucha verde). 3) Aada 60 mL de agua corriente. 4) Con ayuda de una batidora manual, muela moderadamente el material biolgico. En este paso se permitir el rompimiento de las clulas vegetales o animales lo que dejara los ncleos celulares sueltos. 5) Sobre un vaso de precipitados de 100 mL coloque una tela de algodn la cual servir como filtro. Vierta la masa biolgica sobre la tela de algodn. Envuelva el material biolgico con la tela y por accin mecnica, forzar la filtracin recibiendo el lquido filtrado en el vaso de precipitados. 6) Realice otra filtracin ms fina del lquido sobre papel filtro al alto vacio con ayuda de matraz kitazato/embudo buchner. 7) Agregue 2.0 g de sal de mesa. Con ayuda de un agitador de vidrio agite moderadamente la solucin por 5 minutos. Con la accin mecnica de la licuadora manual se permiti el rompimiento de las clulas dejando libre a los ncleos. El cloruro de sodio (sal de mesa) alterar la presin osmtica de los ncleos lo que llevar a su estallido para que queden libres las fibras de cromatina.
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8) Agregue 0.3 g de ablandador de carne domestico en polvo. Agita muy lentamente la solucin con el agitador de vidrio por 1 min para homogenizar. Deja reposar por 10 min. iS cuidadoso! Si lo agitas demasiado fuerte rompers el ADN hacindolo ms difcil de ver. El ablandador de carne tiene un alto contenido de enzimas proteolticas, estas actan como tijeras rompiendo los enlaces peptdicos. Esto permitir que las protenas que rodean al ADN se rompan.
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9) En otro vaso de precipitados de 50 mL homogeniza perfectamente 4.0 mL de jabn lquido en 10 mL de agua corriente. 10) Agrega la solucin de jabn a la solucin biolgica. Agite LENTAMENTE por 5 Segundos. deja reposar por 5 min. MUY
Aunque anteriormente las protenas que rodean al ADN fueron hidrolizadas, las fracciones de las protenas y aminocidos remanentes aun siguen pegadas al ADN. La accin del detergente es formar un complejo con las protenas, aminocidos y lpidos para separarlas del ADN. As nos quedar el ADN libre de las protenas que tiene asociadas.
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CLULA
DETERGENTE
11) En una probeta de 50 mL coloca solamente 25 mL de la solucin biolgica. Hazlo cuidadosamente sin agitar mucho la solucin. Pon en posicin diagonal la probeta para recibir la solucin biolgica. 12) Con ayuda de una pipeta de 10 mL se adicionaran 20 mL de etanol previamente enfriado. La adicin del etanol se har cuidadosamente dejando caer SUAVEMENTE Y LENTAMENTE el alcohol POR LAS PAREDES de la probeta, esto se hace con el fin de evitar cualquier agitacin brusca en la superficie de la solucin biolgica. 13) El alumno observara inmediatamente que la fase superior alcohlica comienza a ponerse turbia. El ADN se est separando de la fase acuosa inferior. Espere 10 min hasta que la mayor cantidad de ADN sea separada. Observe que en la interfase se encuentra el mayor cmulo de ADN, en la dems solucin alcohlica se observar una tela de ADN. Este paso final es el proceso para precipitar el ADN. El ADN es soluble en agua y, por tanto, no visible en la mezcla que se filtr al inicio. Sin embargo, el ADN es insoluble en etanol en presencia de sal. Por lo tanto, la adicin cuidadosa de etanol sobre la parte superior de la mezcla de ADN causar que el ADN se salga de la solucin y formar hilos visibles, insolubles. 14) Con ayuda de una pipeta pasteur, extraiga lo ms que pueda la fase alcohlica sin extraer el ADN formado.
15) Con ayuda de una varilla de madera, recoja el ADN y colquela en un vidrio de reloj previamente pesado. Deseche la fase acuosa en la tarja.
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16) Repita los pasos 11-15 con la dems solucin biolgica que se dividi y que quedo en el matraz de precipitados de 100 mL. 17) En casa deje a la intemperie el producto recolectado evitando las altas temperaturas y accin solar. Deje a que el alcohol se evapore. Despus del tercer da, pide permiso en el laboratorio para pesar el vidrio de reloj y por diferencia de pesos calcule el rendimiento del ADN. Pide los resultados a otros dos equipos que hayan realizado la extraccin de ADN con otra fuente biolgica, en tu reporte final discute los tres resultados.
CUESTIONARIO
1) 2) 3) 4) Para el uso de tejido animal porque es preferible usar hgado y no otro rgano de animal? Cul es el nombre de la enzima contienen los ablandadores de carne? Cul es el ingrediente activo en el jabn que permiti la emulsificacin de los lpidos y protenas? Investigue como podra determinar la presencia y pureza del ADN extrado en esta prctica.
Prctica 5:
SINTESIS DE LA CAFEINA A PARTIR DE LA TEOBROMINA
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Parte 1:
Extraccin de la Teobromina del Polvo de Cocoa
O HN O N CH3 N N
CH3
O CH3I MeONa MeOH H3C N O N CH3 N N
CH3
T eobromina
Caf eina
INTRODUCCION
a teobromina es un alcaloide de la familia de las metilxantinas, familia que incluye tambin a la teofilina y la cafena. En estado puro, es un polvo blanco. Es soluble en cidos y bases, poco soluble en agua y alcohol etlico, y prcticamente insoluble en ter etlico. Esta sustancia se encuentra en la planta del cacao (Theobroma cacao), principalmente en las semillas, las cuales contienen entre un 1% a un 4% de sta. Al fermentar y secar las semillas, y luego procesar el extracto obtenido, se obtiene el chocolate. El chocolate negro contiene aproximadamente 1,5% de teobromina, esto es, diez veces ms que el chocolate
con leche comn. La teobromina estimula el sistema nervioso central, provoca broncodilatacin y diversos efectos cardiovasculares; sin embargo, en los humanos no se ven estos efectos al consumir chocolate, siendo muy raras las intoxicaciones, aunque es posible que puede producir dolor de cabeza, inapetencia o alergias en personas sensibles o en cantidades grandes. La cafena es una sustancia amarga que se encuentra en el caf, el t, bebidas gaseosas, chocolate, nueces de cola y ciertas medicinas. Tiene muchos efectos en el metabolismo del cuerpo, incluyendo la estimulacin del sistema nervioso central. sta puede hacerlo sentirse ms alerta y aumentar su energa. La cafena fue descubierta en 1819 por el qumico alemn Friedrich Ferdinand Runge: fue l quien acu el trmino Koffein, un compuesto qumico en el caf, el cual pasara posteriormente al espaol como cafena. Las fuentes de cafena ms comnmente usadas son el caf, el t y en menor medida el cacao. SUSTITUCIN NUCLEOFLICA BIMOLECULAR (SN2) La sustitucin nucleoflica bimolecular conocida tambin como reaccin SN2, es un tipo de sustitucin nucleoflica, donde un par libre de un nuclefilo (Nuc:) ataca un centro electroflico y se enlaza a l, expulsando otro grupo denominado grupo saliente (X) En consecuencia, el grupo entrante reemplaza al grupo saliente en una etapa (Esq. 1)
_ Nuc: +
nuclefilo
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_
C
Nuc
X
grupo saliente
electrfilo (sustrato unido al grupo saliente)
producto
Esq. 1:
Forma general de una Sustitucin Nucleoflica Bimolecular, SN2.
Esta sustitucin nucleoflica de un solo paso es un ejemplo de mecanismo SN2 (abreviatura de sustitucin nucleoflica bimolecular). El trmino bimolecular quiere decir que en el estado de transicin hay implicadas dos molculas que colisionan. Las reacciones bimoleculares normalmente tienen ecuaciones de velocidad de segundo orden. Durante esta reaccin, un nuclefilo fuerte (donante de un par de + electrones) con carga negativa ataca a un sustrato, es decir, el C X compuesto que es atacado por el reactivo o nuclefilo. El tomo de carbono del sustrato es electroflico ya que va unido a un sustrato tomo (X) electronegativo. La densidad electrnica se representa alejada del carbono debido a la induccin ejercida por el grupo saliente, lo que hace que el tomo de carbono tenga una cierta carga positiva parcial.
Durante la transicin bimolecular en las reacciones SN2 entre el nuclefilo y el grupo saliente, Cul es la disposicin espacial del nuclefilo en la reaccin con el grupo saliente cuando los reactivo pasan a travs del estado de transicin en su transformacin en productos? Como se muestra en Esq. 2, el nuclefilo ataca al sustrato por la cara opuesta al enlace con el grupo saliente. Esto se denomina desplazamiento por la cara de detrs, o sustitucin con inversin de la configuracin.
_
R R C R R X R
_
Nu
C R R X Nu C R R
48
_ Nu:
nuclefilo
electrfilo
estado de transicin
producto
grupo saliente
Esq. 2::
Este mecanismo de reaccin muestra el cambio de configuracin estereoqumica que sufre una molcula durante una SN2
Obsrvese que las flechas que se usan para mostrar el movimiento del par de electrones van desde el nuclefilo rico en electrones hasta el tomo de carbono pobre en electrones, electrfilo. El carbono solo puede alojar ocho electrones en su capa de valencia, por lo que el enlace CX debe comenzar a romperse cuando el enlace NuC comienza a formarse. El grupo saliente X, se desprende con el par de electrones con el que estaba enlazado al tomo de carbono.
OBJETIVO GENERAL
Extraer la teobromina de la Cocoa para la posterior sntesis de la cafena.
O CH3 N N CH3 N O CH3I MeONa MeOH H3C N O N CH3 N N CH3
Cocoa en Polvo
extraccin
HN O
Teobromina
Caf eina
PARA ESTA SESIN: Extraer la Teobromina de la Cocoa en polvo mediante los procesos de extraccin ya estudiados.
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Los puntos a calificar en el Marco Terico, entre otros, son: 1) 2) 3) 4) Generalidades del chocolate (defina que es el Cacao y que es la Cocoa) Componentes qumicos que se encuentran en la Cocoa y sus proporciones. Propiedades de la teobromina Propiedades y generalidades de la cafena
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Cocoa en polvo (se consigue fcilmente
en tiendas de materias primas) Bata, lentes de seguridad, guantes de ltex. Agitador de vidrio 1 pipeta de 1.0 mL 1 perilla 3 pipetas pasteur y un bulbo Embudo de vidrio Tela de algodn o felpa
Metanol ter etlico Cloroformo MgO Sulfato de sodio anhidro.
____________________________________
Parrilla de calentamiento Cubetas y bombas de reflujo. matraces erlenmeyer de 250 mL matraces redondos de 250 mL boca
Algodn Vaso de precipitados de 50 mL Probeta de 50 o 100 mL Vidrio de reloj Papel filtro y tijeras 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Esptula delgada Franela. 3 mangueras de ltex (80 cm de largo) 1 soporte universal 2 pinzas de tres dedos con contrapinza o nuez. Escobilln, zacate y detergente.
refrigerantes entrada esperilada 24/40 Vasos de precipitados de 250 mL Rotavapor Embudo Buchner Matraz kitazato
esmerilada 24/40
50
1) Es de suma importancia que el alumno se cerciore de usar COCOA pura (sin algunos otros aditivos), esta se caracteriza por ser un polvo amargo, de color caf con olor caracterstico a chocolate. Este experimento no es exitoso si se usa otro producto comercial de chocolate ya que contiene varios aditivos que estropean los resultados. Durante el tiempo del reflujo, el Equipo Expositor comenzar seminario correspondiente. su
2) 3)
Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad guantes de ltex y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
4)
PROCEDIMIENTO
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9) En un vaso de precipitados de 250 mL homogenice 20 g de polvo de cocoa y 6 g de MgO (use agitador de vidrio para mezclar). Agregue 40 mL de agua corriente y 20 mL de metanol. Mezcle perfectamente. En la parrilla de calentamiento lleve la mezcla a sequedad total (temperatura 150 C). Se obtiene un slido grumoso. Transfiera la muestra solida a un matraz redondo de 250mL (boca esmerilada 24/40). Aada 60 mL de cloroformo. Prepare un sistema de reflujo. Use un refrigerante con boca 24/40. La mezcla se somete a reflujo constante por 30 min. Despus de este tiempo, quite con cuidado la parrilla de calentamiento y deje enfriar el matraz. Con ayuda de un embudo de vidrio y matraz erlenmeyer de 250 mL, filtre la mezcla de la siguiente forma: En un trozo de tela de algodn o afelpado (30x30 cm) filtre el disolvente del matraz sobre el embudo de vidrio, colocando el total de la masa slida en el centro de la tela, junte las esquinas de la tela y ejerza presin mecnica sobre la muestra para extraer el mximo de disolvente (use guantes de ltex). Evite cualquier partcula del slido en el filtrado color amarillo contenido en el matraz erlenmeyer. El slido recolectado en la tela se vuelve a verter en el matraz de bola, aada nuevamente otros 60 mL de cloroformo y realice otra extraccin a reflujo por 30 min. Filtre como lo hizo anteriormente. Al matraz erlenmeyer que contiene la recoleccin de extractos aada 2 g de sulfato de sodio anhidro. Agite vigorosamente. Filtre el disolvente sobre algodn y embudo de vidrio. Reciba el filtrado en un matraz redondo de 250 mL.
51
10)
11) 12)
13) 14)
Elimine el disolvente en el rotavapor. Se observara la aparicin de un slido. Vierta en el matraz redondo 1.0 mL de cloroformo raspando las paredes del matraz con ayuda de una esptula delgada, esto para concentrar el slido en el cloroformo. Con ayuda de una pipeta pasteur extraiga la solucin y colquelo en un vaso de precipitados de 50 mL.
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15) 16)
Vierta nuevamente 1.0 mL de cloroformo en el matraz redondo para recolectar el mximo del slido. Extraiga nuevamente con la pipeta pasteur y coloque en el vaso de precipitados. Adicione 40 mL de ter etlico en el vaso de precipitados. Permita la cristalizacin de la teobromina en el fondo del vaso por 45 minutos (evite cualquier movimiento en el vaso). En este paso, la teobromina es altamente insoluble en ter etlico lo que provocara que todos los dems componentes indeseables se solubilicen en el ter y la teobromina se separe en el fondo del vaso. Esto es por lo tanto, el paso de la purificacin. La teobromina comienza a cristalizar cerca de los 15 minutos.
17) 18)
19) 20)
Con una pipeta pasteur extraiga el mximo de disolvente. Evite succionar la teobromina cristalizada en el fondo del vaso. Adicione 3 mL de ter etlico al vaso de precipitados y con una pipeta pasteur limpia succione el slido y filtre sobre un papel filtro previamente pesado. Utilice embudo buchner y matraz kitazato en un sistema al vaco. Enjuague el vaso con otros 3 mL de ter etlico para extraer el mximo de la teobromina. Filtre. Lave la teobromina que se encuentra en el papel filtro con otros 10 mL de ter etlico. Seque el papel filtro sobre la parrilla de calentamiento a una temperatura moderada. Pese el papel filtro y por diferencia de pesos
21) 22) 23)
calcule el rendimiento. Guarde la teobromina en un frasco pequeo y limpio para la siguiente sesin.
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Prctica 6:
SINTESIS DE LA CAFEINA A PARTIR DE LA TEOBROMINA
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Parte 2:
Sustitucin Nucleoflica Bimolecular (SN2) Monitoreo de una Reaccin Qumica por TLC
OBJETIVO GENERAL
Extraer la teobromina de la Cocoa para la posterior sntesis de la cafena.
O CH3 N N CH3 N O CH3I MeONa MeOH H3C N O N CH3 N N CH3
Cocoa en Polvo
extraccin
HN O
Teobromina
Caf eina
PARA ESTA SESIN: 1) 2) 3) Sintetizar la cafena a partir de la teobromina por medio de una SN 2. Comprender en la prctica el principio de la SN2. Comprender el fundamente del seguimiento de una reaccin qumica por TLC.

Teobromina (practica anterior) Equipo de microescala 1 agitador magntico muy pequeo Bata, lentes de seguridad, guantes de ltex. Termmetro 2 pipeta de 1.0 mL 1 pipeta de 5.0 mL 1 perilla 3 pipetas pasteur y un bulbo Embudo de vidrio Algodn 1 tubo de ensaye de 15 cm con taparrosca. Probeta de 50 o 100 mL Vidrio de reloj 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Esptula delgada Franela. 3 mangueras de ltex (80 cm de largo) 1 soporte universal 2 pinzas de tres dedos con contrapinza o nuez. Escobilln, zacate y detergente. Es importante que para el desarrollo de la TLC consulte el material requerido segn lo especificado en la prctica No. 2
Metanol Metxido de sodio Yodometano Cloroformo Sulfato de sodio anhidro.
____________________________________ Parrilla de agitacin y calentamiento Cubetas y bombas de reflujo. Rotavapor
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1)
Nota para el profesor: El monitoreo de la reaccin puede ser seguida a temperatura ambiente o por catlisis calorfica (las observaciones realizadas para ambas se muestran ms adelante). El seguimiento de una o de otra estar sujeto a las consideraciones del profesor. Seguir la reaccin a temperatura ambiente aumentara las perspectivas del estudiante en el significado del monitoreo por TLC del avance de una reaccin, pero esto involucrara el gasto masivo de recursos como lo son las placas de TLC (el cual depende tambin del nmero de equipos en el laboratorio) as como un mayor tiempo en el desarrollo de la sesin de laboratorio. La otra propuesta es monitorear la reaccin en el minuto 10 a temperatura ambiente (donde se muestras aproximadamente el 50% de avance de la reaccin), posteriormente llevar la reaccin a catlisis calorfica durante 30 minutos (40 minutos de reaccin) y llevar a cabo un segundo monitoreo para observar la reaccin total (desaparicin de la teobromina y aparicin de la cafena); las ventajas para este ltimo es el entendimiento por el alumno del efecto calorfico en una reaccin SN2 (mayor reaccin a menor tiempo), el ahorro de recursos y tiempo en el desarrollo de la sesin. Una ltima propuesta es dividir y asignar a un determinado nmero de equipos el seguimiento de la reaccin a temperatura ambiente y otra por catlisis calorfica La reaccin por catlisis calorfica se lleva a cabo a una temperatura de 5060 C. Es importante que antes de comenzar con el procedimiento ya se tenga preparado el sistema de reflujo y calentamiento (bao de sal) a esta temperatura. Coloque 1/3 de sal de mesa en un vaso de precipitados de 50 mL. Para calentar la sal contenida en el vaso de precipitados use la parrilla de calentamiento. Use termmetro para monitorear constantemente la temperatura del bao de sal. Nota: Nunca infiera la temperatura del sistema por el lector o indicador de la parrilla de calentamiento, use siempre termmetro. El equipo expositor deber preparar 30 mL del sistema de elucin diclorometano/metanol 95:5 para ser usado por el resto del grupo. Use probeta para medir los disolventes. Guarde el sistema de elucin en un matraz erlenmeyer de 50 mL y tape con algodn. El profesor deber preparar la referencia de cafena pura disuelta en cloroformo (una pisca de cafena en 0.5 mL de cloroformo). Es importante que cada equipo guarde teobromina, la cual servir como referencia en el seguimiento de la reaccin por TLC. En un frasco muy pequeo coloque una pisca de teobromina y aada 2 gotas de metanol.
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2)
3)
4) 5)
Cuando vaya a aplicar la referencia de teobromina en la placa de TLC es importante que agite el frasco vigorosamente. 6) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad guantes de ltex y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
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7)
PROCEDIMIENTO
1) En el matraz redondo de 10 mL del equipo de microescala provisto con un agitador magntico pequeo disuelva 0.02 g de teobromina en 1.0 mL de MeOH. Observe que la teobromina no se disuelve en el metanol 2) Entonces adicione 0.015 g de metxido de sodio y agite moderadamente por un minuto (use parrilla de agitacin). Observe que la teobromina se ha disuelto completamente. La solucin torna a un color amarillo 3) Entonces vierta a la solucin 0.3 mL de yodometano. Es importante que este paso lo haga en la campana de extraccin; use guantes de ltex, lentes de seguridad y cubrebocas. Con el tapn de rosca, tape el matraz de reaccin. Comience la reaccin (agitacin magntica) y monitoreo por TLC. Si la reaccin se hace a temperatura ambiente monitoree la reaccin al minuto 10, 30, 50, 70 y 100.
4) 5)
Si la reaccin se lleva a cabo por catlisis calorfica entonces monitoree la reaccin de la siguiente forma: agite la reaccin a temperatura ambiente por 10 minutos y entonces monitoree la reaccin. Con el sistema de reflujo del equipo de microescala someta inmediatamente la reaccin a 5060 C por 30 minutos ms. Despus de este tiempo, quite cuidadosamente la fuente de calentamiento, deje enfriar el sistema de reflujo, quite el refrigerante y monitoree la reaccin por TLC. Es importante que para el desarrollo de la TLC (pinchado y corrimiento) cuide las observaciones descritas en la prctica No.2. Use capilares finos para la toma de muestras. En la placa de TLC marque tres puntos de aplicacin con un grafito (lpiz), a la primera identifquela con la letra T (teobromina) a la segunda con la letra C (cafena) y a la tercera como R (reaccin). Use un capilar para cada una de ellas para evitar contaminacin cruzada. Cuando pinche las aplicaciones de referencia de teobromina y cafena cercirese bajo la luz UV que la intensidad (concentracin) de dichas aplicaciones es la adecuada. Para realizar la aplicacin de la reaccin en la TLC, destape la reaccin, extraiga una alcuota con el capilar y coloque solo una pinchada en la TLC (se ha observado que una sola pinchada en la TLC es suficiente para una mejor resolucin en la lectura de la misma). Para esta ocasin use un sistema de elucin Diclorometano/Metanol 95:5 (preparada por el equipo expositor) Una vez que corra la TLC en la cmara de elucin, sople sobre la TLC para evaporar el disolvente y observe bajo luz UV. Marque con un grafito las manchas observadas. Haga un dibujo en su bitcora, calcule el Rf para cada mancha observada.
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A continuacin se muestran las observaciones esperadas por el alumno para el monitoreo de la reaccin a temperatura ambiente. Nota: el alumno deber anotar sus propias observaciones percibidas en su bitcora.
Porcentaje estimado en TLC de los compuestos en la reaccin a temperatura ambiente % de % de Minuto Teobromina Cafena 0 100 0 10 50 50 30 30 70 50 20 80 70 15 90 100 0 100
59
120 100 80 60 40 20 0 0.0 10.0 30.0 50.0 70.0 100.0 % estimado de teobromina % estimado de cafeina
Las observaciones en TLC que el alumno podra esperar para la reaccin a temperatura ambiente as como para la reaccin en catlisis calorfica se muestran a continuacin: T= Teobromina; C= Cafena; R= Reaccin en proceso
30 min 50 min 70 min 90-100 min
60
10 min
Temperatura Ambiente
T C R T C R T C R T C R
Temperatura Ambiente
DCM/MeOH 95:5
Rf = 0,45 Rf = 0,35
40 min
50-60 C
T C R
T C R
El alumno podr notar tambin en la TLC que en la aplicacin de la reaccin se observa un subproducto en la parte inferior (Rf=0.1) el cual se elimina durante el work-up de la misma (siguientes pasos). 6) 7) 8) 9) Una vez que se ha observado reaccin total, el metanol de la reaccin se evapora en el rotavapor. Posteriormente se adiciona 1.0 mL de cloroformo agitando ligeramente y manualmente el matraz para disolver el producto. Con una pipeta pasteur extraiga la solucin y colquela en un tubo de ensaye de 15 cm con tapon de rosca. Adicione al tubo 3 mL de agua corriente, tape el tubo con el tapn de rosca y agite vigorosamente.
10)
Con otra pipeta pasteur limpia extraiga cuidadosamente la fase orgnica (inferior) y hgala pasar por una cama de sulfato de sodio anhidro en un embudo de vidrio soportado en algodn. Reciba el filtrado en un matraz limpio redondo de 10 mL previamente pesado.
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11) 12) 13) 14) 15)
Aada otro mililitro de cloroformo al tubo de ensaye, agite, extraiga y vuelva a pasar por el mismo sulfato de sodio. Vierta 4 mL de cloroformo sobre el sulfato de sodio recolectando siempre en el matraz redondo. Entonces rotaevapore el disolvente a sequedad total. Observe la formacin de cristales sedosos y blancos de cafena. Pese el matraz y por diferencia de pesos calcule el rendimiento. Determine el punto de fusin y comprelo con el reportado en la literatura.
CUESTIONARIO
1) Explique en trminos fisicoqumicos por que la reaccin es acelerada o catalizada cuando se somete energa calorfica.
2) 3)
Cul es el fundamento de hacer pasar la solucin de la muestra por sulfato de sodio anhidro? Proponga otro mtodo de sntesis para metilar la teobromina a la cafena.
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Prctica 7:
SINTESIS DE SABORIZANTES FRUTALES:
ESTERIFICACION DE FISHER
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INTRODUCCION
LA QUMICA DEL AROMA Y EL SABOR: or ms que los nutrilogos o entusiastas de la alimentacin para la salud deseen lo contrario, lo que elogiamos de una comida o alimento en general, es su aspecto, aroma y sabor y no su riqueza en nutrientes. Esta actitud de los comensales no es tan torpe como pudiera parecer a primera vista. Los rganos de los sentidos implicados en la deteccin del aroma y sabor, evolucionaron para desempear una funcin esencial: establecer qu era y qu no era adecuado como alimento. Como regla general, la palatabilidad al consumir un alimento traduce su valor nutritivo.
Se considera al sabor como una propiedad de los lquidos, slidos y gases en disolucin que se detectan en la boca a travs de las clulas receptoras localizadas tanto en las papilas gustativas de la lengua como en otras partes de la cavidad bucal. El aroma se considera una propiedad de las sustancias voltiles que es detectada por las clulas receptoras del sistema olfatorio de la nariz. El inters fundamental de la qumica en el flavor (aroma-sabor) de los alimentos es la identificacin de las sustancias concretas responsables de los elementos constitutivos del mismo as como identificar las estructuras qumicas que desencadenan una particular respuesta en nuestros rganos de los sentidos. El qumico se encuentra a numerosas dificultades en la investigacin del flavor. El primer problema consiste en la inexistencia de sondas fsicas o qumicas que puedan detectar especficamente las sustancias de inters. No existe el equivalente para el flavor a los espectrofotmetros, que cuantifican la absorcin de la luz de distintas longitudes de onda por los pigmentos. Aqu, solo el xito de un mtodo
analtico puede depender de la experiencia de un equipo de degustacin entrenado o de la nariz de un experimentador. Una segunda complicacin puede deberse a que un flavor en particular dependa de la combinacin de varias sustancias qumicas en proporciones especficas. Una de las principales biosntesis dentro de los frutos para la obtencin de sus componentes aromticos y saborizantes es a partir de los aminocidos gracias a la accin de las proteasas a travs de reacciones de desaminacin, descarboxilacin, reduccin y esterificacin con lo cual se sintetizan diversos esteres como el acetato de isoamilo tpico en el platano, butirato de metilo en manzanas, butirato de etilo en pia y manzana, acetato de octilo en naranja, etc. (Fig. 1 y Esq. 1)
Fig. 1: Esteres presentes en frutas.
O (CH3)2CHCH2CH2O Acetato de isoamilo (platano) O H3CH2CO CH2CH2CH3 CH3(CH2)6CH2O CH3 H3CO O CH2CH2CH3
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Butirato de Metilo (manzana)
O CH3
Butirato de Etilo (pia)
Acetato de Octilo (naranja)
Esq. 1:
Biognesis del acetato de isoamilo por conversin enzimtica de aminocidos (Leucina).

O O CO2 NH2 OH O C CH2 CH CH3 CH3 OH H CH2 O H3C C SCoA C O CH2 CoSAH CH2 CH CH3 CH3 OCH3
H2N
CH C CH2 CH CH3 CH3
CH2 CH CH3 CH3
L-Leucina
acetato de isoamilo (platano)
LA ESTERIFICACIN DE FISHER: La esterificacin de Fischer-Speier o esterificacin de Fischer es un tipo especial de esterificacin que consiste en la formacin de un ster por reflujo de un
cido carboxlico y un alcohol, en presencia de un catalizador cido. La reaccin fue descrita por vez primera por Emil Fischer y Arthur Speier en 1895. La mayora de cidos carboxlicos son aptos para la reaccin, pero el alcohol debe ser generalmente un alcohol primario o secundario. Los alcoholes terciarios son susceptibles a la eliminacin, y los fenoles suelen ser muy poco reactivos para dar rendimientos tiles. Los catalizadores ms comnmente usados para una esterificacin de Fischer incluyen al cido sulfrico, cido tsico y un cido de Lewis como el triflato de escandio(III). Para sustratos ms valiosos o sensibles (por ejemplo, biomateriales), suele usarse DCC. La reaccin suele llevarse a cabo sin un solvente, particularmente cuando hay un gran exceso de reactante, o en un solvente no polar. Los tiempos de reaccin comunes varan de 1 a 10 horas a temperaturas de 60-110C.
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OBJETIVO GENERAL
Sintetizar el acetato de isoamilo (pltano), butirato de metilo (manzana), butirato de etilo (pia) y el acetato de octilo (naranja) como saborizantes/aromatizantes naturales mediante la Esterificacin de Fisher.
O R1 OH + HO C R2
alcohol cido car boxilico
H+ cat.
O R1O C R2
ster
H2O
agua
1) Comprender y conocer los factores que intervienen en una sntesis qumica como la estequiometria, temperatura, catlisis, etc. 2) Comprender el fundamento de la Esterificacin de Fisher. 3) Conocer y comprender el work-up (tratamiento) de una reaccin, como son: neutralizacin de cidos, separacin de fases, desecacin, destilacin, etc.
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo.
Por lo tanto, los puntos a calificar en el Marco Terico son: 1) Saborizantes en la industria alimenticia. 2) Fundamento de las reacciones de condensacin de los cidos carboxlicos con los alcoholes (Esterificacin de Fisher). 3) Mecanismo general de la Esterificacin de Fisher
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4) Propiedades de los cidos carboxlicos y alcoholes. 5) Sustancias qumicas usadas para la desecacin de fases orgnicas y su fundamento. 6) Caractersticas de cualquier Reaccin Cataltica y un catalizador

Equipo de microescala. Bata, lentes de seguridad, guantes de
ltex y cubrebocas Termmetro Cinta tefln 1 vaso de precipitados de 50 mL. 1 matraz erlenmeyer de 100 mL 2 pipetas de 2.0 mL 1 perilla Sal de mesa. 3 pipetas pasteur y un bulbo 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Esptula. Franela. 2 mangueras de ltex (80 cm de largo) 1 soporte universal 2 pinzas de tres dedos con contrapinza o nuez. Escobilln, zacate y detergente.
Alcohol etlico Alcohol isoamilico Metanol Octanol cido actico glacial (>98%) cido sulfrico concentrado (>98%) cido butrico Bicarbonato de sodio Sulfato de sodio anhidro.
____________________________________ Parrilla de calentamiento Cubetas y bombas de reflujo. 1 matraz erlenmeyer de 250 mL
1)
PRECAUCION: EL ACIDO SULFRICO Y ACETICO SON ALTAMENTE CORROSIVOS Y DESPRENDEN GASES LOS CUALES QUEMAN AL CONTACTO LAS VAS RESPIRATORIAS SI SE INHALAN. TRABAJE SIEMPRE ESTOS COMPUESTOS EN LA CAMPANA DE EXTRACCION, USE GUANTES, LENTES DE SEGURIDAD, CUBREBOCAS Y BATA.
2) 3) 4)
El cido butrico desprende un olor ftido penetrante, por lo que se recomienda evitar mancharse con la ropa. Durante el tiempo del reflujo, el Equipo Expositor comenzar seminario correspondiente. su
67
El equipo expositor deber preparar 170 mL de bicarbonato de sodio al 10% para uso de todo el grupo. Pida al responsable del laboratorio un matraz erlenmeyer de 250 mL. Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
5)
6)
PROCEDIMIENTO
Tabla 1: Condiciones de reaccin para la Esterificacin de Fisher
Alcohol A
Acido B
O
Ester
O
(CH3)2CHCH2CH2OH alcohol isoamilico 1.0 mL
HO
CH3
H
95-100 C
(CH3)2CHCH2CH2O Acetato de isoamilo (platano)
CH3
cido actico 1.0 mL O
68
CH3OH metanol 0.6 mL
H
75-80 C H3CO
CH2CH2CH3 HO cido butrico 1.0 mL O
CH2CH2CH3
Butirato de Metilo (manzana) O
CH3CH2OH etanol 0.9 mL
CH2CH2CH3 HO cido butrico 1.0 mL O
H
75-80 C H3CH2CO CH2CH2CH3 Butirato de Etilo (pia) O
H
CH3(CH2)6CH2OH n-octanol 1.0 mL
HO
CH3
CH3(CH2)6CH2O 95-100 C
CH3
cido actico 0.7 mL
Acetato de Octilo (naranja)
Rol de Equipos: Equipos 1-7: Sntesis del sabor pltano Equipos 8: Sntesis del sabor manzana Equipos 9: Sntesis del sabor pia Equipos 10: Sntesis del sabor naranja 1) 2) Monte el equipo de reflujo. Prepare el bao de sal y con la ayuda de su termmetro mantenga la temperatura especificada en la Tabla 1 (segn sea el caso). Coloque 1/3 de sal de mesa en el vaso de precipitados de 50 mL. Para calentar la sal contenida en el vaso de precipitados use la parrilla de calentamiento. Use termmetro para monitorear constantemente la temperatura del bao de sal. Nota: Nunca infiera la temperatura del sistema por el lector o indicador de la parrilla de calentamiento, use siempre termmetro.
3)
En el matraz cnico de 5.0 mL del equipo de microescala se mezclan el alcohol A y el cido B en base a las cantidades especificadas en la Tabla 1 (segn sea el caso). Se adicionan 2 gotas de cido sulfrico concentrado. Verifique que la concentracin del cido sulfrico no sea menor al 98% Coloque el matraz en el sistema de reflujo y bao de sal. Se recomienda sellar con cinta tefln para evitar fugas inesperadas.
69
4) 5) 6)
Comience la reaccin a reflujo por 50 min. Es importante medir la temperatura constantemente con el termmetro, se ha observado para la sntesis del saborizante de pia y manzana que un aumento de la temperatura especificada lleva a rendimientos bajos del producto, visualmente la reaccin puede tornar a un color caf-oscuro, en condiciones normales este cambio de color no debe ocurrir. En el caso del acetato de isoamilo el cambio a un color caf es normal. Despus de este tiempo la mezcla se saca del bao de sal y se deja enfriar a temperatura ambiente. En este paso observe la formacin de dos fases, la fase inferior (de menor proporcin) corresponde al agua formada como subproducto de la reaccin. Con una pipeta de 2.0 mL vierta lentamente 2.0 mL de bicarbonato de sodio al 10% (tenga cuidado, la mezcla de reaccin producir violentas burbujas de CO2 que podran expulsar el producto contenido en el matraz). Espere un momento. Con su dedo pulgar (se supone que usted porta guantes ltex) tape la boca del matraz y haga movimientos de 180 arriba y abajo. Entonces con ayuda de una Pipeta Pasteur extraiga cuidadosamente la fase acuosa (inferior) y deseche. Repita este paso 6 veces ms. En las ltimas dos extracciones, la agitacin con el dedo pulgar hgalo vigorosamente. El producto se seca aadiendo 0.6 g de sulfato de sodio anhidro, se agita el matraz. Con otra pipeta pasteur se extrae cuidadosamente (sin extraer partculas de Na2SO4) el producto desecado y se transfiere a un frasco pequeo previamente pesado. Por diferencia de pesos se calcula el rendimiento.
7)
8)
9) 10)
CUESTIONARIO
1) 2) 3) 4) Explique que es una reaccin cataltica? En caso de no disponer del cido sulfrico, Qu otro cido se puede utilizar? Por qu se hacen los lavados con bicarbonato de sodio? Escriba la ecuacin qumica. En el paso 8 se describi que la fase acuosa es la que se encuentra en la parte inferior y la fase orgnica en la parte superior. En cualquier otro caso, Cmo podemos saber que fase es la acuosa y que fase es la orgnica? Explique el fundamento fisicoqumico de usar temperaturas en una reaccin qumica.
70
5)
Prctica 8:
SINTESIS DE LA ERITROSINA B:
UN COLORANTE ARTIFICIAL ALIMENTICIO
71
Parte 1:
Obtencin de la FLOURESCENA como intermediario
.
INTRODUCCION
tro de los aditivos alimentarios ms importante y usado en la industria alimentaria son los colorantes. El color en los alimentos es muy importante para el consumidor, ya que, siendo el primer contacto que tiene con ellos, es determinante para la aceptacin o rechazo de los mismos. El color representa una parte esencial en la vida cotidiana del hombre desde los aspectos sociales, culturales, ambientales, etc. el color se basa en una serie de procesos fsicos, qumicos, fisiolgicos y psicolgicos. Esta percepcin es especialmente evidente en el rea alimentaria, donde la relacin entre el color y el sabor son muy importantes para que el consumidor adquiera un producto. Un producto puede ser sustituido por otro si este no cumple con las propias normas de calidad del consumidor, como el no tener un color homogneo y consistente, por lo que se busca siempre una apariencia natural.
Los colorantes usados en la industria alimenticia se clasifican principalmente en naturales y sintticos (Esq. 1) Ya al principio del curso, separamos los pigmentos de los extractos vegetales los cuales son usados tambin como colorantes naturales en los alimentos. Como el alumno se habr dado cuenta, el uso de colorantes naturales a niveles industriales presenta algunos inconvenientes: Los rendimientos de la fuente natural son muy bajos y algunos de ellos (como las clorofilas) se descomponen fcilmente por el efecto de la luz (fotosensibles); esto se traduce como materias primas poco rentables.
Clorofila Vegetales Orgnicos Animales Carotenoides Antocianinas Betalanas Flavonoides cido carmnico Naturales Otros cido kermsico Otros Dixido de titanio Colorante Inorgnicos Minerales Negro carbn Otros Xantenos Sintticos Orgnicos Azo Antraquinonas
Esq. 1: Clasificacin de los colorantes alimenticios
72
Otros
La ERITROSINA B es un xanteno y es el principal colorante (rojo) certificado para uso en la industria alimenticia a nivel mundial, ste se usa principalmente en confiteria, helados, cremas, bebidas y jarabes; estadsticas describen que de todos los productos alimenticios usados en la industria para teir a los alimentos color rojo, el 30% de estos usan a la eritrosina como colorante de eleccin. La eritrosina est catalogada en la Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (FD&C) como Red No. 3; por el Sistema Internacional de Numeracin (INS) bajo el cdigo E-127, segn lo determinado por el rgano correspondiente del Codex Alimentarius y por el Colour Index con el No. 45430.
Eritrosina B
Flouresceina
La eritrosina B se obtiene principalmente de la FLUORESCENA. La fluorescena es una sustancia colorante orgnica utilizada en el examen de los vasos sanguneos del ojo y en ciertas tcnicas odontolgicas. Fue descubierta por el Premio Nobel de Qumica (1905) Johann Adolf von Baeyer (1835-1917). La
fluorescena es una sustancia colorante orgnica hidrosoluble de color amarillo perteneciente al grupo de las xantinas que produce un color fluorescente verde intenso en soluciones alcalinas (con pH mayor a 7). Cuando se expone a la luz (principalmente a la luz UV), la fluorescencia absorbe ciertas longitudes de onda y emite luz fluorescente. La reaccin ms importante de los compuestos aromticos es la Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA), donde un electrfilo (E+) reacciona con un anillo aromtico y sustituye uno de los hidrgenos: ArH + EX ArE + HX
Donde Ar es un
73
compuesto aromtico y E un electrfilo.
Mediante este tipo de reaccin es posible anexar distintos sustituyentes al anillo aromtico. Se le puede Halogenar (-F, -Cl, -I, -Br,), Nitrar (-NO2), Sulfonar (SO3H), Alquilar (-R), etc. Todas estas reacciones pueden ser llevadas a cabo seleccionando los reactivos y condiciones apropiadas. Al igual que el alqueno, el benceno tiene nubes de electrones arriba y debajo de los enlaces que forman el anillo. Aunque los electrones del benceno toman parte de un sistema aromtico estable, permanecen disponibles para atacar un electrfilo fuerte y producir un carbocation (Esq. 2). Este carbocatin estabilizado por resonancia se le llama complejo , por que el electrfilo est unido al anillo de benceno por un nuevo enlace . El carbocatin es no aromtico, porque el tomo de carbono hibrido sp3 interrumpe al anillo de orbitales p. Esta falta de aromaticidad contribuye a que el ataque electrfilo sea muy endotrmico. El complejo recupera la aromaticidad, por la prdida del protn en el tomo de carbono tetradrico, que origina un producto de sustitucin.
Fig. 2
Los electrones del benceno atacan un electrfilo fuerte dando un carbocatin estabilizado por resonancia, que se llama complejo . La prdida de un protn forma el producto de sustitucin y regenera al sistema aromtico.
La formacin del complejo determina la velocidad y el estado de transicin que conduce a dicha formacin, ocupa el punto mximo en el diagrama de energa (Esq. 3). Este paso es muy endotrmico debido a que forma un carbocatin no aromtico. El segundo paso es exotrmico y se recupera la aromaticidad, adems se origina una molcula de H-X. La reaccin general es exotrmica.
74
Esq. 3
El diagrama de energa de la SEA indica que el primer paso es endotrmico y determinante en la velocidad y que el segundo paso es muy exotrmico.
La sntesis de eritrosina propuesta para esta prctica est basada en el trabajo publicado por McCullagh y Daggett en el 2007 en la revista Journal of Chemical Education (Synthesis of Triarylmethane and Xanthene Dyes Using Electrophilic Aromatic Substitution Reactions) (ver bibliografa).
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar la Eritrosina B a partir de la Fluorescena como intermediario mediante la Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA). (Dos sesiones)
O HO O O anhidrido f talico OH HO O O HO O OH
+ 2
Resorcinol I NaO
H 180-190 C
COOH
O O
I O O I COONa
Flourescena
4I2, NaI, NaHCO3 100 C
Eritrosina B
PARA ESTA SESIN: 1) 2) 3) Sintetizar la Fluorescena a partir del anhdrido ftlico y resorcinol. Verificar la fluorescencia en condiciones bsicas de la fluorescena mediante la incidencia de luz UV. Entender y comprender la reaccin de Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA) y las condiciones necesarias de reaccin.
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MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Por lo tanto, los puntos a calificar en el Marco Terico entre otros son: 1) Generalidades de la Sustitucin Electrofilica Aromtica 2) Generalidades de los colorantes alimenticios. 3) Generalidades de la Eritrosina B 4) Generalidades de la Fluorescena 5) Mecanismo de reaccin.

Bata, lentes de seguridad y guantes de latex 1 termmetro 2 tubos de ensaye grandes (15 cm) con tapa de rosca. Algodn Papel filtro y tijeras 1 tubos de ensaye de 15 cm 1 agitador de vidrio 1 pipeta 1 mL. 1 perilla
Anhdrido ftlico Resorcinol Acido sulfrico
------------------------------------------------------------- Parrillas de calentamiento. Embudos buchner Matraces kitazato Lmpara de UV _______________________________________
Qumico Farmacutico Biotecnlogo Equipo expositor: 1 bolsa de hielo
2 vaso de precipitados de 50 mL Sal de mesa Esptula 1 vidrio de reloj para pesar los reactivos 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Franela, escobilln, zacate y detergente.
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. El equipo expositor deber preparar 20 mL de HCl al 60% y 100 mL de NaOH al 15% para todo el grupo. Asesrese con el profesor. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata y lentes de seguridad es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
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2) 3)
PROCEDIMIENTO
SINTESIS DE LA FLUORESEINA
1)
En un vaso de precipitados de 50 mL, prepare un bao de sal a una temperatura constante de 125-130 C sobre una parrilla de calentamiento (use siempre termmetro para medir la temperatura del bao de sal). En un tubo de ensaye de 15 cm con rosca mezcle 0.1 g de anhdrido ftlico y 0.15 g de resorcinol. Agite el tubo para homogenizar la muestra. En la campana de extraccin, y con ayuda de una pipeta, agregue 2 gotas de cido sulfrico concentrado (al 98%). Acerque la punta de la
2) 3)
pipeta a la mezcla de los reactivos, evite que el cido corra por las paredes. 4) 5) 6) Tape el tubo de ensaye sin sellar hermticamente. Sumerja el tubo de ensaye al bao de sal por 30 min (asegrese que la temperatura permanezca en todo tiempo a 125-130 C). Observaciones durante la reaccin: Durante la reaccin se observara la fundicin de los reactivos hasta la formacin de una masa solida muy oscura. En la superficie se podr apreciar un tono ligeramente metlico. Despus de este tiempo saque el tubo y deje enfriar la reaccin (aun no apague el calor del bao de sal). Aada 2.0 g de hielo finamente picado y agite vigorosamente. NOTA: El alumno se dar cuenta que la mezcla demuestra ser una masa muy slida totalmente adherida a las paredes del tubo de ensaye (verifique esto con ayuda del agitador de vidrio, no trate de despegar el slido del tubo) para nuestro procedimiento, esto es bueno, entonces contine con los siguientes pasos. Adicione 5 mL de agua corriente, agite vigorosamente, decante y deseche (evite perder producto solido). Entonces adicione otros 3 mL de agua y 1.0 mL de HCl al 60 % Caliente el tubo a 125-130 C por 5 min (tape sin sellar hermticamente). Decante nuevamente y deseche. Adicione 3.0 mL de agua y solo 3 gotas de HCl al 60%, tape el tubo sin sellar, y entonces sumerja nuevamente el tubo al bao de sal a 125130 C hasta que la fluorescena se desadhiera del tubo de ensaye. Observaciones: Note que el slido comienza a desintegrarse en un polvo fino que precipita en el fondo del tubo. La solucin comienza a cambiar a un color marrn. Saque el tubo y deje enfriar.
77
7)
8) 9) 10) 11)
12)
13)
Se ha observado que esto no ocurre cuando se manejan cantidades mayores a los 0.2 g de anhdrido ftlico, ya que el slido formado no es adherible a las paredes. Si esto ocurre, aada poca cantidad de la solucin de HCl (pues la fluorescena es soluble en esta), filtre y lave.
14) Filtre el slido sobre un papel filtro previamente pesado con ayuda del alto vacio (usar embudo buchner/matraz kitazato). Lave el producto con 30 mL de agua helada. Espere hasta sequedad del producto. 15) Pese el papel filtro y por diferencia de pesos calcule el rendimiento. 16) Se obtiene un polvo rojizo-marrn. Guarde el producto en un frasco limpio. Prueba de fluorescencia: 17) En otro tubo de ensaye de 15 cm coloque 10 mL de una solucin de NaOH al 15% 18) Aada una pisca de fluorescena. Agite hasta que la fluorescena se disuelva. 19) En un ambiente oscuro haga incidir luz UV a la solucin y observe lo que pasa. Anote y tome fotografa para su reporte.
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CUESTIONARIO
1) Explique en trmino fsicos Por qu la fluorescena emite fluorescencia cuando se hace incidir una longitud de onda corta como la luz UV? 2) La fluorescena al ser un compuesto orgnico, Por qu es soluble en agua? 3) Es ms comn que una reaccin qumica se lleve a cabo con ayuda de un disolvente para mejorar la interaccin entre las molculas y disociacin de iones. En este caso la reaccin se hizo en ausencia de disolvente, entonces Qu factor fue determinante para que la reaccin fuese exitosa? 4) De otros ejemplos de colorantes de la familia de los xantenos.
BIBLIOGRAFIA
1) 2) McCullagh, J. V.; Daggett, K. A., Synthesis of Triarylmethane and Xanthene Dyes Using Electrophilic Aromatic Substitution Reactions. J. Chem. Edu. 2007, 84,11, 1799-1802 Markow, P. G. et al. A Global Perspective on the History, Use, and Identification of Synthetic Food Dyes. J. Chem. Edu., 2011, 88, 1, 24-28.
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Prctica 9:
UN COLORANTE ALIMENTICIO
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Parte 2:
YODACIN de la FLOURESCENA
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar la Eritrosina B a partir de la Fluorescena como intermediario mediante la Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA). (Dos sesiones)
O HO O O anhidrido f talico OH HO O O HO O OH
+ 2
Resorcinol I NaO
H 180-190 C
COOH
O O
I O O I COONa
Flourescena
4I2, NaI, NaHCO3 100 C
Eritrosina B
PARA ESTA SESIN: 1. Sintetizar la Eritrosina B mediante la yodacin de la fluorescena en condiciones bsicas.
2. Sintetizar la eritrosina B a travs de una Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA). 3. Conocer y comprender el comportamiento de solubilidad de los compuestos orgnicos y sus sales en medios acuosos y orgnicos. .
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I2 NaHCO3 NaI Agua destilada ter etlico Sulfato de sodio anhidro Tiosulfato de sodio

Bata, lentes de seguridad y guantes de ltex Fluorescena (practica anterior) 2 vasos de precipitados de 50 mL 1 termmetro Sal de mesa 1 tubo de ensaye grande (15 cm) con tapa de rosca Esptula delgada Vidrio de reloj Agitador de vidrio 3 pipetas de 1.0 mL 1 pipeta de 10 mL 2 matraces erlenmeyer de 50 mL Algodn. Embudo de vidrio de tallo corto. 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Franela, escobilln, zacate y detergente.
--------------------------------------------------------------
Parrillas de calentamiento. Embudos buchner Matraces kitazato Embudos de separacin de 60 mL con tapa Rotavapor con matraz redondo de 50 mL
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) El equipo expositor deber preparar 15 mL de tiosulfato de sodio al 10%, 15 mL de HCl al 40% y 20 mL de NaOH al 15% para todo el grupo. Asesrese con el profesor. 3) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El
uso de bata y lentes de seguridad es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
PROCEDIMIENTO
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1) En un vaso de precipitados de 50 mL, prepare un bao de sal a una temperatura constante de 120 C sobre una parrilla de calentamiento (use siempre termmetro para medir la temperatura del bao de sal). 2) En un tubo de ensaye grande de 15 cm agregue 0.05 g de fluorescena, 0.126 g de NaHCO3, 0.04 g de NaI y 0.152 g de I2. Si el yodo se presenta en forma de perlas, macerar con ayuda del agitador de vidrio. 3) Por ltimo agregue 1.0 mL de H2O destilada y tape ligeramente el tubo sin sellar hermticamente para evitar una fuerte presin dentro del tubo. El tubo deber tener tapn con rosca o podr usarse un corcho de tal medida. 4) Sumerja el tubo en el bao de sal (mantenga constante la temperatura, use termmetro). 5) Caliente el tubo durante 45 min. 6) Observaciones durante la reaccin: La mezcla de reaccin comenzar a burbujear y tornar a un color rojo intenso. Si se agita el tubo se podr apreciar un tono rosa en las paredes del tubo. 7) Despus de este tiempo, saque el tubo del bao de sal y deje enfriar. 8) Agregue 1.0 mL de una solucin de tiosulfato de sodio al 10%. Agite durante 30 s. 9) Vierta al tubo 7.0 mL de agua corriente y transvase a un embudo de separacin de 60 mL. Repita esta operacin. 10) Aada 20 mL de ter etlico. Observe las dos fases: La fase acuosa (inferior) presenta un color rojo profundo pues contiene a la eritrosina B. La fase orgnica (superior) permanece incolora.
11) Aada lentamente 1.0 mL de HCl al 40%. Tape el embudo, agite vigorosamente hasta que la eritrosina B pase de la fase acuosa a la fase orgnica. Elimine la presin. Observe que ahora la fase acuosa permanece incolora y la fase orgnica con un color naranja. 12) Separe las fases. Reciba la fase acuosa en un matraz erlenmeyer de 50 mL, neutralice con bicarbonato de sodio (hasta ya no ver aparicin de CO2) y deseche a la tarja.
83
13) Reciba la fase orgnica en un matraz erlenmeyer de 50 mL y deseque con 1.0 g de sulfato de sodio anhidro agitando moderadamente. 14) Filtre la solucin sobre algodn y embudo de vidrio de tallo corto, reciba el filtrado en un matraz redondo para rotavapor de 50 mL (proporcionado por el laboratorio). Enjuague el matraz erlenmeyer con otros 15 mL de ter etlico y repita este paso. 15) Destile el disolvente en rotavapor. 16) Con ayuda de una esptula delgada, raspe el matraz y transfiera el slido color naranja a un vidrio de reloj para pesar el producto. Anote el peso. 17) Vierta el producto en un vaso de precipitados de 50 mL y regenere la eritrosina B en base a la siguiente relacin: 1.5 mL de NaOH al 2%: 0.1 g de producto naranja. Cercirese que el vaso permanezca en todo tiempo diagonalmente, esto para provocar el agrupamiento de los reactivos y su fcil interaccin.
18) Adicione la solucin de NaOH agitando el contenido del vaso con ayuda de un agitador de vidrio o esptula. Homogenice completamente el slido en la solucin de NaOH. Observe el cambio de color naranja a rojo-rosado (regeneracin de la eritrosina B). 19) Evapore a sequedad sobre la parrilla de calentamiento a una temperatura no mayor a 60 C. 20) Raspe la eritrosina B y pese para obtener el rendimiento.
CUESTIONARIO
1) En el paso (6) Por qu la reaccin genera burbujas?
2) En el paso (8) Por qu se agrega tiosulfato de sodio a la reaccin? 3) En el paso (11) Por qu es necesario pasar la eritrosina B de la fase acuosa a la fase orgnica? Considere que en este paso la eritrosina B ya estaba formada, pudimos haber evaporado a sequedad el agua y obtener el slido deseado, si esto fuera as Qu hubiese pasado con el rendimiento experimental? Explique. 4) Escriba la ecuacin qumica que ocurre para la eritrosina B cuando se adiciona HCl en el paso (11) 5) En el paso (18) por qu decimos que la eritrosina B se regenera cuando agregamos NaOH? Escriba la ecuacin qumica.
84
Prctica 10:
SINTESIS DE UN CONSERVADOR Prctica 7 ALIMENTICIO:
REACCION DEL HALOFORMO
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INTRODUCCION
CONSERVADORES QUMICOS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA: odos los alimentos, ya sea de origen vegetal o animal, estn compuestos por materia orgnica, es decir, provienen de clulas vivas, por lo tanto, estn sujetos a factores fsicos, qumicos y biolgicos de degradacin y descomposicin. Dentro de los factores biolgicos, los microorganismos son considerados como los agentes principales del deterioro de los alimentos. Los mtodos de conservacin de alimentos se clasifican en tres grupos principales: Mtodos Fsicos (Ej. Esterilizacin o Pasteurizacin), Mtodos Biolgicos (Fermentacin) y Mtodos Qumicos. En estos ltimos, son considerados como aditivos alimentarios, que aadidos a los alimentos detienen o minimizan el deterioro causado por la presencia de diferentes tipos de microorganismos (bacterias, levaduras y mohos).
Se sabe con certeza que ms del 20% de todos los alimentos producidos en el mundo se pierden por accin de los microorganismos y, por otra parte, estos alimentos alterados pueden resultar muy perjudiciales para la salud del consumidor, por lo tanto el primer empleo es el de evitar el deterioro. Los alimentos en mal estado pueden llegar a ser extremadamente venenosos y perjudiciales para la salud de los consumidores, un ejemplo de esto es la toxina botulnica generada por la bacteria Clostridium botulinum que se encuentra presente en las conservas mal esterilizadas, embutidos, as como en otros productos envasados, esta sustancia se trata de una de las ms venenosas que se conocen (incluso puede ser ms txica que el cianuro en una misma dosis). La accin conservante del cido benzoico fue descrita por primera vez en el ao de 1875, por H. Fleck, al intentar encontrar un sustituto del entonces ya familiar cido saliclico. Fue Fleck quien estableci una relacin entre la accin de ambos cidos y la del fenol. A diferencia del cido saliclico, el cido benzoico no pudo
inicialmente producirse sintticamente en grandes cantidades, por lo que, hasta el cambio de siglo, no pudo ser introducido en la conservacin de los alimentos. Desde entonces, ha sido un conservante ampliamente usado en todo el mundo, principalmente debido a su bajo precio. El cido benzoico ha sido catalogado por el Sistema Internacional de Numeracin (INS) bajo el cdigo E-210, segn lo determinado por el rgano correspondiente del Codex Alimentarius. LA REACCIN DEL HALOFORMO Y LA GENERACIN DE CIDOS CARBOXLICOS: La reaccin del haloformo es una reaccin orgnica en la que se produce un haloformo (CHX3, donde X es un halgeno) por halogenacin exhaustiva de una metilcetona (una molcula que contiene el grupo R-CO-CH3) en presencia de una base. R puede ser hidrgeno, un alquilo o un arilo.
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En esta reaccin dos productos son formados: (1) un haloformo, como son CHCl3, CHBr3 o CHI3 dependiendo del halgeno usado; y (2) un cido carboxlico que muestra la prdida de un tomo de carbono a la cetona de partida. Esta reaccin fue usada tradicionalmente para determinar la presencia de una metilcetona, o un alcohol secundario oxidable a metil cetona, a travs de la Prueba del Yodoformo. Hoy en da, las tcnicas espectroscpicas como RMN y la espectroscopia IR son preferidas, debido a que requieren muestras ms pequeas, pueden ser no destructivas (para la RMN) y son fciles y rpidas de efectuar. Anteriormente esta reaccin fue usada para producir yodoformo y bromoformo, inclusive cloroformo, a nivel industrial. En qumica orgnica, esta reaccin puede ser usada para convertir una metilcetona terminal en un cido carboxlico apropiado. En este experimento, un blanqueador domstico ser usada como fuente de cloro debido al contenido en solucin de hipoclorito de sodio (NaOCl). En esta solucin, el halgeno y la base estn presentes debido al equilibrio de reaccin en la solucin comercial: H2O + NaOCl + NaCl 2 NaOH + Cl2
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar el cido benzoico (conservador alimenticio) por oxidacin de la acetofenona a travs de la reaccin del haloformo.
O C CH3
acetof enona
1) NaOCl 2) H+
O C OH
cido benzoico
+ HCCl3
clor of or mo
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1) 2) 3) Comprender y conocer la reaccin del haloformo como ruta sinttica para la preparacin de cidos carboxlicos. Conocer el uso de la solucin bsica acuosa del hipoclorito de sodio como fuente de cloro molecular (Cl2). Comprender y reforzar el uso de tcnicas apropiadas para el work-up de las reacciones orgnicas, como son la extraccin liquido-liquido, filtracin, precipitacin, entre otras. Comprender y reforzar la importancia de la Qumica Orgnica en la sntesis de Aditivos Alimenticios.
4)
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Puntos a calificar en el Marco Terico, entre otros, son: 1) Generalidades de los conservadores alimenticios (clasificacin, ejemplos de sus aplicaciones, estructuras qumicas, toxicologa, aplicaciones)
2) 3) 4)
Reacciones de las cetonas Mtodos de sntesis de los cidos carboxlicos. Mecanismo de reaccin

Blanqueador domestico Bata y lentes de seguridad. Equipo de microescala 1 barra magntica pequea de agitacin 1 pipeta de 1 mL 2 pipetas de 10 mL 1 perilla 2 matraces erlenmeyer de 50 mL Papel filtro y tijeras 1 frasco pequeo color ambar para almacenar el producto. Esptula. 1 soporte universal con pinza de tres dedos Franela, escobilln, zacate y detergente.
Acetofenona ter etlico cido clorhdrico al 38-40% Bicarbonato de sodio Agua destilada
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--------------------------------------------------------------
Parrillas de agitacin magntica Embudos de separacin de 60 mL Matraz kitazato Embudo buchner
1) La presente prctica fue reproducida usando blanquedor domestico de la marca Cloralex Clsico, es importante que el blanquedor usado no contenga algunos otros aditivos, como colorantes, estabilizantes, etc. Verificar el contenido de hipoclorito de sodio. Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. El expositor se encargara del tratamiento de los residuos cidos acuosos: Recolecte los residuos cidos acuosas en un matraz erlenmeyer de 500 mL (pida este matraz al responsable del laboratorio).
2)
3)
Vierta lentamente bicarbonato de sodio y agite. Repita hasta ya no observar generacin de CO2. Deseche a la tarja. 4) En caso de no contar directamente con el HCl al 40%, equipo expositor deber preparar la solucin de acuerdo al HCl que se disponga. Haga los clculos pertinentes, use agua destilada. Asesrese con el profesor. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y guantes ltex es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
5)
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PROCEDIMIENTO
1) 2) 3) 4) En el matraz redondo de 10 mL del equipo de microescala verter 0.2 mL de acetofenona y 7.0 mL de blanquedor domstico. Colorar en el interior del matraz una pequea barra de agitacin magntica Colocar el condensador de aire al matraz y fijarlo en el soporte universal sujetado a las pinzas de tres dedos. El matraz se somete a agitacin magntica (usar parrilla de agitacin) por 30 min a temperatura ambiente. Comience los primeros 10 min con agitacin vigorosa y posteriormente permita la agitacin moderada. Observaciones durante la reaccin qumica: La solucin permanecer en todo tiempo incoloro y transparente. Al inicio observara que la acetofenona permanece inmiscible en la solucin (dos fases). Despus la solucin tornara a una sola fase y posteriormente se comenzar a observar la formacin del cloroformo en el fondo del matraz (dos fases). Despus de este tiempo, la mezcla de reaccin se transfiere a un embudo de separacin de 60 mL. El embudo de separacin deber estar sujeto a un soporte universal con ayuda del anillo metlico o pinzas de tres dedos.
5)
6)
7) 8)
Vierta 10-15 mL de ter etlico al embudo de separacin. Tape el embudo de separacin y agite vigorosamente. Libere la presin. Coloque nuevamente en el soporte universal. Observe las dos fases que se formaron, la fase inferior acuosa y la fase superior orgnica. En este paso, el cido benzoico se encuentra en la fase acuosa, la extraccin con ter remueve al cloroformo formado en la reaccin y cualquier traza de acetofenona que no haya reaccionado. En un matraz erlenmeyer de 50 mL reciba la fase acuosa. En otro matraz erlenmeyer de 50 mL reciba la fase orgnica. Vierta nuevamente la fase acuosa al embudo de separacin para realizar otra extraccin (ya que en la fase acuosa pueden quedar remanentes de subproductos). Repita los pasos 7-10. Utilice los mismo matraces para recolectar la fase acuosa y orgnica. Al matraz que contiene la fase acuosa agregue lentamente y con agitacin manual 1.0 mL de HCl al 40%. Observe como precipita el cido benzoico. Los cristales de cido benzoico formados se filtran en embudo buchner/matraz kitazato al alto vaco. Utilice papel filtro previamente pesado. Enjuague los cristales de cido benzoico con 30 mL de agua destilada. Mantenga en el embudo hasta total sequedad. Se pesa el papel filtro y por diferencia de pesos se calcula el rendimiento.
90
9) 10) 11)
12)
13)
14) 15)
CUESTIONARIO
1) Para el paso (12) explique el fundamento de lo ocurrido. Escriba la ecuacin qumica. 2) Proponga otra ruta de sntesis para el cido benzoico.
Prctica 11:
SINTESIS DE LA VAINILLINA:
UN SABORIZANTE NATURAL
91
INTRODUCCION
a vainillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehdo) es el compuesto primario de la vaina de la vainilla. La vainilla es una de las sustancias olorosas ms apreciadas por las industrias alimenticias, cosmticas y farmacuticas, ya que se usa como agente saborizante en alimentos, bebidas y elementos farmacuticos as como base en formulaciones de perfumes. La extraccin de la vainillina de la planta de vainilla es costosa con bajos rendimientos adems que se presenta como una mezcla de cientos de compuestos diferentes que van incorporados a la misma. La sntesis de la vainillina en el laboratorio presume ser un compuesto puro y ms barato. La vainillina es un compuesto cristalino de color blanco con olor caracterstico, soluble en cloroformo y ter.
Vainillina En los sistemas biosintticos, la Ruta del cido Shikmico proporciona la porcin aromtica de los compuestos relacionados con el cido shikmico, siendo esta ruta la ms conocida por su papel en la produccin de fenilalanina y aminocidos aromticos; en la biognesis de la vainillina, la ruta del cido shikmico es la ms estudiada. (Esq.1).
Ruta del cido Shikmico

COOH
COOH NH2
COOH
COOH
Azucares
HO OH
cido shik mico
OH
L-Fenilalanina cido cinmico
OH
cido cumar ico
Ruta del cido ferlico

COOH COOH COSCoA HO COSCoA O COSCoA
92
OH OH
cido caf ico
OCH3 OH
cido f er lico
OCH3 OH
Fer uloil-CoA
OCH3 OH
HMPHP-CoA
OCH3 OH
( 4-hidroxi-3-met oxibencil)acetil CoA
CoA O S CHO
OCH3 OH
vainillin-CoA
OCH3 OH
vainillina
Esq. 1:
Biognesis de la vainillina a travs de la ruta del cido shikmico y cido ferlico.
Adems de la Sustitucin Electroflica Aromtica (ver Prctica No. 8), otra reaccin importante de los compuestos aromticos es la Sustitucin Nucleoflica Aromtica (SNA). En la que un nuclefilo desplaza a un buen grupo saliente de un anillo aromtico (Esq. 2).
X Nu Nu
X
X= buen grupo saliente N=Nucleofilo
Esq. 2:
Sustitucin Nucleoflica Aromtica (SNA).
La SNA se efecta en un mecanismo de AdicinEliminacin (Esq. 3).
X Nu
lent a
Nu
Nu
Nu
Nu
X
r pida
Nu
+
R
R
X= buen grupo saliente N=Nucleof ilo
Esq. 3:
Sustitucin Nucleoflica Aromtica (SNA).
1) Adicin: El nuclefilo ataca al carbono que tiene el grupo saliente desde una trayectoria que es casi perpendicular al anillo aromtico. El ataque nucleoflico forma un carbanin intermediario estabilizado por resonancia llamado Complejo de Meisenheimer (por Jacobo Meisenheimer, 18761934). 2) Eliminacin: El grupo saliente se desplaza y la aromaticidad del anillo se restablece. En una reaccin de SNA, el nucletido que entra debe ser una base ms fuerte que el sustituyente que se reemplaza, pues la base ms dbil de las dos ser la que se elimine del compuesto intermediario. En 2007, Taber, et al. public en el Journal of Chemical Educacion su trabajo titulado Vanillin Synthesis from 4-Hydroxybenzaldehyde, mismo que ser desarrollado en esta ocasin.
93
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar la vainillina a partir del 4-hidroxibenzaldehido.
O H Br2 MeOH OH Br OH 3-bromo4-hidroxibenzaldehdo O H NaOMe, CuBr AcOEt, Me O OH vainillina O H
(SEA)
(SNA)
p -hidroxibenzaldehido
1) 2) Sintetizar el 3-bromo-4-hidroxibenzaldehido mediante una Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA) a partir del 4-hidroxibenzaldehido. Sintetizar la vainillina usando una Sustitucin Nucleoflica Aromtica (SNA) a partir del 3-bromo-4-hidroxibenzaldehido.
94
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Puntos a calificar en el Marco Terico (entre otros): 1) Generalidades de los saborizantes naturales alimenticios incluyendo la vainillina (clasificacin, ejemplos de sus aplicaciones, estructuras qumicas, toxicologa, aplicaciones) Generalidades de la Sustitucin Electroflica Aromtica (SEA) Generalidades de la Sustitucin Nucleoflica Aromtica (SNA) Mecanismo de Reaccin de la presente prctica.
2) 3) 4)
Bata, lentes de seguridad, guantes
de latex y cubrebocas. Equipo de microescala 1 termmetro 1 frasco Gerber 1 pinzas de cirujano para manipular la TLC 1 cuchara de plstico desechable para la slica gel 1 manguera de ltex para ejercer
4-hidroxibenzaldehido Vainillina (4-Hidroxi-3-metoxibenzaldehido) NaOMe Br2 Metanol CuBr Acetato de Etilo (1 L) Hexano (1 L) Slica gel cido clorhdrico
presin de aire sobre la columna cromatogrfica 4 pipetas Pasteur y un bulbo 2 tubos de ensaye de 15 cm 15 tubos de ensaye (que puedan contener un volumen de 5 mL) Algodn 1 soporte universal 1 pinzas de tres dedos 2 capilares de boca pequea 1 agitador de vidrio pipetas de 1 y 10 mL 1 perilla 1 vaso de precipitados de 50 mL para bao de sal Sal de mesa Probeta 1 matraz erlenmeyer Esptula. 2 pipetas pasteur Jeringa de plstico desechable de 10 mL 1 vidrio de reloj para pesar los reactivos Mangueras de ltex para el refrigerante. 1 frasco pequeo color mbar para almacenar el producto. Franela, escobilln, zacate y detergente.
Sulfato de sodio anhidro
------------------------------------------------------------- Cubetas y recirculadores. Parrillas de calentamiento. Lmpara de UV Buretas Placas de TLC Matraz redondo para rotavapor _______________________________________ Equipo expositor: 1 bolsa de hielo
95
1) El equipo expositor deber preparar 30 mL del sistema de elucin Hex/AcOEt 6:4 para ser usado por el resto del grupo. 2) El equipo expositor deber preparar 150 mL del sistema de elucin Hex/AcOEt 7:3 para ser usado por el resto del grupo. 3) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los
reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 4) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata y lentes de seguridad es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
96
PROCEDIMIENTO
Se usaran dos matraces redondos de microescala (capacidad de 5.0 mL) debidamente etiquetados como A y como B. En el Matraz A se llevara a cabo la primer reaccin (de bromacin) mientras que en el Matraz B se llevara a cabo la segunda reaccin de la sntesis. Antes de preparar las mezclas de reaccin de los matraces, se montar el equipo de reflujo y un bao de sal a 130 C (use termmetro). Los siguientes pasos requerirn la sincronizacin de los integrantes de cada equipo. 1) 2) 3) Al Matraz A aadir 1.6 mL de la solucin de Br2/MeOH 0.5 M y colocarlo en un bao de hielo. Al Matraz B aadir 1.4 mL de la solucin NaOMe/MeOH 4.0 M, 0.1 mL de acetato de etilo (AcOEt) y 0.08 g de CuBr. Llevar a reflujo la mezcla de reaccin a una temperatura de 130 C en bao de sal. Entonces contar 7 minutos. Se recomienda utilizar cinta tefln para sellar la junta del matraz con el refrigerante. Use el tapn de rosca para el refrigerante, sin sellar hermticamente, para evitar presin en el sistema. 4) Cuando el Matraz B corra en el minuto 6, al Matraz A (en bao de hielo) se le aaden 0.1 g de 4-hidroxibenzaldehido, tape este matraz con su tapn de rosca y agitarlo manualmente durante 45 segundos. Ya en el minuto 7, vierta rpidamente el Matraz A en el Matraz B. Deje transcurrir el reflujo del Matraz B durante 1 hora.
5) 6)
Se recomienda utilizar cinta tefln para sellar la junta del matraz con el refrigerante. Use el tapn de rosca para el refrigerante, sin sellar hermticamente, para evitar presin en el sistema. 7) 8) 9) 10) Al trmino de la hora de reflujo, dejar que el Matraz B alcance la temperatura ambiente. Coloque el matraz en el rotavapor para extraer el disolvente. Vierta 3.0 mL de la solucin acuosa de HCl al 10%, agite el matraz para homogenizar. Con ayuda de una pipeta Pasteur succione todo el contenido y transfiralo a un tubo de ensaye de 15 cm etiquetado como A (es indispensable que los tubos de ensaye sean de 15 cm). Con otros 3.0 mL de la solucin cida enjuague el matraz B, succione y colquelos en el tubo A. Entonces agregue al tubo A 5 mL de acetato de etilo (AcOEt). Colquese su guante de ltex. Con su dedo pulgar tape la boca del tubo A, y agite el contenido 180 de arriba a abajo. Con una pipeta Pasteur extraiga la fase orgnica (superior) y colquela en otro tubo de ensaye etiquetado como B. Repita este paso con otros 5 mL de AcOEt. Agregue al tubo B no ms de 0.2 g de sulfato de sodio anhidro. Agite como lo hizo en el paso (11). Para verificar la presencia de la vainillina y los subproductos formados, lleve a cabo una TLC como lo hizo en la prctica 2 y 6, usando el sistema Hex/AcOEt 6:4. Observe la presencia de la vainillina en luz infrarroja (asesora con el profesor). Es necesario usar vainillina pura de referencia en la TLC Lleve el tubo B con el profesor quien verter el contenido del tubo a un matraz redondo (el matraz ser proporcionado por el laboratorio) para elimina el disolvente en el rotavapor El slido color caf se raspa y se coloca en un matraz y se sella con el tapn de rosca. Este se guarda en el refrigerador, para purificarlo en la prxima sesin.
97
11)
12) 13)
14)
15)
PERCOLACIN DE LA MUESTRA IMPURA: Una percolacin es una purificacin exprs que tiene el fin de elimina impurezas mayores aunque es posible que algunas impurezas menores, despreciables o insignificantes permanezcan en el producto semi-puro. Para poder llevar a cabo este tipo de purificaciones exprs, es necesario que las impurezas mayores sean lo bastante polares para no correr en la micro-columna y obviamente que el producto de inters tenga poca polaridad para poder correr y separarse rpidamente en la micro-columna. Para nuestro caso, la percolacin de la vainillina es un ejemplo claro para poder llevar a cabo una percolacin de la muestra impura. El slido obtenido tiene un color caf, pero la vainillina es incolora; esto es porque la reaccin origino subproductos inherentes los cuales permanecen en la base de la TLC. El alumno tambin habr observado en la TLC que la reaccin origina un subproducto semipolar casi despreciable. Si deseramos obtener la vainillina 100% pura tendramos que llevar a cabo una purificacin por columna para tambin eliminar el subproducto semi-polar formado, pero para fines prcticos, ser suficiente obtener la vainillina semi-pura por una percolacin. 16) Arme un sistema de percolacin con una jeringa de plstico desechable de 10 mL y una pipeta pasteur tal y como se muestra en la figura siguiente, la idea es armar una micro-columna cromatogrfica (ver Prctica No. 3). A una pipeta pasteur colquele un pequeo tapn de algodn en la parte interior e inferior para poder soportar la slica gel, cuide de no poner un tapn muy apretado ya que el corrimiento de la cromatografa ser dificultosa. Agregue slica gel a un tercio de la pipeta con ligeros golpes para compactar la slica. Raspe con una esptula delgada el matraz que contiene el producto impuro y adicione con cuidado el polvo al interior de la micro-columana sobre la slica gel. Entonces coloque otro tapn de algodn. De una manguera ltex, corte 1.5 cm de sta la cual servir para unir la jeringa con la pipeta pasteur. Llene la jeringa (sin aguja) con 10 mL de un sistema de elucin Hex/AcoEt 7:3. Una la jeringa con la pipeta. Presione el mbolo de la jeringa para hacer pasar el sistema de elucin por la micro-columna cromatogrfica. Reciba el disolvente en un vaso de precipitados de 50 mL. Repita con otros 10 mL de sistema de elucin. La vainillina (invisible) bajara rpidamente por la micro-columna. Observar que las impurezas coloridas (caf) trataran de bajar muy lentamente por la micro-columna; si observa que estas impurezas estn por caer al vaso de precipitados, entonces detenga el corrimiento.
98
99
17)
Evapore el disolvente en el rotavapor, raspe el slido (vainillina), pese y calcule el rendimiento.
CUESTIONARIO
1) 2) Por qu es necesario poner en bao de hielo el matraz A en el paso 3? Aproximadamente 80% de 4-hidroxibenzaldehido reacciona para dar la vainillina. Un 8% reacciona para dar un subproducto. Escriba la estructura de este subproducto. Fundamente su respuesta escribiendo su mecanismo de reaccin. Nuestra sntesis se fundamenta por el proceso y la formacin del Complejo Sigma y el Complejo de Meisenheimer. Explique el fundamento de cada uno de estos procesos, sus diferencias entre s, y en qu proceso de nuestra sntesis se llevan a cabo. Investigue las estructuras qumicas de la capsaicina, gingerol, eugenol y benzaldehdo. Describa sus fuentes naturales, discuta las diferencias y similitudes estructurales con la vainillina as como las caractersticas en aroma y sabor de cada una de estas. Investigue otras rutas sintticas de la vainillina, especifique los reactivos y las condiciones de reaccin (es necesario citar las referencias bibliogrficas).
100
3)
4)
5)
ANEXO: PREPARACION DE SOLUCIONES PARA EL GRUPO 25 mL de Br2/MeOH 0.5 M: 0.64 mL de bromo en 25 mL de metanol. Precaucin: el bromo es altamente toxico y voltil, use campana de extraccin, lentes, guantes de ltex y cubrebocas. El bromo al ser un lquido voltil, deber tener cuidado al extraer con pipeta, pues la succin es rpida y puede proyectarse a la perilla. 25 mL de solucin NaOMe/MeOH 4 M: 5.4 g de NaOMe en 25 mL de MeOH 100 mL de solucin acuosa de HCl al 10%: 30 mL de cido clorhdrico al 30 % mas 60 mL de agua destilada.
BIBLIOGRAFIA
1) 2) 3) 4) Taber, D. F. et al. Vanillin Synthesis from 4-Hydroxybenzaldehyde. J. Chem. Educ., 2007, 84, 7, 1158 Ainscough, E. W.; Brodie, A. M. The determination of vanillin in vanilla extract: An analytical chemistry experiment. J. Chem. Educ. 1990, 67, 12, 1070. Gleason, F. K.; Raymond, Ch., Plant Biochemistry. Ed. Jones & Bartlett Learning, USA, 2012. Havkin-Frenkel, D.; Belanger, F. C., Biotechnology in Flavor Production. Ed. Blackwell Publishing, UK, 2008. Van den Heuvel, R. H.; Fraaije, M. W.; Laane, C.; Van Berkel, W. J., Enzymatic synthesis of vanillin, J. Agric. Food Chem. 2001,49, 6, 2954. Schmidt, H. L.; Werner, R. A.; Romann, A.; 18O Pattern and biosynthesis of natural plant products, Phytochemistry, 2001, 58, 1, 932. 7) Negishi, O.; Sugiura, K.; Negishi, Y., Biosynthesis of Vanillin via Ferulic Acid in Vanilla planifolia, J. Agric. Food Chem. 2009, 57 (21), 99569961
101
5)
6)
Prctica 12:
SINTESIS DE LA ADENINA:
REPRODUCCION DE LOS ACONTECIMIENTOS PRIMITIVOS DE LA TIERRA (REACCION EN MODELO PREBITICO)
102
INTRODUCCION
l alumno ha de recordar que en la Practica No. 4 llevamos a cabo la extraccin de ADN de compuestos biolgicos. En esta ocasin sintetizaremos un monmero de ese material gentico: la Adenina, mediante la reproduccin de un modelo qumico que ocurri hace miles de millones de aos.
Nuestra tierra en sus orgenes slo exista como una nube de gas, que estaba tan caliente que incluso los ms simples compuestos no podra existir. Bajo la influencia de la gravedad, los tomos que componen la nube de gas primordial habran comenzado a organizarse en capas, con las ms densas de los gases en el centro y los menos densos en los bordes exteriores. A medida que la nube se enfra, sus componentes ms ntimos condensa en un lquido, mientras que las capas exteriores se mantuvo en la forma de una envoltura de gas. El enfriamiento continuo permiti la formacin de molculas: las ms simples formadas primero, las cuales reaccionaron entre s para formar molculas ms complejas. Poco a poco, la corteza de la Tierra se desarroll a partir de una envoltura slida de compuestos condensados que rodean el ncleo caliente del planeta. Como el centro fundido de la Tierra continu enfrindose, se contrajo. La capa rgida de encima, no puede contraerse junto con el centro lquido, lo que form grietas y pliegues a travs de las cuales las rocas fundidas se vertieron sobre la superficie del planeta. Modernos eventos geolgicos como las erupciones volcnicas y formacin de montaas, son evidencia de que estos mismos fenmenos se siguen produciendo hoy en da. Al principio, la atmsfera de la Tierra primitiva consista slo en aquellos tomos que se encentraban en la parte exterior de la nube de gas inicial. Una combinacin del enfriamiento atmosfrico y la actividad volcnica, generaron un conjunto ms diverso de molculas, las cuales durante un proceso largo de evolucin dieron origen a las molculas de la vida, entre estas, las sntesis de nucletidos, monmeros de cidos nucledos.
103
Bacteria s
Arqueobacterias Plantas
Animales
Origen de la vida Sntesis de Nucletidos EVOLUCION QUIMICA

Esq. 1: Mapa de la evolucin biolgica de las especies.
Ancestro comn para toda vida hasta hoy existente
Aunque la composicin exacta de la atmsfera primitiva de la Tierra no se conoce con exactitud, varios modelos sugieren que contena agua (H2O), dixido de carbono (CO2), metano (CH4), amonaco (NH3), y el nitrgeno molecular (N2). En 1961, Or y Kamat publicaron en la revista Nature su trabajo titulado Amino-acid Synthesis from Hydrogen Cyanide under Possible Primitive Earth Conditions . Or y Kamat consideraron al hidrogeno de cianuro (HCN) como el precursor principal de las bases nitrogenadas en la atmosfera de la tierra primitiva. En 1973 Snyder et al. demostr lo antes propuesto por Or y Kamat al encontrar HCN en el espacio interestelar. Desde entonces surgieron varios modelos tericos y prcticos para la sntesis de las bases nitrogenadas. Algunos de estos modelos sugirieron que el rol que juega el HCN para la sntesis de adenina era la formacin de intermediarios clave, como la formamida en equilibrio con el formato de amonio (Esq. 2) as como la formacin de diaminomaleonitrilo (DAMN) (Esq. 3).
104
Esq. 2:
Equilibrio qumico entre el HCN, formamida y formato de aminio
Esq. 3:
Cuatro molculas de HCN se polimerizan para formar diaminomaleonitrilo (DAMN).
Se han realizado varios experimentos orgnicos que han demostrado la sntesis de adenina a partir de formamida y DAMN. Estas reacciones han sido consideradas relevantes para entender la qumica prebitica y astroqumica ya que la formamida, formato de amonio, y DAMN son todos, productos del compuesto qumico interestelar HCN. En 2007, Von Rague Shleyer et al. public su trabajo titulado Chemical evolution: The mechanism of the formation of adenine under prebiotic conditions en donde propone los compuestos intermediarios en la formacin de adenina (Esq. 4). Ese mismo ao, Glaser et al. public en la revista
Astrobiology su trabajo titulado Adenine Synthesis in Interstellar Space: Mechanisms of Prebiotic Pyrimidine-Ring Formation of Monocyclic HCN-Pentamers mismo que concuerda con lo planteado por Von Rague.
105
Esq. 4:
Intermediarios de reaccin interestelar propuestos por Von Rague y Glaser para la sntesis de adenina a partir de HCN
Recientemente (2011) el Dr. Nicholas V. Hud, director de la Divisin de Astroqumica y Qumica Evolutiva de la NASA ha publicado en el Journal of Chemical Education un procedimiento en modelo prebitico para la sntesis de adenina a partir de formamida, formato de amonio y Diaminomaleonitrilo para ser desarrollado en los programas de Prcticas de laboratorio a nivel licenciatura del Instituto Tecnolgico de Georgia. Este mismo procedimiento es el que se describe a continuacin.
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar la adenina en modelo prebitico (a partir de formamida, formato de amonio y Diaminomaleonitrilo)
1) Generar una base prica en condiciones semejantes a las de la tierra primitiva.
2) Conocer las caractersticas y propiedades de los compuestos heterociclos y su importancia en los compuestos de la vida. 3) Identificar y comparar la adenina sintetizada por TLC con adenina de referencia. 4) Fundamentar por medio de la sntesis orgnica las teoras de la evolucin biolgica.
106
Bata, lentes de seguridad, guantes
de ltex y cubrebocas. 2 tubos de ensaye con taparosca 1 esptula delgada 2 pipetas de 1.0 mL Agitador de vidrio Termmetro Sal de mesa 1 vaso de precipitados de 100 mL Matraz erlenmeyer de 50 mL Para desarrollar la TLC, remtase al material requerido segn la Practica No.2
Formato de amonio Formamida diaminomaleonitrilo (DAMN). Acetonitrilo Metanol Acetato de etilo Lmpara UV
--------------------------------------------------------------
_______________________________________
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
2)
3) 4)
El formato de amonio, la formamida y el DAMN son irritantes. Es obligatorio el uso de guantes de ltex y cubrebocas. Antes de comenzar el procedimiento que se describe, es importante que prepare el bao de sal a 240 C. Use vaso de precipitados de 100 mL y sal de mesa. Recuerde usar termmetro. El equipo expositor deber preparar el sistema de elucin Acetato de etilo/acetonitrilo/Metanol/Agua 6:1:1:1. En un matraz erlenmeyer de 50 mL vierta 12 mL de acetato de etilo, 2.0 mL de acetonitrilo, 2.0 mL de metanol y 2.0 mL de agua corriente. Agite vigorosamente hasta que se observe la disolucin total de los componentes. Tape con algodn o papel aluminio.
5)
107
PROCEDIMIENTO
1) En un tubo de ensaye con rosca colocar 0.1 g de formato de amonio y 0.6 mL de formamida. 2) Tape el tubo de rosca sin sellar hermticamente. Agite la solucin. Anote sus observaciones describiendo los cambios de apariencia fsica de la solucin. 3) Coloque el tubo en el bao de sal por 5 minutos a 240 C. 4) Con mucho cuidado, saque el tubo del bao de sal y permita que se enfre. Asegrese que el formato de amonio se encuentre totalmente disuelto en la formamida, si no es as, entonces deje el tubo en el bao de sal por otros 3 minutos. 5) Una vez frio el tubo de ensaye, vierta inmediatamente y exactamente 0.012 g de DAMN. Agite vigorosamente el tubo para homogenizar con un agitador de vidrio. Anote sus observaciones. 6) Tape el tubo y colquelo nuevamente en el bao de sal. Deje calentar por 20 min. 7) Despus de este tiempo, saque el tubo y deje enfriar. Anote la apariencia fsica de la solucin.
8) Aada 1.0 mL de agua corriente. 9) Desarrolle una TLC conforme al procedimiento de la Practica No. 2. Use como sistema de elucin etilo/acetonitrilo/Metanol/Agua 6:1:1:1 Acetato de
Es importante correr la TLC con un patrn de adenina como referencia.

108
referencia (adenina pura)
Reaccin
Para la preparar la referencia de adenina, en un tubo de ensaye o frasco pequeo y limpio disuelva una pisca de adenina con 1 mL de agua, si es necesario caliente ligeramente el tubo o frasco para disolver completamente la adenina. Cuando coloque las aplicaciones en la TLC cercirese bajo la luz UV que las concentraciones son las convenientes. 10) Observe la placa en UV. Con un lpiz, marque las manchas que se observan. 11) Calcule el Rf de las manchas. Dibuje en su bitcora la placa de TLC desarrollada. NOTA: Hasta aqu, los objetivos planteados para esta prctica han sido alcanzados. Los fundamentos de la TLC y Cromatografa en Columna ya han sido cubiertos en este curso, aun as, el profesor puede considerar necesario invertir otra sesin para aislar la adenina por Cromatografa en Columna y as ampliar las perspectivas del alumno para esta sesin. Llvese a cabo la purificacin en columna de la adenina conforme al procedimiento de la Practica No. 3, considere que la adenina no se puede
ver a simple vista en la columna, por lo tanto debe utilizar la TLC para monitorear las fracciones recolectadas.
CUESTIONARIO
1) 2) 3) 4) 5) Describa que es un heterociclo en la qumica orgnica. Enliste a las familias de los heterociclos. El heterociclo sintetizado en esta sesin, a qu grupo pertenece? Describa otras rutas sintticas usadas comnmente para obtener este tipo de heterociclos. Proponga otras materias primas para sintetizar la adenina por otro mtodo. Escriba el mecanismo de reaccin.
109
BIBLIOGRAFIA
1) 2) 3) 4) 5) 6) 7) Hud, N. V et al. Adenine Synthesis in a Model Prebiotic Reaction: Connecting Origin of Life Chemistry with Biology. J. Chem. Educ. 2011, 88, 16981701 Hudson, R. L., Astrochemistry: Examples in the Classroom. J. Chem. Educ., 2006, 83 (11), 1611 Miller, S. L., A Production of Amino Acids Under Possible Primitive Earth Conditions, Science, 1953, 528-529. Joyce, G. F. RNA Evolution and the Origins of Life, Nature, 1989, 338, 217-224 Mann, A.P.C.; Willis, D.A. A List of Interstellar Molecules, Nature, 1980, 283, 721 - 725 Oro,J; Kamat, S.S. Amino-acid synthesis from hydrogen cyanide under possible primitive earth conditions. Nature, 1961, 190, 442 443 Snyder, L. E. & Buhl, D. Interstellar mathylacetylene and isocyanic acid, Nature, Phys. Sci. 1973, 243, 45.
Laboratorio de Qumica Orgnica 8)
Shuman, R.F; Shearin, W. E; Tull, R. J., Chemistry of hydrocyanic acid. Formation and reactions of N- (aminomethylene) diaminomaleonitrile, a hydrocyanic acid pentamer and precursor to adenine. J. Org. Chem. 1979, 44, 45324536
9)
Roy, D.; Najafian, K.; Von Rague Shleyer, P., Chemical evolution: The mechanism of the formation of adenine under prebiotic conditions, Proc. Nat. Acad. Sc., 2007, 104, 44, 1727217277.
10) Glaser, R.; Hodgen, B.; Farrel, D.; McKee, E. Adenine Synthesis in Interstellar Space: Mechanisms of Prebiotic Pyrimidine-Ring Formation of Monocyclic HCN-Pentamers. Astrobiology, 2007, 7, 3, 455-470 11) Hill, A.; Orgel, L. E.; Synthesis of Adenine from HCN Tetramer and Ammonium Formate. Origins of Life and Evolution of the Biosphere, 2002, 32, 99102. 12) Al-Azmi, A.; Elassar, A.Z.A.; Booth, B. L. The chemistry of diaminomaleonitrile and its utility in heterocyclic synthesis. Tetrahedron, 2003, 59, 27492763 13) Wills, C.; Bada, J. L. The Spark Of Life: Darwin And The Primeval Soup; Basic Books: New York, 2000. 14) www.centerforchemicalevolution.org
110
Prctica 13:
SINTESIS DE UNA CHALCONA:
OBTENCION DE UNA CETONA ,-INSATURADA MEDIANTE LA CONDENSACION ALDOLICA DE CLAISEN-SCHMIDT
111
INTRODUCCION
LAS CHALCONAS: COMPUESTOS VIRTUOSOS DE LA NATURALEZA. as chalconas son absorbidos en la dieta diaria y parecen ser agentes prometedores quimiopreventivos del cncer. Las chalconas representan un grupo importante de la familia de polifenoles, que incluye un gran nmero de molculas de origen natural (Esq. 1).
Esq. 1:
Las chalconas son derivados de los flavonoides, compuestos polifenlicos.
Esta familia de chalconas posee una interesante gama de actividades biolgicas, incluyendo la antibacteriana, antioxidantes, anti-inflamatorios, anticancergenos, citotxicos, e inmunosupresores. La mayora del contenido de
chalconas en ctricos y plantas diversas est representada por la naringenina chalcona (Esq. 2).
CO S CoA OH
O S CoA
chalcona sintetasa
HO
OH
+
OH 4-cumarolil-CoA
HO malonil-CoA
OH
Naringenina chalcona
Esq. 2:
La naringenina chalcona es un ejemplo representativo de la biosntesis de estos compuestos en la naturaleza.
112
En los ltimos aos, se ha incrementado la atencin sobre las chalconas debido a sus actividades biolgicas. En efecto, las chalconas constituyen un importante grupo de compuestos naturales que son especialmente abundantes en frutas (p. ej., ctricos y manzanas), vegetales (p. ej., tomates, cebolla, patatas) y diversas plantas y especias (Esq. 3). Muchos de los cuales han sido utilizados durante siglos en la medicina tradicional.
OH HO OH HO OH OH O O
OH
O i soli quir itigenina
OH
Nar ingenina chalcona
1,2-di hidroparatocarpi na A
HO HO O O HO O HO OH O O OH OH O O HO OH OH OH
xantohumol
i soli quir itina apiosida
OH HO HO OH O OH O OCH3
OH
mirigalona B
x antohumol D
Esq. 3:
Ejemplo de chalconas encontradas en la naturaleza
Aunque las chalconas se producen de forma natural, la qumica orgnica dispone de stas en grandes cantidades a travs de sntesis eficientes y simples. CONDENSACIN ALDLICA CLAISEN-SCHMIDT. Los compuestos carbonilicos de aldehdos y cetonas pueden funcionar como nuclefilos al formar carbaniones en el tomo de carbono vecino al carbonilo: el tomo de carbono alfa. Por ejemplo, se puede quitar un protn del carbono alfa para formar un ion enolato estabilizado por resonancia, que es un nuclefilo fuerte y puede formar un enlace con un electrfilo (Esq. 4).
O C H C O O C C C E C C O E
113
Base
Esq. 4:
ion enolato El hidrogeno de carbono alfa de un carbonilo es extrado por una base para formar un ion enolato.
Algunas de las reacciones ms importantes de los iones enolatos de los compuestos carbonlicos son las condensaciones. Las condensaciones unen entre s dos o ms molculas. La condensacin aldlica implica la adicin nucleoflica de un ion enolato a otro grupo carbonilo. El producto, que es una -hidroxicetona o -hidroxialdehido (segn sea el caso) se llama aldol. Bajo ciertas condiciones, se puede deshidratar para formar un compuesto carbonlico ,-insaturado (Esq. 5).
O H R1 R2 H
O OH
O R4 R1 R2
OH OH R3 R4 R1
R3 R4 R2
R3
+ H2O
aldol
alf a-beta-insaturado
Esq. 5:
Formacin de un compuesto carbonlico ,-insaturado por la deshidratacin de un aldol.
Para los esquemas anteriores, la condensacin aldlica puede ser ventajosa cuando se parte de un solo reactivo. Pero cuando un enolato de un aldehdo (o cetona) se agrega a un grupo carbonilo de otro (tambin con hidrgenos ), el resultado no puede ser del todo satisfactorio, pues se obtendr una mezcla de
productos. (Esq. 6) A la adicin de dos grupos carbonilo diferente se le llama condensacin aldlica cruzada.
O H etanal O OH OH H propanal H 3-hidroxibutanal (de dos moleculas de etanal) OH O 3-hidroxi-2-metilpentanal (de dos moleculas de propanal ) O H
OH
O H OH O
114
3-hidroxi-2-metilbutanal
3-hidroxipentanal (de una molecula de etanal y una de propanal)
Esq. 6:
Subproductos originados por la condensacin aldlica cruzada del etanal con el propanal.
El problema anterior puede evitarse si la reaccin se planea de tal modo que slo uno de los reactivos pueda formar un ion enolato (gracias a la presencia de hidrgenos ) pero el otro no (con ausencia de hidrgenos ). En tales casos, el compuesto -hidroxicarbonilo sera solo un intermediario ya que la enona (carbonilo ,-insaturado) sera el producto final de la reaccin. A este tipo de reaccin se le conoce como CONDENSACIN ALDLICA CLAISEN-SCHMIDT. Esta se define como la condensacin de un aldehdo aromtico con un aldehdo o cetona aliftico en presencia de una base fuerte (hidrxido o ion alcxido) para formar un aldehdo o cetona ,-insaturado (Esq.7).
O H O OH R1 OH R2 beta-hidroxicarbonlo O R1 OH R2 carbonlo alf a,beta-insaturado O R1
H2C R2
H2O
aldehido aromatico
aldehdo, R1= H cetona, R1= alquilo
Esq. 7:
Condensacin Aldlica Claisen-Schmidt. Note la ausencia de hidrgenos alfa en el aldehdo aromtico.
Para el Esquema 7, el -hidroxicarbonlo formado pierde agua tan pronto como se forma, ya que el nuevo doble enlace esta conjugado no slo con el grupo carbonilo sino tambin con el anillo del benceno; esta conjugacin favorece y estabiliza el producto ,-insaturado, y por consiguiente, determina que su formacin sea fcil.
OBJETIVO GENERAL
Sintetizar una CHALCONA mediante la CONDENSACIN ALDLICA CLAISENSCHMIDT a partir del salisaldehdo y acetofenona.
OH O H O OH CH3
NaOH/EtOH 10%
+
acetofenona
+
chalcona
H2O
115
salisaldehdo
1) Conocer y comprender las condiciones de reaccin de la Condensacin
Aldlica Claisen-Schmidt. 2) Comprender y demostrar que la Condensacin Aldlica Claisen-Schmidt es un mtodo verstil en la sntesis de chalconas.
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Por lo tanto, los puntos a calificar en el Marco Terico entre otros son: 1) Generalidades de las chalconas. 2) Generalidades de las condensaciones aldlicas 3) Condensacin Aldlica Claisen-Schmidt. 4) Mecanismo de reaccin.

Bata, lentes de seguridad y guantes de ltex 1 matraz erlenmeyer de 50 mL 1 vaso de precipitados de 50 mL 1 pipeta de 5 mL 2 pipetas de 1.0 mL Perilla Agitador de vidrio Papel filtro y tijeras Manguera ltex para el alto vacio 1 frasco pequeo para almacenar el producto. Franela, escobilln, zacate y detergente.
--------------------------------------------------------------
Acetofenona Salisaldehido NaOH Etanol
Embudos buchner Matraces kitazato
116
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) El equipo expositor deber preparar 40 mL de NaOH/EtOH al 10%. Asesrese con el profesor. 3) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata y lentes de seguridad es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido. Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
PROCEDIMIENTO
1) En un vaso de precipitados de 50 mL adicionar 0.5 mL de acetofenona y 0.5 mL de salisaldehido. Mezcle perfectamente con ayuda de un agitador de vidrio.
2) Una persona integrante del equipo deber mantener en agitacin constante (con agitador de vidrio) la mezcla de reaccin mientras la otra persona adiciona lentamente 3.0 mL de NaOH/EtOH al 10%. Se observara la formacin instantnea de la chalcona mientras esta precipita. La mezcla de reaccin se torna color amarilla. 3) Mantenga la agitacin por 10 minutos. 4) Agregue a la mezcla de reaccin 2.0 g de hielo finamente picado. 5) Entonces sobre un papel filtro previamente pesado, filtre el slido formado al alto vacio con ayuda de un embudo buchner y un matraz kitazato. 6) Enjuague el slido con 50 mL de agua helada (use agua corriente). 7) Deje el slido al alto vacio a sequedad total. 8) Pese el papel filtro y por diferencia de pesos calcule el rendimiento. Guarde la chalcona en un frasco limpio. Se obtiene un slido ligeramente amarrillo.
117
CUESTIONARIO
1) Describa otros mtodos de sntesis para las chalconas (es necesario la fuente bibliogrfica). 2) Proponga las materias primas para la sntesis de la naringenina chalcona. 3) De nombre IUPAC a la chalcona sintetizada en esta prctica.
Prctica 14:
OBTENCION de JABONES a partir de GRASAS ANIMALES y VEGETALES:
REACCION DE SAPONIFICACION
118
INTRODUCCION
a hidrlisis catalizada por acido de un ster es simplemente la inversa de la Esterificacin de Fisher. La adicin de un gran exceso de agua impulsa al equilibrio hacia el cido y el alcohol. Por otro lado, la hidrlisis bsica de los steres y cidos carboxlicos se llama saponificacin.
O Na HO
ion hidr x ico
O
saponif icacin
+ H O C R
cido car boxilico
Na
O C R
H O H
agua
car box ilato ( estearato de sodio)
O Na HO
ion hidr x ico
O
saponif icacin
+ R O C R2
ster
Na
O C R2
R O H
alcohol
car box ilato ( estearato de sodio)
El termino saponificacin (Latn saponis, jabn) significa literalmente fabricacin de jabn. El jabn se fabrica por hidrlisis bsica de las grasas, que son esteres de cidos carboxlicos de cadena larga (cidos grasos) o triglicridos. Cuando se hidroliza una grasa con hidrxido de sodio, las sales de carboxilato de cadena larga que se producen, son lo que conocemos como jabn. Esta reaccin se descubri antes de 500 A.C. cuando se encontr que se obtena cuajo cuando la grasa animal se calentaba con cenizas de madera. Las sustancias alcalinas de las cenizas promueven la hidrlisis de los enlaces ster de la grasa. Estos compuestos tienen la particularidad de ser anfipticos, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares. Este hecho es lo que confiere a los jabones como agentes limpiadores.
OBJETIVO GENERAL
Obtener un jabn mediante la reaccin de una base fuerte con una grasa animal o vegetal (Reaccin de Saponificacin).
O O R2 C O H2C CH H2C O C O R3 O C R1 H2O H2C HC H2C OH OH OH R1 COO COO COO Na Na Na
NaOH
R2 R3
119
st er (T r iglicer ido)
O R C O
cido car boxilico (c. graso)
NaOH
H2O
O H2O
R C O
Na
1) Comprender las reacciones de saponificacin que sufren los steres representadas por sebo de res y manteca vegetal. 2) Comprender las reacciones de saponificacin que sufren los cidos carboxlicos representadas por aceite comestible casero.
MARCO TEORICO
Este apartado forma parte de la investigacin extra-clase del alumno, por lo que deber describirlo en su Plan de trabajo. Puntos a calificar en el Marco Terico, entre otros, son: 1) Generalidades de los jabones. 2) Caractersticas de los jabones (parte hidrofbica e hidroflica) 3) Forma de actuar de un jabn.
4) Clasificacin de grasas y aceites 5) Reaccin de saponificacin (mecanismo de reaccin) 6) Diferencia entre un jabn y un detergente 7) Como elaborar un detergente
Bata,
120
Etanol Hidrxido de sodio
lentes de seguridad y cubrebocas. Termmetro 1 vaso de precipitados de 50 mL. 1 matraz erlenmeyer de 50 mL 2 pipetas de 2 mL 1 perilla Papel filtro y tijeras 1 vaso de precipitados de 100 mL para bao de sal Sal de mesa 1 agitador de vidrio Esptula. Franela. Escobilln, zacate y detergente.
Cloruro de sodio Agua destilada cido brico ------------------------------------------------------------- Parrilla de calentamiento con agitacin magntica. Matraz kitazato Embudo buchner Por el alumno: 5 g de grasa (segn sea el caso) Perfume
1) Durante toda la sesin hasta el final de la misma, el equipo expositor ser el responsable de mantener la limpieza de la balanza analtica, de los reactivos y de la campaa de extraccin, as como de la limpieza y orden del laboratorio al final de la prctica. 2) El equipo expositor deber preparar la solucin de cido brico al 20% para todo el grupo (15 mL). 3) La entrada y estancia del alumno en el laboratorio estar condicionada al respeto de las normas de seguridad previamente discutidas (sesin 1). El uso de bata, lentes de seguridad y cubrebocas es imprescindible. Las seoritas debern tener en todo tiempo el pelo debidamente recogido.
Queda estrictamente prohibido el uso de sandalias o cualquier calzado abierto.
PROCEDIMIENTO
Rol de Equipos: Equipos 1-3: Sebo de res (steres) Equipos 4-6: Manteca vegetal (steres) Equipos 7-10: Aceite comestible casero (cidos grasos) 1) En un vaso de precipitados de 50 mL se disuelven 2.0 g de hidrxido de sodio en una mezcla de 2.0 mL de etanol y 2.0 mL de agua destilada. Entonces se colocan 1.0 g del cido graso (segn sea el caso). Prepare un bao de sal en un vaso de precipitados de 100 mL a una temperatura constante de 70 C (use termmetro). Entonces sumerja el vaso con la mezcla de reaccin en el bao de sal. Agite constantemente la mezcla de reaccin con un agitador de vidrio durante 45 min. Use cubrebocas para evitar respirar los vapores. En un matraz erlenmeyer de 50 mL se disuelven 2 g de cloruro de sodio en 8 mL de agua destilada. Vierta el contenido del vaso que contiene el jabn formado en la solucin de NaCl con agitacin vigorosa. El jabn formado se filtra al vacio con ayuda de un embudo buchner y matraz kitazato lavando con 30 mL de agua destilada. Saque el jabn slido y vulvalo a colorar en el vaso de precipitados. En este momento el pH del jabn es cerca de 11. Para neutralizar el jabn se usa cido brico, el cual es usado como agente amortiguador de pH. Agregue al jabn 1.0 mL de cido brico al 20 %. Homogenice lo ms posible con el agitador de vidrio
121
2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9)
10)
11) 12) 13)
Deje el jabn en el vaso de precipitados y agregue unas gotas de perfume. En casa: Deje el jabn a la intemperie para que se seque. En la prxima sesin de laboratorio pese el jabn, calcule el rendimiento obtenido, y antalo en el reporte a entregar.
122
CUESTIONARIO
1) 2) 3) 4) Explique porque los jabones limpian (dibuje un esquema) Por qu se adiciona cloruro de sodio a la mezcla saponificante? Explique cmo podra regenerarse el cido graso. Escriba la ecuacin qumica. Muchas regiones en el mundo disponen de agua domestica con contenido de iones calcio, magnesio y/o hierro. Aunque estas aguas ricas en minerales pueden ser saludables para beber, los iones reaccionan con los jabones formando sales insolubles llamada nata de agua dura (esta se puede observar como sarro formado en las paredes de la ducha). Escriba la ecuacin que muestre la reaccin con los iones calcio, magnesio y hierro.
BIBLIOGRAFA GENERAL CONSULTADA PARA LA ELABORACION DE ESTE MANUAL 1) Brewster, R.Q. Valder Werf, C.A. y McEwen, W.E., Curso de qumica orgnica experimental, editorial alambra, coleccin Vrtix, No. 26, 1 a reimpresin, Madrid, 1978. 2) Shriner, R.L., Fuson, R.C. y Curtin, D.Y., Identificacin sistemtica de compuestos orgnicos, editorial Limusa, 2a reimpresin, Mxico, 1974. 3) Domnguez, X.A. y Domnguez S., X. A., Qumica orgnica experimental, editorial Limusa, 1a edicin, Mxico, 1982. 4) Mayo, D.W., Pike, R.M. Butcher, S.S. and Trumper P.K. Microscale techniques for the organic laboratory, editorial John Wiley and Sons, New York, 1991. 5) Williamson, K.L., Macroscales and microscale organic experiments, editorial D.C. Heath, 2a edition, Lexington, 1994. 6) Lehman, John W., Operational organic chemistry a laboratory course, edit. Allyn and Bacon, Inc., Boston, 1981. 7) Mayo, D.W., Pike, R.M. and Trumper, P.K. Microscale organic laboratory with multistep and multiscale syntheses, editori al John Wiley and Sons, 3a. edicin, New York, 1994. 8) Morrison R. y Boyd, Qumica orgnica, Grupo Editorial Iberoamericana, 5a edicin, Mxico, 1990. 9) McMurry John, Qumica orgnica, Grupo Editorial Iberoamericana, 3a edicin, Mxico 1994. 10) March, Jerry, Advanced organic chemistry, editorial Wiley Interscience, 4a. edit., New York, 1992. 11) Fausto Antonio de Azevedo, Gua sobre las necesidades mnimas para un laboratorio de ecotoxicologa, Centro Panamericano de ecologa Humana y Salud, OPS, Organizacin Mundial de la Salud; Mxico, 1986.
123
12) Robert A, Corbitt, Standard handbook on enviromental engineering, Mc. Graw Hill Publishing Company, New York, 1990. 13) Emil T. Chanlett, La proteccin del medio ambiente, Instituto de Administracin Local, Madrid, 1976. 14) N. Irving Sax. Dangerous properties of industrial materials, Van Nostrand Reinhold Company, New Cork, 1979. 15) Richard J. Lewis, Sr., Hazard chemicals. Desk references, 3a. edition, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1993.
124

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