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Las pruebas bioqumicas son una serie de anlisis clnicos que sirven a la Medicina como apoyo a la hora de diagnosticar infecciones por bacterias. Las principales pruebas son:
1 IMVIC o 1.1 Indol o 1.2 Rojo de Metilo o 1.3 Voges Proskauer o 1.4 Citrato 2 Enzimticas o 2.1 Oxidasa o 2.2 Catalasa o 2.3 Coagulasa o 2.4 Ureasa o 2.5 Reduccin Nitratos o 2.6 - D - Galactosidasa o 2.7 Descarboxilasas 3 Otras o 3.1 Agar TSI o 3.2 xido - Fermentativa o de Hugh-Leifson o 3.3 cidos y gases o 3.4 Hidrolisis Gelatina 4 ndice Analtico de Perfil 5 Enlaces externos
IMVIC
El IMVIC se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. Su finalidad es identificar un organismo del grupo de los coliformes. La presencia de estos indica contaminacion fecal.
Indol
La prueba del indol estudia la capacidad de degradar el triptfano con produccin de Indol y metabolitos indlicos.
Rojo de Metilo
Estudia la fermentacin cido mixta con produccin de cidos estables en el tiempo.
Voges Proskauer
Estudia la fermentacin butanodilica con formacin de un metabolito intermediario neutro. Tcnica: Sembrar la muestra en el medio e incubar de 24 a 48h a 37 C. Segn el volumen del medio aadir a partes iguales el volumen de los reactivos, agitar para exponer el medio al O2. VP POSITIVO: Color rojo-rojizo en menos de 1h. VP NEGATIVO: Amarillo en superficie.
Citrato
Estudia la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono.
Enzimticas
Oxidasa
prueba de Oxidasa La oxidasa estudia la presencia del enzima citocromo c oxidasa que acta en la cadena respiratoria del organismo.
Catalasa
Estudia si el microorganismo posee el enzima catalasa que acta descomponiendo el perxido de hidrgeno.
Reaccin de la catalasa
Coagulasa
Cogulos formados por la reaccin de la coagulasa en un tubo de ensayo. Estudia la produccin del enzima coagulasa, capaz de coagular el plasma. Diferencia Staphylococcus aureus de otras especies.
Ureasa
prueba de ureasa Estudia si el microorganismo posee el enzima ureasa que cataliza la hidrlisis de la urea.
Reduccin Nitratos
Estudia la capacidad de los microorganismos para reducir los nitratos por la presencia de un conjunto de enzima denominado nitrato reductasa
- D - Galactosidasa
Estudia la capacidad de producir - D - galactosidasa, enzima necesario para metabolizar la lactosa.
Descarboxilasas
Estudia si el microorganismo produce los enzimas que descarboxilan los aminocidos presentes en el medio.
Otras
Agar TSI
El agar TSI estudia la utilizacin de la glucosa y lactosa, la produccin de gas y cido sulfhidrico (como producto metabolico final de los aminoacidos azufrados).
Resultados de un agar TSI: (de izquierda a derecha) preinoculado (como control), P. aeruginosa, E. coli, Salmonella Typhimurium, Shigella flexneri.
cidos y gases
Estudia la capacidad de utilizar un hidrato de carbono con la produccin de cidos y la formacin de gas.
Hidrolisis Gelatina
Estudia la capacidad proteoltica del microorganismo por degradacin de la gelatina.
API 20NE Sistema de deteccin a las 24 horas de incubacin. El ndice Analtico de Perfil (Analytical Profile Index o API) son un conjunto de pruebas bioqumicas que se concentran en muy poco espacio mediante el uso de pocillos con el reactivo correspondiente ya preparado para ser usado. Se llenan los pocillos siguiendo las instrucciones del fabricante con la muestra problema. Se sellan los pocillos que sean obligatorios. Se incuba la estufa a unos 37 C normalmente. Posteriormente se comprueba los resultados pasado el tiempo indicado en la tira. Los resultados se apuntan por cada prueba bioqumica en el casillero correspondiente, de manera que al final dar un nmero de varias cifras. Con este numero se puede buscar en el libro de referencia de las tiras API, el tipo de bacteria que se tiene en la muestra. Son muy tiles, capaces de identificar en poco tiempo la bacteria problema (actualmente unas 600 especies). Hay varios modelos dependiendo del uso. Por ejemplo, si la muestra es un coprocultivo se debera usar una tira de enterobacterias.
2a. ed. en espaol, 1993. Mxico ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.
gentica molecular / Bernard D. Davis 2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat. Internet:
Prueba de la Oxidasa El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa. Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e-. Este se detecta utilizando el tetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por la citocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a prpura. Procedimiento: Con un pequeo papel de filtro aadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con la bacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos, observamos si ha ocurrido algn cambio.
Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo. Se considera positva esta prueba cuando toma un color prpura la muestra. Resultados: (+) Pseudomonas aeruginosa ( - ) Escherichia coli Prueba de la Catalasa El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa El perxido de hidrgeno se produce al utilizar la bacteria el azcar por va oxidativa. Al ser ste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la produccin de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + O2). Prodecimiento:
Agregamos aproximadamente 5 ml. de perxido de hidrgeno al 3% a un tubo de ensayo previamente esterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimos por el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liquida de perxido de hidrogeno y debemos observar la reaccin de esta.
La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxgeno. Resultados: (+) Staphylococcus aureus ( - ) Streptococcus spp. Prueba de la Coagulasa La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del genero Staphylococcus. Procedimiento:
Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayo con algodn hidroflico y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados. Resultados: Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles: 1: pequeos cogulos no oganizados 2: pequeos cogulos oganizados 3: gran cogulo organizado 4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo. Se consideran positivos los niveles 3 y 4. (+) Staphylococcus aureus ( - ) Staphylococcus epidermis. Prueba MIO (Motility-Indole-Ornitine Motilidad-Indol-Ornitina) Esta prueba bioqumica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reaccin de Indol a la descarboxilacin de la ornitina. Procedimiento: Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Interpretacin y Resultados: Reaccin Enturbiamiento del Hay movilidad Agar. Agar transparente deNo hay movilidad sarrollo solo en picada Azul (alcalino) Coloracin Amarilla (cido) Descarboxila ornitina No descarboxila Interpretacin
Prueba TSI (Triple Sugar Iron Triple Azcar Hierro) El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambien permite la identificacin de la produccin de SH2. Esta es una prueba especfica para la identificacin a nivel de gnero en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:
bacterias fermentadoras de la glucosa bacterias fermentadoras de la lactosa bacterias fermentadoras de sacarosa bacterias aerognicas bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgnicas que contengan azufre.
Procedimiento: Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos. Resultados:
Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentacin de azucares. Caracterstica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp. Pico alcalino/fondo cido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp. Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Salmonela spp. Pico cido/fondo cido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli.
Prueba LIA (Lysine Iron Agar Agar Lisina Hierro) Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es ms sensible que el TSI para la deteccin de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros. Procedimiento: Inocular en forma de estra las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37 . Interpretacin y Resultados: Reaccin Azul (alcalino) Rojo Engrecimiento Ruptura del Agar Fondo Amarillo y Descarboxilacin de lisina Tendido prpura Pruebas Bioqumicas IMViC: Agar Citrato La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp. Interpretacin Hay movilidad No hay movilidad Descarboxila ornitina No descarboxila
( - ) Escherichia Coli Indol El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Procedimiento: Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Klebsiella pneumoniae Rojo Metilo Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. Procedimiento:
Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin agregar unas gotas del reactivo de rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo ferment la glucosa por
la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. Resultados: (+) Escherichia coli ( - ) Enterobacter aerogenes Vogues Proskauer En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodiol descripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia. Procedimiento: Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a 35C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 ml del caldo RM/VP a un tubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa-naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva. Resultados: (+) Enterobacter aerogenes (-)Escherichia coli Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioqumicas MICROORGANISM O PSEUDOMONA SPP. FAMILIA ENTEROBACTE R ENTEROBACTE R ENTEROBACTE R TINCIO N GRAM FORMA BACILOS CORTOS, CURVADOS O RECTOS BACILOS CORTOS BASTONCILLO S BACILOS MOVILIDA D POSEE FLAGELOS POLARES FLAGELOS PERTRICOS NO TIENE FLAGELOS
Resultados Experimentales Grupo 1: Sebastin Leyton - Carlos Vera Grupo 2: Yuri Glvez - David Fuica Grupo 3: Graciela Quintero - Carolina Grupo 4: Carolina Iribarra - Jessica Pizarro Oxidasa MICROORGANISMO PSEUDOMONA SPP. SALMONELLA SHIGUELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 + + + Catalasa MICROORGANISMO PSEUDOMONA SPP. SALMONELLA SHIGUELLA SPP. ESCHERICHIA COLI STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 + + + + Coagulasa MICROORGANISMO STAPHYLOCOCCUS AUREUS GRUPO 1 + GRUPO 2 + GRUPO 3 + GRUPO 4 + GRUPO 2 + + + + + GRUPO 3 + + + + GRUPO 4 + + + + + GRUPO 2 + + + GRUPO 3 + + + GRUPO 4 + + + -
Indol MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI GRUPO 1 + GRUPO 2 + Agar Citrato MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 3 + GRUPO 4 +
Vogues-Proskauer MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI GRUPO 1 GRUPO 2 Rojo Metilo MICROORGANISMO ESCHERICHIA COLI GRUPO 1 + GRUPO 2 + LIA MICROORGAN ISMO(S) DETECTADO(S) SALMONELLA SHIGUELLA SPP. DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI LACION DE LACION DE LACION DE LACION DE ORNITINA ORNITINA ORNITINA ORNITINA DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI LACION DE LACION DE LACION DE LACION DE LISINA LISINA LISINA LISINA MIO MICROORGAN ISMO(S) GRUPO 3 + GRUPO 4 + GRUPO 3 GRUPO 4 -
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
GRUPO 4
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
GRUPO 4
DETECTADO(S) PSEUDOMONA DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI DESCARBOXI LACION DE LACION DE LACION DE LACION DE
SPP.
ORNITINA
ORNITINA
ORNITINA
ORNITINA
ST. AUREUS
GRUPO 1 GLUCOSA
GRUPO 2 GLUCOSA
GRUPO 3 GLUCOSA
GRUPO 4 GLUCOSA
FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD A A A A LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI SACAROSA SALMONELLA SACAROSA SACAROSA SACAROSA
FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD AS AS AS AS PRODUCCIO PRODUCCIO PRODUCCIO PRODUCCIO N N N N DE ACIDO DE ACIDO DE ACIDO DE ACIDO
FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD FERMENTAD A A A A SHIGUELLA SPP. LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI LACTOSA NI SACAROSA SACAROSA SACAROSA SACAROSA
Aqu estn algunas de las Pruebas Bioqumicas ms frecuentes: Fermentacin de la lactosa (Mc Conkey) Agar Hierro de Kliger (KIA) Prueba del Indol Citrato de Simmons Agar Hierro Lisina (LIA) Agar Urea de Christiansens Prueba de la Fenilalanina (PPA) Reduccin de los Nitratos Movilidad RM - VP Oxidasa y Catalasa
- Cloruro sdico 5.0 : para mantener la tonicidad del medio (evitar osmosis). - Rojo neutro 0.05 : indicador que va hacer que el medio vire de coloracin. Si las bacterias son Lac +, producirn cidos derivados de la fermentacin que darn al medio un aspecto rosceo; si por el contrario son Lac -, el medio se basificar por el uso de la peptona y se tornar amarillo. - Cristal violeta 0.001 : interfiere junto con las sales biliares en la selectividad del medio. - Agar-agar 15.0: da consistencia al medio.
Lac +
Lac -
Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica acidificacin (derivada de c. de la fermentacin) Interpretacin del Kliger: NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad
Fermentador glucosa, productor c. sulfhdrico y de gas. Fermentador glucosa, lactosa y productor de gas.
Citrato de Simmons
Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono y compuesto amoniacales como nica fuente de nitrgeno. El medio contiene citrato sdico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornar azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones amonio al medio (degradacin del fosfato amnico) lo que provoca que este se alcalinice y el indicador vire azul. Cit + Cit -
Urea -
Urea +
PPA -
PPA +
Determina la capacidad e la bacteria para desaminar el aminocido fenilalanina en cido fenilpirvico por accin de la enzima Fenilalanina desaminasa, esto va a producir una acidificacin del medio, que se va a poner de manifiesto mediante la aplicacin de 0,2 - 0,3 mL de Cloruro frrico al 10 %, si hay en el medio c. fenilpirvico aparece una coloracin verdeazulada.
Reduccin de Nitratos
Va a poner de manifiesto la capacidad de transformar los Nitratos en Nitritos. Para esto inoculamos tres tubos en el medio para dicha prueba y los incubamos 24, 49 y 72 horas respectivamente. Tras 24 h. aadimos 2 o 3 gotas del reactivo "A-B", si aparece coloracin rojo cereza indica que es positivo, si no aparece coloracin es un presunto negativo, para confirmarlo basta con aadir una punta de esptula de Zinc y si realmente es negativo se tornara rojo. Si el ultimo da (72 h.) la bacteria da negativo, entonces podemos decir con seguridad que no tiene capacidad para reducir los nitratos. Positivo Presunto negativo
Movilidad
Se realiza una siembra en picadura, y tras incubar 24 h. observamos si se ha producido crecimiento entorno a la zona inoculada.
Positivo
Negativo