UNIVERSIDAD DE NARIO FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y EXACTAS. Asignatura: MICROBIOLOGA Docente: Alexandra Espaa Jojoa - Bacteriloga.

LABORATORIO No 1 NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA (Manipulacin de instrumentos y equipos)

JUSTIFICACION: DEFINICIN Conjunto de medidas y normas preventivas, destinadas a mantener el control de factores de riesgo laborales procedentes de agentes biolgicos, fsicos o qumicos, logrando la prevencin de impactos nocivos frente a riesgos que atentan contra la salud de las personas que trabajan en un laboratorio o en entidades prestadoras de salud, asegurando que el desarrollo o producto final de dichos procedimientos no atenten contra la seguridad de los trabajadores, estudiantes y el medio ambiente. FACTORES DE RIEGO Se conocen como Factores de Riesgo todos los elementos, sustancias, procedimientos y acciones humanas presentes en el ambiente laboral que de una u otra forma ponen en riesgo al trabajador teniendo la capacidad de producirle lesin. Estos factores de riesgo pueden encontrarse en la fuente, en el medio o en las personas mismas. Tienen como caracterstica fundamental que son fcilmente controlables. Los diferentes factores a los que est expuesto un trabajador del laboratorio se pueden clasificar en factores fsicos, qumicos, ergonmicos, elctricos y psicosociales. OBJETIVOS GENERALES Conocer la importancia de implementar medidas de Bioseguridad en un laboratorio. Cambiar la actitud de los estudiantes frente a la bioseguridad. OBJETIVOS ESPECIFICOS Exigir implementos de proteccin personal y crear cultura de autoproteccin en las actividades diarias para evitar accidentes. Mantener el rea de trabajo en condiciones de orden y limpieza. Detectar y relacionar los factores que intervienen en la confiabilidad de los resultados. Manejar todas las muestras como potencialmente patgenas para disminuir riesgos de contaminacin. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD PRECAUCIONES QUE SE DEBEN LABORATORIO DE MICROBIOLOGA: ADOPTAR EN EL - Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de que as sea cubrir la herida de manera conveniente. - Usar guantes de ltex de buena calidad para todo manejo de material biolgico o donde exista, aunque sea de manera potencial, el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales. Cambiar los guantes toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos y ponerse guantes limpios. - No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas. - No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos. - Bajo ninguna circunstancia se pipeteara sustancia alguna con la boca, para ello se utilizaran peras plsticas o pipeteadores automticos. - Lavar las manos con jabn y agua inmediatamente despus de realizar el trabajo. Descartar los guantes de ltex en un recipiente con solucin desinfectante. - No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar. - No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus implementos de bioseguridad adecuados. - Todos los objetos que se deban utilizar se deben preparar con anterioridad y tener listos sobre la mesa en un orden determinado. Todas las manipulaciones se deben realizar con rapidez y exactitud. - Flamear siempre las aberturas de los tubos antes y despus de cada siembra. Utilizar las pipetas de mayor exactitud, tomar la cantidad exacta y no dejar muestra en la punta de la pipeta. - Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo. - Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aqu expuesta y las adoptadas por la Universidad de Nario. DERRAMES Y ACCIDENTES Todos los derramamientos y accidentes se deben informar inmediatamente al docente y Laboratorista. Seguir el protocolo respectivo.

- No se permitir comer, beber, fumar y/o almacenar comidas as como cualquier otro item personal (maquillaje, cigarrillos, etc.) dentro del rea de trabajo. - Usar bata de manga larga dentro de laboratorio, la cual se pondr al momento de entrar y deber ser quitada inmediatamente antes de abandonar el laboratorio.

ELEMENTOS PROTECTORES Y SU USO ADECUADO

Se usaran guantes de ltex en todo procedimiento que implique el manejo de material biolgico o donde exista el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales, as mismo debern usarse en los procesos de descontaminacin y eliminacin de residuos contaminados. Los guantes debern ser descartados una vez hayan sido contaminados en los sitios dispuestos para los residuos contaminados, y luego reemplazados por otros. Usar mascarilla en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de material biolgico en las mucosa bucal y nasal. El uso de la bata es obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual debe ser retirada antes de salir del laboratorio. Esta debe ser de manga larga para protegerse de cualquier reactivo o agente qumico, o material biolgico manipulado en el laboratorio. Debe usarse zapatos cerrados dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel con material contaminado o cualquier producto qumico peligroso, por derramamiento o salpicadura. Debe usarse gorro de tela para evitar el contacto directo del cabello con material contaminado o sustancias qumicas peligrosas. MANIPULACION Y EVACUACION DE DESECHOS Todo el equipo reusable (puntas de micropipeta, cnulas, , tubos, etc.) deber ser ubicado en un recipiente metlico o de plstico resistente a punciones y cortaduras, que contenga liquido descontaminante y debe estar localizado en el mismo lugar de trabajo. Despus es preciso desinfectar el material con sustancias qumicas antes de limpiarlo e introducirlo en el autoclave. Todo elemento descartable (agujas, jeringas, etc.) debe ser colocado en un recipiente de material resistente a punciones y cortaduras. Estos recipientes deben ser preferiblemente amplios de paredes rgidas y semirrgidas, con tapa asegurada para su posterior descarte y estar ubicados lo ms cerca posible del lugar de uso de los instrumentos. Para la eliminacin de todo material contaminado, el mtodo de eleccin es la incineracin de los mismos, o el material puede ser auto clavado y luego destruido o enterrado. Los residuos lquidos que se sospechen estn contaminados deben ser tratados con desinfectantes antes de su eliminacin o colectados en recipientes que sean eliminados en forma segura. Realizar adecuadamente la segregacin de desechos segn lo indica cada recipiente ubicado en el laboratorio. CUESTIONARIO 1. Cul es la diferencia entre desinfectante, antisptico, esterilizante.

2. Menciones cinco riesgos biolgicos, qumicos, fsicos, ergonmicos en un laboratorio. 3. En qu momentos se debe realizar el lavado de manos en un laboratorio? 4. Cules son los desinfectantes ms utilizados en el laboratorio y por qu? 5. El hipoclorito se utiliza en diferentes diluciones para la descontaminacin, cuales son las diluciones y que se descontamina en cada una. Que desventajas tiene la utilizacin de hipoclorito? BIBLIOGRAFIA: GUIA DE METODOS EFICACES DE ESTERILIZACION Y DESINFECCION CONTRA EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH) 2da Edicin. Organizacin Mundial de la Salud (OMS) NORMAS DE BIOSEGURIDAD PARA LABORATORIOS DE DIAGNOSTICO E INVESTIGACION QUE TRABAJEN CON EL VIH ARC COPY Organizacin Mundial de la Salud Serie OMS sobre SIDA Ginebra MANUAL DE GARANTIA DE CALIDAD EN BANCOS DE SANGRE Migel A. Rodriguez, Lorena Carboni Costa Rica VIH/SIDA Y HEPATITIS: PREVENCION Y CONTROL DE FACTORES DE RIESGO BIOLOGICO Leonor Quinceno, Yaneth Sanchez

LABORATORIO No. 2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA. PRIMERA PARTE : Preparacin de medios de cultivo. b) Su utilizacin: Comunes, de enriquecimiento, INTRODUCCION: selectivos, inhibidores, diferenciales, de identificacin, Uno de los sistemas ms importantes para la de identificacin de microorganismos es observar su multiplicacin, de transporte. crecimiento en sustancias alimenticias artificiales c) Su composicin: complejos, sintticos, semisinteticos. preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en d) Su origen: Naturales y qumicos o sintticos. el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el ESTERILIZACION Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de Es un mtodo del control del crecimiento microbiano cultivo diferentes. que involucra la eliminacin de todas las formas de vida, Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un incluidos virus y esporas. Es un trmino absoluto que medio de cultivo artificial debe reunir una serie de implica la prdida de la viabilidad mediante la condiciones como son: temperatura, grado de humedad destruccin de todos los microorganismos contenidos y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado en un objeto, rea especfica o sustancia, correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo acondicionando de tal modo la posterior propagacin o debe contener los nutrientes y factores de crecimiento contaminacin a otros objetos o al medio ambiente. necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee La mayora de las bacterias patgenas requieren todos los requisitos indispensables como grados de nutrientes complejos similares en composicin a los temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base tamao del autoclave y el flujo del vapor, la densidad de muchos medios de cultivo es una infusin de y el tamao de la carga en la cmara aumentan extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros la tasa se muerte de los microorganismos, en una ingredientes. temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o El agar es un elemento solidificante muy empleado para ms. la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y OBJETIVO: se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las capacidad de: bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. Envasar los medios de cultivo de manera adecuada en En los diferentes medios de cultivo se encuentran los diferentes recipientes de acuerdo al uso que se les numerosos materiales de enriquecimiento como dar. hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Preparar adecuadamente medios de cultivo Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos deshidratados y por componentes. fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del Indicar el mtodo de esterilizacin y almacenamiento medio y para detectar reacciones de fermentacin de apropiado. los microorganismos que ayuden a identificarlos. El Comprobar la efectividad del proceso de esterilizacin. suero y la sangre completa se aaden para promover el Relacionar la composicin de los diversos medios de crecimiento de los microorganismos menos resistentes. cultivo con sus caractersticas y aplicaciones. Tambin se aaden colorantes que actan como MATERIALES Y REACTIVOS: indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de Cajas de petri grandes, tubos de ensayo, pipetas de 5 y cido o como inhibidores del crecimiento de unas 10 ml, erlenmeyer de 200 ml, probeta de 100 ml, bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como mezcladores de vidrio, mecheros, Autoclave, balanza indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH analtica, estufa, cinta de esterilizacin, papel indicador cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya de pH, papel aluminio o empaque, agua destilada. que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Medios deshidratados: Gram-positivas). agar base sangre, Mueller Hinton, agar nutritivo, agar sabouraud, caldo nutritivo, SIM, TSI, citrato simons. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO: PROCEDIMIENTO Se pueden clasificar teniendo en cuenta: Cada grupo preparar un medio diferente: a) Su consistencia: Slidos, lquidos, semislidos.

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparacin del medio de cultivo asignado. Realizar los clculos teniendo en cuenta la cantidad de medio a preparar. (regla de tres). 2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes (medio natural). Medir la cantidad exacta de agua destilada. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo. 3. Marcar el erlenmeyer con el nombre del medio. Disolver la porcin pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar y evitar derrames, no descuidar el medio.

4. Medir el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25C). De ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. 5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones sealadas por el profesor. 6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribucin y fecha de preparacin. 7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones sealadas por el docente. Si se presenta algn inconveniente que impida su inmediata esterilizacin, el medio de cultivo se puede almacenar por un periodo mximo de 12 horas bajo refrigeracin.

RESULTADOS MEDIO DE CULTIVO: ____________________________________ CANTIDAD PREPARADA: _______________________ CANTIDAD PESADA: ____________________________ CLCULOS:

ASPECTO DEL MEDIO DE CULTIVO: _______________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________ ESTADO FSICO: Slido__________ Lquido_________ Semislido___________ TIPO DE MEDIO DE CULTIVO Segn la naturaleza de los ingredientes: Natural __________ complejo_________ Sinttico_________________ Segn el propsito de uso Enriquecimiento____________ Selectivo__________ Diferencial_________ Otro_____________________________ DISTRIBUCIN: __________________________________________________ CONDICIONES DE ESTERILIZACIN: __________________________________________________________________ CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO: _______________________________________________________________ CUESTIONARIO 1. Cul fue el aporte de los medios de cultivos en el establecimiento de la microbiologa como ciencia. 2. Qu ventajas ofrecen los medios slidos para el cultivo de microorganismos? 3. Qu es el solidificante de un medio? 4. Explique tres tipos de esterilizacin utilizados en la preparacin de medios de cultivo. 5. Explique y de ejemplos de los tipos o clases de medios de cultivo.

LABORATORIO No 3 UBICUIDAD DE LOS MICROORGANISMOS, CARACTERISTICA CULTURALES Y AISLAMIENTO. JUSTIFICACION: Toda superficie inerte o viva esta colonizada, tiene presente microorganismos, es decir: las mesas, ventanas, pisos, lapiceros, la piel, el cabello, las uas, todo lo que nos rodea contiene bacterias, hongos, virus y hasta parsitos, todos estos microorganismos no deseados son contaminantes, por ello cuando trabajamos en un laboratorio de microbiologa debemos asegurarnos que el material de trabajo est ESTERIL, lo que nos asegura un trabajo optimo, que los microorganismos aislados representan un cultivo puro indispensable para realizar estudios de identificacin, fisiologa, gentica propios de l. INTRODUCCION: La ubicuidad de los microorganismos se basa en tres caractersticas principales: su tamao pequeo, que les permite una gran capacidad de dispersin, su variabilidad y flexibilidad metablica, que les permite tolerar y adaptarse rpidamente a condiciones ambientales desfavorables, y su plasticidad gentica (o gran capacidad de transferencia horizontal de genes), que les permite recombinar y recolectar los caracteres positivos y persistir durante largo tiempo adaptndose a condiciones ambientales cambiantes. MICROBIOTA: El cuerpo humano presenta una gran superficie cutnea y mucosa por la que entra en contacto con el medio ambiente. En esta superficie existen diversos sectores, donde residen microorganismos con diferentes caractersticas de humedad, temperatura, pH y disponibilidad de nutrientes. La flora humana normal es el conjunto de grmenes que conviven con el husped en estado normal, sin causarle enfermedad. Su composicin es caracterstica para la especie humana, tanto en los grmenes que la componen como en su nmero y distribucin en el organismo. Sitios colonizados y sitios estriles: La flora normal coloniza las superficies cutneo-mucosas. Por otro lado, en el organismo existen sectores que son estriles en condiciones normales: por ejemplo, pleura, meninges, cavidad peritoneal, pericardio, etc. OBJETIVOS - Identificar microorganismos contaminantes, para evitarlos en el desempeo de actividades en el laboratorio de microbiologa. - Identificar las bacterias de nuestro cuerpo y reconocer que hacen parte de la flora Normal o Microbiota. - Aplicar normas de bioseguridad necesarias para garantizar la calidad la calidad de nuestro trabajo. MATERIALES Y REACTIVOS: (POR GRUPO) 2 Cajas de agar nutritivo. 2 cajas de agar sangre. 5 Hisopos estriles, 2 ml solucin salina estril, 1 bajalenguas estril. Cada estudiante debe llevar blusa, guantes, tapabocas. PROCEDIMIENTO: A temperar los medios de cultivo: sin destapar las cajas pasar con mucho cuidado la base de cada caja sobre la flama del mechero, secarlas con una franela o<papel absorbente. Marcar la base de cada caja con marcador en el borde, no en el centro para permitir la observacin de cambios o interpretaciones. (grupo, fecha, tipo de medio- inicialesmuestra que se sembr) 1. Sembrar las cajas de agar nutritivo as: Primera caja: humedecer un hisopo en solucin salina, escoger una superficie del laboratorio (mesn, ventana, piso, etc) y frotarlo sobre un rea de 10 x 10 cm, luego frotarlo suavemente sobre el agar haciendo estras (deslizarlo de lado a lado: zig zag). Segunda caja: seleccionar un implemento de uso diario ( lapicero, celular, monedas, cosmtico, etc) y realizar el procedimiento anteriormente descrito. 2. Sembrar las cajas de agar sangre as: Primera caja: con un escobilln humedecido en solucin salina frotarlo dentro de la oreja o cuero cabelludo, o piel alguna superficie seca de su cuerpo. Sembrarlo en forma de estras sobre el agar sangre. Segunda caja: con un escobilln seco frotarlo dentro de la boca o nariz y sembrarlo en forma de estras. Cada caja debe ser marcada correctamente para identificacin posterior. Llevar las cajas a incubar a 37 C por 24 horas. Realizar el informe. RESULTADOS: 1. Examine cada una de las cajas y cuente el nmero de colonias desarrolladas, puede utilizar el cuenta colonias. 2. Utilizando los criterios siguientes describa las colonias desarrolladas en cada caja. Y anexe la fotografa respectiva. 3. Que caja presento mayor desarrollo y justifique la respuesta. Criterios para describir las colonias observadas a. Forma: -Regular/irregular Redondeada/difusa/estrellada/ramificada. b. Aspecto superficial: -Pulida (lisa y regular) -spera (con pequeas irregularidades) -Con anillos concntricos. -Con radios en su interior c. Color y transparencia: identificar el color. d. Consistencia (se percibe como): -Mantecosa Fibrosa Viscosa Seca -Quebradiza e. Elevacin: -Difusa Plana Elevada Conexa Umblicada f. Borde: -Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentosa

CUESTIONARIO 1. Qu es una colonia bacteriana? 2. Porque en nuestro cuerpo se presentan areas colonizadas por bacterias, que representa esta situacin? 3. Especifique por reas corporales los tipos de microorganismos que normalmente se encuentran, microbiota. 4. Que precauciones se deben tener para evitar contaminaciones en microbiologa- cultivos. 5. Qu es un cultivo puro y como se obtiene?

LABORATORIO No 4 TECNICAS DE SIEMBRA INTRODUCCION: Identificar y describir correctamente las Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han caractersticas culturales y microscpicas de algunas diseado diversos mtodos que permiten cultivarlos bajo bacterias. condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo Organizar e interpretar los resultados del estudio condiciones experimentales y manejar un solo tipo de macroscpico y microscpico de bacterias. microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el laboratorio de microbiologa consiste en transferir una MATERIALES Y REACTIVOS: (POR GRUPO) muestra microbiolgica de un ambiente determinado a un 1 tubo tioglicolato, 1 tubo con medio SIM, 1 caja de agar medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos sangre, una caja de EMB, 80 ml de agar Plate Count fundido, microbianos. A l efectuar este procedimiento, es necesario 4 tubos con 9 ml de solucin salina estril, 1 tubo con medio considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros TSI en pico de flauta, 1 caja con Mueller Hinton, 4 pipetas de microorganismos; debido a esto, es necesario tomar 1 ml estriles, 1 pipeteador automtico, 1 asa en argolla, 1 precauciones para impedir que stos penetren y contaminen asa recta, 2 escobillones estriles, 4 cajas petri estriles, los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo sensidiscos (varios para todo el grupo), mecheros, Tubo No. 1 el aspecto nutricional, sino tambin las condiciones de la escala de Mc Farland, una pinza o depilador. ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio de Cultivos de E. coli, Staphylococcus, otros, 1 erlenmeyer con cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y un cultivo activo de E. coli. durante la incubacin condiciones tales como la temperatura, PROCEDIMIENTO: aireacin la luminosidad. La aplicacin de estos Limpiar y esterilizar el rea de trabajo procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos Prender los mecheros, ajustar la flama hasta que sta en cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de presente un cono azul bien marcado. cultivos puros, facilitando de este modo, el estudio, Identificar y organizar el material dentro del rea de trabajo. caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma Marcar el material con iniciales de la cepa a sembrar, fecha y de sembrarlos y cultivarlos depende del tipo de grupo. microorganismo y propsito especfico del estudio. a) Siembra en medio lquido: caldo tioglicolato. Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, Transferir aspticamente, con el asa de argolla o proveniente de una sola clula. Los cultivos axnicos son muy redonda, una pequea muestra de los microorganismos, raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, desde el tubo que contiene el material problema al tubo con en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-existen cultivos medio de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y agitar mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y para desprender y diluir la muestra. Incubar el tubo recin diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo sembrado en incubadora, durante 10 a 20 minutos a 37C, axnico se obtiene artificialmente en el laboratorio. este ser utilizado en el literal f). A la hora de obtener un cultivo axnico se han de b) Siembra en medio semislido : (SIM tomar precauciones especiales, ya que los microorganismos MIO)Cualquier medio de movilidad. estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio La siembra en este tipo de medio, que contiene una ye n l o s i n s t r u m e n t o s y r e c i p i e n t e s u s a d o s e n proporcin menor de agar que los medios slidos y los experimentos. Estos microorganismos no que se envasa en tubos, se lleva a cabo con d e s e a d o s o contaminantes deben ser eliminados de u n h i l o d e s i e m b r a ( a s a r e c t a ) esterilizada, con el un cultivo para que ste pueda ser axnico. El cual se toma la muestra. El medio queda inoculado al segundo paso para obtener un cultivo axnico es introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, inocular o introducir, una sola clula de un retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada microorganismo en un medio slido o liquido, al realizar esterilizado previamente. De esta manera, aislamos c) Tcnicas de estriado: un solo microorganismo del resto y se podr Estriado simple: EMB McConkey (cualquier medio selectivo) multiplicar en condiciones favorables. Un Clon est Esteriliza el asa de siembra en argolla (redonda) y toma la constituido por una poblacin de clulas descendientes de un parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo solo microorganismo. Una colonia es un clon lo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfre el asa y suficientemente grande como para ser visible sobre la toma una colonia de la placa, tapa el cultivo inicial, superficie de un medio slido. ahora, toma una placa con agar estril (donde se vaya a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la OBJETIVOS muestra en un extremo de la placa y con el asa en posicin Manipular adecuadamente los cultivos puros. ligeramente horizontal realiza las estras (muy juntas), Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una adecuadas para alcanzar propsitos especficos. porcin pequea del agar; mediante un balanceo sucesivo y rpido de la mueca.

Siembra para aislamiento por estra (cuadrantes): agar sangre. El objetivo es esta tcnica es extender lo ms posible el inoculo con el fin de obtener colonias aisladas (separadas). 1 Paso: Esterilizar el asa, dejar enfriar, tomar una colonia y hacer una estra en un borde de la caja sobre el agar; a continuacin quemar el asa para evitar una mayor carga bacteriana en el cultivo. 2: luego estriar el segundo plano perpendicular a nuestro primer estriado, y repetir lo mismo con el ltimo estriado logrando completar todo el espacio de la placa.

e)Siembra en agar inclinado: (TSI) Se toma una colonia del cultivo puro con el asa recta previamente esterilizada, se destapa el tubo con agar inclinado o en pico de flauta, se flamea la boca y se introduce el asa sin tocar las paredes del tubo, picar el fondo y sacar el asa deslizndola suavemente por su superficie en zig-zag. Este tipo de siembre sirve para identificar bacterias: en superficie (aerobias) y en la profundidad del agar (anaerobias).

d)Siembra por diluciones: Tubos con solucin salina estril, agar Plate Count. A partir de un cultivo fresco de bacterias realizar una serie de -1 -2 -3 -4 4 diluciones: marcar los tubos como 10 , 10 , 10 , 10 , cada tubo contiene 9 ml de solucin salina estril al primer tubo se agrega 1 ml del cultivo inicial, mezclar, transferir del primer tubo al segundo 1 ml, mezclar y transferir al tercer tubo 1 ml como indica la grfica. Marcar 4 cajas petri estriles una para cada dilucin y agregar de la dilucin respectiva 1 ml a cada caja luego agregar medio fundido Plate Count mezclar segn indicacin del docente.

f) Siembra masiva (antibiograma): Mueller Hinton (MH). a) disco-placa. Con este sistema se puede probar la eficacia de varios antimicrobianos al mismo tiempo realizando una siembra de una suspensin bacteriana, con un inculo normalizado sobre la superficie de un medio slido, colocando sobre la misma discos de papel impregnados de una cantidad conocida de antibitico. Por el agua del medio los antimicrobianos difunden y se crea un gradiente de concentraciones decrecientes a medida que nos alejamos del disco. Tras un periodo de incubacin se obtiene, alrededor del disco, una zona de inhibicin del crecimiento bacteriano. La valoracin del halo se hace por patrones obtenidos de forma que se hayan correlacionado la CMI, el dimetro del halo de inhibicin y la carga del antibitico del disco. Los resultados se expresan en trminos de categora clnica (S, I, R). Es un mtodo sencillo y til para determinar la sensibilidad de microorganismos de crecimiento rpido, no se debe usar en bacterias de crecimiento lento y anaerobios. Es el mtodo que vamos a utilizar en las prcticas. Marcar la caja, tener todo el material listo: escobillones estriles, el medio liquido sembrado en el literal a) y llevado a

incubar, compara la turbidez con el tubo No. 1 de la escala de McFarland. 4 tubos de sensidiscos antibiticos, pinza. Destapar el tubo sembrado con microorganismos, flamear la boca del tubo, introducir los escobillones estriles, humedecerlos en el medio, sacarlos haciendo presin en las paredes del tubo para retirar el exceso de liquido, flamear el tubo, taparlo, con los escobillones hacer estras muy pegadas en toda la caja sobre el agar de arriba abajo, luego de abajo arriba y por los bordes. Quemar los escobillones, cerciorarse que estn bien apagados y descartar en recipiente rojo. Con ayuda de una pinza depositar 4 sensidiscos sobre el agar hacer un poco de presin pero no romper el agar, observar la imagen.

dilucin 10 --3 10
-2

Numero de colonias 128 = 12800 262 = 262000

reporte 1.3 x 10 4 2.6 x 10

3

4. Interprete el antibiograma realizado. 5.Anexe las fotografas de sus cultivos. Criterios para describir las colonias observadas a. Forma: -Regular/irregular Redondeada/difusa/estrellada/ramificada. b. Aspecto superficial: -Pulida (lisa y regular) -spera (con pequeas irregularidades) -Con anillos concntricos. -Con radios en su interior c. Color y transparencia: identificar el color. d. Consistencia (se percibe como): -Mantecosa Fibrosa Viscosa Seca -Quebradiza e. Elevacin: -Difusa Plana Elevada Conexa Umblicada f. Borde: -Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentosa CUESTIONARIO 1. Qu es una colonia bacteriana? 2. Qu caractersticas tiene un cultivo puro? 3. Especifique por reas corporales los tipos de microorganismos que normalmente se encuentran, microbiota. 4. Que precauciones se deben tener para evitar contaminaciones en microbiologa- cultivos. 5. Cuando tomas un inoculo de un cultivo bacteriano. por qu es necesario tocar una parte estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano? 6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra? 7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?

3) INCUBACIN: Verificar que todas las cajas estn correctamente marcadas, llevar a incubar a 37 C durante 24 horas 48 horas. (observar al da siguiente). RESULTADOS: 1. Examine cada una de las cajas y cuente el nmero de colonias desarrolladas, puede utilizar el cuenta colonias. 2. Utilizando los criterios siguientes describa las colonias desarrolladas en cada caja. Y anexe la fotografa respectiva. 3. Que caja de la siembra por diluciones presento mayor desarrollo y justifique la respuesta. Realizar el recuento de colonias en caja: Escoger la caja que contenga entre 30 y 300 UFC y multiplicar por el factor de dilucin, reportar con dos dgitos y potencia de 10, cuando el tercer digito es igual o mayor de 5 se aproxima a la unidad al digito anterior si es menor se anula. Ejemplos:

LABORATORIO No. 5 AISLAMIENTO SELECTIVO Y DIFERENCIAL DE MICROORGANISMOS BACTERIAS GRAM POSITIVAS. Prueba de la Catalasa Introduccin Morfologa de la colonia. Es importante conocer los microorganismos Gram Positivos que forman parte de la biota normal de nuestro organismo e Fermentacin de Carbohidratos identificar su forma patgena. Son habitantes de nuestro Coagulasa. organismo y se encuentran dispersos en el medio ambiente, Hemlisis se encuentran en piel, mucosas, intestino de animales. Son Novobiocina: Es un antibitico que inhibe el crecimiento saprofitos habituales de piel y mucosas, y desempean un del Staphylococcus aureus y los E. C. N. permite el efecto positivo en el proceso de maduracin de las carnes. crecimiento nico de S. saprophyticus. Pueden contaminar alimentos, suelos y agua (Micrococcus). Ureasa Hay otros como los Staphylococcus, los cuales, se encuentran Hidrlisis del hipurato en tejido habitual de las vas respiratorias altas: faringe, Tolerancia a la sal laringe, senos nasales. Prueba de la bilis esculina Muchos de ellos son agentes secundarios, pero tambin los Prueba de CAMP hay patgenos (agentes primarios). Tambin se encuentran Utilizacin de Sistemas Comerciales de identificacin en el tracto urogenital, y de all pasan a algunos rganos (API) internos, en especial articulaciones y el corazn (son agentes complicantes de las endocarditis), y tambin el tejido renal. OBJETIVOS: 1. Identificar e interpretar los fundamentos de las pruebas La identificacin bioqumica debe hacerse partiendo de un para Gram positivos. cultivo puro o colonias perfectamente aisladas. Tras observar 2. Realizar aislamiento e identificar los microorganismos en la morfologa de las colonias, el tipo de crecimiento en medio estudio, identificando el metabolismo, caractersticas lquido, la morfologa bacteriana y la tincin de Gram, se culturales. procede a la identificacin empleando diversas pruebas bioqumicas. Materiales: Para cada Grupo: 1 tubo con plasma humano. 1 portaobjetos, Enzimas que producen los Gram Positivos: 1 caja con agar manitol-salado, 1 caja de agra sangre, 1 tubo Hialuronidasas, proteinasas, estreptoquinasas (Enzima que con bilis esculina. Asa en argolla, escobilln estril. destruye cogulos sanguneos). Cuando se produce la ruptura Para todo el grupo: de un vaso sanguneo se produce una hemostasia, para que Agua oxigenada, mecheros, sensidiscos de SXT, pinzas. el animal no se desangre. Aqu es donde actan estas Cepas de Staphylococcus aureus, epidermidis, saprofiticus, enzimas. Streptococcus sp. Estreptolisinas O y S. Responsables de la -hemlisis Hemolisina: hemlisis-completa BETA / hemlisisPROCEDIMIENTO incompleta ALFA 1. Realizar la prueba de catalasa: dependiendo del resultado Estreptolisinas (S. pyogenes): tipo 0 / Tipo S trabajamos segn la siguiente tabla: Positivo:(Staphylococcus) Negativo: ( Streptococcus) Coagulasa Bilis esculina Tolerancia a la sal CAMP Sensibilidad al SXT Prueba de catalasa: Los microorganismos que tienen la enzima catalasa descomponen el agua oxigenada en agua y oxgeno. Al depositar sobre una colonia bacteriana (de un medio sin sangre) una gota de agua oxigenada se observarn burbujas (de oxgeno) si la bacteria produce catalasa.

Pruebas comunes para Gram Positivos Bacitracina: permite diferenciar entre Streptococcus pyogenes (sensible) de los Streptococcus pneumoniae y agalactiae (son resistentes) Sensibilidad SXT.

Prueba de coagulasa: La coagulasa es una enzima que tiene la facultad de coagular las protenas sricas del plasma. Se utiliza para la identificacin de estafilococos coagulasa positiva ( S. aureus).

Prueba de CAMP: sembramos en una placa de Agar Sangre estreptococos de forma perpendicular y sin tocarse a una siembra de S. aureus. Si el m.o se trata de un Strept. del grupo B se producir una sustancia llamada CAMP que en presencia de los Estafilococos producen una zona de lisis en forma de punta, agrandando la zona de hemlisis. Demuestra el sinergismo de hemolisinas entre el Streptococcus y el S. aureus.

Tolerancia a la sal: Manitol salado: La utilizacin del manitol formando cido en altas concentraciones de NaCl 35%es la capacidad que tiene el S. aureus y le permite diferenciarlo de otros Staphylococcus. Forma de siembra: Tomar una colonia y hacer una estra radial en la placa. Lectura: cambio de color del medio de rojo a amarillo (S. aureus.)

Sensibilidad a SXT:<el trimetropim sulfa es un antibitico que nos permite clasificar y diferenciar al grupo de los Streptococcus Beta hemolticos. En un agar sangre sembrar en forma masiva una colonia de la bacteria a estudiar y colocar un sensidisco de SXT en el centro, incubar a 37 C 24 horas. Sensible: halo de inhibicin superior a 14 mm (Streptococcus no Alfa, no Beta) Resistente: Streptococcus pyogenes, S. agalactiae. RESULTADOS: 1. Para cada cepa estudiada hacer un diagrama de las pruebas realizadas, los resultados obtenidos, las caractersticas culturales de las colonias, y la identificacin de cada una. 2. Anexar las fotografas. Cuestionario: 1. Que bacterias Gram Positivas provocan con mayor frecuencia intoxicaciones alimentarias? 2. Que bacterias Gram positivas presentan Endosporas y cual es la importancia en la industria alimentaria.

Prueba de la Bilis Esculina: los Strept. del grupo D hidrolizan la esculina en presencia de bilis dando como productos esculetina y glucosa. El medio que se usa es el Medio Bilis Esculina que es slido y se deja enfriar inclinado. La siembra se realiza a partir de un caldo, depositando dos gotas con una pipeta o un asa. La incubacin se hace a 35-37C durante 48-72 horas. Si la prueba resulta positiva se observa un color negro en la mitad o ms de la superficie. Si la prueba resulta negativa no hay ennegrecimiento o aparece en menos de la mitad del medio.

3. Realice un esquema en el que se indiquen los grupos bacterianos Gram positivos de acuerdo a la forma (gneros y especies)

LABORATORIO 6 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS. Introduccion Principio: en TSI se determina la capacidad de un Las pruebas bioqumicas se basan en la determinacin de la microorganismo para atacar los hidratos de carbono presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el GLUCOSA, LACTOSA y/o SACAROSA, con produccin o no de material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas gases (CO2 y H2), junto con la produccin o no de cido (catalasas, coagulasas, decarboxilasas, deaminasas, ureasas, sulfhdrico (H2S). peroxidasas, etc) involucradas en el metabolismo bacteriano, Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a pueden ser evidenciadas en medios de cultivo especiales que 37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie contienen los substratos (DNA, hidratos de carbono, del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la aminocidos, etc) sobre los cuales ellas actan, junto con un reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al sistema indicador que va a poner de manifiesto la denominador (parte anaerobia) La acidez se denomina con la degradacin del substrato o la presencia de un metabolito letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color especfico (cido frmico, cido lctico, cido succnico, indol, rojo) etc). Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones Las pruebas bioqumicas tambin evalan: la capacidad de bioqumicas: reducir ciertos iones (ferroso a frrico), la presencia o Fermentacin de la glucosa (K/A). ausencia de flagelos (prueba de movilidad), la produccin o Fermentacin de glucosa, lactosa y/o sacarosa (A/A) no de hemolisinas, el requerimiento o no de algunos factores No fermentacin de los carbohidratos (K/K), la bacteria no especiales (protenas sricas), la produccin o no de algunas utiliza los hidratos de carbono, produciendo aminas que toxinas con capacidad virulenta (toxina diftrica, toxina alcalinizan el fondo y la superficie del medio. botulnica, etc). Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la peptona aerbicamente dando un TSI: K/N, es decir no hay IMPORTANCIA CLINICA cambio en el fondo del tubo. Cuando se han aislado las bacterias causantes de un proceso Produccin de gas: ruptura del medio. infeccioso, stas deben ser identificadas hasta llegar a Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio GENERO Y ESPECIE, para lograrlo se debe evaluar su actividad bioqumica o metablica. Del microorganismo aislado LECTURAS AGAR TSI depender el tipo de tratamiento que debe ser administrado al paciente. Las enterobacterias son las responsables del 50% de todos los aislamientos clnicamente significativos, producen el 50% de los casos de septicemia, del 60 al 70% de la enteritis bacterianas, el 90% de las infecciones urinarias. Son causa importante de contaminacin de alimentos, el agua, utensilios, medio ambiente en general. OBJETIVOS 1. Sembrar, leer e interpretar algunas pruebas bioqumicas tiles en la identificacin de bacterias bacilares Gram negativas. 2. Determinar gnero y especie de la cepa problema. MATERIALES Cepas bacterianas: cepas de bacterias bacilares Gram negativas Medios de cultivo: Una batera sembrada con una cepa diferente para cada grupo: Agar TSI (triple azcar hierro), agar A/A K/A K/K A/A K/A LIA (lisina, hierro, agar) agar UREA, agar CITRATO DE SIMMONS, caldo MR (rojo metilo), caldo VP (voges El agar TSI tiene tres azcares: glucosa (1 g/L), lactosa (10 g/L) proskauer), medio SIM (sulfuro, indol, movilidad). y sacarosa (10 g/L). Como indicador de PH tiene ROJO DE FENOL el cual vira al Otros: reactivo de oxidasa (dimetil para fenilne diamina o color amarillo en presencia de acidez y al color rojo en tetrametil para feniline diamina), rojo de metilo, KOH 40%, presencia de alcalinidad. alfa naftol 5%, Kovacs o Erlich. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para que las bacterias puedan producir H2S y como PROCEDIMIENTO: indicador de H2S, SULFATO FERROSO el cual reacciona con el Sembrar la cepa problema en toda la batera disponible de H2S produciendo un precitado negro e insoluble de sulfato acuerdo a la siguiente instruccin: ferroso. Para que se produzca H2S, se requiere de un medio 1- AGAR TSI: siembre el agar TSI haciendo una puncin cido por lo que dicha produccin generalmente est limitada central hasta el fondo del tubo y estra en superficie. al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe

leerse como A (cido), aunque el color amarillo usual est tapado por el color negro . 2- AGAR LIA: Sembrar con asa recta, por doble picadura hasta el fondo del tubo y en superficie. Principio: en agar LIA se determina la capacidad de un microorganismo para atacar el aminocido LISINA descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de glucosa, laproduccin o no de gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S). Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas si es necesario) a 37C. Se lee un quebrado, la reaccin ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reaccin ocurrida en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color prpura). Fundamento: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas: a- Fermentacin de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca el aminocido solo fermenta la glucosa. b- Descarboxilacin de la lisina: (K/K) c- Desaminacin de la lisina: R/A) rojo/ amarillo d- Produccin de gas: ruptura del medio e- Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio El indicador del PH del medio es PRPURA DE BROMOCRESOL, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color prpura. Por contener pequea cantidad de Glucosa (1 g/ L) al ser fermentada al fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina. LECTURAS DEL LIA.

generalmente est limitada al fondo del medio, razn por la cual un fondo negro debe leerse como A (cido), Aunque el color amarillo usual est tapado por color negro. 3- AGAR CITRATO DE SIMMONS: sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar CITRATO DE SIMNONS se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como nica fuente de carbono en ausencia de fermentacin de azcares o de produccin de cido lctico. Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin (48 horas s es necesario) a 37C. Fundamento: Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensacin de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El medio utilizado contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono tambin es capaz de utilizar las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las sales de amonio se desdoblan en amoniaco (NH_) con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en presencia de alcalinidad vira al color azul indicando que la prueba es POSITIVA. Cuando no hay cambio de color ni crecimiento se dice que la prueba es NEGATIVA. Si no hay cambio de color, pero s hay crecimiento la prueba es DUDOSA. LECTURAS AGAR CITRATO

R/A

K/K

K/K

K/A

Muchas bacterias poseen descarboxilasas que atacan el aminocido lisina, con liberacin de aminas de reaccin alcalina y con produccin de CO2. Para que acten las descarboxilasas se requiere PH cido que se obtiene por la fermentacin de la glucosa que tiene el medio. La desaminacin de la lisina es un proceso oxidativo que se manifiesta por la aparicin de color rojo en el tendido, siendo el fondo del tubo amarillo por fermentacin de la glucosa que posee el medio. Tiene como fuente de azufre el TIOSULFATO DE SODIO, necesario para las bacterias puedan producir H2S y como indicador H2S, CITRATO FERRICO DE AMONIO el cual reacciona con el H2S produciendo un precipitado negro e insoluble de sulfato ferroso. Para que se produzca H2S se requiere de un medio cido por lo que dicha produccin

+ +d 4- AGAR UREA: Sembrar con asa recta, solamente en superficie. Principio: en agar UREA se determina la capacidad de un microorganismo de producir UREASA y desdoblar la urea, formando 2 molculas de amoniaco. Lectura. Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Fundamento: El sustrato urea es una diamina del cido carbnico, denominada carbamida. Todas las amidas (RCONH2) son Rpidamente hidrolizadas. La hidrlisis de la urea es catalizada por una enzima especfica que es la ureasa es una enzima microbiana importante, relacionada con la descomposicin de los compuestos orgnicos. Las enzimas bacterianas se clasifican en adaptativas o constitutivas. Una enzima adaptativa o inducida es aquella que es producida por una bacteria solamente cuando se encuentra presente su sustrato especfico. La ureasa es una

enzima constitutiva ya que la sintetizan ciertas bacterias sin tener en cuenta si hay o no el sustrato urea. El indicador de PH es rojo de fenol, el cual en alcalinidad vira a un color violeta indicando una prueba POSITIVA. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. LECTURAS AGAR REA

+ +d 5- AGAR SIM: sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo. Principio: EN AGAR SIM se determina la capacidad e un microorganismo de moverse (presencia e flagelos), de producir INDOL y H2S. Lectura: Se efecta de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de reactivo de ERLICH o Kovacs. Fundamento: el INDOL es uno de los productos del metabolismo del aminodico TRIPTOFANO. Las bacterias que poseen la enzima TRIPTOFANASA son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de indol, cido pirvico y amoniaco. El indol se puede detectar en un medio adecuado observando el desarrollo de un color rojo despus de agregar el reactivo de Erlich o de Kovacs indicando una prueba POSITIVA, debido a que el indol reacciona con el grupo aldehdo del p- dimetilaminobenzaldehido. Si el color es amarillo indica una prueba NEGATIVA. EL SIM es un medio semislido sin hidratos de carbono que inhiban la produccin de H2S y tiene TIOSULFATO DE SODIO fuente de azufre y HIERRO PEPTONADO como indicador de H_S, lo que lo hace ms sensible en la deteccin de H2S por produccin de un precipitado negro de sulfuro ferroso. La MOVILIDAD BACTERIANA es otra caracterstica importante en la identificacin final de especie, se realiza en medios semislidos como el SIM, debindose leer antes que la prueba de indol porque al agregar el reactivo de Erlich sta se puede enmascarar. La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscpico del medio para observar una zona de desarrollo difuso que parte de la lnea de inoculacin. LECTURAS AGAR SIM

Indol: + + H2S: + + 6- CALDOS MR-VP: sembrar en cada caldo con asa recta. Principio: En el caldo MRVP se determina por qu va metablica fermenta la glucosa la bacteria. Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Agregar 10 gotas de ROJO DE METILO al tubo MR, la aparicin inmediata de un color rojo indica que la prueba es positiva para MR, la aparicin de un color amarillo indica que la prueba es NEGATIVA. Al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de ALFA NAFTOL al 5%, mezclar fuerte despus de la adicin de cada reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparicin de un color rojo indica una prueba de VP POSITIVA, la aparicin de un color amarillo o caf indica una prueba de VP NEGATIVA. Fundamento: La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA ACIDA MIXTA con produccin de metabolitos como cido lctico, frmico y succnico, los cuales van a hacer descender el pH inicial del medio de 6.9 a 4.2, lo cual se visualiza al agregar el indicador de pH ROJO DE METILO, el cual a pH cido vira a un color rojo. La bacteria puede fermentar la glucosa por la VIA BUTILEN GLICOLICA con produccin de productos neutros como el ACETIL METIL CARBINOL (ACETOINA), el 2,3 BUTILEN GLICOL y el DIACETIL. El producto final ms frecuente es el 2,3 BUTILEN GLICOL, que es fcilmente oxidado a ACETIL METIL CARBINOL y luego a DI-ACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DIACETIL. El VP realmente es una bsqueda de DI-ACETIL, ya que las condiciones de la prueba convierten fcilmente los otros dos componentes en diacetil. Las 3 sustancias son neutras con el resultado de que PH del medio no baja sensiblemente y por lo tanto la bacteria es MR negativa y VP positiva. La bioqumica de la fermentacin de la glucosa hace muy poco probable encontrar cultivos MR y VP positivos. Lo s es ms probable es encontrar las 2 pruebas negativas en el caso de bacterias no fermentadoras. LECTURAS CALDO MR-VP

sr.

7- CALDO FENIL ALANINA- MALONATO: Sembrar con asa recta. Principio: En el caldo FENIL ALAININA MALONATO se determina la capacidad que tiene una bacteria de desaminar la FENILALANINA y de utilizar el MALOTO como nica fuente de carbono. Movilidad: + + + + +

Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Primero se lee la prueba de malonato si cambia al color azul indica que la PRUEBA es POSITIVA, si continua de color verde la PRUEBA es NEGATIVA. Para leer la prueba de la FENIL ALANINA agregar 10 g0tas de CLORURO FERRICO al 10%, MEZCLAR FUERTE. La aparicin de un color verde oscuro indica que la prueba es FENIL ALANINA POSITIVA. Si el color es amarillo castao la PRUEBA es NEGATIVA. Fundamento: la bacteria puede utilizar el MALONATO de SODIO como nica fuente de carbono con la consiguiente alcalinidad del medio. El indicador de PH es AZUL DE BROMOTIMOL que en alcalinidad vira al color azul. Algunas bacterias tienen la capacidad de desaminar la FENIL ALANINA produciendo ACIDO FENIL PIRUVICO por su actividad enzimtica, con la consiguiente acidez resultante. Este cido se visualiza al agregar el cloruro frrico. 8- MEDIO OF GLUCOSA (OXIDACIN FERMENTACIN de HUGH Y LEIFSON) : sembrar por duplicado con asa recta POR PICADURA CENRAL. A uno de los dos tubos agregar 1 ml de aceite mineral estril. Principio: Determinar si una bacteria presenta metabolismo FERMENTATIVO u OXIDATIVO de un hidrato de carbono. Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Fundamento: Algunas bacterias pueden metabolizar un hidrato de carbono (produccin de cido) solo en condiciones aerbicas, mientras que otras producen cido aerbica y anaerbicamente. La FERMENTACIN es un proceso ANAERBICO que requiere la fosforilacin inicial de la glucosa previa a su egradacin, mientras que la OXIDACIN en ausencia de compuestos inorgnicos como nitrato y sulfatos es un proceso estrictamente AEROBIO, que comprende la oxidacin directa de una molcula de glucosa no fosforilada (inicialmente). La fermentacin produce una acidez ms elevada que la producida por la oxidacin. El medio OF contiene una elevada concentracin de hidrato de carbono, con una baja concentracin de peptona, para obviar la posibilidad de que un organismo aerbico utilice la peptona, produciendo as una condicin alcalina que neutraliza la ms ligera acidez producida por una bacteria oxidativa. La baja concentracin de agar permite observar la movilidad del microorganismo, adems de la capacidad oxidativa o fermentativa, ya que permite la difusin por todo el tubo de la acidez. El indicador de PH es el AZUL DE BROMOTIMOL el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color azul. Cuando la bacteria es fermentadora los 2 tubos el tapado (tubo con aceite mineral) y el destapado van a presentar color amarillo).Cuando la bacteria es oxidadora el tubo tapado permanece de color verde y la superficie del medio destapado vira al color amarillo. Si la bacteria es NO SACAROLITICA (ni oxida ni fermenta) los dos tubos son de

color verde, aunque el tubo destapado en una superficie puede presentar un color azul por degradacin de peptonas producindose aminas. 9- GLUCOSA, LACTOSA y SACAROSA: sembrar cada tubo de hidrato de carbono con asa recta. Principio: Determinar si una bacteria FERMENTA o no stos hidratos de carbono. Con o sin produccin de gas. Lectura: se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin a 37C. Se debe observar cuidadosamente la campana de fermentacin o campana de DURHAM, para precisar si hay o no produccin de gas por desplazamiento de lquido de la campana. Fundamento: algunas bacterias pueden metabolizar (fermentar) diversos hidratos de carbono con produccin de cido, anaerbicamente. El indicador de PH es el ROJO DE FENOL que en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad al color rojo. 10- PRUEBA DE OXIDASA: coloque sobre las colonias 5 gotas de reactivo de OXIDASA. Observe la reaccin. Principio: determinar la presencia de las enzimas OXIDADAS. Lectura: se efecta despus de 10 a 15 SEGUNDOS despus de agregado el reactivo. Fundamento: la prueba de la oxidasa est basada en la produccin bacteriana de una enzima OXIDASA. Esta reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema CITOCROMOOXIDASA que activa la oxidacin del citocromo reducido por el oxgeno molecular, el que a su vez acta como aceptor de electrones en la etapa terminal del sistema de transferencia de electrones. Todas las bacterias aerbicas obtienen su energa por la respiracin, proceso responsable de la oxidacin de algunos sustratos . El oxgeno molecular oxida un sustrato con la intervencin del sistema de transporte de nectrones. El oxgeno es el aceptor de hidrgeno final, produciendo a partir del H_ agua o perxido de hidrgeno, segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico. El sistema citocromo slo se encuentra por lo general en los aerobios, lo que los hace capaces de utilizar el 02 como un aceptor de H2 final para reducir el O2 molecular en H202, el ltimo enlace de la cadena de la respiracin aerbica. Los diversos colorantes para la prueba de oxidasa son aceptores de electrones artificiales. La aparicin de un color violeta a negro indica la POSITIVIDAD de la prueba. RESULTADOS Compare sus resultados con los de sus compaeros, observe las diferentes lecturas en cada uno de los medios de identificacin. Identificacin del microorganismo: identifique el microorganismo que le correspondi con la ayuda de la tabla anexa. Cuestionario: 1. Cul es la prueba bsica que nos permite diferenciar los bacilos Gram Negativos fermentadores de lactosa de los que no lo son?

2. Consulte los gneros y especies Gram negativos ms importantes en la industria alimentaria y en salud pblica. 3. Para la identificacin temprana de la E. coli que pruebas se realizan (no es necesario hacer toda la batera). 4. Qu enterobacterias se utilizan como indicadores de calidad del agua, por qu? 5. Que medios selectivos se utilizan para Salmonella, Vibrin, Shiguella, Klebsiella. Cul es la importancia de estas bacterias en la salud pblica. BIBLIOGRAFIA - Koneman Elmer W. The Enterobacteriaceae in Diagnostic Microbiology. 5. Edicin,

Washington Square: Lippincott Raven Publishers, 1997: 173203 - Mac Faddin J. Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. Panamericana , 1980 -Koneman Elmer W.

Anexo: Tabla para identificacin Enterobacterias. guias.

Al final de las

LABORATORIO No. 7 TINCION O COLORACION DE ESTRUCTURAS. TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM INTRODUCCIN: La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario. La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoico. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas sern del color del cristal violeta, o colorante primario, y las clulas Gram negativas sern del color de la safranina que es el colorante de contraste. OBJETIVOS: 1. Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas de acuerdo a la tincin de Gram. 2. Conocer y aplicar las coloraciones de cpsula y esporas. 3. adquirir destreza en la realizacin de frotis ptimos para coloraciones. 4. Comprender la importancia que tienen estas tinciones para la caracterizacin e identificacin de las bacterias. 5. Describir el fundamento de cada coloracin. MATERIAL POR EQUIPO: - Microscopio ptico, - Colorantes para tincin de Gram - 1 mechero, - asa microbiolgica, gradilla para coloraciones - Recipiente de plstico para las tinciones, asa redonda, portaobjetos limpios. - Aceite de inmersin, Papel absorbente, lpiz de cera, Cultivos bacterianos jovenes: Gram positivos, Negativos, Klebsiella, Bacillus . PROCEDIMIENTO: 1. Marcar un portaobjetos con el nmero de la caja a observar. Cada equipo deber hacer obligatoriamente una tincin por cada caja. 2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar: en una gota de agua diluir una colonia, expandirla circularmente hasta que quede fino, si el extendido es grueso descartarlo y volver a realizarlo, pasarlo dos o tres veces sobre el mechero (fijacin). 3. Aadir 1 2 gotas de cristal violeta a la preparacin, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. 4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparacin con agua sobre el recipiente de plstico para tinciones. 5. Agregar 1 2 gotas de solucin lugol a la preparacin, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lava. 6. Con cuidado, aadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparacin durante 10 segundos. 7. Aadir el colorante de contraste, safranina (1 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lavar.

8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la tcnica de la prctica anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersin. RESULTADOS: describe brevemente los resultados obtenidos. Dibuja tus observaciones Gnero o especie: Aumento: ____ Morfologa: Gram: DISCUSIN Investiga qu tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan resultados no deseables cuando se realiza una tincin de Gram (por ejemplo que una bacteria Gram negativa se colore de morado). 2. COLORACION DE ESPORAS Mtodo de Schaeffer y Fulton:

i..Nigrosina (Tincin negativa). Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro. II..Mtodo de Hiss: Realizar un frotis con Klebsiella pneumoniae. Fijarlo. Cubrirlo con fuscina bsica. Llevarlo al calor hasta emitir vapores por 30 seg. Lave la preparacin con sulfato de cobre. Dejar secar, observar con 100 X.

Preparar un frotis de Bacillus cereus. Fijar con calor. Cubrir la placa con Verde de malaquita al 5%. Pasar la lamina 1 mn. sobre el mechero, hasta emitir vapores (no hervir, porque el colorante se evapora totalmente). Dejar la lamina con el colorante durante 3 mn ms sin calentar. Lavar con abundante agua. Cubrir el extendido con Safranina durante 2 mn. Lavar con abundante agua, dejar secar, limpiar la lamina por debajo y bordes. Observar con objetivo de inmersin. Interpretacin: Las esporas se ven de color verde y las bacterias de color rosado fucsia. 3. COLORACION DE CAPSULA:

Procedimiento 1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos. 2. Extender la muestra (Escherichia y Bacillus) en la gota con el asa de siembra. 3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que cubra toda la superficie del primero. 4. Secar al aire. 5. Observar (primero 40 y luego 100 con aceite de inmersin). CUESTIONARIO: a) Glosario. Defina los siguientes trminos. 1. Colorante 2. Mordiente 3. Tincin diferencial 4. Tincin simple 5. Peptidoglicano. b) Cul es la funcin y estructura de la capsulas y esporas? c) Cul es el fundamento de la coloracin de capsulas y esporas?.

LABORATORIO No. 8 CUANTIFICACION DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL La cintica de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones ms utilizadas por la ingeniera alimentaria y la biotecnologa, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, as como, la forma de cuantificacin de los mismos, sus formas de aplicacin, las ventajas y desventajas de los diferentes mtodos, y sobre todo el monto econmico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una informacin general acerca de los diferentes mecanismos de reproduccin bacteriana, as como de dar una idea acerca de la utilizacin de los mismos, sus caractersticas, especificaciones, y un anlisis de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos. CRECIMIENTO MICROBIANO: La divisin celular se efecta luego de un aumento en el tamao de la clula, duplicacin del ncleo, divisin celular, divisin citoplasmtica. De sta manera una clula da nacimiento a dos clulas hijas de tamao idntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades. En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es la gemacin o botn. Se forma una pequea protuberancia que aumenta progresivamente de tamao, luego se produce la divisin en el ncleo y migra hacia el botn. Finalmente crece hasta un tamao suficiente y posteriormente se separa formando otra clula idntica a la madre. Las clulas hijas, sin importar el procedimiento de divisin celular, deben heredar todo el potencial gentico y son idnticas. MEDICIN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO: El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos. Mtodos directos: Recuento del nmero de clulas en una cmara. Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA Mtodos indirectos: Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin. Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). Turbidimetra: Mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.
RECUENTO MICROSCPICO: Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa. Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos, aunque tambin pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas o teidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina). La mayor dificultad del recuento en cmara es obtener reproductibilidad en el llenado de la cmara con lquido. Otra dificultad es la adsorcin de las clulas en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorcin es crtica en el proceso de dilucin de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en medios de alta fuerza inica (solucin fisiolgica o medios mnimos sin fuente de carbono). Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. Una de las mayores ventajas del recuento microscpico es brindar informacin adicional sobre el tamao y la morfologa de los objetos contados. OBJETIVOS: 1. Determinar la cintica de crecimiento de E. coli, en caldo tripticasa de soya TSB. 2. Trazar la curva de crecimiento del microorganismo utilizando el mtodo turbidimetrico. 3. Calcular el tiempo de duplicacin, el coeficiente de correlacin y la ecuacin de la recta de la fase exponencial. MATERIALES Y REACTIVOS: Para cada grupo: Erlenmeyer con 45 ml de caldo TSB. (a 36C) Tubo con 5 ml de caldo TSB inoculado con E. coli. (mantenido a 36C) 8 tubos tapa rosca estriles.

ABSORCIN:

 1 pipeta 10 ml estril. Pipeteadores automticos. Cronometro. Para todo el curso: Cmara cuenta clulas. Microscopio. Espectrofotmetro. 50 ml de TSB estril para realizar los tubos blanco. PROCEDIMIENTO: Iniciar el equipo ubicando el filtro UV (650 aprox.) colocando en cero con el tubo blanco (caldo TSB estril) Marcar los tubos con el nombre del grupo y enumerarlos de 1 a 8. Siembra: Agregue al erlenmeyer con 45 ml de TSB los 5ml del medio activo con E. coli. Registrar esta hora (t=0) pipetear 6 ml en el tubo 1 y medir inmediatamente la absorbancia (No). Pipetear en los 7 tubos restantes 6 ml de TSB cultivo activo y llevar a la incubadora a 36C.

Limpiar la cmara y colocar el cubreobjetos en la parte central, agregar una gota del cultivo de bacterias, teniendo cuidado de no inundar la parte central. Enfocar con objetivo de exploracin para ubicar la cuadricula, pasar a 10X, 40 X y 100X. Seleccionar 4 cuadriculas centrales (de 25 cuadritos cada uno) y contar el numero de bacterias sacar el promedio: Media 14+15+13+14 / 4 = 14 bacterias en 25 cuadros. Y aplicar la frmula genrica siguiente: Si se encuentran 14 bacterias en 25 cuadros en la cmara cuantas bacterias habr en 16 cuadros? X = 16 * 14 / 25 = 224 / 25 = 8,96
Volumen de la cmara = 0.2mm x 0.2mm x 0,1mm x 25 = 0,1 mm3

Determine la DO. de cada caldo inoculado, teniendo en cuenta que la cubeta est libre de huellas dactilares o sustancias que impidan la real lectura. Completar la siguiente tabla teniendo en cuenta los siguientes tiempos: TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8
LECTURA A Hora lectura absorbancia Recuento cmara
RECUENTO EN CAMARA:

8.96 bacterias X 400 cuadros X inverso dil.(10) =bacterias /ml 16cuadros 0.1mm3 1ml = Otra frmula ms sencilla es: Promedio bacterias contadas X 25 X 10 X 10= bacterias/ml Donde 25 numero de cuadritos 10= factor de correccin de la cmara 10= inverso de la dilucin. RESULTADOS: Trazar la curva de crecimiento por los dos mtodos. Calcular el tiempo de duplicacin (g) Encontrar la ecuacin de la recta en fase exponencial. Cuestionario: 1. por qu el crecimiento exponencial origina grandes poblaciones celulares en cortos periodos de tiempo? 2. Que es una representacin semilogaritmica? 3. Cuando no se presenta fase de latencia? 4. Por que entran las bacterias en fase estacionaria? 5. Que mtodos se utilizan para la cuantificacin de clulas? Qu ventajas y desventajas tiene cada uno? 6. Por qu un recuento de viables es mas sensible que un recuento microscpico? 7. Cul es la diferencia entre la constante de la velocidad de crecimiento (k) de un organismo y su tiempo de generacin (g).

5 mn

10 mn

20 mn

30 mn

60 mn

90 mn

120 mn

150 mn

Procedimiento:

LABORATORIO No. 9 y 10 CULTIVO DE HONGOS Y LEVADURAS INTRODUCCION: Los dermatofitos son el grupo de hongos ms homogneo segn sus requerimientos y su poder patgeno. Segn su hbitat se han clasificado en geoflicos, zoofilicos y antropofilicos lo cual es importante para saber de donde proviene la infeccin que se est estudiando. Tambin son capaces de invadir diferentes sitios: el gnero Trichophyton ataca la piel, pelo, uas; Microsporum lesiona piel y pelo Epidermophyton ataca piel y uas. La identificacin de las especies de dermatofitos se hace a partir de los cultivos, los cuales se realizan cuando se sospecha enfermedad y a pesar de que en el examen directo KOH no se hayan observado hongos. Las muestras se siembran en agar sabouraud modificado, se incuban de 22 a 27 C, se mantienen en la oscuridad de 5 das a 3 semanas. OBJETIVOS: 1. Realizar tcnica de siembra de hongos macro y microcultivos, y reconocer la importancia de estos en el logro de la esporulacin de los dermatofitos. 2. Realizar placas de hongos: examen directo con KOH y teidas con azul de lactofenol. 3. Reconocer microscpicamente estructuras morfolgicas de los hongos filamentosos y mohos: micelio (septado y aseptado), micro y macroconidias, artrosporas, clamidosporas. 4. Reconocer las estructuras de levaduras: pseudomicelios, blastoconidias. MATERIALES: Cultivos puros de: Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton, Aspergillus, Fusarium, Penicillum, Cndida. Porta y cubreobjetos, agujas de diseccin, mecheros. KOH al 10% y azul de lactofenol. Para cada grupo: 1 Caja de agar sangre. Tres cajas de agar sabouraud. 1 caja Petri estril, 1 porta y cubreobjetos estriles, una cuchilla de bistur estril, palillos, 1 pinza o depilador estril, papel absorbente. Para todo el grupo 5 cajas con agar sabouraud de 18 mm de grosor. Agua destilada estril. PROCEDIMIENTO: 1. TECNICAS DE SIEMBRA DE HONGOS A. MACROCULTIVOS. Las cajas deben estar a temperatura ambiente, se beben marcar en el borde, en la base de la caja. En cada caja sembrar un hongo diferente. Con el asa recta, previa esterilizacin y enfriamiento, coger de la parte externa de la colonia una porcin del cultivo suministrado. Inocular la muestra tomada en el agar sabouraud, haciendo un pinchazo en el centro. Garantizando que se sembr en profundidad. Sellar la caja con papel microfilm o cinta. Incubar las cajas en un sitio oscuro preferiblemente, a temperatura ambiente (22 a 25C) ms de cinco das o hasta la prxima prctica de microbiologa. B. MICROCULTIVOS: Tcnica Ridell o en Bloque. Esta tcnica de cultivo induce al hongo a la esporulacin necesaria para su identificacin. Los medios utilizados para esta tcnica son: agar arroz, agar smola de maz. Ubicar cerca al mechero todos los materiales necesarios, los cuales deben estar estriles. Marcar las cajas de la manera indicada. En la caja Petri estril, colocar el papel absorbente (o filtro) humedecerlo con unas gotas de agua destilada estril, colocar dos palillos en los lados opuestos de la caja los cuales sern el soporte del portaobjetos estril para que no que en contacto directo con el papel humedecido. Con el bistur estril cortar un cuadro de 1 cm de lado del agar, con el mismo bistur sacar cuidadosamente el cuadro y colocarlo en el centro del portaobjetos estril. Con el asa recta (esterilizada y fra) coger una muestra del hongo suministrado, y sembrarlo picando los lados y el centro del cuadro de agar. Con ayuda de una pinza o depilador colocar el cubreobjetos sobre el cuadro de agar. Tapar la caja Petri, con mucho cuidado sellarla con cinta o papel microfilm. Incubarla a temperatura ambiente, revisando peridicamente si hay desarrollo del hongo (1 semana a 1 mes). C. Cultivo de levaduras: En la caja de agar sangre sembrar en estra para aislamiento una colonia de levaduras. RESULTADOS. Una vez se haya desarrollado el hongo en la tcnica de: A.MACROCULTIVO: 1- Observar y describir las caractersticas macroscpicas de las colonias, dibujar o fotografiar y realizar un cuadro comparativo entre los tres gneros que sembr. 2- Observacin microscpica: a. En un portaobjetos colocar una porcin del hongo tratando de expandirlo, adicionar una gota de KOH al 10%, cubrir con el cubreobjetos. Observar en 40 X. b. En un portaobjetos limpio colocar una gota de AZUL DE LACTOFENOL, coger con la aguja de diseccin una porcin del hongo y extenderlo en la gota, no macerar la muestra ni disolverla. Colocar el cubre hacer una ligera presin y observar en 40X. Dibujar o fotografiar identificando las estructuras observadas en cada una de las preparaciones.

B.MICROCULTIVO: Para observar el desarrollo de la esporulacin: con ayuda de una pinza colocar el cubreobjetos del microcultivo en otro portaobjetos con una gota de azul de lactofenol. Observar en 40X, dibujar o fotografiar e indicar las estructuras observadas. D. LEVADURAS: Del cultivo de levaduras realizar una lmina y colorear con Gram. Observar en 100X, fotografiar indicar estructuras observadas. De un tubo germinal realizar un montaje hmedo, observar en 40X fotografiar e indicar estructuras observadas.

CUESTIONARIO 1. Cite 10 indicaciones se deben seguir para evitar la contaminacin con hongos del ambiente. 2. Qu es y que funcin cumple el micelio areo y el vegetativo? 3. Cules son las levaduras de inters industrial. 4. Cules son los hongos del ambiente del laboratorio. Anexar los resultados de esta prctica: descripciones,

caractersticas, fotografas, identificacin de estructuras: conidias, fialides, esparangioforos, macroconidias, tipo de hifa, esterigmas, clamidosporas, etc.

LABORATORIO No 11 Y 12. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS. CARACTERIZACION FENOTIPICA. B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es -4 -7 Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los necesario detectar bacterias que suponen entre 10 y 10 de alimentos. Generalidades sobre la toma de muestras y el la flora normal del alimento, flora sta inocua. Es necesario anlisis microbiolgico de los productos finales: Principios utilizar medios selectivos para detectar estos ecolgicos, Fundamentos de los procedimientos analticos microorganismos presentes en proporciones tan bajas. (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los Como norma general conviene probar experimentalmente los alimentos, transporte de muestras, confianza en los medios usados para determinar su selectividad y su procedimientos, dao o lesin subletal, evaluacin productividad; as como no debe usarse un medio diseado sistemtica de los medios de cultivo): Necesidad de valores para un producto en otro producto diferente porque las de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras condiciones ecolgicas pueden ser diferentes dando lugar a representativas. Utilizacin de microorganismos como una distorisin de los resultados. marcadores (ndices e indicadores). B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos 1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los pueden producir daos subletales en los microorganismos alimentos. que no pueden, en esas condiciones, ser sometidos El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter rigurosamente a medios selctivos. Son necesarios medios de preventivo sino que simplemente es una inspeccin que recupe-racin en los que hay que considerar: (a) El tipo de permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede microorganismo a recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el y la intensidad del dao infligido, (c) El tipo de alimento en el anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es que est el microorganismo y (d) El medio selectivo final. determinar en la Industria cules son los puntos de riesgo de Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a contaminacin o multiplicacin microbiana (los llamados seguir. De una forma general, hay dos tipos de tratamiento de Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un cdigo recuperacin: recuperacin en lquido (2 h. 25 en agua estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y Distribucin del peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar, incubando alimento (BPE). luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido del tratamiento selectivo La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar (siembra en medio selectivo o recubrimiento con agar blando productos de baja calidad microbiolgica y no en comprobar selectivo). la calidad microbiolgica de los ya elaborados (lo que, por 3. Muestreo. otra parte, presenta una relacin coste - beneficio muy baja El muestreo consiste en separa una serie de muestras por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar). representativas del lote para someterlas al anlisis Fundamentos de los procedimientos analticos: microbiolgico. B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en A. Muestreo nico los alimentos: El factor ms importante en el anlisis es el Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de muestreo, que incluye: (a) Evaluacin de la muestra necesaria alimento hay que considerar que los datos de mayor para evitar la distorsin producida por los microorganismo importancia los proporcionan las normas de elaboracin y que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por conservacin del alimento. Esto es especialmente importante ejemplo de las canales o de las mquinas, sistemas de en partidas de alimentos importados, sobre todo los alimentos heterogneos (ensaladas, platos congelados, etc.); enlatados. (b) Determinacin del modo ptimo de remocin del Como norma general, si se trata de un lote desconocido es micoorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La conveniente analizar un nmero de muestras equivalente al evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o 1% si el lote es grande y al 10% si es pequeo. Aunque estos transporte de muestras. valores hay que adecuarlos a las condiciones reales. B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de durante el transporte de las muestras se produzca: (a) seguimiento son las especificaciones del fabricante. Las Multiplicacin de los microorganismos presentes y (b) muestras nicas estn siempre sometidas a una gran Inactivacin de algn microorganismo. probabilidad de falsos negativos. En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas B. Anlisis repetido. del entorne de 0 C por un tiempo no superior a las 24 horas, Se pueden definir dos tipos de riesgo microbiolgico: (a) el excepto en el caso de grmenes termotrofos. riesgo del consumidor: probabilidad de aceptacin de lotes

substndar y (b) el riesgo del fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substndar. Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al consumidor. C Planes de muestreo de tres categoras. Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma microbiolgica establecida conforme a los valores microbiolgicos de referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos en que el obtener valores ms altos que los de referencia no hace inaceptable el alimento]. D. Toma de muestras representativas. Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de seleccionarse stas de forma estadsticamente representativa utilizando tablas de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe homogeniezar la muestra usando batidoras o stomacher. 4. Utilizacion de los microorganismos como marcadores (indices e indicadores). A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin. Historicamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli y posteriormente, el grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de contaminacin final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi. En todo Control Microbiolgico de calidad destacan dos aspectos : Calidad Higinico - Sanitaria : que no se distribuyan microorganismos patgenos para la salud . Calidad Comercial : presencia de microorganismos alterantes , que alteren el producto hacindolo no comestible ( aunque no sean patgenos ) OBJETIVOS: 1. Conocer y aplicar el protocolo adecuado para el procesamiento de muestras para anlisis microbiolgico. 2. Determinar el grado de contaminacin de un alimento a partir del anlisis microbiolgico. 3. Establecer el tipo y el nmero de microorganismos presentes en el alimento analizado. MATERIALES: Cada grupo debe traer al laboratorio aproximadamente 12 gr de un alimento. Para cada grupo 1 erlenmeyer con 99 ml de agua peptonada al 0,1% 3 tubos con 9 ml cada uno de agua peptonada (gradilla) 9 tubos con caldo Bilis verde brillante ( cada tubo con campana de Durham)

2 cajas de agar E.M.B. 3 tubos con caldo Brilla. (campana de durham) 3 tubos con caldo Triptona . (campana de durham) 1 erlenmeyer con 90 ml de agar Plate Count fundido. 1 erlenmeyer con 90 ml de agar Ogy o saboraud Fundido. 8 cajas petri estriles 5 pipetas de 1 ml estriles. 20 puntas amarillas estriles Pipeteador automtico, perilla plstica. Pipeta automtica (micropipeta) de 100 ul. (rotar para todos los grupos) 1 mortero completo 1 bistur nuevo ( estril) Mechero, incubadora a 37 C, bao Mara a 44,5 C (esta temperatura es critica), Reactivo de Kovacs (gotero) balanza analtica,

PROCEDIMIENTO. 1. DILUCIN DE LA MUESTRA (ALIMENTO): 1.1. Tener en cuenta las normas de bioseguridad y asepsia en el sitio de trabajo, Iniciar lo antes posible. Pesar 11 gr del alimento (en papel aluminio) el alimento debe estar descongelado y a temperatura ambiente en el momento de iniciar. 1.2. Desinfectar el rea de trabajo y los empaques que contienen el alimento (bolsa plstica, lata, embase, etc) si el alimento es liquido mezclar antes de hacer la dilucin. 1.3. Si el alimento es liquido se hacen las diluciones en tubo midiendo 1 ml de la muestra y transfiriendo a un tubo con agua peptonada, se mezcla y se transfiere 1 ml al siguiente tubo, as sucesivamente. 1.4. Si el alimento es slido: en un mortero estril colocar los 11 gr de alimento y partirlo en pedazos muy pequeos (triturar). -1 -4 1.5. Se preparan las diluciones 10 hasta 10 Alimento 11 gr + 99 ml

1ml

1 ml

1 ml

10

-1

10

-2

10

-3

10

-4

2. INOCULACION DEL ALIMENTO: 2.1. PRUEBA PRESUNTIVA PARA COLIFORMES TOTALES: Pipetear 1 ml de cada una de las diluciones en tubos con caldo Verde Bilis Brillante (Brilla) utilizando tres tubos por cada dilucin. Asegurarse que las campanas de Durham estn libres de burbujas. Incubar los tubos a 37Cpor 24 48 horas.

Los tubos con produccin de gas se deben sembrar en agar EMB, incubar a 37 C por 24 48 horas.

2.2 PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES Y FECALES: Confirmar que los tubos con produccin de gas (burbujas o desplazamiento tubo de Durham) son positivos, inoculando 100 ul de cada tubo positivo en un nuevo tubo con caldo Brilla y otro con caldo Triptona (+ tubo Durham) Incubar estos tubos en bao Mara a 44,5 C por 24 horas. Pasadas las 24 horas registrar los tubos que presentaron produccin de gas. Al caldo triptona agregar 4 gotas de reactivo de kovacs mezclar suave y observar la formacin de un anillo rojo en la superficie del tubo, reaccin que indica que la prueba es positiva. 2.3 RECUENTO DE MESOFILOS: (: agar cuenta grmenes) Indica contaminacin durante la elaboracin o empaque. Marcar dos cajas petri por dilucin. En cada caja petri (duplicado) colocar 1 ml de cada dilucin. Inmediatamente agregar a cada caja petri agar fundido PLate Count . Mezclar haciendo crculos hacia la derecha, izquierda, arriba y abajo garantizando que el inoculo quede bien diluido en el agar ( tener cuidado de no manchar la tapa de la caja) Dejar solidificar el agar e invertir las cajas, incubar a 37 C por 24 horas. Observar los resultados. 2.4 RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS (agar Ogy o Sabouraud)Indica contaminacin por manipulacin de personas contaminadas, contaminacin por el aire durante el empaque o almacenamiento inadecuado. Realizar el mismo procedimiento que en recuento de mesofilos pero agregar agar fundido Ogy o Sabouraud. Dejar solidificar , invertir las cajas, incubar a temperatura ambiente durante 5 a 8 das 3. INTERPRETACIN DE RESULTADOS: 3.1 DETERMINACION DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Registrar el nmero de tubos positivos por cada dilucin e interpretar en la tabla NMP. Anexo. Ejemplo: -1 -2 -3 10 10 10 NMP 2 0 1 0.68

prueba de Kovacs (caldo triptona) de la prueba confirmativa para coliformes totales y fecales. Realizar el recuento de colonias para mesofilos y hongos: Escoger la caja que contenga entre 30 y 300 UFC y multiplicar por el factor de dilucin, reportar con dos dgitos y potencia de 10, cuando el tercer digito es igual o mayor de 5 se aproxima a la unidad al digito anterior si es menor se anula. Ejemplo: dilucin Numero de reporte colonias -2 3 10 128 = 12800 1.3 x 10 --3 4 10 262 = 262000 2.6 x 10

4. CUESTIONARIO: A. Qu importancia tiene el anlisis microbiolgico de los alimentos, de tres ejemplos concretos. B. Qu valor tienen las pruebas presuntiva y confirmativa en un anlisis de alimentos? C. Que pruebas (medios de cultivos) se realizan para la determinacin de Staphylococcus coagulasa positivo, Salmonella, Vibrio cholerae. D. Cules son los parmetros que establece el INVIMA sobre la presencia de microorganismos en los alimentos, (escoja cuatro alimentos) ejemplo: NORMA INVIMA Pescados y mariscos min. MAX Coliformes Fecales 4 400 Staphylococcus C.P. 100 1.000 Salmonella 0 0 V. cholerae 0 0 E. Anexar la evidencia de los resultados del laboratorio.

Las cajas de agar EMB: observar si hay crecimiento de colonias con brillo verde metlico, deben coincidir con la

E. Escherichia coli disenteriae REACCION

Shigella flexnery sonnei boydii

Salmonella Citrobacter enteriditis diversus freundy arizona typhi

Klebsiella rinoscienoma tis neumoniae ozaenae

Serratia liquefaciens marcescens rubidae

Enterobacter aerogenes mirabilis cloacae hafniae

Proteus

Providencia alcalifaciens marsumi stuartii N N R/A P N P-N P P N ratgeri N P-N R/A P P P P P N

TSI TSI (H2S) TSI GAS LIA C. SIMONS UREASA

A/A K/A K/A K/A K/A K/A N P N N N N N N N N d N

K/A KA/A KA/A KA/A A/A A/A A/A A/K A/K A/K A/A K/A KA/A A/A A/A A/A KA/A KA/A KA/A P P K/A P-d N P N P N P-N P K/A P d P N-P P N N P K/A P d P P P N P P N P N P N P N N N d N P N P N P P P P P N P-N N d

P-N P-N

K/A K/A K/A K/A K/A K/A N N N N N N N N N N N N N N N P N N N P N P N

K/A K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K K/K R/A R/A R/A R/A P N P N P N P P N N N-P P d d N N P N N N N N P N P d P N P d P N P d P N P P-N P N N P P N P N N P d N P N N-P P P P P N P N-P d P P P P N N P-N P-N P-N P-N N P N P P P N

MOVILIDAD P-N INDOL ROJO DE METILO VOGES P. P P N

N-P P-N N-P P N P-N N P N

N-P N-P N-P P N-P P

RESULTADOS: Cultivo No._____________

Pruebas Bioquimicas. TSI________ H2S________ Gas_______ LIA__________ C.Simons_____________ SIM: Indol_________ Movilidad__________ Ureasa__________ Rojo de metilo__________ Voges Proskawer__________ Microorganismo: gnero_____________________especie________________

vulgaris