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Il sistema eritrocitario AB0

Il sistema eritrocitario AB0


Biochimica Genetica Espressione Gruppi principali e loro varianti: nomenclatura Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

Metodiche
Significato clinico

Biochimica

La storia: Karl Landsteiner


1901: Mescolando sangue e siero di pazienti diverso identific i gruppi AB0.

http://www.nobelpreis.org/castellano/medizin/images/landsteiner.jpg

Daniels 2002

- gli antigeni ABH e Lewis sono composti da carboidrati


- lespressione e la distinzione degli antigeni H, A, B e Lewis dipende dalla natura del monosaccaride terminale immunodominante - La presenza di uno specifico zucchero determinata dallazione di uno specifico enzima (transferasi) codificato a livello genico - le catene di oligosaccaridi possono legarsi a polipeptidi per formare glicoproteine, a ceramidi per formare glicosfingolipidi e a lipidi per formare glicolipidi

- i complessi oligosaccaridici sono parte integrante della membrana eritrocitaria, delle cellule epiteliali ed endoteliali e possono essere riscontrati in vari tipi di secrezioni umane

La molecola di base su cui vengono costruiti gli antigeni A, B e H detta Precursore


Precursore = catena oligosaccaridica legata sia a glicosfingolipidi (GR) o a glicoproteine (secrezioni).

Globulo Rosso

Glucosio Galattosio N-acetilglucosammina Galattosio

Sostanza Precursore

Mediante laggiunta di uno zucchero alla sostanza precursore viene ottenuto lantigene H.
Questa la base su cui si costruiscono gli antigeni A e B. I geni A e B codificano per enzimi che aggiungono uno zucchero immunodominante allantigene H.

Formazione dellantigene H
Il gene H codifica per un enzima che aggiunge uno zucchero (Fucosio) allo zucchero terminale della sostanza precursore. La struttura biochimica costituisce l Antigene H. (lallele h amorfo.)
Globulo Rosso

Glucosio

Antigene H

Galattosio

N-acetilglucosammina
Galattosio Fucosio

Formazione dellantigene A
Globulo

Il gene A codifica per un enzima che aggiunge GalNAc (N-Acetil-D galattosammina) allo zucchero terminale dell Antigene H

Rosso

Glucosio
Galattosio N-acetilglucosammina Galattosio N-acetylgalattosammina

Fucosio

Formazione dellantigene B
Globulo Rosso

Il gene B codifica per un enzima che aggiunge D-Galattoso allo zucchero terminale dell Antigene H.

Glucosio
Galattosio N-acetiglucosammina Galattosio Galattosio

Fucosio

L antigene H si trova solo sui GR in presenza del genotipo HH e Hh ma NON nel genotipo hh (rarissimo).

L antigene A si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e A/A, A/0 o A/B.

L antigene B si trova nei GR in presenza dei genotipi Hh, HH, e B/B, B/0 o A/B.

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Genetica

Localizzazione cromosomica dei gruppi sanguigni

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Genetica degli antigeni ABO


1. H gene H e h alleli (h amorfo). Si trova sul cromosoma 19.
2. AB0 geni alleli A, B e 0. Si trovano sul cromosoma 9. 1. Se gene Se e se alleli (se amorfo); lallele Se presente nell80 % della popolazione. Si trova sul cromosoma 19.

Stato di secretore
Il gene Se codifica per la presenza dellantigene H nelle secrezioni biologiche, quindi la eventuale presenza dellantigene A e/o B nelle secrezioni oltre alla presenza dei rispettivi geni (A e B), dipende dalla presenza del gene Se e dellantigene H
antigene A Gene Se (SeSe o Sese) Antigene H nelle secrezioni
e/o

antigene B

Gene se (sese)

Nessun antigene A, B o H presente nelle secrezioni

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Genotipo 00

Fenotipo 0

A0 AA B0 BB AB

A
B AB

Generazione parentale: omozigoti 1 Generazione: eterozigoti

Accoppiamento con eterozigoti A0 / B0

2 Generazione: eterozigoti

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Esempio 1

P1:

Padre fenotipo A

Madre Fenotipo A

F1:

Figlio 1 fenotipo 0

Figlio 2 Fenotipo A

Genotipi?

Esempio 1

P1:

Padre fenotipo A genotipo A0

Madre fenotipo A genotipo A0

F1:

Figlio 1 fenotipo 0
genotipo 00

Figlio 2 fenotipo A
genotipo AA o A0

Genotipi?

Esempio 2

P1:

Padre fenotipo AB

Madre fenotipo A

F1:

Figlio 1 fenotipo 0

Figlio 2 fenotipo A

Genotipi?

Espressione

La grande maggioranza (ma non tutti) degli antigeni H nel gruppo A e B vengono trasformati in antigeni A o B
A A Gruppo O Gruppo A A A

Molti Antigeni H

Pochi Antigeni H

Maggiori quantit di H

O > A2 > B > A2B > A1 > A1B

Minori quantit di H

Fenotipo Bombay (Oh)


Dipende da un genotipo hh
I globuli rossi sono privi di antigeni H e quindi anche degli antigeni A e B c solo la sostanza precursore Descritto per la prima volta a Bombay, India I GR NON sono agglutinati da anti-A, Anti-B o Anti-H (Ulex europaeus - lectina) Il Siero ha attivit anti-A, anti-B e anti-H; agglutina quindi tutti i gruppi ABO.

Che gruppo ABO usereste per trasfondere questi pazienti ?

Antigeni A e B :Una funzione ?


Sconosciuta ! Soggetti AB pi resistenti al colera Lo stato di secretore conferisce ulteriore protezione Soggetti 0 pi resistenti alla malaria Forse rimasti per pressione selettiva positiva

Espressione antigeni AB0


Membrana eritrocitaria Tessuti endotelio vasi sanguigni epitelio degli organi di secrezione ed escrezione

Secrezioni (quando presente Se)


saliva succhi gastrici liquido seminale fluidi di cisti ovariche Latte Urine

Gruppi principali e loro varianti

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Sottogruppi ABO
I sottogruppi ABO differiscono nella quantit
di antigene presente sulla membrana dei GR: hanno meno antigene Sono il risultato della presenza di trasferasi meno efficienti nellaggiungere gli zuccheri

immunodominanti alla sostanza H


I sottogruppi di A sono pi frequenti di quelli di B

Sottogruppi di A: A1 e A2
I due principali sottogruppi di A sono: A1 e A2
Entrambi reagiscono fortemente con anti-A Per distinguere A1 da A2 si pu utilizzare la lectina Dolichos biflorus (anti-A1) La Lectina anti-H reagisce fortemente con le emazie A2 (meno antigeni A sul GR) 80% degli individui di gruppo A o AB sono di suttogruppo A1, 20% are A2 and A2B Circa 1/10 dei soggetti A2 hanno anticorpi anti A1 che generano una discrepanza nella prova indiretta con A1 Risoluzione: La prova indiretta con emazie A2 negativa, la reazione con la lectina anti- A1 negativa.

N. siti antigenici sulla superficie degli eritrociti

Gruppo A1

8 - 12 x 105

Gruppo A2

1 - 4 x 105

Gruppo A1B

5-9x

105

Gruppo A2B

1 x 105

Gestione trasfusionale dei soggetti A2


Gli anticorpi anti A1 prodotti da un soggetto A2 sono nella stragrande maggioranza dei casi NON clinicamente significativi (anticorpi freddi) Ad un soggetto A2 si possono quindi trasfondere emazie A1

Altri sottogruppi A
Vi sono altri sottogruppi anche se molto pi rari:
Aint (intermediate), A3, Ax, Am, Aend, Ael, Abantu

Le emazie A3 danno una reazione a campi misti quando cimentati con anti-A policlonali, possono contenere anti-A1 I gruppi Ax, Am, Ael danno una reazione diretta perfettamente negativa, la presenza dellantigene sospettata dalla completa assenza di reazione sierica con le emazie A.
Non noto come queste emazie vengano tollerate in caso di trasfusione a soggetto 0.

Sottogruppi B
I sottogruppi B sono ancora pi rari degli A Si differenziano per il tipo di reazione con i rispettivi sieri anti-B, anti-A,B, antiH Quelli noti sono: B3, Bx, Bm, and Bel

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Tratto da: F. Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news 2006

Qualche problema con la nomenclatura

AB0 e Lewis: uno stretto legame


Sistema Lewsi: Ag Lea e Leb Risultano dalla azione di una glicosiltrasferasi codificata da un allele Le che aggiunge uno zucchero ad una catena precursore Lea prodotto quando Le ereditato con alleli sese (soggetti non secretori) Leb quando Le ereditato con almeno un allele Se (secretori) Se si eredita lallele amorfo le, non si produrr alcun antigene Lewis Le(a-b-) Lea e Leb non sono antigeni antitetici ma risultano dalla interazione di alleli ereditati indipendentemente Gli antigeni Lewis non sono intrinseci alla membrana dei globuli rossi ma sono espressisu glicosfingolipidi adsorbiti dal plasma sulla membrana

Tratto da: AABB Technical Manual. 15th Edition 2005

Anticorpi diretti verso gli antigeni AB0

Gli Anticorpi Regolari: la regola di Landsteiner


Soggetti normali e sani possiedono NATURALMENTE
gli anticorpi anti-A o anti-B diretti contro gli antigeni A o B che assente sui loro Globuli Rossi

In altre parole NON richiedono una esposizione


(trasfusione o gravidanza) ad emazie estranee NON sono presenti alla nascit, e perci si pensa siano stimolati da antigeni ambientali (probabilmente batterici) a cui siamo tutti esposti

Anticorpi anti-A / anti-B


Le IgM sono predominanti negli individui di Gruppo A e di gruppo B
Anti-A Anti-B

IgG (con una minoranza di IgM) lanticorpo predominante negli individui di gruppo 0
Anti-A,B ( con alcuni anti-A e anti-B)

Reagiscono a Temperatura Ambiente Attivano facilmente il complemento ( sopratutto le IgM) Sono ad alto titolo (grado di reazione 4+)

Anticorpi AB0: evoluzione con let


Di solito compaiono dopo 3-6 mesi di vita Ma i neonati possono acquisire passivamente le IgG materne: NON SI DEVE FARE la PROVA INDIRETTA (sierica) nel sangue dei neonati Titolo stabile a 5-6 anni Declinano nellanziano

Anti-A1
Individui di gruppo O e B presentano anti-A nel loro siero Tuttavia gli anti-A possono essere divisi in due categorie distinte: anti-A e anti-A1 Infatti lantigene A presente in due forme A1 e A2 Anti-A1 agglutina solo lantigene A1 non l A2 Lanti-A agglutina entrambi; non esiste un anti-A2. Una piccola parte dei soggetti A2 pu sviluppare anti-A1 In questo caso si di fronte ad una discrepanza alla tipizzazione Gli Anti-A1 sviluppati dagli A2 non danno pressoch mai luogo a conseguenze cliniche in caso di trasfusione con sangue A

Anti-A,B
Presenti nel siero dei soggetti di gruppo 0 Reagisce con emazie A, B, ed AB Sono prevalentemente IgG (con una piccola quota di IgM) Anti-A,B un singolo anticorpo, non una miscela di anti-A and anti-B

Metodiche

Tipizzazione AB0
La determinazione del gruppo AB0 deve necessariamente includere:
una prova diretta sugli eritrociti con utilizzo di antisieri specifici con anticorpi monoclonali anti-A, anti-B , antiA,B un indagine indiretta sul siero/plasma dello stesso soggetto utilizzando emazie di gruppo noto (A1, A2 e B) Ciascuna delle due indagini rappresenta il controllo dellaltro. Basta un campione anticoagulato con EDTA

Tipizzazione AB0 risultati attesi


Rezione delle emazie da tipizzare con: Reazione del siero del sangue da tipizzare con: Emazie Emazie

anti-A anti-B 1 2 3 4 0 + 0 + 0 0 + +

A1 e A2

gruppo AB0

%
Caucasici

%
Africani.

+ 0 + 0

+ + 0 0

0 A B AB

45 40 11 4

49 27 20 4

Anti-B Anti-A Anti A,B

GR-A1 GR-A2 GR-B

Discrepanze AB0:
Una discrepanza si ha quando la prova diretta (globulare) non confermata da una prova indiretta (sierica)
Paziente

Anti-A
4+ 0 4+ 0

Anti-B
1+ 4+ 4+ 3+

GR A1
0 1+ 1+ 0

GR B
4+ 0 0 0

1 2 3 4

Discrepanze AB0: dovute a 2 situazioni:


Problemi con i Globuli Rossi
Antigeni con debole/assente reattivit Extra antigeni Reazioni a campo misto Trasfusioni recenti con GR non-omogruppo

Problemi con il Siero


Anticorpi con debole/assente reattivit Extra anticorpi

Che fare?
Identificare la causa Escludere innanzitutto un problema tecnico
Provetta sbagliata/ mal etichettata Reagente non dispensato

Primi passi: ripetere il test sullo stesso camione ; richiedere un ulteriore campione; lavare le emazie In alcuni casi ci sono delle vere discrepanze legate a fattori globulari (GR) o sierici

Cosa fare con una discrepanza irrisolta e/o in emergenza?


Escludere un fenotipo Bombay Escludere la presenza di un alloanticorpo freddo potenzialmente significativo (cross match negativo) In urgenza trasfondere gruppo 0

Sapr farlo funzionare?

Possibili cause delle discrepanze di gruppo ABO Diretto


(cellulare) Ag Mancanti
/ Deboli Sottogruppi A/B Extra Ag

Determinazione Gruppo

Indiretto (sierico)
Mancanti Deboli Neonati / anzianii / immunocomp romessi

Campo misto

Extra

B Acquisito
(A1 malattia intestinale)

Trasfusione di gruppo 0

Anti-A1

Malattia
(leucemia)

Fenotipo B(A)
Rouleaux (impilamento) Autoanticorpi Freddi Gelatina Wharton (cordone) Esposizione antigene T (sepsi)

Trapianto di midollo

Alloanticorpi Freddi

Fenotipo A3
Possono causare tutte reazioni positive (panagglutinazione)

Rouleaux (impilamento)

Autoanticorpi Freddi

Discrepanze nella tipizzazione ABO diretta: risoluzione problemi


FALSI NEGATIVI
Aggiunti i reattivi ??

FALSI POSITIVI
Eccessiva centrifugazione

Lemolisi una reazione Reagenti/campioni positiva !! (Ac freddi anti A-B- contaminati da batteri H-Lea) Errato rapporto antisiero/cellule Insufficiente centrifugazione Sbagliata interpretazione o registrazione

Incubazione a T > 20-24 C

Discrepanze nella prova indiretta ABO: risoluzione problemi


Coaguli di fibrina Conc. Anomala di proteine, HMW plasma expanders: formano rouleaux visibili al microscopio; diluire il siero con salina Agglutinine a freddo nellantisiero: reazioni pi deboli; preriscaldare lantisiero Immunodeficit (et, patologia, terapia): verificare la diagnosi o let

Biologia molecolare e immunoematologia


Nel 1986 stato clonato il gene del sistema MN (gene GYPA) Le basi molecolari di 28 su 29 sistemi di gruppo sanguigno sono state definite Partendo da tests su DNA genomico, possibile predire con un buon grado di accuratezza i fenotipi dei principali gruppi sanguigni

Genotipo=AelB1 Fenotipo=AelB

Significato clinico

Perch il sistema AB0 importante?

In assenza dellantigene, sono attesi gli anticorpi corrispondenti Gli anticorpi sono spesso presenti ad elevato titolo ed avidit, anche se il soggetto non stato stimolato immunologicamente Gli anticorpi sono reattivi a basse temperature ma a differenza di molti altri anticorpi freddi sono in grado di legarsi al corrispondente Ag anche a 37C Gli antigeni A e B sono presenti in grandi quantit sui globuli rossi Sia che siano IgG o IgM , gli anticorpi ABO attivano con efficienza il complemento Questo significa che la trasfusione di emazie AB0

Schema di compatibilit ABO per la trasfusione di emazie concentrate

Schema di compatibilit ABO per la trasfusione di plasma

E le piastrine?
Trasfondere preferenzialmente omogruppo Le piastrine esprimono gli Antigeni A e B e questo pu associarsi ad una ridotta sopravvivenza in caso di trasfusione incompatibile I concentrati piastrinici sono un prodotto con una quantit variabile di plasma (molto in caso di aferesi poco in caso di assemblati da buffy risospesi in soluzione conservant) il rischio di emolisi da incompatibilit da plasma 0 pericoloso non va sottovalutato

Gli Zero Pericolosi


Alcuni rari soggetti di gruppo 0 presentano degli anticorpi (in genere anti-A) ad alte concentrazioni La trasfusione anche di pochi millilitri di sangue di questi soggetto sono capaci di causare una emolisi massiva delle emazie del ricevente Questo rischio non negligible in caso di trasfusione di piastrine sospese in plasma O Per questo per un utilizzo universale consigliabilescreenare la presenza ed il titolo delle emolisine in donatori 0 di piastrine in aferesi: le piastrine di donatori con presenza di anticorpi antiA o B ad alto titolo e/o con spiccata azione emolitica sono riservate a pazienti di gruppo 0

Sistema AB0 e trapianti


Anticorpi del sistema AB0 possono:
essere causa di rigetto di organi solidi (rene, cuore, fegato) influenzare negativamente lattecchimento del midollo osseo trapiantato

Conclusioni
Il sistema AB0 una base fondamentale della immunoematologia e della medicina trasfusionale Ha una rilevanza anche nel trapianto di organi solidi In immunoematologia poche regole e molte eccezionia cominciare dallABO Fortunatamente lutilizzo di antisieri monoclonali e di metodi automatizzati e standardizzati hanno ridotto discrepanze AB0 dovute a fattori interferenti ed alla aspecificit dei sieri policlonali umani usati in passato

Per saperne di pi
- Fernanda Morelati. Il sistema eritrocitario AB0. OCD news n. 22 2006 - M. Murphy, D. Pamphilon eds. Practical Transfusion Medicine. Blackwell 2001. - G. L. Daniels. Human Blood Groups. Blackwell 2002. - AABB Technical Manual. 15th edition 2005. - Massimo La Raja. http://immunoematologia.blogspot.com/2009/03/proce sso-trasfusionale-prova.html