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INTERAZIONI PROTEICHE: Espressione proteina esca con un tag (GST).

Cromatografia per affinit con esca immobilizzata sulla resina e eluizione dellestratto proteico totale. I componenti proteici trattenuti sono frazionati mediante SDS-PAGE Oppure: 1.6.1 Co-IP Uno dei metodi pi comunemente utilizzati per la verifica delle interazioni proteina proteina la coimmunoprecipitazione (Co-IP). In un esperimento tipico, come descritto dettagliatamente in precedenza, i complessi dellesca sono catturati da un lisato proteico utilizzando un anticorpo specifico. L'anticorpo poi immobilizzato usando o la proteina A o la proteina G legate a beads di agarosio o sefarosio. Dopo aver lavato le beads, l'esca e le proteine associate allesca sono eluiti. Le proteine legate possono quindi essere identificate mediante Spettrometria di massa. Per confermare un interattore cos identificato, si ripete lesperimento e dopo leluizione si saggia la presenza del partner nelleluato mediante lutilizzo di un anticorpo specifico anti-partner. Se anche questo saggio risulta essere positivo, si ripete lesperimento per una terza volta, immunoprecipitan do la proteina partner e poi rivelando lesca per Immunoblotting. Esperimenti di Co-IP di solito generano un significativo background ed quindi importante condurre in parallelo controlli negativi. Questi esperimenti possono essere effettuati in diversi modi: (i) possono essere eseguite co-IP da linee cellulari o tessuti che esprimono le loro proteine endogene. Il vantaggio di questo approccio che sono studiati complessi di proteine endogene. Pertanto sono evitati eventuali effetti artificiali di tag di affinit o sovraespressione. Lo svantaggio che sono richiesti anticorpi molto specifici. (ii) anche possibile utilizzare cellule trasfettate con un plasmide codificante per una proteina esca taggata. Negli esperimenti di co-IP pu essere utilizzato un anticorpo diretto contro il tag (invece che contro la proteina esca). Un vantaggio di questo approccio che si pu essere relativamente sicuri che l'anticorpo diretto contro il tag specifico e non una reazione aspecifica con altre proteine. Inoltre, le proteine taggate possono essere spesso eluite per competizione mediante incubazione con peptidi, o altre piccole molecole. Tali eluizioni specifiche spes-

so riducono la quantit di proteine contaminanti nell'eluato. (iii) In alternativa, si possono eseguire esperimenti di co-IP utilizzando cellule transfettate con versioni taggate di due putativi partner di interazione