Universidad de Costa Rica

Escuela de Qumica
Laboratorio de Qumica Orgnica I QU-0213
I Ciclo Lectivo 2012

Cromatografa de tiza, capa fina y de columna

Esteban Jos Mejas Vargas B14047
Ana Laura
Tipo de Reporte: II
Profesor: Godofredo Solano
Asistente: Jorge Chaves

Introduccin
La cromatografa es una tcnica de separacin que se basa una fase estacionaria y
una mvil (Harris, 2003). Con el fin de que los diversos componentes de una mezcla se
separen a travs de la fase mvil, la cromatografa logra la separacin de diversos
compuestos en diferentes estados de agregacin, ya sea slido-lquido, gaseoso-gaseoso
entre otros. La cromatografa es de suma importancia debido a su gran uso tanto en la
industria como en el campo de la salud y la biologa, por lo que se busca con esta prctica
ensear algunos tipos de cromatografa (como la de capa fina y columna).
En la prctica se lograron separar los pigmentos de extracto de espinaca y tomate,
adems de comprobar la afinidad de algunos analgsicos en diferentes disolventes para la
cromatografa de capa fina, adems de la cromatografa de tiza. El objetivo principal de la
prctica fue la separacin e identificacin de los principales compuestos de una mezcla
mediante la cromatografa.
Resultados
Cuadro I. R
f
obtenido para cada sustancia diluida en 95% acetato de etilo 5% cido
actico. Prueba Incgnita 1 y 2. (Grupo Ana Laura).
Muestra Distancia (cm) R
f

Incgnita 1 3,5 1,2069
Incgnita 2 3,0 1,0344
Cafena 3,3 1,1379
Aspirina 3,2 1,1034
Acetaminofn 2,0 0,6896
Ibuprofeno 2,1 0,7241
La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 2,9cm.

Cuadro II. R
f
obtenido para cada sustancia diluida en 95% formato de etilo 5% cido
frmico. Prueba Incgnita 1 y 2. (Grupo Ana Laura).
Muestra Distancia (cm) R
f

Incgnita 1 3,2 1,0667
Incgnita 2 3,7 1,2333
Cafena 4,0 1,3333
Aspirina 3,7 1,2333
Acetaminofn 2,2 0,7333
Ibuprofeno ----- -----
La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,0cm.


Cuadro III. R
f
obtenido para cada sustancia diluida en 95% acetato de etilo 5% cido
actico. Prueba Incgnita 1 y 2. (Grupo Esteban).
Muestra Distancia (cm) R
f

Incgnita 1 2,30 0,5897
Incgnita 2 3,90 1,0000
Cafena 3,10 0,7949
Aspirina 3,30 0,8462
Acetaminofn 3,60 0,9231
Ibuprofeno 3,80 0,9744
La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,9cm

Cuadro II. R
f
obtenido para cada sustancia diluida en 95% formato de etilo 5% cido
frmico. Prueba Incgnita 1 y 2. (Grupo Esteban)
Muestra Distancia (cm) R
f

Incgnita 1 3,05 0,7820
Incgnita 2 3,80 0,9744
Cafena 3,10 0,7949
Aspirina 3,80 0,9744
Acetaminofn 4,00 1,0256
Ibuprofeno 4,00 1,0256
La distancia desde el punto de inicio hasta el frente de disolvente es de 3,9cm
Clculo R
f
:

,
donde d
1
es la distancia de arrastre del compuesto y d
d
es la distancia entre la lnea trazada
inferior y el frente de disolvente:

Cuadro V. Resultados de cromatografa de tiza. Grupo Ana.
Disolventes Estructura Observaciones



Agua




No se da un arrastre notorio
de la tinta

Acetona




La tinta se desplaza ms, sin
embargo no es tan
perceptible

Etanol




Se da un eficiente
desplazamiento de la tinta a
travs de la tiza










Figura 1. Fotografa de la cromatografa de columna para el extracto de espinacas.
Cuadro VI. Cromatografa de tiza para cuatro marcadores de colores. (Grupo de Esteban)
Disolvente d
d
(0,5cm)
Color del marcador Distancia recorrida
(0,5cm)
R
f
(1)

Agua

6,00
Azul 0,20 0,03
Verde 3,80 0,63
Rojo 5,00 0,83
Anaranjado 0,50 0,08

Acetona

6,20
Azul 5,60 0,90
Verde 5,50 0,89
Rojo 0,90 0,15
Anaranjado 5,30 0,86

Etanol

6,30

Azul 5,10 0,81
Verde 5,00 0,79
Rojo 4,30 0,68
Anaranjado 5,00 0,79

Discusin
Se procede a realizar la prueba de cromatografa de capa fina. La cromatografa de capa
fina consiste en la separacin de los componentes de una mezcla a travs de la migracin
diferencial sobra cada capa fina de absorbente, retenida sobre una superficie plana
(Sharapin, 2000). Este tipo de cromatografa tiene aplicaciones similares a las de
cromatografa de lquidos. Se aplica para desarrollar las condiciones para las separaciones
en cromatografa de lquidos en alta resolucin. La cromatografa tiene amplio uso en
laboratorios clnicos e industriales (Skoog, James & Crouch, 2008)
En este mtodo de cromatografa hay dos tipos de fases, una mvil, que es el disolvente que
se colca en la cmara; y otra estacionaria que es donde se agregan las muestras. La
separacin se logra porque algunas sustancias son ms fuertemente retenidas por la fase
estacionaria, mientras que otras se desplazan mejor en la fase mvil (Bolaos, Herrera &
Luts, 2003).
Se toma una placa de cromatografa y se marca con un lpiz la lnea base del nivel
de disolventes a 1cm del extremo inferior y luego otra a 1cm del extremo superior, que va a
ser la lnea de frente de disolvente. En la lnea de abajo se agrega una pequea muestra de
cada sustancia en el siguiente orden (indicando en la placa):
1. Incgnita 1
2. Incgnita 2
3. Cafena
4. Aspirina
5. Acetaminofn
6. Ibuprofeno
Luego se coloca la placa en una cmara de desarrollo con 15mL de 95% acetato de etilo
5% cido actico. Adems, previo a colocar la placa se coloca un papel filtro que va a
generar una atmsfera controlada con el disolvente que se adicion. Se deja la placa dentro
de la cmara hasta que el disolvente se desplace hasta el frente de disolvente. Luego se pasa
por una luz ultravioleta y por la cmara de yodo. Las lminas de yodo son sensibles a los
compuestos orgnicos que estn en la placa y dan productos oscuros. En cuanto a la luz
fluorescente, los componentes de la muestra amortiguan la fluorescencia del material de tal
forma que toda la placa exhibe fluorescencia, excepto los lugares donde se encuentran los
componentes de la muestra (Skoog, James & Crouch, 2008). Se debe indicar dnde est la
mxima altura que lleg a alcanzar la sustancia aplicada al arrastrarse con el disolvente.
Luego se averigua el R
f
y se comparan los resultados obtenidos. Esto se repite usando ahora
95% formato de etilo 5% cido frmico.



(a) (b)
Figura 2. (a) Revelado con luz ultravioleta, (b) revelado con cmara de yodo.
Segn lo que se aprecia en los cuadros de resultados, la incgnita 1 es cafena pues
los valores de R
f
de estos son los ms similares en el disolvente que contiene acetato de
etilo, sin embargo con el formato de etilo la diferencia es mayor. En cuanto a la segunda
incgnita, el valor R
f
al que ms se acerca en ambos disolventes es al de la aspirina, donde
en uno difiere por 0,069 (en el acetato de etilo grupo Ana), mientras que en el otro
disolvente (el formato de etilo grupo Ana) no presenta ninguna diferencia pues ambos
alcanzan la misma altura. Sin embargo, los valores las incgnitas 1 y 2 en el formato de
etilo del grupo Esteban son ms cercanos a sus identidades (aspirina e incgnita 2 son
iguales, mientras que la incgnita 1 y la cafena presentan los valores ms similares). En
cuanto a los valores obtenidos para el acetato de etilo del grupo Esteban, sucede lo mismo
que en los del grupo Ana donde se presentan leves diferencias. Sin embargo con la
incgnita 2 si se da una diferencia mucho mayor que en los otros cuadros.
Con este tipo de cromatografa, aunque posee diversas ventajas como la simplicidad
del equipo, el bajo costo y la rapidez; tambin se presentan ciertos problemas que conllevan
a errores y a valores muy variados entre sustancias similares como el hecho de que el
disolvente no migre de manera regular, o el tiempo que transcurre entre el revelado y la
lectura de la placa. La presencia de manchas puede deberse a la aplicacin de sustancias en
baja concentracin que necesitan de la aplicacin de un volumen mayor de la solucin que
se va a analizar (Sharapin, 2000). Todo esto puede afectar la eficiencia de esta tcnica y por
esa razn los valores obtenidos difieren un poco entre s.
En cuanto al uso de disolventes, deben buscarse aquellos ms voltiles para que se
evaporen antes de ingresar las placas a la cmara de yodo y as evitar manchas que generen
incertidumbre sobre donde est la marca de la muestra. Adems, se debe tomar en cuenta la
polaridad de este y la acidez o basicidad (Walton & Reyes, 1983).

(a) (b)
Figura 3. Estructuras disolvente A. (a) Acetato de etilo, (b) cido actico (Wolfram Alpha,
2012).

(a) (b)
Figura 4. Estructuras disolvente B. (a) Formato de etilo, (b) cido frmico. (Wolfram
Alpha, 2012).
Las estructuras demuestran que el formato de etilo cido frmico posee puntos de
ebullicin menores debido al metilo menos que posee en comparacin con Acetato de etilo
cido actico, lo que adems, lo vuelve ms voltil y por ende mejor disolvente.
Con la cromatografa de columna se bas en la utilizacin de diversos filtros para la
separacin de los diversos pigmentos pertenecientes a la hoja de espinaca y extracto de
tomate. Se utiliz el gel de slice ya que la filtracin por gel produce una serie de poros de
diferentes tamaos, por lo que las molculas ms pequeas pueden atravesar los diversos
poros y recorrer mucha mayor longitud dentro del tubo que las molculas ms grandes
(Watson, 2005). Para la espinaca se observ (ver Figura 1) que la molcula que realiz el
mayor recorrido es el pigmento amarillo, seguido de diversas tonalidades de verde. Como
describe Oate (2010) las hojas de espinaca poseen 4 pigmentos bsicos, las xantofilas
(pigmento amarillo), carotenos (pigmento naranja) y las clorofila A y B (pigmentos verdes,
la B es ms oscura que la A). Por lo que encontramos en el fondo de la columna, el
pigmento amarillo son xantofilas mientras las diversas tonalidades de verde son mezclas
entre las clorofilas A y B, esto ltimo es producto de la distribucin uniforme de los poros
del gel. Las xantofilas son molculas de menor tamao en comparacin con la clorofila (ver
Figuras 6 y 7), por lo que se les facilita atravesar los poros y llegar a la parte ms baja de la
columna, cabe destacar que como se observa en la Figura 5 las xantofilas se componen
nicamente de cadenas de carbonos por lo que no poseen polaridad ya que carecen de un
compuesto ms electronegativo que atraiga los electrones. Debido que silanol (SiOH),
presente en la superficie de gel de slice, posee polaridad (Climent, 2004), las xantofilas
como son no polares no poseen interaccin con el gel lo que les permite localizarse en la
zona ms baja de la columna. Para el caso de las clorofilas se basan en el grupo funcional
que diferencia la clorofila A de la B, la clorofila A posee un metilo en una posicin donde
la clorofila B posee un aldehdo (Orozco, 2012). Este grupo funcional posee una gran
variante ante la interaccin el gel de slice ya que el aldehdo posee polaridad debido al
oxgeno que posee (Bruice, 2007) adems de que el hidrgeno forma puentes de hidrgeno
con el oxgeno del silanol, lo que permite mayor interaccin con el gel causando que este se
localizara en zonas superiores a la clorofila A (ver Figura 6), a diferencia de la clorofila B,
la A por el metilo no interacta con el gel debido a que posee un grupo metilo que no
interacciona con el silanol. Debido a la irregularidad de los poros del gel no se da una
distribucin exacta entre los pigmentos, sino que se encuentran diferentes capas de colores,
podemos observar en la Figura 1 hay xantofilas tanto en el fondo de la columna como en
una zona superior de la columna.

Figura 5. Estructura de una xantofila (Sigma-Aldrich, 2010).

Figura 6. Estructura de la clorofila A (Sigma-Aldrich, 2010).

Figura 7. Estructura de la clorofila B extrado de espinaca (Sigma-Aldrich, 2010).
Para el caso del tomate, este posee un pigmento caracterstico que es el licopeno que
le otorga la tonalidad rojiza caracterstico de los tomates (Nuez, 2001). Adems del
licopeno el tomate posee otros carotenoides en menor cantidad que poseen una tonalidad
diferente. En la Figura 10 (Anexos) observamos como en la parte superior de la columna se
nota la presencia de un pigmento rojizo, el licopeno. Pero a travs de la columna se
descomponen otros pigmentos amarillos, otros carotenos (Murray et al., 2004) encontrados
en las clulas del tomate, que debido a su tamao si pudieron atravesar los poros del gel
mientras que el licopeno se almaceno en la parte superior de la columna.


Figura 8. Estructura del licopeno, pigmento que otorga color al tomate (Sigma-Aldrich,
2010).
Se realiza la prctica de cromatografa de tiza donde se marca la tiza con un punto
en cada lado con marcadores permanentes. Luego se coloca sobre un disolvente especfico
y se espera hasta que la elusin termine. Luego se analiza que tan bueno es el disolvente
segn la distancia a la que se desplace la sustancia coloreada del marcador.
La tiza se utiliza como medio poroso, para que realice una funcin similar a la del papel
filtro, trabajando como fase estacionaria (Villa, 2007). El primer cientfico en usar la tiza
como fase estacionaria para realizar las pruebas de cromatografa fue Mikhail Tswett, quien
observo cmo se separaban los colores de los diferentes pigmentos al pasarlos por un tubo
con polvo de tiza (Valpuesta, 2008). De hecho, si la tiza fuese muy compacta la prueba de
cromatografa no se puede realizar pues los compuestos muy compactos, como los
productos de cermica compactos, son impermeables (CEAC, 2007).
El alcohol resulta ser mejor eluyente debido a que producen generalmente una disminucin
de la hidrofobicidad de la fase estacionaria y de la polaridad de la fase mvil, y en
consecuencia, una disminucin en los factores de retencin de los compuestos (Morell &
Candela, 1998). Y por esta misma razn el agua no funciona, pues promueve la retencin
de la tinta.





(a) (b)
Figura 9. Cromatografa de tiza, (a) disolvente alcohol, (b) disolvente agua.
El problema con la acetona es la velocidad con que este se volatiliza, pues esto impide un
desarrollo normal de la cromatografa, al mover la tinta pero levemente (Mallol, 2008).






Figura 10. Cromatografa de tiza con acetona como disolvente.
Conclusiones:
La aplicacin de la cromatografa de capa fina es un buen mtodo para averiguar
una incgnita siempre que se tenga un modelo para comparar los resultados.
Es importante la utilizacin de un buen disolvente como fase mvil, en este caso fue
el 95% formato de etilo 5% cido frmico, que generaron mejores resultados.
Las tizas empleadas al no ser compactas facilitaron el arrastre de las tintas. Eso s,
empleando un alcohol como fase mvil.
El sustrato utilizado en la columna, como el gel de silica, puede intervenir la
separacin de pigmentos segn la polaridad de los mismos.
El tamao de las molculas por separar es un factor importante en la cromatografa
de columna por el tamao de los poros del sustrato utilizado en la columna.






Referencias:
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3. Climent, J. (2005). Experimentacion en quimica . quimica organica, ingenieria
quimica. Valencia: Univerisidad Politcnica de Valencia.
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5. Herrera, C.; Bolaos, N.; Lutz, G. (2003) Qumica de Alimentos: Manual de
Laboratorio. Editoria Universidad de Costa Rica, 1 edicin, San Jos, Costa Rica,
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10. Oate, L. (2010). Biologa.
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15. Valpuesta, J. (2008). A la bsqueda del secreto de la vida. Una breve historia de la
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18. Watson, J. (2005). Biologia molecular del gen.
Panamericana, D.L.
19. Wolfram Alpha. (2012). Wolfram Alpha. Recuperado el 14 de junio de 2012, de
Wolfram Alpha: http://www.wolframalpha.com
Anexos

Figura 10. Cromatografa de columna para el extracto de tomate.