Sei sulla pagina 1di 4

Replicacin de ADN

Replicacin de ADN. La doble hlice es desenrollada y cada hebra hace de plantilla para la sntesis de la nueva cadena. La ADN polimerasa aade los nucletidos complementarios a los de la cadena original. El proceso de replicacin de ADN es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idntica). De esta manera de una molcula de ADN nica, se obtienen dos o ms "clones" de la primera. Esta duplicacin del material gentico se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la sntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble hlice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementacin entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN tiene la importante propiedad de reproducirse idnticamente, lo que permite que la informacin gentica se transmita de una clula madre a las clulas hijas y es la base de la herencia del material gentico. La molcula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los puentes de hidrgeno entre las bases complementarias liberndose dos hebras y la ADN polimerasa sintetiza la mitad complementaria aadiendo nucletidos que se encuentran dispersos en el ncleo. De esta forma, cada nueva molcula es idntica a la molcula de ADN inicial. La replicacin empieza en puntos determinados: los orgenes de replicacin. Las protenas iniciadoras reconocen secuencias de nucletidos especficas en esos puntos y facilitan la fijacin de otras protenas que permitirn la separacin de las dos hebras de ADN formndose una horquilla de replicacin. Un gran nmero de enzimas y protenas intervienen en el mecanismo molecular de la replicacin, formando el llamado complejo de replicacin o replisoma. Estas protenas y enzimas son homlogas en eucariotas y arqueas, pero difieren en bacterias Semiconservadora Tres posibles modelos de replicacin. a) Conservadora, b) Dispersora, c) Semiconservadora (mecanismo real) En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas originales, y por eso se dice que la replicacin del ADN es semiconservadora. Hasta que finalmente se pudo demostrar que la replicacin es semiconservadora, se consideraron tres posibles modelos para el mecanismo de la replicacin: Semiconservadora (modelo correcto). En cada una de las molculas hijas se conserva una de las cadenas originales. Conservadora. Se sintetiza una molcula totalmente nueva, copia de la original. Dispersora, o dispersante. Las cadenas hijas constan de fragmentos de la cadena antigua y fragmentos de la nueva.

Experimento de Meselson y Stahl. El experimento de Meselson y Stahl en 1958 permiti demostrar que el mecanismo real se ajusta a la hiptesis de replicacin semiconservadora. Para ello se hicieron crecer clulas de Escherichia coli en presencia de nitrgeno-15, un istopo del nitrgeno ms pesado de lo habitual. En consecuencia, el istopo se incorpor a las cadenas de ADN que se iban sintetizando, hacindolas ms pesadas. Secuencial y bidireccional desde puntos fijos. Los orgenes de replicacin son los puntos fijos a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma secuencial formando estructuras con forma de horquilla. Por otro lado, la replicacin se lleva a cabo bidireccionalmente, es decir, a partir de cada origen se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. El origen de replicacin La cantidad de ADN que se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn o unidad funcional de replicacin. El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariticos, la replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb aproximadamente), es decir, hay 2 varios replicones. En las clulas eucariotas hay varios replicones Experimento de Cairns Los experimentos realizados por Cairns (1963) con bacterias Escherichia coli permitieron determinar la existencia de ese punto fijo u origen de replicacin a partir del cual el genoma empezaba a replicarse. Los experimentos consistan en mantener un cultivo de E. coli creciendo en un medio que contena timidina tritiada (timina marcada con tritio), de forma que el ADN quedara marcado radiactivamente pudiendo efectuarse una autorradiografa. A continuacin se observaba al microscopio. Los resultados indicaban que la replicacin en E. coli se iniciaba en un punto concreto 3 (OriC).

Secuencialidad Sueoka y Yoshikawa (1963) realizaron estudios genticos de complementacin de mutaciones que permitieron determinar que desde los orgenes la replicacin avanza de forma secuencial. Trabajaron con Bacillus subtilis porque era posible obtener cultivos sincronizados de forma que todas las clulas del cultivo estuvieran en la misma fase del ciclo celular. El mtodo consista en la conjugacin bacteriana de cepas silvestres con cepas mutantes incapaces de sintetizar determinados aminocidos. Conociendo la localizacin de los genes que codifican las protenas implicadas en la sntesis de los diferentes aminocidos en el cromosoma bacteriano, y haciendo crecer las bacterias receptoras en un "medio mnimo" (donde slo pudiesen crecer las que hubieran recibido alguno de estos genes), al extraer ADN a diferentes tiempos se observ que, tras la ltima extraccin apareca con mayor frecuencia el gen implicado en la sntesis de uno de los aminocidos (el correspondiente a la "posicin 1"), que el gen adyacente implicado en la sntesis de otro aminocido ("posicin 2"). De la misma forma, el gen que ocupaba la "posicin 3" apareca con menor frecuencia que el que ocupaba la "posicin 2", y as sucesivamente.Como los primeros genes en replicarse en la bacteria donadora seran los primeros en transferirse, el experimento permiti demostrar, a partir de las frecuencias relativas de los diferentes genes en las bacterias receptoras, que la replicacin sigue un orden (es secuencial). La replicacin avanza en forma de horquilla Debido a que en la clula ambas cadenas de la doble hlice de ADN se duplican al mismo tiempo, stas deben separarse para que cada una de ellas sirva de molde para la sntesis de una nueva cadena. Por eso, la replicacin avanza con una estructura en forma de horquilla formndose una burbuja u ojo de replicacin (tambin llamada estructura cuando el ADN es circular debido a la similaridad entre la letra grie ga y la forma que adopta el cromosoma bacteriano en estados intermedios de replicacin, no obstante pudiendo aparecer estructuras 3 alternativas), que avanza en direccin a la regin de ADN no duplicado dejando atrs los dos moldes de ADN de 2 cadena simple donde se est produciendo la replicacin. Bidireccionalidad El movimiento de la horquilla es bidireccional en la mayora de los casos, es decir, a partir de un punto se sintetizan las dos cadenas en ambos sentidos. Esto ocurre en la mayora de los organismos, pero se dan excepciones en algunos procariontes debido a que los mecanismos de replicacin que tienen lugar dependen de la propia estructura 3 de su material hereditario (si el ADN es circular, lineal, bicatenario o monocatenario). As, en casos particulares como el ADN mitocondrial, algunos plsmidos y algunos genomas monocatenarios de fagos pequeos, la replicacin se da unidireccionalmente pudiendo haber uno o dos orgenes de replicacin. Distincin entre la replicacin unidireccional y la bidireccional mediante el recuento de copias de genes marcadores. O es el origen de replicacin y A, B, C, D, E son genes marcadores. En la mayora de los casos la replicacin es bidireccional. No obstante, la replicacin se puede considerar, de forma general, bidireccional. La evidencia experimental del crecimiento bidireccional de la hebra de ADN viene dada por una tcnica basada en el marcaje radiactivo del ADN usando timidina marcada con tritio. Primero se aade timidina marcada y luego sin 3 marcar, y siguiendo el rastro de tritio se observa hacia dnde se ha replicado la molcula de ADN. Tambin se puede, mediante el recuento de copias de genes marcadores, determinar si la replicacin es unidireccional o bidireccional. Otras tcnicas se basan en medir la distancia desde los ojos de replicacin hasta los extremos de un ADN lineal (o circular convertido en lineal mediante enzimas de restriccin). Semidiscontinua La replicacin es semidiscontnua La replicacin siempre se produce en sentido 5' 3', siendo el ext remo 3'-OH libre el punto a partir del cual se produce la elongacin del ADN. Esto plantea un problema, y es que las cadenas tienen que crecer simultneamente a pesar de que son antiparalelas, es decir, que cada cadena tiene el extremo 5' enfrentado con el extremo 3' de la otra cadena. Por ello, una de las cadenas debera ser sintetizada en direccin 3' 5'. Este problema lo resolvieron los cientficos japoneses Reiji Okazaki y Tsuneko Okazaki en la dcada de 1960, al descubrir que una de las nuevas cadenas de ADN se sintetiza en forma de trozos cortos que, en su honor, se denominan fragmentos de Okazaki. Su longitud suele variar entre 1000 y 2000 nucletidos en las bacterias y entre 100 y 400 nucletidos en eucariontes. La cadena que se sintetiza en el mismo sentido que avanza la horquilla de replicacin se denomina hebra adelantada (en ingls, leading strand, que a veces se traduce por lder o conductora) y se sintetiza de forma continua por la ADN polimerasa, mientras que la que se sintetiza en sentido contrario al avance se denomina hebra rezagada o retrasada

(en ingls, lagging strand), cuya sntesis se realiza de forma discontinua teniendo que esperar a que la horquilla de 2 replicacin avance para disponer de una cierta longitud de ADN molde. ADN Polimerasas Es la enzima que cataliza la sntesis de la nueva cadena de ADN a partir de desoxirribonucletidos y de la molcula de ADN plantilla o molde que es la que ser replicada. La enzima copia la cadena de nucletidos de forma complementaria (A por T, C por G) para dar a cada clula hija una copia del ADN durante la replicacin. Modo de operacin En cada horquilla de replicacin, la ADN polimerasa y otras enzimas sintetizan dos nuevas cadenas de ADN que son complementarias respecto a las 2 cadenas originales. Durante este proceso, la ADN polimerasa reconoce una base nucleotdica no apareada de la cadena original y la combina con un nucletido libre que tiene la base complementaria correcta. Luego, la ADN polimerasa cataliza la formacin de nuevos enlaces covalentes que ligan el fosfato del nucletido libre entrante con el azcar del nucletido previamente agregado en la cadena hija en crecimiento. De esta forma, la ADN polimerasa sintetiza el esqueleto de azcar-fosfato de la cadena hija. Funcin correctora exonucleasa 3' 5' de las ADN polimerasas. Las ADN polimerasas tambin realizan otras funciones durante el proceso de replicacin. Adems de participar en la elongacin, desempean una funcin correctora y reparadora gracias a su actividad exonucleasa 3', que les confiere la capacidad de degradar el ADN partiendo de un extremo de ste. Es importante que existan estos mecanismos de correccin ya que de lo contrario los errores producidos durante la copia del ADN daran lugar a mutaciones. Proceso general La helicasa rompe los puentes de hidrgeno de la doble hlice permitiendo el avance de la horquilla de replicacin. La topoisomerasa impide que el ADN se enrede debido al superenrollamiento producido por la separacin de la doble hlice. Las protenas SSB se unen a la hebra discontnua de ADN, impidiendo que sta se una consigo misma. La ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria de forma continua en la hebra adelantada y de forma discontnua en la hebra rezagada. La ARN primasa sintetiza el cebador de ARN necesario para la sntesis de la cadena complementaria a la cadena rezagada. La ADN ligasa une los fragmentos de Okazaki.

El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciacin, elongacin y terminacin. El cebador: son pequeas unidades de RNA que se unen a los fragmentos para que la ADN polimerasa reconozca donde debe unirse.

Los cebadores los quita la pol. I y coloca bases a la cadena en crecimiento por la ligasa. Iniciacin Mediante consumo de ATP en direccin a la horquilla de replicacin, es decir, en direccin 5' 3' en la he bra rezagada y 3' 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de hidrgeno que mantienen unida la doble 3 hlice. El siguiente conjunto de protenas reclutadas son las denominadas protenas SSB (single-stranded DNA binding proteins, protenas ligantes de ADN monocatenario) encargadas de la estabilizacin del ADN monocatenario generado por la accin de las helicasas, impidiendo as que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hlice, de manera que pueda servir de molde. Estas protenas se unen de forma cooperativa, por lo que su unin al DNA conforme avanza la helicasa es rpida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si stos no fueran eliminados, llegado a un punto el replisoma ya no podra seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar

los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasndolas a travs de la rotura realizada, 2 sellando a continuacin la brecha. Elongacin Enzimas que participan en la replicacin de E. coli: helicasa, protenas SSB, topoisomerasa, ARN primasa, Holoenzima ADN Pol III En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la sntesis de las nuevas cadenas aadiendo nucletidos sobre el molde. Esta sntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicacin que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado. Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formacin de un fragmento corto especfico de ARN llamado cebador, que determinar el punto por donde la ADN polimerasa comienza a aadir nucletidos. As, durante la sntesis, en cada horquilla de replicacin se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciacin, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que slo es capaz de sintetizar en sentido 5 3', la replicacin slo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki. La mitad del dmero de la holoenzima 3 ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada. La elongacion de la hebra rezagada ocurre por medio del modelo del trombn. Hebra rezagada: sntesis de cebadores, unin de fragmentos de Okazaki y eliminacin de los cebadores Enzimas que participan en la eliminacin de cebadores y unin de los fragmentos de Okazaki. El cebador de ARN est pintado en azul y el ADN que lo reemplaza en naranja En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de ste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recin sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hlice de ADN. La eliminacin de cebadores tambin se da en la hebra conductora, de sntesis continua, pero debido a que en sta hay un solo cebador es un proceso que slo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dar tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. En la eliminacin del fragmento de Okazaki (tambin denominado iniciador, cebador o primer) intervienen dos de enzimas: por un lado la ADN Pol I, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa 5' 3' y simultneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5' 3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por ltimo, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reaccin de condensacin entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del 2 nucletido contiguo, completando el enlace fosfodister; para ello, es preciso hidrolizar una molcula de ATP.