UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL Facultad de Ciencias Naturales y Matemticas Escuela Profesional de Biologa

PRACTICA N1 FRAGILIDAD OSMOTICA DEL ERITROCITO

Docente: Blga. Rossalyn Acua Payano Estudiantes: Hidalgo Venegas, Carlos. Toribio Gamuzo, Csar. Vsquez Domnguez, Andrs. Grupo: Grupo E Viernes 16:20 18:00

2013

FRAGILIDAD OSMTICA DEL ERITROCITO

I. INTRODUCCIN La osmosis es un tipo especial de transporte pasivo en el cual slo las molculas de agua son transportadas a travs de la membrana. El movimiento de agua se realiza desde un punto en que hay mayor concentracin a uno de menor para igualar concentraciones. De acuerdo al medio en que se encuentre una clula, la osmosis vara. La funcin de la osmosis es mantener hidratada a la membrana celular. Dicho proceso no requiere gasto de energa. En otras palabras, la osmosis es un fenmeno consistente en el paso del solvente de una disolucin desde una zona de baja concentracin de soluto a una de alta concentracin de soluto, separadas por una membrana semipermeable. La membrana celular constituye una interfase entre el compartimento intra y extracelular que permite el libre recambio de molculas de agua, establecindose un gradiente osmtico. La membrana celular de los eritrocitos es flexible, pero prcticamente carece de elasticidad, lo que significa que la clula se rompe si le entra agua hasta exceder un volumen crtico. Cuando la clula enfrenta un ambiente hipotnico se genera un movimiento neto de agua libre hacia su interior. Segn el grado de hipotonicidad y la capacidad de la membrana para mantener su integridad, la clula se hincha y estalla permitiendo, en el caso de los eritrocitos, la salida de hemoglobina. Esta propiedad es utilizada en la prueba de la fragilidad osmtica eritrocitaria (FOE), que consiste en exponer alcuotas de eritrocitos a concentraciones decrecientes de NaCl, usualmente entre 0,85% y 0%, y luego cuantificar el grado de hemlisis en cada una de ellas. Por lo tanto, la FOE permite evaluar la resistencia y estabilidad de la membrana del eritrocito frente a un estrs osmtico. La ruptura de la membrana celular produce la salida del contenido de hemoglobina, por lo que se puede medir la ruptura de los eritrocitos midiendo y cuantificando la cantidad de hemoglobina liberada al medio mediante tcnicas espectrofotomtricas.

La fragilidad osmtica del eritrocito depende de caractersticas como la edad del eritrocito, su tamao, forma y las dems condiciones propias de la estructura interna de la clula. Como se emplea una poblacin de millones de clulas, la fragilidad osmtica sigue la distribucin de una curva normal. El objetivo de esta prctica, es conocer la fragilidad osmtica de los eritrocitos frente a diferentes efectos fsicos y qumicos; como la temperatura y el pH; en concentraciones decrecientes de NaCl. II. MARCO TERICO Eritrocitos Los eritrocitos son clulas sanguneas anucleadas que miden aproximadamente 8 m de dimetro (as, unos 3000 eritrocitos en fila ocupan 2,5 cm de longitud) y tienen forma de disco bicncavo. La membrana del eritrocito en un complejo de lpidos y protenas (bicapa lipdica), el cual es importante para mantener la elasticidad celular y la permeabilidad selectiva. Los eritrocitos pueden deformarse, sin llegar a lesionarse para poder pasar por los ms estrechos capilares. Este grado de deformidad o elasticidad influye en la rapidez del flujo sanguneo por la microcirculacin. Los eritrocitos son los elementos celulares ms abundantes de la sangre. En el varn adulto existen alrededor de 5.500.000 por cc de sangre, y en las mujeres unos 4.800.000 por cc. Un eritrocito contiene 200 a 300 millones de molculas de Hemoglobina (Hb). La Hb consiste en la combinacin de una molcula proteica de globina, con cuatro molculas de un compuesto pigmentado llamado grupo hemo. Cada molcula de hemo posee un tomo de hierro en su centro (Fe2+), por lo que, una molcula de Hb puede transportar hasta cuatro molculas de oxgeno y formar oxihemoglobina por medio de una reaccin reversible. La Hb tambin puede combinarse con dixido de carbono para formar carboxihemoglobina, tambin por una reaccin reversible. El CO2 se une a la porcin globina de la molcula de Hb. En un varn adulto normal, 100 cc de sangre contienen 14 a 16 g de Hb; la sangre de una mujer contiene de 12 a 14 g de Hb por 100 cc. El proceso de formacin de eritrocitos se denomina eritropoyesis. La vida promedio de un eritrocito circulante en el torrente circulatorio es de unos 120 das. Se fragmentan en los capilares y son fagocitados

por las clulas retculo-endoteliales de la cubierta de los vasos sanguneos en hgado, bazo y mdula sea. En condiciones fisiolgicas, los eritrocitos se encuentran en equilibrio osmtico con la sangre que los contiene (valor de osmolaridad del plasma sanguneo: 290 10 mOsm/L), por lo cual se dice que la sangre es una solucin isosmtica e isotnica. Si la osmolaridad del plasma llega a disminuir significativamente (plasma hipotnico), el agua como lquido, entra al interior celular aumentando su volumen. Si por el contrario, la osmolaridad del plasma se incrementa, este se torna hipertnico y el agua sale del eritrocito ocurriendo una reduccin del volumen celular. La forma y el volumen de los eritrocitos cambian cuando vara la cantidad de agua contenida en su interior, pudiendo tomar una forma estrellada o irregular al ocurrir prdida de volumen (fenmeno de crenacin) o bien aumentar su volumen hasta adquirir la forma de una esfera. Cuando la clula no puede resistir la carga de agua que recibe, la membrana se rompe (fenmeno de hemlisis) y se libera la hemoglobina la cual puede ser cuantificada por mtodos espectrofotomtricos. La hemlisis es un proceso que ocurre en una poblacin mixta de clulas por lo que no ocurre en un solo punto y a la misma velocidad en todos los casos. Como el efecto final es un tanto difcil de apreciar experimentalmente, debido a que la hemlisis ocurre en forma que se hace asinttica al 100 % (curva aplanada), se prefiere analizar el tiempo de hemlisis al alcanzar el 50%. Membrana del Glbulo Rojo La membrana del glbulo rojo es la responsable de las propiedades mecnicas y de la mayora de las funciones fisiolgicas de la clula. Est formada por una bicapa lipdica plana, donde predominan en el 80 % los fosfolpidos y el colesterol y en menor medida los glicolpidos y aminofosfolpidos, distribuidos asimtricamente. De igual forma, se encuentran embebidas parcial o totalmente en ella las protenas integrales de membrana, unidas fuertemente por enlaces apolares. Su libre desplazamiento a travs de esta bicapa contribuye a mantener su fluidez. Las protenas perifricas interactan entre s para formar una malla o enrejado que recubre la cara interior de la doble capa de fosfolpidos y son las responsables de la estabilidad y las propiedades viscoelsticas de la membrana. Entre estas protenas se destacan la espectrina (Sp), la ankirina (banda 2.1, 2.2, 2.3 y 2.6), la banda 4.1, la banda 4.2, la banda 4.9, la aducina, la

tropomiosina y la banda 7. Otras protenas perifricas se disponen hacia la cara exterior de la bicapa lipdica y ellas son fundamentalmente antgenos de grupo sanguneo (fig.1).

Fig. 1. Estructura de la membrana eritrocitaria. La banda 3 representa el 25 % del total de las protenas integrales. Est constituida por 2 dominios estructurales: el dominio citoplasmtico, que es el encargado de la unin con las protenas del esqueleto, y el sitio transmembranoso que mantiene el contacto con el medio extra e intracelular, proporcionando los canales responsables del transporte de iones bicarbonato (HCO3-) y cloruros (CI-). Adems, posee un sitio de glicosilacin capaz de unir antgenos para el grupo sanguneo I/i e interviene activamente en la eliminacin de eritrocitos envejecidos. Las glicoforinas son un grupo de protenas integrales caracterizadas por su elevado contenido en cido silico. Las glicoforinas A,B,C y D son las ms importantes y constituyen los sustratos antignicos de los diferentes grupos sanguneos. La glicoforina C contribuye a la estabilidad de la membrana gracias a su interaccin con protenas perifricas, adems de participar en el intercambio inico transmembranoso. La Sp es la protena ms abundante y adems la principal responsable del mantenimiento del enrejado proteico. Est compuesta por 2 subunidades a y b enrolladas de forma antiparalela, las que se unen por sus extremos para formar tetrmeros. Estas 2 subunidades estn constituidas por secuencias repetitivas de 106 aminocidos, las que se enlazan para formar una triple hlice (fig.2).

Fig.2. Estructura del tetrmero de espectrina (Sp). Se observa la triple hlice de las unidades repetitivas, los sitios de autoasociacin de la Sp y los sitios de nucleacin donde comienza la interaccin lateral entre las cadenas a y b de la Sp. La ankirina (ANK) est compuesta por 3 subunidades estructurales correspondientes a 3 dominios funcionalmente diferentes: regulador, de unin a la membrana y de unin a la Sp. Su contribucin a la integridad de la membrana es decisiva, ya que constituye un importante punto de anclaje a la doble capa lipdica a travs de la banda 3.1 La actina es una protena organizada en forma de protofilamentos helicoidales estabilizados por la interaccin con la Sp, la protena 4.1 y la tropomiosina. Otra de las protenas que integran el citoesqueleto es la protena 4.1, cuya funcin fundamental es estabilizar la unin espectrina-actina y contribuir a fijar el esqueleto a la bicapa lipdica. El mantenimiento de la forma y estabilidad de la tambin responsabilidad de otras protenas. Entre protena 4.2, que acta como modulador para interaccin ankirina-banda 3. La banda 4.9, la tropomiosina, protegen la estabilidad de la actina. membrana ellas est estabilizar aducina y es la la la

III.

MATERIALES: Tubos de ensayo. Rejilla. Estufa para Bao Mara. Termmetro. Micropipeta y Propipeta. Pipetas graduadas. Agua destilada. Solucin salnica amortiguadora (fosfato salino) a pH 7,4 de NaCl al 1% Solucin anticoagulante de ethylen diamine tetra-actico 0,1% Buffer a pH 5,6; 7,4 y 8,9. Muestra Biolgica: Sangre de Caballo.

IV.

METODOLOGA:

Experimento N1: Fragilidad Osmtica Para cada muestra sangunea realizar el siguiente esquema de evaluacin:
Reactivos Concentracin de NaCl % Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) pH 7,4 mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL. 1 0,00 0,00 1 0,01 2 0,10 0,1 0,9 0,01 3 0,35 0,35 0,65 0,01 4 0,45 0,45 0,55 0,01 5 0,5 0,5 0,5 0,01 6 0,55 0,55 0,45 0,01 7 0,6 0,6 0,4 0,01 8 0,7 0,7 0,3 0,01 9 0,85 0,85 0,15 0,01

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos. Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer en espectrofotmetro a 530 nm usando el tubo 9 como blanco (0% de hemlisis). Haga una grfica de los valores de hemlisis en % contra la concentracin de NaCl.

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmtica

Reactivos Concentracin de NaCl % Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) pH 7,4 mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL. Mezcla e incubar a C/30 min. 1 0,00 0,00 1 0,01 ambiente 2 0,85 0,85 0,15 0,01 Sobre hielo 3 0,85 0,85 0,15 0,01 ambiente 4 0,85 0,85 0,15 0,01 37 5 0,85 0,85 0,15 0,01 45

Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de temperatura de incubacin. Se calcula utilizando el valor de la absorbancia del sobrenadante del tubo donde ocurre la mxima hemlisis como el 100%.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica

Reactivos Concentracin de NaCl % pH Sol. Fosfato salino (NaCl 1%) mL Agua destilada mL Sangre total con EDTA mL. 1 0,00 2 0,85 5,6 0,00 1 0,01 4,25 0,15 0,01 3 0,85 7,4 4,25 0,15 0,01 4 0,85 8,9 4,25 0,15 0,01

Mezclar suavemente y dejar reposar a temperatura ambiente 30 minutos. Mezclar y centrifugar a 2000rpm/ 5 min. Leer el sobrenadante en espectrofotmetro a 530 nm. Usar agua destilada como blanco. Expresar el resultado como el porcentaje de hemlisis a cada valor de pH. Se calcula utilizando el valor de absorbancia del sobrenadante, del tubo donde ocurre la mxima hemlisis como el 100%.

V.

RESULTADOS Clculos Experimento N1: Fragilidad Osmtica

TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8

ABSORBANCIA 0.737 0.715 0.541 0.462 0.251 0.211 0.152 0.065

Concentracion NaCl 0 0.1 0.35 0.45 0.5 0.55 0.6 0.7

% Hemlisis 100 97.01 73.41 62.69 34.06 28.63 20.62 8.82

9 0 0.85 0 Tabla 1.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm

Experimento N1: Fragilidad Osmtica

120 100 80

%hemolisis

60 40 20 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 % Hemolisis

Concentracin de NaCl
Cuadro 1.- Grfico de la concentracin de NaCl respecto al porcentaje de hemolisis obtenido

Experimento N2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmtica TUBO 1 2 3 4 5 ABSORBANCIA 0.56 0.482 0.588 0.661 0.595 Efecto de T Ambiente (sin Sol. Salina) Hielo Ambiente (con Sol. Salina) 37 45 % Hemlisis 84.72 72.92 88.96 100 90.02

Tabla 2.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm con relacin al efecto de temperatura y porcentaje de hemolisis.

Cuadro N 2: Experimento N 2: Efecto de la temperatura sobre la fragilidad osmtica; el porcentaje de hemlisis en relacin al efecto de la temperatura.

Experimento N3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica TUBO 1 2 3 4 ABSORBANCIA 1 0.043 0.166 0.219 Efecto del pH 0 5.6 7.4 8.9 % Hemlisis ----------19.63 75.8 100

Tabla 3.- Lectura de las absorbancias en el espectrofotmetro a 530nm con relacin al efecto del pH y porcentaje de hemolisis.

Cuadro N 3: Efecto del pH sobre la fragilidad osmtica; el % de hemlisis en relacin al pH.

Cuestionario 1. Una solucin salina que es isotnica para eritrocitos es necesariamente isotnica para otro tipo de clulas? El paso del agua hacia dentro o fuera de las clulas es un proceso biolgico de importancia. Si las concentraciones mol/L de solutos en ambos lados de la membrana celular son las mismas, la presin osmtica es igual y las soluciones son isotnicas sin que haya paso neto de lquido en ningn sentido. Por lo tanto una solucin salina para eritrocitos o cualquier otra clula, es la misma. La concentracin de solutos en la sangre es isotnica con una solucin de 0,9% de cloruro de sodio. La concentracin de cloruro de sodio 0,85< 0,9%, se llama solucin salina normal o fisiolgica o suero fisiolgico. 2. Cules son las causas de la hipernatremia? El exceso de sodio en la sangre puede ser ocasionado por ciertas condiciones. Las causas especficas de la hipernatremia incluyen: Deshidratacin o prdida de fluidos corporales por vmitos prolongados, diarrea, sudoracin o fiebre alta. Deshidratacin por no beber la cantidad suficiente de agua. Frmacos tales como esteroides, regaliz y ciertos medicamentos para disminuir la presin sangunea. Ciertas enfermedades endocrinolgicas como diabetes (cuando la orina es muy frecuente) o aldosteronismo. Ingestin excesiva de sal. Hiperventilacin (respiracin demasiado rpida).

En todos los casos, la hipernatremia y por lo tanto la hipertonicidad plasmtica, induce la salida de agua del espacio celular al extracelular, lo que produce disminucin del volumen celular. La disminucin del volumen neuronal se manifiesta clnicamente por sntomas neurolgicos: letargia, reflejos hiperactivos, temblor muscular, convulsiones y coma. Con frecuencia, sobre todo en personas ancianas, se producen trombosis de los senos venosos craneales, y, al disminuir el tamao del cerebro, hemorragias cerebrales por traccin de las

estructuras vasculares. La salida del agua celular al espacio extracelular tiende a preservar la volemia, por lo que al principio no son aparentes los sntomas y signos de hipovolemia, que pueden aparecer, hasta la situacin de shock, en fases avanzadas. 3. Cmo se comportara el eritrocito en un estado de hipernatremia? Cuando sobreviene la hipernatremia, todas las clulas del organismo se reducen en tamao, que es proporcional al grado de reduccin del volumen celular; sin embargo, los mecanismos regulatorios internos permiten restaurar, en muchas clulas, su volumen casi normal. Los eritrocitos y las neuronas tienen esta habilidad para regular su volumen. Una vez que han pasado ms de 48 horas de hipernatremia; es decir, el inicio de considerarse crnica, tendr un volumen normal a expensas del contenido de solutos intracelular aumentado. En ese momento, rpidamente se restaura la osmolaridad que originar una hinchazn celular, lo que en la mayor parte de los rganos del cuerpo no tendr mayor consecuencia; sin embargo, en el cerebro es devastadora, pues aparecen: edema cerebral, herniacin y la muerte. De ah la importancia del tratamiento cauteloso en la hipernatremia crnica.

VI.

CONCLUSIONES A menor concentracin de NaCl se incrementa el porcentaje de hemolisis, debido a que ingresa agua al eritrocito liberando hemoglobina. La variacin del porcentaje de hemolisis influye directamente con la lectura de las absorbancias. En un ambiente salino se produce mayor cantidad de hemolisis comparado con un ambiente normal. La temperatura del hielo obtiene la menor hemolisis debido a que conserva a los eritrocitos sin ningn cambio y por consiguiente no hay liberacin de hemoglobina.

VII.

DISCUSIONES Para sta evaluacin tomamos en cuenta que los resultados obtenidos son de una especie de caballo sana y joven. Los efectos de temperatura, salinidad y pH frente a una muestra de sangre se ven influenciada de acuerdo a las condiciones inmunolgicas del animal (Forchetti, 2006). Los mrgenes de error para nuestros resultados se obtuvieron en las lecturas de las absorbancias, para i) la temperatura: sabemos que la temperatura fisiolgica es 37C y el porcentaje de hemolisis debe ser mnimo o nulo; sin embargo en los resultados obtenidos no se coincide esta afirmacin; ii) el pH: de la misma forma, sabemos que el pH fisiolgico es 7,4 y su hemolisis debe ser mnima; pero nuestras lecturas nos indican lo distinto comparadas con lo normal (Chihuailaf, 2006).

VIII.

REFERENCIAS BILIOGRFICAS
Granados J, Fragilidad osmtica de los eritrocitos de carnero en relacin con su uso en el laboratorio clnico, Hospital de San Juan de Dios, Costa Rica, 1993. Hariharan S.: Nutrition of laboratory animals. LAIS Centre News 1984; 12: 2- 35. Lovelock J, La hemolisis de clulas sanguneas por congelacin y descongelacin, Instituto Nacional para la investigacin mdica, Londres Inglaterra, 1953. Zou CG, Haemolisis of human and sheep redblood cells in glycerol media: the effect of pH and the role of band 3. School of biological science. Inglaterra. 2000. Forchetti, O.; Maffrand C.; Vissio C.; Boaglio C.; Cufr G.. Hipofosfatemia y fragilidad osmtica eritrocitica en cabras. Revista Electrnica de Veterinaria, Vol. VII, n 01, Enero/2006 Chihuailaf R H . Variaciones de la Fragilidad Osmtica Eritrocitaria en Bovinos a Pastoreo sobre praderas con bajo contenido de Selinio y Suplementados o no con Selenio, Instituto de Ciencias Clnicas Veterinarias. Chile, 2006 http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S08642892002000100001&script =sci_arttext