TEMA 02:

CAMBIOS BIOQUMICOS EN LA ETAPA DE LA MADURACIN DE QUESOS AZULES

2.1. INTRODUCCIN
La maduracin de los quesos conduce a cambios en sus propiedades fsicas, de apariencia, de sabor y aroma debido a la combinacin de factores que junto con los microorganismos se reconoce que son agentes de importancia. Muchos tipos de enzimas de bacterias y hongos intervienen en el proceso de la maduracin. En cada tipo de queso existe, en general, una secuencia definida de los organismos que se desarrollan en fases sucesivas de la maduracin. Alguno de estos microorganismos tienen poca relacin con la formacin del sabor, pero revisten importancia en el control del curso de las fermentaciones, y en la preparacin del terreno para el desarrollo de las bacterias o los mohos que dan a cada queso su sabor caracterstico, tal es el caso de los quesos madurados por mohos superficialmente (como el Camembert) o en la pasta (como el Roquefort). En concreto, la maduracin de los quesos tiene por objetivo el desarrollo de las caractersticas sensoriales de sabor, aroma, cuerpo, textura y color. Un evento clave en el proceso de maduracin de la pasta de un queso es la muerte progresiva de millones de bacterias acidolcticas presentes inicialmente en la cuajada. Despus de su muerte, las clulas bacterianas se desintegran y liberan sus enzimas intracelulares (proteasas, lipasas, endopeptidasas, dipeptidasas y otras). Estas enzimas, junto con la renina (quimosina) y las enzimas nativas de la leche transforman gradualmente

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las protenas y la materia grasa. El queso adquiere as, con el tiempo, una textura y un gusto caracterstico, tpico de su especie. Puede considerarse que la velocidad y el grado de maduracin de un queso dependen de las condiciones de la pasta y de la concentracin, el tipo de microorganismos y las enzimas en ella existentes. Los microorganismos de la pasta provienen de la leche original, cruda o pasteurizada, o son aportados por contaminacin o inoculacin en forma de cultivos lcticos Bioqumicamente, la maduracin de la pasta de un queso implica tres fenmenos complejos: la fermentacin de la lactosa, la hidrlisis de la grasa butrica y la degradacin de las protenas. Para los tipos de queso el grado de cada una de estas ser diferente.

2.2. OBJETIVOS

2.1.2. OBJETIVO GENERAL

Describir los cambios bioqumicos que ocurren durante la etapa de maduracin de los Quesos de Pasta Azul

2.2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Diferenciar las caractersticas de los Quesos de Pasta Azul Conocer el modo en que actan los cultivos iniciadores y el cultivo especfico de Penicillum Roqueforti.

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Establecer como ocurre la transformacin de la casena, de la materia grasa y de la lactosa.

2.3. JUSTIFICACIN
El aroma y sabor de una cuajada fresca son consecuencia de la accin de las bacterias de los cultivos iniciadores, que producen acido y compuestos voltiles. En un queso madurado, el desarrollo del flavor y la textura se deben fundamentalmente a una serie de complejas reacciones bioqumicas en las que se hidrolizan los componentes mayoritarios de la cuajada: la grasa y las protenas. La extensin de estos procesos depende de las condiciones del medio, por ejemplo del contenido en humedad, del pH y de la concentracin de sal en el queso. Los cultivos iniciadores utilizados en la elaboracin, ya sean mesfilos o termfilos, desempean un papel fundamental en la creacin en el

medio de las condiciones mas favorables para el desarrollo del flavor y de la textura. Adems de los fermentos, hay otros microorganismos concretos que se emplean para impartir caractersticas especficas de aroma, sabor y textura a un tipo de queso, como en el caso de las variedades maduradas por mohos. La maduracin o afinacin, mas que una etapa del proceso de produccin, es un fenmeno muy complejo que consiste en la transformacin de la lactosa, casena (que forma la estructura bsica) y de la materia grasa, a travs de una serie de procesos bioqumicos.

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2.4. DESARROLLO DEL TEMA 2.4.1 Definicin.

Queso se define como el producto fresco o madurado, slido o semislido, obtenido por separacin parcial del suero de leche previamente pasteurizada, leche reconstituida o bien sueros lcteos debidamente pasteurizados, coagulados por la accin de cuajo u otros coagulantes apropiados, tale como enzimas especficas o cidos orgnicos permitidos, de apta calidad alimentaria. Segn DUMAIS et al. (1991), el queso es el resultado de la concentracin selectiva de la leche. El contenido de agua en un queso depende de la variedad, y en ella son arrastrados elementos solubles y las protenas no coaguladas de la leche. Cada tipo de queso es el resultado de un proceso de maduracin dirigido, ya sea, modificando o combinando los diferentes parmetros que intervienen en los mecanismos madurativos.

2.4.2 Clasificacin de quesos.

Puesto que ciertas caractersticas deseables para muchos quesos, constituyen defectos para otros, se hace imposible establecer una clasificacin nica o un patrn para todos ellos. As muchas de estas clasificaciones se basan en sus caractersticas internas y externas, as como en su forma de elaboracin, siendo las principales: proceso de

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coagulacin, grado de maduracin, textura, mtodo de elaboracin (MAHECHA, 1987). Es as como segn su grado de maduracin, los quesos se pueden clasificar en: no madurados y madurados por bacterias u hongos.

2.4.3 Quesos Azules o de Pasta Azul

Queso obtenido por coagulacin de la leche por medio del cuajo y/u otras enzimas coagulantes apropiadas, complementado o no por la accin de bacterias lcticas especficas, y mediante un proceso de elaboracin que utiliza hongos especficos (Penicillium roqueforti), complementados o no por la accin de hongos y/o levaduras subsidiarias responsables de otorgarle al producto caractersticas distintivas durante el proceso de elaboracin y maduracin.

FIGURA Nro. 07: QUESO ROQUEFORT Fuente: www.countrycheeses.co.uk 2008

Los mtodos de elaboracin de estos quesos difieren entre variedades, pero todos pretenden producir una cuajada que tenga textura abierta, de color blanco a cremoso (debida a la estructura, blanqueo o aditivos

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colorantes complementarios) y en la que la degradacin de las protenas, proporciona un medio para que los mohos puedan crecer. Los quesos de vena azul de maduracin ms rpida con frecuencia estn ms salados. Cuando la degradacin de la protena alcanza cierto nivel, el queso es perforado con agujas para que penetre mas oxigeno y dejar salida al dixido de carbono. La perforacin, es una operacin esencial del proceso de maduracin de las variedades de vena azul-verdoso, hasta color azul (Villegas, 2004). Microorganismos que intervienen: (Villegas, 2004). Cultivo iniciador. Cuando el queso se elabora con leche cruda, no se aaden cultivos iniciadores mesfilos. A la leche pasteurizada se adicionan cultivos mesfilos, o termfilos. La formacin de gas por Leuconostoc es deseable para la adecuada implantacin de los mohos y muchas veces se aaden adems estas bacterias. Crecen fcilmente si la acidificacin no es demasiado rpida, por eso se siembra un pequea proporcin de cultivo. Esporas de Penicillium roqueforti, algunas veces la suspensin de esporas se aade a la cuajada. Los mohos seleccionados pueden crecer a bajas presiones de oxgeno (por ej., 5% O2), resisten altas concentraciones de CO2, y crecen fcilmente a bajan temperatura (5-10 C) Interacciones microbianas (Villegas, 2004) La flora de los quesos azules es un ecosistema muy complejo, y de una serie de estudios sobre ellos, se pudo concluir que (ver Figura Nro. 08):

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FIGURA Nro. 08: ASOCIACIONES MICROBIANAS EN EL QUESO ROQUEFORT Fuente: Devoyod 1972

A. Al final del desuerado la flora esta constituida por: 1) Lactococos mesofilos: L. lactis spp. lactis y cremoris,

aproximadamente 109 por gramo de queso. 2) Leuconostoc, en nmero superior a 106 por gramo. Se produce un crecimiento considerable, potenciado por los compuestos mas

nitrogenados formados por los lactococos, que son proteolicticos (nmero 1 en la figura 08).

Principalmente

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intervienen cepas que no fermentan el citrato y, por tanto, no producen CO2 cuando crecen en la leche. 3) Enterococos, unos 107 por gramo. Algunas especies, sobre todo S. faecalis ssp. liquefaciens, favorece el crecimiento y la produccin de acido de los lactococos mesofilos y la produccin de CO 2 por Leuconostoc; los metabolitos producidos por los enterococos pueden incluir pptidos de baja masa molecular y aminocidos aromaticos como, por ejemplo, el triptfano (nmero 2). El CO2 tambien puede estimular el crecimiento de los lactococos mesofilos. 4) Levaduras alrededor de 108 por gramo. Antes del salado son fundamentalmente especies fermentadoras de la lactosa y sensibles a la sal, como Saccharomyces, Candida y Torulopsis. Asi mismo, favorecen el crecimiento de los lactococos mesofilos y la produccin de CO2 del por Leuconostoc la (nmero 3). Como y son

consecuencia

salado,

levaduras

cambian

predeterminantemente especies que no fermentan la lactosa y son halotolerantes, como Pichia, Hansenula y Debaryomyces (el contenido en sal del Q. Roquefort es alto, de alrededor del 10% de la fase acuosa). 5) Otros organismos, especialmente micrococos, estafilococos,

lactobacilos y coliformes. 6) La produccin de CO2 por parte de Leuconostoc y las levaduras, genera en el queso ojos que crean rpidamente si les llega

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suficiente aire a travs de los canales formados al pinchar el queso.

B. Algunos fenmenos que tienen lugar durante la maduracin: (Villegas, 2004) 1) Aumento del pH en la superficie del queso, debido principalmente al consumo de acido lactico por las levaduras, que permiten crecer a los micrococos aerobios halotolerantes y a las

corinebacterias, , especialmente Brevibacterium linens (nmero 5) 2) La contaminacin ocasional de la leche de quesera por micrococos muy proteolticos puede originar quesos con

insuficientes aberturas y , en consecuencia, en el que los mohos no crecen bien. Esto se debe a metabolitos que no afectan al crecimiento de Leuconostoc, pero les impiden producir gas (nmero 6)

2.4.4 Penicillium roqueforti

Es un moho ampliamente distribuido en la naturaleza. De hecho, Penicillium spp es un contaminante habitual de todos los sitios. Posee colonias de color verde y aspecto verdoso que son inodoras. Los conidoforos son de pared netamente rugosa y las hifas de pared fina. Su temperatura ptima de crecimiento gira entorno a 35-40C aunque resiste bien temperaturas bajas, superiores a 5C, pudiendo alterar

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alimentos en refrigeracin. A esas bajas temperaturas, su crecimiento sigue siendo rpido. Se desarrolla mejor y ms rpido a pH cercano a 4; tolera grandes variaciones de pH (3,5-10). Puede crecer con 5% de cido lctico en el medio. Tolera concentraciones de sal de 2-2,5%. Los pequeos contenidos estimulan la germinacin de los conidios y su lmite de tolerancia es >20%. Sin embargo depende de las cepas ya que con 68%, algunas se retrasan en cuanto otras se ven favorecidas. Es un microorganismo microaerfilo: 5% de oxigeno. Necesita aireacin para su extensin. No esporula a o ni al 100% de O2. Se ve ligeramente estimulado por un aporte de CO2. Los fermentos fngicos estn constituidos por una cepa pura o por una asociacin de cepas seleccionadas de mohos. Se pueden aislar de elaboraciones tradicionales o bien de colecciones de laboratorio. (Arroyo, 2005) Las cepas a emplear se eligen segn los siguientes criterios: Que sea de empleo fcil Que sea lo mas robusta y exigente posible Coste de produccin bajo Que este desprovista de poder patgeno Tambin influyen el desarrollo requerido de pasta, las necesidades en O2 del moho, su coloracin as como su actividad lipoltica y proteoltica. En los quesos azules segn diversos laboratorios, los tipos de Penicillium empleados son: P. roqueforti PRB6 y P. roqueforti Alce RO, ambas en suspensin de esporas. (Arroyo, 2005)

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CUADRO Nro. 03: CARACTERSTICAS PARTICULARES DE LOS TIPOS DE PENICILLIUM ROQUEFORTI

TIPO PRB6 Alce RO COLOR CRECIMIENTO Verde brillante Verde oscuro PROTEOLISIS Media Fuerte LIPOLISIS Media Fuerte

Fuente: LABORATORIOS ARROYO. 2005

Se pretende que los fermentos de P. roqueforti tengan las siguientes funciones: Provocar la desacidificacin de la pasta del queso mediante la utilizacin del cido lctico Segregar un conjunto de enzimas que le confieren un poder proteoltico importante Desarrollar una gran actividad lipoltica, produciendo el aroma tpico de los quesos de pasta azul Accin del fermento P. roqueforti se desarrolla en las cavidades del queso formadas por la produccin de CO2 por las bacterias lcticas heterofermentativas (Leuconostoc). Tiene un sistema proteoltico complejo, compuesto por dos endopeptidasas exocelulares (proteasa cida y metaloproteasa) y exopeptidasas (carboxipeptidasa cida y aminoproteasa alcalina). Su sistema lipoltica consta de dos lipasas exocelulares (cida y alcalina). Emplea la beta-oxidacin para transformar los cidos grasos; esa accin lipoltica es la principal responsable del sabor del queso por la produccin de compuestos aromticos. (Arroyo, 2005)

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2.4.5 Aspectos Bioqumicos de la maduracin de Quesos Azules

La aptitud al proceso de maduracin de los quesos depende de la composicin bioqumica de la cuajada que antes de la maduracin ya ha sido determinada en el proceso de elaboracin (SCOTT, 1991; BRITO et al., 1995). El objetivo de la maduracin del queso es convertir la cuajada fresca, que difiere muy poco entre las distintas variedades, a una cuajada que posee diferentes caractersticas de apariencia, gusto, aroma, textura y funcionalidad, segn el tipo de queso (FOX, 2002). La Figura Nro. 09 resume el complejo fenmeno c de la maduracin en una pasta de queso; en ella se destacan los principales agentes, los

factores (variables fisicoqumicas) que los afectan, los cambios que experimentan los componentes primarios y los atributos sensoriales afectados. En general durante la maduracin se reconocen tres eventos

bioqumicos: gliclisis, liplisis y protelisis (FOX y McSWEENEY, 1998), de las cuales la liplisis y la gliclisis son los mas importantes en quesos azules, quesos italianos duros y en los Suizos, pero la protelisis es esencial en todas las variedades especialmente en quesos madurados por bacterias internas y en aquellos de maduracin especial (FOX y McSWEENEY, 1997), aun as los efectos sobre la proporcin de grasa y protenas es relativamente pequea comparada con la de la lactosa la cual desaparece rpidamente (SCOTT, 1991).

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FIGURA Nro. 09: CAMBIOS DURANTE LA MADURACIN DEL QUESO Fuente: Villegas, 1993; Davis, 1965

Los principales constituyentes del queso, protenas, lpidos y lactosa son degradados por efectos de reacciones microbiolgicas, bioqumicas y qumicas a productos primarios y secundarios, entre estos se encuentran, los provenientes de las protenas como pptidos, aminocidos, aminas, cidos, tioles y tiosteres; los provenientes de los lpidos como cidos grasos, metilcetonas, lactonas y steres; los provenientes de la lactosa Ing. Kathia Perea Layme

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como cidos (lctico, actico, propinico), dixido de carbono, steres y alcoholes (FOX y McSWEENEY, 1997). El metabolismo de la lactosa junto con la hidrlisis de las grasas, son procesos fundamentales en la elaboracin de quesos ya que infunde en ellos las caractersticas e intensidad del sabor y aroma de stos. Por su parte, las protenas tienen un papel importante en la textura del mismo (GONZALEZ DEL LLANO, 1990). En la maduracin del queso estn involucrados agentes que provienen de 6 fuentes: enzimas coagulantes; enzimas nativas de la leche; bacterias iniciadoras y sus enzimas las cuales son liberadas despus de la muerte y lisis de las clulas; enzimas de microorganismos iniciadores secundarios (los que adquieren mayor importancia en las variedades azules, como Penicillium roqueforti. camemberti ); bacterias no iniciadoras (BALNS), por ejemplo organismos que sobreviven a la pasteurizacin de la leche o posteriormente contaminan la leche o la cuajada; y, por ltimo, enzimas exgenas que eventualmente se agregan para acelerar la maduracin del queso (MCSWEENEY, 2004). Conner et al. (1988), citado por MOLINA et al. (1996), sealan que las propiedades fisicoqumicas, qumicas y sensoriales del producto final depende de una serie de factores tales como: materia prima utilizada, cambios producidos durante la maduracin del queso, los que a su vez dependen de las condiciones de humedad y temperatura de la cmara de maduracin, aireacin, manejo de los quesos. El control de dichos factores es esencial para que en el queso ocurra una distribucin

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homognea de la sal dentro de la masa, ligera reduccin de la humedad, aumento del pH, formacin de la corteza adems de intensificacin del color normal de ste (BRITO, 1982).

FIGURA Nro. 10: RESUMEN DE LAS REACCIONES BIOQUMICAS QUE OPERAN EN EL QUESO DURANTE LA MADURACIN Fuente: Mcsweeney 2004

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2.4.6 GLICLISIS.
La fermentacin de la lactosa o gliclisis se inicia desde que se agrega el cultivo a la leche antes de la coagulacin, contina durante el proceso de elaboracin y termina en la maduracin. La lactosa es el sustrato para la formacin de cido lctico, el cual origina una disminucin del pH a niveles prximos a 5.0, El pH alcanzado repercute en el curso que tomen los procesos proteolticos y lipolticos, tpicos de la etapa de maduracin, adems el desarrollo de la acidez, juega un papel importante en la formacin del cuerpo del queso y en los productos secundarios responsables del sabor y aroma, estos pueden incluir cido actico, diacetilo, acetaldehdo, etanol, anhdrido carbnico y cido propinico (Veisseyre, 1980, Alais, 1985, Brito, 1990, Khalid y Marth,1990). Dentro de las dos primeras semanas de la maduracin, desaparece casi

completamente la lactosa (Veisseyre, 1980, Conner, 1988 y Brito,1993). La cuajada contiene un nivel bajo de lactosa (1 2 % residual) la que se metaboliza rpidamente en la primera etapa de la maduracin a lactato (principalmente L-ismero), el cual puede ser catabolizado

posteriormente por varias vas. Al final de la maduracin la concentracin de cido lctico en el queso es de aproximadamente 1% en los quesos de masa lavada (FOX, 2002).

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FIGURA Nro. 11: RESUMEN DEL METABOLISMO DE LA LACTOSA Fuente: Fox 2002

El lactato contribuye al sabor cido del queso, principalmente en la primera etapa de la maduracin, adems es un sustrato importante para una serie de reacciones que ocurren durante la maduracin y que contribuyen al sabor del queso. Es as como el L-lactato es racemizado a DL-lactato por la flora BALNS y a CO2 y H2O, en el caso del Penicillium Roqueforti mediante el ciclo de Krebs. El CO2 liberado por Leuconostoc provoca fisuras o chimeneas donde se podr implantar luego el Penicillium. El lactato es degradado rpidamente y en su casi totalidad, lo que asegura la neutralizacin de la pasta e interviene en las caractersticas organolpticas (Villegas, 2004). El cido lctico formado adems de controlar la flora microbiana, produce el paracaseinato monoclcico que da plasticidad a la cuajada, lo que es necesario para que se lleve acabo modificaciones en las

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caractersticas sensoriales de cuerpo o consistencia del queso. Este proceso se realiza al reaccionar el cido lctico con el paracaseinato biclcico, de la cuajada el cual constituye la matriz del queso representando aproximadamente el 99% de las protenas de ste, las cuales remueven poco a poco el calcio (formndose el paracaseinato monoclcico) transformando la cuajada inicialmente friable,

desgranable y discontinua en una masa elstica, continua y flexible (FAO, 1986 y Brito, 1993). La formacin de este cido tambin otorga al producto una mayor proteccin contra el desarrollo de la flora microbiana indeseable (BRITO, 1993). El desarrollo de la acidez producto de la formacin de cido lctico, juega un papel importante en la formacin del cuerpo. Como se observa en el Cuadro 04, la teora de Van Slyke, explica la accin conjunta que ocurre entre la casena soluble y la acidez, en la formacin del cuerpo del queso (BRITO, 1990).
CUADRO Nro. 04: TEORA DE VAN SLYKE

FUENTE: BRITO, 1990

Lo que explica, que un desarrollo excesivo de la acidez produce quesos de cuerpo duro, ya que la degradacin puede ser tal que haya gran formacin de paracasena libre, la cual no presenta las caractersticas de elasticidad propias de su sal monoclcica. En consecuencia, el control adecuado del desarrollo de la acidez durante la produccin, otorga las caractersticas de elasticidad tpicas de cada variedad de queso (BRITO, 1990).

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2.4.7 LIPLISIS.
La liplisis, constituye la divisin hidroltica de los triglicridos con separacin de cidos grasos libres, producida por accin de la lipasa lctea, lipasa del cuajo y/o lipasa microbiana. A diferencia de otros

productos la liplisis no genera defectos organolpticos en los quesos, de hecho la degradacin lipdica existe en todo tipo de queso y solo se transforma en defecto cuando sobrepasa el umbral ptimo de cada variedad de queso (IDFFIL, 1980). El tratamiento mecnico de los glbulos de grasa durante la

manipulacin de la leche puede daar la membrana de glbulos grasos, permitiendo que la grasa sea accesible a las lipasas. es por esto que la homogenizacin es una operacin necesaria en la elaboracin de los quesos azules. Ya que esta operacin ocasiona una muy fuerte activacin de la liplisis, debido a que la nueva membrana de los glbulos grasos es menos estructurada y ms permeable que la natural, lo que la hace ms vulnerable a los procesos degradativos (LUQUE, 2008). Para las variedades de Quesos Azules, la actividad lipoltica es extensiva y decisiva para lograr sus caractersticas fundamentales. Ya que aporta la mayor contribucin, directa o indirectamente, al desarrollo del sabor en queso Al ser la grasa ms accesible se asegura la actividad lipoltica. La leche para queso azul se estandariza con el agregado de crema homogeneizada y con tratamiento trmico a temperaturas por debajo de las de una pasteurizacin ordinaria. (LUQUE, 2008).

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La liplisis que es la hidrlisis del ester entre los cidos grasos y el glicerol por lipasas; segn su origen, las lipasas pueden tener actividades preferenciales para hidrolizar ciertos acidos grasos; asi la lipasa de P. roqueforti libera mas rpidamente acidos grasos de cadena corta. (LUQUE, 2008).

FIGURA Nro. 12: RESUMEN DE LA LIPLISIS EN EL QUESO Fuente: Fox 2002

Adems, los cidos grasos son importantes precursores para la produccin de otros compuestos voltiles durante la maduracin, como las metilcetonas (en el caso de quesos madurados por mohos), lactonas, steres, alcanos y alcoholes secundarios. Por reaccin de cido graso con alcohol se forman cidos grasos steres; al reaccionar cido graso con tiol se forman tiosteres; las lactonas son compuestos cclicos formados por la esterificacin intramolecular de hidroxicidos (FOX, 2002; MCSWEENEY 2004).

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Las lipasas, responsables de la liplisis, se originan de varias fuentes, como el coagulante, las enzimas de las bacterias cido lcticas y las lipasas nativas de la leche que son ms importantes en los quesos elaborados con leche cruda (MCSWEENEY, 2004). En los quesos azules la liplisis es la etapa mas importante,

comparativamente el nivel de liplisis es muy variado y vemos que mientras para un queso gruyere es de 1%; cheddar 0,25 1.5% ; camembert 6 -10%; para un queso Azul es de 8 10% y la extensin de la liplisis puede producir la liberacin de hasta un 25% del total de sus cidos grasos (FOX y McSWEENEY, 1998). En el roquefort, la liplisis origina ms del 95% de los AGL. Adems, aumenta el contenido en AG Voltiles de cadena corta. Los dems microorganismos en cambio no emplean tanto la lipolisis. Las lipasas de P. roqueforti permiten la diversificacin de los AGL, lo que se demuestra en el sabor del queso. El sistema lipolitico de los Penicillium esta formado por dos enzimas una alcalina y otra acida. La beta-ceto-acil-descarboxilasa es una enzima que desva la beta-oxidacin dando lugar a metilcetonas de cadena media (6 a 12 carbones) de un atomo de carbn menos, que son los compuestos caractersticos del aroma del queso. Esa desviacin es debida a que los AGL en exceso pueden inhibir al fermento, sobre todo los de cadena media. Es pues una va de destoxificacin. Adems, enseguida las metilcetonas sufren une reduccin enzimtica a alcoholes secundarios (ver Figura 13): la acumulacin de metilcetonas esta pues

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limitada. Esta transformacin permite reducir los efectos inhibitorios causados por la acumulacin de acidos grasos. Hay que tener en cuenta que a mayor lipolisis, mayor cantidad de metilcetonas se forman. Es, por tanto, una buena manera de protegerse puesto que la lipolisis es tan importante. Y es por estas degradaciones que no hay percepcin de sabor a rancio. Dentro de las metilcetonas que han sido el resultado del metabolismo de las esporas y el micelio de los penicillium, las mas importantes son la 2heptanona y la 2-nonanona.

FIGURA Nro. 13: ESQUEMA DE REDUCCIN ENZIMTICA DE METILCETONAS A ALCOHOLES Fuente: Luque 2008

Tanto las metilcetonas como los alcoholes secundarios son muy voltiles y son los principales responsables del flavor del Roquefort. Ambos productos se forman en cantidades variables segn la cepa empleada como fermento. Las transformaciones posteriores tambien provocan la formacin de compuestos secundarios que otorgan especialmente sabores fuertes y caractersticos., tales como: cido propinico, actico, butrico, caproico, caprlico y cprico (Veisseyre, 1980 y Brito, 1993).

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2.4.8 PROTELISIS.
La conversin del queso fresco en un queso madurado est determinado principalmente por la protelisis (Visser,1993). Segn Visser y Van Den Berg, (2002), La protelisis es un proceso balanceado que se produce debido a la combinacin de la accin de enzimas y microorganismos, que degradan la casena en grandes y pequeos fragmentos de pptidos, aminocidos y otros compuestos voltiles que contribuyen al sabor. Segn Fox, (1989); Brito et al. (1996); Broome y Limsowtin, (1998); Reid y Coolbear, (1999) y Maifreni et al. (2002), la protelisis es probablemente la reaccin bioqumica ms importante durante la maduracin de quesos que presenta un mayor impacto en la textura y sabor-aroma del producto y se puede dividir en tres fases: Protelisis de la leche durante la elaboracin del queso, Coagulacin enzimtica inducida y, protelisis durante la maduracin del queso.

En la Figura 14 se presenta un resumen de la protelisis y sus reacciones.

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FIGURA Nro. 14: RESUMEN DE LA PROTELISIS Y CATABOLISMO DE LOS AMINOCIDOS EN EL QUESO DURANTE LA MADURACIN Fuente: Mcsweeney 2004

Este proceso comienza con la formacin del gel provocado por el cuajo al romper el enlace fenilalanina 105 y metionina 106 de la casena , ms tarde los agentes proteolticos son los que determinan la protelisis en el queso, por rupturas de las cadenas de aminocidos formndose cadenas ms cortas de proteasas, peptonas y pptidos, siendo estos los que otorgan cuerpo y consistencia al queso, luego son degradadas hasta

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aminocidos, los cuales ayudan a aportar al sabor y aroma en el queso (GONZALEZ DEL LLANO, 1991; BRITO, 1993). Por ltimo, por diferentes reacciones que pueden sufrir los aminocidos, se pueden obtener gas carbnico y aminas por descarboxilacin, amoniaco y un cido cetnico por desaminacin oxidativa, cido aliftico por desaminacin reductora y sulfuros por degradacin de aminocidos sulfurados (ALAIS, 1985). Durante la protelisis se presenta una solubilidad regresiva de las casenas que se ponen de manifiesto por el aumento del nitrgeno soluble del queso recin desuerado desde 4,8% hasta un 50% al final de la maduracin (segn el tipo de queso), lo que se reduce en la aparicin de una masa blanda y untuosa y de nmerosas sustancias spidas (Alais, 1985 y Ordez, 1987). El sabor y aroma de cualquier tipo de queso, resulta de la mezcla equilibrada de compuestos presentes en la cuajada fresca y los originados de la degradacin enzimtica de uno o ms constituyente (lactosa, materia grasa y casena) del queso durante la maduracin (Brito, 1990 y Quintanilla y Pea-Hernndez, 1992). La accin proteoltica del Penicillium es intensa y libera tanto pptidos de alto y bajo peso molecular como aminocidos. La accin predominante se debe a la proteasa cida (endopeptidasa). Las endopeptidasas exocelulares de P. roqueforti degradan las casenas alfa y beta. La proteasa cida ataca la casena beta liberando pptidos, sobre todo al final del afinado, a pesar del pH poco favorable a su buen

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funcionamiento. La metaloproteasa degrada tambin la casena beta, en particular al principio del proceso aunque su accin es menor (LUQUE, 2008). Las exopeptidasas degradan los pptidos presentes en el medio originando cantidades elevadas de aminocido en la pasta del queso. En el roquefort, se sabe de la presencia de triptamina, tiramina e histamina que son aminas no voltiles. Tambin hay presencia de amoniaco procedente de la desaminacin de los aminocidos. Las grandes cantidades de aminocido presentes en el queso, junto con el amoniaco son componentes muy importantes del aroma de la pasta. La proteolisis, adems de participar en el sabor, da lugar a una pasta menos dura y menos elstica. Puesto que las protenas son la nica fase slida continua del queso, es obvio el papel mayoritario que tienen en la textura del queso (LUQUE, 2008).

2.4.8.1. Agentes Proteolticos en la maduracin del Queso.

Los principales agentes proteolticos responsables de la degradacin de las protenas durante la maduracin del queso son el agente coagulante, las enzimas endgenas de la leche y los microorganismos en los cuales se encuentran los starters, bacterias no starters (cido lcticas) y los cultivos secundarios (FOX y McSWEENEY, 1997; McSWEENEY y SOUSA, 2000). El proceso de maduracin depende de las caractersticas de especificidad y estabilidad de las proteasas en el queso (Reid y

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Coolbear, 1999). De acuerdo a Fox, (1989); Leaver et al. (1993); Broome y Limsowtin, (1998), adems de las bacterias adicionadas, existen otros agentes proteolticos en el queso que contribuyen a la degradacin de la protena de la leche. Estos incluyen:

Las enzimas coagulantes (Cuajo o sustituto del cuajo).

La quimosina es la principal enzima componente del cuajo de ternero. Durante la elaboracin del queso hay un aumento de la unin de la quimosina a las casenas a medida que disminuye el pH, incorporndose a la cuajada Entre el 15 y 40% del cuajo adicionado a la leche, este porcentaje de retencin depende de la temperatura de coccin de la cuajada, del pH al cual se realice el drenaje del suero y cantidad de cuajo adicionado a la leche utilizada para la elaboracin del queso. Se presenta algo de inactividad en la quimosina retenida durante la elaboracin del queso, tanto que el nivel final remanente del coagulante activo en la cuajada es aproximadamente 6 7% de la adicin inicial de la quimosina y en el caso de la renina microbiana es de aproximadamente del 3% (Fox, 1989; Broome y Liomsowtin, 1998; Mcsweeney y Soousa, 2002). Adems de la hidrlisis especfica entre los enlaces fenilanalina 105 y metionina 106 de la casena, la quimosina puede tambin

hidrolizar a la s1 y casena pero su accin en esta ltima es limitada y mucho ms lenta (Alais, 1985; Lawrence et al. 1987; Fox, 1989; Broome y Liomsowtin, 1998; McSweeney y Soousa, 2002).

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El coagulante juega el principal papel en el inicio de la degradacin de s1-casena (Lawrence et al. 1987). La quimosina durante la maduracin de los quesos, degrada ms extensivamente a la s1casena que a la -casena (Lawrence et al. 1987). Comnmente la hidrlisis primera de la casena es dominada por dos mecanismos, la actividad de la plasmina y la de la quimosina. La plasmina es activa en tres lugares de la casena, Lis28 Lis29, Lis105 - His106 y Lis107 - Glu108 y la actividad de la quimosina en la

s-1casena en el lugar Fen23 Fen24, esto produce pptidos cortos

como el s-I

f(1-23) y pptidos largos como el f(24199), que

corresponde a los productos del rompimiento de la s-Icasena. Estos fragmentos de casena no son solubles a pH 4,4 (Ines et al. 1999; Ard, 2001). Al incrementar la proporcin sal en humedad (S/H), se aumenta la cantidad de sal agregada a la casena por lo tanto tambin se presenta incremento en la resistencia de los enlaces sensible al ataque por parte de la quimosina (Lawrence et al. 1987) La accin del cuajo en el queso depende entre otros factores de la cantidad aadida a la leche, del pH tanto de la leche como de la cuajada y de la tasa de produccin de cido por parte de las bacterias cido lcticas (VISSER, 1993).

Enzimas endgenas de la leche.

La leche contienen un nmero de enzimas proteolticas, la principal de sta es la plasmina (anteriormente conocida con el nombre de

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proteasa alcalina), que es secretada en leche normalmente como plasmingeno inactivo y se activa en el lumen antes del ordeo. Aproximadamente el 80% de la plasmina en la leche est en la forma de plasmingeno (Broome y Limsowtin, 1998; Visser y Van Den Berg, 2002). En la leche la plasmina se asocia con la casena y es incluida en la matriz que sta forma durante la coagulacin, es necesario un calentamiento a 80 C por 10 minutos para inactivarla (Broome y Limsowtin, 1998; Visser y Van Den Berg, 2002 y Kaminoogawa et al.1972 citado por Somers y Kelly, 2002). la asociacin a las casenas se produce en un rango de pH 4,6-6,6 y, por lo tanto, la mayora del plasmingeno y de la plasmina en la leche quedan retenidos en el queso en el proceso de elaboracin (BROOME y LIMSOWTIN, 1998) Los inhibidores tanto de la plasmina como de los activadores del plasmingeno son en su mayora desnaturalizados por la

pasteurizacin de la leche o removidos en el proceso de elaboracin del queso (VISSER, 1993). Es de gran importancia para la protelisis primaria de la casena durante la maduracin del queso, pues degrada a la s1, ,s2casena

-casena,

proteasa peptona y posiblemente

casena (Lelievre y Lawrence, 1988; Farkye y Fox, 1992 y Broome y Limsowtin, 1998). Segn Visser y Van Den Berg (2002), la accin de la plasmina en la maduracin del queso se verifica por el aumento permanente de la Ing. Kathia Perea Layme

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cantidad de casena, que son largas cadenas terminales productos de la degradacin de la casena representada por los residuos de 29-209, 106-209 y 114-209 de la protena. Lawrence et al. (1987), afirma que en los quesos que contienen pequeas cantidades o no contienen coagulante residual, la plasmina es la responsable de iniciar la degradacin de la casena. La plasmina es una proteinasa como la tripsina la cual es ptimamente activa alrededor de un pH 7,5 y a 37 C Sealan adems que es una protena que contienen cistina y su actividad podra depender del potencial redox y es altamente especfica a uniones peptdicas que involucran los grupos carboxilos de la lisina y en menor extensin de la arginina particularmente en la casena y la -casena. (FOX y McSWEENEY, 1997).

s2-

Las proteasas del cultivo lctico.

Los microorganismos del cultivo lctico en el queso cumplen con el desarrollo de la acidez durante la elaboracin del queso, adems de proporciona las enzimas proteolticas que promueven la degradacin de las protenas y lpidos durante la maduracin (Kunji et al. 1996 citado por Broome y Limsowtin, 1998; Visser y Van Den Berg, 2002); tambien se tienes un efecto de proteccin biolgica del producto por ejemplo, por el bajo pH y la produccin de bacteriocinas (EL SODA et al., 2000).

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GONZALEZ DEL LLANO (1991), menciona que los microorganismos cidos lcticos ocupados en la elaboracin del queso son poco proteolticos comparados con otros microorganismos. El sistema proteoltico de estos se puede dividir en proteinasas y peptidasas tanto intracelulares como extracelulares, las cuales pueden estar unidas a la pared o a la membrana de las clulas (VISSER, 1993). El pH ptimo de las peptidasas es neutro o alcalino pero en el medio cido del queso stas sobreviven y actan por largos perodos de tiempo (GONZALEZ DEL LLANO, 1991). Todas las peptidasas, esterasas y fosfatasas son intracelulares y, por lo tanto, la lisis de la clula es esencial para que ellas contribuyan a la maduracin (FOX y McSWEENEY, 1998). Se han identificado 2 tipos de proteinasas la PI y la PIII, las cuales Reid y Coolbear, citados por BROOME y LIMSOWTIN (1998), las clasificaron en dos grupos especficos: la lactocepin I (PI), que degrada las casenas y k y la lactocepin III (P pero no la casena III), que acta sobre las casenas , y k pero su especificidad de unin en el pptido es diferente al lactocepin I. El la Figura 15 se esquematiza la ubicacin de las proteinasas (endopeptidasas) y dipeptidasas localizadas en la pared de las clulas de bacterias acidolcticas.

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FIGURA Nro. 15: UBICACIN DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA DIGESTIN DE PROTENAS DE LA LECHE POR LAS BACTERIAS ACIDOLCTICAS Fuente: Roissart 1986

Las bacterias adjuntas no pertenecientes al cultivo.

Bacterias cido lcticas no starters. El queso es un medio ambiente muy selectivo y su microflora interna de bacterias no starters es principalmente del tipo de bacterias cido lcticas (FOX y

McSWEENEY, 1998). Entre las principales estn las variedades de Lactobacillus y algunos Micrococcus y Pediococcus (FOX y

McSWEENEY, 1997; FOX y McSWEENEY, 1998; BROOME y LIMSOWTIN, 1998), de stas las ms comnmente encontradas estn los tipos de Lactobacillus y las especies ms predominantes son las L. casei, L paracasei, L plantarum y L. curvatus (EL SODA et al., 2000). Estas bacterias pueden ingresar al queso por contaminacin de la leche, son fuertemente proteolticas y pueden provocar una gran

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variedad de sabores en el queso, los cuales son generalmente indeseables en la mayora de estos. El crecimiento de estos microorganismos se previene con la pasteurizacin de la leche y la buena higiene en la elaboracin de los quesos (WALSTRA et al., 1999). Las proteinasa extracelular de las bacterias cido lcticas, degradan la casena en grandes fragmentos de pptidos lo que no puede tener lugar sin la lisis de las clulas. Estos pptidos despus son degradados en pptidos ms pequeos y aminocidos (Visser y Van Den Berg, 2002). La diversidad de las peptidasas promueve un eficiente rompimiento de los pptidos pequeos y de los aminocidos. Esta es una importante razn por la que peptidasas intracelulares juegan un papel decisivo en la cantidad de pptidos amargos en un queso (Visser y Van Den Berg, 2002).

Cultivos secundarios.
Son aquellos que son aadidos a determinadas variedades de quesos para proporcionar funciones bien definidas, como en este caso, el Penicillium roqueforti (EL SODA et al., 2000), Estos microorganismos secundarios presentan una fuerte actividad metablica y dominan tanto la maduracin como las caractersticas de los quesos (FOX y McSWEENEY, 1998). Por su parte EL SODA et al. (2000), mencionan que la contribucin de los cultivos secundarios es necesaria para el desarrollo del sabor tpico del queso azul.

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2.4.8.2. Factores que afectan la Protelisis.

Retencin del agente coagulante en la cuajada del queso;

Mientras menor sea el pH de la cuajada en el momento del desuere, mayor cantidad de cuajo es retenido en la cuajada y la cantidad de S1 casena hidrolizada es mayor. Cuando no hay actividad del cuajo no se presenta o se presenta muy poca degradacin de la S1 casena y por lo tanto no ocurre ablandamiento de la cuajada (Stadhouders et al. 1977 citado por Lawrence et al. 1987). Retencin de la plasmina en la cuajada del queso. Tanto el pH

como el nivel del drenaje ocurrido durante el desuere determinan la proporcin de plasmina retenida en el queso. La plasmina presenta un pH ptimo cercano a 4 y se ha demostrado que bajo condiciones cidas produce S1-I CN a partir de la S1 casena al igual que los pptidos -1 y -II casena a partir de la casena (Lawrence et al. 1987). Efecto de la proporcin sal/humedad (S:H): FOX (1987), menciona

que se ha demostrado una relacin inversa entre la extensin de la degradacin de la casena y con el porcentaje de sal en humedad en queso joven. Adems, menciona que un cuerpo dbil y pastoso en el queso es producto de una baja concentracin de sal, y un cuerpo excesivamente firme se debe a sus altos niveles de sal, debido a la influencia del NaCl en la protelisis de la casena .

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KELLY et al. (1996) y KRISTIANSEN et al. (1999), al estudiar la influencia de la sal en la velocidad de la protelisis en queso, observaron que sta disminua con el aumento del porcentaje sal/humedad, siendo la actividad del coagulante la ms afectada en especial sobre la casena donde al aumentar la concentracin de sal disminua la extensin de la degradacin de esta casena. KELLY et al. (1996), en su investigacin mencionan que los enlaces ms resistentes a la degradacin con el aumento de la sal fueron Leu101-Tyr102 en la casena y Leu192-Tyr193 en la casena , siendo esta ltima la ms afectada. Olson (1982), reporta que tanto la actividad de la quimosina como la de las otras enzimas proteolticas disminuyen por el efecto de la sal. Efectos de la temperatura. Se ha demostrado que el aumento de

la temperatura de maduracin produce un aumento en la protelisis; adems las altas temperatura de maduracin (17 y 20 C) en relacin a lo normal (14 C) no afectan las caractersticas sensoriales. Efecto del pH. La protelisis del queso presenta un incremento

notable cuando los quesos tienen un pH mayor a 5,8. El pH inicial de la leche no influye en la magnitud de la hidrlisis de la S1 casena en

el queso (Lawrence et al. 1987). Las enzimas microbianas como endopeptidasas, peptidasas y descarboxilasas su pH ptimo de accin es de 5 a 6 y en las desaminasas su pH es de 7 y ms alto (ALAIS, 1985).

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Segn Alais (1985), el pH ptimo para la accin de las enzimas en el proceso de las protelisis es de alrededor de 5,2 dependiendo del contenido de sal. Valores elevados de pH aumentan la actividad de los microorganismos y sus enzimas, acelerando los procesos de degradacin, en cambio a pH inferiores a 5 se reduce notablemente la velocidad de degradacin de los componentes,

consecuentemente los quesos ms cidos maduran mas lento (Brito et al. 1995). Efecto del contenido de calcio. Al disminuir el pH y aumentar la

captacin de la sal en el queso, la concentracin del in calcio en el suero del queso incrementa. Es difcil diferenciar la influencia directa del calcio en la actividad proteoltica ocurrido durante la maduracin de quesos. Existe una relacin entre el contenido total de calcio del queso y la degradacin de la casena durante su maduracin (Lawrence et al. 1987). Efecto del contenido de Humedad. La humedad en el proceso de

maduracin del queso, tiende a disminuir, esta variacin es fundamental en este perodo, puesto que influye en gran medida en los procesos degradativos que ocurren en el interior del producto al posibilitar la solubilidad y difusin de las enzimas y de los productos de la degradacin del proceso bioqumico. Por lo anterior, los quesos con mayor humedad maduran ms rpido que los ms secos (Alais, 1985), ya que la degradacin de las protenas generalmente es ms rpida a mayores contenidos de agua(WALSTRA et al., 1999).

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Una baja relacin de humedad/casena, fortalece la matriz de casena en el queso y pequeos cambios en esta relacin, resultan en grandes cambios de humedad disponible, ya que gran parte de esta humedad se encuentra unida a las casenas y sus productos de degradacin. Adems la relacin cuajo residual/casena es menor en quesos de bajo contenido de humedad por lo tanto cambios en la textura sern menores y en consecuencia a mayor contenido de humedad en el queso a cualquier pH, suavizar su textura (Lawrence et al. 1987). Si hablamos en alusion a la influencia de la actividad del agua (aw), la cual describe el grado con el cual el agua esta unida al alimento, a diferencia del contenido de agua que se refiere a la cantidad total de agua presente en un sistema alimenticio (FONTANA, 2000). La a w posiblemente influye sobre varios sistemas enzimticos en el queso, los cuales seran inhibidos al reducirse la aw (FOX, 1987).

2.4.8.3. Protelisis primaria de las casenas

En la actualidad se admite que existen cuatro especies de casenas en leche bovina s1 (9 g/ l), (8,5 g/l) y en menor proporcin s2 (2,5 g/l) y k (3,2 g/l) (ALAIS, 1985), la cuajada de queso consiste principalmente de s1, s2, y para-k-casena (VISSER, 1993). Los hongos internos de los Quesos Azules, sus proteinasas presentan una accin mayor sobre la casena (GRAPPIN et al., 1985).

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Generalmente en los dems quesos se puede observar que la casena s1 es ms extensamente degradada que la casena . Los principales responsables de la protelisis primaria son la quimosina (enzima coagulante) y en menor grado la plasmina (FOX y McSWEENEY, 1998), observndose en todas las variedades de quesos la hidrlisis de la casena s1 por la quimosina (aun en quesos con alta coccin) y la hidrlisis de la casena por la plasmina (FOX y McSWEENEY, 1997), adems VISSER (1993) tambin menciona que la enzima coagulante es fuertemente dominante en especial en los quesos elaborados a baja temperatura de coccin. En la Figura 16 se pueden observar los pptidos producidos por la accin de la quimosina sobre la casena s1 pura en solucin (condiciones electroforticas de este anlisis: electroforesis en poliacrilamida (PAGE), 7% de Cyanogum, 5,4 M de urea, pH 9,2, buffer Tris/EDTA/H3BO3) (figura 16 a.1); los pptidos producidos de la casena pura en solucin por la accin de la quimosina a pH 4,7 (I, II y III) (condiciones: PAGE, 7% de Cyanogum, 4,5 M de urea, pH 8,9, buffer Tris/HCl) y por accin de la plasmina (casenas ) (condiciones: 2% d e almidn, 7 M de urea, pH 8,6, buffer Tris/Citrato) (figura 16 a.2). Tambin se observan los patrones electroforticos de los quesos Meshanger (figura 16 b.1),

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FIGURA Nro. 16: DEGRADACIN DE LAS CASENAS s1 y en solucin (a) y en queso (b).
Fuente: a.1) y a.2) GRAPPIN 1985. b.1) JONG (1976).

Con respecto a la hidrlisis de la casena s1 en solucin por accin del cuajo se han obtenido los siguientes fragmentos: s1 I (24/25-199), s1 II (24/25-169), s1 III y IV(24/25-149/150), s1 V (29/33-199), s1 VI (56179) (Mulvihill y Fox, citados por GRAPPIN et al., 1985); donde sus movilidades electroforticas se pueden observar en la Figura 16. a.1. En queso la enzima coagulante inicia la degradacin de la casena s1 obtenindose s1 I (f24-199) (f= fraccin de casena), pero tambin las proteinasas nativas de la leche son capaces de actuar sobre esta casena produciendo este tipo de pptido (GRAPPIN et al., 1985). La unin de la quimosina al enlace Phe 23-Phe24 de la casena la s1 se cree que es responsable de la suavidad de la textura del queso y de la produccin de pptidos pequeos producto del rompimiento de la s1 (f1-23), que es uno de los productos de la degradacin de la casena s1 (FOX y McSWEENEY, 1997).

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El pptido s1 I puede ser posteriormente degradado por las enzimas coagulantes (VISSER, 1993), adems sus posteriores hidrlisis podran depender de la edad del queso, su pH y en los quesos azules de sus proteinasas fngicas (FOX y McSWEENEY, 1997), quizs por estas razones GRAPPIN et al. (1985), mencionan que no se ha observado una buena relacin entre la desaparicin de la s1 y la produccin de s1 I en queso. Por otra parte, el fragmento s1 (f1-23) que corresponde a uno de los productos de la degradacin de la casena s1 es rpidamente hidrolizado por las proteinasas starters (FOX y

McSWEENEY, 1997), siendo adems soluble bajo las condiciones del gel teido y puede por lo tanto no ser detectado por el gel (VISSER, 1993). En las primeras etapas de maduracin del queso se puede esperar que la casena sea hidrolizada por la renina y la plasmina, y que los productos de estas hidrlisis podran ser degradados por enzimas de las bacterias starters y otras enzimas. (GRAPPIN et al., 1985). En solucin la accin de la quimosina o la renina sobre la casena produce los pptidos I, II y III (f1-192/189, f1-163/4/5 y f1-139) (GRAPPIN et al., 1985; VISSER, 1993; FOX y McSWEENEY, 1997) (Figura Nro. 16 - a.2). Aunque en solucin la casena es hidrolizada rpidamente por la quimosina, en queso sta es resistente a esta enzima (FOX y McSWEENEY, 1998). La casena s2 en solucin es hidrolizada por la plasmina y la quimosina pero en el queso los grandes pptidos derivados de esta

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casena no son detectados en los geles, posiblemente esto se pueda deber a su baja concentracin (10% del total de las casenas), adems de su hidrlisis probablemente menos selectivamente (FOX y McSWEENEY, 1997).

2.4.8.4. Determinacin del grado de protelisis.

Por lo general para la evaluacin de la maduracin de los quesos se utiliza una tcnica especfica (cromatografa y electroforesis) y no especfica (determinacin de nitrgeno soluble) a objeto de obtener una mejor y mayor informacin (McSweeney y Fox, 1996; Ard, 2001). RANK et al. (1985), mencionan que la protelisis en queso se puede dividir en 2, protelisis primaria y secundaria. La primaria involucra los cambios ocurridos en las casenas , y , producindose pptidos y otras bandas menores que pueden ser detectados y separados por electroforesis en geles de poliacrilamida. Debido a que los

componentes de la protena y de los pptidos tienen pesos moleculares distintos (19.000 a 25.230), distinta secuencia de los aminocidos y grado de fosforilacin, para luego ser visualizadas a travs de un teido con tintes especficos (Van Hekken y Thompson, 1992 citado por Leaver et al. 1993, Leaver et al. 1993).La protelisis secundaria abarcaran los pptidos, protenas y aminocidos que son solubles en el queso, los cuales pueden ser extrados como fracciones solubles en agua, sin embargo, se han encontrado coincidencias entre estas dos protelisis al realizarse las electroforesis en gel a estas

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fracciones solubles en agua, ya que se han detectado bandas en la regin de las casenas . Los compuestos nitrogenados solubles del queso se pueden extraer a travs de diferentes mtodos, como la extraccin tanto en agua como en cido a pH 4,4-4,6 donde se han podido extraer protenas (excepto las casenas, que son totalmente excluidas a pH cido 4,4 y en agua son excluidas la gran mayora), todos los pptidos, aminocidos y compuestos ms pequeos con nitrgeno, en tanto con la utilizacin del cido tricloroactico (TCA) al 12% se han podido extraer pptidos de tamao pequeo a mediano, aminocidos y pequeos compuestos nitrogenados, y con el cido fosfotngstico (PTA) se han extrado pptidos muy pequeos, aminocidos y pequeos compuestos nitrogenados excepto los aminocidos

dibsicos y el amonio (ARD, 1999). Tambin se pueden medir los grupos aminos libres por reaccin con ninhidrina, trinitrobenceno o fluorescamina. Para determinar los perfiles de pptidos pequeos en queso se esta usando la fase inversa de HPLC, otro mtodo menos utilizado es la cromatografa por intercambio inico de alta resolucin (FOX y McSWEENEY, 1998). Segn Astete (1989) y Brito (1993), La electroforesis del gel de poliacrilamida es uno de los anlisis ms completos incorporados al estudio de maduracin de quesos, dando una visin cualitativa y cuantitativa de la protelisis. La principal dificultad asociada con ste mtodo es la cuantificacin de varios componentes, particularmente

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en muestras con mayor maduracin donde las bandas pueden unirse entre s. Adems, por el bajo peso molecular de los pptidos puede ser expulsado fuera de la matriz del gel durante el teido (Leaver et al. 1993). La columna cromatogrfica usada para separar y cuantificar individualmente las protenas de la leche, tambin ha sido utilizada para el anlisis de la protelisis en queso, particularmente la cromatografa de alta presin y cromatografa lquida de las protenas y las grasas (HPLC y FPLC), ste es un sistema de alta sensibilidad, mejorado para determinar la capilaridad en un tiempo corto (Leaver et al. 1993). El tamao, solubilidad y conformacin de las protenas y pptidos son diferentes en el queso. Para los anlisis de estos componentes nitrogenados se hace necesario un fraccionamiento previo de los productos de la hidrlisis de la casena, utilizando diferentes precipitaciones qumicas para separar los componentes nitrogenados en distintas fracciones solubles (Alonso et al. 1988, Christensen et al. 1991). La determinacin fraccionada de los diferentes componentes nitrogenados resultantes de la degradacin proteica, tales como el nitrgeno soluble total, el nitrgeno no proteico, el nitrgeno titulable en presencia de formol y el nitrgeno amoniacal han servido de ndice clsico de la extensin y profundidad de la maduracin del queso (Fernndez Salguero et al. 1978 citado por Brito et al. 1995).

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EL ndice de maduracin es la relacin en porcentaje entre el nitrgeno soluble y el nitrgeno total, dado que corresponde a aquellas fracciones producidas por hidrlisis enzimtica de la casena (Brito et al. 1995). Ard y Meisel (1991), proponen mtodos para estimar rpidamente la protelisis en el queso, como es la determinacin del contenido de triptfano y tirosina por absorbancia a 280nm o por el mtodo descrito por Hull utilizando el cido tricloroactico como precipitante proteico y el reactivo Folin Ciocalteau, el cual reacciona con stos aminocidos. El mtodo ms comn para estimar el grado de protelisis en queso es la determinacin del contenido de nitrgeno en diferentes fracciones, por el mtodo de Kjeldahl, pero este requiere de mucho tiempo y es muy laborioso.

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