Extraccin de DNA bacteriano A partir de un concentrado de bacterias provenientes de 10mL de cultivode E. coli, colocar: 1. 1.

5ml de medio de cultivo en un tubo eppendorf y centrifugar a 12,000g durante 30 segundos a 4C. El cultivo restante guardar a 4C. 2. Retire el medio de cultivo, sobrenadante, con una micropipeta, dejando el pellet lo ms seco posible. 3. Resuspender el pellet bacteriano en 100ul de la solucin I fra. Mezcle vigorosamente. o Es indispensable que el pellet bacteriano est completamente disperso en la Solucin I 4. Aada 200ul de Solucin II recientemente preparada o Cierre el tubo, y mezcle los contenidos por inversin rpidamente cinco veces. Asegrese de que toda la superficie del tubo entre en contacto con la solucin II. No mezcle utilizando el vrtex. Mantenga el tubo en hielo. 5. Aada 150ul de solucin III, bien fra o Cierre el tubo y mezcle utilizando el vrtex en una posicin invertida durante 10 segundos para dispersa la Solucin III por todo el lisado bacteriano viscoso. o Conserve el tubo en hielo durante 3-5 minutos 6. Centrifugue a 12,000g por 5 minutos a 4C. 7. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. 8. Precipite el ADN de doble cadena con usando 2 volmenes de etanol a temperatura ambiente. Mezcle usando el vrtex. o Permita que la mezcla repose durante 2 minutos a temperatura ambiente. 9. Centrifugue a 12,000g durante 5 minutos a 4C. 10. Retire el sobrenadante usando la pipeta. 11. Resuspenda el ADN en 50ul de agua ultra pura. Mezcle rpidamente usando el vrtex. 12. Mantenga el ADN a -20C, para su posterior uso. PREPARACIN DE SOLUCIONES: SOLUCIN I 50Mm de glucosa 25mn Tris.Cl (pH 8) 10mM EDTA (pH 8) SOLUCIN II 0.2N NaOH (diluidos de un stock de 10N) 1% SDS

La solucin I puede ser preparada en un frasco de 100ml y autoclavada por 15 minutos. Debe mantenar a 4C

SOLUCIN III 5M Acetato de Potasio cido actico glacial H2O

60ml 11.5ml 28.5ml

La solucin resultante es 3M con respecto al potasio y 5M con respecto al acetato

BILIOGRAFA Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU. Sambrook, J & D, Russell. 2001. Molecular cloning: Laboratory Manual. Vol 1. Editorial CSHL. EE.UU. Promega. Protocols and Applications Guide: The Source for Discovery. En:http://www.promega.com/paguide/, consultado el 1 de febrero del 2010.