n prezent, pentru examinarea medical general a unui bolnav sau pentru a diagnostica un ansamblu specific de simptoame este nevoie

de o serie de analize cantitative ale unor probe recoltate din corpul omenesc. n viitor, astfel de probe se estimeaz c vor deveni din ce n ce mai numeroase, iar rezultatele analizelor vor putea fi la ndemna medicului, jucnd un rol esenial la stabilirea diagnosticului. n ultimul timp, peste dou miliarde de probe sunt executate anual n laboratoarele clinicilor medicale i acest numr crete mereu. Majoritatea acestor teste includ determinarea glucozei, ureei, proteinelor, sodiului, calciului, HCO3-/ H2CO3, acidului uric i pHului, etc.

Schema bloc a unui flux analitic

Clasificarea metodelor analitice n funcie de cantitatea de substan determinat

 Avantajele metodelor instrumentale:

determinarea este foarte rapid; pot fi utilizate probe mici; pot fi cercetare probe complexe; prezint o sensibilitate ridicat; dau un grad mare de siguran rezultatelor msurtorilor. procedeele sunt simple i precise; metodele se bazeaz n general pe msurtori absolute; echipamentul necesar nu este scump. Din prezentarea avantajelor, nu trebuie s se trag concluzia c metodele instrumentale le-au nlocuit pe cele chimice. n practic, metodele chimice constituie parte integrant dintr-o metod instrumental.

Avantajele metodelor chimice:

Astfel, n orice analiz exist etape ca: prelevarea probelor; dizolvarea; schimbri n starea de oxidare; ndeprtarea excesului de reactiv; ajustarea pH-ului; adugarea de ageni de complexare; precipitarea; concentrarea; ndeprtarea impuritilor. Unele dintre aceste metode implic utilizarea metodelor de separare.

 Dezavantajele metodelor chimice:

uneori lipsete specificitatea; realizarea unei analize ia de obicei un timp destul de lung; precizia scade odat cu micorarea cantitilor de prob (msurtori absolute); sunt lipsite de flexibilitate; sunt poluante pentru mediul nconjurtor.

Dezavantajele metodelor instrumentale:

este necesar o etalonare iniial sau continu a aparatului; sensibilitatea i precizia depind de aparatura sau metoda chimic de etalonare; precizia final se afl adesea n domeniul 5%; costul iniial i pentru ntreinerea echipamentului este ridicat; intervalul de concentraie este limitat (msurtori relative); n mod obinuit, necesit spaiu destul de mare; implic un personal cu o pregtire special.

Analiza cantitativ
Analiza cantitativ este bazat pe msurarea unei proprieti care este corelat direct sau indirect, cu cantitatea de constituent ce trebuie determinat dintr-o prob.

Etapele analizei cantitative

1. Obinerea unei probe semnificative prin metode statistice; 2. Prepararea probei; 3. Stabilirea procedeului analitic n funcie de:
a. Metode: (chimice; fizice cu sau fr schimbri n substan); b. Condiii: (determinate de metoda de analiz aleas; determinate de substana cercetat); c. Cerine: (rapiditate, exactitate, costuri; posibilitatea de amortizare);

4. Evaluarea i interpretarea rezultatelor.

PREGTIREA PROBEI
Pretratarea probelor n vederea caracterizrii ori cuantificrii lor implic solubilizarea, denaturarea i eliminarea complet a interaciuniilor dintre componente. Dei este de dorit, nu exist o metod unic de pregtire a probelor care poate fi universal aplicat din cauza diversitii probelor care sunt analizate. O procedur ideal pentru solubilizarea probei n vederea analizei sale trebuie s conduc la perturbarea tuturor complexelor legate necovalent i a agregatelor din soluii cu obinerea unor componente individuale. Cu toate acestea, indiferent de metoda aleas de preparare a probei, cel mai important aspect este cel de reducere la minimum a modificrilor structurale ale componentelor i care ar putea conduce la rezultate artefactuale. n general, probele trebuie s fie supuse unei minime manipulri i se pstreaz pe tot parcursul, la rece.

 Un alt considerent care trebuie avut n vedere este, tipul de prob care se analizeaz (extract celular (proteic) total, fracii subcelulare ca de exemplu mitocondrii, ribozomi, sau anumite fraciuni proteice cu o anumit solubilitate, ca de exemplu, fraciuni proteice solubile n ap sau proteine extrase ntr-o soluie hidroalcoolic). Probele care conin proteine solubile disponibile n form lichid pot fi adesea analizate cu sau fr pretratamente minime. Aceste tipuri de prob sunt exemplificate de fluidele corpului, precum serul, plasma, urina, lichidul cefalorahidian, materialul seminal i lichidul amniotic. Probele serice ori plasmatice au o concentraie de proteine inerent ridicat i pot fi analizate direct dup diluare n tamponul de solubilizare. Cu toate acestea, n cazul probelor de ser o problem major o reprezint abundena ridicat a unui numr mic de proteine, cum ar fi imunoglobulinele i albumina, acestea putnd ascunde (ecrana) multe componente minore. Aceste proteine cu o abunden nalt pot fi epuizate (eliminate) din prob, nainte, cu toate c exist un risc semnificativ ca acest tratament s conduc la eliminarea nespecific a unor componente proteice.

 Alte tipuri de fluide corporale au un coninut sczut de proteine, dar conin o concentraie relativ mare de sruri, care pot interfera n procesul de analiz. Aceste probe trebuie s fie, de obicei, desalinizate nainte, prin tehnici precum dializa sau gelcromatografia. Probele trebuie s fie concentrate apoi prin metode de tipul liofilizrii, precipitrii cu acid tricloracetic sau precipitrii cu aceton rece. Ultima abordare s-a dovedit a fi deosebit de util la concentrarea unei mari varieti de probe pentru analize.

 Probele din esuturi solide trebuie disrupte n prezena unui tampon de solubilizare. Liza diferitelor tipuri de celule i esuturi se poate realiza prin omogenizare (de exemplu omogenizatorul Potter), disrupere prin mojarare cu pistil sau prin imersie n azot lichid, dezintegrare cu ultrasunete, liz enzimatic (cu lizozim, de exemplu), tratament cu detergeni precum Nonidet P-40, Triton X-100, CHAPS, SDS), oc osmotic, congelare urmat de decongelare repetat sau printr-o combinaie a acestor metode. De exemplu, micile fragmente de esut trebuie s fie nvelite n folie de aluminiu, congelate n azot lichid, i strivite pn la o pulbere fin ntre dou blocuri de metal rcit ori ntr-un mojar. Probele mari de esut pot fi procesate prin omogenizare n tamponul solubilizare folosind un omogenizator avnd n vedere reducerea la minim a spumrii i a nclzirii, procese care conduc la modificarea proteinelor.

Structura chimic a detergentului Nonidet P 40 (4-Nonil fenil-polietilen glicol). Alte denumiri ale acestuia: ImbentinN/52, NP 40.

Structura chimic a detergenilor zwitterionici CHAPS (R=H) i CHAPSO (R=OH).

PRINCIPIUL SOLUBILIZRII PROTEINELOR CU DETERGENT

Procesul de solubilizare a proteinelor de membran depinde de raportul dintre cantitatea de detergent i cantitatea de protein din membran. Extracia cu detergent a unei proteine membranare se realizeaz apare, dup cum urmeaz: (a) legarea detergentului la membran i iniierea lizei; (b) solubilizarea membranei, n format de complexe detergent-lipideproteine; (c) solubilizare n continuare a complexelor detergent-lipide-proteine cu obinerea unor complexe detergent-proteine, respectiv detergentlipide. La o concentraie foarte mic de detergent, monomerii de detergent se leag i partiioneaz n membran fr o modificare semnificativ a acesteia. Odat cu creterea concentraiei de detergent n domeniul concentraiei critice (un raport de aproximativ 1:10), structura membranei este modificat, ceea ce conduce la liza ei (Figura urmtoare).

 Odat cu creterea cantitii de detergent n raport cu cantitatea de proteine (aproximativ 1:1), se formeaz mici complexe de lipide membranare, proteina de membran cu detergentul, n timp ce la un raport crescut de detergent (10:1 spre 20:1), se formeaz complexe individuale detergent-proteine i detergent-lipide. Acest proces nu este ntotdeauna identic pentru toi detergenii . unele lipide nalt legate rezist la procesul de solubilizare a proteinelor de membran. n practic, cel mai bun detergent i condiiile ideale pentru solubilizare sunt determinate prin testare direct. Pentru fiecare detergent analizat, se realizeaz o serie de concentraii de detergent (0,01 la 3%) care se amestec cu preparatul proteic. Dup incubare, pentru o anumit perioad de timp, amestecul este n continuare centrifugat la 105,000 g timp de 1 or, dup care proteina de membran solubilizat este recuperat n supernatant i se determin activitatea biologic. Detergentul care conduce la activiti specifice totale mari este n continuare ales pentru studiu.

 Depozitarea de scurt durat de timp a extractelor proteice (cteva ore pn la o noapte) este adesea posibil prin pstrare n frigider, la 4C. Aceste extracte pot fi apoi utilizate fie imediat. Pentru un timp mai ndelungat, pot fi depozitate la -80oC,. Trebuie avut ns n vedere c nghearea i dezghearea repetat a probei poate conduce la denaturarea sa. n general, o cantitate adecvat de prob (de exemplu, celule de drojdii, celule animale sau semine de plante) este suspendat n tamponul de liz, urmat de sonicare ntr-o baie de ghea (3x10 secunde) i n continuare centrifugat (60 min, 42000 g, 15oC); celule de drojdie (120 mg), mieloblaste (5x108 celule) sau de esuturi umane sau animale, cum ar fi ficatul sau inima (50-100 mg), semine (de legume, 20 mg ori cereale, 50-100 mg) sunt omogenizate n azot lichid ntr-un mojar. Pulberea este apoi suspendat ntr-un tampon de liz (1 ml), astfel nct concentraia final de proteine s se situeaz n domeniul 5-10 mg/ml. Proteinele din esutul de natur vegetal (de exemplu, proteine din frunz) sunt tratate la rece cu TCA/aceton (-20oC) pentru a ndeprta compuii fenolici: Frunzele sunt zdrobite ntr-un mojar cu azot lichid iar pulberea este concentrat prin resuspendare ntr-o soluie pre-rcit (-20oC), de acid tricloracetic, 10% ori n aceton care conine 2mercaptoetanol, 0,07%. Proteinele sunt lsate s precipite peste noapte la -20oC. Dup centrifugare, extractul se spal cu aceton pre-rcit care conine 2mercaptoetanol, 0,07%, iar n continuare supernatantul este ndeprtat, iar sedimentul se usuc n vid.

 Celulele circulante (de exemplu, eritrocitele, leucocitele, trombocitele) i celulele crescute in vitro n suspensie de cultur pot fi pur i simplu recoltate prin centrifugare; n continuare, se spal n soluie de tampon fosfat salin (phosphate-buffered saline - PBS) i se trateaz cu tamponul de solubilizare a probei. Celulele cultivate ca monostraturi pe substrat de sticl sau plastic necesit, de asemenea, o mic prelucrare. Astfel, n prim etap mediul de cultur trebuie s fie aspirat iar stratul de celule se spal cu PBS pentru a minimiza contaminarea probei cu componentele din mediu, n special cu proteine serice. Stratul de celule este apoi fragmentat, dup care se spal din nou cu PBS iar celulele se recolteaz prin centrifugare. Utilizarea de enzime proteolitice pentru a elibera celulele ar trebui s fie evitat deoarece acest proces conduce la degradarea proteinelor din prob. Alternativ, celulele din cultur pot fi lizate n timp ce sunt nc ataate la substrat prin adugarea unui volum mic de tampon de solubilizare. Probele care conin niveluri ridicate de acizi nucleici trebuie s fie tratate prin adugarea a unei zecimi de volum de amestec DN-az/RN-az, fr proteaze (amestecul conine DN-az I (1mg/ml), RN-az A (500g/ml), 0,5 M Tris (pH=7,00), 50 mM MgCl2) dup care se incubeaz, la rece pn cnd proba nu mai este vscoas.

 Dup liza celulelor, este necesar, n majoritatea cazurilor, s se inactiveze substanele interferente (fenolii de exemplu, n preparatele vegetale sau acizii nucleici) i s se elimine componentele insolubile prin centrifugare. Fenolii din plante au tendina de a adsorbi proteine i astfel pot s cauzeze profiluri proteice distorsionate. Eliminarea lor se realizeaz fie prin precipitarea proteinelor cu acid tricloracetic (TCA) 20% ori se elimin prin solubilizare n aceton rece/TCA, sau prin adsorbie specific de ctre un polimer (polivinilpolipirolidon). Dac celulele conin cantiti mari de acizi nucleici, probele pot fi tratate cu un amestec de DNAaz/RNA-az care nu conine proteaze.

Metode de disrupie a celulelor

Proteazele, dac sunt prezente n probe, pot produce alterri ale profilului proteic. Din aceast cauz este adesea recomandat s se aduge inhibitori de proteaze, ca de exemplu PMSF, Pefabloc, EDTA, pepstatin, sau coctailuri de inhibitori de proteaze), avnd n vedere faptul c astfel de reactivi pot modifica, de asemenea, proteinele i astfel pot introduce artefacte de sarcin electric. Alte posibiliti pentru inactivarea proteazelor sunt precipitarea proteinelor cu acid tricloracetic rece (TCA) sau fierberea n prezen de SDS a probei, dar trebuie ntotdeauna amintit c proteazele, mai multe ori, pot fi inactivate doar cu mare dificultate.

Structurile chimice ale fenilmetilsulfonilfluorurii (PMSF), (4-(2Aminoetil) benzen sulfonilfluorur hidrocloric, sinonim AEBSF hidroclorur sau Pefabloc SC), pepstatinei (X-Val-ValStatil-Ala-Statin).

Pregtirea probei pentru analiz

Diluia probei este o metod foarte simpl de pregtire a probei. Ea este nespecific i este utilizat n condiiile n care analitul este prezent n concentraii suficient de mari. Proba este diluat cu ap ori tampon, centrifugat, dac necesit aceast operaiune de ndeprtare a unor componente i apoi analizat. O alt metod eficient de pregtire a probei o reprezint precipitarea i deproteinizarea. Aceast metod este deseori utilizat n cazul probelor de snge total naintea analizei. Agenii comuni utilizai n precipitarea proteinelor sunt ori acizi (acid tricloroacetic, acid percloric, acid tungstic, acid sulfosaliciclic, acid metafosforic, etc.), solveni organici (metanol, etanol, aceton, acetonitril, dimetil sulfoxid), sruri anorganice (sulfat de amoniu) ori cationi metalici (zinc i cupru). Tehnica este simpl i rapid. Marele dezavantaj al acestei metode este cel de pierdere posibil de analit prin ocluziune n precipitat. Probele biologice sunt de asemenea purificate prin tehnici de ultrafiltrare. Procedeul este utilizat pentru ndeprtarea rapid a compuilor cu mas molecular mic (< 50000) de solui dizolvai din matrix-ul biologic prin trecere printr-o membran de filtru anizotrop sub presiune pozitiv exercitat de un gaz inert ori sub aciunea forei centrifugale. Aceast tehnic este general utilizat n concentrarea proteinelor i aplicarea apoi de volume mici. Prin dializ se poate separa un analit din matrix prin difuziune printr-o membran semipermeabil care reine macromoleculele i las s treac moleculele de solut cu mas molecular mai mic, n jur de 5000. Difuziunea este un proces lent, i este realizat printr-un gradient de concentraie pn la stabilirea unui echilibru. Metoda este aplicabil numai compuilor relativ sunt slab legai de proteine. Utilizarea dializei n pregtirea probei nu este recomandabil datorit timpului de lucru mare i a diluiei probei. Hidroliza este de asemenea utilizat n prepararea probelor pentru analiz. Ea este aplicabil oricrui analit ce se gsete n forma sa conjugat n probele biologice. Aceast hidroliz poate fi realizat specific, cu ajutorul unor enzime precum glucuronidaza ori arilsulfataza, de exemplu, ori nespecific cu ajutorul acizilor ori bazelor tari. Scopul acestei prelucrri l reprezint clivajul conjugatului i eliberarea sa ca sub form de compus original de analiz.

Metode de separare
Metoda Precipitare Distilare Sublimare Extracie Cristalizare Rafinare zonal Flotaie Ultrafiltrare Dializ osmoza Electrodepunere Bazele metodei solubiliti diferite volatiliti diferite presiuni de vapori diferite solubilitatea diferit ntre dou faze proprieti de solubilitate funcie de temperatur cristalizare la temperatur ridicat diferene de densitate ntre substane i lichid mrimea substanei vs dispozitivul de filtrare trecerea selectiv a unui sistem printr-o membran electroliza folosind electrozi ineri de adsorbie pe coloan distribuia solutului ntre o faz solid i una lichid pe coloan de repartiie pe coloan distribuia solutului ntre dou lichide pe coloan pe strat subire adsorbia sau repartiia pe un strat subire poros plan
pe hrtie repartiia pe o suprafa de hrtie plan lichide, nalt presiune cromatografia de lichide pe o coloan sub o presiune ridicat

Cromatografia

prin schimb ionic schimbul de ioni cu site moleculare mrimea solutului penetraia prin gel mrimea solutului de gaze distribuia solutului ntre un gaz i o faz lichid sau solid
Electroforeza (separarea n prezena unui cmp electric) Mediu liber zonal

Extracia lichid lichid este o tehnic adaptabil, general utilizat n pregtirea probei. n extracia lichid lichid, pH-ul fazei apoase este ajustat astfel nct analitul poate fi extras efectiv nedisociat, aceasta facilitnd extracia n solvent. Un avantaj al extraciei lichid lichid l constituie selectivitatea sa. Funcie de solventul ales i de ajustarea pH-ului fazei apoase, compusul de interes poate fi extras. Succesul treptei de extracie depinde totui, de cunoaterea polaritii analitului. O problem frecvent ntlnit n condiiile utilizrii acestui procedeu o reprezint formarea de emulsii care conduc la pierdere de analit prin ocluzarea sa n emulsie, astfel, o parte din analit neputnd fi recuperat. Formarea emulsiilor poate fi minimizat prin utilizarea unor volume mari de solvent de extracie, printr-o agitare viguroas, prin centrifugare, ultrasonicare, agitare pe agitator magnetic ori prin filtrare prin vat de sticl sau hrtie de filtru. Creterea triei ionice prin adugare de sruri (clorur de sodiu, bromur de potasiu) ori adugarea unor cantiti mici de etanol ori etil-1-hexanol poate conduce la scderea forelor ce stabilizeaz emulsia. Alte dezavantaje ale acestei tehnici constau din timpul crescut, volum mare de solvent i posibil pierderea din analit. Utilizarea unor coloane comerciale lichid lichid au sporit popularitatea metodei de izolare a compuilor din specimenele biologice. Aceste coloane conin pmnt diatomeic ca adsorbant. Totui, au fost descrise o serie de limitri ale extraciei lichid lichid i n cazul acestei metode.

Un instrument major de extracie utilizat n mod curent l reprezint extracia n faz solid. Izolarea compusului prin aceast metod depinde de afinitatea relativ a analitului prezent n matrix-ul biologic pentru adsorbentul solid i relativa uurin de eluie a compusului n analizele care urmeaz. Sorbenii convenionali precum carbonul, celita, alumina, rinile nenionice, schimbtorii de ioni ori gelul de Sephadex sunt n general utilizai pentru prepararea probei, dar direcia recent o constituie utilizarea silicailor modificai chimic, fiind comercializai sub form de cartue. Principalul avantaj al extraciei n faz solid l reprezint selectivitatea sa, proprietate dat de posibilitatea alegerii sorbentului, funcie de scopul urmrit. Prin alegerea corect a cartuelor ori a microcoloanelor disponibile de extracie n faz solid, alturi de alegerea solventului de eluie convenabil, se pot izola analii funcie de proprietile lor fizico-chimice din probele biologice facilitnd astfel separarea cromatografic. Alte avantaje includ un consum sczut de solvent, timp scurt de lucru, extracie curat, nalt recuperare, eliminarea emulsiilor i rezultate reproductibile. Aceast tehnic reprezint o alternativ atractiv fa de tehnicile tradiionale de pregtire a probei.

Tipuri de metode de analiz

(1) gravimetrice; (2) volumetrice; (3) optice; (4) electrice; (5) de separare; (6) termice; (7) de rezonan.

n procedeul analitic stoichiometric:

iRi jPj
n procedeul analitic nestoichiometric nu pot fi scrise reacii exacte, bine definite; n majoritatea cazurilor, metodele nestoichiometrice se bazeaz pe msurarea unor proprieti fizice care se schimb proporional cu concentraia constituentului de determinat.

Metode de msurare i tipul de stoichiometrie

1. GRAVIMETRICE izolarea unui precipitat care poate fi cntrit 1.1 Ageni de precipitare anorganici (S)

1.2
1.3

Ageni de precipitare organici

Electrodepunere

(S)
(S)

2. VOLUMETRICE reacia substanei de analizat cu o soluie standard 2.1 Titrri acid-baz 2.2 2.3 2.4 Titrri de precipitare Titrri complexonometrice Titrri de oxidare - reducere

(S) (S) (S) (S)

3. OPTICE 3.1 ABSORBIE DE ENERGIE - atenuarea radiaiei de ctre o prob absorbant

3.1.1
3.1.2

Colorimetrie
Spectrofotometrie n ultraviolet

(N)
(N)

3.1.3
3.1.4

Spectrofotometrie n infrarou
Msurarea reflectanei luminii reflectate de prob

(N)
(N)

3.2 EMISIE DE ENERGIE - aplicarea unei energii suplimentare (cldur, lumin) i observarea emisiei fotonice 3.2.1 Emisia n arc - excitarea n arc electric (N) 3.2.2 3.2.3 Flamfotometria - excitarea n flacr Fluorescena - excitarea prin fotoni, observarea fotonilor emii Fosforescena - excitarea prin fotoni i observarea emisiei ntrziate de fotoni Chemiluminescena - observarea fotonilor eliberai dintr-o reacie chimic (N) (N)

3.2.4

(N)

3.2.5

(N)

4. ANALIZA GAZELOR 4.1 4.2 Volumetria - msurarea volumului unui gaz Manometria - msurarea presiunii unui gaz (S) (S)

5. ANALIZE ELECTRICE - msurarea parametrilor electrici n soluii

5.1

Poteniometria - msurarea potenialului unei celule (N) electrochimice Conductometria - msurarea rezistenei unei soluii (N)

5.2

5.3

Coulombmetria - msurarea cantitii de electricitate (S) necesare pentru a provoca o reacie Polarografia - caracteristica potenial-intensitate a unei (N) soluii ionice n procese redox

5.4

6. DE REZONAN - interaciunea radiaiei electromagnetice cu nucleele n cmp magnetic 6.1 Rezonana magnetic nuclear (N)

7. TERMICE - msurtori funcie de temperatur

7.1 Msurtori de temperatur proprieti fizice n funcie de (N)

8. ALTE METODE specifice/nespecifice 8.1 Fluorescena de raze X - excitarea probei cu raze X (N) i observarea razelor X emise Spectrometria de mas - msurarea numrului de (N) ioni de mase date

8.2

8.3

Refractometria - msurarea indicelui de refracie (N) al probei Polarimetria - msurarea rotaiei luminii ntr-o (N) soluie Dispersia optic rotativ msurarea rotaiei (N) luminii n prob n funcie de lungimea de und Fotometria prin difuzia luminii - msurarea (N) cantitii de lumin dispersat de ctre o suspensie Analize de radioactivitate - formarea de materiale (N) radioactive i numrarea particulelor Absorbia radiaiilor absorbia radiaiilor emise (S) de o surs de ctre proba reinut pe un suport

8.4

8.5

8.6

8.7

8.8

Standarde, reactivi i soluii etalon

Este foarte important stabilirea de standarde sau de referine pentru orice fel de msurtoare. Astfel, standardul de baz n cazul msurrii unor proprieti fizice este o unitate de msur foarte precis definit. n chimie/biochimie, standardul de baz poate fi o substan a crei puritate a fost verificat. Deoarece n multe cazuri, standardele de baz nu sunt ntotdeauna accesibile, se recurge la comparaii cu materialul de referin. Acestea sunt numite standarde secundare.

 pentru o analiz instrumental (cantitativ sau calitativ) trebuie utilizai reactivi de puritate analitic (pro analysis sau pentru analiz, prescurtat p.a.). Odat cu coborrea limitei de detecie la diversele tipuri de analiz instrumental, necesarul unor reactivi purificai a crescut nct astzi exist:
Reactivi spectral puri (for spectroscopy n lb. englez) Reactivi cromatografici (for chromatography), mai puri dect cei p.a. Reactivi pentru biologia molecular

Metode optice de analiz

Metodele optice de analiz utilizeaz ca mijloc de excitare a substanelor (respective atomilor componeni ai moleculelor) radiaia electromagnetic, n vederea obinerii de informaii privind:
fie natura constituenilor, fie cantitatea acestora.

 Metodele optice dau i alte informaii valoroase privind substanele, de exemplu:

compoziia (concentraii, componeni, faze), viteze de reacie, constante de echilibru, structuri ale combinaiilor (distane ntre atomi, ntre plane de atomi, energii de legtur).

Contribuiile importante n progresul metodelor optice le-au adus:

Newton - 1696 - ce realizeaz primul descompunerea luminii albe cu ajutorul prismei; Wollaston - 1802 - i Fraunhofer - 1859 - care descoper spectrele de emisie respectiv de absorbie; Kirchhoff - 1859 - enun legea privind legtura ntre capacitatea de emisie i de absorbie a luminii de ctre corpuri, lege ce-i poart numele; Bunsen i Kirchhoff - 1860 - primul chimist, al doilea fizician, pun bazele spectroscopiei, devenit astzi spectrometrie datorit msurtorilor electrice asociate; Louis de Broglie - 1924 - intuiete existena dualismului corpuscul - und.

 n ultimul timp, principalul progres l-a reprezentat computerizarea instrumentaiei spectrometrice pentru toate tipurile de analize, lucru care a deschis noi perspective prelucrrii numerice rapide a semnalelor, ceea ce a condus chiar la noi metode (de exemplu extinderea aplicrii transformatei Fourier n analizele chimice) dar i utilizarea fibrelor optice, pentru dirijarea drumului optic, ceea ce a dus la micorarea dimensiunilor instrumentelor.

radiaia electromagnetic - form specific a materiei

 Lumina (sau radiaia electromagnetic) mai nseamn i energie ce se transmite doar n buci, numite cuante de energie, i care pot fi calculate din lungimea de und: E = h = hc/

Caracteristicile cantitative ale luminii

lungimea de und a oscilaiei (), frecvena ()
legat de lungimea de und prin: = c/ (unde c este viteza luminii),

amplitudinea (A), polarizarea.

 Orice raz de lumin poate fi asociat unui flux de fotoni (concepia corpuscular), fiecare foton avnd energia, E

E = h = hc/

numrul de und, 1/, de preferin exprimat n cm-1 care se noteaz

Intensitatea undei electromagnetice, I, este definit ca energia ce trece prin unitatea de suprafa i este legat de amplitudinea, A, prin ecuaia:

I = A2c/8

 O mare parte din informaiile cantitative pe care le deinem la ora actual privind structura atomilor, moleculelor sau materialelor au fost obinute prin excitarea substanei cu o anumit form de energie electromagnetic - deci prin metodele spectrale (optice). De altfel i n metodele electrochimice, substanelor li se aplic din exterior energie electric sau sunt aduse n situaia de a reaciona i a emite energie. Analog stau lucrurile i n metodele optice. De exemplu, radiaia infraroie posed o energie potrivit pentru a face atomii moleculelor din aer s intre n vibraie. Cednd energie, lumina infraroie scade n intensitate. Energia nu dispare ci se transform treptat n energie de agitaie termic - form spre care tinde orice energie furnizat materiei.

 Pe de alt parte, lumina ultraviolet (UV), anume cea cu lungimi de und sub 200nm, are o energie potrivit pentru a excita electronii din atomii componeni ai moleculelor (covalente) din substanele aflate n stare gazoas n aer. Molecula excitat are un timp de via scurt, ~10-8s. Dup acest interval, aceasta revine la starea fundamental, n care a existat iniial, emind la rndul ei (cednd) energie, dar de ast dat n toate direciile. Aceasta este radiaia difuzat (mprtiat). Anumite molecule, ca dioxidul de sulf de exemplu, nu revin direct n starea fundamental deoarece au nivele intermediare. Acestea, cnd revin din starea intermediar la starea fundamental, moleculele emit o alt lungime de und fa de lumina primit, n general mai srac n energie (deci de lungime de und mai mare). Spunem n acest caz c s-a emis o radiaie de fluorescen. Aadar n domeniul UV moleculele din aer absorb lumin din cauza salturilor electronilor din atomi pe nivele energetice mai nalte. Fa de alte domenii ale energiilor luminoase, substanele pot fi transparente.

n funcie de natura interaciunii radiaiilor de natur luminoas cu substanele, metodele spectrale se pot clasifica n: metode de absorbie (pe domenii diverse: raze X, vizibil, UV, IR, RMN etc), metode de emisie a radiaiei electromagnetice (tot pe diverse domenii), metode de fluorescen (UV, VIS, X etc), fosforescen sau luminescen, metode de difracie (cu raze X, cu electroni, cu neutroni), refractometria i interferometria, polarimetria, metode bazate pe difuzia luminii, metode combinate.

Domenii spectrale folosite n analizele instrumentale

Spectrometria de absorbie n UV-VIS

Principii generale Metoda bazat pe absorbia luminii din domeniul vizibil (VIS). Se cunosc mai multe variante importante pentru aceast metod: colorimetria, fotometria i spectrofotometria.

Colorimetria
una dintre tehnicile extrem de mult utilizate n practica analitic, reprezint varianta n care intensitatea culorii probei se compar vizual sau instrumental, n lumin alb, cu un set de soluii etalon preparate n condiii absolut identice cu proba.
sensibilitatea maxim a ochiului omenesc atinge maximul pentru domeniul 550-560nm (domeniul culorii verzi)

Fotometria i spectrofotometria
Msoar instrumental lumina transmis de o soluie colorat lucrnd cu o surs de lumin monocromatic. Cnd lumina incident este filtrat, prin filtre optice, avnd un spectru mai larg, avem de a face cu o fotometrie iar cnd domeniul filtrat este mai ngust (utiliznd monocromatoare) vorbim de spectrofotometrie.

Instrumentaia
orice spectrofotometru reprezint o reuniune de 4 pri componente distincte:
(1) sursa, (2) sistemul dispersiv sau monocromatorul, (3) detectorul i (4) nregistratorul

 ntruct principiile sunt identice iar aparatele sunt n multe privine similare n cele dou domenii, n ultimul timp, n afar de aparatele dedicate domeniului VIS sau a celor pentru UV, de multe ori se utilizeaz un singur instrument pentru ambele intervale de lungimi de und. Construcia instrumentelor are n general dou variante anume:
spectrofotometrele monocanal, cu un singur drum optic i cele comparative, prevzute cu dou canale.
n spectrometrele comparative printr-o singur msurtoare, proba etalon cu cea de analizat se compar utiliznd dou radiaii care-i au originea n aceeai surs (coerente).

Sursele luminoase cele mai obinuite utilizate n domeniul UV-VIS, sunt lampa cu incandescen prevzut de obicei cu filament incandescent de W - deosebindu-se de becurile electrice obinuite prin aceea c zona de ieire a radiaiei este confecionat din sticl de cuar lampa cu deuteriu prevzut cu arc de descrcare n deuteriu, aflat la o presiune medie (ceea ce asigur un spectru continuu). O astfel de lamp, a crui punct de descrcare este zona cenuie din interiorul cutiei mari permite obinerea unui spectru continuu pe domeniul 160-400nm, care se completeaz foarte bine cu spectrul becului cu incandescen. Un spectrometru prevzut cu ambele surse, poate acoperi tot domeniul UV-VIS. Razele de lumin trec prin aer, dar mai nou dirijarea acestora se face i prin fibre optice.

Schia de principiu a unei lmpi cu deuterium (D2). Pata de culoare cenuie indic punctul n care are loc descrcarea

Curbe reprezentnd spectrele emise de cele doua tipuri de lampi utilizate n UV-VIS: 1- Lampa cu filament incandescent de W; 2- Lampa cu deuterium

Sistemul dispersiv sau monocromatorul poate fi, n vizibil, un filtru colorat din sticl sau material plastic transparent dar i un filtru cu interferen, iar n UV-VIS o prism confecionat din cuar sau, n ultimul timp, sisteme bazate pe reele plane sau concave cu circa 1200 trsturi per mm. Aceste reele sunt integrate n monocromatoare care permit extragerea unei zone nguste din spectrul UV-VIS, printr-o simpl deplasare a oglinzii
Parcursul luminii ntr-un monocromator cu reea concav i sensul de deplasare al reelei pentru selecia lungimii de und. F = fante, OP = oglinzi plane, OC = oglind concav
Limea domeniului spectral care trece prin monocromator depinde mult de limea fantelor de intrare i ieire. Cele mai bune rezoluii se obin prin utilizarea unor oglinzi prevzute cu distane focale mari (0.2-0.5m).

Detectorul
transform semnalul luminos n semnal electric.
Acest dispozitiv d aadar un semnal proporional cu intensitatea care iese din celula de msur. Intensitatea semnalului recepionat va depinde de lungimea de und - deci de lungimea de und selecionat prin poziia oglinzii - dar i prin deschiderea fantelor de intrare, respectiv de ieire, din monocromator. Acestea din urm, limiteaz domeniul spectral dar i intensitatea luminii, n ansamblu. De aceea fiecare modificare de deschidere a fantelor sau de lungime de und modific i intensitatea msurat de spectrofotometru. s-au impus dou tipuri de detectori: tuburile fotomultiplicatoare i dispozitivele semiconductoare (care pot fi, la rndul lor, detectori cu transfer de sarcin sau fotodiode cu siliciu). Fotomultiplicatoarele - nite dispozitive ultrasensibile al crui domeniu liniar mare - au fost pn nu demult cele mai utilizate dintre acestea. Pentru spectrofotometrele de rutin, fotodiodele sunt cele mai utilizate. n ultimul timp au aprut detectoarele cu reelele de diode care constituie de fapt nite diode de dimensiuni mici nirate pe aceeai plac. n acest caz nu mai este nevoie de fanta de ieire, ceea ce a simplificat ntructva instrumentaia.

Reprezentarea schematic a unui spectrofotometru cu reea de diode.

Spectrometrele monocanal, a cror schem bloc este prezentat n figur, sunt cele mai utilizate n aplicaiile de rutin. De regul n calea razei incidente se plaseaz succesiv proba martor sau de referin (care conine solventul plus eventual reactivii necesari pentru analiz) i proba de analizat.

Schema bloc a unui spectrofotometru monocanal. Prin prob (nr. 3) se nelege att proba de analizat ct i cea de referin.

Schema unui spectrofotometru de absorbie

Pri componente ale spectrofotometrului de absorbie: sursa de radiaie (S), monocromatorul (M), cuveta cu prob (P), detectorul (D), amplificatorul (A), nregistratorul (I), fante (F).

 Radiaia incident, monocromatic, realizat cu ajutorul monocromatorului M, trece prin cuv(et)a cu prob, C, unde intensitatea scade fa de situaia n care n locul probei de analizat se pune o aa-numit prob martor (sau prob oarb blank) o prob de referin de concentraie zero. Apoi fascicolul cade pe detectorul D, unde semnalul optic este transformat n semnal electric. Semnalul rezultat, dup o amplificare, poate fi n final msurat i nregistrat.

Pentru a se compensa i variaiile sursei luminoase se utilizeaz, la instrumentele ceva mai sofisticate, sisteme split-beam bazate, de exemplu, pe o oglind semitransparent

Prezentarea schematic a unui spectofotometru UV-VIS, monocanal, cu sistem splitbeam; componentele principale sunt: 1- surs, 2 - monocromator, 3 - prob, 4 detector.
Din aceast categorie face parte i spectrometrul cu reea de diode care are avantajul c permite recepia simultan a ntregii game spectrale ntr-un interval de timp de cteva milisecunde. Deosebirea const doar n ordinea prob-monocromator care-i schimb locul ntre ele. Rezoluia acestor spectrometre este limitat de dimensiunile microdiodelor care in locul fantelor de ieire.

 n sistemele cu dispozitive split-beam, raza care iese din monocromator este desprit n dou i una dintre aceste raze cade pe un detector care preia fondul, iar cealalt, dup ce trece prin prob (respectiv prin proba martor), cade pe un al doilea detector. Semnalul final rezult prin diferena dintre semnalele date de cele dou detectoare i prelucrat pentru a se msura (sau nregistra) direct absorbana. Pe figura urmtoare se poate observa funcionarea alternativ a lmpii pentru domeniul vizibil (VIS) cu cea pentru domeniul UV. Spectrometrele bazate pe comparaie (cu dublu canal) sunt cele mai performante spectrofotometre cunoscute. n acestea, dup desprirea razei incidente, monocromatice n dou fascicule, una dintre acestea traverseaz proba iar alta, simultan sau secvenial, traverseaz celula de referin care conine proba martor. Se cunosc cel puin dou variante de astfel de montaje. n una dintre acestea (figura urmtoare), montajul folosete pentru desprirea fascicolului metoda amintit anterior, n cazul spectrometrelor monocanal - oglinda semitransparent iar detectoarele (dou fotodiode) sunt montate n opoziie. Avantajul const n faptul c rspunsul detectorului este meninut constant, n funcie de , prin reglarea automat a intensitii de intrare n monocromator (printr-un mecanism de feed-back).

Schema de principiu a spectrofotometrului cu dublu fascicol prevzut cu oglind semitransparent i fotodiode

 O alt variant folosete pentru desprirea razei incidente, monocromatice, un disc rotitor prevzut cu o oglind n form de sector de cerc (dispozitiv denumit curent n literatura de specialitate chopper). O jumtate de perioad oglinda reflect raza incident iar n cealalt jumtate, o transmite. Aadar, una dintre raze trece prin celula de msur iar cealalt prin cea de referin, fiind ulterior aduse prin montajul optic pe acelai detector - de ast dat un fotomultiplicator. Faptul c are loc amplificarea unui singur semnal compenseaz micile variaii parazite ale intensitii sursei. Circuitul de msur funcioneaz sincron cu rotaia chopper-ului; o perioad semnalul corespunde celulei de msur iar o alt o perioad, celei de referin. Aceste spectrofotometre se caracterizeaz printr-o vitez mare de baleiaj i prin aceea c pot msura mai mult de dou uniti de absorban.

Componentele unui spectrofotometru de absorbie n vizibil i n ultraviolet

Detectorii UV/VIS sunt identici iar cuva de cuar permite lucrul n ambele domenii (doar sursele difer). Prin nglobarea ambelor surse - lampa cu deuteriu i cea cu wolfram - n acelai instrument, funcionnd consecutiv, s-a reuit realizarea spectrofotometrelor UV/VIS.

 Un studiu asupra lungimii de und sau frecvenei radiaiei absorbite sau emise de ctre un atom sau o molecul va oferi informaii despre identitatea acesteia iar aceast tehnic este cunoscut sub denumirea de spectroscopie calitativ. Tehnica de msurare a cantitii totale de radiaii care ofer informaii asupra numrului de atomi sau molecule care absorb sau care emit este denumit spectroscopie cantitativ.

Spectrul de absorbie al adenozin difosfatului (ADP)

Legea Lambert - Beer

reprezint legea de baz folosit n analizele sau determinrile spectrofotometrice S considerm o radiaie incident monocromatic, I0, care cade pe o celul coninnd proba.
Celula are lungimea l iar concentraia substanei ce absoarbe lumina, C.

 intensitatea final, I, este mai mic dect cea iniial, I0 n urma absorbiei luminii, la trecerea prin celul.

Dac lungimea l provoac o reducere cu un anumit procent a intensitii iniiale, I0, de exemplu cu 50%, un nou strat de lungime l, egal cu primul, va aciona, conform legii Lamber - Beer, n acelai mod, adic va diminua tot la jumtate noua radiaie incident.

Se observ pe diagrama de mai jos c graficul punctelor corespunztoare dimensiunilor celulei 1l, 2l, 3l, se distribuie pe o curb exponenial.

Aceast curb poate fi scris algebric ca o funcie: k este o constant. Ecuaia precedent reprezint una din formele legii lui Lambert -Beer. Prin convenie, se numete transmitan fracia transmis, I a intensitii, raportat la I0, prin cuva cu soluie, T, adic:

legea Lambert - Beer mai poate fi scris i: schimbnd semnul:

Convenim de asemenea s numim absorban, notat A, logaritmul natural, cu semn schimbat al transmitanei: Introducnd absorbana, A, n ecuaia precedent, legea LambertBeer mai poate fi scris: unde A este absorbana, k - coeficientul de absorbie l - lungimea parcurs de lumin prin mediul colorat (lungimea celulei)
k este proporional cu concentraia substanei care absoarbe lumina

n cazul exprimrii concentraiei n molL-1, aceast constant se numete coeficient molar de extincie (sau de absorban), simbolizat

forma cea mai utilizat dar i cea mai simpl a legii Lambert - Beer este:

Din examinarea ecuaiei precedente se poate observa c dac l=1cm i C=1molL-1, atunci avem: = A. Aadar, coeficientul molar de extincie reprezint absorbana unei soluii de concentraie 1 mol/l dac lungimea celulei cu prob este 1 cm. Legea este riguros respectat doar pentru o radiaie monocromatic. Deci, cu ct filtrul optic este mai ngust, ca domeniu spectral, cu att liniaritatea dreptei se respect pe un domeniu mai larg de concentraii. Dar un filtru cu domeniu spectral ngust las s treac puin lumin i performanele metodei sunt condiionate i de performanele detectorului.

Spectrele de absorbie
Spectrele de absorbie reprezint dependena semnalului de lungimea de und, . Exist mai multe variante de prezentare dar cea mai utilizat este varianta reprezentrii absorbanei n funcie de lungimea de und: A = f(). Celelalte variante, mai puin utilizate - numite toate spectre de absorbie - sunt T = f(), log A = f(), = f() sau log = f(). Ultimele dou servesc n special pentru caracterizarea speciilor moleculare ntruct nu mai depind de condiiile experimentale n care se fac determinrile acestor spectre. Fiecare substan are un spectru de absorbie caracteristic, ca form general, ca domeniu spectral, ca numr de maxime (denumite picuri) precum i ca raporturi ntre intensitile diverselor picuri.

Caracteristicile unui spectru de absorbie

Poziia picului este caracterizat de valoarea sa maxim, max. Se numete maxim de absorbie att vrful ca atare ct i lungimea de und care corespunde maximului. Pot exista unul sau mai multe maxime de absorbie. Numrul de maxime precum i forma general a curbei, reprezint caracteristica calitativ dup care se pot identifica substanele.
Selectivitatea unui maxim de absorbie este dat de limea picului la baz (sau benzii spectrale), notat X pe figura de mai sus, deoarece cu ct picurile sunt mai nguste se pot mai bine deosebi dou substane care posed spectre cu aspecte apropiate. Tot pentru a se evita suprapunerile, n cazul existenei mai multor maxime de absorbie, se prefer lucrul la maximele de absorbie cu lungimile de und cele mai mari.

Spectrul de absorbie al benzenului n soluie

Maximele acestuia sunt inconfundabile i acesta poate servi, la nevoie, pentru identificarea sau analiza benzenului din soluii

nlimea peak-ului i suprafaa ncadrat de peak reprezint caracteristici cantitative care servesc la determinarea concentraiei substanelor din probe.
Pentru a se nelege modul de utilizare, pe figura de mai jos se gsesc reprezentate spectrele de absorbie pentru mai multe concentraii (C1, C2, ... , C5) ale aceleiai substane n soluie, Co(NO3)2.

 Aceasta este curba de etalonare i servete la analiza cantitativ. Nu ntotdeauna punctele se situeaz toate, n mod riguros, pe o dreapt deoarece intervin erori experimentale i din acelai motiv, n practic, dreapta nu trece exact prin origine.

Analiza chimic cantitativ

Analiza chimic cantitativ n spectrofotometria de absorbie se bazeaz pe legea Lambert-Beer. Se utilizeaz o curb de calibrare (etalonare): A = f(C), trasat pentru probe de concentraii cunoscute, n aceleai condiii cu cele de analizat, evident lucrndu-se cu aceeai celul i la o lungime de und ct mai riguros monocromatic. Se alege un domeniu de concentraii, pe care se pregtesc 5-8 probe cunoscute i, dup trasarea dependenei A = f(C), grafic sau analitic, se poate trece la analiza cantitativ.

Analiza cantitativ: pe baza valorii Ax, msurate, se calculeaz valoarea Cx

 Domeniul pe care curba de etalonare este perfect liniar nu este foarte larg (de cel mult 10 oxi prima valoare de concentraie).
De aceea metoda nu poate funciona dect strict pe domeniul pentru care a fost trasat i, cel mai corect, pe poriunea de la jumtatea dreptei. Se fac mai multe citiri. Cu ct eroarea la determinarea absorbanei este mai mic cu att eroarea de determinare a concentraiei va fi mai cobort. Panta curbei este decisiv n mrimea erorii. Dac aceasta este foarte mic, eroarea la determinarea concentraiei va crete.

De aceea, soluiile foarte colorate duc automat la erori, datorit aplatizrii curbei la concentraii ridicate i ca urmare coninuturile nu pot fi determinate exact, recurgndu-se la diluri. Dac diluia este prea mare apare o cretere a erorii tocmai datorit dilurii, mai precis datorit limitelor determinrilor exacte a volumelor, fenomen ce trebuie avut n vedere. n concluzie, concentraiile soluiilor msurate trebuie s fie relativ reduse.

REGULI PRACTICE, FOARTE IMPORTANTE PENTRU RESPECTAREA LEGII LUI LAMBERT-BEER I TOTODAT PENTRU OBINEREA DE REZULTATE ANALITICE CORECTE:

soluiile trebuie s fie limpezi (fr suspensii) i s nu fie fluorescente; n soluiile supuse msurtorilor nu trebuie s se petreac transformri fotochimice sau reacii cu oxigenul din aer; substana de analizat nu trebuie s dea asociaii, cu compoziii variabile, cu solventul (diluantul) daca este necesar; punctele obinute trebuie s se situeze ct mai riguros pe aceeai dreapt, iar prelungirea dreptei s treac ct mai aproape punctul de coordonate (0,0); absorbana msurat pentru o proba necunoscut, Ax, trebuie, pe ct posibil, s se situeze pe poriunea din mijloc a domeniului punctelor de etalonare.

 Se mai poate utiliza legea lui Lambert-Beer i pentru determinarea concentraiei a dou specii diferite, de exemplu M i N, din aceeai soluie. n mod obinuit se utilizeaz dou lungimi de und diferite, 1 i 2 dar pentru oricare dintre acestea: Atotal = AM + AN. Cu alte cuvinte msurnd la 1 absorbana amestecului, notat A1 i la 2, absorbana A2, se obine: A1 = M1CMl + N1CNl, respectiv, A2 = M2CMl + N2CNl adic un sistem de dou ecuaii cu dou necunoscute concentraiile CM i CN. Prin rezolvarea algebric a sistemului de ecuaii aprut, se pot obine valorile acestora, deci se pot calcula concentraiile necunoscute.

 Analiza chimic calitativ se bazeaz pe compararea spectrelor de absorbie ale substanelor sau materialelor n domeniul UV-VIS, adic 180-1100nm cu spectre cunoscute. Acest procedeu permite identificarea unui anumit numr de specii chimice, dar numai pentru acele substane care absorb n acest domeniu. n chimia organic/biochimie, de exemplu, absorb n acest domeniu perechile de electroni de valen angajai n legturi i precum i perechile de electroni neparticipani. Pentru c n cursul acestor tranziii apar modificri ale polaritii legturii respective, aceste spectre au primit numele de spectre cu transfer de sarcin. Fiecare tranziie are asociat o lungime de und caracteristic (unde va aprea un maxim) i un coeficient molar de absorbie, , corespunztor. Acestea se datoreaz unor salturi ale electronilor de valen, adic a electronilor situai pe straturile exterioare ale atomilor angajai n legturi chimice.

Reprezentarea schematic a salturilor electronilor de valen care dau spectrele electronice, comparativ cu nivelele implicate n spectrele de rotaie sau de vibraie. Scara energiilor este logaritmic, diferenele ntre valorile numerice ale tranziiilor electronice i celelalte tranziii fiind mult mai mari dect cele reprezentate pe figur.

Diagram energetic corespunznd variantelor tranziiilor de rotaie, vibraie i electronice posibile pentru o molecul dat

 n substanele formate din molecule covalente se cunosc aa-numitele grupri cromofore sau auxocrome, care sunt grupri de atomi care dau ntregii molecule calitatea de a absorbi lumina - n cazul de fa, n domeniul UV-VIS.
o grupare cromofor reprezint locul (zona) din molecul unde-i au originea tranziiile electronice. S-a mai introdus i termenul de cromogen care constituie ansamblul dintr-un schelet molecular pe care se gsesc grefai mai muli cromofori. Pentru o serie de molecule, toate avnd legate acelai cromofor, poziia i intensitatea benzilor de absorbie rmn n mare aceleai (tabelul urmtor). Mai mult, dac o molecul conine mai multe grupe cromofore izolate, mai exact separate ntre ele prin cel puin dou legturi simple, se poate observa suprapunerea efectelor individuale.

Cteva dintre cele mai intense grupri cromofore caracteristice moleculelor covalente coninnd azot: lungimea de und a absorbanei maxime i coeficientul de extrincie

 Cnd nu este posibil analiza unor specii chimice, direct, din cauza lipsei culorii acestora, se pot provoca reacii care dau compui colorai, prin apariia unor grupri cromofore, pe baza crora se pot analiza anumite substane n prezena altora, realizndu-se astfel, pe cale chimic, o selectivitate metodei. Dac un anumit compus nu absoarbe n domeniul vizibil, dar n urma unei reacii chimice, se introduce n molecul o grupare cromofor, n noua substan, aceast grupare va absorbi lumina, n vizibil sau UV i va putea fi analizat cantitativ. Aceast reacie este o reacie de culoare. Cnd reacia de culoare este ea nsi una selectiv reacia poate servi i la identificarea calitativ a compusului incolor.

Punctul izobestic, sau de egal absorban este punctul de intersecie a unei familii de curbe de absorbie ale aceleiai substane, n condiii fizice sau de mediu diferite (de exemplu la mai multe valori ale pH-uri diferite) i semnaleaz existena a dou specii chimice diferite, aflate n echilibru chimic una cu cealalt - indiferent de tipul reaciei chimice ce are loc. Numrul de puncte izobestice reprezint numrul de specii chimice, aflate n echilibru ntre ele, fiecare absorbind lumina la lungimi de und diferite. Lungimea de und izobestic este valoarea pentru care coeficientul molar de extincie, , este egal pentru ambele componente i fie M, respectiv N, aceste componente.

Aspectul punctului izobestic n cazul unui indicator acid-bazic

 Algebric, acest lucru se reflecta n expresia absorbanei la lungimea de und respectiv (): A = (*M+ + *N+)l, unde l este lungimea celulei; cum concentraia lor global este aceeai, fiind dat de suma: C = [M] + [N] = const., absorbana la punctul izobestic (), va fi: A = lC, adic tot o constant.

Absorbia molecular

Conform teoriei cuantice, o molecul nu poate trece dect in stri energetice cu valori bine determinate. Moleculele prezinta mai multe nivele energetice: electronice, de vibratie, de rotaie tranziii electronice, de vibraie, de rotaie. Tranziiile de rotaie energia cea mai mica absorbie de radiaii din domeniul microunde IR ndeprtat; sunt spectre de linii. Tranzitiile de vibratie - de intindere si - de deformare. Necesita radiatii cu energie mare, absorbtia avand loc la mici in IR. Tranzitiile electronice sunt de mai multe tipuri: -*, , u-u*. Radiatii cu energie mare (UV-Vis) si conduc la spectre de benzi. Spectre moleculare: - corespund unor tranzitii intre stari de rotatie, stari de vibratie sau electronice. Energiile acestor tranziii, deci si frecvenele, cresc in aceasta ordine. Lungimile de unda corespunztoare sunt descrescatoare. Spectre de rotatie microunde; Spectre de vibratie : - IR; Spectre electronice: - UV-Vis.

SPECTROMETRIA DE ABSORBIE N IR
Domeniul infrarou (IR) al spectrului undelor electromagnetice conine radiaii cu lungimi de und cuprinse ntre 0.8 i 1000m. La ora actual se cunosc i se aplic un grup de metode de analiz chimic care valorific semnalele obinute prin absorbia radiaiilor din acest domeniu. Domeniul amintit, poate fi divizat la rndul su n trei subdomenii:
IR apropiat (ntre 0.8 i 2.5m), IR-mediu (ntre 2.5-25m) i IR-ndeprtat (peste 25m).

Domeniul mediu se mai numete i IR fundamental. Acesta este cel mai bogat n informaii i cel mai accesibil experimental. n vorbirea obinuit este domeniul IR care servete n mod curent att pentru analiza chimic ct i pentru recunoaterea calitativ a combinaiilor anorganice, organice sau naturale dar i n determinri de structur chimic. Domeniul IR apropiat, destul de srac n benzi de absorbie specifice anumitor legturi, are o importan mare tocmai n aplicaii cantitative ale lichidelor. Domeniul IR ndeprtat este nc n studiu.

Ca i n alte domenii ale spectrometriei, n IR se determin transmitana dat de raportul intensitilor transmise, I, respectiv incidente, I0, adic:

Se mai poate exprima transmitana procentual: T% = 100T sau absorbana, A, definit de:

Spectrul IR al unei substane este adesea o reprezentare grafic, n coordonate (T, ) unde cu s-a notat numrul de und dat de ecuaia: Pe acest grafic de disting mai multe maxime mai nguste - linii - sau mai largi - benzi. Pe axa ordonatelor, n loc de T poate aprea T% sau A - absorbana - dar n mod obinuit se utilizeaz numrul de und n cm-1 (sau Kaysers) din necesitatea de a nu se apela la numere att de mari ca frecvenele - exprimate n Hz - sau lungimile de und - exprimat n nm.

 Exist la ora actual o diversitate de metode de analiz bazate pe spectrele IR.

Astfel exist spectrometre bazate pe dispersie dup lungimea de und, sau bazate pe transformata Fourier, diverse analizoare industriale simple, nedispersive - ultimele specializate doar pe anumite combinaii chimice - precum i spectrometre de proces care fac analize, n mod continuu, pe anumite linii tehnologice de gaze sau lichide. n fine, exist spectrometre IR portabile care permit analiza unor poluani ai mediului.

 Absorbia n IR se datorete interaciunilor dintre radiaia electromagnetic incident i anume componenta electric a acesteia, cu dipolii electrici ai unei molecule. Se admite astzi c energia radiaiilor IR provoac o amplificare a energiei de vibraie a moleculelor datorit faptului c dipolul corespunztor legturii oscileaz cu o frecven apropiat cu cea a componentei electrice amintite.

(ntr-o molecul, n mod natural, atomii componeni execut micri de vibraie de-a lungul legturii n timp ce molecula se rotete. O intensificare a micrii de vibraie duce la o alungire i simultan, la o slbire a legturii dar i la o intensificare a micrii de rotaie. n acest fel se explic de ce, n absena oricrui dipol permanent, nu apare nici un cuplaj cu unda electromagnetic i nu are loc nici o diminuare a intensitii radiaiei IR incidente). Sau, altfel spus, gazele monoatomice (gazele rare) i substanele cu moleculele simetrice (ca de exemplu O2, N2, Cl2), avnd legturi nepolare, sunt perfect transparente la radiaiile din domeniu IR. n moleculele poliatomice posibilitile de apariie ale spectrelor IR sunt mai mari deoarece aici vibraiile asimetrice pot duce, chiar n moleculele nepolare, la apariia unor dipoli electrici, iar posibilitile de apariie ale unor vibraii de deformare (de modificare a unghiurilor dintre legturi n afara celor de alungire) se mresc. Pe de alt parte, intensitatea unei benzi de absorbie n IR este proporional cu ptratul variaiei momentului dipolar al moleculei, datorit absorbiei. Se tie c n general grupele polare (C-O, C=O, C-Br etc.) genereaz benzi de absorbie mai intense dect cele slab polare (C-N, C=N, C-H etc.).

Se mai tie din studiul fizic al spectrelor c energia mecanic total, a unei molecule izolate, poate fi aproximat printr-o reuniune de trei termeni (toi cuantificai) - corespunznd energiilor de rotaie, de vibraie i a electronilor de legtur - care se poate reda prin ecuaia:

Energia de rotaie se refer la rotaia moleculei n jurul centrului de greutate i valorile cu care variaz aceast energie sunt cu mult mai mici dect n cazul vibraiei, care la rndul ei este mai mic dect cea a electronilor de legtur. Acetia din urm interacioneaz n special cu radiaia din domeniul UV-VIS. Cei trei termeni, care apar adesea simultan n spectre, sunt foarte diferii ca valoare energetic i se poate considera c cei trei variaz independent unii de alii. Aceast aproximaie este posibil pe baza teoremei Born - Oppenheimer, care permite o abordare simplificat a problemei.

Cele dou tipuri de vibraii a unei legturi covalente polare implicate n absorbie IR

Numere de unda caracteristice modurilor de alungire a legaturii:

Grupa
Hidroxil Amine Aromatice alchene Alcani

Legatura
OH NH si C H CH

Domeniul ( in cm -1) 3610 3640 3300 3500 3000 3100

Aparatura
Primele instrumente comerciale pentru domeniul IR au aprut nc din anii 1940. Diversitatea extraordinar de aparate utilizate astzi n cele mai diferite domenii se poate mprii n trei categorii: Fotometre nedispersive bazate pe filtre simple formate uneori chiar din gazele de analizat. Aceste pot fi monocanal sau comparative. Spectrometre bazate pe dispersia luminii (folosind prisme sau monocromatoare bazate pe difracie i interferen) i care pot fi prevzute cu dou canale sau monocanal (cu sau fr chopper). Spectrometre bazate pe transformata Fourier, care permit intrarea n celul a ntregului domeniu spectral i care sesizeaz interferometric liniile caracteristice de absorbie. Aceste instrumente, datorit unei rezoluii mai bune i a rapiditii, datorate cuplrii cu calculatorul, n ultimul timp au devenit preferate.

Fotometrele nedispersive
Chiar dac nu permit obinerea unor spectre de absorbie, deci sunt inutile n ceea ce privete analiza calitativ, aceste aparate servesc doar pentru analize de amestecuri dinainte cunoscute (de exemplu CO, CO2 sau H2O, D2O) n procese industriale sau controlul mediului. Aceste analizoare sunt robuste, uor de utilizat i ieftine. Se pot analiza astfel sute de soluii formate din mai multe gaze sau lichide n controlul tehnologic sau al mediului ambiant. Un exemplu de aplicaie de acest tip este analizorul de CO i CO2 din gazele de eapament ale automobilelor - prezent practic n orice service auto. Acestea msoar absorbana la 2170 cm1 n cazul CO i la 2350 cm-1 n cazul CO . Una dintre 2 numeroasele variante ale acestui analizor este cel prezentat n figura urmtoare

Schema de principiu a unui analizor IR nedispersiv

Spectrometre bazate pe dispersie

Cu excepia celor destinate IR - apropiat unde componentele spectrometrului: sursa, mediul optic, celula sau detectorii sunt asemntoare cu cele pentru domeniul UV-VIS, n spectrometria IR apar componente din materiale diferite de primele. Deosebirea major este aceea c monocromatorul este aezat dup celulele cu probe.

Componente ale instrumentaiei n IR

Sursele de radiaie IR sunt becul cu filament de W (pentru IR apropiat), tuburile Nernst, lmpile Globar i filamentele Nicrom toate trei pentru IR fundamental i lmpile cu mercur la presiune ridicat pentru IR ndeprtat. Tuburile Nernst constau din rezistene formate din tubuoare cu diametru de 2mm i 30cm lungime confecionate din amestecuri de oxizi ai pmnturilor rare (n special Y i Er) plus ZrO2. Domeniul spectral n care lucreaz este 0.4-20 m. Lmpile Globar (denumire comercial - GLOBAR care s-a ncetenit) sunt rezistene care constau din nite baghete de 4 mm diametru avnd 50 cm lungime, confecionate din SiC. Sunt mai fragile dect tuburile Nernst. Spiralele din srm Nicrom sunt sursele cele mai puin pretenioase. Stabile n timp, rezistente n aer acestea dau o temperatur mai sczut i, n consecin, au o putere de emisie mai slab. Stratul de oxizi format pe suprafa asigur emisia radiaiei. Servesc drept surse n aparatele mai puin pretenioase.

 Monocromatoarele pentru IR sunt construite pe aceleai principii cu cele din domeniul UV-VIS i pot fi cu prism sau reea. Un dezavantaj al acestora este acela c nu pot fi confecionate din acelai material pentru tot domeniul IR. Exist materiale preferate doar pe anumite subdomenii ale IR-ului ca de exemplu: LiF (0.115-7m), CaF2 (0.125-10m) BaF2 (0.2-13.5m), NaCl (0.217m), KBr (0.2-26m) sau CsI (1-40m). De aceea se prefer selectarea cu prisme a unei poriuni i cu un monocromator se submparte domeniu pe subdomenii foarte nguste.

 Detectorii utilizai n spectrometria de absorbie n IR sunt deosebii de restul detectorilor folosii n UV-VIS. Acetia pot fi clasificai pe baza principiului care st la baza funcionrii n dou grupuri:
Detectori cuantici bazai pe efectul fotonilor asupra materialelor; Detectori termici care se bazeaz pe modificarea proprietilor fizice ale materialelor cu temperatura.

Emisia moleculara
Fotoluminescenta emiterea de lumina de ctre compuii supui excitrii de fotoni, include:
Fluorescena: absorbie UV-Vis molecula trece de pe nivelul vibraional cel mai cobort al strii e- fundamentale (So) pe unul din nivelele vibraionale ale strii de excitare (Si);
- este o tranziie rapid

Fosforescenta: are loc o modificare a spinului

este o tranziie lent;

Chemoluminescena: Energia este furnizata moleculei de o reacie chimic, produsul de reacie rezult in stare excitat din care revine in stare fundamentala prin emisie de fotoni.

Spectroscopia de fluorescen
Spectroscopia de fluorescen (denumit i fluorometrie sau spectrofluorometrie), este un tip de spectroscopie electromagnetic care analizeaz fluorescena dintr-o prob.
Aceasta implic utilizarea unui fascicul de lumin, de obicei, ultraviolet, care excit electronii din moleculele anumiilor compui i care provoac emisia de lumin cu o energie mai mic, de obicei (dar nu neaprat), lumina vizibil. Este o tehnic complementar spectroscopiei de absorbie.

 Anumite combinaii chimice, aflate mai ales n soluie sau n stare solid, n urma excitrii moleculelor cu radiaii din domeniile vizibil i UV apropiat, reemit o parte din energia primit sub form de radiaie luminoas adesea vizibil. Aceast re-emisie se numete fluorescen.
Maximul radiaiei de fluorescen este situat de obicei la o valoare a lungimii de und mai mare dect maximul picului radiaiei care a provocat excitarea, diferena de energie corespunztoare transformndu-se n cldur, fiind disipat n mediu.

Reprezentarea simplificat a fenomenului de fluorescen

Schema procesului de apariie a fluorescenei. Radiaia incident are lungimea de und mai mic dect cea emis Fluorescena, riguros vorbind, implic emisia de radiaie prin tranziia ntre dou niveluri care au aceeai multiplicitate (de exemplu singlet la singlet sau triplet la triplet). Dac tranziia are loc ntre dou niveluri de multiplicitate diferit, aceasta poart numele de luminescen.

 Dup excitare, intensitatea luminii emise de ctre atomi, F, scade exponenial n timp respectnd o ecuaie de forma: F = I0 ekf t unde F este radiaia de fluorescen produs de ctre o substan, I0 - intensitatea radiaiei incidente, kf - o constant caracteristic substanei (analog constantei de vitez) iar t - timpul. Trebuie fcut o distincie ntre fluorescen, care corespunde unei scderi rapide a intensitii luminoase emise i fosforescen - la care scderea n timp este cu mult mai lent.; o specie molecular poate fi, deodat, att fluorescent ct i fosforescent. Pe de alt parte, luminescena este tot o reemisie de lumin dar aceasta are la origine energia unei reacii. Aceast energie nu se degaj sub form de cldur (ca n majoritatea cazurilor) ci sub form de energie radiant. De fapt o putem considera ca pe o excitare a electronilor cu ajutorul cldurii de reacie.

 Timpul de via a unei specii moleculare excitate, 0, se definete cu ajutorul constantei de vitez kf din relaia precedent (F = I0 ek t):
f

Dup acest timp intensitatea rezidual nu reprezint dect 36,7% din cea iniial adic peste 60% dintre moleculele excitate au revenit la starea neemisiv. De aceea fluorimetria lucreaz n regim staionar - excitarea avnd loc pe tot parcursul msurtorii - pe cnd fosforescena, la care diminuarea intensitii n timp este mult mai lent, se studiaz doar dup ce a ncetat faza de excitare.

0 = 1/kf

 Metodele de analiz bazat pe fluorescen nu sunt general aplicabile oricror substane. Dar, toate metodele analitice bazate pe att pe fluorescen ct i pe i luminescen pe lng c sunt foarte specifice sunt i foarte sensibile. De exemplu, putem aminti c limita de determinare a unei metode fluorimetrice, pentru o anumit combinaie chimic, este de circa 1000 de ori mai cobort dect cea a unei metode prin absorbie n vizibil sau n ultraviolet. De aceea, din aceast categorie de metode exist cteva extrem de utile n analiza biochimic i de monitorizare a unor poluani ai mediului.

ntruct nivelul radiaiei de luminescen nu este ntotdeauna foarte ridicat, exist dou tipuri de instrumente diferite: fluorimetre i spectrometre de chemiluminescen. Ultimele i-au gsit aplicaii n domeniul analizelor biochimice precum i n monitorizarea NOx, H2S din aer precum i n studiile, respectiv analizele fenomenelor de mbtrnire a materialelor plastice.

Bazele fizice ale fluorescenei

Din punct de vedere fundamental, fluorescena compuilor moleculari (de interes pentru analiza chimic/biochimic) se poate descrie ca o absorbie de radiaie UV-VIS, urmat de o serie de tranziii energetice ntre ultimii orbitali ocupai ai strii fundamentale a moleculei, i primii orbitali externi vacani.
Iniial moleculele se afl n repaos, n starea fundamental, notat S0.

Diagrame energetice prezentnd comparativ fluorescena i fosforescena. Sgeile scurte simbolizeaz conversii interne fr emisie de fotoni. S = singlet; T = triplet; V1 V4 = numere cuantice de vibraie i totodat notaii ale strilor de vibraie S0, S1, T1 ... reprezint stri electronice (nivele energetice), iar V0, V1, ...nivele energetice de vibraie caracterizate fiecare de un numr cuantic de vibraie uneori notat tot V0, V1,... . S i T sunt prescurtri amintind sensurile de singlet, respectiv de triplet.

 Dup absorbia unui foton incident electronii trec n starea S1 - prima stare de tranziie electronic, excitat. Apoi, foarte rapid (10-12s), are loc un proces denumit conversie intern, prin care moleculele sufer rearanjri, fr a emite fotoni, timp n care electronii ajung n starea caracterizat prin numrul de vibraie V0 a strii electronice urmtoare, S1. Abia apoi intervin tranziiile de fluorescen (timp de 10-9-10-7s) n urma crora moleculele revin pe unul din nivelele notate V0, V1, ... (stri energetice de vibraie caracterizate fiecare prin numrul de vibraie respectiv, Vi) - aparinnd nivelului iniial S0.

 Se poate observa (n figura alturat) c moleculele pot pstra o parte din energia lor sub form de energie de vibraie. Acest exces de energie urmeaz a fi disipat n mediul nconjurtor prin coliziuni mecanice sau alte procese neradiative cunoscute sub denumirea de relaxare vibraional. Totui, se mai poate uneori produce i o emisie de fotoni, evident mai sraci n energie, care stau la baza unei fluorescene situate n IR apropiat.

Spectrul de absorbie i cel de fluorescen pentru diferii compui prezint (cu o bun aproximaie) o simetrie, unul reprezentnd aproape imaginea n oglind a celuilalt.

Cum e i firesc absorbia este situat la lungimi de und mai mici, respectiv n conformitate cu ecuaiile:
E = h = hc/, la valori ale energiei, E, mai ridicate.

Poziiile relative ale absorbiei i fluorescenei n cazul eozinei. Se remarc o zon de lungimi de und comun

 Fosforescena, pe lng faptul c nsoete o reacie chimic, analog luminescenei, corespunde i unui mod diferit de revenire la starea fundamental. Dup faza de absorbie o dat cu transferul unui electron pe nivelul S1 (prima stare electronic excitat dup cea fundamental - o stare de singlet) are loc, dac relaxarea vibraional se produce suficient de lent, modificarea spinului electronului la o stare de triplet, notat T1 (fig. Diagrame energetice), ceva mai stabil (metastabil). Din acest motiv, revenirea la starea fundamental este ncetinit, deoarece implic o nou modificare de spin a acestui electron. Ca urmare, durata strii excitate n fosforescen poate fi de 108 ori mai mare dect n fluorescen.

 Se cunosc cteva reguli privind legtura dintre structura compuilor organici i fluorescena acestora:
Moleculele organice care nu absorb puternic lumina peste 200 nm n general nu sunt fluorescente. Moleculele care au banda de absorbie corespunztoare tranziiei: S0S1 (fig. Schema procesului de apariie a fluorescenei), localizat la = 250nm i pentru care absorbia luminii se datorete unei tranziii (') sunt fluorescente. Substituenii - donori de electroni - grefai pe un sistem delocalizat mresc ntotdeauna absorbia luminii, intensificnd fluorescena. n acest sens, se pot aminti, de exemplu, funciunile: OH > OR > NH2. Grupele funcionale puternic atragtoare de electroni (grefate la sistemul ') tind s reduc fluorescena moleculei respective. n plus prezena, alturi de acestea, a unor grupri donoare de electroni, tinde s diminueze fluorescena (i nu s o intensifice).

n consecin, moleculele organice care au cel puin dou legturi conjugate i care conin i o band de absorbie la > 200nm, cu un coeficient de absorbie 103Lmol-1cm-1, prezint fluorescen i pot fi analizate fluorimetric. De exemplu, compuii moleculari ciclici cu sisteme conjugate (figura de mai jos), care mai posed grupri funcionale donoare de electroni, se preteaz foarte bine la acest tip de determinri.

Diveri compui fluoresceni aromatici. Oxina (8-hidroxichinoleina) formeaz combinaii complexe fluorescente cu numeroi ioni metalici

Intensitatea fluorescenei
Semnalul analitic n fluorimetrie l constituie intensitatea fluorescenei, F. Valoarea acesteia depinde att de poziia punctului de unde este emis radiaia ct i de poziiile fantelor de intrare i ieire din celula de msur. Astfel, o parte a radiaiei incidente (excitante) este absorbit de ctre lichidul din celul nainte de a atinge punctul de emisie iar o parte a radiaiei de fluorescen, o dat emise, este absorbit de aceeai soluie, nainte ca aceasta s prseasc celula. Asadar, intensitatea radiaiei de fluorescen care atinge detectorul corespunde unui volum de soluie relativ mic prezent n spaiul delimitat de proieciile ferestrelor de intrare i ieire din celul.

 Fenomenul de diminuare a intensitii luminoase numit impropriu filtrare intern - se datorete mai ales suprapunerii pariale a spectrelor de fluorescen i de absorbie (figur). n afar de absorbia propriu zis, denumit i diminuare prin culoare, mai pot interveni transferuri de energie de la molecule excitate la alte molecule sau la ioni strini din celul, n urma unor coliziuni sau formri de compleci.

 Acest fenomen se numete diminuare chimic. De exemplu, prezea oxigenului atmosferic provoac o diminuare suplimentar de fluorescen. De aceea, pentru soluii, se definete o mrime denumit randamentul fluorescenei, f, cuprins ntre 0 i 1 - un parametru independent de intensitatea sursei: f = (Numrul de fotoni emii)/(Numrul de fotoni absorbii) (1)

 Se poate observa c aceast mrime reprezint fracia radiaiei incidente absorbite, care este reemis sub form de fluorescen. Cu ajutorul acesteia, n soluii diluate, se poate scrie o ecuaie a intensitii fluorescenei, F. n primul rnd trebuie s se in cont de factorii care determin absorbana, A, ct i de lungimea, notat cu b, a parcursului radiaiei de fluorescen prin celul. n consecin expresia intensitii fluorescenei se poate scrie: F = fI0Ab (2) unde cu I0 s-a notat intensitatea radiaiei incidente, A - absorbana soluiei (A = lC) iar b - lungimea parcursului radiaiei de fluorescen prin celula de msur. nlocuind A avem: F = fI0lbC (3) unde C este concentraia molar a soluiei. nglobnd toate constantele care depind de celul, respectiv de soluie, ntr-o singur constant, K, obinem o ecuaie mai simpl: F = KI0C (4)

Pe baza acestei ecuaii se poate gsi experimental o curb de etalonare n coordonatele F, C care este o dreapt (figura de mai jos, -stnga). Desigur c aceasta este valabil doar n soluii diluate, ntruct s-a constatat c poate suferi modificri accentuate la concentraii superioare (figura de mai jos - dreapta) tocmai din cauzele amintite.

Relaia liniar dintre intensitatea fluorescenei, F, i concentraia C. Domeniul liniar este relativ ngust iar la concentraii ridicate liniaritatea dispare

Aparatura
Deoarece proba spus analizei emite radiaia de fluorescen n toate direciile, pe fotodioda sau fotomultiplicatorul instrumentului folosit cad doar radiaiile care vin n direcia acestuia, n timp ce restul se pierd. De aceea suprafaa senzorului care preia radiaia trebuie s fie ct mai mare. n general se msoar radiaia care prsete celula sub un unghi de 90 fa de radiaia incident. Pentru soluii cu absorban ridicat studiul se poate realiza i n prelungirea fascicolului incident. Pentru soluii semiopace se preconizeaz o observare sub un unghi variabil ntre 90-180. Geometria fluorimetrelor poate fi sintetizat prin schema din figura urmtoare.

Geometria unui spectrofluorimetru; unghiul preferat de observare a fluorescenei este 90; F = fanta

 Sursele optice ale fluorimetrelor actuale emit un spectru luminos continuu. Au devenit uzuale urmtoarele lmpi folosite n calitate de surse:
Lmpile cu arc de deuteriu (190-400nm), Lmpile cu arc de xenon (200-850nm), Lmpile cu arc de wolfram (380-700nm).

Se mai utilizeaz i lmpile cu vapori de mercur care produc linii spectrale intense (la 254, 313 i 365 nm). Acestea, pot fi izolate individual folosindu-se nite simple filtre optice. De asemenea au mai aprut surse cu laser heliucadmiu (325nm, 5-10mW) care de asemenea necesit un filtru optic i impun folosirea unor fotomultiplicatori.

 Constructiv se pot distinge dou tipuri de fluorimetre: (1) bazate pe determinarea raportului fluorescenelor (2) spectrofluorimetre.

 Fluorimetrele bazate pe determinarea raportului fluorescenelor (figura de mai jos) dup ce selecteaz radiaia excitant optim, gsit prin ncercri preliminare, radiaia incident este desprit, de o oglind semitransparent, n dou raze: una care cade pe prob (aflat n celula de msur) iar cealt pe o fotodiod. Din celula de msur iese radiaia de fluorescen, care se observ la un unghi de 90 fa de cea incident. Un al doilea monocromator, denumit de emisie, selecteaz radiaia dorit, de regul cea mai intens.

Schema unui spectrofluorimetru cu doi detetectori care elimin deriva sursei

 Proba poate fi nlocuit cu un etalon metrologic pentru reglaje (standard). Folosirea celor dou fotodiode n opoziie elimin fluctuaiile de intensitate inerente oricrei surse bazate pe arc electric. Calculul concentraiei necunoscute se face pe baza ecuaiei F = KI0 C n care K I0 este o constant pentru orice pereche de valori C, F.

Rezult:

unde Cnec este concentraia probei necunoscute, Fnec intensitatea fluorescenei probei necunoscute, Cet - concentraia probei etalon, cunoscute i Fet - intensitatea fluorescenei pentru proba etalon - cunoscut.

 Spectrofluorimetrele permit, pe lng cele amintite anterior la fluorimetre, obinerea unor spectre de fluorescen. Fiecare din cele dou monocromatoare baleiaz ntreg domeniul spectral. Pentru fiecare valoare a radiaiei excitante exist un spectru de fluorescen separat. Pentru tot domeniul se obine o familie de spectre care caracterizeaz n mod unic o combinaie chimic sau un material fluorescent. Cu ajutorul acestora se pot seleciona condiiile optime de lucru pentru o determinare de rutin.

Aplicaii
Exist un numr mic de molecule care posed o fluorescen natural. Acestea pot fi analizate cantitativ prin fluorimetrie dac se dispune de substana pur (etalon). Numrul acestora este foarte mic (5-8% din total). Pe de alt parte, aa cum exist reactivii de culoare, exist i o serie de reactivi de fluorescen care duc, n urma unei reacii chimice, la produi fluoresceni. Din primul grup de metode amintim analiza hidrocarburilor policiclice aromatice din ape, n urma separrii acestora prin cromatografie. Tot n categoria acestui prim grup intr i determinarea aflatoxinelor - nite ageni cancerigeni prezeni n alimente dar i o serie de alte substane importante cum ar fi steroizii i vitaminele. Din a doua grup de metode amintim determinrile unor cationi metalici cum ar fi Be2+ cu reactivul morin sau unii compleci ai metalelor trivalente cu oxina (8oxichinoleina).

Proteina fluorescent verde (GFP)

Proteina fluorescent verde (GFP) este o protein compus din 238 de aminoacizi (26,9 kDa), care prezint fluorescen verde luminoas atunci cnd este expus la o lumin albastr. Dei multe alte organisme marine posed proteine verzi fluorescente similare, GFP n mod tradiional se refer la proteina izolat pentru prima data din meduza Victoria aequorea.

 GFP de la Victoria aequorea are un vrf de excitaie major la o lungime de und de 395 nm i un altul minor la 475 nm. Maximul de emisie este la 509 nm (n partea verde de jos a spectrului vizibil).

 GFP din panselua de mare (Renilla reniformis) are un singur maxim de excitaie major la 498 nm.

n biologia celular i molecular, gena GFP este frecvent folosit ca un reporter de exprimare.

 ntre anii 1960 i 1970 din Victoria aequorea a fost separat i purificat GFP, mpreun cu aequorina, o protein luminescent,iar proprietile sale au fost studiate. S-a stabilit c la V. aequorea, fluorescenta GFP se manifest atunci cnd aequorina interacioneaz cu ioni de Ca2+ i care induce astfel o strlucire albastr. O parte din energia luminiscent este transferat GFP, care conduce la deplasarea spre verde a culorii pe ansamblu. Cu toate acestea, utilitatea sa ca un instrument n biologia molecular nu s-a anticipat dect n 1992 cnd s-a raportat clonarea i secvena a nucleotidelor din gena wtGFP. ADNc a fost clonat n celule de E. coli i Caenorhabditis elegans iar proteina a fost astfel exprimat. S-a constatat c molecula pliat prezint fluorescen la temperatura camerei, fr a fi nevoie de cofactori exogeni specifici meduzei.

 GFP are o structura tipic beta pliat cilindric, compus dintr-o zon cu structur de alfa helix n timp ce domeniul care conine cromofor trece prin centrul su.

 Cromoforul este format printr-o reacie de ciclizare a unei tripeptide Ser65-Tyr66 -Gly67. Acest proces de modificare posttranslaional are loc la maturarea sa. Cromoforul din GFP, mutanta S65T.

 Reeaua de puni de hidrogen i electronii adiaceni influeneaz culoarea wtGFP. Natura mpachetrii ferme sub forma cilindric exclude molecule de solvent, protejnd astfel fluorescen cromoforului de efectul de stingere a fluorescenei de ctre ap.

Neuroni motori de oarece vizualizai cu green fluorescent protein. Se observ axonii.

Osamu Shimomura, Martin Chalfie & Roger Tsien-Nobel Prize in Chemistry for 2008

COLORAIA FLUORESCENT A PROTEINELOR N ELECTROFOREZ

Coloraia fluorescent este metoda optim care combin marea sensibilitate de detecie cu cuantificri de mare certitudine pe un domeniu linear dinamic deosebit de crescut. Totui, coloranii sunt mai scumpi dect cei utilizai n coloraiile vizuale; este necesar existena unui scanner de fluorescen pentru vizualizarea spoturilor i de asemenea este nevoie de sistem de achiziie de imagine pentru analiza de imagini. Coloranii fluoresceni prezint un mare domeniu de linearitate dinamic, de peste 4 ori magnitudine fa de coloraiile clasice, cu rezultate nalt reproductibile.

Structura chimic a colorantului hidrofob Nile red. n timp ce sensibilitile coloranilor Sypro Orange, Red i Tangerine sunt similare celei de coloraie cu Coomassie Blue, Sypro Ruby poate detecta sub 1 ng de protein per spot. Deep Purple, conine drept fluorofor epicocconona din fungul Epicoccum nigrus i este chiar mai sensibil dect Sypro Ruby, sub cteva sute de picograme.

PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI

introducerea coloranilor cianinici cu mrime i sarcin diferit (CyDye DIGE Fluors) cu lungimi de und de excitaie i emisie diferit pentru proteinele marcate
Marcarea prin ataarea colorantului la gruprile amino ale resturilor de lizin Marcarea la saturaie a tuturor resturilor de cistein

Reprezentarea schematic a diferenelor n proteine premarcate a unui gel dup electroforez bidimensional

METODE DE DETECIE A PROTEINELOR DUP TRANSFERUL PE MEMBRAN

Exist reacii chimice care sunt nsoite de emisie luminoas. O astfel de substan este luminol-ul care poate reaciona cu Fe (II) i permite punerea n eviden a unor concentraii mici din acest element. Chemiluminescena reprezint producerea unei lumini detectabile rezultate n urma unei reacii chimice.

n cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul luminos se produce n momentul n care produsul excitat se ntoarce la starea sa de baz. Semnalul este vizualizat prin expunerea membranei pe un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziie a imaginii. Pe lng luminol sunt, disponibile comercial i alte substrate chemiluminescente precum substratele bazate pe acridan (este cazul Lumigen PS-3 care utilizeaz fosfataza alcalin sau peroxidaza din hrean ca enzime reporter) ori substraturi pe baz de 1-2-dioxetan (care utilizeaz fosfataza alcalin ca enzim reporter). Emisia de lumin poate fi crescut de pn la 1000 de ori prin adugarea unor amplificatori cu structur fenolic. Amplificatorul difer de tipul de kit utilizat. Detecia chemiluminescent prezint ca avantaje, viteza i sensibilitatea. Timpul mediu de expunere e de 30 secunde pn la 15 minute.

Bioluminescena

Bioluminescena este un fenomen de emisie de lumin de ctre multe organisme. Sistemele bioluminescente difer n structura i funcia enzimelor i cofactorilor implicai n proces alturi de mecanismul reaciilor de generare a luminii. Bioluminescena poate fi expoatat ca metod de detecie pe membrane. Detecia prin bioluminescen implic incubarea membranei care conine un antigen legat/complex anticorp-enzim n prezena unui substrat bioluminogenic, cu msurarea simultan a luminii emise. Substratul n acest sistem de detecie este un derivat al luciferinei. Detecia luminii este realizat ntr-o camer foto-evideniere iar proteinele sunt vizualizate ca spoturi luminoase. Din punct de vedere al sensibilitii i al vitezei de realizare, tehnica este similar celei de chemiluminescen, dar nu este generalizat datorit numrului mic de substrate bioluminogenice comercializate.

Chemifluorescena

Chemifluorescena reprezint o conversie enzimatic a unui substrat ntr-un produs fluorescent. Compuii fluorogenici (substane nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite n produi fluoresceni) sunt utilizai cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu AP ori HRP. Enzima cliveaz o grupare fosfat a unui substrat fluorogenic cu producerea unui compus nalt fluorescent. Fluorescena poate fi apoi detectat.

Ultra/centrifugarea
Separarea amestecurilor heterogene sub influena forei centrifuge, se realizeaz pe dou principii: 1. Sedimentare 2. Filtrare 1) Sedimentare, cnd separarea sub influena forei centrifuge se realizeaz pe baz de diferen de sedimentare, prin stratificarea componenilor. Se aplic amestecurilor eterogene lichid-lichid, solidlichid, solid-solid, solid-gaz. Separarea centrifugal pe principiul sedimentrii, poart uneori denumiri speciale: a. limpezire (eliminarea impuritilor solide dintr-un lichid), b. concentrare (concentrarea particulelor solide dintr-un amestec solid-lichid ), etc.

Sedimentarea sub influena forei centrifuge se realizeaz n dou faze: depunerea fazei cu viteza de sedimentare sau cu densitatea mai mare, care se supune legilor hidrodinamicii n cazul sedimentelor solide; tasarea sedimentului, care se supune legilor mecanicii solului. Sedimentarea sub influena forei centrifuge se deosebete de sedimentarea sub influena forei gravitaionale prin faptul c se realizeaz sub influena acceleraiei centrifugale. Centrifugarea se folosete pentru accelerarea sedimentrii, pentru amplificarea vitezei de filtrare i eliminarea unei faze lichide (supernatant) dintr-una, solid (sediment).

 2) Prin filtrare, care se aplic n special amestecurilor heterogene solidlichid. Lichidul strbate suprafaa filtrant sub influena forei gravitaionale sau centrifugale, particulele solide din amestec, acionate de fora centrifug/gravitaional se depun pe suprafaa masei filtrante. La filtrarea sub influena forei centrifuge apar trei faze: 1) formarea sedimentului; 2) tasarea sedimentului 3) eliminarea lichidului reinut n porii sedimentului. Faza de formare a sedimentului se aseamn cu cea de la filtrarea obinuit, ns n acest caz, presiunea cu care trece lichidul prin stratul de sediment este provocat de fora centrifug i n mod normal este mai mare dect la filtrarea obinuit Viteza de filtrare depinde de diferena de presiune pe cele dou fee ale stratului filtrant. La filtrarea obinuit, diferena de presiune se poate mri prin mrirea stratului de lichid pe filtru, prin mrirea presiunii asupra lichidului i prin mrirea presiunii sub stratul de filtrat. Presiunea lichidului pe suprafaa filtrant, se mrete mult cnd filtrarea se face ntr-un cmp de fore centrifuge.

 Ultra/centrifugarea este o tehnic de separare frecvent utilizat n domeniul substanelor cu mas molecular mare, att n scop analitic ct i preparativ. Separarea amestecurilor heterogene sub influena forei centrifuge, dac se realizeaz la viteze de rotaie mari, poart denumirea de separare centrifugal sau centrifugare.
Constituie un instrument important al biochimiei, biologiei moleculare; se utilizeaz de asemenea la separarea de virui. Prin utilizarea tehnicilor de gradient de densitate, a devenit posibil separarea componentelor dintr-un amestec, n benzi distincte. Gradientul de densitate a mediului n care componentele (componenii) sedimenteaz se datorete unui gradient de concentraie a unei substane inerte chimic.

Avantaje analitice
Nu necesit o dializ preliminar a probei Componenii individuali ai sistemelor multicomponente sunt separai printr-un procedeu fizic, neavnd loc modificri structurale Utilizeaz cantiti mici de prob

 Svedberg-separarea particulelor in cmp centrifugal (1920) Intensitatea cmpului centrifugal a = 2 unde =poziia radiala =viteza unghiulara = 2 unde =frecvena de rotaie (rpm) Acceleraia: a = (2)2

 n practic, cmpul gravitaional generat ntr-o centrifug este exprimat n mod uzual n relaie cu cmpul gravitaional (g=9,805 m/s2) a = ( 2 )/ g Fora centrifugal este egal cu produsul dintre masa efectiv (me) a particulei care sedimenteaz (masa flotant) i intensitatea cmpului centrifugal. F = me2 Masa efectiv a particulei este egal cu masa real (m) din care se scade masa solventului dislocuit, ms. me= m-ms Astfel, Fef = m2 - ms2

 Considernd Vp=volum particulei de mas, m p= densitatea particulei l = densitatea lichidului ms= m l /p Fef = mx2 - m(l / p) x2 Drept consecin a procesului, se poate considera coeficientul de sedimentare (s) ca fiind viteza de sedimentare pe unitatea de intensitate a cmpului centrifugal s = v/a = dx/dt/2 coeficientul de sedimentare (s) se exprim, prin convenie, n uniti svedvergi (S): 1S=10-13sec Se calculeaz, n mod obinuit la 20oC i n ap. -el este dependent i de concentraie, dup relaia empiric: s = so / (1 + kc) unde k=constant s0=valoarea coeficientului la o concentraie =0 (ordonata la origine a curbei de regresie, 1/s=f(c))

 Corelaia dintre masa molecular (M), difuzibilitatea particulei (D) i coeficientul de sedimentare (s) se exprim prin ecuaia:

sRT M= l D(1- ) p
S=constant a moleculei, nu depinde de mediul n care se determin macromoleculele au s cuprins ntre 1-100

Factorii care influeneaz sedimentarea particulei

1. raza particulei este invers proporional cu timpul necesar pentru a sedimenta o particul de la gura tubului la baza sa; cu ct raza este mai mare, cu att particulele vor sedimenta mai repede. 2. vscuozitatea - este direct proporional cu timpul necesar sedimentrii; -la aceeai mas molecular, moleculele mai compacte vor sedimenta mai repede, datorit frecrii mai mici; -cu ct mediul este mai dens, cu att moleculele vor sedimenta mai ncet 3. densitatea mediului la l = p, timpul de sedimentare este infinit, practic particula se oprete cnd ntlnete o zon egal cu o densitate egal cu a sa

 Separarea particulelor se realizeaz n acord cu densitile lor 1. metoda echilibrului izodensitic

Iniial, proba este uniform distribuit ntr-o soluie unei sri de mas molecular mic, de exp. CsCl. Prin centrifugare, se realizeaz un gradient de densitate care crete de la vrful, la baza tubului, datorit distribuiei echilibrului de sedimentare a srii, componentele probei se vor deplasa spre o zon corespunztoare densitii lor, ocupnd astfel poziiile lor izodensitice
De exemplu, prin aceast tehnic se separ 17N-ADN (= 1,708) de 15N-ADN (=1,772) n gradient de clorur de cesiu.

Ultra/centrifugarea zonal

 2. metoda vitezei zonale Celula (tubul de centrifug) este ncrcat cu o soluie de sucroz a crei gradient crete de la baz, spre vrf. La partea superioar a celulei se introduce (depune) proba ntr-un strat subire. Componentele amestecului sedimenteaz n zone prin ultracentrifugare, n ordinea coeficienilor lor de sedimentare. Gradientul de densitate servete la obinerea unor zone nguste.

 3. metoda izopicnic (a gradientului preformat)

gradientul de densitate preformat acoper domeniul de densitate a particulelor, care n timpul rotirii centrifugale se deplaseaz n sus sau n jos, pn la locul unde densitatea lor concord cu densitatea mediului. Creterea rezoluiei de separare se realizeaz prin existena unui gradient de vscozitate.
Practic, se utilizeaz o soluie de sucroz (zaharoz) , glicerol, etc. De exemplu, o soluie de sucroz 40%, la 20oC are o vscozitate () de 6,2 ori mai mare dect cea a apei i o densitate () de 1,18 ori mai mare dect cea a apei. Exist markeri de densitate sub forma unor perle colorate diferit n funcie de densitatea lor.

Aplicaii
Fracionarea subcelular prin centrifugare diferenial n funcie de fora centrifugal vor sedimenta particulele (macromoleculele, organitele celulare) dup mrimea lor 1. obinerea omogenatului tisular
a. poterizare, ultrasonicare (n soluii izotonice de zaharoz 0,25M pentru a se evita fenomenele de distrucie a organitelor celulare)

2. centrifugarea diferenial
a. b. c. d. 800g, timp de 20 min, sedimentarea nucleilor i a celulelor ntregi 65000g, (gradient de zaharoz) timp de 2 ore, sedimenteaz lizozomii (=1,12g/cm3), mitocondriile (=1,18g/cm3), peroxizomii (=1,23g/cm3), 105000g (gradient de zaharoz) timp de 3 ore, sedimenteaz microzomii, 30000g(gradient de zaharoz) timp de 3 ore, sedimenteaz ribozomii, fracia citosolic

Enzime marker ale fraciilor subcelulare

Fracia nuclear-adeniltransferaza, RNA polimeraza, DNA dependent Fracia mitocondrial-monoaminoxidaza, adenilat ciclaza, citocromoxidaza, succinat dehidrogenaza Fracia peroxizomal- catalaza, urat oxidaza, D-aminoacid oxidaza, L ahidroxiacid oxidaza Fracia lizozomal fosfataza acid, catepsine Fracia microzomal- cit. P450, cit. b5(c) oxidaza, NADPH oxidaze cu funcii mixte Fracia citosolica- acilgras coenzima A sinteteza, transaldolaza, fosfofructokinaza
Se dozeaz enzimele marker pentru a decela prezena unor eventuale contaminri