Manuale Delle Tecniche

TECHNI TECHNICAL MAN MANUAL
15 edizione
ma
Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide
TECHNICAL MANUAL
15 edizione
ma
Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide
Mention of specific products or equipment by contributors to this AABB publication does not represent an endorsement of such products by the AABB nor does it necessarily indicate a preference for those products over other similar competitive products. Any forms and/or procedures in this book are examples. AABB does not imply or guarantee that the materials meet federal, state, or other applicable requirements. It is incumbent on the reader who intends to use any information, forms, policies, or procedures contained in this publication to evaluate such materials for use in light of particular circumstances associated with his or her institution. Efforts are made to have publications of the AABB consistent in regard to acceptable practices. However, for several reasons, they may not be. First, as new developments in the practice of blood banking occur, changes may be recommended to the Standards for Blood Banks and Transfusion Services. It is not possible, however, to revise each publication at the time such a change is adopted. Thus, it is essential that the most recent edition of the Standards be consulted as a reference in regard to current acceptable practices. Second, the views expressed in this publication represent the opinions of authors. The publication of this book does not constitute an endorsement by the AABB of any view expressed herein, and the AABB expressly disclaims any liability arising from any inaccuracy or misstatement.
Copyright 2005 by AABB. All rights reserved. No part of this book may be reproduced or transmitted in any form or by any means, electronic or mechanical, including photocopying, recording, or by any information storage and retrieval system, without permission in writing fromthe Publisher. AABB - 8101 Glenbrook Road - Bethesda, Maryland 20814-2749, USA
Technical Manual Program Unit

Chair and Editor - Mark E. Brecher, MD Associate Editors - Regina M. Leger, MSQA,MT(ASCP)SBB, CQMgr(ASQ); Jeanne V. Linden, MD, MPH; SusanD. Roseff, MD Members/Authors - Martha Rae Combs, MT(ASCP)SBB; Gregory Denomme, PhD, FCSMLS(D); Brenda J. Grossman, MD, MPH; N. Rebecca Haley, MD, MT(ASCP)SBB; Teresa Harris, MT(ASCP)SBB, CQIA(ASQ); Betsy W. Jett, MT(ASCP), CQA(ASQ)CQMgr; Regina M. Leger, MSQA,MT(ASCP)SBB, CQMgr(ASQ); Jeanne V. Linden, MD, MPH; Janice G. McFarland, MD; James T. Perkins, MD; Susan D. Roseff, MD; Joseph Sweeney, MD; Darrell J. Triulzi, MD Liaisons - Gilliam B. Conley, MA, MT(ASCP)SBB; Michael C. Libby, MSc, MT(ASCP)SBB Acknowledgments The Technical Manual Program Unit extends special thanks to those volunteers who provided peer review and made other contributions: James P. AuBuchon, MD; Lucia M. Berte, MA, MT(ASCP)SBB, DLM, CQA(ASQ)CQMgr, Arthur Bracey, MD; Linda Braddy, MT(ASCP)SBB; Donald R. Branch, MT(ASCP)SBB, PhD; Ritchard Cable, MD; Sally Caglioti, MT(ASCP)SBB; Loni Calhoun, MT(ASCP)SBB; Tony S. Casina, MT(ASCP)SBB; Geoff Daniels, PhD, MRcPath; Robertson Davenport, MD; Richard J. Davey, MD; Walter Dzik, MD; Ted Eastlund, MD; Anne F. Eder, MD, PhD; Ronald O. Gilcher, MD, FACP; Lawrence T. Goodnough, MD; Linda Hahn, MT(ASCP)SBB, MPM; Heather Hume, MD; Mark A. Janzen, PhD; Susan T. Johnson, MSTM, MT(ASCP)SBB; W. John Judd, FIBMS, MIBiol; Michael H. Kanter, MD; Louis M. Katz, MD; Debra Kessler, RN, MS; Thomas Kickler, MD; Karen E. King, MD; Joanne Kosanke, MT(ASCP)SBB; Thomas A. Lane, MD; Alan H. Lazarus, PhD; German F. Leparc, MD; Douglas M. Lublin, MD, PhD; Dawn Michelle, MT(ASCP)SBB; Kenneth Moise, Jr., MD; S. Breanndan Moore, MD; Tania Motschman, MS, MT(ASCP)SBB, CQA(ASQ); Marilyn K. Moulds, MT(ASCP)SBB; Nancy C. Mullis, MT(ASCP)SBB; Scott Murphy, MD; Patricia Pisciotto, MD; Mark A. Popovsky, MD; Marion E. Reid, PhD, FIBMS; Jennifer F. Rhamy, MBA, MA, MT(ASCP), SBB, HP; Scott D. Rowley, MD; Arell S. Shapiro, MD; R. Sue Shirey, MS, MT(ASCP)SBB; Bruce Spiess, MD, FAHA; Jerry E. Squires, MD, PhD; Marilyn J. Telen, MD; Susan Veneman, MT(ASCP)SBB; Phyllis S. Walker, MS, MT(ASCP)SBB; Dan A. Waxman, MD; Robert Weinstein, MD; Connie M. Westhoff, PhD, MT(ASCP)SBB, Members of AABB committees who reviewed manuscripts as part of committee resource charges; the staff of the Armed Services Blood Program Office; the staff of the US Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research; the staff of the Transplantation and Transfusion Service, McClendon Clinical Laboratories, UNC Hospitals. Special thanks are due to Laurie Munk, Janet McGrath, Nina Hutchinson, Jay Pennington, Frank McNeirney, Kay Gregory, MT(ASCP)SBB, and Allene Carr-Greer, MT(ASCP)SBB of the AABB National Office for providing support to the Program Unit during preparation of this edition.
AABB non responsabile di eventuali errori nella traduzione edizione italiana dicembre 2009
II
Introduction
The 15th edition of the AABB Technical Manual is the first in the second half century of this publication. The original Technical Manual (then called Technical Methods and Procedures) was published in 1953 and the 14th edition marked the 50th anniversary of this publication. Over the years, this text has grown and matured, until today it is a major textbook used by students (medical technology and residents) and practicing health-care professionals (technologists, nurses, and physicians) around the world. Selected editions or excerpts have been translated into French, Hungarian, Italian, Japanese, Spanish, Polish, and Russian. It is one of only two AABB publications that are referenced by name in the AABB Standards for Blood Banks and Transfusion Services (the other being the Circular of Information for the Use of Human Blood Components). All branches of the US Armed Services have adopted the AABB Technical Manual as their respective official manuals for blood banking and transfusion medicine activities. The Technical Manual serves a diverse readership and is used as a technical reference, a source for developing policies and procedures, and an educational tool. The TechnicalManual is often the first reference consulted in many laboratories; thus, it is intended to provide the background information to allow both students and experienced individuals to rapidly familiarize themselves with the rationale and scientific basis of the AABB standards and current standards of practice. As in previous editions, the authors and editors have tried to provide both breadth and depth, including substantial theoretical and clinical material as well as technical details. Due to space limitations, the Technical Manual cannot provide all of the advanced information on any specific topic. However, it is hoped that sufficient information is provided to answer the majority of queries for which individuals consult the text, or at a minimum, to direct someone toward additional pertinent references. Readers should be aware that, unlike most textbooks in the field, this book is subjected to extensive peer review (by experts in specific subject areas, AABB committees, and regulatory bodies such as the Food and Drug Administration). As such, this text is relatively unique, and represents a major effort on the part of the AABB to provide an authoritative and balanced reference source. As in previous recent editions, the content is necessarily limited in order to retain the size of the Technical Manual to that of a textbook that can be easily handled. Nevertheless, readers will find extensive new and updated information, including expanded coverage of quality approaches, apheresis indications, cellular nomenclature, molecular diagnostics, hematopoietic progenitor cell processing, and transfusion-transmitted diseases. Techniques and policies outlined in the Technical Manual are, to the best of the Technical Manual Program Units ability, in conformance with AABB Standards. They are not to be considered the only permissible way in which requirements of Standards can be met. Other methods, not included, may give equally acceptable results. If discrepancy occurs between techniques or suggestions in the Technical Manual and the requirements of Standards, authority resides in Standards. Despite the best efforts of both the Program Unit and the extensive number of outside reviewers, errors may remain in the text. As with previous editions, the Program Unit welcomes suggestions, criticisms, or questions about the current edition. I would like to thank the members of the Technical Manual Program Unit for their dedication and long hours of work that went into updating this edition. I would also like to thank all the AABB committees, the expert reviewers, and the readers who have offered numerous helpful suggestions that helped to make this edition possible. I would particularly like to thank my three associate editors -Gina Leger, Jeanne Linden, and Sue Roseff- who have provided countless invaluable hours in the preparation of this edition. Finally I would like to thank Laurie Munk, AABB Publications Director, whose tireless efforts on behalf of the Technical Manual never cease to amaze me, and who has made the publication of this book a pleasure. This edition is my third and final Technical Manual. I served as associate editor for the 13th edition and chief editor for the 14th and 15th editions. It has been an honor to help shepherd these editions to fruition and it is my hope that the AABB Technical Manual will continue to be one of the AABBs premier publications for decades to come. Mark E. Brecher, MD Chief Editor Chapel Hill, NC
III
Diritti acquisiti per la traduzione fedele da Ortho Clinical Diagnostics, a division of Johnson & Johnson Medical Spa. Traduzione a cura di SIMTI Servizi Srl su incarico di Ortho Clinical Diagnostics, a division of Johnson & Johnson Medical Spa.
Coordinamento editoriale Massimo Ripamonti e Claudio Velati
Traduzione, adattamento e revisione Stefano Antoncecchi Giorgio Assali Francesco Bennardello Pierluigi Berti Isabella Crocco Isabella Ferro Giorgio Gandini Gabriella Girelli Giancarlo Maria Liumbruno Simona Maria Mazza Pierluigi Piccoli Giorgio Reali Nicoletta Revelli Roberto Reverberi Massimo Ripamonti Aurora Vassanelli Claudio Velati Franco Verlicchi Maria Antonietta Villa Elisabetta Vitali si ringrazia SIMTI - Societ Italiana di Medicina Trasfusionale e Immunoematologia
Al momento in cui la versione italiana del Technical Manual va in stampa venuto improvvisamente a mancare Giorgio Reali, che ha grandemente contribuito alla realizzazione di questa opera editoriale. A lui va il nostro pensiero affettuoso e al suo ricordo viene dedicato questo volume.
IV
Prefazione
Nel bagaglio culturale di chi si occupato di Immunoematologia, le attivit scientifiche ed editoriali che fanno capo alla AABB hanno da sempre costituito un punto di riferimento fondamentale per molte ragioni che vanno ricercate nella grande esperienza di un mondo ricco di risorse e di enormi dimensioni, ma anche, e in particolare, per due sostanziali motivi. Il primo la capacit di questa organizzazione di produrre standard operativi e di aggiornarli continuamente alla nuove necessit professionali e scientifiche. Il secondo la produzione del Technical Manual. Il fascino di questo volume dovuto al fatto che raccoglie, in un numero di capitoli che andato crescendo nel tempo, gli elementi teorici dei vari aspetti della Medicina Trasfusionale riuscendo, per, a trattarli in maniera semplice e lineare, abbinandoli a indicazioni pratiche e accompagnandoli a istruzioni operative che hanno costituito, e costituiscono ancora oggi, una guida imprescindibile per tutte le figure professionali impegnate nel Servizio Trasfusionale, anche se vanno rimarcate alcune differenze concettuali ed operative che derivano dal diverso modello organizzativo di riferimento. Queste caratteristiche del Technical Manual avevano indotto, negli anni passati, Ortho Clinical Diagnostics ad acquisire i diritti per proporre al nostro Paese una versione italiana e ci contribu a rendere questo volume ancora pi fruibile e cos popolare da essere presente, almeno in una copia, in tutti i Servizi Trasfusionali italiani. Ma il Technical Manual un prodotto editoriale, per sua stessa natura, dinamico e soggetto a continue revisioni, a nuove edizioni e agli inevitabili aggiornamenti tecnologici, come le versioni su mezzi informatici. Lultima traduzione italiana risale alledizione del 1985. Ci si prefissi di consentire agli operatori del Servizio Trasfusionale italiano di rinnovare il piacere di consultare una recente edizione del Technical Manual potendolo prelevare dalla propria libreria e sfogliare pagina per pagina, senza la difficolt del computer o della lingua inglese. Auguriamo a tutti una buona lettura.
Indice
Indice
Introduzione ......................................................................................................................... III
Organizzazione della qualit

Capitolo 1 - Sistemi qualit Controllo di qualit, garanzia di qualit e gestione della qualit .................................................... Concetti di qualit ..................................................................................................................... Applicazione pratica dei principi della qualit ............................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................ Appendice 1.1 Glossario dei pi comuni termini usati per la qualit .................................. Appendice 1.2 Codici delle norme federali di qualit e relativi riferimenti .......................... Appendice 1.3 Tavole statistiche per la distribuzione binomiale, utilizzate per determinare il numero adeguato di campioni e il livello di confidenza per la validazione dei dati accettati/rifiutati............................................................................... Appendice 1.4 Esempi di valutazioni: utilizzazione del sangue ............................................ Capitolo 2 - Strutture Trasfusionali e sicurezza Strutture ................................................................................................................................. Programma per la sicurezza ................................................................................................. Prevenzione degli incendi .......................................................................................................... Sicurezza elettrica ................................................................................................................... Sicurezza biologica ..................................................................................................................... Sicurezza chimica .................................................................................................................. Sicurezza dalle radiazioni ......................................................................................................... Spedizione di materiali pericolosi ........................................................................................... Gestione dei rifiuti................................................................................................................... Piani per le calamit ............................................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................ Letture consigliate ...................................................................................................................... Appendice 2.1 Norme e raccomandazioni per la sicurezza applicabili in campo sanitario ... Appendice 2.2 Linee guida generali per pratiche di lavoro sicure, dispositivi di protezione individuali e per controlli tecnologici ............................................................ Appendice 2.3 Precauzioni per una sicurezza biologica di livello 2 ................................... Appendice 2.4 Modulo per dati relativi a campioni di sostanze chimiche pericolose ............. Appendice 2.5 Esempio di lista di sostanze chimiche pericolose in una Struttura Trasfusionale.................................................................................................................. Appendice 2.6 Specifiche categorie di sostanze chimiche e come lavorare con queste in modo sicuro ............................................................................................... Appendice 2.7 Risposta a spandimenti accidentali di sostanze chimiche .......................... Appendice 2.8 Gestione delle perdite di materiali chimici pericolosi .................................. Capitolo 3 - Gestione dellutilizzo del sangue Livelli di scorta ideali e minimi ................................................................................................ Determinazione dei livelli di scorta ......................................................................................... 1 3 5 27 29 31
32 35
39 42 46 47 48 57 63 66 66 67 67 69 70 72 76 77 78 80 82 85
87 87
VII
AABB Technical Manual
Fattori che influenzano la scadenza....................................................................................... Miglioramento delle procedure di richiesta sangue nei Servizi Trasfusionali ......................... Problemi riguardanti prodotti speciali .................................................................................... Bibliografia .............................................................................................................................
88 89 91 93
Donazione di sangue e raccolta

Capitolo 4 - Selezione dei donatori e raccolta di sangue Procedura di donazione .............................................................................................................. Raccolta di sangue ................................................................................................................ Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate ....................................................................................................................... Appendice 4.1 Questionario completo sulla storia clinica del donatore ............................... Appendice 4.2 Lista dei farmaci che contemplano sospensioni dalle donazioni ...................... Appendice 4.3 Materiale informativo per il donatore .......................................................... Appendice 4.4 Alcuni farmaci comunemente accettati per le donazioni ............................... Capitolo 5 - Donazione e trasfusione di sangue autologo Raccolta di sangue autologo pre-intervento ........................................................................... Emodiluzione acuta normovolemica ....................................................................................... Raccolta di sangue intra-operatoria............................................................................................. Raccolta post-operatoria di sangue ........................................................................................ Bibliografia ............................................................................................................................ Capitolo 6 - Aferesi Tecniche di separazione .......................................................................................................... Raccolta di emocomponenti ................................................................................................... Aferesi terapeutiche ............................................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Capitolo 7 - Validazione ed etichettatura degli emocomponenti Tipologia delle analisi ................................................................................................................... Etichettatura, registrazioni, quarantena ................................................................................. Bibliografia .................................................................................................................................. Letture consigliate ...................................................................................................................... Capitolo 8 - Raccolta, preparazione, conservazione e distribuzione di componenti ottenuti da donazioni di sangue intero Descrizione degli emocomponenti ......................................................................................... Raccolta ................................................................................................................................. Lavorazioni prima della conservazione .................................................................................. Conservazione ........................................................................................................................ Lavorazioni dopo conservazione ............................................................................................ Ispezione, spedizione, destinazione, distribuzione ................................................................. Controllo di qualit degli emocomponenti .............................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................. Appendice 8.1 Controllo di qualit degli emocomponenti ................................................... 95 102 106 106 108 111 112 113
115 124 127 131 132
137 138 142 154
159 166 169 170
171 173 174 180 185 189 192 194 197
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Indice
Principi di immunologia e genetica

Capitolo 9 - La biologia molecolare in Medicina Trasfusionale Dal DNA allmRNA alle proteine ............................................................................................. I meccanismi genetici che creano il polimorfismo ................................................................... Variabilit genetica ................................................................................................................. Tecniche molecolari ................................................................................................................ Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate ................................................................................................................. Appendice 9.1 Le tecniche molecolari nella Medicina Trasfusionale ................................... Capitolo 10 - La genetica dei gruppi sanguigni I principi fondamentali ........................................................................................................... La genetica e lereditariet .................................................................................................... I tipi di ereditariet .................................................................................................................. Genetica di popolazione .......................................................................................................... La nomenclatura dei gruppi sanguigni ................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Appendice 10.1 Glossario dei termini nella genetica dei gruppi sanguigni ........................... Capitolo 11 - Immunologia La risposta immune ................................................................................................................ Organi del sistema immunitario .............................................................................................. Cellule del sistema immunitario ............................................................................................. Componenti solubili della risposta immune ........................................................................... Immunologia correlata alla Medicina Trasfusionale ............................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate .................................................................................................................. Appendice 11.1 Definizioni di alcuni termini essenziali in immunologia ............................... Capitolo 12 - Le reazioni antigene-anticorpo dei globuli rossi e la loro rivelazione Fattori che influiscono sullagglutinazione eritrocitaria ............................................................ Il potenziamento della rivelazione degli anticorpi ...................................................................... Il test allantiglobulina .............................................................................................................. Altri metodi per rilevare la reazione antigene-anticorpo ........................................................ Bibliografia ............................................................................................................................. 199 203 204 206 216 217 218
219 220 228 232 233 235 236
237 240 240 250 257 261 262 263
266 269 271 275 280
Gruppi sanguigni
Capitolo 13 - I gruppi sanguigni ABO, H, Lewis e gli antigeni strutturali correlati Il sistema ABO .................................................................................................................... Il sistema H ........................................................................................................................... Il sistema Lewis .................................................................................................................... Gli antigeni e gli anticorpi I/i ................................................................................................... Il sistema di gruppo P e gli antigeni ad esso correlati ............................................................ Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate ................................................................................................................ 281 295 296 298 300 303 304
IX
Capitolo 14 - Il sistema Rh Lantigene D e il suo contesto storico .................................................................................... Considerazioni genetiche e biochimiche ............................................................................... Terminologia Rh ...................................................................................................................... Esami sierologici per lespressione degli antigeni Rh ............................................................. Il D debole ............................................................................................................................... Altri antigeni Rh ..................................................................................................................... La sindrome da Rhnull e altri tipi di delezioni ........................................................................... Anticorpi Rh .......................................................................................................................... Tipizzazione Rh ..................................................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate .................................................................................................................. Capitolo 15 - Altri gruppi sanguigni La distribuzione degli antigeni .................................................................................................. Sistema MNS ......................................................................................................................... Sistema Kell ........................................................................................................................... Sistema Duffy .......................................................................................................................... Sistema Kidd .......................................................................................................................... Altri sistemi gruppoematici eritrocitari .................................................................................... Raccolte gruppoematiche eritrocitarie ................................................................................... Antigeni eritrocitari ad alta frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a raccolte ...... Antigeni eritrocitari a bassa frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a raccolte .... Anticorpi specifici per antigeni a bassa frequenza ..................................................................... Bibliografia .............................................................................................................................. Lettura consigliate .................................................................................................................. Capitolo 16 - Gli antigeni e gli anticorpi delle piastrine e dei granulociti Antigeni delle piastrine .......................................................................................................... Antigeni dei granulociti ........................................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Capitolo 17 - Il sistema HLA Genetica del complesso maggiore di istocompatibilit .......................................................... Biochimica, distribuzione tessutale e struttura ......................................................................... Nomenclatura ........................................................................................................................ Funzione biologica ................................................................................................................. Individuazione degli antigeni e degli alleli HLA ....................................................................... Sistema HLA e trasfusione .................................................................................................... Sistema HLA e trapianti ......................................................................................................... Test di paternit e altre indagini forensi ................................................................................... HLA e malattie ........................................................................................................................ Bibliografia .............................................................................................................................. Letture consigliate ...................................................................................................................
305 306 308 309 311 313 315 316 317 321 323
325 327 330 333 335 337 345 346 347 347 348 350
351 367 373
375 379 380 382 383 386 388 390 390 391 393
Indice
Sierologia e Medicina Trasfusionale

Capitolo 18 - Esami pre-trasfusionali Richieste trasfusionali ............................................................................................................... Campioni di sangue................................................................................................................ Indagini sierologiche ............................................................................................................... Prove di compatibilit ............................................................................................................. Interpretazione dei risultati dei test di ricerca anticorpale e delle prove di compatibilit ............... Etichettatura e consegna del sangue compatibile .................................................................. Selezione delle unit da trasfondere ..................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Letture consigliate ................................................................................................................. Capitolo 19 - Scoperta ed identificazione degli alloanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari Significato clinico degli alloanticorpi ...................................................................................... Procedure generali ................................................................................................................ Tecniche sierologiche di base per lidentificazione anticorpale ............................................... Problemi complessi di identificazione anticorpale .................................................................. Selezione del sangue per la trasfusione ...................................................................................... Procedure sierologiche particolari ......................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................ Letture consigliate .................................................................................................................. Capitolo 20 - Il test allantiglobulina diretto positivo e la distribuzione immuno-mediata delle emazie Il test allantiglobulina diretto ................................................................................................... Emolisi immuno-mediata ....................................................................................................... Problemi sierologici con gli autoanticorpi ............................................................................... Anemia immuno-emolitica indotta da farmaci ....................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................ Letture consigliate ................................................................................................................. Appendice 20.1 Un esempio di algoritmo per le indagini su un TAD positivo (escludendo le immagini per la MEFN) ................................................................................ Appendice 20.2 Alcuni farmaci associati allemolisi immune e/o al TAD positivo determinato da anticorpi farmaco indotti ........................................................................ 395 397 398 401 404 404 406 408 409
411 412 415 419 428 431 438 440
442 445 456 460 465 467 468 469
Considerazioni cliniche nella pratica trasfusionale

Capitolo 21 - Pratica trasfusionale Trasfusione di globuli rossi .................................................................................................... Trasfusione di piastrine ........................................................................................................... Trasfusioni di granulociti ............................................................................................................ Emocomponenti cellulari speciali .......................................................................................... Reintegro dei fattori della coagulazione ................................................................................ Trasfusione di crioprecipitato di fattore anti-emofilico ........................................................... La trasfusione in particolari situazioni .................................................................................... 473 477 481 482 483 490 497
XI
Alternative farmacologiche alla trasfusione ........................................................................... Supervisione della pratica trasfusionale ................................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................ Capitolo 22 - Assegnazione e trasfusione di sangue e di emocomponenti Eventi che precedono la consegna ......................................................................................... Consegna e trasporto del sangue .......................................................................................... Eventi che precedono la trasfusione ...................................................................................... Trasfusione di sangue ............................................................................................................. Eventi che seguono la trasfusione ......................................................................................... Garanzia di qualit ................................................................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................ Capitolo 23 - Problemi perinatali nella pratica trasfusionale Malattia emolitica del feto e del neonato ................................................................................ Trombocitopenia neonatale alloimmune ................................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................ Capitolo 24 - Pratica trasfusionale in neonatologia e pediatria Eritropoiesi fetale e neonatale ............................................................................................... Aspetti specifici della fisiologia neonatale ............................................................................... Infezione da citomegalovirus ................................................................................................. Trasfusione eritrocitaria nei bambini di et inferiore ai 4 mesi................................................ Trasfusione di altri emocomponenti ....................................................................................... Policitemia neonatale ............................................................................................................. Ossigenazione extracorporea a membrana ........................................................................... Leucoriduzione ...................................................................................................................... Pratiche trasfusionali nei bambini di et superiore ai 4 mesi................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Capitolo 25 - Terapia cellulare e trapianti di cellule Malattie trattate con trapianto di CSE .................................................................................... Fonti di CPE ........................................................................................................................... Idoneit del donatore ............................................................................................................. Raccolta dei prodotti ............................................................................................................... Manipolazioni sulle cellule progenitirici ematopoietiche .......................................................... Congelamento e conservazione ............................................................................................. Trasporto e spedizione .......................................................................................................... Scongelamento e infusione .................................................................................................... Valutazione e controllo di qualit dei prodotti ematopoietici ................................................... Normative .............................................................................................................................. Standard ................................................................................................................................. Bibliografia ............................................................................................................................. Capitolo 26 - Il trapianto di organi e tessuti Le malattie trasmissibili con il trapianto e le misure preventive ................................................. Le banche dellosso ...............................................................................................................
500 503 503
509 512 513 515 519 519 519
523 538 541
545 546 549 550 555 559 559 560 561 564
571 571 577 578 583 591 594 594 595 595 596 596
606 610
XII
Indice
Le banche della cute .............................................................................................................. Le valvole cardiache .............................................................................................................. Le registrazioni dei tessuti conservati per gli allotrapianti ........................................................ Regolamentazioni FDA sui tessuti ........................................................................................... Limportanza della compatibilit ABO .................................................................................... Il ruolo della trasfusione nel trapianto del rene ...................................................................... Il trapianto di fegato ............................................................................................................... Trapianto di altri organi .......................................................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................. Capitolo 27 - Le complicanze non infettive della trasfusione di sangue Manifestazioni ......................................................................................................................... Reazioni trasfusionali acute ................................................................................................... Valutazione di una sospetta reazione trasfusionale acuta ..................................................... Le conseguenze ritardate della trasfusione ........................................................................... Le registrazioni delle complicanze trasfusionali ..................................................................... Bibliografia ............................................................................................................................ Capitolo 28 - Le malattie trasmesse con la trasfusione Lepatite ................................................................................................................................. I virus dellimmunodeficienza umana ..................................................................................... I virus linfotropici umani per le cellule T ................................................................................... Il West Nile virus ...................................................................................................................... Gli herpesvirus e i parvovirus ................................................................................................ Le encefalopatie spongiformi trasmissibili ............................................................................. La contaminazione batterica .................................................................................................. La sifilide ............................................................................................................................... Le infezioni trasmesse dalle zecche ....................................................................................... Altre complicanze infettive non virali della trasmissione del sangue ....................................... La riduzione del rischio di trasmissione di malattie infettive .................................................... Bibliografia ............................................................................................................................ Letture consigliate ...................................................................................................................
611 613 613 614 614 615 615 617 618
621 627 640 644 649 650
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Metodi
Metodi introduzione ............................................................................................................ Metodi sezione 1 - Generalit sui metodi di laboratorio Introduzione .......................................................................................................................... Metodo 1.1 Spedizione e trasporto di materiali pericolosi ................................................... Metodo 1.2 Trattamento di campioni parzialmente coagulati ............................................. Metodo 1.3 Preparazione delle soluzioni - Istruzioni .......................................................... Metodo 1.4 Diluizione di sieri .............................................................................................. Metodo 1.5 Soluzioni a diluizioni percentuali ...................................................................... Metodo 1.6 Preparazione di una sospensione eritrocitaria al 3% ....................................... Metodo 1.7 Preparazione e impiego di una soluzione tamponata ai fosfati ........................ Metodo 1.8 Lettura e graduazione di una agglutinazione in provetta .................................. 701
703 704 710 710 712 713 713 714 715
XIII
Metodi sezione 2 - Tipizzazioni eritrocitarie Metodo 2.1 Test su vetrino per la determinazione su globuli rossi del gruppo ABO ............ Metodo 2.2 Test in provetta per la determinazione del gruppo ABO su globuli rossi e su siero ................................................................................................... Metodo 2.3 Test in micropiastre per la determinazione del gruppo ABO su globuli rossi e su siero ...................................................................................................... Metodo 2.4 Confermare un sottogruppo debole di A o di B con tecniche di assorbimento/eluizione .................................................................................. Metodo 2.5 Test sulla saliva per le sostanze gruppo specifiche A, B, H, Lea e Leb .............. Metodo 2.6 Determinazione dellantigene Rh D su vetrino ............................................ Metodo 2.7 Determinazione dellantigene Rh D in provetta .......................................... Metodo 2.8 Determinazione dellantigene Rh D in micropiastra .................................... Metodo 2.9 Indagini per il D debole ..................................................................................... Metodo 2.10 Preparazione e uso di lectine ........................................................................... Metodo 2.11 Uso di reagenti sulfuridici per disperdere le autoagglutinazioni .................. Metodo 2.12 Eluizione delicata al calore per tipizzare globuli rossi con TAD positivo ......... Metodo 2.13 Distacco di IgG con clorochina per la tipizzazione antigenica di globuli rossi con TAD positivo ................................................................................................................... Metodo 2.14 Metodo alla glicina acida/EDTA per rimuovere anticorpi dai globuli rossi ...... Metodo 2.15 Separazione con centrifugazione semplice dei globuli rossi trasfusi da quelli autologhi ....................................................................................................................................... Metodo 2.16 Separazione dei globuli rossi trasfusi da quelli autologhi appartenenti a pazienti con emoglobina S ................................................................................................ Metodi sezione 3 - Ricerca e identificazione di anticorpi e test sierologici di compatibilit Metodo 3.1 Test di compatibilit con centrifugazione immediata per evidenziare unincompatibilit ABO ............................................................................... Metodo 3.2 Test allantiglobulina indiretto per lindividuazione di anticorpi eritrocitari ... Metodo 3.3 Tecnica di preriscaldamento ....................................................................... Metodo 3.4 Sostituzione con fisiologica per individuare alloanticorpi in presenza di impilati ........................................................................................................... Metodo 3.5 Tecniche enzimatiche .................................................................................. Metodo 3.6 Test allantiglobulina diretto ......................................................................... Metodo 3.7 Titolazione degli anticorpi ........................................................................... Metodo 3.8 Uso di reagenti sulfidrilici per distinguere gli anticorpi IgM da quelli IgG ...... Metodo 3.9 Inibizione con plasma per distinguere gli anticorpi anti-Ch e anti-Rg dagli anticorpi con caratteristiche HTLA ............................................................... Metodo 3.10 Trattamento di globuli rossi con ditiotreitolo ................................................ Metodo 3.11 Neutralizzazione dellanti-Sda con lurina .................................................... Metodo 3.12 Procedure di assorbimento ........................................................................ Metodo 3.13 Uso del programma americano di donatori rari .......................................... Metodi sezione 4 - Indagini su un test allantiglobulina diretto positivo Techniche di eluizione ............................................................................................................ Metodo 4.1 Eluizione acida a freddo ............................................................................. Metodo 4.2 Eluizione alla glicina-HCI/EDTA .................................................................. Metodo 4.3 Eluizione al calore ......................................................................................
717 718 719 720 721 723 724 725 726 727 728 729 730 731 732 733
735 736 738 739 739 743 744 746 748 749 750 751 751
753 753 754 755
XIV
Indice
Metodo 4.4 Eluizione (congelamento/scongelamento) tramite Lui..................................... Metodo 4,5 Eluizione al diclorometano ........................................................................... Metodi per ricerche relative ad anemie emolitiche immunologiche ........................................ Metodo 4.6 Autoassorbimento a freddo ........................................................................ Metodo 4.7 Determinazione della specificit di autoagglutinine fredde .......................... Metodo 4.8 Titolazione delle agglutinine fredde ............................................................ Metodo 4.9 Assorbimento autologo di autoanticorpi reattivi a caldo .................................. Metodo 4.10 Assorbimento selettivo a caldo usando globuli rossi allogenici trattati con enzimi o con ZZAP ..................................................................................... Metodo 4.11 Assorbimento allogenico con un campione di una sola cellula trattata con enzimi o con ZZAP ....................................................................................... Metodo 4.12 Assorbimento con polietilenglicole ................................................................ Metodo 4.13 Il test di Donath-Landsteiner ...................................................................... Metodo 4.14 Individuazione di anticorpi anti-penicillina o anti-cefalosporine analizzando globuli rossi trattati con farmaci ...................................................................... Metodo 4.15 Dimostrazione della formazione di immunocomplessi indotti da farmaci ... Metodo 4.16 Dimostrazione ex-vivo di complessi farmaco anti-farmaco ........................ Metodi sezione 5 - Malattia emolitica del feto e del neonato Metodo 5.1 Test delle rosette per lemorragia feto-materna ............................................. Metodo 5.2 Test di eluizione acida (Test di Kleihauer-Betke, modificato) ....................... Metodo 5.3 Titolazione di anticorpi per la precoce individuazione di una malattia emolitica del feto e del neonato ................................................................................. Metodi sezione 6 - Prelievo di sangue, conservazione e preparazione di emocomponenti Metodo 6.1 Metodica al solfato di rame al fine di controllare i donatori per anemia ...... Metodo 6.2 Preparazione del braccio per la raccolta del sangue .................................. Metodo 6.3 Flebotomia e prelievo di campioni per i test di validazione e di compatibilit .......................................................................................... Metodo 6.4 Preparazione di concentrati eritrocitari ....................................................... Metodo 6.5 Preparazione di concentrati eritrocitari leucoridotti prima della conservazione (Pre-storage) .............................................................................................. Metodo 6.6 Ringiovanimento dei gobuli rossi ................................................................ Metodo 6.7 Crioconservazione di globuli rossi impiegando glicerolo ad alta concentrazione. Metodologia Meryman ...................................................... Metodo 6.8 Crioconservazione di globuli rossi impiegando glicerolo ad alta concentrazione. Metodica di Valeri............................................................. Metodo 6.9 Valutazione delladeguatezza della glicerolizzazione dei globuli rossi ............ Metodo 6.10 Preparazione di plasma fresco congelato da unit di sangue intero ........... Metodo 6.11 Preparazione di crioprecipitato anti-emofilico da sangue intero ................. Metodo 6.12 Scongelare e riunire crioprecipitati AHF ..................................................... Metodo 6.13 Preparazione di unit piastriniche partendo da sangue intero ................... Metodo 6.14 Preparazioni di piastrine ottenute da sangue intero e leucoridotte prima della conservazione ...................................................................................... Metodo 6.15 Rimozione del plasma (riducendone il volume) dai concentrati piastrinici ...
756 756 757 757 758 760 760 762 763 764 765 766 768 769
773 774 775
779 780 781 783 784 785 786 788 791 791 792 793 794 795 795
XV
Metodi sezione 7 - Controlli di qualit Metodo 7.1 Controllo di qualit per la soluzione di solfato di rame ............................... Metodo 7.2 Standardizzazione e calibrazione dei termometri ........................................ Metodo 7.3 Controllo degli allarmi degli apparecchi di conservazione del sangue ........ Metodo 7.4 Calibrazione funzionale delle centrifughe impiegate per la separazione di piastrine ...................................................................................................... Metodo 7.5 Calibrazione funzionale di una centrifuga per test sierologici ...................... Metodo 7.6 Analisi delle prestazioni di lavacellule automatiche ................................... Metodo 7.7 Monitoraggio delle conte cellulari negli emocomponenti da aferesi .............. Metodo 7.8 Metodica manuale per contare i globuli bianchi residui nel sangue e negli emocomponenti leucoridotti .......................................................................
797 798 800 803 805 807 808 808
Appendici
Appendice 1 Appendice 2 Appendice 3 Appendice 4 Appendice 5 Appendice 6 Appendice 7 Appendice 8 Appendice 9 Appendice 10 Valori normali negli adulti ................................................................................ Selezione di valori normali nei bambini ........................................................ Tipici valori normali net test di emostasi e coagulazione (adulti) .................... Fattori della coagulazione nei concentrati piastrinici ................................... Valori normali approssimativi dei volumi di eritrociti, di plasma e di sangue totale............................................................................................................. Antigeni gruppoematici ascritti a sistemi ...................................................... Esempi di termini per geni, antigeni e fenotipi .............................................. Esempi di terminologia corretta e scorretta ................................................. Distribuzione dei fenotipi ABO/Rh per razza o etnia ...................................... Intervalli di tempo consigliati per i controlli di qualit ..................................... 811 812 813 814 815 816 820 820 821 822
XVI
Capitolo 1: Sistemi qualit
Capitolo 1
Sistemi qualit
Un obiettivo principale delle Banche del Sangue e dei Servizi Trasfusionali promuovere elevati standard di qualit in tutti gli aspetti che riguardano produzione, cura dei pazienti e attivit di servizio. Questo impegno alla qualit si rispecchia negli standard emessi dallAABB1(p1). Un sistema qualit comprende: struttura organizzativa, responsabilit, politica, processi, procedure e risorse assicurate dalla direzione per ottenere qualit1(p1). Un glossario sui termini usati in questo capitolo si trova nellAppendice 1.1. Ladozione di un programma formale di garanzia di qualit richiesta per legge nelle CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments) dei Centri per i Servizi di Assistenza Medica (CMS, Centres for Medicare and Medicaid Services)2 e dalle norme correnti di Buona Prassi di Produzione (cGMP, current Good Manufactoring Practice) della FDA (Food and Drug Administration)3-5. Le normative FDA contemplate al punto 21 del Codice Federale di Regolamentazione (CFR) numero 211.22 richiedono un controllo di qualit (CdQ) indipendente o lesistenza di ununit di gestione della qualit che abbia la responsabilit sulla qualit complessiva del prodotto finito e lautorit di controllo sui processi che possono influenzare il prodotto (vedi i riferimenti CFR, citate nellAppendice 1.2). Anche organizzazioni professionali e di accreditamento, quali lAABB, la Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations6, il College of American Pathologists (CAP)7 e il Clinical and Laboratory Standards (CLS), precedentemente noto come NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards)8 hanno stabilito requisiti e linee guida in materia di qualit. Le norme ISO 9001 sui sistemi di gestione della qualit, emanate dallOrganizzazione Internazionale per la Standardizzazione (ISO, International Organization for Standardization), sono genericamente rivolte a ogni tipo di impresa e e descrivono gli elementi-chiave di un sistema qualit 9. Inoltre, gli Health Care Criteria for Performance Excellence10, pubblicate dal Baldrige National Quality Program, forniscono unottima base per realizzare qualit a livello organizzativo. LAABB definisce nei QSEs (Quality System Essentials) gli elementi minimi che devono essere presi in considerazione dai sistemi qualit delle Banche del Sangue e dei Servizi Trasfusionali11. I QSEs dellAABB sono stati redatti in modo da essere compatibili con gli standard ISO 9001 e con le linee guida FDA per la garanzia di qualit nelle Strutture Trasfusionali5. La Tabella 1.1 mostra un quadro comparativo dei requisiti QSEs dellAABB e di quelli ISO 9001:2000.
Controllo di qualit, garanzia di qualit e gestione della qualit

Lo scopo del controllo di qualit (CdQ) di fornire informazioni di ritorno agli operatori circa la situazione di un processo in corso. Indica agli operatori se il processo pu continuare (tutto accettabile) o se si deve sospendere, sino a che gli eventuali problemi non siano stati risolti (si evidenziato qualcosa fuori controllo). Un controllo
Tabella 1.1 - Quadro comparativo dei dati fondamentali del sistema qualit AABB (QSEs) e delle categorie ISO 9001* QSEs Organizzazione AABB ISO 9001:2000 4.1 Requisiti generali 5.1 Responsabilit della direzione 5.2 Attenzione focalizzata al cliente 5.3 Politica della qualit 5.4 Pianificazione 5.5 Responsabilit, autorit e comunicazione 5.6 Riesame da parte della direzione 6.1 Messa a disposizione delle risorse 6.2 Risorse umane 6.3 Infrastrutture 7.6 Tenuta sotto controllo dei diaspositivi di monitoraggio e misurazione 7.2 Processi relative ai clienti 7.4 Approvvigionamento 7.1 Pianificazione della realizzazione del prodotto 7.2 Progettazione e/o sviluppo 7.5 Produzione ed erogazione di servizi 4.2 Requisiti della documentazione 8.3 Tenuta sotto controllo dei prodotti non conformi
Risorse
Apparecchiature
Problemi di fornitori e clienti
Controllo delle procedure
Documentazioni e registrazioni Deviazioni, non conformit, complicazioni Verifiche: interne ed esterne
8.2 Misurazioni e monitoraggi 8.4 Analisi dei dati 8.1 Generalit 8.3 Analisi dei dati 8.6 Miglioramento 6.3 Infrastrutture 6.4 Ambiente di lavoro
Miglioramento dei processi
Strutture e sicurezza
* La tabella rappresenta soltanto una modalit di comparazione fra i due sistemi.
di qualit di prodotto viene eseguito per verificare se il prodotto stesso o il servizio sono conformi alle specifiche. Storicamente, le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali hanno impiegato molte misurazioni di CdQ, quali pratiche standard nelle loro attivit operative. Gli esempi riguardano i CdQ dei reagenti, il controllo degli errori di trascrizione, le ispezioni visive, i dati dei registratori delle temperature dei frigoriferi, i volumi e le conte cellulari sugli emocomponenti finiti. Le attivit relative alla garanzia di qualit non sono direttamente legate alle prestazioni effettive di un processo. Esse comprendono la revisione retrospettiva e le analisi sui dati delle prestazioni operative, per determinare se il processo complessivo sotto controllo e per evidenziare deviazioni o tendenze che meritano attenzione. La garanzia di qualit fornisce a chi gestisce i processi informazioni sui livelli di prestazione, che possono essere usate per stabilire priorit al fine di migliorare i processi medesimi. Gli esempi riguardanti le attivit trasfusionali riguardano la revisione delle registrazioni, il monitoraggio degli indicatori di qualit e le verifiche interne. La gestione della qualit prende in considerazione le correlazioni fra i processi nel contesto dellorganizzazione le loro relazioni con clienti e i fornitori. Essa sottolinea il ruolo-guida della direzione nel creare un diffuso orientamento verso la qualit in tutta lorganizzazione, nel coinvolgere fornitori e clienti quali partner nella qualit, nella gestione delle risorse umane e non e nel pianificare la qualit. Lapproccio ai sistemi di gestione per la qualit descritto in questo capitolo comprende tutte queste attivit. Esso assicura lapplicazione dei principi della qualit allintera organizzazione e riflette la mutata focalizzazione del punto di attenzione, dalla rilevazione dellerrore alla sua prevenzione, degli sforzi tesi alla qualit.
Concetti di qualit
La trilogia della qualit di Juran La trilogia della qualit di Juran un esempio di approccio alla gestione della qualit. Questo
modello individua tre processi fondamentali per la gestione della qualit in ogni organizzazione: pianificazione, controllo, miglioramento12(p2.5). Il processo di pianificazione, per un nuovo prodotto o per un nuovo servizio, comprende le attivit per identificare i requisiti, per sviluppare le specifiche di prodotto e di processo atte soddisfare tali requisiti, e per progettare i processi. Durante la fase di pianificazione, la struttura deve eseguire i seguenti passaggi: 1. stabilire gli obiettivi di qualit del progetto; 2. identificare i clienti; 3. determinare le necessit e le aspettative dei clienti; 4. elaborare le specifiche di prodotti e servizi per soddisfare le richieste del cliente e i requisiti operativi, normativi e di accreditamento; 5. sviluppare processi operativi per la produzione e la consegna, che comprendano procedure scritte e necessit di risorse; 6. sviluppare controlli di processo e convalidare il processo in ambito operativo. I risultati della pianificazione vengono indicati come design output (elementi in uscita della progettazione)5. Una volta rese effettive, il processo di controllo fornisce un riscontro retrospettivo delle operazioni, che comprende i seguenti aspetti: 1. valutazione delle prestazioni effettive; 2. confronto fra le prestazioni e gli obiettivi; 3. azioni per correggere ogni discrepanza fra le due. Il processo rivolto al controllo degli elementi in ingresso (input), della produzione, della consegna dei prodotti e dellerogazione dei servizi, per verificare se soddisfino le specifiche. Il controllo di processo dovrebbe mettere il personale operativo in una condizione di auto-controllo, cosicch possano riconoscere quando le cose stanno andando male, se siano da attuare appropriate correzioni per assicurare la qualit del prodotto oppure si debba arrestare il processo. Uno scopo importante della gestione della qualit quello di stabilire una serie di controlli che assicurino la qualit del processo e dei prodotti, pur senza essere eccessivi. I controlli che non hanno valore aggiunto dovrebbero essere eliminati, per preservare risorse limitate e per
consentire al personale di concentrare la propria attenzione sui controlli critici per quelloperazione. Strumenti statistici, quali la misura delle capacit del processo o luso di grafici di controllo, consentono alla struttura di valutare le prestazioni del processo, durante la pianificazione e durante le operazioni. Tali strumenti aiutano a determinare se un processo stabile (per esempio, se sotto controllo statistico) e se in grado di soddisfare le specifiche dei prodotti e dei servizi erogati12(p22,19). Per miglioramento della qualit si intende il raggiungimento di un livello pi alto delle prestazioni, sia creando nuovi o migliori caratteristiche che aggiungano valore, sia eliminando i difetti esistenti nei processi, nei prodotti o nei servizi. Le opportunit per migliorare possono essere correlate: ai difetti insiti nel progetto iniziale, a elementi imprevisti che si evidenziano durante le fasi di realizzazione, a cambiamenti nelle necessit dei clienti, a modificazioni nelle materie prime, nei fattori ambientali o in altre variabili che possono influenzare il processo. I miglioramenti debbono essere basati su unanalisi guidata dai dati; per questo processo fondamentale sviluppare un programma continuativo di valutazione e verifica. Approccio per processi Nella sua forma pi generica, un processo comprende tutte le risorse e le attivit che trasformano una elemento in ingresso (input) in un elemento in uscita (output). Comprendere come gestire e controllare i processi in una Banca del Sangue o in un Servizio Trasfusionale si basa sulla semplice equazione: elemento in ingresso (input) processo elemento in uscita (output) Per esempio, un processo-chiave per un Centro di Raccolta sangue rappresentata dalla selezione del donatore. Linput comprende: 1) il soggetto che si presenta per la donazione e 2) tutti le risorse per la valutazione della sua salute. Tramite una serie di attivit che includono la verifica dellidoneit (basata sui risultati delle precedenti donazioni, una semplice visita
preliminare e su un questionario anamnestico), un soggetto viene giudicato idoneo. Loutput sia che il donatore idoneo possa adire al passo successivo (cio, alla donazione) sia che venga giudicato non idoneo e, quindi, scartato. Quando il processo di selezione risulta nello scarto di un donatore, le risorse (input) impegnate in questo processo vengono sprecate e contribuiscono al costo a carico della gestione della qualit. Un mezzo, con il quale le Strutture Trasfusionali cercano di minimizzare tale costo, di istruire i candidati donatori prima che siano sottoposti alla valutazione del loro stato di salute, cosicch quelli non idonei non entrino nel processo di selezione. Le strategie per gestire un processo dovrebbero prendere in considerazione ogni suo componente, comprese le attivit interconnesse, gli input, gli output e le risorse. La qualificazione dei fornitori, gli accordi formali, la verifica delle forniture e il controllo delle scorte sono tutte strategie che assicurano che gli input di un processo soddisfino le specifiche. Laddestramento del personale e la verifica della sua competenza, la manutenzione e il controllo delle apparecchiature, la gestione dei documenti e delle registrazioni e lintroduzione di appropriati controlli di processo danno assicurazione che il processo operer come desiderato. I controlli e le ispezioni sul prodotto finale, le informazioni di ritorno da parte dei clienti e la misurazione dei risultati forniscono informazioni che aiutano a valutare la qualit dei prodotti e a migliorare i processi nel loro insieme. Queste misurazioni degli output e gli indicatori di qualit sono utilizzati per valutare lefficacia del processo e il fatto che i processi siano tenuti sotto controllo. Per gestire un sistema di processi in modo efficace, la struttura deve comprendere come essi interagiscano ed ogni relazione causa-effetto fra loro. Nel precedente esempio della selezione di un donatore, le conseguenze di accettare un volontario non idoneo si riflette su quasi tutti gli altri processi. Un esempio potrebbe essere quello di un soggetto, con comportamenti ad alto rischio, non identificato durante la selezione. Il prodotto donato pu risultare positivo ad uno dei test sui marcatori virali, innescando tutta una serie di test
successivi, di indagini retrospettive e procedure di scarto del donatore e notifica di non idoneit. Gli emocomponenti debbono essere posti in quarantena e la loro eliminazione deve essere documentata. Tutto il personale coinvolto nella raccolta e nella lavorazione dellemocomponente a rischio di essere stato esposto ai patogeni. Una parte della pianificazione della qualit di identificare tali relazioni, cosicch da poter assumere rapide e appropriate azioni correttive, se il controllo sui processi fallisce. importante ricordare che i processi operativi non comprendono soltanto la produzione di un componente o la creazione di un servizio, ma riguardano anche la consegna di un prodotto o lerogazione di un servizio. Essi generalmente comportano linterazione con il cliente. La qualit di questa transazione cruciale per la soddisfazione del cliente e non dovrebbe esser trascurata nella pianificazione e nella continuativa rivalutazione del sistema qualit. Il servizio rispetto alla produzione I principi della qualit si applicano, allo stesso modo, ad un ampio spettro di attivit, da quelle coinvolte nella trasformazione e nella produzione a quelle che riguardano i reciproci rapporti fra persone nell erogazione di un servizio. Tuttavia, possono essere appropriate strategie diverse, quando vi sono aspettative differenti in riferimento alla soddisfazione del cliente. Mentre nel processo di produzione lenfasi cade sul minimizzare le variazioni per ottenere un prodotto che corrisponda, in maniera costante, alle specifiche, i processi relativi ai servizi richiedono una certa flessibilit, per adeguarsi alle necessit del cliente ed alle circostanze presenti al momento dellinterazione con il cliente. Nella produzione, il personale necessita di conoscere come mantenere uniformit nelle attivit giorno per giorno. Nel servizio, il personale deve essere abile nelladattare il servizio stesso in modo che soddisfi le aspettative del cliente, senza compromettere la qualit. Per ottenere ci, il personale deve possedere sufficiente conoscenza e comprensione delle interrelazioni fra i processi, per giudicare in modo appropriato e indipendente
o avere un rapido accesso a chi prende le decisioni ad un livello superiore. Quando si programmano sistemi di qualit per i processi produttivi, utile pensare al processo come a una guida, con persone che sovrintendono ed il supporto necessario per mantenere tale processo funzionante, in modo armonico ed efficace. Nei servizi, il centro dellinteresse rappresentato dalle persone; i pertinenti processi forniscono le fondamenta che permettono al personale di fornire servizi sicuri ed efficienti, in grado di soddisfare le necessit dei clienti, in pressoch tutte le situazioni. Gestione della qualit come scienza in evoluzione importante ricordare che la gestione della qualit una scienza in evoluzione. I principi e gli strumenti attualmente in uso muteranno quando la ricerca fornir nuove conoscenze sul comportamento organizzativo, quando la tecnologia fornir nuove soluzioni e quando la Medicina Trasfusionale affronter nuove sfide. Verifiche periodiche dei sistemi di gestione della qualit aiuteranno a identificare le pratiche non pi efficaci o che potrebbero essere migliorate con limpiego di nuove tecnologie e nuovi strumenti.
Applicazione pratica dei principi della qualit

Quanto segue in questo capitolo discute gli elementi di un sistema qualit e lapplicazione pratica dei principi della qualit alle Banche del Sangue ed ai Servizi Trasfusionali. Questi elementi di base comprendono: gestione organizzativa; risorse umane; relazioni con clienti e fornitori; gestione delle apparecchiature; gestione dei processi; documenti e registrazioni; deviazioni e non conformit di prodotti e servizi; monitoraggio e verifica; miglioramento dei processi; ambiente di lavoro.
Gestione organizzativa La struttura dovrebbe essere organizzata in modo da promuovere lefficace realizzazione e la gestione del proprio sistema qualit. La struttura dellorganizzazione devessere documentata e debbono essere chiaramente definite le responsabilit sullapprovvigionamento di sangue, di emocomponenti, di prodotti e di servizi. Tale documentazione dovrebbe includere la descrizione dei reciproci rapporti e delle modalit di comunicazione fra le unit organizzative e quelle responsabili per le funzioni-chiave della qualit. Ogni servizio deve definire la propria struttura nella forma che pi si addice alla propria operativit. vantaggioso, a tale scopo, creare diagrammi od organigrammi, che illustrino la struttura e rapporti fra le sue parti. La struttura deve definire, per iscritto, lautorit e le responsabilit della direzione, relative alla creazione e al mantenimento del sistema qualit. Tutto ci comprende la supervisione delle operazioni e la conformit alle norme di legge e di accreditamento, nonch i riesami periodici e la valutazione sullefficacia del sistema qualit. Per il successo del programma che persegue gli scopi, gli obiettivi e le politiche del sistema qualit, cruciale il supporto della direzione. La direzione deve partecipare alla revisione e allapprovazione delle politiche della qualit e tecniche, dei processi e delle procedure. Chi designato a sovrintendere alle funzioni relative alla qualit della struttura deve fare riferimento direttamente alla direzione. Questa persona ha la responsabilit di coordinare, monitorare e facilitare le attivit del sistema qualit e ha lautorit di raccomandare e dare inizio ad azioni correttive, se appropriate5. Il soggetto designato non deve necessariamente svolgere, di persona, tutte le funzioni relative alla qualit. Da un punto di vista ideale, questa persona dovrebbe essere indipendente dalle funzioni operative di un Centro Donatori o di un Servizio Trasfusionale. Nelle strutture piccole, tuttavia, ci pu non essere sempre possibile. In relazione alle dimensioni e agli scopi dellorganizzazione, la persona designata alla supervisione, pu lavorare in un dipartimento (per esempio, in un Servizio
Trasfusionale), pu avere responsabilit che spaziano in diverse aree (per esempio, nellintero ambito di un laboratorio) o pu avere a disposizione un gruppo di operatori (per esempio, ununit per la qualit) o essere parte di ununit che si occupa di unintera organizzazione (per esempio, lufficio per la gestione della qualit di un intero ospedale). Le persone con doppia responsabilit (sulla qualit e operativa) non dovrebbero sovrintendere alla qualit di ci che hanno personalmente eseguito (21 CFR 211.194). Le funzioni di supervisione della qualit sono le seguenti5: revisione e approvazione delle Procedure Operative Standard (SOP, Standard Operating Procedures) e dei programmi di addestramento; revisione e approvazione dei programmi di validazione e dei risultati; revisione e approvazione del controllo di documenti e dei sistemi di registrazione; verifica ispettiva delle funzioni operative; elaborazione di criteri per i sistemi di valutazione; revisione e convalida dei fornitori; revisione e convalida delle specifiche di prodotto, cio dei requisiti che i prodotti utilizzati nella lavorazione, nella distribuzione o nella trasfusione di sangue e di emocomponenti debbono possedere; revisione e segnalazione delle reazioni avverse, delle deviazioni nel processo produttivo, dei prodotti e dei servizi non conformi e dei reclami dei clienti; partecipazione alle decisioni per determinare lidoneit di sangue ed emocomponenti al loro uso, alla loro distribuzione o alla loro eliminazione; revisione e approvazione dei piani delle azioni correttive; sorveglianza sui problemi (per esempio, segnalazioni di errori, difetti nelle ispezioni, reclami dei clienti) e sullefficacia delle azioni correttive attuate per risolverli; uso delle risorse informative per identificare le tendenze e i potenziali problemi, prima che
una situazione peggiori e che i prodotti e i pazienti ne siano coinvolti; preparazione di relazioni periodiche (secondo quanto fissato dallorganizzazione) sulle questioni relative alla qualit, sulle tendenze, su quanto emerso e sulle azioni correttive e preventive. Le funzioni di supervisione possono essere suddivise fra il personale esistente, i dipartimenti e le strutture, o, in qualche caso, possono essere affidate, per contratto, a ditte esterne. Lo scopo quello di ottenere valutazioni, il pi possibile indipendenti, sulle attivit riguardanti la qualit della struttura. Devono esistere politiche, processi e procedure per definire ruoli e responsabilit di tutti i soggetti, nello sviluppare e nel mantenere gli scopi qualitativi. Le politiche e i processi relativi ai sistemi qualit dovrebbero essere applicabili allintera struttura. Una Banca del Sangue o un Servizio Trasfusionale non necessitano di sviluppare proprie politiche di qualit, quando facciano parte di entit pi ampie, il cui sistema di gestione della qualit risponda a tutti i requisiti minimi. Il sistema qualit deve riguardare tutte le questioni legate alla conformit alle norme federali, statali e locali e agli standard di accreditamento, applicabili alla organizzazione. Risorse umane Questa parte del sistema qualit riguarda la gestione del personale, dalla selezione allavviamento al lavoro, alladdestramento, alla valutazione delle competenze e allorganico. Selezione Ogni Banca del Sangue, ogni Servizio Trasfusionale e ogni Centro Donatori debbono avere un processo per dotarsi di personale qualificato in un numero adeguato a eseguire, verificare e gestire tutte le attivit allinterno della struttura 1(3),3. I requisiti della qualificazione vengono determinati in base alle responsabilit di lavoro. Il processo di selezione dovrebbe prendere in considerazione quanto siano qualificati gli aspiranti a una particolare posizione di lavoro, in base allistruzione ricevuta, alladdestramento, allesperienza, alle
certificazioni e/o alle abilitazioni. Per gli operatori dei laboratori che eseguono esami, gli standard per la qualificazione del personale debbono essere compatibili con i requisiti normativi richiesti dalla CLIA ( Clinical Laboratory Improvement Amendments)2. Per tutto il personale coinvolto in processi o procedure che influiscano sulla qualit di sangue, emocomponenti, tessuti o servizi sono richieste descrizioni del lavoro (job descriptions). Una efficace descrizione del lavoro deve definire, con chiarezza, le qualificazioni, le responsabilit e riportare le relazioni della posizione con gli altri membri dellorganizzazione. Orientamento, addestramento e valutazione delle competenze Una volta assunti, i dipendenti debbono essere orientati alla loro posizione e alle politiche e alle procedure dellorganizzazione. Il programma di orientamento dovrebbe comprendere i requisiti specifici della struttura e unintroduzione alle politiche sui problemi di sicurezza, qualit, attivit informatiche, sicurezza, protezione dei dati e riservatezza. La parte del programma di orientamento correlata al compito svolto riguarda specifici problemi operativi delle varie aree di attivit. Deve essere assicurato un addestramento specifico per ogni attivit, per la quale i dipendenti abbiano responsabilit. Il risultato finale del programma di orientamento e di addestramento di formare nuovo personale in grado di agire indipendentemente nellattuare i compiti e le responsabilit, cos come definiti nelle loro job descriptions. Dovrebbe essere predefinita la tempistica necessaria a conseguire questa meta. Prima di introdurre nuovi test o nuovi servizi, il personale presente deve essere istruito a eseguire i nuovi compiti e deve esserne giudicato allaltezza. Durante lorientamento e laddestramento, dovrebbe essere data al dipendente lopportunit di porre domande e di cercare ulteriori aiuti e chiarimenti. Tutti gli aspetti delladdestramento debbono essere documentati, e listruttore della struttura o il rappresentante designato dalla direzione della struttura e il personale dipendente dovrebbero vicendevolmente convenire sulla determinazione delle competenze.
Per il personale coinvolto nella produzione del sangue ed emocomponenti richiesto un addestramento sulle norme di cGMP, dettate dalla FDA5. Ci dovrebbe far s che il personale abbia conoscenza delle basi normative che regolano politica e procedure della struttura, come pure che sia addestrato sulle applicazioni specifiche dei requisiti cGMP della struttura stessa, secondo quanto descritto nelle procedure operative. Laddestramento deve essere ripetuto a intervalli periodici, per garantire che il personale mantenga dimestichezza con i requisiti normativi. Per assicurarsi che queste conoscenze siano mantenute nel tempo, la struttura deve programmare regolari valutazioni sulla competenza di quel personale, le cui attivit possono influenzare la qualit del sangue, degli emocomponenti, dei tessuti o dei servizi2.6. A seconda della natura dei compiti espletati, queste valutazioni debbono comprendere: prove scritte, osservazioni dirette delle attivit, revisione delle registrazioni e dei rapporti di lavoro, registrazioni informatiche, registrazioni sui CdQ, indagini su campioni non noti, valutazione delle capacit del personale di risolvere i problemi5. Un piano ufficiale delle competenze, che comprenda un programma delle valutazioni, la definizione delle prestazioni minime accettabili e le misure correttive, rappresenta un modo per assicurare valutazioni appropriate e coerenti sulla competenza. Non necessario che le valutazioni riguardino ogni singolo test od ogni procedura effettuati da un dipendente, ma possono essere raggruppate insieme per essere valutate come si usa per tecniche o metodiche. Le prove scritte possono essere efficacemente utilizzate per valutare le capacit di risolvere problemi e per includere in modo rapido molti argomenti, formulando una o pi domande per ogni ambito da sottoporre a giudizio. Per il personale che esegue test diagnostici, i CMS richiedono che i dipendenti siano esaminati ogni sei mesi il primo anno e, successivamente, ogni anno2. Il personale che sovraintende alla qualit dovrebbe assicurare assistenza nella stesura, nella revisione e nellapprovazione dei programmi di addestramento, ivi compresi i criteri per il
riaddestramento5. Chi sovraintende alla qualit deve anche monitorare lefficacia dei programmi di addestramento e delle valutazioni sulla competenza e formulare raccomandazioni per modifiche, se necessarie. Inoltre, la JCAHO richiede lanalisi dei dati cumulativi sulle valutazioni di competenza, al fine di individuare le necessit di formazione del personale. Organico I responsabili della gestione debbono avere un piano relativo allorganico, che descriva numero e qualificazioni del personale necessari per eseguire, in modo sicuro ed efficace, i compiti della struttura. La JCAHO richiede che gli ospedali valutino lefficienza dellorganico, basandosi sugli indicatori delle risorse umane (per esempio: attivit in orario straordinario, danni fisici al personale, soddisfazione del personale) insieme agli indicatori relativi alle attivit operative (per esempio, eventi avversi, reclami dei pazienti)6. I risultati di queste valutazioni dovrebbero fornire elementi nella pianificazione delle risorse umane della struttura, insieme con le proiezioni basate su nuove o modificate necessit operative. Relazioni con clienti e fornitori I materiali, le forniture e i servizi, usati come input di un processo, vengono considerati critici se influenzano la qualit dei prodotti o dei servizi che vengono erogati. Esempi di forniture critiche sono gli emocomponenti, le sacche da prelievo, i kit e reagenti per le analisi. Esempi di servizi critici sono leffettuazione di test per le malattie infettive trasmissibili, lirradiazione e il trasporto di emocomponenti, la calibrazione delle apparecchiature, i servizi di manutenzione preventiva. I fornitori di questi materiali e servizi possono essere interni (ad esempio altri dipartimenti della stessa organizzazione) o esterni (venditori al di fuori dellorganizzazione). Le forniture e i servizi impiegati nella raccolta, nellesecuzione dei test, nella produzione, nella conservazione, nello stoccaggio, nella distribuzione, nel trasporto e nella somministrazione di sangue, emocomponenti e tessuti, che possano influenzare la qualit,
dovrebbero essere qualificati prima del loro utilizzo e ottenuti da fornitori che soddisfino i requisiti richiesti dalla struttura1(pp8,9). Il sistema qualit deve comprendere un processo per valutare le capacit dei fornitori a corrispondere a tali requisiti. Tre elementi importanti sono: la qualificazione di un fornitore, gli accordi, laccettazione, lispezione e lanalisi delle forniture in entrata. Qualificazione del fornitore Le forniture e i servizi critici debbono essere qualificati sulla base di requisiti ben definiti. Egualmente, il fornitore dovrebbe essere qualificato al fine di garantire di essere una fonte affidabile di materiali. La struttura dovrebbe chiaramente definire, per i fornitori, i requisiti o le aspettative e condividere, sia con il personale che con il fornitore, tali informazioni. Labilit del fornitore di corrispondere in modo appropriato alle specifiche di materiali e servizi, dovrebbe essere valutata nel corso delle prestazioni, relativamente alla disponibilit, alla consegna e allassistenza. Esempi di fattori che potrebbero essere presi in considerazione per qualificare i fornitori, sono: licenze, certificazioni o accreditamenti; requisiti di forniture e prodotti; revisione dei documenti della qualit rilevanti per il fornitore; risultati di verifiche o ispezioni; revisione di relazioni sintetiche della qualit; revisione di reclami da parte dei clienti; revisione delle esperienze maturate con il fornitore; costo di materiali e servizi; accordi sulla consegna; sicurezza finanziaria, posizione nel mercato, soddisfazione dei clienti; assistenza post-vendita. Si dovrebbe conservare un elenco dei fornitori approvati, che includa sia quelli principali che quelli alternativi, idonei per eventuali contingenze. Le forniture e i servizi critici dovrebbero essere acquisiti soltanto da fornitori gi qualificati. Dopo la qualificazione, una valutazione periodica delle prestazioni di un fornitore aiuta a garantire la sua continua capacit di soddisfare ai requisiti. Tener traccia della capacit del fornitore di far fronte alle
aspettative offre alla struttura valide informazioni circa la solidit dei processi del fornitore e del suo orientamento alla qualit. Fallimenti documentati di forniture o di fornitori nel soddisfare requisiti ben definiti dovrebbero determinare azioni immediate da parte della struttura. Tali azioni comprendono la notifica al fornitore, al personale che sovraintende alla qualit e alla struttura direzionale che ha lautorit di gestire i contratti, se del caso. Pu essere necessario che le forniture siano sostituite o messe in quarantena fintanto che tutti i problemi relativi alla qualit non siano stati risolti. Accordi I contratti e gli accordi definiscono le reciproche aspettative e rispecchiano la cooperazione fra le parti1(8). Una periodica revisione degli accordi assicura che le aspettative di tutte le parti continuino ad essere soddisfatte. Le modifiche debbono essere concordate e se necessario formalizzate negli accordi. Le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali dovrebbero tenere contratti e accordi scritti con i fornitori esterni di materiali e servizi critici, quali gli emocomponenti, le irradiazioni, le prove di compatibilit, le indagini sui marcatori delle malattie infettive. ll fornitore esterno pu essere un altro dipartimento della stessa struttura o appartenere ad una struttura diversa (per esempio, un produttore legato da un contratto). Il produttore si assume la responsabilit per la manifattura di un prodotto, assicurandone la sicurezza, la purezza e lefficacia, e assicurando pure, al contempo, che si conformato a tutti gli standard e alle normative applicabili al prodotto. Sia la struttura che stipula il contratto sia il contraente sono entrambi legalmente responsabili del lavoro compiuto dal contraente. importante per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali essere partecipi della selezione e delle valutazioni relative ai fornitori. Essi dovrebbero riesaminare i contratti e gli accordi, per assicurarsi che tutti gli aspetti relativi ai prodotti e ai servizi critici siano presi in considerazione. Esempi di argomenti che dovrebbero essere considerati negli accordi o nei contratti: responsabilit per un prodotto o un campione di
sangue durante il trasporto, responsabilit del fornitore di notificare prontamente alla struttura quando siano intervenute, nei prodotti o nei servizi, modifiche che possano riguardare la sicurezza del sangue, degli emocomponenti o dei pazienti, responsabilit del fornitore di notificare alla struttura pertinenti informazioni quando, nel corso dei processi di look back, si scoperto che un prodotto non pu essere considerato sicuro. Accettazione, ispezione e analisi delle forniture in entrata Prima di accettarli e utilizzarli, i materiali critici, quali reagenti o emocomponenti, debbono essere ispezionati e analizzati (se necessario) per assicurarsi che soddisfino alle specifiche pertinenti alluso loro destinato1(pp8,9)4. essenziale che i materiali, utilizzati nella raccolta, nella lavorazione, nella conservazione, nelle analisi, nello stoccaggio, nella distribuzione, nel trasporto e nella somministrazione di sangue ed emocomponenti, soddisfino anche i requisiti FDA. La struttura deve definire i criteri di accettazione delle forniture critiche (21 CFR 210.3) e sviluppare procedure per tenere sotto controllo i materiali che non soddisfino alle specifiche, al fine di prevenire un loro involontario impiego. Le azioni correttive possono contemplare la restituzione dei materiali al fornitore o la loro eliminazione. La registrazione di consegne e di ispezioni provvede alla struttura i mezzi per rintracciare i materiali che sono stati utilizzati in processi particolari e fornisce anche informazioni per la qualificazione continuativa dei fornitori. Gestione delle apparecchiature Unapparecchiatura che deve funzionare entro determinate specifiche per assicurare la qualit di sangue, emocomponenti, tessuti e servizi, viene definita come critica per il sistema qualit1(p4). Le apparecchiature critiche possono comprendere strumenti, dispositivi di misurazione, sistemi informatici (hardware e software). Le attivit intese ad assicurare che lapparecchiatura funzioni come previsto contemplano: qualificazione, calibrazioni, manutenzione e monitoraggi. Le calibrazioni e i controlli funzionali
e di sicurezza e, ancora, le manutenzioni preventive debbono essere programmati ed eseguiti secondo le istruzioni del produttore e i requisiti normativi richiesti da FDA3 e CMS2. Le procedure scritte per lutilizzo e il controllo delle apparecchiature debbono conformarsi con le raccomandazioni del produttore, a meno che non sia stato convalidato, da parte della struttura, un metodo alternativo, approvato anche dalle pertinenti agenzie di regolamentazione e di accreditamento. Quando viene scelta una nuova apparecchiatura, importante considerare non soltanto le prestazioni dello strumento per come sar usato nella struttura, ma anche ogni aspetto che riguardi il fornitore, pertinente a servizi e assistenza continuativa. Ci dovrebbe essere un piano scritto per linstallazione e le qualificazioni operative e prestazionali. Dopo linstallazione, deve essere documentato ogni problema e delle azioni intraprese in seguito. Qualora vengano effettuate riparazioni, che possano influire sulle funzioni operative critiche dello strumento, possono rendersi necessarie nuove calibrazioni e qualificazioni. Queste stesse azioni di ricalibrazione e di riqualificazione dovrebbero essere prese in considerazione anche nel caso di una nuova collocazione dellapparecchiatura. La struttura deve sviluppare un metodo in grado di identificare e rintracciare, in modo univoco, ogni apparecchiatura critica, incluse le versioni del software, se del caso. Tale identificazione univoca pu essere costituita dal numero di serie del produttore o da un numero univoco fornito dalla struttura. Il mantenere un elenco di tutte le apparecchiature critiche aiuta nella funzione di controllo della programmazione e nellattuazione di verifiche funzionali e di sicurezza, delle calibrazioni, delle manutenzioni preventive e delle riparazioni. Questo elenco delle attrezzature pu essere utilizzato per garantire che tutte le appropriate azioni siano state eseguite e registrate. Le valutazioni e le analisi sui dati di calibrazione, manutenzione e riparazione delle apparecchiature favorir la struttura nel determinare lidoneit dellapparecchio. Esse
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permetteranno anche un miglior controllo nella gestione di apparecchi difettosi e per identificare le apparecchiature che possano richiedere di essere sostituite. Quando si evidenzia che un apparecchio opera al di fuori di parametri accettabili, si debbono valutare e documentare i potenziali effetti sulla qualit dei prodotti e sui risultati dei test. Gestione dei processi Debbono esistere documenti scritti e formalmente approvati su politiche, processi e procedure relativi a ogni attivit critica svolta nella struttura, che debba essere effettuata in condizioni controllate. Ogni struttura dovrebbe avere un approccio sistematico per identificare, pianificare e implementare politiche, processi e procedure che influenzino la qualit di sangue, emocomponenti, tessuti e servizi. Questi documenti prima di essere messi in uso debbono essere revisionati dal personale che abbia una diretta autorit sulla gestione del processo e dal personale che sovrintende alla qualit. Le modifiche debbono essere documentate, convalidate, revisionate e approvate. Informazioni aggiuntive su politiche, processi e procedure possono essere rintracciati nella sezione Documenti e Registrazioni. Una volta che unattivit stata avviata, la
struttura deve possedere un metodo che garantisca che le procedure siano eseguite cos come sono scritte e che apparecchiature, reagenti e forniture critiche vengano usate in conformit con le istruzioni scritte dei produttori e secondo i requisiti definiti dalla struttura. La Tabella 1.2 elenca gli elementi per un valido controllo di processo. Una struttura che impieghi reagenti, materiale o apparecchiature in una maniera discordante dalle direttive del produttore, deve aver convalidato tale impiego e le pu essere richiesta di ottenere lapprovazione FDA per agire in modo differente dal 21 CFR 606,65(e), se lattivit conforme alle normative per sangue ed emocomponenti (21 CFR 640.120). Se la struttura ritiene che le modifiche alle direttive del produttore potrebbero essere appropriate, dovrebbe indurre il produttore a registrare tali cambiamenti nel materiale illustrativo (per esempio, nella documentazione inserita nella confezione o nel manuale per lutilizzatore). Convalida del processo La convalida serve a dimostrare che un processo in grado di conseguire i risultati previsti 9. critico convalidare i processi in situazioni, nelle quali non possibile misurare o ispezionare ogni prodotto finito od ogni servizio per verificare la loro piena conformit alle
Tabella 1.2 - Elementi per un valido sistema di controllo del processo Approccio sistematico per sviluppare politiche, processi o procedura e per controllare le modifiche. Convalida delle politiche, processi e procedure. Sviluppo e utilizzo di procedure operative standard (SOP). Processi di qualificazione delle apparecchiature. Istruzione del personale e valutazione delle competenze. Test di accettazione di software nuovi o revisionati, utilizzati nelle procedure dei Centri Trasfusionali. Creazione di programmi per i controlli di qualit, le calibrazioni e la manutenzione preventiva. Monitoraggio dei controlli di qualit, delle calibrazioni, della manutenzione preventiva e delle riparazioni. Monitoraggio e controllo dei processi di produzione. Processi per determinare che le qualificazioni dei fornitori e le specifiche dei prodotti siano mantenute. Partecipazione ad appropriati test di competenza (proficiency testing) per ogni sistema analitico in atto. Procedure per controllare materiali, sangue, emocomponenti e prodotti non conformi.
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specifiche richieste. Tuttavia, anche quando si possono ottenere test efficaci sul prodotto finale, consigliabile convalidare i processi importanti per ottenere informazioni che possano essere utilizzate per ottimizzare le prestazioni. La convalida prospettica viene utilizzata per processi nuovi o revisionati. La convalida retrospettiva pu essere utilizzata per processi gi in uso ma che non erano stati adeguatamente convalidati, prima della loro messa in opera. Una convalida contestuale viene impiegata quando i dati richiesti non possono essere ottenuti senza attuare un processo in vivo. Se si usa questultimo tipo di convalida, i dati debbono essere revisionati a intervalli predefiniti, prima che si abbia lapprovazione finale per la loro applicazione. Le modifiche a un processo convalidato possono richiedere nuove convalide in rapporto alle caratteristiche e allentit dei cambiamenti. compito della struttura determinare la necessita di nuove convalide in base alla comprensione di come le modifiche proposte possano interessare il processo. Piano di convalida Per essere efficace, una convalida deve essere pianificata. Un piano di convalida si realizza nel modo migliore dopo aver ottenuto unadeguata comprensione del sistema o del contesto entro il quale il processo si svolger. Molte strutture creano modelli per la stesura di un piano di convalida per accertarsi che tutti gli aspetti siano stati presi in adeguata considerazione. Bench per un piano di convalida non venga richiesto un tipo di modello unico, gli elementi elencati qui di seguito sono comuni nella maggior parte dei casi: descrizione del sistema; scopi/obiettivi; valutazione del rischio; responsabilit; procedure di convalida; criteri di accettazione; firme di approvazione; documentazione di supporto. Il piano di convalida deve essere revisionato e approvato dal personale che sovrintende alla qualit. Il gruppo responsabile per lesecuzione
delle attivit di convalida deve essere addestrato sul processo prima che il piano venga implementato. I risultati e le conclusioni di queste attivit debbono essere allegati al piano approvato o registrati in un documento separato. Questa documentazione contiene, caratteristicamente, i seguenti elementi: risultati attesi e osservati; interpretazione sullaccettabilit o meno dei risultati; azioni correttive e risoluzione dei risultati inattesi; conclusioni e limitazioni; firme di approvazione; documentazione di supporto; tempistica per limplementazione. Quando un processo di convalida non consegue i risultati attesi, i suoi dati e le azioni correttive intraprese debbono, comunque, essere documentati. Il personale responsabile a sovraintendere alla qualit dovrebbe effettuare una revisione finale e approvare piano, risultati e azioni correttive e determinare se processi o apparecchiature nuovi o modificati possano essere messi in uso, eventualmente specificandone le limitazioni. Convalida delle apparecchiature La convalida di un nuovo apparecchio utilizzato in un processo dovrebbe contemplare le qualificazioni relative allinstallazione, alloperativit e alle prestazioni13. La qualificazione dellinstallazione dimostra che lo strumento installato in modo appropriato e nelle condizioni ambientali indicate dal produttore. La qualificazione delloperativit dimostra che lo strumento installato funziona come desiderato. Essa focalizza la capacit dello strumento di operare entro i limiti stabiliti e le specifiche fornite dal produttore. La qualificazione delle prestazioni dimostra che lo strumento fornisce i risultati attesi per luso per il quale concepito nei processi stabiliti dalla struttura e che gli esiti sono conformi alle specifiche. Essa valuta ladeguatezza dellapparecchiatura per
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lutilizzo in un processo specifico, che impiega il personale stesso della struttura, le sue procedure e materiali, in un normale ambiente di lavoro. Convalida dei sistemi informatici La FDA considera che i sistemi informatici comprendano hardware, software, attrezzature periferiche, personale e documentazione14. La convalida da parte dellutente finale del sistema informatico e delle interfacce fra sistemi dovrebbe essere effettuata nellambiente dove verranno utilizzati. I test eseguiti dai venditori o dai fornitori di software non possono sostituire le convalide da effettuarsi nella struttura. Le analisi di accettabilit da parte dellutilizzatore finale possono ripeterne alcune, gi effettuate da chi ha sviluppato i sistemi, come i test di carico o di stress, e la verifica della protezione, della sicurezza e delle caratteristiche dei controlli, allo scopo di valutare le prestazioni nelle reali condizioni di operativit. Si deve, inoltre, valutare la capacit del personale di usare i sistemi informatici nel modo desiderato, nel contesto delle reali attivit di lavoro. I dipendenti debbono essere in grado di navigare efficacemente fra hardware e software e rispondere, in modo appropriato, a messaggi, ad avvertimenti e ad altre funzioni. In base alle caratteristiche di funzionalit del computer, le modifiche del sistema informatico possono determinare cambiamenti su come un processo condotto. Se questo avviene, debbono anche essere effettuate nuove procedure di convalida. Come per la convalida del processo, il personale che sovrintende alla qualit dovrebbe revisionare e approvare i piani di convalida, i risultati e le azioni correttive e determinare se la loro realizzazione pu proseguire con o senza limitazioni. Le strutture che creano propri software dovrebbero far riferimento, per ulteriori informazioni, alle direttive FDA sui principi generali della convalida di software15. Controllo di qualit I test dei controlli di qualit (CdQ) vengono eseguiti per garantire il corretto funzionamento di materiali, apparecchiature e metodiche nel corso
delle attivit. I valori attesi delle prestazioni dei CdQ e i loro limiti accettabili debbono essere definiti e prontamente resi disponibili al personale, cosicch esso possa riconoscere i risultati non accettabili e le linee di tendenza e rispondervi adeguatamente. La frequenza dei CdQ fissata dalla struttura, in accordo con i requisiti richiesti da CMS, FDA, AABB, dallo Stato e dal fabbricante. I risultati dei CdQ debbono essere documentati contestualmente alle prestazioni3. Le registrazioni dei CdQ debbono comprendere lidentificazione del personale, dei reagenti (compreso numero di lotto, date di scadenza etc.), delle apparecchiature, la data e lorario (se del caso) degli esami eseguiti, i risultati, la loro interpretazione e le revisioni. Si debbono condurre indagini sui risultati non accettabili dei CdQ e attuare azioni correttive, se indicate, prima di ripetere i processi di CdQ o proseguire nel processo operativo. In Appendice 10, alla fine del manuale, sono riportati alcuni esempi di intervalli di CdQ da consigliare a Banche del Sangue e a Servizi Trasfusionali, mentre informazioni sulle metodiche da utilizzare nei CdQ si possono reperire nella sezione specificamente riservata a tale argomento. Documenti e registrazioni La documentazione fornisce una struttura portante per la comprensione e la comunicazione in tutte le componenti dellorganizzazione. I documenti descrivono il modo con il quale i processi debbono funzionare, come essi interagiscono, a quale momento debbono essere controllati, quali sono i loro requisiti e come debbono essere realizzati. Le registrazioni forniscono la prova che il processo stato eseguito come previsto e le informazioni necessarie a valutare la qualit di prodotti e servizi. Nel loro insieme, documenti e registrazioni sono utilizzati dal personale che sovrintende alla qualit per valutare lefficacia delle politiche, dei processi e delle procedure di una struttura.Un esempio di documentazione relativa al sistema qualit offerto dalla norma ISO 9001 e riguarda gli argomenti elencati qui sotto9:
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1. politica e obiettivi della qualit; 2. descrizione delle interazioni fra processi; 3. procedure documentate per tenere sotto controllo documenti, registrazioni, prodotti non conformi, azioni correttive e preventive, verifiche ispettive interne della qualit; 4. registrazioni relative al sistema qualit, alle prestazioni operative e alla conformit di prodotti e servizi; 5. tutte le ulteriori documentazioni che necessitano allorganizzazione per garantire lefficace pianificazione, operativit, e tenuta sotto controllo dei processi. Politiche scritte, descrizioni dei processi, procedure, istruzioni di lavoro, etichettature, moduli e registrazioni fanno parte del sistema documentale della struttura. I documenti possono essere cartacei o elettronici. Essi forniscono una descrizione o le istruzioni su ci che si presume possa accadere; le registrazioni danno evidenza di ci che realmente accaduto. Un sistema di gestione dei documenti assicura che essi siano esaurienti, aggiornati e disponibili, e che le registrazioni siano accurate e complete. Un sistema ben strutturato di gestione dei documenti lega fra loro politiche, descrizione dei processi, procedure, moduli e registrazioni in un sistema organizzato e fattibile. Documenti I documenti dovrebbero essere redatti in un formato tale da comunicare, con chiarezza, le informazioni e fornire al personale istruzioni e moduli. Il Clinical and Laboratory Standards Institute offre una guida sulle caratteristiche generali della documentazione 8 e istruzioni dettagliate su come scrivere le procedure16. Tali caratteristiche generali della documentazione vengono descritte qui di seguito. Politiche. Le politiche mirano a comunicare, scopi, obiettivi e intenti di pi alto livello dellorganizzazione. Le restanti parti della documentazione dellorganizzazione forniranno interpretazioni e istruzioni per la realizzazione di queste politiche. Processi. I documenti di processo descrivono una sequenza di azioni e identificano
responsabilit, momenti decisionali, requisiti e criteri di accettazione. La Tabella 1.3 elenca esempi di documenti di processo che potrebbero essere messe in atto per sostenere un sistema qualit. A questo livello di documentazione, vengono spesso impiegati grafici e diagrammi di flusso. di aiuto mostrare sui diagrammi i punti di controllo delle attivit, cos come il flusso e lo scambio delle informazioni fra dipartimenti o gruppi di lavoro. Procedure e istruzioni di lavoro . Questi documenti forniscono, passo-passo, le direttive su come svolgere i compiti di lavoro e le procedure. Le procedure e le istruzioni di lavoro dovrebbero essere sufficientemente dettagliate perch i compiti siano svolti correttamente, ma non essere troppo particolareggiate, tali da renderle di difficile lettura. Luso di formati standard aiuter il personale a sapere dove trovare elementi specifici e ne faciliter realizzazione e controllo1(p66). Le procedure possono anche essere incluse come riferimento, come quelle prese dai manuali dei produttori. Le procedure pertinenti debbono essere disponibili al personale in ogni area, dove vengono svolti i corrispondenti compiti di lavoro1(p66),3. Moduli. I moduli forniscono uno schema per raccogliere dati, sia in forma cartacea che elettronica. Questi documenti specificano i requisiti dei dati richiesti per le SOP e i processi. Essi dovrebbero essere accuratamente concepiti per un loro facile uso, per minimizzare le probabilit di errore e facilitare il recupero di informazioni. Dovrebbero contenere istruzioni per la loro utilizzazione, quando non appaia immediatamente evidente quale informazione debba essere registrata o come registrarla. Per i dati quantitativi, il modulo dovrebbe indicare le unit di misura. Limmissione di dati informatici nel computer e le schermate analitiche rappresentano un tipo di modulo. I moduli debbono essere progettati in modo da evidenziare efficacemente i risultati e aiutare la tracciabilit del processo. Etichette. Le etichette da utilizzare per gli emocomponenti rappresentano un materiale critico, soggetto ai requisiti propri di un sistema di gestione dei documenti. Molte strutture
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mantengono una serie di etichette-matrici, che possono servire da riferimento, per verificare che in uso soltanto la scorta correntemente approvata. Debbono essere verificate come
corrette le scorte di nuove etichette prima di metterle in funzione; per ottenere questo, il confronto con le etichette-matrici offre un sistema. Si debbono stabilire procedure di controllo delle
Tabella 1.3 - Esempi di documenti di processo relativi al sistema qualit Organizzazione Risorse Processo per il riesame da parte della direzione Processo per lassunzione di personale Processo per laddestramento del personale Processo per la valutazione delle competenze Processo per la gestione delle apparecchiature Processo per la qualificazione delle installazioni Processo di qualificazione dei fornitori Processo per la revisione dei contratti Processo per la qualificazione dei materiali critici Controllo degli ordini e delle scorte di materiali critici Ricevimento, ispezione e analisi di materiali critici in entrata Processo per il controllo delle modifiche apportate Processo di convalida Processo per test di accettazione dei software Processo per maneggiare i proficiency testing Processo per manipolare, conservare, distribuire, trasportare gli emocomponenti
Apparecchiature
Fornitori e cliente
Controllo dei processi
Documenti e registrazioni
Processo per la creazione e lapprovazione di documenti Processo per la gestione di documenti Processo per la gestione delle registrazioni Processo per la gestione di eventi Processo per gestire i reclami dei clienti Processo per la notifica di materiali esterni Processo per le verifiche interne Processo per il monitoraggio della qualit Processo per la gestione delle verifiche esterne Processi per le azioni correttive e preventive Processo per gestire le catastrofi Processo per la gestione della sicurezza dei dipendenti
Deviazioni, non conformit, complicazioni
Verifiche
Miglioramento del processo Strutture e sicurezza
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modifiche di stampa, per lutilizzo di stampanti di etichette su richiesta, al fine di prevenire cambiamenti non conformi nel formato o nel contenuto delle etichette. Ogni struttura deve avere un processo ben definito per creare e mantenere le documentazioni. Tali processi dovrebbero comprendere: elementi di base richiesti per il formato dei documenti, procedure per revisionare e approvare documenti nuovi o modificati; metodi per mantenere in uso i documenti e tenere sotto controllo la distribuzione dei documenti, un processo per archiviare, proteggere e ritirare i documenti obsoleti. Al personale responsabile del contenuto di documenti nuovi o revisionati deve essere assicurato un pertinente addestramento. I sistemi per gestire la documentazione debbono comprendere i processi stabiliti per: 1. verificare ladeguatezza dei documenti prima della loro approvazione ed emissione; 2. revisionare, modificare e riapprovare, quando necessario per mantenere i documenti aggiornati; 3. identificare le modifiche e lo stato di revisione; 4. assicurarsi che i documenti siano leggibili, identificabili e prontamente disponibili; 5. prevenire un involontario uso di documenti scaduti od obsoleti; 6. prevenire la distruzione o il danneggiamento involontario di documenti. I documenti di origine esterna, che vengano inclusi quali riferimento, diventano parte del sistema di gestione della documentazione e debbono essere identificati e controllati. La struttura deve avere, nel suo sistema, un meccanismo per rilevare modifiche nei documenti esterni, quali quelli presenti negli inserti allegati alle confezioni o nei manuali duso, in modo da poter inserire i relativi cambiamenti nelle procedure e nei moduli. Quando politiche, descrizioni di processi, procedure o moduli nuovi o revisionati vengono aggiunti o rimpiazzati nel manuale della qualit della struttura, i relativi documenti debbono essere contrassegnati con la data effettiva. Una copia dei documenti ritirati deve essere conservata, come precisato dagli standard e dalle norme esistenti e applicabili.
Un elenco di riferimento di tutte le politiche, le descrizioni dei processi, le procedure, i moduli e le etichette correnti utile per mantenere sotto controllo la documentazione. Lelenco dovrebbe comprendere il titolo del documento, la persona o il gruppo di lavoro responsabile per la sua conservazione, data e numero (se assegnato) della revisione e lambito di utilizzo. Dovrebbe anche identificare numero e collocazione delle copie controllate in circolazione. Le copie dei documenti che saranno utilizzate nei luoghi di lavoro dovrebbero essere identificate e controllate per assicurarsi che nessuna stata trascurata, quando sono state effettuate delle modifiche. Registrazioni Le registrazioni forniscono levidenza che le fasi critiche di una procedura sono state eseguite in modo appropriato e che i prodotti o i servizi sono conformi ai requisiti specificati. La revisione delle registrazioni un importante strumento per valutare lefficacia del sistema qualit. Le registrazioni debbono essere redatte contestualmente allesecuzione di ogni fase significativa e indicare chiaramente lidentit dei soggetti che la hanno eseguita e quando ci avvenuto3. Il sistema qualit deve comprendere un processo per gestire le registrazioni che prenda in considerazione i seguenti argomenti: creazione e identificazione delle registrazioni; protezione da modifiche o distruzioni accidentali o non autorizzate; verifica delle loro completezza, accuratezza e leggibilit; conservazione e recupero; creazione di copie e back-up; periodo di conservazione; riservatezza. I sistemi per mantenere le registrazioni debbono permettere un loro pronto recupero entro i tempi stabiliti dalla struttura e la rintracciabilit degli emocomponenti, come richiesto dalle norme federali3. Negli Standard AABB1(pp69-80) e nel 21 CFR 606.160 sono contemplati i requisiti specifici per le registrazioni che debbono essere conservate da Banche del Sangue e Servizi Trasfusionali.
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Quando vengono utilizzati moduli per acquisire dati, fasi delle registrazioni o risultati di test, essi diventano registrazioni. I dati debbono essere registrati in un formato chiaro e coerente. La struttura deve definire un processo e le tempistiche per revisionare le registrazioni allo scopo di garantirne accuratezza, completezza e un appropriato controllo nel tempo. Si deve determinare come le relazioni e le registrazioni debbano essere archiviate e definire il periodo della loro conservazione. Quando sono conservate delle copie di registrazioni, la struttura deve verificare che il loro contenuto sia completo, leggibile, accessibile e conforme alloriginale, prima che questultimo sia distrutto. Se le registrazioni vengono conservate elettronicamente, debbono esistere back-up idonei per leventualit di guasti del sistema informatico. Le registrazioni elettroniche debbono essere leggibili per tutto il periodo della loro conservazione. I software obsoleti, necessari a ricostituire o a rintracciare registrazioni, debbono essere archiviati in maniera appropriata. Se non possono essere mantenuti gli strumenti o i software utili per accedere a dati gi archiviati, le registrazioni debbono essere convertite in formati differenti o copiati in un altro ambiente informatico, in modo da poterne assicurare un accesso continuativo. I dati cos convertiti debbono essere verificati con quelli originali, per verificarne la completezza e laccuratezza. Al fine di archiviare documenti, sono largamente utilizzati mezzi elettronici, quali nastri magnetici, dischi ottici e la conservazione on-line di dati informatici. Le registrazioni mantenute in questi modi debbono corrispondere ai requisiti FDA per la conservazione dei dati elettronici17. Si possono impiegare microfilm o microschede per archiviare registrazioni scritte. Il mezzo scelto deve essere appropriato ai requisiti relativi alle conservazione dei dati. Nel sistema qualit va garantita la riservatezza sulle informazioni riguardanti pazienti e donatori, mediante politiche e procedure idonee a mantenere sicurezza e segretezza delle registrazioni. I sistemi informatici debbono essere progettati con sistemi di sicurezza, per prevenirne
accessi e utilizzi non autorizzati. Il sistema pu comprendere livelli di sicurezza, definiti dalle responsabilit proprie del tipo di lavoro svolto e gestiti con luso di codici di sicurezza e password. Ogni struttura dovrebbe avere una politica per modificare e correggere le registrazioni. Pratica comune indicare la data, la modifica, lidentit della persona che ha provveduto alla modifica e la prova della revisione effettuata da parte di un responsabile. La registrazione originale non deve essere cancellata sulla copia scritta, pu essere sbarrata con una linea singola, ma dovrebbe rimanere leggibile. Le registrazioni elettroniche debbono permettere la tracciabilit di entrambi i dati, quelli originali e quelli corretti e includere data e identit della persona che ha provveduto alle modifiche. Dovrebbe esserci una processo per tenere sotto controllo le modifiche1(10). Sono essenziali un metodo affinch le modifiche facciano riferimento alle registrazioni, in un modo collegato alle registrazioni originali, e un sistema per revisionare tali modifiche, al fine di una loro completezza e accuratezza. Dalla FDA sono richieste prove di verifica sulle modifiche dei dati nei sistemi informatici17. Quando si pianifica la conservazione delle registrazioni, si debbono prendere in considerazione i punti di seguito elencati: conservazione delle registrazioni in modo che siano protette da danneggiamenti e da distruzioni o modifiche accidentali o non autorizzate; grado di accessibilit alle registrazioni, in rapporto alla frequenza del loro uso; metodo per la conservazione delle registrazioni e loro collocazione, in rapporto al loro volume e agli spazi disponibili; disponibilit di strumentazioni, hardware, software e applicativi per visionare le registrazioni archiviate, che funzionino correttamente; documentazione che le registrazioni in microschede rimpiazzino correttamente i documenti originali, che possono essere conservati in altri luoghi o anche essere distrutti; mantenimento delle registrazioni originali a
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colori, quando sono disponibili soltanto copie in bianco-nero. Le considerazioni relative alle registrazioni elettroniche comprendono: un metodo di verifica dellaccuratezza dellimmissione dei dati; la prevenzione della cancellazione involontaria dei dati o dellaccesso da parte di persone non autorizzate; unadeguata protezione dalla perdita involontaria dei dati (per esempio, quando una memoria piena); protezioni convalidate, per assicurare che una registrazione pu essere modificata soltanto da una persona alla volta; protezione e accesso ai dati riservati. Dovrebbe essere conservato un dischetto o un nastro di recupero dati (back-up) nellipotesi di uninaspettata perdita di informazioni da parte della memoria. Le registrazioni informatiche recuperate o archiviate e i database debbono essere conservati in altro luogo1(p68). Lo strumento dove conservare le registrazioni dovrebbe essere sicuro e mantenuto in condizioni appropriate, secondo le raccomandazioni e le istruzioni dei produttori. Una copia archiviata del sistema operativo informatico e dei software applicativi dovrebbe essere conservata nella stessa maniera. La struttura dovrebbe sviluppare e mantenere dei sistemi alternativi per garantire laccesso alle informazioni, qualora i dati informatici non siano disponibili. Si debbono definire i processi di back-up e di recupero dati, in caso di computer momentaneamente fermi, con documenti di convalida che dimostrino che i sistemi di recupero funzionano in modo appropriato. I pertinenti processi debbono essere controllati periodicamente, per assicurarsi che i sistemi di back-up restino efficaci. Dovrebbe essere riservata una considerazione speciale alla competenza e alla prontezza, da parte del personale, nelluso dei sistemi di recupero. Per associare il relativo personale ai dati registrati, la struttura deve mantenere un registro dei nomi, con le date di assunzione, le firme, le iniziali identificative o i codici di identificazione del personale autorizzato a creare, sottoscrivere,
siglare o revisionare relazioni e registrazioni. Al posto di firme scritte, vengono, in genere, accettate anche tessere magnetiche con il codice del dipendente o altre metodiche di identificazione informatica, sempre che abbiano i requisiti propri delle registrazioni elettroniche. Deviazioni e non-conformit di prodotti e servizi Il sistema qualit deve comprendere un processo per individuare, investigare e rispondere a eventi che determinino deviazioni dalle politiche, dai processi e dalle procedure approvate o mancanze nel corrispondere ai requisiti, definiti dai Centri Donatori e dai Servizi Trasfusionali, dagli Standard AABB o dalle normative applicabili1(p81),3. Ci comprende la scoperta di prodotti e servizi non conformi, come pure le reazioni avverse alla donazione ed alla trasfusione di sangue1(pp81-85),2. La struttura dovrebbe definire in quale modo: documentare e classificare le evenienze; determinarne gli effetti, se ve ne sono, sulla qualit di prodotti o servizi; valutarne limpatto sulle attivit interconnesse; mettere in opera unazione correttiva, che comprenda la notifica e il ritiro, se appropriati; analizzare levento per capirne la causa prima; realizzare azioni preventive, se del caso, sulla base dellanalisi della causa prima (root-cause analysis); relazionare alle agenzie esterne, quando richiesto. Il personale della struttura dovrebbe essere istruito a riconoscere e riportare tali evenienze. In base alla gravit dellevento e ai rischi per pazienti, donatori e prodotti e, anche alla probabilit che levento si ripeta, dovr essere garantita lindagine sui fattori che hanno contribuito allevento stesso e sulla causa/cause sottostanti. Le norme di cGMP richiedono inchieste e documentazioni sugli esiti, qualora uno specifico evento possa sfavorevolmente interessare la sicurezza dei pazienti o la sicurezza, la purezza, la potenza e lefficacia del sangue e degli emocomponenti23. Gli strumenti e gli approcci per analizzare le cause prime e per attivare azioni correttive sono
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discussi nella sezione dedicata al miglioramento dei processi. Deve essere approntato un sintetico documento sugli eventi, sulle indagini e sui
controlli successivi. La Tabella 1.4 evidenzia le componenti suggerite di un rapporto interno su un evento.
Tabella 1.4 - Elementi costitutivi di rapporto interno su un evento18,19 Chi Identit dellestensore (o degli estensori) del rapporto Identit dei soggetti coinvolti (per compiti e qualifica) nel dare indirizzi, preparare, scoprire, indagare, iniziare qualsiasi azione immediata Identificazione del paziente o del donatore Revisore (o revisori) del rapporto Breve descrizione dellevento Effetti ed esiti sul paziente, sul donatore, sullemocomponente Tipo di emocomponente e numero identificativo dellunit Produttore, numero del lotto, data di scadenza di reagenti e forniture Azione immediatamente intrapresa Data del rapporto Data e ora dellevento Data e ora della scoperta Date di raccolta e invio dellemocomponente (o degli emocomponenti)
Che cosa
Quando
Dove
Luogo fisico, dove occorso levento Dove stato evidenziato Dove iniziato Delucidazioni su come levento occorso Fattori che hanno contribuito allevento Causa (cause) prima Rapporti esterni o notifiche (ad esempio: allFDA*, al produttore, al curante del paziente) Azioni correttive Date di realizzazione Efficacia delle azioni intraprese
Perch/come
Controlli nel tempo
* Di seguito, alcuni esempi, identificati dallFDA come eventi segnalabili, se lemocomponente o il prodotto sono stati gi distribuiti: - disinfezione del braccio non effettuata o scorretta; - unit prelevata a donatori che erano (o avrebbero dovuto essere) temporaneamente o permanentemente sospesi dalle donazioni per anamnesi o per test sui marcatori virali ripetutamente reattivi; - spedizione di unit con test sui marcatori virali ripetutamente reattivi; - tipizzazione ABO/Rh o test per malattie infettive non eseguiti seguendo le indicazioni dei produttori; - unit da donatori, dei quali i risultati dei test sono stati impropriamente interpretati a causa di errori correlati alluso scorretto di strumenti; - unit distribuite prima del completamento di tutti gli esami (eccetto i casi durgenza); - campioni usati per le prove di compatibilit con identificazione errata; - errori nei test che hanno determinato la distribuzione di ununit errata; - emocomponenti scorrettamente etichettati (per esempio, gruppo ABO, data di scadenza); - etichette o cartellini di prove di compatibilit errati; - conservazione di prodotti biologici a temperature incongrue; - contaminazione microbica di emocomponenti, se essa attribuibile a errori durante la produzione.
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Le evenienze mortali, collegate alla raccolta o alla trasfusione di sangue, debbono essere riportate, quanto prima possibile, al Centro per la Valutazione e la Ricerca Biologica (CBER, Center for Biologics Evaluation and Research) della FDA [21 CFR 606.170(b)]. Le istruzioni per la trasmissione al CBER sono disponibili su documenti pubblicati20 o sul sito http//www.fda.gov/cber/transfusion.htm. Un rapporto scritto deve essere presentato entro 7 giorni dallevento mortale e dovrebbe contenere la descrizione di ogni nuova procedura implementata per evitare un suo ripetersi. Il bollettino dellAABB numero 04-06 (giugno 2004) fornisce ulteriori informazioni, incluso un modulo da usarsi per riportare gli eventi fatali che hanno interessato donatori21. Senza tener conto dei loro rapporti con la FDA per quanto riguarda autorizzazioni e registrazioni, tutti i Centri Donatori, le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali, debbono sollecitamente riferire alla FDA le deviazioni (precedentemente note come errori o incidenti) intervenute nei prodotti biologici e le informazioni pertinenti a tali eventi, utilizzando il modulo FDA - 3486, ogni volta che levento: associato alla produzione (cio, agli esami, ai processi produttivi, al confezionamento, alletichettatura, alla conservazione, al possesso o alla distribuzione); rappresenta una deviazione dalle cGMP, dalle norme o dagli standard applicabili, da Tabella 1.5 - Esempio di classificazione di un evento
specifiche stabilite o inatteso o imprevedibile; pu influenzare la sicurezza, la purezza o lefficacia del prodotto; avvenuto quando la struttura aveva il controllo o era responsabile del prodotto; coinvolge un prodotto gi distribuito. Ci deve anche essere una modalit per riferire alla FDA gli eventi sfavorevoli che interessano i dispositivi medici. La JCAHO incoraggia la segnalazione degli eventi sentinella, comprese le reazioni trasfusionali emolitiche, che interessano la somministrazione di sangue o emocomponenti per incompatibilit gruppoematiche maggiori7. Ogni struttura dovrebbe tracciare gli eventi riportati ed evidenziarne le tendenze. Limpiego di schemi classificativi pu facilitare le analisi sulle tendenze e coinvolge, tipicamente, una o pi delle categorie seguenti: la natura dellevento, il processo (o la procedura) nel quale levento occorso, la gravit dellevento, le sue cause. Se numerosi eventi, in un periodo relativamente breve, coinvolgono un particolare processo o procedura, quel processo o procedura dovrebbero essere ulteriormente sottoposti ad indagine. Gli schemi maggiormente utili riguardano limpiego di molteplici categorie per ogni evento, il che consente di classificare i dati secondo varie modalit, tali da far emergere modelli-tipo (vedi esempi in Tabella 1.5). Tale classificazione pu condurre a identificare situazioni che richiedono un monitoraggio pi stretto o a individuare
Evento: un concentrato eritrocitario da un donatore dedicato stato fornito a un paziente sbagliato. Classificazione dellevento Tipo dellevento - paziente Procedura coinvolta - assegnazione del prodotto Processo coinvolto - somministrazione di sangue Prodotto coinvolto - concentrato eritrocitario Altri fattori - donatore dedicato Lindagine ha rivelato Causa recente - per due pazienti con nome simile stato crociato sangue disponibile Causa prima - procedura non adeguata per verificare lidentit del paziente durante lassegnazione
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problemi che necessitano di azioni correttive. Lestensione del monitoraggio e la durata nel tempo del monitoraggio dei processi dipenderanno dalla frequenza con cui gli eventi capitano e dai loro aspetti critici. Riportare e monitorare gli eventi sfavorevoli sono metodi essenziali di identificazione dei problemi, al fine di migliorare i processi in un sistema di gestione della qualit. Occasionalmente, le Banche del Sangue o i Servizi Trasfusionali possono avere necessit di divergere dalle procedure approvate, per soddisfare le specifiche necessit sanitarie di un particolare paziente. Quando si verifica questa situazione, si pianifica una eccezione clinicamente motivata, che viene approvata anticipatamente dal direttore medico della struttura. Il razionale e la natura alla base delleccezione pianificata debbono essere documentati. Si dovrebbero fornire accurate considerazioni per mantenere il processo sotto controllo e per verificare sicurezza e qualit dei prodotti o dei servizi risultanti. Ogni rischio aggiuntivo per il paziente devessere messo in evidenza. Monitoraggio e verifica Il sistema qualit dovrebbe descrivere come la struttura monitora e verifica i suoi processi. Gli Standard AABB1(p93) definiscono la verifica come un esame sistematico e indipendente, che viene effettuato a intervalli definiti e con una frequenza sufficiente a determinare se le attivit svolte sono conformi a quelle pianificate, se sono realizzate efficacemente e se raggiungono gli obiettivi. Le valutazioni comprendono, caratteristicamente, la comparazione fra i risultati ottenuti e quelli attesi. A seconda delloggetto, ci pu comprendere la valutazione dellesito di un processo (cio, il risultato), le attivit che completano un processo e i suoi risultati o un gruppo di processi correlati e i pertinenti risultati (cio, il sistema). Esempi di tali valutazioni riguardano le verifiche esterne, quelle interne, quelle sulla qualit, le valutazioni fra pari e le autovalutazioni. Verifiche interne Le verifiche interne possono comprendere valutazioni sugli indicatori di qualit, audit
focalizzati a singoli processi o audit di sistema, che sono di ambito pi ampio ed interessano un insieme di processi correlati. Tali verifiche dovrebbero essere pianificate e programmate. Dovrebbero essere precisati i dettagli su chi svolge le valutazioni e su come esse debbono essere effettuate. Le verifiche dovrebbero comprendere il sistema qualit e i sistemi operativi pi importanti che sono in atto nella Banca del Sangue, nel Servizio Trasfusionale o nel Centro Donatori. Inoltre, deve esistere un processo per rispondere ai problemi che derivano dai risultati delle verifiche, compresi i processi di revisione e le tempistiche. I risultati dovrebbero essere documentati e sottoposti al personale di gestione avente autorit sui processi valutati, come pure al management esecutivo. Lamministrazione dovrebbe sviluppare piani di azioni correttive e preventive, partendo dagli input dello staff operativo e del personale che sovraintende alla qualit, per qualsiasi difetto emerso nelle verifiche. Il personale che sovraintende alla qualit dovrebbe seguire i progressi nella realizzazione delle attivit correttive e preventive, e monitorarne lefficacia. Allo scopo di fare il miglior uso possibile di queste valutazioni, deve esistere un processo per seguire, orientare e analizzare i problemi evidenziati, cosicch si possano riconoscere le opportunit di miglioramento1(pp86,87). Una precoce individuazione delle tendenze rende possibile sviluppare azioni preventive, prima che venga in qualche modo alterata negativamente la sicurezza di pazienti ed emocomponenti. Una sintesi delle valutazioni offre utili informazioni per correggere problemi riguardanti le prestazioni individuali o di gruppo, e per assicurare che i metodi di analisi e gli strumenti siano adeguati. Oltre a revisionare i risultati delle valutazioni, il management esecutivo deve sottoporre a revisione tutte le azioni correttive e preventive inerenti. Indicatori di qualit Gli indicatori di qualit sono specifiche misurazioni di prestazioni, studiate per monitorare uno o pi processi in un tempo definito e risultano
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utili per valutare le richieste di servizi, la produzione, ladeguatezza del personale, il controllo delle scorte, la stabilit dei processi. Tali indicatori possono essere basati sul processo o sul risultato. Gli indicatori di processo misurano il grado in cui un processo pu essere eseguito in modo coerente. Un esempio di questo tipo di indicatori la misurazione del tempo che intercorre fra la richiesta di un emocomponente e la sua trasfusione. Gli indicatori di risultato vengono spesso usati per misurare cosa accade o cosa non accade, dopo che un processo stato o non stato eseguito. Calcolare il numero di risultati di test non corretti, un esempio di questo tipo di indicatori. Per ogni indicatore, vengono stabiliti valori soglia, che rappresentano limiti di avvertimento e/o di azione. Tali valori soglia si possono ricavare dai requisiti normativi o di accreditamento, dal benchmarking o da dati interni. Strumenti usati frequentemente per mostrare i dati degli indicatori di qualit sono le run charts (grafici che rappresentano i dati in rapporto alla variabile tempo) e le control charts (grafici di controllo). Nelle run charts, il tempo viene inserito sulle ascisse e i valori sulle ordinate. Nei control charts, vengono inseriti nei grafici la media dei dati e i limiti di controllo superiori e inferiori, calcolati sulla base dei risultati. I punti situati al di fuori dei limiti di controllo superiori o inferiori sono dovuti a cause particolari. Le regole statistiche per interpretare punti consecutivamente al di fuori di una deviazione standard (SD), 2 SD e 3 SD dovrebbero essere utilizzate al fine di identificare un processo fuori controllo, se ne dovrebbe determinare la causa prima e si dovrebbero iniziare azioni correttive, qualora indicato. Valutazioni sullutilizzo del sangue Le attivit dei comitati che revisionano luso del sangue (corrispondenti in Italia ai Comitati Ospedalieri per il Buon Uso del Sangue, COBUS), istituiti laddove si eseguono le trasfusioni, rappresentano un esempio di verifica interna. Sono disponibili linee guida da parte dellAABB per la rivalutazione dellutilizzo del sangue nei pazienti adulti e pediatrici24-26. Una revisione fra pari sulla pratica trasfusionale richiesta, oltre che
dallAABB, anche dalla JCAHO 6 per laccreditamento di ospedali, dai CMS2, sempre per gli ospedali, allo scopo di ottenere la qualificazione utile per i rimborsi Medicare e, da alcuni Stati, per i rimborsi Medicaid. Gli audit trasfusionali forniscono una revisione delle politiche e dei processi per assicurare trasfusioni sicure e appropriate e sono basate su criteri di prestazioni misurabili e predeterminate. I Servizi Trasfusionali dovrebbero indagare un campionamento adeguato di casi (per esempio, il 5% delle trasfusioni eseguite in un periodo di tempo definito o 30 casi se il numero pi ampio). Le verifiche stabiliscono prestazioni e efficienza della struttura: nelle attivit di richiesta per tutti i tipi di sangue ed emocomponenti; nel minimizzare lo spreco di emocomponenti; nella distribuzione, nel maneggiare, nellutilizzo e nella somministrazione di emocomponenti; nella valutazione di tutti le reazioni trasfusionali che siano state confermate; nel soddisfacimento delle necessit trasfusionali dei pazienti; nellinformare pazienti e medici curanti, in maniera tempestiva e riservata, della possibile trasmissione di malattie infettive. Un metodo per valutare il processo di somministrazione del sangue di tenere sotto osservazione un numero predeterminato di trasfusioni, seguendo il cammino dellunit, dallassegnazione alla sua trasfusione25. Politica e pratica delle valutazioni della sicurezza trasfusionale possono comprendere la revisione delle reazioni trasfusionali e delle di malattie trasmesse con la trasfusione. Il COBUS pu monitorare le politiche e le pratiche di notifica ai riceventi di prodotti ritirati (notifica di look back) e, ai donatori, di risultati anomali dei test eseguiti su di loro. Altre valutazioni, importanti nella pratica trasfusionale, comprendono la revisione delle politiche sul consenso informato, le indicazioni allemoterapia, il rilascio di unit provenienti da donatori dedicati, le trasfusioni ambulatoriali o a domicilio. Qualora sia appropriato, ulteriori valutazioni dovrebbero riguardare: le aferesi
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terapeutiche, luso di dispositivi per il recupero del sangue, la raccolta e la conservazione di cellule staminali ematopoietiche, la raccolta di sangue autologo in periodo perioperatorio, la raccolta e la conservazione di tessuti, la valutazione di nuove tecnologie e di nuovi prodotti. LAppendice 1.4 elenca alcuni esempi di valutazione sulluso del sangue. Verifiche esterne Le verifiche esterne includono ispezioni, sorveglianze, audit e valutazioni, effettuate da chi non appartiene alla struttura organizzativa, come FDA, AABB, CAP o JCAHO. La partecipazione a programmi di verifica esterna offre un punto di vista indipendente e obiettivo delle prestazioni della struttura. I valutatori esterni possiedono, spesso, vaste esperienze e conoscenze sulle pratiche migliori, che possono essere condivise. Nella fase di preparazione delle valutazioni programmate, tipicamente si attua una qualche raccolta di dati e di informazioni da sottoporre allorganizzazione che esegue le valutazioni. Programmazioni e pianificazioni coordinate aiuteranno ad assicurare che, per ciascuna area da indagare, sia assegnato un tempo adeguato e che sia disponibile personale sufficiente per rispondere alle domande e per fornire assistenza alle attivit di valutazione. Durante la fase di valutazione, importante sapere chi il responsabile dei valutatori e degli ispettori per il tempo nel quale sono presenti nella struttura. Una descrizione chiara su quali informazioni si possono dare a queste persone e in quale forma, aiuter la struttura durante tutto il processo di valutazione e di ispezione. Dopo le valutazioni, dovranno essere presi in considerazione i problemi identificati. Di solito, viene presentata una risposta scritta. Test di valutazione delle prestazioni per laboratori I test che valutano le prestazioni di un laboratorio o proficiency testing (PT) sono un mezzo per determinare che i sistemi di analisi (dai metodi alle forniture e agli strumenti) stanno funzionando come ci si attende. Il CMS richiede, quale condizione per la certificazione, che i
laboratori partecipino, e con successo, a un programma approvato di PT, per ogni specialit e per ogni analita che, di norma, indagano. Quando non esiste un programma di PT approvato per uno specifico analita, il laboratorio deve disporre un metodo alternativo per verificare, almeno due volte lanno, laccuratezza dellindagine svolta2. I PT debbono essere condotti usando i processi e le condizioni di lavoro routinarie, se essi sono intesi ad ottenere informazioni significative. Il trattamento e lanalisi dei campioni sottoposti a PT dovrebbero essere gli stessi che riguardano i campioni di pazienti o di donatori. Va documentato il riesame da parte di un supervisore della relazione riassuntiva sulle valutazioni, come pure le indagini eseguite e le azioni correttive messe in opera per i risultati inaccettabili. Il personale che sovraintende alla qualit dovrebbe monitorare il programma di PT e verificare che il sistema di analisi si mantenuto sotto controllo e che, quando indicato, sono state prese appropriate azioni correttive. Miglioramento dei processi Il miglioramento continuo uno scopo fondamentale di ogni sistema di gestione della qualit. In Medicina Trasfusionale, questo scopo legato allobiettivo della sicurezza del paziente e alle aspettative di trattamenti sanitari della pi elevata qualit. Limportanza di identificare, investigare, correggere e prevenire problemi non pu essere, comunque, esagerata. Il processo di sviluppo di piani di azioni correttive e preventive contempla lidentificazione dei problemi e delle loro cause, nonch il riconoscimento e la valutazione delle soluzioni atte a prevenire problemi futuri. Esso deve comprendere un metodo per la raccolta e lanalisi dei dati, cos come i controlli nel corso del tempo per valutare lefficacia delle azioni intraprese. Nelle pubblicazioni della AABB e della Societ Americana per la qualit si possono reperire gli strumenti statistici adatti e le loro applicazioni 27,28. Gli Standard JCAHO per il miglioramento delle prestazioni sono elencati nella Tabella 1.6. Unazione correttiva viene definita come
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Tabella 1.6 - Standard JCAHO applicabili per un miglioramento delle prestazioni Vengono raccolti dati per misurare le prestazioni relative a procedure ad alto rischio, compresa lutilizzazione del sangue. I dati relativi alle prestazioni vengono sistematicamente aggregati e analizzati per determinare, nel corso del tempo, il livello delle prestazioni correnti, la tipologia e le tendenze. Si valutano, per quanto riguarda le prestazioni, le tipologie e le tendenze non desiderabili. Vengono analizzate tutte le reazioni trasfusionali, che sono state confermate. Esiste un processo definito per identificare e gestire i gravi eventi sfavorevoli. Vanno documentate le analisi sulle cause prime e le azioni correttive intraprese. Le informazioni ottenute dallanalisi dei dati vengono utilizzate per migliorare le prestazioni, la sicurezza dei pazienti e per minimizzare i rischi di gravi eventi sfavorevoli. La struttura definisce e realizza un programma per identificare, in maniera proattiva, le opportunit per un miglioramento. Vengono messe in opera azioni preventive e monitorate riguardo alla loro efficacia. unazione intrapresa per eliminare le cause di non conformit esistenti o di altre indesiderabili situazioni per prevenirne la iterazione1(p94). Lazione preventiva definita come lazione presa per eliminare le cause di una potenziale non conformit o di altre situazioni indesiderabili, al fine di prevenirne il verificarsi. Lazione correttiva pu essere intesa come un approccio reattivo a problemi segnalati,che comportano una componente preventiva, mentre lazione preventiva pu essere intesa come un approccio proattivo, risultante dallanalisi dei dati e delle informazioni. Al contrario, lazione riparatrice viene definita come unazione intrapresa per attenuare i sintomi di non conformit esistenti o di ogni altra situazione indesiderabile27,28. Lazione riparatrice diretta soltanto allindicatore visibile di un problema, non alla sua causa reale (cfr. il quadro comparativo di Tabella 1.7). Efficaci azioni correttive e preventive non possono essere messe in atto sino a che non si sia determinata la causa sottostante e si sia valutato il processo, in relazione ad altri processi. Pendenti tali valutazioni, pu essere auspicabile mettere in atto azioni riparatrici provvisorie. Identificazione dei problemi e delle loro cause Fonti di informazione per le attivit volte al miglioramento dei processi comprendono: deviazioni di prodotti ematici e di altro tipo, prodotti e servizi non conformi, reclami da parte dei clienti, registrazioni di CdQ, proficiency testing (PT), verifiche interne, indicatori di qualit, verifiche esterne. Si possono approntare programmi di monitoraggio attivo, per aiutare a identificare le aree problematiche. Tali programmi dovrebbero essere rappresentativi dei processi della struttura, coerenti con gli obiettivi organizzativi e riflettere
Tabella 1.7 - Comparazioni fra azioni riparatrici, correttive e preventive29 Azione Riparatrice Correttiva Preventiva Problema Esistente Esistente Non esistente Approccio Reattivo Reattivo Proattivo* Esito Attenua i sintomi Previene il ripetersi Previene la comparsa
* Cio, in grado di produrre cambiamenti
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le necessit dei clienti. La preparazione di un riesame annuale sulla qualit della struttura, nel quale vengano raccolti e analizzati i dati da tutte queste fonti, pu essere uno strumento valido a identificare i problemi per migliorare le prestazioni. Una volta identificati, i problemi debbono essere analizzati per determinarne la portata, i potenziali effetti sulla qualit e sulla operativit, la frequenza relativa e lestensione delle loro variabilit. Tale analisi importante per evitare di alterare processi che hanno mostrato variazioni nellambito di normalit o problemi di scarso impatto. Lidentificazione delle cause sottostanti a condizioni o problemi indesiderabili pu essere effettuata da una persona o da un gruppo di persone. Pi un problema complesso e pi il processo coinvolto, maggiore la necessit di arruolare un gruppo di persone e di formalizzare le analisi. I tre strumenti, pi comunemente utilizzati per identificare in maniera obiettiva le cause sottostanti, sono: usare diagrammi di flusso che analizzano il processo, usare il perch ripetitivo e utilizzare diagrammi di causa-effetto. Il diagramma di flusso del processo offre un quadro dettagliato delle molteplici attivit e dei punti decisionali importanti, allinterno del processo. Il perch ripetitivo si utilizza per
Personale Procedure
Addestramento inadeguato Incarichi multipli Organico inadeguato Troppa fretta
esaminare retrospettivamente il processo. Ci si domanda, ripetutamente perch accaduto questo? fino a che: 1) non si possono ottenere nuove informazioni, 2) la via causale non pu essere seguita per mancanza di informazioni o 3) ulteriori indagini siano impraticabili, impossibili od oltre i limiti dellorganizzazione. Luso del perch ripetitivo evita lerrore di interpretare un effetto come la sua causa. Il diagramma causa-effetto, noto anche come digramma di Ishikawa o a lisca di pesce, sfrutta un tipo particolare di brainstorming , che fraziona i problemi in pezzi minuscoli. Un esempio di un diagramma causa-effetto fornito dalla Figura 1.1. Si tratta di un metodo progettato per mettere a fuoco le idee sulle componenti di un processo e dare, contemporaneamente, un quadro rappresentativo delle idee che si generano e delle loro interazioni. Quando si impiega un diagramma causa-effetto, si esaminano gli strumenti, i materiali, le metodiche, lambiente e i fattori umani. Questi strumenti identificano, in tal modo, sia gli errori attivi che quelli latenti. Gli errori attivi sono quelli che hanno un immediato effetto avverso. Quelli latenti sono relativi ad azioni e decisioni pi generali e potenzialmente dannose,che possono rimanere dormienti ma che possono
SOP non chiare Idoneit dei campioni non definita Inadeguate per luso desiderato Non convalidate
Fallimento test
Non programmati Lotto sbagliato Lotto contaminato Fuori calibrazione Lotto scaduto Guasto meccanico Mancata manutenzione Uso errato dei calibratori T ambiente troppo alta Scarsa ventilazione Contaminazione ambiente Mancata pulizia Mancanza di SOP Pulizia inadeguata
Reagenti, forniture
Strumenti
Ambiente
Figura 1.1 - Esempio di diagramma causa-effetto (SOP = standard operating procedure)
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evidenziarsi soltanto quando innescati dalla presenza di fattori circoscritti. La chiave del successo, nel determinare le cause prime, di non fermarsi troppo presto o cadere nella trappola di biasimare una singola persona. La maggior parte dei problemi, in particolare di quelli complessi, riconosce diverse cause prime. Un metodo che pu essere utilizzato, in questi casi, lanalisi di Pareto. Si prepara un diagramma delle cause, in ordine decrescente di frequenza. Le cause che intervengono con maggiore frequenza vengono ritenute le poche essenziali, mentre le restanti vengono considerate le molte futili. Il metodo indica dove dedicare le risorse per ottenere un impatto massimale. Un esempio di un diagramma di Pareto presentato in Figura 1.2. Identificazione e valutazione delle soluzioni Le possibili soluzioni dei problemi vengono identificate durante la fase creativa del
miglioramento dei processi. In questa fase, il brainstorming e i diagrammi di flusso dei processi possono essere di notevole aiuto. Le soluzioni possibili dovrebbero essere valutate in relazione ai limiti organizzativi e ridursi a quelle pi ragionevoli. Le persone che eseguono il processo sono, di solito, quelle dalle quali si possono ricavare le maggiori conoscenze su quale soluzione funzioner. Esse dovrebbero essere coinvolte quando vengono prese in considerazione le possibili soluzioni. Dovrebbero anche essere comprese le persone a conoscenza delle interrelazioni dei processi e con una visione pi globale dellorganizzazione. Le soluzioni prospettate possono fallire, qualora non siano coinvolte le persone che portino tali punti di vista. Le soluzioni potenziali dovrebbero essere messe alla prova prima di una loro totale applicazione, pianificando chiaramente metodi,
Motivi dei rifiuti di provette per crossmatch ordinati per frequenza
Figura 1.2 - Esempio di un diagramma di Pareto
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Percentuale dei campioni rifiutati
Numero campioni rifiutati
obiettivi, tempistica, punti decisionali e algoritmi per ogni risultato possibile della sperimentazione. Le soluzioni di larga scala possono essere sperimentate su basi limitate, quindi estese, se hanno avuto esito positivo, le soluzioni di scala minore possono essere applicate mentre ancora mancano le valutazioni di efficacia. Si dovrebbero, tuttavia, raccogliere i dati per valutare lefficacia delle modifiche proposte. I dati possono essere raccolti con i metodi usati inizialmente per identificare i problemi o con metodiche appositamente progettate per la sperimentazione. Una volta che le soluzioni siano state testate con successo, si pu passare alla loro totale realizzazione. Dopo la realizzazione, si dovrebbero raccogliere dati, almeno su base periodica, per garantire che il processo sia adeguatamente tenuto sotto controllo. Ambiente di lavoro La struttura deve mettere a disposizione un posto di lavoro sicuro, con adeguati controlli dellambiente e procedure di emergenza per la sicurezza dei dipendenti, dei donatori, dei pazienti e di tutti gli altri residenti o visitatori1(p18). Debbono essere in vigore procedure per prendere in considerazione: la sicurezza globale; la preparazione a possibili disastri; la sicurezza biologica (per patogeni a partenza ematica); la sicurezza chimica; la sicurezza dagli incendi; la sicurezza dalle radiazioni, se pertinente; leliminazione di sangue, di emocomponenti e di tessuti. Le vigenti norme di cGMP richiedono di pianificare la qualit e la tenuta sotto controllo dellambiente fisico di lavoro, comprendendo: spazi e ventilazione adeguati; igiene e smaltimento dei rifiuti; strumentazione per il controllo della qualit di aria, pressione, umidit e temperatura; sistemi idrici; strutture per bagni e lavaggio delle mani. Una valutazione delle infrastrutture e dei loro
limiti, prima di mettere in opera procedure o strumentazioni, aiuter ad assicurare la massima efficienza e la massima sicurezza. Nel successivo Capitolo 2, si potr trovare una trattazione pi approfondita su strutture e sicurezza.
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005. Code of federal regulations. Title 42 CFR Part 493. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). Code of federal regulations. Title 21 CFR Parts 606, 610, 630, and 640. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). Code of federal regulations. Title 21 CFR Parts 210 and 211. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). Food and Drug Administration. Guideline for quality assurance in blood establishments. Docket #91N-0450. ( July 11, 1995) Rockville, MD: CBER Office of Communication, Training, and Manufacturers Assistance, 1995. Hospital accreditation standards. Oakbrook Terrace, IL: Joint Commission Resources, Inc., 2004. College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program checklists. Chicago, IL: College of American Pathologists, 2003. A quality system model for health care; NCCLS approved guideline (HS1-A). Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2002. ANSI/ISO/ASQ Q9000-2000 series-quality management standards. Milwaukee, WI: ASQ Quality Press, 2000. Baldrige National Quality Program. Health care criteria for performance excellence. Gaithersburg, MD: National Institute of Standards and Technology, 2004 (revised annually). Quality program implementation. Association Bulletin 97-4. Bethesda,MD: AABB, 1997. Juran JM, Godfrey AB. Jurans quality handbook. 5th ed. New York:McGraw-Hill, 1999. Food and Drug Administration. Guidance on general principles of process validation. (May 1,
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Manufacturers Assistance, 2003. 21. Reporting donor fatalities. Association Bulletin #04-06. Bethesda,MD: AABB, 2004. 22. Food and Drug Administration. Draft guidance for industry: Biological product deviation reporting for blood and plasma establishments. (August 10, 2001) Rockville, MD:CBER Office of Communication, Training, and Manufacturers Assistance, 2001. 23. Code of federal regulations. Title 21 CFR Part 803. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). 24. Shulman IA, Lohr K, Derdiarian AK, et al. Monitoring transfusionist practices: A strategy for improving transfusion safety. Transfusion 1994;34:11-15. 25. Becker J, Blackall D, Evans C, et al for the Scientific Section Coordinating Committee. Guidelines for blood utilization review. Bethesda,MD: AABB, 2001. 26. Strauss RG, Blanchette VS, Hume H. National acceptability of American Association of Blood Banks Hemotherapy Committee guidelines for auditing pediatric transfusion practices. Transfusion 1993;33:168-71. 27. Anderson TD. Tools for statistical process control. In: Ziebell LW, Kavemeier K, eds. Quality control: A component of process control in blood banking and transfusion medicine. Bethesda,MD: AABB Press, 1999:13-48. 28. Russell JP, Regel T. After the quality audit. 2nd ed.Milwaukee,WI: ASQ Quality Press, 2000. 29. Motschman T. Corrective versus preventive action. AABB News 1999;21(8):5,33.
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Appendice 1.1. - Glossario dei pi comuni termini usati per la qualit
Analisi e ispezione finale Calibrazione
Verifica, mediante osservazioni, esami, e/o test, che il prodotto o il servizio finale sono conformi agli specifici requisiti. Paragone fra misure eseguite con uno strumento e quelle effettuate con strumenti pi accurati o con standard, al fine di individuare, registrare ed eliminare errori nelle misurazioni. Abilit di un processo controllato di fornire un servizio o un prodotto che corrispondono ai requisiti. Anche una misura statistica della variabilit intrinseca del processo per una data caratteristica, relativa alle specifiche del progetto. La formula, pi largamente accettata, per la conformit del processo il sei sigma (six sigma). Procedure stabilite per pianificare, documentare, comunicare ed eseguire modifiche nelle infrastrutture, nei processi, nei prodotti o nei servizi. Vengono comprese: proposte, analisi, processi decisionali, approvazioni, realizzazioni, revisioni successive delle modifiche. Il controllo formale delle modifiche fornisce un mezzo per misurare la stabilit e la sicurezza ed evita modifiche arbitrarie che potrebbero influire sulla qualit. Tecniche e attivit operative usate per monitorare ed eliminare le cause di prestazioni insoddisfacenti ad ogni stadio di un processo. Dimostrazione, mediante evidenze oggettive, che i requisiti per una specifica applicazione o per un uso designato sono stati soddisfatti. La convalida assicura che processi nuovi o modificati e le procedure sono in grado di soddisfare regolarmente specifici requisiti, prima della loro applicazione. Strumento grafico usato per determinare se la distribuzione del valori dei dati generati da un processo stabile nel tempo. Il diagramma traccia i dati statistici rispetto al tempo e aiuta a stabilire se un processo sotto o fuori controllo, secondo criteri definiti (per esempio: uno spostamento da una linea centrale o una tendenza verso limiti di accettabilit verso lalto o verso il basso). (Design output). Documenti, registrazioni ed evidenze in qualsiasi altro formato usati per verificare che gli scopi della progettazione sono stati conseguiti. I risultati dovrebbero identificare le caratteristiche di un prodotto o di un servizio, cruciali per la sicurezza e la funzionalit e in grado di corrispondere ai requisiti normativi. Gli esempi al riguardo comprendono: SOP, specifiche per le forniture, per i reagenti e per gli strumenti, identificazione dei requisiti per i CdQ, i risultati delle attivit di verifica e convalida. Attivit che interessano la pianificazione, il controllo, la valutazione e le relazioni sulla qualit, e i miglioramenti necessari per assicurare che un prodotto o un servizio corrispondano a definiti standard o requisiti di qualit.
(segue)
Conformit del processo
Controllo delle modifiche
Controllo di qualit Convalida
Diagramma di controllo
Elementi in uscita della progettazione
Garanzia di qualit
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Gestione della qualit
La struttura organizzativa, i processi e le procedure necessarie per assicurare che vengano soddisfatte le intenzioni e le indicazioni complessive di un programma di qualit di unorganizzazione e che la qualit dei prodotti e dei servizi assicurata. La gestione della qualit comprende una pianificazione strategica, lallocazione delle risorse e altre attivit sistematiche, quali la programmazione, la realizzazione e la valutazione della qualit. Aspetti misurabili dei processi e dei risultati che offrono unindicazione sulle condizioni o sulle tendenze nel tempo di una prestazione. Sono usati per monitorare i progressi verso scopi e obiettivi stabiliti di qualit. Dimostrazione che unentit in grado di corrispondere a requisiti specifici. Verifica degli attributi che debbono essere corrispondenti o soddisfacenti, perch una persona o una cosa siano considerate in grado di esaudire specifici requisiti. Per esempio, uno strumento pu essere qualificato a un determinato uso con la verifica delle caratteristiche di prestazione, quali la linearit, la sensibilit e la facilit duso. Un dipendente pu essere qualificato, in base alle conoscenze tecniche, scolastiche e pratiche e alle abilit sviluppate mediante addestramento, istruzione e prestazioni sul campo. Unesigenza o unaspettativa stabilita od obbligatoria, misurabile od osservabile, necessarie ad assicurare qualit, sicurezza, efficacia o soddisfazione del cliente. I requisiti possono includere le cose che il sistema o il prodotto devono fare, le caratteristiche che devono avere, e il livello di prestazioni che devono raggiungere. Descrizione di una serie di requisiti da soddisfare da parte di prodotti, materiali, o processi che indichino, se del caso, le procedure da utilizzare per stabilire se i requisiti vengono soddisfatti. Spesso, le specifiche sono descrizioni scritte, figure, standard professionali o altri riferimenti descrittivi. Attivit tese a minimizzare le variazioni allinterno di un processo, per far s che esso fornisca un esito prevedibile, conforme alle specifiche. Conferma, mediante esame di evidenze oggettive, che sono stati s soddisfatti specifici requisiti.
Indicatori di qualit
Qualificazione
Requisito
Specifica
Tenuta sotto controllo del processo Verifica
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Appendice 1.2 - Codici delle norme federali di qualit e relativi riferimenti

nCFR 606.20 606.40 606.60 606.65 606.100 606.140 606.160 606.170 606.171 211.22 211.25 211.28 211.160 211.192 211.194 Argomento Personale Struttura Controllo di qualit degli strumenti Forniture, reagenti Procedure operative standard Controlli di laboratorio Registrazioni Reazioni avverse Deviazioni nei prodotti biologici Responsabilit delle unit di controllo e di garanzia di qualit Qualificazione del personale Responsabilit proprie del personale Controlli di laboratorio Revisione delle registrazioni sulla produzione Registrazioni di laboratorio e loro revisioni
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Appendice 1.3 - Tavole statistiche per la distribuzione binomiale*, utilizzate per determinare il numero adeguato di campioni e il livello di confidenza per la validazione di dati accettati/rifiutati
Livelli di confidenza (%) per percentuali di conformit Requisiti per % di conformit 90%
Numero campioni Numero fallimenti
Requisiti per % di conformit 90%

Numero campioni Numero fallimenti
95%
95%
% di confidenza
% di confidenza
10
0 1
65,1 26,4 87,8 60,8 32,3 95,8 81,6 58,9 35,5 98,5 91,9 77,7 57,7 37,1
64,2 26,4 78,5 44,6 87,1 60,1 32,3 -
50
0 1 2 3 4 5
99,5 96,3 88,8 75,0 56,9 38,4 99,8 98,6 94,7 86,3 72,9 56,3 39,4
92,3 71,1 45,9 95,4 80,8 58,3 35,3 -
20
0 1 2
30
0 1 2 3
60
0 1 2 3 4 5 6
40
0 1 2 3 4
Questa tabella risponde alla domanda: Qual il livello di confidenza percentuale (90 o 95) che tutti i prodotti soddisfino le specifiche richieste, se ho esaminato un numero tot di campioni e ho trovato un numero tot di non conformit (fallimenti)?
(segue)
32
Numero minimo di campioni per le percentuali di conformit Requisiti per le percentuali di conformit 90% Livello di confidenza 90% Numero fallimenti 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 95% 99% 95% Livello di confidenza 90% 95% 99% 99% Livello di confidenza 90% 95% 99%
Quantit campioni 22 39 53 66 78 91 104 116 128 140 152 29 47 63 79 90 103 116 129 143 154 167 45 65 83 98 113 128 142 158 170 184 197
Quantit campioni 46 77 106 133 159 184 209 234 258 282 306 59 94 125 180 208 235 260 286 310 336 361 90 130 166 198 228 258 288 317 344 370 397
Quantit campione 230 388 526 664 789 926 1051 1175 1297 1418 299 467 625 773 913 1094 1186 1312 1441 459 662 838 7002 1157 1307 1453 -
Questa tabella risponde alla domanda: Quanti campioni debbo testare con tot numero di fallimenti se voglio avere una percentuale di livello di confidenza del 90%, del 95% o del 99% che il 90%, il 95% o il 99% dei prodotti soddisfi le specifiche?
(segue)
33
Esempi di un numero minimo di campioni e di fallimenti concessi per soddisfare i requisiti AABB nella convalida dei prodotti e nel controllo di qualit Prodotto Concentrati piastrinici da aferesi Requisiti1 Almeno il 90% delle unit deve contenere 3x1011 piastrine e avere un pH 6,2 alla fine della conservazione consentita. Un minimo del 95% delle unit deve contenere un residuo di leucociti <5x106. N campioni2 10 10 N fallimenti 0 1 Livello di confidenza 65 26
Concentrati piastrinici da aferesi leucoridotti Concentrati eritrocitari da aferesi
20 20
0 1
64 26
Almeno il 95% delle unit deve avere >50 g di emoglobina (o 150 mL) in volume di globuli rossi.
20 20
0 1
64 26
Concentrati granulocitari da aferesi
Preparati con un metodo 4 noto per raccogliere 4 un minimo di 1,0x1010 granulociti in almeno il 75% delle unit.
0 1
68 26
Da Silva MA (ed) Standards for Blood Banks and Transfusion Services, 23rd ed, Bethesda.MD. AABB, 2005. Bench gli Standard AABB non richiedano uno specifico livello di confidenza, la struttura pu usare questi requisiti come mezzo per valutare il grado di certezza che ogni prodotto soddisfer alle specifiche. Il periodo di tempo scelto per definire il numero dei campioni determinato dalla struttura. (Nota: Pi lungo il periodo, maggiore sar la difficolt di identificare le cause dei fallimenti e maggiore il numero dei prodotti gi distribuiti, che possono essere richiamati).
* Nota generale. I dati riportati nelle tre tabelle dellAppendice 1.3 derivano dal Centro analisi di affidabilit e sono visibili al sito: http//rac.alioscience.com/toolbox/
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Appendice 1.4 - Esempi di valutazioni: utilizzazione del sangue1,2
La Commissione che deve effettuare la revisione delluso del sangue (COBUS) dovrebbe prendere in considerazione le seguenti aree della paratica e sviluppare misurazioni specifiche di monitoraggio dei processi trasfusionali. Poche misurazioni forniscono dati su parecchie attivit. Richiesta di emocomponenti appropriati 1. Errori pre-analitici 2. Unit trasfuse Errori nella raccolta dei campioni, negli ordinativi a voce, nelle richieste. Numero per ciascun tipo di emocomponente e per preparazioni speciali. Uso di sangue autologo e prelevato a donatore dedicato. Analizzare per ciascun servizio clinico o per ciascun medico prescrittore. Numero totale di pazienti che hanno ricevuto i vari tipi di emocomponenti o prodotti elencati al punto 2. Numero medio di unit di ciascun emocomponente o prodotto dati ai pazienti riceventi tale emoconponente. Pu essere utile analizzare per diagnosi o per procedura chirurgica/medica. Numero e relativa percentuale di unit leucoridotte, irradiate o preparati citomegalovirus-negativi; quantit preparate e trasfuse; trasfusioni ambulatoriali o a domicilio. Numero e percentuale delle unit consegnate e rientrate perch non utilizzate. Analisi per reparto, per servizio clinico o per prescrittore. Numero di unit crociate diviso per numero di unit trasfuse. Lanalisi potrebbe essere fatta per lintero istituto, per le richieste durgenza contro quelle di routine, per reparto clinico, per procedure chirurgiche o per medico prescrittore, se necessario. Verifica che le linee guida sono aggiornate, appropriate per la popolazione di pazienti trattati e prontamente disponibili per i medici.
3. Pazienti trasfusi 4. Unit trasfuse per paziente 5. Componenti speciali e trasfusi 6. Unit non utilizzate e rese 7. Rapporto unit crociate su unit trasfuse (C:T)
8. Linee guida trasfusionali
Preparazione e distribuzione di emocomponenti 1. Tempo intercorrente (Turnaround time, TAT) 2. Richieste durgenza Intervallo fra quando si ricevuta una richiesta e il momento nel quale lunit disponibile e/o trasportata al letto del paziente. Si pu analizzare per richieste durgenza, di routine o relative a interventi chirurgici. Numero e percentuale possono essere analizzati per servizio clinico, per medico prescrittore, per diagnosi o per lasso di tempo (settimanale, giornaliere, per turno). Numero e percentuale di unit distribuite senza prove di compatibilit o con test pretrasfusionali abbreviati. Possono essere analizzate per reparto clinico o per medico prescrittore.
(segue)
3. Unit non crociate
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4. Et degli emocomponenti Et delle unit in giacenza e crociate per ABO ed Rh, et delle unit al alla distribuzione momento del ricevimento dal fornitore, et al momento della trasfusione, et della restituzione al fornitore. 5. Cancellazione di interventi chirurgigi per indisponibilit di sangue 6. Variazioni significative nellemogruppo trasfuso dovute a indisponibilit di sangue 7. Tasso di scadenza Numero e percentuale dei casi di rinvii dovuti a indisponibilit di sangue; numero di ore o di giorni di rinvio, analizzati per procedura chirurgica e per causa (presenza di anticorpi in un dato paziente, carenza generale o carenza di specifici tipi ABO o Rh). Numero di pazienti Rh-negativi trasfusi con emazie o piastrine Rh-positive; trasfusioni con plasma ABO-incompatibile.
Numero di unit scadute (non utilizzate alla data di scadenza) diviso per il numero di unit ricevute; il monitoraggio dovrebbe interessare tutti gli emocomponenti e i plasmaderivati. Lanalisi per tipo ABO ed Rh pu essere molto informativa. Numero di unit scartate per rottura, preparazione incongrua, manipolazione o conservazione impropri; unit preparate per un paziente ma non utilizzate; numero di unit che non hanno corrisposto ai requisiti ispettivi.
8. Tasso di scarto
9. Adeguatezza del servizio Numero di ordinativi evasi come richiesto; tempi medi intercorsi fra da parte del fornitore lordinativo e il ricevimento di unit in urgenza; numero di ordinativi di sangue associati ad errori quali ricevimento di ununit errata o unit impropriamente spedite. 10. Requisiti delle prove di compatibilit 11. Politiche e procedure per i controlli di qualit Adeguatezza, aggiornamento e appropriatezza delle politiche e delle procedure. Percentuale delle registrazioni incomplete o anomale relative a temperature, strumenti, preparazione degli emocomponenti, controlli.
Somministrazione di sangue ed emocomponenti 1. Errori o problemi nella Numero di unit erroneamente uscite; numero di unit assegnate al assegnazione e consegna paziente o al reparto sbagliato o trasportate impropriamente. 2. Politiche e procedure di somministrazione del sangue 3. Verifiche sulla somministrazione di sangue Aderenza ai requisiti specifici della struttura nel monitorare pazienti con segni e sintomi di reazioni avverse. Disponibilit di copie delle politiche e procedure correnti, nonch delledizione pi recente della Circolare Informativa sullUso del Sangue Umano e degli Emocomponenti. Sintesi delle revisioni sulle prestazioni in loco, per includere il numero delle deviazioni per categoria (identificazione del paziente e del donatore, documentazione e completezza delle registrazioni mediche). Pu comprendere la verifica sulle richieste e sulle indicazioni delle trasfusioni o sul consenso informato.
(segue)
36
4. Attrezzature per la trasfusione
Revisione dei documenti relativi al controllo di qualit delle attrezzature, ivi inclusi: riscaldatori, pompe da infusione, filtri speciali, set per la somministrazione, documentazione in cartella clinica sulle apparecchiature utilizzate, numero di casi di un loro uso improprio. Revisione della conformit con le politiche relative alle trasfusioni esterne allospedale e alla raccolta peri-operatoria e post-operatoria di sangue autologo.
5. Situazioni trasfusionali particolari
Monitoraggio dei risultati trasfusionali 1. Conformit alle linee guida trasfusionali 2. Reazioni trasfusionali Numero e percentuale di trasfusioni non appropriate, come rilevato dal comitato di revisione sulluso del sangue; analisi delle ragioni delle trasfusioni non appropriate. Numero e percentuale delle reazioni segnalate, lasso di tempo per una investigazione completa, documentazione sulle revisioni effettuate dal Servizio Trasfusionale e dal comitato, documentazione presente in cartella clinica. Numero di casi di infezioni, lasso di tempo per linvestigazione, completezza di revisioni e registrazioni.
3. Malattie trasmesse con la trasfusione
4. Investigazioni retrospettive Numero di casi per agente infettivo, lasso di tempo per le investigazioni, completezza dellindividuazione dei casi, loro notifica, revisione e registrazione. 5. Revisioni di politiche e procedure Adeguatezza, aggiornamento e appropriatezza delle politiche e delle procedure per individuate e riportare gli effetti sfavorevoli della trasfusione.
Dati sulla gestione 1. Carichi di lavoro e produttivit Valutazione sulle attivit e sullefficienza del laboratorio; lanalisi pu essere per giorno della settimana o per turni. Le ore lavorate per unit trasfusa o per paziente trasfuso possono rappresentare una misura pi valida rispetto ai dati ottenuti dai tradizionali calcoli di produttivit. Numero di eventi riguardanti i processi di laboratorio (ed esempio: etichettatura, preparazione, esami, assegnazione); eventi procedurali relativi alla somministrazione del sangue; errori, incidenti e richiami da parte dei fornitori. Documentazione delladdestramento e della competenza continuativa del personale di laboratorio e infermieristico per eseguire le procedure e le politiche legate alla trasfusione
2. Relazione sugli eventi
3. Addestramento e competenza del personale

1.
Comprehensive accreditation manual for hospitals. The official handbook. Oakbrook Terrace, IL: Joint Commission Resources, Inc., 2002. 2. Becker J, Blackall D, Evans C, et al for the Scientific Session Coordinating Committee. Guidelines for blood utilization review. Bethesda, MD: AABB, 2001. Le due citazioni bibliografiche qui sopra sono richiamate, con asterisco, nel titolo di Appendice 1.4.
37
AABB Manuale Tecnico
38
Capitolo 2: Strutture Trasfusionali e sicurezza
Capitolo 2
Strutture Trasfusionali e sicurezza
La progettazione e la manutenzione di una Struttura Trasfusionale sono elementi critici al fine di assicurare che le necessit operative siano rispettate e che lambiente di lavoro sia sicuro, sia per i dipendenti che per i visitatori. Tutti i seguenti fattori dovrebbero essere presi in considerazione nel piano per la gestione della struttura: la disposizione degli spazi fisici, la gestione di servizi quali acqua e ventilazione, i flussi del personale, dei materiali e dello smaltimento dei rifiuti, i fattori ergonomici. Oltre ad assicurare ladeguatezza della struttura, lorganizzazione deve studiare e realizzare un programma di sicurezza, che definisca le politiche e le procedure per esercitare in modo sicuro le attivit lavorative. Ci comprende le comunicazioni su possibili rischi, luso di dotazioni protettive personali, laddestramento, la valutazione delle competenze riguardo alle norme di legge sulla preparazione alle emergenze ed ai disastri, ligiene chimica, i patogeni trasmessi con la trasfusione e la sicurezza alle radiazioni, se del caso. Tutti i dipendenti sono responsabili per la protezione della propria sicurezza e per quella altrui, aderendo alle politiche vigenti nel programma di sicurezza della struttura. LAABB richiede alle Banche del Sangue e ai Servizi Trasfusionali accreditati di pianificare, realizzare e mantenere un programma, che minimizzi i rischi per la salute e la sicurezza di donatori, pazienti, volontari e dipendenti dai rischi biologici, chimici e radiologici 1(p88) . Altre organizzazioni professionali e di accreditamento,
quali il CAP (College of American Pathologists), il CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute, [precedentemente noto come NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards)], la JCAHO (Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations) hanno programmi per la sicurezza simili o ancor pi approfonditi2-5. Molte agenzie federali hanno pubblicato normative e raccomandazioni per la sicurezza dei lavoratori e del pubblico. Quelle pertinenti allambiente sanitario sono elencate nellAppendice 2.1 di questo capitolo. I contenuti di queste norme e linee guida sono approfonditamente discussi in ogni sezione di questo secondo capitolo. Le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali dovrebbero anche consultarsi con le agenzie statali e locali per conoscere ogni eventuale requisito di sicurezza addizionale. Le organizzazioni commerciali e professionali forniscono anchesse raccomandazioni sulla sicurezza, importanti per le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali. Anche queste organizzazioni sono citate nellAppendice 2.1.
Strutture
Progettazione della struttura e flussi di lavoro Idonei progetti per la costruzione e la manutenzione delle strutture e lorganizzazione del lavoro possono ridurre o eliminare molti possibili rischi. Progetti, manutenzione e
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organizzazione del lavoro possono anche influenzare lefficienza, la produttivit, i tassi di errore, la soddisfazione di dipendenti e clienti e la qualit di prodotti e servizi. Negli stadi progettuali che pianificano la sicurezza architettonica per spazi, arredamenti e magazzini, si dovrebbero consultare le norme statali e locali sulledilizia. Durante i progetti per nuovi spazi, si dovrebbero prendere in considerazione la collocazione e i flussi del personale, dei materiali e delle apparecchiature, nel contesto dei processi da eseguire. Debbono essere previsti spazi adeguati per i movimenti del personale, per la sistemazione delle forniture e degli strumenti di maggior volume e per le zone riservate e prive di distrazione per certi compiti di lavoro (ad esempio il colloquio con i donatori, le revisioni delle registrazioni, letichettatura degli emocomponenti). La struttura deve essere in grado di mettere a disposizione spazi puliti e sporchi e controllare il movimento di materiali e rifiuti, dentro e fuori queste zone, per evitare contaminazioni. Le cappe per laspirazione di fumi chimici e le cabine di sicurezza biologica dovrebbero essere sistemate lontano dalle correnti daria e dalle zone ad elevato traffico. Si debbono anche considerare numero e collocazione delle docce oculari e delle docce di emergenza, nonch la presenza di prese dacqua per la preparazione di reagenti. Il personale che maneggia materiali pericolosi deve avere un rapido accesso ai lavandini per lavarsi le mani. Per certe apparecchiature pesanti, quali gli irradiatori, si deve prevedere le capacit dei pavimenti di sopportarne il carico. I laboratori debbono essere progettati con illuminazione ed energia elettrica adeguate e prese di corrente sistemate in modo conveniente. Si devono prevedere per le emergenze sorgenti alternative e ininterrotte di energia elettrica e generatori di emergenza, al fine di assicurare che non si verifichi la perdita di emocomponenti durante le sospensioni nellerogazione dellenergia. Si usa, di norma, il Codice Nazionale Elettrico come linea guida per progettare sistemi essenziali di distribuzione dellelettricit, con eventuali modifiche approvate dalle locali autorit edilizie, che hanno competenza giurisdizionale.
Si debbono usare appropriati sistemi per il riscaldamento, la ventilazione e il condizionamento dellaria. Si dovrebbero prendere in considerazione sistemi di monitoraggio degli ambienti per i laboratori che debbono mantenere differenziali positive e negative della pressione ambientale o dove vengono utilizzati sistemi di filtrazione dellaria, al fine di controllare i livelli delle particelle disperse. Le specifiche per la ventilazione, accettate in campo nazionale, sono pubblicate dalla ASHRAE (American Society of Heating, Refrigeratine and Air-conditioning Engineers)7. Pulizia e gestione degli ambienti I posti di lavoro dovrebbero essere mantenuti puliti e in ordine. Le superfici di lavoro e le apparecchiature dovrebbero essere pulite e disinfettate con regolarit. Quanto pu accumulare polvere o detriti non dovrebbe essere posato sulle superfici di lavoro o sui materiali. Le vie di fuga e i sistemi antincendio non debbono essere bloccati o ostruiti in alcun modo. Dovrebbero essere delineate chiaramente le linee guida sui ripostigli e sullo smaltimento di materie solide non pericolose, cos come quello di scorie comportanti un pericolo biologico, chimico o da radiazioni. Per ogni area di lavoro, si dovrebbero definire le responsabilit, i metodi e i programmi di gestione degli ambienti. Per lavorare in modo sicuro, sono essenziali: procedure scritte, addestramento iniziale, formazione continua del personale, monitoraggio continuativo dellefficienza della gestione degli ambienti. Aree riservate Le aree pericolose dovrebbero essere chiaramente e uniformemente identificate con avvisi di allarme redatti secondo gli standard federali della OSHA (Occupational Safety and Health Administration) e della NRC (Nuclear Regulatory Commission), in modo che il personale che vi entra o che vi lavora sia edotto sui pericoli biologici, chimici e da radiazioni8-11. Il personale di norma non assegnato a queste aree dovrebbe ricevere un addestramento adeguato per evitare di autodanneggiarsi. Le zone a rischio possono
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essere classificate. Per esempio, le zone ad alto rischio dovrebbero comprendere quelle con cappe di aspirazione per fumi chimici, le cabine di sicurezza e le aree di stoccaggio per sostanze chimiche volatiti o per radioisotopi. Le zone dove si svolgono lavori tecnici si possono considerare a rischio moderato e riservate esclusivamente al personale di laboratorio. Le zone dedicate ad attivit amministrative e impiegatizie potrebbero essere considerate a basso rischio e non essere sottoposte a restrizioni. Ogni qualvolta sia possibile, le attivit che non richiedono precauzioni particolari dovrebbero essere separate da quelle svolte in aree riservate. Si dovrebbe compiere ogni possibile sforzo per evitare le contaminazioni delle aree definite pulite e le apparecchiature comuni. I telefoni delle aree lavorative possono essere equipaggiati con altoparlanti per eliminare la necessit di sollevare il ricevitore. Le tastiere dei computer e i telefoni possono essere coperti con materiali plastici. Essi dovrebbero essere puliti con regolarit e, comunque, ogni volta che siano visibilmente sporchi. I dipendenti dovrebbero togliersi i loro personali mezzi di protezione, quali guanti e camici di laboratorio, e lavarsi le mani con acqua e sapone, prima di lasciare unarea contaminata. Problemi di sicurezza impongono che non vi siano visitatori casuali nelle zone dove ci si pu imbattere in rischi da laboratorio12. In particolare, non si dovrebbe permettere ai bambini laccesso a zone, dove potrebbero essere esposti a pericoli, e dovrebbero essere strettamente sorvegliati in quelle zone dove la loro presenza permessa. Le strutture dovrebbero prendere in considerazione di redigere specifiche linee guida sulla sicurezza dei visitatori che per motivi di lavoro devono accedere ad aree riservate, e di documentare che le informazioni loro fornite sono state ricevute e comprese. Unit mobili di raccolta sangue La raccolta di sangue in unit mobili pu presentare problemi specifici. Un esperto nei principi della sicurezza dovrebbe effettuare una visita anticipata al luogo della raccolta, per assicurarsi che i pericoli siano minimi. Tutto il
personale delle unit mobili dovrebbe essere addestrato a riconoscere le condizioni non sicure e a comprendere le politiche e le procedure sul controllo delle infezioni, ma la responsabilit della sicurezza del luogo della raccolta dovrebbe essere assegnata ad un dipendente con maggiore anzianit. In qualsiasi posto di raccolta sangue, essenziale la presenza di lavandini per lavarsi le mani. Superfici con moquette o difficili da pulire possono essere ricoperte con uno strato assorbente impermeabile cos da proteggerle contro possibili schizzi di sangue. Paraventi mobili e nastri di demarcazione sono utili per indirizzare il flusso del traffico e mantenere protette le aree di lavoro. Le zone di ristoro dovrebbero essere fisicamente separate da quelli di raccolta e di conservazione del sangue. Il materiale di scarto contaminato da sangue deve essere o riportato alla struttura centrale per la sua eliminazione o impacchettato e decontaminato, impiegando sterilizzatori termici (autoclavi, inceneritori) o disinfettanti chimici, nel rispetto delle norme locali riguardanti i rifiuti sanitari. Personale addestrato deve compiere tale decontaminazione, facendo particolare attenzione alla pulizia delle unit mobili, dopo la raccolta del sangue. Ergonomia Nella progettazione delle strutture dovrebbero essere considerate lergonomia (interazione fra individui e tecnologie) e la sistemazione dei dipendenti, tutelate dallAtto per gli Americani Disabili (42 USC 12101-12213, 1990). Numerosi fattori possono contribuire allaffaticamento, ai disturbi muscolo-scheletrici o alle lesioni che colpiscono i dipendenti, comprese quelle elencate qui di seguito13: posture scomode: posizioni che procurano stress al corpo, quali allungamenti, torsioni, piegamenti, genuflessioni o accoccolamenti; ripetizioni: il ripetere continuamente o frequentemente gli stessi movimenti; sforzi: linsieme degli sforzi fisici richiesti per compiere un lavoro; punti di pressione: il premere parti del corpo contro superfici dure o taglienti;
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vibrazioni: oscillazioni continue o ad alta intensit di mani, braccia o dellintero corpo; altri fattori: temperature troppo alte o troppo basse, illuminazione troppo scarsa o troppo brillante. Sia il tempo totale per turno che lunghi periodi di impegno ininterrotto possono essere significativi nel determinare problemi. Le azioni correttive di problemi correlati allergonomia possono essere le seguenti: miglioramenti tecnologici per ridurre o eliminare le cause di base, quali modifiche negli strumenti, nelle postazioni di lavoro o nei materiali; miglioramenti amministrativi, quali: variare i compiti, adattare i programmi e i ritmi di lavoro, concedere tempi di recupero o di relax, modificare le pratiche lavorative, assicurare la regolare pulizia e manutenzione degli spazi di lavoro, degli strumenti e delle apparecchiature; incoraggiare lesercizio fisico; fornire dispositivi di sicurezza, quali guanti, ginocchiere, paragomiti, calzature o altri articoli che i dipendenti indossino per proteggersi dai danni fisici.
Programma per la sicurezza

Un efficace programma per la sicurezza inizia con un piano ben congegnato. Il piano di sicurezza identifica i requisiti normativi che si debbono applicare e descrive come essi saranno osservati. In linea generale si richiede alle strutture di: fornire spazi di lavoro privi di rischi riconosciuti; valutare tutte le procedure per la possibile esposizione a rischi; valutare la posizione di ogni singolo dipendente per lesposizione a possibili rischi; identificare le aree e i materiali a rischio, con opportune etichette e segnalazioni; istruire il personale, documentarne laddestramento, monitorarne lapplicazione; applicare gli Standard Precauzionali (ivi comprese le Precauzioni Universali e quelle sul sangue e sui liquidi organici) nel
maneggiare sangue, liquidi organici e tessuti; eliminare, in maniera appropriata, i rifiuti pericolosi; segnalare gli incidenti e gli eventi accidentali, trattarli e controllarli nel tempo; revisionare continuativamente le politiche, le procedure, il funzionamento e le attrezzature per la sicurezza; sviluppare le politiche della struttura riguardanti la preparazione e la risposta ai disastri. I programmi per la sicurezza dovrebbero prendere in considerazione le necessit di tutte le persone che possono essere influenzate dallambiente di lavoro. pi importante, ovviamente, la sicurezza del personale tecnico, ma si debbono anche valutare i potenziali rischi riguardanti i donatori, gli ausiliari, i volontari, i visitatori, il personale di pulizia e manutenzione, nonch gli operai presenti per eventuali riparazioni. Si debbono applicare appropriati provvedimenti, qualora queste persone non possano essere escluse dalle zone a rischio. I laboratori dovrebbero nominare un dirigente della sicurezza, che sia in grado di fornire consigli ed esperienza 3. Questa persona potrebbe stendere il programma di sicurezza, supervisionare orientamento e addestramento, eseguire verifiche ispettive sulla sicurezza, esercitare la sorveglianza sui posti di lavoro, raccomandare cambiamenti, partecipare o dirigere le attivit dei comitati per la sicurezza. Si raccomanda che le strutture che utilizzano materiali chimici o sostanze radioattive pericolose nominino un dirigente igienista esperto in chimica e un dirigente esperto in sicurezza dalle radiazioni per sovrintendere ai relativi programmi di prevenzione 9-11. Un direttore per la sicurezza generale, dotato di sufficiente esperienza, pu ricoprire questi ruoli o possono essere nominati dirigenti distinti, mentre la sorveglianza sul programma pu essere affidata al comitato per la sicurezza. Esistono cinque elementi basilari che debbono essere presi in considerazione in un programma di sicurezza, per ciascun tipo di rischio: 1. addestramento;
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2. identificazione e comunicazione dei rischi; 3. controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali; 4. pratiche di lavoro sicure, ivi compresa leliminazione dei rifiuti; 5. piani di risposta alle emergenze. Dovrebbero, inoltre, essere introdotti controlli da parte della direzione allo scopo di assicurare che i succitati elementi siano attuati ed efficaci. La direzione responsabile di: 1. sviluppo e comunicazione del piano messo per iscritto; 2. garanzia della realizzazione del piano e della disponibilit di risorse adeguate; 3. accesso del personale ai servizi sanitari, relativi alle strategie di prevenzione e alla cura delle esposizioni a rischi; 4. monitoraggio dellapplicazione da parte del personale e dellefficacia del piano; 5. valutazioni e miglioramenti del piano di sicurezza. Elementi di base di un programma di sicurezza Addestramento Il personale deve rendersi conto dei pericoli presenti sul posto di lavoro e prendere le precauzioni appropriate, per gestirli con sicurezza. Il mandato per i programmi di addestramento del personale si basa sulle buone pratiche generali e sui requisiti fissati dalla OSHA 9-11. Tutte le persone debbono essere addestrate a proteggersi, prima che inizino un lavoro con materiali pericolosi. I supervisori o i loro sostituti sono responsabili di documentare la comprensione da parte del personale e la capacit di applicare le precauzioni di sicurezza, prima che venga loro permesso di lavorare in autonomia. Laddestramento sulla sicurezza deve precedere lassegnazione, anche temporanea, di unattivit, se esistono significative possibilit di esposizione al rischio. Il personale che non dimostra lapprendimento e labilit richiesti deve essere sottoposto a un ulteriore addestramento. I requisiti richiesti non si applicano soltanto al personale di laboratorio, ma
anche a quello di pulizia e ad altri dipendenti che possano venire in contatto con sostanze o rifiuti pericolosi. La Tabella 2.1 elenca gli argomenti che devono essere inclusi nei programmi di addestramento per la sicurezza sul lavoro. Identificazione e comunicazione del rischio I dipendenti debbono sapere se stanno lavorando con sostanze pericolose e debbono conoscere dove queste si trovino sul posto di lavoro. Ai datori di lavoro viene richiesto di fornire ai dipendenti informazioni circa i rischi legati al posto di lavoro, per aiutare a limitare i rischi di malattie o di lesioni professionali. Ci viene ottenuto per mezzo di avvisi, etichette sui contenitori, informazioni scritte e programmi di addestramento. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali Ogni qualvolta sia possibile, lo spazio fisico di lavoro dovrebbe essere progettato in modo da eliminare qualsiasi potenziale esposizione. Quando questo non possibile, si debbono fornire al personale dipendente dispositivi di protezione. I controlli tecnologici pertinenti sono controlli degli impianti tecnici o di strumenti come i sistemi antincendio, le cappe per laspirazione di fumi chimici e i sistemi di protezione dagli aghi, che isolano o rimuovono il rischio dal posto di lavoro. I dispositivi di protezione individuali (DPI) sono rappresentati da indumenti o equipaggiamenti speciali, quali i guanti, le maschere e i camici da laboratorio, indossati dai dipendenti per la protezione contro i rischi. Una guida generale per limpiego dei controlli tecnologici e dei DPI illustrata nellAppendice 2.2. Pratiche di lavoro sicure Si debbono addestrare i dipendenti a conoscere come lavorare con materiale pericoloso, in modo da proteggere loro, i loro collaboratori e lambiente. Le pratiche di lavoro sicuro vengono definite come compiti svolti in maniera tale da ridurre la probabilit di esporsi ai pericoli legati al posto di lavoro. Raccomandazioni generali al riguardo sono contenute nellAppendice 2.2.
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Tabella 2.1 - Argomenti da trattare in un programma di addestramento per la sicurezza sul lavoro I programmi di addestramento per la sicurezza sul lavoro dovrebbero accertarsi che tutto il personale: abbia accesso a una copia del testo sulle normative pertinenti e a una spiegazione del loro contenuto; comprenda il piano di controllo dellesposizione dei dipendenti e come ottenere una sua copia scritta; comprenda come i virus delle epatiti e HIV vengano trasmessi e quanto frequentemente, abbia familiarit con i sintomi e le conseguenze delle infezioni da HBV, HCV e HIV; sappia che gli viene offerta la possibilit di vaccinarsi contro lHBV; conosca i compiti che comportano rischi di infezione e li distingua da altri doveri; conosca quali indumenti e dispositivi protettivi siano appropriati per le procedure di competenza e come debbano essere usati; conosca e comprenda i limiti di indumenti e dispositivi protettivi (per esempio, che diversi tipi di guanti vengono raccomandati in base alla permeabilit al materiale pericoloso da maneggiare). Il personale dovrebbe essere messo sullavviso riguardo al falso senso di sicurezza; sappia dove sono tenuti gli indumenti e i dispositivi protettivi; abbia familiarit e comprenda tutti i requisiti per le pratiche lavorative specificate nelle SOP (procedure operative standard) per i compiti a lui assegnati, ivi compreso il significato di avvisi ed etichette; conosca come rimuovere, maneggiare, decontaminare ed eliminare materiali contaminati; conosca le azioni appropriate da prendere e le persone da contattare in caso di esposizione a sangue o ad altro materiale biologico, chimico o radioattivo pericoloso; conosca le azioni correttive da attuare nelleventualit di schizzi di liquidi biologici o di una personale esposizione a fluidi, tessuti od oggetti taglienti, le procedure per stendere unappropriata relazione, e il monitoraggio medico raccomandato, quando pu essere avvenuta unesposizione parenterale; conosca il proprio diritto di accesso al trattamento medico e alla relativa cartella clinica. Piano di risposta alle emergenze Quando i controlli tecnologici e quelli sulle pratiche di lavoro falliscono, i dipendenti debbono conoscere come comportarsi. Lo scopo di un piano preventivo di controllare, il pi rapidamente e con la maggior sicurezza possibile, la situazione a rischio. Compiere con regolarit esercitazioni sui piani di risposta alle emergenze permetter di identificare le aree che necessitano di miglioramenti e creer, nel personale, un senso di fiducia nel rispondere con efficacia in una situazione reale. La OSHA richiede alle strutture con pi di 10 dipendenti un piano di risposta scritto. Le comunicazioni verbali sul piano sono ammesse per strutture con 10 o meno dipendenti14. Controlli da parte della direzione Il personale di supervisione deve monitorare le pratiche di sicurezza nelle aree di propria responsabilit. Unattenzione continua agli argomenti della sicurezza dovrebbe essere prestata nelle abituali riunioni del personale e nelle sessioni di addestramento. Verifiche periodiche condotte con laiuto di professionisti della sicurezza aiutano ad accrescerne la consapevolezza. La direzione dovrebbe cercare i consigli del personale nel progettare e migliorare il piano di sicurezza della struttura. Il programma di sicurezza, con le sue politiche, le linee guida, i riferimenti di supporto ai documenti normativi, dovrebbe essere dettagliato in un manuale di sicurezza, da rendere disponibile a tutto il personale a rischio. Questo manuale, come quello delle procedure, dovrebbe essere revisionato ogni anno e aggiornato, man mano che la tecnologia si evolve e divengono disponibili nuove informazioni. Anche i posti di lavoro e i dispositivi di sicurezza dovrebbero essere ispezionati regolarmente per assicurare adesione e prontezza di risposta. Le liste di riscontro
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servono a documentare queste verifiche e a valutare la preparazione alla sicurezza. Gli argomenti delle liste di riscontro e gli elementi essenziali per la sicurezza, nonch le verifiche sulla gestione ambientale possono essere ottenuti da altre fonti 2,3,15 o sviluppati allinterno della struttura. Servizi sanitari per i dipendenti Profilassi delle epatiti A tutti i dipendenti a contatto con il sangue devessere offerta la possibilit di vaccinarsi contro lHBV, a meno che non abbiano gi un titolo protettivo di anticorpi anti-HBV (cio, anti-HBs). La OSHA richiede che la vaccinazione sia gratuita e, se un dipendente non laccetta, il rifiuto deve essere documentato21. Programmi di monitoraggio Il datore di lavoro deve fornire un sistema per monitorare lesposizione a certe sostanze come definite negli standard OSHA, qualora ci sia motivo di ritenere che i livelli dellesposizione siano usualmente eccedenti i livelli di allarme16. Pronto soccorso medico e follow-up Quando richiesto da un lavoratore che ha subito unesposizione al sangue, reale o sospetta, dovrebbe essergli fornito un monitoraggio degli anticorpi anti-HBV, anti-HCV e anti-HIV e appropriate consulenze. Per questi test, ad adesione volontaria, necessario un consenso informato. Il rifiuto a sottoporsi alle analisi offerte deve essere documentato. Il programma dovrebbe, usualmente, comprendere test immediati sul lavoratore e sulla fonte del materiale potenzialmente infettante, con controlli nel tempo (follow-up), a intervalli regolari, sul lavoratore, dopo lesposizione9,10. Tutti gli aspetti del follow-up dovrebbero essere appropriatamente documentati. Il CDC ( Centers for Disease Control and Prventions) ha pubblicato raccomandazioni sulla profilassi pre- e post-esposizione, quando il materiale contaminante HBV positivo o qualora manchino informazioni al riguardo 17 . Le immunoglobuline anti-epatite B sono
somministrate contestualmente al vaccino anti-HBV nel caso di lesioni penetranti. Se somministrati secondo le direttive del produttore, entrambi questi prodotti sono molto sicuri e non sono mai stati documentati rischi di infezione da HBV, HCV o HIV. La profilassi per HIV dopo unesposizione in continua evoluzione; le politiche al riguardo si basano, in generale, sulle raccomandazioni del Servizio di Sanit Pubblica17 e su aggiornati standard di esercizio dellattivit. Segnalazioni di incidenti e di lesioni Quando interviene una lesione, si dovrebbe documentare il maggior numero possibile di informazioni previste (Tabella 2.2). Il supervisore, inoltre, dovrebbe compilare le relazioni e i moduli per le indagini relative a ogni incidente previsti dallassicuratore dellistituzione e dalle agenzie di indennizzo del lavoratore. Le cartelle cliniche di ogni singolo dipendente dovrebbero essere conservate per tutta la durata dellimpiego e per ulteriori 30 anni, salvo poche eccezioni17. La OSHA richiede ai datori di lavoro dei servizi sanitari con 11 o pi dipendenti di conservare le registrazioni relative a lesioni professionali e a malattie, che richiedano trattamenti superiori alle capacit di una persona esperta in soccorsi di primo livello18. Le registrazioni che riguardano soccorsi forniti da personale non-medico, per piccole lesioni, quali ferite o ustioni, non debbono essere conservate. La documentazione iniziale deve essere completata entro 6 giorni dallincidente. Tutte le notazioni, le sintesi e le registrazioni aggiuntive debbono essere conservate per almeno 5 anni, oltre lanno solare dellaccaduto. I datori di lavoro debbono notificare alla OSHA, entro 8 ore dallaccaduto, le morti o gli incidenti che hanno richiesto lospedalizzazione di tre o pi dipendenti18. Allergie al lattice Con il continuo uso di guanti, aumentato il numero di lavoratori sanitari che hanno manifestato allergie al lattice. Le reazioni avverse determinate dal lattice e/o da guanti con polvere sono caratterizzate da dermatiti da contatto, dermatiti allergiche, orticaria, anafilassi.
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Tabella 2.2 - Informazioni da includere nei rapporti su lesioni Nome e indirizzo della persona che ha subito la lesione. Data della lesione (ora, giorno, mese, anno). Luogo preciso nel quale si verificata la lesione. Dettaglio delle attivit svolte dalla persona colpita al momento della lesione. Natura della lesione (per esempio, contusione, lacerazione, ustione etc.). Parte del corpo lesa (per esempio capo, braccio, gamba etc.). Natura dellagente (noto o potenziale), nel caso di esposizione a patogeni o ad altro materiale pericoloso. Tipo di cura medica o di pronto soccorso praticati sul posto di lavoro. Data nella quale la persona lesionata ha interrotto il lavoro. Data nella quale la persona lesionata ritornata al lavoro. Costo stimato del danno alla propriet o alla strumentazione. Dichiarazioni della persona colpita relative agli eventi che hanno determinato la lesione. Dichiarazioni dei testimoni. Causa della lesione. Azione correttiva messa in atto o raccomandazioni per unazione correttiva.
Gli strumenti medici che contengono lattice debbono portare unetichetta davvertimento. Il National Institute for Occupational Safety and Health raccomanda quanto segue19: mettere a disposizione, quale alternativa, guanti non in lattice. Incoraggiare luso di guanti non in lattice per quelle attivit e per gli ambienti di lavoro, dove vi soltanto un minimo rischio di venire a contatto con materiale infetto; se si usano guanti in lattice, fornire guanti con bassa quantit di proteine e senza polvere (nota: non si tratta di un requisito, ma di una raccomandazione per ridurre le esposizioni); usare pratiche di pulizia per rimuovere i guanti al lattice con polvere dal posto di lavoro; impiegare quelle pratiche di lavoro, che riducono le probabilit di reazioni, quali lavarsi le mani ed evitare lozioni a base di olio; fornire ai lavoratori programmi di formazione e di materiale di addestramento sulle allergie al lattice; controllare periodicamente i lavoratori ad alto rischio di allergie al lattice; valutare aggiornate strategie di prevenzione; se compaiono sintomi di allergia, evitare il contatto diretto con il lattice e consultare un medico sulle precauzioni da adottare.
Prevenzione degli incendi

La prevenzione degli incendi fa riferimento a una combinazione di progetto della struttura basato sul Codice di Salvaguardia della Vita della NFPA (National Fire Protection Association)29, su processi ben definiti per mantenere in perfetto ordine i sistemi di protezione dal fuoco e su pratiche di lavoro sicure relativamente agli incendi. Il Codice contempla sia i sistemi attivi sia quelli passivi di protezione dal fuoco (ad esempio: allarmi, rilevatori di fumi, estintori, uscite e corridoi demergenza, barriere a prova di fuoco). Addestramento Si raccomanda un addestramento sulla sicurezza dagli incendi, al momento dellassunzione e, in seguito, almeno una volta lanno. Tale addestramento dovrebbe porre enfasi sulla prevenzione e sulla consapevolezza del dipendente riguardo allambiente di lavoro, compreso come riconoscere e riferire le situazioni insicure, come redigere una relazione sugli incendi, la localizzazione dellallarme pi vicino e delle apparecchiature antincendio e il loro uso, le modalit e le vie di evacuazione. A tutto il personale viene richiesto, da CAP e
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da JCAHO2,4, di partecipare, almeno una volta lanno, alle esercitazioni antincendio. Nelle zone di ricovero o di trattamento dei pazienti, la JCAHO richiede che, per ciascun turno, le esercitazioni siano trimestrali. La partecipazione dei dipendenti e il loro apprendimento dovrebbero essere documentati. Identificazione e segnalazione dei pericoli Le uscite di emergenza debbono essere chiaramente indicate con il cartello USCITA. Ulteriori cartelli debbono essere posti lungo le vie di uscita per indicare la direzione del tragitto, se non immediatamente chiaro. Tutto il materiale infiammabile dovrebbe essere etichettato con appropriati avvisi di pericolo e le stanze per la conservazione del materiale infiammabile dovrebbero essere chiaramente segnalate. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali I laboratori che conservano grandi quantit di sostanze chimiche infiammabili sono, di solito, costruiti con muri di separazione dal fuoco resistenti per la durata di due ore oppure di unora, se esiste un sistema di estinzione automatico3. Le uscite di emergenza permanenti debbono essere progettate in modo tale da permettere una fuoriuscita libera e senza ostacoli sino a zone di sicurezza, da ogni parte dellimpianto. Per le aree di pi di 300 metri quadrati possono essere richieste uscite di sicurezza secondarie; si consultino le autorit locali sulla sicurezza aventi giurisdizione al riguardo, cos come il locale capo dei vigili del fuoco e la NFPA. I sistemi di rilevamento del fuoco e di allarme dovrebbero essere costruiti secondo le norme federali, statali e locali. Pratiche di lavoro sicure Tutte le apparecchiature antincendio dovrebbero essere ispezionate con regolarit al fine di assicurare il loro buon funzionamento. Gli estintori dovrebbero essere resi prontamente disponibili e il personale dovrebbe essere addestrato al loro uso appropriato. Nulla, che possa ostacolare levacuazione, dovrebbe essere
conservato lungo il tragitto delle uscite di emergenza. Le porte delle uscite non debbono essere chiuse a chiave dallinterno. I piani di gestione della pulizia e del magazzino dovrebbero essere progettati per controllare laccumulo di materiale infiammabile e combustibile conservato nella struttura. Nelle zone dove sono installati estintori a pioggia, ogni cosa dovrebbe essere situata ad almeno 45 cm al di sotto del getto dellestintore. Codici locali di protezione dagli incendi possono richiedere un maggior spazio libero. Piano di risposta alle emergenze Il piano di risposta allemergenza incendio dovrebbe comprendere sia lestensione della struttura sia quella delle zone particolari limitrofe. Il piano dovrebbe descrivere i sistemi di allarme e come stendere le relazioni pertinenti, la collocazione e luso delle attrezzature di emergenza, ruoli e responsabilit del personale durante la risposta, strategie di difesa sul posto, condizioni che richiedono levacuazione, procedure di evacuazione e uscite di emergenza4,14. Quando si verifica un incendio, la sequenza per una risposta immediata dovrebbe essere la seguente: 1) soccorrere chiunque sia in pericolo immediato, 2) attivare i sistemi di allarme e avvertire i presenti in zona, 3) confinare il fuoco, chiudendo porte e, se possibile, spegnendo i ventilatori e neutralizzando altre sorgenti di ossigeno e 4) spegnere il fuoco con estintori manuali, se si tratta di un incendio limitato, o evacuare la zona se lincendio troppo esteso per poterlo gestire.
Sicurezza elettrica
I rischi elettrici, compresi incendi e folgorazioni, possono derivare da attrezzature elettriche difettose, da interruttori, prese o fili danneggiati o da pratiche di lavoro non sicure. Un uso appropriato delle attrezzature elettriche, le ispezioni e le manutenzioni periodiche, laddestramento a riconoscere i pericoli sono essenziali per prevenire folgorazioni o
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elettrocuzioni. La gravit della folgorazione dipende dal percorso della corrente lungo il corpo e dalla sua durata. Anche esposizioni a correnti a basso voltaggio possono procurare gravi danni21. Addestramento Si dovrebbero programmare corsi di addestramento per istruire il personale sui pericoli elettrici connessi con gli interruttori e le prese e per aiutarli a riconoscere i problemi potenziali, quali rotture di interruttori e prese, connessioni improprie, fili danneggiati, messe a terra inadeguate. Identificazione e segnalazione dei pericoli Il piano sulla sicurezza dovrebbe essere rivolto a un uso appropriato di interruttori e prese. Gli strumenti che non rispettano i requisiti di sicurezza dovrebbero essere contrassegnati per prevenirne una loro fortuita utilizzazione. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali La OSHA richiede che i sistemi elettrici e le strumentazioni siano costruiti e installati in modo da minimizzare i potenziali pericoli sul posto di lavoro. Quando acquista uno strumento, la struttura dovrebbe verificare che esso porti il marchio di un laboratorio di prova indipendente approvato dalla OSHA, quale UL (Underwriters Laboratories)22. Intorno allo strumento dovrebbe essere previsto uno spazio di lavoro adeguati, cos da sicure permettere un facile accesso per attivit di lavoro e di manutenzione sicure. Nelle zone umide o bagnate dovrebbero essere installati interruttori del circuito di messa a terra. Pratiche di lavoro sicure Le pratiche di sicurezza elettrica sono focalizzate su: 1) uso appropriato delle strumentazioni e 2) appropriate manutenzioni e riparazioni. I dipendenti non dovrebbero inserire o disinserire strumenti da una sorgente elettrica, quando hanno le mani bagnate. Un sovraccarico del circuito con troppi strumenti inseriti pu causare il surriscaldamento dei fili e provocare un incendio. Prese danneggiate e strumenti elettrici
difettosi dovrebbero essere contrassegnati e rimossi dal servizio, sino a che non siano stati riparati e controllati riguardo alla loro sicurezza. I fili mobili dovrebbero essere fissati per prevenire inciampi e protetti da danni provocati da oggetti pesanti o taglienti. I fili mobili dovrebbero essere tenuti allentati per prevenire tensioni sui terminali elettrici e i fili elettrici in genere dovrebbero essere controllati per tagli, rotture o mancati isolamenti. Non si dovrebbero utilizzare prolunghe al posto di conduttori permanenti. Piano di risposta alle emergenze Quando non sia possibile diminuire lenergia elettrica o scollegare strumenti, si dovrebbe interrompere lerogazione dal circuito. Se ci non possibile, si dovrebbero usare materiali che non conducono, quali legno secco, per allontanare dalla corrente una sua vittima21. Le vittime non debbono essere toccate direttamente. Si deve ricorrere a un primo soccorso demergenza per le vittime di scariche elettriche. Non si debbono impiegare estintori ad acqua negli incendi determinati da elettricit.
Sicurezza biologica
Le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali debbono definire e far rispettare i provvedimenti per minimizzare i rischi di esposizione a materiali biologici sul posto di lavoro. I requisiti pubblicati dalla OSHA negli standard per i patogeni a trasmissione ematica ( Bloodborne Pathogen Standard) e le raccomandazioni del Ministero della Salute degli Stati Uniti (US Department of Health and Human Services)9,12, forniscono le basi per un efficace piano di sicurezza biologica. Standard per patogeni di origine ematica Gli standard per i patogeni a trasmissione ematica della OSHA mirano a proteggere il personale in tutte le attivit dove esiste un rischio di esposizione al sangue o ad altri materiali potenzialmente infetti. Viene richiesto che la struttura sviluppi un Piano di Controllo delle Esposizioni e descriva i controlli tecnologici
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appropriati, i dispositivi di protezione individuali, nonch i controlli sulle pratiche di lavoro, al fine di minimizzare i rischi di una esposizione. Richiede anche al datore di lavoro di fornire la vaccinazione per lepatite B al personale con esposizione professionale, di provvedere a un follow-up medico in caso di esposizione accidentale e di conservare le registrazioni relative a incidenti e a esposizioni. Standard Precauzionali Gli Standard Precauzionali (SP, Standard Precautions) sono le pi recenti raccomandazioni emesse dai CDC per diminuire, negli ospedali, il rischio di trasmissione di patogeni di origine ematica o di altri agenti infettanti. Pubblicati nel 1996 nelle Linee Guida per le Precauzioni di Isolamento Ospedaliere (Guidelines for Isolation Precautions in Hospitals9), essi riuniscono anche precedenti raccomandazioni, ivi comprese quelle sullIsolamento delle Sostanze Corporee (Body Substance Isolation, 1987), sulle Precauzioni Universali (Universal Precautions, 1986) e sulle Precauzioni Relative al Sangue e ai Liquidi Organici ( Blood and Body Fluid Precautions, 1983). Gli standard per i patogeni a trasmissione ematica della OSHA si riferiscono alluso delle Precauzioni Universali; tuttavia, la OSHA riconosce le pi recenti linee guida emesse dai CDC e, nella Direttiva CPL 2-2.69, consente agli ospedali di servirsi di alternative accettabili, ivi compresi gli Standard Precauzionali, sempre che tutti gli altri requisiti siano soddisfatti23. Gli SP si applicano a tutte le attivit relative al trattamento dei pazienti, indipendentemente dalla diagnosi, quando esiste un rischio di esposizione a 1) sangue, 2) a tutti i liquidi organici, le secrezioni, le escrezioni, eccetto il sudore, 3) a pelle non integra, 4) a membrane mucose. Livelli di sicurezza biologica Le raccomandazioni per la sicurezza in laboratorio si basano sui rischi potenziali riguardanti specifici agenti infettanti e sulle attivit svolte12. Tali raccomandazioni comprendono sia i controlli tecnologici sia le pratiche di lavoro sicure. Quattro sono i livelli di biosicurezza, elencati in
ordine ascendente, con crescente protezione per il personale, lambiente e la comunit. Il livello di sicurezza biologica 1 (BSL-1) riguarda unattivit con agenti ignoti o di rischio potenziale minimo per il personale di laboratorio e per lambiente. Queste attivit si svolgono su superfici aperte e non richiedono mezzi di contenimento. Il lavoro al livello di sicurezza biologica 2 (BSL-2) coinvolge agenti a rischio potenziale modesto per il personale e per lambiente. La maggior parte delle attivit di un laboratorio trasfusionale viene considerato di BSL-2. Le precauzioni descritte in questa sezione saranno focalizzate ai requisiti BSL-2. I laboratori dovrebbero consultare le linee guida del CDC e dello NIH (National Institutes of Health) per le precauzioni appropriate per maggiori livelli di contenimento. Il livello 3 (BSL-3) riguarda il lavoro con agenti eziologici indigeni o esotici, che possano causare malattie gravi o potenzialmente letali, come risultato di unesposizione ad aerosol (aria infetta, ad esempio, da Mycobacterium tubercolosis) o attraverso altre vie di contagio, che determinino gravi conseguenze nellospite infettato (per esempio, da HIV). Le raccomandazioni per lavori a BSL-3 tendono a controllare i rischi per via aerea e a minimizzare quelli provenienti da superfici contaminate. Il livello di biosicurezza 4 (BSL-4) riguarda un lavoro con agenti pericolosi o esotici, che presentano alti rischi di contrarre malattie in grado di mettere in pericolo la vita (per esempio, contatti con gli agenti patogeni delle febbri emorragiche o con i filovirus). Il BSL-4 non applicabile alle usuali attivit di una Struttura Trasfusionale. Addestramento La OSHA richiede un addestramento annuale per tutti i dipendenti, le cui mansioni comportino un rischio di esposizione ad agenti infettanti10,23. I programmi di addestramento debbono essere adattati ai gruppi pertinenti, sia per quanto riguarda il livello sia per i contenuti. La conoscenza generica dei rischi biologici, la comprensione delle procedure di controllo o le esperienze di lavoro possono non soddisfare i requisiti di un
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addestramento specifico, quantunque la valutazione di tali conoscenze rappresenti il primo passo nel pianificare i contenuti di un programma. I lavoratori volontari richiedono un programma di addestramento sulla sicurezza almeno pari a quello dei dipendenti remunerati, che svolgono funzioni similari. Identificazione e segnalazione di pericoli Il piano per il controllo delle esposizioni in una Struttura Trasfusionale d informazioni sui rischi presenti nel posto di lavoro e descrive i sistemi di controllo per minimizzare lesposizione. Le strutture che hanno livelli da BSL-2 a BSL-4 debbono avere segnali di rischio biologico, posti allentrata, quando vengono usati agenti infettanti. Ci serve a mettere sullavviso il personale e i visitatori sugli agenti usati, sui punti di contatto e su ogni dotazione protettiva speciale o sulle pratiche di lavoro svolto. Etichette di avvertimento sul rischio biologico debbono essere poste sui contenitori dei rifiuti speciali, sui frigoriferi e sui congelatori contenenti sangue o altro materiale potenzialmente infetto; su altri contenitori se utilizzati per conservare, trasportare o spedire sangue o altro materiale potenzialmente infetto. Sono esenti da queste misure gli emocomponenti che siano etichettati per lidentificazione del loro contenuto e che siano stati gi assegnati per trasfusioni o per altro uso clinico. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali La OSHA richiede che, ogni volta sia possibile, i rischi siano controllati dal punto di vista tecnico e delle pratiche di lavoro. I controlli tecnologici per laboratori di livello BSL-2 comprendono laccesso limitato al laboratorio, quando il lavoro in corso, e alle cabine di sicurezza biologica o ad altre strumentazioni di contenimento per attivit che possono coinvolgere aerosol o schizzi infetti. Debbono essere disponibili lavabi per lavarsi le mani e docce oculari. Gli spazi di lavoro dovrebbero essere progettati in modo che siano
facilmente pulibili e i piani dei banchi dovrebbero essere impermeabili allacqua e resistenti a prodotti chimici e solventi. Le cappe di sicurezza biologica (BSC) sono, innanzi tutto, strumenti di contenimento per maneggiare organismi a moderato o ad alto rischio. Ce ne sono di tre tipi (Classe I, II e III), con la Classe III in grado di fornire la protezione maggiore al lavoratore. Un confronto fra le caratteristiche e le applicazioni dei tre tipi di cappe illustrato in Tabella 2.324. Le BSC non sono richieste dalle SP (Standard Precautions), ma la centrifugazione di provette di sangue non tappate o la manipolazione di unit positive per HBsAg o HIV sono esempi di procedure trasfusionali, per le quali sarebbe utile una BSC. Lefficacia delle BCS in funzione della direzione del flusso daria verso linterno e verso il basso, mediante filtri ad alta efficienza. Questa efficacia si riduce da qualsiasi cosa interrompa il flusso, per esempio, da braccia che si muovano rapidamente dentro e fuori la cappa, da movimenti rapidi alle spalle delloperatore, da correnti daria provenienti dal sistema di ventilazione, da porte del laboratorio aperte o che si aprano. Si dovrebbe far attenzione a non bloccare le griglie anteriori di entrata e quelle posteriori di uscita dellaria. La qualit delle prestazioni dovrebbe essere certificata ogni anno. Le lesioni da aghi contaminati o da altri oggetti taglienti continuano a essere il problema maggiore in ambiente sanitario, anche dopo che sono entrati in vigore degli standard, per includervi i riferimenti sulla protezione delle lesioni da oggetti taglienti e sui sistemi privi di ago26. Viene richiesto ai datori di lavoro di inserire nuove tecnologie di controllo e strumentazioni medicali pi sicure nel loro piano di controllo delle esposizioni e di sollecitare interventi da parte dei dipendenti per identificare, valutare e scegliere controlli tecnologici e delle pratiche di lavoro. Esempi di strumentazioni pi sicure sono i sistemi che non impiegano aghi o aghi con sistemi di re-incappucciamento automatico, nei quali la copertura per la messa in sicurezza fa parte integrante dellapparato.
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Tabella 2.3 - Confronto fra le cappe di sicurezza biologica di Classe I, II e III*
Classe Classe I
Caratteristiche principali Nella cappa viene introdotta aria non filtrata. Il flusso daria interno protegge loperatore dallesposizione a materiale esistente allinterno della cappa. Laria di uscita filtrata HEPA** per proteggere lambiente. Mantiene il flusso daria a una velocit minima di 23 metri al minuto (m/m) lungo lapertura anteriore. Usa flussi laminari (laria si muove a una velocit costante in una direzione e per linee parallele). Laria ambiente entra dalla griglia anteriore. Laria filtrata HEPA forzata verso il basso in flusso laminare per minimizzare la contaminazione reciproca dei materiali nella cappa. Laria di uscita filtrata HEPA.
Impiego Protezione del personale e dellambiente.
Applicazioni usuali Per inserire strumenti (per esempio centrifughe) o procedure che possono generare aerosol.
Classe II (in generale: si applica a tutti i tipi di classe II)
Protezione del personale, dellambiente e dei prodotti.
Operazioni con microorganismi di livello di sicurezza 1, 2 o 3. Trattamento di prodotti, per i quali la prevenzione della contaminazione critica, quali culture cellulari o emocomponentI in sistema aperto. Vedi Classe II (in generale) Consente manipolazioni sicure di piccole quantit di sostanze chimiche o biologiche pericolose.
(segue)
Classe II, A Classe II, B1
Il 75% dellaria ricircola dopo essere passata attraverso un filtro HEPA. Velocit frontale = 23 m/m Il 70% dellaria esce dalla griglia posteriore, filtrata HEPA, poi viene scaricata dalledificio. Il restante 30% rientra nella griglia anteriore e filtrata HEPA. Velocit frontale = 30 m/m.
Vedi Classe II (in generale). Vedi Classe II (in generale)
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Classe Classe II, B2
Caratteristiche principali Tutta laria (100%) viene eliminata, non ricircola. Una ventola aggiuntiva prende aria dallambiente o dallesterno, passa attraverso un filtro HEPA per fornire il flusso laminare. Velocit frontale 30 m/m. Simile al tipo A, ma contempla un sistema di condotte per contenenere ogni possibile contaminazione allinterno della cappa. Velocit frontale 30 m/m. La cabina a tenuta daria. I materiali sono trattati con guanti di gomma sigillati al fronte della cappa. Laria in entrata filtrata HEPA. Laria di uscita doppiamente filtrata HEPA o pu avere un filtro e un inceneritore daria. I materiali sono immessi e tolti dalla cabina attraverso una tanica o una scatola di passaggio a porta doppia e che pu essere decontaminata. La cappa mantenuta sotto pressione negativa.
Impiego Vedi Classe II (in generale).
Applicazioni usuali Contenimento di sostanze chimiche e biologiche. Operativit pi costosa per la quantit di aria condizionata della stanza che impiega e scarica allesterno Manipolazioni sicure di piccole quantit di sostanze chimiche e biologiche pericolose. Lavori con microorganismi di livello di sicurezza 4.
Classe II, B3
Vedi Classe II (in generale).
Classe III
Protezione massima del personale e dellambiente.
* Dati dal Dipartimento di Salute e Risorse Umane USA24 ** Filtri ad alta efficienza (HEPA, High Efficiency Particulate Air)
Decontaminazione Gli strumenti riusabili e le superfici di lavoro che possono essere contaminati da sangue richiedono pulizie e decontaminazioni quotidiane. Evidenti versamenti sugli strumenti o sui piani di lavoro dovrebbero essere immediatamente puliti; pulizie routinarie con disinfettanti dovrebbero essere attuate alla fine di ogni turno di lavoro o a intervalli regolari, in grado di assicurare una sicurezza equivalente. Lo strumento esposto a sangue o ad altro materiale potenzialmente infetto deve essere decontaminato prima che venga sottoposto a manutenzione o che sia spedito. Quando non fattibile la decontaminazione di tutto o di parte dello strumento, si deve applicare, prima della sua manutenzione o di una sua spedizione, unetichetta di rischio biologico che segnali quale sua parte rimasta contaminata. Scelta del disinfettante L EPA (Enivironmental Protection Agency) mantiene una lista dei prodotti chimici, che si sono dimostrati efficaci disinfettanti antimicrobici27 (per consultare la lista aggiornata, visitare il sito http://www.epa.gov/oppad001/chemreginex.htm). Anche la Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology pubblica una linea guida per aiutare i sanitari sulla scelta giudiziosa e sullimpiego corretto di specifici disinfettanti 28. Per le strutture soggette alla Bloodborne Pathogens Rule, la OSHA consente limpiego dei disinfettanti tubercolicidi registrati EPA, cos come di quelli che sono efficaci contro HIV e HBV, sempre registrati EPA, e/o le soluzioni di candeggina diluita per decontaminare le superfici di lavoro23. Prima di scegliere un prodotto, i lavoratori dovrebbero considerare numerosi fattori. Fra questi, il tipo di materiale o la superficie da trattare, le caratteristiche pericolose della sostanza chimica quale la corrosivit e il livello di disinfezione richiesto. Dopo aver selezionato un prodotto, necessario scrivere le procedure atte ad assicurare pulizia e trattamento delle superfici di lavoro efficaci e coerenti. Alcuni fattori da prendere in considerazione per una decontaminazione efficace riguardano la
durata del contatto, il tipo di microrganismi, la presenza di materia organica, la concentrazione degli agenti chimici. I lavoratori dovrebbero esaminare le informazioni di base sulla decontaminazione e seguire le istruzioni dei produttori. Conservazione I materiali pericolosi debbono essere confinati e le zone di conservazione chiaramente delimitate. Il sangue deve essere protetto da esposizioni non necessarie ad altri materiali e viceversa. Se i prodotti trasfusionali non possono essere conservati in frigoriferi separati da quelli utilizzati per reagenti, per campioni o per materiali diversi, le zone allinterno del frigorifero debbono essere chiaramente etichettate e si deve prestare unattenzione aggiuntiva per ridurre le probabilit di perdite o di altri eventi negativi. Le zone di conservazione debbono essere tenute pulite e in ordine; non sono permessi cibi e bevande dove vengono conservati materiali a rischio biologico. Dispositivi di protezione individuali Quando i rischi non possono essere eliminati, la OSHA richiede che il datore di lavoro doti i dipendenti di idonei presidi e indumenti protettivi individuali e che provveda alla loro pulizia, lavaggio ed eliminazione, senza costi a loro carico. I presidi e gli indumenti protettivi comprendono divise, camici da laboratorio, guanti, schermature per il viso, maschere e occhiali di protezione. Le indicazioni e le linee guida per il loro impiego sono trattate in Appendice 2.2. Pratiche di lavoro sicure Le prassi di lavoro sicure, appropriate per le Precauzioni Standard (SP), riguardano quanto di seguito elencato: lavarsi le mani, dopo aver toccato sangue, liquidi organici, secrezioni, escrezioni e materiali contaminati, che si siano o meno indossati i guanti; indossare i guanti, quando si tocca sangue, liquidi organici, secrezioni, escrezioni e materiali contaminati, e cambiarli fra un compito e laltro;
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mettersi una maschera e una protezione per gli occhi o schermature per il viso, quando si svolgono attivit, che possono verosimilmente generare schizzi o spruzzi di sangue, di secrezioni e di escrezioni; indossare camici lunghi quando si svolgono attivit, che possono verosimilmente generare schizzi o spruzzi di sangue, di secrezioni e di escrezioni; maneggiare indumenti sporchi e altro materiale appartenenti a pazienti, in modo da prevenire le esposizioni, assicurarsi che non siano riusati per altro pazienti sino a che non siano stati puliti e riprocessati in modo corretto, assicurarsi che i materiali non riusabili siano eliminati con modalit appropriate; assicurarsi che siano definite e seguite idonee procedure per la protezione, la pulizia e la disinfezione di routine delle superfici e degli strumenti presenti nellambiente; maneggiare la biancheria sporca in modo da prevenire esposizioni; maneggiare aghi, bisturi e altri strumenti o apparecchi taglienti in modo tale da minimizzare i rischi di esposizioni; usare boccagli, palloncini di rianimazione e altri strumenti di ventilazione, in alternativa ai metodi di rianimazione bocca-bocca; sistemare in camere singole i pazienti che sono a rischio di contaminare lambiente o che non sono in grado di mantenere unigiene appropriata (per esempio, pazienti tubercolotici). Precauzioni per la sicurezza biologica nei laboratori Quando si valutano i rischi del personale di laboratorio di essere esposto al sangue, bisogna considerare parecchi fattori. Alcuni di questi riguardano il numero dei campioni esaminati, i comportamenti del personale, le tecniche utilizzate e il tipo di strumentazione utilizzata29. Il direttore del laboratorio pu voler istituire pratiche o procedure di livello di sicurezza biologica 3 (o BSL-3, BioSafety Level), che vengono considerate a pi alto rischio di quelle BSL-2. Quando si in dubbio se unattivit
BSL-2 o BSL-3, si debbono seguire le precauzioni BSL-3. Le precauzioni di sicurezza BSL-2 sono sintetizzate in Appendice 2.3. Considerazioni sulle sale di raccolta sangue Gli standard per i patogeni di provenienza ematica o BPS riconoscono che esiste una differenza fra i pazienti ospedalizzati e i donatori sani, nei quali la presenza di marcatori di malattie infettive significativamente pi bassa. Il datore di lavoro di una struttura per la raccolta di sangue pu stabilire che luso regolare di guanti non richiesto per i salassi purch: le pratiche siano periodicamente rivalutate; siano disponibili guanti per chi desidera utilizzarli e il loro impiego non sia scoraggiato; i guanti siano obbligatori, quando un dipendente ha tagli, graffi o lesioni cutanee, quando una contaminazione probabile, quando si preleva sangue autologo, quando vengono effettuate procedure terapeutiche, durante laddestramento sulle tecniche di salasso. Le procedure usate nella raccolta di sangue dovrebbero essere valutate per i rischi di esposizioni pericolose e per quelli inerenti alle attivit con i donatori o con i pazienti. Alcune procedure possono, con maggiore probabilit rispetto ad altre, causare ferite, per esempio, nelluso di lancette per digito-puntura, nellutilizzazione di capillari, nel rompere fiale, nellusare aghi non incappucciati, nel pulire forbici, nel praticare una rianimazione cardio-polmonare. In qualche caso, pu essere necessario prelevare sangue a soggetti noti per un alto rischio di infettivit (per esempio, prelievi di sangue autologo o di plasma per la produzione di vaccini). La FDA fornisce indicazioni per le raccolte da soggetti ad alto rischio 30 . Si dovrebbero consultare le norme e le linee guida pi recenti per individuare modifiche o aggiunte. Piano di risposta alle emergenze Fuoriuscite di sangue Ogni struttura nella quale si maneggi sangue dovrebbe essere preparata, in anticipo, alle possibilit di versamenti di sangue.
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La Tabella 2.4 elenca i provvedimenti da adottare, quando si versa sangue. Una pulizia approfondita pi facile, se si sono predisposti gli elementi elencati di seguito: progettare le aree di lavoro in modo tale che la pulizia sia relativamente semplice; preparare un kit o un carrello che contenga tutti i materiali e gli strumenti necessari per affrontare le perdite e le istruzioni per il loro uso. Sistemarli in vicinanza delle zone dove le perdite possono essere prevenute; assegnare la responsabilit sulla manutenzione del kit o del carrello, sulle registrazioni e fare una relazione su tutti gli eventi significativi; istruire il personale sulle procedure di pulizia approfondita e sulle modalit di riferire gli eventi significativi. Rifiuti pericolosi Si definisce rifiuto sanitario ogni scoria (solida, semisolida o liquida) che si crea durante la diagnosi, il trattamento o limmunizzazione di esseri umani o animali, in relazione a ricerche, produzioni o analisi biologiche. I rifiuti infetti riguardano strumenti monouso, oggetti o sostanze
che possano ospitare o trasmettere patogeni o le loro tossine. In linea generale, le scorie infette dovrebbero essere incenerite o decontaminate prima della loro eliminazione in una discarica per materiale sanitario. Sangue, emocomponenti, liquidi aspirati, escrezioni e secrezioni possono essere versati con attenzione in un drenaggio, connesso con una discarica sanitaria, qualora la legge statale lo permetta. Tali discariche possono essere usate anche per eliminare altri rifiuti potenzialmente infetti, che possano essere tritati e immessi nello scarico fognario. Si dovrebbero consultare le autorit sanitarie statali e locali circa le leggi e i regolamenti che riguardano leliminazione di materiale biologico nella fogna. I laboratori dovrebbero definire con chiarezza quali rifiuti debbano essere considerati pericolosi. Per esempio, in un Centro Trasfusionale, i materiali contaminati con sangue liquido o semiliquido vengono considerati a rischio biologico. Oggetti contaminati con sangue secco sono ritenuti rischiosi qualora sia possibile che il materiale secco si sfaldi se manipolato. Gli strumenti taglienti contaminati da sangue sono sempre considerati pericolosi, per il rischio di lesioni transcutanee.
Tabella 2.4 - Pulizia approfondita in caso di fuoriuscite di sangue Contenere, se possibile, la quantit di sangue che viene versato. Evacuare larea per 30 minuti se si sono creati aerosol. Porre avvisi di mantenere larea sgombra. Levarsi gli abiti se si sono contaminati. Se le perdite sono avvenute nella centrifuga, spegnerla immediatamente e lasciare il coperchio chiuso per 30 minuti. Luso di coperture supplementari aiuta a prevenire la formazione di aerosol e a limitare le perdite. Indossare indumenti protettivi e guanti adatti. Se sono coinvolti oggetti taglienti, i guanti debbono essere a prova di perforazione e si debbono usare scope o altri strumenti simili durante le operazioni di pulizia per evitare ferite. Usare materiale assorbente per asciugare la maggior quantit possibile di liquido. Pulire larea interessata con detergenti. Sciacquare la zona con disinfettanti, usandoli secondo le istruzioni del produttore. Consentire adeguati tempi di contatto con il disinfettante. Se necessario, raccogliere il disinfettante residuo. Eliminare tutto il materiale, seguendo le linee guida relative alla sicurezza dal rischio biologico. Tutto il materiale contaminato da sangue deve essere sterilizzato in autoclave o incenerito.
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Tuttavia, oggetti quali guanti usati, tamponi, pipette con rimozione del liquido in eccesso, garze contaminate da goccioline di sangue si possono considerare non a rischio, se il materiale secco e non potr essere rilasciato nellambiente durante il trattamento. Linee guida per leliminazione di rifiuti pericolosi. I dipendenti debbono essere addestrati al riguardo prima di maneggiare o eliminare rifiuti pericolosi, anche se sono impacchettati. Si raccomandano le linee guida riportate di seguito31: identificare in maniera idonea i rifiuti pericolosi: si raccomanda luso di sacche plastiche prive di saldature e di almeno 2 millimetri di spessore e contenitori che portino il simbolo rischio biologico (biohazard); sistemare le sacche in un contenitore di protezione, con la chiusura in alto, al fine di evitare rotture e perdite durante la conservazione o il trasporto; quando trasportati in strade pubbliche, i rifiuti debbono essere preparati e spediti secondo le norme del Dipartimento Statunitense dei Trasporti; eliminare gli oggetti taglienti (ad esempio: aghi, vetri rotti, vetrini per microscopia, lamine di apparecchiature per connessioni sterili) in contenitori rigidi a prova di perforazioni e di perdite; immettere le sostanze liquide esclusivamente in contenitori a prova di perdite e di rotture; non compattare i rifiuti. Per ridurre i rischi di eventi accidentali, le zone destinate a conservare materiali infetti debbono essere protette. Le scorie infette non debbono mai essere immesse nel sistema pubblico di raccolta dei rifiuti. La maggior parte delle strutture si serve di trasportatori privati per decontaminare ed eliminare rifiuti infetti o pericolosi. I contratti con queste ditte dovrebbero comprendere la dichiarazione dei rischi da parte della struttura e il riconoscimento, da parte del trasportatore, che tutte le norme, federali, statali e locali, per il trasporto, il trattamento e leliminazione dei rifiuti sanitari a rischio biologico sono note e seguite.
Trattamento delle scorie mediche infette. Le strutture che inceneriscono i rifiuti pericolosi debbono conformarsi agli standard EPA di prestazione per i nuovi impianti e alle linee guida per le emissioni di impianti esistenti32. Per queste normative, viene considerato inceneritore ospedaliero/medico/di rifiuti infetti (HMIWI) qualsiasi impianto che sottopone a combustione qualsiasi quantitativo di scorie ospedaliere o di rifiuti sanitari/infetti. Un altro metodo, usato comunemente, per la decontaminazione/inattivazione di sangue ed emocomponenti, la sterilizzazione in autoclave. Nel determinare i tempi del processo per questultima metodica necessario prendere in considerazione gli elementi di seguito: dimensione del carico di materiale da sterilizzare in autoclave; tipo di confezione del materiale da sterilizzare; compattezza del materiale da sterilizzare; numero di oggetti per singola seduta di sterilizzazione; sistemazione degli oggetti allinterno dellautoclave, per permettere la migliore penetrazione del vapore. utile sistemare un indicatore biologico al centro dei carichi, che possono variare per dimensione e caratteristiche del contenuto, al fine di valutare i tempi di ottimale penetrazione del vapore. L EPA fornisce dettagliate informazioni sulla scelta e sulla operativit di questi indicatori31. La sterilizzazione richiede tempi pi lunghi, ma la decontaminazione esige almeno 1 ora, come minimo. Regola generale trattare per 1 ora ogni 5 kg di rifiuti da processare. Di norma, le scorie decontaminate di un laboratorio possono essere eliminate come rifiuti solidi non pericolosi. Il personale dovrebbe controllare, presso lautorit locale preposta ai rifiuti solidi, se la struttura si conforma alle normative della propria zona. Le scorie con vetri rotti o altri materiali aguzzi dovrebbero essere eliminate con metodiche conformi alle politiche relative allo scarto di oggetti taglienti similari o potenzialmente pericolosi.
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Sicurezza chimica
Una delle misure preventive pi efficaci che che una Struttura Trasfusionale pu prendere per ridurre lesposizione a sostanze chimiche rischiose quella di valutare luso, ogni volta che sia possibile, di sostanze alternative non pericolose. Unanalisi delle prassi per gli ordinativi pu concludersi con lacquisto di pi piccole quantit di sostanze chimiche pericolose, riducendo, al contempo, il rischio di scorte eccessive e, pi tardi, di problemi legati alla loro eliminazione. La OSHA richiede che le strutture che utilizzano sostanze chimiche pericolose sviluppino, per iscritto, un Piano di Igiene Chimica (CHP, Chemical Hygiene Plan ) e che il piano sia accessibile a tutti i dipendenti. Questo piano dovrebbe sottolineare le procedure, gli strumentari, i dispositivi di protezione individuali e le prassi di lavoro in grado di proteggere i dipendenti dalle sostanze chimiche pericolose in uso presso la struttura11,16. Il CHP deve anche garantire che equipaggiamento e strumenti protettivi stiano funzionando correttamente e che i criteri per determinare la loro messa in opera e il mantenimento di ogni
aspetto del piano siano sotto controllo. I dipendenti debbono essere informati di tutti i rischi chimici presenti sul posto di lavoro e debbono essere addestrati a riconoscerli, per proteggere s stessi durante il lavoro con queste sostanze e dove raccogliere informazioni su particolari sostanze chimiche pericolose. LAppendice 2.4 riporta lesempio di un foglio informativo sui dati di sicurezza, relativi alle sostanze chimiche pericolose, da inserire nel CHP. Verifiche sulla sicurezza e unannuale revisione del piano rappresentano un importante mezzo di controllo per assicurarsi che le procedure di sicurezza soddisfino le politiche del piano CHP e che questo sia aggiornato. Definire con assoluta chiarezza quali siano le sostanze chimiche pericolose , talora, difficile. In linea generale, sono quelle che pongono a rischio la salute, nel caso un dipendente sia a loro esposto o che determinino un significativo rischio fisico, provocando incendi o esplosioni, qualora siano maneggiati o conservati in maniera impropria. Nella Tabella 2.5 sono elencate le sostanze chimiche pericolose per la salute e in quella 2.6 quelle che possono determinare rischi fisici. LAppendice 2.5 riporta una lista di sostanze
Tabella 2.5 - Categorie delle sostanze a rischio per la salute Sostanze a rischio Cancerogeni Irritanti Corrosivi Tossici o altamente tossici Specificazione Sostanze che determinano neoplasie. Agenti che causano, per contatto, irritazioni (edemi, ustioni etc.) alla pelle o alle mucose. Agenti che distruggono i tessuti nei punti di contatto. Sostanze che determinano gravi effetti biologici, dopo la loro inalazione, ingestione o contatto cutaneo, anche di quantit relativamente piccole. Sostanze chimiche con effetti sulle capacit riproduttive, ivi inclusi i danni cromosomici o gli effetti sui feti. Epatotossine, nefrotossine, neurotossine, agenti che agiscono sullematopoiesi o che danneggiano polmoni, pelle, occhi o mucose.
Tossici per la riproduzione Altri tossici
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Tabella 2.6 - Categorie di rischi fisici Rischio Combustibili o infiammabili Definizione Sostanze chimiche che possono bruciare (inclusi i liquidi, i solidi, gli aerosol e i gas combustibili e infiammabili). Un gas o una mescolanza di gas in un contenitore sotto pressione. Sostanze chimiche instabili o reattive, sottoposte a violenti cambiamenti di stato a temperature e pressione normali. Sostanze chimiche che possono autoreagire se sottoposte ad urti, pressioni, sbalzi di temperatura. Sostanze chimiche che reagiscono allacqua, cedendo gas infimamabili o che possono causare danni alla salute. le dotazioni protettive personali e le procedure di emergenza specifiche per quel posto di lavoro. Laddestramento deve essere fornito ogni volta che nel posto di lavoro si introduce un nuovo rischio per la salute o un nuovo rischio fisico, ma non per ogni nuova sostanza chimica che gi rientra in un particolare classe di rischio11. Per esempio, se viene introdotto un nuovo solvente, che abbia una categoria di rischio simile a quello di una sostanza chimica per la quale sia gi stato effettuato un addestramento, il datore di lavoro deve soltanto avvertire il personale sulla categoria di rischio cui appartiene il nuovo solvente (per esempio, corrosivo, irritante). Peraltro, se tale nuovo solvente sospettato di essere cancerogeno e laddestramento sul rischio di cancerogenesi non stato precedentemente svolto, devessere effettuato, per il personale potenzialmente esposto, un nuovo addestramento. consigliabile un riaddestramento, tanto spesso quanto sia necessario, per assicurarsi che il personale si sia reso conto dei pericoli, particolarmente nel caso di rischi per la salute cronici ed organo-specifici, connessi al materiale con cui lavora.
Gas compressi Esplosivi
Sostanze chimiche instabili (reattive) Sostanze reattive allacqua
chimiche pericolose che possono trovarsi in una Banca del Sangue. La Struttura Trasfusionale dovrebbe identificare un dirigente, qualificato in igiene chimica, che sia responsabile per la stesura di linee guida sulle sostanze pericolose16. Il dirigente dovr anche rispondere del monitoraggio e della documentazione di incidenti e avviare, se necessario le modifiche al processo. Addestramento Per tutti i dipendenti che possano essere esposti a sostanze chimiche pericolose, prima che essi comincino a lavorare in aree dove tale rischio esiste, viene richiesto un addestramento iniziale. Se un soggetto gi stato precedentemente addestrato, pu non essere necessaria una sua riqualificazione, sulla base della valutazione del suo livello di conoscenze da parte del datore di lavoro. probabile che laddestramento di un nuovo dipendente sia, comunque, necessario, relativamente ad alcuni problemi specifici, come la collocazione delle schede di sicurezza dei materiali (MSDS, Material Safety Data Sheets), i dettagli sulletichettatura delle sostanze chimiche,
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Identificazione e segnalazione dei pericoli Segnalazione dei pericoli I datori di lavoro devono preparare un programma esauriente per la segnalazione dei pericoli, riguardanti tutte le aree che utilizzano sostanze chimiche pericolose, al fine di integrare il CHP e di assicurare che si sono valutati i pericoli di tutte le sostanze chimiche prodotte o acquisite, e che le informazioni pertinenti sono state trasmesse al datore di lavoro e ai dipendenti11. Il programma dovrebbe comprendere letichettatura delle sostanze chimiche pericolose, quando e dove collocare queste etichette, la gestione dei MSDS per segnalare gli incidenti chimici avvenuti nella struttura e laddestramento del personale. Il materiale informativo a disposizione del personale dovrebbe comprendere quanto segue: il CHP scritto della struttura; il programma scritto sulla comunicazione dei pericoli; lidentificazione delle aree di lavoro dove sono presenti sostanze chimiche pericolose; la lista richiesta delle sostanze chimiche pericolose e i loro MSDS. ( responsabilit della struttura determinare quali sostanze possano presentare un rischio per i dipendenti. Tale decisione dovrebbe essere basata sulla quantit di sostanza che viene utilizzata; sulle propriet fisiche, sulla potenza e sulla tossicit della sostanza; sulle modalit con le quali la sostanza usata; sui mezzi
disponibili per controllare la sua cessione e sullesposizione del personale). Etichettatura e simboli per le sostanze chimiche pericolose. Gli standard per la segnalazione dei pericoli (Hazard Communication Standard) richiedono ai produttori di sostanze chimiche e di materiali pericolosi di fornire allutilizzatore informazioni di base sui rischi di tali materiali mediante etichette e schede di sicurezza (i gi citati MSDS)11. Viene richiesto ai datori di lavoro di fornire ai dipendenti in procinto di lavorare con tali materiali: informazioni circa i rischi connessi ai materiali stessi, come leggere le etichette, come interpretare i simboli e i segnali posti sulle etichette, come leggere e utilizzare i MSDS. La Tabella 2.7 elenca gli elementi da includere in un MSDS. Come minimo, letichetta per un contenitore di una materia chimica pericolosa deve contenere: denominazione della sostanza; nome e indirizzo del produttore; avvisi di pericolo; segnali, simboli, cartelli o altre forme di avvertimento per fornire un richiamo visivo del pericolo specifico. Per informazioni aggiuntive sulle etichette ci si pu riferire agli MSDS. Le etichette poste dai produttori debbono rimanere sui contenitori. Lutilizzatore pu soltanto aggiungere i requisiti di conservazione e le date di ricevimento, le date di inizio delluso e di scadenza. Se le sostanze chimiche sono aliquotate in contenitori secondari,
Tabella 2.7 - Elementi da includere in un MSDS Identit del prodotto come riportato sulletichetta. Denominazione chimica e nome comune di tutti gli ingredienti pericolosi. Caratteristiche fisico/chimiche. Dati sui pericoli di incendio o di esplosione. Dati sulle caratteristiche di reattivit. Dati sui pericoli per la salute, ivi compresi la via primaria dingresso e i limiti di esposizione. Precauzioni da prendere per un trattamento e un uso sicuri. Misure per il controllo delle esposizioni. Procedure per le emergenze e per il primo soccorso. Informazioni dei produttori e data di revisione del MSDS.
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questi ultimi debbono riportare le etichette con nome della sostanza e con gli appropriati avvertimenti di pericolo. Ulteriori informazioni quali le misure precauzionali, la concentrazione (se del caso) o la data di preparazione sono utili, ma non imperative. pratica di sicurezza etichettare tutti i contenitori, anche se di sola acqua. I contenitori di trasferimento, utilizzati per una conservazione temporanea, non necessitano di essere etichettati se la persona che provvede al trasferimento li tiene sotto controllo e li destina a un uso immediato. Le informazioni relative agli standard accettabili per le etichette sui pericoli sono fornite dalla NFPA33 e dalla National Paint and Coatings Association34. Nelle aree dove vengono impiegate sostanze chimiche pericolose debbono essere posti simboli che soddisfino i requisiti OSHA. Le decisioni sul luogo dove sistemare i simboli che richiamano attenzione sono basate sulle raccomandazioni dei produttori circa i pericoli delle sostanze chimiche, sulla quantit di tali sostanze nella stanza o nel laboratorio, sulla loro potenza e sulla loro tossicit. Schede di sicurezza dei materiali La scheda di sicurezza dei materiali (MSDS, Material Safety Data Sheets) identifica le propriet fisiche e chimiche del materiale pericoloso (per esempio, punto di infiammabilit, pressione di vapore), i pericoli per lorganismo e la salute (per esempio, possibilit di provocare un incendio o unesplosione, segni e sintomi di unesposizione), e le precauzioni da adottare per una modalit sicura di trattamento e uso. In un singolo MSDS, istruzioni specifiche avranno la precedenza sulle generiche nel cosiddetto programma HAZMAT (Hazardous Materials). I datori di lavoro debbono conservare sul posto di lavoro le copie dei MSDS richieste per ogni sostanza chimica pericolosa e debbono assicurarsi che esse siano prontamente disponibili, ad ogni turno, per i dipendenti, quando lavorano nelle aree loro assegnate. Se sul posto di lavoro vengono utilizzati prodotti per uso domestico nello stesso modo con il quale un qualsiasi utente potrebbe impiegarli - cio, quando durata e frequenza delluso (e, quindi,
lesposizione) non risultino maggiori di quelli cui possa essere sottoposto il tipico consumatore la OSHA non richiede che venga fornito agli acquirenti uno specifico MSDS. Tuttavia, se lesposizione a questi prodotti supera quella usuale nelle normali applicazioni, i dipendenti hanno il diritto di conoscere le propriet delle sostanze pericolose. La OSHA non richiede ai datori di lavoro n li incoraggia a mantenere un MSDS per le sostanze chimiche non pericolose. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali Si debbono stabilire linee guida per le aree di laboratori dove sono usate e conservate sostanze chimiche pericolose. Le strumentazioni fisiche, specialmente quelle di ventilazione, debbono essere adeguate alla natura e al volume del lavoro svolto. Le sostanze chimiche debbono essere conservate in relazione alle caratteristiche di compatibilit chimica (per esempio, corrosive, infiammabili, ossidanti etc.) e in minima quantit. Le grandi quantit debbono essere mantenute al di fuori delle zone di lavoro. Gli standard NFPA e altri forniscono linee guida per un magazzinaggio corretto3,33,35. Si raccomandano cappe per aspirazione di fumi chimici quando si usano solventi organici, liquidi volatili e anche sostanze chimiche secche ma con serio pericolo di inalazione3. Bench costruiti con vetri di sicurezza, molti pannelli vetrati delle cappe di aspirazione non sono stati progettati come barriere di sicurezza. Le cappe debbono essere collocate in aree dove il traffico di persone minimo, per evitare di interrompere i flussi daria e compromettere, quindi, i campi di contenimento. I corredi protettivi personali, che possono essere forniti in relazione alla pericolosit del materiale usato, comprendono: guanti e grembiuli resistenti alle sostanze chimiche, occhiali di protezione infrangibili, respiratori. Nelle aree dove sono impiegate sostanze chimiche caustiche, corrosive, tossiche, infiammabili o combustibili, debbono essere disponibili docce di emergenza 3,36 . Esse dovrebbero avere un accesso non ostruibile ed
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essere disponibili entro 10 secondi, a partire dallarea dove sono utilizzate sostanze chimiche pericolose. Tali docce di sicurezza dovrebbero essere, periodicamente, fatte scorrere e controllate nella loro funzionalit, cos come i drenaggi sul pavimento per assicurarsi che i sifoni restino pieni dacqua. Pratiche di lavoro sicure I materiali pericolosi non debbono essere conservati o trasportati in contenitori aperti. I contenitori e i loro coperchi o dispositivi di chiusura dovrebbero essere studiati in modo da prevenire schizzi o perdite, in tutte le condizioni ragionevolmente prevedibili. I contenitori dovrebbero essere in grado di conservare, con sicurezza, il volume massimo previsto e dovrebbero essere facilmente pulibili. Le superfici esterne dovrebbero essere sempre mantenute pulite e asciutte. Quando si lavora usando cappe di aspirazione dei fumi, tutto il materiale dovrebbe essere mantenuto ad una distanza di almeno 15 cm dal fronte anteriore aperto; i pannelli verticali scorrevoli in vetro dovrebbero essere posizionati allaltezza specificata nelletichetta certificativa. I ventilatori, i deflettori e i canali di ventilazione non debbono essere bloccati. LAppendice 2.6 elenca specificamente le sostanze chimiche e suggerisce come impiegarle in modo sicuro. Risposta alle emergenze Il momento per prepararsi ad una possibile fuoriuscita di una sostanza chimica interviene prima che ci accada. Un completo programma di addestramento dovrebbe fornire al personale tutti gli strumenti necessari per agire responsabilmente al momento dellemergenza. Il dipendente dovrebbe conoscere le procedure da adottare, essere in grado di valutare la gravit dellaccaduto, conoscere o essere capace di stimare, con rapidit, le caratteristiche fisiche di base della sostanza fuoriuscita, sapere dove trovare i numeri telefonici di risposta alle emergenze. Il dipendente dovrebbe essere in grado di:
valutare, fermare, confinare la fuoriuscita, sia provvedendo direttamente alla pulizia sia chiamando il gruppo addetto alla pulizia stessa, di seguire e controllare la segnalazione dellaccaduto. Il dipendente deve conoscere quando chiamare per lassistenza, quando isolare la zona e dove reperire il materiale per la pulizia. Le fuoriuscite di sostanze chimiche in un posto di lavoro possono essere suddivise nelle categorie elencate qui di seguito37: perdite accidentali sono quelle che riguardano le fuoriuscite limitate in quantit e in tossicit e che non pongono pericoli significativi per la sicurezza e la salute dei dipendenti. Esse possono essere facilmente pulite dai dipendenti che abbiano familiarit con le sostanze chimiche coinvolte. I residui del materiale utilizzato per la pulizia si possono classificare come pericolosi e debbono essere eliminati in modo appropriato. LAppendice 2.7 descrive le idonee risposte alle fuoriuscite accidentali; perdite che possono essere accidentali o che possono richiedere una risposta di emergenza sono quelle che possono porre a rischio di esposizione i dipendenti, in relazione alle circostanze. A determinare una risposta appropriata entrano in gioco considerazioni sulla pericolosit del materiale, sulle circostanze che hanno determinato la fuoriuscita, sui fattori che possono mitigare i pericoli. Il piano per la risposta alle emergenze nella struttura dovrebbe prevedere delle indicazioni su come determinare se la perdita sia stata accidentale o se richieda una risposta di emergenza; perdite che richiedono una risposta di emergenza sono quelle che rappresentano una minaccia per la salute e la sicurezza, indipendentemente dalle circostanze che le hanno determinate. La perdita pu esigere levacuazione dallarea interessata. La risposta proviene, caratteristicamente, dallesterno dellarea dove avvenuta la perdita, da parte di personale addestrato a dare risposte di emergenza. Tali fuoriuscite comprendono, ma non sono limitate a:
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immediato pericolo per la vita o la salute, grave minaccia di incendi o esplosioni, presenza di notevoli quantit di sostanze tossiche. LAppendice 2.8 considera la gestione delle perdite di sostanze chimiche pericolose. Dovrebbero essere disponibili in ogni area kit per la detersione delle sostanze fuoriuscite e carrelli adeguati agli specifici pericoli. Essi dovrebbero contenere: guanti e grembiuli di gomma, soprascarpe, occhiali di protezione, aspiratori idonei, assorbenti, agenti neutralizzanti, scope, palette per la spazzatura, sacchi o contenitori di eliminazione dei rifiuti, indicazioni per la pulizia. Assorbenti chimici come argilla o panni possono essere utilizzati per detergere molte sostanze pericolose e, quindi, possono essere pi facili da usare da parte dei dipendenti in casi di perdite. Per ogni perdita di materiale chimico pericoloso, specialmente se cancerogeno, ci si deve riferire agli MSDS specifici e contattare il supervisore designato o la persona incaricata a gestire le perdite e leliminazione di sostanze pericolose3. Anche il personale incaricato della salute e della sicurezza della struttura pu offrire la propria assistenza. Il datore di lavoro deve valutare il grado dellesposizione dei dipendenti. Dopo unesposizione, deve essere concessa al dipendente la possibilit di un consiglio medico,
al fine di stabilire la necessit di unapprofondita visita clinica. Uninaspettata perdita di vapori pericolosi costituisce unaltra fonte di pericolo sul posto di lavoro. La OSHA ha stabilito i limiti di unesposizione ai vapori pericolosi emessi da sostanze tossiche e pericolose 38. Il rischio potenziale associato alle sostanze chimiche definito dal produttore e viene elencato in un MSDS. Si veda la Tabella 2.8 per un elenco dei limiti di esposizione. Eliminazione delle scorie chimiche La maggior parte delle scorie provenienti da laboratori chimici considerata pericolosa e la loro eliminazione regolamentata dall EPA con il Resource Conservation and Recovery Act (42 USC 6901 et seq., 1976). Questa legge specifica che le scorie pericolose possono essere legalmente eliminate solo in una struttura di smaltimento approvata dallEPA. Leliminazione dei rifiuti chimici nella rete fognaria regolata dal Clean Water Act (33 USC 1251 et seq., 1977) e molti Stati hanno norme restrittive, relativamente alleliminazione di sostanza chimiche nei sistemi fognari. Sono da consultare le norme federali e statali, quando si realizzano o si revisionano le politiche della struttura riguardanti i rifiuti.
Tabella 2.8 - Limiti rdi legge per lesposizione a vapori tossici e pericolosi32 Limiti Limite permesso di esposizione Definizione La concentrazione massima di vapori (parti per milione) cui un dipendente pu essere esposto per 8 ore al giorno o per 40 ore alla settimana. Massima concentrazione di vapori permessa, cui un dipendente pu essere esposto per un periodo di 15 minuti, con un massimo di 4 esposizioni al giorno, intervallate da almeno unora. Massima concentrazione di vapori, che non si deve mai superare.
Limite di esposizione a breve termine
Limite massimo
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Sicurezza dalle radiazioni

La radiazione pu essere definita unenergia emessa sotto forma di onde o di particelle, che si propaga attraverso lo spazio o allinterno di un materiale. I raggi gamma sono radiazioni elettromagnetiche, mentre i raggi alfa e beta sono esempi di radiazioni particellari. In una Struttura Trasfusionale, la presenza di radiazioni, che partono dai radioisotopi usati in laboratorio per gli esami diagnostici o dagli irradiatori di unit di sangue, richiede ulteriori precauzioni e addestramenti3,39. Unit di misura delle radiazioni Lunit di misura che quantifica il carico di energia assorbito per unit di massa di tessuto il Gray (Gy) o rad (radiation absorbed dose, dose di radiazione assorbita): 1 Gy equivale a 100 rad. Le misurazioni delle dose-equivalenze sono molto pi utili di quelle della semplice energia, perch considerano lefficacia dei vari tipi di radiazioni nel causare conseguenze biologiche. Alla capacit di una radiazione di causare un danno viene assegnato un numero chiamato quality factor (QF). Per esempio, lesposizione a una data quantit di particelle alfa (QF = 20) molto pi dannosa dellesposizione a uneguale quantit di raggi gamma (QF = 1). Lunit di misura usuale per la dose-equivalenza il rem (rad equivalent man). Per ottenere la dose in rem di un particolare tipo di radiazione, si moltiplica il numero di rad per il quality factor (rad x QF = rem). Dato che il QF per i raggi gamma, i raggi X e per la maggior parte delle particelle beta 1, la dose in rad eguale a quella in rem per questi tipi di radiazioni. Effetti biologici delle radiazioni Ogni lesione tessutale da radiazioni inizia con lassorbimento dellenergia radiante e la susseguente rottura di legami chimici. Le molecole e gli atomi si ionizzano e/o si eccitano, assorbendo tale energia. Il percorso della azione diretta conduce alla radiolisi o alla formazione di radicali liberi che, a loro volta, alterano la struttura e le funzioni delle molecole allinterno della cellula.
Le alterazioni molecolari possono causare modifiche cellulari o cromosomiche, in relazione alla quantit e al tipo di energia radiante assorbita. Le modifiche cellulari possono manifestarsi visivamente, per esempio, con un eritema. Quelle a livello cromosomico possono manifestarsi come leucemie o altre neoplasie, o con possibili effetti sulle cellule germinali, che vengono trasmessi alle generazioni future. Il danno biologico influenzato dal tipo di radiazione, dalla parte del corpo esposta, dalla dose totale assorbita e dal ritmo di assorbimento della dose. La dose totale assorbita la quantit di radiazione che si accumula nei tessuti. Maggiore la dose, maggiore la potenzialit del danno biologico. Lesposizione pu essere sia acuta che cronica. I bassi livelli di radiazione che si possono produrre in Strutture Trasfusionali non dovrebbero porre alcun rischio nocivo40-43. Regolamentazioni La NRC (Nuclear Regulatory Commission) controlla luso dei materiali radioattivi, stabilendo i requisiti per le autorizzazioni. Anche gli Stati e le autorit municipali possono stabilire propri requisiti per le ispezioni e le autorizzazioni. Il tipo di autorizzazione per utilizzare radioisotopi o irradiatori dipender dagli scopi e dallampiezza dimpiego della radioattivit. Le strutture dovrebbero contattare la NRC e le agenzie statali appropriate per i requisiti delle autorizzazioni e per la loro applicazione, non appena tali attivit vengono proposte. Gli stabilimenti autorizzati dalla NRC debbono avere un dirigente qualificato in sicurezza dalle radiazioni, che stabilisca i requisiti di protezione del personale e le modalit appropriate di trattamento e smaltimento del materiale radioattivo. Le politiche e le procedure specifiche per la protezione dalle radiazioni dovrebbero prendere in considerazione: le dosi-limite, laddestramento dei dipendenti, i simboli e le etichette di avvertenza, le linee guida sulle spedizioni e sulle manipolazioni, il monitoraggio delle radiazioni, la gestione delle esposizioni.
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Le procedure di emergenza debbono essere chiaramente definite e rese prontamente disponibili al personale. Limiti di esposizione La NRC stabilisce standard per la protezione contro i pericoli da radiazione, che possono derivare dalle attivit autorizzate, ivi comprese le dosi-limite8. Questi limiti, o il massimo consentito di dosi-equivalenti, sono una misura del rischio di radiazione nel tempo, e servono come standard per le esposizioni. Il limite professionale effettivo di dosi-equivalenti totali di 5 rem per anno. Il limite superficiale (per la pelle) di 50 rem/anno, quello del punto pi distante di 50 rem/anno, quello per gli occhi di 15 rem/anno8,41. La dose limite per lembrione o il feto non deve superare 0,5 rem nel corso della gravidanza8,41,44. Ci si attende che i datori di lavoro non soltanto mantengano le esposizioni alle radiazioni sotto i limiti consentiti, ma anche che li mantengono al pi basso livello possibile, per quanto ragionevolmente ottenibile. Monitoraggio delle radiazioni Il monitoraggio essenziale per la precoce individuazione e per la prevenzione dei problemi legati allesposizione a radiazioni. Si soliti valutare lambiente, le pratiche e le procedure di lavoro e conformarsi alle norme e ai requisiti delle autorizzazioni NRC. Il monitoraggio si esegue con dosimetri, test biologici, misuratori di sorveglianza e test di strofinatura3. I dosimetri (pellicole, tessere e/o anelli termoluminescenti) misurano le dosi personali di radiazioni assorbite. La necessit di disporre di dosimetri dipende dalla quantit e dal tipo di materiale radioattivo in uso. Il dirigente preposto alla sicurezza dalle radiazioni determiner le necessit di dosimetri personali. Le pellicole devono: essere cambiate almeno ogni trimestre, in qualche caso anche ogni mese, protette da alte temperature e da umidit e conservate lontane da sorgenti di radiazioni. I test biologici, quali il conteggio delle captazioni nella tiroide o nellintero corpo, o le analisi dellurina, possono essere usati per determinare
se vi radioattivit nel corpo e, se s, quanta. Se del caso, i test biologici vengono eseguiti, di norma, ogni trimestre e dopo ogni evenienza che pu aver determinato un apporto accidentale di radiazioni. I misuratori di sorveglianza sono sensibili a bassi livelli di radiazioni gamma o particellari e forniscono valutazioni quantitative sui rischi da radiazione. Possono essere usati per monitorare le zone di conservazione per materiali radioattivi o loro scorie, per analizzare le aree durante o dopo le procedure, le confezioni e i contenitori di materiali radioattivi. Tali misuratori debbono essere calibrati annualmente da parte di un licenziatario autorizzato da NRC. La scelta di un misuratore adatto dovrebbe essere discussa con il dirigente incaricato della sicurezza dalle radiazioni. Nelle zone dove sono maneggiati materiali radioattivi, le superfici di lavoro, gli strumenti e i pavimenti, che potrebbero essere contaminati, dovrebbero essere regolarmente controllati con test di strofinatura. In questo tipo di test, un materiale assorbente umido (lo strofinaccio) viene passato sulle diverse superfici e poi sottoposto al conteggio delle radiazioni. A tale scopo sono disponibili kit. Nella maggior parte dei laboratori clinici, i livelli di radiazione sono nettamente al di sotto dei limiti stabiliti dalle norme federali e statali. Addestramento Il personale che maneggia materiali radioattivi o lavora con irradiatori del sangue, deve ricevere un addestramento sulla sicurezza dalle radiazioni prima di iniziare a lavorare. Tale addestramento dovrebbe fornire una spiegazione sulla presenza di materiali radioattivi nellarea specifica di lavoro del dipendente e sui loro potenziali rischi, sulle problematiche relative alla protezione della salute, sulle procedure di emergenza, sui simboli e sulle etichette di avvertimento usati. Si suggerisce, inoltre, di fornire istruzione sui punti seguenti: le normative NRC e le condizioni di autorizzazione; limportanza di osservare le condizioni di
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autorizzazione e i regolamenti e di segnalare le violazioni o le situazioni che determinano esposizioni evitabili; le precauzioni per ridurre al minimo le esposizioni; linterpretazione dei risultati forniti dagli strumenti di monitoraggio; gli obblighi per le lavoratrici gravide; i diritti dei dipendenti; i requisiti dei documenti e delle registrazioni. La necessit di rinfrescare laddestramento viene determinata dagli accordi sulla licenza intercorsi fra NRC e la Struttura Trasfusionale. Controlli tecnologici e dispositivi di protezione individuali Bench gli irradiatori indipendenti di sangue rappresentino un pericolo assai piccolo per il personale di laboratorio e non richiedano dosimetri per le attivit routinarie, le Strutture Trasfusionali che programmano luso di irradiatori debbono essere autorizzate dalla NRC41. Il produttore di irradiatori accetta, di solito, le responsabilit connesse al trasporto, allinstallazione e alla convalida degli strumenti, come parte del contratto dacquisto. Il dirigente incaricato della sicurezza dalle radiazioni pu aiutare a sovrintendere alle procedure di installazione e convalida e confermare che sono stati posti in opera, prima delluso, un addestramento appropriato, sistemi di monitoraggio, procedure e protocolli per la manutenzione che riflettono le raccomandazioni del produttore. Sospetti malfunzionamenti debbono essere riportati immediatamente alle autorit preposte, in modo che si possano iniziare azioni correttive. Gli irradiatori di sangue dovrebbero essere collocati in aree ad accesso limitato, cos che possano entrarvi solamente persone addestrate. Deve anche essere presa in considerazione la protezione dagli incendi. Nellarea circostante dovrebbero essere prontamente disponibili rivelatori automatici dincendio e sistemi di controllo. Gli emocomponenti irradiati non sono radioattivi e non costituiscono una minaccia per i dipendenti o per il pubblico in genere.
Pratiche di lavoro sicure Ogni laboratorio dovrebbe stabilire le politiche e le procedure per un uso sicuro dei materiali radioattivi. Queste dovrebbero comprendere gli obblighi da seguire sui principi generali di sicurezza, sulla corretta conservazione delle soluzioni radioattive e sullappropriato smaltimento dei rifiuti radioattivi. La sicurezza dalle radiazioni pu essere migliorata adottando le seguenti misure: minimizzando il pi possibile i tempi di esposizione del personale; aumentando al massimo la distanza fra la fonte di radiazioni, rimanendo il pi lontano possibile da tale fonte; aumentando le schermature (per esempio, utilizzando irradiatori autoschermati o indossando grembiuli con piombo, quando si lavora con certi materiali radioattivi); in genere, tali requisiti sono riportati nelle condizioni di autorizzazione; usando buone pratiche di pulizia per ridurre al minimo la diffusione della radioattivit in zone non controllate. Piano di risposta alle emergenze La contaminazione radioattiva la dispersione di materiale radioattivo entro e su zone non destinate: per esempio, pavimenti, posti di lavoro, strumenti, indumenti personali, cute. Le norme NRC stabiliscono che le contaminazioni gamma o beta non debbono superare 2.200 dpm (disintegrazioni per minuto)/100 cm2 nelle aree riservate o 220 dpm/100 cm2 nelle aree non riservate, come i corridoi. Per le contaminazioni alfa, questi valori sono 220 dpm/100 cm 2 e 22 dpm/100 cm 2 , rispettivamente45. Se si verifica una dispersione, la cute contaminata deve essere lavata accuratamente pi volte e deve essere informato immediatamente il dirigente per la sicurezza dalle radiazioni per ulteriori consigli. Nessunaltro deve entrare nellarea sin tanto che non sia arrivato il personale per le emergenze. Gestione dei rifiuti Le politiche per lo smaltimento dei rifiuti radioattivi, sia liquidi che solidi, dovrebbero essere
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stabilite con lintervento del dirigente deputato alla sicurezza dalle radiazioni e, se viene utilizzata una ditta autorizzata, da chi ha sottoscritto il contratto. I rifiuti liquidi debbono essere raccolti in ampie e robuste bottiglie etichettate adeguatamente come rifiuti radioattivi. Si debbono applicare le regole di separazione, in base alle compatibilit chimiche. Le bottiglie debbono essere conservate con cura per proteggerle da perdite o da rotture. I rifiuti secchi o solidi debbono essere sigillati in sacche di plastica e etichettati come scarti radioattivi. Il tipo di isotopo, la sua attivit e la data nella quale tale attivit stata misurata, dovrebbero essere indicati sulla sacca. I rifiuti radioattivi non debbono mai essere smaltiti nella rete fognaria, senza la preventiva approvazione del dirigente deputato alla sicurezza dalle radiazioni.
Spedizione di materiali pericolosi

Il trasporto locale di superficie di campioni di sangue, di emocomponenti o di materiale pericoloso dal punto di vista biologico da una struttura a unaltra (o allinterno di una stessa struttura) deve essere effettuato da un corriere locale autorizzato. Un trasporto sicuro di questi materiali esige che essi siano confezionati in modo tale da evitare la possibilit di perdite o di altre forme di spargimento durante il trasporto. Vedi il Metodo 1.1 per le istruzioni dettagliate per il trasporto di campioni diagnostici e di sostanze infette.
Gestione dei rifiuti

I responsabili della sicurezza debbono essere coinvolti per la protezione dellambiente e del personale. Dovrebbe essere fatto ogni sforzo per stabilire programmi validi per lintera struttura, al fine di ridurre i rifiuti solidi, sia quelli non pericolosi sia, soprattutto, quelli pericolosi (con rischi biologici, chimici, radioattivi).
Un programma di riduzione delle scorie pericolose, istituito nel posto di utilizzo del materiale, consegue diversi scopi. Diminuisce il rischio per lesposizioni professionali ad agenti pericolosi e le responsabilit dalla culla alla tomba dello smaltimento, cos come aumenta la conformit ai requisiti richiesti dallambiente di ridurre linquinamento, generato dalle attivit quotidiane di un laboratorio31,46.47. I requisiti necessitano che la struttura diminuisca linquinamento attraverso le tre erre (ridurre, riusare, riciclare). Ricercare adatte alternative alluso di materiali che possono produrre scarti pericolosi e separare questi ultimi dalle scorie non pericolose pu ridurre la quantit dei rifiuti pericolosi e far diminuire i costi per lo smaltimento. Uno scopo della gestione dei rifiuti dovrebbe essere quello di ridurre al minimo il volume del materiale a rischio. I rifiuti non infetti debbono essere sempre separati da quelli infetti. Dovrebbero essere prese in seria considerazione le modifiche a tecniche o a materiali, che possono ridurre la quantit degli scarti infetti o renderli meno pericolosi e il personale dovrebbe essere incoraggiato a identificare le alternative pi sicure ogni volta che sia possibile. Le strutture dovrebbero controllare insieme alle autorit sanitarie ed ambientali statali e locali i requisiti aggiornati per lo stoccaggio e lo smaltimento di particolari rifiuti con pi elementi di rischio, prima che tali rifiuti vengano prodotti. Se il rifiuto multirischio non pu essere evitato, il volume prodotto dovrebbe essere minimizzato. In alcuni stati, il solfato di rame contaminato da sangue considerato un rifiuto multirischio. Il suo smaltimento pone vari problemi di trasporto dal sito di raccolta alla struttura centrale per lo smaltimento dei contenitori finali. I dipartimenti della salute statali e locali devono essere coinvolti nella revisione delle pratiche di trasporto e di smaltimento laddove ci sia rilevante, e le procedure devono essere sviluppate in accordo alle loro norme unitamente a quelle del Dipartimento dei Trasporti USA.
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Piani per le calamit

Le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali dovrebbero stabilire dei piani di azione per i pericoli non comuni ma potenzialmente gravi (per esempio: alluvioni, uragani, tornados, terremoti, incendi, esplosioni, emergenze biologiche, chimiche o per radiazioni, collassi strutturali, situazioni di presa in ostaggio, minacce di bombe o di atri atti terroristici, altre evenienze dove potrebbero intervenire incidenti di massa). Tali eventi richiedono un piano che garantisca la sicurezza di pazienti, visitatori, lavoratori e dellapprovvigionamento di sangue. I disastri possono interessare la sola struttura, larea circostante, o entrambe e possono essere classificati per livello di gravit: minimo impatto sulla normale operativit, da moderata a sostanziale riduzione delloperativit o grave e prolungata perdita di operativit. La JCAHO richiede un piano che consideri quattro fasi: attenuazione, preparazione al disastro, risposta, e ritorno alla normalit4. Le politiche e le procedure possono prendere in considerazione: procedure di segnalazione; comunicazioni continuative (ad esempio centro di comando); evacuazione o nuova collocazione; isolamento o contenimento; sicurezza e protezione del personale; ottenimento di personale aggiuntivo; Caratteristicamente, in caso di disastro, la prima persona che si accorge della situazione intraprende azioni immediate ed avverte gli altri, sia attraverso un sistema di attivazione di allarme (ad esempio, mediante un avvisatore dincendio) sia notificando levento alle autorit, che mettono in funzione fasi iniziali di risposta e contattano il coordinatore della struttura deputato alle calamit. I dipendenti dovrebbero essere addestrati alle politiche della struttura in tema di risposta ai disastri. Dato che la probabilit di essere coinvolti in un reale disastro minima, si dovrebbero effettuare delle esercitazioni, al fine di assicurare risposte appropriate e preparare il personale ad agire rapidamente. Ogni disastro unevenienza
unica. Se necessario, debbono esse fatte modifiche: la flessibilit importante. Una volta che il disastro sotto controllo e il recupero in atto, le azioni dovrebbero essere rivalutate e dovrebbero essere apportate modifiche al piano, se necessarie. Tuttavia, la singola protezione maggiormente efficace che ha una struttura contro una calamit inaspettata la consapevolezza che i dipendenti consci della sicurezza hanno per ci che li circonda.
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Appendice 2.1 - Norme e raccomandazioni per la sicurezza applicabili in campo sanitario
Agenzia/organizzazione Norme e raccomandazioni federali Commissione per la Regolamentazione Nucleare (NRC)
Riferimento
Titolo del documento
10 CFR 20 Guida 8.29
Standard per la protezione contro le radiazioni. Istruzioni sui rischi da esposizione professionale alle radiazioni. Esposizione professionale ai patogeni di origine ematica.
Dipartimento del Lavoro, Amministrazione della Sicurezza Professionale e e della Salute (OSHA)
29 CFR 1910.1030
29 CFR 1910.1096 29 CFR 1910.1200 29 CFR 1910.1450
Radiazioni ionizzanti. Standard di segnalazione dei rischi. Esposizione professionale a rischi chimici in laboratorio. Regolamento sui materiali pericolosi. Guide EPA per la gestione di rifiuti pericolosi. Linee guida per le precauzioni di isolamento in Ospedale.
Dipartimento dei Trasporti (DOT) Agenzia per la Protezione dellAmbiente (EPA) Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC) Amministrazione dei Cibi e dei Farmaci (FDA)
49 CFR 171-180
21 CFR 606.40, 606.60 e 606.65
Prassi di buona produzione (cGMP) per sangue ed emocomponenti. Linee guida per la raccolta di prodotti ematici da donatori con test positivi per i marcatori di malattie infettive.
21 CFR 801.437
Etichettature per strumenti che contengono gomma naturale.

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Agenzia/organizzazione
Riferimento
Titolo del documento
Organizzazioni commerciali e professionali Associazione Nazionale di Protezione dagli Incendi (NFPA) NFPA 70 NFPA 70E NFPA 101 NFPA 704 Codice nazionale per lelettricit. Requisiti per la sicurezza elettrica del posto di lavoro dei dipendenti. Codice per la sicurezza vitale da incendi in edifici e strutture. Standard per identificare i pericoli di materiali per la risposta alle emergenze. Manuale per la realizzazione di sistemi di identificazione di materiali pericolosi (HMIS). Regolamentazione per merci pericolose.
Associazione Nazionale per Pitture e Rivestimenti
Associazione Internazionale del Traffico Aereo (IATA)
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Appendice 2.2 - Linee guida generali per pratiche di lavoro sicure, per dispositivi di protezione individuale e per controlli tecnologici
Divise e indumenti di laboratorio Quando i dipendenti sono esposti a sangue, sostanze chimiche corrosive o cancerogene dovrebbero indossare indumenti da laboratorio chiusi o grembiuli su indumenti a manica lunga e vesti lunghe. Il materiale degli indumenti di copertura dovrebbe essere adatto al tipo del pericolo e alla durata dellesposizione. I grembiuli a perdere di plastica possono essere indossati al di sopra di indumenti di cotone, se esiste unalta probabilit di ampie perdite o di spruzzi di sangue o di liquidi organici; sono da preferirsi i grembiuli di gomma (nitrile), quando si versano sostanze chimiche caustiche. Prima di lasciare le zone di lavoro, ci si dovrebbe liberare dagli indumenti protettivi, da eliminare o da conservare lontano da sorgenti di calore e da vesti pulite. Gli indumenti contaminati dovrebbero essere prontamente rimossi, sistemati in contenitori adatti e lavati o scartati, come potenzialmente infettanti. Non viene consentito il lavaggio domestico di indumenti indossati nelle aree di lavoro a livello di biosicurezza 2 (vedi oltre), dato che metodi non prevedibili di trasporto e trattamento potrebbero disseminare contaminazione e le tecniche di lavaggio interno potrebbero non essere sufficientemente efficaci1. Guanti Si dovrebbero usare guanti o tipi di barriere consimili ogni volta che un compito possa verosimilmente comportare unesposizione a materiali pericolosi. I guanti in lattice o in vinile debbono essere adeguati ai trattamenti della maggior parte dei campioni di sangue e di materiali chimici (vedi, pi sotto, i problemi di allergia al lattice). Tipi di guanti I tipi di guanti variano a secondo dei compiti affidati: guanti sterili: per procedure che coinvolgono contatti con parti del corpo normalmente sterili; guanti da esplorazione: per procedure che coinvolgono contatti con mucose, a meno di diverse indicazioni, e per altre cure di pazienti o per procedure diagnostiche che non richiedono luso di guanti sterili; guanti in gomma di comune pratica: per attivit di pulizia di tipo domestico, che possano implicare contatti con sangue, per procedure di pulitura e decontaminazione di strumenti, per maneggiare acidi e solventi organici concentrati. Questo tipo di guanto pu essere decontaminato e riusato ma dovrebbe essere scartato se mostra segni di deterioramento (spellature, rotture, decolorazioni) o se sviluppa forature o tagli; guanti isolanti: per maneggiare materiale urente o congelato. Indicazioni per luso Si dovrebbero osservare le seguenti linee guida per determinare se luso di guanti si rende necessario: per prelievi di sangue ai donatori, quando il personale sanitario ha tagli, ferite o altre soluzioni di continuo sulla cute; per prelievi di sangue autologo o per prelievi a pazienti (come nel caso di aferesi terapeutiche o recuperi intra-operatori); per le persone che stanno ricevendo un addestramento sul prelievo di sangue; quando si maneggiano contenitori o campioni di sangue aperti;
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quando si raccolgono o si maneggiano sangue o campioni di sangue da pazienti o da donatori noti per essere infetti da patogeni a trasmissione ematica; quando si esaminano membrane mucose o lesioni cutanee aperte; quando si maneggiano materiali chimici corrosivi o radioattivi; quando si puliscono spruzzi di sangue o si maneggiano rifiuti pericolosi; quando non si possono valutare le probabilit di esposizione per mancanza di esperienza con una procedura o situazione. LOSHA non richiede luso routinario dei guanti in chi effettua prelievi di sangue a donatori sani, gi selezionati e sottoposti ai test di screening, o di cambiare guanti puliti fra una donazione e laltra qualora siano sciupati 1,2. Lesperienza ha dimostrato che le procedure di prelievo a scopo trasfusionale (flebotomie) sono a basso rischio, in quanto i donatori hanno un basso tasso di marcatori delle malattie infettive. Inoltre, durante lusuale flebotomia, il rischio di esposizione al sangue raro e si possono anche usare barriere alternative di protezione, quali tamponi di garza per controllare ogni fuoriuscita di sangue, al momento di togliere lago dal braccio del donatore. Il datore di lavoro, quando le politiche e le procedure non richiedono luso routinario di guanti, dovrebbe rivalutare, periodicamente, le potenziali necessit di guanti. I dipendenti non dovrebbero essere scoraggiati al loro uso e dovrebbero essere sempre disponibili scorte di guanti. Linee guida alluso dei guanti Le linee guida per un uso sicuro dei guanti dovrebbero prevedere i punti di seguito esplicitati3,4: bendaggi ben aderenti o medicazioni sopra lesioni della pelle sulle mani o sulle braccia prima di indossare guanti; cambiare immediatamente i guanti, se sono strappati, perforati o contaminati, in caso di contatto con campioni ad alto rischio, dopo aver condotto un esame obiettivo (per esempio, su un donatore da sottoporre ad aferesi); rimuovere i guanti, mantenendo la loro superficie esterna a contatto soltanto con lesterno, rovesciandoli mentre si tolgono; usarli soltanto quando necessario, evitando che tocchino superfici pulite, quali telefoni, maniglie, o terminali di computer; cambiarli dopo contatti con pazienti diversi fra loro. Se sono puliti, non necessario cambiare i guanti fra un donatore e laltro; lavarsi le mani con sapone o altro disinfettante adatto, dopo esserseli tolti; non lavare n disinfettare guanti chirurgici o da esplorazione per un loro riuso. I lavaggi con tensioattivi possono causare rotture (e, quindi, un aumento della penetrazione di liquidi attraverso i fori del guanto). I disinfettanti comuni possono deteriorare i guanti; se necessario, usare solamente lozioni a base acquosa per le mani inguantate; i prodotti a base di olio causano microlesioni nel lattice. Schermature per il viso, maschere e occhiali di sicurezza Quando esiste il rischio di spruzzi di sangue o di sostanze chimiche, gli occhi e le mucose della bocca e del naso dovrebbero essere protetti5. Sono da preferirsi schermature permanenti, fissate come parte integrante degli apparecchi o ai banchi, come barriere contro le perdite integrate ai saldatori dei tubicini delle sacche da prelievo o agli alloggiamenti delle centrifughe.
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Tutti i tipi di barriere dovrebbero essere puliti e disinfettati con regolarit. Gli occhiali di sicurezza forniscono una protezione dallimpatto di oggetti proiettabili ma non difendono adeguatamente gli occhi da spruzzi di sostanze pericolose biologiche o chimiche. Le schermature complete per il viso, le maschere e gli occhiali di sicurezza vengono raccomandati quando non sia possibile servirsi di schermature permanenti. In commercio sono disponibili molti modelli; suscitare linteresse del personale sul loro comfort e sulla loro scelta pu migliorarne laccettazione e luso. Ogni volta che esiste un pericolo di inalazione, si dovrebbero indossare maschere. Maschere semplici, monouso, come quelle per le polveri, sono idonee per maneggiare sostanze chimiche secche, ma, nelle zone dove si producono fumi nocivi (per esempio, nel pulire sostanze pericolose versate), sono da preferirsi respiratori con filtri per i vapori organici. I respiratori dovrebbero essere saldamente fissati agli specifici apparati per indossarli e controllati ogni anno. Lavaggio delle mani Un frequente lavaggio delle mani rappresenta la prima linea di difesa nel controllo delle infezioni. I patogeni a partenza ematica non penetrano generalmente attraverso la cute intatta, cos che una loro immediata rimozione riduce le probabilit di trasferimento a mucose, a zone con lesioni cutanee o la trasmissione fra le persone. Mediante il lavaggio di mani (e braccia) si riduce anche il rischio di una esposizione a materiali chimici o radioattivi pericolosi. Ci si dovrebbe lavare le mani ogniqualvolta si abbandona una zona riservata, prima di utilizzare cappe di sicurezza biologica, fra un esame clinico e laltro, immediatamente dopo che ci si insudiciati con sangue o materiale pericoloso, dopo essersi sfilati i guanti e dopo aver usato la toilet. essenziale un accurato lavaggio delle mani prima di toccare lenti a contatto o applicare cosmetici. La OSHA consente limpiego di soluzioni antisettiche senza acqua per lavarsi le mani, quale metodo temporaneamente sostitutivo2. Tali soluzioni sono utili nei punti mobili di raccolta sangue o dove lacqua non prontamente disponibile. Qualora si usino queste soluzioni, tuttavia, le mani dovrebbero, poi, essere lavate con sapone e acqua corrente non appena possibile. Dato che non esistono elenchi o registrazioni di prodotti accettabili per asciugarsi le mani simili a quelli che lEPA mantiene per i disinfettanti superficiali, i consumatori dovrebbero richiedere ai produttori i dati a supporto di quanto affermano nei messaggi pubblicitari di tali prodotti. Lavaggio degli occhi Le zone con laboratori che contengono sostanze chimiche pericolose debbono essere equipaggiate con docce oculari3,6. Tali postazioni debbono avere accessi non ostruiti ed essere raggiungibili nel giro di 10 secondi dalla zona dove sono usate sostanze a rischio. Le docce oculari debbono operare in modo che entrambe le mani dellutilizzatore siano in grado di tenere aperti gli occhi. Debbono essere presenti procedure e istruzioni per luso e debbono essere controllate le funzioni di routine. Il controllare settimanalmente le postazioni ne assicura la funzionalit corretta e consente di scaricare i residui dacqua stagnante. Docce oculari portatili sono consentite soltanto se sono in grado di fornire acqua o liquidi correnti a un ritmo di un litro e mezzo al minuto per un periodo totale di 15 minuti. Dovrebbero essere monitorati regolarmente per assicurare la purezza dei liquidi contenuti. I dipendenti dovrebbero essere addestrati a un uso appropriato degli apparati per il lavaggio degli occhi, quantunque sia preferibile la prevenzione, attuata con lutilizzo costante e appropriato di occhiali di sicurezza e di schermature.
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Se interviene uno schizzo, i dipendenti dovrebbero essere invitati a mantenere le palpebre aperte e a usare le docce oculari secondo le procedure o andare al pi vicino lavandino e indirizzare negli occhi un costante flusso di acqua tiepida. Soluzioni diverse dallacqua dovrebbero essere impiegate soltanto dietro prescrizione medica. Dopo un adeguato lavaggio con acqua (molte strutture raccomandano della durata di 15 minuti), si dovrebbe chiedere un follow-up medico nel tempo, specialmente nel caso si sviluppino dolore e rossore. Non stato dimostrato che il lavaggio degli occhi prevenga le infezioni, ma , comunque, consigliabile quando interviene un incidente.
1. Code of federal regulations. Occupational exposure to bloodborne pathogens, final rule. Title 29 CFR Part 1910.1030. Fed Regist 1991;56(235):64175-82. 2. Occupational Safety and Health Administration. Enforcement procedures for the occupational exposure to bloodborne pathogens. OSHA Instruction CPL2-2.44D. Washington, DC: US Government Printing Office, 1999. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. Clinical laboratory safety; approved guideline. NCCLS document GP17-A. Wayne, PA: CLSI, 1996. 4. Food and Drug Administration. Medical glove powder report. (September 1997) Rockville, MD: Center for Devices and Radiological Health, 1997. [Disponibile a http://www.fda.gov/cdrh/glvpwd.html]. 5. Inspection checklist: General laboratory. Chicago, IL: College of American Pathologists, 2001. 6. American National Standards Institute. American national standards for emergency eyewash and shower equipment. ANSI Z358.1-1998. New York: ANSI, 1998
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Appendice 2.3 - Precauzioni per una sicurezza biologica di livello 2

Le precauzioni di sicurezza biologica di livello 2 applicate nelle Strutture Trasfusionali devono comprendere almeno quanto elencato di seguito1,2: le attivit ad alto rischio siano appropriatamente separate da quelle a rischio minore e i suoi confini siano chiaramente definiti; le superfici superiori dei banchi siano facilmente pulibili e siano decontaminati ogni giorno con disinfettanti ospedalieri approvati dallEPA; le stanze dei laboratori abbiano porte chiudibili a chiave e lavandini. preferibile (ma non richiesto) un sistema di ventilazione senza ricircolo; si richiede ai lavoratori di effettuare procedure che possono creare aerosol (per esempio, apertura di provette sotto vuoto, centrifugazione, agitazione, sonicazione) sotto cappe di sicurezza biologica o in apparati equivalenti o di indossare maschere o occhiali di protezione, oltre a guanti e indumenti lunghi nel corso di tali procedure. (Nota: provette aperte contenenti sangue non dovrebbero essere centrifugate. Quando si centrifugano unit di sangue o di plasma, si raccomanda luso di un sacchetto di contenimento di eventuali perdite); uso routinario di guanti e vesti lunghe, secondo le linee guida generali sulla sicurezza. Le schermature per il viso o apparati consimili siano usati dove vi un rischio di schizzi; proibito pipettare con la bocca; non mangiare, bere, fumare, applicarsi cosmetici o manipolare lenti a contatto nelle zone di lavoro. Cibi e bevande vanno conservati al di fuori delle aree riservate e gli articoli di laboratorio in vetro non debbono essere mai usati per cibi e bevande. Istruire il personale a non toccarsi il viso, le orecchie, la bocca, gli occhi o il naso con le proprie mani o con altri oggetti, quali penne o telefoni; usare ed eliminare aghi e siringhe in modo sicuro. Gli aghi non siano piegati, rotti, tagliati, sistemati nelle coperture di protezione o distaccati dalla siringa prima di essere sistemati in contenitori a prova di punture e di perdite, allo scopo di uneliminazione controllata. Le procedure siano studiate per minimizzare lesposizione a oggetti taglienti; sistemare tutti i campioni di sangue in contenitori ben costruiti e con coperchi di sicurezza, per evitare perdite durante i trasporti. Per i trasferimenti, le unit di sangue siano confezionate secondo i requisiti richiesti dalla agenzie di regolamentazione per agenti eziologici o campioni clinici, qualora indicato; i rifiuti infetti non siano riuniti e siano decontaminati prima della loro eliminazione in contenitori a prova di perdite. Unappropriata confezione consiste in sacche doppie (di color arancione o rosso) senza commessure, resistenti agli strappi, inserite in cartoni protettivi. Sia la scatola sia le sacche allinterno debbono essere etichettate con simbolo rischio biologico. Attraverso tutte le fasi di trasporto e consegna a un inceneritore o a unautoclave, i rifiuti siano maneggiati soltanto da persone specificamente addestrate. Se, per maneggiare tali rifiuti, si utilizza una ditta esterna, che ha sottoscritto un contratto, laccordo deve definire, con chiarezza, le rispettive responsabilit, sia del personale sia del sottoscrittore; gli strumenti che debbono essere riparati o sottoposti a manutenzione preventiva, qualora potenzialmente contaminati da sangue, debbono essere decontaminati prima di essere consegnati ai tecnici addetti alla riparazione; segnalare immediatamente al direttore o al responsabile del laboratorio lesposizione accidentale a materiale sospetto o realmente infetto.
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Clinical laboratory safety; approved guideline. NCCLS document GP17-A. Wayne, PA: CLSI, 1996. 2. Fleming DO. Laboratory biosafety practices. In: Fleming DO, Richardson JH, Tulis JJ, Vesley D, eds. Laboratory safety, principles and practices. 2nd ed. Washington, DC: American Society for Microbiology Press, 1995:203-18.
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Appendice 2.4 - Modulo per dati relativi a campioni di sostanze chimiche pericolose
Le seguenti informazioni dovrebbero far parte per procedure relative alluso di sostanze chimiche pericolose. Identificazione della struttura Nome del laboratorio Numero della stanza Nome della sostanza chimica Sinonimi Numero dellestratto chimico Nome comune Rischio primario :___________________________________________________ :___________________________________________________ :___________________________________________________ :___________________________________________________ :___________________________________________________ :___________________________________________________ :___________________________________________________ Cancerogeno Tossico per la riproduzione Estrema tossicit acuta Altro rischio per la salute Rischio per la sicurezza MSDS o altro riferimento disponibile Luso della sostanza chimica stato approvato? E se s, da chi? :______________________ :______________________ :______________________ :______________________ :______________________ :______________________ :______________________
Precauzioni generali e speciali: Segnalazioni richieste (simboli che indicano la presenza di sostanze chimiche o di attivit pericolose):_____________________________________________________________________ Conservazione (contenitori secondari, sensibilit alle temperature, incompatibilit, reattivit allacqua etc.):__________________________________________________________________________ Controlli e postazioni speciali (cappe per i fumi, celle a guanti etc.):________________________ ______________________________________________________________________________ Strumentazioni speciali (filtri in linea per il vuoto, trappole per liquidi e altro materiale, schermature speciali):_______________________________________________________________________ Dotazioni protettive personale (tipo di guanti, protezioni per gli occhi, indumenti speciali etc.):___________________________________________________________________________ Procedure di emergenza: Schizzi o perdite:_________________________________________________________________ Incendi:________________________________________________________________________ Procedure di decontaminazione:_____________________________________________________ Procedure di eliminazione:__________________________________________________________
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Appendice 2.5 - Esempio di lista di sostanze chimiche pericolose in una Struttura Trasfusionale
Sostanza chimica Acido citrico Acido cloridrico Acido solfo salicilico Acido tricloracetico (TCA) Alcol isopropilico Anidride carbonica (ghiaccio secco) Azoto liquido Bromelina Bromuro di etidio Cloroformio Cloruro dammonio Cloruro di Calcio Cloruro esaidrato di Cromo 111 Diclorometano Digitonina Dimetilsulfossido (DMSO) Etere etilico Etilendiamminotetraacetato (EDTA) Etilmercuriltiosalicilato di Sodio Ficina (in polvere) Fosfato di Sodio Ghiaccio secco (anidride carbonica) Glicerolo Idrosolfito di Sodio Idrossido di Potassio Idrossido di Sodio Imidazolo
Caratteristiche pericolose Irritante Altamente tossico, corrosivo Tossico, corrosivo Corrosivo, tossico Infiammabile, irritante Corrosivo Corrosivo Irritante, sensibilizzante Cancerogeno, irritante Tossico, sospetto cancerogeno Irritante Irritante Tossico, irritante, sensibilizzante Tossico, irritante Tossico Irritante Altamente infiammabile ed esplosivo, tossico, irritante Irritante Altamente tossico, irritante Irritante, sensibilizzante Irritante, igroscopico Irritante Irritante Tossico, irritante Corrosivo, tossico Corrosivo, tossico Irritante
(segue)
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Sostanza chimica Ipoclorito di Sodio (candeggina) Lipogel 2-Mercaptoetanolo Mercurio Olio minerale Papaina Polibrene Polvere di Ferro carbonile Saponina Sodiazide Solfato di Cu (solfato rameico) Soluzione di formaldeide (al 34,9%) Tripsina Xilene
Caratteristiche pericolose Corrosivo Corrosivo Tossico, maleodorante Tossico Irritante, cancerogeno, combustibile Irritante, sensibilizzante Tossico Ossidante Irritante Tossico, irritante, esplosivo se riscaldata Tossico, irritante Sospetto cancerogeno, combustibile, tossico Irritante, sensibilizzante Altamente infiammabile, tossico, irritante
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Appendice 2.6 - Specifiche categorie di sostanze chimiche e come lavorare con queste in modo sicuro
Categorie Acidi, alcali e composti corrosivi Rischio Irritazioni Ustioni gravi Danni tessutali Precauzioni Trattamenti specifici
Nel trasporto proteggere i grandi Conservare gli acidi contenitori, trasportandoli con in armadietti sicuri. carrelli per secchi in gomma Limitare a 1 L i volumi di acidi o in plastica. Durante i travasi concentrati. indossare occhiali protettivi, guanti Sistemare avvertimenti di e grembiuli come raccomandato. prudenza per i materiali Aggiungere sempre acidi allacqua, di unarea. mai acqua agli acidi. Segnalare, al responsabile Quando si lavora con grandi della sicurezza chimica, bottiglie, tenere una mano sul cambiamenti di aspetto collo e una sul fondo e (lacido perclorico pu essere tenerle lontano dal viso. esplosivo se diviene giallastro o marrone) Indossare guanti per sostanze chimiche. Lavarsi subito le mani dopo lesposizione. Etichettare secondo il contenuto. Lasciare la valvola di sicurezza, coperta sino allutilizzo. Aprire lentamente le valvole. Etichettare le bombole vuote. Conservare lacrilamide in sicuri armadi per sostanze chimiche pericolose. Trasportare i gas usando carrelli a mano o bombole. Sistemare le bombole in supporti o assicurarle per prevenire la caduta. Conservare in stanze separate ben ventilate. Lossigeno non dovrebbere essere conservato vicino a gas o solventi combustibili Controllare, con acqua saponosa, le connessioni per eventuali perdite. I serbatoi i dovrebbero essere dotati di supporti di sicurezza per evitare di essere ribaltati. Il contenitore finale dellazoto liquido (unit di congelamento) dovrebbe essere ben assicurato per evitarne il ribaltamento.
(segue)
Acrilamide
Neurotossico Cancerogeno Assorbibile attraverso la cute Esplosivi
Gas compressi
Azoto liquido Lesioni da congelamento Ustioni gravi a cute e occhi
Usare guanti altamente isolanti e occhiali mentre si lavora con azoto liquido.
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Categorie Solventi infiammabili
Rischio Classificati secondo il punto di infiammabilit vedi MSDS
Precauzioni Usare estrema attenzione nel maneggiarli. Sistemare i cartelli non fumare. nelle zone di lavoro. Avere nella stanza un estintore e un kit di pulizia per solventi. Versare i solventi volatili sotto la cappa riservata. Usare occhiali di protezione e guanti di neoprene, resistenti alle sostanze chimiche. Quando si versano solventi infiammabili non ci dovrebbero esservi fiamme o altre fonti di possibile accensione nellarea o vicina ad essa. Etichettare come infiammabile.
Trattamenti specifici Fare ogni sforzo per rimpiazzare i materiali pericolosi con altri meno rischiosi. Conservare i contenitori di volume maggiore di 4 litri in una stanza di conservazione o in un armadio a prova di fuoco. Sistemare a terra i contenitori connettendoli a un tubo dellacqua o a una presa a terra; se anche il recipiente del contenitore di metallo, dovrebbe essere elettricamente connesso al contenitore di trasporto mentre si versa il liquido.
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Appendice 2.7 - Risposta a spandimenti accidentali di sostanze chimiche*

Categorie Acidi: Acetico Cloridrico Nitrico Perclorico Solforico Reagenti fotografici (acidi) Basi e caustici: Idrossido di potassio Idrossido di sodio Reagenti fotografici (basi) Rischio Gravemente irritanti se inalati. Il contatto causa ustioni a cute ed occhi. Corrosivi. Il fuoco o il contatto con metalli pu produrre gas irritanti o velenosi. Gli acidi nitrico, perclorico e solforico sono ossidanti reattivi allacqua. Corrosivi. Il fuoco pu produrre gas irritanti o velenosi. DPI Guanti resistenti agli acidi. Grembiuli, indumenti di copertura integrale. Schermature per viso e occhi. Scarponi resistenti agli acidi. Trattamenti specifici Sostanze assorbenti e neutralizzanti gli acidi. Barriere assorbenti. Contenitori a prova di perdite. Cuscini assorbenti. Tappeti di copertura per gli scoli. Pale e spatole. Sostanze assorbenti e neutralizzanti le basi. Cuscini assorbenti. Barriere assorbenti Tappeti di copertura per gli scoli. Contenitori a prova di perdite. Pale e spatole.
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Guanti, grembiuli o indumenti a copertura integrale impermeabili. Schermature per il viso e gli occhi; scarponi impermeabili.
Cloro: Candeggina Ipoclorito di sodio
Linalazione pu causare irritazione respiratoria. Il contatto con liquido pu produrre irritazione a occhi e cute. Tossicit dovuta allalcalinit, possibile generazione di cloro gassoso e propriet ossidanti.
Guanti (doppio set di sottoguanti Polveri di trattamento di cloro. tipo 4 H e sopraguanti in butile o nitrile). Cuscini assorbenti. Grembiuli e indumenti impermeabili. Assorbenti. Occhiali di protezione e schermature Barriere assorbenti. per il viso. Barriere per i vapori. Scarpe impermeabili (scarponi in Tappeti di copertura per gli scoli. neoprene per la risposta a emergenze). Barriere ai vapori. Respiratori autosufficienti (per la Contenitori a prova di perdite. risposta a emergenze). Pale e spatole
(segue)
Categorie Gas criogenici: Anidride carbonica Ossido nitroso Azoto liquido
Rischio Il contatto con lazoto liquido pu produrre congelamenti. Asfissia (spiazzano lossigeno) Effetto anestetico (ossido nitroso).
DPI Schermature complete per il viso od occhiali di protezione, scarponi in neoprene, guanti (isolati per la protezione dal freddo).
Trattamenti specifici Carrelli a mano (per eventuale trasporto delle bombole allesterno). Soluzioni saponose (per controllare le perdite). Stucco (per riparare piccole perdite di tubi e condotti). Carrelli a mano (per eventuale trasporto delle bombole allesterno). Soluzioni saponose (per controllare le perdite). Assorbenti. Barriere assorbenti. Cuscini assorbenti. Pale e spatole (non metalliche, non producenti scintille). Tappeti di copertura per gli scoli. Contenitori a prova di perdite. Neutralizzanti le aldeidi/assorbenti. Barriere assorbenti. Cuscini assorbenti. Pale e spatole (non producenti scintille). Tappeti di copertura per gli scoli. Contenitori a prova di perdite.
(segue)
Gas infiammabili: Acetilene Ossigeno gassoso Butano Propano Liquidi infiammabili: Acetone Xilene Metanolo Toluene Etanolo Altri alcol Formaldeide e glutaraldeide: Formaldeide al 4% Formaldeide al 37% Formalina al 10% Glutaraldeide al 2%
Asfissia semplice (spiazzano lossigeno). Potenziali anestetici. Rischio estremo di incendio e di esplosione. Il rilascio pu creare unatmosfera povera in ossigeno. Vapori dannosi se inalati (deprimono il sistema nervoso centrale). Dannosi se assorbiti attraverso la cute. Estrema infiammabilit. I liquidi evaporano formando vapori infiammabili.
Schermature complete per il viso od occhiali di protezione; scarponi in neoprene; doppio set di guanti; indumenti a copertura integrale con cappuccio e sovrascarpe. Guanti (doppio set di sottoguanti tipo 4H e sopraguanti in butile o nitrile). Grembiuli e indumenti impermeabili a schermatura completa. Occhiali di protezione e schermature per il viso. Scarpe impermeabili. Guanti (doppio set di sottoguanti tipo 4 H e sopraguanti in butile o nitrile). Grembiuli e indumenti impermeabili a schermatura completa. Occhiali di protezione. Scarpe impermeabili.
Dannose se inalate o assorbite attraverso la cute. Irritazione a cute, occhi, apparato respiratorio. La formaldeide un sospetto cancerogeno per luomo. Tenere lontano da calore, scintille e fiamme (formaldeide al 37%).
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Categorie Mercurio: Sonde di Cantor Termometri Barometri Sfigmomanometri Bicloruro di mercurio
Rischio Il mercurio e i vapori di mercurio sono rapidamente assorbiti nellapparato respiratorio, gastroenterico e della cute. Lesposizione a breve termine pu causare erosione delle mucose respiratorie e gastrointestinali, nausea, vomito, diarrea ematica, shock, cefalea, gusto metallico in bocca. Linalazione di alte concentrazioni pu causare polmonite, dolore toracico, dispnea, tosse, stomatiti, gengiviti e ipersalivazione. Evitare levaporazione di mercurio da piccoli globuli mediante rapida ed accurata pulizia.
DPI Guanti (doppio set di sottoguanti tipo 4 H e sopraguanti in butile o nitrile). Grembiuli e indumenti impermeabili. a schermatura completa. Occhiali di protezione. Scarpe impermeabili.
Trattamenti specifici Apparati a vuoto o a rovesciamento per il recupero di mercurio. Palette. Aspiratori. Contenitori per rifiuti pericolosi. Polvere indicatrice di mercurio. Assorbenti Spatole. Asciugamani monouso. Spugne con amalgama. Soppressori di vapore.
* Questa lista di rischi fisici e per la salute non sostituisce le specifiche informazioni fornite da specifici MSDS (Material Safety Data Sheets, schede di sicurezza). Qualora si verifichi un versamento o sorga qualsiasi altro problema fare sempre riferimento al responsabile dei MSDS per le sostanze chimiche al fine di avere informazioni pi esaurienti.
Appendice 2.8 - Gestione delle perdite di materiali chimici pericolosi

Azioni Togliere energia: Istruzioni per perdite pericolose di liquidi, gas e mercurio Liquidi: per la formaldeide al 37%, togliere energia e rimuovere tutte le sorgenti di possibili incendi entro una zona di ~3 metri (10 piedi) dal materiale pericoloso fuoriuscito. Per liquidi infiammabili rimuovere ogni sorgente di possibili incendi Gas: rimuovere ogni fonte di calore o di incendio entro ~15 metri (50 piedi) da gas infiammabili.Rimuovere ogni fonte di calore o di incendio per le perdite di ossido di azoto. Isolare la zona dove avvenuta la perdita e allontanare tutti dalle aree circostanti, eccetto il personale responsabile per la pulizia dellarea pertinente (per il mercurio evacuare la zona entro ~3 metri per piccole perdite ed entro ~6 metri per perdite maggiori). Rendere sicura larea. Vedi Appendice 2.2 per i dispositivi di protezione individuali raccomandati.
Isolare, evacuare e rendere sicura la zona Indossare i DPI appropriati
Contenere la perdita Liquidi e mercurio: se possibile, bloccare ogni fonte di perdite. Gas: valutare la scena, considerare le circostanze della perdita (quantit, localizzazione, ventilazione). Se le circostanze indicano che esiste una necessit di risposta allemergenza, effettuare le appropriate notifiche. Se si determina che la perdita stata accidentale, contattare i fornitori per lassistenza. Confinare la perdita Liquidi: confinare le perdite alla zone iniziale, usando strumenti e materiali adatti. Per i liquidi infiammabili, porre argine agli scoli. Gas: seguire le raccomandazioni dei fornitori o richiedere unassistenza esterna. Mercurio: usare materiali adatti a confinare la perdita (vedi Appendice 2.2). Se possibile, espellere il mercurio dai bulbi e immetterlo in contenitori sigillati. Liquidi: applicare i materiali adatti per neutralizzare le sostanze chimiche (vedi Appendice 2.2). Mercurio: se necessario, usare kit adatti a contenere le perdite. Liquidi: riunire i materiali solidi, i cuscini, le barriere e ogni altro materiale simile. Sistemare i materiali usati in un contenitore a prova di perdite. Etichettare il contenitore con il nome del materiale pericoloso. Raccogliere i residui. Pulire con soluzioni detergenti, strofinando almeno tre volte le superfici della zona dove avvenuta la perdita. Sciacquare con acqua pulita. Raccogliere i materiali usati (occhiali, palette etc.) rimovendo le contaminazioni grossolane e sistemarli in contenitori separati per i lavaggi e le decontaminazioni. Gas: seguire le raccomandazioni dei fornitori o richiedere unassistenza esterna. Mercurio: pulire le perdite con un aspiratore, riunendo il mercurio dopo neutralizzazione e raccoglierlo in un contenitore destinato allo scopo. Usare spugne e detergenti per raccogliere e pulire, almeno tre volte, la superficie della perdita, per rimuovere la sostanza assorbente. Riunire tutto il materiale contaminato monouso e immetterlo in un contenitore per rifiuti pericolosi. Raccogliere i materiali riusabili e rimuovere le contaminazioni grossolane; sistemare in contenitori separati gli equipaggiamenti che dovranno essere lavati a fondo e decontaminati.
(segue)
Neutralizzare la perdita Pulire le zone
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Azioni Materiali monouso
Istruzioni per perdite pericolosi di liquidi, gas e mercurio Liquidi: il materiale neutralizzato va eliminato come rifiuto solido. Seguire le procedure della struttura per lo smaltimento dei rifiuti. Per i liquidi infiammabili, controllare con il responsabile della sicurezza per unappropriata identificazione dei rifiuti. Gas: i produttori o i fornitori istruiranno la struttura circa leliminazione dei rifiuti, se applicabile. Mercurio: etichettare appropriatamente i rifiuti e applicare letichetta a losanga del Dipartimento dei Trasporti. Seguire la documentazione appropriata al problema delle perdite e registrare le procedure. Investigare sui motivi dellaccaduto e, se necessario, analizzare le cause prime. Cogliere lopportunit per migliorare la sicurezza.
Notifica
DPI = dispositivi di protezione individuali
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Capitolo 3: Gestione dellutilizzo del sangue
Capitolo 3
Gestione dellutilizzo del sangue
Lobiettivo della gestione dellutilizzo del sangue assicurare lutilizzazione efficace di una risorsa limitata. Ci comprende i criteri e le prassi relativi alla gestione delle scorte e alla valutazione delluso del sangue. Bench i Centri di Raccolta regionali e i Servizi Trasfusionali affrontino la gestione dellutilizzo da prospettive differenti, essi condividono il fine comune di fornire emocomponenti appropriati e di alta qualit, con scarti ridotti al minimo. Questo capitolo esamina gli elementi di gestione delluso del sangue, sottolineando il ruolo delle Strutture Trasfusionali.
Determinazione dei livelli di scorta

Il livello ideale di scorta assicura unadeguata disponibilit di sangue per la routine e per le situazioni di emergenza e minimizza gli scarti per scadenza. Fare una stima al riguardo rappresenta un tentativo di prevedere luso futuro di emocomponenti, utilizzando dati storici di utilizzo. Il numero ottimale di unit da mantenere come scorta pu essere stimato impiegando formule matematiche, simulazioni al computer o con calcoli empirici. Di seguito, sono descritti tre metodi poco complicati per la stima della scorta minima. Una volta calcolato il livello minimo di scorta, andrebbe aggiunto un margine ulteriore per le emergenze, al fine di definire un livello ideale di scorta. Stima delluso settimanale medio Questo metodo fornisce una stima delluso settimanale medio di sangue per ogni gruppo ABO e tipo Rh: 1. raccogliere i dati relativi allutilizzo di sangue ed emocomponenti riguardanti un periodo di 26 settimane; 2. registrare luso di sangue per gruppo ABO e tipo Rh per ogni settimana; 3. ignorare i singoli picchi di utilizzo per ciascun tipo, al fine di correggere il dato in relazione a variazioni eccezionali alle medie settimanali (dovute, per esempio, ad elevati consumi per unemergenza); 4. sommare il numero delle unit utilizzate per gruppo ABO e tipo Rh, omettendo il valore di utilizzo settimanale pi alto riscontrato in ogni colonna;
Livelli di scorta ideali e minimi

I Servizi Trasfusionali dovrebbero stabilire sia i livelli di scorta minimi sia quelli ideali. Tali livelli dovrebbero essere valutati periodicamente e, se necessario, adattati a nuove esigenze. Indicatori importanti di prestazione sono, tra gli altri, la percentuale di prodotti scaduti, la frequenza di spedizioni di sangue in emergenza, i ritardi nella programmazione degli interventi di chirurgia elettiva. I livelli delle scorte dovrebbero essere anche rivalutati ogniqualvolta che si programmino o si osservino cambiamenti significativi; esempi di tali cambiamenti possono essere un aumento del numero dei posti letto, leffettuazione di nuove procedure chirurgiche, nuove procedure in oncologia, trapiantologia, neonatologia o cardiochirurgia.
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5. dividere ogni totale per 25 (numero delle settimane, tolta quella di maggiore utilizzo). Il risultato una stima delluso settimanale medio per ciascun gruppo ABO e tipo Rh. Stima delluso giornaliero medio Le strutture che trasfondono su base giornaliera possono calcolare luso quotidiano di sangue, impiegando il metodo seguente: 1. determinare luso totale nel corso di pi mesi; 2. dividere luso totale per il numero di giorni presi in considerazione; 3. determinare la percentuale di ciascun gruppo sanguigno usato in uno o pi mesi rappresentativi; 4. moltiplicare luso medio giornaliero di sangue per la percentuale di ogni tipo di sangue usato; 5. determinare il livello minimo di scorta, moltiplicando luso giornaliero per il numero di giorni che passano tra una fornitura di sangue e laltra (che pu essere 3, 5 o 7 in relazione al programma di consegna del fornitore di emocomponenti). Un Servizio Trasfusionale pu trovare il calcolo delluso medio giornaliero pi utile, quando le spedizioni di sangue vengono fatte una o pi volte al d. Metodo della movimentazione media Il metodo della movimentazione media pu essere utile per qualsiasi struttura, indipendentemente dai livelli di attivit: 1. determinare il periodo di registrazione preferito (ad esempio giorno o settimana); 2. sommare il numero di unit utilizzate in ciascun periodo per ottenere luso totale; 3. dividere il numero totale di unit per il numero dei periodi di registrazione; 4. cancellare i vecchi dati quando se ne aggiungono di nuovi. Questo metodo tende a minimizzare le variazioni fra un periodo e laltro.
Fattori che influenzano la scadenza

I dati di riferimento sulla scadenza di emocomponenti sono stati pubblicati dal National
Blood Data Resource Center (NBDRC)1. I dati pubblicati mostravano che circa 2.190.000 emocomponenti erano scaduti nel 2001, con una diminuzione del 6,6% rispetto al 1999. I concentrati piastrinici da sangue intero rappresentavano la met degli emocomponenti scaduti (49%, pari a 1.074.000 unit). I concentrati eritrocitari allogenici (dedicati e non dedicati) costituivano il 26,8% di tutti gli emocomponenti scaduti, pari a 588.000 unit. Le scadenze di ciascun tipo di emocomponente sono riportate in Tabella 3.1. Le scadenze continuano a essere un problema, soprattutto per quanto riguarda le unit autologhe e le piastrine. La percentuale di scadenza influenzata da molti fattori, oltre che dai livelli di scorta (per esempio: dimensione della struttura ospedaliera, entit dei servizi forniti, durata di vita degli emocomponenti, distanza del luogo di spedizione degli emocomponenti e frequenza di spedizioni, criteri di emissione degli ordini). In aggiunta alla definizione dei livelli minimi e ideali delle scorte, i livelli massimi di scorta possono aiutare il personale nello stabilire quando organizzare la restituzione o il trasferimento di prodotti non scaduti, al fine di evitarne la scadenza. Sia i Servizi Trasfusionali che i Centri di Raccolta dovrebbero introdurre sistemi di registrazione, che permettano al personale di accertare il numero di unit ordinate e il numero di unit ricevute o spedite. La responsabilit di emettere ordini pu essere centralizzata e gli ordinativi dovrebbero basarsi su linee di condotta definite in relazione ai livelli minimi e massimi. Ordinativi fissi possono semplificare la pianificazione delle scorte, sia nei Centri di Raccolta che nei Servizi Trasfusionali. I Centri di Raccolta possono inviare un numero predeterminato di unit seguendo un programma regolare o possono mantenere le scorte nel Servizio Trasfusionale a livelli prestabiliti, rimpiazzando le unit trasfuse. La gestione ottimale delle scorte richiede di distribuire e trasfondere prima le unit pi vecchie, e questo esige chiare linee guida scritte sulla conservazione e sulla scelta delle unit di sangue.
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Tabella 3.1 - Unit di emocomponenti prodotti, trasfusi e scaduti negli Stati Uniti nel 20011 Emocomponente Unit prodotte 14.259.000 619.000 169.000 4.164.000 1.456.000 4.437.000 1.068.000 Unit trasfuse 13.361.000 359.000 95.000 2.614.000 1.264.000 3.926.000 898.000 Unit scadute 576.000 263.000 12.000 1.074.00 160.000 77.000 28.000 % Unit scadute 4,0 42,5 7,1 25,8 11,0 1,7 2,6
Concentrati eritrocitari allogenici, non dedicati Concentrati eritrocitari autologhi Concentrati eritrocitari dedicati Concentrati piastrinici da sangue intero Concentrati piastrinici da aferesi Plasma fresco congelato Crioprecipitati antiemofilici
I tecnici di solito trovano pi facile scegliere, eseguire le prove di compatibilit pre-trasfusionali e consegnare le unit pi vecchie per prime se le scorte sono sistemate per data di scadenza. Le linee di indirizzo sulla scelta del sangue debbono essere flessibili, per consentire luso di unit pi fresche quando indicate (ad esempio, per i bambini). Di solito, comunque, le unit pi vecchie sono assegnate a pazienti, che, con ogni probabilit, saranno trasfusi.
Miglioramento delle procedure di richiesta sangue nei Servizi Trasfusionali

La durata di vita di ununit diminuisce ogni volta che essa viene riservata o compatibilizzata per un paziente che poi non la utilizza. Quando i medici richiedono pi sangue di quello necessario, questo viene reso indisponibile per altri pazienti e ci pu aumentare la percentuale di scadenza. Pu essere utile fornire linee guida sui test da eseguire, come criteri per il Type and Screen (T&S) e liste di richiesta massima di sangue per intervento chirurgico (MSBOS, Maximum Surgical Blood Order Schedule ) 2 , cos come monitorare il rapporto fra sangue compatibilizzato e sangue trasfuso (C:T). Un rapporto C:T maggiore di 2 indica, di norma, richieste eccessive.
In talune situazioni pu essere utile determinare i rapporti C:T per servizio, cos da identificare le aree a rapporto pi alto. Alcune strutture definiscono le procedure che normalmente non usano sangue in una linea guida sul T&S. Sia le linee guida sul T&S che lMSBOS utilizzano dati relativi alluso storico di sangue in chirurgia per raccomandare una richiesta di T&S o un numero massimo di unit che dovrebbero essere richieste pre-operatoriamente per le comuni procedure di chirurgia elettiva. Con lMSBOS i medici possono richiedere il numero di unit ritenuto appropriato per il paziente, dal momento che lMSBOS vuole essere una linea guida per un appropriato trattamento trasfusionale dei pazienti. Alcune istituzioni hanno modificato il concetto di MSBOS in un sistema di richieste di sangue standard (SBO, Standard Blood Order)3 per gli interventi chirurgici. Linee guida per le richieste, come quelle riportate in Tabella 3.2, provengono dalla revisione delluso del sangue in una data struttura, considerando un adeguato periodo di tempo. Si possono quindi trarre conclusioni sulla probabilit di trasfusione e sulla probabile quantit di sangue necessario per ogni tipo di intervento chirurgico. Il T&S uno SBO raccomandato per procedure che richiedono mediamente meno di 0,5 unit di sangue per paziente sottoposto a intervento chirurgico. Un SBO rappresenta spesso il numero
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Tabella 3.2 - Esempi di MSBOS Procedura Chirurgia generale Biopsia mammaria Resezione colon Laparotomia esplorativa Gastrectomia Laringectomia Mastectomia radicale Pancreotomia Splenectomia Tiroidectomia Chirurgia cardiaca e toracica Resezione di aneurisma Reintervento di by-pass coronarico By-pass coronarico primitivo Lobectomia Biopsia polmonare Chirurgia vascolare By-pass aortico con impianto Endoarteriectomia By-pass femoro-popliteso con impianto Chirurgia ortopedica Artroscopia Laminectomia Artrodesi spinale Protesi totale danca Protesi totale di ginocchio Chirurgia ostetrica-ginecologica Plastica addomino-perineale Taglio cesareo Dilatazione e raschiamento Isterectomia addominale/laparoscopica Isterectomia radicale Chirurgia urologica Resezione transuretrale di vescica Nefrectomia radicale Prostatectomia radicale perineale Prostatectomia transuretrale Trapianto di rene Unit* T&S 2 T&S 2 2 T&S 4 2 T&S 6 4 2 T&S T&S 4 T&S 2 T&S T&S 3 3 T&S T&S T&S T&S T&S 2 T&S 3 2 T&S 2
medio di unit trasfuse per ciascuna procedura chirurgica, mentre lMSBOS definisce generalmente il numero di unit utili a soddisfare le necessit trasfusionali dell80-90 % dei pazienti sottoposti a una specifica procedura chirurgicha3. Una linea guida propria di una struttura sanitaria deve rispecchiare la realt locale in merito alla pratica chirurgica e alle caratteristiche dei pazienti trattati; essa pu essere confrontata con linee guida gi pubblicate, per assicurarsi che la pratica locale non presenti scostamenti evidenti dagli standard di cura generalmente accettati (gli audit sullattivit trasfusionale sono discussi nel Capitolo 1). Una volta che T&S, MSBOS, SBO o altri programmi simili siano stati accettati, il livello delle scorte spesso pu essere ridotto. Le linee guida sulle richieste dovrebbero essere revisionate periodicamente, per mantenerle al passo con i cambiamenti di metodologie e pratiche; una variazione del rapporto C:T potrebbe essere il segno di una significativa variazione nella pratica clinica. T&S, MSBOS e SBO sono sistemi pensati per circostanze ben precise. Chirurghi e anestesisti possono individuare specifiche richieste e non tener conto degli schemi adottati per andare incontro a particolari necessit. Il Servizio Trasfusionale deve tenere in particolare considerazione pazienti con ricerca anticorpale positiva; lanticorpo dovrebbe essere identificato e, se potenzialmente clinicamente significativo, si dovrebbe identificare un adeguato numero di unit antigene-negative (per esempio due, se la richiesta originale era di eseguire un T&S). Le strutture che usano l immediate-spin o il computer crossmatch , possono fornire pi rapidamente unit compatibili, qualora richieste; tale potenzialit pu consentire a queste strutture di adattare di conseguenza i loro programmi T&S, MSBOS e SBO. Quante pi procedure chirurgiche possono gestite in sicurezza con il T&S, tante meno unit compatibilizzate possono essere necessarie. Richieste di routine e richieste urgenti Le Strutture Trasfusionali dovrebbero stabilire procedure in grado di definire i livelli ottimali delle
* Il numero di unit pu variare in base alla pratica chirurgica delle diverse strutture.
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scorte per ciascun tipo di sangue e i livelli critici ai quali sono indicati ordinativi in emergenza. Il personale del Servizio Trasfusionale dovrebbe avere norme formali che identificano: chi monitora i livelli di scorta; chi il responsabile di effettuare gli ordini; Quando e come procedere agli ordini (per telefono o per iscritto); come vengono documentati gli ordini; Dovrebbero essere immediatamente disponibili indirizzi e numeri telefonici dei fornitori qualificati di sangue e di eventuali corrieri o servizi di taxi. I Servizi Trasfusionali devono definire linee guida per gestire carenze di sangue o richieste in emergenza inaspettate. egualmente importante che siano specificate le azioni da intraprendere qualora non sia possibile esaudire immediatamente le richieste trasfusionali. I Servizi Trasfusionali dovrebbero produrre documenti che definiscano: quando si possono dare unit ABO compatibili invece di unit ABO identiche; quando si possono dare unit Rh positive a riceventi Rh negativi; quando unit compatibilizzate per una procedura chirurgica, possono essere liberate prima che sia trascorso il tempo standard definito; se unit possono essere compatibilizzate, nello stesso momento, per pi pazienti; quali risorse cono disponibili per trasferire le scorte; le modalit per informare i medici di carenze critiche di sangue; quando si dovrebbe prendere in considerazione la cancellazione di interventi di chirurgia elettiva; le modalit per informare personale e pazienti della cancellazioni di interventi chirurgici. Conteggio e ispezione delle scorte Le unit a disposizione possono essere contate una o pi volte al giorno, per determinare la necessit di emettere ordinativi. Le strutture computerizzate possono preferire di valutare le scorte in via elettronica. Prima della consegna o della spedizione le singole unit debbono essere
ispezionate visivamente, al fine di individuare segni di contaminazione o un aspetto anomalo. Le unit che non soddisfano i criteri ispettivi debbono essere messe in quarantena, per ulteriore valutazione. Si dovrebbe stabilire e seguire un modello organizzativo per il magazzino sangue. Le unit non ancora lavorate o lavorate in modo incompleto, le unit autologhe e quelle non idonee devono essere chiaramente separate (poste in quarantena) dalle scorte di routine4(p15). La maggior parte delle strutture organizza le proprie scorte di sangue secondo il loro stato (unit poste in quarantena, con controllo di gruppo non confermato, con controllo di gruppo confermato, disponibili, compatibilizzate etc.), per tipo di emocomponente, per gruppo ABO ed Rh, e, allinterno di queste categorie, per data di scadenza. necessario porre particolare attenzione nel collocare le unit nel luogo di conservazione, dato che un errore di collocazione potrebbe risultare critico, qualora venisse consegnata ununit posta in quarantena o ununit di gruppo O Rh positivo, posta erroneamente fra quelle O Rh negative, venisse consegnata senza un attento controllo in situazione di emergenza.
Problemi riguardanti prodotti speciali

Piastrine Pochi articoli prendono in considerazione la gestione delle scorte dei concentrati piastrinici. I livelli ottimali sono difficili da determinare, perch le richieste sono episodiche e la durata di vita dei concentrati piastrinici breve. Spesso la loro durata di vita effettiva di soli 3 giorni, in quanto, dei possibili 5 giorni di validit dal prelievo, il giorno 1 serve per i test di validazione e il giorno 2 per linvio ai Servizi Trasfusionali. Una pianificazione al riguardo viene ulteriormente complicata da richieste di prodotti particolari, come concentrati piastrinici leucoridotti, compatibilizzati, HLA-compatibili o citomegalovirus (CMV) siero-negativi.
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La gestione delle scorte di concentrati piastrinici richiede buona comunicazione e collaborazione fra i curanti, i Servizi Trasfusionali e i Centri di Raccolta. Avere informazioni sulle diagnosi dei pazienti e sui programmi trasfusionali attesi aiuta i Centri di Raccolta a pianificare quanti concentrati piastrinici preparare e quali donatori convocare per le piastrinoaferesi. I Servizi Trasfusionali con basso uso di piastrine ordinano usualmente i concentrati piastrinici solo quando ricevono una richiesta specifica. Se il personale di un Servizio Trasfusionale segue giornalmente le conte piastriniche e le specifiche esigenze trasfusionali di utilizzatori di concentrati piastrinici gi noti, spesso in grado di prevedere le necessit e di fare gli ordini in anticipo. I Servizi Trasfusionali con uso elevato, possono trovare utile mantenere delle scorte di concentrati piastrinici a magazzino. I Servizi Trasfusionali dovrebbero definire linee guida per la selezione e la trasfusione delle piastrine, con riferimento a gruppo ABO, tipo Rh, irradiazione, sierologia CMV, leucoriduzione. Per fare una valutazione del livello ideale delle scorte, si possono utilizzare le formule riportate allinizio di questo capitolo. Spesso lutilizzo di concentrati piastrinici aumenta il giorno che segue una festivit, in quanto potrebbero essere stati differiti gli interventi di chirurgia elettiva e le trasfusioni in campo oncologico. Una preventiva pianificazione finalizzata a rifornirsi di concentrati piastrinici aiuta a soddisfare la richiesta dei giorni post-festivi. Unit di plasma congelato Dal momento che gli emocomponenti plasmatici possono essere conservati congelati fino a 1 anno, questo tipo di scorta pi facile da gestire. I livelli ottimali di scorta si determinano valutando i dati statistici sulla popolazione dei pazienti e sulluso di questo emocomponente. Si possono quindi fissare obiettivi e piani di produzione. La maggior parte dei Centri di Raccolta trova maggiormente utile mantenere costanti livelli di produzione per tutto lanno, al fine di ottenere date di scadenza
uniformemente distribuite. Alcune strutture preferiscono congelare unit di plasma di gruppo AB e di gruppo A, in quanto compatibili con la maggior parte dei potenziali riceventi. Per aumentare le scorte in generale e per tener conto di necessit speciali, il plasma pu essere raccolto mediante aferesi. Il crioprecipitato antiemofilico un prodotto laborioso da preparare e le sue scorte non possono essere aumentate con facilit per soddisfare necessit improvvise consistenti. prudente mantenerne scorte vicine al livello massimo. Unit di sangue autologo e dedicato Qualora le unit di sangue autologo e dedicato costituiscano una frazione crescente delle scorte, la loro gestione diventa un problema significativo e controverso, sia per i riceventi dedicati che per le strutture. Unampia discussione sui metodi di raccolta e trasfusione di sangue autologo si pu trovare nel Capitolo 5. Le unit di sangue autologo e dedicato dovrebbero essere conservate in aree separate e ben definite delle frigoemoteche. Queste unit spesso vengono sistemate secondo lordine alfabetico dei cognomi dei destinatari. Le unit disponibili debbono essere chiaramente identificate e controllate, in modo da garantirne la consegna secondo una sequenza appropriata. Le unit autologhe dovrebbero sempre essere utilizzate per prime, seguite da quelle provenienti da donatori dedicati, e, infine, dalle unit di sangue allogenico provenienti dalle scorte generali. Sia dal Servizio Trasfusionale che dal Centro di Raccolta dovrebbero essere stabilite delle linee di comportamento, in merito al periodo di prenotazione esclusiva per le unit da donatore dedicato e al possibile rilascio per altri riceventi, e queste indicazioni dovrebbero essere rese note al personale di laboratorio, ai potenziali riceventi e ai loro medici curanti. Scorte speciali I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali si trovano a dover affrontare richieste relative ad emocomponenti con caratteristiche speciali, quali
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unit a basso rischio di infezione da CMV, piastrine HLA-compatibili, eritrociti compatibili per determinati antigeni, emocomponenti irradiati. Luso appropriato di questi emocomponenti viene discusso in un altro capitolo. In relazione alle modalit e al tempo di preparazione, le date di scadenze di questi prodotti possono essere ridotte. Se i livelli di richiesta e di scorta sono molto elevati, un Servizio Trasfusionale pu avere necessit di mantenere scorte separate di questi componenti speciali, in modo da poterli pi facilmente posizionare e controllare. Quando sono vicini alla scadenza, questi prodotti speciali possono essere inseriti nelle scorte generali, dato che possono essere dati in sicurezza ad altri pazienti.
Bibliografia 1. Comprehensive report on blood collection and transfusion in the United States in 2001. Bethesda, MD: National Blood Data Resource Center, 2003. Friedman BA, Oberman HA, Chadwick AR, et al. The maximum surgical blood order schedule and surgical blood use in the United States. Transfusion 1976;16:380-7. Devine P, Linden JV, Hoffstadter L, et al. Blood donor-, apheresis-, and transfusion-related activities: Results of the 1991 American Association of Blood Banks Institutional Membership Questionnaire. Transfusion 1993;33:779-82. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005:15
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Capitolo 4: Selezione dei donatori e raccolta di sangue
Capitolo 4
Selezione dei donatori e raccolta di sangue
I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali dipendono dai donatori volontari per poter procurare il sangue necessario ai pazienti. Per attirare i donatori volontari e incoraggiarli a continuare la loro attivit donazionale, essenziale che le condizioni che accompagnano la donazione siano il pi possibile piacevoli, sicure e comode. I donatori volontari sono sottoposti a domande riguardanti la loro anamnesi sanitaria al fine di proteggere sia i donatori che i riceventi e ad un breve esame clinico per aiutare il personale dei Centri Trasfusionali a stabilire se si tratta di soggetti idonei alla donazione. Il prelievo di sangue deve essere effettuato con attenzione, per ridurre al minimo qualunque potenziale reazione per il donatore o contaminazione batterica nellunita raccolta.
contaminazioni o esposizioni ad attivit o a strumenti non correlati alla raccolta del sangue. Registrazioni Le informazioni ottenute dal donatore durante la registrazione devono poter consentire la sua completa identificazione e collegarlo a precedenti registrazioni1(p13). Alcune strutture richiedono unidentificazione fotografica. A ogni donazione devono essere richieste e registrate informazioni aggiornate. Parti selezionate delle registrazioni devono essere conservate a tempo indeterminato e devono permettere di segnalare al donatore tutte quelle informazioni che necessario gli siano rese note 1(p69) . Queste informazioni dovrebbero comprendere quanto segue: 1. data e ora della donazione; 2. nome e cognome del donatore; 3. indirizzo dellabitazione e/ o del luogo di lavoro; 4. numero telefonico dellabitazione e/o di lavoro; 5. sesso; 6. et o data di nascita. Il donatore deve avere almeno 17 anni o let stabilita dalle norme di legge dello stato; 7. la registrazione delle cause di precedenti sospensioni, qualora sia richiesto. I soggetti che sono state sospesi o inseriti in una lista di sorveglianza devono essere identificati prima che qualsiasi unit loro prelevata sia distribuita. Idealmente, dovrebbe essere disponibile un registro dei donatori sospesi per poter identificare coloro che non sono idonei prima di effettuare la donazione. Se questo
Procedura di donazione
Larea destinata ai prelievi deve essere piacevole, accessibile e attiva in orari convenienti per i donatori. Deve essere ben illuminata, adeguatamente ventilata, ordinata e pulita. Il personale addetto ai prelievi dovrebbe essere cordiale, comprensivo, professionale e ben addestrato. Questa area deve prevedere spazi adeguatamente riservati per poter effettuare accurati esami clinici sui volontari atti a stabilire la loro idoneit come donatori di sangue e per eseguire i prelievi con un rischio minimo di
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registro non disponibile, deve esistere una procedura per esaminare le registrazioni delle donazioni precedenti e/o i registri delle sospensioni prima di togliere gli emocomponenti dalla quarantena. Anche le informazioni che seguono possono risultare utili: 1. mezzi supplementari di identificazione, quali il numero dellassicurazione sociale o della patente di guida, o eventuali altri nomi usati dal donatore in precedenti donazioni. Il documento emesso dalla Sicurezza Sociale permette specificamente di utilizzare il numero di assicurazione per questo scopo. Alcuni dati sono richiesti per il recupero di informazioni dai sistemi informatici. Lidentificazione di altri nomi usati dal donatore particolarmente importante per assicurarsi di aver aperto il file relativo al soggetto o che il suo stato di sospensione corretto; 2. nome o gruppo del paziente da riconoscere; 3. razza: sebbene questa informazione non sia richiesta, pu essere particolarmente utile nel caso in cui sia necessario disporre di sangue di uno specifico fenotipo per i pazienti che hanno anticorpi rari. necessario porre una particolare attenzione sul fatto che le minoranze razziali comprendano limportanza medica e scientifica di questa informazione e le sue applicazioni3,3; 4. caratteristiche particolari del donatore: alcune informazioni possono permettere alla Struttura Trasfusionale di fare un uso ottimale della donazione. Ad esempio, ai neonati viene spesso riservato il sangue di donatori negativi per il citomegalovirus o di gruppo O Rh negativo. I Centri di Raccolta possono stabilire che il sangue di volontari con tali caratteristiche venga prelevato di routine in sacche idonee alle trasfusioni pediatriche. Si possono identificare i donatori noti per anticorpi clinicamente significativi, in modo da ricavare dal loro sangue degli emocomponenti con quantit minime di plasma; 5. un registro per fornire speciali informazioni al donatore, prelievi di campioni di sangue per studi clinici, etc;
6. se una donazione dedicata a uno specifico ricevente, si devono ottenere informazioni su quando e dove il paziente sar ricoverato. Una specifica richiesta, redatta dal medico curante del paziente, deve essere inviata al personale del Centro Trasfusionale, che pu richiedere ulteriori informazioni sul ricevente, quali la data di nascita, il numero dellassicurazione sociale o altri dati per lidentificazione. Se il donatore un consanguineo del ricevente, si deve tener conto di questa informazione, in modo da irradiare i componenti cellulari1(p13). Informazioni da fornire al candidato donatore A tutti i donatori deve essere consegnato materiale didattico che li informi sui principali rischi della procedura, sui segni clinici obbiettivi e sui sintomi propri dellinfezione da HIV e dellAIDS, sui comportamenti a rischio che trasmettono la malattia e sullimportanza di astenersi dalla donazione se i volontari hanno tenuto tali comportamenti o hanno presentato la sintomatologia propria dellinfezione. Prima della donazione, i candidati donatori devono documentare di aver letto il materiale illustrativo e che stata data loro la possibilit di porre domande sullargomento. Le informazioni devono comprendere una lista di comportamenti che la FDA definisce come causa di incremento del rischio di esposizione al virus dell HIV. Deve essere fornita al candidato donatore una descrizione dei segni clinici obiettivi e dei sintomi collegati allinfezione da HIV, ad esempio5: 1. perdita inaspettata di peso; 2. sudorazioni notturne; 3. macchie blu o color porpora sulla (o sotto la) pelle o sulle mucose; 4. aumento del volume dei linfonodi da pi di 1 mese; 5. macchie bianche o ulcere in bocca; 6. temperatura corporea superiore ai 38 C per pi di 10 giorni; 7. tosse persistente e respiro affannoso; 8. diarrea persistente; Il candidato donatore dovrebbe essere informato anche sui test che vengono eseguiti sul suo sangue, sullesistenza di registri di donatori
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non idonei, sulle norme e sulle locali procedure operative standard (o SOP, Standard Operating Procedures) che richiedono la notificazione alle agenzie governative dello stato infettivo del volontario. La richiesta di notificare la positivit dei test pu differire da stato a stato, relativamente ai test per HIV, sifilide ed epatite. I candidati donatori devono anche essere informati che esistono circostanze routinarie, dove certi test sui marcatori di malattie non vengono effettuati1(15). Il volontario deve essere informato che gli saranno comunicati i risultati dei test anomali e che sar inserito in una lista dei donatori sospesi. Se necessario, il donatore deve essere informato che il suo sangue sar analizzato con particolari tecniche, quali la NAT. Deve essere inclusa anche linformazione che le analisi possono mancare di evidenziare uninfezione nella fase precoce di sieronegativit6. Lo stesso materiale informativo pu essere utilizzato per avvisare il donatore delle possibili reazioni e offrire suggerimenti per il comportamento post-prelievo. Il documento dovrebbe essere redatto in modo comprensibile per il donatore5. Sarebbe necessario provvedere per eventuali deficit visivi o uditivi del donatore e dovrebbero essere disponibili interpreti per tradurre il materiale per coloro che non hanno una buona conoscenza della lingua locale. Si dovrebbe sconsigliare limpiego di traduttori noti al donatore e, qualora sia necessario servirsi di interpreti, si dovrebbe ottenere, da parte del donatore, unautorizzazione scritta e riservata. In alcune localit, pu essere utile avere un opuscolo in pi lingue. utile inoltre fornire informazioni pi dettagliate a chi dona per la prima volta. Dovrebbero essere disponibili per tutti i candidati donatori informazioni sui luoghi o su altre modalit per eseguire test dellHIV. Selezione del donatore La procedura di selezione del donatore rappresenta uno dei momenti pi importanti per la sicurezza delle scorte di sangue. Lo scopo di identificare gli elementi dellanamnesi e i comportamenti o gli eventi che
pongono una persona a rischio di malattie trasmissibili o della propria salute. Ne consegue che, per rendere efficace la procedura di selezione, imperativo seguire linee guida e procedure appropriate. Lidoneit dei donatori deve essere determinata da un medico qualificato in materia. La responsabilit pu essere delegata, da parte della direzione medica, ad altro personale, dopo un adeguato addestramento. I criteri relativi alla selezione dei donatori sono stabiliti da normative, raccomandazioni e standard procedurali. Quando una particolare condizione del donatore non inclusa o contemplata da nessuna delle norme di cui sopra, soltanto un medico esperto dovrebbe definire la sua idoneit a donare. La selezione del donatore si basa sulla storia clinica e su un esame obbiettivo limitato , eseguiti nel giorno della donazione, per determinare se donare sangue pu arrecare danno al donatore o se la trasfusione dellunit pu essere dannosa per il ricevente1(p17). Le domande sulla storia clinica (comprese quelle riguardanti i comportamenti a rischio associati allinfezione da HIV) possono essere poste da un intervistatore qualificato oppure i donatori possono compilare da soli un questionario che deve essere rivisto con il donatore e siglato da un membro esperto e ben addestrato dello staff medico del servizio secondo le normative locali, statali e approvate dalla FDA sulle SOP5,8. Alcuni Centri Donatori hanno adottato un questionario computerizzato, approvato dalla FDA. Lintervista e lesame clinico devono essere condotti in modo da garantire la massima riservatezza, attenuare le apprensioni del candidato donatore e fornire tutto il tempo necessario per discussioni e chiarimenti. Il personale dovrebbe documentare in modo dettagliato sul modulo di donazione, le risposte dei donatori che abbiano richiesto ulteriori domande. Contestualmente devono essere registrate le osservazioni fatte nel corso della visita medica e i risultati dei test. I donatori devono comprendere le informazioni loro fornite, in modo che possano prendere una decisione informata sulla donazione del loro sangue.
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Una comunicazione efficace di vitale importanza per trasmettere informazioni importanti ed escludere i donatori non idonei dalle liste. Non meno importante laddestramento del personale dei Centri Trasfusionali. La selezione risulta efficace solo se il personale competente nel proprio lavoro e conosce a fondo le informazioni tecniche richieste per eseguirlo. Buone relazioni interpersonali e pubbliche sono essenziali per la competenza nel lavoro. Dato che lo staff di un Centro di Raccolta in contatto costante con i donatori, la presenza di personale esperto e comunicazioni efficaci contribuiscono ad una percezione positiva da parte del pubblico e al successo dei programmi di selezione dei donatori. Storia clinica del donatore Durante la registrazione della storia clinica dei candidati donatori, necessario formulare alcune domande molto specifiche per garantire il pi possibile la sicurezza del donatore e quella del sangue da trasfondere. Lintervistatore dovrebbe revisionare e valutare tutte le risposte per stabilire lidoneit alla donazione e documentare questa decisione. Per garantire che siano state poste tutte le domande necessarie e che ai donatori sia rivolto un messaggio conforme, si raccomanda di utilizzare il pi recente questionario AABB, approvato dalla FDA. La versione approvata pi recente rintracciabile sul sito web dellAABB (vedi le Appendici da 4.1 a 4.3, in vigore al momento della pubblicazione di questo manuale). La parte della storia clinica relativa alle terapie e allassunzione di farmaci da parte del donatore richiede spesso ulteriori approfondimenti. Farmaci di nuova prescrizione e medicine da banco (che non richiedono ricetta) entrano sul mercato quotidianamente, cos che i donatori possono riferire luso di medicamenti non elencati specificamente nel manuale SOP della struttura. Bench vi sia consenso unanime su quei farmaci che sono sempre, oppure mai, causa di sospensione, molti di essei ricadono in categorie sulle quali vi disaccordo. In questi casi, di solito, i motivi dellassunzione del farmaco (piuttosto che le caratteristiche del farmaco stesso) sono causa
di sospensione. LAppendice 4.4 elenca i farmaci che molti centri considerano accettabili, senza unapprovazione specifica da parte del medico del Centro Trasfusionale. I candidati donatori che hanno assunto isotretinoina (Roaccutan in Italia, Accutane negli USA) o finasteride (Proscar o Propecia) nei 30 giorni precedenti la donazione, dutasteride (Avodart) nei 6 mesi precedenti, acitretina (Soriatane) nei 3 anni precedenti, devono essere sospesi dalle donazioni; chi ha assunto etetrinate (Tegison) viene escluso definitivamente. LUfficio delle Forze Armate per il Programma Sangue ha reso pubblica la sua lista sulle sospensioni dalle donazioni per l assunzione di farmaci9. La sospensione temporanea o lesclusione definitiva di un potenziale donatore spesso provoca in queste persone un senso di frustrazione sia nei propri riguardi che nelle procedure relative alla donazione di sangue. Ai donatori sospesi devono essere fornite spiegazioni dettagliate sulle ragioni delle sospensioni e se e quando possono ritornare a donare. Pu essere utile documentare queste notifiche. Esclusione confidenziale di ununit Ai donatori pu essere data lopportunit di indicare, in modo confidenziale, se il loro sangue , o non , idoneo ad essere trasfuso. Dovrebbe essere adottata una procedura che consenta al donatore di evitare di ammettere, faccia a faccia, comportamenti a rischio. Si deve comunicare al donatore che pu contattare telefonicamente il Centro di Raccolta per richiedere che lunit raccolta non sia utilizzata. Dovrebbe inoltre esistere una procedura che permetta il recupero dellunit senza che venga resa nota lidentit del donatore (usare, per esempio, il numero della donazione). Se il donatore ha comunicato che il sangue donato non deve essere utilizzato ai fini trasfusionali, dovrebbe essere informato che il sangue sar sottoposto ad analisi e che gli verr notificato leventuale risultato positivo. necessario fornire consulenze diagnostiche e
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mediche per ogni test positivo per HIV o per qualsiasi altro risultato positivo di test significativi dal punto di vista medico. Visita medica Si debbono valutare, per ogni donatore, le variabili elencate di seguito. Il medico del centro deve approvare eventuali eccezioni ai riscontri di norma ritenuti validi. Per categorie speciali di donatori, il direttore medico pu adottare metodi e procedure che facciano da guida nelle decisioni. Per altri donatori possono essere necessarie valutazioni individuali: 1. aspetto generale: se il donatore appare malato o eccessivamente nervoso, meglio rimandare la donazione; 2. peso: per ogni singola donazione, non possono essere prelevati pi di 10,5 mL di sangue intero per kg di peso corporeo1(p61). Questa quantit deve comprendere anche i campioni per gli esami. Se necessario prelevare una quantit minore rispetto a quella appropriata per il contenitore, il volume di anticoagulante deve essere regolato di conseguenza. Per determinare la quantit di anticoagulante da rimuovere dal contenitore si pu usare la formula riportata in Tabella 4.1. Il volume di sangue raccolto deve essere misurato attentamente e con precisione; 3. temperatura corporea: non deve superare i 37,5 C, misurata in bocca o un valore equivalente, se misurata con altri metodi. Temperature pi basse della norma non hanno di solito alcun significato in soggetti sani; dovrebbero essere, tuttavia, misurate di nuovo per conferma;
4. pulsazioni: le pulsazioni dovrebbero essere valutate per almeno 15 secondi. Non dovrebbero essere irregolari e la loro frequenza dovrebbe essere compresa fra 50 e 100 battiti al minuto. Se il candidato donatore un atleta noto, si possono riscontrare pulsazioni al di sotto di 50 battiti al minuto e dovrebbe essere accettato. Il medico del Centro Donatori dovrebbe valutare le marcate anormalit delle pulsazioni e disporre laccettazione del candidato, la sospensione o ulteriori accertamenti per laccettazione, la sospensione o la proroga per ulteriori valutazioni; 5. pressione arteriosa: la sistolica non deve essere superiore ai 180 mmHg e la diastolica non superiore ai 100 mmHg. I candidati donatori, la cui pressione al di sopra di questi valori, non dovrebbero essere prelevati senza una valutazione individuale da parte di un medico qualificato; 6. emoglobina o ematocrito: prima di ogni donazione necessario determinare i valori di emoglobina o di ematocrito su un campione. prelevato al momento della donazione Sebbene questi test siano eseguiti per evitare di effettuare prelievi di sangue in soggetti anemici, non assicurano che il donatore sia in possesso di adeguate riserve marziali. La Tabella 4.2 illustra i valori minimi di emoglobina per accettare un donatore di sangue allogenico. Soggetti con valori di emoglobina o di ematocrito insolitamente superiori ai valori di norma debbono essere valutati da un medico in quanto possono essere essere il segnale di alterazioni polmonari, ematologiche o di altra natura. I metodi per valutare la
Tabella 4.1 - Calcolo sulla quantit di sangue da prelevare a donatori che pesano meno di 50 kg A. Volume di sangue da prelevare* = Peso del donatore in kg/50 x 450 mL B. Quantit di anticoagulante necessario** = A/100 x 14 C. Quantit di anticoagulante da rimuovere dalla sacca di raccolta = 63 mL B
* Approssimativamente, il 12% della volemia ** Soluzioni CPD o CPDA, il cui rapporto ottimale anticoagulante/sangue 1,4:10
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Tabella 4.2 - Livelli minimi di emoglobina, ematocrito e di densit eritrocitaria per accettare un donatore di sangue allogenico Test Emoglobina Ematocrito Solfato di rame Valore minimo accettabile 12,5 g/dL 38% 1,053 di gravit specifica nella raccolta dellanamnesi o negli esami post-donazione11. Le anomalie riscontrate prima della donazione possono essere illustrate verbalmente da personale qualificato. I risultati dei test eseguiti dopo la donazione che precludano ulteriori donazioni devono essere comunicati di persona, per telefono o per lettera. Dovrebbe essere richiesto ai donatori di segnalare ogni stato morboso che si verifica entro pochi giorni dalla donazione e, in particolare, di riferire la positivit ai test per HIV o il riscontro di unepatite o di AIDS, che si sviluppano entro 12 mesi dalla donazione. Consenso alla donazione Viene espressamente richiesto al candidato donatore di sottoscrivere un modulo di consenso, che autorizzi il personale della Struttura Trasfusionale a prelevare ed utilizzare il suo sangue 1(p15). Il modulo di consenso fa parte integrante delle registrazioni riguardanti il donatore e deve essere compilato e completato prima della donazione. La procedura di raccolta deve essere spiegata con termini comprensibili per il donatore il quale deve avere la possibilit di porre domande. La registrazione firmata dal donatore o il modulo di consenso dovrebbero inoltre dimostrare che il donatore ha letto e compreso le informazioni riguardanti le malattie trasmissibili con la trasfusione e ha fornito risposte accurate e veritiere alle domande poste al momento della raccolta dellanamnesi. Si consiglia di utilizzare una dichiarazione simile alla seguente: Ho letto e compreso le informazioni che mi sono state fornite circa la diffusione del virus dellAIDS (HIV) con il sangue e il plasma. Se sono un individuo
concentrazione di emoglobina comprendono: 1) la determinazione per gravit (peso specifico) con solfato di rame (vedi Metodo 6.1); 2) la determinazione spettrofotometrica dellemoglobina o la determinazione dellematocrito; 3) altri metodi alternativi accettabili per evitare risultati erronei, che possono portare a scartare un donatore. La puntura di un lobo auricolare non accettabile come campione di sangue1(p61),10; 7. lesioni cutanee: la sede della venipuntura non deve presentare lesioni. Si devono esaminare entrambi gli arti superiori per escludere segni di ripetute somministrazioni parenterali, in particolare segni di sclerosi delle vene come nel caso di chi fa uso di droghe. Questo riscontro motivo di esclusione permanente del candidato donatore. Lesioni cutanee di media entit, quale un rash cutaneo da veleno di edera non dovrebbero rappresentare motivo di sospensione, a meno che la lesione non sia particolarmente estesa e/o sia presente nella zona anticubitale. Devono essere sospesi i soggetti con bolle, ferite purulente o gravi infezioni cutanee in qualsiasi parte del corpo cos come ogni altro soggetto con noduli rosso-porpora o emorragici o con placche indurative che possono far sospettare un sarcoma di Kaposi. Le registrazioni della visita medica e della storia clinica del donatore devono permettere lidentificazione dellesaminatore e riportare la sua firma o la sua sigla. Qualsiasi motivo di sospensione deve essere registrato e spiegato al donatore. Deve essere predisposta una modalit per notificare al donatore anomalie clinicamente significative, riscontrate nella visita medica,
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potenzialmente a rischio di diffondere il virus dellAIDS, concordo nel non donare sangue o plasma da trasfondere ad altra persona o per ulteriori lavorazioni. Ho compreso che il mio sangue sar sottoposto a test per HIV e per i marcatori di altre malattie; tuttavia si possono verificare circostanze imprevedibili, per le quali questi test non possono essere eseguiti. Se i test indicano che non dovrei pi donare sangue o plasma per il rischio di trasmettere una malattia infettiva, il mio nome sar inserito in un elenco di donatori esclusi permanentemente dalle donazioni. Ho compreso che sar informato di un eventuale risultato positivo. Se invece, i risultati dei test non saranno chiaramente o negativi o positivi, il mio sangue non sar utilizzato e il mio nome sar inserito in una lista di donatori sospesi. Se le unit sono occasionalmente utilizzate per scopi diversi da quelli di una trasfusione (ad esempio per ricerca), questa circostanza deve apparire sul modulo di consenso informato. Speciali categorie di donatori Possono essere contemplate eccezioni ai normali requisiti di idoneit per categorie speciali di donatori: 1. donatori di sangue autologo: le indicazioni per la raccolta e le variazioni rispetto alle normali procedure riguardanti i donatori sono discusse nel Capitolo 5; 2. donatori di emocomponenti in aferesi: i requisiti speciali e le raccomandazioni per donatori di cito e plasmaferesi sono riportati nel Capitolo 6; 3. donazioni per ricevimenti specifici: in alcune circostanze pu essere importante utilizzare sangue o emocomponenti prelevati ad uno specifico donatore per un particolare paziente. Si tratta, ad esempio, di pazienti con anticorpi diretti verso antigeni ad alta frequenza o con miscele di anticorpi che rendono difficile trovare sangue compatibile, di neonati con trombocitopenia neonatale alloimmune, da trasfondere con le piastrine materne, di pazienti in attesa di trapianto di rene da donatore vivente, di pazienti politrasfusi,per i quali i familiari possono fornire sangue ed
emocomponenti. permesso il ripetuto utilizzo di un singolo donatore per fornire emocomponenti a un singolo paziente, purch la richiesta sia redatta dal medico curante e approvata dal medico responsabile della Struttura Trasfusionale. In tal caso il donatore deve possedere tutti i requisiti richiesti per la donazione ad eccezione della frequenza, che pu spesso essere di 3 giorni, fino a che il livello di emoglobina pre-donazione si mantiene uguale o superiore a quello minimo richiesto per la donazione di sangue allogenico. Il sangue deve essere lavorato secondo gli standard previsti per i Centri di Raccolta e i ServiziTrasfusionali, editi dallAABB1(pp24-32). Si dovranno applicare alla sacca contenente sangue o emocomponenti etichette speciali che identificano il numero del donatore e il ricevente al quale la sacca destinata e queste unit dovranno essere separate dalle normali giacenze. Nel manuale delle SOP deve essere incluso un protocollo che illustri la gestione di tali unit; 4. donatori dedicati: le problematiche sollevate dallopinione pubblica riguardo la sicurezza della trasfusione hanno indotto i potenziali riceventi a chiedere di poter scegliere i donatori del sangue che sar loro trasfuso. Numerosi Stati hanno stabilito che questa una procedura accettabile, che deve essere offerta,in situazioni di non-emergenza, se proveniente dal ricevente potenziale o prescritta da un medico. Nonostante i problemi organizzativi ed etici, correlati alle donazioni dedicate, la maggioranza dei Centri Trasfusionali e degli ospedali fornisce questo servizio. La selezione e le analisi sui donatori dedicati dovrebbero essere le stesse relative agli altri donatori di sangue allogenico, sebbene possano essere fatte eccezioni sullintervallo di 56 giorni (o di 112 giorni, in caso di raccolta in aferesi di due unit globuli rossi), fra una donazione e la successiva. Le norme federali stabiliscono che un individuo pu donare sangue intero pi di una volta in 8 settimane, soltanto se al momento della donazione, viene sottoposto a visita medica
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e giudicato in buona salute12. Al fine di evitare errate interpretazioni, importante definire SOP che stabiliscano gli intervalli fra le raccolta di sangue e la sua disponibilit disponibilit per il ricevente, la norma per la determinazione del gruppo ABO prima del prelievo e la condotta da adottare per distribuire eventualmente le unit ad altri pazienti.
Raccolta di sangue
Il sangue deve essere raccolto soltanto da personale addestrato e con il diretto controllo di un medico esperto e qualificato. Il prelievo deve essere eseguito con metodica asettica utilizzando un sistema chiuso e sterile. Se si rende necessaria pi di una venipuntura si deve usare ogni volta un nuovo contenitore e un nuovo set da prelievo, a meno che le SOP non consentano luso di un dispositivo approvato FDA, a cui attaccare un nuovo ago, mantenendo la sterilit. Il personale addetto al prelievo deve firmare o siglare il modulo di donazione, anche nel caso in cui non si verifica la raccolta di unintera unit. Contenitori Il sangue deve essere raccolto in un contenitore approvato FDA, sterile, apirogeno e contenente una quantit di anticoagulante sufficiente per la quantit di sangue da prelevare. Letichetta sulla sacca deve riportare tipo e quantit dellanticoagulante e, approssimativamente, la quantit di sangue raccolto. Le sacche per la raccolta del sangue devono essere forniti in confezioni contenenti pi sacche. Dovrebbero essere seguite le direttive del produttore riguardo la durata del tempo in cui le sacche non utilizzate possono essere conservate in confezioni aperte. Identificazione Lidentificazione essenziale in ogni momento,dalla registrazione del donatore alla destinazione finale di ciascun emocomponente. Si devono utilizzare sistemi numerici o alfanumerici che identifichino e consentano un collegamento tra il donatore, le registrazioni dei
suoi dati, i campioni usati per le analisi, il contenitore e tutti gli emocomponenti preparati dallunit. necessaria la massima attenzione per evitare possibili confusione o duplicazioni di numeri. necessario controllare prima delluso tutte le registrazioni e le etichette per identificare errori di stampa. Se si riscontrano numeri duplicati, devono essere cancellati e si pu indagare per accertare le cause delle duplicazioni (per esempio, un errore del fornitore). Si deve tenere una registrazione di tutti i numeri annullati. Prima di iniziare una raccolta di sangue, il personale addetto al prelievo dovrebbe: 1. identificare con il donatore la sua documentazione (quanto meno per il cognome) e chiedere al donatore stesso di dichiarare il suo nome; 2. apporre le etichette numerate sul modulo del donatore e assicurarsi che la numerazione sia identica a quelle sulla sacca di raccolta, sulle sacche satelliti, sulle provette degli esami; attaccare i numeri nel momento in cui il donatore sulla poltrona, piuttosto che durante la visita, pu essere utile per ridurre le probabilit di errori di identificazione; 3. assicurarsi che le provette siano numerate correttamente e che accompagnino il contenitore durante la raccolta del sangue; le provette possono essere attaccate,nel modo pi utile alla sacca primaria o a quelle satelliti; 4. ricontrollare tutti i numeri. Preparazione della sede di venipuntura Il sangue dovrebbe essere prelevato da una vena integra e di buon calibro, in una zona (in genere lo spazio anticubitale) indenne da lesioni cutanee. Entrambe le braccia devono essere ispezionate per evidenziare luso di droghe, malattie della pelle o graffi. Un laccio o il bracciale dellapparecchio per la misurazione della pressione, gonfiato fino a valori compresi fra 40 e 60 mmHg, rendono le vene pi evidenti. utile che il volontario apra e chiuda pi volte la mano. Scelta la vena, lapparecchio della pressione pu essere sgonfiato, prima di preparare la cute per la venipuntura.
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Non possibile rendere la sede della venipuntura totalmente asettica, ma si pu ottenere una pulizia quasi chirurgica per garantire la quasi totale sicurezza di ununit non contaminata. A tale scopo, esistono varie metodiche accettabili (vedi Metodo 6.2). Dopo la preparazione la cute non deve essere pi toccata per testare di nuovo la vena. Se si toccata la cute pulita, va ripetuta lintera preparazione della sede di venipuntura. Flebotomia e raccolta dei campioni per esami La tecnica per il prelievo di ununita di sangue e per la raccolta dei campioni illustrata nei Metodi 6.3. Lunit deve essere raccolta con una singola venipuntura dopo che lapparecchio della pressione stato gonfiato. Durante la raccolta, il sangue deve essere miscelato con lanticoagulante. La quantit di sangue prelevato deve essere accuratamente monitorata, cos che il totale non superi, a ogni donazione, i 10,5 mL per kg di peso corporeo del donatore, compresi i campioni per gli esami 1(p61). Al termine della raccolta i tubi e i segmenti devono essere riempiti. Lago e qualsiasi rifiuto contaminato da sangue devono essere eliminati in totale sicurezza, in accordo con quanto stabilito dalle linee guida universali di protezione. Lago non deve essere incappucciato nuovamente, a meno che non si utilizzi un dispositivo sicuro, e deve essere sistemato in contenitori per rifiuti a prova di punture. Dopo la raccolta necessario verificare che i criteri che identificano lunit, la storia del donatore e i campioni, siano gli stessi. Devono essere disponibili i guanti da usarsi durante i prelievi ed essere indossati da chi esegue il prelievo di ununit di sangue autologo e da chi in fase di addestramento. Assistenza al donatore dopo il prelievo Dopo aver rimosso lago dalla vena, il personale addetto al prelievo dovrebbe: 1. esercitare una pressione sul punto di ingresso dellago in vena premendo con una garza sterile (si pu chiedere al donatore di continuare a premere la garza per alcuni
minuti). Controllare il braccio e applicare un bendaggio soltanto quando cessa il sanguinamento; 2. tenere il donatore sul lettino o sulla poltrona di prelievo per alcuni minuti sotto stretta sorveglianza da parte del personale; 3. permettere al donatore di alzarsi soltanto dopo che le sue condizioni appaiono soddisfacenti. Si dovr osservare il donatore in posizione eretta, prima di avviarlo alla zona di riposo e di ristoro. Il personale dovrebbe monitorare i donatori in questa zona. La durata dei tempo di osservazione e il tipo di forniture per il ristoro dovrebbero essere specificati nel manuale delle SOP; 4. dare istruzioni al donatore circa lassistenza dopo il prelievo. Il direttore medico pu richiedere di includere nel manuale alcune o tutte le raccomandazioni riportate di seguito: a. mangiare e bere qualcosa prima di lasciare il Centro Donatori; b. non allontanarsi prima di aver ottenuto lautorizzazione del personale del centro; c. aumentare lassunzione di liquidi rispetto al solito nelle 4 ore successive; d. evitare lassunzione di alcool a stomaco vuoto; e. non fumare per almeno 30 minuti; f. se c un sanguinamento dal punto del prelievo, alzare il braccio e premere sul punto di prelievo; g. se interviene un senso di svenimento o di vertigine, o stare distesi o seduti con la testa fra le ginocchia; h. se i sintomi persistono, telefonare o ritornare al Centro Donatori o consultare un medico; i. se non compare alcun sintomo riprendere le normali attivit. I donatori con occupazioni particolari (per esempio, lavoratori edili, operatori di macchinari complessi) o persone che lavorano al caldo dovrebbero osservare una speciale cautela, in quanto potrebbero insorgere vertigini o svenimenti, dopo aver donato il sangue, al momento della ripresa del lavoro;
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j. togliere il bendaggio dopo qualche ora; k. bere pi liquidi per qualche giorno allo scopo di ripristinare la volemia; 5. ringraziare il donatore per limportante contributo e incoraggiarlo a ritornare a donare, dopo lintervallo previsto. Tutto il personale in servizio nellarea riservata ai prelievi dei donatori sia volontari che remunerati, dovrebbe mantenere un atteggiamento cordiale ed essere in grado di osservare i sintomi di reazione post-donazione, quali perdita di concentrazione, pallore, respiro accelerato, sudorazione eccessiva. Il personale addetto ai donatori dovrebbe essere addestrato e competente nellinterpretare le istruzioni ricevute, rispondere alle domande, e assumersi la responsabilit a congedare il donatore in buone condizioni; 6. annotare sulla cartella del donatore ogni reazione avversa. Segnalare inoltre se il donatore lascia larea di prelievo prima di aver ricevuto lautorizzazione. Reazioni avverse nei donatori La maggioranza dei donatori tollera perfettamente la donazione di sangue, ma, occasionalmente, possono verificarsi reazioni avverse. Il personale addetto allarea donatori deve essere addestrato a riconoscere queste reazioni e a trattarle, deve essere addestrato alla rianimazione cardio-polmonare (RCP) e devono essere disponibili apparecchiature speciali per far fronte ad eventuali emergenze. La sincope (svenimento o sindrome vaso-vagale) pu essere causata dalla vista del sangue, dal vedere altri donare sangue, da uno stato di eccitazione individuale o collettivo, ma pu verificarsi anche senza un motivo. Qualora sia causata da fattori psicologici o da una risposta neurofisiologica alla donazione la sintomatologia pu essere caratterizzata da pallore, sudorazione, perdita di coscienza, convulsioni, perdita di feci e urina. La pelle in alcuni casi fredda e la pressione sanguigna si abbassa. Talora, il livello della pressione sistolica arriva sotto i 50 mmHg, cos da non potersi rilevare allo stetoscopio. Il polso rallenta sensibilmente. Questo pu essere utile per distinguere una sindrome vaso-vagale da uno
shock cardiogeno o ipovolemico nel cui caso il polso accelera. Questa distinzione, bench tipica, non assoluta. La respirazione accelerata o liperventilazione possono determinare nel donatore ansioso ed eccitato, uneccessivo accumulo di anidride carbonica. Questo pu determinare una sensazione generalizzata di soffocamento o uno stato dansia o problemi localizzati di formicolio o mioclonie. Il medico del Centro Donatori deve fornire istruzioni scritte per la gestione delle reazioni nei donatori, compresa una procedura per attivare un soccorso medico in emergenza. Esempi di tali istruzioni possono essere come quelle elencate di seguito: 1. generali: a. se la reazione sfavorevole interviene durante il prelievo, sciogliere il laccio e togliere lago dal braccio del donatore; b. se possibile, allontanare il donatore dal luogo dove si verificata la reazione avversa e sistemarlo in un posto appartato dove pu essere monitorato; c. adottare le misure indicate di seguito e, se non si ottiene alcun risultato, chiamare il medico del centro o il medico designato a questo scopo; 2. svenimento: a. applicare compresse fredde sulla fronte del donatore o sul retro del collo; b. sistemare il donatore sulla schiena, con le gambe sollevate sopra il livello del capo; c. allentare gli indumenti che provocano costrizione; d. assicurare la perviet delle vie respiratorie; e. monitorare periodicamente pressione arteriosa, polso e respirazione, sino al completo recupero del donatore. Nota: nel caso di donatori che lamentano unipotensione prolungata pu essere utile linfusione endovenosa di soluzione fisiologica. La decisone di adottare questa terapia spetta al medico del centro, sulla base della valutazione di ogni singolo caso o seguendo le istruzione riportate nel manuale delle SOP
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della struttura. 3. nausea e vomito: a. offrire al donatore la situazione pi confortevole possibile; b. raccomandare al donatore che ha nausea di respirare lentamente e profondamente; c. applicare compresse fredde sulla fronte e/o sul retro del collo; d. girare la testa del donatore da un lato; e. procurare un contenitore per il vomito e tenere a disposizione dei teli di pulizia o un un asciugamano bagnato. Assicurarsi che la testa del donatore sia posizionata di lato per il pericolo di aspirare il vomito; f. dopo che ha terminato di vomitare fornire al donatore dellacqua per pulire la bocca; 4. mioclonie e spasmi muscolari. I donatori eccessivamente agitati possono iperventilare e per questo lamentare deboli mioclonie o spasmi tetanici alle mani o al volto. Il personale della zona di prelievo dovrebbe controllare attentamente la comparsa di questi sintomi durante o immediatamente dopo il prelievo: a. distogliere lattenzione del donatore iniziando una conversazione per interrompere liperventilazione; b. dire al donatore di tossire se sintomatico. Non dare ossigeno. 5. comparsa di ematomi durante o dopo il prelievo: a. sciogliere il laccio e togliere lago dal braccio del donatore; b. applicare 3 o 4 quadrati di garza sterile sulla sede della venipuntura ed esercitare, una forte pressione per 7-10 minuti tenendoil braccio del donatore in alto, sopra il livello del cuore. In alternativa, applicare un bendaggio stretto da rimuovere dopo 7-10 minuti per permettere di ispezionare lematoma; c. se si desidera, applicare ghiaccio sulla zona di prelievo; d. se si sospetta di aver punto unarteria, rimuovere immediatamente lago e applicare una forte pressione per 10 minuti. Successivamente, applicare un bendaggio stretto per esercitare una forte
pressione. Verificare la presenza di pulsazione radiale. Se il polso radiale assente o debole, chiamare il medico del centro; 6. convulsioni: a. chiamare immediatamente aiuto. Prevenire danni al donatore. Nel corso di crisi convulsive severe molte persone presentano grande forza muscolare, difficile da dominare. Mantenere, se possibile, il donatore sul lettino o sulla poltrona da prelievo. Se ci non possibile, sdraiarlo per terra. Tentare di impedire danni al donatore e/o al personale; b. assicurarsi che il donatore abbia unadeguata ventilazione. Un tampone imbottito potrebbe servire a separare le mascelle, una volta che le convulsioni siano cessate; 7. sintomi cardiaci gravi: a. chiamare immediatamente un soccorso medico e/o lintervento dellunit di terapia durgenza; b. se il donatore in arresto cardiaco, iniziare immediatamente la rianimazione cardio-polmonare e proseguirla sino allarrivo dellunit di terapia durgenza. La natura e il tipo di trattamento delle reazioni avverse devono essere registrate nella cartella del donatore o nellapposito modulo per la notifica degli incidenti. utile anche segnalare se il donatore pu essere accettato per ulteriori donazioni. Il direttore medico dovrebbe decidere quali presidi di emergenza e quali farmaci devono essere presenti nelle area di prelievo dei donatori. La distanza fra queste aree e la pi vicina stanza o unit di emergenza condiziona pesantemente la presenza di presidi e farmaci. La maggior parte delle strutture ha a disposizione alcuni o tutti di quanto segue: 1. bacinelle per il vomito o contenitori equivalenti; 2. asciugamani; 3. dispositivi oro-faringei di plastica o di gomma solida per mantenere la perviet delle vie aeree;
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4. ossigeno e maschere; 5. farmaci di emergenza. Raramente necessario ricorrere ai farmaci per il trattamento delle reazioni avverse nei donatori. Se il medico del centro desidera avere a disposizione qualche farmaco, il tipo e la quantit devono essere specificati per iscritto. Inoltre, il direttore medico deve elaborare procedure scritte che stabiliscano quando e da chi ciascuno dei presidi o dei farmaci sopra citati possano essere utilizzati.
http://www.tricare.osd.mil/asbpo/library/policies/ downloads/medication_list.doc]. 10. Newman B. Blood donor suitability and allogeneic whole blood donation. Transfus Med Rev 2001;15:234-44. 11. Food and Drug Administration. General requirements for blood, blood components, and blood derivatives; donor notification. Title 21 CFR 630.6. Fed Regist 2001;66:31165-77. 12. Code of federal regulations. Title 21 CFR 640.3(f). Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually).
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Appendice 4.1 - Questionario completo sulla storia clinica del donatore*

S No 1. Si sente bene ed in buona salute oggi? 2. Attualmente, assume antibiotici? 3. Fa uso di altri farmaci a causa di uninfezione? Legga cortesemente la lista dei farmaci che contemplano la sospensione dalle donazioni. 4. Sta assumendo o ha assunto in passato qualche farmaco contenuto nella lista? 5. Ha letto il materiale illustrativo e ottenuto risposta alle sue domande? Nelle ultime 48 ore 6. Ha preso aspirina o qualche farmaco che la contenga? Nellultima settimana 7. Ha lamentato mal di testa e febbre contemporaneamente? Nelle ultime 6 settimane 8. (Se donatrici): Ha avuto gravidanze o attualmente gravidanza? (i donatori spuntino sono maschio) Nelle ultime 8 settimane 9. Ha donato sangue, piastrine o plasma? 10. E stato vaccinato o le sono state praticate iniezioni di farmaci? 11. Ha avuto contatti con qualcuno vaccinato per vaiolo? Nelle ultime 16 settimane 12. Ha donato una doppia unit di eritrociti in aferesi? Negli ultimi 12 mesi avete 13. Ha subito una trasfusione di sangue? 14. E stato sottoposto a un trapianto di tessuto, dorgano o di midollo osseo? 15. Ha avuto un innesto di osso o di cute? 16. Ha avuto contatto con sangue di altre persone? 17. Ha subito una puntura accidentale di un ago? 18. Ha avuto contati sessuali con qualcuno che ha lAIDS o che stato positivo per i test di identificazione del virus HIV? 19. Ha avuto contatti sessuali con prostitute o con chi fa sesso in cambio di denaro o di droga? 20. Ha avuto contatti sessuali con chi fa uso di aghi per iniettarsi droghe, steroidi o altri farmaci non prescritti dal proprio medico? 21. Ha avuto contatti sessuali con emofilici o con chi usa concentrati procoagulanti? 22. (Se donatrici): avete avuto contatti sessuali con maschi che abbiano fatto sesso con altri maschi? (i donatori spuntino sono maschio)

sono maschio
sono maschio
(segue)
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S No 23. Ha avuto contatti sessuali con soggetti affetti da epatite? 24. Convissuto con chi ha unepatite? 25. Ha fatto un tatuaggio? 26. Ha praticato la foratura di un lobo auricolare o un body piercing? 27. Ha avuto o stato curato per sifilide o gonorrea? 28. Ha subito detenzione minorile o siete stato in guardina, custodia cautelare o prigione per pi di 72 ore? Negli ultimi tre anni 29. Ha soggiornato fuori dagli Stati Uniti o dal Canada? Fra il 1980 e il 1996 30. Ha trascorso sino a 3 mesi o pi nel Regno Unito? 31. E stato un membro dellEsercito USA, un civile militarizzato o un dipendente di un militare USA? Fra il 1980 a oggi 32. Ha trascorso sino a 5 o pi anni in Europa? 33. Ha ricevuto una trasfusione di sangue nel Regno Unito? Fra il 1977 a oggi 34. Ha ricevuto soldi, droghe o altro tipo di pagamento per prestazioni sessuali? 35. (Se donatori): avete mai praticato sesso con un altro uomo, anche solo una volta? (le donatrici spuntino sono femmina) Avete MAI 36. Avuto un test positivo per HIV? 37. Usato aghi per iniettarvi droghe, steroidi o altri farmaci non prescritti dal vostro medico curante? 38. Usato concentrati di fattori procoagulanti? 39. Avuto epatite? 40. Avuto malaria? 41. Avuto il morbo di Chagas? 42. Avuto babesiosi? 43. Ricevuto un trapianto di dura madre? 44. Avuto neoplasie, ivi comprese forme di leucemia? 45. Avuto problemi cardiaci o polmonari? 46. Avuto emorragie o malattie ematologiche? 47. Avuto contatti sessuali con chi stato in Africa? 48. Fatto un viaggio in Africa? 49. Avuto un parente che ha sofferto del morbo di Creutzfeldt-Jacob?

sono femmina
(segue)
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Altre domande
S No

*Scaricato da http://www.aabb.org il 19 aprile 2005. Consultare il sito web per gli aggiornamenti
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Appendice 4.2 - Lista dei farmaci che contemplano sospensioni dalle donazioni*
Prego, comunicateci se state prendendo o avete mai preso qualcuno dei seguenti farmaci: Proscar (finasteride) - per il trattamento dellipertrofia prostatica. Avodart (dutasteride) - per il trattamento dellipertrofia prostatica. Propecia (finasteride) - per la calvizie. Roaccutan (isotretinoina) - per il trattamento delle forme gravi di acne. Soriatane (acitretina) - per il trattamento delle forme gravi di psoriasi. Tegison (etetrinate) - per il trattamento delle forme gravi di psoriasi. Ormone della crescita da ghiandola pituitaria umana - usato soltanto sino al 1985 nei bambini con sviluppo fisico ritardato o incompleto. Insulina bovina - usata per trattare il diabete. Immunoglobulina anti-HBV - per profilassi dopo esposizione allepatite B. Nota: questa immunoglobulina diversa dal vaccino per lepatite B, che viene somministrato in 3 dosi in un periodo di 6 mesi per prevenire future infezioni da HBV.
Se desiderate conoscere il motivo per cui questi farmaci possono condizionare la vostra idoneit come donatori di sangue, leggete quanto riportato di seguito. Se avete assunto o state assumendo Proscar, Avodart, Propecia, Roaccutan, Soriatane o Tegison, questi farmaci possono causare difetti congeniti. Se il Vostro sangue contiene elevati livelli di questi farmaci, essi possono danneggiare il feto se il sangue trasfuso a una donna gravida. Quando il farmaco scompare dal Vostro sangue, potete riprendere a donare. I periodi di sospensione sono i seguenti: 1 mese per Proscar, Propecia e Roaccutan, 6 mesi per Avodart e 3 anni per Soriatane. Per Tegison lesclusione dal dono permanente. Ormone della crescita da ghiandola pituitaria umana. Questo ormone stato prescritto sino al 1985, per bambini con crescita ritardata o assente. Si accertato che alcuni soggetti trattati con lormone hanno sviluppato il morbo di Creutzfeldt-Jacob. Il morbo di Creutzfeldt-Jacob non stato pi associato alla somministrazione dellormone preparato a partire dal 1985. Insulina bovina, una sostanza iniettabile per trattare il diabete. Se proveniente da paesi dove si sviluppato la Malattia della mucca pazza potrebbe contenere materiale derivante da bovini infetti. Non comunque sicuro che questa malattia possa trasmettersi con la trasfusione di sangue. Immunoglobulina anti-epatite B (HBIG) una sostanza utilizzata per prevenire linfezione dopo unesposizione al virus dellepatite B. LHBIG non previene in tutti i casi linfezione da HBV, tuttavia le persone che hanno ricevuto HBIG debbono aspettare 12 mesi prima di donare sangue per essere sicuri di non essere pi infettanti.
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Appendice 4.3 - Materiale informativo per il donatore*

Materiale informativo per il donatore: rendete sicura la donazione del vostro sangue
Grazie per esservi presentati a donare. Questo foglietto informativo Vi spiega come potete aiutarci a rendere sicura la donazione di sangue per Voi stessi e per il paziente che potrebbe ricevere il Vostro sangue. PREGO LEGGERE QUESTE INFORMAZIONI PRIMA DI DONARE! Se avete qualche domanda da fare adesso o in qualsiasi altro momento della procedura di selezione, per favore interpellate il personale del centro. LA PRECISIONE E LONEST NELLE RISPOSTE SONO ESSENZIALI! La totale onest nel rispondere a ogni domanda molto importante per la sicurezza del paziente che ricever il Vostro sangue. Tutte le informazioni che darete saranno strettamente riservate. PROCEDURA DI DONAZIONE Per stabilire che siete idonei a una donazione noi: - faremo domande sul Vostro stato di salute, sui viaggi che avete compiuto e sui farmaci che avete assunto; - faremo domande per stabilire se siete a rischio di epatiti, infezione da HIV o di AIDS; - vi misureremo la pressione arteriosa, la temperatura corporea e le pulsazioni; - vi prenderemo un piccolo campione di sangue per assicurarci che non siate anemico. Se sarete giudicato idoneo a donare, noi: - disinfetteremo il Vostro braccio con un antisettico (se siete allergici alla tintura di iodio, informateci); - useremo un ago nuovo, sterile, monouso per raccogliere il Vostro sangue. IDONEIT DEL DONATORE SPECIFICHE INFORMAZIONI Perch facciamo domande sui contatti sessuali I contatti sessuali possono causare malattie contagiose come linfezione da HIV, che pu passare nel sangue ed essere trasmesso ad altri con la trasfusione Definizione di contatto sessuale: le frasi avere contatti sessuali con o fare sesso consono usate in alcune domande che Vi rivolgeremo e si riferiscono alle attivit sottospecificate, sia che si usino (o meno) profilattici o altri tipi di protezione: 1. sesso vaginale (contatto fra pene e vagina) 2. sesso orale (bocca o lingua sulla vagina, sul pene, sullano) 3. sesso anale (contatto fra pene e ano) COMPORTAMENTI A RISCHIO DI HIV/AIDS E SINTOMATOLOGIA LAIDS causato dallHIV. LHIV si diffonde soprattutto attraverso i rapporti sessuali con persona infetta o scambiandosi aghi o siringhe utilizzate per iniettarsi droghe. NON DONATE SANGUE SE: - avete lAIDS o avete avuto un test positivo per HIV; - avete usato aghi per iniettarvi droghe, steroidi o altri medicamenti non prescritti dal Vostro medico; - siete maschio e avete avuto contatti sessuali con un altro maschio, anche soltanto una volta, dal 1977; - avete ricevuto denaro, droga o altro tipo di pagamento per prestazioni sessuali dal 1977; - avete avuto, negli ultimi 12 mesi, contatti sessuali con qualcuna delle categorie sopra specificate; - avete avuto sifilide o gonorrea negli ultimi 12 mesi; - siate stato in un carcere minorile, in guardina, in custodia cautelare o in prigione per pi di 72 ore; - avete presentato i seguenti sintomi che possono essere segni clinici di HIV/AIDS: - una perdita inesplicabile di peso corporeo e sudorazioni notturne; - macchie blu o purpuree sulla pelle o sulle mucose; - linfonodi edematosi per pi di un mese; - macchie bianche o piaghe in bocca; - tosse persistente o difficolt di respiro; - diarrea persistente; - febbre superiore a 38 C per pi di 10 giorni. Ricordatevi che POTETE trasmettere lHIV con la trasfusione del Vostro sangue, anche se vi sentite bene e il test anti-HIV negativo. Questo perch le analisi possono non individuare linfezione per un certo periodo dopo lesposizione al virus. Se pensate di poter essere a rischio di HIV/AIDS o desiderate effettuare un test al riguardo,informatevi sulle altre strutture che effettuano questo tipo di analisi. PER FAVORE, NON DONATE SANGUE PER ESEGUIRE UN TEST ANTI-HIV! Viaggi o nascita in Paesi stranieri I test di idoneit eseguiti dal Centri Donatori possono non essere utili per alcune malattie contagiose che si riscontrano soltanto in alcuni Paesi. Se siete nati, avete vissuto o avete visitato certi Paesi potreste non essere idonei al donazione di sangue. Cosa avviene dopo la Vostra donazione Per la protezione dei riceventi il Vostro sangue sottoposto ai test per HBV, per HCV, per HIV, per altri virus e per la sifilide. Se il Vostro sangue positivo per uno o pi di questi test, non sar usato per trasfondere pazienti. Vi saranno notificati gli esiti dei test che potrebbero non renderVi idonei come futuri donatori. Per favore, non donate solo per eseguire i test per lHIV, per le epatiti o per qualsiasi altra infezione. Grazie, per la Vostra odierna donazione! (Nome del Centro Donatori) (Numero di telefono)
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Appendice 4.4 - Alcuni farmaci comunemente accettati per le donazioni

In molti centri, si consente la donazione di sangue a soggetti che hanno assunto i farmaci elencati qui di seguito: tetracicline o altri antibiotici utilizzati per la cura dellacne; steroidi per il trattamento topico di lesioni cutanee (non nel sito di venipuntura); farmaci per la pressione arteriosa, assunti sistematicamente e con successo, cos che la pressione si mantenga ai limiti consentiti. I candidati donatori che assumono anti-ipertensivi non dovrebbero presentare effetti collaterali, quali lipotensione posturale, e non dovrebbero presentare alcuna sintomatologia cardiocircolatoria; broncodilatatori e decongestionanti da banco (che non richiedono ricetta medica); ipoglicemizzanti orali in diabetici ben controllati e senza alcuna complicanza vascolare; tranquillanti, nella maggioranza dei casi. Un medico dovrebbe valutare il donatore per distinguere fra tranquillanti e antipsicotici; ipnotici, assunti prima di dormire; marijuana (ma i cui effetti non siano presenti al momento della donazione), contraccettivi orali, analgesici lievi, vitamine, ormoni, farmaci per limitare il peso corporeo.
Nota: laccettazione di un donatore deve essere sempre approvata dal direttore medico del centro.
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Capitolo 5: Donazione e trasfusione di sangue autologo
Capitolo 5
Donazione e trasfusione di sangue autologo
La trasfusione autologa rappresenta unalternativa terapeutica per molti pazienti che necessitano di terapia trasfusionale. Le tipologie di trasfusioni autologhe sono diverse: 1. raccolta pre-operatoria (il sangue raccolto e conservato in anticipo sulle necessit); 2. raccolta e somministrazione perioperatoria: a. emodiluizione acuta normovolemica (il sangue raccolto allinizio della seduta operatoria e trasfuso durante o alla fine dellintervento), b. raccolta intra-operatoria (il sangue perso recuperato dal campo operatorio o da apparecchiature per la circolazione extracorporea e poi reinfuso); c. raccolta post-operatoria (il sangue raccolto dai drenaggi e reinfuso). Ciascun tipo di trasfusione autologa offre potenziali benefici ma anche rischi, in rapporto al tipo di intervento, alle condizioni del paziente e alla tecnologia disponibile. Ogni struttura deve analizzare le proprie pratiche trasfusionali, quelle di istituzioni simili e le proprie potenzialit di offrire un servizio appropriato. Viene generalmente accettato, tuttavia, che ai pazienti deve essere offerta la possibilit di servirsi del proprio sangue. La Corte Suprema degli Stati Uniti ha stabilito che linfezione asintomatica da HIV uninvalidit tutelata dalla legge nazionale sui disabili 1. Quindi, se le istituzioni offrono lautotrasfusione a tutti i pazienti, dovrebbero prendere in considerazione lofferta di questo servizio anche a favore dei pazienti
HIV-positivi 2 . I pazienti che sono probabili candidati alla terapia trasfusionale e che possiedano i requisiti di idoneit alla donazione, dovrebbero essere informati sulle opzioni per la terapia trasfusionale autologa. I pazienti che decidono di ricorrere alla terapia trasfusionale autologa dovrebbero essere informati sui rischi e sui benefici sia della donazione sia della trasfusione autologa. Dovrebbero essere identificati i problemi specifici propri dellimpiego della trasfusione autologa nellintervento chirurgico previsto, ivi compresi i possibili errori nellassegnazione dellunit stessa. Inoltre, i pazienti debbono essere informati su ogni costo aggiuntivo delle procedure di autotrasfusione, sulla tipologia dei test di laboratorio per la diagnostica delle malattie infettive che verranno effettuati e sul possibile utilizzo anche di unit allogeniche in aggiunta a quelle autologhe.
Raccolta di sangue autologo pre-intervento

I vantaggi e gli svantaggi che frequentemente vengono attribuiti alla donazione pre-intervento di sangue autologo (DPSA) sono sintetizzati in Tabella 5.1. I candidati alla DPSA sono pazienti stabili candidati a interventi chirurgici che, con ogni probabilit, richiederanno supporto trasfusionale. La DPSA non raccomandata per quegli interventi nei quali il ricorso alla terapia trasfusionale improbabile [per i quali cio
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secondo lMSBOS ( maximal surgical blood ordering schedule ) non necessario compatibilizzare unit di sangue]. In sottogruppi selezionati di pazienti, la DPSA pu ridurre significativamente lesposizione al sangue allogenico e dovrebbe essere presa in considerazione per i pazienti che hanno buone probabilit di ricevere terapia trasfusionale, come quelli candidati a interventi di chirurgia maggiore ortopedica, di chirurgia vascolare, di cardiochirurgia e di chirurgia toracica3,4. Le artroprotesi totali sono gli interventi chirurgici in previsione dei quali pi frequentemente viene effettuata la donazione autologa4. Il sangue autologo non dovrebbe essere raccolto per interventi che soltanto raramente (in meno del 10% dei casi) richiedono trasfusioni, quali la colecistectomia, lernioraffia, listerectomia per via vaginale, il parto senza complicazioni5. Categorie speciali di pazienti In circostanze particolari, la DPSA pu essere effettuata da pazienti che, in condizioni normali, non sarebbero ritenuti idonei alla donazione di sangue allogenico. In questi casi, importante la Tabella 5.1 - Donazione di sangue autologo Vantaggi 1. Previene la trasmissione di malattie infettive 2. Previene lalloimmunizzazione eritrocitaria 3. Integra le scorte di sangue 4. Fornisce sangue compatibile a pazienti con alloanticorpi 5. Previene alcune reazioni trasfusionali avverse 6. Rassicura i pazienti circa i rischi della trasfusione allogenica
disponibilit di un supporto medico per valutare lidoneit del paziente. Anche i pazienti pediatrici possono essere arruolati in un programma di DPSA, con opportune modifiche relativamente al volume del sangue da prelevare, con la cooperazione dei genitori e con particolare attenzione a prepararli e tranquillizzarli. Limpiego con successo del sangue autologo stato descritto in un paziente con drepanocitosi7 e questo pu essere particolarmente utile in pazienti falcemici polialloimmunizzati; il paziente affetto da drepanocitosi pu comunque trarre un beneficio maggiore dallapporto di HbA della terapia trasfusionale allogenica. Le emazie che contengono HbS debbono essere manipolate con particolare attenzione durante il processo di crioconservazione8. I pazienti affetti da importanti patologie cardiache sono considerati a basso rischio per la donazione di sangue autologo. Nonostante in letteratura siano pubblicati studi, con limitata numerosit dei pazienti arruolati, sulla sicurezza della donazione autologa 9, i rischi di questa procedura 10 nei cardiopatici gravi sono probabilmente superiori a quelli attualmente associati alla trasfusione allogenica11,12.
Svantaggi 1. Non elimina i rischi di una contaminazione batterica 2. Non elimina i rischi di una incompatibilit ABO 3. pi costosa del sangue allogenico 4. Determina lo spreco del sangue non trasfuso 5. Ha una maggior incidenza di reazioni avverse da donazione 6. Determina anemia peri-operatoria e conseguentemente aumenta la probabilit di trasfusioni allogeniche
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Tabella 5.2 - Controindicazioni a partecipare a un programma di DPSA 1. Presenza di uno stato infettivo e rischio di batteriemia. 2. Intervento chirurgico per correggere una stenosi aortica. 3. Angina instabile. 4. Crisi convulsive non controllate farmacologicamente. 5. Infarto miocardico o ictus nei sei mesi precedenti. 6. Pazienti affetti da cardiopatie o malattie polmonari gravi, che non siano gi stati dichiarati idonei allintervento dal proprio curante. 7. Coronaropatia grave allarteria coronaria principale sinistra. 8. Cardiopatia cianotica. 9. Ipertensione incontrollabile. La Tabella 5.2 elenca le condizioni che controindicano la partecipazione dei pazienti a un programma di DPSA13. La donazione autologa in corso di gravidanza fisiologica non giustificata14, dato che il supporto trasfusionale necessario molto raramente. Molte strutture prendono in seria considerazione il prelievo di sangue autologo nelle gravide con polialloimmunizzazione o anticorpi contro antigeni ad elevata incidenza, con placenta previa, oppure con altre condizioni ad alto rischio di emorragia prima o durante il parto5. Si dovrebbe prevedere una linea di indirizzo strategica per quelle situazioni nelle quali le emazie materne possono essere necessarie per la terapia trasfusionale del neonato. Standard volontari Gli Standards for Blood Banks and Transfusion Services dellAABB presentano standard uniformi da seguire per stabilire lidoneit dei pazienti, ma anche le modalit di prelievo delle unit di sangue, sulle indagini di laboratorio da effettuare su di esse e su come etichettarle, nonch sulla tipologia di test pre-trasfusionali da
eseguire15(pp18,39,51). Questi standard si applicano alla DPSA. Gli Standard per la Raccolta e lAssegnazione Perioperatoria di Sangue Autologo si pongono invece lobiettivo di migliorare qualit e sicurezza delle procedure di autotrasfusione perioperatorie (recupero di sangue intra- e post-operatorio, produzione perioperatoria di emocomponenti autologhi e emodiluizione acuta normovolemica intra-operatoria)16. Considerazioni sui requisiti I requisiti stabiliti dalla FDA (Food and Drug Administration) si sono evoluti nel tempo. La FDA ha emanato una direttiva su sangue ed emocomponenti autologhi nel marzo 198917. Questa direttiva stata poi chiarita in una seconda comunicazione, nel febbraio 1990 18 . Molte informazioni della direttiva sono state sostituite da norme successive. La FDA ha inserito i requisiti riguardanti il sangue autologo nelle normative emesse l11 giugno 200119,20. Esami di laboratorio La FDA richiede di eseguire test per evidenziare le infezioni trasmissibili da: HIV-1, HIV-2, HBV, HCV, HTLV-I e HTLV-II [CFR (Code of Federal Regulations), titolo 21, parte 610.40] ed esami sierologici per la sifilide [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (a), comma (1) e parte 610.40, paragrafo (i)]. Questi esami includono anche i test NAT per HIV e HCV21. Per le donazioni autologhe i test suddetti non sono richiesti, a meno che il sangue donato non venga utilizzato per trasfusioni allogeniche [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (d), comma (1)]. Le donazioni autologhe che devono essere inviate ad unaltra struttura, che consente limpiego delle unit autologhe per la terapia trasfusionale allogenica, devono essere testate [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (d), comma (2)]. Per quanto riguarda invece le donazioni autologhe inviate ad altre strutture che non permettono che il sangue autologo sia usato per trasfusioni allogeniche, devono essere effettuate le indagini di laboratorio sopra menzionate sulla prima donazione in ciascun periodo di 30 giorni [CFR, titolo 21, parte 610.40,
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paragrafo (d), comma (3)15(p34)]. Le donazioni autologhe risultate reattive a uno dei test di screening obbligatori debbono essere riesaminate quando un test supplementare (aggiuntivo, pi specifico) viene approvato dalla FDA. Quanto meno, deve essere analizzata la prima donazione reattiva in ciascun periodo di 30 giorni, a meno che non esista la registrazione di un test supplementare positivo di quel dato donatore [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (2), commi (1,2)]. Sia gli Standard AABB15(p34) che i requisiti FDA [CFR, titolo 21, parte 630.6, paragrafo (d)] stabiliscono che il paziente e il suo medico curante debbono essere informati di ogni dato sanitario anomalo che viene riscontrato. Esclusione del donatore Se un donatore autologo risulta reattivo a un test di screening per un patogeno trasmissibile o per il test sulla sifilide (CFR, titolo 21, parte 610.41), il donatore deve essere escluso da future donazioni allogeniche. Entro otto settimane, il paziente-donatore e il suo medico curante debbono essere informati dei motivi dellesclusione (compresi i risultati dei test supplementari) e, se del caso, del tipo di donazione che il donatore autologo non dovr pi effettuare in futuro (CFR, titolo 21, parte 630.6). Considerazioni sulle etichette speciali Ogni unit autologa deve avere letichetta recante la scritta Donatore autologo. Unaltra etichetta speciale con la scritta Rischio biologico deve essere applicata a ogni unit che risulti reattiva al momento della donazione o negli ultimi 30 giorni. Sulle unit autologhe non analizzate deve essere apposta unetichetta indicante Donatore non testato. Se lunit autologa risulta negativa nel periodo negli ultimi 30 giorni, deve essere etichettata Donatore testato entro gli ultimi 30 giorni [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (d), comma (4)]. Movimentazione degli emocomponenti autologhi Il sangue e gli emocomponenti per uso autologo (incluse le donazioni reattive) possono essere
spediti, purch le unit siano state esaminate come richiesto e siano etichettate in maniera appropriata [CFR, titolo 21, parte 610.40, paragrafo (d)]. Se queste unit vengono smistate utilizzando un comune corriere, senza il diretto controllo della struttura che ha eseguito il prelievo, il trasporto dellunit deve soddisfare le norme previste per la spedizione di materiale infetto22. Come stabilire un programma di DPSA Ogni Centro di Raccolta o Servizio Trasfusionale ospedaliero che decida di attuare un programma di DPSA deve definire le proprie linee di indirizzo strategiche, i processi e le procedure. Esistono delle linee guida per costituire ex novo un programma di donazione autologa, per monitorarne lutilizzo, o per migliorare programmi gi in uso13,23,24. Responsabilit del medico Un programma di donazione autologa, per essere portato a termine con successo, necessita di cooperazione e comunicazione tra tutte le figure mediche coinvolte. Le responsabilit per la salute e la sicurezza del paziente durante il prelievo di sangue autologo competono al direttore medico della struttura di raccolta, mentre, durante la trasfusione, competono al medico curante e al direttore medico del Servizio Trasfusionale. Il medico curante fa la richiesta iniziale per la procedura di autotrasfusione e questa richiesta deve essere approvata dal medico del Servizio Trasfusionale. Dovrebbe essere garantita la presenza di un trasfusionista come consulente per valutare quei pazienti con anamnesi positiva per rischio di complicanze secondarie a possibili reazioni durante la donazione. Terapia marziale Si dovrebbe consigliare al paziente di assumere terapia marziale integrativa. Lideale sarebbe che il medico che richiede lautotrasfusione prescrivesse questa terapia prima della prima donazione, in tempo utile da consentire il massimo apporto di ferro. Leritropoiesi in carenza di ferro rappresenta uno
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Tabella 5.3 - Tempistica e unit di concentrati eritrocitari rigenerate durante un programma di DPSA26 Tempi fra la donazione e lintervento (giorni) 6-13 14-20 21-27 28-34 35-41
* IC = Intervallo di Confidenza
Numero di pazienti 39 127 128 48 30
Numero medio IC* della media al 95% di unit riprodotte 0,52 0,54 0,75 1,16 1,93 0,25-0,79 0,40-0,68 0,61-0,90 0,96-1,36 1,64-2,2
dei fattori che limitano la raccolta di pi unit di sangue autologo, in un intervallo di tempo contenuto. Di solito, il ferro viene somministrato per os, ma ci potrebbe non essere sufficiente a mantenerne le riserve25. I dosaggi e il programma di somministrazione debbono essere tarati per minimizzare gli effetti collaterali gastrointestinali. Prelievo La raccolta di sangue autologo ha molti elementi in comune con quella da donatori volontari; esistono, peraltro, aspetti specifici. La richiesta per una raccolta di sangue autologo va effettuata, per scritto, dal curante del paziente. Il modulo di richiesta (che pu essere una semplice ricetta o uno specifico stampato) viene trattenuto dal Centro di Raccolta. La richiesta dovrebbe riportare il nome del paziente, un codice unico di identificazione, il numero di unit e il tipo di emocomponente richiesto, la data programmata per lintervento chirurgico, le caratteristiche dellintervento e la firma del medico richiedente. importante che vengano redatte linee guida riguardanti il numero appropriato di unit da raccogliere. Quando possibile, dovrebbero essere raccolte unit in numero tale da minimizzare lesposizione al sangue allogenico. Tuttavia, una raccolta di un numero elevato di unit e/o troppo ravvicinata alla data dellintervento aumenta le probabilit di ricorrere a trasfusioni allogeniche.
Il MSBOS ospedaliero pu fornire unindicazione sul numero di unit necessarie per garantire il supporto trasfusionale nei vari interventi chirurgici. Unopzione pu essere rappresentata dalla raccolta in eritroaferesi di 2 unit di concentrati eritrocitari (CE). La raccolta di unit di sangue autologhe dovrebbe essere programmata, il pi possibile in anticipo sulla data dellintervento, cos da consentire uneritropoiesi compensatoria e da minimizzare lanemia. Il programma di raccolta dovrebbe essere stabilito con il paziente. Spesso, viene utilizzato un programma settimanale. La Tabella 5.3 sottolinea limportanza di iniziare la DPSA in anticipo sui tempi che intercorrono fra la raccolta e lintervento, per permettere una eritropoiesi compensatoria ottimale (qui rappresentata in termini di unit di concentrati eritrocitari rigenerate)26. Di solito, lultimo prelievo non si esegue oltre le 72 ore che precedono lintervento chirurgico ma, preferibilmente, in anticipo rispetto a questo limite per permettere un adeguato recupero della volemia. Il programma di autotrasfusione dovrebbe prevedere anche le modalit per informare il medico richiedente sulleffettivo numero di unit raccolte, nel caso in cui non sia stato possibile raccogliere il numero di unit richieste, e dovrebbe inoltre prevedere le azioni da intraprendere nel caso in cui lintervento sia rimandato oltre la data di scadenza delle unit autologhe e se scartarle o congelarle.
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Screening dei donatori La selezione dei donatori non richiede ladozione di criteri rigidi, proprio in relazione allo speciale ambito nel quale si ricorre allautotrasfusione. In queste circostanze, nelle quali i requisiti per la selezione dei donatori e la raccolta di sangue allogenico non vengono applicati, comunque necessario che il dirigente medico della struttura stabilisca criteri di selezione alternativi e li riporti sul manuale delle procedure operative. La concentrazione di emoglobina non dovrebbe essere inferiore a 11,0 g/dL e lematocrito, se usato come parametro di valutazione alternativo, non inferiore al 33%. Singole deviazioni da questi requisiti debbono essere autorizzate dal direttore medico del centro, in accordo, di solito, con il medico curante del paziente. Colloquio con il medico Il colloquio con il medico deve essere mirato ad approfondire aspetti tipici della selezione del donatore autologo. Per esempio, unattenzione maggiore deve essere posta a domande sullassunzione di terapie farmacologiche, sulle patologie ad esse associate e sulla presenza di fattori di rischio cardiovascolare10. Le domande dovrebbero essere mirate a evidenziare ogni possibile batteriemia transitoria. Linchiesta anamnestica dovrebbe scoprire ogni possibile batteriemia intermittente. Dato che la destinazione del sangue autologo a trasfusioni allogeniche non viene di norma consentita, si pu usare una serie ridotta di domande; per esempio, non sono necessari quesiti sui rischi correlati alla trasmissione di malattie infettive. Quantit da prelevare Per un donatore autologo che pesi oltre 50 kg, vengono di solito utilizzate sacche da 450 mL, al posto di quelle da 500 mL, qualora il donatore non possa fornire ununit piena. Se il volume raccolto fra 300 e 450 mL, i globuli rossi sono idonei alla conservazione e alla successiva trasfusione. Il plasma, da queste unit a volume ridotto, non pu essere trasfuso a causa di un rapporto anticoagulante/plasma alterato. Unit al di sotto di 300 mL possono essere idonee alluso
autologo, previa approvazione del direttore medico della struttura. Per pazienti di peso inferiore ai 50 kg, si dovrebbe ridurre proporzionalmente il volume del sangue raccolto. Indipendentemente dal peso del donatore, il volume raccolto non deve superare i 10,5 mL/kg di peso corporeo, ivi compresi i campioni per le analisi. Test sierologici Il Centro di Raccolta deve tipizzare tutte le unit per lABO e lRh. Il Servizio Trasfusionale deve ritestare, per ABO ed Rh, le unit prelevate in altra sede, a meno che la struttura di raccolta non analizzi i segmenti che accompagnano lunit, seguendo le istruzioni degli Standard AABB15(p37). Le determinazioni ABO ed Rh debbono essere effettuate su campioni di sangue del paziente, appropriatamente etichettati. Dovrebbe essere anche effettuato uno screening anticorpale in vista di un possibile fabbisogno di terapia trasfusionale allogenica. Etichette Le unit dovrebbero essere etichettate in maniera chiara, con il nome del paziente, un codice individuale identificativo, la data di scadenza dellunit e, se disponibile, il nome della struttura dove il paziente verr trasfuso. Le unit dovrebbero essere marcate, in modo chiaro, con la dicitura Per esclusivo uso autologo, se destinate soltanto a questo scopo. Se sono stati preparati emocomponenti, ognuno di essi deve essere etichettato in maniera eguale. Quando indicato dai requisiti FDA (vedi sopra, Considerazioni sui requisiti), si deve applicare unetichetta di rischio biologico. I requisiti per etichettare le unit autologhe sono descritti negli Standard AABB15(p51), che si rifanno alle norme FDA. Conservazione La raccolta dovrebbe essere programmata in modo da permettere una conservazione pi lunga possibile del sangue prelevato. Ci accresce la flessibilit sia per il paziente che per la struttura di raccolta e concede al donatore autologo il tempo di ricostituire la massa eritrocitaria,
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nellintervallo temporale che intercorre fra il prelievo e lintervento chirurgico. La conservazione del sangue autologo in emoteca possibile sino a 6 settimane. Alcuni programmi prevedono di conservare le unit autologhe come sangue intero (SI) per 35 giorni, piuttosto che come concentrati eritrocitari. Il sangue intero pi semplice da conservare e il rischio di sovraccarico circolatorio da trasfusione basso. stata descritta in letteratura la raccolta di unit autologhe pi di 6 settimane prima dellintervento operatorio, ma questo richiede che le unit siano congelate. Quantunque questa modalit conceda pi tempo al donatore di recuperare la massa eritrocitaria perduta, il congelamento e lo scongelamento aumentano il costo del programma, riducono la quantit di emazie per le perdite durante le due procedure e rendono pi complicata la disponibilit di sangue nel periodo perioperatorio. Trasfusione delle unit autologhe Il programma di terapia trasfusionale autologa deve prevedere procedure che garantiscano che, se sono disponibili unit autologhe, queste vengano assegnate e trasfuse prima degli emocomponenti allogenici. Pu essere utilizzata una speciale etichetta autologa numerata, per assicurare che le unit pi vecchie siano distribuite per prime. Gli anestesisti, i chirurghi e i medici dovrebbero essere istruiti circa limportanza di utilizzare gli emocomponenti autologhi prima di ricorrere a quelli allogenici e si dovrebbe attuare una politica sulla assegnazione alla sala operatoria delle unit autologhe, di quelle allogeniche e di quelle dedicate. Registrazioni Gli Standard AABB sulla corretta assegnazione delle unit autologhe e sulle modalit per una corretta restituzione di quelle non utilizzate sono identici a quelli per le unit allogeniche 15(pp45,71). Le registrazioni che identificano lunit e gli emocomponenti da essa prodotti, dal momento del prelievo e della lavorazione fino alla loro destinazione finale, devono essere conservate.
Reazioni avverse Le indagini in caso di sospetto di evento avverso trasfusionale sono le stesse per unit autologhe o per unit allogeniche. Le trasfusioni autologhe, rispetto a quelle allogeniche, hanno un rischio minore di complicazioni infettive o immunologiche, ma hanno lo stesso rischio di contaminazione batterica, sovraccarico circolatorio o di errata assegnazione. Per tali motivi, il sangue autologo non dovrebbe essere trasfuso senza una chiara indicazione. Miglioramento continuo della qualit Nellambito della DPSA sono stati identificati diversi aspetti relativi al miglioramento della qualit5. Lindicatore principale deve misurare lefficacia dellautotrasfusione nel ridurre la trasfusione allogenica nei pazienti che vi si sottopongono. Pu essere monitorato anche lo scarto delle unit autologhe. Un programma ben studiato per procedure quali le protesi articolari totali o la prostatectomia radicale pu comunque dare luogo al mancato utilizzo del 50% delle unit prelevate (Figura 5.1)5,27. Ciononostante, il 25% circa del sangue autologo viene prelevato per procedure che soltanto raramente necessitano di trasfusioni, quali listerectomia per via vaginale o un parto normale. Ne consegue che oltre il 90% delle unit raccolte per tali procedure viene eliminato 14. I costi aggiuntivi per la raccolta di unit autologhe e lincremento del livello di sicurezza del sangue allogenico hanno modificato il rapporto costoefficacia della DPSA in molti ambiti28. Queste analisi di costo-efficacia non considerano leffetto immunomodulatorio dei leucociti allogenici, che, comunque, rimane controverso29,30. Per monitorare lappropriatezza delle trasfusioni autologhe, si possono stabilire criteri adeguati, che possono essere gli stessi stabiliti per le trasfusioni allogeniche o differire da essi24. Come per il sangue allogenico, anche il sangue autologo raccolto nel pre-operatorio comporta i medesimi rischi di unerrata assegnazione o di una contaminazione batterica. Altri parametri da monitorare sono:
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lindisponibilit di sangue autologo nel momento in cui sarebbe stato necessario, le trasfusioni di sangue allogenico prima di quello autologo, gli errori di identificazione. Problematiche emergenti nella DPSA Selezione dei pazienti I tentativi di stratificare i pazienti in gruppi ad alta o a bassa probabilit di essere trasfusi, sulla base del livello di emoglobina e delle caratteristiche dellintervento chirurgico possono essere promettenti. In uno studio canadese, basato su di un sistema a punti, l80% dei pazienti sottoposti a chirurgia ortopedica stato identificato come a bassa probabilit (<10%) di essere trasfuso, cos che per questi pazienti non veniva raccomandato il ricorso allautotrasfusione31. Un problema, tuttavia, con gli algoritmi che si basano sulla valutazione delle perdite di sangue e lematocrito pre-operatorio, che le perdite ematiche sono difficili da misurare 32,33 o da
prevedere, perch determinati interventi, anche se eseguiti dallo stesso chirurgo, possono presentare unincidenza estremamente variabile di emorragia. Ruolo di un programma intensivo di predeposito e impiego delleritropoietina Lefficacia della DPSA dipende dal grado con il quale leritropoiesi del paziente aumenta la produzione di globuli rossi25,34-36. La risposta delleritropoietina endogena e leritropoiesi compensatoria sono in una situazione subottimale quando, come si verifica nella situazione standard, si dona ununit ogni settimana. Una DPSA settimanale determina unespansione del volume eritrocitario che va dall11% (senza terapia marziale) al 19% (con ferro) nellarco di 3 settimane, espansione non sufficiente a prevenire uno stato di anemia nel donatore autologo34,35. Se la risposta eritropoietica al prelievo autologo
Percentuale del totale delle unit di globuli rossi costituiti da DPSA Unit Raccolte Trasfuse 1980 0,3 1986 1,5 <1,0 1989 4,8 3,1 1992 8,5 5,0 1994 7,8 4.3 1997 4,9 3,7 1999 4,7 3.0 2001 4,0 2,6
Figura 5.1 - Dati sulle unit autologhe raccolte e trasfuse negli USA dal 1980 al 2001, che illustrano lincremento e la caduta dellinteresse per la DPSA. La linea tratteggiata indica la percentuale (asse di destra) delle unit raccolte e trasfuse (Da Brecher e Goodnough27, riproduzione autorizzata).
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non in grado di mantenere il livello dellematocrito del paziente nellintervallo di tempo tra le donazioni, la donazione di sangue autologo pu essere dannosa37. Ci stato confermato in uno studio su pazienti sottoposte a isterectomia38, dove si dimostrato che la DPSA ha determinato anemia nel perioperatorio e maggiore probabilit, per le pazienti, di ricevere terapia trasfusionale autologa o allogenica. stato pubblicato un modello matematico37 che illustra la relazione tra la previsione di perdita ematica dellintervento, il livello di ematocrito che il medico desidera mantenere nel periodo perioperatorio e la necessit di donazione autologa per singoli pazienti (Figura 5.2). Modelli di questo tipo possono essere utili nel progettare programmi di approvvigionamento di sangue autologo o per monitorarne lutilit mediante verifiche di assicurazione della qualit. Contrariamente alla DPSA in condizioni standard, gli studi sulla DPSA intensiva (doppia donazione settimanale per 3 settimane, iniziando da 25 a 35 giorni prima dellintervento) hanno
dimostrato che i livelli di eritropoietina endogena e leritropoiesi aumentano, con unespansione della massa eritrocitaria che va dal 19 al 26%39-41. Una terapia farmacologica con eritropoietina esogena per stimolare ulteriormente leritropoiesi (oltre il 50% di espansione del volume eritrocitario39-41) stata approvata in Canada e in Giappone, ma non negli Stati Uniti42. Trigger trasfusionale Non esiste accordo sui livelli di emoglobina/ ematocrito ( trigger trasfusionali) ai quali appropriato ricorrere alla terapia trasfusionale autologa23. La trasfusione autologa non priva di rischi per il ricevente, rischi che comprendono lerrata identificazione del ricevente o dellunit, la contaminazione batterica delle unit conservate e il sovraccarico circolatorio. I trigger trasfusionali per il sangue autologo e allogenico dovrebbero essere gli stessi, dato che il rischio di mortalit aggiuntiva determinato dalla trasfusione allogenica si avvicina attualmente al rischio di mortalit derivante da errori di assegnazione di entrambi i
Perdita stimata di sangue (mL)
Hct minimo (%) Figura 5.2 - Rapporto fra perdite stimate di sangue e lematocrito minimo durante lospedalizzazione a vari livelli iniziali di Hct (= 30%; z= 35%; S= 40%; = 45%) in un paziente chirurgico con una volemia di 5.000 mL. (Da Cohen e Brecher37, riproduzione autorizzata.)
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tipi di trasfusione (autologa e allogenica)43. I dati di uno studio ben progettato indicano che anche i pazienti in condizioni critiche possono sopportare unanemia notevole (emoglobina da 7 a 9 g/dL), senza avere nessun chiaro beneficio da una terapia trasfusionale pi aggressiva. Rapporto costo-efficacia Quantunque la raccolta di sangue autologo sia in voga, i suoi costi sono generalmente pi alti di quelli della raccolta di sangue allogenico. La necessit di continuare i programmi di donazione autologa stata messa in discussione, in considerazione dei limitati rischi delle trasfusioni allogeniche e della necessit di ridurre i costi sanitari27. La Tabella 5.4 elenca le proposte per migliorare lefficacia dei programmi ospedalieri di raccolta di sangue autologo, senza sacrificare la sicurezza45. Raccolta pre-operatoria di emocomponenti Alcuni addetti ai lavori ritengono che la raccolta pre- o intra-operatoria di plasma ricco di piastrine durante un by-pass cardio-polmonare possa migliorare lemostasi e diminuire lesposizione a sangue allogenico, mentre altri non hanno riscontrato alcun beneficio46. La raccolta preoperatoria di piastrine autologhe, soprattutto in cardiochirurgia, spesso non praticabile, in quanto il paziente pu essere in terapia con farmaci antipiastrinici, lintervento spesso durgenza e si raccoglie una quantit di piastrine limitata.
Di recente, stata raccomandata la raccolta di piastrine autologhe con sistemi commerciali al fine di produrre gel piastrinico per uso topico. Il gel si ottiene aggiungendo cloruro di calcio e trombina a un concentrato piastrinico e funziona come fonte di fattori crescita di origine piastrinica che favoriscono la riparazione tissutale e la cicatrizzazione delle ferite, come riportato in alcuni studi, peraltro caratterizzati da limitata numerosit dei pazienti arruolati48,49. Sono necessarie sperimentazioni cliniche pi ampie per stabilire lefficacia di questo prodotto che non ancora approvato dalla FDA.
Emodiluizione acuta normovolemica

Per emodiluizione acuta normovolemica (EAN) si intende la rimozione, dal circolo del paziente, di sangue intero con contestuale rimpiazzo della volemia, infondendo soluzioni prive di cellule, subito prima di interventi chirurgici per i quali si preveda una perdita di sangue significativa. Per minimizzare il lavoro manuale di unEAN, il sangue dovrebbe essere raccolto in sacche con anticoagulante, poste su un agitatore basculante fornito di sensori di volume per larresto automatico del flusso. Il sangue va poi conservato a temperatura ambiente e reinfuso durante lintervento, dopo emorragie maggiori o anche prima, se necessario. Si raccomanda 50 la contemporanea infusione di soluzioni cristalloidi
Tabella 5.4 - Suggerimenti per rendere i protocolli autotrasfusionali costo-efficaci 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Usare indicazioni standardizzate per la raccolta pre-operatoria e la trasfusione di sangue autologo. Ottimizzare tempi e modi del colloquio medico con il donatore autologo. Non eseguire i test per i marcatori di malattie infettive dopo una raccolta di sangue autologo. Semplificare il processo della donazione per pazienti senza complicazioni. Limitare luso di sangue congelato. Conservare il sangue autologo come sangue intero, piuttosto che sotto forma di emocomponenti. Usare indicazioni standardizzate e adatte tecnologie per il recupero intra- e post-operatorio di sangue autologo. 8. Condividere con altre strutture le risorse per il recupero intra-operatorio del sangue. 9. Adottare con molta cautela nuove applicazioni della ricerca alle tecniche di autotrasfusione.
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(3 mL per ogni mL di sangue sottratto) e di colloidi (destrano, amido, gelatina, albumina, in rapporto di 1 mL per ogni mL di sangue prelevato). La successiva terapia con fluidi nel corso dellintervento chirurgico non si discosta dalla normale pratica chirurgica. Le unit di sangue vengono reinfuse in ordine inverso a quello della raccolta. La prima unit raccolta, quindi lultima a essere trasfusa, ha lematocrito pi alto e la maggiore concentrazione di fattori della coagulazione e di piastrine. Quantunque questa tecnica sia stata inizialmente sviluppata e utilizzata in Europa, il notevole interesse suscitato negli USA ha consentito di ottenere dati che la pongono come alternativa promettente alla raccolta di sangue autologo51. UnEAN spinta (rimpiazzo parziale del sangue raccolto con lEAN o di quello perso durante lintervento con apportatori di ossigeno) ha il vantaggio di non essere limitata dallanemia. Il suo uso comunque circoscritto a una fase sperimentale, fino a che non sar stata approvata dalla FDA. Considerazioni di fisiologia Conservazione della massa eritrocitaria Il beneficio principale dellEAN rappresentato dalla riduzione della perdita di globuli rossi, dato che, una volta completata lemodiluizione, il sangue perso in corso di intervento ha livelli inferiori di ematocrito32. Modelli matematici indicano che sarebbero necessari unEAN spinta a livelli pre-operatori di ematocrito inferiori al 20%, e una contemporanea perdita significativa di sangue, perch il volume di sangue risparmiato grazie allEAN possa essere considerato significativo da un punto di vista clinico53. Tuttavia, lEAN pu fare risparmiare lequivalente di una unit di sangue 54,55, che costituisce allincirca il risultato, in termini di espansione della massa eritrocitaria, che si ottiene dalla DPSA in condizioni standard (Tabella 5.3). Miglioramento dellossigenazione Il prelievo di sangue intero e la sua sostituzione con cristalloidi o colloidi diminuisce il contenuto arterioso di ossigeno, ma meccanismi emodinamici compensatori e lesistenza di un
surplus nella capacit di cedere ossigeno, rendono lEAN sicura. Un rapido abbassamento della concentrazione eritrocitaria diminuisce la viscosit ematica, riducendo, quindi, le resistenze periferiche e aumentando la gittata cardiaca. Se la gittata cardiaca in grado di compensare efficacemente, la cessione di ossigeno ai tessuti a un ematocrito compreso fra 25 e 30% altrettanto buona, ma non migliore, della cessione di ossigeno quando lematocrito compreso fra 30 e 35%56. Mantenimento dellemostasi Dato che il sangue raccolto con lEAN viene conservato a temperatura ambiente e viene restituito al paziente, di norma, entro 8 ore, vi scarso deterioramento delle piastrine e dei fattori della coagulazione. La capacit emostatica del sangue da EAN discutibile in chirurgia ortopedica o urologica, considerato che plasma e piastrine sono raramente indicate in questo caso. , invece, meglio definita46,57 la sua capacit di proteggere plasma e piastrine dalla coagulopatia acquisita che si verifica in cardiochirurgia a causa della circolazione extracorporea. Studi clinici Studi prospettici randomizzati, relativi alla prostatectomia radicale58, allartroprotesi totale di ginocchio59 e danca60, indicano che lEAN si pu considerare una metodica equivalente alla DPSA, quale fonte di sangue autologo. Altre sperimentazioni cliniche selezionate sono riportate in Tabella 5.5 61-67 . Sono stati pubblicati rassegne68,69 e commenti70 sugli effetti favorevoli della EAN. Tuttavia, una meta-analisi su 42 studi clinici in cardiochirurgia, pubblicata di recente, riscontra soltanto modesti benefici, senza provarne la sicurezza 71. Quando lEAN e la successiva reinfusione sono effettuate in sala operatoria dal personale addetto, i costi della procedura nel suo complesso sono ridotti. Il sangue ottenuto con lEAN non richiede perdite di tempo per il paziente, trasporto, costi e assenze dal lavoro, come nel caso della DPSA. Anche lo spreco di unit che si verifica con la DPSA (circa il 50% delle unit raccolte) con lEAN viene
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Tabella 5.5 - Selezione di studi clinici sullEAN Perdita ematica stimata (in mL) Tipo di intervento Chirurga vascolare Resezione epatica Protesi danca Artrodesi spinale Colectomia Prostatectomia Prostatectomia Controlli 2.250 1.479 1.800 5.490 NR 1.246 1.717 EAN 2.450 11.284 2.000 1,700 NR 1.106 1.710 p NS NS NS <0,05 NR NS NS Hct post-operatorio (%) Controlli NR 37,9 38,4 NR 37,0 35,5 29,5 EAN 33,0 33,8 32,4 28,7 35,0 31,8 27,9 p NR <0,01 NS NR NR <0,001 <0,05 Unit allogeniche trasfuse (o litri) Controlli 6,0 3,8 (2,1) 8,6 2,4 0,16 0,30 EAN 2,6 0,4 (0,9) <1,0 0 0 0,13 p <0,01 <0,001 NR <0,001 NR NS NS Bibliografia 61 62 63 64 65 66 67
NR = Non riportato; NS = non significativa. (Da Brecher e Rosenfeld, adattamento autorizzato)
eliminato. Per di pi, le unit derivanti da unEAN non hanno costi di conservazione o per lesecuzione di test. Inoltre, dato che il sangue non lascia mai lambiente dove si trova il paziente, sono praticamente azzerate le possibilit di errori trasfusionali maggiori, che potrebbero essere causa di trasfusione ABO incompatibile e morte, come pure il rischio di contaminazione batterica dovuto a una prolungata conservazione a 4 C. Considerazioni pratiche Le considerazioni elencate qui di seguito sono importanti, quando si fa un programma di EAN: 1. le decisioni circa il ricorso allEAN si dovrebbero basare su: tipo di procedura chirurgica; volemia ed ematocrito del paziente prima dellintervento; livello di ematocrito da raggiungere dopo emodiluizione; altre possibili variabili fisiologiche; 2. dovrebbero essere stabilite (e periodicamente revisionate) le linee di indirizzo strategiche della struttura le procedure e le metodiche per addestrare il personale; 3. dovrebbero essere attentamente monitorati, per tutta la durata della procedura, il volume ematico circolante e lo stato di perfusione del paziente; 4. il sangue deve essere raccolto asetticamente in comuni sacche da prelievo, contenenti soluzioni anticoagulanti a base di citrato; 5. le unit debbono essere appropriatamente etichettate: letichetta deve riportare, almeno, nome e cognome del paziente, codice sanitario individuale, data e ora del prelievo e la dichiarazione Esclusivamente per Uso Autologo. La conservazione a temperatura ambiente non deve superare le 8 ore. Le unit mantenute a temperatura ambiente dovrebbero essere reinfuse nellordine inverso con il quale sono state raccolte, per apportare il massimo numero di piastrine funzionanti e di fattori della coagulazione nellultima unit che viene trasfusa. Se trascorre un tempo maggiore fra prelievo e reinfusione, il sangue dovrebbe essere conservato in unemoteca a temperatura controllata. Il sangue da una EAN
effettuata con un sistema aperto (per esempio, con una linea venosa centrale o con un catetere arterioso), pu essere conservato sino a 8 ore a temperatura ambiente e sino a 24 ore in unemoteca a temperatura controllata. Politiche, procedure e linee guida sulla EAN debbono essere sviluppate da un gruppo di anestesisti esperti in collaborazione con il personale infermieristico di sala operatoria e con gli specialisti in Medicina Trasfusionale dellospedale 68. Esse comprenderanno le indicazioni per lEAN, le modalit di monitoraggio del paziente, i limiti per il prelievo e la trasfusione del sangue, la tipologia e le quantit dei liquidi di sostituzione (per esempio, rapporto soluzioni cristalloidi/ colloidi), in completa conformit con le linee guida dellAABB. Alcune considerazioni pratiche sono elencate nella Tabella 5.6, mentre i criteri utili per la selezione dei pazienti sono riportati in Tabella 5.7.
Raccolta di sangue intra-operatoria

Con i termini raccolta o recupero di sangue intraoperatorio vengono descritte le tecniche per raccogliere e reinfondere il sangue perso dal paziente durante un intervento chirurgico. Le propriet ossiforetiche delle emazie recuperate sono del tutto simili a quelle di globuli rossi allogenici conservati. La loro sopravvivenza una volta trasfusi quanto meno paragonabile a quella di eritrociti allogenici72. La raccolta intra-operatoria di sangue controindicata quando determinati materiali ad azione procoagulante (per esempio il collagene per uso topico) vengono applicati sul campo chirurgico, perch si pu avere unattivazione sistemica della coagulazione. Il sangue recuperato viene reinfuso molto spesso mediante filtri per microaggregati (40 micron), che vanno utilizzati perch esso pu contenere frammenti di tessuto, microcoaguli o frammenti ossei. Le apparecchiature che prevedono il lavaggio del sangue sono in grado di fornire lequivalente
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Tabella 5.6 - Considerazioni pratiche per lemodiluizione acuta normovolemica (EAN) Deve esserci un medico responsabile del programma di recupero perioperatorio del sangue. Le responsabilit dovrebbero comprendere la conformit agli Standard AABB16, la redazione di linee di indirizzo strategico e di procedure e la loro periodica revisione. I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali dovrebbero partecipare allo sviluppo di politiche e procedure riguardanti i programmi di recupero perioperatorio di sangue. Il sangue raccolto nel perioperatorio non dovrebbe essere trasfuso ad altri pazienti. I metodi per la raccolta e la reinfusione perioperatorie del sangue dovrebbero essere sicuri e asettici, e garantire unesatta identificazione di tutti gli emocomponenti raccolti. Le attrezzature usate dovrebbero essere prive di pirogeni e dotate di un filtro in grado di trattenere particelle potenzialmente pericolose per il ricevente e di impedire unembolia gassosa. Se il sangue viene riscaldato prima della reinfusione, applicare i relativi protocolli. Si dovrebbe mantenere un protocollo scritto di tutte le procedure di raccolta perioperatoria, che comprenda anche la scelta delle soluzioni anticoagulanti e dei fluidi impiegati per la lavorazione del sangue, letichettatura del sangue medesimo e degli emocomponenti, le procedure per prevenire e trattare le reazioni avverse. Tutte le strutture che con regolarit raccolgono il sangue nel perioperatorio dovrebbero mettere in atto programmi di controllo e di assicurazione della qualit. Le procedure scritte dovrebbero comprendere i criteri per definire i parametri di accettabilit delle prestazioni erogate. Si dovrebbero rivedere e conservare le registrazioni dei risultati. I controlli di qualit dovrebbero essere rivolti a verificare sicurezza e qualit del sangue e degli emocomponenti raccolti per il ricevente. Le unit raccolte con EAN dovrebbero essere conservate, prima di iniziare la reinfusione, con una delle seguenti modalit: - a temperatura ambiente per non pi di 8 ore; - fra 1 e 6 C sino a 24 ore, semprech tale conservazione cominci entro 8 ore dallinizio della raccolta. Tabella 5.7 - Criteri per la selezione dei pazienti candidati allEAN 1. Probabilit di essere trasfusi superiore al 10% (cio, necessit di unit di sangue compatibilizzate in base allMSBOS). 2. Emoglobina pre-operatoria pari ad almeno 12 g/dL. 3. Assenza di affezioni coronariche, polmonari, renali o epatiche clinicamente significative. 4. Assenza di unipertensione grave. 5. Assenza di infezioni e di rischio di batteriemia. di 12 unit di sangue allora in un paziente con emorragia massiva72. I dati sugli eventi avversi derivanti dalla reinfusione del sangue da recupero intra-operatorio sono stati oggetto di pubblicazione73. Lembolismo gassoso costituisce un potenziale e grave problema che in 5 anni ha fatto registrare, al dipartimento di Salute Pubblica dello Stato di New York, tre eventi fatali, determinando un rischio globale di eventi fatali pari a uno su 30.00043. Il sangue recuperato pu emolizzarsi se viene aspirato dalla superficie invece che immergendo bene laspiratore stesso nel sangue. Per questo motivo, le linee guida dei produttori delle apparecchiature consigliano un vuoto massimo di 150 torr. Uno studio ha, peraltro,
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riportato che si pu utilizzare, in caso di necessit, una pressione di aspirazione di 300 torr, senza causare eccessiva emolisi74. Limportanza clinica dellemoglobina libera, alle concentrazioni che generalmente si riscontrano, non stata stabilita, bench una sua presenza in eccesso possa indicare un lavaggio inadeguato. Si sono osservate, talvolta, colture batteriche positive dal sangue recuperato; i casi di infezione sono, tuttavia, rari 75. La maggior parte dei programmi di recupero intra-operatorio si avvalgono di apparecchiature che raccolgono il sangue perduto, lo lavano e ne concentrano i globuli rossi. Questa procedura fornisce, tipicamente, unit da 225 mL di emazie concentrate in soluzione salina, con un ematocrito che va dal 50 al 60%. I pazienti presentano un livello plasmatico di emoglobina libera di solito pi alto di quello dovuto a trasfusione di sangue allogenico. Le concentrazioni di sodio e cloruro sono le stesse presenti nelle soluzioni di lavaggio, mentre il livello di potassio basso. Il sangue ritrasfuso contiene pochi fattori della coagulazione e poche piastrine. Studi clinici Come nel caso di DPSA e di EAN, la raccolta e il recupero intra-operatorio di sangue autologo dovrebbero essere sottoposti a verifiche di sicurezza ed efficacia. Alcuni studi controllati in chirurgia cardio-toracica hanno evidenziato risultati contrastanti sullefficacia nel ridurre il fabbisogno trasfusionale e sugli esiti clinici75,76. Se si utilizzano apparecchiature per il recupero che prevedono il lavaggio del sangue, c accordo unanime nel ritenere che, per ottenere un rapporto costo-efficacia favorevole, necessario recuperare almeno due unit di sangue; tuttavia, se si impiegano metodiche meno costose, che non prevedono il lavaggio del sangue, la costoefficacia della procedura pu essere conseguita recuperando una sola unit di sangue77. Lutilit del recupero intra-operatorio stata meglio definita in chirurgia vascolare, come nella protesi di un aneurisma aortico e nella trapiantologia epatica 78 . Tuttavia, una sperimentazione clinica prospettica e
randomizzata79 su recupero intra-operatorio e reinfusione in caso di protesi di aneurismi aortici non ha dimostrato alcun effetto favorevole nel contenere lesposizione al sangue allogenico. Un modello matematico sul recupero intra-operatorio indica che, in presenza di unanemia normovolemica, esso in grado di evitare il ricorso a trasfusioni allogeniche, anche in presenza di perdite ematiche abbondanti (per esempio, da 5 a 10 L)80. Nei pazienti con emorragie maggiori, lutilit di questa metodica dipende da valutazioni di carattere finanziario legate al contenimento dei costi e da valutazioni sullautosufficienza in sangue della Struttura Trasfusionale. Controversie mediche Le apparecchiature di raccolta che non concentrano e non lavano il sangue recuperato aumentano i rischi di effetti sfavorevoli. Il sangue perduto soggetto, a vario grado, a coagulazione/ fibrinolisi ed emolisi, ed descritto che la reinfusione di grandi quantit di sangue da recupero intra-operatorio (lavato e non) pu indurre CID (coagulazione intravascolare disseminata)81. I fattori che possono influenzare lentit di coagulazione e fibrinolisi sono: 1) la scoagulazione del paziente; 2) la quantit e il tipo di anticoagulante impiegato; 3) il grado di contatto fra sangue e superfici sierose; 4) il grado di contatto fra sangue e superfici artificiali; 5) il grado della turbolenza intervenuta durante la raccolta. In generale, il sangue raccolto da pazienti che non sono stati scoagulati, a basso flusso di aspirazione o nel corso di sanguinamenti lenti, andr incontro a coagulazione e fibrinolisi e non contribuir allemostasi dopo reinfusione. Alte pressioni di aspirazione, formazione di schiuma durante laspirazione stessa del sangue, turbolenze o compressioni meccaniche che intervengono nelle pompe ruotanti o nei tubi di plastica inevitabilmente causano una quota di emolisi. Unalta concentrazione di emoglobina libera pu risultare nefrotossica in pazienti con
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funzione renale compromessa. Molti programmi di recupero intra-operatorio mettono un limite definito alla quantit di sangue recuperato che pu essere ritrasfuso senza essere sottoposto a centrifugazione e lavaggio. Considerazioni pratiche Le attivit di recupero intra-operatorio richiedono gli sforzi coordinati di chirurghi, anestesisti, trasfusionisti e di personale specificamente addestrato alluso di queste speciali apparecchiature che comprendono: 1) apparecchi che raccolgono il sangue recuperato e lo reinfondono direttamente; 2) apparecchi che raccolgono il sangue recuperato, lo concentrano e lo lavano in strumenti separati; 3) macchine ad alta velocit, che automaticamente concentrano e lavano il sangue recuperato. Alcuni ospedali sviluppano propri programmi per il recupero intra-operatorio, mentre altri siglano contratti con servizi esterni. Ogni ospedale, in base alle proprie esigenze, dovrebbe stabilire se adottare la pratica del recupero intra-operatorio e come gestirla. Lavorazione prima della reinfusione Molte apparecchiature lavorano automaticamente il sangue recuperato prima di reinfonderlo. Il recupero del sangue avviene mediante laspirazione sottovuoto e la contestuale anticoagulazione. Per limitare lemolisi, il livello del vuoto non dovrebbe superare i 150 torr, bench possono essere, occasionalmente, raggiunti livelli pi alti in caso di emorragie rapide. Come anticoagulanti, si possono impiegare sia la soluzione ACD che leparina. Il sangue viene mantenuto in un reservoir sino alla centrifugazione e al lavaggio con un volume di soluzione salina che varia fra i 500 e i 1.500 mL. Se non immediatamente ritrasfusa, lunit deve essere etichettata con il nome del paziente e il suo codice identificativo, la data e lora dinizio della raccolta e lavvertenza Per esclusivo uso autologo. Un approccio alternativo consiste nel raccogliere il sangue in un contenitore progettato
direttamente per la reinfusione, e concentrare e lavare i globuli rossi recuperati, in un momento successivo, con una apparecchiatura di lavaggio della Struttura Trasfusionale. La gestione delle unit di sangue da recupero intra-operatorio di pertinenza del Servizio Trasfusionale, analogamente ad ogni altra unit autologa. Lunit deve essere ritrasfusa con filtro. Reinfusione diretta Sono disponibili sistemi che raccolgono il sangue recuperato e lo ritrasfondono direttamente. Consistono, generalmente, in un catetere di aspirazione attaccato a una sacca di raccolta monouso o a un contenitore rigido in plastica, ai quali pu essere aggiunto lanticoagulante (ACD o eparina). Il sangue aspirato nel contenitore rigido, prima di essere reinfuso, utilizzando un filtro per microaggregati. Per i sistemi che non prevedono lavaggio, sono da preferirsi unaspirazione a bassa pressione con grado di emolisi pi contenuto possibile. Requisiti e raccomandazioni LAABB richiede che il processo di recupero intra-operatorio contempli lidentificazione del paziente e della sacca di raccolta, la data della raccolta e quella di scadenza 16(p10). Le unit raccolte durante un intervento chirurgico devono essere etichettate con nome e cognome del paziente, con il codice di identificazione ospedaliero, con la data e lora della raccolta, con la data di scadenza e con lavvertenza Per esclusivo uso autologo16(p10). In Tabella 5.8 sono elencate le modalit di conservazione e la relativa scadenza degli emocomponenti raccolti in sala operatoria16(p14). Se il sangue viene allontanato dal paziente per essere lavato e conservato in un luogo distante dalla sala operatoria, devono essere previste procedure che garantiscano letichettatura appropriata delle unit, secondo gli Standard AABB16(pp9,10). Gli ospedali che si avvalgono di programmi di recupero intra-operatorio del sangue dovrebbero redigere linee di indirizzo strategiche e procedure da far regolarmente revisionare da parte del personale medico, cui stata affidata la
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Tabella 5.8 - Gestione, conservazione e scadenze del sangue raccolto nel periodo intra-operatorio Tipo di raccolta Emodiluizione acuta normovolemica T di conservazione Temperatura ambiente 1-6 C Scadenza 8 ore dallinizio della raccolta 24 ore dallinizio della raccolta 4 ore dalla fine della raccolta 24 ore dallinizio della raccolta 4 ore dalla fine della raccolta 6 ore dallinizio della raccolta Condizioni speciali Nessuna La conservazione a 1-6 C dovrebbe iniziare entro 8 ore dallinizio della raccolta Nessuna La conservazione a 1-6 C dovrebbe iniziare entro 4 ore dallinizio della raccolta Nessuna
Recupero intra-operatorio con lavorazione
Temperatura ambiente 1-6 C
Recupero intra-operatorio senza lavorazione Sangue recuperato dopo intervento o dopo traumi con o senza lavorazione Preparazione emocomponenti non eritrocitari
Temperatura ambiente o a 1-6 C Non applicabile
Nessuna
Temperatura ambiente
Dovrebbero essere Nessuna usati prima di lasciare la sala operatoria
responsabilit del programma stesso. Gli specialisti in Medicina Trasfusionale dovrebbero giocare un ruolo attivo nella progettazione, realizzazione e operativit dei programmi di recupero intra-operatorio. Le procedure scritte devono riguardare le corrette modalit di raccolta, etichettatura e conservazione del sangue autologo da recupero intra-operatorio. Le apparecchiature e le tecniche di raccolta e infusione debbono garantire che il sangue si mantenga asettico. La gestione della qualit dovrebbe essere applicata anche alla valutazione dellappropriatezza dellutilizzo del recupero intraoperatorio e delladeguatezza del livello di addestramento del personale dedicato. Viene raccomandato24 limpiego di protocolli scritti, di registrazioni delle procedure, di una corretta manutenzione degli apparecchi, di procedure per la gestione degli eventi avversi, nonch la
documentazione degli stessi.
Raccolta post-operatoria di sangue

Per raccolta post-operatoria di sangue si intende il recupero di sangue dai drenaggi e la successiva reinfusione, con o senza trattamento dello stesso. Secondo alcuni programmi, il sangue perso dopo lintervento viene immesso in contenitori sterili e infuso, attraverso un filtro per microaggregati, senza sottoporlo ad alcuna lavorazione. Questo sangue diluito, parzialmente emolizzato e defibrinato e pu contenere unalta concentrazione di citochine. Per tali motivi, la maggior parte dei programmi fissa un limite massimo del volume (per esempio, 1.400 mL) di sangue non lavorato che pu essere reinfuso. Se la trasfusione di questo sangue non
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inizia entro 6 ore dalla raccolta, deve essere eliminato. Gli ospedali dovrebbero avere linee di indirizzo strategiche e procedure scritte, requisiti per letichettatura, lassicurazione di qualit e le verifiche conformi agli Standard AABB16(p2). Studi clinici Il progresso compiuto dalla cardiochirurgia andato di pari passo con lacquisizione di unampia esperienza in tema di conservazione post-operatoria. La trasfusione di sangue autologo raccolto nel post-operatorio largamente utlizzata, ma non in modo uniforme. Sperimentazioni prospettiche e controllate sono state in disaccordo circa lefficacia del recupero post-operatorio in cardiochirurgia: almeno tre di tali studi82-84 non hanno verificato alcuna validit, ma almeno altri due85,86 hanno messo in luce lefficacia di questa tecnica nel contenere il consumo di sangue allogenico. La diversit di risultati pu, almeno parzialmente, essere spiegata con differenze nella pratica trasfusionale da parte dei medici; queste differenze possono essere infatti state sottostimate negli studi sopra citati. Nel post-operatorio di interventi di chirurgia ortopedica, lefficacia del recupero e della successiva reinfusione di sangue (lavato87 e non lavato88,89) proveniente da drenaggi applicati a pazienti sottoposti a protesi articolari. Gli eritrociti raccolti in questo ambito sembrano avere una normale sopravvivenza in circolo90. Nei pazienti sottoposti a protesi totale di ginocchio non cementata89, il volume del sangue recuperato dai drenaggi e reinfuso raggiunge i 3.000 mL, con una media superiore a 1.100 mL. Dato che il contenuto in eritrociti del liquido recuperato dai drenaggi basso (livello di ematocrito del 20%), la quantit di globuli rossi reinfusi spesso scarsa91. Uno studio prospettico randomizzato92 sul recupero post-operatorio e sulla reinfusione in pazienti sottoposti a protesi totale di ginocchio e di anca non ha rilevato alcuna differenza nel livello perioperatorio di emoglobina o nel numero di trasfusioni allogeniche fra pazienti che hanno (o non hanno) utilizzato sistemi di raccolta dai drenaggi. La sicurezza del sangue reinfuso senza
lavaggio, proveniente da drenaggi applicati per interventi ortopedici, controversa. Sono state manifestate riserve teoriche per linfusione, con il sangue recuperato, di materiali potenzialmente pericolosi, quali emoglobina libera, stromi eritrocitari, grasso del midollo osseo, tossici irritanti, frammenti di tessuto o di metilacrilato, prodotti di degradazione della fibrina, fattori della coagulazione attivati e complemento. Bench due studi limitati93,94 abbiano riferito complicazioni, parecchi studi, pi ampi, non hanno riportato nessun grave effetto sfavorevole quando il sangue da drenaggio viene passato attraverso un filtro standard da 40 88,89,95. Selezione dei pazienti La possibilit di ridurre lesposizione a sangue allogenico in pazienti ortopedici, ai quali viene raccolto sangue (lavato o non) nel periodo postoperatorio, maggiore in quelli sottoposti a protesi totale di ginocchio non cementata, a revisioni di protesi danca o di ginocchio, ad artrodesi di pi vertebre. Come nel caso del recupero intra-operatorio, la perdita di sangue deve essere tale da giustificare i costi addizionali della tecnologia utilizzata96,970. Analogamente a quanto avviene per la selezione dei pazienti che possono trarre beneficio dalla DPSA e dallEAN, possibile identificare prima dellintervento quei pazienti che possono avvalersi del recupero intra e post-operatorio basandosi sulla valutazione delle perdite intraoperatorie previste e del trigger trasfusionale, come illustrato in Figura 5.2.
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Capitolo 6: Aferesi
Capitolo 6
Aferesi
Laferesi, dal greco (sottrazione), implica la rimozione selettiva di costituenti del sangue da donatori o da pazienti. LAABB fornisce Standard1 per conformarsi (volontariamente) alle attivit aferetiche. Anche la Food and Drug Administration (FDA) ha stabilito specifici requisiti, che sono raccolti nel Codice delle Norme Federali2. La Societ Americana per lAferesi (ASFA, American Society for Apheresis)3 ha pubblicato linee guida e raccomandazioni ulteriori. Inoltre, sono disponibili certificati per i praticanti lemaferesi e per i tecnici di aferesi da parte della Direzione del Registro della Societ Americana di Patologia Clinica. Tutto il personale coinvolto in attivit aferetiche dovrebbe avere familiarit con queste documentazioni e dovrebbe possedere, per eseguire aferesi, documenti che ne comprovino laddestramento e lesperienza.
Tecniche di separazione
Per la preparazione di emocomponenti o per le applicazioni terapeutiche dellaferesi vengono usati apparecchi che lavorano, in via automatica, il sangue. Laferesi manuale, dove il sangue viene raccolto in sacche multiple e centrifugato a parte, richiede una grande attenzione per accertarsi che le sacche siano etichettate correttamente e che siano restituite al donatore giusto. Con lattuale tecnologia automatizzata, il metodo manuale utilizzato molto raramente.
Separazione mediante centrifugazione La maggior parte delle apparecchiature utilizza la forza centrifuga per separare gli emocomponenti, in base a differenze di densit. Una quantit controllata di soluzione anticoagulante viene aggiunta al sangue intero al momento della raccolta da un donatore o da un paziente. Il sangue viene spinto entro una campana rotante o entro una camera o un rotore tubolare, dove i componenti si depositano in base alla loro densit. Si separa la frazione che interessa, mentre i componenti restanti sono restituiti al donatore (o al paziente), con sistemi a flusso continuo o discontinuo (intermittente). Tutti i sistemi richiedono set preconfezionati e monouso di sacche sterili e di tubi, nonch dispositivi per la centrifugazione dedicati allo strumento. Ogni sistema ha un meccanismo che permette al dispositivo di separazione di ruotare senza attorcigliare i tubi. Negli apparati che utilizzano il metodo a flusso discontinuo il contenitore rotante viene, alternativamente, riempito e svuotato. La maggior parte delle apparecchiature usate attualmente impiega il metodo che comporta un flusso continuo del sangue in una camera di separazione. In rapporto al metodo e agli apparecchi utilizzati, il tempo per una procedura di aferesi pu variare da 30 minuti a diverse ore. Ogni produttore fornisce informazioni dettagliate e protocolli dimpiego. Ogni struttura deve avere, in un manuale prontamente disponibile a infermieri e tecnici, una
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descrizione dettagliata di ciascun tipo di procedura attuata, specifica per ciascun tipo di apparecchiatura. Separazione per assorbimento Una rimozione selettiva di materiale patologico presenta teorici vantaggi su quella di separazione di tutti i costituenti plasmatici. Le apparecchiature che centrifugano possono essere adattate a protocolli in grado di rimuovere, selezionandoli, specifici costituenti plasmatici solubili, sfruttando i principi della cromatografia di affinit5. La rimozione di lipoproteine a bassa densit (LDL) in pazienti con ipercolesterolemia familiare stata realizzata sia impiegando limmunoaffinit (anticorpi anti-LDL) sia colonne di affinit chimica (per esempio, di destrano solfato)6. Altre sostanze assorbenti, quali la proteina A stafilococcica, anticorpi monoclonali, sostanze gruppoematiche specifiche, DNA di collodio, polimeri con attaccate IgG, possono estrarre anticorpi, antigeni proteici, immunocomplessi. Il restituire il plasma depleto insieme ai componenti cellulari del sangue riduce o elimina la necessit di ricorrere alla restituzione di liquidi. Lassorbimento immune pu essere effettuato in linea o il plasma pu essere separato dai componenti cellulari del sangue, fatto passare attraverso colonne fuori linea e, quindi, reinfuso.
Piastrinoaferesi Le piastrinoaferesi sono impiegate per ottenere piastrine da donatori volontari, da familiari dei pazienti, da donatori compatibili con il paziente per gli antigeni HLA o per quelli specifici delle piastrine. Dato che con laferesi si possono ottenere molte piastrine, questo tipo di raccolta fa diminuire il numero dei donatori ai quali il paziente viene esposto. Gli Standard AABB richiedono che il concentrato piastrinico contenga almeno 3x1011 piastrine nel 90% delle unit controllate1(p31). Quando la raccolta maggiore, lunit originale pu essere suddivisa in unit multiple, ciascuna delle quali deve conformarsi, di per s, ai requisiti minimi richiesti. Alcuni apparecchi sono in grado di calcolare la raccolta in base allematocrito del donatore, alla sua conta piastrinica, allaltezza e al peso. Per i pazienti immunizzati, refrattari a piastrine allogeniche scelte a caso (vedi Capitoli 16 e 21), luso di donatori, selezionati in base a prove di compatibilit per gli antigeni specifici delle piastrine o per gli antigeni HLA, pu rappresentare lunico mezzo per ottenere un soddisfacente incremento post-trasfusionale nel numero delle piastrine. Limpiego delle piastrinoaferesi negli Stati Uniti fortemente aumentato negli ultimi 25 anni. Si stima, attualmente, che il 75% delle unit terapeutiche di piastrine provenga da piastrinoaferesi produttive7. Selezione e monitoraggio dei donatori I donatori di piastrine in aferesi possono donare pi frequentemente di quelli di sangue intero, ma devono soddisfare criteri differenti. Lintervallo fra due donazioni dovrebbe essere di almeno due giorni e i donatori non dovrebbero essere sottoposti a piastrinoaferesi pi di 2 volte in una settimana e a non pi di 24 volte in un anno1(pp19,20). Se il volontario dona sangue intero o se risulta impossibile restituirgli i propri globuli rossi durante la piastrinoaferesi, devono trascorrere almeno 8 settimane prima di unulteriore piastrinoaferesi, a meno che il volume extracorporeo eritrocitario sia minore di 100 mL1(p20). Possono essere raccolte piastrine anche da donatori che non soddisfino
Raccolta di emocomponenti
Si tratta delle aferesi produttive. Ogni qualvolta si raccolgono emocomponenti a fini trasfusionali, il donatore deve dare un consenso informato. Sebbene, in aferesi, la raccolta e le procedure di lavorazione siano diverse da quelle utilizzate per la preparazione di emocomponenti da sangue intero, le condizioni di conservazione, i requisiti per il trasporto e alcuni controlli di qualit sono gli stessi. Per informazioni pi dettagliate, vedi il Capitolo 8. La struttura deve possedere protocolli scritti per tutte le procedure impiegate e deve conservare la registrazione di ogni procedura, secondo quanto richiesto dagli Standard AABB per i Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali1(p2).
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Capitolo 6: Aferesi
questi requisiti, qualora il prodotto sia di particolare valore per uno specifico ricevente (per esempio, nel caso di donatore HLA-compatibile) e se il curante certifica, per iscritto, che la salute del donatore non verr compromessa. Le piastrinaferesi da donatori che hanno assunto, entro 36 ore dalla raccolta, farmaci contenenti aspirina sono, in genere, differite, considerato che le piastrine ottenute con laferesi possono essere lunico sostegno piastrinico per un paziente. Le reazioni vaso-vagali o ipovolemiche sono rare nei donatori, mentre sono comuni quelle al citrato, come parestesie e simili (vedi oltre). Le reazioni severe sono meno frequenti tra i donatori di piastrine in aferesi, che fra i donatori di sangue intero. I donatori di piastrine in aferesi dovrebbero soddisfare i requisiti dei comuni donatori di sangue, ivi compresi i valori di emoglobina ed ematocrito. Non richiesto un conteggio delle piastrine anteriormente alla prima raccolta o se sono trascorse 4 (o pi) settimane dallultima procedura. Se lintervallo minore, il donatore deve avere una conta superiore a 150.000/L, prima di essere sottoposto a unulteriore raccolta. Gli Standard AABB permettono di documentare il conteggio piastrinico da un campione raccolto immediatamente prima della procedura o da un campione ottenuto prima o dopo la precedente procedura1(p21). Le eccezioni a questi controlli di laboratorio devono essere approvate, per iscritto, dal medico responsabile dellaferesi. La FDA specifica che il volume totale del plasma raccolto non deve essere superiore a 500 mL (o anche 600 se il peso del donatore supera gli 80 kg)8. Il conteggio delle piastrine di ogni unit deve essere registrato e conservato, ma non necessario che sia scritto sulletichetta del prodotto8. Alcuni programmi di piastrinoaferesi raccolgono anche, in una sacca separata, plasma (da usarsi come plasma fresco congelato o PFC) durante la procedura. Le tecniche aferetiche possono essere impiegate per raccogliere plasma senza piastrine: si tratta della plasmaferesi. La FDA fornisce indirizzi sulle quantit di plasma che si possono raccogliere con le strumentazioni
automatiche 9 . La determinazione della proteinemia totale e di IgG e IgM (o unelettroforesi sierica delle proteine) devono essere effettuate, ad intervalli di 4 mesi, su quei donatori sottoposti a raccolte di grandi quantit di plasma, qualora il volume annuale di plasma raccolto superi i 12 litri (14,4 L, se il peso del donatore superiore a 80 kg) o se il donatore sottoposto a frequenti raccolte di plasma (pi spesso di ogni 4 settimane)10. Gli Standard AABB richiedono che, in qualsiasi momento, il deficit nella volemia del donatore debba essere minore di 10,5 mL per kg di peso1(p24). Test di laboratorio Il Centro di Raccolta deve eseguire la tipizzazione ABO ed Rh, la ricerca di anticorpi irregolari e quella dei marcatori di malattie trasmissibili con la trasfusione, come avviene per tutti gli altri emocomponenti. Ogni unit deve essere analizzata, a meno che il donatore non sia sottoposto a ripetute raccolte per il supporto di uno specifico paziente, nel qual caso le analisi per i marcatori necessitano di essere ripetute soltanto ogni 30 giorni1(p34). Se un prodotto contiene eritrociti visibili, se ne deve determinare lematocrito. La FDA richiede che, se lunit contiene pi di 2 mL di emazie, al contenitore deve essere attaccato un campione di sangue del donatore per le prove di compatibilit 8 . In alcuni casi, pu essere desiderabile che il plasma sia ABO-compatibile con i globuli rossi del ricevente, se questi un bambino o un paziente che ha subito un trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche ABO-incompatibili. Per essere ritenute leuco-ridotte, le unit di piastrine da aferesi devono contenere meno di 5x106 leucociti e devono essere conformi alle specifiche indicate dal produttore delle apparecchiature. Il Capitolo 8 riporta ulteriori misure per i controlli di qualit da condurre su tutti i componenti piastrinici. Registrazioni Per ogni procedura si devono conservare registrazioni complete (vedi Capitolo 1). Si devono documentare tutte le reazioni, insieme ai risultati
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delle indagini e dei controlli eseguiti nel tempo. Le registrazioni di ogni risultato di laboratorio e dei dati delle raccolte devono essere periodicamente revisionate da un medico esperto e trovate entro limiti accettabili. La FDA richiede che tali revisioni siano effettuate ogni 4 mesi8. Le strutture di raccolta devono avere in atto politiche e procedure, per assicurarsi che la perdita di globuli rossi da parte del donatore, per ogni procedura, non ecceda i limiti accettabili. Plasmaferesi Laferesi pu essere impiegata per raccogliere plasma, sotto forma di plasma fresco congelato o plasma source per le successive derivazioni. I requisiti FDA per la raccolta di plasma differiscono da quelli relativi al sangue intero o alla piastrinoaferesi. Il personale adibito alle plasmaferesi deve avere buona conoscenza degli Standard AABB e dei requisiti FDA. Se il plasma destinato alla terapia trasfusionale, gli esami di controllo sono gli stessi dei componenti eritrocitari. Il plasma raccolto per la derivazione soggetto a requisiti differenti per quanto riguarda i test sulle malattie infettive. necessario fare una distinzione fra le plasmaferesi occasionali, dove il donatore si sottopone alla plasmaferesi non pi di una volta ogni 4 settimane e le plasmaferesi intensive, dove la donazione pi frequente di una ogni 4 settimane. Per il primo tipo di plasmaferesi, la selezione del donatore e il suo monitoraggio sono gli stessi relativi alla donazione di sangue intero, mentre per le plasmaferesi intensive, effettuate sia con metodiche automatiche sia manuali, si devono applicare i principi illustrati qui di seguito: 1. i donatori devono dare un consenso informato. Devono essere sorvegliati attentamente durante la procedura e deve esserci disponibile un servizio medico di emergenza; 2. le perdite di globuli rossi legate alle procedure, ivi comprese quelle relative ai campioni prelevati per gli esami, non devono superare i 25 mL per settimana, in modo che, in 8 settimane, non si siano asportati pi di 200 mL. Se i globuli rossi non possono essere restituiti al donatore durante la plasmaferesi,
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una raccolta in aferesi o una donazione di sangue intero devono essere posposte di 8 settimane; se la plasmaferesi manuale, deve esistere un sistema per assicurare la reinfusione delle emazie autologhe. Prima che la sacca contenente sangue sia separata dal donatore, ci dovrebbero essere due metodiche di identificazione, disgiunte e indipendenti, cos che entrambi, donatore e prelevatore, possono accertarsi che il contenuto della sacca veramente quello del donatore. La firma del donatore sulla sacca , spesso, uno dei metodi di identificazione, insieme con un numero unico di donazione; nelle procedure manuali, effettuate in donatori che pesano fra 50 e 80 kg, non si dovrebbe sottrarre una quantit di sangue intero superiore a 500 mL per volta o 1.000 mL durante lintera seduta o in un periodo di 48 ore. I limiti per donatori di peso superiore a 80 kg sono di 600 mL e 1.200 mL, rispettivamente. Per le procedure automatiche, il limite stato stabilito dalla FDA9, per ogni tipo di strumento; devono passare almeno 48 ore fra due successive procedure; di norma, i donatori non dovrebbero essere sottoposti a pi di due procedure nellarco di 7 giorni. Sono consentite eccezioni, nel caso che il plasma abbia un particolare valore terapeutico per un determinato ricevente; prima di iniziare il programma di plasmaferesi e, poi, a intervalli di 4 mesi, ai donatori sottoposti a plasmaferesi pi spesso di una volta ogni 4 settimane, devono essere eseguiti test per le proteine totali, lelettroforesi per le proteine sieriche o il controllo quantitativo delle immunoglobuline. I risultati devono rientrare nei limiti di norma2; responsabile del programma deve essere un medico esperto in tutti gli aspetti dellemaferesi.
Eritroaferesi Sia gli Standard AABB sia i requisiti approvati dalla FDA prendono in considerazione la raccolta
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Capitolo 6: Aferesi
di due unit di concentrati eritrocitari allogenici o autologhi ogni 16 settimane, utilizzando leritroaferesi automatica. Linfusione di soluzioni saline si utilizza per minimizzare lipovolemia e questo procedimento viene limitato alle persone di maggiore corporatura e con ematocrito pi alto dei limiti minimi attualmente richiesti per donazioni di sangue intero (cio, per i maschi: peso 59 kg, altezza 1,55 cm; per le femmine: peso 68 kg, altezza 1,65 cm; valori di ematocrito pari al 40% in entrambi i sessi). Granulocitoaferesi Sono controverse le indicazioni per la trasfusione di concentrati granulocitari; vedi Capitolo 21. Una meta-analisi di studi controllati e randomizzati relativi allimpiego di concentrati granulocitari indica che la loro efficacia dipende da dosi adeguate (maggiori di 1x10 10 granulociti/giorno) e da prove di compatibilit negative (il ricevente non ha anticorpi contro gli antigeni dei granulociti)12. Linteresse sulla terapia con concentrati granulocitari, in adulti, si sta rinnovando, in quanto possibile ottenere forti dosi di cellule da donatori che siano stati pretrattati con fattori di crescita12. Qualche successo si ottenuto nel trattamento di bambini settici, forse perch la dose in granulociti abbondante per questi piccoli riceventi e perch assente unalloimmunizzazione anti-HLA. Somministrazione di farmaci per leucoaferesi Per ottenere un effetto terapeutico, necessario somministrare una dose giornaliera di granulociti pari a 1x1010 cellule. Un raccolta di tanti granulociti richiede la somministrazione al donatore di farmaci (o di altri mezzi adiuvanti). Il modulo di consenso del donatore dovrebbe includere il permesso specifico per ogni tipo di farmaco o per luso di agenti sedimentanti. Amido idrossietile . Un semplice agente sedimentante, lamido idrossietile (HES), causa laggregazione dei globuli rossi e, quindi, una maggiore sedimentazione. Gli agenti sedimentanti aumentano la raccolta di granulociti e determinano una presenza minima di eritrociti nei concentrati
granulocitari. Dato che lHES si pu rinvenire nel circolo del donatore anche dopo un anno dallinfusione, gli Standard AABB richiedono alle strutture che eseguono raccolte di concentrati granulocitari di avere un sistema di controllo della dose cumulativa massima di ogni agente sedimentante somministrato al donatore in un dato periodo di tempo1(p24). LHES un colloide, agisce come plasma-expander e i donatori, cui stato somministrato, possono accusare cefalee o edemi per una maggiore volemia. Corticosteroidi . I corticosteroidi possono raddoppiare il numero dei granulociti circolanti, mobilizzandoli dal pool marginale. Un protocollo che utilizzi, prima della donazione, 60 mg di prednisone per os, in dose unica o suddivisa, determina una maggiore raccolta di granulociti, con minima attivit sistemica steroidea 16. In alternativa, si possono impiegare 8 mg di desametasone per os. Prima che gli vengano somministrati steroidi, il donatore dovrebbe essere interrogato sullanamnesi o su sintomatologie riferibili a ipertensione, diabete, cataratta17 o ulcera peptica. Fattori di crescita . Fattori di crescita ematopoietica ricombinanti, in particolare il fattore di crescita che stimola la formazione di colonie granulocitarie o G-CSF (Granulocyte - Colony Stimulating Factor), possono accrescere efficacemente la raccolta di granulociti. Questi fattori, da soli, possono permettere una raccolta da 4 a 8x1010 granulociti per singola procedura aferetica 13. La dose di G-CSF usualmente impiegata va da 5 a 10 g/kg, somministrata da 8 a 12 ore prima della raccolta 18 . Evidenze preliminari indicano che il recupero in vivo e la sopravvivenza di questi granulociti sono eccellenti e che i fattori di crescita sono ben tollerati dai donatori13. Esami di laboratorio Sono richiesti: la determinazione ABO ed Rh, la ricerca di alloanticorpi irregolari e quella dei marcatori di malattie infettive, eseguite su un campione prelevato al donatore al momento della raccolta. inevitabile un certo contenuto di eritrociti nei concentrati granulocitari. I globuli rossi
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dovrebbero essere ABO-compatibili con il plasma del ricevente e, se la loro quantit maggiore di 2 mL, i concentrati granulocitari dovrebbero essere sottoposti a prove pre-trasfusionali di compatibilit. In teoria, i pazienti D negativi dovrebbero ricevere concentrati granulocitari provenienti da donatori D negativi. Nei pazienti immunizzati, viene raccomandato la compatibilit HLA. Conservazione e trasfusione Poich la funzione granulocitaria si deteriora con la conservazione, i concentrati granulocitari dovrebbero essere trasfusi entro il pi breve tempo possibile dalla loro preparazione. Gli Standard AABB prescrivono una conservazione a temperatura compresa fra 20 e 24 C, per non pi di 24 ore 1(p57). Forse non necessario mantenerli in agitazione. La loro irradiazione richiesta per riceventi immunodeficienti e potrebbe essere raccomandabile per quasi tutti i pazienti, in rapporto alla loro malattia di base. controindicato somministrarli con filtri per microaggregati o per leucodeplezione. Raccolta di cellule staminali ematopoietiche La raccolta di progenitori ematopoietici utile per ottenere cellule staminali ematopoietiche (CSE) per la ricostituzione del midollo osseo di pazienti affetti da neoplasie, leucemie in remissione e vari tipi di linfomi (vedi Capitolo 25). Tale tipo di procedura pu anche essere impiegata per raccogliere i linfociti del donatore specifico (realizzando la cosiddetta DLI, Donor Lymphocyte Infusion) quale immunoterapia nei riceventi un trapianto di cellule staminali ematopoietiche (vedi capitolo 25). LAABB ha pubblicato gli Standard per i Servizi che effettuano terapie cellulari 18. Ulteriori informazioni in argomento sono rinvenibili al Capitolo 25.
rimpiazzarli con plasma normale, soluzioni cristalloidi o colloidi (di HES o di albumina). Il termine aferesi terapeutica viene usato per indicare la procedura in generale, mentre quello di scambio plasmatico terapeutico (Therapeutic Plasmaexchange o TPE) impiegato per designare le procedure, il cui scopo essenzialmente quello di rimuovere plasma, indipendentemente dalle varie soluzioni di reintegro volemico utilizzate. La base teorica dellaferesi terapeutica quella di diminuire, nel paziente, il carico di sostanze patologiche a livelli tali da consentire interventi che permettano miglioramenti clinici. In alcune condizioni, la sostituzione con plasma normale finalizzata a fornire una sostanza assente. Se non esiste necessit di rimpiazzare i costituenti plasmatici, si dovrebbero usare soluzioni colloidali o fisiologica, quali fluidi di reintegro. Altri possibili impieghi dellaferesi terapeutica riguardano: alterazioni del rapporto antigeni-anticorpi, modifiche nei mediatori infiammatori o immunologici, eliminazione di immunocomplessi. Alcuni benefici, percepiti dal paziente, possono essere dovuti anche a un effetto placebo. Nonostante molte difficolt nelle documentazioni, vi un accordo generale che laferesi terapeutica sia un trattamento efficace delle condizioni patologiche elencate nella Tabella 6.1, limitatamente alle Categorie I e II3,20-23. Considerazioni generali Un uso appropriato dellaferesi terapeutica richiede conoscenze mediche consistenti e buone capacit di giudizio. Il paziente deve essere valutato dal suo curante e dal medico addetto allaferesi. importante uno stretto scambio di pareri fra questi due medici, in particolare: nel caso di pazienti pediatrici o molto anziani, se gli accessi venosi sono difficili, se esiste instabilit cardio-vascolare, se vi sono condizioni, per le quali gli effetti benefici dellaferesi sono incerti. Il giudizio finale circa la appropriatezza della procedura e lidoneit del paziente dovrebbe essere emesso dal medico addetto alle aferesi (vedi Tabella 6.1)3,20-22. Quando viene prevista una aferesi terapeutica,
Aferesi terapeutiche
Laferesi terapeutica stata impiegata per curare svariate malattie. Si possono rimuovere dal circolo cellule, plasma o costituenti plasmatici e
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Capitolo 6: Aferesi
Tabella 6.1 - Categorie delle indicazioni per le aferesi terapeutiche2 Malattie Malattie renali e metaboliche Anticorpi contro la membrana basale del glomerulo Glomerulonefrite rapidamente progrediente Sindrome emolitico-uremica (SEU) Trapianto renale: Rigetto Sensibilizzazione Glomerulosclerosi focale ricorrente Rigetto di trapianto cardiaco Scompenso epatico acuto Ipercolesterolemia familiare Overdose di droga o avvelenamenti Malattia da deposito di acido fitanico (Malattia di Refsum) Malattie autoimmuni e reumatiche Crioglobulinemia Porpora trombotica trombocitopenica (PTT) idiopatica Fenomeno di Raynaud Vasculite Malattia emolitica autoimmune Artrite reumatoide Tipo di procedura Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Fotoaferesi Plasmaexchange Assorbimento selettivo Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Categoria I II III IV III III III III II I II III I
Sclerodermia o sclerosi sistemica progressiva Lupus eritematoso sistemico Nefrite lupica Psoriasi Malattie ematologiche Trapianto ABO-incompatibile di CSE Eritremia o policitemia vera Leucocitosi e trombocitosi (piastrinosi) Porpora trombotica trombocitopenica (PTT) Porpora post-trasfusionale Drepanocitosi Mieloma, presenza di paraproteine, iperviscosit Mieloma o scompenso renale acuto
Plasmaexchange Immunoassorbimento Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Immunoassorbimento Linfoplasmaferesi Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Rimozione eritrociti dalle CSE Plasmaexchange (nel ricevente) Salasso Eritrocitoaferesi Citoaferesi Plasmaexchange Plasmaexchange Eritroexchange Plasmaexchange Plasmaexchange
II II III III III II II IV III III IV IV I II I II I I I I II II

(segue)
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Malattie Inibitori dei fattori della coagulazione Anemia aplastica o aplasia eritrocitaria pura Linfoma cutaneo a cellule T Malattia emolitica del feto e del neonato Alloimmunizzazione e refrattariet piastrinica Malaria o babesiosi AIDS Malattie neurologiche Poliradicolopatia diemilinizzante infiammatoria cronica Sindrome miastenica di Lambert-Eaton Sclerosi multipla in recidiva progressiva Miastenia gravis Malattia demielinizzante infiammatoria acuta del sistema nervoso centrale Sindromi neurologiche paraneoplastiche Polineuropatia diemielinizzante con IgG e IgA Corea di Sydenham (corea minor) Polineuropatia con IgM (con o senza Waldestrm) Crioglobulinemia con polineuropatia Mieloma multiplo con polineuropatia Sindrome POEMS Amiloidosi sistemica Polimiosite o dermatomiosite Miosite a corpi inclusi Encefalite di Rasmussen Sindrome della persona rigida (stiff-person) PANDAS Sclerosi laterale amiotrofica
Tipo di procedura Plasmaexchange Plasmaexchange Fotoaferesi Leucoaferesi Plasmaexchange Plasmaexchange Immunoassorbimento Eritroexchange Plasmaexchange
Categoria II III I III III III III III IV
Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Linfocitoaferesi Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Immunoassorbimento Plasmaexchange Immunoassorbimento Plasmaexchange Plasmaexchange Immunoassorbimento Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Leucoaferesi Plasmaexchange Leucoaferesi Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange Plasmaexchange
I II III III III I II III III I III II II III II III III IV III IV III IV III III II IV
POEMS = polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gammopatia monoclonale e lesioni cutanee. PANDAS = Disordini neuropsichiatrici infantili autoimmuni. Categoria I = terapia standard accettabile; Categoria II = sufficienti evidenze ne suggeriscono lefficacia solitamente come terapia supplementare; Categoria III = evidenze non conclusive di efficacia e bilancio costi/benefici incerto; Categoria IV = nessuna efficacia in studi controllati.
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gli addetti alla cura del paziente dovrebbero pianificare il trattamento e stabilirne lo scopo. Il punto darrivo dovrebbe essere un accordo sugli obiettivi o sulla durata predeterminata del trattamento. utile documentare questi scopi, reciprocamente accettati, sulla cartella clinica del paziente. Al paziente dovrebbero essere illustrati, da parte di persona informata, la natura del procedimento, gli effetti benefici attesi, i possibili rischi e le alternative disponibili. Si dovrebbe documentare il consenso del paziente. Laferesi dovrebbe essere eseguita in un ambiente dove esiste facile accesso a trattamenti di eventi inattesi, con strumenti, medicinali e personale esperto nel gestire reazioni particolarmente gravi. Accessi vascolari Per la maggioranza dei pazienti adulti e che necessitano di poche procedure, le vene anticubitali sono adatte per rimuovere e restituire il sangue. In adulti gravemente ammalati o nei bambini vengono usualmente impiegati cateteri venosi centrali o periferici a permanenza. Particolarmente efficaci sono i cateteri a parete
rigida, a largo calibro e a doppia via, da inserire nelle vene: succlavia, femorale o giugulare interna. I cateteri del tipo usato nelle emodialisi permettono sia la rimozione sia la restituzione del sangue a unalta velocit. I cateteri centrali possono essere mantenuti in situ per settimane, qualora siano necessarie ripetute procedure. Quando si presume di effettuare aferesi a lungo termine, si possono utilizzare cateteri tunnellizzati (parzialmente impiantati). Rimozione di sostanze patologiche Con il TPE, si rimuove plasma che contiene sostanze patologiche e si infondono soluzioni per reintegrare la volemia. Lefficienza, con la quale il materiale viene rimosso, si pu valutare calcolando il volume plasmatico del paziente e usando la Figura 6.1. La stima dipende dai seguenti presupposti : 1) la volemia del paziente non cambia, 2) lo scambio avviene immediatamente e 3) la produzione o la mobilizzazione del materiale patologico da rimuovere relativamente bassa nei tempi della procedura. Come si pu vedere dalla Figura 6.1, la rimozione massima allinizio e diminuisce progressivamente durante il TPE.
Volume di plasma rimpiazzato Figura 6.1 - Relazione fra il volume di plasma scambiato e quantitativo rimasto di plasma originale del paziente
Percentuale di rimozione
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Frazione restante
Lo scambio limitato, di norma, a 1-1,5 volte il volume plasmatico o, approssimativamente, da 40 a 60 mL di plasma scambiato per kg di peso corporeo nei pazienti con ematocrito normale e corporatura media. Tutto ci rende massima lefficienza della procedura, ma potrebbe anche rendere necessaria una sua ripetizione. Raramente i volumi di plasma scambiato in corso della procedura sono due o pi volte tanto il volume plasmatico. Bench maggiori volumi scambiati determinano una diminuzione iniziale maggiore del materiale patologico, complessivamente la procedura risulta meno efficace, richiedendo anche tempi pi lunghi. Gli scambi di grandi volumi possono comportare un aumento del rischio di coagulopatie, di tossicit da citrato, di squilibrio elettrolitico dipendente dai liquidi di sostituzione. Landamento con il quale la sostanza patologica sintetizzata e distribuita fra il comparto intravascolare e quello extravascolare influenza lesito del TPE. Per esempio, le IgM patologiche, proprie della macroglobulinemia di Waldestrm, sono sintetizzate lentamente e restano quasi tutte (circa al 75%) nel comparto intravascolare, rendendo lo scambio particolarmente efficace23. Per di pi, un cambiamento relativamente piccolo nella concentrazione intravascolare delle proteine pu causare una modifica sostanziale nella viscosit ematica. Al contrario, non hanno avuto successo i tentativi di prevenire lidrope fetale con TPE intensivi, condotti per abbassare il livello degli anticorpi anti-D materni. Ci dovuto, almeno in parte, al fatto che le IgG sono, per il 55%, nel comparto extravascolare. Inoltre, un rapido calo delle IgG pu causare, di rimbalzo, un loro celere aumento, con una risalita sopra il livello precedente24. Una sintesi reattiva di rimbalzo pu anche complicare il trattamento con TPE di malattie autoimmuni. Per attenuare la risposta autoanticorpale reattiva al TPE, si possono somministrare sostanze immunosoppressive, quali la ciclofosfamide, lazatioprina o il prednisone. Il plasma rimosso durante un TPE dovrebbe essere maneggiato attentamente e appropriatamente eliminato. Questo plasma non
pu essere impiegato per plasmaderivati da trasfondere.
preparare
Rimozione di normali costituenti del plasma Quando la quantit di plasma rimosso durante un TPE supera una volta e mezzo il volume plasmatico, si devono osservare ritmi differenti per la rimozione e la ricostituzione dei differenti costituenti25. Nel caso del fibrinogeno, del C3 (terzo componente del complemento) e di immunocomplessi, dopo una procedura che interessi 1,5 volte il volume plasmatico, viene rimossa una quota che va dal 75 all85% della sostanza originale. I livelli pre-trattamento sono ricostituiti in 3-4 giorni. Le concentrazioni degli elettroliti, dellacido urico, del fattore VIII (FVIII) e di altre proteine sono meno influenzate dal trattamento. Generalmente interviene un diminuzione del 10% (o maggiore) nella conta piastrinica, con la necessit che intercorrano da 2 a 4 giorni per ristabilire i valori pre-TPE26. I fattori della coagulazione, a eccezione del fibrinogeno, ritornano ai valori precedenti entro 24 ore. La rimozione di immunoglobuline riguarda circa il 65% del volume plasmatico, ma i tempi di recupero variano, per le diverse classi, in rapporto alla loro distribuzione intravascolare e ai tempi di risintesi (la Tabella 11.3 descrive le caratteristiche delle immunoglobuline). Il livello delle IgG ritorna (approssimativamente) al 60% dei valori pre-TPE entro 48 ore, in relazione al riequilibrio proteico nel comparto extravascolare. Questi dati sono importanti quando si programma la frequenza delle TPE. Le aferesi effettuate una volta la settimana permettono un pi completo recupero dei normali costituenti del plasma, mentre procedure quotidiane possono causare la diminuzione di molti costituenti normali (oltre a quella delle sostanze anormali). Da considerare, inoltre, che aferesi intensive riducono la concentrazione di costituenti plasmatici utili a fini diagnostici, cos che il sangue per gli esami dovrebbe essere prelevato prime dei TPE. Fluidi di sostituzione Le soluzioni di reintegro della volemia che abbiamo a disposizione comprendono: cristalloidi,
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Capitolo 6: Aferesi
albumina, plasma (plasma fresco congelato, plasma deprivato di crioprecipitato, plasma congelato entro 48 ore dalla raccolta), HES27. La Tabella 6.2 illustra vantaggi e svantaggi di queste soluzioni. Spesso tali soluzioni si usano combinate fra loro e le relative proporzioni saranno determinate dal medico, in base alla malattia del paziente, alla sua situazione clinica, alla programmata frequenza e ai costi delle procedure. Il trattamento di condizioni che mettono in pericolo la vita richiede una serie di aferesi quotidiane che determinano, spesso, una riduzione significativa dei fattori della coagulazione. Il monitoraggio della conta piastrinica, del tempo di protrombina, del tempo di tromboplastina parziale attivata e dei livelli di fibrinogeno aiutano a determinare la necessit di fornire piastrine, plasma o crioprecipitati. Dato che il plasma contiene citrato, impiegarlo pu determinare un aumento del rischio di reazioni legate alla sua tossicit. Complicazioni Con unaccurata selezione dei pazienti e con particolare attenzione ai dettagli tecnici, la Tabella 6.2 - Confronti fra le soluzioni di sostituzione Soluzioni Cristalloidi Vantaggi Basso costo Ipo-allergici Nessun rischio virale
maggiore parte dei TPE non comporta complicazioni. Un ampio studio ha riportato28 che le reazioni sfavorevoli intervengono nel 4% dei pazienti trattati. Spesso, tuttavia, i TPE sono richiesti per pazienti gravemente malati e, quindi, a rischio di diverse complicazioni. Accessi vascolari. I pazienti che necessitano di essere sottoposti a TPE hanno spesso subito numerose venipunture, che rendono difficile il reperimento di accessi vascolari. Si deve, quindi, ricorrere frequentemente a speciali accessi venosi, quali cateteri a permanenza del tipo a doppia via (per aferesi o dialisi). I cateteri possono causare ulteriori danni ai vasi, con rischio di trombosi. Meno frequentemente, si possono determinare complicazioni pi gravi, quali pneumotorace o perforazione del cuore o di grossi vasi28. Altre complicanze riguardano: lesioni di arterie, ematomi profondi, formazione di fistole artero-venose. Spesso, la permanenza a lungo termine di cateteri determina proliferazioni batteriche e relative sepsi, specialmente nei pazienti che hanno ricevuto steroidi o farmaci immunosoppressori. Laccidentale distacco del
Svantaggi Richiedono 2-3 volumi Ipo-oncotici Non hanno fattori della coagulazione Non hanno immunoglobuline Alto costo Non ha fattori della coagulazione Non ha immunoglobuline Non ha fattori della coagulazione Residui di HES a lungo termine Controindicato negli scompensi renali Pu causare coagulopatie Rischio di trasmissione di virus Sovraccarico di citrato Rischio di incompatibilit ABO Rischio di reazioni allergiche Rischio di sensibilizzaione
Albumina
Iso-oncotica Non contamina i mediatori infiammatori Nessun rischio virale Modico costo Iso-oncotico Non contamina i mediatori infiammatori Mantiene i normali livelli di: immunoglobuline complemento antitrombina altre proteine
HES
Plasma
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catetere pu provocare emorragie ed emboli gassosi. Alterazioni nella farmacodinamica. Il TPE pu causare un abbassamento del livello ematico dei farmaci, specialmente di quelli che legano lalbumina. La procedura riduce il livello plasmatico di antibiotici e di anticonvulsivanti, ma sono disponibili pochi dati clinici relativi allesito infausto per il paziente associato a una diminuzione del livello dei farmaci. Ciononostante, si dovrebbe prendere in considerazione, prima di iniziare il TPE, la farmacocinetica di tutte le medicine assunte dal paziente e, se necessario, aggiustarne la posologia. prudente non dare farmaci, la cui somministrazione sia prevista durante o fino a unora prima dellaferesi e sino al termine della procedura. La rimozione della colinesterasi dal plasma pu complicare la terapia con agenti paralizzanti, quali la succinilcolina, nel periodo che segue immediatamente laferesi. Ipocalcemia. La maggioranza di pazienti e donatori con paratiroidi e fegato normalmente funzionanti mantiene una normale omeostasi del calcio durante laferesi. Ciononostante, i sintomi di ipocalcemia, legata alla tossicit da citrato, rappresentano la pi comune delle reazioni che intervengono nel 3% del TPE, secondo uno studio su unampia casistica28. I sintomi di un ridotto livello plasmatico di calcio (parestesie peri-orali, formicolii, senso di vibrazioni) riflettono il ritmo con il quale il citrato rimesso in circolo, il calcio ionizzato e legato rimosso e il calcio ionizzato si lega allalbumina (deprivata di calcio) usata come liquido di sosituzione. Liperventilazione, lipotermia, lipomagnesemia, e luso di plasma quale liquido di sostituzione esacerbano la tossicit da citrato. Lipocalcemia viene, di norma, controllata riducendo la proporzione di citrato e rallentando il ritmo di reinfusione. Se non trattati, i sintomi possono aggravarsi sino alla comparsa di mioclonie, brividi, oppressione toracica, nausea, vomito e ipotensione. Basse concentrazioni di calcio ionizzato possono provocare aritmie cardiache. Chiedere al paziente di riferire le sensazioni di vibrazione e i formicolii pu contribuire a decidere il ritmo appropriato della reinfusione. Si devono
prendere ulteriori precauzioni nel caso di pazienti incapaci di comunicare o che metabolizzino scarsamente il citrato (per esempio, chi ha epatopatie). Lipocalcemia viene solitamente controllata con la somministrazione di carbonato di calcio o di calcio endovena22,23,29. Effetti sulla circolazione. Durante le procedure di aferesi, soprattutto se il volume di sangue extracorporeo superiore al 15% della volemia totale, pu intervenire ipovolemia, con conseguente ipotensione. Lipotensione tende a colpire i pazienti pediatrici, gli anziani, gli affetti da malattie neurologiche, gli anemici e quelli trattati con separatori a flusso discontinuo, che richiedono un volume ematico extracorporeo maggiore. I separatori a flusso continuo richiedono minori volumi extracorporei, ma possono indurre ipovolemia, se il flusso di ritorno , inavvertitamente, deviato verso la sacca di eliminazione, per una svista delloperatore o per difetti dellapparecchiatura o del programma computerizzato. Essa pu anche essere dovuta a una inadeguata sostituzione di liquidi o di proteine. Durante la procedura, essenziale registrare, attentamente e di continuo, i volumi rimossi e reinfusi. Anche luso di farmaci ipotensivi, in particolar modo degli ACE-inibitori (inibitori dellenzima di conversione dellangiotensina), in unione allimpiego di albumina come soluzione di reintegro, pu contribuire allipotensione (vedi Capitolo 27). In pazienti trattati con ACE-inibitori possono intervenire gravi episodi di ipotensione, se vengono sottoposti a separazioni plasmatiche con colonne contenenti proteina A stafilococcica o altri immunoassorbenti30. Ai pazienti, che saranno sottoposti a procedure con immunoassorbenti, non si dovrebbero somministrare questi farmaci a partire da 72 ore prima del trattamento. Poich linfusione di liquidi freddi, tramite il catetere venoso centrale, pu provocare aritmie, alcuni programmi aferetici prevedono, per specifici pazienti, luso di riscaldatori del sangue. Infezioni . Il plasma lunico liquido di sostituzione che ha il rischio di trasmettere infezioni virali. Proliferazioni batteriche e inerenti
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Capitolo 6: Aferesi
infezioni, correlate a ripetuti TPE, prendono origine dai cateteri. Regimi di aferesi intensive diminuiscono il livello di immunoglobuline e dei componenti opsonici del complemento. Per di pi, i farmaci immunosoppressivi, che vengono usati per prevenire il rimbalzo nella produzione anticorpale, possono ulteriormente compromettere i meccanismi di difesa. Emolisi meccanica e difetti delle apparecchiature. Tubi collassati o attorcigliati, valvole a manicotto flessibile difettose, errato montaggio delle apparecchiature possono danneggiare i globuli rossi di donatori o di pazienti nel circuito extracorporeo. Lemolisi, collegata alle macchine, stata osservata nello 0,07% di 195.000 procedure aferetiche nel Regno Unito31. Percentuali simili (0,06% e 0,01%) sono state riferite in un questionario, che riguardava, rispettivamente, aferesi terapeutiche o produttive32,33. Lemolisi pu anche intervenire per impiego di soluzioni incompatibili, come il destrosio (D5W) per diluire lalbumina al 25%, o di plasma ABO-discordante. Loperatore deve osservare, con la massima attenzione, la linea di raccolta del plasma e cogliere una sua colorazione rosa, indizio di emolisi. Altri difetti delle apparecchiature, legati ai dispositivi a rullo di chiusura, a perdite dai tubi di plastica o a malfunzionamenti della pompa rotante, sono rari34. Reazioni allergiche e difficolt respiratorie. Le difficolt di respiro, durante o subito dopo le aferesi, possono riconoscere varie cause: edema polmonare, embolismo polmonare massivo, embolia gassosa, ostruzioni nel microcircolo polmonare, reazioni anafilattiche e TRALI (Transfusion Related Acute Lung Injury)35. Lemotorace e lemopericardio, per erosione vascolare di un catetere venoso centrale, sono, di solito, insospettati, ma possono essere fatali36,37. Ledema polmonare, dovuto a sovraccarico circolatorio o a scompenso cardiaco, si associa normalmente a dispnea, ad aumento della pressione diastolica e a caratteristici reperti nelle radiografie del torace. In forma acuta, ledema pu anche derivare dal danno delle membrane dei capillari degli alveoli, secondario a una reazione immunologica o alla presenza di sostanze
vasoattive nel plasma fresco congelato o nelle soluzioni colloidali preparate con plasma umano. Limpiego di plasma fresco congelato, quale liquido di sostituzione, stato associato ad attivazione del complemento e a reazioni allergiche come orticaria, edema della mucosa orale e broncospasmo. Queste reazioni rispondono, di solito, positivamente a farmaci antistamici e a corticosteroidi. Lipotensione e le vampate di calore che possono accompagnare le rapide infusioni di albumina in pazienti trattati con ACE-inibitori sono discussi al Capitolo 27. Sono state segnalate reazioni prevalentemente oculari (edemi periorbitali, congiuntiviti, lacrimazioni) in donatori sensibili allossido di etile, gas utilizzato per sterilizzare i kit in plastica, monouso, per aferesi. Eventi fatali dovuti allaferesi. Nonostante il fatto che i pazienti sottoposti a TPE sono spesso malati critici, le morti durante le aferesi sono, comparativamente, rare. Lincidenza stimata di mortalit va da 3 su 10.000 39 a 1 su 500 40 procedure. In maggioranza, gli eventi fatali sono stati causati da aritmie o da arresti cardiaci durante o subito dopo la procedura, da edema polmonare acuto o da gravi difficolt respiratorie in corso di trattamento aferetico. Rare sono le morti dovute a reazioni anafilattiche, a perforazioni vascolari, a epatiti, a sepsi, a trombosi e a emorragie. Indicazioni allaferesi terapeutica Bench le aferesi terapeutiche siano state impiegate per curare molte malattie, la maggior parte degli studi pubblicati descrive singoli casi o riporta piccole casistiche non-controllate, senza offrire, spesso, sufficienti evidenze di efficacia. Questi limiti delle pubblicazioni, tendono a sottolineare i risultati positivi e i curanti dovrebbero evitare di sottoporre i pazienti ai rischi e agli alti costi di aferesi terapeutiche, basandosi su esperienze cliniche marginali. Studi controllati, randomizzati e a doppio cieco sulle aferesi terapeutiche sono difficili da condurre, perch gli studi simulati di controllo sono particolarmente costosi e comportano dei rischi. Le apparecchiature assai complicate e la grande attenzione posta dal personale medico e tecnico possono creare o amplificare un effetto
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placebo e distorcere le valutazioni relative allefficacia clinica. Di molte delle malattie trattate, eziologia, patogenesi e storia naturale sono comprese soltanto parzialmente e la diminuzione di sostanze variabili che possono essere misurate (componenti del complemento, fattore reumatoide o immunocomplessi) pu non correlare, in modo corretto, con i cambiamenti della malattia. Un esempio tipico dato dalla variazione della velocit di sedimentazione delle emazie (VES) nellartrite reumatoide. La VES diminuisce invariabilmente durante TPE intensive, in rapporto alla rimozione di fibrinogeno, ma non riflette, necessariamente, modifiche nella malattia. Per identici motivi, spesso non vengono stabiliti il volume ottimale e la frequenza degli scambi. Per malattie che pongono in immediato pericolo di vita, con albumina e fisiologica quali liquidi di sostituzione, il TPE si esegue quotidianamente, almeno in fase iniziale di trattamento. Dopo pochi giorni, il fibrinogeno e il conteggio piastrinico possono essere cos diminuiti da aumentare, significativamente, il rischio di emorragie. Deve intervenire, quindi, un giudizio clinico per decidere se si deve procedere con i TPE, usando concentrati della coagulazione e trasfusioni di piastrine o sospendere i TPE sino alla normalizzazione di questi parametri. Le situazioni cliniche discusse di seguito rappresentano indicazioni ben stabilite per le aferesi terapeutiche3,20,21,41,42. Emopatie Sindromi da iperviscosit sierica. Liperviscosit sierica, nel mieloma multiplo e nella macroglobulinemia di Waldestrm, pu causare: uno scompenso cardiaco congestizio, un ridotto flusso ematico al cervello, al cuore o ai polmoni, una sintomatologia caratterizzata da cefalea, vertigini, sonnolenza, ottundimento del sensorio. Le paraproteine possono interferire con lemostasi, provocando emorragie. Liperviscosit correla, soltanto in termini generali, con la concentrazione delle paraproteine. Misurare la viscosit del siero relativamente allacqua un sistema semplice che fornisce
informazioni obiettive. Per alcune proteine patologiche, la viscosit collegata fortemente alla temperatura, cos che la viscosit sierica dovrebbe essere misurata alle temperature fisiologiche pertinenti. La viscosit sierica normale varia da 1,4 a 1,8 volte rispetto allacqua. Dato che maggior parte dei pazienti non presenta sintomatologia sin tanto che i valori della viscosit non superano 4 o 5 volte quella dellacqua, i pazienti con aumenti modesti possono non richiedere TPE. Per le forme sintomatiche, anche un solo trattamento , di solito, molto efficace23. Iperleucocitosi. La leucoaferesi viene usata per il trattamento di conte eccezionalmente alte di leucociti, come pu accadere in corso di leucemia acuta. Per stabilire la necessit di trattamento, si sono utilizzati diversi valori-soglia: percentuale in volume di leucociti superiore al 10%, un numero totale di leucociti circolanti superiore a 100.000/L, un numero totale di blasti circolanti superiore a 50.000/ L 43. , tuttavia, uneccessiva semplificazione utilizzare i dati di un singolo valore di laboratorio per lindicazione al trattamento. Si devono prendere in considerazione molti fattori, quale la concentrazione eritrocitaria, il tipo di cellule leucemiche, il ritmo con il quale il numero dei leucociti aumentato, il pericolo di ostruzioni nel circolo cerebrale o polmonare, lo stato della coagulazione del paziente, le sue condizioni cliniche generali. La maggior parte dei leucemici con leucocitosi importante soffrono di unanemia significativa. La ridotta massa eritrocitaria riduce la viscosit ematica cos che, se non assolutamente necessario aumentare le capacit ossiforetiche, si deve evitare la trasfusione di eritrociti sino a che le crisi di iperviscosit non siano risolte43. In alcuni pazienti in crisi blastica o con forme di leucemie inusuali, sia lematocrito sia il leucocrito sono alti. Se esistono sintomi cerebrali o polmonari, bisogna prendere in considerazione la possibilit di ridurre la concentrazione leucocitaria, sebbene non sia provata lefficacia di tale riduzione. Di solito, tuttavia, laumento della conta leucocitaria avviene in settimane o in tempi ancora pi lunghi e la riduzione dei globuli bianchi si pu ottenere con la chemioterapia, con o senza leucoaferesi.
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La leucoaferesi viene, talora, impiegata per ridurre la conta a <100.000 cellule/L, prima di iniziare la chemioterapia per diminuire le probabilit di una sindrome da lisi del tumore. Non vi sono, comunque, sperimentazioni cliniche controllate per provare tale approccio e si deve anche ammettere che pi cellule maligne sono presenti al di fuori del circolo rispetto a quelle circolanti. Trombocitemia. Una piastrinoaferesi terapeutica viene, di norma, impiegata in pazienti sintomatici con conta piastrinica superiore a 1.000.000/L. Di per s, la conta non dovrebbe rappresentare il criterio per determinare se la riduzione del numero delle piastrine sia indicata o meno. La piastrinoaferesi pu essere vantaggiosa in pazienti con trombosi secondaria a trombocitemia. Meno chiaro il razionale circa la riduzione delle piastrine in pazienti sanguinanti. Non vi sono indicazioni accettate sulle piastrinoaferesi profilattiche in pazienti asintomatici, bench il rischio di infarti placentari e di morte del feto possano giustificare la procedura in gravide con elevata trombocitemia43. Porpora trombotica trombocitopenica e sindrome emolitico-uremica (PTT/SEU). Le condizioni descritte sotto letichetta di PTT/SEU riguardano patologie che colpiscono sistemi diversi, nelle quali trombi di fibrinogeno e piastrine occludono la microcircolazione. Tali patologie sono caratterizzate da piastrinopenia di vario grado, anemia emolitica microangiopatica, disfunzione renale, anormalit neurologiche, febbre. I pazienti con PTT fulminante hanno, usualmente, una conta di piastrine inferiore a 50.000/ L e livelli di lattico deidrogenasi (LDH) superiori a 1.000 UI/mL, dovuti allischemia sistemica e allemolisi44. Gli strisci del sangue periferico mostrano, tipicamente, un aumento di schistociti. Sono generalmente assenti i sintomi di CID (coagulazione intravascolare disseminata). La PTT si sviluppa, di solito, senza una causa apparente, sebbene gli episodi possano intervenire dopo infezioni, in gravidanza o dopo luso di alcuni farmaci, quali la ticlopidina e clopidogrel. Recenti pubblicazioni sostengono che sia
causata da anticorpi transitori diretti contro una proteasi (ADAMTS13), che cliva i multimeri ad alto peso molecolare del fattore von Willebrand (vWF). Linsolita avidit di questi multimeri aggrega le piastrine circolanti, dando inizio alla sindrome45,46. Sono stati descritti in aumento casi ricorrenti o di ricadute di PTT. La SEU una condizione consimile che colpisce pi i bambini che gli adulti; pu seguire uninfezione diarroica da ceppi (secernenti verotossina) di Escherichia coli (ceppo 0157:H7) o di Shigella. Paragonati ai pazienti con PTT, i malati con SEU hanno maggiori disfunzioni renali, e sintomatologie neurologiche ed ematologiche. La maggior parte dei colpiti da SEU non ha anticorpi contro la proteasi vWF e ha una concentrazione normale di ADAMTS13. Le sindromi PTT/SEU possono colpire i riceventi trapianti dorgano o di cellule staminali ematopoietiche trattati con ciclosporina e tacrolimus47,48. Lemolisi microangiopatica legata ai trapianti risponde male alle terapie e, probabilmente, rappresenta un differente processo patologico48. Il TPE con plasma normale o depauperato da crioprecipitato divenuto il trattamento di scelta per le sindromi PTT/SEU49,50. I livelli di ADAMTS13 restano stabili per almeno 2 settimane nel plasma citratato, conservato a 37 C 51 . Si ritiene, attualmente, che il TPE rimuova gli anticorpi anti-proteasi e rimpiazzi lADAMTS13 deficiente. Altre terapie, prive peraltro di riscontri, sono costituite da prednisone, agenti anti-piastrine, splenectomia, vincristina, rituximab, immunoglobuline endovena. Dato che le trasfusioni di piastrine sono state associate, in alcuni casi, allesacerbazione delle sindromi e a morte, esse sono controindicate (a meno che non vi siano emorragie che mettono in pericolo la vita). Il trattamento di scambio plasmatico viene, di regola, attuato quotidianamente per 1 o 2 settimane, ma frequenza e durata del trattamento dovrebbero essere guidati dal decorso dei singoli pazienti. Occasionalmente, si richiedono trattamenti prolungati. Il TPE ha influenzato molto positivamente la prognosi della PTT, sindrome
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quasi sempre fatale prima del 1964 e che oggi ha una percentuale di sopravvivenza dell80%49. Gli indizi di una risposta alla terapia riguardano un aumento nella conta delle piastrine e una riduzione della LDH, nel corso dei TPE. Quando il paziente raggiunge livelli di LDH vicini alla norma e una conta piastrinica di 100-150.000/ L, il trattamento pu essere sospeso. Alcuni programmi prevedono il passaggio da un trattamento intensivo a uno intermittente o la semplice infusione di plasma, ma lefficacia di questo approccio terapeutico non stata ancora stabilita52. Malgrado il successo del TPE, le sindromi PTT/SEU restano situazioni serie. Fallimenti del trattamento continuano a succedere, con danno degli organi maggiori o morte. Complicazioni della drepanocitosi. Alcune complicazioni dellanemia falciforme possono essere trattate con scambi eritrocitari. Le complicazioni riguardano colpi apoplettici in atto o incombenti, la sindrome toracica acuta, insufficienze multi-organo. Leritro-exchange pu essere attuato con metodiche automatiche o manuali, ma le tecniche automatiche risultano pi rapide e meglio controllabili. Lo scopo di rimpiazzare eritrociti contenenti HbS con un numero sufficiente di emazie contenenti HbA, in modo che proporzione di HbA sia, complessivamente, del 60-80%. Certi centri forniscono emazie fenotipicamente compatibili per alcuni antigeni (C, E o K1) al fine di evitare alloimmunizzazioni in pazienti trasfusi ripetutamente e per lungo tempo. Al termine della procedura, lematocrito non dovrebbe superare il 30-35% per evitare un aumento della viscosit ematica. Si pu attuare un programma di eritrocitoferesi croniche per gestire il sovraccarico marziale in pazienti che necessitano di una terapia trasfusionale a lungo termine53. Crioglobulinemia Un aumento significativo delle crioglobuline pu determinare occlusioni vascolari (indotte dal freddo), alterazioni della coagulazione, insufficienza renale, danni ai nervi periferici. La rimozione delle crioglobuline si pu ottenere con laferesi, ma la terapia definitiva dipende
dallidentificazione e dal trattamento della condizione patologica di base. Malattie neurologiche Miastenia gravis . La miastenia grave determinata da un blocco, dovuto ad autoanticorpi, dei recettori dellacetilcolina, situati sulla placca post-sinaptica dei muscoli motori. Le terapie standard comprendono steroidi e inibitori della acetilcolinesterasi. Il TPE viene impiegato, come trattamento addizionale, nei pazienti che presentano unesacerbazione della sintomatologia, non controllabile dai medicamenti o dei malati che si devono sottoporre a timectomia. Un tipico protocollo contempla 5-6 TPE nel corso di una o due settimane. Si raccomanda di attuare contestualmente, immunosoppressione, per prevenire un rimbalzo degli autoanticorpi. Un trattamento cronico con TPE stato utilizzato, con qualche successo, in un ristretto numero di pazienti. Sindrome di Guillain-Barr acuta. Si tratta di una polineuropatia acuta, autoimmune, demielinizzante, che determina paralisi drammatiche in soggetti per altro sani. La causa ignota. Molti casi fanno seguito a uninfezione virale benigna o a quella da Campylobacter jejuni. La maggior parte dei pazienti guarisce spontaneamente, ma, in circa un caso su sei, i malati sono incapaci di camminare o di respirare senza lausilio di una ventilazione di supporto. Un trattamento precoce benefico per i pazienti con malattia rapidamente progressiva. La risposta , invece, minore nei pazienti che, per alcune settimane, non vengono trattati. Recenti studi controllati hanno indicato che la terapia con immunoglobuline endovena equivale, in un periodo di due settimane, a 5 TPE 54, ma il trattamento con TPE meno costoso55. Sperimentazioni multicentriche hanno indicato che il TPE, se iniziato precocemente, diminuisce il periodo di minima funzione sensitiva e motoria56. I pazienti, la cui patologia non ha un esordio acuto o non ha le caratteristiche della sindrome di Guillain-Barr, oppure nei quali gli studi sulla conduzione nervosa evidenziano un totale blocco assonico, possono avere una prognosi peggiore e una minor risposta alla terapia aferetica
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Polineuropatia infiammatoria demielinizzante cronica. Questa polineuropatia, spesso osservata in pazienti con infezione da HIV, determina un insieme di alterazioni a lento esordio e a decorso progressivo o intermittente, caratterizzate da aumento del livello proteico del liquido spinale, marcato rallentamento della velocit di conduzione nervosa e demielinizzazione segmentarla dei nervi periferici. Ne derivano anormalit varie, sensitive e motorie. Questa neuropatia pu anche intervenire nella cosiddetta sindrome POEMS, caratterizzata da polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, MGUS (gammapatia monoclonale dincerto significato) e modifiche cutanee. Il trattamento di prima linea luso di corticosteroidi. Il TPE e linfusione endovena di immunoglobuline hanno efficacia sovrapponibile nei pazienti che non rispondono agli steroidi57. Polineuropatia associata alla MGUS. Quando una neuropatia si associa alla MGUS il TPE si dimostrato efficace per tutte le varianti58,59. Malattie renali La glomerulonefrite rapidamente progressiva (GNRP), con presenza di anticorpi diretti contro le membrane basali di glomeruli e alveoli, che pu causare emorragie polmonari (sindrome di Goodpasture), risponde, di solito, al TPE, quale trattamento aggiuntivo a farmaci immunosoppressivi 41. Il TPE accelera la scomparsa degli anticorpi contro le membrane basali e migliora la funzione renale. particolarmente efficace nellarrestare le emorragie polmonari nei pazienti, anche quando la funzione renale non si ancora normalizzata. Il TPE stato utilizzato per trattare le vasculiti nelle GNRP con anticorpi diretti contro il citoplasma dei neutrofili60,61 e si dimostrato molto efficace nei casi pi gravi4. Il mieloma a catene leggere pu essere tossico per lepitelio dei tubuli renali e causare insufficienza renale sino al 10% dei casi. Il TPE utile, quale terapia addizionale, in alcuni pazienti con nefropatia (e produzione di cilindri renali), ma non determina una maggior sopravvivenza 41,62.
Altre condizioni patologiche Il TPE stato utilizzato, sempre come terapia di supporto, in numerose malattie multisistemiche. Combinazioni di steroidi, agenti citotossici e TPE sono state utilizzate in pazienti affetti da forme particolarmente gravi di poliartrite nodosa63, bench la maggioranza delle malattie reumatiche risponda poco al TPE. Sperimentazioni cliniche, che hanno utilizzato il TPE standard, non hanno dimostrato alcun effetto benefico nel trattamento del lupus eritematoso sistemico, nelle polimiositi, nelle dermatomiositi e nella sclerodermia21. Le colonne per lassorbimento immune si sono dimostrate utili nel trattamento di pazienti con artrite reumatoide, che non rispondevano al trattamento farmacologico64. Ipercolesterolemia familiare omozigote di tipo II. Lipercolesterolemia omozigote una rara alterazione dei recettori delle lipoproteine a bassa densit (LDL), che comporta una precoce e grave arteriosclerosi e una morte prematura per coronaropatia. Con ripetuti TPE, spesso in associazione con assorbimenti selettivi o tecniche di filtrazione, possibile ottenere una riduzione dei lipidi circolanti che si prolunga nel tempo43. La forma eterozigote deriva da numerosi difetti genici a livello dei recettori LDL. Alcuni pazienti affetti dalla forma eterozigote possono presentare alti livello di colesterolo ed essere a rischio di sviluppare una precoce cardiopatia aterosclerotica. La FDA ha autorizzato due sistemi per la rimozione selettiva di LDL in pazienti affetti da ipercolesterolemia sia omozigote sia eterozigote. Il Liposorber LA-150 della Kaneka Pharma America (New York, NY, USA) si basa su colonne di affinit chimica per assorbimento su destrano solfato. Il sistema H.E.L.P. LDL della Braun (Melsungen, Germania) un sistema che determina una precipitazione del colesterolo LDL indotta dalleparina. Queste procedure rimuovono selettivamente i colesteroli che contengono apolipoproteina B, come le LDL e le LDL propriamente dette, risparmiando, nel contempo, le lipoproteine ad alta densit (HDL). Ci fornisce un vantaggio sulle aferesi standard, che rimuovono tutte le proteine plasmatiche, compreso
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lHDL protettivo. La procedura abbassa il valore del colesterolo bersaglio, del 60-70%. Il trattamento si effettua, in genere, settimanalmente od ogni due settimane e, di regola, si utilizzano, contemporaneamente, anche farmaci anti-colesterolo. Numerosi studi hanno testimoniato che limpiego dellLDL-aferesi consegue significative diminuzioni dei lipidi in quasi tutti i pazienti con ipercolesterolemia65,66. Risultati promettenti si sono anche ottenuti con un sistema in grado di assorbire, direttamente dal sangue intero, LDL e lipoproteine (a) o DALI (Direct Adsorption Lipoproein)67. Malattia di Refsum (o Malattia da acido fitanico). Si tratta di una rara malattia ereditaria, dovuta a un errore metabolico che provoca laccumulo di acido fitanico (introdotto con la dieta) e determina alterazioni neurologiche, cardiache, scheletriche e cutanee. Il TPE utile nellaccoppiare una dieta priva di acido fitanico e dovrebbe essere impiegato il pi precocemente possibile, prima che intervengano danni permanenti. Immunoassorbimento su proteina A stafilococcica Limmunoassorbimento su proteina A stafilococcica (PAS) stata approvato dalla FDA per il trattamento della PTT acuta e cronica. La FDA lo ha anche approvato per trattare gli adulti affetti da artrite reumatoide che non rispondono ai farmaci specifici64. Sebbene non approvata dalla FDA, questa tecnica stata anche utilizzata, con modesti successi, per altre forme di trombocitopenie autoimmuni68. Sono state anche riportati casi (aneddotici) di PTT/SUE, refrattari al TPE, che hanno risposto allimmunoassorbimento su PAS69. Fotoaferesi La fotoaferesi una tecnica che contempla di trattare il paziente con psoralene, di effettuare unaferesi per separare i suoi linfociti e di trattare questi con raggi ultravioletti (UV). Questo rende i linfociti (e altre cellule nucleate) incapaci di suddividersi. Le cellule, cos trattate, vengono, poi, reinfuse. La procedura, nota anche come fotochemioterapia extracorporea, stata
approvata dalla FDA per il trattamento dei linfomi cutanei a cellule T e viene considerata come primo trattamento per la fase eritrodermica della malattia70. Sono in corso sperimentazioni cliniche per valutare lefficacia della fotoaferesi nelle situazioni seguenti: rigetto, cellulo-mediato, di trapianti di cuore o di polmoni e trattamento della GvHD, sia acuta che cronica, dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche. Si tratta di una tecnologia non disponibile in tutti i centro di aferesi.
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Capitolo 6: Aferesi
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Capitolo 7: Validazione ed etichettatura degli emocomponenti
Capitolo 7
Validazione ed etichettatura degli emocomponenti
Ogni unit di sangue donato deve essere adeguatamente esaminata ed etichettata prima di essere distribuita per uso trasfusionale. Nonostante gli scopi e le caratteristiche dei test sui donatori cambino per lintroduzione di nuovi esami e di nuove normative, il principio rimane immodificato: migliorare la sicurezza delle scorte di sangue. Il presente capitolo prende in considerazione i principi generali della validazione e delletichettatura e fornisce una descrizione degli specifici test richiesti (o eseguiti volontariamente) ad ogni donazione. La discussione sulle complicanze della trasmissione di malattie infettive si trova al Capitolo 28, mentre gli aspetti relativi alla preparazione degli emocomponenti sono trattati nel Capitolo 8.
Tipologia delle analisi

Requisiti generali necessario che ogni laboratorio sviluppi procedure operative standard per lesecuzione degli esami sugli emocomponenti, nellassoluto rispetto delle istruzioni fornite dai produttori dei test. Le analisi devono essere eseguite in maniera pianificata e ordinata, seguendo un programma di qualit e una serie di procedure scritte che indichino al personale come effettuarle, in quali circostanze sia necessario aggiungere test supplementari e quali provvedimenti prendere nel caso di situazioni anomale. Le attrezzature e le strumentazioni devono essere adeguate alle attivit da svolgere. Laccesso al laboratorio deve
essere limitato. Lambiente deve essere controllato in modo da garantire che le specifiche di temperatura dei test siano rispettate e che i risultati non vengano alterati da condizioni ambientali sfavorevoli. Materiali e strumentazioni devono essere quelli preventivamente approvati e validati dalla struttura. Se una struttura utilizza reattivi o strumenti provenienti da produttori diversi, essa ha la responsabilit di documentare che la combinazione di reattivi o strumenti stata validata per ogni test in uso e che la formazione del personale avvenuta con le istruzioni pi aggiornate. Per i test richiesti dalla Food and Drug Administration (FDA)1 e/o dagli Standard AABB per i Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali, tutti i reagenti in uso devono avere caratteristiche di qualit uguali (o superiori) ai requisiti richiesti dalla FDA2(p9). Se il produttore di un test autorizzato fornisce i controlli, questi devono essere utilizzati per quel test. Tuttavia, se tali controlli vengono usati per la calibrazione degli apparecchi, necessario, per la verifica delle prestazioni del test, utilizzare controlli differenti. Pu essere necessario acquistare separatamente tali controlli. Il produttore definisce i criteri di accettabilit del campione e fornisce informazioni che, di solito, comprendono la presenza e il tipo dellanticoagulante, la durata dellidoneit del campione, i tempi e le condizioni di conservazione. I test devono essere condotti su campioni chiaramente identificati, provenienti dalla donazione corrente. Le analisi devono essere completate su ogni donazione di sangue prima
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della sua distribuzione. Il risultato di ciascun test deve essere registrato simultaneamente al suo rilevamento; linterpretazione deve essere registrata solo dopo che il test stato completato. I risultati dei test devono essere registrati e le registrazioni conservate, in modo che tutti i risultati per ogni unit di sangue e/o emocomponente possano essere rintracciati. La struttura dovrebbe avere una politica per notificare al donatore il risultato positivo di un test infettivologico. I risultati dei test sono riservati e non devono essere resi noti a nessuno, ad eccezione del donatore, senza il suo consenso scritto. Al momento della donazione, qualora la norma preveda di trasmettere eventuali risultati positivi ad agenzie sanitarie locali o nazionali, il donatore deve essere informato e deve fornire il proprio consenso prima del prelievo. I donatori devono firmare, prima della donazione, un modulo di consenso in cui confermano di essere informati che la struttura mantiene un registro con i nomi dei donatori che hanno dichiarato comportamenti che controindicano la donazione o che sono risultati positivi ai test infettivologici. Il donatore deve essere anche informato nel caso in cui il campione venga sottoposto ad analisi per scopi di ricerca, compresi i protocolli per lo studio di nuovi farmaci. Le comunicazioni che pongono maggiori problemi sono quelle relative a falsi risultati positivi. Per alcune analisi (quali, per esempio, la ricerca di anticorpi anti-HCV o anti-HIV-1/2), sono, di solito, eseguiti test di conferma o supplementari, allo scopo di fornire una consulenza al donatore o per una sua eventuale riammissione. Nel caso di minori, si applicano le leggi statali o locali3. Test obbligatori La determinazione del gruppo ABO e del tipo Rh deve essere eseguita a ogni donazione. Su ogni donazione di sangue destinato a trasfusioni allogeniche deve essere analizzato un campione per i seguenti test1,2(p33): sifilide; HBsAg; NAT HIV (da solo o nella combinazione HIV/HCV);
NAT HCV (da solo o nella combinazione HIV/HCV); anti-HIV-1; anti-HIV-2; anti-HBc; anti-HCV; anti-HTLV-I/II. possibile anche utilizzare il test combinato anti-HIV-1/2. N la FDA n lAABB richiedono un test per le ALT. La FDA ha emanato raccomandazioni per letichettatura di unit con ALT elevate5. Requisiti delle strumentazioni Tutti gli strumenti impiegati nelle analisi devono essere adeguatamente calibrati e validati al momento dellinstallazione, dopo le riparazioni e, comunque, periodicamente. Deve esistere una programmazione degli interventi di manutenzione ordinaria. Tutte le attivit di calibrazione, manutenzione e riparazione, per ciascuno strumento, devono essere documentate. Anche il software impiegato per il controllo degli strumenti o per linterfaccia con il sistema informatico della struttura, deve essere validato5. Requisiti delle registrazioni Le registrazioni devono documentare tutti i passaggi riguardanti la produzione di ogni emocomponente, dallorigine alla destinazione finale 6,7 . Le registrazioni devono essere conservate in modo da proteggere lidentit e le informazioni personali del donatore da chiunque sia estraneo alla struttura addetta al reclutamento, alla qualificazione e alla raccolta del sangue, ad eccezione delle agenzie governative cui i risultati positivi di certi esami debbano essere per legge comunicati, per la tutela della salute pubblica. Le registrazioni dei risultati delle analisi sulle unit donate devono essere conservate in modo da rendere possibili le indagini in caso di conseguenze sfavorevoli per i riceventi. Le registrazioni dei test devono, inoltre, essere idonee a permettere le indagini retrospettive (look back) su emocomponenti precedentemente donati, qualora il sangue di
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un donatore fornisse risultati positivi ad un test infettivologico nuovo o perfezionato. Le precedenti registrazioni delle tipizzazioni ABO ed Rh del donatore devono essere controllate e confrontate con i risultati ottenuti per la donazione corrente. Questo costituisce un controllo di qualit molto valido, sia sulla corretta identificazione del campione che sul funzionamento del laboratorio. In caso di incongruenza fra qualunque dato storico o attuale, lunit non deve essere distribuita, fino alla completa risoluzione della discordanza2(p39). Tipizzazione ABO e D Ogni unit di sangue destinata ad essere trasfusa deve essere sottoposta a tipizzazione ABO e D2(p32),8. Il gruppo ABO deve essere determinato testando le emazie del donatore con sieri anti-A e anti-B e il siero (o il plasma) con emazie test A1 e B. La tipizzazione Rh si effettua testando gli eritrociti del donatore con il siero anti-D. Le emazie che non reagiscono con lanti-D in agglutinazione diretta, devono essere ricontrollate con metodica idonea allindividuazione del D debole. Le emazie che reagiscono con il siero anti-D, in agglutinazione diretta o con le metodiche per il D debole, devono essere classificate come D positive, mentre quelle che non reagiscono con i reagenti anti-D n in agglutinazione diretta n con i metodi per la ricerca del D debole, devono essere etichettate come D negative. Alcune delle tecniche con strumentazione automatica sono sufficientemente sensibili da rendere la ricerca del D debole non necessaria. Questi strumenti dispensano i reagenti, li incubano insieme al campione in modo appropriato, leggono la reazione e forniscono il risultato pronto per linterpretazione. Inoltre, tali apparecchiature automatiche includono lidentificazione positiva dei campioni con lettori di codici a barre e utilizzano sangue non coagulato, cos che basta una sola provetta per i test sugli eritrociti e sul plasma. Per una discussione pi approfondita sui principi delle tipizzazioni ABO ed Rh vedi ai Capitoli 13 e 14.
Screening anticorpale Il sangue di donatori con anamnesi positiva per trasfusioni o per gravidanze deve essere esaminato per leventuale presenza di anticorpi irregolari. Dato che, di solito, non risulta pratico separare il sangue su cui eseguire questa ricerca da quello per il quale lindagine non necessaria, la maggior parte dei Centri Trasfusionali effettua la ricerca degli anticorpi irregolari su tutte le unit. Il siero (o il plasma) dei donatori pu essere cimentato contro sospensioni, singole o in pool, di emazie test a fenotipo noto. Le metodiche da impiegarsi sono quelle in grado di evidenziare anticorpi clinicamente significativi. Si veda la Sezione 3 dei Metodi per le tecniche di rilevamento degli anticorpi e il Capitolo 19 per la discussione sul rilevamento degli anticorpi. Test sierologico per la sifilide Da pi di 50 anni, sui campioni di sangue dei donatori viene eseguito il test sierologico per la sifilide. Nonostante studi sperimentali condotti negli anni 80, abbiano dimostrato che la sopravvivenza delle spirochete a 4 C dipende dalla loro concentrazione, non noto per quanto tempo il Treponema pallidum sopravviva, a basse temperature, in un emocomponente infetto9. Lultimo caso di trasmissione di sifilide con la trasfusione di sangue fresco stato segnalato nel 196910. Nei centri statunitensi di raccolta sangue, la maggioranza delle analisi di screening per la sifilide basata su test che utilizzano la microemoagglutinazione o lantigene cardiolipina, tipicamente automatizzati. Le unit positive non possono essere utilizzate per trasfusioni allogeniche. I risultati positivi possono essere confermati prima di notificarli ai donatori. Nei donatori di sangue i risultati falsi positivi sono molto pi probabili dei positivi veri. Test per i marcatori virali Due sono le metodiche di screening pi largamente impiegate per identificare antigeni o anticorpi virali. La prima il test EIA ( Enzyme-linked Immunosorbent Assay). Il test EIA per evidenziare
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lantigene virale HBsAg utilizza un supporto solido (biglie o micropiastre) rivestito da un anticorpo non marcato diretto contro lantigene. Lindicatore costituito da un altro anticorpo, identico o meno al precedente, marcato con un enzima, la cui presenza verr evidenziata dal cambiamento di colore del relativo substrato. Se il campione in esame contiene lantigene, questo si legher allanticorpo della fase solida e sar, a sua volta, legato dallanticorpo indicatore marcato con enzima. Per individuare anticorpi anti-virali, come ad esempio anti-HIV-1, anti-HIV-2, anti-HBc, anti-HCV, anti-HTLV-I/II, la fase solida (biglia o micropozzetto) rivestita da antigeni, preparati da specifiche proteine virali ricombinanti o da peptidi sintetici. La seconda metodica di rilevazione dei virus si basa sullamplificazione degli acidi nucleici e sullindividuazione di materiale nucleico virale11. I virus a RNA testati di routine sono lHIV e lHCV. Due test sperimentali per il West Nile virus (WNV) sono attualmente in fase di studio12,13. In alcuni Centri Sangue sono in corso studi clinici sulluso del test NAT (Nucleic Acid Technology) per il virus dellepatite B. Nei sistemi a cattura, frequentemente utilizzati nei test, il siero o il plasma vengono incubati con lantigene fissato in fase solida. Se presente, lanticorpo si lega saldamente alla fase solida e rimane fissato dopo che il liquido in eccesso stato rimosso. Viene poi aggiunta una preparazione di antigeni o di antiglobulina coniugati con enzima; se lanticorpo si era fissato allantigene della fase solida, esso verr legato dallantigene marcato o dallantiglobulina e si potr quantificare il complesso antigene-anticorpoantigene (o antigene-anticorpo-antiglobulina), misurando lattivit enzimatica. Un test per lanti-HBc utilizza un metodo di cattura indiretto (analisi competitiva), nel quale il coniugato enzima-anticorpo viene aggiunto allantigene in fase solida assieme al campione da analizzare. L eventuale anticorpo presente nel campione competer con lanticorpo coniugato con enzima, riducendo, in maniera significativa, la quantit di enzima legato rispetto ai risultati ottenuti con campioni non reattivi. Gli antigeni impiegati nei
test di screening di anticorpi virali possono essere di produzione sintetica con tecnologia ricombinante o estratti da particelle virali. La NAT una tecnologia potente ma costosa, che accorcia il periodo finestra di HIV e HCV, rilevando un numero molto ridotto di copie virali dopo la loro comparsa in circolo. I primer per HCV e HIV sono posti in pozzetti di micropiastre, distinti o in combinazione, a seconda delle specifiche caratteristiche del test. Nei test che utilizzano pool di sieri, da 16 a 24 campioni vengono riuniti e analizzati. Se nei campioni presente RNA virale corrispondente ai frammenti presenti nel pozzetto, lamplificazione ciclica al calore dellacido nucleico determina la moltiplicazione dei frammenti virali, rendendoli facilmente rilevabili . Laliquota del pool dei sieri viene posta nel pozzetto con i primer virali ed il substrato, cos che, se i primer e il materiale virale dei campioni sono gli stessi, la loro quantit aumenter geometricamente a ogni ciclo. La presenza virale potr, quindi, essere evidenziata in modo affidabile. Quando un pool risulta positivo, ogni singolo campione che ne fa parte dovr essere esaminato singolarmente e separamene per HIV e HCV, per individuare quello reattivo. Un ulteriore vantaggio di questo tipo di test la bassa incidenza di risultati falsamente positivi, sempre che si riescano a controllare le contaminazioni crociate di campioni o quelle dovute a manualit di laboratorio12. Per la maggior parte degli esami, i campioni non reattivi ai test iniziali di screening, secondo le istruzioni fornite dai produttori, vengono considerati negativi e non vi necessit di ulteriori indagini. I campioni reattivi al test iniziale di screening devono essere ripetuti in duplicato. La reattivit di una o di entrambe le ripetizioni costituisce un risultato positivo e il campione viene considerato ripetutamente reattivo. In questo caso, tutti i relativi emocomponenti devono essere eliminati. Se entrambe le ripetizioni sono negative, il campione viene giudicato non reattivo. Prima che un donatore sia ritenuto antigene o anticorpo positivo, una condizione che pu avere conseguenze cliniche e sociali significative e comportare la sua esclusione
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dalle donazioni di sangue, importante determinare se il risultato del test di screening sia un vero o un falso positivo. Invalidazione dei risultati delle analisi Nel corso delle analisi sui marcatori virali, pu essere necessario invalidare i risultati, se la prestazione della seduta analitica non soddisfa i requisiti del produttore specificati nella confezione (per esempio, apparecchiatura difettosa, procedura impropria, reagenti alterati) o se i risultati dei controlli non soddisfano i criteri di accettabilit, sempre specificati nella confezione. Tutti i risultati, reattivi e non reattivi, ottenuti nella seduta analitica, devono essere considerati non validi: tutti i campioni coinvolti devono essere riesaminati in una nuova seduta, che diventa, per le registrazioni, la seduta iniziale13. Tuttavia, se i controlli del lotto sono accettabili e non viene evidenziato nessun errore nellesecuzione del test, i risultati della seduta iniziale restano quelli validi per le registrazioni relative a tutti i campioni pertinenti. I campioni reattivi devono essere riesaminati in duplicato, come indicato dalle istruzioni dei produttori. Prima di invalidare una seduta, i problemi osservati dovrebbero essere revisionati da un supervisore o da persona equivalente, le cause dovrebbero essere analizzate, e dovrebbero essere presi i provvedimenti correttivi del caso. Si dovrebbero registrare le deviazioni dalle normali procedure standard, con una descrizione completa dei motivi dellinvalidazione e del tipo delle azioni correttive intraprese13. Tabella 7.1 - Utilizzazione di controlli esterni Reagenti del kit Solo controllo negativo Solo controllo positivo Controlli positivi e negativi
Uso di controlli esterni Quando si utilizzano controlli esterni, pu essere necessario prendere in esame altre considerazioni, prima di invalidare i risultati di un test13. I controlli interni sono i materiali di validazione forniti con il kit; sono impiegati per dimostrare che il test funziona come atteso. Generalmente, i controlli esterni consistono, almeno, di un controllo positivo e di uno negativo. Se il controllo negativo del kit viene utilizzato per calcolare il cut-off del test, esso non pu essere usato come campione di controllo dellanalisi. Al suo posto dovrebbe essere utilizzato un controllo negativo esterno (vedi Tabella 7.1). I controlli esterni vengono spesso utilizzati per verificare la capacit del test di individuare campioni debolmente reattivi. I controlli esterni sono campioni sostitutivi, non compresi nei kit, acquistati dal commercio o preparati dalla struttura; sono usati per controllare le prestazioni dei test. Vengono analizzati con le stesse modalit dei campioni dei donatori, al fine di aumentare la sicurezza del sangue e di mettere in guardia i laboratori sulla possibilit di un aumentato rischio di errori. Prima di essere introdotti nelluso routinario, i controlli esterni devono essere qualificati, lotto per lotto, perch il comportamento di ciascun lotto pu variare con il kit in uso. Una modalit per qualificare i controlli esterni il seguente: 1. impiegare il controllo esterno nelle sedute di analisi per due giorni, quattro repliche al giorno, usando 2 o 3 differenti lotti del kit. La
Utilizzato per calcolare il cut-off S No S No S
Richiesti controlli esterni? S - controllo negativo No S - controllo positivo No S - controlli positivi e negativi
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prestazione dei controlli esterni deve essere conforme ai requisiti specifici, prima di essere utilizzato; 2. se i controlli esterni non sono conformi alle specifiche, deve essere determinato il rapporto campione/cut-off accettabile (per esempio, entro tre deviazioni standard dalla media). Ogni volta che viene introdotto un nuovo lotto del kit o dei controlli, devono essere effettuati test di qualificazione aggiuntivi. Quando si cambia un lotto del kit, si dovrebbero effettuare sedute ripetute (per esempio, venti) del controllo esterno con il kit in uso e con il nuovo kit. Si dovrebbero determinare il nuovo rapporto campione/cut-off e i suoi limiti. Gli utilizzatori dovrebbero verificare se esistono speciali requisiti (statali, federali o internazionali) richiesti nella gestione dei controlli esterni. Una struttura pu invalidare risultati non-reattivi sulla base dei controlli esterni, ma, se il test stato eseguito in accordo con le specifiche del produttore e i controlli interni hanno funzionato secondo le attese, i controlli esterni non possono essere usati per invalidare risultati reattivi. Per rifiutare i risultati delle analisi, i controlli esterni possono essere impiegati con criteri pi rigorosi rispetto a quelli indicati nelle confezioni del kit, ma sempre in modo coerente con essi. Losservazione dei dati sulla popolazione dei donatori, come un inatteso aumento della frequenza di reattivit nella seduta di lavoro, pu portare a considerare non validi i risultati non-reattivi. La successiva analisi, eseguita in singolo sui campioni coinvolti, diviene il test iniziale di registrazione per i campioni non-reattivi della seduta invalidata. Tuttavia i risultati reattivi, ottenuti in una seduta con inaspettato aumento di reattivit, non possono essere invalidati, a meno che lintera seduta risulti non conforme ai criteri specificati nellinserto della confezione. Questi risultati reattivi costituiscono il test iniziale di registrazione. I campioni devono essere analizzati in duplicato alla ripetizione del test. I controlli esterni possono anche essere utilizzati per invalidare una seduta di ripetizione di test duplicati, quando essa valida per i criteri di accettabilit del kit ed entrambe le ripetizioni siano
non-reattive. I campioni duplicati possono essere ripetuti in duplicato: il secondo test duplicato diviene il test di registrazione. Se anche uno solo dei test originali ripetuti in duplicato reattivo, il donatore deve essere classificato come ripetutamente reattivo e non necessario eseguire ulteriori test. Quando i campioni risultano reattivi ai test iniziali di screening, le unit di sangue allogenico devono essere poste in quarantena, sin tanto che non siano disponibili i risultati delle ripetizioni in duplicato. Gli emocomponenti con esami ripetutamente reattivi non devono essere utilizzate per trasfusioni allogeniche. Sui campioni ripetutamente reattivi possono essere eseguiti test supplementari o di conferma, al fine di ottenere ulteriori informazioni per la consulenza al donatore e per una sua eventuale riammissione, in relazione alle caratteristiche del marcatore virale e alla disponibilit di test approvati. Test supplementari: neutralizzazione Nei test di neutralizzazione per confermare la presenza di un antigene (per esempio, di HBsAg), il campione reattivo viene incubato con siero umano noto per la presenza di anticorpi specifici per quellantigene. Se lincubazione determina la scomparsa della reazione positiva o la sua riduzione di almeno il 50% (o della percentuale indicata nelle istruzioni allegate al kit) e tutti i controlli si comportano come atteso, viene confermata la presenza dellantigene e il risultato originale viene considerato come sicuramente positivo. Se lincubazione con lanticorpo noto non modifica la reattivit, il risultato precedente da considerarsi falsamente positivo. Campioni di controllo, noti per essere positivi e negativi, devono essere analizzati in parallelo con i campioni dei donatori o dei pazienti. Una preparazione nota per la presenza di anticorpi specifici per lantigene in questione e una conosciuta per essere assolutamente priva sia di antigeni che di anticorpi, devono essere incubate in parallelo. Se i valori dei controlli positivi e negativi non ricadono entro i limiti stabiliti dalle istruzioni allegate al kit, il test deve essere ripetuto.
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Test supplementare per campioni reattivi in EIA per anti-HIV-1/2, -HTLV I/II e -HCV Il Western blot il metodo pi largamente utilizzato per confermare i test EIA ripetutamente reattivi per anti-HIV. Questa metodica separa il materiale antigenico virale in bande, a seconda del peso molecolare. Il materiale viene, poi, trasferito su membrane di nitrocellulosa. Lanticorpo del siero test reagisce con le singole bande, in base alla specificit. La maggior parte delle persone con HIV, siano esse asintomatiche o affette da AIDS, mostrano bande multiple, che rappresentano anticorpi diretti, virtualmente, contro tutti i vari prodotti del gene. Un siero completamente reattivo dovrebbe reagire con le proteine gag p17, p24 e p55; con le proteine pol p31, p51 e p66; con le glicoproteine env gp41, gp120 e gp160. I risultati del Western blot di campioni di donatori EIA-reattivi vengono classificati come positivi, negativi o indeterminati. I risultati positivi sono quelli con reattivit per almeno due delle seguenti proteine HIV: proteina core p24; proteina transmembrana gp41; proteina esterna e precursore della proteina esterna gp120/160. I campioni indeterminati sono quelli che mostrano altri quadri di reattivit. In alcuni centri, come alternativa al Western blot, viene utilizzato un test di immunofluorescenza. Cellule infettate dal virus vengono fissate su un vetrino. Il campione in esame incubato con le cellule fissate. Lanticorpo nel campione si legher ai siti antigenici delle particelle virali. La miscela di reazione incubata con un anti-IgG umana marcata con una sostanza fluorescente. Dopo incubazione e lavaggio, il legame dellanti-IgG umana marcata evidenziato con un microscopio a fluorescenza, con successiva interpretazione del pattern di fluorescenza. Bench esistano test di conferma per anti-HIV in Western blot approvati dalla FDA, il Western blot che usa DNA ricombinante e lisati antigenici virali per anti-HTLV-I/II non stato approvato dalla FDA. Un test supplementare appropriato per confermare una reattivit anti-HTLV consiste nella ripetizione del test, impiegando un test EIA di un altro produttore. Se questo ripetutamente
reattivo, il risultato si considera confermato. Se il test negativo, il risultato del test anti-HTLV viene considerato come falso positivo. La FDA ha approvato un test RIBA (Recombinant Immuno Blot Assay) per differenziare ulteriormente campioni ripetutamente reattivi per EIA anti-HCV. Il RIBA un sistema basato sulla fusione degli antigeni HCV alla superossido dismutasi umana nel test di screening e alla superossido dismutasi ricombinante nel test di conferma, al fine di evidenziare reazioni aspecifiche. Un risultato positivo richiede la reattivit verso due antigeni HCV e lassenza di reattivit alla superossido dismutasi. La reattivit verso un solo antigene HCV o ad un antigene HCV e alla superossido dismutasi viene classificata come reazione indeterminata. I risultati vengono normalmente presentati come: positivi, negativi o indeterminati. Come per tutte le procedure, per classificare i risultati del test essenziale seguire le indicazioni dei produttori. Luso del test NAT viene discusso al Capitolo 28. Test per il citomegalovirus Su unit di sangue destinate a essere trasfuse a pazienti con esigenze particolari, possono essere eseguiti ulteriori test suppplementari. Per esempio, il test per il citomegalovirus (CMV) un classico test opzionale comunemente effettuato. Il CMV pu persistere nei tessuti e nei leucociti di persone asintomatiche per molti anni dopo l infezione iniziale. Le unit provenienti da persone prive di anticorpi anti-CMV hanno un rischio ridotto di trasmettere linfezione, in confronto alle unit non testate (e non leucodeplete). Soltanto una piccola minoranza di unit positive al test per anti-CMV trasmetter linfezione. Tuttavia, non esiste, attualmente, alcun modo di distinguere le unit anticorpo-positive infettanti da quelle con anti-CMV ma non infettanti. La ricerca di routine degli anticorpi anti-CMV non richiesta dagli Standard AABB2(p43), ma, se effettuata, dovranno essere applicate le consuete garanzie di qualit. Le pi comuni metodiche per individuare gli anticorpi anti-CMV sono l EIA e lagglutinazione al lattice.
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Sono anche disponibili altri metodi come lemoagglutinazione indiretta, la fissazione del complemento e limmunofluorescenza.
lImpiego del Sangue Umano e degli Emocomponenti 14 , comprese le dimensioni delletichetta, quelle dei caratteri, le diciture, gli spazi e gli adesivi da utilizzare) devono essere rigorosamente controllati. L ISBT 128 Il sistema di etichettatura ISBT 128 definito a livello internazionale ed basato sulla simbologia di bar-code denominata Code 128. Esso standardizza letichettatura del sangue, in modo che le etichette bar-code possono essere lette dai Centri Sangue e dai Servizi Trasfusionali di tutto il mondo. Il sistema permette che il numero assegnato a ununit di sangue (numero identificativo) sia unico. Il numero unico consente di seguire lunit di sangue dal donatore al ricevente, indipendentemente dal luogo dove il sangue stato raccolto o trasfuso. Come descritto nel Consensus Standard dellIndustria Statunitense per lEtichettatura Uniforme del Sangue e degli Emocomponenti utilizzando ISBT 12815, le informazioni contenute sulletichetta, la sua posizione e le diciture esatte sono standardizzate. LISBT 128 differisce dal sistema precedente, che utilizzava la simbologia CODABAR, in quanto prevede sulletichetta informazioni pi specifiche. Uno dei vantaggi del sistema standardizzato che le informazioni supplementari consentono una migliore definizione dei codici del prodotto. Altre modifiche riguardano un numero identificativo della donazione pi esteso che comprende lidentificazione della struttura di prelievo, il numero del lotto di produzione in bar-code, il tipo di sacca e quantaltro, la data di scadenza in bar-code, un codice per le analisi speciali. Luso di etichette bar-code standardizzate, generate informaticamente (con la possibilit di meglio differenziare gli emocomponenti, le metodiche della loro preparazione, le date di scadenza) aumenta lefficienza, laccuratezza e, in definitiva, la sicurezza degli emocomponenti etichettati. Per esempio, letichetta ISBT 128 mostra in maniera evidente che ununit autologa a rischio biologico non ununit standard, indicando il gruppo sanguigno con caratteri differenti, pi piccoli e
Etichettatura, registrazioni, quarantena

Etichettatura Letichettatura un processo che racchiude una revisione finale delle registrazioni riguardanti la storia clinica del donatore, il prelievo, le analisi effettuate, le modifiche degli emocomponenti, i controlli di qualit e ogni ulteriore informazione raccolta dopo la donazione. Comprende anche una valutazione delle etichette dei componenti e i controlli effettuati per garantire che tutte le etichette siano conformi ai requisiti regolamentari e che forniscano informazioni accurate sul contenuto del sangue e degli emocomponenti1,8. Tutte le etichette degli emocomponenti devono soddisfare i requisiti richiesti dagli Standard AABB2(p12) e dalle normative FDA. I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali devono assicurarsi che letichettatura sia precisa e controllata. Prima di iniziare il procedimento di etichettatura, dovrebbe essere messo in atto un sistema o una procedura che garantiscano luso di etichette appropriate. Questo processo dovrebbe comprendere la garanzia di un formato di etichette accettabile, lispezione al loro ricevimento, una conservazione e una distribuzione sicure, larchiviazione delle etichette obsolete e la disponibilit di un elenco di quelle in uso. Inoltre, le procedure dovrebbero descrivere le modalit di produzione di nuove etichette, le loro variazioni e le modifiche relative al controllo di emocomponenti alterati o di nuova produzione. Le etichette dovrebbero essere controllate per il corretto codice di prodotto dellemocomponente da etichettare, che dipende dalla modalit di raccolta, dallanticoagulante e dalle modifiche intervenute nellemocomponente durante la sua preparazione. Tutti gli aspetti delletichettatura (letichetta della sacca, cos come la Circolare Informativa per
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utilizzando lo spazio normalmente riservato al gruppo per un simbolo di rischio biologico. Laderenza alle pertinenti linee guida assicura la conformit agli Standard AABB2(p12) e alle norme FDA. La comunit trasfusionale USA stata recentemente invitata da una direttiva generale del Ministro della Salute e dei Servizi Umani e da un successivo progetto dellFDA, alladesione uniforme a questo pi efficace sistema di etichettatura. Fino a che le nuove linee guida internazionali non saranno realizzate, resta in vigore la linea guida FDA per lEtichettatura Uniforme del 1985. Maggiori informazioni sul sistema ISBT 128 sono disponibili al sito www.iccbba.com del Consiglio Internazionale delle Comunit per lAutomazione nei Servizi Trasfusionali. Requisiti delle etichette Le informazioni elencate di seguito, devono essere stampate in modo chiaro e leggibile su unetichetta saldamente attaccata al contenitore di tutte le unit di sangue e di emocomponenti: il nome corretto dellemocomponente, in posizione preminente; un identificativo unico, numerico o alfanumerico, che colleghi lunit originale al donatore e ciascun emocomponente allunit originale; per gli emocomponenti, il nome, lindirizzo e il numero di licenza FDA o il numero di registrazione (quello appropriato dei due) della struttura che ha prelevato il sangue o lemocomponente. Letichetta deve riportare il nome e lubicazione di tutte le strutture che hanno partecipato alla produzione dellemocomponente, comprese quelle responsabili del lavaggio, dellirradiazione e della leucodeplezione mediante filtrazione. Se una procedura eseguita a contratto, ed condotta sotto il controllo della struttura contraente, richiesto solo il nome di quella struttura. Non dovrebbero essere presenti pi di due identificativi alfanumerici su ogni unit; le date di scadenza, con giorno, mese e anno. Se la durata del prodotto di 72 ore, o inferiore, deve essere indicata anche lora di
scadenza; la quantit di sangue prelevato; il tipo e la quantit di anticoagulante (dati non richiesti per emazie congelate, deglicerolizzate, ringiovanite o lavate); per il sangue e per ogni emocomponente, compresi quelli ottenuti da pool, deve comparire, sul contenitore, il volume approssimativo; temperatura di conservazione raccomandata; il gruppo ABO e il tipo Rh; linterpretazione del test per la ricerca di anticorpi irregolari, se positivo, per i componenti che contengono plasma (dato non richiesto per emazie congelate, deglicerolizzate, ringiovanite o lavate); i risultati di test o di procedimenti non standard, effettuati in quanto necessari per la sicurezza e lefficacia del prodotto. Non necessario che siano riportati sulletichetta i test eseguiti di routine per garantire la sicurezza dellunit, purch siano elencati nella Circolare Informativa per lImpiego del Sangue Umano e degli Emocomponenti14; il riferimento alla Circolare Informativa per lImpiego del Sangue Umano e degli Emocomponenti 14 , che deve essere disponibile per la distribuzione e che contiene informazioni sul meccanismo dazione, sulle indicazioni, sulle controindicazioni, sul dosaggio, sulle modalit di somministrazione, sugli effetti collaterali e sui rischi; istruzioni o precauzioni per luso essenziali, ivi comprese le avvertenze che il componente pu trasmettere agenti patogeni o altre informazioni, tipo Solo su prescrizione medica o Identificare correttamente il ricevente; informazioni sulle caratteristiche del donatore (donatore autologo, donatore retribuito, donatore volontario), evidenziate in maniera non meno evidente rispetto alla denominazione dellemocomponente; ogni soluzione additiva, sedimentante o crioprotettiva, che potrebbe essere ancora presente nellemocomponente.
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Etichettature speciali I componenti cellulari, distribuiti come Leucodepleti, devono essere etichettati come tali. Il nome, il volume finale dellemocomponente e un identificativo unico per un pool deve comparire per tutti i componenti prodotti da pool. Il numero di unit che costituiscono un pool e il loro gruppo ABO e tipo Rh devono essere riportati sulletichetta o su un cartellino legato alla sacca. I numeri identificativi delle singole unit che costituiscono un pool non dovrebbero essere riportati sulletichetta, ma devono rimanere delle registrazioni della struttura che ha preparato il pool. Gli emocomponenti cellulari, distribuiti come CMV negativi, devono essere etichettati come tali. Gli emocomponenti irradiati devono portare lapposita etichetta. Registrazioni Le regole della corrente buona prassi di fabbricazione ( current Good Manufacturing Practice - cGMP), come definite dal Titolo 21 CFR ( Code of Federal Regulations), Parti 200 e 6006,7,1618, stabiliscono che la produzione principale e le registrazioni di controllo devono far parte del processo di etichettatura. Tali registrazioni devono essere descritte nelle procedure della struttura. Prima della etichettatura queste registrazioni devono essere controllate per stabilirne laccuratezza e la completezza. Date e firme (sia elettroniche che manuali) appropriate devono documentare lavvenuto controllo. Registrazioni di controllo Le registrazioni di controllo comprendono, ma non si limitano, a quanto riportato di seguito: procedura di donazione: che sulla cartella del donatore risulta che egli ha risposto a tutte le domande, che il modulo di consenso stato firmato, che tutti gli esami pre-donazione (emoglobina, pressione) sono accettabili; che il controllo finale documentato da personale qualificato;
test infettivologici: se eseguiti presso la struttura di raccolta, che i controlli di qualit e le prestazioni sono accettabili; che la manutenzione quotidiana degli strumenti stata effettuata ed accettabile; che i risultati finali sono stati controllati, per identificare date e persone che hanno eseguito il controllo; registro dei donatori sospesi: che la lista dei donatori sospesi stata controllata per assicurarsi che il donatore sia idoneo; preparazione degli emocomponenti: che tutto il sangue e tutti gli emocomponenti sono stati lavorati o modificati in condizioni controllate di temperatura e di altri requisiti fisici richiesti per ciascun componente; trasferimento delle registrazioni: nel caso in cui i test di controllo vengano effettuati in una struttura esterna, che tutte le registrazioni di questa struttura sono aggiornate e che indicata la pertinente licenza. Le registrazioni, elettroniche o manuali, devono trasferire i dati in maniera appropriata. Tutte le registrazioni trasferite elettronicamente devono essere trasmesse con un sistema preventivamente convalidato. Il trasferimento dei risultati deve essere effettuato con un sistema che identifichi, in maniera appropriata, i risultati delle analisi condotte su tutto il sangue e su tutti gli emocomponenti; quarantena: che ogni unit non conforme stata adeguatamente isolata. Registrazione delle produzioni Le registrazioni relative alle principali produzioni devono permettere di rintracciare: le date di tutte le lavorazioni e delle modifiche attuate; lidentificazione delle persone e degli strumenti coinvolti nelle varie fasi della produzione; lidentificazione dei lotti e dei materiali utilizzati; i pesi e le misure utilizzati nel corso delle produzioni; i risultati dei controlli interni del laboratorio (su temperature, frigoriferi e quantaltro); lispezione dellarea risevata alletichettatura, prima e dopo luso; la resa degli emocomponenti, se del caso;
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i controlli sulletichettatura; le sacche e i contenitori secondari utilizzati nelle procedure; ogni campionatura effettuata; lidentificazione delle persone che hanno effettuato e controllato ogni fase della produzione; ogni indagine effettuata su emocomponenti non conformi; i risultati delle verifiche su tutte le procedure controllate; Quarantena Prima delletichettatura finale, vi deve essere una procedura per isolare sangue ed emocomponenti non conformi dal procedimento di etichettatura, fin tanto che non si siano eseguite ulteriori indagini. Tale procedura deve essere convalidata per individuare e isolare, in ogni area critica di raccolta, di analisi e di lavorazione, tutto il sangue e gli emocomponenti non conformi. Tale procedura deve anche registrare ogni informazione verbale (per esempio, le chiamate telefoniche) giunta alla struttura di raccolta dopo il prelievo. Tutte le unit non conformi devono rimanere in quarantena, sin tanto che non siano state sottoposte a indagine e ogni problema sia stato risolto. Le unit potranno, poi, essere eliminate, etichettate come non conformi (per esempio, unit autologhe) o etichettate adeguatamente per luso trasfusionale, se le indagini hanno risolto tutti i problemi. Se non si riesce a risolvere la non conformit, e le unit sono destinate a uso allogenico, esse devono essere eliminate.
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Industry: United States industry consensus standard for the uniform labeling of blood and blood components using ISBT 128, Version 1.2.0. (November 28, 1999) Rockville, MD: CBER Office of Communication, Training, and Manufacturers Assistance, 1999. 16. Code of federal regulations. Title 21 CFR 606.210, and 606.211. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). 17. Food and Drug Administration. Guidelines for the uniform labeling of blood and blood components. (August 1985) Rockville, MD: CBER Office of Communication, Training and Manufacturers
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Letture consigliate AABB, American Red Cross, and Americas Blood Centers. Circular of information for the use of human blood and blood components. Bethesda, MD: AABB, 2002.
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Capitolo 8
Raccolta, preparazione, conservazione, e distribuzione di componenti ottenuti da donazioni di sangue intero
I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali condividono, nellattivit di produzione di emocomponenti, uno scopo comune: fornire prodotti sicuri ed efficaci, che siano di beneficio per i riceventi cui sono destinati. A questo fine, e in armonia con le correnti regole di buona prassi di fabbricazione (current Good Manufacturing Practice - cGMP) emanate dalla FDA (Food and Drug Administration), tutti i processi connessi alla raccolta, ai controlli analitici, alla preparazione, alla conservazione e al trasporto del sangue e dei suoi componenti, comprese le procedure, il personale, i reagenti, le apparecchiature e il contenuto degli emocomponenti stessi, sono sottoposti a monitoraggio di qualit. Le procedure dovrebbero garantire lefficacia e la qualit del prodotto finale, ridurre al minimo la contaminazione e la proliferazione batterica, prevenire o ritardare le dannose modificazioni fisiche e chimiche che si verificano quando il sangue viene conservato.
anticoagulante-conservante della sacca di raccolta. Viene comunemente utilizzato per la preparazione degli emocomponenti. Dopo 24 ore di conservazione, diventa, essenzialmente, una sospensione di globuli rossi in una soluzione proteica equivalente al plasma liquido, con un ematocrito minimo del 33% circa. Concentrati eritrocitari I concentrati eritrocitari sono unit di sangue intero, dalle quali stata rimossa la maggior parte del plasma (vedi Metodo 6.4). Se preparati da sangue intero raccolto in sacche contenenti citratofosfato-destrosio (CPD), citrato-fosfato-destrosiodestrosio (CP2D), o citrato-fosfato-destrosioadenina (CPDA-1), il loro ematocrito finale deve essere = 80%. I sistemi di conservazione degli eritrociti con soluzioni additive consistono in una sacca di raccolta primaria contenente un anticoagulante-conservante con almeno due sacche satelliti connesse ad essa: una di esse vuota e una contiene una soluzione additiva. Le soluzioni additive contengono cloruro di sodio, destrosio, adenina e altre sostanze che consentono la sopravvivenza e la funzione dei globuli rossi sino a 42 giorni2 (vedi Tabella 8.1). Il volume della soluzione additiva, in un set di raccolta da 450 mL, di 100 mL, mentre, in un set di raccolta da 500 mL, di 110 mL. La soluzione additiva viene aggiunta agli eritrociti che restano nella sacca primaria, dopo che la maggior parte del plasma stata rimossa. Questo consente, ai Centri Trasfusionali, lutilizzo e il recupero della massima quantit di
Descrizione degli emocomponenti

Per maggiori dettagli sulle indicazioni e sulle controindicazioni della trasfusione, i lettori dovrebbero fare riferimento ai Capitoli 21, 23 e 24, nonch alla vigente Circolare Informativa sullUso del Sangue Umano e degli Emocomponenti1. Sangue intero Il sangue intero (SI) fresco contiene tutti i componenti del sangue, pi la soluzione
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plasma e anche la preparazione di concentrati eritrocitari con ematocrito finale compreso fra il 55 e il 65%, livello che permette uneccellente velocit di flusso e una facile somministrazione. I concentrati eritrocitari possono essere preparati in qualsiasi momento della loro durata di vita, ma le soluzioni additive devono essere aggiunte entro lintervallo di tempo indicato dal produttore, generalmente entro le prime 72 di conservazione. La loro durata, se conservati a 1-6 C, dipende dalla soluzione anticoagulante-conservante utilizzata e dal metodo di preparazione. Piastrine I concentrati piastrinici sono prodotti da unit di sangue intero la cui temperatura non sia scesa sotto i 20 C. Il plasma ricco di piastrine (PRP) viene separato entro 4 ore dal prelievo o entro lintervallo di tempo specificato dalle indicazioni duso dei sistemi di raccolta, lavorazione e conservazione del sangue, tipicamente entro 8 ore3. Le piastrine vengono concentrate con una successiva centrifugazione e con la rimozione della maggior parte del plasma supernatante. Un procedimento per la preparazione del concentrato piastrinico da singola unit di sangue intero, illustrato nel Metodo 6.13. Lunit finale dovrebbe contenere piastrine risospese in una quantit di plasma adeguata a mantenere un pH accettabile, in genere da 40 a 70 mL. Bench si tratti di una metodica non approvata negli USA, in Europa i concentrati piastrinici vengono comunemente preparati
utilizzando il buffy-coat come prodotto intermedio. Con questo metodo, la centrifugazione iniziale ad alto numero di giri, in modo che le piastrine si concentrino nel buffy-coat. Il plasma povero di piastrine e il concentrati eritrocitari possono essere separati usando un dispositivo top-and-bottom. I buffy-coat sono successivamente centrifugati a bassa velocit per allontanare i leucociti o, pi frequentemente, assemblati prima della conservazione (modalit attualmente non consentita dalla FDA), centrifugando poi il pool a bassa velocit, per ottenere il plasma ricco di piastrine4-6. Plasma Il plasma di ununit di sangue intero pu essere separato in ogni momento della conservazione, sino a 5 giorni dopo la data di scadenza dellunit. Se conservato congelato a 18 C o a temperature inferiori, questo componente noto come plasma e pu essere usato sino a 5 anni dopo la data di raccolta. Se non congelato, esso viene denominato plasma liquido, conservato fra 1 e 6 C, e pu venire trasfuso sino a 5 giorni dopo la data di scadenza del sangue intero dal quale stato preparato. Il plasma fresco congelato (PFC) preparato da sangue intero, sia dopo centrifugazione primaria con suddivisione in plasma e concentrati eritrocitari, sia dopo centrifugazione secondaria di plasma ricco di piastrine. Il plasma deve essere congelato entro 8 ore dalla raccolta3 (vedi Metodi 6.10 e 6.13).
Tabella 8.1 - Composizione delle soluzioni additive (SA) in mg/100 mL Sostanze Destrosio Adenina Fosfato monobasico di sodio Mannitolo Cloruro di sodio Citrato di sodio Acido citrico SA-1 (Adsol) 2.200 27 0 750 900 0 0 SA-3 (Nutricel) 1.100 30 276 0 410 588 42 SA-5 (Optosil) 900 30 0 525 877 0 0
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Capitolo 8: Produzione e distribuzione di componenti ottenuti da donazioni di sangue intero
I Centri Trasfusionali, spesso, convertono il plasma e il plasma liquido in un componente non autorizzato, detto plasma di recupero (o per lavorazione), che viene, di norma, inviato allindustria di frazionamento e lavorato per produrre emoderivati, come albumina e/o immunoglobuline. Per inviare al frazionamento il plasma di recupero, la struttura di raccolta deve avere un accordo di fornitura a breve con il produttore7. Dato che il plasma di recupero non ha scadenza, le registrazioni relative a questo emocomponente devono essere conservate a tempo indeterminato. Per ulteriori discussioni su altri prodotti plasmatici, vedi pi avanti in questo capitolo. Crioprecipitato di fattore anti-emofilico Il crioprecipitato di fattore anti-emofilico (AHF) la parte del plasma, insolubile a freddo, che precipita quando il plasma fresco congelato viene scongelato fra 1 e 6 C. Si tratta, essenzialmente, di un concentrato di glicoproteine ad alto peso molecolare, noto anche come CRIO. Questo emocomponente si prepara da ununita di sangue intero, raccolta in CPDA-1, in CPD o in CP2D, e viene risospeso in meno di 15 mL di plasma. Contiene = 80 UI di Fattore VIII (Fattore anti-emofilico), >150 mg di fibrinogeno e la maggior parte di Fattore XIII, originariamente contenuto nel plasma fresco. Il CRIO contiene sia lattivit procoagulante (Fattore VIII) sia il fattore von Willebrand del complesso Fattore VIII von Willebrand. Una volta separato, il CRIO viene ricongelato entro 1 ora dalla preparazione e conservato a una temperatura di 18 C o inferiore, fino a 1 anno dalla data del prelievo. Vedi Metodo 6.11 per un procedimento di preparazione. Plasma a basso contenuto di crioprecipitato Se il crioprecipitato stato rimosso dal plasma, questo deve essere specificato sulletichetta. Quando conservato a 18 C o a temperature inferiori,questo emocomponente scade dopo 12 mesi dalla raccolta8(p59). Esso viene utilizzato prevalentemente nel trattamento della porpora trombotica trombocitopenica (PTT)9.
Granulociti I granulociti sono, di norma, raccolti con tecniche di aferesi; tuttavia i buffy-coat prodotti da unit di sangue fresco possono costituire una fonte di granulociti (<1 x 109) in situazioni di urgenza neonatale. La loro efficacia , tuttavia, controversa10. I granulociti dovrebbero essere trasfusi nel pi breve tempo possibile dopo la raccolta, ma possono essere conservati fra 20 e 24 C, senza agitazione, sino a 24 ore. Pu risultare utile programmare i test di validazione prima della raccolta. Il prodotto sta comunque diventando obsoleto.
Raccolta
La qualit degli emocomponenti ha inizio da un donatore sano e da una sede di venipuntura pulita, per ridurre al minimo le contaminazioni batteriche. Per prevenire lattivazione del sistema emocoagulativo durante la raccolta, il sangue deve essere prelevato velocemente e con il minimo traumatismo per i tessuti. Nonostante il tempo di raccolta considerato ottimale sia, di solito, compreso fra i 4 e i 10 minuti, uno studio11 ha dimostrato come piastrine e plasma fresco congelato siano di qualit soddisfacente anche dopo un prelievo durato sino a 15 minuti. In relazione a questi tempi di raccolta, si dovrebbero seguire le procedure scritte della struttura. Si dovrebbe mescolare, frequentemente e delicatamente, il sangue con la soluzione anticoagulante. Se non prevista, dopo la raccolta, una filtrazione prima della conservazione (pre-storage), il tubo che era collegato al braccio del donatore pu essere svuotato nella sacca madre, lasciato riempire e suddiviso in segmenti, in modo che esso rappresenti il contenuto della sacca per i test di compatibilit. Il sangue viene quindi refrigerato fra 1 e 6 C, a meno che non debba essere utilizzato per la produzione di emocomponenti a temperatura ambiente, nel qual caso esso dovrebbe essere raffreddato a temperature intorno ai 20 C (ma non al di sotto). Il Capitolo 4 approfondisce nel dettaglio la raccolta.
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Anticoagulanti e conservanti Il sangue intero viene raccolto in una sacca che contiene una soluzione anticoagulante-conservante autorizzata dalla FDA, progettata per prevenire la coagulazione e per mantenere la vitalit e la funzione cellulare durante la conservazione. La Tabella 8.2 mette a confronto alcune delle soluzioni pi comunemente impiegate. Il citrato previene la coagulazione chelando il calcio, inibendo cos le varie fasi calcio-dipendenti della cascata coagulativa 2 . La FDA approva la conservazione sino a 21 giorni, a 1-6 C, del sangue prelevato in CPD e in CP2D e sino a 35 giorni del sangue prelevato in CPDA-112. La maggior parte dei Centri di Raccolta, attualmente, preleva fino a 500 50 mL (450-550 mL) di sangue intero in sacche prodotte appositamente per contenere questi volumi pi ampi. Le sacche progettate per contenere 450 45 mL (405-495 mL) di sangue intero, contengono 63 mL di soluzione anticoagulante-conservante. Il volume di anticoagulante-conservante nelle sacche da 500 50 mL di 70 mL. Il volume di sangue intero che pu essere raccolto dipende dalla sacca scelta e pu variare a seconda del produttore, ma il volume totale raccolto, compresi i campioni per le analisi,non deve superare i 10,5 mL/kg di peso corporeo a donazione. Se in una sacca destinata a contenere 450 mL, si raccolgono soltanto da 300 a 404 mL di sangue intero8(p28), i globuli rossi possono essere utilizzati a scopo trasfusionale purch lunit sia etichettata Basso Volume di Emazie. Da queste unit non
si dovrebbero, tuttavia, preparare altri emocomponenti. Se si programma una raccolta di sangue intero inferiore a 300 mL, il volume della soluzione anticoagulante-conservante dovrebbe essere proporzionalmente ridotto (vedi Capitolo 4 per i calcoli relativi), per garantire lutilizzo di un giusto volume di anticoagulante (cio, di un corretto rapporto anticoagulante:sangue intero). Trasporto dal luogo di raccolta Il sangue intero dovrebbe essere trasportato, dal luogo della raccolta al laboratorio di preparazione degli emocomponenti, nel pi breve tempo possibile. Le unit dovrebbero essere raffreddate a temperature comprese fra 1 e 6 C, a meno che non si debbano raccogliere piastrine, nel qual caso lunit dovrebbe essere raffreddata intorno, ma non al di sotto, a 20 C. Il tempo che intercorre fra la raccolta e la separazione degli emocomponenti non deve superare i limiti specificati nelle direttive per la raccolta3, la lavorazione e la conservazione del sangue.
Lavorazioni prima della conservazione

Centrifugazione differenziale Per semplificare la separazione del sangue intero nei suoi componenti, il sangue viene raccolto in una sacca principale, alla quale sono collegate sino a tre sacche satelliti 5 . Le caratteristiche del set dipendono sulluso cui
Tabella 8.2 - Soluzioni anticoagulanti-conservanti (mg in 63 mL) per prelievi di 450 mL Caratteristiche e contenuto Rapporto soluzione/sangue (mL) Giorni di conservazione approvati FDA Contenuto: Citrato di sodio Acido citrico Destrosio Fosfato di sodio monobasico Adenina CPD 1,4 su 10 21 1.660 206 1.610 140 0 CP2D 1,4 su 10 21 1.660 206 3.220 140 0 CPDA-1 1,4 su 10 35 1.660 206 2.010 140 17,3
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questo destinato: preparazione di concentrati eritrocitari, concentrati piastrinici, plasma fresco congelato, CRIO o aliquote per uso neonatale. Per le procedure relative alla preparazione di specifici emocomponenti, fare riferimento ai Metodi Sezione 6. Il sangue intero deve essere separato e i componenti portati alla rispettive e opportune temperature di conservazione , entro i limiti di tempo raccomandati dai produttori delle soluzioni anticoagulanti-conservanti 3. Nelle registrazioni relative alla preparazione di emocomponenti, dovrebbero essere identificati tutti i soggetti coinvolti in ogni passaggio significativo del processo. Dato che i globuli rossi, le piastrine e il plasma hanno differente peso specifico, essi vengono separati usando la centrifugazione differenziale13. La dimensione del rotore, la velocit e la durata delle rotazioni rappresentano variabili critiche per la centrifugazione. Il Metodo 7.4 descrive come calibrare una centrifuga per la separazione di piastrine, ma ogni centrifuga deve essere calibrata, per ottimizzare velocit e tempi di rotazione, per ogni combinazione di emocomponenti e per ciascun differente tipo di sacca di raccolta. I tempi comprendono la fase di accelerazione e quella di velocit stabile, non i tempi di decelerazione. Una volta che si siano identificate le variabili operative per la preparazione dei componenti, la precisione del timer, il numero di giri al minuto, la temperatura (se del caso), le centrifughe dovrebbero essere periodicamente controllate per verificarne le prestazioni. Unaltra modalit pratica per valutare la centrifugazione, consiste nel monitorare i dati dei controlli di qualit sugli emocomponenti preparati con ciascuna centrifuga. Se la qualit del componente non soddisfa gli standard definiti (per esempio, la resa dei concentrati piastrinici insoddisfacente), si dovrebbe rivalutare lintero procedimento. I fattori che influenzano la valutazione della qualit sono la calibrazione della centrifuga, la conta iniziale di piastrine nel sangue intero, la durata della conservazione, le condizioni intercorse fra la raccolta del sangue e la preparazione del concentrato, la tecnica di
campionamento e i metodi di conteggio. Grandi centrifughe, con elevate velocit di rotazione, esercitano forze gravitazionali di migliaia di chili sulla sacca. Difetti nella sacca o nelle saldature effettuate sui tubi di connessione, possono causare rotture o perdite. Laggiunta di filtri al set di prelievo, causa ulteriori problemi per linserimento delle sacche nei cestelli della centrifuga. Le sacche possono essere rivestite da involucri di plastica, al fine di contenere ogni possibile perdita. Esse dovrebbero essere posizionate nei cestelli in modo tale che la superficie maggiore venga a trovarsi in corrispondenza della parete esterna della centrifuga, per ridurre la forza centrifuga sulle saldature. I contenuti di cestelli in posizione opposta devono essere di peso equivalente, per migliorare lefficienza della centrifuga ed evitare danni al rotore. Per il bilanciamento, preferibile limpiego di materiale solido, piuttosto che liquido. Dischi o strisce di gomma sono eccellenti mezzi per fornire spessori adatti e flessibili per il bilanciamento. I cestelli oscillanti consentono una migliore separazione fra componenti cellulari e plasma rispetto a quelli rigidi. Analisi ed etichettatura delle unit donate Il Capitolo 7 riporta dettagliate informazioni sulle analisi e sulle etichettature da eseguire sugli emocomponenti. Filtrazione Nel corso della filtrazione in linea di sangue intero, il sangue anticoagulato filtrato per gravit attraverso un filtro per la leucoriduzione, gi contenuto nel set di prelievo. Il sangue intero filtrato pu essere trasformato in concentrati eritrocitari poveri di leucociti. I filtri per la leucoriduzione del sangue intero trattengono, a vario grado, le piastrine, cos che non possibile, routinariamente, preparare concentrati piastrinici da sangue intero filtrato. Si stanno, tuttavia, studiando nuovi filtri capaci di preservare le piastrine. Questo tipo di filtrazione dovrebbe essere effettuato entro i limiti di tempo specificati dai produttori. Un filtro per leucoriduzione pu essere
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connesso allunit di sangue intero o di concentrati eritrocitari, utilizzando un dispositivo di connessione sterile. In teoria, tale filtrazione dovrebbe essere effettuata nel pi breve tempo possibile dopo il prelievo, ma ci si deve uniformare alle raccomandazioni dei produttori per lo specifico filtro utilizzato. Questo tipo di filtrazione pu essere preferibile se, per la leucoriduzione, necessario selezionare unit speciali. Nella filtrazione in linea di concentrati eritrocitari, si rimuovono, in primo luogo, dallunit di sangue intero le piastrine e/o il plasma e, in seguito, si aggiunge la soluzione additiva ai globuli rossi. Successivamente gli eritrociti vengono filtrati mediante un filtro in linea e trasferiti ad un contenitore di conservazione secondario. Questa fase della filtrazione dovrebbe essere effettuata nel pi breve tempo possibile, entro i limiti consentiti per lo specifico filtro utilizzato. Le piastrine leucoridotte possono essere preparate dal plasma ricco di piastrine impiegando filtri in linea14. Il plasma fresco congelato preparato con questo passaggio intermedio, avr, caratteristicamente, un contenuto di leucociti inferiore a 5 x 106. Congelamento Componenti privi di cellule Quando conservato a 18 C o a temperature inferiori, il plasma fresco congelato contiene il livello massimo di fattori, labili e non, della coagulazione (circa 1 UI per mL) e ha una durata di vita di 12 mesi dalla data del prelievo. Il plasma fresco congelato congelato e mantenuto a 65 C pu essere conservato sino a 7 anni. Vedi il Metodo 6.10 per i dettagli sulla sua preparazione. Il plasma pu essere congelato rapidamente ponendo la sacca: 1) in un bagno dighiaccio secco-etanolo o di ghiaccio secco-antigelo, 2) fra strati di ghiaccio secco, 3) in un abbattitore, 4) in un congelatore meccanico mantenuto a 65 C o a temperature inferiori. La sacca di plasma congelata in un bagno liquido dovrebbe essere rivestita da un involucro di plastica, per proteggere il contenitore da alterazioni chimiche. Quando si utilizza un congelatore meccanico, si deve fare molta
attenzione ad evitare un rallentamento del processo di congelamento legato allintroduzione contemporanea di troppe unit. pratica prudente utilizzare un metodo idoneo a evidenziare scongelamenti involontari del plasma durante la conservazione, come: 1. premere una provetta sulla sacca durante la procedura di congelamento, per lasciare un solco che scomparir se lunit si scongela. Poi rimuovere la provetta; 2. congelare il plasma in posizione orizzontale su una superficie piana, ma conservarlo verticalmente. Le bolle daria, intrappolate lungo la superficie maggiore della sacca, situata in posizione superiore durante la procedura di congelamento, si sposteranno verso lapice se lunit si scongela in posizione verticale; 3. sistemare un elastico attorno alla sacca contenente il plasma ancora liquido e rimuoverlo dopo il congelamento, al fine di creare un solco, che scomparir dopo un eventuale scongelamento. Il plasma separato e congelato a 18 C fra 8 e 24 ore (che non rispetta, cio, i pi rigorosi requisiti temporali del plasma fresco congelato) pu essere etichettato come Plasma congelato entro 24 ore dal prelievo. Esso contiene tutte le proteine stabili che si rinvengono nel plasma fresco congelato (vedi Tabella 8.3). Per il suo scongelamento, si applicano le linee guida del plasma fresco congelato. Componenti cellulari La conservazione allo stato congelato pu prolungare significativamente la durata dei componenti eritrocitari. Sfortunatamente, il processo pu anche causare danni cellulari e incrementare considerevolmente i costi. Effetti del congelamento e dello scongelamento. Quando si congelano cellule senza proteggerle, possono verificarsi danni dovuti alla disidratazione cellulare o a traumi meccanici provocati dalla formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari. Per velocit di congelamento inferiori a 10 C/minuto, lacqua extracellulare congela prima di quella intracellulare, determinando un gradiente
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osmotico che causa la diffusione dellacqua dallinterno allesterno della cellula. Questo provoca una disidratazione intracellulare. Il controllo della velocit di congelamento non tuttavia, di per se, sufficiente a prevenire il danno celullare, per cui necessario utilizzare sostanze crioprotettive. Gli agenti crioprotettivi si classificano come penetranti e non-penetranti. Gli agenti penetranti, come il glicerolo, sono piccole molecole che attraversano liberamente la membrana cellulare e penetrano nel citoplasma. I crioprotettivi intracellulari forniscono una forza osmotica che impedisce allacqua di uscire dalla cellula quando si forma ghiaccio extracellulare. Una elevata concentrazione di crioprotettivi previene la formazione di cristalli di ghiaccio e il conseguente danno alla membrana15. Il glicerolo, un alcol triidrato, un fluido incolore, dolce al sapore, sciropposo, miscibile con lacqua. Dal punto di vista farmacologico, il glicerolo relativamente inerte. Gli agenti crioprotettivi non penetranti, quali lamido idrossietilico, sono grosse molecole, che non entrano nelle cellule. Essi proteggono le cellule mediante un processo noto come vetrificazione in quanto formano una conchiglia vitrea non cristallina attorno alle cellule. Questo previene la perdita di acqua e i danni da disidratazione
e modifica la temperatura alla quale la soluzione passa dallo stato liquido a quello solido. Congelamento di globuli rossi . La conservazione di eritrociti allo stato congelato viene principalmente utilizzata per unit di gruppo raro o autologhe. Le emazie congelate possono essere efficacemente immagazzinate per mobilitazioni militari o per disastri civili, ma lalto costo e la durata, limitata a 24 ore, dopo deglicerolizzazione le rendono poco adatte per la gestione routinaria delle scorte. Di recente, stato approvato un sistema chiuso che consente una durata, dopo scongelamento, di 2 settimane, se il sangue raccolto in CPDA-1, congelato entro 6 giorni e conservato a 80 C. Due sono le concentrazioni di glicerolo impiegate per criopreservate eritrociti, come illustrato nella Tabella 8.3. Questo Capitolo e i Metodi 6.7 e 6.8 riguardano soltanto la tecnica di congelamento ad alta concentrazione di glicerolo, utilizzata dalla maggior parte delle Strutture Trasfusionali. Sono state elaborate modifiche alle procedure di glicerolizzazione, congelamento, conservazione, scongelamento e deglicerolizzazione di globuli rossi, che sono discusse in altra pubblicazione16. Sono disponibili diverse strumentazioni che automatizzano parzialmente la glicerolizzazione
Tabella 8.3 - Paragone fra i due metodi usati per crioconservare emazie Problematiche Concentrazione finale del glicerolo (peso/vol.) Temperatura iniziale di congelamento Velocit di congelamento Controllo della velocit di congelamento Tipo di congelatore Temperatura massima di conservazione Modifiche nella temperatura di conservazione Tipo di sacche per la conservazione Sostanze da usarsi per le spedizioni Speciali apparecchi per la deglicerolizzazione Tempi di deglicerolizzazione Ematocrito Basso glicerolo Alto glicerolo
40% (approssim.) 20% (approssim.) 80 C 196 C Lenta Rapida No S Meccanico Azoto liquido 65 C 120 C Si pu scongelare e ricongelare Critiche Polivinilcloride, poliolefin Poliolefin Ghiaccio secco Azoto liquido S No 20-40 minuti 30 minuti 55-70% 50-70%
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e la deglicerolizzazione dei globuli rossi. I produttori di ogni strumento forniscono dettagliate istruzioni per luso. Il sangue da congelare pu essere prelevato in CPD, CP2D o in CPDA-1 e conservato come sangue intero o come concentrati eritrocitari (compresi i concentrati eritrocitari in soluzioni additive). Normalmente, le emazie sono glicerolizzate e congelate entro 6 giorni dal prelievo o ringiovanite e congelate sino a 3 giorni dopo la loro scadenza, ma emazie conservate in soluzioni additive sono state congelate sino a 42 giorni dopo la raccolta, con un recupero adeguato17,18. Alcune procedure di glicerolizzazione richiedono la rimozione della maggior parte del plasma e delle soluzioni additive, altre no. La concentrazione di glicerolo usata per il congelamento ipertonica rispetto al sangue. Una sua immissione rapida pu causare danno osmotico ai globuli rossi, che si evidenzia, sotto forma di emolisi, soltanto dopo lo scongelamento. Pertanto, quando si inizia il processo di criopreservazione, il glicerolo dovrebbe essere introdotto lentamente per consentirne lequilibrio allinterno dei globuli rossi. Il Dipartimento della Difesa statunitense ha adottato un metodo per la glicerolizzazione ad alta concentrazione, che usa un contenitore primario per la raccolta da 800 mL (vedi Metodo 6.8), adatto al congelamento. Dato che lagente crioprotettivo per il congelamento viene trasferito direttamente nel contenitore primario, vi sono minori possibilit di contaminazione e/o di errori di identificazione. Inoltre, la quantit di glicerolo extracellulare minore, per cui la conservazione ed il trasporto di unit preparate con questo metodo risultano pi efficienti. Sacche di conservazione. La composizione delle sacche pu essere rilevante per la procedura di congelamento; un minor grado di emolisi pu verificarsi in sacche di poliolefin, rispetto a quelle in polivinilcloride (PVC). Il contatto fra emazie e la superficie delle sacche in PVC pu determinare un danno che aumenta leggermente lemolisi dopo deglicerolizzazione. Inoltre, le sacche in poliolefin sono meno fragili a 80 C ed meno probabile
che si rompano durante il trasporto o durante le lavorazioni, rispetto a quelle in PVC. Processo di congelamento. I globuli rossi, congelati entro 6 giorni dalla raccolta con una concentrazione finale di glicerolo del 40% (peso/volume), devono essere conservati a 60 C o a temperature inferiori. I globuli rossi sono, di solito, sistemati in contenitori rigidi, per proteggere la sacca di plastica durante il congelamento, la conservazione e lo scongelamento. Bench possano trascorrere sino 18 ore a temperatura ambiente fra la glicerolizzazione e il congelamento, senza aumento dellemolisi allo scongelamento, viene raccomandato un intervallo non superiore a 4 ore16. Con lattuale metodo con glicerolo al 40% (peso/volume), il controllo della velocit di congelamento non necessario; il congelamento viene effettuato sistemando il contenitore dei globuli rossi direttamente in un congelatore a 80 C. Ricongelamento di globuli rossi deglicerolizzati. Pu essere opportuno, occasionalmente, ricongelare emazie scongelate, che non sono state utilizzate come previsto o che sono state scongelate involontariamente. Unit che erano state deglicerolizzate, conservate a temperatura di frigorifero per 20 ore, e, poi, riglicerolizzate e ricongelate non hanno mostrato riduzione di adenosin trifosfato (ATP), 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG), o della sopravvivenza in vivo19 e globuli rossi sottoposti per tre volte a glicerolizzazione, congelamento e scongelamento hanno mostrato una diminuzione del 27% dellemoglobina totale20. Gli Standard AABB per le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali non prendono in considerazione il ricongelamento di unit scongelate, dal momento che questa non pu essere considerata una pratica di routine. Se unit scongelate vengono ricongelate, le registrazioni dovrebbero documentare la loro validit e i motivi del ricongelamento. Congelamento di piastrine. Forse a causa della loro maggiore complessit, le piastrine sembrano subire un danno pi rilevante durante la crioconservazione rispetto ai globuli rossi, nonostante diversi protocolli abbiano utilizzato con
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successo il dimetilsulfossido come crioprotettivo21,22. Dato che il recupero delle piastrine dopo scongelamento e la loro funzionalit si riducono significativamente, rispetto alle piastrine conservate allo stato liquido, luso di piastrine crioconservate non molto diffuso. Lutilizzo principale di questa procedura riguarda il congelamento di piastrine autologhe per eventuali impieghi futuri. Si tratta, essenzialmente, di una tecnica di ricerca. Irradiazione Gli emocomponenti cellulari possono essere irradiati prima della conservazione, allo scopo di prevenire la Graft versus Host Disease (GvHD) associata a trasfusione. Lirradiazione non riduce la durata di piastrine e granulociti, ma gli eritrociti scadono 28 giorni dopo lirradiazione o alla fine del periodo di conservazione, a seconda della data che viene prima. Assemblaggio Dispositivi per la connessione sterile vengono utilizzati per collegare, ad una unit di sangue, sacche aggiuntive e tubi compatibili senza compromettere la sterilit del sistema. La durata di vita dei componenti cosi preparati la stessa di quelli preparati con sistema chiuso, ad eccezione delle piastrine che scadono 4 ore dopo lassemblaggio. Tutte le saldature effettuate con sistemi di connessione sterile devono essere ispezionate per completezza, integrit, perdite o bolle daria; le procedure devono definire le azioni da intraprendere se la saldatura non soddisfacente. Le registrazioni dovrebbero comprendere la documentazione dei prodotti sottoposti a saldatura, dei controlli di qualit sulle saldature e del numero di lotto dei materiali monouso23. Crioprecipitato di fattore anti-emofilico Le unit di CRIO possono essere assemblate prima di essere etichettate, congelate e conservate. Se raggruppate immediatamente dopo la preparazione, impiegando una tecnica asettica, e prontamente ricongelate,
lemocomponente che risulta va etichettato come Pool di crioprecipitato di fattore anti-emofilico, con il numero di unit assemblate riportato sulletichetta. Anche il volume di soluzione fisiologica, eventualmente aggiunta per favorire lassemblaggio, deve comparire sulletichetta. La dichiarazione pu comparite nella Circolare Informativa sullUso del Sangue Umano e degli Emocomponenti1, invece che sulletichetta del contenitore. La struttura che ha preparato il pool deve conservare le registrazioni atte a consentire di ricondurre ogni singolo donatore allidentificativo unico usato per il componente assemblato8(p26). Se un pool o un componente preparati con sistema aperto devono essere conservati congelati, essi andrebbero posti in congelatore entro 6 ore dal momento in cui la saldatura stata aperta. Sia lAABB che la FDA richiedono che la trasfusione di pool scongelati e conservati fra 20 e 24 C venga effettuata entro 4 ore8(p58). Piastrine E possibile lassemblaggio pre-storage di piastrine prodotte da plasma ricco di piastrine derivati da sangue intero, utilizzando un dispositivo di connessione sterile e un contenitore adatto alla conservazione di concentrati ad elevato contenuto di piastrine. I concentrati piastrinici possono essere leucodepleti mediante filtrazione in linea14 o possono essere assemblati in un contenitore da assemblaggio e, successivamente, filtrati e conservati in un contenitore da conservazione . Nonostante i vigenti requisiti FDA limitino la durata a 4 ore, studi su questi pool di concentrati piastrinici leucodoepleti pre-storage, mostrano un buon mantenimento delle funzioni piastriniche fino a 7 giorni24, senza alcuna evidenza di reazione linfocitaria mista. Ciononostante, sia lAABB che la FDA richiedono che tali concentrati piastrinici siano trasfusi entro 4 ore dallassemblaggio. Come specificato in precedenza, i concentrati piastrinici da buffy-coat sono usualmente raggruppati pre-storage, filtrando il plasma ricco di piastrine dopo la centrifugazione4-6.
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Conservazione
Conservazione in frigoriferi Il sangue deve essere conservato esclusivamente in frigoriferi che, per caratteristiche e capacit, siano in grado di mantenere, in tutto il loro volume interno, una temperatura compresa fra 1 e 6 C. Ci deve essere un sistema capace di monitorare continuamente le temperature e di registrarle almeno ogni 4 ore, e un sistema di allarme in grado di emettere un segnale acustico, che si attiva prima che il sangue raggiunga temperature di conservazione inaccettabili. Linterno dei frigoriferi deve essere pulito, adeguatamente illuminato e ben ordinato. Ci devono essere aree, chiaramente indicate e separate, per: 1) sangue non ancora analizzato; 2) sangue etichettato e idoneo per la trasfusione allogenica; 3) sangue scartato, scaduto o in quarantena; 4) sangue autologo; 5) sangue autologo a rischio biologico. I frigoriferi utilizzati per la conservazione di sangue e di emocomponenti, possono anche essere usati per emoderivati, tessuti, campioni di sangue di donatori e pazienti, reagenti di laboratorio. I frigoriferi per la conservazione del sangue al di fuori delle Strutture Trasfusionali, come quelli in sale operatorie o in unit demergenza, devono rispettare gli stessi standard. Quando presente sangue, la registrazione delle temperature sempre richiesta. Di solito, risulta pi pratico che il monitoraggio di questi frigoriferi sia a carico del personale della Struttura Trasfusionale. Conservazione allo stato congelato La FDA autorizza la conservazione di globuli rossi congelati sino a 10 anni, quando questi vengono preparati con metodi ad alta concentrazione di glicerolo (40% peso/volume). Unit conservate sino a 21 anni sono state trasfuse con successo. Il direttore medico di una Struttura Trasfusionale potrebbe desiderare di allungare il periodo di conservazione; tuttavia, la conservazione oltre i 10 anni richiede circostanze eccezionali. La natura particolare di queste unit, e la
ragione per conservarle oltre il periodo di 10 anni, dovrebbero essere documentate. Quando le unit sono destinate a una conservazione a lungo termine, molti considerano prudente congelare campioni di siero o di plasma, nellevenienza che in futuro siano introdotti nuovi test di screening sul sangue donato. Il tipo di ogni campione conservato, la data di raccolta, la data del congelamento, la sua ubicazione (se necessario) dovrebbero essere compresi nelle registrazioni relative al sangue congelato. possibile che non tutti questi campioni siano conformi ai requisiti per nuovi test. Se i campioni congelati non sono disponibili o non sono appropriati per le analisi, la Struttura Trasfusionale pu tentare di richiamare il donatore per sottoporlo ai nuovi test. Le unit di emazie di gruppo raro congelate, che non siano state analizzate per tutti i marcatori infettivologici richiesti, dovrebbero essere trasfusi soltanto dopo aver ben valutato rischi e benefici per il paziente. Letichetta dovrebbe riportare che lunit non stata esaminata completamente e indicare i risultati mancanti. I congelatori hanno gli stessi requisiti relativi ai sistemi di monitoraggio delle temperature e di allarme dei frigoriferi, e devono essere mantenuti puliti e ben organizzati. I congelatori destinati alla conservazione del plasma devono mantenere una temperatura al di sotto di 18 C (molti funzionano a 30 C o a temperature pi basse); i congelatori per unit di emazie devono mantenere temperature inferiori a 65 C (molti mantengono temperature inferiori a 80 C). I congelatori auto-scongelanti devono mantenere temperature accettabili durante tutto il ciclo di scongelamento. I sensori di allarme dei congelatori devono essere accessibili e situati vicino allo sportello, bench quelli pi vecchi possano avere sensori localizzati fra le pareti interne ed esterne, dove non sono n visibili n accessibili. In questi casi lubicazione del sensore pu essere richiesta al produttore, e pu essere posto un indicatore permanente sulla parete in corrispondenza di esso. I bioingegneri possono essere in grado di riposizionare la termocoppia dei sensori, per una utilizzazione pi agevole.
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Anche per i contenitori di azoto liquido, utilizzati per la conservazione di unit di sangue, sono richiesti specifici requisiti relativi al sistema di allarme. Dovrebbe essere misurato il livello dellazoto liquido e il sensore sistemato in un punto al di sopra dellaltezza minima necessaria. Conservazione a temperatura ambiente Le piastrine richiedono unagitazione delicata e continua durante la conservazione, in quanto le piastrine immobili evidenziano unaumentata produzione di lattato ed una riduzione del pH. Sono disponibili agitatori ellittici, circolari o piani. Quelli ellittici non sono consigliabili per sacche da conservazione in poliolefin senza plastificante (PL-732)25. Altri componenti che richiedono temperature fra 20 e 24 C, come i crioprecipitati, possono essere mantenuti sopra un tavolo, in qualsiasi stanza con temperatura ambiente appropriata, purch questa sia registrata ogni 4 ore durante la conservazione. Dato che le temperature dellambiente oscillano, sono state costruite camere ambientali o camere per piastrine, allo scopo di fornire
temperature costanti e controllate. Queste camere sono fornite di ventilatori, registratori delle temperature e sistemi di allarme. Conservazione allo stato liquido Globuli rossi Quando gli eritrociti sono conservati fra 1 e 6 C si verificano modificazioni biochimiche; tali modificazioni, alcune delle quali reversibili, contribuiscono alle lesioni da conservazione dei globuli rossi e ad una riduzione della vitalit e del livello del 2,3-DPG, che influiscono sulla cessione di ossigeno ai tessuti26. Le modificazioni biochimiche pi importanti che si verificano nei concentrati eritrocitari conservati, sono elencate in Tabella 8.4, ma alcune di esse raramente rivestono un significato clinico, anche in pazienti sottoposti a trasfusione massiva. Lemoglobina si satura completamente con lO2 a livello dei polmoni, ma, caratteristicamente, cede solamente una parte del proprio O2 alla pi bassa pressione di ossigeno (pO2) dei tessuti normali. La relazione fra pO2 e saturazione di ossigeno dellemoglobina rappresentata dalla curva di dissociazione dellO2 (vedi Figura 8.1).
Saturazione O2 (%)
Pressione parziale di O2 Figura 8.1 - Dissociazione dellO2 dallemoglobina in condizioni normali e in eritrociti conservati oltre 14 giorni. Alla pO2 tissutale (40mmHg), viene rilasciato dal 25 al 30% dellO2 . Negli eritorciti conservati, la percentuale scender al 10-15%.
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Tabella 8.4 - Modifiche biochimiche che intervengono nei concentrati eritrocitari non leucodepleti Variabili CPD SI Giorni di conservazione % di emazie vitali a 24 ore dalla trasfusione pH (misurato a 37 C) ATP (% del valore iniziale) 2,3-DPG (% del valore iniziale) Potassio plasmatico (in mmol/L) Emoglobina plasmatica % di emolisi 0 100 7,20 100 100 3,9 17 N/A 21 80 6,84 86 44 21 191 N/A SI 0 100 7,60 100 100 4,20 82 N/A CE 0 100 7,50 100 100 5,10 75 N/A CPDA-1 SI 35 79 6.98 56 (16) <10 27,50 461 N/A CE 35 71 6,71 45 (12) <10 78,50* 658* N/A SA-1 CE 42 76 (64-85) 6.6 60 <5 50 N/A 0.5 SA-2 CE 42 84 6,5 59 <10 46 386 0,9 SA-3 CE 42 80 6,5 68.5 <5 45,6 N/A 0,6
I valori dellemoglobina plasmatica e delle concentrazioni di potassio possono essere talora pi alti in concentrati eritrocitari conservati per 35 giorni, il volume totale del plasma in queste unit di circa 70 mL. Abbreviazioni: CPD = citrato-fosfato-destrosio; CPDA-1 = citrato-fosfato-destrosio-adenina; SA-1 = soluzione additiva 1 o adsol; SA-2 = soluzione additiva 2 o nutricel; SA-3 = soluzione additiva 3 o optosil; ATP = adenosin-tri-fosfato; 2,3-DPG = 2,3 di-fosfo-glicerato; N/A = non applicabile.
Il rilascio di O2 da parte dellemoglobina, a una data pO2, influenzato dal pH dellambiente, dal livello intraraeritrocitario di 2,3-DPG, e da altre variabili. Alti livelli intraeritrocitari di 2,3-DPG comportano una maggiore cessione di ossigeno ad una data pO 2, il che rappresenta un meccanismo di adattamento nellanemia; livelli pi bassi di 2,3-DPG aumentano laffinit dellemoglobina per lO 2 , determinando una minore cessione di ossigeno a parit di pO2. Nei globuli rossi conservati in CPDA-1 o nelle comuni soluzioni additive, il livello di 2,3-DPG tende allo zero, con andamento lineare, dopo, approssimativamente, 2 settimane di conservazione. Ci determinato dalla diminuzione del pH intraeritrocitario causata dallacido lattico, che aumenta lattivit di una difosfatasi26. Questo provoca lo spostamento a sinistra della curva di dissociazione, con conseguente riduzione nella cessione di O2 (Figura 8.1). Una volta entrati nel circolo del ricevente, gli eritrociti conservati rigenerano ATP e 2,3-DPG, riprendendo metabolismo energetico e funzione di emoglobina normali. Approssimativamente, sono necessarie 12 ore per la rigenerazione di met del livello di 2,3-DPG di eritrociti severamente depleti, e 24 ore per un completo recupero del 2,3-DPG e della normale funzionalit dellemoglobina26,27. Durante le prime 2-3 settimane di conservazione a 1-6 C, i globuli rossi perdono potassio (K) e acquisiscono sodio (Na), perch ladenosin-trifosfatasi Na/K, che pompa il sodio fuori dalle emazie e lo sostituisce con il potassio, ha un coefficiente di temperatura molto elevato e funziona poco al freddo. stato riportato che il livello di potassio nel sovranatante di ununit di globuli rossi in CPDA-1 cresce dai 5,1 mmol/L del giorno di prelievo a 23 mmol/L del giorno 7 e a 75 mmol/ L del giorno35. Il livello intraeritrocitario di potassio verr reintegrato dopola trasfusione. I livelli di potassio nel sovranatante di concentrati eritrocitari appaiono elevati se paragonati a quelli di unit di sangue intero di eguale et. Tuttavia, quando si determina il carico
totale di potassio, si deve tenere conto del minore volume di sovranatante. Sangue intero conservato da 1 a 6 C per pi di 24 ore contiene poche piastrine funzionanti, ma i livelli dei fattori II, VII, IX e X della coagulazione e del fibrinogeno sono ben mantenuti. I fattori labili (il FV e il FVIII) si riducono nel tempo, e sono considerati non sufficienti a correggere deficit specifici in pazienti emorragici, bench siano stati riportati livelli del 30% di FV e dal 15 al 20% di FVIII nel sangue intero conservato per 21 giorni, e sia stato dimostrato che le piastrine conservate a temperatura ambiente mantengono livelli di FV pari al 47% (vedi Capitolo 21) e di FVIII pari al 68% dopo 72 ore 13 . Per una migliore conservazione di FV, FVIII e piastrine, il sangue intero viene separato nei suoi diversi componenti e il plasma viene conservato come plasma fresco congelato. Piastrine Le piastrine conservate allo stato liquido, fra 20 e 24 C, sono sospese non loro stesso plasma (in USA e in Europa) o in soluzioni additive per piastrine (in Europa). In tali condizioni, la durata di vita delle piastrine , nella maggior parte dei Paesi, di 5 giorni (Tabella 8.5). Questa limitazione temporale legata in parte alla perdita di efficacia del prodotto28 e, in parte, alla possibilit, in questo range di temperatura, di rapida proliferazione batterica29,30. Per quanto riguarda lefficacia, le piastrine conservate allo stato liquido subiscono modificazioni in vitro, correlate alla durata della conservazione e note, nellinsieme, come lesioni piastriniche da conservazione31,32. Esse sono caratterizzate da modificazioni morfologiche (passaggio da forma discoide a forma sferica); da produzione di acido lattico da parte della glicolisi, con conseguente diminuzione del pH; da rilascio del contenuto del citoplasma e dei granuli; dalla diminuzione di molte funzioni piastriniche misurabili in vitro, particolarmente della pressione osmotica; da alterazioni di forma indotte dalladenosin-difosfato; da un ridotto recupero e da una diminuita sopravvivenza in vivo.
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Tabella 8.5 - Date di scadenza di emocomponenti selezionati8(pp53-60) Emocomponente Sangue intero Sangue intero irradiato Concentrati eritrocitari (CE) CE lavati CE leucoridotti CE ringiovaniti CE ringiovaniti lavati CE irradiati CE congelati (glicerolo al 40%) CE congelati (glicerolo al 20%) CE deglicerolizzati CE preparati in Sistema Aperto CE congelati (Sistema Aperto) CE congelati (Sistema Chiuso) CE congelati (Azoto Liquido) Piastrine Piastrine in pool o in sistema aperto Piastrine leucoridotte Piastrine irradiate Concentrati granulocitari Plasma fresco congelato (PFC) PFC scongelato PFC congelato entro 24 ore dal prelievo PFC congelato entro 24 ore dal prelievo, scongelato Plasma scongelato Plasma liquido Plasma privo di CRIO, congelato Plasma privo di CRIO, scongelato CRIO anti-emofilico (AHF) AHF scongelato
* La durata massima, senza agitazione, di 24 ore.
Data di scadenza ACD, CPD, CP2D: 21 giorni - CPDA-1: 35 giorni. Scadenza originale (in base alla soluzione) o 28 giorni dalla data di irradiazione, qualsiasi data venga prima ACD, CPD, CP2D: 21 giorni - CPDA-1: 35 giorni - Uso di sistema aperto: 24 ore - in soluzioni additive: 42 giorni 24 ore ACD, CPD, CP2D: 21 giorni - CPDA -1: 35 giorni - Uso di sistema aperto: 24 ore - in soluzioni additive: 42 giorni 24 ore 24 ore Scadenza originale (in base alla soluzione) o 28 giorni dalla data di irradiazione, qualsiasi data venga prima 10 anni 10 anni 24 ore o 14 giorni (in rapporto al metodo impiegato) 24 ore 10 anni, 24 ore dopo lo scongelamento 10 anni, 2 settimane dopo scongelamento, se approvato FDA 10 anni Da 24 ore a 5 giorni in rapporto al sistema di raccolta* 4 ore, se non differentemente specificata 4 ore in sistema aperto, non differente dalla data originale se in sistema chiuso* 4 ore in sistema aperto, non differente dalla data originale se in sistema chiuso* 24 ore 12 mesi a 18 C, 7 anni a 65 C (con approvazione FDA) 24 ore 12 mesi 24 ore <5 giorni se separato da sangue intero, 24 ore se da aferesi 5 giorni dopo la scadenza dei concentrati eritrocitari 12 mesi Da 24 ore a 5 giorni 12 mesi 4 ore (sistema aperto o in pool), 6 ore se da singola unit
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I test in vitro sono utili indicatori della funzionalit, ma esistono tuttora controversie circa la loro utilit pratica nel predire vitalit e funzioni in vivo33. Ad oggi i tentativi di definire la natura biochimica delle lesioni piastriniche da conservazione non hanno portato a risultati conclusivi. Le modifiche osservate possono rappresentare un normale processo di invecchiamento, attenuato dalla temperatura di conservazione inferiore (20-24 C) rispetto a quella in vivo (37 C). , tuttavia, plausibile un ruolo giocato da danni mitocondriali, come causa corresponsabile di queste modifiche. Le piastrine a riposo traggono una quota rilevante di energia dalla -ossidazione di acidi grassi 34 . Alterazioni dellintegrit dei mitocondri potrebbero determinare una riduzione del flusso di carbonio allinterno del ciclo dellacido tricarbossilico e richiedere uno spostamento del metabolismo energetico verso la glicolisi, con conseguente aumentata produzione di lattato. La riduzione di attivit del ciclo dellacido tricarbossilico potrebbe compromettere la produzione di ATP efficiente, provocare una diminuzione del pool metabolico di ATP e, quindi, del carico energetico della piastrina35. Il ridotto carico energetico potrebbe compromettere lintegrit della membrana, determinando una perdita del contenuto citoplasmatico, una diminuita risposta agli stimoli fisiologici e unincapacit a riparare i lipidi di membrana ossidati, con conseguente deformazione della morfologia piastrinica36. Durata di vita Il periodo massimo di conservazione per un emocomponente, mantenuto in condizioni e a temperature accettabili, viene denominato durata di vita. Per i concentrati eritrocitari, i criteri per stabilire la durata di vita per un anticoagulanteconservante approvato richiedono che almeno il 75% dei globuli rossi originari (da un normale donatore allogenico) sia presente, nel circolo del ricevente, 24 ore dopo una trasfusione. Per gli altri componenti, la durata di vita si basa su considerazioni funzionali. I tempi di conservazione sono elencati nella Tabella 8.5.
Lavorazioni dopo conservazione

Ulteriori discussioni su alcuni dei temi affrontati di seguito possono essere reperite nei Capitoli 21 e 22. Filtrazione per la leucoriduzione Soltanto filtri speciali per la leucoriduzione raggiungono, in maniera affidabile, una rimozione di oltre il 99,9% (log 3), necessaria ad ottenere la specifica di 5 x 106 leucociti per componente37. I filtri per la leucoriduzione di concentrati eritrocitari contengono numerosi strati di fibre sintetiche grezze, che trattengono leucociti e piastrine, consentendo il passaggio degli eritrociti. I filtri per la leucoriduzione sono reperibili in commercio in numerose configurazioni, che facilitano la filtrazione al letto del ricevente (bedside) o in laboratorio, prima della distribuzione38. Lefficiente rimozione di leucociti, infatti, si ottiene meglio subito dopo la raccolta; la leucoriduzione prima della conservazione (pre-storage) , quindi, da preferirsi39. Esiste qualche motivo di preoccupazione circa il fatto che una precoce rimozione dei leucociti possa favorire la proliferazione dei batteri presenti al momento del prelievo. Alcuni studi indicano, tuttavia, che una rimozione precoce (entro 24 ore), nel caso di concentrati eritrocitari, pu ridurre le probabilit di una contaminazione batterica significativa40. La filtrazione bedside , in particolare di concentrati piastrinici, pu non essere altrettanto efficace nel prevenire reazioni in soggetti politrasfusi ed , per tale motivo, meno auspicabile della leucoriduzione pre-storage41. La filtrazione bedside ha anche provocato reazioni ipotensive42. Le citochine e le altre sostanze che si accumulano durante la conservazione (particolarmente nei componenti piastrinici) possono spiegare alcuni insuccessi della filtrazione bedside nel prevenire reazioni febbrili43 (vedi Capitolo 27). In pi, il controllo di qualit della filtrazione bedside pi difficoltoso44. Scongelamento Scongelamento di plasma fresco congelato Il plasma fresco congelato viene scongelato sia
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a una temperatura compresa fra 30 e 37 C, sia mediante dispositivi approvati FDA8(p59). Lemocomponente conosciuto successivamente come plasma fresco congelato scongelato e dovrebbe essere trasfuso immediatamente o conservato fra 1 e 6 C per non pi di 24 ore. Data e ora di scadenza devono essere indicate sulletichetta. Il plasma fresco congelato scongelato a bagnomaria dovrebbe essere protetto in modo che i punti dingresso non vengano contaminati dallacqua. Questo si ottiene avvolgendo il contenitore con un rivestimento di plastica o ponendo il contenitore in posizione verticale, con i punti dingresso al di sopra il livello dellacqua. Per le apparecchiature a microonde, andrebbe attestato che i limiti di temperatura non vengano superati e che le proteine plasmatiche non vengano danneggiate e dovrebbe essere presente un sistema di allarme che segnali se la temperatura aumenta oltre livelli accettabili. Come per ogni tipo di strumentazione, dovrebbe esistere una procedura per il controllo di qualit delle funzioni indicate. Quando ununit di plasma fresco congelato, preparata da sangue intero con sistema chiuso, viene scongelata ma non trasfusa entro 24 ore, letichetta deve essere modificata. Il prodotto dovrebbe essere etichettato come Plasma scongelato e pu essere conservato a 1-6 C e trasfuso sino a 5 giorni dopo lo scongelamento. Questo componente simile al plasma fresco congelato, ma con ridotta attivit di entrambi i FV e FVIII (sopratutto del FVIII). Scongelamento di CRIO Il CRIO viene scongelato fra 30 e 37 C, per non pi di 15 minuti [CFR 606.122(n) (4)]. Una volta scongelate, le sacche non dovrebbero essere lasciate a 30-37 C, in modo tale da minimizzare la degradazione del FVIII. Come per il plasma fresco congelato, i punti dingresso dovrebbero essere protetti dalla contaminazione dellacqua, qualora lunit sia scongelata in un bagnomaria. Singole unit scongelate di CRIO devono essere trasfuse immediatamente o possono essere conservate a temperatura
ambiente (fra 20 e 24 C) per non pi di 6 ore. Tutti i pool di CRIO, preparati con sistema aperto o chiuso, devono essere trasfusi entro 6 ore dallo scongelamento o entro 4 ore dallassemblaggio, a seconda dellora che viene prima. Per semplificare le trasfusioni a riceventi che necessitino di molte unit, i vari CRIO possono essere assemblati, dopo scongelamento, allinterno di ununica sacca. Al prodotto assemblato viene assegnato un numero unico, ma le registrazioni devono documentare le singole unit incluse. Vedi il Metodo 6.12 per le linee guida su come scongelare e assemblare i CRIO da trasfondere. Scongelamento e deglicerolizzazione di concentrati eritrocitari Il contenitore protettivo e le relative cellule congelate, pu essere posto direttamente in un riscaldatore a secco a 37C o pu essere rivestito e immerso in un bagnomaria, sempre a 37 C. Le unit di eritrociti congelate nella sacca madre dovrebbero essere scongelate a 42 C16. Lo scongelamento impiega almeno 20-25 minuti e non dovrebbe superare i 40 minuti. Per accelerare lo scongelamento si pu utilizzare una delicata agitazione. Le emazie scongelate contengono glicerolo ad alta concentrazione, che deve essere ridotta gradualmente per evitare lemolisi in vitro o in vivo. La deglicerolizzazione si ottiene lavando i globuli rossi con soluzioni a osmolarit decrescente. In una proceduta (vedi Metodo 6.9), le cellule glicerolizzate sono diluite con 150 mL di fisiologica al 12%, poi lavate con 1 litro di fisiologica al 1,6% e, infine, con 1 L di fisiologica allo 0,9% con lo 0,2% di destrosio. La diminuzione progressiva nellosmolarit delle soluzioni di lavaggio causa un rigonfiamento osmotico delle cellule, pertanto ogni soluzione deve essere aggiunta lentamente, lasciando tempo sufficiente per il mescolamento e lequilibrio osmotico. Per deglicerolizzare emazie congelate in glicerolo ad alta concentrazione, pu essere impiegato qualsiasi strumento per batch o per lavaggio a flusso continuo, disponibile in commercio. Dato che vi sono molte variazioni
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potenzialmente importanti nei protocolli di deglicerolizzazione per ogni tipo di strumento, il personale di ogni struttura dovrebbe non solo seguire le indicazioni dei produttori, ma anche validare localmente il procedimento. La procedura scelta deve assicurare, dopo il processo di deglicerolizzazione, unadeguata rimozione degli agenti crioprotettivi, una quantit di emoglobina libera minima e il recupero di pi dell80% del volume eritrocitario originale 8(p27). Quando la deglicerolizzazione terminata, i tubi connessi alla sacca devono essere riempiti con unaliquota di emazie e saldati in modo da poterne staccare dei segmenti per le prove di compatibilit. Sulletichetta devono essere identificate la struttura che ha eseguito il prelievo e quella che ha preparato lunit deglicerolizzata, se diversa dalla prima. Quando le emazie congelate glicerolizzate provenienti da un paziente affetto da drepanocitosi sono sospese in soluzioni di lavaggio ipertoniche per la deglicerolizzazione e centrifugate, formano una massa gelatinosa e emolizzano16. E possibile risolvere questo problema modificando le procedure di lavaggio, utilizzando solamente la fisiologica allo 0,9% pi lo 0,2 di destrosio, dopo laggiunta della fisiologica al 12%45. In alcuni protocolli di criopreservazione, le donazioni sono analizzate per la presenza di HbS, prima di essere congelate. Se la glicerolizzazione o la deglicerolizzazione comportano lapertura della sacca di sangue, il sistema viene considerato aperto e la risultante sospensione di emazie deglicerolizzate pu essere conservata fra 1 e 6 C soltanto per 24 ore. Un metodo di glicerolizzazione e deglicerolizzazione in un sistema effettivamente chiuso permette di conservare la sospensione di emazie deglicerolizzate per 2 settimane a 1-6 C. Un tale metodo consente una gestione pi efficace delle scorte. Quando le emazie deglicerolizzate sono conservate oltre i 14 giorni a 1-6 C, le pi importanti modificazioni osservate sono laumento della concentrazione del potassio e dellemoglobina nel fluido sopranatante. Gli eritrociti sottoposti a gamma-irradiazione e
successiva conservazione fra 1 e 6 C, tollerano il congelamento senza danni maggiori rispetto alle cellule non iradiate46,47. Irradiazione Gli emocomponenti che contengono linfociti vitali (compresi i concentrati eritrocitari, i concentrati piastrinici e i concentrati granulocitari) dovrebbero essere irradiati per prevenire la proliferazione dei linfociti T trasfusi, se il ricevente a rischio di contrarre, o il donatore a rischio di provocare, la GvHD. AABB ed FDA raccomandano una dose minima di 25 Gy di raggi gamma nella porzione centrale del contenitore, con non meno di 15 Gy erogati su ogni punto della sacca8(p26). Lirradiazione si ottiene con Cesio 137 (137Ce) o con Cobalto 60 (60Co) usando un irradiatore per sangue proprio della struttura o utilizzando gli apparecchi ospedalieri per terapie radianti. Di recente, stato messo a punto un apparecchio a raggi-x, in grado di erogare dosi adeguate. Nelle procedure della struttura dovrebbero essere indicate: la misura della distribuzione della dose, la verifica del tempo di esposizione, del corretto funzionamento meccanico e della rotazione orizzontale, laggiustamento del tempo di esposizione al decadere della sorgente radioattiva48. Tutte le registrazioni devono essere conservate e devono essere documentati tutti i passaggi, le forniture e gli strumenti utilizzati nelle procedure di irradiazione. Per confermare lavvenuta irradiazione di singole unit, si possono applicare alle sacche, prima dellirradiazione, etichette di pellicola radiocromica disponibili in commercio. Quando esposte a una adeguata quantit di radiazione, la pellicola diviene scura, indicando che il componente stato sottoposto a una dose di radiazione appropriata. Dato che lirradiazione danneggia gli eritrociti e ne riduce la vitalit (recupero a 24 ore)49, i concentrati eritrocitari che sono stati irradiati scadono alla loro originale data di scadenza o 28 giorni dopo lirradiazione, a seconda di quale delle due date venga prima. Le piastrine subiscono danni minimi
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dallirradiazione, cos che la loro data di scadenza non cambia50. Il sangue irradiato essenziale per i pazienti a rischio di GvHD associata a trasfusione, compresi feti che ricevono trasfusioni intrauterine, riceventi parzialmente o completamente immunodepressi, soggetti sottoposti a trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE), riceventi di concentrati piastrinici selezionati per compatibit HLA o piastrinica, e riceventi di unit donate da consanguinei. Lavaggio Il lavaggio di ununita di concentrati eritrocitari con 1 o 2 litri di normale soluzione salina sterile rimuove circa il 99% delle proteine plasmatiche, degli elettroliti e degli anticorpi. I metodi di lavaggio, sia manuali che automatici, rimuovano anche parte dei leucociti presenti in un concentrati eritrocitari, ma non in quantit sufficiente a prevenire una possibile alloimmunizzazione. A seconda del protocollo utilizzato, si pu perdere sino al 20% della massa eritrocitaria totale. I concentrati eritrocitari lavati devono essere utilizzati entro 24 ore, dato che la preparazione eseguita, di solito, con sistema aperto e che la rimozione della soluzione anticoagulanteconservante compromette il mantenimento, a lungo termine, di vitalit e funzioni. Le piastrine possono essere lavate con normale soluzione fisiologica o con fisiologica tamponata con ACD-A o citrato, impiegando metodiche manuali o automatiche. Le procedure possono determinare una riduzione del recupero (circa 33% in meno), ma non della sopravvivenza delle piastrine lavate51; il contenuto in leucociti non significativamente modificato. Le piastrine lavate devono essere usate entro 4 ore dalla preparazione. Assemblaggio Quando un paziente necessita di numerose unit di piastrine, lassemblaggio in una sacca unica semplifica la distribuzione e la trasfusione. Questo prodotto dovrebbe essere etichettato come Pool di piastrine. Se il concentrato piastrinico contiene una quantit significativa di
eritrociti e i gruppi ABO sono misti, gli anticorpi del plasma dovrebbero essere compatibili con tutti i tipi di emazie presenti nel pool. Al componente finale viene apposto un solo numero identificativo, ma le registrazioni devono riportare lintero procedimento di assemblaggio e tutte le unit incluse nel pool. Tale prodotto ha una scadenza di 4 ore. Singole unit di CRIO possono essere assemblate, dopo scongelamento ed etichettate in modo appropriato. LAABB e la FDA richiedono che il CRIO sia trasfuso entro 4 ore dopo assemblaggio e successiva conservazione fra 20 e 24 C. Riduzione di volume I concentrati piastrinici possono essere ridotti per diminuire il volume totale dellemocomponente trasfuso o per rimuovere parzialmente sostanze presenti nel supernatante, come gli anticorpi ABO. La riduzione di volume pu essere necessaria per pazienti con ridotta volemia o con sovraccarico circolatorio (per scompenso renale o cardiaco). La rimozione di sostanze si ottiene meglio con il lavaggio (vedi avanti). Se si perde la sterilit, la scadenza del prodotto ridotta a 4 ore. Se, invece, la sterilit conservata (usando, per esempio, un connettore sterile)23, la rimozione del supernatante riduce la disponibilit di glucosio e le capacit del tampone e la conseguente conservazione dei concentrati piastrinici avviene in un ambiente subottimale. E generalmente consigliata la trasfusione nel pi breve tempo possibile. Suddivisione in aliquote Gli emocomponenti possono essere suddivisi in volumi pi piccoli per tenere conto delle esigenze di riceventi con volemia molto ridotta o con sovraccarico circolatorio. La composizione dei componenti eritrocitari o plasmatici non viene modificata dalla suddivisione in aliquote, a differenza di quanto avviene con la riduzione di volume. Le date di scadenza, pertanto, non vengono modificate, a condizione che venga utilizzato, per la suddivisione, un connettore sterile23. La durata di vita e la vitalit dei concentrati piastrinici dipendono, tuttavia, dal tipo di sacca, dal volume di plasma e dallambiente di conservazione.
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La rimozione di aliquote di piastrine dalla sacca madre, modifica lambiente di conservazione di quelle rimaste nella sacca di partenza. Se lambiente di conservazione modificato non soddisfa i requisiti di conservazione della sacca indicati dal produttore, anche la data di scadenza del componente residuo dovrebbe essere modificata. Ringiovanimento possibile ripristinare il livello di 2,3-DPG e di ATP in concentrati eritrocitari conservati in CPD o CPDA-1, aggiungendo una soluzione, approvata dalla FDA, contenente piruvato, inosina, fosfato e adenina (vedi Metodo 6.6). I concentrati eritrocitari possono essere ringiovaniti dopo conservazione fra 1 e 6 C sino a 3 giorni dopo la data di scadenza; possono poi essere glicerolizzati e congelati come gli eritrociti freschi. Se le unit di concentrati eritrocitari ringiovaniti devono essere trasfuse entro 24 ore, possibile la loro conservazione fra 1 e 6 C; tuttavia, essi devono essere lavati prima delluso, per rimuovere linosina che pu risultare tossica per il ricevente. Letichetta dellemocomponente e le registrazioni devono indicare limpiego di soluzioni ringiovanenti.
Ispezione, spedizione, destinazione, distribuzione

Ispezione Gli emocomponenti conservati vanno ispezionati subito prima della distribuzione per uso trasfusionale o per linvio ad altre strutture8(pp14,15). Le ispezioni vanno documentate; le registrazioni devono comprendere data, numero del donatore, descrizione di ogni unit anomala, azioni intraprese e identit del personale coinvolto. Lispezione visiva non sempre in grado di individuare contaminazioni o altre condizioni pericolose; tuttavia, gli emocomponenti che appaiono anomali non devono essere consegnati o trasfusi. Condizioni pericolose dovrebbero
essere sospettate se52: 1) il sangue contenuto nei segmenti appare di colore pi chiaro di quello contenuto nella sacca (per concentrati eritrocitari in soluzioni additive), 2) la massa eritrocitaria appare di colore purpureo ,3) si osserva una zona di emolisi subito al di sopra della massa eritrocitaria, 4) sono visibili coaguli, 5) si osserva sangue o plasma nei punti di ingresso o nelle saldature dei segmenti, 6) il plasma o il fluido supernatante appaiono torbidi, purpurei, marroni o rossi. Un color verde, per i cambiamenti indotti dalla luce sulla bilirubina, non implica lo scarto dellunit. Una lieve lipemia, caratterizzata da un aspetto lattescente, non rende non idonea una donazione, sempre che sia possibile eseguire tutti i test infettivologici. Campioni grossolanamente lipemici sono non idonei. Un emocomponente controverso per qualsiasi motivo, deve essere posto in quarantena fintanto che un responsabile non ne decida la destinazione. Una corretta valutazione potrebbe essere effettuata capovolgendo delicatamente lunit pi volte in modo da risospendere le cellule nel sovranatante, in quanto unemolisi non evidente, coaguli o altre alterazioni possono esser presenti nella massa (non miscelata) degli eritrociti. Se, dopo la risospensione, lulteriore sedimentazione e un accurato esame, lunit non appare pi alterata, essa pu essere rimessa nella scorta. Dovrebbero essere conservate appropriate registrazioni, che documentino quali interventi sono stati effettuati, quando e da chi. Le unit di plasma fresco congelato e di CRIO dovrebbero essere ispezionate, al momento in cui vengono estratte dal congelatore, per eventuali segni di scongelamento e ricongelamento o di rottura della sacca o dei segmenti. Una insolita torpidit del componente scongelato, pu costituire motivo di scarto. Tutti i componenti piastrinici dovrebbero essere ispezionati prima della distribuzione. Quelli con aggregati piastrinici macroscopicamente evidenti non dovrebbero essere utilizzati a scopo trasfusionale. Alcune strutture valutano il fenomeno dello swirling piastrinico, tenendo la sacca sopra una sorgente luminosa e dandole leggeri colpetti. Il fenomeno dello swirling correla bene con valori di pH
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associati con unadeguata sopravvivenza in vivo delle piastrine. stato notato che alcuni componenti piastrinici contengono una piccola quantit di particelle.Questi componenti sono idonei allimpiego. La contaminazione batterica degli emocomponenti rara, grazie allimpiego di tecniche asettiche e di indagini per la presenza di batteri nel concentrato piastrinico, alla disponibilit di sistemi chiusi per raccolta e preparazione, e allaccurato controllo delle condizioni di conservazione. I test di sterilit sugli emocomponenti giocano un ruolo importante nel convalidare le procedure per la loro produzione. Se un componente ha un aspetto anomalo o se una reazione trasfusionale sembra essere in relazione a sangue contaminato, dovrebbe essere effettuato un esame colturale e si dovrebbe valutare una colorazione di Gram. I microbiologi possono consigliare al meglio il personale dei Servizi Trasfusionali sulle caratteristiche dei campioni e sui test pi appropriati a individuare potenziali contaminanti del sangue, compresi i microrganismi psicrofili. Lesecuzione di esami colturali direttamente dal contenuto della sacca e dal ricevente pu fornire informazioni utili alla diagnosi. Ogni struttura che ha raccolto sangue di cui stata evidenziata contaminazione, dovrebbe essere informata, in modo che essa abbia la possibilit di esaminare una eventuale batteriemia nel donatore, una tecnica di preparazione del braccio del donatore potenzialmente inadeguata, o una tecnica di lavorazione o assemblaggio impropria. Andrebbero rivalutate le condizioni di salute del donatore e dovrebbero essere scartati altri emocomponenti provenienti da quella donazione. Spedizione Le spedizioni al di fuori della struttura, richiedono ulteriori confezionamenti. I contenitori o i refrigeratori per il trasporto e le procedure di confezionamento devono essere validate prima dellutilizzo, per verificare che siano in grado di mantenere gli emocomponenti alla temperatura richiesta per i tempi e nelle condizioni previste. I
contenitori devono anche essere in grado di resistere alle perdite, alla pressione o ad altre condizioni conseguenti a manipolazioni di routine. Per maggiori informazioni sulle norme e sulle linee guida relative al trasporto, consultare il Capitolo 2. La semplice esposizione a temperature al di fuori di quelle accettabili non rende, necessariamente, il sangue non idoneo alluso trasfusionale. Si possono fare eccezioni per circostanze non comuni, come nel caso di unit autologhe o di fenotipo raro, ma le registrazioni devono documentare le ragioni che hanno portato alla decisione di conservare lunit, la valutazione della sua persistente idoneit alla trasfusione e lidentit di chi ha preso tale decisione. Altri fattori da tenere in considerazione per stabilire laccettabilit di un emocomponente dopo il trasporto sono i tempi e modalit del trasporto, lentit delle variazioni della temperatura, al di sopra o al di sotto dei limiti accettabili, la presenza di residui di ghiaccio nei contenitori usati per la spedizione, laspetto e let dellunit, e la probabilit di unulteriore conservazione, prima della trasfusione. La struttura che ha effettuato la spedizione dovrebbe essere informata quando la struttura ricevente ha osservato il superamento di una temperatura accettabile. Sangue intero e concentrati eritrocitari Il sangue intero e i concentrati eritrocitari, spediti dalla struttura che ha effettuato il prelievo a unaltra, devono essere trasportati in modo da assicurare una temperatura compresa fra 1 e 10 C. Il limite superiore di 10 C pu essere raggiunto in 30 minuti, se una unit, presa da una conservazione a 5 C, viene lasciata a una temperatura ambiente di 25 C. Unit pi piccole, come quelle comunemente utilizzate per i pazienti pediatrici, possono riscaldarsi anche pi rapidamente. Il ghiaccio, confezionato in modo da evitare perdite, rappresenta il refrigerante di scelta per mantenere le temperature idonee durante il trasporto e la spedizione. Un appropriato quantitativo va sistemato al di sopra delle unit nella scatola di cartone o nel contenitore isolante.
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Per mantenere temperature di trasporto accettabili, possono anche essere utilizzate confezioni refrigeranti per uso clinico o contenitori studiati specificamente.Il ghiaccio superraffreddato (ad esempio grandi blocchi di ghiaccio mantenuti a 18 C) a contatto con il sangue intero o con i concentrati eritrocitari, pu determinare temperature al di sotto di 1 C, con possibile emolisi degli eritrociti. Piastrine e granulociti Deve essere fatto ogni ragionevole tentativo per assicurarsi che i concentrati piastrinici e i granulociti vengano mantenuti a 20 e 24 C durante il trasporto. Si raccomanda luso di contenitori ben isolati senza aggiunta di ghiaccio o con un refrigerante del commercio, studiato in modo da mantenere la temperatura fra 20 e 24 C. Involucri di fibra o giornali sono eccellenti isolanti. Per viaggi lunghi o che durano oltre 24 ore, possono essere necessari contenitori a doppio strato isolante. Componenti congelati Gli emocomponenti congelati devono essere confezionati per il trasporto in modo da mantenerli in tale stato. Ci si pu ottenere utilizzando una quantit appropriata di ghiaccio secco in contenitori ben isolati o in cartoni standard foderati da materiale isolante, come imballaggi di plastica a bolle daria o frammenti di imballaggi secchi. Il ghiaccio secco, in lastre, pu essere stratificato sul fondo del contenitore, fra ogni strato di unit congelate e sulla parte superiore. Le strutture che spediscono dovrebbero determinare le condizioni ottimali per il trasporto di componenti congelati, in considerazione delle temperature richieste per quel componente, della lunghezza del viaggio, del contenitore utilizzato e delle temperature ambientali che si possono incontrare. Le procedure e i contenitori per le spedizioni dovrebbero essere validate e monitorate periodicamente. La struttura che riceve dovrebbe sempre osservare la temperatura di spedizione e riferire alla struttura che spedisce ogni rilevamento inaccettabile.
I concentrati eritrocitari criopreservati con glicerolo ad alta concentrazione (40% peso/volume) tollerano oscillazioni della temperatura comprese fra 85 e 20 C, senza significativi cambiamenti nel recupero in vitro o nella sopravvivenza posttrasfusionale a 24h, cos che il trasporto con ghiaccio secco accettabile. Le spedizioni di sangue contenenti ghiaccio secco come refrigerante sono considerate merce pericolosa e richiedono luso di confezionamenti speciali e di specifiche etichettature (vedi Capitolo 2). Le scatole di trasporto contenenti ghiaccio secco non devono essere completamente sigillate, cos che lanidride carbonica, rilasciata dalla sublimazione del ghiaccio, possa fuoriuscire senza pericolo di esplosioni. Utilizzo I Centri di Raccolta e i Servizi Trasfusionali devono mantenere le registrazioni riguardanti tutti gli emocomponenti trattati, cos che ogni unit possa essere rintracciata, dal prelievo allutilizzo finale. Le unit, che non possono essere distribuite per uso trasfusionale, dovrebbero essere restituite al fornitore o eliminate come materiale a rischio biologico. La natura del problema che ha portato allesclusione dellunit, dovrebbe essere indagata e i risultati dellindagine dovrebbero essere comunicati al fornitore. Le conclusioni potrebbero indicare la necessit di migliorare le tecniche di prelievo, i metodi di selezione dei donatori, o il trattamento delle unit durante la lavorazione, la conservazione o il trasporto. Le procedure di eliminazione devono essere conformi alle locali norme di salute pubblica in tema di rifiuti a rischio biologico. Si raccomandano la sterilizzazione in autoclave o lincenerimento. Se leliminazione viene effettuata da strutture esterne, deve essere stipulato, con lazienda incaricata, un contratto, in cui dovrebbe essere specificato che vengono rispettate le appropriate norme EPA ( Environmental Protection Agency), quelle statali e quelle locali (vedi Capitolo 2, per leliminazione dei rifiuti a rischio biologico).
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Distribuzione da parte del Servizio Trasfusionale Il trasporto di sangue, ad una breve distanza allinterno della struttura, per esempio allarea clinica per la trasfusione, non richiede confezionamenti speciali se non quelli dettati da ragioni di sicurezza e da preferenze istituzionali. Non si dovrebbe, tuttavia, permettere che il sangue raggiunga senza motivo temperature al di fuori dei limiti accettabili. Qualora i tempi di trasporto siano prolungati, per le spedizioni possono essere opportune specifiche linee guida. Le unit uscite dal Servizio Trasfusionale o dal Centro di Raccolta e poi rientrate, non devono essere ridistribuite per uso trasfusionale, a meno che non siano soddisfatte le condizioni elencate di seguito: 1. la chiusura del contenitore non stata penetrata o infiltrata o modificata in qualche modo; 2. gli emocomponenti eritrocitari sono stati mantenuti costantemente fra 1 e 10 C, preferibilmente fra 1 e 6 C. In genere, i Centri e i Servizi Trasfusionali non ridistribuiscono concentrati eritrocitari che siano rimasti, per pi di 30 minuti, al di fuori di un frigorifero controllato o da un refrigeratore convalidato, in quanto, trascorso questo tempo, la temperatura del componente pu avere superato i 10 C; 3. almeno un segmento saldato rimasto attaccato alla sacca, quando il componente ha lasciato i locali della struttura di distribuzione; 4. le registrazioni indicano che il sangue stato ridistribuito e che stato ispezionato prima della ridistribuzione.
e gli strumenti utilizzati devono essere validate prima della loro messa in opera e, successivamente, controllate periodicamente. Il personale deve essere addestrato in maniera appropriata e la sua competenza deve essere valutata. I contenuti dei prodotti finali dovrebbero essere periodicamente valutati per assicurarsi che siano conformi alle attese. Lentit dei controlli di qualit viene preferibilmente stabilita allinterno dellistituzione, con il contributo del responsabile della qualit e tenendo conto dei requisiti AABB ed FDA (vedi Appendice 8.1). Controllo di qualit della strumentazione Sistemi per la registrazione continua della temperatura La maggior parte dei frigoriferi, dei congelatori e delle camere fredde provvista di sensori di temperatura incorporati, connessi con grafici di registrazione o con sistemi di lettura digitali per unagevole sorveglianza. I sistemi di registrazione digitale misurano le differenze di potenziale generate da una termocoppia; questa differenza poi convertita in temperatura. Dato che laria calda sale verso lalto, i sensori per la registrazione della temperatura dovrebbero essere posizionati su un ripiano elevato e immersi in un liquido di volume non superiore a quello del pi piccolo componente conservato. Possono essere utilizzati sia contenitori in vetro che sacche di plastica per sangue. I grafici di registrazione e i sistemi di monitoraggio devono essere controllati quotidianamente, per assicurarsi del corretto funzionamento. Quando i grafici o i nastri di registrazione vengono sostituiti, dovrebbero essere chiaramente datati (per esempio, con le date di inizio e di fine registrazione) ed etichettati in modo da identificare la struttura, lo specifico frigorifero o congelatore e la persona che ha effettuato la sostituzione. Ogni scostamento dalla temperatura normale dovrebbe essere giustificata per iscritto sul grafico a lato del tracciato o su un altro documento, e dovrebbe essere riportato il modo con cui gli emocomponenti sono stati gestiti . Un grafico con un tracciato perfettamente circolare pu indicare che il registratore non sta funzionando in modo
Controllo di qualit degli emocomponenti

Per assicurare la sicurezza e lefficacia degli emocomponenti, necessario applicare i principi di garanzia di qualit a tutti gli aspetti che riguardano la raccolta, la preparazione, le indagini, la conservazione e il trasporto. Tutte le procedure
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appropriato o non abbastanza sensibile da registrare le normali variazioni di temperatura che si verificano in ogni frigorifero in funzione. I Servizi Trasfusionali con molti frigoriferi e congelatori possono trovare pi semplice lutilizzo di un sistema centrale di monitoraggio degli allarmi, in grado di controllare tutti gli strumenti continuativamente e simultaneamente e di produrre una stampa delle temperature almeno ogni 4 ore. Questi sistemi sono provvisti di un allarme acustico, che si attiva nel momento in cui una qualunque apparecchiatura collegata raggiunge la propria, predeterminata, temperatura critica e segnala lo strumento relativo. I dispositivi per la conservazione del sangue provvisti di questo tipo di controllo non richiedono sistemi di registrazione indipendenti. Termometri I termometri visivi, presenti nelle apparecchiature di conservazione del sangue, offrono una verifica continua dellaccuratezza delle temperature. Uno di questi dovrebbe essere immerso nel contenitore con il sensore per il monitoraggio continuo. La temperatura del termometro dovrebbe essere periodicamente confrontata con quella del grafico di registrazione. Se le due temperature non corrispondono entro uno scarto di 2 C, entrambe dovrebbero essere controllate con un termometro certificato dal NIST (National Institute of Standards and Technology), e dovrebbero essere prese opportune azioni correttive (vedi Metodo 7.2). (Una variazione di 2 C, tra termometri calibrati, consentita in considerazione delle variazioni che possono verificarsi fra termometri calibrati su quelli NIST). I termometri contribuiscono anche a verificare che la temperatura mantenuta, in modo appropriato, in tutto lo spazio adibito alla conservazione. Grandi frigoriferi o grandi congelatori possono richiedere la presenza di pi termometri per accertare oscillazioni di temperatura. In aggiunta al termometro immerso con il sensore per il monitoraggio continuo (di solito posto su un ripiano elevato), almeno un altro, in un contenitore simile, va sistemato sul ripiano
pi basso su cui viene conservato il sangue. Le temperature rilevate in entrambe queste aree devono essere, in ogni momento, entro i limiti richiesti. Per verificare le temperature di conservazione, possono essere utilizzati sia termometri liquido-in-vetro (analogici) sia strumenti elettronici o a termocoppia (digitali), sempre che la loro accuratezza sia calibrata con un termometro certificato dal NIST o con un termometro provvisto di certificato di calibrazione NIST (vedi Metodo 7.2). altrettanto importante che essi siano usati come prescritto, secondo le raccomandazioni dei produttori. Sistemi di allarme Per garantire che i segnali di allarme vengano attivati ad una temperatura che consenta al personale di prendere gli opportuni provvedimenti prima che il sangue raggiunga temperature indesiderate, sia la temperatura di attivazione che lalimentazione vanno controllate periodicamente. Lalimentazione elettrica del sistema di allarme deve essere indipendente da quella del frigorifero o del congelatore; sia una batteria a ricarica continua, che un circuito elettrico indipendente collegato ad un generatore di emergenza, sono accettabili. Il Metodo 7.3.1 illustra una procedura dettagliata per verificare le temperature di attivazione degli allarmi dei frigoriferi. Il Metodo 7.3.2 riporta suggerimenti per gli allarmi dei congelatori. I sistemi a termocoppia che funzionano a temperature di congelamento, sono particolarmente utili per determinare, con accuratezza, la temperatura di attivazione, quando i sensori sono accessibili. Quando non lo sono, le temperature di attivazione approssimative possono essere determinate controllando un termometro del congelatore e il grafico di registrazione nel momento in cui lallarme entra in funzione dopo che il congelatore stato spento per la pulizia periodica o per la manutenzione. Pu anche essere accertata sistemando una bottiglia riempita dacqua fredda contro la parete interna del congelatore in corrispondenza del sensore. Quando lallarme viene disattivato, di solito in breve tempo, il grafico di registrazione pu essere immediatamente controllato per la temperatura
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dattivazione. Devono esistere istruzioni scritte per il personale, da seguire quando suona un allarme. Tali istruzioni dovrebbero comprendere i vari passaggi per determinare la causa diretta della variazione della temperatura e le modalit per la gestione di malfunzionamenti temporanei, cos come le operazioni da effettuare in caso di guasti prolungati. importante elencare i nomi dei soggetti-chiave da informare e quali misure adottare per assicurarsi che unadeguata temperatura di conservazione sia mantenuta per tutto il sangue, gli emocomponenti e i reagenti. Controllo di qualit di concentrati eritrocitari I concentrati eritrocitari, preparati senza laggiunta di soluzioni additive, devono avere un ematocrito = 80%. Ci dovrebbe essere stabilito durante la validazione del processo e periodicamente confermato da procedure per il controllo di qualit. I concentrati eritrocitari leucoridotti dovrebbero contenere meno di 5 x 106 leucociti residui e conservare l85% degli eritrociti originali54. Il controllo di qualit dovrebbe dimostrare che almeno il 95% delle unit esaminate conforme a questo requisito. Le unit controllate devono soddisfare le specifiche proprie della leucoriduzione6,8(p28). Vedi Appendice 8.1. Controllo di qualit di piastrine La qualit di ogni metodo di preparazione di concentrati piastrinici deve essere valutata periodicamente. I dati devono dimostrare che almeno il 90% dei concentrati analizzati contiene un numero accettabile di piastrine (5,5 x 1010 per concentrati piastrinici preparati da sangue intero) e ha, alla fine del periodo di conservazione consentito, un pH plasmatico di 6,2 o superiore 8(P36). I concentrati piastrinici leucoridotti pre-storage, derivati dalla filtrazione di plasma ricco di piastrine, devono contenere meno di 8,3 x 105 leucociti residui, per essere etichettati come emocomponente leucodepleto. I procedimenti di validazione e i controlli di qualit devono dimostrare che almeno il 95%
delle unit esaminate sono conformi a tale requisito8(p31). Controllo di qualit di crioprecipitati di fattore anti-emofilico Gli Standard AABB richiedono che tutte le unit singole di CRIO esaminate, contengano un minimo di 80 UI di FVIII e 150 mg di fibrinogeno 8(p30). Ogni pool deve avere un contenuto di FVIII di almeno 80 UI moltiplicato per il numero di unit presenti nel pool; per il fibrinogeno, il contenuto deve essere di almeno 150 mg moltiplicato per il numero delle unit8(p30). Vedi Appendice 8.1
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Appendice 8.1 - Controllo di qualit degli emocomponenti

Componente Concentrati eritrocitari Concentrati eritrocitari leucoridotti Crioprecipitato anti-emofilico Concentrati piastrinici Concentrati piastrinici leucoridotti Concentrati piastrinici da aferesi Concentrati piastrinici da aferesi leucoridotti Granulociti da aferesi Componenti irradiati Specifiche e standard* In tutti, ematocrito 80% Mantenimento dell80% delle emazie originali, il 95% delle unit testate <5x106 di leucociti residui In tutti, FVIII 80 UI, fibrinogeno 150 mg 5,5x1010 piastrine e pH 6,2 nel 90% delle unit esaminate Standard AABB 5.7.5.1 5.7.5.6
5.7.5.14 5.7.5.16
5,5x1010 piastrine nel 75% delle unit esaminate, 5.7.5.17 6,2 pH nel 90% e <8,3 leucociti residui nel 95% 3x1011 piastrine nel contenitore finale e pH6,2 nel 90% delle unit esaminate <5x106 di leucociti nel 95% delle unit esaminate e 3x1011 piastrine nel contenitore finale; pH 6,2 nel 90% 1x1010 granulociti in almeno il 75% delle unit esaminate 5 Gy erogati alla porzione centrale del contenitore, con un minimo di 15 Gy in ogni punto 5.7.5.19 5.7.5.20
5.7.5.21 5.7.4.2
* Per specifiche si intendono i valori-soglia e per standard la percentuale delle unit conformi o eccedenti tali valori. Le procedure usate per la lavorazione dovrebbero essere convalidate come in grado di fornire tali standard, prima di porle in opera e di attivare i controlli qualit di routine. Il numero di unit esaminate durante i controlli qualit dovrebbe essere tale da garantire che stata raggiunta la conformit con gli standard. Silva MA (Ed). Standards for Blood Banks and Transfusion Services. 23rd ed, Bethesda, MD: AABB. 2005.
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Capitolo 9: La biologia molecolare in Medicina Trasfusionale
Capitolo 9
La biologia molecolare in Medicina Trasfusionale
Le proteine sono macromolecole composte da amminoacidi le cui sequenze vengono determinate dai geni. I lipidi ed i carboidrati non vengono codificati direttamente dai geni; la determinazione genetica del loro assemblaggio e delle loro strutture funzionali il risultato dellazione di differenti proteine enzimatiche. Gli antigeni gruppoematici possono essere considerati dei prodotti del gene sia di origine diretta come i polimorfismi delle proteine associati alla membrana eritrocitaria, che di origine indiretta come le configurazioni di carboidrati catalizzate dalle glicosiltransferasi.
Dal DNA allmRNA alle proteine

Struttura del DNA Un gene costituito da una sequenza specifica di nucleotidi localizzati in un preciso sito (locus) lungo il cromosoma. Ogni cromosoma costituito da una lunga molecola o filamento di acido desossiribonucleico (DNA). Il DNA composto dallo zucchero desossiribosio, da un gruppo fosfato e dalle basi puriniche adenina (A), guanina (G) e pirimidiniche timina (T), citosina (C). La combinazione di uno zucchero desossiribosio, un gruppo fosfato ed una base purinica o pirimidinica, viene indicato con il termine di nucleotide. Un doppio filamento di DNA consiste in due singoli filamenti complementari tra loro (non identici), che sono vicendevolmente legati da ponti idrogeno formati tra le specifiche basi puriniche e pirimidiniche appaiate di A-T e di
G-C. I due filamenti formano una configurazione a doppia elica con i gruppi zucchero-fosfati posti nella parte dorsale della struttura a doppia elica e le basi appaiate esposte nella parte interna della doppia elica (vedi Figura 9.1). La sintesi del DNA viene catalizzata dalla DNA polimerasi, che aggiunge un desossiribonucleotide al terminale 3 della catena esistente. Lindicazione 3 e 5 riferita alla posizione dellatomo di carbonio del legame del desossiribosio con il gruppo fosfato. Il gruppo fosfato lega i gruppi saccaridici tra il quinto atomo di carbonio di una molecola di desossiribosio ed il terzo atomo di carbonio della molecola di desossiribosio adiacente, creando in questo modo la struttura dorsale del filamento di DNA. La sintesi polimerasi-dipendente del DNA si verifica sempre in direzione 53. Trascrizione del DNA La sequenza lineare dei nucleotidi lungo il filamento del DNA costituisce i geni. I geni occupano una posizione fissa (locus) nel DNA di uno specifico cromosoma; i loci occupati dai geni pi conosciuti sono stati identificati grazie al Progetto Genoma Umano. Affinch si realizzi la sintesi delle proteine (vedi Figura 9.2), necessario che linformazione, codificata nel DNA, venga copiata nellRNA (trascrizione) e sia successivamente trasportata ad organuli citoplasmatici, detti ribosomi, dove prende inizio lassemblaggio delle proteine (traduzione). La trascrizione viene eseguita copiando un
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di una coppia di basi appaiate, poste nel sito di legame del fattore di trascrizione del promotore del gene Duffy, blocca lattivit del promotore e determina il fenotipo Fy(ab)1. Dopo il legame con il promotore, lRNA polimerasi apre una regione locale della doppia elica di DNA, esponendo i nucleotidi di ogni singolo filamento. I nucleotidi di un filamento di DNA esposto agiscono come matrice (template) per lappaiamento delle basi complementari; lRNA viene sintetizzato con laggiunta dei ribonucleotidi alla catena in fase di allungamento. Non appena lRNA polimerasi si sposta lungo la matrice del filamento di DNA, la doppia elica si apre davanti a lei e si richiude dietro come una cerniera lampo. Il processo prosegue, per tratti di solito estesi da 0,5 a 2 kb a valle del segnale poli-A, dopo di che lenzima arresta la sintesi e rilascia sia la matrice di DNA che la nuova catena sintetizzata di RNA. Modificazione dellRNA messaggero (mRNA) Poco dopo linizio della trascrizione, la catena di nuova formazione viene incappucciata al terminale 5 con laggiunta di un nucleotide G metilato. Il cappuccio, o cap, al terminale 5 importante per linizio della sintesi proteica e forse per proteggere dalla degradazione la molecola di mRNA durante il suo trasporto verso il citoplasma. Al terminale 3 dellmRNA, un complesso multiproteico di clivaggio-poliadenilizzazione svolge un processo in due fasi che taglia il nuovo RNA in una specifica sequenza e poi attacca da 100 a 200 copie di acido adenilico, formando la cosiddetta coda poli-A. La funzione della coda poli-A si esprime durante il trasferimento dal nucleo al citoplasma dellmRNA maturo, nella sua stabilizzazione e come segnale di riconoscimento necessario per i ribosomi per realizzare una traduzione efficace. Nelle cellule eucariote, la sequenza nucleotidica di un gene contiene spesso alcune regioni che sono rappresentate nellmRNA e altre regioni che non sono rappresentate. Le regioni del gene rappresentate nellmRNA sono definite esoni e specificano le sequenze che codificano la proteina
Figura 9.1 - Rappresentazione schematica dellappaiamento delle basi di un doppio filamento di DNA. filamento di DNA in un trascritto primario di acido ribonucleico che viene successivamente modificato nellacido ribonucleico messaggero (mRNA). LmRNA rappresenta un singolo filamento lineare di una sequenza di nucleotidi che si differenzia da quello del DNA per il saccaride presente nella sua struttura dorsale (il ribosio al posto del desossiribosio) e dalla sostituzione della timina con luracile (U), anchesso appaiato con ladenina. La trascrizione del DNA viene catalizzata dallenzima RNA polimerasi. LRNA polimerasi si lega strettamente ad una specifica sequenza del DNA, detta promotore, che contiene il sito nel quale inizia la sintesi dellRNA (vedi Figura 9.3). Sono necessarie allRNA polimerasi delle proteine, dette fattori di trascrizione, per legarsi al DNA ed iniziare la trascrizione. La regolazione della trascrizione pu determinare un incremento, una diminuzione o anche lannullamento dellespressione fenotipica di un gene. Per esempio, una singola mutazione
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Figura 9.2 - Modello di una sequenza nucleotidica. La sequenza fittizia. e altre sequenze comprese nelle regioni 5-3 che non vengono tradotte. Le regioni non rappresentate nellmRNA vengono indicate come sequenze non codificanti o introni. Nella trascrizione iniziale del DNA nellRNA, gli introni e gli esoni sono copiati integralmente ed il prodotto risultante conosciuto come trascritto primario dellRNA o pre-mRNA. La sua modificazione si verifica quando il pre-mRNA ancora presente nel nucleo, dove gli introni vengono rimossi con un processo che conosciuto come splicing dellRNA (vedi Figura 9.4). Lo splicing dellRNA dipende dalla presenza di certe sequenze altamente conservate che consistono nella presenza di GU nel sito di splicing 5 (sito donatore) ed di AG nel sito di splicing 3 (sito accettore). Inoltre, un residuo adenosinico allinterno di una specifica sequenza dellintrone partecipa a una complicata reazione con un complesso ribonucleoproteico molto grande detto spliceosoma. La reazione consiste nel taglio e giunzione dei siti 5 e 3 di splicing e con il rilascio delle sequenze introniche mediante la formazione di un cappio. Una sostituzione in una qualunque di queste sequenze altamente conservate pu determinare
Figura 9.3 - La sequenza promotore () contiene il sito di partenza per la sintesi dellRNA. La RNA polimerasi si lega al promotore e apre in fuori una regione locale della sequenza del DNA. Un filamento del DNA (quello posto in basso in questa figura) agisce come modello per lappaiamento complementare delle basi. La RNA polimerasi copia il DNA in direzione da 5 a 3 fino ad incontrare un segnale di arresto (). Le lettere minuscole rappresentano i nucleotidi negli introni; le lettere maiuscole rappresentano le basi codificanti negli esoni. La sequenza fittizia.
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uno splicing impreciso (vedi Figura 9.4). Lo splicing del pre-RNA viene strettamente regolato durante la differenziazione ed specifico per i diversi tessuti. Per esempio, lacetilcolinoesterasi, che porta lantigene gruppoematico Cartwright, viene frazionata in modo da produrre una proteina legata al glicosilfosfatidilinositolo nei globuli rossi, ma, nelle cellule nervose, una proteina transmembrana2. Uno splicing alternativo pu verificarsi anche in un singolo tipo di tessuto e pu determinare la produzione di pi di una singola proteina che viene in realt codificata dal medesimo gene; un esempio di questo tipo la produzione delle glicoforine C e D da un singolo gene che codifica per la glicoforina C (GPC)3. Traduzione dellmRNA Le basi presenti nelle sequenze lineari della catena di mRNA vengono lette (o tradotte) in gruppi di tre, detti codoni. Ogni combinazione di tre basi codifica per un amminoacido. Vi sono solo 20 amminoacidi che vengono comunemente utilizzati per la sintesi delle proteine ed esistono 64 (4x4x4) possibili codoni. Quasi tutti gli aminoacidi sono rappresentati da pi di un codone e questa situazione conosciuta con il nome di degenerazione o ridondanza nel codice genetico. Per esempio, la lisina pu essere codificata sia
con AAA che con AAG. La metionina codificata dal solo codone AUG. Tre codoni (UAA, UGA e UAG) funzionano come segnale di arresto; quando il processo di traduzione incontra una di queste triplette, la sintesi del peptide viene interrotta. Per la traduzione dei codoni in amminoacidi, lmRNA richiede lassistenza delle molecole dellRNA transfer (tRNA). Le molecole tRNA interagiscono con lmRNA attraverso uno specifico appaiamento delle basi, trasportando con s lamminoacido specificato dal codone dellmRNA. Dopo di che, gli amminoacidi sono uniti tra loro mediante legami ammino-carbossilici formando cos una catena polipeptidica che cresce via via. Le proteine vengono sintetizzate in modo che abbiano lamminoacido iniziale con il gruppo amminico non concatenato e terminino con il gruppo di acido carbossilico (COOH) libero. La sintesi proteica si realizza nei ribosomi, che sono costituiti da grandi complessi di molecole di RNA e proteine; i ribosomi legati al reticolo endoplasmico rugoso sono il luogo della sintesi delle proteine di membrana e secretorie, mentre i ribosomi liberi sono il luogo di sintesi delle proteine disperse nel citosol delle cellule. I ribosomi si legano al tRNA e allRNA messaggero, iniziando dal loro terminale 5 (terminale amminico).
Figura 9.4 - La sostituzione di due nucleotidi (in grassetto) nelle sequenze degli introni che fiancheggiano lesone 3 della GYPB impedisce uno splicing normale. Al suo posto, tutti i nucleotidi compresi tra il sito donatore 5 del secondo introne ed il sito accettore 3 del terzo introne vengono escissi. Poich lesone 3 non viene di conseguenza tradotto, indicato come pseudoesone ().
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Per questo motivo, la sintesi proteica inizia dal terminale amminico e finisce con il terminale carbossilico. La proteina viene sintetizzata fino a quando viene raggiunto un codone di arresto, che termina il processo di traduzione determinando il rilascio della proteina di nuova sintesi. Molti dei passaggi della via di sintesi che procede dallRNA alla produzione delle proteine sono strettamente controllati a differenti livelli dallespressione dei geni di controllo. Questi passaggi comprendono: linizio della trascrizione, la correzione del processo di trascrizione, laggiunta della coda poli-A, il trasferimento dellmRNA nel citosol, linizio del processo di traduzione e lallungamento della catena polipeptidica. Inoltre, lespressione di un gene pu essere influenzata dalla specificit tissutale, dalla differenziazione oppure da fattori di fase-specifici, come anche dagli elementi di una risposta ormonale o da elementi regolatori ai terminali 5 e 3 dellmRNA.
I meccanismi genetici che creano il polimorfismo

Malgrado la ridondanza dovuta alla degenerazione del codice genetico, eventi molecolari come la sostituzione, linserzione o la delezione di un nucleotide possono avere effetti di ampia portata sulla proteina codificata. Alcuni dei polimorfismi dei gruppi sanguigni osservati a livello fenotipico possono essere ricondotti a piccoli cambiamenti a livello nucleotidico. La sequenza nella Figura 9.2, che non intende rappresentare una sequenza conosciuta, pu essere utilizzata per illustrare gli effetti di piccoli cambiamenti a livello nucleotidico, come sar discusso pi avanti. Sostituzione di nucleotidi Le sostituzioni dei nucleotidi nel DNA genomico possono avere effetti molto profondi sulla proteina risultante. Molti degli antigeni dei gruppi sanguigni sono semplicemente il risultato di un singolo cambiamento nucleotidico, verificatosi a livello del DNA. I cambiamenti nucleotidici vengono trascritti
nellRNA, con conseguente alterazione della sequenza dei codoni. In alcuni casi, il cambiamento del codone determina lincorporazione di un amminoacido differente. Per esempio, un cambiamento nella sequenza del DNA da T a C in una determinata posizione risulter in un cambiamento nellmRNA da U a G. Ognuno dei tre possibili risultati che vengono successivamente elencati pu essere la conseguenza della sostituzione di un singolo nucleotide: 1. mutazione silente. Per esempio, la sostituzione di una A con una C nella terza posizione del filamento di DNA che codifica per serina (UCU) nella Figura 9.2 codifica anchessa per la serina (UCG). Per questo, non vi saranno effetti sulla proteina perch il codone verr tradotto ancora come serina; 2. mutazione di senso (o risposta missense). La sostituzione di una G con una A nella seconda posizione del filamento di DNA che codifica per la seconda serina cambia il prodotto del codone da serina (UCG) a leucina (UUG). Molti polimorfismi dei gruppi sanguigni riflettono il cambiamento di un singolo amminoacido nella molecola di riferimento. Per esempio, lantigene K2 ha come amminoacido alla posizione 193 la treonina, mentre K1 ha la metionina. Questo il risultato di una singola sostituzione da C a T nellesone 6 del gene Kell (KEL)4; 3. mutazione non senso (o risposta nonsense). La sostituzione di una G con una T nella seconda posizione del filamento di DNA che codifica per la serina (UCG) determina la formazione del codone (UAG), che uno dei tre codoni di arresto della sintesi. Nessuna sintesi proteica si verificher dopo questo punto, determinando la formazione di una proteina accorciata o tronca. In base al sito dove si verifica questa sostituzione nonsense, la proteina sintetizzata potr andare incontro ad una rapida degradazione oppure conservare qualche funzione anche nella sua forma accorciata. Gli antigeni del sistema Cromer sono localizzati sulla proteina di membrana del fattore accelerante il
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decadimento (DAF). Nel fenotipo null (Inab) una sostituzione nucleotidica da G ad A nel gene DAF crea un codone di stop in posizione 53 e di conseguenza i globuli rossi non presentano alcuna espressione antigenica DAF5. Una sostituzione nucleotidica che avviene al di fuori di un esone pu, comunque, alterare lo splicing dellRNA e determinare la produzione di proteine alterate, come si pu notare nella alterata espressione della glicoforina B (GPB)6 o nella mancata produzione di una normale quantit di proteina, come si verifica nel fenotipo Dr(a) del sistema Cromer7. Nel GYPB, che il gene che codifica la GPB, le sostituzioni di due nucleotidi conservati che sono necessari per lo splicing dellRNA e che sono presenti nel gene della glicoforina A, determinano lescissione dellesone 3 cos come degli introni 2 e 3 del gene GYPB (vedi Figura 9.4). Poich lesone 3 un esone codificante nel gene GYPA ma non codificante nel GYPB, viene indicato come pseudoesone nel gene GYPB. Inserzione di nucleotidi e delezione Linserzione di un nuovo nucleotide determina
un frameshift, descritto come +1, perch stato aggiunto un nucleotide. La delezione di un nucleotide causa invece un frameshift che viene indicato come 1. Un peptide pu essere modificato in modo drastico dallinserzione o dalla delezione di un singolo nucleotide. Per esempio, linserzione di una A dopo il secondo nucleotide del filamento del DNA non codificante che rappresentato nella Figura 9.2 pu cambiare il modulo di lettura dellmRNA in UAU CAG AAG CUG CCC UGG e rappresentare il polipeptide isoleucina-valina-fenilalanina-acido aspartico-glicina-treonina.
Variabilit genetica
La conversione del gene ed il crossing-over possono verificarsi tra geni omologhi che sono posti su due copie del medesimo cromosoma che si sono disallineati tra loro durante la meiosi. Esempi di geni omologhi che codificano per degli antigeni dei gruppi sanguigni sono i geni RHD ed RHCE del sistema Rh e GYPA e GYPB che codificano gli antigeni del sistema
Figura 9.5 - Singolo crossover: lo scambio di nucleotidi avviene tra geni omologhi che si sono disallineati. I prodotti sono reciproci.
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gruppoematico MNS. Singolo crossover Un crossover singolo costituito dal mutuo scambio di nucleotidi tra due geni omologhi. Se il crossover si verifica in una regione dove i cromosomi omologhi che si sono appaiati sono disallineati, si formano due geni ibridi durante il riarrangiamento reciproco (vedi Figura 9.5). La nuova sequenza di amminoacidi che viene codificata dai nucleotidi originatisi dalla giunzione dei geni ibridi pu determinare la formazione di epitopi che vengono riconosciuti da anticorpi presenti in sieri umani e sono ben conosciuti i casi che si sono verificati in almeno tre sistemi gruppoematici eritrocitari: i sistemi Rh, MNS e Gerbich.
Conversione genica Si ritiene che il processo della conversione genica consista in un crossover, che comporta un processo generalizzato di ricombinazione del DNA e la riparazione del DNA durante la meiosi. Il risultato finale che nucleotidi, provenienti da un gene omologo, vengono inseriti in un altro gene senza scambio reciproco. Durante la meiosi, nel punto del crossover cromosomico, si pu formare un punto di giunzione eteroduplice; questa una giunzione che determina un intervallo tra le sequenze nucleotidiche su uno dei due filamenti partecipanti di DNA (vedi Figura 9.6). Il secondo tipo di conversione del gene che si pu verificare nella meiosi, avviene quando la DNA polimerasi scambia la matrice del filamento di DNA e copia
Figura 9.6 - La conversione genica: una giunzione eteroduplice viene formata tra le sequenze omologhe di due geni. La DNA polimerasi ripara le doppie eliche. Ogni eccesso di DNA strutturato in un filamento singolo viene degradato dalle nucleasi, producendo un gene ibrido su un cromosoma ma nessuna modifica sullaltro.
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le informazioni dalla sequenza omologa. Questo evento di solito il risultato di una riparazione malassortita; i nucleotidi che vengono rimossi da un filamento di DNA sono rimpiazzati con una sintesi riparativa, che utilizza come matrice il filamento omologo di DNA.
Tecniche molecolari
Lo sviluppo delle moderne tecniche molecolari ha espanso enormemente le nostre conoscenze su tutti i sistemi biologici. Queste stesse tecniche sono applicabili nella diagnostica delle malattie, nellesercizio della scienza forense, nella generazione di proteine ricombinanti e nella produzione di geni funzionali per la terapia genica. Molte di queste procedure hanno avuto origine con la tipizzazione e lanalisi del DNA, tutte tecniche che esamineremo di seguito. Lisolamento degli acidi nucleici Il primo passo per la maggior parte delle tecniche applicate nella biologia molecolare consiste nellisolamento e nella purificazione degli acidi nucleici, sia del DNA che dellRNA. Per le applicazione che interessano al personale che opera nelle Banche del Sangue, gli acidi nucleici di interesse sono ovviamente il DNA e lmRNA del genoma umano. Il DNA genomico presente in tutte le cellule nucleate e pu essere isolato dai leucociti del sangue periferico, oppure dai tessuti della bocca utilizzando un semplice bastoncino tampone. Sia le cellule nucleate che i reticolociti sono delle fonti cellulari specifiche per lmRNA. I produttori di diagnostici offrono dei kit per lisolamento del DNA genomico dal sangue intero, dalle cellule e dai tessuti. Questi kit sono variabili per la quantit e per la qualit del DNA che viene isolato, con un rapporto approssimativo tra il costo e la semplicit di utilizzo del kit. Il DNA viene definito di alta qualit quando di alto peso molecolare ed relativamente libero dalla contaminazione di proteine o di RNA. La purezza del DNA viene accertata con il rapporto tra la sua densit ottica (DO) a 260 nm rispetto a quella
rilevabile a 280 nm, con un rapporto di DO 260/ 280 per il DNA puro di 1,8. Un rapporto pi basso (<1,6) indica che il DNA contaminato da proteine o da materiali utilizzati nella procedura di isolamento ed un rapporto pi alto (>2,0) indica che il DNA contaminato dallRNA. Se il DNA puro ed in concentrazione sufficiente, pu essere misurato quantitativamente mediante DO a 260 nm. Se il DNA non puro o in concentrazione troppo bassa, meglio quantificarlo con lelettroforesi in gel di agarosio in parallelo con un DNA standard a concentrazione nota, dopo la visualizzazione del DNA con una colorazione con bromuro detidio. Per certe tecniche di biologia molecolare, come la reazione della polimerasi a catena (PCR), la quantit e la qualit del DNA genomico utilizzato come materiale di partenza non cruciale e possono essere ottenuti dei buoni risultati con qualsiasi quantit di nanogrammi di DNA che stato degradato in piccoli frammenti. Per altre tecniche di biologia molecolare, come la clonazione, sono necessarie delle quantit maggiori di DNA ad alto peso molecolare. Una cellula nucleata contiene circa 6 pg di DNA genomico. Basandosi su un conteggio medio di globuli bianchi di 5.000/ L, ogni millilitro di sangue periferico contiene circa 30 g di DNA. I kit commerciali per lisolamento del DNA hanno di solito una resa di 15 g di DNA per ogni millilitro di sangue intero processato. La reazione della polimerasi a catena Lintroduzione della tecnica della polimerasi a catena ha rivoluzionato il campo della genetica molecolare8. Questa tecnica permette la rapida e precisa replicazione in vitro di una specifica sequenza di DNA. La PCR pu amplificare, per miliardi di volte, una singola copia della sequenza del DNA in esame, purch almeno un frammento della sequenza nucleotidica sia noto. Gli operatori devono conoscere almeno qualche cosa della sequenza genica per sintetizzare gli oligonucleotidi del DNA da utilizzare come primer. Sono necessari due primer: primer di inizio (5) ed un primer inverso (3). Questi sono disegnati in modo che ciascuno
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sia complementare ad ogni filamento di DNA e che, insieme, fiancheggino la regione di interesse. I primer possono essere progettati in modo da aggiungere dei siti di restrizione al prodotto della PCR per semplificare la loro successiva clonazione o la marcatura, rendendo pi facile il loro riconoscimento. La marcatura pu essere ottenuta incorporando un radioisotopo o, pi comunemente, prevedendo una marcatura non radioattiva, come con la biotina o con un colorante fluorescente. La reazione di PCR viene catalizzata da una o pi DNA polimerasi stabili al calore, essendo state isolate da specie batteriche originarie da sorgenti calde o da correnti termali del fondo delloceano. La termostabilit di questi enzimi ne permette la resistenza ai cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento. Procedura della reazione La tecnica di amplificazione semplice e richiede una quantit molto piccola di DNA (di solito <100 ng di DNA genomico). Il DNA in esame viene miscelato insieme a una soluzione tampone, a nucleotidi in eccesso, ai primer e alla polimerasi (vedi Figura 9.7). La miscela di reazione viene posta in un termociclatore programmato per produrre una serie di cicli di riscaldamento e raffreddamento che determinano unamplificazione esponenziale del DNA. Il DNA bersaglio viene inizialmente denaturato con il riscaldamento della miscela, in modo tale che il doppio filamento di DNA si separi in filamenti singoli. Il successivo raffreddamento, in presenza di quantit in eccesso di primer a singolo filamento, sia senso che antisenso, consente a questi di appaiarsi alle sequenze complementari presenti sul filamento singolo del DNA matrice. La temperatura di raffreddamento viene calcolata in funzione dei primer utilizzati. La miscela di reazione viene poi riscaldata alla temperatura ottimale per la DNA polimerasi termostabile, che genera un nuovo filamento di DNA su ogni singolo filamento di DNA matrice, utilizzando i nucleotidi come mattoni da costruzione per realizzare lallungamento del DNA.
Il ciclo successivo denatura nuovamente i doppi filamenti neo formati e le copie di DNA a singolo filamento serviranno, a loro volta, come modello per le successive sintesi. Il numero di copie di DNA raddoppia ad ogni ciclo in modo che, dopo 20 cicli, vi unamplificazione di miliardi di volte del DNA bersaglio. Il DNA amplificato pu essere analizzato con lelettroforesi su gel di agarosio in presenza di etidio bromuro, che si lega al DNA e lo rende visibile alla luce ultravioletta. Il DNA sar presente come una singola banda definita equivalente in lunghezza alla distanza tra i terminali 5 dei primer. Il DNA amplificato pu essere anche differenziato per le dimensioni utilizzando unelettroforesi capillare. Alternativamente, il campione di DNA pu essere trasferito su una membrana ed essere ibridizzato ad una sonda (probe) allele-specifica marcata. Questo procedimento conosciuto come trasferimento a puntini ( dot blot ) ed particolarmente utile quando si analizzano numerosi campioni per il medesimo polimorfismo. Sono state sviluppate delle varianti della PCR per soddisfare necessit specifiche. Per esempio la PCR long-distance che, contenendo una miscela di polimerasi termostabili, pu amplificare bersagli pi grandi (pi di 40 kilobasi in lunghezza) di quelli che vengono di solito amplificati con la PCR convenzionale (oltre 2 kilobasi in lunghezza). anche possibile eseguire una PCR in situ, nei tessuti e nelle cellule. Una tecnologia correlata, la reazione a catena con ligasi (LCR), utilizza una DNA ligasi termostabile al posto della DNA polimerasi termostabile. In alternativa allamplificazione di un segmento di DNA bersaglio, localizzato tra due primer fiancheggianti utilizzando una DNA polimerasi, come avviene nella PCR, nella LCR si verifica un legame diretto dei primer senza lamplificazione del segmento di DNA interposto. Altre varianti della PCR comprendono la PCR multiplex, nella quale segmenti multipli ed indipendenti di DNA vengono contemporaneamente amplificati nella stessa reazione e la PCR cinetica, nella quale il prodotto di
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Figura 9.7 - La reazione della polimerasi a catena consiste in unamplificazione esponenziale di una breve sequenza di DNA in modo che la sequenza bersaglio venga amplificata per oltre un miliardo di volte dopo 20 cicli (la Taq polimerasi viene utilizzata in questo caso come esempio di polimerasi termostabile del DNA).
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amplificazione viene misurato in tempo reale al fine di quantificare la quantit di acido nucleico iniziale. Le applicazioni della PCR Lamplificazione di quantit ridotte di DNA fino a livelli rilevabili pu influire significativamente sulla pratica della Medicina Trasfusionale. Nello screening per gli agenti infettivi nei donatori di sangue, la PCR diventata la procedura di prima scelta, eliminando in questo modo la dipendenza della diagnosi dalla sieroconversione, che si verifica parecchio tempo dopo lesposizione ai virus o ad altri patogeni (vedi Capitolo 28). I Centri Trasfusionali hanno iniziato ad usare lamplificazione degli acidi nucleici con i test NAT utilizzati per identificare la presenza dellRNA dellHIV e dellHCV nei campioni di sangue dei donatori; il rilievo dellRNA del virus West Nile stata eseguito in un test sperimentale. La determinazione dellRNA virale comprende tre fasi: estrazione, amplificazione e rilievo. Lestrazione pu essere effettuata dopo una fase di centrifugazione per concentrare il virus e rimuovere i contaminanti. In un altro modo, lestrazione dellRNA pu essere eseguita successivamente alla cattura dellRNA virale su una molecola immobilizzata in fase solida o su particelle magnetiche in soluzione (questa procedura viene indicata come cattura del bersaglio). Dopo limmobilizzazione, le impurit possono essere rimosse con una serie di lavaggi. Prima dellamplificazione, lRNA virale deve essere convertito in DNA; questo passaggio viene effettuato con un enzima, la transcriptasi inversa (RT). Lamplificazione del DNA pu poi essere eseguita attraverso delle intermediazioni multiple. Nel caso della PCR, il prodotto amplificato il DNA (che viene sintetizzato utilizzando la Taq DNA polimerasi termostabile), mentre nel caso dellamplificazione trascrizione-mediata, il prodotto amplificato lRNA (che viene sintetizzato utilizzando la T7 RNA polimerasi) (vedi Figura 9.8). Levidenziazione del prodotto amplificato pu essere effettuato mediante la cattura del DNA amplificato su nitrocellulosa o con un test
immunoenzimatico oppure in chemiluminescenza. Correntemente, il NAT per lo screening dei donatori stato applicato per lHIV e per lepatite C; mentre il NAT per lepatite B in corso di sviluppo. I NAT per altri agenti patogeni (per esempio, il virus linfotropico per le cellule-T umane, il virus dellepatite A, il parvovirus B19) non sono facilmente disponibili. La PCR inizia ad essere utilizzata per la determinazione prenatale di molte patologie ereditarie come lanemia falciforme, nella valutazione della malattia emolitica fetale e neonatale, per tipizzare gli amniociti fetali9, per quantificare i leucociti residui nel sangue filtrato e per identificare i leucociti del donatore nei riceventi trasfusi (chimerismo). La PCR long distance viene utilizzata per la clonazione, il sequenziamento e la mappatura dei cromosomi, mentre la transcriptasi inversa (RT)-PCR viene utilizzata per lo studio dellespressione genica e per la clonazione DNA complementare (cDNA). La PCR ha una particolare applicazione in Medicina Trasfusionale per la sua efficacia nellevidenziare le varianti genetiche. Nel campo dei trapianti, per la tipizzazione HLA viene utilizzata la PCR, che utilizza sonde oligonucleotidiche sequenza-specifiche oppure primer sequenza-specifici (vedi Capitolo 17). Le endonucleasi di restrizione La scoperta delle endonucleasi batteriche di restrizione ha fornito la chiave tecnica per lanalisi del DNA. Questi enzimi, che sono stati rilevati in diversi tipi di batteri, proteggono la cellula batterica dallinfezione virale degradando il DNA virale dopo il suo ingresso nel citoplasma. Ogni endonucleasi di restrizione riconosce solo una specifica sequenza nucleotidica, costituita di solito da quattro a sei nucleotidi. Questi enzimi tagliano il filamento di DNA ogni volta che si verifica il riconoscimento della sequenza nucleotidica, generando una quantit di frammenti di DNA, la cui lunghezza dipende dal numero e dalla localizzazione dei siti di taglio del filamento originale di DNA. Numerose endonucleasi sono state purificate da differenti specie di batteri; il nome di ogni enzima riflette il
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Passaggio 1: Passaggio 2: Passaggio 3: Passaggio 4: Passaggio 5: Passaggio 6: Passaggio 7: Passaggio 8: Passaggio 9: Passaggio 10: Passaggio 11: Passaggio 12:
Il primer-promotore si lega allrRNA bersaglio. La trascriptasi inversa (RT) crea una copia dellrRNA bersaglio. Duplicazione RNA:DNA. Lattivit dellRNAse H della RT degrada lrRNA. Il primer 2 si lega al DNA e la RT crea una nuova copia di DNA. Il filamento doppio del DNA matrice con una sequenza promotore. LRNA polimerasi (RNA Pol) inizia la trascrizione dal DNA matrice. Vengono prodotte 100-1000 copie di RNA amplicon. ll primer 2 si lega ad ogni RNA amplicon e la RT crea una copia del DNA. Duplicazione RNA: DNA. Lattivit dellRNAse H della RT degrada lrRNA. Il primer-promotore si lega al DNA di nuova sintesi. La RT crea un filamento doppio di DNA e il ciclo autocatalitico viene ripetuto, con il risultato di unamplificazione di un miliardo di volte.
Figura 9.8 - Ciclo di amplificazione trascrizione-mediato.
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nome del batterio ospite, per esempio Eco RI stata isolata dallEscherichia coli, Hind III deriva dall Hemophilus influenzae ed Hpa I origina dallHemophilus parainfluenzae. Lanalisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione Le propriet uniche delle endonucleasi di restrizione rendono lanalisi del polimorfismo della lunghezza di frammenti di restrizione (RFLP) utile alla determinazione del polimorfismo del DNA. I cambiamenti nella sequenza dei nucleotidi descritti precedentemente (sostituzione, inserzione e delezione) possono alterare la collocazione relativa dei punti di resezione dove agiscono le nucleasi di restrizione, alterando in questo modo la lunghezza dei frammenti prodotti. Gli RFLP vengono studiati utilizzando le tecniche di Southern blotting e mediante libridizzazione con sonde (vedi Figura 9.9). Il DNA isolato viene tagliato in frammenti mediante la digestione operata da una o pi endonucleasi di restrizione. I frammenti del DNA vengono successivamente separati con
elettroforesi su gel di agarosio e poi trasferiti su una membrana di nylon od un foglio di nitrocellulosa. Dopo la fissazione sulla membrana di nylon o sul foglio di nitrocellulosa, i frammenti di DNA vengono esaminati con lapplicazione di una sonda, che un piccolo frammento di DNA la cui sequenza nucleotidica complementare alla sequenza di DNA in esame. Una sonda pu essere un oligonucleotide prodotto artificialmente o pu anche essere ottenuto da un DNA complementare che stato clonato. La sonda viene marcata con un radioisotopo oppure con un altro indicatore che permetta la visualizzazione dei frammenti di restrizione del DNA in esame che sono stati marcati e vengono poi indotti ad ibridizzare con la tecnica Southern blotting. Leccesso di sonda non legata viene eliminata mediante lavaggi ed il DNA ibridizzato viene visualizzato come una o pi bande di specifica dimensione, che determinata dalla sequenza nucleotidica specifica. Se vengono esaminati per il polimorfismo soggetti diversi, potranno essere osservati degli
Figura 9.9 - Southern blotting: una tecnica per il rilievo del polimorfismo mediante il trasferimento dal gel per blotting ed ibridizzazione con sonde conosciute.
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schemi di bandeggio differenti. Lanalisi dei RFLP stata utilizzata nella mappatura e nellanalisi dei geni, per lanalisi delle correlazioni, nella caratterizzazione dei geni HLA nei trapianti, per le indagini sulla paternit e nella scienza forense. Profilo del DNA Le regioni del DNA che presentano unelevata variabilit allelica (minisatelliti e microsatelliti) possono essere studiate utilizzando la mappatura dei FRLP e/o con lanalisi PCR (una procedura che viene talvolta indicata come profilo del DNA, tipizzazione del DNA, oppure impronta identificativa del DNA del soggetto o fingerprinting). I minisatelliti o numero variabile di loci ripetuti in tandem (VNTR), consistono in sequenze di medie dimensioni (6-100 coppie di basi) che sono ripetute in tandem, mentre i microsatelliti o loci con sequenza breve ripetuta in tandem (STR), sono costituiti da brevi ripetizioni di sequenze in tandem (di solito 4 coppie di basi). Questi tratti sono rilevati quasi sempre nelle regioni non codificanti del DNA. La variabilit deriva dalla differenza nel numero delle unit ripetute che sono contenute allinterno dei frammenti. Vi sono cos tante variazioni tra gli individui che la probabilit per due diversi soggetti di presentare lo stesso numero di ripetizioni sono molto basse, anche se sono consanguinei. Lo schema dei VNTR e/o dei STR che vengono rilevati in quattro o otto loci diversi pu essere unico per un individuo e questo costituisce il profilo (o impronta di identificazione) che definisce solo il suo DNA. Quando venne sviluppata la definizione del profilo del DNA, gli esami furono eseguiti con lanalisi dei RFLP. Ora la definizione del profilo del DNA stata migliorata con lamplificazione di loci selezionati di VNTR e/o di STR altamente informativi, utilizzando primer oligonucleotidici locus -specifici, che viene poi seguita dalla misurazione delle dimensioni dei prodotti dalla PCR. I prodotti della PCR possono essere separati per dimensioni con lelettroforesi in gel di poliacrilammide ed essere evidenziati con la colorazione in argento, oppure, se i prodotti della
PCR hanno incorporato un marcatore fluorescente, con sistemi di rilevazione della fluorescenza, compresi quelli progettati per il sequenziamento automatico del DNA. Il confronto dei prodotti VNTR e STR con una scala dimensionale standard differenzia gli alleli che sono presenti nel campione. Il profilo del DNA una tecnica estremamente potente per identificare la fonte del DNA umano; per questo motivo, ha trovato applicazione negli esami forensi e nelle indagini sulla paternit, come anche nella documentazione del chimerismo che risulta di particolare importanza nel monitoraggio del trapianto ematopoietico allogenico. Clonazione del DNA La PCR pu essere impiegata anche per lanalisi dellmRNA, che costituisce una fonte particolarmente utile di materiale genetico perch vi sono rappresentati solo gli esoni del gene. Con una modifica della PCR, che viene indicata come RT-PCR, il singolo filamento di mRNA viene convertito in un doppio filamento di DNA. Per prima cosa viene utilizzato lenzima RT per generare un singolo filamento di DNA, che serve come modello per generare un secondo filamento di DNA utilizzando la DNA polimerasi. Il prodotto un filamento di DNA complementare (cDNA) che costituisce la molecola di DNA di prima scelta per eseguire la clonazione e il sequenziamento. Nella clonazione di un gene, il DNA che contiene il gene in esame viene inserito in un vettore, che pu essere costituito da un elemento genetico autoreplicante come un virus (per esempio il batteriofago lambda gt11), oppure un plasmidio. I plasmidi sono delle piccole molecole circolari di DNA a doppia elica, naturalmente presenti nei batteri ai quali conferiscono solitamente loro la resistenza agli antibiotici. Dopo che il gene stato inserito nel DNA del vettore, il DNA ricombinante pu essere introdotto in un batterio ospite, dove inizia a replicarsi. Poich molti vettori presentano dei geni per la resistenza agli antibiotici, questa caratteristica pu essere sfruttata per coltivare i batteri ospiti in presenza del pertinente antibiotico; in questo modo solo i
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batteri che hanno incorporato con successo il vettore ricombinante potranno sopravvivere e quindi formare le colonie o i cloni. Ogni vettore pu contenere potenzialmente una differente sequenza del cDNA. La sommatoria dei cloni batterici che portano i vettori ricombinanti viene indicata come libreria del DNA. Le librerie possono essere ottenute da molte fonti commerciali oppure possono essere prodotte da un ricercatore privato. La libreria pu essere esaminata con una tecnica analoga al Southern blotting, con una sonda oligonucleotidica che basata su una parte conosciuta della sequenza. I cloni positivi possono essere selezionati ed colture pure possono essere coltivate in grandi quantit. Dopo la purificazione, il DNA clonato pu essere recuperato per essere utilizzato come sonda e per una dettagliata caratterizzazione molecolare. La capacit virtuale di inserire dei geni nei genomi di qualsiasi organismo, compresi i batteri, le piante, gli invertebrati (come gli insetti) e i vertebrati (come i mammiferi), permette non solo la caratterizzazione, ma anche lingegneria genetica, compresa la produzione di proteine ricombinanti (vedi di seguito) e la terapia genica. Bench attualmente in una fase di sviluppo, la terapia genica promette di avere un ruolo nella gestione di varie malattie genetiche ereditarie, dei virus responsabili dellimmunodeficienza umana, del cancro e nello sviluppo di nuovi vaccini10,11. Sequenziamento del DNA Uno dei maggiori sforzi scientifici mondiali, denominato Progetto Genoma Umano, ha realizzato la sequenza completa del genoma umano, cos come quella di diversi altri organismi chiave. Liniziativa ha inoltre migliorato la tecnologia del sequenziamento del DNA. La realizzazione di entrambi gli obiettivi ha comportato un impatto positivo sulla pratica trasfusionale. Lidentificazione di tutti i geni umani12,13 fornisce una completa rappresentazione delle proteine che sono importanti in Medicina Trasfusionale.
A sua volta, questa informazione ha aiutato lo sviluppo delle proteine ricombinanti utilizzate come emoderivati per un uso trasfusionale e per i reattivi impiegati in vitro. Ha anche giocato un ruolo nel chiarire dei problemi che affliggono i riceventi delle trasfusioni. I miglioramenti nel sequenziamento del DNA hanno aperto un settore ad ampio sviluppo rispetto alle ingombranti tecniche manuali comunemente utilizzate fino a tempi recenti nei laboratori di ricerca14. Il sequenziamento automatizzato del DNA, realizzato attraverso la tecnologia laser per il rilievo delle sequenze dei prodotti marcati con la fluorescenza, evidenzia tutte e quattro le basi nucleotidiche in una singola linea su un gel di poliacrilammide e pu essere ottimizzato per delle applicazioni specialistiche, come il rilievo degli eterozigoti e per il dimensionamento dei frammenti della PCR. Il sequenziamento automatizzato del DNA, utilizzando lelettroforesi capillare, particolarmente utile per un rapido sequenziamento di DNA. La sequenza del DNA pu essere ottenuta anche utilizzando la spettrometria di massa. Con il progredire di questa tecnologia il sequenziamento automatizzato diventer di uso sempre pi comune nei laboratori clinici. Se si potr realizzare un contenimento dei costi per un impiego nella routine, il sequenziamento del DNA potr diventare un metodo di routine per la genotipizzazione. Microarray di DNA La complessit del genoma umano necessita che le espressioni differenzianti dei geni multipli vengano analizzate una alla volta per comprendere i processi biologici normali, cos come i cambiamenti che si verificano nelle malattie. Una tecnica con delle grandi potenzialit per poter conseguire questo obiettivo sono i microarray di DNA o gene chips15. In questo metodo, decine di migliaia di molecole separate di DNA vengono distribuite in puntini, oppure sono sintetizzate, su una piccola area di un supporto solido, spesso su vetrino. Il DNA pu essere
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generato con la PCR o con la sintesi oligonucleotidica. Questi microarray sono poi esaminati, con una procedura analoga al Southern blotting , utilizzando un cDNA formato dallmRNA totale che viene espresso in un momento stabilito da una cellula o da un tessuto. Il risultato un quadro del profilo dellespressione genica di un tessuto per tutti i geni che sono espressi nei micropozzetti. I micropozzetti possono essere utilizzati anche per degli studi genomici comparativi e per la genotipizzazione, costituendo una possibile applicazione per i gruppi sanguigni. Proteine ricombinanti La tecnologia per produrre le proteine ricombinanti comprende sistemi in vitro che impiegano cellule di batteri, di lievito, di insetti e di mammiferi, come pure dei sistemi in vivo che coinvolgono piante e animali transgenici16. Per prima cosa, viene preparata una sorgente di DNA che corrisponde ad una sequenza di acido nucleico utile per la sintesi della proteina desiderata, di solito mediante la clonazione del cDNA fissandolo in un vettore ad espressione accettabile. Successivamente, il vettore stabilito che contiene il DNA in studio viene transfettato nella cellula ospite ed il DNA che interessa viene trascritto sotto il controllo del promoter del vettore. Dopo di che, lmRNA viene tradotto nella proteina dalla cellula ospite. Eventuali modifiche dopo la traduzione, come per esempio laggiunta di carboidrati alla nuova proteina, saranno eseguite dalla cellula ospite. Se sono necessarie delle specifiche modifiche dopo la traduzione, richieste per la funzionalit della nuova proteina ma che non possono essere eseguite dalla cellula ospite, pu rendersi necessario dotare in seguito la cellula ospite di ulteriori capacit aggiuntive; per esempio mediante la transfezione di un cDNA che codifica per uno specifico enzima. In alcuni casi, la modifica dopo la traduzione pu non essere essenziale per lefficacia della proteina ricombinante; per esempio, il fattore stimolante le
colonie granulocitarie (G-CSF) viene prodotto in forma non glicosilata nellE. coli (filgastrim) e in forma glicosilata nel lievito (lenogastrim). Le proteine ricombinanti hanno trovato molteplici impieghi in Medicina Trasfusionale come agenti terapeutici e come componenti di vaccini, nella preparazione di emoderivati, nella diagnostica virologica e negli esami sierologici. Leritropoietina umana ricombinante17, il G-CSF e il GM-CSF18, linterferone-alfa, linterleukina-2, linterleukina-11 ed i Fattori VIII19, IX20, VII, e VIIa21 tutti sono stati resi disponibili ed hanno trovato accoglienza nellambito clinico. Per esempio, leritropoietina ricombinante pu essere utilizzata per incrementare la produzione degli eritrociti nei pazienti anemici prima degli interventi chirurgici, riducendo la richiesta di sangue allogenico22. Leritropoietina ricombinante pu anche essere utilizzata per aumentare la quantit di sangue autologo che pu essere prelevato dai pazienti non anemici prima di un intervento chirurgico23. Inoltre, il suo impiego ha rivoluzionato la gestione dei candidati al trapianto renale quando questi pazienti presentano dei reni troppo compromessi per produrre delleritropoietina endogena. La trombopoietina umana ricombinante pu essere di grande utilit nellaumentare la raccolta delle piastrine con laferesi in donatori, ma purtroppo risultata inefficace per ridurre significativamente la necessit delle trasfusioni di piastrine se viene somministrata ai pazienti trombocitopenici24. Nellambito dellemostasi le proteine ricombinanti come la proteina C, lantitrombina e lirudina sono state certificate per luso dalla Food and Drug Administration, mentre gli inibitori dei fattori della via emostatica tissutale, il Fattore VIII ed il fattore di von Willebrand sembrano essere promettenti. I fattori ricombinanti che stimolano la proliferazione mieloide come il G-CSF vengono utilizzati per incrementare la raccolta delle cellule progenitrici durante laferesi e per il supporto dei pazienti dopo la chemioterapia ed il trapianto delle cellule ematopoietiche25. Le proteine ricombinanti possono essere utilizzate anche come componenti trasfusionali26.
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Lemoglobina umana ricombinante stata prodotta in numerose forme per un uso nei sistemi in vitro e in vivo nei suini transgenici che potrebbero risultare utili come sostituti non infettivi del sangue27. Lalbumina ricombinante del siero umano e stata prodotta nel lievito. Lalfagalattosidasi, un enzima che in grado di convertire le emazie di gruppo B in eritrociti di gruppo O, stato prodotto in forma ricombinante, in grado di modificare ununit di gruppo B per la trasfusione dei riceventi di gruppo A e O28. Queste proteine ricombinanti e altri prodotti che sono in via di sviluppo, potranno indubbiamente avere un ruolo per la variet delle componenti trasfusionali che si renderanno disponibili nel futuro. Le proteine ricombinanti che corrispondono alle proteine dei virus, dei batteri e dei parassiti clinicamente importanti, alcuni dei quali possono essere trasmessi con la trasfusione del sangue, potranno essere utilizzate come delle componenti di vaccini29 e anche come antigeni bersaglio nei kit per gli esami diagnostici che vengono impiegati per il rilievo degli anticorpi. Le cellule transfettate con vettori idonei possono essere indotte ad esprimere delle specifiche proteine ricombinanti sulla superficie della loro membrana cellulare e, in questo modo, possono diventare delle utilissime cellule geneticamente ingegnerizzate utilizzabili, come cellule test, negli esami in vitro. La terapia genica La terapia genica si riferisce allintroduzione di materiale genetico non-self nelle cellule di un soggetto al fine di trattare, oppure prevenire, una malattia. Attualmente, la terapia genica viene limitata alle sole cellule somatiche, perch sussistono degli impedimenti di carattere etico relativi al trasferimento di geni allinterno delle linee germinali. Oltre 3.500 pazienti hanno ricevuto una terapia genica nel corso di diverse sperimentazioni cliniche30, ma i risultati, nella maggior parte dei casi, hanno ampiamente disatteso le aspettative a causa dei problemi relativi allinserimento (transfezione) del materiale genetico (transgene o gene estraneo) nelle cellule e per la limitata
durata della vita delle cellule che sono state efficacemente transfettate. Vi sono diversi tipi di vettori (veicoli trasportatori di geni) che trasportano i geni allinterno delle cellule: vettori virali (retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati, vaccini, herpes simplex), il DNA nudo e il DNA modificato. Il materiale genetico pu essere trasferito nelle cellule anche con mezzi fisici come lelettroporazione (usando un campo elettrico). Non appena saranno migliorati i metodi per il trasporto dei geni allinterno delle cellule, facilmente prevedibile che i benefici della terapia genica diventeranno pi evidenti. La terapia genica pu essere utilizzata per la sostituzione di un gene difettoso, permettendo lincremento della produzione di una proteina specifica, come per esempio nella sostituzione produttiva del Fattore VIII o IX nei pazienti affetti dallemofilia31, oppure pu essere utilizzata per sottopotenziare (ridurre) lespressione fenotipica di un gene indesiderabile. Questa possibilit pu essere realizzata mediante lintroduzione di una sequenza di DNA corrispondente in senso contrario al filamento di mRNA (nucleotidi antisenso), che successivamente interferiranno con la traduzione dellmRNA nella proteina. Inattivazione di proteine e di RNA bersaglio Pi recentemente, sono state sviluppati dei nuovi prodotti farmacologici in grado di interferire con le molecole specificamente prodotte dalle cellule cancerogene o da degli agenti infettanti. Uno di questi agenti limatinib mesilato (Gleevec, Novartis Pharmaceuticals, East Hanover, NJ, USA), che si lega specificamente alla proteina Bcr-Abl e blocca lattivit della sua tirosinochinasi nelle malattie neoplastiche dei leucociti. Esso blocca specificamente il sito di legame per ladenosintrifosfato sulla chinasi e in questo modo inibisce la sua capacit nella fosforilazione delle proteine intracellulari32. Linattivazione previene la proliferazione delle cellule maligne indotta dalla Bcr-Abl e la sua attivit anti-apoptosi. La via di segnalazione normale della chinasi non viene normalmente influenzata. Unaltra promettente terapia costituita
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dallinterferenza con lRNA, che ha la sua radice storica come mezzo di ricerca utilizzato per caratterizzare la funzione dei geni conosciuti. Linterferenza con lRNA basata su un meccanismo antivirale nel quale il dsRNA (RNA a doppio filamento) viene inserito in una cellula e viene successivamente processato in piccole (2125 bp) molecole di RNA interferente (siRNA). Le molecole di siRNA inibiscono lespressione del gene bersaglio in modo sequenza-specifico. Ma, ancora pi importante, lRNA interferente possiede il potenziale per realizzare una strategia terapeutica utile per inibire i geni correlati al cancro o alle patologie infettive come lepatite virale33.
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Appendice 9.1 - Le tecniche molecolari nella Medicina Trasfusionale

Tecnica PCR Applicazioni Esami per le malattie infettive Indagini sui polimorfismi Indagini prenatali Proteine Ricombinanti/ Clonazione del DNA Terapia Esempi Virus, batteri, parassiti HLA, antigeni dei gruppi sanguigni Rh Eritropoietina, trombopoietina, G-CSF G-CSF Esami virali Fattori della coagulazione Emoglobina Alfa-galattosidasi Epatite, malaria, HIV Chimerismo, scienza forense Tipizzazione batterica HLA Anti-D Bibliografia 35 36 37, 38 1, 39 9 17, 18, 34
Aferesi Esami per le malattie infettive Componenti ricombinanti Componenti di processo Produzione di vaccini Profilo del DNA Identificazione umana Identificazione batterica Sequenziamento del DNA Phage display/ repertorio di clonazione RFLP Rilievo del polimorfismo rilievo degli eterozigoti Produzione di anticorpi monoclonali Rilievo del polimorfismo
39 40 19 27 28 27-29 41 42 14 43
HLA, antigeni dei gruppi sanguigni
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PCR = reazione della polimerasi a catena; G-CSF = fattore di stimolazione delle colonie granulocitarie; HIV = virus dellimmunodeficienza umana; RFLP = polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione.
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Capitolo 10: La genetica dei gruppi sanguigni
Capitolo 10
La genetica dei gruppi sanguigni
La scoperta di Landsteiner del sistema ABO dimostr che il sangue umano esprime strutture polimorfiche ereditarie. Poco dopo la scoperta del sistema ABO i globuli rossi si dimostrarono un mezzo semplice ed accessibile per analizzare il polimorfismo dei gruppi sanguigni nei soggetti di qualunque et. Con laumentare degli antigeni eritrocitari descritti, i fenotipi eritrocitari produssero un abbondante incremento delle informazioni relative alle strutture polimorfiche espresse sulle proteine, glicoproteine e glicolipidi degli eritrociti e le basi genetiche della loro ereditariet.
I principi fondamentali
Lereditariet dei caratteri trasmissibili o trait, comprendendo gli antigeni eritrocitari, costituisce le basi della scienza genetica. Il materiale genetico che determina ogni carattere localizzato nel nucleo della cellula. Questo materiale nucleare denominato cromatina ed fondamentalmente costituito da DNA (vedi Capitolo 9). Quando la cellula si divide, la cromatina perde la sua struttura omogenea e d origine a bastoncelli chiamati cromosomi. Nel DNA della cromatina dei cromosomi sono presenti le unit dellinformazione genetica, detti geni. I geni sono distribuiti con un ordine specifico lungo il cromosoma in una precisa collocazione fisica definita locus.
I cromosomi Il numero e la morfologia dei cromosomi sono specifici per ogni specie. Le cellule somatiche umane hanno 46 cromosomi strutturati in 23 coppie (un cromosoma per ogni coppia viene ereditato da ognuno dei genitori). Ventidue coppie di cromosomi sono simili sia nei maschi che nelle femmine e sono indicati come autosomi; i cromosomi sessuali, XX nelle femmine e XY nei maschi, costituiscono lultima coppia. Ogni cromosoma costituito da due braccia collegate da un restringimento, il centromero. Le due braccia sono di solito di diversa lunghezza: il braccio corto o piccolo, indicato come p e il braccio lungo come q. Le braccia di uno specifico cromosoma sono indicate dal numero del cromosoma seguito da p o q (per esempio, Xp il braccio corto del cromosoma X; 12q il braccio lungo del cromosoma 12). Quando si effettua il bandeggio cromosomico, ogni cromosoma presenta uno specifica sequenza di bande, che sono numerate dal centromero verso lesterno (Figura 10.1). I cromosomi vengono identificati dalla localizzazione del centromero e dalla specifica sequenza delle bande. La collocazione di uno specifico gene sul cromosoma pu essere fisicamente definita nella localizzazione di una specifica banda. La lionizzazione Nelle cellule somatiche femminili, solo uno dei cromosomi X attivo. Linattivazione di uno dei due cromosomi X un processo casuale che avviene entro pochi giorni dalla fecondazione.
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Solo uno dei cromosomi X viene inattivato e tutte le cellule originate dalla cellula clonale presenteranno il medesimo cromosoma X inattivo. Linattivazione del cromosoma determinata casualmente ma dopo che la decisione stata presa, la scelta immutabile. Questo processo viene definito come lionizzazione.
Figura 10.1 - Diagramma di un normale cromosoma 7 umano colorato con colorazione di Giemsa. Con lincremento della risoluzione (da sinistra a destra) le sottili sfumature del bandeggio vengono evidenziate. Le bande sono numerate verso lesterno a partire dal centromero (c), che divide il cromosoma nelle braccia p e q1. La mitosi e la meiosi Le cellule devono duplicare i propri cromosomi prima di replicarsi in modo che ognuna delle cellule figlie riceva un corredo completo delle informazioni genetiche.
Le cellule si dividono in due modi: con la mitosi e con la meiosi. La mitosi il processo che permette laccrescimento corporeo e la sostituzione delle cellule morte o danneggiate. Questo processo suddiviso in cinque stadi: profase, prometafase, metafase, anafase e telofase. Il risultato conclusivo dopo la citochinesi sono due cellule figlie, ognuna delle quali ha un nucleo contenente tutte le informazioni genetiche della cellula progenitrice (Figura 10.2). La meiosi si verifica solo nelle cellule primordiali destinate a maturare come gametociti aploidi. Le cellule diploidi destinate alla meiosi danno origine a gameti aploidi (cellule spermatiche e ovociti con solo 23 cromosomi). Per cui, le cellule somatiche moltiplicate con la mitosi, originano dalle cellule diploidi con un patrimonio cromosomico 2N. I gameti originati con la meiosi sono invece aploidi, con un patrimonio cromosomico 1N. durante la meiosi che si possono verificare delle variazioni genetiche. Un tipo di variazione origina dallassortimento indipendente dei cromosomi omologhi sia materni che paterni durante la prima divisione meiotica. Alla fine della meiosi, i gameti sono costituiti da un assortimento di cromosomi materni e paterni. Laltro tipo di diversificazione avviene nella prima profase meiotica quando si allineano le coppie di cromosomi omologhi. I cromosomi omologhi si ricombinano geneticamente scambiandosi del materiale genetico con un processo indicato come crossing-over (vedi di seguito). Di conseguenza, i cromosomi non sono solo rimescolati durante la meiosi, ma vengono fisicamente scambiate alcune porzioni di cromosomi per mescolare i geni presenti su ogni singolo cromosoma.
La genetica e lereditariet
Gli alleli Le forme alternative dei geni, ognuno dei quali pu occupare un singolo locus su uno dei cromosomi omologhi, sono definiti alleli. La terminologia dellISBT distingue tra gli alleli per
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Figura 10.2 - I due tipi di divisione cellulare sono la mitosi e la meiosi. gli antigeni dei gruppi sanguigni (polimorfismo genetico) e gli antigeni da essi codificati. Per esempio, gli antigeni principali del sistema ABO sono gli antigeni A, B e O, gli alleli che li codificano sono A1, B1 e O1. Nel sistema Kell, due alleli, K e k, determinano rispettivamente gli antigeni K e k. Gli individui che hanno alleli identici in un determinato locus di entrambi i cromosomi omologhi sono omozigoti per quellallele (per es., A1/A1 o K/K o k/k). Nella situazione eterozigote, gli alleli presenti in un determinato locus di ciascun cromosoma omologo sono diversi (A1/O o A1/B1 o K/k). Nella Tabella 10.1 sono elencati i genotipi e la collocazione cromosomica dei 29 sistemi antigenici eritrocitari. In alcuni sistemi antigenici eritrocitari gli individui che sono omozigoti per un determinato allele possono presentare sui propri eritrociti una maggior quantit di antigene rispetto ai soggetti eterozigoti per quellallele. Per esempio, i globuli rossi di individui con fenotipo Jk(a+b) hanno una doppia dose dellallele Jka e, di conseguenza, esprimono una quantit maggiore di antigene Jka sulla superficie eritrocitaria rispetto ai soggetti con fenotipo Jk(a+b+) (allele Jka espresso in singola dose). L a d i v e r s a q u a n t i t a n t i g e n i c a espressa sulla superficie eritrocitaria di un omozigote e di un eterozigote pu essere osservata sierologicamente e viene definita come effetto dose. Per esempio, alcuni sieri anti-Jka possono presentare le seguenti intensit di reazione: Fenotipo eritrocitario del donatore Jk(a+b) Jk(a+b+) 3+ 2+
Anticorpo Anti-Jka
Leffetto dose non rilevabile con tutti gli antigeni eritrocitari o con tutti gli anticorpi rivolti verso una determinata specificit. Gli anticorpi che tipicamente sono influenzati delleffetto dose comprendono quelli diretti contro antigeni dei sistemi Rh, MNS, Kidd e Duffy.
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Tabella 10.1 - Collocazione cromosomica dei geni dei sistemi antigenici eritrocitari umani* Sistema Numero ISBT Simbolo ISBT Designazione gene(i) (ISGN) ABO GYPA, GYPB, GYPE P1 RHD, RHCE LU KEL FUT3 DARC SLC14A1 SLC4A1 ACHE XG SC DO AQP1 LW C4A, C4B FUT1 XK GYPC DAF CR1 CD44 CD147 MER2 SEMA7A CGNT2 B3GALT3 AQP3 Posizione
ABO MNS P Rh Lutheran Kell Lewis Duffy Kidd Diego Yt Xg Scianna Dombrock Colton Landsteiner-Wiener Chido/Rodgers H Kx Gerbich Cromer Knops Indian OK RAPH JMH I Globoside GIL
001 002 003 004 005 006 007 008 009 010 011 012 013 014 015 016 017 018 019 020 021 022 023 024 025 026 027 028 029
ABO MNS P1 RH LU KEL LE FY JK DI YT XG SC DO CO LW CH/RG H XK GE CROM KN IN OK MER2 JMH I P GIL
9q34.2 4q28.2-q31.1 22q11.2-qter 1p36.13-p34.3 19q13.2 7q33 19p13.3 1q22-q23 18q11-q12 17q21-q22 7q22.1 Xp22.32 1p34 12p12.3 7p14 19p13.3 6p21.3 19q13.3 Xp21.1 2q14-q21 1q32 1q32 11p13 19p13.3 11p15.5 15q22.3-q23 6p24 3q25 9q13
(*Da Zelinski1; Garratty et al.2; e Denomme et al.3, adattamento autorizzato.)
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Gli alleli sono originati da mutazioni geniche a livello del DNA e possono risultare in fenotipi espressi in modo diverso. Alcune delle mutazioni osservate negli alleli dei gruppi sanguigni possono derivare da: mutazioni missense (una singola sostituzione nucleotidica che determina una sostituzione aminoacidica); mutazioni nonsense (una singola sostituzione nucleotidica che determina un codone di interruzione della sintesi proteica); mutazioni che alterano il processo di trascrizione; mutazioni che conducono a splicing alternativi; delezioni di un gene, esone o nucleotide/i; inserzioni di un esone o nucleotide/i; sito alternativo di inizio della trascrizione; traslocazione cromosomica; conversione genica o ricombinazione di un gene; crossing-over.
Le mutazioni possono determinare la creazione di un nuovo polimorfismo associato con il gene alterato. La Figura 10.3 illustra come le mutazioni nel gene che codifica gli antigeni del sistema gruppoematico MNS hanno determinato la formazione di numerosi antigeni a bassa frequenza nel sistema. Le frequenze alleliche (geniche) La frequenza di un allele (o la sua frequenza genica) indica la proporzione del suo contributo al pool totale degli alleli di un determinato locus allinterno di una popolazione definita in un determinato periodo. Questa frequenza pu essere calcolata dalle frequenze fenotipiche osservate nella popolazione. La somma delle frequenze degli alleli di un determinato locus uguale a 1, cio alla totalit della popolazione allelica.
Figura 10.3 - Come il crossing-over, la ricombinazione e la sostituzione nucleotidica (sost. nucl.) risultano nelle variazioni dei geni che producono le glicoforine A e B. I cambiamenti sono associati alla formazione di vari antigeni a bassa frequenza del sistema MNS (modificata da Reid4).
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La legge di Hardy-Weinberg La legge di Hardy-Weinberg basata sul principio che in una popolazione i genotipi sono distribuiti in proporzione alla frequenza allelica individuale e permane costante da una generazione allaltra se non intervengono processi di mutazione, migrazione, etc. Per esempio, il sistema Kidd un sistema biallelico (Jka e Jkb: lallele silente Jk estremamente raro) che possono essere utilizzati per illustrare il calcolo delle frequenze geniche. Questo calcolo utilizza lequazione di Hardy-Weinberg per un sistema a due alleli. Se p la frequenza dellallele Jka e q la frequenza dellallele Jkb, la frequenza delle tre combinazioni alleliche viene rappresentata dallequazione p2 + 2pq + q2 = 1 ove: p q p2 2pq q2 = frequenza dellallele Jka = frequenza dellallele Jkb = frequenza del genotipo Jka/Jka = frequenza del genotipo Jka/Jkb = frequenza del genotipo Jkb/Jkb
Sono state calcolate solo le frequenze alleliche, il numero dei soggetti Jk (b+) (sia omozigoti che eterozigoti) viene calcolato come: 2pq + q2 = frequenza dei Jk(b+) = 2 x (0,52 x 0,48)+(0,48)2 = 0,73
Utilizzando linformazione che il 77% degli individui della popolazione esprime lantigene Jk(a) sui globuli rossi, quindi: p2 + 2pq = frequenza delle persone che sono Jk(a+) e presentano lallele Jka = 0,77 q2 = 1 (p2 + 2pq)= frequenza delle persone che sono Jk(a)(omozigoti per lallele Jkb) 2 q = 1 0,77 = 0,23 = 0,23 = 0,48 (frequenza dellallele Jkb)
q q
Poich la somma dei due alleli deve essere uguale a 1, p+q p p p = = = = 1 1q 1 0,48 0,52 (frequenza allelica di Jka)
Se sono disponibili i sieri sia anti-Jka che antiJk , la frequenza degli alleli pu essere stabilita con maggiore semplicit mediante il conteggio diretto. Come viene mostrato nella Tabella 10.2, un campione random di 100 soggetti testati per gli antigeni Jka e Jka possiede un totale di 200 alleli del locus Jk (ogni persona eredita due alleli, uno da ogni genitore). Vi sono due alleli Jka ereditati da ognuno dei 28 soggetti con fenotipo Jk(a+b), per un totale di 56 alleli. Ci sono inoltre 49 alleli Jka negli individui che sono Jk(a+b+), per un totale di 105 alleli cio una frequenza genica di Jka pari a 0,52 (105 200). La frequenza genica di Jkb 95 200 = 0,48. La legge di Hardy-Weinberg generalmente utilizzata per il calcolo delle frequenze alleliche e genotipiche in una popolazione quando conosciuta la frequenza di un carattere (per esempio un fenotipo antigenico). Tuttavia, tale legge basata su alcuni presupposti: nessuna mutazione; emigrazione o immigrazione nella popolazione; nessuna pressione selettiva vantaggiosa o svantaggiosa per un particolare carattere; e una popolazione abbastanza ampia in modo che singoli cambiamenti non possano alterare una frequenza allelica. Se tutte queste condizioni sono soddisfatte, il pool genetico di quella popolazione in equilibrio e la frequenza allelica non cambia da una generazione allaltra. Se non ci sono queste condizioni, possono avvenire variazioni delle frequenze geniche in poche generazioni, spiegando molte delle differenze osservate nelle frequenze alleliche tra le diverse popolazioni.
b
La segregazione Il termine segregazione indica il concetto che due alleli di uno stesso gene non possono essere
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Tabella 10.2 - Frequenza genica nel sistema gruppale Kidd calcolata utilizzando il metodo del conteggio diretto* Fenotipo Jk(a+b) Jk(a+b+) Jk(ab+) Totale Frequenza genica N degli individui 28 49 23 100 N dei geni Kidd 56 98 46 200 Frequenza genica(%) Jka Jkb 56 49 0 105 0,525 0 49 46 95 0,475
*Presumendo lassenza dellallele Jk silente.
presenti nello stesso gamete, ma segregano e si trasmettono in gameti diversi. Nella genetica dei gruppi sanguigni, questo pu essere illustrato dallereditariet degli alleli ABO (Figura 10.4). In questo esempio, i membri della generazione parentale (P1) sono omozigoti per un allele A e un allele O. Tutti i membri della prima generazione filiale (F 1 ) saranno eterozigoti ( A/O ), ma
presenteranno lantigene del gruppo sanguigno A (O un allele silente). Se un individuo della generazione F1 si incrocia con un soggetto con genotipo A/O , la sua progenie, indicata come seconda generazione filiale (F2), presenter gruppi A (sia eterozigoti che omozigoti) o gruppi O. Se un soggetto della generazione F1 si incrocia
Figura 10.4 - La legge di Mendel della segregazione indipendente dimostrata con lereditariet dei geni ABO .
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con una persona di gruppo B (B/O) la sua prole potr essere di gruppo A, B, AB o O. Lassortimento indipendente La legge di Mendel relativa allassortimento casuale stabilisce che i geni che determinano caratteri diversi sono ereditati indipendentemente gli uni dagli altri. Per esempio, se un genitore di gruppo A (omozigote per A) e K+k+ e laltro genitore di gruppo B (omozigote per B) e Kk+ (omozigote per k), tutti i figli della prima generazione (F1)
saranno di gruppo AB; met saranno K+k+ e met Kk+ (Figura 10.5). Una seconda generazione filiale potr presentare ognuno dei seguenti fenotipi: gruppo A, K+k+; gruppo AB, K+k+; gruppo B, K+k+; gruppo A, Kk+; gruppo AB, Kk+; gruppo B, Kk+, con una proporzione 1:2:1:1:2:1. Lassortimento indipendente si applica se i geni sono localizzati su cromosomi diversi o in loci distanti dello stesso cromosoma. Uneccezione a questa legge che i geni che sono strettamente vicini sullo stesso cromosoma,
Figura 10.5 - La legge di Mendel sullassortimento casuale dimostrata con lereditariet dei geni ABO e Kk .
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non segregano indipendentemente ma restano insieme una generazione dopo laltra. Questa situazione si chiama associazione (o linkage). La associazione La associazione genetica (o legame genetico, universalmente definita dai genetisti con il termine inglese linkage ) indica la tendenza di alleli strettamente vicini sullo stesso cromosoma ad essere trasmessi insieme. Durante la mitosi, ogni coppia di cromosomi omologhi sottoposta ad una serie di ricombinazioni. Il conseguente scambio reciproco di segmenti tra cromatidi si chiama crossing-over (Figura 10.6). I geni strettamente vicini su un cromosoma tendono ad essere scambiati in blocco durante queste ricombinazioni e i loro alleli, di conseguenza, non segregano in modo indipendente. Qualche volta il linkage molto stretto cos che la ricombinazione avviene molto raramente.
La forza della concatenazione pu essere utilizzata come unit di misura per stimare la distanza tra i diversi loci. Questo tipo di analisi pu aiutare nellidentificazione, nella mappatura e nella diagnostica genetica relativa ad alcune malattie ereditarie. La dimostrazione della concatenazione tra i geni che controllano la secrezione degli antigeni idrosolubili ABH (Se) e lespressione degli antigeni del sistema Lutheran (Lua, Lub) costituisce il primo esempio di concatenazione autosomica rilevata nelluomo. Lanalisi di queste correlazioni ha inoltre fornito le prime evidenze delle ricombinazioni genetiche umane determinate dal crossing-over e ha aiutato nella dimostrazione che il crossing-over avviene con maggiore frequenza nelle femmine che nei maschi. Il linkage disequilibrium Quando due loci sono strettamente associati gli alleli di questi loci tendono ad essere ereditati insieme e vengono indicati col termine di aplotipo.
Figura 10.6 - I loci strettamente concatenati sono raramente interessati dal crossing-over, cos gli alleli di questi loci vengono ereditati insieme (N ed S, M ed s nellesempio presentato). I loci dello stesso cromosoma non strettamente collegati (il locus Ss e il locus Zz) possono presentare il crossing-over. Il crossing-over un tipo di ricombinazione. Avviene tra i cromatidi di cromosomi omologhi durante la meiosi, determinando la segregazione di alleli che sono posti sullo stesso cromosoma.
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Ancora, lo stretto linkage tra i loci che controllano lespressione degli antigeni M ed N e di quelli S ed s sono un esempio di linkage disequilibrium. Le frequenze approssimative di ognuno di questi quattro alleli sono: M = 0,53 S = 0,33 N = 0,47 s = 0,67 Se gli alleli che codificano gli antigeni M, N, S ed s segregano indipendentemente le frequenze attese per ogni aplotipo devono essere il prodotto delle frequenze individuali degli alleli. Tuttavia le frequenze osservate non sono quelle attese: Frequenze attese MS = Ms = NS = Ns = Totale 0,53 x 0,33 0,53 x 0,67 0,47 x 0,33 0,47 x 0,67 = = = = Frequenze osservate 0,17 0,36 0,16 0,31 1,00 0,24 0,28 0,08 0,40 1,00
Quando il linkage in equilibrio, gli alleli di due loci si associano con frequenze che riflettono le loro frequenze individuali. Per esempio, se gli alleli di una popolazione hanno le seguenti frequenze: Y y Totale 0,53 0,47 1,00 Z z 0,30 0,70 1,00
le frequenze delle combinazioni possono essere il prodotto delle frequenze di ogni allele: YZ Yz yZ yz Totale 0,53 x 0,30 0,53 x 0,70 0,47 x 0,30 0,47 x 0,70 = = = = 0,16 0,37 0,14 0,33 1,00
In questo caso, gli alleli sono in linkage equilibrato perch vengono ereditati indipendentemente.
Questo un esempio linkage disequilibrium: la tendenza di specifiche combinazioni di alleli, appartenenti a due o pi loci associati, ad essere ereditati insieme con una frequenza maggiore di quanto atteso dalle probabilit di combinazione casuale indicate dalle frequenze dei singoli alleli. Un altro esempio comunemente citato di linkage disequilibrium rilevabile nel sistema HLA (vedi Capitolo 17). Lassociazione di HLA-A1 con HLA-B8 avviene in alcune popolazioni con una frequenza circa cinque volte superiore di quanto atteso dal calcolo delle frequenze dei singoli alleli e questo un esempio di disequilibrio positivo da concatenazione. Il linkage disequilibrium pu essere, infatti, positivo o negativo e pu indicare un vantaggio selettivo per un aplotipo rispetto ad un altro. Attraverso molte generazioni, gli alleli dei loci strettamente associati allo stesso livello possono raggiungere lequilibrio e associarsi in accordo con le loro frequenze individuali nella popolazione.
I tipi di ereditariet
I caratteri dominanti e recessivi I caratteri sono lespressione visibile dei geni. Un carattere che osservabile quando un determinato allele presente viene definito dominante; quando due diversi alleli presenti sui cromosomi omologhi esprimono entrambi un carattere vengono indicati come codominanti. Un carattere recessivo osservabile solo quando il suo allele non accoppiato con un allele dominante sul cromosoma omologo (sono presenti due alleli recessivi). Descrivere i caratteri come dominanti o recessivi dipende dal metodo utilizzato per rilevare il prodotto di un gene. I caratteri osservabili sono indicati col termine fenotipi. Perci la tipizzazione antigenica eritrocitaria, utilizzando antisieri, identifica un fenotipo. In alcuni casi, i genotipi possono essere dedotti dai fenotipi, specialmente se vengono condotti studi familiari, ma, di solito, i genotipi non sono
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direttamente determinati con la tipizzazione antigenica dei globuli rossi. Caratteri dominanti autosomici Un carattere autosomico dominante presenta un tipico modello di ereditariet. Il carattere si evidenzia ogni volta che un individuo possiede il corrispondente allele. La Figura 10.7(A) presenta un albero genealogico con il modello ereditario di un carattere autosomico dominante. Tipicamente,
ogni persona con il carattere ha almeno un genitore con tale carattere, continuando a risalire nelle generazioni. Caratteri autosomici recessivi I soggetti che presentano un carattere autosomico recessivo sono omozigoti per lallele che lo codifica. I loro genitori possono presentare o meno il carattere. Tuttavia, i genitori che non esprimono il
Figura 10.7 - Quattro alberi genealogici che mostrano i diversi modelli di ereditariet.
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carattere debbono essere portatori, per esempio, eterozigoti per un allele recessivo che non esprime la sua presenza nel fenotipo. Se la frequenza della variante allelica bassa, il carattere recessivo sar raro e generalmente apparir solo in soggetti appartenenti ad ununica generazione, ma non sar osservabile nelle generazioni precedenti o successive se non si verificano incroci tra i consanguinei. I consanguinei hanno una maggior probabilit di possedere uno stesso allele raro rispetto alle persone non consanguinee di una popolazione random. Quando i figli sono omozigoti per un allele raro (frequenza: inferiore a 1:10.000) e presentano il carattere, in molti casi i genitori sono consanguinei [Figura 10.7(B)]. I caratteri recessivi possono restare inespressi per molte generazioni; la comparsa di un carattere recessivo raro non implica quindi necessariamente la consanguineit, sebbene letnia familiare e lorigine geografica possano essere informative. Una maggior frequenza di un allele recessivo indica una minore probabilit di consanguineit. I caratteri ereditati in modo autosomico, sia dominante che recessivo, ricorrono con uguale frequenza nei maschi e nelle femmine. Caratteri dominanti o co-dominanti legati al sesso Un maschio riceve il suo singolo cromosoma X dalla madre. La caratteristica predominante nellereditariet legata al sesso, sia dei caratteri dominanti che recessivi, costituita dalla mancanza della trasmissione del carattere da maschio a maschio (dal padre al figlio). Dato che un maschio trasmette il suo cromosoma X a tutte le sue figlie, tutte le figlie di un uomo che esprime un carattere dominante, legato al cromosoma X, possiedono lallele dominante e presentano il carattere. Se una donna esprime un carattere dominante legato al sesso, ma eterozigote, ogni figlio maschio o femmina ha il 50% di probabilit di ereditare questo allele e quindi di esprimere il carattere [Figura 10.7(C)]. Se la madre possiede quel determinato allele dominante su entrambi i
cromosomi X, tutti i suoi figli esprimeranno il carattere. Un carattere dominante legato al sesso tende ad apparire in ogni generazione familiare, ma senza la trasmissione da maschio a maschio. Un esempio di carattere dominante legato al sesso nellambito della genetica dei gruppi sanguigni il sistema Xg. I caratteri recessivi legati al sesso Un esempio classico di ereditariet recessiva legata al sesso fornito dallemofilia A [Figura 10.7(D)]. I maschi ereditano il carattere dalla madre portatrice o, molto raramente, da una madre omozigote per lallele e che, di conseguenza, esprime il carattere. Nellincrocio tra un maschio normale e una femmina portatrice, met dei figli maschi sono emofilici e met delle figlie sono portatrici. Tra i figli di un maschio emofilico e una femmina che non possiede lallele che determina lemofilia A, tutti i figli sono normali e tutte le figlie sono portatrici. Se un gene recessivo legato al sesso raro, il carattere si presenter quasi esclusivamente nei maschi. Se lallele recessivo legato al cromosoma X ricorre con maggiore frequenza nella popolazione, potranno essere osservate femmine che lo esprimono, perch aumenta la probabilit che un maschio affetto incroci una femmina portatrice generando figlie che, in met dei casi, saranno omozigoti ed esprimeranno lallele anormale. I caratteri co-dominanti dei gruppi sanguigni Gli antigeni dei gruppi sanguigni, di regola, sono espressi come caratteri co-dominanti: gli eterozigoti esprimono il prodotto di entrambi gli alleli. Se gli eritrociti di un individuo sono tipizzati come K+ e k+, si pu dedurre un genotipo K/k. La Figura 10.8 presenta il modello ereditario dei due alleli attivi del sistema eritrocitario Kidd (Jka e Jkb) e lespressione fenotipica co-dominante dei due rispettivi antigeni Jka e Jkb. Nel sistema ABO la situazione pi complicata. I geni del sistema ABO non codificano per delle proteine della membrana, ma controllano la produzione di enzimi, indicati come glicosiltransferasi. Questi enzimi aggiungono degli zuccheri ad una
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sostanza di base, presente sulla membrana eritrocitaria, determinando una specifica espressione antigenica. In un eterozigote A1/A2, il fenotipo A1; la presenza dellallele A2 non pu essere dedotta. Bench lallele A1 risulti come dominante rispetto allallele A2 utilizzando la semplice tipizzazione eritrocitaria, le tecniche che identificano le specifiche transferasi evidenziano che in un eterozigote A1/A2 sono presenti i prodotti dei due alleli: cio, entrambe le transferasi A1 e A2. Analogamente in un soggetto A 2 /0 , A 2 dominante nei confronti di O. Lallele O codifica per una specifica proteina, ma questa proteina (transferasi) non funzionante. La presenza dei geni ABO pu essere dimostrata con tecniche molecolari (vedi Capitolo 13). La localizzazione cromosomica I loci dei geni dei principali gruppi sanguigni sono stati localizzati su una o laltra delle 22 coppie di autosomi, come viene indicato nella Tabella 10.1. I loci dei geni Xg e XK sono gli unici localizzati
sul cromosoma X. Linterazione tra gli alleli o il prodotto di altri geni pu modificare lespressione di un carattere. I termini soppressore e modificatore vengono utilizzati per descrivere dei geni che alterano lespressione di altri geni; tuttavia il meccanismo di azione di queste postulate interazioni geniche non sempre completamente chiaro. Alcune osservazioni nella sierologia eritrocitaria sono state spiegate grazie allinterazione genica: lindebolimento dellespressione antigenica D quando lallele C presente in cis (sullo stesso cromosoma) o in trans (sul cromosoma omologo)6 e la soppressione dellespressione antigenica Lutheran da parte del gene modificatore, In (Lu)7. Quando i prodotti di due geni diversi sono importanti nello sviluppo sequenziale di un prodotto biochimico finale, linterazione genica viene definita epistasi. La mancata espressione degli antigeni A o B se la sostanza H non stata precedentemente prodotta (assenza del gene H) un esempio di epistasi. stato realizzato un database delle mutazioni nei locus dei geni che
Figura 10.8 - Ereditariet ed espressione co-dominante degli antigeni del gruppo sanguigno Kidd.
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codificano antigeni comuni o rari dei gruppi sanguigni ( Blood Group Antigen Mutation Database) ed disponibile in Internet (vedere http:// www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/index.htm).
c K Jk(a)
Frequenza fenotipica (%) 20 91 23
Genetica di popolazione
Qualche nozione di genetica di popolazione essenziale per le indagini parentali ed utile nelle situazioni cliniche che richiedano la previsione della probabilit di poter reperire del sangue compatibile per un paziente il cui siero contenga una miscele di anticorpi. I calcoli necessari utilizzano le frequenze fenotipiche pubblicate. Frequenze fenotipiche Le frequenze fenotipiche dei gruppi sanguigni sono ottenute dalla tipizzazione di molte persone, scelte in modo casuale, ma appartenenti alla stessa razza o gruppo etnico, rilevando la proporzione delle reazioni positive e negative con un anticorpo specifico per un gruppo sanguigno. In un sistema antigenico eritrocitario, la somma delle frequenze fenotipiche deve essere uguale a 100. Per esempio, in una popolazione caucasica, il 77% degli individui selezionati in modo casuale Jk(a+). La frequenza dei soggetti Jk(a) sar pari al 23%. Se necessario del sangue per un paziente con un anticorpo anti-Jk a , il 23% o approssimativamente una su quattro delle unit di sangue ABO compatibili, potr essere compatibile per il paziente. I calcoli per i fenotipi combinati Se un paziente presenta una miscela di diversi anticorpi, utile stimare il numero di unit che dovranno essere esaminate per reperire delle unit di sangue compatibili che siano negative per tutti gli antigeni che costituiscono il bersaglio degli anticorpi del paziente. Per esempio, se un paziente ha gli anticorpi anti-c, anti-K e anti-Jka, quante unit di sangue ABO compatibili si dovranno testare per trovare quattro unit con fenotipo compatibile?
Per calcolare la frequenza fenotipica combinata, si devono moltiplicare le frequenze fenotipiche individuali perch ogni fenotipo indipendente dagli altri. Cos la percentuale delle persone che sono c 20%. Del 20% delle persone che sono c, 91% sono K; quindi 18% sono c e K (0,20 x 0,91= 0,18). Di questo 18% di soggetti cK, 23% saranno Jk(a); quindi, solo il 4% degli individui saranno cKJk(a) (0,2 x 0,91 x 0,23 = 0,04). Ne consegue che, su 100 unit di sangue esaminate, si dovrebbero trovare 4 unit compatibili. Calcoli come questo determinano la decisione se gestire il problema con le risorse locali o chiedere il supporto di un laboratorio di riferimento, quando diventa difficoltoso trovare del sangue compatibile per un paziente alloimmunizzato. Le indagini parentali Gli antigeni dei gruppi sanguigni, molti dei quali sono espressi come caratteri co-dominanti con una ereditariet di tipo mendeliano semplice, sono utili nelle indagini parentali. In caso di maternit, e accertato che i risultari dei test siano accurati, una paternit pu essere esclusa nei seguenti due modi: 1. lesclusione diretta della paternit viene accertata quando un marcatore genetico presente nel figlio ma assente nella madre e nel presunto padre. Esempio: Fenotipi eritrocitari Madre Presunto padre O O
Figlio B
Il bambino ha ereditato un gene B, che non stato trasmesso dalla madre o dal presunto padre, dopo essersi accertati che n la madre n il presunto padre presentino il raro fenotipo Oh. Basandosi sul fenotipo della madre e del figlio, il gene B deve essere stato ereditato dal padre biologico e viene indicato come gene paterno obbligatorio;
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2. lesclusione di paternit viene detta indiretta quando il figlio non presenta un marcatore genetico che il presunto padre (dato il suo fenotipo) deve trasmettere necessariamente ai suoi figli. Esempio: Fenotipi eritrocitari Madre Presunto padre Jk(a+b) Jk(ab+)
Figlio Jk(a+b)
In questo caso il presunto padre presumibilmente omozigote per Jk b e deve necessariamente aver tramesso il gene Jkb al figlio. Lesclusione diretta pi convincente dellesclusione indiretta quando si deve accertare o meno un rapporto di parentela. Unapparente esclusione indiretta di paternit pu essere qualche volta determinata dalla presenza di un allele silente. Nellesempio precedente, il presunto padre potrebbe avere un allele silente (Jk) che stato trasmesso al bambino. Il genotipo del bambino potrebbe essere Jka/Jk invece del pi comune genotipo Jka/Jka. Linterpretazione dei dati fenotipici deve considerare tutti i fattori biologici o analitici conosciuti che siano in grado di influenzare i risultati. Quando il presunto padre non pu essere escluso, possibile calcolare la probabilit di paternit. La probabilit che il presunto padre abbia trasmesso i geni paterni obbligatori viene confrontata con la probabilit di ogni altro soggetto, selezionato in modo casuale della stessa etnia/razza, di aver trasmesso i geni. Il risultato viene espresso come rapporto di probabilit (indice di paternit) o come percentuale (probabilit a posteriori di paternit, stabilite alcune probabilit a priori). Le metodologie di indagine sulla discendenza comprendono lo studio di diversi sistemi genetici, oltre ai gruppi sanguigni [per esempio, HLA e metodi short tandem repeat (STR)]. Molti laboratori dedicati alle indagini sulla paternit utilizzano il metodo STR per lanalisi del DNA (vedi Capitolo 9) come mezzo di indagine nei casi di paternit contestata. LAABB ha sviluppato gli standard operativi per i laboratori che eseguono le indagini sulla consanguineit8.
Il chimerismo Si definisce chimera un soggetto le cui cellule originano da pi di una linea zigotica. Per quanto raro, questo pu accadere quando si verificano delle anastomosi vascolari tra embrioni gemelli o quando due zigoti si fondono per formare un singolo individuo. Questa situazione, per quanto non ereditaria, determina, in uno stesso individuo, una doppia (multipla) popolazione cellulare con fenotipi diversi. La tipizzazione degli antigeni eritrocitari di questi rari soggetti pu evidenziare agglutinazioni a campo misto con differenti popolazioni cellulari che presentano il vero genotipo del soggetto e quello delle cellule impiantate. Le chimere presentano inoltre la tolleranza immunologica: un soggetto geneticamente di gruppo O con un impianto di cellule di gruppo A non produce gli anticorpi anti-A. Con maggiore frequenza, le chimere non sono naturali e originano dallimpianto di cellule in attiva riproduzione, come per esempio con il trapianto di midollo emopoietico (vedi Capitolo 25).
La nomenclatura dei gruppi sanguigni

La terminologia dei gruppi sanguigni esprime molte incongruenze perch gli immunoematologi non hanno seguito le convenzioni stabilite dalla classica genetica mendeliana. Di seguito sono elencati alcuni esempi della confusione generata da molti decenni di pubblicazioni scientifiche non coordinate: 1. un allele che codifica per un carattere dominante di solito espresso con una lettera maiuscola; uno che determina un carattere recessivo viene indicato con entrambe le lettere minuscole. I geni co-dominanti A e B del sistema ABO sono contrassegnati con una lettera maiuscola. Il gene O pure indicato con una lettera maiuscola ma non esprime un carattere dominante. Quindi, senza ulteriori precedenti conoscenze, impossibile riconoscere che queste notazioni rappresentano i prodotti allelici in un sistema gruppoematico eritrocitario; 2. alcuni caratteri allelici co-dominanti sono stati contrassegnati con una lettera maiuscola per
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un allele e una lettera minuscola per lallele co-dominante; per esempio, K e k del sistema Kell o C e c del sistema Rh; 3. alcuni caratteri co-dominanti hanno unidentica simbologia di base ma differiscono per il simbolo in apice, come Fy a e Fy b (sistema Duffy) e Lu a e Lu b (sistema Lutheran); 4. in alcune coppie alleliche, lantigene con minore frequenza viene indicato con lapice a (Wra ha una minore frequenza di Wrb). In altre coppie alleliche, lapice a indica lantigene con maggiore frequenza (Coa presenta una maggiore frequenza di Cob); 5. alcuni autori hanno indicato la mancanza di una specificit rilevabile sierologicamente con un simbolo base privo di apice, altri utilizzano per lo stesso fine una lettera minuscola per il simbolo base. Nel sistema Lutheran, il gene amorfo viene indicato come Lu, non lu, ma il gene amorfo nel sistema Lewis viene indicato come le; 6. la terminologia numerica introdotta per alcuni sistemi eritrocitari, ha determinato una mescolanza di lettere e numeri per la designazione degli antigeni, per esempio K, Kpa e K11. Luso familiare di queste terminologie, anche in alcuni articoli e testi pubblicati, ha consolidato il suo uso improprio, ma i computer e le stampanti meno recenti non accettano facilmente certe terminologie (per esempio con apice, pedice o caratteri inconsueti). Negli ultimi anni, sono stati fatti tentativi concertati al fine di stabilire criteri razionali ed uniformi per designare i fenotipi, i genotipi e le informazioni sui loci dei sistemi eritrocitari. Issitt e Crokston9 e Garratty et al.2 hanno presentato le linee guida per la nomenclatura e la terminologia dei gruppi sanguigni. Nel gruppo di lavoro sulla terminologia degli antigeni eritrocitari di superficie l International Society of Blood Transfusion (ISBT) ha fornito un sistema standardizzato per la classificazione degli antigeni eritrocitari (vedi Appendice 6). Analoghe commissioni internazionali hanno stabilito i criteri per la classificazione delle
emoglobine, degli allotipi immunoglobulinici, degli antigeni di istocompatibilit, dei clusters di differenziazione, delle sequenze STR e di altri sistemi relativi a proteine sieriche e a enzimi eritrocitari. Sebbene sia opportuno che, per evitare ulteriori confusioni, molte delle vecchie terminologie siano conservate, esistono ora delle comuni convenzioni per un uso corretto. La terminologia dellISBT per gli antigeni eritrocitari venne ideata come una classificazione numerica idonea per la computerizzazione. Un titolo a sei cifre indica ogni specificit dei gruppi sanguigni. Le prime tre cifre indicano il sistema eritrocitario, mentre gli ultimi tre numeri identificano le singole specificit. Questa terminologia numerica concepita principalmente per i database dei computer e non necessariamente finalizzata a sostituire quella di uso comune. Per la classificazione ISBT, ogni sistema antigenico eritrocitario deve essere geneticamente differenziato. Lassegnazione degli antigeni a specifici sistemi eritrocitari dipende dai rilievi genetici, sierologici e/o biochimici. La mappatura del gene ha assolto il compito dellassegnazione definitiva e ha permesso alcune assegnazioni precedentemente non dimostrate dagli studi familiari tradizionali (per esempio lespansione del sistema Diego, che ha incluso numerosi antigeni a bassa frequenza). Tuttavia, alcuni antigeni, non sono ancora stati dimostrati come appartenenti a sistemi riconosciuti. Le raccolte (Collection), indicate come serie 200, sono gruppi di antigeni apparentemente correlati per i quali mancano ancora informazioni genetiche definitive. Altri antigeni isolati ad alta frequenza (serie 901) o a bassa frequenza (serie 700) sono tuttora solo elencati fino a quando non saranno disponibili delle adeguate informazioni genetiche. Negli ultimi anni, il numero degli antigeni in queste tre serie si drasticamente ridotto grazie alle nuove assegnazioni consentite dalle ulteriori informazioni genetiche e biochimiche acquisite. La terminologia corretta Le seguenti sono delle convenzioni accettate ed idonee per indicare i fenotipi e i genotipi eritrocitari2:
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1. i geni che codificano lespressione degli antigeni eritrocitari sono scritti in corsivo (o sono sottolineati se il corsivo non disponibile). Se il nome dellantigene prevede un pedice ( A 1 ), generalmente il gene codificante viene riportato allapice (A1); 2. i nomi degli antigeni indicati con un apice o un numero (per esempio: Fya, Fy:1) sono scritti con caratteri normali. Le designazioni numeriche sono scritte sulla stessa linea delle lettere. Le lettere soprascritte sono in carattere minuscolo (qualche eccezione ammessa per ragioni duso storico: hrS, hrB); 3. quando un fenotipo antigenico espresso utilizzando una sola lettera di designazione, i risultati sono abitualmente scritti come + o , in una serie sulla stessa linea della lettera/e che indica lantigene: K+k; 4. per indicare dei fenotipi con antigeni che hanno delle lettere in apice, queste lettere sono scritte in parentesi sulla stessa linea del simbolo che definisce lantigene: Fy(a+) e Fy(a); 5. per gli antigeni designati con un numero, il simbolo che identifica il sistema scritto con lettere maiuscole seguite da due punti in colonna, seguiti dal numero che indica lantigene esaminato. Nessun ulteriore segno deve essere messo se lantigene presente (per esempio: K:1), ma un segno negativo viene posto dopo i due punti se la tipizzazione dellantigene negativa (per esempio: K:1). Se sono state eseguite numerose tipizzazioni per diversi antigeni di uno stesso sistema, il fenotipo viene indicato con la lettera/e maiuscola/e del locus del sistema gruppoematico eritrocitario seguita da due punti in colonna, a loro volta seguiti dai numeri indicativi degli antigeni esaminati separati da virgole, per esempio: K:1,2,3,4. Solo gli antigeni esaminati devono essere elencati; se un anticorpo che identifica uno specifico antigene non stato utilizzato, il numero dellantigene non deve essere scritto, per esempio: K:1,3,4. Sebbene la terminologia numerica sia stata
ideata per vari sistemi ed antigeni, non deve essere necessariamente considerata come sostitutiva della terminologia convenzionale. Luso dei nomi convenzionali degli antigeni anchesso accettabile. Di alcuni sistemi, particolarmente del sistema Rh, esistono numerose terminologie e non tutti gli antigeni di uno stesso sistema hanno una designazione in ogni terminologia.
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Appendice 10.1 - Glossario dei termini nella genetica dei gruppi sanguigni
Allelici Cellule somatiche Centromero Co-dominante Cromatidio Coppia di geni collocati nello stesso posto (locus), ciascuno su uno dei due cromosomi della coppia (omologhi). Cellule o tessuti non riproduttivi. Regione ristretta di un cromosoma che connette i cromatidi durante la divisione cellulare. Gene che esprime un carattere indipendentemente dal fatto che vi sia o meno lallele alternativo, nello stesso locus sul cromosoma omologo parentale. Uno dei due filamenti di DNA uniti dal centromero, che costituiscono i due potenziali cromosomi formati dalla replicazione del DNA di ogni singolo cromosoma prima della mitosi o della meiosi. Il materiale genetico fortemente colorato presente nel nucleo di una cellula che non si sta dividendo. Un corpuscolo lineare filamentoso formato dal DNA presente nel nucleo delle cellule. Processo di rottura e riunione dei filamenti di DNA a doppia elica, sia materni che paterni, che esita nellinterscambio di segmenti corrispondenti tra i cromatidi dei cromosomi omologhi. Gene che esprime un carattere che non consente lespressione di un carattere alternativo codificato da un suo allele presente allo stesso locus sul cromosoma omologo. Unit di base dellereditariet, costituito da DNA. Ogni gene occupa uno specifico sito su un cromosoma. Gene contenuto nel cromosoma X o in quello Y. Sito occupato da un gene sul cromosoma. Linattivazione di uno dei due cromosomi X femminili durante lembriogenesi. Questo cromosoma forma il corpo di Barr nel nucleo cellulare. Processo di una doppia divisione successiva che produce cellule uovo, o spermatozoi, che contengono la met dei cromosomi presenti nelle cellule somatiche. Divisione delle cellule somatiche che genera cellule figlie che contengono lo stesso numero di cromosomi delle cellule progenitrici. Gene che in presenza del suo allele dominante non esprime il carattere che codifica. Un carattere recessivo rilevabile solo se entrambi gli alleli sono recessivi. Gene posto sul cromosoma X per il quale non conosciuto un gene corrispondente sul cromosoma Y.
Cromatina Cromosoma Crossing-over
Dominante
Gene Legato al sesso Locus Lionizzazione Meiosi
Mitosi Recessivo X-linked
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Capitolo 11: Immunologia
Capitolo 11
Immunologia
La risposta immune un sistema naturale ed adattativo altamente evoluto che fondamentale per la sopravvivenza. Il sistema possiede la sofisticata abilit di differenziare tra il proprio (self) e il non proprio (non self) e, con una banca della memoria, permette allorganismo di rispondere rapidamente agli organismi estranei ricorrenti con cui viene in contatto. Una salutare risposta immune pu riconoscere le sostanze o i patogeni che invadono il corpo e pu iniziare una serie di eventi per eliminare questi patogeni con una morbilit minima o comunque ridotta per lospite. Le numerose componenti del sistema immunitario lavorano in un delicato equilibrio per assicurare lo stato di salute. Questo pu comprendere la distruzione di cellule anormali o maligne, la rimozione di virus o batteri nocivi e/o una risposta infiammatoria utile per accelerare la guarigione. Se il sistema immunitario diventa iper reattivo, il corpo pu attaccare i suoi stessi tessuti od organi (malattia autoimmune) o sviluppare allergie. Se ipo reattivo, lospite pu diventare suscettibile ad unampia variet di agenti infettivi o alla proliferazione di cellule maligne. Lobiettivo finale dellattivit immunitaria di mantenere questo delicato equilibrio.
Le risposte innate sono indiscriminate: il medesimo meccanismo pu essere impiegato contro microrganismi invasori o contro stimoli nocivi. Diversamente, la risposta acquisita riconosce le specifiche caratteristiche dello stimolo nocivo e provvede ad adeguare la risposta basandosi sulle precedenti esperienze (Figura 11.1). La risposta acquisita lultimo sviluppo evoluzionistico ed presente solo nei vertebrati. Limmunit innata, daltra parte, utilizza propriet e processi che sono universali come le barriere epiteliali, gli enzimi proteolitici, la fagocitosi cellulare e le reazioni infiammatorie. importante rilevare che nella risposta immune limmunit innata e quella acquisita sono tra loro complementari e non si escludono a vicenda. Indipendentemente dalla classificazione, la risposta immune rappresenta una complessa interazione tra le cellule, i tessuti, gli organi e i fattori solubili. LAppendice 11.1 descrive alcuni termini immunologici di uso comune. La superfamiglia delle immunoglobuline Le molecole che appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline (IgSF) giocano un ruolo critico nel riconoscimento degli antigeni estranei. Il riconoscimento degli antigeni viene realizzato attraverso recettori che possono essere sia in forma solubile sia sulla superficie delle cellule linfoidi. La Figura 11.2 illustra la struttura similare di alcuni di questi recettori immunologici. La struttura generale di questi recettori fatta in modo analogo ed stato ipotizzato che
La risposta immune
La risposta immune pu essere classificata in due categorie: la risposta innata e la risposta acquisita.
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Fagocitosi Attivazione del complemento (via alternativa) Innata Barriere epiteliali Batteri Reazioni infiammatorie Recettori a singolo segmento (recettori tool-like) Risposta immune
Vaccini Alloimmunizzazione Immunoglobuline eritrocitaria/piastrinica Cellule T citotossiche Test tubercolinico Acquisita Ipersensibilit di tipo ritardato Rigetto di trapianto
Figura 11.1 - Esempi degli elementi utilizzati nellimmunit innata ed in quella acquisita ed esempi dei due tipi di immunit. essa origini da un gene ancestrale comune. La struttura basilare analoga a quella dei domini delle molecole immunoglobuliniche; di conseguenza, questi recettori sono stati raggruppati in una singola superfamiglia di molecole. Esempi di questi recettori comprendono: le immunoglobuline, i recettori delle cellule T (TCR, T-cell receptor ), le molecole del complesso maggiore di istocompatibilit di Classe I e II, i recettori dei fattori di crescita e le citochine. Ci sono diverse centinaia di membri della IgSF (per esempio i recettori delle immunoglobuline, le integrine, etc.)2. Il complesso maggiore di istocompatibilit Il complesso maggiore di istocompatibilit (MHC, Major Histocompatibility Complex ) comprende un ampio gruppo di geni. Nelluomo, lMHC comprende i geni del sistema HLA e i geni che codificano altre proteine come il fattore di necrosi tumorale (TNF, tumor necrosis factor), alcune componenti del complemento e alcune proteine dello heat shock. I geni che codificano le molecole MHC sono posti sul braccio corto del cromosoma 6. Vi sono tre classi di queste molecole. Molecole MHC di Classe I Le molecole MHC di Classe I sono rilevabili in quasi tutte le cellule dellorganismo. Le molecole sono definite da tre geni principali di Classe I indicati come HLA-A, -B e -C. Pertanto, ogni individuo esprime sei differenti molecole HLA di Classe I: due HLA-A, due HLA-B e due HLA-C. Ogni locus ha molti alleli: oltre 50 sono stati rilevati per lHLA-A, oltre 75 per lHLA-B e oltre 30 per lHLA-C. La struttura delle molecole HLA di Classe I illustrata nella Figura 11.2. Ogni molecola costituita da una catena pesante (45 kDa) e da una piccola catena peptidica (12 kDa) detta 2-microglobulina. La catena pesante ha unestremit citoplasmatica, una regione transmembrana e tre regioni extracellulari simili a quelle delle immunoglobuline. La 2-microglobulina associata alla catena pesante con un legame non covalente e non una proteina transmembrana. Questa proteina essenziale per lespressione e le funzioni degli antigeni di Classe I sulla superficie cellulare. La cavit che lega lantigene della molecola di Classe I formata dalle regioni 1 e 2 della catena pesante.
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La struttura della cavit che lega lantigene consiste di una piattaforma di otto filamenti paralleli, supportata da due eliche4. I peptidi espressi nella cavit che lega lantigene sono costituiti da 8 a 12 amminoacidi e rappresentano proteine idrolizzate, che sono state sintetizzate allinterno delle cellule che presentano lantigene; di conseguenza, sono da considerare come antigeni endogeni. Lorigine endogena delle proteine indica che anche il gene che le codifica deve risiedere nella cellula. Queste proteine possono essere il prodotto di geni dellospite, inclusi geni oncogeni o geni di virus o batteri intracellulari. Molecole MHC di Classe II Ci sono tre loci principali dei geni di Classe II: HLA-DR, -DQ e -DP. Come per le molecole di
Classe I, esistono diversi alleli che possono occupare ognuno di questi loci. Ogni individuo esprime quattro molecole DR, quattro molecole DQ e due molecole DP, per un totale di 10 forme di molecole HLA di Classe II. Le molecole di Classe II sono eterodimeri costituiti da una catena pesante (da 30 a 34 kDa) ed una catena leggera (da 26 a 29 kDa). Ogni catena ha unestremit citoplasmatica, una regione transmembrana e una porzione extracellulare. Vi sono due regioni simili a quelle delle immunoglobuline su ogni catena (1 e 2 e 1 e 2). Le regioni 2 e 2 presentano una struttura costante per ogni gene; le regioni 1e 1 sono diverse. La cavit che lega lantigene collocata dentro le regioni 1, 1, presentando una struttura analoga a quella delle molecole di Classe I.
Figura 11.2 - Struttura di alcuni recettori trovati su differenti cellule del sistema immunitario1.
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Tuttavia, la cavit pi ampia, pu ospitare peptidi lunghi da 12 a 20 amminoacidi. Le molecole di Classe II sono espresse su monociti, macrofagi, cellule dendritiche e linfociti B. I peptidi antigenici presentati nella cavit delle molecole HLA di Classe II originano da proteine che sono state inglobate per fagocitosi o endocitosi dalle cellule che presentano lantigene. Queste proteine sono definite antigeni esogeni e comprendono prevalentemente batteri, parassiti e particelle virali rilasciate da altre cellule5. Molecole MHC di Classe III Esistono circa 20 geni collocati nella regione MHC di Classe III. Questi geni codificano per delle proteine del sistema del complemento e per molecole proinfiammatorie come il TNF. Le molecole CD (Cluster of Differentiation) La denominazione CD un sistema di nomenclatura utilizzato per descrivere numerose molecole espresse sulle cellule e sui componenti del sangue oltre che negli organi linfoidi. Attualmente, sono stati descritti oltre 200 marcatori CD3. Alcuni dei principali marcatori espressi sulle cellule del sistema immunitario sono elencati nella Tabella 11.1. Molecole di adesione cellulare Affinch avvenga un normale funzionamento del sistema immunitario, i leucociti devono essere in grado di aderire a qualunque matrice extracellulare e vicendevolmente. Tre famiglie di molecole di adesione agevolano questo processo: le selectine, le integrine e le molecole di adesione IgSF. I membri della famiglia delle selectine (L-selectina, E-selectina e P-selectina) sono poste sui leucociti e contribuiscono al processo di rolling dei leucociti lungo lendotelio vascolare. Le integrine (VAL, LFA-1 e MAC-1) e le molecole di adesione IgSF (ICAMs, VCAMs, LFA-2 e LFA-3) sono necessarie per fermare il rolling dei leucociti e mediarne laggregazione e la migrazione transmenbrana6. La maggior parte delle molecole di adesione hanno una designazione CD (per esempio, LFA-2 il CD2 e LFA-3 il CD58)7.
Trasduzione di segnale La trasduzione di segnale il processo di invio di segnali tra le cellule o allinterno di esse, che ha come effetto linizio o linibizione della trascrizione genica. Lattivazione dei segnali di superficie cellulare associati con la risposta immune inizia dallinterazione extracellulare di diversi ligandi e recettori. Molti di questi differenti ligandi e recettori hanno una denominazione CD. Ogni difetto o carenza nella trasduzione di segnale pu avere significative conseguenze sul normale funzionamento del sistema immunocompetente. Per esempio, una immunodeficienza combinata severa pu derivare da una deficienza di Jak3, che danneggia la trasduzione di segnale di una specifica sub-unit del recettore delle citochine 7.
Organi del sistema immunitario

Numerosi organi sono coinvolti nel sistema immunitario. Gli organi centrali comprendono il midollo ematopoietico, il fegato e il timo. Gli organi periferici sono i linfonodi e la milza. I tessuti linfoidi associati al tratto gastrointestinale e allalbero bronchiale giocano pure un ruolo importante che coinvolge sia le funzioni centrali sia le periferiche.
Cellule del sistema immunitario

Le principali cellule coinvolte nel sistema immunitario sono i linfociti: le cellule B, le cellule T e le cellule che presentano lantigene. Altre cellule come i macrofagi sono coinvolti nellinduzione della risposta immunitaria e sia i macrofagi che i leucociti polimorfonucleati partecipano ai diversi processi infiammatori che sono associati con la risposta immunitaria. Tutte queste cellule sono di origine ematopoietica (di produzione midollare) e sono generate da una singola cellula progenitrice indicata come cellula staminale ematopoietica pluripotente.
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Tabella 11.1 - Alcuni dei principali antigeni CD sulle cellule del sistema immunitario Designazione CD CD1 CD2 CD3 CD4 CD5 CD8 CD14 CD16 CD19 CD20 CD21 CD25 CD34 Popolazione cellulare Timociti corticali Marcatore pan-T, presente sui timociti allo stadio iniziale Linfociti T Timociti in sviluppo e maturi e sui 2/3 dei linfociti T periferici Marcatore pan-T, dallo stadio corticale tardivo Timociti in sviluppo e maturi e linfociti T citotossici Monociti Macrofagi, neutrofili, cellule NK Linfociti B Linfociti B Cellule B mature Cellule B e T attivate Cellule staminali Altre cellule Alcune cellule che presentano lantigene, alcuni linfociti B Cellule natural killer (NK) T helper e alcuni macrofagi Cellule B della LLC, forse cellule B autoreattive a lunga vita Nessuna Forse macrofagi Macrofagi, virociti Cellule ematopoietiche e cellule endoteliali Commento Lintensit di espressione inversa a quella del T CD3/CD3 Recettore delle rosette di emazie di montone;svolge attivit di attivazione e adesione (LFA-2) Funziona come complesso per la trasduzione Molecola di adesione che media la restrizione MHC; trasmissione dei segnali, recettore HIV Funzione sconosciuta; possibile coinvolgimento in effetti di stimolazione comune nelladesione fra cellule Molecola di adesione che media la restrizione MHC; trasmissione dei segnali Recettore di lipopolisaccaridi (LPS) Recettore a bassa affinit per lFC delle IgG (FcRIII) Segnalatore indicato anche come B4 Segnalatore indicato anche come B1
Recettore per C3d (CR2), recettore di EBV Recettore IL-2 ad alta affinit, prima indicato TaC Detto Antigene delle cellule staminali, usato in laboratorio per isolare i precursori ematopoietici; funzione fisiologica ignota
(segue)
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Designazione CD CD35 CD45 CD56 CD71
Popolazione cellulare Cellule B mature e attivate Cellule B e T mature e immature Cellule NK (natural killer) Timociti allo stadio iniziale, cellule B e T attivate
Altre cellule Eritrociti, macrofagi, granulociti, cellule dendritiche Tutte le cellule di origine ematopoietica tolti gli eritrociti Cellule TNK (natural killer T) Cellule ematopoietiche attivate, cellule proliferanti di altre linee, reticolociti
Commento Recettore per C3b (CR4) Detto anche antigene leucocitario comune (LCA); differenti leucociti hanno isoforme differenti Adesione e marcatore di cellule NK ;immunit innata Recettore della transferrina
EBV = virus di Epstein-Barr; IL = interleuchina; LFA-2 = antigene linfocitario associato a funzione-2; LLC = leucemia linfatica cronica.
Come illustrato nella Figura 11.3 la cellula staminale pluripotente pu originare due linee cellulari: la mieloide e la linfoide. I granulociti (neutrolifili, basofili ed eosinofili), le piastrine, le mastcellule, gli eritrociti ed i macrofagi si sviluppano dai progenitori mieloidi. I linfociti B e T sono formati dai progenitori linfoidi. Le cellule dendritiche e le cellule natural killer (NK) derivano anchesse dalla cellula staminale pluripotente; tuttavia lorigine precisa sconosciuta. Linfociti Le due principali linee proliferative dei linfociti sono le cellule B e le cellule T. Le cellule B sono prodotte dal midollo ematopoietico e le cellule T originano dai precursori delle cellule T di produzione midollare, che migrano nel timo. Le cellule B sono i precursori delle cellule che producono gli anticorpi (plasmacellule). Le cellule T sono costituite da sottopopolazioni che alternativamente aiutano nella formazione degli anticorpi (cellule T helper) o uccidono delle cellule bersaglio (cellule T citotossiche) o inducono processi infiammatori (cellule T dellipersensibilit ritardata) o inibiscono la risposta immunitaria (cellule T regolatrici). I linfociti B Ogni cellula B pu riconoscere uno o una serie limitata di epitopi antigenici attraverso i recettori di superficie della cellula. Questi recettori, analoghi alle molecole IgM ed IgD, vengono prodotti e successivamente trasportati sulla superficie della membrana. Quando i recettori immunoglobulinici si legano ad uno specifico antigene, la cellula viene stimolata a moltiplicarsi e a differenziarsi in plasmacellula. La plasmacellula pu secernere una forma solubile del recettore immunoglobulinico, che viene indicata col nome di anticorpo. Lanticorpo secreto specifico per lo stesso antigene che interagisce con il recettore immunoglobulinico legato sulla superficie della cellula. Il recettore della cellula B (BCR, B-cell receptor) ha una regione (dominio) addizionale sulla catena pesante (CH4) rispetto allimmunoglobulina che viene secreta. Questa regione necessaria per
ancorare il recettore alla membrana cellulare. Diverse molecole accessorie che sono presenti sulla superficie delle cellule B sono strettamente correlate con il recettore della cellula B e sono importanti per la trasduzione del segnale. Alcune di queste molecole accessorie comprendono Ig, Ig, molecole MHC di Classe II, recettori del complemento ed alcuni marcatori CD (vedi Tabella 11.2). Tutte queste componenti sono parte del complesso antigenico BCR (alcune di queste strutture sono illustrate nella Figura 11.2). La sfida per lorganismo di avere linfociti B in grado di riconoscere ognuno delle migliaia di differenti antigeni estranei che si incontrano nellarco di una vita. Il sistema immunitario ha un approccio singolare per assicurare questa variabilit. Il genoma umano notoriamente costituito approssimativamente da circa 40.000 geni. Le cellule B del corpo producono probabilmente oltre 100 milioni di proteine anticorpali differenti che sono espresse come recettori immunoglobulinici. Poich il corpo umano non pu avere abbastanza geni per codificare diversi i milioni di proteine estranee che il sistema immunocompetente deve essere in grado di riconoscere, utilizza, per creare la necessaria diversificazione, un processo che viene indicato come ricombinazione genica9. Numerosi geni codificano per le catene pesanti e leggere che costituiscono i recettori immunoglobulinici sulle cellule B. I loci dei geni che codificano le catene pesanti sono localizzati sul cromosoma 14 ed i loci dei geni che codificano le catene leggere sono localizzati sul cromosoma 2 (catene leggere ) o sul cromosoma 22 (catene leggere ). Tre loci contribuiscono alla diversificazione del recettore immunoglobulinico: V (per variabile), D (per diversit) e J (per giunzione). Il quarto locus codifica per la regione C (costante) del recettore immunoglobulinico e ne definisce lespressione isotipica. La regione C non coinvolta nel legame con lantigene, ma codifica per le funzioni biologiche associate allimmunoglobulina come lattivazione del complemento e il legame con gli specifici recettori.
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Tabella 11.2 - Recettori/marcatori presenti su macrofagi, monociti e linfociti B Marcatore Macrofagi e monociti Recettori per il complemento: CR1 (recettori di C3b, CD35) CR3 (recettore di C3bi, CDIIb) Recettori di citochine (IL-1, IL-4, IFN) fattore di migrazione-inibizione Recettori specifici per il frammento Fc: FcRI (CD64) FcRII (CD32) FcRIII (CD16) FcRII (CD23) Antigene 1 associato alla funzione leucocitaria (LFA1 o CD11a) Recettori di mannosio/fucosio P150, 95 (cD11c) Linfociti B CD5 CD19, 20 e 22 CD72-78 Recettori del complemento: C3b (CR1, CD35), C3d (CR2, CD21) Ig Ig Molecole MHC di Classe II (DQ, DP, DR) Funzione
Lega le cellule rivestite da C3b Adesione e attivazione Recettori che legano le citochine segnalando attivazione ed altre funzioni cellulari Alta affinit per le IgG Affinit media per le IgG Bassa affinit per le IgG Recettore a bassa affinit per le IgE Adesione e attivazione Legano gli zuccheri sui microrganismi Adesione e attivazione Marcatore cellulare che identifica una sottopopolazione di cellule B predisposte alla produzione di autoanticorpi Marcatoti principali per distinguere le cellule B Altri marcatori che identificano le cellule B Giocano un ruolo nellattivazione e nellhoming (trovare la direzione verso casa) delle cellule Trasporto e assemblaggiodei dei monomeri Igm sulla membrana cellulare Molecole accessorie che interagiscono con segmenti transmembrana di IgM Si trovano sulle cellule che presentano gli antigeni e sono fondamentali per iniziare le risposte immuni che dipendono dalle cellule T
La commutazione isotopica (cambiare dalle IgM o IgD ad uno degli altri isotipi) un processo dipendente dalle cellule T che avviene a livello del DNA. Il processo di commutazione isotopica permette il mantenimento della specificit della molecola anticorpale indipendentemente dallisotipo
delle catene pesanti9,10. La Tabella 11.3 elenca le propriet biologiche dei diversi isotipi immunoglobulinici. Allo stadio di sviluppo cellulare pre-B, un gene che codifica per la catena pesante viene selezionato casualmente da ognuno dei quattro segmenti (VH, DH, JH e CH).
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Figura 11.3 - La cellula staminale pluripotente (nella parte medio-superiore del diagramma) si divide nella cellula staminale linfoide e nella cellula staminale mieloide, dalle quali derivano tutte le altre linee delle cellule ematiche. Le citochine prodotte dalle cellule stromali del midollo ematopoietico influenzano la replicazione e la differenziazione delle staminali e delle successive cellule. Le citochine prodotte dai membri attivati delle linee altamente differenziate delle cellule T e dei macrofagi esercitano effetti importanti a tutti gli stadi di sviluppo delle serie mieloidi e linfoidi (da Goldsby et al.8, riproduzione autorizzata).
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Vi sono oltre 10.000 possibili combinazioni, dato lelevato numero di geni possibili in ogni segmento. Il gene che codifica la catena leggera possiede solo tre segmenti (VL, JL, CL) ed un gene viene selezionato casualmente da ciascuno di questi segmenti con un procedimento analogo a quello della selezione del gene per la catena pesante. Questo processo determina oltre 1.000 possibili combinazioni di catene leggere. Quando la catena pesante e la catena leggera si uniscono, possono essere formate circa 10 milioni di differenti combinazioni, ciascuna rappresentando un recettore immunoglobulinico con una specificit antigenica unica. Oltre alla ricombinazione genica molti altri processi contribuiscono a questa diversit. Questi processi comprendono le mutazioni somatiche che avvengono quando la cellula B attivata, il mescolamento combinatorio che si verifica quando le catene pesanti e leggere vengono assemblate e laggiunta di basi di DNA casuali alla fine dei geni durante il processo di giunzione. La combinazione di tutti questi processi assicura che le cellule B abbiano recettori immunoglobulinici specifici per ogni antigene estraneo che possa essere incontrato (approssimativamente 1011 specificit antigeniche)9-11. Poich la formazione dei recettori immunoglobulinici delle cellule B avviene attraverso una ricombinazione casuale, alcuni dei recettori prodotti saranno reattivi con le cellule del proprio organismo. Per prevenire linsorgenza di malattie autoimmuni, lorganismo deve eliminare o inibire queste cellule B. Ci si realizza con un processo di selezione negativa12. Quando la cellula B viene formata, incontra unampia quantit di antigeni del proprio organismo (self). Se una cellula B lega fortemente un proprio antigene, il recettore immunoglobulinico invia un segnale che attiva degli enzimi che frammentano il DNA nucleare. Questo determina la morte della cellula, in un processo denominato apoptosi (morte cellulare programmata). Solo il 25% delle cellule B che maturano nel midollo raggiungono il circolo periferico. La maggioranza delle cellule B subisce lapoptosi.
Questo processo esita nella produzione di cellule B che hanno una bassa affinit per gli antigeni self ma sono in grado di legarsi con gli antigeni estranei che entrano nellorganismo. Quando le cellule B mature entrano nel torrente circolatorio periferico, legano gli antigeni estranei che sono specifici per il loro recettore immunoglobulinico. Quando uno specifico antigene si lega al recettore immunoglobulinico, viene inviato un segnale che determina linglobamento allinterno della cellula del complesso antigene/recettore. Dentro la cellula, lantigene viene degradato in piccoli peptidi che si legano alle molecole MHC di Classe II presenti allinterno della cellula. Questo complesso MHC-peptide viene trasportato alla membrana esterna della cellula dove pu interagire con il TCR. Questi segnali di interazione stimolano la cellula a produrre diverse citochine, determinando la proliferazione della cellula B in cellula della memoria o plasmacellula. Gli anticorpi prodotti da una plasmacellula sono sempre della stessa classe immunoglobulinica. Tuttavia, ogni volta che avviene la proliferazione di una cellula B, avvengono mutazioni somatiche che determinano piccole differenze nellaffinit di legame dei recettori immunoglobulinici. Poich i recettori immunoglobulinici con la pi alta affinit di legame saranno quelli che con maggiore probabilit incontreranno lantigene, con questo processo viene determinata preferenzialmente la proliferazione delle cellule B che presentano la pi elevata affinit di legame per lantigene. Questa selezione preferenziale viene indicata come focalizzazione della risposta immune5, 13, 14. Linfociti T Esistono due tipi principali di linfociti T: i linfociti T citotossici e i linfociti T helper. Questi due tipi di cellule possono essere differenziati dalla presenza di specifici marcatori CD sulla superficie. I linfociti T citotossici sono positivi per lantigene di superficie CD8 e sono negativi per lantigene CD4 e costituiscono circa 1/3 dei linfociti T circolanti nel sangue periferico. Le cellule T helper sono CD4 positive e CD8 negative e rappresentano circa i 2/3 dei linfociti T
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Tabella 11.3 - Caratteristiche e propriet biologiche delle immunoglobuline umane Classe Struttura: Isotipo delle catene pesanti Numero di sottoclassi Tipo di catene leggere Peso molecolare (Dalton) IgG
IgA
IgM
IgD
IgE
4
;
2
;
1
;
?
;
?
;
150.000
Vi sono polimeri? No Mobilit elettroforetica Costante di sedimentazione 6-7S (in unit Svedberg) Allotipi Gm (catene pesanti) + Allotipi Km (catene leggere : + in passato: Inv) Allotipi Am 0 Concentrazione nel siero (mg/dL) 1.000-1.500 Totale delle immunoglobuline (%) 80 Tasso di sintesi (mg/kg/giorno) 33 Emivita nel siero (giorni) 23 Distribuzione (% del totale 45 nello spazio intravascolare) Presenza nelle secrezioni No epiteliali Attivit anticorpale S Caratteristiche sierologiche Di solito non agglutinati Fissazione del complemento S Passaggio transplacentare S
180.000500.000 S
900.000 S fra e 19S 0 + 0 85-205 5 6-7 5 76 No
180.000 No fra e 7S 0 ? 0 3 <0,1 <0,4 2-8 75 No
200.000 No alta 8S 0 ? 0 0,01-0,07 <0,1 <0,02 1-5 51 No S ?
7-15S 0 + + 200-350 15 24 6 42 S S Di solito non agglutinati No No
S Probabilmente no Di solito ? agglutinati S No No No
No No
circolanti. I linfociti T helper riconoscono lantigene presentato dalle molecole HLA di Classe II, mentre i linfociti T citotossici riconoscono lantigene in un contesto di molecole HLA di Classe I. Circa il 5% dei linfociti T periferici sono negativi sia per il CD4 che per il CD8. I T linfociti attraversano un processo di selezione positiva e negativa nel timo durante lontogenesi delle cellule T.
Se una cellula T idonea al riconoscimento degli antigeni MHC self, sopravvive (selezione positiva) ed emigra nella zona midollare del timo. In questa zona, le cellule T sono sottoposte a un processo (selezione negativa) che distrugge le cellule T che presentano unelevata affinit per gli antigeni MHC propri. Le cellule T che falliscono nel riconoscimento degli antigeni MHC self vanno incontro ad apoptosi.
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Lobiettivo fondamentale quello di selezionare le cellule T che riconoscono come proprie le molecole MHC self che hanno peptidi estranei nella loro cavit. Il processo cos raffinato che circa il 10% delle cellule T hanno labilit di reagire con i complessi MHC estranei, formando lelemento fondamentale sul quale si basa il rigetto del trapianto. Alla fine solo il 5% delle cellule sopravvive, nel timo, sia al processo selettivo positivo che a quello negativo e diventano cellule T mature 5,13,15 . Il recettore sulle cellule T responsabile del riconoscimento del complesso MHC/peptide il TCR (vedi Figura 11.2). Esistono due tipi principali di TCR: quelli che presentano catene e oppure quelli con catene e come componenti del complesso TCR. Circa il 90% di tutte le cellule T portano catene e . Ogni catena transmembrana ha due regioni (una variabile e laltra costante). Queste catene vengono prodotte attraverso un processo di ricombinazione genica in modo analogo a quello per lMHC e per i recettori immunoglobulinici. Il numero dei possibili TCR e viene stimato nellordine di 1015. I TCR che presentano catene e sono espressi nel 5-15% delle cellule T, prevalentemente nelle cellule T collocate negli endoteli mucosi. Queste cellule T sembrano giocare un ruolo importante nella protezione delle superfici mucose dellorganismo dai batteri estranei. Il TCR associato con legami non covalenti al complesso CD3, che composto da tre paia di dimeri. Questo complesso CD3 responsabile della trasduzione di segnale una volta che il peptide sia riconosciuto dal TCR16. Riconoscimento da parte delle cellule T citotossiche. I linfociti T citotossici riconoscono il peptide associato con molecole MHC di Classe I. Come gi riferito, questi peptidi possono originare da proteine self o da proteine intracellulari di origine virale o microbica. Il recettore TCR-2 sulle cellule T citotossiche riconosce la molecola peptide-MHC di Classe I in combinazione con un co-recettore (CD8) sulla cellula T. Questa interazione segnala alla cellula di produrre proteine (per esempio la perforina) che
spezzano lintegrit della membrana della cellula bersaglio, determinandone la morte. Durante questo processo, vengono prodotte anche delle citochine, TNF- e interferone (IFN ). Queste citochine prevengono la replicazione di virus che possono essere espulsi dalla cellula durante la morte cellulare; pertanto, linfezione viene bloccata attraverso questo processo. Sebbene il processo sia un meccanismo altamente efficace per leliminazione delle cellule infettate da virus, pu essere dannoso per lospite. Le citochine prodotte per prevenire la replicazione virale possono provocare effetti avversi che comprendono il danno o la distruzione di tessuti sani. I danni epatici associati allinfezione da epatite B sono un esempio della morbilit indotta dalla risposta delle cellule T citotossiche5,11. Stimolazione delle cellule B. Lattivazione delle cellule B pu avvenire attraverso lattivazione delle cellule T o con un meccanismo indipendente dallinterazione con i linfociti T. Questi due meccanismi vengono di seguito descritti. Stimolazione dipendente dalle cellule-T . I recettori delle cellule T helper riconoscono i peptidi estranei nella cavit legante lantigene delle molecole MHC di Classe II in combinazione con il CD4. Questa interazione del TCR-CD4 con la molecola MHC di Classe II aumenta lespressione del CD80/86 sulla superficie dei linfociti B specifici per lantigene. Il CD80/86 reagisce con il ligando CD28 sulla superficie delle cellule T, determinando laumento di espressione del ligando CD40 (CD40L) che interagisce con il CD40 sulle cellule B. Questa cascata di segnali importante per la produzione di citochine, che esita nella risposta di commutazione isotipica delle cellule B. La produzione di interleuchina 4 (IL-4) induce le cellule B alla commutazione da IgM a IgG4 ed IgE. La produzione del fattore di crescita trasformante (TGF-) e dellIL-10 induce le cellule B alla commutazione a IgA1 e IgA2. Se manca o si verifica un cattivo funzionamento dellinterazione col ligando la commutazione isotopica pu essere alterata.
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Per esempio, se linterazione CD40L-CD40 danneggiata, la commutazione isotipica non avverr e si produrranno solo anticorpi di classe IgM. Questa situazione clinica viene indicata come immunodeficienza iper-IgM7. Stimolazione indipendente dalle cellule T. I linfociti B possono essere attivati alla produzione anticorpale da polisaccaridi, lipopolisaccaridi, e polimeri proteici, indipendentemente dallinterazione con i linfociti T. I linfociti B reagiscono direttamente con queste molecole, producendo una rapida risposta immune nei confronti dei patogeni. Tuttavia, vi sono degli svantaggi in questo meccanismo: il processo inefficace per la produzione dei linfociti B della memoria immunologica, la maturazione dellaffinit anticorpale scarsa, la commutazione isotopica non viene indotta. Il processo di attivazione indipendente dai linfociti T pu anche determinare la produzione di linfociti B i cui anticorpi sono specifici per antigeni diversi da quelli presenti sui patogeni; pertanto, possono essere prodotti sia anticorpi protettivi che autoanticorpi. Quando, attraverso questo meccanismo, si producono autoanticorpi, si pu verificare una transitoria sintomatologia clinica di malattia autoimmune7. Cellule natural killer Le cellule natural killer (NK) non esprimono n recettori delle cellule T n recettori delle cellule B e rappresentano circa il 10% della popolazione linfocitaria. Queste cellule sono efficaci nella soppressione di alcune cellule infettate dai virus e di alcune cellule tumorali. Le cellule natural killer operano mediante un meccanismo indicato come citotossicit cellulare anticorpo-dipendente o ADCC ( antibodydependent cellular cytotoxicity). LADCC avviene quando proteine di origine virale sono espresse sulla superficie di una cellula infetta, solitamente come risultato della gemmazione virale. Le proteine vengono riconosciute come estranee dal sistema immunitario e si producono gli anticorpi, che successivamente si legano alle proteine virali espresse sulle cellule infettate. I linfociti natural killer riconoscono la presenza di anticorpi legati sulla
superficie cellulare attraverso i loro recettori Fc. Le cellule natural killer producono, quindi, delle perforine che causano la lisi delle cellule infettate dai virus mediante un meccanismo che non stato ancora completamente compreso5. Cellule fagocitiche I fagociti comprendono delle cellule come i monociti e i granulociti polimorfonucleati (eosinofili, basofili e neutrofili). Alcuni monociti emigrano nei tessuti (fegato, polmone, milza, rene, linfonodi e cervello) e diventano macrofagi tissutali. I granulociti polimorfonucleati vengono prodotti rapidamente e vivono per un breve periodo (alcuni giorni). Il granulocita neutrofilo il pi comune. Queste cellule rispondono ad agenti chemiotattici come i frammenti del complemento e le citochine, dai quali vengono indotti ad emigrare nella sede dellinfiammazione. Gli eosinofili rappresentano dal 2 al 15% dei leucociti e giocano un ruolo importante nella regolazione del processo infiammatorio, rilasciando unantistamina. Queste cellule possono anche giocare un ruolo nella fagocitosi e nella soppressione dei microorganismi. I basofili costituiscono meno dello 0,2% del pool totale dei leucociti. Queste cellule possono pure rispondere a stimoli chemiotattici ed essere coinvolte nella risposta allergica. Storicamente, questo insieme di cellule fagocitiche era indicato come sistema reticoloendoteliale ma, attualmente, viene definito come sistema fagocitico mononucleare. Lattivit fagocitica delle cellule viene realizzata grazie alla presenza di recettori sulla membrana cellulare. Esistono numerosi tipi di recettori: recettori mannosio-fucosio, che si legano agli zuccheri presenti sulla superficie dei microrganismi, recettori Fc, che si legano alle IgG, recettori del complemento. Un elenco di alcuni dei recettori di membrana presenti sui macrofagi e monociti si trova nella Tabella 11.2. Linglobamento allinterno della cellula e il trattamento di alcuni componenti corpuscolati avviene mediante la produzione di enzimi (perossidasi e idrolasi acida)5. In condizioni ottimali di citochine, i macrofagi e
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i monociti possono diventare le cellule che presentano lantigene propriamente dette; la loro capacit di ingerire ed elaborare le molecole estranee costituisce, quindi, una parte essenziale nella risposta immune acquisita.
Componenti solubili della risposta immune

Esistono tre principali componenti solubili della risposta immune: le immunoglobuline, il complemento e le citochine. Le immunoglobuline Le immunoglobuline (Ig) sono proteine che possono fissarsi sulla superficie delle cellule e servire come recettori di antigeni sulle cellule B (vedi sezione sui linfociti B) oppure possono essere secrete in forma solubile come anticorpi. Lo sviluppo molecolare delle immunoglobuline stato discusso nella sezione dedicata ai linfociti B. Le strutture dei diversi tipi di immunoglobuline saranno discusse di seguito. Ogni molecola immunoglobulinica monomerica costituita da due identiche catene pesanti e da due identiche catene leggere. Le catene pesanti sono costituite da circa 450 amminoacidi del peso molecolare di circa 50-70 kDa. Vi sono cinque classi di catene pesanti, indicate come isotipi. Esse comprendono le mu (), le gamma (), le alfa (), la delta () e le epsilon (). Le catene leggere sono pi piccole (circa 210 amminoacidi, con peso molecolare di 25 kDa) e possono essere kappa () o lambda (). Le catene pesanti e le catene leggere sono unite tra loro mediante ponti disolfuro. Le catene polipeptidiche delle catene immunoglobuliniche (sia pesanti che leggere) sono avvolte ad ansa, formando strutture globulari dette domini delle immunoglobuline. Su ogni catena, si trova una regione variabile, nella quale la sequenza amminoacidica diversificata, fornendo la specificit anticorpale. Gli epitopi espressi in questa regione sono definiti idiotipi. Gli altri domini, sia sulle catene pesanti che leggere, sono chiamati regioni costanti ed hanno sequenze amminoacidiche similari, in
funzione dellisotipo. Larea di cerniera della molecola (compresa tra CH1 e CH2, come mostrato nella Figura 11.4) forniscono flessibilit alla molecola, permettendo alle due componenti molecolari che legano lantigene di operare indipendentemente. Le funzioni biologiche della molecola sono associate con la regione costante delle catene pesanti.Queste funzioni comprendono: il passaggio placentare, il legame con i macrofagi e lattivazione del complemento4. Legami tra le catene Ogni catena leggera unita ad una catena pesante da un ponte disolfuro. Uno o pi ponti disolfuro legano le due catene pesanti in un punto compreso tra CH1 e CH2, in unarea di elevata flessibilit detta regione cerniera. Sono questi ponti disolfuro fra le catene che costituiscono il bersaglio degli agenti riducenti utilizzati per produrre i reattivi anti-D chimicamente modificati. Frammenti Fab ed Fc I polipeptidi possono essere spezzati in punti prestabiliti con enzimi proteolitici. Molte informazioni sulla struttura e sulle funzioni delle immunoglobuline sono state ottenute con lo studio dei frammenti di scissione, generati dalla digestione delle molecole immunoglobuliniche da parte della papaina. La papaina spezza le catene pesanti in un punto di poco al di sopra della regione cerniera, formando tre frammenti separati. Due sono identici, essendo ciascuno costituito da una catena leggera legata a mezza catena pesante con estremit N-terminale; laltro frammento costituito dalle due mezze catene pesanti con estremit C-terminale, ancora unite una allaltra dal ponte disolfuro della regione cerniera. I due frammenti N-terminali identici, che conservano la specificit anticorpale, sono definiti frammenti Fab. Le due met C-terminali delle catene pesanti unite tra loro costituiscono un frammento proteico cristallizzabile, privo di specificit anticorpale, denominato frammento Fc. Polimeri immunoglobulinici I ponti disolfuro possono unire una allaltra
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Figura 11.4 - Unit di base, a quattro catene, delle immunoglobuline. La specificit idiotipica risiede nelle regioni variabili delle catene pesanti e di quelle leggere (VH e VL). La capacit di combinarsi con lantigene dipende dallintegrit del legame tra una catena leggera (VL e CL) e la met amino-terminale di una catena pesante (VH e CH1), i frammenti Fab della molecola. I ponti disolfuro nella regione cerniera uniscono le due met carbossi-terminali delle due catene pesanti (CH1 e CH3, pi CH4 per le catene pesanti ed ), per formare il frammento Fc (da Goldsby et al.8, riproduzione autorizzata). anche alcune unit Ig monomeriche per formare molecole polimeriche pi grandi; solo le IgM e le IgA possono formare dei polimeri. Le IgG, IgE ed IgD esistono soltanto in forma monomerica; non ci sono forme polimeriche di queste classi Ig. Le molecole IgM sintetizzate da un linfocita B non stimolato ed espresso sulla membrana come recettore immunoglobulinico, presente in forma monomerica. Come gi detto, le catene pesanti () delle IgM espresse sulla superficie della membrana presentano quattro regioni costanti. La quarta regione permette ai monomeri IgM di ancorarsi sulla membrana come recettore immunoglobulinico. Dopo lespansione clonale e la differenziazione in plasmacellule, le cellule attivate producono catene con la perdita di una regione costante. Mentre permangono per qualche tempo nel citoplasma delle plasmacellule, cinque monomeri IgM vengono uniti con la formazione di ponti disolfuro tra i domini CH3 e CH45. Il risultato un pentamero che viene secreto allesterno della cellula e rappresenta la forma nella quale le IgM si accumulano nei fluidi corporei. Le IgA vengono secrete sia come forma monomerica che come forma polimerica. La forma monomerica quella predominante nel torrente circolatorio, ma i dimeri e i trimeri, secreti dai linfociti B presenti sulle superfici mucose e nei tessuti esocrini sono quelli biologicamente attivi. Altre catene I pentameri IgM ed i dimeri e trimeri delle IgA contengono un polipeptide di 15 kDa detto catena J. Prima che il polimero lasci la plasmacellula, la catena J si attacca al terminale della regione costante di due monomeri adiacenti. Non importante quanti monomeri costituiscono il polimero, vi sar una sola catena J. La sua funzione non ancora chiaramente compresa.
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Le molecole polimeriche presenti nelle secrezioni epiteliali possiedono anche una subunit indicata come componente secretoria. La componente secretoria agisce come elemento protettivo dalla proteolisi a cui sono esposti gli anticorpi di superficie biologicamente importanti, nelle secrezioni ricche di enzimi dei tratti respiratori ed alimentari. Classi immunoglobuliniche individuali IgM. La classe delle IgM costituisce la prima classe anticorpale prodotta dalle cellule B in maturazione. la prima classe ad apparire nel siero durante lo sviluppo infantile ed la prima che viene rilevata in una risposta immunitaria primaria. Le IgM pentameriche secrete costituiscono, in un siero normale, dal 5 al 10% delle immunoglobuline totali. Ben poche di queste grandi molecole vengono diffuse nei fluidi interstiziali. Bench i cinque monomeri comprendano 10 siti combinatori, solo cinque di questi siti sono realmente disponibili per combinarsi con la maggior parte degli antigeni; ragione per cui, lanticorpo IgM indicato come pentavalente. Grazie alla loro dimensione e alla multivalenza, le molecole IgM si legano rapidamente agli antigeni esposti sulle superfici corpuscolate, specialmente quelle dei globuli rossi o dei microrganismi. Gli anticorpi IgM possono legare insieme cellule che esprimono uno specifico antigene, formando aggregati di cellule (agglutinati). Sebbene molto utile da un punto di vista laboratoristico, lagglutinazione gioca probabilmente un ruolo secondario negli eventi biologici. Leffetto biologico pi importante mediato dalle IgM la capacit di attivare la cascata del complemento, incrementando i meccanismi difensivi infiammatori e fagocitici e la possibilit di indurre la lisi delle cellule che portano lantigene. IgG. LIgG esiste solo come monomero e costituisce tra il 75 e l80% delle immunoglobuline presenti nel siero. Essa ugualmente distribuita nei comparti intra ed extravascolari. In vivo, le cellule o le particelle sensibilizzate dalle IgG sono sottoposte a un marcato incremento delle interazioni con le cellule che hanno recettori per il frammento Fc delle catene gamma,
particolarmente i neutrofili e i macrofagi. Le molecole IgG possono essere classificate in quattro sottoclassi: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Strutturalmente, queste sottoclassi si differenziano principalmente per le caratteristiche della regione cerniera e per il numero di ponti disolfuro che collegano le catene pesanti. Biologicamente, hanno propriet molto differenti. Le IgG3 presentano la maggior capacit di attivare il complemento, seguite dalle IgG1 e, molto da lontano, dalle IgG2. Le IgG4 sono incapaci di attivare il complemento. Le IgG1, le IgG3 e le IgG4 superano facilmente la barriera placentare. Le IgG1, le IgG2 e le IgG4 hanno una emivita di 23 giorni, che significativamente pi lunga di quella delle altre immunoglobuline circolanti; tuttavia, lemivita delle IgG3 solo leggermente pi lunga di quella delle IgA e delle IgM. Le IgG1 e le IgG3 interagiscono rapidamente con il recettore del frammento Fc delle cellule fagocitiche, mentre le IgG4 e le IgG2 presentano una bassa affinit per questi recettori, con leccezione delle IgG2 che hanno unaffinit analoga a quella delle IgG1 e delle IgG3 per un allotipo del recettore Fc IIa. IgA. Bench vi sia, nellorganismo, una notevole quantit di anticorpi IgA (dal 10% al 15% della concentrazione sierica delle immunoglobuline), relativamente poche sono rilevabili nel sangue. La maggior parte delle IgA si trova nelle secrezioni mucose. Le IgA secretorie proteggono lepitelio sottostante dalla penetrazione batterica o virale. Si ritiene che le IgA polimeriche si combinino con gli antigeni dellambiente, formando complessi che vengono eliminati con lescrezione delle secrezioni superficiali. Questo processo pu essere importante per il controllo dello sviluppo di ipersensibilit. Le catene pesanti delle IgA non presentano un sito combinatorio per il complemento, per cui le IgA non sono in grado di attivare il complemento attraverso la via classica. Le IgA possono attivare il complemento solamente per la via alternativa (vedi oltre). IgE. La concentrazione sierica delle IgE viene misurata in nanogrammi, rispetto ai milligrammi delle altre immunoglobuline. Anche quando i pazienti con gravi allergie hanno una
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concentrazione sierica di IgE significativamente aumentata, il livello assoluto minimo se confrontato con quello delle precedenti classi immunoglobuliniche. La maggior parte delle IgE sono presenti come monomeri strettamente legati alla membrana dei granulociti basofili o delle mastcellule. LIgE responsabile di eventi di ipersensibilit immediata, come lasma allergica, la febbre da fieno e delle reazioni anafilattiche sistemiche. Sebbene le IgE appaiano coinvolte in reazioni contro protozoi parassitari, non stato identificato alcun meccanismo protettivo specifico. IgD. Il siero contiene soltanto tracce di IgD. La maggior parte delle IgD esiste come immunoglobuline sulla membrana di linfociti B non stimolati. La funzione delle IgD sconosciuta, ma potrebbe essere importante per la differenziazione linfocitaria, innescata dal legame con lantigene e per linduzione della tolleranza immunologica. Il complemento Complemento il termine che indica un sistema costituito da 25 a 30 proteine del siero e delle membrane cellulari, sistema che agisce come una cascata, analogamente al sistema coagulativo, fibrinolitico e delle chinine, per produrre numerosi effetti biologici. Le proteine coinvolte restano inattive fino a quando un evento non d inizio al processo, dopodich il prodotto di una reazione diventa il catalizzatore della tappa successiva (vedi Figura 11.5). Ogni enzima o complesso attivato pu reagire con substrati molecolari multipli, creando il potenziale per unenorme amplificazione di un evento inizialmente modesto o localizzato. Il complemento ha tre ruoli fondamentali: la promozione di eventi infiammatori acuti, lalterazione delle superfici in modo che la fagocitosi sia stimolata e la modificazione delle membrane cos da condurre alla lisi cellulare. Queste azioni determinano la distruzione batterica, proteggono dalle infezioni virali, eliminano complessi proteici e promuovono lo sviluppo dellattivit immunitaria. Tuttavia, lattivazione del complemento pu anche dare inizio a processi infiammatori e immunitari che possono danneggiare lospite e mediare la distruzione delle
sue cellule, specialmente quelle del sangue. Esistono due meccanismi differenti 17 che possono attivare la cascata complementare: la via classica, che inizia con linterazione tra un anticorpo e il suo antigene e la via alternativa, che solitamente non viene mediata da un anticorpo. La via classica Per lattivazione della via classica necessario che unimmunoglobulina reagisca con il suo antigene bersaglio. La combinazione con lantigene altera la configurazione della porzione Fc dellimmunoglobulina, rendendo accessibile unarea posta nella regione costante della catena pesante che interagisce con la componente C1 del complemento. La componente C1 pu combinarsi solo con le molecole immunoglobuliniche che presentano unadeguata configurazione della catena pesante. Questa configurazione esiste nelle catene pesanti e delle sottoclassi IgG 1, 2 e 3. La componente C1 del complemento si attacca ai siti di attivazione posti sul frammento Fc di due o pi monomeri Ig. La molecola pentamerica IgM dispone in abbondanza di siti Fc configurati in modo ravvicinato; pertanto una singola molecola IgM pu dare inizio alla cascata complementare. Per quanto riguarda gli anticorpi IgG, per attivare la sequenza necessario che due diverse molecole aderiscano a siti antigenici strettamente vicini 3. Di conseguenza, lattivazione complementare da parte delle IgG non dipende solo dalla concentrazione e dallavidit dellanticorpo, ma anche dalla topografia dellantigene. La componente C1 circolante una macromolecola costituita da tre diverse proteine (C1q, C1r e C1s). Quando avviene una reazione antigene-anticorpo, due o pi catene di C1q si attaccano alla regione CH2 delle IgG o a quella CH3 delle IgM. Questo determina un cambiamento conformazionale, che determina lattivazione di due molecole C1r che successivamente scindono due molecole C1s nella forma attivata C1s (una potente serino-esterasi). Il complesso C1r, C1s e C1q viene stabilizzato dagli ioni Ca++. In assenza degli ioni Ca++, il complesso si dissocia. Perci,
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degli agenti chelanti comunemente utilizzati nei laboratori, come gli anticoagulanti citrato ed ossalato, prevengono la stabilizzazione del complesso C1 e la successiva attivazione delle proteine del complemento. Il complesso C1s attivato lavora su due substrati. C1s spezza C4 in due frammenti: un grosso frammento (C4b) e un pi piccolo frammento C4a, che presenta una modesta attivit anafilotossinica. La maggior parte del C4b prodotto viene inattivato; tuttavia, una parte del C4b aderisce alla superficie cellulare e agisce come sito di attacco per il C2. C1s scinde anche il C2 legato rilasciando un frammento detto C2b. Il frammento C2a che resta adeso a C4b forma un complesso attivato C4b2a, conosciuto anche come C3 convertasi. Ogni C3 convertasi pu scindere oltre 200 molecole C3 native, dividendo la molecola in due frammenti. Un piccolo frammento (C3a) che presenta unattivit anafilotossinica viene rilasciato nel plasma; il frammento pi grande (C3b) aderisce alle proteine e agli zuccheri della superficie cellulare. Sia la via classica che quella alternativa sono entrambe idonee per generare la C3 convertasi. Una volta che la componente C3 stata spezzata, avvengono, in seguito, gli stessi eventi in entrambe le vie di attivazione. La via alternativa La via alternativa conduce allattivazione del complemento senza linterazione determinata da una reazione antigene-anticorpo. Questa via costituisce una difesa antimicrobica di prima linea nei vertebrati ed un meccanismo con il quale gli invertebrati possono incrementare lefficacia dei loro processi infiammatori. La via di attivazione alternativa un fenomeno di attivazione di superficie che pu essere innescato da alcuni attivatori quali: le membrane di dialisi, le membrane cellulari di molti batteri, lieviti e virus, alcuni complessi proteici, compresi quelli che contengono anticorpi non attivanti il complemento, polimeri anionici come il destrano e alcune cellule neoplastiche. La via alternativa dattivazione complementare pu iniziare anche spontaneamente nel plasma a
una velocit bassa ma stabile (attivazione tickover) (vedi Figura 11.5). Quattro proteine partecipano alla via alternativa: fattore B, fattore D, properdina (fattore P) e C3. Il C3 in fase fluida sottoposto ad una continua e spontanea scissione a basso livello che origina il C3i che viene rapidamente inattivato dalle proteine di controllo presenti nella fase fluida. Se il C3i incontra il fattore B, si forma il complesso C3iB e possono avvenire ulteriori interazioni. Il fattore D agisce sul fattore B legato, generando il complesso C3iBb capace di scindere il C3 in C3a e C3b. La maggior parte del C3 generato in fase fluida viene inattivato; tuttavia, se il C3b aderisce ad una superficie estranea, come la parete di un batterio, lattivazione della cascata complementare pu essere accelerata. Quando il C3b aderisce ad una superficie cellulare, il fattore B viene legato formando C3bB. Anche il fattore D pu reagire con questo substrato legato alla cellula, rilasciando il piccolo frammento Ba e lasciando il complesso C3bBb legato alla cellula. Questo complesso pu dissociarsi, se non viene stabilizzato dalla properdina, per formare il complesso C3bBbP. Simile al complesso C4b2a della via classica, il complesso C3bBbP in grado di convertire laltro C3 in C3b. In conclusione, entrambe le vie di attivazione, sia la classica che lalternativa, determinano la formazione di C3b. La C3 convertasi della via classica il C4b2a, mentre le C3 convertasi della via alternativa sono il C3iBb, in fase liquida e il C3bBbP quando legato alla cellula. Il complesso di attacco ala membrana La fase finale di attivazione detto complesso di attacco alla membrana e pu verificarsi una volta che il C3b stato scisso sia attraverso la via classica che attraverso la via alternativa. La C3 convertasi spezza il fattore C5 in due frammenti: un piccolo peptide (C5a) che possiede una potente attivit anafilotossinica e un pi ampio frammento (C5b). Il C5b lega i fattori C6, C7, C8 e sino a 14 monomeri del C9, con il risultato di produrre un foro litico sulla membrana cellulare. Una modesta lisi pu gi verificarsi quando
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Figura 11.5 - Diagramma che illustra lattivazione del complemento attraverso la via classica e quella alternativa (da Heddle1, riproduzione autorizzata). viene legato il C8; tuttavia, ladesione di C9 facilita la lisi cellulare. La fissazione del C3b alla membrana il punto di svolta del processo. Il legame di C3b alla cellula pu procedere con lattivazione del complesso di attacco (C5-C9) e determinare la citolisi o, in alternativa, gli inibitori del complemento possono bloccare la sequenza di attivazione, lasciando la cellula sensibilizzata con il C3b. Il fattore I un inibitore che pu rompere il C3b legato alla cellula, lasciando liC3b sulla membrana. Queste due subcomponenti del C3 (C3b, iC3b) possono stimolare la fagocitosi, agendo come opsonine. Peraltro, il C3b pu essere ulteriormente degradato, lasciando un piccolo frammento detto C3dg. La molecola C3dg la molecola che viene evidenziata dalla componente anti-C3d presente nei reattivi anti-complemento utilizzati nel test diretto allantiglobuline. I recettori del complemento Alcune cellule fagocitiche hanno recettori che possono fissarsi al C3 adeso sulle cellule. Quattro diversi recettori del complemento sono stati identificati sulla membrana delle cellule fagocitiche: CR1, CR2, CR3 e CR418. CR1. Il CR1 viene rilevato su una grande variet di cellule. Sugli eritrociti e sulle piastrine, il recettore CR1 gioca un ruolo importante nelleliminazione degli immunocomplessi. Sulle cellule fagocitiche e sui linfociti B, un recettore opsonizzante coinvolto nellattivazione dei linfociti. Il CR1 gioca anche un ruolo regolatore nellattivazione del complemento aiutando il fattore I nella degradazione del C3 nei frammenti iC3b e C3dg. CR2. Il CR2 rilevabile sulle cellule B, su alcune cellule epiteliali e sulle cellule dendritiche follicolari. Gioca un ruolo importante mediando lattivazione delle cellule B, ed anche il recettore dellinterferone e del virus di Epstein-Barr. CR3. Il CR3 viene rilevato sulle cellule della linea mielopoietica. Il CR3 media la fagocitosi di particelle rivestite di iC3b ed anche unimportante molecola di adesione, in grado di legarsi a certi batteri e lieviti. CR4. Il CR4 viene individuato sia sulle cellule linfoidi che sulle cellule mieloidi. La sua funzione non ben definita, ma sembra avere unattivit opsonizzante per liC3b e giocare, inoltre, un ruolo nel processo di adesione.
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Regolazione dellattivazione del complemento necessario controllare o regolare i fattori enzimatici di attivazione della cascata complementare.Lazione regolatrice di queste proteine di controllo previene i danni che possono essere causati ai tessuti dellospite. Questi sistemi di controllo (Tabella 11.4) agiscono con numerosi meccanismi diversi: linibizione diretta delle proteasi seriniche, il decadimento e la distruzione delle convertasi, il
controllo dei complessi di attacco alla membrana19. Effetti fisiologici dellattivazione complementare Opsonizzazione . I neutrofili e i macrofagi fagocitano ogni particella che protrude dalla superficie di una cellula o di un microrganismo, indipendentemente dalla natura del materiale. La fagocitosi pi intensa se le particelle aderiscono solidamente alla membrana delle cellule fagocitiche. Per realizzare ladesione, le cellule
Tabella 11.4 - Elenco sintetico degli inibitori dellattivazione complementare Proteine di controllo del complemento Inibizione delle proteasi seriniche Inibitore di C1 Decadimento/distruzione delle convertasi Fattore I (delle convertasi) pi proteina che lega C4 (C4-bp, protein binding) C4-bp Fattore che accelera il decadimento o DAF (decay accelerating factor) CD55 Recettore 1 del complemento (CR1, CD35) Proteina co-fattore di membrana (MCP) Funzione
Inibitore della proteasi serinica che lega e attiva C1r e C1s
Catabolizza C4 in fase fluida Determina la dissociazione di C2a da C4b2a Inibisce il legame di C2 con C4b e causa la dissociazione di C2 da C4b Accelera la dissociazione di C3bBb Stimola il catabolismo del C4b da parte del fattore I ed un cofattore, insiema al fattore I, nella scissione del C3b Causa la dissociazione di Bb da C3I e C3b e contribuisce insiema al fattore I al catabolismo di C3i e di C3b Scinde e degrada C3b usando uno di tre co-fattori: fattore H (plasmatico), CR1 o MCP (legati alla membrana)
Fattore H
Fattore I
Complesso di attacco alla membrana (o MAC membrane attack complex) Proteina S (vitronectina) Proteina che lega C8 (CD59) Proteina che impedisce il MAC
Si lega al complesso C5b67 prevenendone linserimento nel doppio strato lipidico Questa proteina legata alla cellula si associa a C8 prevenendo linserimento di C9 nella membrana Inibitore di C9, noto anche come fattore omologo di restrizione HRF, homologous restriction factor
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che fagocitano possiedono molte molecole recettoriali come i recettori per il frammento Fc di alcune immunoglobuline e quelli per il C3b. Lesaltazione della fagocitosi causata dallanticorpo o dal complemento adesi alle cellule chiamata opsonizzazione. Anafilotossine promotrici dellinfiammazione. I frammenti complementari C3a e C5a sono anafilotossine e giocano in ruolo importante nel processo infiammatorio acuto. Queste anafilotossine si legano ai recettori presenti sulle mastcellule e sui granulociti basofili, provocando il rilascio dellistamina e di altri modificatori della risposta biologica, che possono essere associati allanafilassi. Pi frequentemente, le anafilotossine alterano la permeabilit vascolare, la propriet adesiva delle membrane e la contrazione della muscolatura liscia, eventi che costituiscono la componente predominante della risposta infiammatoria acuta. I frammenti C5a e C3a inducono, inoltre, la migrazione dei neutrofili e dei macrofagi verso il sito di attivazione del complemento. Citochine In questo capitolo, si fatto riferimento a un certo numero di mediatori solubili, denominati citochine. Le citochine sono un gruppo eterogeneo di peptidi e di glicoproteine, con funzioni di segnalazione intracellulare ed un peso molecolare oscillante tra 6.000 e 60.000 dalton. Ogni citochina viene secreta da particolari tipi di cellule in risposta a differenti stimoli e pu essere coinvolta in unampia variet di importanti funzioni regolatorie di natura biologica, quali linfiammazione, la riparazione tessutale, lattivazione cellulare, la proliferazione cellulare, la fibrosi e la morfogenesi. Una citochina pu avere diverse funzioni in base al tipo di cellule cui si lega. Sono state descritte centinaia di citochine differenti. Alcune delle citochine coinvolte nelle funzioni immunitarie sono elencate nella Tabella 11.51,5. Le citochine sono implicate in una variet di eventi clinicamente significativi della Medicina Trasfusionale: reazioni trasfusionali emolitiche e febbrili, immunomodulazione, raccolta di cellule staminali, etc. (vedi Capitolo 27).
Immunologia correlata alla Medicina Trasfusionale

Sono stati descritti in precedenza molti esempi di come il sistema immunitario si correla con situazioni che si osservano in Medicina Trasfusionale: lalloimmunizzazione eritrocitaria, lalloimmunizzazione piastrinica, la distruzione immuno-mediata di eritrociti e la produzione degli anticorpi utilizzati per i sieri diagnostici. Alloimmunizzazione eritrocitaria Il meccanismo che governa lalloimmunizzazione eritrocitaria non stato ancora completamente compreso. Quando vengono trasfuse emazie allogeniche, alcuni globuli rossi si frammentano sia in conseguenza della loro et, sia per il passaggio attraverso la milza, rilasciando di conseguenza nel torrente circolatorio proteine della membrana eritrocitaria quando i frammenti si degradano. Sia le cellule che presentano lantigene propriamente dette, che i linfociti B, possono presentare lantigene o per una risposta immune primaria (vera e propria presentazione dellantigene da parte delle cellule dendritiche) oppure, nella risposta immune secondaria, da parte dei linfociti B. Alloimmunizzazione HLA piastrinica La leucodeplezione dei globuli rossi e delle piastrine a valori di 5x106 per unit trasfusionale, si dimostrata efficace nel ridurre lalloimmunizzazione HLA col seguente possibile meccanismo. I leucociti del donatore esprimono sia gli antigeni MHC di Classe I che quelli di Classe II. Alcuni degli antigeni MHC di Classe II del donatore conterranno peptidi originati dagli antigeni di Classe I sulle cellule del donatore. La maggior parte dei linfociti T del ricevente, riconoscono i propri antigeni MHC che portano i peptidi estranei. Tuttavia, come precedentemente riferito, una piccola percentuale dei linfociti T (inferiore al 10%) in grado di riconoscere antigeni MHC estranei che trasportano peptidi estranei. Quando vengono trasfuse delle piastrine, le cellule T helper del ricevente riconoscono il
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Tabella 11.5 - Alcune citochine coinvolte nel sistema immunitario, loro sede di produzione e funzioni1 Citochina Interleuchine (IL) IL-1 Numerose cellule (ad esempio: cellule APC, cellule endoteliali, cellule B, fibroblasti) Cellule TH attivate Cellule TH attivate Attivazione di cellule T e di neutrofili, stimolazione midollo osseo, pirogenicit, fase acuta della sintesi di proteine Proliferazione cellule T, chemiotassi, attivazione macrofagi Attivazione e differenziamento cellule B, proliferazione cellule T, differenziamento TH2 Differenziamento cellule B, pirogenicit, sintesi delle proteine della fase acuta Infiammazione, migrazione/chemiotassi cellulare Soppressione di cellule TH1, inibizione della presentazione di antigeni e della produzione di citochine (IL-1, IL-6, TNF, IFN) Prodotta da Funzioni principali
IL-2 IL-4
IL-6
Numerose cellule (ad esempio: APC, cellule B e T, fibroblasti, cellule endoteliali) Numerose cellule (ad esempio: macrofagi e cellule endoteliali) Cellule TH2 attivate
IL-8 IL-10
Altre citochine TNF IFN Macrofagi e linfociti Cellule T Attivazione neutrofili, pirogenicit, sintesi delle proteine della fase acuta Attivazione dei fagociti Stimola laccrescimento del tessuto connettivo e la formazione di collageno, funzioni inibitorie Accrescimento e attivazione di cellule fagocitiche
Fattore trasformante Numerose cellule di crescita
Fattori stimolanti colonie Numerose cellule (GM-CSF, M-CSF, G-CSF)
APC= cellule che presentano lantigene; G-CSF = fattore stimolante le colonie granulocitarie; GM-CSF = fattore stimolante le colonie granulocito-macrofagiche; IFN = interferone; M-CSF = fattore stimolante colonie macrofagiche; TNF = fattore di necrosi tumorale.
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complesso MHC di Classe II estraneo che presente sui leucociti del donatore. Se viene inviato un segnale, i linfociti T attivano le cellule B del ricevente, che hanno adesi anche dei frammenti di antigeni MHC di Classe I del donatore sui loro recettori Ig, provocando la proliferazione cellulare e la produzione di anticorpi contro gli antigeni MHC di Classe I (HLA) (Figura 11.6). In questo caso, i leucociti del donatore assolvono la funzione di cellule che presentano lantigene. Questo meccanismo principale indicato come riconoscimento allogenico diretto, perch i linfociti T del ricevente sono stimolati direttamente dalle cellule del donatore che presentano lantigene20. Alternativamente, il processo di presentazione dellantigene e il riconoscimento immunologico dei peptidi HLA estranei pu avvenire attraverso il sistema immunocompetente del ricevente stesso. Questa forma alternativa di riconoscimento
allogenico viene definita come riconoscimento indiretto ed la classica risposta alloimmune che si osserva per la maggior parte degli antigeni estranei. La leucodeplezione sembra essere efficace nel limitare lalloimmunizzazione HLA perch diminuisce la presentazione dellantigene da parte dei leucociti del donatore e la quantit di antigeni HLA di Classe I trasfusi viene marcatamente ridotta. Distruzione eritrocitaria immunomediata Lattivazione del complemento e/o la presenza di IgG sulla superficie eritrocitaria pu scatenare la distruzione eritrocitaria, fondamentalmente con due meccanismi: emolisi intravascolare e distruzione extravascolare (Figura 11.7). Lemolisi intravascolare si verifica quando viene attivato il complemento, esitando nellattivazione del complesso di attacco alla membrana. Non appena lintegrit della membrana viene alterata, lemoglobina (Hb) viene rilasciata nel plasma.
Figura 11.6 - Diagramma che illustra il principale meccanismo di alloimmunizzazione HLA, determinata dalla presenza dei leucociti nelle trasfusioni piastriniche (da Heddle1, riproduzione autorizzata).
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Lemoglobina libera viene legata allaptoglobina ed escreta con le urine. Il gruppo eme dellemoglobina si lega allalbumina, formando la metalbumina, che pu essere visualizzata direttamente nel plasma per il colore bruno-verdastro. Talora, gli inibitori del complemento bloccano la cascata, lasciando il frammento C3b sulle emazie. Questo frammento complementare presenta unattivit chemiotattica per le cellule fagocitiche e tali cellule possiedono i recettori per il C3b. Le emazie sensibilizzate dal C3b aderiscono alle cellule fagocitiche, ma sono relativamente inefficaci nellattivare la fagocitosi. Gli enzimi possono scindere i frammenti C3b del complemento fissati sulla membrana eritrocitaria, lasciando sulla cellula un piccolo frammento (C3dg). I globuli rossi sensibilizzati dal C3dg
sopravvivono normalmente, perch le cellule fagocitiche non possiedono recettori per questo frammento. Se lanticorpo IgG presente sulleritrocita, avverr ladesione ai recettori Fc, determinando la fagocitosi. Se sia lIgG che il C3b sono adesi al globulo rosso, leliminazione delle cellule pu aumentare, probabilmente a causa dellattivit chemiotattica esercitata dal C3b e per la sua capacit di adesione. Anticorpi per uso diagnostico Gli anticorpi eterogenei non sono dei reagenti ideali per un loro uso in sierologia, perch possono variare nella concentrazione, nelle caratteristiche sierologiche, nel riconoscimento degli epitopi dellantigene e contenere altri anticorpi contaminanti di specificit indesiderata. Il siero ottimale per gli esami sierologici una
Lisi eritrocitaria
Emolisi intravascolare
Emolisi extravascolare
C1C9
C3b*
IgG e C3Bg

IgG
Hb libera nel plasma aptoglobina emoglobinuria matemalbumina
Aderenza alle Chemiotassi cellule fagocitiche (fagocitosi minima) Aderenza Conversione a C3d Normale sopravvivenza

Legame al recettore Fc sui fagociti
Fagocitosi bilirubina aumentata frammenti cellulari possono essere presenti alcuni indicatori di emolisi intravascolare
* Mediatore inefficace di fagocitosi g Per lattivit chemiotattica del C3b la distruzione extravascolare pu essere incrementata quando IgG e C3b sono presenti sugli eritrociti
Figura 11.6 - Diagramma che illustra il principale meccanismo di alloimmunizzazione HLA, determinata dalla presenza dei leucociti nelle trasfusioni piastriniche (da Heddle1, riproduzione autorizzata).
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sospensione concentrata di immunoglobuline altamente specifiche, ben caratterizzate e uniformemente reattive. Prima del 1970, lunico modo per ottenere anticorpi per uso diagnostico era di immunizzare uomini o animali con antigeni purificati per poi eseguire lunghe e talora imprevedibili tecniche di separazione allo scopo di purificare i sieri ottenuti. La produzione di anticorpi monoclonali ha reso disponibile un mezzo alternativo allorigine umana ed animale di queste proteine. Usando tale approccio, un clone ottenuto da una singola cellula B viene moltiplicato in una coltura cellulare; in questo modo, il fluido sopranatante della coltura contiene un anticorpo con ununica specificit. Tuttavia, ci sono dei problemi con questo approccio. I normali linfociti B si riproducono per un numero limitato di volte; di conseguenza, le linee di coltura cellulare sopravvivono solo per un breve periodo. Nel 1976, Khler e Milstein 21 trovarono la soluzione al problema. Le capacit delle plasmacellule di un normale produttore di anticorpi vennero fuse allillimitata capacit riproduttiva di plasmacellule neoplastiche (cellule mielomatose). Le tecniche precedentemente sviluppate che consentivano alle membrane cellulari di unirsi, permisero ai citoplasmi ed ai nuclei dei due diversi tipi di cellule di fondersi in ununica cellula. Questi ibridi plasmacellula/cellula mielomatosa possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi, producendo grandi quantit di un singolo anticorpo selezionato. La raffinata specificit di un anticorpo monoclonale costituisce, al tempo stesso, sia un vantaggio che uno svantaggio per luso diagnostico. Un anticorpo che fornisce forti e specifiche reazioni con un singolo epitopo di una molecola antigenica multivalente, pu non reagire con quelle cellule che presentano unespressione antigenica priva di questa particolare configurazione. Perci, nella preparazione dei reattivi comunemente utilizzati nei laboratori vengono fatte delle miscele di diversi prodotti monoclonali, in modo da incrementare lambito delle varianti fenotipiche che il siero diagnostico in grado di identificare.
Preparazioni monoclonali, singole o miscelate, reagiscono spesso con maggiore intensit di un preparato ottenuto da un siero immune, quando sono cimentate con cellule che presentano degli antigeni debolmente espressi. La tecnologia che utilizza i fagi virali attualmente in fase di studio come approccio per la produzione di anticorpi geneticamente ingegnerizzati, utili per un certo numero di trattamenti terapeutici 22 ed anche per la produzione di reattivi diagnostici tipizzanti23.
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Appendice 11.1 - Definizioni di alcuni termini essenziali in immunologia

Allotipico Variazioni nella struttura amminoacidica delle catene leggere e pesanti, non correlate con la specificit anticorpale. Presente in alcuni ma non tutti i membri delle diverse specie. Anticorpo Immunoglobulina secreta dalle plasmacellule originate dai linfociti B, dopo la stimolazione con uno specifico immunogeno. Le molecole immunoglobuliniche presenti sulla superficie di un linfocita non stimolato assolvono la funzione di recettori antigenici. Antigene Ogni materiale capace di una specifica combinazione con un anticorpo o con i recettori cellulari di superficie dei linfociti T. Spesso viene usato come sinonimo di immunogeno, tuttavia alcuni antigeni che sono in grado di reagire con i prodotti della risposta immunitaria non sono in grado di evocarla. Cellule che Una cellula in grado di incorporare gli epitopi dellantigene nelle molecole MHC di presentano lantigene Classe II e di esporre il complesso epitopo-MHC sulla propria membrana. Citochina Una proteina a basso peso molecolare, secreta da una cellula attivata, che influisce sulle funzioni o sullattivit delle altre cellule. Clone Una popolazione di cellule geneticamente identiche, originate dalle successive divisioni di una singola cellula progenitrice. Epitopo La piccola porzione di un immunogeno, solitamente costituito da 5-15 amminoacidi o 3-5 glicosidi, che si combina specificamente con i recettori antigenici di un linfocita T o B. Fagocitosi Processo col quale i macrofagi e i granulociti inglobano materiale corpuscolato presente nellambiente circostante e lo sottopongono a trasformazioni intracellulari. Idiotipo La configurazione molecolare unica che posta nella porzione variabile di una molecola legante lantigene e riflette la ricombinazione del DNA che avviene nelle fasi iniziali del differenziamento linfocitario, conferendo alla cellula la sua specificit nel riconoscimento dellantigene. Immunogeno Un materiale in grado di evocare la risposta immune quando viene introdotto in un ospite immunocompetente a lui estraneo Ligando Una molecola, sia libera in un mezzo fluido, oppure presente su una membrana, la cui conformazione tridimensionale le consente di formare un complesso strettamente aderente ad una molecola della superficie cellulare (il suo recettore) di forma complementare. Molecola di adesione Ognuna delle numerose molecole di membrana espresse sui leucociti e sulle cellule endoteliali, che permettono alle cellule di venire in stretto contatto tra loro. Molecole MHC Proteine eterodimeriche di membrana determinate da geni MHC, costituite da una di Classe I catena altamente polimorfica, legata in modo non covalente alla catena non polimorfica della 2-microglobulina; queste molecole presentano lantigene ai linfociti T CD8+ e sono il sito degli antigeni HLA delle serie HLA-A, HLA-B e HLA-C.
(segue)
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Molecole MHC di Classe II
Recettore
Sistema immunitario
Proteine eterodimeriche di membrana determinate da geni MHC, costituite da due catene polipeptidiche transmembrana; queste molecole presentano lantigene ai linfociti T CD4+ ed espongono le serie degli antigeni HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR. Molecola proteica presente su una membrana cellulare, la cui conformazione tridimensionale le consente di formare, con unaltra molecola (detta il suo ligando), un complesso di forma complementare, strettamente aderente. Un termine collettivo per tutte le cellule ed i tessuti coinvolti nellattivit immunitaria. Comprende, oltre ai linfociti e alle cellule della linea monocitica/macrofagica, il timo, i linfonodi, la milza, il midollo ematopoietico, parti del fegato ed i tessuti linfoidi associati alle mucose.
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Capitolo 12: Le reazioni antigene-anticorpo dei globuli rossi e la loro rilevazione
Capitolo 12
Le reazioni antigene-anticorpo dei globuli rossi e la loro rilevazione
Il rilievo delle reazioni antigene-anticorpo il punto chiave dellimmunoematologia. La combinazione tra lantigene e lanticorpo pu produrre una variet di risultati osservabili. Nella sierologia dei gruppi sanguigni, le reazioni pi comunemente osservate sono lagglutinazione, lemolisi e la precipitazione. Lagglutinazione consiste nellaggregazione, mediata dagli anticorpi, di particelle che presentano il relativo antigene sulla loro superficie. Lagglutinazione dei globuli rossi avviene perch le molecole degli anticorpi si legano ai determinanti antigenici di globuli rossi diversi ma adiacenti, legandoli tra loro fino a formare un aggregato visibile. Lagglutinazione il risultato finale della maggior parte degli esami che riguardano le emazie e gli anticorpi gruppoematici ed il principale tipo di reazione che viene discusso in questo capitolo. In alcuni test, lanticorpo colma direttamente la distanza tra gli eritrociti adiacenti; in altri, le molecole anticorpali si legano agli eritrociti ma non li agglutinano, e si rende necessaria una fase aggiuntiva per indurre unagglutinazione visibile o misurare in altro modo la reazione. Lemolisi consiste nella rottura delle emazie con il conseguente rilascio dellemoglobina intracellulare. In vitro lemolisi anticorpo-mediata dipende dallattivit dellunit di attacco alla membrana del complemento. Lemolisi non si verifica se lantigene e lanticorpo interagiscono in un siero che manca di complemento o nel plasma nel quale lanticoagulante ha chelato i cationi (calcio e magnesio) necessari per
lattivazione del complemento. Nei test per il rilievo degli anticorpi anti-eritrocitari, lemolisi un risultato positivo perch dimostra lunione dellantigene con lanticorpo con lattivazione della cascata complementare. (Le azioni del complemento sono descritte nel Capitolo 11.) Un sopranatante rosato o rosso, in un test con il siero e gli eritrociti, unosservazione importante che pu indicare lavvenuta reazione tra lantigene e lanticorpo. Alcuni anticorpi che sono emolitici in vitro (per esempio, anti-Vel, anti-Lea e anti-Jka) possono causare unemolisi intravascolare nel ricevente trasfuso. La precipitazione consiste nella formazione di un complesso insolubile, solitamente visibile, che viene originato dalla reazione di un anticorpo solubile con un antigene solubile. Questi complessi sono osservati nei test in provetta come un sedimento o un anello, e come una linea bianca nei gel di agar. La precipitazione il risultato finale di procedure quali limmunodiffusione o limmunoelettroforesi. La precipitazione pu non verificarsi anche quando un antigene solubile ed il suo anticorpo specifico sono presenti. La precipitazione del complesso antigene-anticorpo richiede che sia lantigene che lanticorpo siano presenti in proporzioni ottimali. Se lanticorpo presente in eccesso, restano disponibili troppo pochi siti antigenici per legare a ponte le molecole e la struttura reticolare non viene formata. Il complesso antigene-anticorpo si forma ma non si accumula in quantit sufficiente per produrre un reticolo visibile. Questo fenomeno viene definito prozona.
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La combinazione tra un antigene e un anticorpo solubili pu anche provocare una parziale o completa neutralizzazione dellanticorpo. Sebbene un precipitato visibile spesso non venga prodotto, una tale inibizione pu essere utile nelle procedure di identificazione anticorpale eliminando selettivamente degli anticorpi specifici.
Fattori che influiscono sullagglutinazione eritrocitaria

Lagglutinazione una reazione chimica reversibile che si ritiene avvenga in due fasi: 1) sensibilizzazione, lattacco dellanticorpo allantigene sulla membrana eritrocitaria; e 2) la formazione dei ponti tra gli eritrociti sensibilizzati per creare il reticolo che costituisce lagglutinazione. Diversi elementi agiscono su queste due fasi e possono essere modificati per potenziare (o ridurre) lagglutinazione. Gli effetti sulle due fasi delle tecniche di potenziamento non possono essere sempre chiaramente differenziati1. Prima fase: la sensibilizzazione Inizialmente lantigene e lanticorpo devono avvicinarsi e interagire in unidonea relazione spaziale. Le probabilit di legame tra lanticorpo e lantigene possono essere incrementate in molti modi, come per esempio con lagitazione o la centrifugazione, oppure modificando le concentrazioni relative dellanticorpo e dellantigene. Come viene mostrato nella Figura 12.1, lanticorpo e lantigene devono adattarsi luno allaltro in modo complementare sia per dal punto di vista strutturale (sterico), sia chimico. Affinch avvenga la sensibilizzazione, si deve formare un legame chimico non covalente tra lantigene e lanticorpo. Le forze che tengono uniti antigeni e anticorpi sono generalmente deboli (se confrontate con i legami covalenti che uniscono le molecole) e sono attive solo a brevissima distanza. Il legame antigene-anticorpo reversibile e legami casuali si creano e si spezzano costantemente, fino a quando non si raggiunge uno stato di equilibrio. Figura 12.1 - Grado di conformit fra antigene e anticorpo. Per la massima complementariet, devono essere presenti sia la conformit strutturale che la distribuzione complementare dei gruppi chimici. (A) Buona conformit strutturale con attrazione chimica complementare. (B) I gruppi chimici sono complementari, ma la conformit strutturale insufficiente. (C) Buona conformit strutturale, ma i gruppi chimici e possono respingersi. (Da Moore2, riproduzione autorizzata.)
I legami chimici Diversi tipi di legami chimici sono coinvolti nellunione tra lantigene e lanticorpo; essi comprendono: i legami idrogeno, i legami idrofobici, i legami elettrostatici o ionici e le forze di Van der Waals. Questi tipi di legami chimici sono rilevanti per un immunoematologo perch i differenti tipi di legame hanno differenti caratteristiche termodinamiche; essi possono essere esotermici o endotermici. Le caratteristiche termodinamiche possono quindi, a loro volta, alterare i fenomeni sierologici rilevati in un test. Per esempio, gli antigeni glicidici tendono a formare dei legami idrogeno esotermici con il sito legante dellanticorpo, sicch i legami sono pi forti alle basse temperature. Al contrario, i legami idrofobici che si formano con gli antigeni proteici sono endotermici, pertanto questi legami sono pi forti a temperature di reazione pi elevate. La costante di equilibrio (affinit) dellanticorpo La costante di equilibrio o costante di affinit (Ko) di una reazione determinata dalle velocit relative di associazione e di dissociazione (vedi
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Figura 12.2). Per ogni reazione antigene-anticorpo la Ko varia. La Ko riflette il grado con il quale un anticorpo e un antigene si associano e si legano uno allaltro (grado di conformit) e la velocit della reazione. Quanto pi elevato il valore di Ko, tanto migliore lassociazione o conformit. Quando la Ko elevata, la reazione avviene pi rapidamente ed dissociabile con pi difficolt; tali anticorpi possono avere una maggiore importanza clinica. Quando Ko piccola, una proporzione pi elevata di anticorpo, rispetto allantigene, pu essere necessaria perch sia rilevato. Il grado di conformit fra antigene e anticorpo influenzato dal tipo di legami predominanti.
sospensione, oltre alle concentrazioni relative di antigene ed anticorpo. Nei test di laboratorio che utilizzano come risultato finale lagglutinazione, la modifica delle condizioni fisiche del sistema pu incrementare o ridurre la sensibilit. La temperatura La maggior parte degli anticorpi gruppoematici reagisce in un ambito ristretto di temperatura. Tipicamente, questi anticorpi si collocano in due categorie generali: quelli che reagiscono in maniera ottimale a temperature fredde (per esempio da 4 a 25 C) e quelli che reagiscono in maniera ottimale a temperature calde (per esempio da 30 a 37 C). Gli anticorpi che reagiscono in vitro solo a temperature inferiori ai 30 C raramente provocano la distruzione di emazie trasfuse antigene-positive e sono generalmente considerati clinicamente non significativi. Molti di questi anticorpi reattivi a freddo sono risultati essere di classe IgM, mentre i loro equivalenti reattivi a caldo sono stati trovati, nella maggior parte dei casi, essere IgG. Questo ha portato allerrata conclusione di molti che sia la classe anticorpale che determina la temperatura di reazione dellanticorpo (ed il suo significato clinico). Al contrario, la temperatura ottimale della reazione antigene-anticorpo ha molto pi a che vedere con il tipo di reazione e con la natura chimica dellantigene che con la classe dellanticorpo coinvolto. Gli antigeni glicidici sono con maggiore frequenza associati con gli anticorpi freddi e gli antigeni proteici con gli anticorpi caldi. Il pH I cambiamenti del pH possono influenzare i legami elettrostatici. Per la maggior parte degli anticorpi gruppoematici clinicamente significativi, non stato stabilito quale sia il pH ottimale ma si presume che sia approssimativamente quello dellambito fisiologico. Anticorpi occasionali, eminentemente alcuni esemplari di anticorpi antiM, reagiscono meglio a pH pi bassi. Per la maggior parte dei test di routine, andrebbe utilizzato un pH attorno a 7.0.
Tutte le reazioni chimiche sono reversibili. Le reazioni antigene-anticorpo possono essere espresse come Ag+Ab AgAb
La reazione procede fino a quando uno stato di equilibrio non viene raggiunto. Questo controllato dalle costanti di velocit di associazione (Ka) e di dissociazione (Kd). Ag+Ab
ka kd
AgAb
Per la legge di azione delle masse, la velocit della reazione proporzionale alla concentrazione dei reagenti e dei loro prodotti. La costante di equilibrio (Ko) una funzione di queste costanti di associazione intrinseche per lanticorpo esaminato. [AbAg] [AbAg] = ka kd = Ko
Figura 12.2 - La legge di azione delle masse e la costante di equilibrio I legami idrofobici sono solitamente associati a valori pi elevati di Ko rispetto ai legami idrogeno. La Ko inoltre influenzata dalle condizioni fisiche come la temperatura alla quale avviene la reazione, il pH e la forza ionica del mezzo di
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La soluzione salina conservata ha spesso un pH da 5.0 a 6.0. La soluzione salina tamponata unalternativa che pu essere particolarmente utile nei test in fase solida3. Il tempo di incubazione Il tempo necessario per raggiungere lequilibrio diverso per i diversi anticorpi gruppoematici. Variabili significative comprendono: i requisiti di temperatura, la classe immunoglobulinica e le specifiche interazioni tra la configurazione dellantigene e i siti Fab dellanticorpo. Laggiunta al sistema di agenti potenzianti pu ridurre il tempo di incubazione necessario per raggiungere lequilibrio. Per un sistema in soluzione salina, nel quale viene utilizzato un siero antiglobuline per dimostrare ladesione di un anticorpo, un tempo di incubazione dai 30 ai 60 minuti a 37 C adeguato per evidenziare la maggior parte degli anticorpi clinicamente significativi. Per alcuni anticorpi, debolmente reattivi, lassociazione antigene-anticorpo pu non raggiungere lequilibrio a 30 minuti ed estendendo il tempo di incubazione si pu aumentare la sensibilit del test. Lallungamento del tempo di incubazione oltre ai 60 minuti presenta pochi svantaggi tranne il ritardo nella disponibilit dei risultati. Il tempo di incubazione a 37 C pu essere di solito ridotto a 10-15 minuti se viene utilizzata una soluzione salina a bassa forza ionica (LISS) (incluse le soluzioni LISS additive). Luso di polimeri solubili in acqua, come il polietilenglicole (PEG), pu pure ridurre il tempo necessario di incubazione, anche se per ragioni diverse (vedi la sezione relativa al Potenziamento della rilevazione degli anticorpi e la sezione 3 dei Metodi). La forza ionica In una normale soluzione salina, gli ioni Na+ e Cl si raggruppano attorno e neutralizzano parzialmente, le cariche opposte presenti sulle molecole degli antigeni e degli anticorpi. Questo intralcia lassociazione degli anticorpi con gli antigeni. Abbassando la forza ionica del mezzo di reazione, tuttavia, questo effetto di scudo pu
essere indebolito e lattrazione elettrostatica incrementata. Riducendo la concentrazione salina del sistema siero-cellule, viene incrementata la velocit alla quale lanticorpo e lantigene si pongono in prossimit e pu essere aumentata la quantit di anticorpo legato. Il prolungamento del tempo di incubazione in un sistema LISS pu causare una perdita di sensibilit4 (vedi la sezione sul LISS e gli additivi LISS). Le proporzioni di antigene e anticorpo Un eccesso di antigene rispetto allanticorpo dovrebbe determinare un incremento della quantit di anticorpo adeso. Per i test di inibizione o di assorbimento, tale eccesso di antigene auspicabile. Tuttavia, per la maggior parte dei test sui globuli rossi, un eccesso di antigene riduce il numero di molecole anticorpali fissate ad ogni eritrocita, limitando la loro capacit di agglutinare. Un eccesso di anticorpi preferibile, per questo motivo, nella maggior parte dei test di routine. Una proporzione comunemente utilizzata nella sierologia dei globuli rossi di 2 gocce di siero con 1 goccia di una sospensione dal 2% al 5% di emazie. Se lanticorpo debolmente reattivo, laumento della quantit di anticorpo pu incrementare la sensibilit del test. Molto raramente, un significativo eccesso di anticorpo pu arrivare ad inibire lagglutinazione diretta, producendo un fenomeno di prozona comparabile a quello che si verifica con le reazioni di precipitazione. Tuttavia, di solito lincremento della concentrazione anticorpale aumenta la sensibilit dei test di agglutinazione. Riducendo la concentrazione delle emazie dal 5 al 2% o 3% viene raddoppiato il rapporto siero/emazie, come pure avviene aggiungendo 4 gocce di siero ad una sospensione cellulare standard. Qualche volta utile incrementare il volume del siero a 10 o anche a 20 gocce, specialmente durante le indagini per una reazione trasfusionale emolitica ove i test di routine non evidenziano alcun anticorpo. Le variazioni del volume di siero o plasma alterano significativamente la forza ionica, nei sistemi di reazione nei quali il LISS ha ridotto la costante dielettrica; perci la procedura deve essere modificata in modo che un
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appropriato rapporto tra il siero ed il LISS venga mantenuto. I Capitoli 18 e 19 forniscono maggiori particolari relativi al rilievo degli anticorpi ed ai test pre-trasfusionali. Seconda fase: lagglutinazione Dopo che le molecole anticorpali hanno aderito alla superficie del globulo rosso, le cellule sensibilizzate devono essere legate in un reticolo. Questo permette la visualizzazione della reazione. La dimensione e le propriet fisiche delle molecole anticorpali, la concentrazione dei siti antigenici su ogni cellula e la distanza tra le cellule influenzano tutte lo sviluppo degli agglutinati. I ponti formati tra anticorpi legati a siti antigenici posti su emazie adiacenti di solito si producono per la collisione casuale tra le emazie sensibilizzate. In condizioni isotoniche, gli eritrociti non possono avvicinarsi ad una distanza inferiore a 50-100 1. Le molecole IgG tipicamente non riescono a colmare questa distanza tra le emazie e determinano la sensibilizzazione senza formare il reticolo. Tuttavia, con le grandi molecole multivalenti di classe IgM, lagglutinazione diretta si verifica facilmente. La localizzazione e la densit dei siti antigenici sugli eritrociti pu consentire anche ad alcuni anticorpi di classe IgG di produrre lagglutinazione diretta; gli antigeni A, B, M e N, per esempio, sono posti sul margine esterno delle glicoproteine eritrocitarie ed hanno una densit relativamente elevata, permettendo agli anticorpi di classe IgG di formarsi un ponte. Le emazie sospese in una soluzione salina hanno una carica netta di superficie elettronegativa e di conseguenza si respingono tra loro. Le molecole elettronegative poste sulla membrana cellulare provocano la reciproca repulsione. Questa repulsione pu essere ridotta in laboratorio con diversi artifici tecnici o a causa di caratteristiche intrinseche o alterate della membrana cellulare. Vengono utilizzate diverse strategie per superare questa repulsione ed aumentare lagglutinazione. La centrifugazione forza fisicamente le cellule ad avvicinarsi fra loro. Il test allantiglobulina indiretto(TAI) utilizza un siero antiglobuline per fare da ponte alle reazione. Altri
metodi prevedono la riduzione della carica elettronegativa delle molecole di superficie (per esempio gli enzimi proteolitici), la riduzione dello strato di idratazione attorno alle emazie (per esempio albumina) o lintroduzione di macromolecole cariche positivamente (per esempio Polibrene) che aggregano le cellule1. Linibizione dellagglutinazione Nei test di inibizione dellagglutinazione la presenza dellantigene o dellanticorpo, viene rilevata dalla sua capacit di inibire lagglutinazione in un sistema con reagenti noti (vedi Capitolo 19). Per esempio, la saliva di un secretore contiene degli antigeni gruppoematici solubili che reagiscono con gli anticorpi anti-A,-B o -H. Il sistema rivelatore costituito da una diluizione standardizzata di anticorpo che agglutina le cellule corrispondenti con una determinata intensit di reazione. Se la saliva contiene la sostanza gruppospecifica, preincubando la saliva con lanticorpo, lagglutinazione delle cellule aggiunte alla miscela incubata sar completamente o parzialmente abolita. La mancanza dellattesa agglutinazione indica la presenza dellantigene solubile nel materiale in esame. Lagglutinazione delle cellule rivelatrici indica un risultato negativo.
Il potenziamento della rilevazione degli anticorpi

Gli additivi albuminici Bench sia stata utilizzata nella routine per molti anni come mezzo potenziante, lalbumina in se stessa probabilmente fa ben poco per promuovere ladesione dellanticorpo (Fase 1). Molto delleffetto potenziante attribuito allalbumina pu essere dovuto alla sua caratteristica di tampone a bassa forza ionica. Lalbumina pu influenzare lagglutinazione riducendo la repulsione tra le cellule, predisponendo in tal modo le cellule sensibilizzate allagglutinazione. La sieroalbumina bovina disponibile in concentrazioni del 22% o del 30%.
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Gli enzimi Gli enzimi proteolitici comunemente utilizzati nei laboratori di immunoematologia sono la bromelina, la ficina, la papaina e la tripsina. Questi enzimi incrementano lagglutinazione con alcuni anticorpi ma distruggono altri antigeni eritrocitari, in particolare M, N, S, Fya e Fyb. Gli enzimi proteolitici riducono la carica di superficie eritrocitaria staccando dalle catene polisaccaridiche dei polipeptidi che contengono molecole di acido sialico cariche elettronegativamente. Lacido sialico il principale responsabile della carica elettronegativa presente sulla superficie delle emazie. Ogni meccanismo che riduca la carica netta dovrebbe potenziare lagglutinazione dei globuli rossi e le emazie pretrattate con gli enzimi proteolitici spesso mostrano unaumentata agglutinazione da parte delle molecole di IgG. Il polietilenglicole Il polietilenglicole (PEG) un polimero lineare solubile in acqua utilizzato come additivo per potenziare le reazioni antigene-anticorpo5. Si ritiene che il PEG promuova ladesione anticorpale mediante lesclusione sterica delle molecole dacqua del diluente, in modo che le molecole anticorpali e lantigene possano porsi in stretta prossimit, determinando un aumento delle collisioni anticorpo-cellula con conseguente legame dellanticorpo. Diversi studi hanno evidenziato che il PEG aumenta la rilevazione degli anticorpi potenzialmente clinicamente significativi mentre riduce la rilevazione degli anticorpi non clinicamente significativi6. Lanti-IgG solitamente il reattivo antiglobuline umane utilizzato nei test con il PEG, per evitare delle false reazioni positive che si verificano con alcuni reattivi antiglobulinici polispecifici. I reattivi commerciali con il PEG possono essere preparati in una soluzione LISS. Il PEG pu essere utilizzato in test sia con eluati, sia con siero o plasma. Il PEG pu potenziare la reattivit degli autoanticorpi caldi e pu quindi essere vantaggioso nella ricerca di deboli autoanticorpi per fini diagnostici. Daltra parte, questo potenziamento pu essere svantaggioso quando si cerca di rilevare alloanticorpi in
presenza di autoanticorpi. In tali casi analizzare il siero con il LISS o con un test antiglobulinico in soluzione salina, pu portare allindividuazione o allesclusione della presenza di alloanticorpi senza linterferenza degli autoanticorpi. La centrifugazione del PEG con siero ed emazie prima del lavaggio dovrebbe essere omessa, poich gli aggregati aspecifici causati dal PEG possono non disperdersi. Dopo lincubazione con il PEG, le emazie test devono essere subito lavate in soluzione salina per il test allantiglobulina. stata riportata la precipitazione delle proteine sieriche dopo laggiunta del PEG; questo problema sembra essere correlato ad un elevato livello sierico delle globuline6. Questo problema diventa evidente quando le emazie rivestite di IgG non sono reattive. Almeno quattro lavaggi degli eritrociti nella fase antiglobulinica, con agitazione, assicureranno che le emazie siano completamente risospese e servir ad evitare che questo problema si verifichi. Il LISS e gli additivi LISS Il LISS (circa 0,03 M) incrementa notevolmente la velocit di sensibilizzazione degli eritrociti con gli anticorpi, se confrontata con la normale soluzione salina isotonica (0,17 M). Per prevenire lemolisi degli eritrociti ad una forza ionica cos bassa, una sostanza non ionica come la glicina viene incorporata nel LISS. La maggior parte dei laboratori usa un reagente LISS additivo invece del vero e proprio LISS. Questi additivi LISS commerciali possono contenere dellalbumina oltre a sali ionici e a tamponi. Le soluzioni LISS aumentano la velocit di associazione (Fase 1) quando le proporzioni dei volumi sono corrette (vedi Metodi 3.2.2 e 3.2.3). Aumentando il volume di siero in un test aumenta la forza ionica; quindi, ogni variazione nei volumi prescritti di siero richiede un aggiustamento del volume di LISS o lomissione del LISS. Per questa ragione, luso del LISS per le titolazioni di routine ed alcuni altri test problematico. Quando il LISS viene utilizzato come reagente additivo, devono essere seguite le istruzioni del produttore.
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Il test allantiglobulina
Nel 1945, Coombs, Mourant e Race 7 descrissero delle procedure per evidenziare gli anticorpi che non producevano agglutinazione. Questo test utilizza un anticorpo contro le globuline umane ed conosciuto come il test allantiglobulina. Esso venne inizialmente usato per dimostrare la presenza di un anticorpo nel siero, ma successivamente lo stesso principio venne utilizzato per rilevare ladesione in vivo agli eritrociti di anticorpi o componenti del complemento. Per le applicazioni in immunoematologia, i test allantiglobulina producono delle agglutinazioni visibili delle emazie sensibilizzate. Il test allantiglobulina diretto (TAD) viene usato per dimostrare la sensibilizzazione in vivo dei globuli rossi. Il test allantiglobulina indiretto (TAI) viene utilizzato per rilevare in vitro le reazioni tra gli eritrociti e gli anticorpi che sensibilizzano, ma non agglutinano, le cellule che esprimono lantigene corrispondente. I principi del test allantiglobulina Tutte le molecole anticorpali sono globuline. Un animale inoculato con globuline umane produce anticorpi contro le proteine estranee. Dopo che il siero animale stato assorbito per eliminare le agglutinine non desiderate, esso reagir specificamente con le globuline umane e potr essere definito come un siero AHG (Anti-Human Globulin). Possono essere prodotti sieri AHG con diverse specificit, in particolare anti-IgG ed anticorpi contro diverse componenti del complemento. Le tecniche con ibridomi sono utilizzate per la produzione della maggior parte dei sieri AHG. Queste tecniche sono descritte pi dettagliatamente nel Capitolo 11. Lanti-IgG si lega principalmente alla porzione Fc delle molecole dellanticorpo sensibilizzante, non con epitopi nativi del globulo rosso (vedi Figura 12.3). I due siti Fab della molecola di AHG formano un ponte tra cellule adiacenti rivestite di anticorpi per produrre unagglutinazione visibile. Le cellule che non hanno globuline adese non saranno agglutinate.
Lintensit dellagglutinazione rilevata solitamente proporzionale alla quantit di globuline legate. Il siero AHG reagir con anticorpi umani e molecole del complemento che sono fissate sui globuli rossi o sono presenti, libere, nel siero. Le globuline non legate possono reagire con il siero AHG, determinando false reazioni negative nei test allantiglobulina. A meno che, prima dellaggiunta del siero AHG, i globuli rossi non vengano lavati liberandoli dalle proteine non fissate, le globuline non legate possono neutralizzare il siero AHG e causare un risultato falsamente negativo.
Figura 12.3 - La reazione allantiglobulina. Le molecole anti-IgG umane sono mostrate mentre reagiscono con la porzione Fc di IgG umane che rivestono globuli rossi adiacenti (per esempio, antiD legato a globuli rossi D positivi). Il test allantiglobulina diretto Il TAD viene utilizzato per dimostrare il legame in vivo dei globuli rossi con anticorpi o complemento, in particolare IgG e C3d. Le emazie lavate di un paziente o di un donatore sono esaminate direttamente con reattivi AHG (vedi Metodo 3.6). Il TAD usato nelle indagini sullanemia emolitica autoimmune (AIHA), lemolisi indotta da farmaci, la malattia emolitica del feto e del neonato e nelle reazioni alloimmuni contro emazie recentemente trasfuse.
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Il test allantiglobulina indiretto Nelle procedure dei test allantiglobulina indiretti, il siero (o il plasma) incubato con globuli rossi, che sono successivamente lavati per rimuovere le globuline non adese. Lagglutinazione che si verifica quando si aggiunge il siero AHG indica che lanticorpo si legato ad uno specifico antigene, presente sugli eritrociti. La specificit dellanticorpo pu essere nota e lantigene ignoto, come nella fenotipizzazione antigenica eritrocitaria con un reattivo che richieda luso di un siero AHG quale lanti-Fya. La presenza o la specificit di un anticorpo pu essere ignota, come nei test di ricerca ed identificazione anticorpale. Oppure, in altre applicazioni come la prova crociata, sia il siero che le cellule sono sconosciute. Questa procedura viene usata per determinare se avvenuta una qualunque interazione tra gli antigeni e gli anticorpi. Sono stati sviluppati dei metodi che evitano la necessit di lavare le emazie sensibilizzate prima dellaggiunta del reattivo antiglobulinico. La tecnologia di agglutinazione su microcolonna, descritta successivamente in questo capitolo, un esempio. Essa utilizza una microcolonna riempita con una miscela di sferette di vetro o di gel con un tampone e dei reagenti, che pu essere utilizzata nelle procedure antiglobuliniche dirette o indirette. Le barriere di densit causano la separazione del siero (o plasma) in esame dai globuli rossi, rendendo inutile la fase di lavaggio in soluzione salina. I reattivi antiglobulinici Anticorpi monospecifici per le globuline umane possono essere preparati iniettando gli animali con IgG, IgA, IgM, C3 o C4 purificati. Questi sieri richiedono successivamente lassorbimento per rimuovere tutti gli anticorpi indesiderati (per esempio gli eterofili) dal reattivo AHG monospecifico. Questi antisieri prodotti in animali sono per natura policlonali. Reattivi monospecifici monoclonali possono anche essere preparati efficacemente da ibridomi (vedi Capitolo 11). Gli anticorpi monospecifici prodotti da animali o da ibridomi possono essere miscelati in preparazioni di reattivi
contenenti ogni combinazione desiderata di specificit, oppure cloni diversi in grado di riconoscere la stessa specificit antigenica possono essere riuniti in un singolo reattivo. In questo modo, i reagenti possono essere policlonali, monoclonali, miscele di monoclonali o miscele di anticorpi monoclonali e policlonali. La Food and Drug Administration (FDA) ha stabilito delle definizioni per un certo numero di reattivi AHG8, come viene mostrato nella Tabella 12.1. Antisieri specifici per altre immunoglobuline (IgA, IgM) o sottoclassi (IgG1, IgG3, etc.) esistono, ma raramente sono standardizzati per i metodi di routine in provetta e devono quindi essere utilizzati con controlli rigorosi. AHG polispecifici I reattivi AHG polispecifici sono utilizzati per i TAD e, in alcuni laboratori, per i test di compatibilit e per la ricerca degli anticorpi in routine. Questi reattivi contengono anticorpi per le IgG umane e per la componente C3 del complemento umano. Altri anticorpi contro il complemento possono essere presenti, inclusi lanti-C3b, -C4b e -C4d. I sieri antiglobuline polispecifici preparati commercialmente, correntemente reperibili, hanno unattivit assente o debole contro le catene pesanti di IgA ed IgM. Tuttavia, alcuni reattivi possono reagire con molecole di IgA o IgM perch la miscela polispecifica pu presentare una reattivit con le catene leggere lambda e kappa, che sono presenti nelle immunoglobuline di tutte le classi. Poich la maggior parte degli anticorpi clinicamente significativi sono IgG, la funzione fondamentale dei sieri AHG polispecifici, nella maggior parte delle procedure, quella di evidenziare le IgG. La componente anti-complemento ha una limitata utilit nelle prove crociate e nella ricerca degli anticorpi perch gli anticorpi rilevabili solo per la loro capacit di fissare il complemento sono veramente rari. Lattivit anti-C3d tuttavia importante nel TAD, specialmente nelle indagini sullAIHA. In qualche paziente con AIHA, il C3d pu essere lunica globulina rilevabile sui globuli rossi9.
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Reattivi AHG monospecifici I reattivi AHG monospecifici approvati e di uso comune sono lanti-IgG e lanti-C3b e -C3d. La FDA ha stabilito dei requisiti di etichettatura per gli altri reattivi anticomplemento, inclusi lanti-C3b, lanti-C4b e lanti-C4d, ma questi prodotti non sono generalmente disponibili. Se il TAD con un reattivo polispecifico evidenzia delle globuline adese agli eritrociti, sono utilizzati reattivi monospecifici per caratterizzare le proteine legate. Anti-IgG I reattivi etichettati come anti-IgG non contengono alcuna attivit anticomplemento. La componente prevalente dellanti-IgG lanticorpo specifico per le catene pesanti gamma Tabella 12.1 - Reattivi antiglobuline umane Designazione dellanticorpo sulletichetta del contenitore (1) Anti-IgG, -C3d; Polispecifico (2) Anti-IgG (3) Anti-IgG; catene pesanti (4) Anti-C3b
umane, ma a meno che non siano etichettati come specifico per le catene pesanti, questi reagenti possono presentare qualche reattivit per le catene leggere che sono comuni per tutte le classi immunoglobuliniche. Un reattivo anti-IgG, che non sia contrassegnato come specifico per le catene pesanti, deve essere considerato teoricamente capace di reagire con le catene leggere delle IgA o delle IgM. Un TAD positivo con un tale anti-IgG non dimostra in modo definitivo la presenza di IgG, bench sia molto rara unadesione in vivo di IgA o IgM in assenza di IgG. Molti operatori preferiscono lanti-IgG al posto dellAHG polispecifico nei test di ricerca anticorpi e di compatibilit, perch il siero AHG anti-IgG non reagisce con il complemento
Definizione*
Contiene anti-IgG e anti-C3d (pu contenere altri anticorpi anti-complemento anti-immunoglobuline) Contiene anti-IgG senza attivit anticomplemento (non necessariamente specifici per la catena gamma) Contiene solo anticorpi reattivi contro le catene gamma umane Contiene solo anticorpi anti-C3b senza attivit anti-immunoglobuline. Nota: Lanticorpo prodotto in risposta allimmunizzazione di solito diretto contro il determinante antigenico situato nella subunit C3; alcuni hanno chiamato tale anticorpo anti-C3c. Sulla etichetta questo anticorpo dovrebbe essere designato anti-C3b. Contiene solo anticorpi anti-C3d senza attivit anti-immunoglobuline. Contiene solo anticorpi anti-C4b senza attivit anti-immunoglobuline. Contiene solo anticorpi anti-C4 senza attivit anti-immunoglobuline.
(5) Anti-C3d (6) Anti-C4b (7) Anti-C4d

*Fornita dallFDA
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legato ai globuli rossi a causa di anticorpi freddi che non sono clinicamente significativi. Anti-C3b,-C3d I reagenti anti-C3b, -C3d, preparati da animali immunizzati, non contengono alcuna attivit contro le immunoglobuline umane e vengono usati nelle situazioni descritte per lanti-C3d. Questo tipo di anti-C3d tipicamente reagisce anche con il C3b e forse altri epitopi presenti sui globuli rossi con C3 legato. Il reattivo monoclonale anti-C3b,-C3d murino costituito da una miscela di anticorpi derivati da ibridomi. Il ruolo del complemento nelle reazioni con il siero antiglobuline Le componenti del complemento possono aderire agli eritrociti in vivo o in vitro con uno di due seguenti meccanismi: 1. un anticorpo fissante il complemento, specifico per un antigene eritrocitario, pu provocare ladesione del complemento alla superficie cellulare, come conseguenza dellattivazione del complemento provocata dal complesso antigene-anticorpo; 2. complessi immuni, non specifici per gli antigeni eritrocitari, possono essere presenti nel plasma e possono attivare componenti del complemento che sono assorbiti in modo aspecifico sulle emazie. Ladesione del complemento sulla membrana delle cellule non coinvolte nella specifica reazione antigene-anticorpo viene spesso descritta come attacco del complemento astante innocente. I globuli rossi sensibilizzati con elementi della cascata complementare possono andare incontro a emolisi. Se la cascata complementare non arriva al completamento, la presenza delle componenti iniziali della cascata adese pu essere evidenziata dai reattivi anticomplemento. La componente pi facilmente evidenziata il C3, perch molte centinaia di molecole C3 possono essere fissate agli eritrociti anche per lattacco di poche molecole anticorpali. Anche la componente C4 pu essere evidenziata, ma lattacco del C3 ha un maggiore significato clinico.
Il complemento come unica globulina fissata Il solo complemento, senza immunoglobuline rilevabili, pu essere presente sulle emazie lavate in certe condizioni: 1. gli anticorpi di classe IgM reattivi in vitro occasionalmente si attaccano agli antigeni eritrocitari senza agglutinare le cellule, come si osserva con gli anticorpi IgM contro gli antigeni Lewis. Le IgM fissate sono difficilmente dimostrabili nel test antiglobulina, in parte perch le molecole IgM tendono a dissociarsi durante le procedure di lavaggio e in parte perch i sieri AHG polispecifici presentano una scarsa o assente attivit anti-IgM. Gli anticorpi IgM possono attivare il complemento e la reattivit delle IgM pu essere dimostrata rilevando le diverse centinaia di molecole C3 legate alla membrana in prossimit dei siti di attacco degli anticorpi; 2. dal 20 al 30% dei pazienti con AIHA da autoanticorpi caldi hanno emazie con un TAD positivo dovuto al solo C3 legato10. Nessuna IgG, IgA o IgM fissata alle emazie dimostrabile con le procedure di routine, bench alcuni campioni possano essere rivestiti di IgG a livelli inferiori al limite di sensibilit del TAD. 3. nella sindrome da agglutinine fredde, lautoanticorpo freddo pu reagire con gli antigeni eritrocitari a temperature sino a 32 C11. I globuli rossi che transitano nei vasi della pelle a questa temperatura vengono rivestiti dallautoanticorpo, che attiva il complemento. Se le emazie sfuggono allemolisi, ritornano nella circolazione profonda, dove la temperatura di 37 C e lautoanticorpo si dissocia dalle cellule, lasciando le componenti complementari solidamente fissate alla membrana eritrocitaria. La componente solitamente evidenziata dai reattivi AHG il C3d; 4. gli immunocomplessi che si formano nel plasma aderiscono, debolmente e in modo aspecifico, agli eritrociti e possono causare la fissazione del complemento. Il complemento attivato rimane sulla superficie eritrocitaria anche dopo che
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limmunocomplesso si dissociato. Il C3 rimane come unica globulina rilevabile sulla superficie. Le cellule sensibilizzate con le IgG Laggiunta di cellule sensibilizzate con IgG ai test allantiglobulina negativi (utilizzati per evidenziare le IgG) necessaria nella ricerca anticorpale e nelle prove crociate12(p33). Queste emazie sensibilizzate dovrebbero reagire con il siero antiglobuline, verificando cos che il reattivo AHG ha funzionato. La reattivit con le cellule sensibilizzate da IgG dimostra che il siero AHG effettivamente stato aggiunto e che non stato neutralizzato. I test devono essere ripetuti se le emazie sensibilizzate con le IgG non sono reattive. I test con le cellule sensibilizzate da IgG non evidenziano tutti i potenziali fallimenti del test allantiglobulina13-15. Una parziale neutralizzazione del siero AHG pu non essere affatto evidenziata, particolarmente se le emazie di controllo sono fortemente ricoperte di IgG. Errori nel test originale, come lomissione del siero in esame, una velocit di centrifugazione impropria o una concentrazione inadeguata delle emazie test, possono fornire un risultato negativo del test ma risultati positivi con le cellule di controllo. Cellule di controllo eccessivamente sensibilizzate possono agglutinare direttamente quando vengono centrifugate. Cellule ricoperte di complemento possono pure essere preparate e sono reperibili in commercio. Esse possono essere usate per controllare i test con reattivi specifici per il complemento. Alcune delle cause di errore nei test allantiglobulina sono elencate nelle Tabelle 12.2 e 12.3.
anticorpi, informazioni che vengono ottenute quando sono utilizzate le tradizionali procedure in provetta. Il test di aderenza eritrocitaria in fase solida La tecnica in fase solida eseguita in micropiastre utilizza antigeni o anticorpi immobilizzati. In un test diretto, lanticorpo viene fissato alle pareti del pozzetto nella micropiastra e vengono aggiunti i globuli rossi. Se le emazie presentano lantigene corrispondente, aderiranno alla parete del pozzetto; se non avviene alcuna reazione antigene-anticorpo, i globuli rossi si raccoglieranno in un bottone sul fondo del pozzetto dopo la centrifugazione16. Un test indiretto utilizza invece emazie di nota composizione antigenica fissate al pozzetto. Il campione in esame viene aggiunto al pozzetto con le emazie legate e lasciato a reagire con le cellule; dopo di che le piastre sono lavate e liberate dalle proteine non adese. Il sistema rivelatore per evidenziare ladesione degli anticorpi costituito da una sospensione di emazie rivestite di anti-IgG. La reazione positiva se le emazie del sistema rivelatore aderiscono alle pareti del pozzetto. Se invece esse formano un bottone sul fondo del pozzetto dopo la centrifugazione, dimostrano che non avvenuta alcuna reazione antigene-anticorpo (vedi Figura 12.4)17. Nel test indiretto, componenti isolate della membrana (per esempio specifiche proteine), invece delle emazie intere, possono essere fissate al pozzetto. Ladesione dellantigene o dellanticorpo alla fase solida una parte integrante anche di altri test, come quello di immobilizzazione anticorpo monoclonalespecifica degli antigeni eritrocitari (MAIEA), discusso pi avanti. I sistemi in fase solida sono stati progettati per un utilizzo nel rilievo degli anticorpi antipiastrinici, negli esami per la sifilide, per il citomegalovirus e per lantigene di superficie dellepatite B17-20. La tecnologia di agglutinazione su microcolonna Sono stati escogitati vari metodi nei quali i globuli rossi sono filtrati attraverso una colonna
Altri metodi per rilevare le reazioni antigene-anticorpo

I seguenti metodi rappresentano delle procedure alternative ai tradizionali metodi in provetta ed alluso del siero antiglobuline. Alcuni metodi non permettono il rilievo degli anticorpi sia IgM, sia IgG e non possono fornire informazioni sulla fase e sulla temperatura di reazione degli
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Tabella 12.2 - Cause di errore nei test allantiglobulina - Risultati falsamente negativi Neutralizzazione del reattivo antiglobuline umane (AHG) Insuccesso nel lavare adeguatamente le cellule per rimuovere tutto il siero/plasma. Riempire le provette almeno per con soluzione salina ad ogni lavaggio. Verificare il volume dispensato dalle centrifughe lavaglobuli automatiche. Se viene usato un volume aumentato di siero, il lavaggio di routine pu essere inadeguato. Lavare pi volte o rimuovere il siero prima dei lavaggi. Contaminazione del siero AHG con proteine estranee. Non usare le dita o le mani per tappare le provette. Tappi contagocce contaminati o provenienti da un reattivo sbagliato possono neutralizzare lintero flaconcino di AHG. Alte concentrazioni di paraproteine IgG nel siero in esame; le proteine possono permanere anche dopo lavaggi multipli. Interruzioni nellesecuzione del test Le immunoglobuline IgG possono dissociarsi dalle emazie e possono lasciare troppo poche IgG per essere rilevabili, o anche neutralizzare il reattivo AHG. Lagglutinazione delle emazie sensibilizzate dalle IgG verr indebolita. Centrifugare e leggere immediatamente. Scorretta conservazione dei reagenti I reattivi AHG possono perdere la reattivit se sono congelati. I reattivi possono essere contaminati da batteri. Leccesso di temperatura o dei ripetuti congelamenti/scongelamenti possono provocare la perdita della reattivit dei sieri diagnostici. Le emazie test possono perdere la forza antigenica con la conservazione. Altri sottili cambiamenti possono comportare la perdita della reattivit. Procedure improprie Leccesso di centrifugazione pu impaccare le cellule cos fortemente che lagitazione necessaria per risospenderle rompe gli agglutinati. Una centrifugazione troppo scarsa pu non essere ottimale per lagglutinazione. Lomissione del siero in esame, del mezzo potenziante o del siero AHG pu causare un test negativo. Una sospensione eritrocitaria troppo concentrata pu mascherare una debole agglutinazione. Una troppo diluita pu essere difficoltosa da leggere. Improprio/insufficiente rapporto siero/emazie. Complemento Rari anticorpi, particolarmente gli anti-Jka,-Jkb, possono essere rilevati solo utilizzando siero AHG polispecifico in presenza di complemento attivo. Soluzione salina isotonica Un basso pH della soluzione salina pu ridurre la sensibilit. La soluzione salina ottimale per i lavaggi della maggior parte degli anticorpi da pH 7.0 a 7.2. Alcuni anticorpi possono richiedere che la soluzione salina sia ad una specifica temperatura per mantenere gli anticorpi adesi alle cellule. Usare la soluzione salina a 37 C o a 4 C.
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Tabella 12.3 - Cause di errore nei test allantiglobulina - Risultati falsamente positivi Cellule agglutinate prima del lavaggio Se sono presenti potenti agglutinine, gli agglutinati possono non essere dispersi durante il lavaggio. Osservare le cellule prima di aggiungere il siero antiglobuline umane (AHG) o utilizzare una provetta di controllo sostituendo il siero AHG con salina. La reattivit prima dellaggiunta di AHG o nel controllo in salina invalida la lettura della fase con AHG. Particelle corpuscolate o contaminanti La polvere o la sporcizia nella vetreria pu causare laggregazione (non lagglutinazione) delle emazie. La fibrina o dei precipitati nel siero in esame possono produrre aggregati cellulari che simulano gli agglutinati. Procedure improprie Leccesso di centrifugazione pu impaccare le emazie cos strettamente da renderne difficoltosa la dispersione ed apparire positive. La centrifugazione nei test con polietilenglicole o con polimeri carichi positivamente prima del lavaggio pu formare degli aggregati che non si disperdono. Cellule con un test allantiglobulina diretto (TAD) precedentemente positivo Cellule gi positive al TAD, saranno positive in qualunque TAI. Le procedure per rimuovere le IgG dalle emazie TAD positive sono descritte nei Metodi 2.13 e 2.14. Complemento Le componenti del complemento, soprattutto il C4, possono fissarsi alle emazie provenienti da coagulo o da segmenti in CPDA-1 di donatore durante la conservazione a 4C e occasionalmente a temperature pi elevate. Per i TAD, utilizzare eritrociti anticoagulati con EDTA, ACD o CPD. I campioni prelevati in provette contenenti del gel di silicone possono presentare un attacco spurio del complemento14. Il complemento pu aderire alla cellula dei campioni raccolti dalle linee di infusione utilizzate per somministrare delle soluzioni contenenti destrosio. Le reazioni pi forti sono osservate quando vengono usati grossi aghi o quando il volume del prelievo inferiore a 0,5 mL. contenente un mezzo che separa selettivamente le popolazioni eritrocitari. I preparati commerciali consistono in sistemi che impiegano una schedina o una strip di microprovette al posto delle provette convenzionali. Esse permettono lesecuzione simultanea di diversi test. Generalmente, uno spazio o una camera di reazione al vertice di ogni colonna viene usata per i globuli rossi da soli, oppure per incubare gli eritrociti con siero o plasma. Quando le cellule passano attraverso la colonna (di solito con la centrifugazione) il mezzo nella colonna separa le emazie agglutinate da quelle non agglutinate, sulla base della dimensione degli aggregati17. Alternativamente, in alcuni test, antisieri specifici o proteine possono essere inclusi nel mezzo stesso della colonna; le emazie che presentano uno specifico antigene vengono selettivamente catturate, mentre passano attraverso il mezzo. Quando la colonna contiene siero antiglobuline o una proteina che si lega specificamente alle immunoglobuline, le emazie saranno quelle sensibilizzate con le immunoglobuline. Utilizzando un tempo ed una velocit di centrifugazione che permettano alle emazie di penetrare nella colonna, lasciando il siero o il
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plasma nella parte superiore, la necessit di lavare in soluzione salina per il test allantiglobulina pu essere eliminata21. Tipicamente, nei test in colonna, nel caso di risultati negativi, le emazie si raccolgono in un bottone omogeneo sul fondo della colonna. Nei test positivi, le emazie vengono catturate in alto o lungo il corpo della colonna. Un vantaggio, presentato dalla maggior parte di questi sistemi, la stabilit della fase finale della reazione che pu essere letta da diverse persone o, in qualche caso, documentata con una fotocopia. I test in colonna solitamente hanno una sensibilit analoga a quella dei metodi LISS-antiglobulina, tuttavia stata segnalata una minore efficacia nellevidenziare anticorpi deboli, specialmente quelli nel sistema ABO22. Nel 1986, Lapierre et al. hanno sviluppato un procedimento che utilizza una colonna di particelle di gel23. Come preparazione commerciale, il gel test impiega sei microcolonne al posto delle provette, contenute in ci che viene indicato come schedina o strip. Le particelle di gel funzionano come un filtro che intrappola gli agglutinati eritrocitari quando la schedina viene centrifugata. Per catturare le cellule che sono sensibilizzate,
ma non agglutinate, dagli anticorpi, vengono utilizzati gel contenenti siero antiglobuline. Gel con antisieri diversi possono essere usati per determinare il fenotipo delle cellule (vedi Figura 12.5). In unaltra tecnologia di agglutinazione su colonna, una colonna di microsfere di vetro in un diluente viene usata al posto del gel. Come con il gel test, le sferette di vetro possono anchesse intrappolare gli agglutinati di cellule o antisieri, come lanti-IgG, possono essere aggiunti al diluente24. Piattaforme di analisi automatizzata Sono stati sviluppati diversi dispositivi automatici per evidenziare le reazioni antigeneanticorpo. Tutti i passaggi del processo di analisi, dallaliquota del campione al referto, sono eseguiti dal sistema. Questi sistemi di analisi permettono lesecuzione di test multipli, utilizzando tecnologie in fase solida, gel su colonna e/o micropiastra. I sistemi vengono controllati da un programma computerizzato e lidentificazione positiva dei campioni pu essere assicurata dalla tecnologia a codici a barre. Il computer del sistema di analisi pu essere integrato nei sistemi informativi di
Figura 12.4 - Un test indiretto in fase solida. Un monostrato di eritrociti viene fissato alle pareti di un micropozzetto (1). Viene aggiunto il siero in analisi. Se lanticorpo (2) presente, si lega agli antigeni delle emazie fissate al micropozzetto (3). Le emazie rivelatrici legate con lIgG e lanti-IgG (4) vengono aggiunte. La porzione libera dellanti-IgG si lega ad ogni anticorpo che attaccato alle emazie fissate al micropozzetto (5). In un test positivo, le emazie rivelatrici sono distribuite ampiamente nel pozzetto. In un test negativo, le emazie rivelatrici non si legano e formano un pellet al centro del fondo del micropozzetto dopo la centrifugazione. Le reazioni deboli danno dei risultati intermedi.
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trasfuse e monitorare la loro sopravvivenza nel ricevente, per misurare bassi livelli di IgG legate alle cellule e per differenziare lespressione antigenica dei soggetti omozigoti da quella dei soggetti eterozigoti per gli antigeni gruppoematici25. Il test di immunoassorbimento legato ad enzima I test di immunoassorbimento legato ad enzima (ELISA) sono utilizzati per misurare lantigene o lanticorpo. Si possono legare enzimi, come la fosfatasi alcalina, a molecole anticorpali senza distruggere n la specificit anticorpale, n lattivit enzimatica. Gli ELISA sono stati utilizzati per individuare e misurare le IgG fissate alle cellule e per dimostrare le emorragie feto-materne. Quando vengono esaminati gli eritrociti, il test viene spesso definito come test allantiglobulina legata ad enzima (ELAT). Il test di immobilizzazione anticorpo monoclonale-specifica degli antigeni eritrocitari Nel test di immobilizzazione anticorpomonoclonale specifica degli antigeni eritrocitari (MAIEA), i globuli rossi sono incubati con due anticorpi. Uno contiene un alloanticorpo umano specifico per un antigene gruppoematico, mentre laltro un anticorpo non umano (solitamente un anticorpo monoclonale di origine murina), che reagisce con una diversa porzione della medesima proteina di membrana. Le emazie vengono poi emolizzate e le membrane solubilizzate, e introdotte in un micropozzetto rivestito di anticorpi di capra antitopo. Questo anticorpo cattura lanticorpo murino attaccato alla proteina di membrana (con lanticorpo umano pure attaccato). Si aggiunge poi un anticorpo coniugato anti-uomo, che reagisce con lanticorpo umano legato e fornisce una reazione leggibile in ELISA. Fino ad ora, questa metodologia stata utilizzata soprattutto per isolare specifiche strutture della membrana per scopi di studio degli antigeni gruppoematici26,27.
Figura 12.5 - Il gel test laboratorio per la refertazione dei risultati. I sistemi di analisi automatizzati possono essere particolarmente utili nelle strutture che eseguono grandi volumi di analisi per pazienti o donatori. Limmunofluorescenza Le analisi in immunofluorescenza permettono lidentificazione e la localizzazione di antigeni allinterno o sulla superficie delle cellule. Un fluorocromo, come la fluorescina o la ficoeritrina, pu essere attaccato ad una molecola anticorpale senza alterarne la specificit o la capacit di legame con lantigene. Ladesione agli antigeni cellulari degli anticorpi marcati con fluorescina rende le cellule rivestite da anticorpi visibili in un brillante giallo-verde o rosso (in funzione del fluorocromo). Gli anticorpi immunofluorescenti possono essere utilizzati nelle procedure dirette o indirette, con la fluorescenza analoga allagglutinazione quale risultato finale. In un test diretto, lanticorpo marcato con fluorescina specifico per un singolo antigene di interesse. In un test indiretto, un siero antiglobuline marcato con fluorescina viene aggiunto alle cellule che sono state incubate con un anticorpo, non marcato, di specificit nota. Le tecniche con limmunofluorescenza sono state inizialmente utilizzate per rilevare antigeni dentro o sui linfociti oppure nelle sezioni di tessuti. Pi recentemente, gli anticorpi immunofluorescenti sono stati impiegati nella citometria a flusso. Tra le loro varie applicazioni, essi sono stati usati anche per quantificare le emorragie feto-materne, per identificare le emazie
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Capitolo 13: I gruppi sanguigni ABO, H, Lewis e gli antigeni strutturali correlati
Capitolo 13
I gruppi sanguigni ABO, H, Lewis e gli antigeni strutturali correlati
Gli antigeni gruppoematici ABO, cos come quelli dei sistemi H, Lewis ed I, sono localizzati su molecole polisaccaridiche, strutturalmente correlate. Gli antigeni vengono formati dallazione di specifiche glicosiltrasferasi, che aggiungono, in sequenza, zuccheri specifici nei siti posti sulle catene corte dei saccaridi (oligosaccaridi), che sono strutturati su una comune sostanza precursore. Le interazioni dei prodotti dei geni ABO, Hh, Sese e Lele incidono sullespressione degli antigeni ABO, H e Lewis. Consultare lAppendice 6 per la nomenclatura e per i numeri ISBT utilizzati nellindicazione dei gruppi sanguigni.
Il sistema ABO
Il sistema ABO venne scoperto quando, nel 19001, Karl Landsteiner rilev lagglutinazione dei globuli rossi umani utilizzando dei sieri provenienti da altri individui e, nellanno seguente, descrisse in modo particolareggiato il modello di reattivit di tre tipologie antigeniche, ora denominate gruppi A, B e O2,3. Egli scopr che i sieri di soggetti di gruppo A agglutinavano le emazie degli individui di gruppo B e, viceversa, i sieri di soggetti di gruppo B agglutinavano i globuli rossi di gruppo A. Gli antigeni A e B furono, quindi, i primi antigeni eritrocitari ad essere scoperti. I globuli rossi che non erano agglutinati n dal siero di gruppo A, n dal siero di gruppo B vennero successivamente definiti di gruppo O; il siero dei soggetti di gruppo O agglutinava sia gli eritrociti degli individui di
gruppo A sia quelli di gruppo B. Von Decastello e Sturli, nel 1902, scoprirono il quarto gruppo sanguigno, il gruppo AB4. Limportanza della scoperta di Landsteiner consiste nel riconoscimento del fatto che gli anticorpi reattivi con gli antigeni A e B sono presenti nel siero quando lantigene corrispondente manca sulle emazie. Le procedure basilari nella tipizzazione ABO di routine si svilupparono da questi e dagli studi successivi5. Gli antigeni e gli anticorpi del sistema ABO sono ancora oggi i pi importanti per la pratica trasfusionale. Questo lunico sistema di gruppo nel quale gli anticorpi reciproci (vedi Tabella 13.1) sono presenti sempre e in quantit consistente nei sieri della maggioranza di soggetti che non sono stati esposti a eritrociti umani. A causa di questi anticorpi, la trasfusione di sangue ABO incompatibile pu causare una severa emolisi intravascolare, cos come le altre manifestazioni proprie di una reazione trasfusionale emolitica acuta (vedi Capitolo 27). Gli esami per rilevare lincompatibilit ABO tra ricevente e donatore il fondamento su cui si basano le analisi pre-trasfusionali. Genetica e biochimica I geni responsabili per tutti gli antigeni polisaccaridici che vengono discussi in questo capitolo, codificano per delle specifiche glicosiltrasferasi, enzimi che trasportano specifici saccaridi sullappropriato recettore della catena carboidratica; in questo modo, gli antigeni sono i prodotti indiretti dei geni. I geni di tre distinti loci
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Tabella 13.1 - Tipizzazione ABO di routine Reazione delle emazie testate con siero anti-A 0 + 0 + anti-B 0 0 + + Reazione del siero testato con emazie emazie A1 + 0 + 0 emazie B emazie O + + 0 0 0 0 0 0 Interpretazione gruppo O A B AB Incidenza (%) nella popolazione USA Bianchi 45 40 11 4 Neri 49 27 20 4
+ = Agglutinazione; 0 = nessuna agglutinazione
(H, Se ed ABO) controllano la formazione e la localizzazione degli antigeni A e B. I loci dei geni H ed Se (Secretore), formalmente identificati rispettivamente come FUT1 e FUT2, sono posti, strettamente concatenati, sul cromosoma 19. Ogni locus ha due alleli riconoscibili, uno dei quali non presenta un prodotto evidenziabile ed , quindi, considerato un gene amorfo. Lallele attivo al locus H, cio il gene H, produce una trasferasi che agisce a livello cellulare per formare lantigene H sui globuli rossi. Il gene allelico amorfo, h, molto raro. Lallele attivo al locus Se, cio il gene Se, produce una trasferasi che pure forma lantigene H, ma prevalentemente nelle secrezioni, come la saliva6. Lottanta per cento delle persone sono secretori. Lallele amorfo indicato come se. Gli enzimi prodotti dagli alleli H e Se sono entrambi delle fucosiltrasferasi, ma con attivit enzimatiche leggermente diverse. Lantigene H presente sugli eritrociti e nelle secrezioni costituisce il substrato per la successiva formazione degli antigeni A e B. Vi sono tre alleli comuni nel locus ABO, posto sul cromosoma 9, A, B e O7. Gli alleli A e B codificano trasferasi che producono, rispettivamente, gli antigeni A e B; lallele O non codifica per un enzima funzionale8. I globuli rossi degli individui di gruppo O sono, quindi, privi degli antigeni A e B, ma presentano unelevata quantit di antigeni H, che la sostanza precursore non convertita sulla quale sono costruiti gli antigeni A e B. Le catene carboidratiche (oligosaccaridi) che
portano gli antigeni ABH possono essere unite ad altre molecole portatrici, di natura proteica (glicoproteine), sfingolipidica (glicosfingolipidi) o lipidica (glicolipidi). Le glicoproteine e gli glicosfingolipidi che portano gli antigeni A e B sono parti integrali della membrana dei globuli rossi, delle cellule epiteliali e delle cellule endoteliali (Figura 13.1) e sono presenti, in forma solubile, anche nel plasma. Le glicoproteine che sono secrete nei fluidi corporei, come la saliva, contengono molecole che possono, se il soggetto possiede un allele Se, presentare gli antigeni A, B ed H. Gli antigeni A e B che, invece, non sono uniti a molecole proteiche o lipidiche portatrici, sono rilevabili nel latte e nelle urine come oligosaccaridi liberi. Le trasferasi codificate dagli alleli A, B, H e Se aggiungono uno specifico saccaride alla catena carboidratica. Lo zucchero che viene aggiunto indicato come immunodominante perch, quando rimosso dalla struttura, lattivit gruppospecifica viene persa. Il saccaride pu essere aggiunto soltanto in modo sequenziale. La struttura H viene prodotta per prima, poi, ad essa, vengono aggiunti gli zuccheri per gli antigeni A e/o B. Gli alleli H e Se codificano per una fucosiltrasferasi che aggiunge il fucosio (Fuc) alla catena precursore; quindi, il fucosio lo zucchero immunodominante per lantigene H (vedi Figura 13.2). Lallele A codifica per lN-acetil-D-Galattosaminiltrasferasi, che aggiunge l N -acetil-D-galattosamina (o GalNAc) alla sostanza H per formare lantigene A sui globuli rossi.
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Figura 13.1 - Rappresentazione schematica della membrana eritrocitaria che mostra la glicosilazione responsabile delle caratteristiche antigeniche, delle proteine e dei lipidi. GPI = glicofosfatidilinositolo (per gentile concessione di ME Reid, New York Blood Center). Lallele B codifica la galattosiltrasferasi che aggiunge il D-galattosio (o Gal) allantigene H per formare lantigene B. Gli individui di gruppo AB possiedono alleli che producono le trasferasi per aggiungere sia Gal NAc che Gal allantigene precursore H. Laggiunta degli zuccheri immunodominanti A e/o B riducono la reattivit sierologica dellantigene H in modo tale che lespressione degli antigeni A o B risultano inversamente proporzionali a quella dellantigene H. Rari soggetti che sono privi sia degli alleli H che Se (genotipo hh e sese) non hanno lantigene H, di conseguenza, n lantigene A n quello B sono presenti sulle loro emazie o nei loro secreti (vedi successivamente il fenotipo Oh). Tuttavia, gli antigeni H, A e B vengono rilevati nelle secrezioni di alcuni individui hh che sembrano, attraverso studi familiari, possedere almeno un allele Se (vedi, pi oltre, i fenotipi para-Bombay). Gli oligosaccaridi concatenati con gli zuccheri immunodominanti A o B esistono come semplici ripetizioni di poche molecole saccaridiche legate in una catena lineare, oppure come una parte di strutture pi complesse, con molti residui saccaridici, strutturati in catene laterali. La differenza tra i neonati e gli adulti nellespressione eritrocitaria degli antigeni A, B ed H pu essere correlata alla quantit di strutture ramificate presenti sulla membrana cellulare alle differenti et. Si ritiene che gli eritrociti dei neonati presentino, in modo predominante, catene polisaccaridiche lineari che possiedono un solo punto terminale al quale pu essere aggiunto il saccaride immunodominante dellantigene H (e successivamente A e/o B). Al contrario, i globuli rossi degli adulti presentano unelevata proporzione di catene carboidratiche ramificate, rendendo disponibili siti addizionali per la conversione in antigene H e successivamente negli antigeni A e/o B. Gli antigeni A, B ed H sono costruiti su delle catene carboidratiche caratterizzate da legami diversi e da una differente composizione del disaccaride terminale; esistono almeno sei diversi tipi di concatenazione del disaccaride9. Le catene di Tipo 1 e di Tipo 2 si diversificano nel legame del Gal al disaccaride GlcNAc (vedi Figura 13.3). Le strutture di Tipo 1 A, B ed H sono presenti
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Tipo 3 H vengono successivamente convertite nel tipo 3 A, mediante laggiunta di GalNAc attraverso lazione dellA1-trasferasi, ma non con la A2trasferasi (vedi Figura 13.4). Gli alleli attivi H ed Se, dei geni FUT1 e FUT2, codificano una fucosiltrasferasi con un elevato grado di omologia. Lenzima prodotto da H agisce preminentemente sulle catene di Tipo 2, che sono prevalenti sulle membrane eritrocitarie. Lenzima prodotto da Se agisce preferenzialmente, ma non esclusivamente, sulle catene di Tipo 1 ed opera soprattutto nelle ghiandole secretrici. I geni ABO a livello molecolare Yamamoto et al.11 hanno dimostrato che gli alleli A e B si diversificano lun laltro per una differenza di sette nucleotidi, quattro di questi originano da una sostituzione amminoacidica alle posizioni 176, 235, 266 e 268 nella sequenza proteica delle trasferasi A e B. La recente cristallografia delle trasferasi di A e B evidenziano il ruolo di questi amminoacidi critici nel riconoscimento del substrato12. Il primo allele O esaminato presentava una Figura 13.2 - Laggiunta di Gal al subterminale Gal conferisce la specificit B; il GalNAc aggiunto al subterminale Gal conferisce la specificit A al polisaccaride. Latomo di C in posizione 3 del galattosio non pu legare alcuna molecola di zucchero se non presente sul carbonio in posizione 2 una molecola di fruttosio che responsabile della specificit H. nelle secrezioni, nel plasma e nei tessuti di derivazione endodermica. Esse non sono sintetizzate dai globuli rossi ma vengono incorporate nella membrana eritrocitaria provenendo dal plasma. Le catene di Tipo 2 sono gli oligosaccaridi prevalenti come portatori degli antigeni ABH sugli eritrociti e vengono rilevati anche nelle secrezioni. Le catene di Tipo 3 (forma ripetitiva) sono rilevate sulle emazie di soggetti di gruppo A10. Sono sintetizzate per laggiunta di Gal al terminale Gal N Ac delle catene di Tipo 2 A, formando in questo modo Il Tipo 3 H; le catene di
Figura 13.3 - Le catene oligosaccaridiche di Tipo 1 e di Tipo 2 si diversificano solo nel legame tra il GlcNAc e il Gal terminale.
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Figura 13.4 - Struttura dellantigene Tipo 3 A. singola delezione nucleotidica che comportava un cambiamento strutturale allorigine di un prematuro codone di arresto (stop codon) che poi esitava nella prevista traslazione di una proteina tronca (inattiva). Successivamente, sono stati identificati altri alleli O, come anche delle mutazioni degli alleli di A e di B che determinavano espressioni antigeniche indebolite (riesaminati altrove)13,14. Lallele A2 codifica per una proteina con 21 amminoacidi aggiuntivi. Antigeni I test di agglutinazione diretta vengono utilizzati per rilevare gli antigeni A e B sui globuli rossi. Gli anticorpi diagnostici producono frequentemente delle reazioni pi deboli con gli eritrociti dei neonati che con le emazie di adulti. Sebbene gli antigeni A e B possano essere rilevati sugli eritrociti di embrioni di 5-6 settimane, essi non sono completamente sviluppati alla nascita, presumibilmente perch la struttura ramificata dei polisaccaridi si sviluppa gradualmente. Dai 2 ai 4 anni di et, le espressioni antigeniche A e B sono pienamente sviluppate e rimangono sostanzialmente immutate per tutta la vita. Sottogruppi I sottogruppi ABO sono fenotipi che differiscono per la quantit di antigeni presente sugli eritrociti e, per i secretori, per lantigene idrosolubile nella saliva. I sottogruppi di A sono pi frequenti di quelli di B. I due principali sottogruppi di A sono A1 e A2. Le emazie dei soggetti A1 e A2 reagiscono entrambe fortemente con i reattivi anti-A nei test di agglutinazione diretta. La differenza sierologica tra gli eritrociti A1 e A2 pu essere rilevata con la lectina anti-A1 (vedi, avanti, anti-A1). Vi una differenza sia quantitativa che qualitativa tra A1 ed A215. La trasferasi A1 molto efficiente nella conversione della sostanza H in antigene A ed in grado di elaborare le strutture ripetitive di tipo 3 A. Negli adulti, vi sono circa 10,5 x 105 siti antigenici A sulle emazie A1 e circa 2,21 x 105 siti antigenici A sulle emazie A29. Approssimativamente l80% degli individui di gruppo A o di gruppo AB hanno delle emazie che sono agglutinate dallanti-A 1 e perci sono classificati come A1 o A1B. Il rimanente 20%, i cui globuli rossi sono fortemente agglutinati dallanti-A ma non dallantiA 1 sono classificati come A 2 o A 2B. La determinazione di routine utilizzando i reagenti anti-A1 non necessaria per i donatori o per i riceventi. Sottogruppi pi deboli di A 2 sono rari e, generalmente, sono caratterizzati da un numero ridotto dei determinanti antigenici A sulle emazie, con un contestuale aumento dellantigene H. I sottogruppi sono riconosciuti, nella maggior parte dei casi, quando si verificano delle discrepanze nella tipizzazione antigenica degli eritrociti (prova diretta) con quella anticorpale del siero (prova indiretta). Generalmente la classificazione dei sottogruppi di A (A3, Ax, Am, Ael) basata su: 1. il grado di agglutinazione delle emazie con lanti-A e lanti-A1. 2. Il grado di agglutinazione delle emazie con sieri di origine umana e alcuni sieri
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monoclonali anti-A,B. 3. Il grado di agglutinazione delle emazie con la lectina lanti-H (da Ulex europaeus). 4. La presenza o meno dellanti-A1 nel siero. 5. La presenza degli antigeni A ed H nella saliva dei secretori. 6. Gli accertamenti con il test di assorbimento/ eluizione. 7. Lindagine familiare (albero genealogico). Lidentificazione dei diversi sottogruppi non viene eseguita nella routine. La classificazione sierologica dei sottogruppi di A (e di B) venne sviluppata utilizzando dei sieri diagnostici policlonali umani anti-A, anti-B ed anti-A,B. Questi reattivi sono stati successivamente sostituiti dei reattivi monoclonali di origine murina e la reattivit degli stessi con i diversi sottogruppi dipende da quale clone viene selezionato dal produttore del siero diagnostico. Vi sono, tuttavia, alcune caratteristiche che devono essere rilevate. Gli eritrociti A3 presentano un tipico quadro a campo misto, quando analizzati con lanti-A di donatori B e O. Le emazie Ax caratteristicamente non vengono agglutinate con lanticorpo anti-A dei soggetti di gruppo B, ma sono debolmente agglutinate dallanti-A,B dei gruppi O. Le emazie Ax possono essere reattive con alcuni anti-A monoclonali, in rapporto a quale siero monoclonale viene selezionato come reagente. Le emazie Ael non vengono agglutinate dagli anti-A o dagli anti-A,B di qualsiasi origine e la presenza dellantigene A dimostrabile solo mediante test di assorbimento/eluizione. I sottogruppi di B sono molto meno frequenti dei sottogruppi di A. Gli studi molecolari hanno confermato che i sottogruppi sono eterogenei e che la classificazione sierologica non si correla solidamente con lanalisi genomica; diversi alleli conducono allo stesso fenotipo debole e, in alcuni casi, pi di un fenotipo nasce da un medesimo allele16. Anticorpi anti-A e anti-B Normalmente, un individuo possiede gli anticorpi specifici contro lantigene A o B che assente sui suoi stessi eritrociti (vedi Tabella 13.1). Questa prevedibile relazione complementare
permette lesame ABO del siero, con la stessa affidabilit di quella per i globuli rossi (vedi Metodi 2.2 e 2.3). Unipotesi per spiegare lo sviluppo di questi anticorpi basata sul fatto che le configurazioni che conferiscono le specificit antigeniche dei determinanti A e B esistono anche in altre entit biologiche, in particolare sulle pareti batteriche. I batteri sono diffusi liberamente nellambiente e la loro presenza nella flora intestinale, nella polvere, nel cibo e in altri agenti largamente diffusi nellambiente assicura una costante esposizione di tutte le persone a degli antigeni con caratteristiche A e B simili. Gli individui immunocompetenti reagiscono allesposizione agli antigeni ambientali, producendo gli anticorpi per quelli che sono assenti nel loro organismo. Perci, lanti-A viene prodotto dai soggetti di gruppo B od O e lanti-B dagli individui di gruppo O o A. Le persone di gruppo AB, possedendo entrambi gli antigeni, non producono alcun anticorpo, anti-A od anti-B. La spiegazione ambientale per la formazione degli anticorpi anti-A ed anti-B resta unipotesi non dimostrata. Epoca di comparsa Gli anticorpi anti-A ed anti-B, nei lattanti, si possono generalmente rilevare nel siero dopo il terzo-sesto mese di et. La maggior parte degli anticorpi anti-A ed anti-B, presenti nel sangue cordonale, sono di origine materna e vengono acquisti con il passaggio transplacentare delle IgG di origine materna anche se, occasionalmente, possono essere trovati dei neonati che producono questi anticorpi alla nascita17(p.124). Gli anticorpi anti-A e anti-B, rilevati nei sieri dei neonati o dei lattanti di meno di 3-6 mesi di et, non possono, quindi, essere considerati attendibili. La produzione anticorpale aumenta tra il quinto e il decimo anno di vita fino a raggiungere i livelli delladulto e decresce nellultima parte della vita. Le persone anziane hanno solitamente dei livelli di anti-A e anti-B inferiori rispetto ai giovani adulti. Reattivit degli anti-A e anti-B Le IgM rappresentano
la
classe
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immunoglobulinica predominante, degli anti-A prodotti dai soggetti di gruppo B e degli anti-B prodotti dai soggetti di gruppo A, sebbene piccole aliquote di anticorpi di classe IgG siano pure presenti nei sieri. Le IgG sono la classe dominante degli anti-A ed anti-B prodotti nel siero dai soggetti di gruppo O17(p.124). Poich le IgG attraversano rapidamente la barriera placentare e le IgM no, i neonati di gruppo A o B nati da madri di gruppo O sono esposti ad un rischio pi elevato di malattia emolitica neonatale o fetale, da incompatibilit ABO (MEFN), rispetto ai neonati da madri di gruppo A o B; gravi MEFN possono, comunque, verificarsi anche nei neonati nati da madri di gruppo A o B. Gli anti-A e gli anti-B di entrambe le classi anticorpali (IgG od IgM) sono reattivi prevalentemente a temperatura ambiente (2024 C) o a temperature inferiori ed attivano efficacemente il complemento a 37 C. La capacit emolitica complemento-dipendente di questi anticorpi rilevabile nei test sierologici che prevedano una incubazione a 37 C. Alcuni sieri possono causare lemolisi delle emazie ABO incompatibili a temperature inferiori ai 37 C. Unemolisi determinata dagli anticorpi ABO deve essere sospettata quando il sopranatante di un test eseguito con il siero appare rosato o rosso o quando il fondello di emazie, dopo la centrifugazione, assente o chiaramente ridotto. Lemolisi deve essere interpretata come un risultato positivo. Poich lemolisi mediata dal complemento, essa non si verificher se, nel test, viene utilizzato plasma al posto del siero o se le emazie utilizzate sono sospese in una soluzione che contenga EDTA o altre componenti che prevengono lattivazione del complemento. Reattivit del siero anti-A,B (siero di gruppo O) Il siero dei soggetti di gruppo O contiene un anticorpo indicato come anti-A,B perch reagisce sia con le emazie A che con le emazie B e la reattivit anti-A ed anti-B, di questo anticorpo, non separabile con un assorbimento selettivo. In altre parole, un eluato preparato da delle emazie di gruppo A o di gruppo B che hanno assorbito lanti-
A,B risulter reattivo sia con le sole emazie A sia con le sole emazie B. La saliva di un soggetto secretore delle sostanza A oppure della sostanza B inibisce rispettivamente lattivit dellanti-A,B, sia nei confronti delle emazie A sia nei confronti delle emazie B. Anti-A1 Lanti-A1 rilevabile, come alloanticorpo, in una percentuale variabile dall1 al 2% nel siero dei soggetti A2 e del 25% nel siero delle persone A2B15. Talvolta lanti-A1 pu essere rilevabile anche nei sieri di individui con altri sottogruppi deboli di A. Lanti-A1 pu determinare delle discrepanze tra la prova diretta ed indiretta nella determinazione di gruppo ABO, oppure dei problemi nelle prove crociate con emazie A1 o A1B. Lanti-A1 di solito, reattivo, preferibilmente o esclusivamente, a temperature ben al di sotto dei 37 C ed considerato non clinicamente significativo, se non si rileva una reattivit a 37 C. Quando reattivo a 37 C, per le trasfusioni debbono essere utilizzate soltanto emazie A2 o O. In studi di assorbimento semplice, lanti-A presente nel siero dei soggetti di gruppo B sembra contenere degli anticorpi separabili con specificit anti-A ed anti-A1. Il siero intero del gruppo B agglutina sia le emazie A1 che le A2; mentre, dopo lassorbimento con le emazie A2, il siero cos assorbito reagisce solo con le emazie A1. Ma se vengono comunque condotte ulteriori indagini, le differenze, nellespressione antigenica di A, tra le emazie A1 ed A2 sembrano essere di natura quantitativa piuttosto che qualitativa9. Un efficace reattivo anti-A1 pu essere ottenuto dalla lectina del Dolichos biflorus, che disponibile commercialmente o pu essere preparata (vedi Metodo 2.10). Lestratto puro della pianta reagisce e con le emazie A1 e A2, ma unappropriata preparazione diluita non agglutiner pi le emazie A 2 , costituendo in questo modo un reattivo anti-A1 . Tipizzazione ABO di routine Le analisi di routine per la determinazione del gruppo ABO consistono nellesaminare i globuli rossi con i sieri diagnostici anti-A e anti-B (prova
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diretta) e analizzare il siero o il plasma con eritrociti test A1 e B (prova indiretta). Sia le prove sulle emazie sia quelle sul siero sono necessarie per laccertamento di routine del gruppo ABO dei donatori e dei pazienti, perch ognuna serve come controllo reciproco dellaltra18(pp.32,37). Le uniche due eccezioni ammesse nellesecuzione di entrambi i test (sulle emazie e sul siero) sono la conferma del gruppo ABO di ununit di sangue di un donatore gi tipizzato e lanalisi del sangue di un lattante di et inferiore ai 4 mesi; in entrambi questi casi, necessario soltanto laccertamento del gruppo ABO sui globuli rossi. La maggior parte dei reattivi diagnostici anti-A e anti-B agglutina direttamente le emazie positive per lantigene, anche senza la centrifugazione, ma gli anticorpi anti-A e anti-B, presenti nei sieri di alcuni pazienti o donatori, possono essere troppo deboli per agglutinare le emazie senza la centrifugazione o senza unincubazione prolungata. Le analisi sui sieri devono essere, quindi, condotte con metodi che possano evidenziare adeguatamente gli anticorpi presenti (per esempio, metodi di agglutinazione in provetta, su micropiastre o su microcolonne). Le procedure per la tipizzazione ABO, che utilizzano vetrini, provette o micropiastre, sono descritte nei Metodi 2.1, 2.2 e 2.3. Reattivi aggiuntivi, come lanti-A,B per le emazie e gli eritrociti A2 e O per i test sul siero, non sono necessari per le indagini di routine ma sono di aiuto nella risoluzione delle discrepanze nelle tipizzazioni (vedi avanti). Lutilizzo di un siero antiA,B pu non avere la stessa efficacia nel rilevare i sottogruppi ABO deboli impiegando antisieri monoclonali In rapporto al clone utilizzato) rispetto a quando si utilizzavano reattivi policlonali di origine umana. Sono stati preparati molti diagnostici ABO monoclonali al fine di evidenziare alcuni dei sottogruppi deboli. Si debbono consultare i foglietti informativi dei produttori dei diagnostici per accertare le caratteristiche specifiche dei reattivi. Le tecniche specialistiche utilizzate per evidenziare i sottogruppi deboli non sono necessarie nella determinazione di routine, perch, di solito, una discrepanza (per esempio,
lassenza di unagglutinina attesa), differenzia questi campioni dai campioni di gruppo O. Le emazie A 2 sono utili per facilitare il riconoscimento dellanticorpo anti-A1. Poich la maggior parte dei campioni di gruppo A non presentano lanti-A1, luso routinario di questo reagente non necessario. Discrepanze fra i test sui globuli rossi e sul siero La Tabella 13.1 mostra i risultati e le interpretazioni dei test per la tipizzazione eritrocitaria e sierologica ABO di routine. Si verifica una discrepanza quando i risultati ottenuti con i globuli rossi non concordano con quelli rilevati con il siero. Quando si rileva una discrepanza, il risultato deve essere registrato, ma la definizione del gruppo ABO deve essere rimandata fino a quando la discrepanza non stata risolta. Se il campione quello di ununit di sangue di un donatore, lunit non deve essere rilasciata per scopi trasfusionali, prima che la discrepanza sia stata definita. Quando il sangue proviene, invece, da un potenziale ricevente, pu essere necessario assegnare delle emazie di gruppo O, con un appropriato fenotipo Rh, prima che lindagine sia stata completata. importante disporre di un campione di sangue pre-trasfusionale del paziente in quantit sufficiente per completare ogni studio aggiuntivo che pu rendersi necessario. I risultati dei test sulle emazie e sul siero possono essere discrepanti a causa di problemi intrinseci con le emazie o col siero, oppure dipendere da errori tecnici. Le discrepanze possono venire segnalate perch si sono ottenuti rilievi negativi quando erano attesi risultati positivi, oppure si hanno risultati positivi quando i test dovrebbero essere negativi (vedi Tabella 13.2). Problemi relativi al campione nei test sulle emazie La tipizzazione ABO delle emazie pu dare dei risultati inattesi per molteplici ragioni: 1. gli eritrociti di soggetti con varianti alleliche A o B possono avere determinanti antigenici poco espressi. Unespressione antigenica pu
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Tabella 13.2 - Possibili cause di discrepanza nella tipizzazione ABO Categorie Reattivit debole/assente Cause Sottogruppo ABO Leucemia/Tumore maligno Trasfusione Trasfusione intrauterina nel feto Trapianto Eccesso di sostanze gruppospecifiche solubili Autoagglutinine/eccesso di proteine adese Emazie non lavate: proteine plasmatiche Emazie non lavate: anticorpo nel siero del paziente contro costituenti del reattivo Trapianto Antigene B acquisito Fenomeno B(A) Trasfusione con gruppo ABO diverso Trasfusione recente Trapianto Emorragia feto-materna Chimerismo gemellare o dispermico (tetragametico) Correlata allet (inferiore a 4-6 mesi, anzianit) Sottogruppo ABO Ipogammaglobulinemia Trapianto Autoanticorpo freddo Alloanticorpo freddo Anticorpo sierico reattivo con i componenti dei diagnostici Eccesso di proteine sieriche Trasfusioni di componenti plasmatici Trapianto Infusione endovenosa di immunoglobuline 3. quantit eccezionalmente elevate di sostanze gruppospecifiche solubili A o B nel plasma possono reagire e neutralizzare gli anticorpi del siero diagnostico, determinando uninattesa reazione negativa contro emazie sospese nel siero o nel plasma; 4. un paziente con una potente autoagglutinina pu presentare delle emazie cos rivestite dallautoanticorpo da agglutinarsi spontaneamente, in presenza del diluente,
Reattivit inattesa delle emazie
Reattivit a campo misto
Reattivit del siero debole/assente
Reattivit incongrua del siero
essere indebolita anche sui globuli rossi dei pazienti affetti da leucemia o da altre malattie di natura maligna; 2. un paziente che ha ricevuto trasfusioni di concentrati eritrocitari (CE) o un trapianto di midollo ematopoietico, pu avere nel circolo emazie con gruppi sanguigni ABO differenti e costituire una chimera trasfusionale o da trapianto (vedi oltre, Agglutinazioni a campo misto);
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5.
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indipendentemente dalla specificit del siero diagnostico utilizzato; anormali concentrazioni proteiche o la presenza nel siero di soluzioni macromolecolari (infuse di recente) possono provocare unaggregazione aspecifica delle emazie, sospese nel siero, che simula lagglutinazione; le emazie sospese nel siero o nel plasma possono dare reazioni falsamente positive con i reattivi monoclonali, se il siero o il plasma contengono autoanticorpi pHdipendenti19,20. Le emazie sospese nel siero o nel plasma possono dare dei risultati discrepanti anche a causa di anticorpi reattivi con coloranti o componenti dei diagnostici21 o con proteine che formano impilamento di eritrociti; le emazie di alcuni soggetti di gruppo B vengono agglutinate da un reattivo diagnostico anti-A (certificato dalla FDA), che contenga un particolare anticorpo monoclonale di origine murina, lMHO4. Questi individui di gruppo B presentano un livello eccessivo della specifica galattosiltrasferasi dellallele B: stata utilizzata la sigla B(A) a indicare questo particolare fenotipo22; le emazie degli individui con il fenotipo B acquisito danno tipicamente agglutinazioni di forte intensit con lanti-A e di minore intensit con lanti-B, mentre il siero contiene un potente anti-B. Il fenotipo B acquisito si forma quando una deacetilasi di origine batterica modifica lantigene A, alterando lo zucchero immunodominante (N -acetil-D-galattosamina), in modo che assomigli al galattosio, che il determinante B. Il fenomeno B acquisito viene rilevato pi spesso in soggetti di fenotipo A1; anormalit ereditarie o acquisite della membrana eritrocitaria possono condurre a ci che viene indicato come una situazione di poliagglutinabilit. Gli eritrociti anormali possono essere inaspettatamente agglutinati dai reattivi anti-A, anti-B o da
entrambi, perch i reattivi di origine umana contengono degli anticorpi che sono specifici per i cosiddetti criptoantigeni, che si espongono sulla superficie della membrana eritrocitaria nelle situazioni di poliagglutinabilit. Generalmente, i reattivi monoclonali anti-A ed anti-B non rilevano la poliagglutinabilit. Problemi relativi al campione nei test sul siero o sul plasma Anche i test indiretti (su siero o plasma) sono soggetti a falsi risultati: 1. piccoli coaguli di fibrina, che possono essere scambiati per agglutinati, possono essere osservati nei test ABO con il plasma o con siero non completamente coagulato; 2. risultati negativi o deboli si osservano nei test sierologici di lattanti di et inferiore ai 4-6 mesi. Il siero dei neonati non viene solitamente esaminato perch gli anticorpi presenti sono generalmente trasferiti passivamente dalla madre; 3. la mancanza di unisoagglutinina attesa pu essere dovuta alla presenza di una variante A o B; 4. i pazienti immunodeficienti a causa di una malattia o di una terapia, possono presentare un livello cos depresso delle immunoglobuline da determinare unagglutinazione debolissima o assente per lattivit delle isoagglutinine ABO. I campioni di pazienti anziani, i cui livelli anticorpali sono declinati con let, oppure provenienti da pazienti, i cui anticorpi sono stati pesantemente diluiti con procedure di plasmaferesi, possono presentare delle isoagglutinine inaspettatamente deboli; 5. se un paziente ha ricevuto un trapianto di midollo ematopoietico di diverso gruppo ABO, gli anticorpi del siero non saranno complementari con gli antigeni eritrocitari. Per esempio, un individuo di gruppo A, che abbia ricevuto un trapianto di midollo di gruppo O, pu avere in circolo emazie di gruppo O, ma produrr soltanto anticorpi anti-B nel siero. Per maggiori informazioni sugli effetti dei trapianti ABO incompatibili, consultare il Capitolo 25;
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6. allo- o autoanticorpi freddi, reattivi a temperatura di laboratorio, possono reagire con una o entrambe le emazie test utilizzate nella prova indiretta. Per esempio, se il paziente ha un anticorpo freddo anti-M reattivo a temperatura ambiente, si pu determinare, alla prova indiretta, uninaspettata agglutinazione delle emazie test A1 e/o B se queste sono M-positive; 7. anticorpi specifici per delle componenti del medium utilizzato per la conservazione delle emazie test A1 e B possono agglutinare le emazie, indipendentemente dagli antigeni e dagli anticorpi ABO; 8. unanormale concentrazione proteica, che alteri le proporzioni delle componenti sieriche o la presenza di espansori plasmatici ad alto peso molecolare, possono provocare unaggregazione cellulare aspecifica, detta impilamento, che pu essere difficile da distinguere da una vera agglutinazione. La formazione di impilati facilmente riconoscibile con lesame microscopico, se le emazie assumono ci che descritto come la formazione di una pila di monete; 9. una trasfusione recente di plasmacomponenti che contengano isoagglutinine ABO pu causare delle reazioni inattese; 10. la recente infusione venosa di immunoglobuline che possono contenere isoagglutinine ABO pu determinare reazioni inattese. Agglutinazioni a campo misto Occasionalmente si possono osservare dei campioni che contengono due distinte e separabili popolazioni eritrocitarie. Solitamente, questo evidenzia una recente trasfusione di emazie di gruppo O in un ricevente di diverso gruppo sanguigno o lattecchimento di un trapianto di midollo ematopoietico di un gruppo ABO diverso da quello del paziente stesso. La miscela dei globuli rossi avviene anche in una condizione indicata come chimerismo, che origina sia dallo scambio intrauterino di tessuto ematopoietico tra due gemelli dizigotici o dal mosaicismo indotto da una dispermia. In tutti questi casi, la tipizzazione
ABO diretta pu presentare un quadro di agglutinazione a campo misto. Le reazioni a campo misto di origine trasfusionale terminano con la fine della sopravvivenza delle emazie trasfuse. Dopo un trapianto di midollo ematopoietico, le reazioni a campo misto solitamente scompaiono quando le emazie originali del paziente non vengono ulteriormente prodotte, anche se persistenti popolazioni eritrocitarie miste possono permanere in alcuni riceventi di trapianto. Le reazioni a campo misto che derivano da un chimerismo del gruppo sanguigno possono persistere per tutta la vita. Per maggiori informazioni relative alle trasfusioni e valutazione dei trapianti ematopoietici dei pazienti, fare riferimento ai Capitoli 21 e 25. Errori tecnici Gli errori tecnici che conducono a delle discrepanze ABO comprendono i casi elencati di seguito: 1. miscelazione di campioni diversi; 2. sospensioni eritrocitarie troppo concentrate o troppo diluite; 3. omessa aggiunta dei reattivi; 4. mancato rilievo di unemolisi; 5. mancata applicazione delle istruzioni del produttore del diagnostico; 6. centrifugazione dei test eccessiva o scarsa; 7. scorretta interpretazione o registrazione dei risultati dei test. Risoluzione delle discrepanze La prima cosa da fare per la risoluzione di un evidente problema di sierologia, deve essere quella di ripetere il test sul medesimo campione. Se i test iniziali sono stati eseguiti su eritrociti sospesi in siero o plasma, la verifica dei test deve essere ripetuta dopo ripetuti lavaggi delle emazie con soluzione fisiologica. Il lavaggio degli eritrociti pu eliminare molti dei problemi relativi alla tipizzazione delle emazie, se associati con le proteine plasmatiche. Se il problema persiste, i seguenti passi possono essere inclusi nellindagine: 1. ottenere informazioni sulla diagnosi del
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paziente, precedenti determinazioni del gruppo sanguigno ed anamnesi relativa a pregresse trasfusioni, a trapianti e farmaci; 2. ricontrollare i risultati dellidentificazione dellanticorpo, utilizzando emazie O ed emazie autologhe, per rilevare possibili interferenze causate da allo- o autoanticorpi; 3. ottenere un nuovo prelievo di sangue ed esaminare il nuovo campione, se si sospetta che la discrepanza possa essere causata da un campione contaminato. Oltre ad una discrepanza tra le emazie ed il siero, si pu originare un problema anche quando la reattivit osservata in disaccordo con i risultati previsti o con risultati registrati in precedenza. Il primo passo per risolvere questo tipo di problemi quello di procurarsi un nuovo prelievo di sangue. Risoluzione di discrepanze dovute allassenza di un antigene atteso La causa del problema pu qualche volta essere attribuita allintensit della reazione ottenuta nei test con i globuli rossi o con il siero. Per esempio, un siero che agglutina fortemente le emazie di gruppo B ma non reagisce con le emazie A1, probabilmente proviene da un soggetto di gruppo A, anche se le emazie non vengano agglutinate con i sieri anti-A ed anti-B nella prova diretta. Le seguenti procedure possono essere utilizzate per incrementare la reattivit dei determinanti antigenici debolmente espressi: 1. incubare i globuli rossi lavati con lanti-A, lantiB e lanti-A,B per 15 minuti a temperatura ambiente, per incrementare lassociazione dellanticorpo con lantigene. Incubare i test dai 15 ai 30 minuti a 4 C pu aumentare ulteriormente ladesione dellanticorpo. Si raccomanda un controllo con un mezzo inerte (per esempio albumina al 6%), oppure un autocontrollo, per i test a temperatura ambiente e a 4 C. Si dovrebbero consultare le istruzioni del produttore per eventuali commenti o delle limitazioni; 2. pre-trattare le emazie del paziente con enzimi proteolitici, quali la ficina, la papaina o la bromelina. Il trattamento enzimatico
incrementa la reazione anticorpo-antigene con lanti-A e lanti-B. Se si utilizzano emazie trattate con enzimi, in qualche caso, la reazione tra i diagnostici e i globuli rossi che esprimono lantigene diventa visibile entro 30 minuti a temperatura ambiente. Per controllare la specificit della reazione ABO, si debbono analizzare, in parallelo, emazie di gruppo O, trattate con enzimi ed emazie autologhe. Si dovrebbero consultare le istruzioni del produttore per eventuali commenti o limitazioni; 3. incubare unaliquota di emazie a temperatura ambiente o a 4 C, con lanti-A o lanti-B (appropriatamente al caso) per assorbire lanticorpo al corrispondente antigene eritrocitario per una successiva eluizione (vedi Metodo 2.4). Emazie di gruppo A o B (appropriatamente al caso) ed emazie O dovrebbero essere soggette a una metodica di assorbimento-eluizione condotta in parallelo con ogni reattivo necessario, come controllo positivo o negativo. La lectina anti-A1 non deve essere utilizzata per le procedure di assorbimento/eluizione perch in forma concentrata, come in un eluato, pu reagire, in modo aspecifico, con i globuli rossi. Testare gli eluati contro emazie A1, B e O. Reattivit inattese negli eluati di controllo invalidano i risultati ottenuti con le emazie del paziente. Questo indica che le procedure di assorbimento/eluizione non sono state eseguite correttamente, un altro anticorpo pu essere presente (per esempio nel reattivo policlonale) o la specificit del reattivo monoclonale non abbastanza diversificata per il reattivo che deve essere utilizzato con questo metodo; 4. testare la saliva per la presenza degli antigeni idrosolubili H e A o B (vedi Metodo 2.5). I test sulla saliva sono di aiuto per risolvere le discrepanze ABO solo se il soggetto un secretore. Questo pu essere presunto dal fenotipo Lewis ma pu non essere noto fino a quando i test sulla saliva non siano stati completati. Vedere la discussione relativa agli antigeni Lewis.
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Risoluzione di discrepanze dovute allassenza di un anticorpo atteso 1. Incubare il siero con dei globuli rossi A1 e B da 15 a 30 minuti a temperatura ambiente. Se non si rilevano reazioni, incubare i test da 15 a 30 minuti a 4 C. Quale controllo per reattivit da parte delle comuni autoagglutinine fredde, si raccomanda di comprendere un autocontrollo ed emazie di gruppo O, per i test condotti a temperatura ambiente e a 4 C. 2. Pre-trattare le emazie testo A1 e B con enzimi proteolitici, quali la ficina, la papaina o la bromelina. Emazie di gruppo O, pre-trattate con enzimi e le emazie autologhe, devono essere esaminate in parallelo come controllo della reattivit. Le istruzioni del produttore dovrebbero essere consultate per eventuali commenti o limitazioni. Risoluzione delle discrepanze dovute a inattese reazioni degli eritrociti con lanti-A e lanti-B Globuli rossi tipizzati per lABO presentano, in qualche caso, delle reazioni positive inattese. Per esempio, un diagnostico anti-A pu agglutinare debolmente le emazie di un campione, il cui siero presenta le reazioni attese per un normale gruppo B o O. I paragrafi successivi descrivono alcuni eventi, che possono causare reazioni inattese nei test di tipizzazione ABO ed i passi che devono essere intrapresi per identificarne la causa. Fenotipo B(A). Quando un campione reagisce debolmente con un reattivo monoclonale anti-A e fortemente con un anti-B, mentre il siero reagisce con le emazie A1, ma non con le emazie B, pu essere sospettato un fenotipo B(A). La verifica che il reattivo anti-A monoclonale contiene lanticorpo discriminante del clone MHO4 pu confermare il sospetto. Le emazie B(A) possono presentare una reattivit variabile con lanti-A; la maggior parte dei campioni reagisce debolmente e gli agglutinati sono fragili e si disperdono facilmente, bench alcuni casi di questo fenotipo abbiano reagito con unintensit 2+22. I sieri di questi soggetti agglutinano sia le emazie testo A1 che quelle A2.
Eccetto i casi di neonati e di pazienti immunocompromessi, i test sul siero possono differenziare questo fenomeno da un gruppo AB nel quale un sottogruppo di A sia accompagnato dalla presenza nel siero dellanti-A1. Lanalisi con un anti-A non prodotto dal clone MHO4 pu risolvere la discrepanza. Il ricevente pu essere considerato un gruppo B. Fenotipo B acquisito. La situazione di emazie fortemente agglutinate dallanti-A e debolmente dallanti-B, mentre il siero contiene un potente anti-B, suggerisce la presenza del fenotipo B acquisito. Il fenomeno di tale acquisizione viene rilevato, nella maggior parte dei casi, in soggetti A1; mentre sono stati trovati pochissimi esempi di soggetti A2 con B acquisito. La maggior parte dei globuli rossi con B acquisito reagisce debolmente con lanti-B, ma occasionali campioni possono essere agglutinati fortemente. Il comportamento con gli anti-B monoclonali varia secondo il particolare clone utilizzato. Un aumento della frequenza dei casi di acquisizione dellantigene B simile stato osservato con alcuni monoclonali, approvati dalla FDA, contenenti il clone ES-423, ma i produttori dei diagnostici hanno abbassato il pH di questi reattivi anti-B, in modo che la frequenza del rilievo del fenotipo B acquisito tornasse a dei livelli sovrapponibili a quelli osservabili con lanti-B policlonale, oppure hanno cessato limpiego di questo clone. Per confermare che emazie di gruppo A hanno acquisito strutture B, si debbono eseguire le tappe elencate qui di seguito: 1. accertare la diagnosi del paziente. Lantigene B acquisito solitamente associato a condizioni tissutali che permettono lingresso nel torrente circolatorio di colonie batteriche, ma il B acquisito stato rilevato anche su eritrociti di donatori di sangue apparentemente normali23; 2. esaminare il siero del paziente contro le emazie autologhe o delle emazie note per possedere lantigene B acquisito. Lanti-B di questi soggetti non agglutina le proprie emazie o quelle dei soggetti con emazie che presentano il B acquisito; 3. esaminare le emazie con reattivi anti-B
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monoclonali per i quali i produttori forniscono istruzioni dettagliate. Diversamente dalla maggioranza dei sieri test policlonali di origine umana, alcuni monoclonali non sono reattivi con il fenotipo B acquisito; questa informazione pu essere descritta nelle istruzioni fornite dal produttore; 4. esaminare le emazie con un siero anti-B umano che stato acidificato a pH 6.0. Una volta acidificato, il siero anti-B umano non reagisce con lantigene B acquisito. Emazie rivestite da anticorpi. Gli eritrociti di neonati affetti da MEFN o di adulti affetti da patologie auto- o alloimmunitarie, possono essere cos pesantemente ricoperti di molecole anticorpali IgG da agglutinare spontaneamente in presenza di un reattivo, il cui diluente contenga unelevata concentrazione proteica. Di solito questo si verifica in alcuni sieri test anti-D, con un range proteico che va dal 18 al 22%, ma qualche volta le emazie sensibilizzate si agglutinano anche con i reattivi ABO, con una concentrazione proteica dal 6 al 12%. I Metodi 2.12 o 2.14 possono essere utilizzati per rimuovere la maggior parte di questi anticorpi dalle emazie in modo che possano essere esaminate in modo attendibile con lanti-A e lantiB. Le emazie di un campione contenente delle autoagglutinine fredde di classe IgM possono autoagglutinarsi nei test in soluzione fisiologica. Incubare brevemente la sospensione delle emazie a 37 C e lavarle ripetutamente con fisiologica riscaldata a 37 C, pu, di solito, rimuovere gli anticorpi. Se lagglutinazione correlata alle IgM non viene dispersa con questa tecnica, le emazie possono essere trattate con composti sulfidrilici, come il ditiotreitolo (DTT) (vedi Metodo 2.11). Risoluzione delle discrepanze dovute a reazioni inattese del siero Il paragrafo che segue descrive alcuni eventi che possono causare dei risultati sierologici inattesi o errati e i passi che devono essere intrapresi per risolverli. 1. La reattivit delle emazie A1, quando lanti-A fortemente reattivo con gli eritrociti nella
prova diretta, suggerisce la presenza dellanti-A1 nel siero di un soggetto di gruppo A2 o A2 B. Per dimostrare che questa la causa della discrepanza: a. testare le emazie del paziente con la lectina anti-A1 per differenziare il gruppo A1 dalle emazie A2; b. testare il siero contro diversi campioni di ognuna delle seguenti emazie: A1, A2, e O. Solo se lanticorpo agglutina tutti i campioni A1 e nessuno dei campioni A2 o O pu essere identificato come anti-A1. 2. Potenti autoagglutinine fredde, come lanti-I, lanti-IH, lanti-IA e lanti-IB, possono agglutinare le emazie di un adulto, comprese le emazie autologhe e le emazie test della prova indiretta a temperatura ambiente (20-24 C). Salvo poche eccezioni, lagglutinazione indotta dalle autoagglutinine fredde meno forte di quella prodotta dallanti-A e dallanti-B. Si possono mettere in pratica i passi descritti successivamente, quando la reattivit interferisce al punto di rendere difficoltosa linterpretazione dei test sul siero: a. pre-riscaldare il siero e le emazie test a 37 C prima di miscelarle ed esaminarle. Incubare per 1 ora ed eseguire una lettura dei risultati selettiva (per esempio, esaminare per lagglutinazione senza centrifugare). Rari esemplari di deboli anti-A o anti-B di classe IgM possono non essere rilevati con questo metodo; b. rimuovere lautoagglutinina fredda dal siero utilizzando una metodica di autoassorbimento a freddo come descritta nel Metodo 4.6. Il siero assorbito pu essere esaminato contro le emazie test A1 e B. 3. Anticorpi inattesi che reagiscono a temperatura ambiente, come lanti-P1 o lantiM, possono agglutinare le emazie utilizzate nei test sul siero se gli eritrociti presentano lantigene corrispondente. Una o pi emazie testo, utilizzate nella ricerca degli anticorpi irregolari, pu essere stata agglutinata se la miscela siero-emazie stata centrifugata sia per una lettura a temperatura ambiente che
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a 37 C; un siero raro potrebbe reagire con un antigene a bassa frequenza, casualmente presente sulle emazie test impiegate nella prova indiretta di gruppo ABO, ma assente sulle emazie test della ricerca degli anticorpi irregolari. I passi che devono essere eseguiti per una corretta definizione ABO di un siero contenente un alloanticorpo freddo comprendono quanto segue: a. identificazione degli alloanticorpi reattivi a temperatura ambiente, come descritto nel Capitolo 19 e tipizzazione delle emazie test A1 e B per accertare quali presentano lantigene corrispondente. Procurarsi delle emazie A 1 e B che siano .prive dellantigene bersaglio dellanticorpo irregolare ed utilizzarle per esaminare il siero; b. aumentare la temperatura a 30-37 C prima di miscelare il siero e le e mazie test, incubare per 1 ora; ed eseguire una lettura selettiva (per esempio, senza la centrifugazione). Se lampiezza termica dellanticorpo al di sotto della temperatura alla quale reagiscono gli antiA e anti-B, questo pu risolvere la discrepanza; c. se la ricerca di anticorpi irregolari negativa, testare il siero con numerosi campioni di emazie A1 e B. Il siero pu contenere un anticorpo specifico per un antigene a bassa frequenza, che sar assente sulla maggioranza delle emazie A1 e B selezionate a caso. 3. I sieri dei pazienti con unanormale concentrazione di proteine o con un rapporto siero-proteico alterato o che hanno ricevuto degli espansori plasmatici ad alto peso molecolare possono aggregare le emazie test, simulando unagglutinazione. Alcuni di questi campioni provocano laggregazione del tipo descritto come rouleaux (impilamento). Molto frequentemente, gli aggregati appaiono come raggruppamenti di forma irregolare che sembrano effettivamente agglutinati indotti da anticorpi. I risultati dei test sul
siero spesso possono essere corretti diluendo il siero 1:3 in soluzione fisiologica per eliminare la sua capacit aggregante, oppure utilizzando la tecnica di sostituzione con soluzione salina (vedi Metodo 3.4).
Il sistema H
Sulle emazie di gruppo O, mancano gli antigeni A e B e la membrana esprime unabbondante quantit di antigene H. Questo perch la sostanza H un precursore degli antigeni A e B, le persone di gruppo A o B hanno una minore quantit di H rispetto alle persone di gruppo O. La quantit di antigene H rilevata sui globuli rossi con la lectina anti-H da Ulex europaeus , in ordine di diminuzione quantitativa: O>A2>B>A2B>A1>A1B. Occasionalmente, individui di gruppo A1, A1B o (meno frequentemente) B hanno cos poco antigene H non convertito sulle loro emazie da produrre lanticorpo anti-H. Questo tipo di anti-H generalmente debole, reagisce a temperatura ambiente o pi bassa e non considerato come clinicamente significativo. I soggetti del raro fenotipo Oh (vedi subito di seguito), le cui emazie sono prive dellantigene H, hanno un potente alloanticorpo anti-H, clinicamente significativo (oltre allanti-A e allanti-B). Il fenotipo Oh Il termine Oh o Bombay viene utilizzato per indicare i rarissimi soggetti, i cui eritrociti e le cui secrezioni sono privi degli antigeni H, A e B, mentre il loro plasma contiene dei potenti anticorpi anti-H, anti-A e anti-B6. Questo fenotipo venne originariamente scoperto in India, nella citt di Bombay. Nelle indagini iniziali, questo fenotipo mima le caratteristiche di un comune gruppo O, ma diventa evidente quando il siero di un soggetto Oh viene testato contro delle emazie di gruppo O, causando una potente ed immediata agglutinazione e/o emolisi delle emazie, dopo una centrifugazione immediata. Lanti-H dei soggetti O h reagisce con una ampiezza termica che si estende dai 4 ai 37 C
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con tutti i campioni di emazie, ad eccezione di quelli provenienti da altri soggetti Bombay. Le persone O h devono essere trasfuse esclusivamente con del sangue Oh, perch i loro anticorpi naturali distruggono rapidamente i globuli rossi che presentano gli antigeni A, B o H. Se sono reperibili altri campioni di globuli rossi O h, unulteriore conferma pu essere ottenuta dimostrando la compatibilit del siero con tali emazie Oh. A livello genotipico, il fenotipo Oh origina dalla trasmissione degli alleli hh al locus H e di sese al locus Se. Poich lallele Se necessario per la formazione dellantigene Leb, le emazie Oh saranno Le(a+b) oppure Le(ab). I fenotipi para-Bombay La designazione di fenotipi para-Bombay (Ah, Bh e ABh) viene classicamente utilizzata per i soggetti secretori H-deficienti, per esempio, per coloro che hanno una H-trasferasi inattiva, ma una Se-trasferasi attiva. I loro eritrociti sono privi di un antigene H sierologicamente rilevabile, ma presentano piccole quantit di sostanza A e/o B (talvolta rilevabile solamente con procedure di assorbimento/eluizione), in rapporto agli alleli individuali presenti al locus ABO. I test con sieri diagnostici anti-A o anti-B possono dare o meno, delle deboli reazioni, ma le emazie non sono reattive con la lectina anti-H o con il siero anti-H dei soggetti Bombay. Gli individui che presentano il fenotipo para-Bombay possiedono un allele funzionale Se , perci esprimeranno gli antigeni A, B ed H nel loro plasma e nelle secrezioni. Il siero dei soggetti Ah e Bh
contiene lanti-H e/o anti-IH oltre agli attesi anti-A o anti-B. I secretori H-deficienti possono anche essere di gruppo O. Queste persone avranno delle tracce di antigeni H, ma non antigeni A o B sulle loro emazie e presenteranno la sostanza H solo nelle loro secrezioni. Nel 1994, Kelley et al. hanno pubblicato le basi molecolari dei fenotipi Bombay e para-Bombay24. Numerose ulteriori mutazioni del locus H sono state successivamente associate alla deficienza dellantigene H.
Il sistema Lewis
Gli antigeni del sistema Lewis, Lea e Le b, originano dallattivit della glicosiltrasferasi codificata dallallele Le che, come le glicosiltrasferasi A, B ed H, aggiungono uno zucchero alla catena di un precursore. Lea viene prodotto quando il gene Le viene ereditato con i geni sese e Leb viene prodotto quando Le viene ereditato con almeno un allele Se . Quando lallele silente o amorfo le viene ereditato, indipendentemente dallallele secretore trasmesso, nessun antigene Lea o Leb viene prodotto. Perci, Lea e Leb non sono antigeni antitetici prodotti da alleli; bens dipendono dallinterazione ereditaria di alleli indipendenti. Gli antigeni Lewis non sono intrinseci della membrana eritrocitaria, ma sono espressi sulle catene glicosfingolipidiche di Tipo 1, che vengono assorbite dal plasma sulla membrana delle
Tabella 13.3 - Fenotipi del sistema Lewis e loro frequenza Reazioni con antiLe + 0 0 +
a
Frequenza fenotipica negli adulti (%) fenotipo Le(a+b) Le(ab+) Le(ab) Le(a+b+) Bianchi 22 72 6 rara Neri 23 55 22 rara
Le 0 + 0 +
+ = agglutinazione; 0 = nessuna agglutinazione
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emazie. I lipidi plasmatici si scambiano liberamente con i lipidi di membrana. Linterazione genica e gli antigeni La biosintesi degli antigeni Lewis dipende dallinterazione di due diverse fucosiltrasferasi: una prodotta dal locus Se ed una dal locus Lewis. Entrambi gli enzimi agiscono sul medesimo precursore, le catene substrato di Tipo 1. La fucosiltrasferasi codificata dallallele Le attacca una molecola di fucosio nella concatenazione (14) del subterminale GlcNAc; in assenza della trasferasi codificata dallallele Se , questa configurazione presenta unattivit Lea. Questo prodotto non pu essere ulteriormente glicosilato. Lantigene Leb si forma quando il precursore di Tipo 1 viene convertito nel Tipo 1 H dalla fucosiltrasferasi prodotta dallallele secretore, che successivamente agisce sulla fucosiltrasferasi prodotta dallallele Le. Questa configurazione Leb ha due fucosi9. Perci, Leb riflette la presenza di entrambi gli alleli Le ed Se. Le senza Se determina la sola attivit Lea; Se con lallele amorfo le determina la mancata secrezione degli antigeni Lea o Leb e gli eritrociti presenteranno il fenotipo Le(ab). La Tabella 13.3 presenta i fenotipi del sistema Lewis e la loro frequenza nella popolazione. I globuli rossi tipizzati come Le(a+b+) sono rari nelle popolazioni europee e di origine africana, mentre sono relativamente comuni negli asiatici, per la presenza di una fucosiltrasferasi codificata da una variante allelica secretore, che compete, con minore efficienza, con la Le-fucosiltrasferasi9. Anticorpi Lewis Gli anticorpi Lewis sono rilevabili, quasi esclusivamente, nei sieri di soggetti Le(ab), di solito in assenza di una stimolazione antigenica evidente. Gli individui che presentano un fenotipo eritrocitario Le(ab+) non possono produrre anticorpi anti-Lea, perch piccole quantit di sostanza Lea non convertita sono presenti nella loro saliva e nel plasma. molto inconsueto rilevare lanti-Leb nei sieri dei soggetti con fenotipo Le(a+b), ma lanti-Leb pu essere presente da
solo o insieme con lanti-Lea, nei sieri dei soggetti Le(ab). Gli anticorpi Lewis sono frequentemente osservati nei sieri delle donne in gravidanza che presentano un fenotipo transitorio Le(ab). Gli anti-Lewis, tuttavia, sono quasi sempre IgM e non attraversano la placenta. Per questo motivo e perch gli antigeni Lewis sono poco sviluppati alla nascita, gli anticorpi non sono associati con MEFN. Gli anticorpi Lewis possono fissare il complemento e sieri freschi contenenti lanti-Lea (o raramente lanti-Leb) possono emolizzare in vitro le emazie incompatibili. Lemolisi osservata con maggiore frequenza con dei globuli rossi pretrattati con enzimi piuttosto che con emazie non trattate. La maggior parte degli anticorpi Lewis agglutinano direttamente in soluzione salina le emazie con fenotipo appropriato. Gli agglutinati prodotti sono spesso fragili e vengono facilmente dispersi, se il fondello di emazie non viene risospeso delicatamente, dopo la centrifugazione. Qualche volta lagglutinazione pu essere visibile dopo lincubazione a 37 C, ma raramente con la stessa intensit osservata nei test incubati a temperatura ambiente. Alcuni campioni di antiLea e, meno frequentemente, anti-Leb, possono essere rilevati con il test allantiglobulina. Talvolta questo dovuto al complemento fissato dallanticorpo, se viene utilizzato un siero antiglobuline polispecifico (contenente anticomplemento). In altri casi, la reattivit con il siero antiglobulina dovuta ad una componente anticorpale di classe IgG. I sieri con attivit anti-Leb possono essere classificati in due categorie. Il tipo pi comune reagisce meglio con le emazie Le(b+) di gruppo O ed A2; questi anticorpi sono stati definiti come anti-LebH . Gli anticorpi che reagiscono allo stesso modo con lantigene Leb di tutti i fenotipi ABO sono indicati come anti-LebL. Pratica trasfusionale e sistema Lewis Gli antigeni Lewis vengono rapidamente assorbiti ed eluiti dalla membrana eritrocitaria. Le emazie trasfuse perdono i loro antigeni Lewis ed assumono il fenotipo Lewis del ricevente, entro
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pochi giorni dallimmissione in circolo. Gli antiLewis presenti nel siero di un ricevente sono rapidamente neutralizzati dagli antigeni Lewis presenti nel plasma del donatore. Per queste ragioni, assolutamente eccezionale che gli antiLewis possano causare lemolisi di emazie Le(a+) o Le(b+) trasfuse. Non considerata necessaria la tipizzazione del donatore di sangue per la presenza degli antigeni Lewis prima della trasfusione o quando vengono eseguiti prove di compatibilit per riceventi con anti-Lewis; ci si aspetta che i globuli rossi risultati compatibili nei test a 37 C sopravvivano normalmente in vivo25,26. Gli antigeni Lewis nei bambini Le emazie dei neonati solitamente non sono reattive n con lanti-Lea n con lanti-Leb umani e vengono considerati come Le(ab). Su alcuni campioni pu essere dimostrata la presenza di piccole quantit di antigene Lea quando vengono esaminate con dei potenti diagnostici anti-Lea monoclonali. Nei bambini piccoli, la frequenza di fenotipi Le(a+) pi alta mentre quella di emazie Le(b+) pi bassa, riflettendo una maggior produzione della trasferasi codificata dallallele Le negli infanti; la trasferasi codificata dallallele Se viene prodotta ad un livello inferiore. Il fenotipo Le(a+b+) pu essere transitoriamente osservato nei bambini quando la trasferasi dellallele Se incrementa verso il livello degli adulti. Unaffidabile tipizzazione degli antigeni Lewis nei bambini piccoli non possibile, perch le reazioni dei test possono non riflettere il vero fenotipo prima dei 2 o 3 mesi di et25.
Gli antigeni e gli anticorpi I/i

Le agglutinine fredde con specificit anti-I vengono frequentemente osservate nei sieri di individui normali. Lanticorpo non , di solito, clinicamente significativo ed reattivo con tutti i campioni eritrocitari tranne che con le emazie da cordone ombelicale e con i rari adulti di fenotipo i. Gli antigeni I ed i, tuttavia, non sono antitetici ma vengono espressi con una reciproca relazione.
Alla nascita, le emazie neonatali sono ricche di antigeni i, mentre quello I quasi indeterminabile. Perci, a fini pratici, le emazie cordonali sono considerate I,i+. Durante i primi due anni di vita, lantigene I aumenta gradualmente a spese dellantigene i. Le emazie di quasi tutti gli adulti sono fortemente reattive con lanti-I e debolmente, o per nulla, reattive con lanti-i. Rari soggetti adulti hanno delle emazie che presentano elevati livelli di antigene i e solo quantit in tracce di I; questi globuli rossi presentano il fenotipo i adulto. Non esistono dei veri fenotipi I o i. Gli antigeni I e i espressi sugli eritrociti sono strutture intrinseche presenti sulle medesime glicoproteine e glicosfingolipidi che portano gli antigeni H, A e B e, nelle secrezioni, sulle stesse glicoproteine che portano H, A, B, Lea e Leb. Gli antigeni I ed i sono legati pi strettamente alla membrana eritrocitaria di quanto lo siano gli zuccheri terminali che determinano gli antigeni ABH. La struttura dellantigene i costituita da una catena lineare con almeno due unit ripetitive di N-acetilgalattosamina [Gal(14)GlcNAc(13)]. Sulle emazie degli adulti, molte di queste catene lineari sono modificate per laggiunta di strutture ramificate costituite da GlcNAc in un legame (1 6) con un residuo galattosio, interno alla sequenza ripetitiva. La configurazione ramificata conferisce la specificit I27,28. Differenti esemplari di anti-I sembrano riconoscere differenti porzioni della catena oligosaccaridica ramificata. Quando si verifica la ramificazione e non appena sono aggiunti gli zuccheri per gli antigeni H, A e B, laccesso degli anti-i ed anti-I pu essere limitato.25 Lantigene I, cos come li, sono abitualmente compresi nella Raccolta (Collection) Ii della nomenclatura ISBT. La recente clonazione del gene che codifica la trasferasi responsabile della conversione delle catene lineari attive dellantigene i nelle catene ramificate attive dellantigene I ed portatore di numerose mutazioni responsabili del raro fenotipo i adulto, ha determinato lassegnazione dellantigene I al nuovo sistema di gruppo
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eritrocitario I; mentre lantigene i rimane nella Raccolta (Collection) Ii29. Anticorpi anti-I/i Lanti-I un comune anticorpo benigno rilevabile nel siero di molti soggetti normali e in buona salute, che si presenta come unagglutinina fredda attiva a 4 C con un titolo inferiore a 64. Lagglutinazione con le emazie di adulto e la debole, o mancante, attivit contro le emazie cordonali, costituisce la sua classica reattivit. Alcuni potenti esemplari agglutinano fortemente le emazie a temperatura ambiente; altri possono reagire con intensit 1+, presentando delle reazioni inconsistenti. Nellincubazione a basse temperature viene incrementata la reattivit dellanti-I e ci aiuta a confermarne lidentificazione; anche luso dellalbumina o di emazie trattate con enzimi incrementano la reattivit dellanti-I. Gli autoanticorpi anti-I assumono un significato clinico quando determinano la sindrome da agglutinine fredde (CAS, Cold Agglutinin Syndrome) nella quale, con un alto titolo ed un ampio range termico, si comportano come un autoanticorpo fissante il complemento. La specificit dellautoanticorpo nella CAS pu non essere evidente, se viene esaminato un siero indiluito (le emazie I di adulto e le emazie cordonali possono reagire con la medesima intensit a temperatura ambiente); possono rendersi necessarie indagini che comprendano la titolazione e/o lampiezza termica della reattivit
con le diverse emazie per definirne la specificit (vedi Capitolo 20). Gli anti-I vengono spesso prodotti dai pazienti affetti da polmonite dovuta a Mycoplasma pneumoniae. Questi pazienti possono avere degli episodi emolitici transitori determinati dallanticorpo. Lautoanticorpo anti-i coinvolto con minore frequenza in patologie sintomatiche, in confronto allanti-I. In rare situazioni, lanti-i pu essere rilevato come una debole agglutinina reattiva preferibilmente 4 C. Lanti-i reagisce fortemente con le emazie cordonali e con quelle dei fenotipi i adulto e, pi debolmente, con le emazie I di adulti. I pazienti affetti da mononucleosi infettiva spesso presentano dei transitori, ma potenti, anticorpi anti-i. La Tabella 13.4 illustra il comportamento sierologico dellanti-I e dellanti-i a 4 e a 22 C. Le intensit delle reazioni devono essere considerate in modo relativo. Differenze nette di reattivit tra i due anticorpi vengono osservate solo con i campioni anticorpali debolmente reattivi. Possono rendersi necessari studi di titolazione per differenziare la specificit degli anticorpi fortemente reattivi. Talora, un siero contenente anti-I o anti-i reattivo allantiglobulina se si utilizzano sieri antiglobuline umane polispecifici. Reazioni del genere raramente indicano unattivit anticorpale a 37 C. Piuttosto, si fissano componenti complementari, quando il siero e le emazie interagiscono a temperature inferiori; durante
Tabella 13.4 - Comportamento sierologico comparativo degli anticorpi I/i con sospensioni eritrocitarie in soluzione salina Temperatura 4 C Fenotipo emazie I adulto i cordonale i adulto I adulto i cordonale i adulto Anti-I 4+ 0-2+ 0-1+ 2+ 0 0 Anti-i 0-1+ 3+ 4+ 0 2-3+ 3+
22 C
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lincubazione a 37 C, lanticorpo si dissocia ma il complemento resta legato ai globuli rossi. Perci, la reattivit osservata allantiglobulina di solito dovuta alle componenti anticomplemento presenti nei sieri antiglobuline polispecifici. Evitando il test a temperatura di laboratorio e utilizzando un anti-IgG al posto del siero antiglobuline polispecifico, si pu, solitamente, evitare il rilievo degli autoanticorpi freddi. Per rimuovere dal siero un potente autoanticorpo, fortemente reattivo, pu rendersi necessario in autoassorbimento a freddo; il siero o il plasma, autoassorbiti possono essere utilizzati anche per la tipizzazione ABO nella prova indiretta (vedi Metodo 4.6). La tecnica del preriscaldamento pu anchessa essere utilizzata, dopo che la reattivit sia stata confermata come determinata da un autoanticorpo freddo (vedi Metodo 3.3). Reattivit complesse Alcuni anticorpi sembrano riconoscere i determinanti I quando questi sono associati agli zuccheri immunodominanti H, A o B. Lanti-IH ricorre comunemente, infatti, nel siero di soggetti A1; esso reagisce fortemente con gli eritrociti che presentano i livelli pi elevati sia di H che di I (per esempio, eritrociti di gruppo O od A2), mentre debolmente o per nulla reattivo, con le emazie di sottogruppo A1 di adulti o con le emazie cordonali di qualunque gruppo.
Lanti-IH deve essere sospettato quando il siero di un paziente di gruppo A causa lagglutinazione diretta di tutti i campioni eritrocitari utilizzati per la ricerca degli anticorpi irregolari mentre compatibile con tutti o con la maggior parte, dei donatori di sangue di gruppo A. Altri esempi di reattivit verso strutture antigeniche composite comprendono lanti-IA, -IP, -IBH, -ILebH e -iH.
Il sistema di gruppo P e gli antigeni ad esso correlati

Il sistema di gruppo P era tradizionalmente costituito dagli antigeni P, P1 e Pk e, in un secondo tempo, da quello Luke (LKE). Tuttavia, la biochimica e la genetica molecolare, sebbene non ancora completamente delucidate, hanno reso evidente che almeno due vie biosintetiche e dei geni posti in loci diversi sono coinvolti nello sviluppo e nellespressione di questi antigeni. Perci, nella nomenclatura ISBT, lantigene P assegnato al nuovo sistema di gruppo GLOB (globoside); il P1 assegnato al sistema P, mentre Pk e Luke restano nella collezione antigenica GLOB29. Per semplicit, questi antigeni sono spesso descritti come appartenenti al sistema P. Il primo antigene del sistema P venne scoperto da Landsteiner e Levine, nel 1927, in una serie di esperimenti con animali che portarono alla scoperta anche degli antigeni M ed N.
Tabella 13.5 - Fenotipi del sistema P e antigeni correlati Reazioni con sieri antiP1 + 0 0 + 0 P + + 0* 0 0 Pk 0 0 0 + + P1+P+Pk + + 0 + + Fenotipo P1 P2 p P1k P2k Frequenza fenotipica (%) Bianchi 79 21 Rarissimo Rarissimo Rarissimo Neri 94 6 Rarissimo Rarissimo Rarissimo
*Di solito negativo, occasionalmente debolmente positivo
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Lactosilceramide (CDH, Ceramide dihexose) Pk Globotriosilceramide (CTH, Ceramiode trihexose) P Globoside LKE Sialosilgalattosilgloboside Paragloboside P1 Galattosilparagloboside
Gal(14)Glc-Cer Gal(14)Gal(14)Glc-Cer GalNAc(13)Gal(14)Gal(14)Glc-Cer NeuAc(23)Gal(13)Gal(14)Gal(14)Glc-Cer Gal(14)GlcnNAc(13)Gal(14)Glc-Cer Gal(14)Gal(14)GlcnNAc(13)Gal(14)Glc-Cer
Figura 13.5 - Alcune strutture biochimiche degli antigeni del sistema P Originariamente denominato P, il nome dellantigene venne successivamente sostituito con P1. La designazione P venne assegnata ad un antigene presente su quasi tutti i globuli rossi umani. Lantigene Pk pure presente su quasi tutti i globuli rossi umani ma non facilmente evidenziabile, tranne che nei rari casi in cui sia assente lantigene P, per esempio nei rari fenotipi P1k o P2k. Il fenotipo null, p, molto raro. Lantigene LKE viene invece espresso su quasi tutti gli eritrociti, tranne che su quelli dei rari fenotipi p o Pk e in circa il 2% delle emazie con fenotipi P+. Fenotipi comuni e fenotipi rari Vi sono due fenotipi comuni associati col sistema P (P1 e P2) e tre fenotipi rari (p, P1k e P2k), come mostrato nella Tabella 13.5. Il fenotipo P1 indica le emazie reattive con lanti-P1 e lanti-P; le emazie che non reagiscono con lanti-P1, ma sono reattive con lanti-P, sono di fenotipo P2. Quando i globuli rossi sono esaminati solo con lanti-P1 e non con lanti-P, i fenotipi dovrebbero essere indicati come P1 positivo o P 1 negativo. Biochimica e genetica Gli antigeni del sistema P, come quelli del
Figura 13.6 - Biosintesi degli antigeni del sistema gruppale P
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sistema ABO, vengono sintetizzati, in sequenza, con laggiunta di saccaridi a delle catene precursori. I diversi determinanti oligosaccaridici degli antigeni del sistema P sono mostrati nella Figura 13.5. Tutti gli antigeni sono espressi esclusivamente sui glicolipidi degli eritrociti umani e non sulle glicoproteine30. Il precursore dellantigene P1 , pu anche essere glicosilato per formare delle catene di Tipo 2H, che portano i determinanti ABH. Ci sono due diverse vie per la sintesi degli antigeni del sistema P, come viene mostrato nella Figura 13.6. Il precursore comune la lactosilceramide, conosciuta anche come diesoso ceramide o CDH. Una via esita nella formazione della paragloboside e dellantigeni P1. La paragloboside anche il precursore delle catene di Tipo 2 per gli antigeni ABH. Laltra via esita nella formazione della serie globosidica di Pk, P e LKE. I geni che codificano le glicosiltransferasi e che sono responsabili della sintesi di P k dalla lactosilceramide e della conversione di Pk a P sono stati clonati nel 2000. Sono state identificate31-33 numerose mutazioni, che determinano i fenotipi p e Pk. Le relazioni genetiche tra P1,P e Pk non sono state ancora ben comprese. Le emazie di fenotipo p sono P1 negative, oltre che P negative e Pk negative; la situazione P1 delle emazie p non pu essere spiegata. Il gene P1 collocato sul cromosoma 22, mentre il gene P si trova sul cromosoma 3. Anti-P1 I sieri dei soggetti P1 negativi contengono, di norma, lanti-P1. Se viene utilizzata una tecnica sufficientemente sensibile, probabile che lantiP1 possa essere rilevato praticamente nel siero di tutti i soggetti con globuli rossi P1 negativi25. Lanticorpo reagisce in modo ottimale a 4 C, ma pu essere occasionalmente rilevato anche a 37 C. Lanticorpo anti-P1 quasi sempre di classe IgM e non stato mai riportato che possa essere responsabile di MEFN. Solo raramente stato
riferito essere causa di emolisi in vivo17 (p.139), 34 . Lespressione antigenica P1 molto variabile tra i diversi campioni di emazie ed stato rilevato che pu diminuire con la conservazione delle emazie. Queste caratteristiche possono determinare difficolt nellidentificazione della specificit anticorpale nei sieri che presentano uno screening anticorpale positivo. Un anticorpo, che reagisca debolmente a temperatura ambiente, pu evidenziare una specificit anti-P1 mediante unincubazione a temperature inferiori oppure utilizzando emazie pre-trattate con enzimi. Il fluido di cisti idatidea o la sostanza ottenuta dalle uova di piccione inibiscono lattivit dellanti-P1. Linibizione della reattivit pu essere utile nellidentificazione dellanticorpo, specialmente se lanti-P1 presente in sieri contenenti miscele con altre specificit anticorpali. Anticorpi rari Lalloanticorpo anti-P, che rilevabile come un potente anticorpo emolitico naturale nei sieri dei soggetti P1k e P2k, reagisce con tutte le emazie, tranne quelle dei rari fenotipi p e Pk. Lanti-P pu essere di classe IgM oppure una miscela di IgM ed IgG. Lanticorpo anti-PP 1 P k , primitivamente designato anti-Tja, viene prodotto dai soggetti con fenotipo p senza alcuna pregressa stimolazione eritrocitaria ed reattivo con tutti i campioni di globuli rossi tranne quelli dei rari fenotipi p. Lanti-PP1Pk pu essere separato nelle sue componenti (anti-P, anti-P1 ed anti-Pk) mediante assorbimenti selettivi. Queste componenti possono essere di classe IgM e/o IgG, reagiscono con un ampio range termico e possono fissare efficacemente il complemento, risultando, quindi, potenti emolisine naturali. Lanti-PP1Pk si dimostrato responsabile di reazioni trasfusionali emolitiche e, occasionalmente, di MEFN17(p.139). Vi una correlazione tra presenza di anti-P e anti-PP1Pk e laborto spontaneo precoce in gravidanza 35,36. Lautoanticorpo anti-P, associato con
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lemoglobinuria parossistica a frigore , un autoanticorpo freddo di classe IgG che viene descritto come unemolisina bifasica 17(pp.220-1). Questo autoanticorpo tipicamente non si evidenzia nelle indagini di routine, ma dimostrabile soltanto con il test di Donath-Landsteiner (vedi Capitolo 20). Gli antigeni P come recettori di agenti patogeni Gli antigeni del sistema P sono i recettori di diversi agenti patogeni. P, P1, Pk ed LKE sono dei recettori dellEscherichia coli uropatogeno; Pk e P1 sono i recettori per le tossine prodotte da E. coli37 enteroemorragico; e il batterio Streptococcus suis, responsabile di meningiti, si fissa sullantigene Pk38. Lantigene P (globoside) si dimostrato essere un recettore per leritrovirus (parvovirus) B19, che causa uninfezione eritematosa (quinta malattia). I soggetti con fenotipo p, che sono privi dellantigene globoside, sono naturalmente resistenti allinfezione indotta da questi patogeni39.
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Capitolo 14: Il sistema Rh
Capitolo 14
Il sistema Rh
Questo capitolo utilizza la nomenclatura DCE, modificata da quella originalmente proposta da Fisher e Race1, dimostratasi idonea per coniugare le nostre attuali conoscenze di genetica e biochimica su questo complesso sistema. La terminologia Rh-Hr di Wiener viene citata solo nel suo contesto storico, visto che le evidenze della genetica molecolare non hanno supportato la teoria ad un locus di Wiener.
Lantigene D e il suo contesto storico

La scoperta del D I termini Rh positivo ed Rh negativo si riferiscono alla presenza o allassenza dellantigene eritrocitario D. Il primo esempio di anticorpo contro lantigene, successivamente indicato come D, fu riferito nel 1939 da Levine e Stetson2; lanticorpo venne rilevato nel siero di una donna, il cui feto soffr di una malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN), mentre lei ebbe una reazione trasfusionale emolitica dopo una trasfusione di sangue del marito. Nel 1940, Landsteiner e Wiener3 descrissero un anticorpo ottenuto immunizzando delle cavie e dei conigli con le emazie di scimmie Rhesus; lanticorpo agglutinava circa l85% degli eritrociti umani esaminati e gli autori indicarono il determinante corrispondente col nome di fattore Rh. Nello stesso anno, Levine e Katzin4 trovarono anticorpi analoghi nei sieri di diverse donne che avevano partorito recentemente e, almeno uno di questi sieri, presentava reazioni
analoghe a quelle ottenute con i sieri anti-Rhesus di origine animale. Ancora nel 1940, Wiener e Peters5 rilevarono anticorpi con la medesima specificit nei sieri di persone i cui eritrociti mancavano del determinante e che avevano ricevuto, in precedenza, trasfusioni ABO compatibili. Successive evidenze stabilirono che lantigene rilevato dal siero animale anti-Rhesus e lanticorpo anti-D umano non erano identici, ma, a quel tempo, il sistema Rh aveva gi ricevuto la sua denominazione. Poco tempo dopo la scoperta dellanti-D, studi familiari dimostrarono che lantigene D geneticamente determinato e la via di trasmissione del carattere seguiva quella di un carattere autosomico dominante. Il significato clinico Dopo gli antigeni A e B, il D il pi importante nella pratica trasfusionale. Diversamente dagli antigeni A e B, tuttavia, le persone che non possiedono il D sui propri eritrociti non presentano, regolarmente, lanti-D. La formazione dellanticorpo anti-D origina dallesposizione, per motivi trasfusionali o gravidanze, ad emazie che presentano lantigene D. Il D possiede limmunogenicit pi elevata rispetto agli altri antigeni eritrocitari; stato stimato che dal 30 all85% delle persone D negative che ricevono una trasfusione D positiva svilupper lanti-D. Per questo motivo, nella maggior parte dei Paesi, tutti i riceventi e tutti i donatori di sangue vengono esaminati, nelle procedure di routine, per
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lantigene D, al fine di assicurare che i riceventi D negativi vengano identificati e ricevano sangue D negativo. Altri antigeni Rh Dalla met degli anni 40, quattro ulteriori antigeni - C, E, c ed e - vennero riconosciuti come facenti parte di quello che viene attualmente definito come il sistema Rh. Successive scoperte hanno portato il numero degli antigeni correlati col sistema Rh a 49 (Tabella 14.1), molti di questi presentano differenze sia qualitative sia quantitative. Il lettore deve essere consapevole dellesistenza di questi ulteriori antigeni (vedere la lista delle Letture consigliate) ma in gran parte dei contesti di Medicina Trasfusionale i 5 antigeni principali ed i loro rispettivi anticorpi costituiscono la maggior parte delle problematiche cliniche che coinvologono il sistema Rh. Bench gli antigeni Rh siano pienamente espressi alla nascita e siano precocemente rilevabili sin dalla ottava settimana di gestazione10, essi sono presenti solo sui globuli rossi mentre non sono rilevabili sulle piastrine, sui linfociti, sui monociti, sui neutrofili o in altri tessuti11,12.
controversie. Wiener13 propose un singolo locus con alleli multipli che codificavano le molecole di superficie che esprimevano numerosi antigeni. Fisher e Race14 dedussero, dallesistenza di antigeni antitetici, lesistenza di alleli reciproci strutturati in tre singoli loci , strettamente concatenati. La predizione della Tippett 15 che due loci strutturali tra loro strettamente concatenati sul cromosoma 1 determinano la produzione degli antigeni Rh, si dimostrata corretta. I geni RH Due geni altamente omologhi, posti sul braccio corto del cromosoma 1, codificano per i polipeptidi non glicosilati che esprimono gli antigeni Rh (Figura 14.1) 16,17. Un gene, designato RHD, determina la presenza della proteina che attraversa ripetutamente la membrana eritrocitaria e conferisce la specificit antigenica D al globulo rosso. Nei soggetti caucasici D negativi, il gene RHD deleto; in alcune altre popolazioni (soggetti di origine africana, giapponesi e cinesi) il fenotipo D negativo associato ad un gene RHD inattivo, mutato o parziale 18. Il gene RHD inattivo o pseudogene (RHD) che responsabile del fenotipo D negativo in alcuni africani stato adeguatamente descritto19. Il gene RHCE quello che determina gli antigeni C, c, E ed e; i suoi alleli sono RHCe, RHCE, RHcE ed RHce20.
Considerazioni genetiche e biochimiche

I diversi tentativi di spiegare il controllo genetico dellespressione degli antigeni Rh furono pieni di
Figura 14.1 - Rappresentazione schematica dei geni RHD, RHCE ed RHAG e delle proteine RhD, RhCE ed RhAG. I su RhD rappresentano le differenze degli amminoacidi tra RhD e RhCE. I su RhCE indicano gli amminoacidi critici coinvolti nellespressione dellantigene C/c ed E/e.
306
Tabella 14.1 - Gli antigeni del sistema gruppale Rh e la loro frequenza Incedenza (%)* Incidenza (%)* Designazione Nome Bianchi Neri Totale Designazione Nome Bianchi Neri Totale numerica dellantigene numerica dellantigene Rh1 Rh2 Rh3 Rh4 Rh5 Rh6 Rh7 Rh8 Rh9 Rh10 Rh11 Rh12 Rh17 Rh18 Rh19 Rh20 Rh21 Rh22 Rh23 Rh26 Rh27 Rh28 Rh29 RH30 Rh31 D C E c e f Ce Cw Cx V Ew G Hr0 Hr hrs VS CG CE Dw cE total Rh Goa hrB 85 68 29 80 65 68 2 1 84 92 27 22 96 98 92 27 1 <0,01 30 <0,01 92 >99,9 >99,9 98 <0.01 32 68 <1 <0,01 80 28 96 22 <0,01 >99,9 0 <0,01 98 Rh32 Rh33 Rh34 Rh35 Rh36 Rh37 Rh39 Rh40 Rh41 Rh42 Rh43 Rh44 Rh45 Rh46 Rh47 Rh48 Rh49 Rh50 Rh51 Rh52 Rh53 Rh54 Rh55 Rh56 Rh32 Har Bastiaan Rh35 Bea Evans C-like Tar Ce-like Ces Crawford Nou Riv Rh46 Dav JAL STEM FPTT MAR BARC JAHK DAK LOCR CENR <0,01 1 <0,01 >99,9 <0,01 <0,1 <0,01 >99,9 <0,01 70 <0,1 2 <0,01 >99,9 <0,01 >99,9 >99,9 <0,01 <0,01 6 <0,01 >99,9 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01 <0,01
(*) Incidenza percetuale in bianchi e neri dove appropriata8.9.
I risultati di studi di trasfusione genica21 indicano che entrambi gli antigeni C/c ed E/e, risiedono su un singolo prodotto polipetidico. Biochimica ed osservazioni strutturali I previsti prodotti di entrambi i geni RHD ed RHCE sono proteine di 417 amminoacidi che, come suggerito dagli studi di modello, attraversano per 12 volte la membrana eritrocitari, formando solo brevi anse esterne di amminoacidi (Figura 14.1). I polipeptidi sono legati ad acidi-grassi e, diversamente dalla maggioranza delle proteine associate ai gruppi sanguigni, non
presentano residui glicidici. Esiste unelevata omologia tra i prodotti dei geni RHD e RHCE; i prodotti dei differenti alleli del gene RHCE sono a un livello ancora pi simili18. Gli antigeni C e c si differenziano uno dallaltro solamente per quattro amminoacidi, nelle posizioni 16, 60, 68 e 103; di queste differenze, solo quella tra la serina e la prolina nella posizione 103 sembra essere lelemento critico. La presenza della prolina o dellalanina nella posizione 226 differenzia E da e. Il polipeptide D, diversamente, possiede da 32 a 35 amminoacidi che sarebbero percepiti come estranei dai soggetti
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D negativi. Allinterno della membrana eritrocitaria, il polipeptide Rh forma un complesso con la glicoproteina Rh-associata (RhAG), che per il 37% della sequenza risulta omologa con quella dei polipeptidi Rh, ma viene codificata dal gene RHAG che posizionato sul cromosoma 6 (Figura 14.1)22. Lo studio delle emazie Rhnull, che sono prive di tutti gli antigeni Rh, rivela che questo complesso (proteine Rh e RhAG) essenziale per lespressione di altre proteine di membrana. Le emazie Rhnull mancano degli antigeni LW, sono negative per lantigene Fy5 del sistema Duffy ed hanno unespressione indebolita degli antigeni presenti sulla glicoforina B (S, s e U)23. Sebbene le proteine Rh/RhAG giochino un ruolo strutturale nella membrana eritrocitaria, come viene evidenziato dalle alterazioni morfologiche delle emazie nella sindrome da Rhnull (vedi avanti, in questo capitolo), la loro funzione resta sconosciuta. Vi , tuttavia, evidenza che la proteina RhAG giochi un ruolo nel trasporto degli ioni ammonio24,25.
I caratteri in pedice o, occasionalmente, allesponente indicano le combinazioni degli altri antigeni che sono presenti. Per esempio, R1 indica laplotipo DCe, R2 indica DcE, r indica dce, Ro indica Dce e cos via (Tabella 14.2). Tabella 14.2 - I principali complessi genici RH e gli antigeni da loro codificati Aplotipo R1 R2 Ro Rz r r r ry Geni presenti RHD, RHCe RHD, RHcE RHD, RHce RHD, RHCE RHCe RHcE RHce RHCE Antigeni presenti D, C, e D, c, E D, c, e D, C, E C, e c, E c, e C, E Fenotipo R1 R2 Ro Rz r r r ry
Terminologia Rh
Per esprimere le informazioni genetiche e sierologiche relative al sistema Rh, si sono utilizzate tre diverse nomenclature, prima dei recenti progressi avvenuti nella nostra comprensione della genetica del sistema. Terminologia del sistema La terminologia Rh-Hr venne proposta da Wiener13 che riteneva che il prodotto del gene RH fosse una singola entit da lui definita agglutinogeno. Un agglutinogeno era caratterizzato da numerose specificit individuali, dette fattori, evidenziati da specifici anticorpi. Questa teoria non era corretta ma, per la designazione dei fenotipi, specialmente nelle conversazioni, molti immunoematologi utilizzano un sistema semplificato che basato sulle notazioni del sistema Rh-Hr di Wiener. Le notazioni fenotipiche esprimono gli aplotipi con le singole lettere R ed r. La lettera R viene utilizzata per gli aplotipi che producono D, la lettera r per gli aplotipi che non producono D.
La terminologia CDE fu introdotta da Fisher e Race1, che postularono la presenza di tre gruppi di geni strettamente concatenati (C e c, D e d, E ed e). Sia i geni sia i prodotti dei geni hanno la stessa lettera in corsivo, come designazione, che viene utilizzata per indicare il nome del gene. Oggi viene correntemente utilizzata una terminologia CDE modificata per comunicare ricerche o conclusioni sierologiche. Rosenfield e collaboratori26 proposero, infine, una nomenclatura fondata sulle osservazioni sierologiche. I simboli non intendevano esprimere informazioni genetiche, ma solamente semplificare la comunicazione dei rilievi fenotipici. Ad ogni antigene viene assegnato un numero, generalmente secondo lordine della sua scoperta o dellassegnazione al sistema Rh. La Tabella 14.1 elenca gli antigeni del sistema Rh con il loro numero di designazione, nome e frequenza. La determinazione del fenotipo Nella pratica clinica, sono facilmente reperibili cinque reattivi per la tipizzazione Rh: anti-D, -C, -E, -c ed -e.
308
Le indagini relative alla routine pre-trasfusionale prevedono solo lesame dellantigene D. Gli altri reattivi vengono utilizzati prevalentemente nella risoluzione dei problemi anticorpali oppure nelle indagini familiari. Linsieme degli antigeni rilevati sulle emazie di una persona costituisce il suo fenotipo Rh. La Tabella 14.3 presenta lo schema delle reattivit delle emazie esaminate con gli anticorpi specifici per i cinque antigene e il probabile fenotipo Rh nella terminologia modificata di Wiener.
Esami sierologici per lespressione degli antigeni Rh

Espressione dellantigene D Le persone D negative sono prive del gene RHD , che codifica per lantigene D, oppure possiedono un gene RHD non funzionante. La maggior parte delle persone D negative sono omozigoti per lallele RHce, il gene che codifica per gli antigeni c ed e; meno frequentemente possono presentare gli alleli RHCe o RHcE che codificano rispettivamente per C ed e oppure per c ed E.
Il gene RHCE, che produce gli antigeni C ed E, veramente raro negli individui D negativi e D positivi. Il genotipo D delle persone D positive non pu essere determinato direttamente con i mezzi sierologici; gli studi per stabilire la dose dellantigene D non sono efficaci per stabilire se un soggetto omozigote o eterozigote per il gene RHD. Utilizzando i test sierologici, il genotipo RHD pu essere assegnato solo attraverso linterferenza degli altri antigeni che sono associati con la presenza di D. Le indagini molecolari, invece, permettono la determinazione del vero genotipo D19,27,28. Linterazione tra i geni esita nel cosiddetto effetto posizione. Se linterazione avviene tra geni o fra il prodotto di geni posti sullo stesso cromosoma viene indicata come effetto cis. Se un gene, o il suo prodotto, interagisce con quello di un altro gene posizionato sul cromosoma omologo linterazione viene indicata come effetto trans. Esempi di entrambi gli effetti vennero descritti per la prima volta da Lawler e Race29, che rilevarono come esempio delleffetto cis, il fatto che lantigene E prodotto da DcE era quantitativamente meno espresso dellE prodotto da cE.
Tabella 14.3 - Determinazione dei probabili fenotipi Rh risultanti dai test eseguiti con i cinque principali reagenti fra le tipizzazioni del sistema Rh Reattivi Anri-D + + + + + + + + + 0 0 0 0 Anti-C + + + 0 0 0 + + + 0 + 0 + Anti-E 0 0 + 0 + + + + + 0 0 + + Anti-c + 0 + + + + 0 + 0 + + + + Anti-e + + + + + 0 + 0 0 + + + + Antigeni presenti D, C, c, e D, C, e D, C, c, E, e D, c, e D, c, E, e D, c, E D, C, E, e D, C, c, E D, C, E c, e C, c, e c, E, e C, c, E, e Fenotipo probabile R1r R1R1 R1R2 R0r0/R0r R2r R2R2 R1Rz R2Rz RzRz rr rr r, r r, r
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Come esempio delleffetto trans, osservarono che sia il C che E, erano meno espressi quando erano codificati dal genotipo DCe/DcE rispetto agli antigeni codificati, rispettivamente, da DCe/ce o DcE/ce. Espressione di C, c, E, e Per stabilire se una persona possiede i geni che codificano C, c, E ed e, le sue emazie vengono esaminate con lanticorpo specifico per ognuno di questi antigeni. Se le emazie esprimono sia C sia c oppure sia E sia e si pu presumere che i geni corrispondenti siano presenti nellindividuo. Se le emazie portano solo C o c, oppure solo E o e, si presume che la persona sia omozigote per quel particolare allele. Lorigine etnica Lorigine etnica influenza le deduzioni relative al genotipo, perch la frequenza dei geni Rh si
diversifica da un gruppo geografico allaltro. Per esempio in un bianco che presenta un fenotipo Dce, il genotipo sar probabilmente Dce/ce, ma in una persona di origine africana esso pu essere, con la stessa probabilit, sia Dce/Dce che Dce/ce. La Tabella 14.4 mostra la frequenza degli Ag D, C, E, c ed e nelle popolazioni di Bianchi e di Neri. Frequenze geniche Il fenotipo DCcEe (riga 3 della Tabella 14.3) pu derivare da ognuno dei numerosi genotipi possibili, ma in tutte le popolazioni il gentotipo pi probabile DCe/DcE . Entrambi questi aplotipi codificano D; un soggetto con questo fenotipo sar molto probabilmente omozigote per il gene RHD, quantunque eterozigote per il gene RHCE (Ce/cE). Alcuni altri genotipi, meno probabili, sono per possibili se la persona eterozigote al locus D (per esempio, DCe/cE, DcE/Ce, oppure
Tabella 14.4 - Frequenza dei genotipi pi comuni nei soggetti D positivi* Probabilit di zigosit per D (%) Genotipi Ag presenti D,C,c,e DCE Rh-hr Incidenza (%) Bianchi 31,1 3,4 0,2 17,6 1,7 10,4 1,1 2,0 0,3 11,8 0,8 0,6 3,0 0,2 Neri 8,8 15,0 1,8 2,9 0,7 5,7 9,7 1,3 <<0,1 3,7 <0,1 0,4 22,9 19,4 10 91 10 87 Omo Etero Omo Neri 59 81 63 99 41 19 37 1 Etero
Bianchi 90 9 90 13
DCe/ce R1r DCe/Dce R1R0 Dce/Ce R0r DCe/DCe R1R1 DCe/Ce R1r DcE/ce R2r DcE/Dce R2R0 DcE/DcE R2R2 DcE/cE R2r
D,C, e D, c, E, e D, c, E
D, C, c, E, e DCe/DcE R1R2 DCe/cE R1r DcE/Ce R2r D, c, e Dce/ce R0r Dce/Dce R0R0
89 6
11 94
90 46
10 54
* Per i fenotipi e genotipi rari non mostrati in questa tabella, consultare le Letture consigliate elencate alla fine di questo capitolo.
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DCE/ce), ma questi genotipi sono infrequenti in tutte le popolazioni. La Tabella 14.4 fornisce la frequenza dei genotipi pi comuni nei soggetti D positivi. I dati presentati sono riferiti alle popolazioni dei Bianchi e dei Neri. Lassenza del gene RHD infrequente in altri gruppi etnici. La determinazione del genotipo Lidentificazione degli antigeni non conduce sempre ad unaffidabile deduzione del genotipo. La presunzione deduttiva riguardante il probabile genotipo si basa sulla frequenza delle combinazioni antigeniche, evidenziate dagli studi di popolazione nei diversi gruppi etnici. Le deduzioni relative al genotipo sono utili negli studi di popolazione, nelle indagini sulla paternit e nella previsione dei geni Rh trasmessi dal marito, o dal partner, di una donna che presenta degli anticorpi specifici per gli antigeni Rh (Tabella 14.4). Le tecniche molecolari che possono determinare direttamente il genotipo Rh sono attualmente disponibili. La determinazione del genotipo con la metodologia della reazione della polimerasi a catena pu essere eseguita utilizzando il DNA ottenuto dai leucociti o dagli amniociti 19,27,28 oppure dal DNA fetale extracellulare presente nel plasma materno30. Raramente, i risultati della tipizzazione genotipica del DNA saranno discordi con i rilievi sierologici.
dopo lincubazione con lanti-D [test allantiglobulina indiretto (TAI)]. Queste emazie sono considerate D positive anche se si rende necessaria una fase addizionale dellesame. In passato, le emazie che richiedevano queste fasi aggiuntive per la dimostrazione del D erano classificate come Du. Il termine Du non viene pi considerato appropriato; le emazie che presentano delle forme indebolite dellantigene D vengono classificate come D positive e possono essere descritte come D deboli. Il miglioramento dei reattivi policlonali e la maggiore diffusione dei sieri diagnostici monoclonali hanno evidenziato, nelle procedure di routine, come D positivi normali i campioni di emazie che, utilizzando dei reagenti policlonali meno sensibili, erano stati classificati come D deboli. Inoltre, gli anti-D monoclonali possono determinare direttamente lagglutinazione con alcuni epitopi del D che, precedentemente, richiedevano metodi di indagine pi sensibili oppure potevano occasionalmente anche non reagire con alcuni epitopi D. Al contrario, alcuni sieri monoclonali possono reagire direttamente con rari epitopi D non rilevati con i reattivi policlonali (per esempio DHAR e Crawford). importante comprendere che i reattivi anti-D sono diversi tra i diversi produttori, ed importante conoscere le caratteristiche del reattivo che si utilizza. D deboli quantitativi Nella maggior parte dei casi, questa forma fenotipica di D debole determinata da un gene RHD che codifica per una proteina RhD alterata ed associata a una ridotta espressione quantitativa dellantigene D sulla membrana eritrocitaria. La localizzazione transmembrana, o citoplasmatica, degli amminoacidi che sono stati sostituiti nella proteina alterata non determina la perdita di epitopi dellantigene D, perci, la produzione di alloanticorpi anti-D, come avviene nei fenotipi D parziali (vedi di seguito), non prevista31,32. Deboli espressioni D sono piuttosto comuni nei Neri e, nella maggior parte dei casi, si verifica con
Il D debole
La maggioranza delle emazie D positive presentano, con un siero dopo centrifugazione anti-D, una netta agglutinazione macroscopica, che ne consente la rapida classificazione come D positive. Le emazie che non vengono immediatamente agglutinate non possono essere classificate con la stessa semplicit. Per alcuni campioni di globuli rossi D positivi, la dimostrazione della presenza del D richiede lincubazione con il reattivo diagnostico, oppure laggiunta del siero antiglobuline umane (AHG),
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laplotipo Dce. I geni che determinano deboli espressioni D sono meno frequenti nei Bianchi e possono essere osservate come prodotti di inconsueti aplotipi DCe o DcE. I campioni di emazie con un D debole quantitativo possono non essere reattivi o reagire molto debolmente nei test di agglutinazione diretta con la maggioranza dei sieri diagnostici anti-D. Tuttavia, le emazie reagiranno fortemente con un test allantiglobulina indiretto. Gli eritrociti di alcuni soggetti con genotipo Dce/Ce presentano una debole espressione antigenica D a causa di un effetto soppressore che viene esercitato da RHC in posizione trans sul cromosoma opposto rispetto ad RHD. Simili effetti depressivi possono essere osservati anche con altri aplotipi RHD associati con RHCe in posizione trans. Molti fenotipi D deboli determinati da effetti di posizione, che erano stati pubblicati nella letteratura depoca, appaiono attualmente come dei D normali. D parziali Il concetto che lantigene D consti di numerose componenti strutturali deriva dalle osservazioni che alcuni soggetti con emazie D positive producono degli alloanticorpi anti-D non reattivi con le emazie autologhe. La maggioranza delle persone D positive che producono alloanticorpi anti-D hanno emazie fortemente reattive, quando esaminate con un siero anti-D. Ma alcuni soggetti, specialmente quelli con il fenotipo DVI, presentano reazioni pi deboli rispetto alle normali emazie D positive oppure reagiscono solo nel test allantiglobulina. I globuli rossi che mancano di alcune componenti del D sono stati indicati in passato come D mosaic o D variant. Nella terminologia attuale appropriato descrivere questi eritrociti come D parziali. La classificazione in categorie dei fenotipi D parziali venne condotta, inizialmente, con dei test incrociati tra le emazie e gli alloanticorpi anti-D prodotti da persone D positive. Le quattro categorie inizialmente descritte da Wiener sono state considerevolmente ampliate nel corso degli anni. I test eseguiti con molti reattivi monoclonali
anti-D diretti contro gli eritrociti delle diverse categorie dei D parziali suggeriscono che lantigene D comprenda numerosi epitopi e i fenotipi D parziali possono essere differenziati in funzione dei loro epitopi. Tippett et al.33 definirono un numero minimo di 10 diversi epitopi, ma puntualizzarono che il D non abbastanza ampio per accogliere pi di otto distinti epitopi e devono, quindi, esserci delle considerevoli sovrapposizioni tra loro. Un modello strutturale attuale del D lo descrive con 30 epitopi34, dimostrando in questo modo la natura dinamica del modello, cos come stato rivisto alla luce dellevoluzione dei reattivi diagnostici e delle metodologie di indagine. Il dogma relativo allesistenza di molti epitopi differenti ha aperto la strada a un modello di natura prevalentemente topografica, con la fissazione dellanticorpo allantigene descritta come limpronta di piede35. Gli studi molecolari hanno chiarito il meccanismo genetico che da luogo a molti fenotipi D parziali, evidenziando che i fenotipi si formano o come il risultato di scambi di materiale genico tra il gene RHCE e il gene RHD oppure prendono origine da singole mutazioni puntiformi9,18. Importanza dei D deboli/parziali nei donatori di sangue Gli Standard AABB per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali36(p32) richiedono che i campioni di sangue dei donatori siano esaminati per le deboli espressioni antigeniche del D e siano etichettati come D positivi se il test risulta positivo. La trasfusione di sangue con unespressione debole dellantigene D in un ricevente D negativo non raccomandata, perch alcune emazie di D debole o parziale possono evocare una risposta immune contro il D37. Le deboli espressioni del D, tuttavia, sembrano essere meno immunogene del sangue D positivo normale; la trasfusione di un totale di 68 unit di sangue con antigene D debole in 45 riceventi D negativi non ha stimolato in nessun caso la produzione di anti-D28. Reazioni trasfusionali emolitiche e casi di MENF
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sostenute da emazie D deboli sono state pubblicate nella letteratura non recente, ma probabile che, con i reattivi attualmente disponibili, le emazie coinvolte in questi episodi sarebbero stati considerate come D positive39. Importanza dei D deboli/parziali nei riceventi unit di sangue La trasfusione dei riceventi i cui eritrociti sono stati tipizzati come D deboli , talora, uno spunto di discussione. La maggior parte di questi pazienti pu, quasi sempre, ricevere del sangue D positivo senza rischiare lalloimmunizzazione, ma se la debole espressione antigenica del D riflette, in realt, lassenza di uno o pi epitopi, esiste la possibilit che la trasfusione di sangue D positivo possa evocare, in questi pazienti, la produzione dellalloanti-D. Questo particolarmente vero nei soggetti appartenenti al fenotipo della categoria DVI. La stessa possibilit esiste, comunque, anche per le persone, le cui emazie D parziali reagiscono fortemente con i sieri diagnostici anti-D. Gli Standard AABB per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali36(p48) richiedono solo che i campioni dei pazienti vengano esaminati per lagglutinazione diretta con lanti-D. Il test per il D debole non viene richiesto. I reattivi anti-D certificati, attualmente reperibili, sono sufficientemente potenti da identificare come D positivi la maggior parte dei pazienti D deboli. I pochi pazienti classificati come D negativi, la cui D positiva identificabile solo con il test allantiglobulina, possono ricevere sangue D negativo senza alcun problema. Alcuni immunoematologi ritengono che questa pratica sia eccessivamente dispendiosa per le scorte di sangue D negativo e preferiscono, quindi, esaminare i potenziali riceventi per lantigene D debole per assegnare del sangue D positivo, quando indicato. Se a un ricevente D debole viene assegnato sangue D positivo, importante salvaguardarlo da inaccurate o scorrette interpretazioni degli esami. Un eventuale ricevente D negativo, che sia stato erroneamente classificato come D positivo, a causa di un test allantiglobulina diretto (TAD)
positivo che ha determinato un risultato falsamente positivo nella ricerca del D debole, corre il rischio di immunizzarsi contro il D, se gli viene somministrato sangue D positivo. Gli individui che presentano unespressione dellantigene D rilevabile solo con un TAI devono essere classificati come riceventi D negativi, se non viene eseguito un TAD. Tuttavia, se, successivamente, donano sangue, saranno classificati come donatori D positivi. Il personale dei Centri e dei Servizi Trasfusionali deve essere preparato a rispondere alle domande dei donatori perplessi o dei loro medici. Questo pu costituire un problema particolare nella donazione di sangue autologo, quando lo stesso sangue del paziente classificato come D negativo viene etichettato come D positivo. In questo caso, la conferma del corretto D debole del paziente con un TAI risolve lapparente discrepanza tra le tipizzazioni del paziente e del donatore.
Altri antigeni Rh
I numeri assegnati nella classificazione numerica degli antigeni del sistema Rh sono 56 (vedi Tabella 14.1); alcuni di questi sono attualmente obsoleti perch alcuni antigeno o sono stati eliminati oppure sono stati riassegnati. Lelenco attuale ne comprende 49, quasi tutti questi antigeni al di l degli antigeni D, C, c, Cw, E ed e, e dei loro corrispondenti anticorpi, vengono rilevati con una frequenza molto bassa nella routine trasfusionale. Gli antigeni composti (prodotti in cis) Le componenti della membrana con una specificit Rh presentano numerose e ulteriori suddivisioni antigeniche. Ogni gene, o complesso genico, determina una serie di strutture di superficie intercorrelate; alcune parti di queste strutture sono in grado di evocare con maggiore efficienza una risposta immune rispetto ad altre. Il polipeptide codificato dai geni presenti nellaplotipo DCe esprime dei determinanti antigenici addizionali oltre a quelli definiti come antigeni D, C ed e. Questi comprendono
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lantigene composto Ce (rh1) che costituito da un prodotto in cis che quasi sempre si associa a C ed e quando questi sono codificati dal medesimo aplotipo. Lantigene Ce non presente sugli eritrociti nei quali lantigene C ed e vengono codificati da aplotipi differenti, per esempio, quelli di una persona con genotipo DCE/ce . Esistono dei prodotti antigenici analoghi che si originano dalle posizioni in cis, quando questi antigeni sono codificati dal medesimo aplotipo: per c ed e (lantigene denominato ce o f), per c ed E (cE) e per C ed E (CE). Bench vengano raramente rilevati anticorpi specifici per i prodotti antigenici in cis, non corretto considerarli rari. Questi anticorpi possono essere presenti, ma non essere rilevati, nei sieri contenenti anticorpi con delle specificit anti-Rh pi evidenti; solamente utilizzando lassorbimento con eritrociti di fenotipo selezionato si pu dimostrare la loro presenza. Lanti-f (anti-ce) pu essere presente, per esempio, come una componente di alcuni sieri anti-c ed anti-e, ma la sua presenza comporta scarsa significativit pratica. Lanticorpo addizionale non pu confondere lo schema della reattivit presentato dallanti-c e dallanti-e perch tutte le emazie che reagiscono con lanti-f esprimeranno entrambi gli antigeni c ed e. Una persona con il genotipo DCe/DcE che ha prodotto lanti-f pu ricevere eritrociti che siano c oppure e perch le emazie di entrambi i fenotipi saranno anche f. Lanti-Ce frequentemente la vera specificit anticorpale prevalente di un apparente alloanticorpo anti-C, prodotto da una persona DcE/DcE dopo unimmunizzazione con sangue C . Questa nozione pu essere utile per stabilire il genotipo Rh di un individuo. Se lanti-Ce la specificit predominante in un reattivo anti-C, il soggetto con un debole antigene C codificato da un aplotipo DCE pu essere tipizzato in modo sbagliato, a meno che le metodiche di indagine ed i controlli non siano scelti molto accuratamente40.
Lantigene G e le reazioni-crociate Lantigene G viene originato da una serina in posizione 103 del polipeptide Rh ed codificato sia dal gene RHD che da quello RHCE41. Con il risultato che il G quasi invariabilmente presente sulle emazie che possiedono lantigene C oppure quello D. Gli anti-G appaiono inizialmente come una miscela di anti-D positivi anti-C, ma la loro reattivit non pu essere separata nelle componenti anti-C e anti-D. Il fatto che il G appaia come unentit unica comprendente le specificit C e D spiega perch persone D negative immunizzate con eritrociti C D+appaiono, qualche volta, aver prodotto anche un anti-C insieme con lanti-D e perch le persone D negative, esposte a emazie C+ D, producano anticorpi che sembrano contenere una componente anti-D. La differenziazione dellanti-D, anti-C e anti-G non necessaria nella selezione pre-trasfusionale perch, virtualmente, tutte le emazie D e C sono anche G. Nelle pazienti ostetriche, tuttavia, alcuni immunoematologi ritengono sia essenziale distinguere le specificit anticorpali, per decidere lopporunit di eseguite limmunoprofilassi Rh42. Gli assorbimenti e le eluizioni selettive necessari per differenziare lanti-D, lanti-C e lanti-G sono riportate da Issit e Anstee43. Sono stati descritti rari esemplari di emazie che possiedono il G ma non gli antigeni D e/o C. Il fenotipo rG viene rilevato soprattutto nei Neri; il G espresso, in genere, debolmente ed associato alla presenza dellantigene VS. Il fenotipo rG stato descritto anche nei Bianchi, ma non si tratta dello stesso rG che viene rilevato nei Neri. Esistono anche eritrociti che esprimono un D parziale, ma sono completamente privi del G, per esempio, le persone con fenotipo DIIIb39. Varianti antigeniche Bench le emazie della maggioranza degli individui diano franche reazioni con i sieri anti-D, anti-C, anti-E, anti-c ed anti-e alcuni eritrociti presentano reazioni atipiche e altri campioni, in apparenza normali, possono stimolare la produzione di antigeni reattivi con i globuli rossi
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dei comuni fenotipi Rh. Si dimostrato conveniente considerare C e c ed E e e come antigeni antitetici nei siti specifici di superficie. Antigeni che si comportano come se avessero una relazione antitetica con C/c o E/e sono stati rilevati prevalentemente in Bianchi. Il pi comune il Cw, ma il rapporto fenotipico sussiste soltanto perch il Cw e il Cx sono antitetici allantigene ad alta frequenza MAR. Si sono identificate varianti delle, per esempio gli antigeni hrS o hrB (rispettivamente Rh19 e Rh31). Le persone che sono e+ ed hrS e/o hrB sono rilevate con maggiore frequenza nella popolazione nera9. Lassenza di hrB associata nella maggior parte dei casi con la presenza del VS44.
unanemia emolitica compensata. La severit dellemolisi e la risultante anemia variano tra le persone che ne soffrono, ma la stomatocitosi, la ridotta sopravvivenza eritrocitaria, lassenza degli antigeni LW e Fy5 e lalterata e variabile espressione degli antigeni S, s ed U costituiscono una caratteristica costante. Osservazioni sierologiche Ben pochi individui Rh null sono stati riconosciuti perch i loro sieri contenevano degli anticorpi anti-Rh. Alcuni di questi soggetti sono stati individuati, quando i test di routine per la tipizzazione Rh delle loro emazie evidenziavano lassenza di qualsiasi antigene Rh. In tre casi, la scoperta si verificata per appropriati accertamenti sugli antigeni Rh di pazienti che presentavano anomali morfologiche degli eritrociti associati ad anemia emolitica. I soggetti Rhnull immunizzati producevano anticorpi con specificit molto variabile, da un semplice anti-e o anti-C a numerosi casi di anticorpi che reagivano con tutte le cellule testate eccetto quelle Rh null . Questo anticorpo, considerato come anti-Rh totale, ha ricevuto la designazione numerica di anti-Rh29. Rhmod Il fenotipo Rhmod rappresenta una soppressione meno completa dellespressione antigenica Rh. Diversamente dalle emazie Rh null, quelle classificate come Rhmod non sono completamente prive degli antigeni Rh ed LW, presentano una reattivit estremamente ridotta e, talvolta, variabile che dipendente dai geni del soggetto e dalla potenza e specificit degli antisieri utilizzati negli esami. Qualche volta, gli antigeni Rh sono cos indeboliti da essere evidenziabili soltanto con tecniche di assorbimento-eluizione. Come nei soggetti Rhnull anche negli Rhmod lanemia emolitica una caratteristica tipica. Pu essere corretto ritenere che le due situazioni anomale siano sostanzialmente simili, differenziandosi solo nel grado. Come nel fenotipo Rhnull di tipo regolatore, una mutazione presente nel gene RHAG si dimostrata essere allorigine del fenotipo Rhmod18.
La sindrome da Rhnull e altri tipi di delezioni

Rhnull La letteratura riferisce almeno 43 persone in 14 famiglie i cui globuli rossi sembrano essere privi di tutti gli antigeni Rh; sono noti anche altri soggetti, ma non sono stati pubblicati. Il fenotipo, descritto come Rhnull, viene prodotto da almeno due diversi meccanismi genetici. Il pi comune lRhnull regolatore che origina da una mutazione nel gene RHAG che esita nella completa assenza del complesso Rh (polipeptidi Rh ed RhAG), necessario per lespressione degli antigeni Rh18. Queste persone trasmettono i normali geni RHD ed RHCE ai loro discendenti. Laltra forma di Rhnull, il tipo amorfo, ha un gene RHAG normale ma presenta, comunque, una mutazione in entrambi i geni RHCE associata alla delezione del gene RHD (come nei normali individui D negativi)18. Il tipo amorfo di Rhnull considerevolmente piu raro del tipo regolatore. I genitori ed i discendenti di questo tipo di Rhnull sono obbligatoriamente degli eterozigoti per il gene amorfo. Anormalit delle emazie Rhnull Qualunque sia la loro origine genetica, le emazie che sono prive delle proteine Rh/RhAG presentano anormalit delle membrana e
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Fenotipi deleti Rari aplotipi RH codificano lantigene D ma non codificano alcuni o tutti gli antigeni CE. Alcuni esemplari dei fenotipi deleti comprendono D , D, DCw, e Dc . Si dimostrato che questi rari fenotipi prendono origine dalla sostituzione di ampie porzioni del gene RHCE con parti del gene RHD18. Le emazie prive di C/c e/o di E/e possono presentare espressioni eccezionalmente forti del D: unosservazione attraverso la quale, qualche volta, queste emazie sono state riconosciute durante la tipizzazione routinaria con lanti-D. Il fenotipo D pu essere identificato nel corso delle indagini condotte per identificare un anticorpo irregolare inatteso. Queste persone possono presentare un alloanticorpo di specificit complessa, perch le loro emazie sono prive di tutti gli epitopi espressi sul polipeptide RhCE. Lanticorpo con specificit anti-Rh17 (anti-Hr o ) viene prodotto, nella maggior parte dei casi, dai soggetti con questo raro fenotipo, sebbene siano stati segnalati sieri contenenti specificit separabili, come un anti-e. Il fenotipo D simile al fenotipo D , con la differenza che lespressione dellantigene D non accentuata allo stesso grado. Le emazie di fenotipo D possono essere debolmente agglutinate da alcuni sieri prodotti dalle persone Rh-delete e immunizzate, se il loro siero contiene lanticorpo anti-Rh47 oltre allanti-Rh1739 . Lantigene Rh47 un antigene ad alta frequenza codificato dal gene RHCE , che assente sugli altri fenotipi deleti (per esempio, D , DCw e Dc). Unaltra caratteristica distintiva delle emazie con fenotipo D costituita dal fatto che presentano lantigene a bassa frequenza Rh37 (Evans).
seguito dagli antigeni c ed E. Sebbene rari esemplari di anticorpi Rh possano comportarsi come agglutinine reattive direttamente con le emazie sospese in soluzione salina, la stragrande maggioranza degli anticorpi Rh reagisce meglio nei sistemi che utilizzano mezzi iperproteici, il siero antiglobuline o test enzimatici. Anche i sieri che contengono potenti anti-D, reattivi in soluzione salina allo stesso grado di quello rilevabile con le altre procedure, sono solitamente reattivi a diluizioni anticorpali pi elevate con il test allantiglobulina. Alcuni operatori trovano particolarmente utile la tecnica con enzimi proteolitici per rilevare deboli anticorpi Rh o nelle prime fasi del loro sviluppo. Gli anticorpi anti-Rh permangono, di solito, per molti anni. Se il loro livello sierico scende al di sotto di quello rilevabile, leventuale successiva esposizione allantigene produce, tipicamente, una risposta immune secondaria. Salvo eccezioni estremamente rare, gli anticorpi Rh non fissano il complemento, almeno per quanto possibile rilevare con le metodiche correntemente utilizzate. Per questo motivo, si determina, in vivo , soprattutto unemolisi di tipo extravascolare invece che di tipo intravascolare, nelle reazioni trasfusionali che coinvolgono anticorpi Rh. Effetti dose Raramente lanti-D presenta una differenza di reattivit tra gli eritrociti di individui omozigoti rispetto ai soggetti eterozigoti per il gene RHD, ma lespressione antigenica D sembra piuttosto modificarsi con gli alleli del genotipo che lo accompagnano. Per esempio, le emazie di soggetti DcE/DcE presentano una quantit maggiore di siti antigenici D rispetto ai globuli rossi di soggetti DCe/DCe e possono presentare score di reazione pi elevati nelle titolazioni dellanti-D. Gli effetti dose possono qualche volta essere dimostrati con alcuni anticorpi specifici per gli antigeni E, c ed e, occasionalmente, C. Anti-D in soggetti D positivi Un alloanticorpo anti-D pu essere prodotto dai soggetti che presentano un fenotipo D parziale (vedi la sezione sul D parziale in questo capitolo),
Anticorpi Rh
La maggior parte degli anticorpi Rh originano dallesposizione a eritrociti umani per trasfusioni o gravidanze. Occasionalmente, gli anticorpi Rh possono essere naturali (per esempio, anti-E,anti-Cw). Lantigene D limmunogeno pi potente,
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tuttavia non tutte le persone D positive che sembrano aver prodotto un anti-D devono essere necessariamente considerate come mancanti di epitopi D sulle loro emazie. Gli anticorpi anti-LWab o anti-LWa, quando sono debolmente reattivi, possono reagire con le emazie D positive e non con le emazie D negative. Un soggetto D positivo con un debole anti-LWa pu essere indistinguibile, nei test sierologici inziali, da un individuo con D parziale che abbia prodotto un alloanticorpo anti-D, specifico per gli epitopi che non possiede (vedi la sezione sul sistema LW nel Capitolo 15). Lanti-LW pu essere differenziato dallanti-D esaminando la reattivit dellanticorpo con emazie pretrattate con DTT 0,02M (Metodo 3.10); lLW viene distrutto dal reagente sulfidrilico, mentre il D non viene alterato. Anticorpi concomitanti Alcuni anticorpi Rh tendono a presentarsi insieme, miscelati nel siero. Per esempio, i soggetti DCe/DCe, quando presentano un anticorpo anti-E, quasi certamente sono stati esposti anche allantigene c, oltre che a quello E. Lanti-c pu essere presente nel siero, associandosi allanti-E, ma se sostanzialmente pi debole, sussiste la possibilit che non venga rilevato nel momento in cui viene identificato lanti-E e la trasfusione di sangue Ec+, apparentemente compatibile, pu determinare una reazione trasfusionale immediata o ritardata. In genere, non una scelta praticata quella di selezionare sangue di donatori negativi per gli antigeni assenti sui globuli rossi del ricevente, quando si sono rilevati anticorpi nel siero, ma alcuni operatori ritengono che sia meritevole fare attenzione al caso di un ricevente DCe/DCe con anti-E evitando di assegnargli sangue c+45. Lanti-E si accompagna meno frequentemente con un anti-c perch un paziente pu essere stato esposto, con maggiore facilit, al solo antigene c piuttosto che a quello E. Vi una scarsa indicazione clinica nel ricevere un ipotetico anti-E in un siero che contiene lanti-c perch la maggioranza dei donatori c saranno negativi anche per lantigene E.
Tipizzazione Rh
La tipizzazione Rh di routine per i donatori e per i pazienti riguarda solo il D. Lesame degli altri antigeni Rh va eseguito quando vengono identificati anticorpi anti-Rh inattesi o per procurarsi sangue compatibile per un paziente che presenta un anticorpo Rh, oppure nelle indagini parentali e negli studi familiari, nella selezione delle emazie fenotipizzate per un pannello eritrocitario da utilizzare nelle procedure di identificazione di anticorpo irregolari, o per valutare la probabilit di una persona di essere omozigote od eterozigote per il gene RHD. Nella ricerca del sangue compatibile per un paziente che presenta un Ab anti-Rh relativamente debole gli esami condotti con potenti reattivi tipizzanti danno una conferma pi affidabile dellassenza dellantigene, bersaglio, rispetto a quanto dimostrato da un crossmatch compatibile. La definizione del fenotipo Rh di un paziente pu contribuire alla conferma della specificit anticorpale identificata e indicare quali altre specificit anticorpali anti-Rh possono essere presenti. Lesame di routine per lantigene D Fino a poco tempo fa, nella maggioranza degli esami si utilizzavano reagenti anti-D policlonali di origine umana, in soluzioni iperproteiche, idonei per gli esami su vetrino, in provette o in micropiastre. In tempi pi recenti, sono diventati ampiamente disponibili reattivi monoclonali anti-D. I test possono utilizzare eritrociti sospesi in soluzione salina, nel siero o nel plasma, ma le procedure tecniche dellesame, prima delluso del diagnostico, devono essere eseguite seguendo le istruzioni del produttore del diagnostico stesso. Le procedure per le micropiastre sono simili a quelle utilizzate per i test in provetta, ma si utilizzano sospensioni eritrocitarie molto diluite. I test su vetrino danno risultati ottimali soltanto quando si impiegano alte concentrazioni eritrocitarie e e soluzioni proteiche alla temperatura di 37 C. Uno svantaggio dei test su vetrino costituito dallevaporazione della miscela di reazione, che pu determinare laggregazione
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delle emazie eventualmente interpretata, in modo erroneo, come unagglutinazione. Vi sono anche elevati rischi biologici associati alla dispensazione dei campioni di sangue, nel corso delle manipolazioni operative. I Metodi 2.6, 2.7 e 2.8 forniscono corrette rappresentazioni procedurali per le metodiche in provette, su vetrini e in micropiastra. Le procedure tecniche per dimostrare la presenza del D debole sono richieste dagli Standard AABB solo per i donatori o per esaminare il sangue di neonati nati da madri Rh negative e determinare leventuale candidatura delle madri alla sieroprofilassi immunoglobulinica anti-Rh36(pp32,48). Quando vi unindicazione per un test di identificazione della variante D debole, deve essere eseguito un TAI (Metodo 2.9). Un test affidabile per laccertamento di una debole espressione D non pu essere eseguito su vetrino. I reattivi iperproteici Alcuni reattivi anti-D destinati alluso su vetrino, in provetta o in micropiastra contengono unelevata concentrazione proteica (20-24%) oltre ad altri additivi macromolecolari. Questi reattivi sono quasi sempre preparati da pool di sieri umani e producono risultati rapidi e affidabili impiegati secondo le istruzioni del produttore. Gli elevati livelli proteici e gli additivi macromolecolari possono determinare reazioni falsamente positive. Una tipizzazione sbagliata pu causare la trasfusione con sangue D positivo in un ricevente D negativo, causandone limmunizzazione. Deve essere eseguito un adeguato test di controllo isecondo le istruzioni del produttore del diagnostico. Il controllo per i reagenti iperproteici I produttori forniscono lo specifico medium diluente dei loro diagnostici, da utilizzare come controllo. Natura e concentrazione degli additivi differiscono significativamente tra i reattivi dei diversi produttori e possono non determinare il medesimo quadro di reazioni falsamente positive. Se le emazie presentano unaggregazione nel test di controllo, i risultati del test con lanti-D non possono essere considerati attendibili. Nella maggior parte dei casi, la presenza o meno dellantigene D pu essere definita con un
altro reagente, come viene descritto pi avanti in questo capitolo. Risultati fuorvianti con i reagenti iperproteici Falsi positivi. Le seguenti circostanze possono determinare risultati falsamente positivi nelle tipizzazioni Rh dei globuli rossi: 1. laggregazione cellulare pu essere causata da immunoglobuline adese sugli eritrociti del paziente, oppure i medesimi fattori sierici che provocano la formazione di impilati determinano risultati falsamente positivi sia nellesame sia nella prova di controllo. I fattori sierici possono essere eliminati, lavando accuratamente le emazie (con fisiologica preriscaldata, se sono presenti agglutinine fredde o se ne sospetta la presenza) e ripetendo, poi, il test. Se gli eritrociti nel test di controllo non vengono agglutinati e il test con lanti-D risulta positivo, le emazie in esame sono D positive. Se lagglutinazione si verifica anche nella prova di controllo, la spiegazione pi probabile che vi siano delle immunoglobuline che sensibilizzano le emazie, che devono essere riesaminate con un reattivo a basso contenuto proteico; 2. laggregazione delle emazie che simula unagglutinazione, pu verificarsi anche nel caso di unincubazione troppo prolungata, che ha determinato uneccessiva evaporazione durante un test eseguito su vetrino. importante seguire le raccomandazioni del produttore del diagnostico per interpretare lesame entro il tempo prescritto. Falsi negativi. Le seguenti circostanze possono determinare risultati falsamente negativi nelle tipizzazioni Rh dei globuli rossi: 1. una sospensione eritrocitaria troppo concentrata nel test in provetta, od una sospensione troppo diluita nel test su vetrino possono indebolire la reazione; 2. le emazie sospese in soluzione salina non devono essere usate per i test su vetrino; 3. i globuli rossi che presentano unespressione indebolita del D possono non reagire in modo ottimale nel limite dei 2 minuti del test su vetrino o dopo la centrifugazione immediata nel test in provetta.
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I reattivi a basso contenuto proteico I reattivi a basso contenuto proteico vengono comunemente utilizzati e sono prevalentemente formulati per gli anticorpi monoclonali. Le emazie sensibilizzate da immunoglobuline incomplete possono, di solito, essere efficacemente tipizzate con dei reagenti Rh a basso contenuto proteico che contengano anticorpi completi direttamente agglutinanti le emazie D positive sospese in soluzione salina. Lorigine degli anti-D monoclonali I reattivi monoclonali anti-D sono prevalentemente costituiti da anticorpi umani di classe IgM che non necessitano di alcun potenziante e agglutinano efficacemente la maggior parte delle emazie D positive di soggetti adulti o di neonati in un sistema salino. I reattivi monoclonali solitamente producono reazioni pi forti di quelle ottenute con i reattivi policlonali di classe IgG, ma possono occasionalmente fallire lagglutinazione delle emazie dei soggetti appartenenti ad alcune categorie di D parziali. Aggiungendo delle piccole aliquote di anticorpi anti-D di classe IgG ai monoclonali di classe IgM, si produce una miscela di anticorpi che reagiranno con gli antigeni D deboli o con D parziali, nel test allantiglobulina. Alcuni rari campioni di eritrociti (DHAR, DVa, DVc, Rh43+) possono reagire anche con la centrifugazione immediata con alcuni di questi reattivi miscelati, ma con altri reattivi queste stesse emazie possono non essere agglutinate neppure con il test allantiglobulina indiretto (TAI), oppure reagire esclusivamente con un TAI. I sieri costituti da miscele di anticorpi monoclonali/policlonali o monoclonali/monoclonali possono essere utilizzati in tutte le metodiche della tipizzazione di routine e sono soddisfacenti, per gli antigeni D deboli, tanto quanto i reattivi ad alto contenuto proteico nel test allantiglobulina indiretto. Tuttavia, si possono verificare falsi risultati negativi se i test con i reattivi monoclonali vengono incubati eccessivamente e non secondo le istruzioni del produttore. Questi reattivi, preparati in un mezzo a bassa forza ionica, possono essere utilizzati anche per esaminare eritrociti con un TAD
positivo, grazie al fatto che questi esami non sono necessariamente soggetti allesecuzione di un TAI. Controlli per i reattivi a basso contenuto proteico La maggior parte dei reattivi monoclonali miscelati hanno una concentrazione proteica totale simile a quella del siero umano. Possono intervenire, con questi reattivi, false reazioni positive per aggregazione spontanea di emazie sensibilizzate da immunoglobuline, con la stessa frequenza di quella rilevabile con gli altri reattivi utilizzati con sospensioni eritrocitarie in soluzione salina. False reazioni positive possono verificarsi in qualunque sistema reattivo in soluzione salina se il siero contiene agglutinine fredde o presenta uno squilibrio proteico che determina la formazione di impilati e le emazie vengono esaminate senza essere state lavate. raramente necessario allestire un esame di controllo separato. Lassenza di unaggregazione eritrocitaria spontanea pu essere dimostrata, osservando la mancanza di agglutinazione con siero anti-A e/o anti-B nella tipizzazione ABO. Per i campioni di emazie che presentano lagglutinazione in tutte le provette (per esempio, la reattivit di un gruppo AB D positivo) deve essere eseguito un controllo seguendo le indicazioni del produttore; questo non richiesto quando vengono esaminate le emazie di un donatore di sangue. Nella maggioranza dei casi, un controllo idoneo costituito da una sospensione di emazie autologhe nel siero dello stesso paziente oppure in una soluzione al 6-8% di albumina bovina, sebbene si siano verificate delle eccezioni46. Se il test fa parte di una serie di esami, eseguiti simultaneamente e nello stesso modo, ogni risultato negativo funge da adeguato controllo. Per esempio, un controllo separato necessario soltanto per i campioni eritrocitari che presentano reazioni positive con tutti i reattivi Rh (come nel caso di una tipizzazione D+C+E+c+e+). Esami per lantigene D nella malattia emolitica del feto e del neonato Poich le emazie di un neonato sofferente per MEFN sono sensibilizzate da immunoglobuline, solitamente necessario, per la tipizzazione Rh,
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un reattivo a basso contenuto proteico. Occasionalmente, le emazie del neonato possono essere cos massivamente ricoperte dagli anticorpi di origine materna che tutti i siti antigenici sono occupati, cos da non rimanerne nessuno libero per reagire con lappropriato anticorpo del siero diagnostico a basso contenuto proteico. Si deve sospettare questo fenomeno di blocco quando le emazie del neonato presentano un forte TAD, ma non vengono agglutinate dal reattivo a basso contenuto proteico che presenta la medesima specificit identificata per lanticorpo materno. Lanti-D la specificit responsabile di quasi tutti i casi i casi di blocco determinati dallanticorpo materno. Solitamente possibile ottenere un risultato corretto della tipizzazione con un anti-D a basso contenuto proteico dopo lesecuzione di una blanda eluizione dellanticorpo materno, a 45 C, dalle emazie del cordone ombelicale (vedi Metodo 2.12). Leluizione libera abbastanza siti antigenici per permettere la tipizzazione delle emazie, ma deve essere eseguita con prudenza perch la sovraesposizione al calore pu denaturare o distruggere gli antigeni Rh. Esami per gli antigeni diversi dal D I reagenti per esaminare gli altri principali antigeni Rh (C, E, c ed e) sono facilmente reperibili. Questi reattivi sono formulati come gli altri reagenti a basso contenuto proteico (solitamente monoclonale o miscele di monoclonale/policlonale), oppure sono reattivi iperproteici. I reattivi iperproteci di qualunque specificit presentano lo stesso problema del reagente anti-D per quanto riguarda le false positivit e richiedono lesecuzione di un analogo test di controllo eseguito contemporaneamente e nelle stesse condizioni operative. Il rilievo di un risultato negativo nel test di controllo per lanti-D, non costituisce un adeguato test di controllo per gli altri antigeni Rh, perch i risultati con lanti-D sono solitamente ottenuti dopo una centrifugazione immediata, mentre gli esami per gli altri antigeni Rh vengono generalmente incubati a 37 C prima della centrifugazione. I reagenti Rh possono fornire reazioni deboli con le emazie che presentano varianti antigeniche.
Questo particolarmente probabile che accada se lanticorpo anti-e viene utilizzato per esaminare le emazie di soggetti di origine africana, tra i quali le varianti delle sono relativamente comuni9. Non possibile ottenere reattivi anti-e che reagiscano fortemente e costantemente con tutte le diverse varianti quantitative e qualitative dellantigene e. Una variabile reattivit con i reagenti anti-C si pu verificare se il C viene codificato dallaplotipo DCE oppure dallaplotipo CE. Sono state riferite anche varianti degli antigeni E e c ma sono molto meno comuni. Qualunque reattivo venga usato, devono essere attentamente seguite le istruzione dei produttori. Il TAI non deve essere utilizzato se le istruzione dei produttori non stabiliscono esplicitamente che il reattivo idoneo per questo uso. La miscela dei sieri di origine umana (non monoclonali) utilizzata per preparare i reattivi per tipizzare gli altri antigeni Rh pu contenere specificit anticorpali contaminanti reattive nel test allantiglobulina. Si devono eseguire controlli positivi e negativi; le emazie per i controlli positivi devono presentare lantigene bersaglio in singola dose oppure essere noti per una debole reattivit con il siero diagnostico. Ulteriori considerazioni sulla tipizzazione Rh Le seguenti limitazioni sono comuni a tutte le procedure di tipizzazione Rh, comprese quelle eseguite con reattivi a basso contenuto proteico. Reazioni falsamente positive Le seguenti circostanze possono determinare risultati falsamente positivi nella tipizzazione Rh: 1. stato inavvertitamente utilizzato un reattivo sbagliato; 2. era presente nel siero umano originale con cui stato prodotto il reattivo diagnostico un insospettato anticorpo di diversa specificit. Anticorpo specifici per antigeni che presentano una frequenza inferiore a 1% nella popolazione possono essere occasionalmente presenti e causare false reazioni positive anche quando sono state seguite le istruzioni del produttore del diagnostico. Per determinazioni di particolare importanza molti
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operatori eseguono di routine una ripetizione del test utilizzando reattivi di diversa origine. La ripetizione del test non costituisce, tuttavia, unassoluta sicurezza, perch i reattivi anche di produttori diversi possono non essere stati ottenuti da unorigine differente; 3. le emazie poliagglutinabili possono essere agglutinate da qualsiasi reattivo che contenga del siero umano. Sebbene gli anticorpi che agglutinano le emazie con alterazioni della superficie della membrana siano presenti nella maggioranza dei sieri umani di adulti, le poliagglutinine causano molto raramente problemi con i sieri diagnostici. Linvecchiamento, la diluizione e i diversi passaggi relativi al processo di preparazione dei reattivi tendono ad eliminare questi anticorpi, prevalentemente costituiti da immunoglobuline di classe IgM; 4. le autoagglutinine e le paraproteine presenti nel siero del paziente possono causare reazioni falsamente positive quando sono utilizzate emazie che non sono state lavate; 5. i contenitori dei reattivi possono essere contaminati da batteri, da sostanze estranee o da reattivi provenienti da altri contenitori. Questo pu essere prevenuto usando una tecnica accurata e attuando unispezione periodica del contenuto dei flaconcini. Tuttavia, una contaminazione batterica pu non provocare una torbidit riconoscibile ad occhio nudo del reagente, perch lindice di rifrazione dei batteri simile a quello dei reattivi iperproteici. Reazioni falsamente negative Le seguenti circostanze possono determinare risultati falsamente negativi nella tipizzazione Rh: 1. stato inavvertitamente utilizzato un reattivo sbagliato; 2. il reattivo non stato aggiunto nella provetta. buona pratica dispensare il siero in tutte le provette prima di aggiungere le emazie e qualunque mezzo potenziante; 3. un reattivo specifico non ha reagito con una variante antigenica;
4. un reattivo costituito prevalentemente da un anticorpo specifico per un antigene Rh composto, originato da una situazione genica in cis, non determina una reazione positiva obiettivamente rilevabile con emazie che presentano i singoli antigeni, ma prodotti da geni posizionati sui cromosomi omologhi (in trans). Questo evento si verifica con maggiore frequenza con i sieri anti-C, che contengono in realt un anticorpo anti-Ce; 5. non sono state seguite le istruzioni del produttore; 6. il fondello di emazie stato scosso cos energicamente durante la risospensione degli eritrociti da disaggregare i piccoli agglutinati; 7. la reattivit dellanticorpo si deteriorata a causa di una contaminazione, una conservazione scorretta, oppure perch il diagnostico scaduto. Gli anticorpo di classe IgG chimicamente modificati sembrano essere particolarmente suscettibili alla distruzione provocata dagli enzimi prodotti da alcuni batteri.
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Capitolo 15: Altri gruppi sanguigni
Capitolo 15
Altri gruppi sanguigni
Esistono molti altri antigeni (Ag) sui globuli rossi oltre a quelli menzionati nei precedenti capitoli. Questi antigeni sono classificati in sistemi gruppoematici eritrocitari, in collezioni e nelle serie di antigeni indipendenti, costituite per la maggior parte da antigeni a bassa od alta frequenza. Un sistema gruppoematico eritrocitario un raggruppamento, costituito da uno o pi antigeni, governato da un singolo locus genico o da un complesso di due o pi loci genici omologhi strettamente concatenati che si sono dimostrati geneticamente e fenotipicamente connessi luno con laltro e sono geneticamente differenziati dagli altri sistemi eritrocitari. Una collezione un gruppo di antigeni che dimostrano di avere tra loro una correlazione fenotipica, biochimica o genetica; tuttavia, non vi sono informazioni o dati sufficienti per dimostrare che si tratti di un distinto sistema gruppoematico eritrocitario, geneticamente indipendente da altri sistemi antigenici del sangue. La Tabella 10.1 elenca i sistemi eritrocitari e la localizzazione dei loro geni1-3, secondo i criteri definiti dal gruppo di lavoro sulla terminologia dei gruppi sanguigni della Societ Internazionale della Trasfusione del Sangue (ISBT, International Society of Blood Transfusion ). Ulteriori informazioni sulla terminologia ISBT per tutti gli antigeni menzionati in questo capitolo sono reperibili nellAppendice 6. La Tabella 15.1 presenta il comportamento sierologico e le caratteristiche dei principali anticorpi (Ab) di origine umana dei sistemi gruppoematici eritrocitari. I sistemi principali
saranno discussi per primi nel capitolo, seguiti successivamente dagli altri sistemi, dalle collezioni e dagli antigeni indipendenti ad alta e bassa frequenza. In ogni raggruppamento, lordine di esposizione rifletter lordine numerico ISBT.
La distribuzione degli antigeni

Gli antigeni che sono rappresentati nella quasi totalit degli individui sono indicati come antigeni ad alta frequenza, cos come gli antigeni presenti in pochissime persone sono definiti col termine di antigeni a bassa frequenza. Lincidenza di questi antigeni ad alta o a bassa frequenza pu anche essere diversa nei differenti gruppi etnici. Gli antigeni che presentano caratteri codominanti, come Jka e Jkb, possono avere una frequenza variabile, che pu essere diversa nei differenti gruppi etnici. Per fare un esempio, la glicoproteina Duffy, nota per essere un recettore per il parassita Plasmodium vivax, uno degli agenti patogeni della malaria. NellAfrica Occidentale, dove la malaria endemica, il fenotipo eritrocitario Fy(a b ), che estremamente raro tra i bianchi, presenta una frequenza superiore all80%. Gli antigeni descritti in questo capitolo sono stati identificati, per la prima volta, dallindividuazione, in un siero, del loro anticorpo specifico. In questo capitolo sono presentate tabelle che elencano le frequenze fenotipiche, nella popolazione statunitense, relative ai soggetti di
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Tabella 15.1 - Comportamento sierologico dei principali anticorpi dei diversi sistemi gruppoematici eritrocitari Salina Anticorpo Emolisi 4 C in vitro Anti-M Anti-N Anti-S Anti-s Anti-U Anti-Lua Anti-Lub Anti-K Anti-k Anti-Kpa Anti-Kpb Anti-Jsa Anti-Jsb Anti-Lea Anti-Leb Anti-Fya Anti-Fyb Anti-Jka Anti-Jkb Anti-Xga Anti-Dia Anti-Dib Anti-Yta Anti-Ytb Anti-Doa Anti-Dob Anti-Coa Anti-Cob Anti-Sc1 Anti-Sc2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 alcuni alcuni 0 0 alcuni alcuni 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 magg. magg. pochi no no alcuni pochi 22 C alcuni pochi alcuni pochi occ. magg. pochi pochi pochi alcuni pochi pochi 0 magg. magg. rari rari pochi pochi pochi alcuni 0 0 0 0 alcuni Albumina 37 C pochi occ. alcuni pochi alcuni pochi pochi alcuni pochi alcuni pochi pochi 0 alcuni alcuni rari rari pochi pochi pochi alcuni 0 0 0 0 alcuni AHG pochi occ. magg. magg. magg. pochi magg. magg. magg. magg. magg. magg. magg. alcuni alcuni magg. magg. magg. magg. magg. magg. magg. magg. tutti alcuni tutti alcuni alcuni tutti magg. Papaina/Ficina 37 C 0 0 vedi testo vedi testo magg. pochi pochi alcuni alcuni alcuni alcuni pochi pochi alcuni alcuni 0 0 alcuni alcuni 0 alcuni alcuni 0 alcuni tutti alcuni alcuni magg. AHG 0 0 Associata con MEFN HTR pochi pochi rari no s s s s s s no no lieve s s s s s s s s s s s s s no rari no no s s lieve s lieve s lieve s non riport. s s s s no s non riport. no s no s s s lieve s no no no no
magg. magg.
magg. pochi pochi magg. magg. magg magg. magg. magg. magg. magg. 0 0 magg. magg. 0 alcuni alcuni alcuni magg. tutti magg. magg. magg.
AHG = siero antiglobuline umane; MEFN = malattia emolitica del feto e del neonato; HTR = reazione trasfusionale emolitica; Occ. = occasionalmente; magg. = maggioranza; non riport. = non riportato. La reattivit presentata nella tabella basata sulle procedure in provetta comunemente utilizzate. Se i test sono condotti con procedure pi sensibili (come in capillari, in micropiastre o col metodo della stratificazione dellalbumina), lagglutinazione diretta (prima della fase con siero antiglobuline) pu essere osservata per alcuni anticorpi con una maggiore frequenza. Gli spazi bianchi indicano la mancanza o linsufficienza di informazioni utili per indicazioni generali relative al comportamento dellanticorpo.
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razza bianca e a quelli di razza nera. Non vengono fornite le frequenze negli altri gruppi della popolazione americana, perch i dati sono scarsi, mentre esistono ampie differenze tra i diversi gruppi di origine asiatica, sudamericana o dei nativi americani, per poter fare generalizzazioni fenotipiche attendibili.
Si rimanda alla successiva sezione sui Geni che codificano le glicoproteine e ai Capitoli 9 e 10 per maggiori informazioni sulle interazioni geniche. I globuli rossi che sono privi di S e s possono essere negativi per lantigene ad alta frequenza indicato come U; i soggetti che sono privi di U possono produrre lanticorpo anti-U, quando esposti a emazie U+. Antigeni a bassa-frequenza del sistema MNS Il sistema MNS comprende numerosi antigeni a bassa frequenza. Recenti informazioni biochimiche attribuiscono la reattivit dei vari determinanti antigenici a bassa frequenza a una o pi sostituzioni amminoacidiche, a variazioni nellestensione o nel tipo di glicosilazione, allesistenza di ibridi delle sialoglicoproteine (SGP). Geni che codificano le glicoforine I geni che codificano gli antigeni del sistema MNS sono localizzati sul cromosoma 4 nel locus 4q28-q31. Il gene che codifica la GPA denominato GYPA e il gene che codifica la GPB GYPB. La similarit tra la sequenza amminoacidica di GPA e GPB suggerisce che entrambi i geni potrebbero originare da un gene ancestrale comune. I geni GYPA e GYPB sono, rispettivamente, costituiti da sette e da cinque esoni. I due geni presentano
Sistema MNS
Antigeni M, N, S, s ed U Il sistema MNS un sistema complesso, costituito da oltre 40 antigeni portati su due molecole glicoproteiche o su molecole ibride di due proteine. Gli antigeni M, N, S, s ed U sono i pi importanti del sistema MNS per la Medicina Trasfusionale. Essi hanno avuto importanza anche per la comprensione della loro biochimica e della genetica. M ed N sono localizzati sulla glicoforina A (GPA). S, s ed U sono situati sulla glicoforina B (GPB). La Tabella 15.2 presenta le frequenze dei fenotipi pi comuni del sistema MNS. Vi un considerevole linkage disequilibrium tra M,N ed S,s, dovuto alla localizzazione dei geni sul cromosoma. Per esempio, il complesso genico che produce N con s molto pi frequente di quello che produce N con S. I geni MNSs GYPA e GYPB sono posti in stretta prossimit sul cromosoma 44. Tabella 15.2 - Fenotipi e frequenze nel sistema MNS Reazioni con antiM + + 0 N 0 + + + + 0 0 0 0 + + 0 0 + + + 0 (+) S s U M+N M+N+ MN+ S+sU+ S+s+U+ Ss+U+ SsU SsU+w Fenotipo Frequenza fenotipica % Bianchi 28 50 22 11 44 45 0 0 Neri 26 44 30 3 28 69 Meno di 1 Rari*
* Possono non essere evidenziati con alcuni antisieri e vengono elencati come U negativi.
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una omologia >95%. Sebbene i due geni siano altamente omologhi, GYPB costituito da una proteina accorciata perch una mutazione puntiforme, posta al sito 5' di splicing del terzo introne, previene la trascrizione dellesone 3, denominato pseudo esone 3. Seguendo la sequenza omologa, GYPA e GYPB si differenziano significativamente nella regione terminale 3'. Molecole ibride Si rilevano evidenti modificazioni nelle molecole ibride che possono formarsi da crossing-over ineguali o da conversioni geniche tra GYPA e GYPB. Le SGP ibride possono portare la porzione ammino-terminale della GPA e la porzione carbossilico-terminale di GPB o viceversa. Altri ibridi si presentano come una molecola GPB con un inserto di GPA oppure come una molecola GPA con un inserto di GPB. Gli antigeni a bassa frequenza Hil (MNS20), Sta (MNS15), Dantu (MNS25) e Mur (MNS10), tra gli altri, sono associati a SGP ibride. Alcune varianti sono localizzate in specifici gruppi etnici; per esempio, lantigene Dantu viene rilevato prevalentemente nei neri, bench si tratti di un antigene a bassa frequenza. Molti degli antigeni a bassa frequenza del sistema MNS sono riuniti in un sottosistema, denominato sistema Miltenberger, in base alla reattivit degli eritrociti con antisieri specifici. Quanti pi antigeni sono stati identificati, e sono stati definiti gli eventi genetici che li hanno originati, tanto pi questi nuovi determinanti antigenici si sono moltiplicati, ed ovvio che il sottosistema Miltenberger sia ormai obsoleto. Questi antigeni, come Mia, Vw, Hill, etc., devono essere considerati varianti glicoforiniche. Biochimica del sistema MNS Gli antigeni del sistema MNS sono localizzati sulle GPA e GPB, glicoproteine con un singolo passaggio transmembrana. Il terminale carbossilico (C) di ogni glicoforina si estende nel citoplasma del globulo rosso, e un segmento idrofobico dello stesso incastonato nel doppio strato lipidico. Un terminale amminoacidico (N) si estende nellambiente extracellulare.
Le molecole sono suscettibili al clivaggio da parte di alcune proteasi in punti diversi della molecola (vedi Figura 15.1). Vi sono circa un milione di copie della GPA per ogni globulo rosso. La reattivit degli antigeni M ed N risiede nel segmento extracellulare, costituito da una sequenza di 72 amminoacidi, con catene carboidratiche unite lateralmente ai primi 50 residui amminoacidici del segmento ammino-terminale. Quando la GPA presenta la specificit antigenica M (GPA M ), il primo residuo amminoacidico la serina ed il quinto la glicina. Quando, invece, presenta una specificit antigenica N (GPA N ), la leucina e lacido glutammico sostituiscono, rispettivamente, la serina e la glicina nelle posizioni uno e cinque (vedi Figura 15.1). Le emazie che sono prive di tutta, o di gran parte, la GPA sono indicate come En(a). Questi rari soggetti possono produrre anticorpi (collettivamente indicati come anti-Ena) che reagiscono con diversi siti antigenici della parte extracellulare della glicoproteina. Alcuni soggetti En(a) possono produrre un anticorpo contro un antigene denominato Wrb che fa parte del sistema gruppoematico Diego. Lantigene Wrb origina da uninterazione tra la GPA e la molecola scambiatrice di anioni AE-1 (conosciuta anche come banda 3)5. La GPB una proteina pi piccola della GPA, e vi un numero minore di copie per ogni globulo rosso (circa 200.000). La GPB la glicoproteina che porta gli antigeni S, s e U. La GPB che esprime la specificit antigenica S presenta una metionina in posizione 29, mentre la GPB con la specificit antigenica s presenta una treonina in questa posizione (vedi Figura 15.1). A partire dallamminoacido 26, il segmento N-terminale della GPB presenta unidentica sequenza amminoacidica della GPAN e questo spiega la presenza di un antigene N (conosciuto come N) su tutti gli eritrociti dei normali fenotipi MNS. I globuli rossi che sono privi della GPB mancano non solo di S, s e U, ma anche di N. I soggetti con il raro fenotipo M N S s U quando immunizzati, possono produrre un
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Figura 15.1 - Diagramma schematico della glicoforina A e della glicoforina B. Viene indicata la sequenza amminoacidica che determina M, N, S e s. indica una O-concatenazione della catena oligosaccaridica laterale,indica una N-concatenazione della catena polisaccaridica laterale. Vengono segnalate le localizzazioni approssimative dei siti di clivaggio delle proteasi (per gentile concessione del New York Blood Center). potente anticorpo anti-N (anti-U/GPB) che reattivo con tutte le emazie che presentano un normale fenotipo MNS, sia N positivo che N negativo, e questo anticorpo deve essere considerato come clinicamente significativo. Alcune emazie S s possono anche presentare varianti della GPB. Effetti degli enzimi proteolitici sugli antigeni MNS Gli enzimi proteolitici, come la ficina o la papaina, spezzano in siti ben definiti le SGP di membrana. La reattivit con gli anticorpi anti-M ed anti-N viene eliminata utilizzando le tecniche enzimatiche comunemente in uso per il trattamento degli eritrociti. Gli effetti dei diversi enzimi sulle espressioni antigeniche del sistema MNS riflettono il punto nel quale lenzima spezza la sialoglicoproteina portatrice dellantigene e la posizione del relativo antigene rispetto al punto di clivaggio (vedi la Figura 15.1). La sensibilit dellantigene alle proteasi pu aiutare nellidentificazione della specificit anticorpale per gli antigeni M ed N, mentre gli effetti delle proteasi nei test condotti per gli antigeni S ed s presentano una maggiore variabilit. Inoltre, lantigene S sensibile alla presenza di tracce di sostanze cloro-ossigenate6. Anticorpi del sistema MNS Gli anticorpi rilevati con maggiore frequenza sono specifici per gli antigeni M, N, S e s. Anticorpo Anti-M Lanti-M viene frequentemente rilevato come
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unagglutinina fredda reattiva con le emazie sospese in soluzione fisiologica, qualora gli esami siano eseguiti a temperatura ambiente. Gli anti-M sono frequentemente osservati in sieri di soggetti che non sono mai stati esposti ad eritrociti umani estranei. Sebbene gli anti-M siano prevalentemente ritenuti di classe IgM, sono stati frequentemente rilevati molti esempi parzialmente o completamente costituiti da IgG. Questi anticorpi, tuttavia, soltanto raramente sono clinicamente significativi. Alcuni esempi di anti-M causano agglutinazioni pi forti se il pH del sistema di reazione viene ridotto a 6,5 e quando le emazie in esame possiedono unespressione a doppia dose dellantigene M. I sieri che reagiscono nel test a 37 C o con il test allantiglobulina dovrebbero essere considerati come potenzialmente significativi. Le prove di compatibilit eseguite con preriscaldamento e mantenute strettamente a 37 C (vedi Metodo 3.3) dovrebbero eliminare la reattivit della maggior parte dei campioni sierici con anti-M. In casi eccezionali, lanti-M rilevabile allantiglobulina ha determinato malattie emolitiche del feto e del neonato (MEFN), oppure lemolisi delle emazie incompatibili trasfuse. Anticorpo anti-N Lanti-N un anticorpo relativamente raro. Solitamente di classe IgM e si comporta, tipicamente, come una debole agglutinina fredda. Alcuni forti esempi di classe IgG, potenzialmente significativi, sono stati rilevati nelle eccezionali persone che presentano i rari fenotipi M+NS sU e M+NSsU+w, dato che questi soggetti sono completamente privi della GPB o ne presentano una forma alterata. Anticorpi anti-S, anti-s ed anti-U Diversamente dagli anti-M e dagli anti-N, gli anticorpi specifici per S, s e U vengono prodotti, di solito, per immunizzazione eritrocitaria. Tutti sono in grado di determinare delle reazioni trasfusionali emolitiche (HTR) e malattie emolitiche del feto e del neonato. Sebbene siano stati riferiti pochi esempi reattivi con emazie sospese in soluzione salina, gli anticorpi specifici
per S, s e U sono solitamente rilevati nel test allantiglobulina. La maggioranza, ma non tutti, dei ricercatori7 ha rilevato che la papaina o la ficina distruggono la reattivit delle emazie S+ con lanticorpo antiS e questo avviene in funzione della soluzione enzimatica che viene utilizzata, mentre la reattivit dellanticorpo anti-s con gli eritrociti s+ pu essere variabile8(p477). La maggioranza degli anticorpi a specificit anti-U reagisce allo stesso modo con le emazie trattate o meno con gli enzimi, ma vi sono stati esempi di anti-U, ampiamente reattivi, che evidenziavano un determinante antigenico U sensibile al trattamento enzimatico. Lanti-U raro, ma dovrebbe essere preso in considerazione quando il siero di un individuo di origine africana precedentemente trasfuso, o con precedenti gravidanze, presenta un anticorpo reattivo con un antigene ad alta frequenza. Anticorpi specifici per antigeni a bassa frequenza Esistono molti esempi di anticorpi specifici per gli antigeni a bassa frequenza del sistema MNS, come lanti-Mg o lanti-Vw. Molti di questi anticorpi sono rilevati come agglutinine attive in fisiologica, in sieri di persone che non sono mai state esposte a eritrociti umani estranei. La rarit di questi antigeni rende improbabile la possibilit di rilevarli, pur se presenti gli anticorpi specifici.
Sistema Kell
Gli antigeni del sistema Kell Gli antigeni del sistema Kell sono espressi, con una bassa densit, sulla membrana eritrocitaria e vengono indeboliti o completamente distrutti dal trattamento delle emazie con agenti riducenti o con acidi. Gli antigeni sono portati da una proteina e sono codificati da un singolo gene. Per una recensione approfondita, si rimanda a Lee, Russo e Redman9. Antigeni K e k Lantigene K venne identificato per la prima volta
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nel 1946 perch un anticorpo aveva determinato una MEFN. Lallele responsabile di K presente nel 9% dei soggetti di razza bianca e in circa il 2% dei neri. Lesistenza dellatteso allele che codifica per lantigene k venne confermata quando venne stabilita la relazione antitetica esistente tra il K e lantigene evidenziato dallanti-k. Lanti-k reattivo con i globuli rossi di oltre il 99% di tutti gli individui. Altri antigeni del sistema gruppoematico Kell Altri antigeni del sistema Kell, tra loro antitetici, comprendono Kpa, Kpb, e Kpc; Jsa e Jsb; K11 e K17; K14 e K24. Non tutte le combinazioni genotipiche del sistema Kell teoricamente possibili sono state osservate, per esempio Kpa e Jsa non sono mai stati rilevati come presenti sullo stesso cromosoma. Kpa un antigene espresso in modo predominante nei bianchi, mentre Js a viene rilevato prevalentemente in soggetti di origine africana. Anche laplotipo che produce gli antigeni K e Kpa non mai stato rilevato. La Tabella 15.3 presenta alcuni dei fenotipi del sistema Kell. La tabella comprende anche Ko, che un fenotipo null, nel quale i globuli rossi sono privi di tutti gli antigeni del sistema Kell. Numerosi ulteriori antigeni, ad alta frequenza, sono stati assegnati al sistema Kell, perch gli anticorpi che li identificano sono risultati non reattivi con le emazie
Ko. Per semplicit, diversi antigeni, ad alta o a bassa frequenza, non sono stati compresi nella tabella. Fenotipi che presentano antigeni Kell depressi Kmod un termine utilizzato per descrivere i fenotipi Kell caratterizzati da deboli espressioni antigeniche. In molti casi, per evidenziarne la presenza, sono necessari dei test di assorbimento/ eluizione e si ritiene che il fenotipo Kmod possa essere originato da numerose e diverse mutazioni puntiformi del gene KEL. Le emazie delle persone con alcuni fenotipi Gerbich negativi presentano anche fenotipi Kell depressi. Le persone con i rari fenotipi Ge:2,3 e Ge:2,3,4 (Leach) hanno almeno alcuni antigeni del sistema Kell depressi. La presenza dellallele Kp a indebolisce lespressione antigenica degli altri antigeni Kell posti in posizione cis. Per esempio, il k delle emazie Kp(a+) pu reagire molto pi debolmente di quanto atteso e, se esaminato con sieri anti-k deboli, pu essere erroneamente interpretato come negativo. Biochimica del sistema Kell Gli antigeni del sistema Kell sono portati da una proteina di 93-kD che attraversa la membrana eritrocitaria una sola volta. Gli antigeni Kell
Tabella 15.3 - Alcuni fenotipi e loro frequenza nel sistema Kell Reazioni con antiK + + 0 K 0 + + + + 0 0 + + + + 0 0 0 + + 0 Kp
a
Fenotipo
a
Frequenza % Bianchi Neri rari 2 98 0 rari 100 1 19 80
Kp
Js
Js
K+k K+k+ Kk+ Kp(a+b) Kp(a+b+) Kp(ab+) Js(a+b) Js(a+b+) Js(ab+) Ko
0,2 8,8 91,0 rari 2,3 97,7 0,0 rari 100,0 Estremamente rari
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vengono efficacemente inattivati dal trattamento degli eritrociti con dei reattivi sulfidrilici, come il 2mercaptoetanolo (2-ME), il ditiotreitolo (DTT) o il 2-aminoetilisodiouroniobromide (AET). Questo trattamento efficace per preparare emazie artificialmente private degli antigeni Kell, molto utili per lidentificazione di anticorpi Kell-correlati. Tuttavia, il trattamento con i reattivi sulfidrilici pu danneggiare la reattivit anche di antigeni di altri sistemi (Lwa, Doa, Dob, Yta, ed altri). Perci, bench il trattamento con questi reattivi possa essere utilizzato nella risoluzione di problemi immunoematologici, la specificit anticorpale deve essere definitivamente dimostrata con altri mezzi. Come prevedibile, gli antigeni Kell sono distrutti anche con il ZZAP, una miscela di DTT ed enzima (vedi Metodi 3.10, 4.6 e 4.9). La suscettibilit allazione dei reattivi sulfidrilici suggerisce che i ponti disolfurici siano essenziali per mantenere la reattivit degli antigeni Kell. Questa ipotesi stata supportata dalla caratterizzazione biochimica delle proteine Kell, ottenuta dal DNA clonato10; le proteine presentano numerosi residui cisteinici nella regione extracellulare. La cisteina forma rapidamente dei ponti disolfurici, con i quali contribuisce alla ripiegatura della proteina. Gli antigeni che riflettono la struttura conformazionale della proteina sono sensibili ad ogni agente che interferisca con la sua struttura terziaria. Gli antigeni Kell vengono distrutti anche dal trattamento con acido EDTA-glicina. La funzione della proteina Kell sconosciuta, ma essa presenta significative similitudini strutturali con la famiglia delle endopeptidasi neutre, che legano lo zinco. Essa presenta inoltre la massima similarit con lantigene comune (common) della leucemia linfoblastica acuta (CALLA o CD10), unendopeptidasi neutra presente sui leucociti8(pp647-648). Antigene Kx, fenotipo McLeod e loro relazioni con il sistema Kell Bench il locus del sistema Kell sia posto sul braccio lungo del cromosoma 7 e il locus Kx (XK) si trovi nella regione Xp21 del cromosoma X, evidenze suggeriscono che le proteine K e Kx formano un complesso legato, in modo covalente,
sui globuli rossi normali8. Sugli eritrociti che presentano normali espressioni antigeniche Kell, lantigene Kx appare espresso solo debolmente. Si ritiene che questa caratteristica rappresenti uninterferenza sterica della glicoproteina Kell nel punto di approccio dellanti-Kx al suo antigene. Le emazie dei soggetti Ko, prive dellantigene K, sono fortemente reattive con lanti-Kx e, analogamente, la rimozione o la denaturazione della glicoproteina Kell con lAET o il DTT rendono le emazie normali fortemente reattive con lanti-Kx. Si ritiene che la presenza della glicoproteina sulla quale espresso lantigene Kx sia essenziale perch gli antigeni Kell si strutturino sulla membrana o per essere normalmente espressi sui globuli rossi. Per questo motivo, la mancanza di Kx associata ad una debole espressione degli antigeni Kell. I globuli rossi privi di Kx non presentano soltanto unespressione depressa degli antigeni Kell ma anche una diminuita sopravvivenza, una ridotta deformabilit, una diminuita permeabilit allacqua e una morfologia acantocitica. Questa combinazione di elementi, o gruppo di anomalie dei globuli rossi, viene indicato come fenomeno McLeod, dal nome della prima persona sulla quale vennero fatte queste osservazioni. Le persone con il fenotipo eritrocitario McLeod hanno ulteriori anomalie, scarsamente definite, del sistema neuromuscolare, caratterizzate da un persistente livello sierico elevato dellenzima creatin-fosfo-chinasi e, nei soggetti anziani, da disordini della funzione muscolare. Il fenotipo McLeod origina da una delezione e da mutazioni nel locus XK del cromosoma X. In pochi casi, il fenotipo McLeod stato osservato in pazienti affetti dalla malattia granulomatosa cronica (CGD), nella quale i granulociti presentano una normale attivit di fagocitosi dei microorganismi ma sono incapaci di sopprimere i patogeni ingeriti. Il fenotipo McLeod con CGD sembra essere originato dalla delezione di una parte del cromosoma X che comprende sia il locus XK come anche il gene responsabile della CGD legata al cromosoma X.
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Anticorpi del sistema Kell Anti-K e anti-k Poich lantigene K un forte immunogeno, lanti-K si rileva frequentemente nel siero di pazienti trasfusi. Rari esemplari di anti-K sono stati osservati anche nei sieri di soggetti mai stati esposti a eritrociti estranei; questi anticorpi appaiono come agglutinine complete attive contro emazie sospese in fisiologica. La larga maggioranza degli anticorpi anti-K di origine immune ed reattiva nel test allantiglobulina; alcuni anticorpi fissano il complemento. Alcuni ricercatori hanno osservato che esempi di anti-K reagiscono meno nelle procedure che utilizzano soluzioni contenenti mezzi a bassa forza ionica (LISS), e particolarmente nel test con il polibrene, rispetto alla reattivit espressa con sospensioni di emazie in soluzione salina, nelle procedure che utilizzano delle soluzioni. Altri, tuttavia, non hanno osservato differenze nella reattivit anticorpale esaminando numerosi campioni di anti-K in sistemi con mezzi a bassa forza ionica. Lanti-K ha determinato molte reazioni trasfusionali emolitiche, sia immediate che ritardate. Lanti-K pu essere la causa di severe MEFN e di grave anemia fetale, dovuta alla distruzione immunologica, nel fegato fetale11, delle cellule progenitrici eritropoietiche K+ da parte dei macrofagi. Poich oltre il 90% dei donatori sono K-negativi, non difficoltoso reperire sangue compatibile per quei pazienti che presentino nel siero lanti-K. Lanti-k presenta delle caratteristiche sierologiche e cliniche analoghe a quelle dellanti-K, ma lanticorpo ricorre molto meno frequentemente. Solamente circa una persona su 500 non possiede lantigene k e la selezione di sangue compatibile presenta ovviamente maggiori difficolt. Altri anticorpi del sistema Kell Gli anticorpi anti-Kpa, anti-Kpb, Anti-Jsa ed antib Js sono tutti molto meno frequenti dellanti-K, ma presentano caratteristiche sierologiche analoghe e sono considerati clinicamente significativi. Ognuno di essi pu essere prodotto in seguito a trasfusioni o per immunizzazione feto-materna. La frequenza di questi anticorpi determinata
dallimmunogenicit del relativo antigene, dalla distribuzione dei fenotipi negativi tra i riceventi delle trasfusioni e da quella dei fenotipi positivi tra i donatori. Nei pazienti di origine africana, frequentemente trasfusi con sangue fenotipicamente selezionato e proveniente, di solito, da donatori neri, lanticorpo anti-Jsa relativamente comune. Questo determinato dalla frequenza approssimativa del 20% dellantigene Jsa nella popolazione di origine africana (vedi Tabella 15.3). Nella pratica quotidiana, tuttavia, questi anticorpi sono rari. Lassistenza di una banca del sangue raro solitamente necessaria per reperire sangue compatibile per i pazienti immunizzati contro gli antigeni ad alta frequenza Kpb e Jsb. Lanticorpo anti-Ku viene tipicamente rilevato nelle persone Ko immunizzate. stato riferito in letteratura quale responsabile di una MEFN ad esito letale12 ed appare specifico per un singolo determinante antigenico dato che non separabile dalle altre specificit anticorpali Kell. Comunque, anticorpi specifici per altri antigeni Kell possono essere presenti contemporaneamente nel siero insieme con lanti-Ku. Alcuni soggetti con il fenotipo Kmod hanno prodotto un anticorpo anti Ku-simile.
Sistema Duffy
Antigeni del sistema Duffy Gli antigeni Fya e Fyb sono codificati da un paio di alleli co-dominanti nel locus Duffy (FY) situato sul cromosoma 1. Gli anticorpi anti-Fya ed antiFyb definiscono i quattro fenotipi del sistema, cio: Fy(a+b), Fy(a+b+), Fy(ab+) e Fy(ab) (vedi Tabella 15.4). Nei caucasici i primi tre fenotipi sono comuni mentre gli individui con fenotipo Fy(a b ) sono estremamente rari. Nei neri, invece, la frequenza del fenotipo Fy(ab) del 68%. Il gene Duffy codifica una glicoproteina che viene espressa anche in altri tessuti, come il cervello, il rene, la milza, il cuore e il polmone. Gli individui Fy(ab) possono originare sia da un genotipo FyFy come da un fenotipo null. In ogni caso, in molti soggetti neri con fenotipo Fy(a b ), viene impedita la trascrizione nella
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matrice eritropoietica del midollo e la proteina Duffy resta assente sui globuli rossi. Questi soggetti hanno un allele simile, che previene la trascrizione8(p439), presente nella regione strutturale del gene Fyb. Tuttavia, la proteina Duffy normalmente espressa nelle cellule non appartenenti alla serie eritroide di queste persone13. Altri individui Fy(a b ) o hanno la totale assenza della glicoproteina Duffy o ne presentano una marcatamente alterata 8(p457-458). Questa situazione riguarda lespressione antigenica anche delle cellule degli altri tessuti e non solamente quella dei globuli rossi. Questi soggetti che sono completamente privi della glicoproteina o ne hanno una alterata, possono produrre lanticorpo anti-Fy3 che risulter reattivo con gli eritrociti Fy(a+) e/o Fy(b+). stata descritta una rara forma ereditaria di antigene Fyb debole detta Fyx, probabilmente dovuta ad una mutazione puntiforme. Il Fyx pu non essere evidenziato se non viene utilizzato nella tipizzazione un potente anti-Fyb. Lantigene Fy5 sembra essere originato da uninterazione dei prodotti genici di Duffy ed Rh, dato che non viene espresso sui globuli rossi con fenotipo Rhnull. Lantigene Fy6 stato rilevato solamente utilizzando anticorpi monoclonali di origine murina e non presente sulle emazie Fy(ab) e Fy:3, 58(p448). Biochimica del sistema Duffy Negli eritrociti, il gene Duffy codifica una glicoproteina che attraversa ripetutamente la membrana. Gli antigeni Fya, Fy b e Fy6 sono Tabella 15.4 - Fenotipi e frequenze nel sistema Duffy Reazioni con antiFy + + 0 0
a
localizzati sul frammento N-terminale della glicoproteina Duffy e sono sensibili alla denaturazione con proteasi, come la ficina, la papaina e l-chimotripsina, differentemente dagli antigeni Fy3 o Fy5. Lantigene Fy3 localizzato sullultima ansa esterna della glicoproteina Duffy, e non viene alterato dal trattamento enzimatico con le proteasi (vedi Pierce e Macpherson)14. La glicoproteina Duffy il recettore per il parassita malarico Plasmodium vivax, e le persone che presentano emazie prive degli antigeni Fya e Fyb sono resistenti a questa forma della malattia. NellAfrica sub-Sahariana, particolarmente nellAfrica Occidentale, la resistenza al parassita malarico P. vivax conferita dal fenotipo Fy(ab) pu aver favorito una sua selezione naturale e, infatti, la maggior parte delle persone presentano tale fenotipo. Il gene Duffy stato clonato13 e la glicoproteina Duffy stata riconosciuta come il recettore eritrocitario di numerose chemochine, particolarmente dellinterleuchina-815. Poich le chemochine sono molecole biologicamente attive, stato postulato che il Duffy agisca come una spugna per regolarne leccesso, senza effetti dannosi sugli eritrociti. Anticorpi del sistema Duffy Lanticorpo anti-Fya piuttosto comune e pu essere causa di MEFN e reazioni trasfusionali emolitiche. Lanti-Fyb un anticorpo raro ed generalmente debolmente reattivo. Lanti-Fyb, in rari casi, pu determinare modeste MEFN ed stato responsabile di reazioni trasfusionali emolitiche, lievi nella maggior parte dei casi. Entrambi gli anticorpi sono solitamente
Fenotipo
Frequenze fenotipiche negli adulti (%) Bianchi Neri 9 1 22 68
Fy 0 + + 0
Fy(a+b) Fy(a+b+) Fy(ab+) Fy(ab)
17 49 34 Molto rari
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di classe IgG e sono reattivi in modo ottimale nel test allantiglobulina. La glicoproteina che esprime gli antigeni viene clivata dalla maggior parte delle proteasi utilizzate nelle indagini sierologiche, cos che gli anticorpi anti-Fya e anti-Fyb non sono solitamente reattivi nelle procedure tecniche che impiegano enzimi. Anti-Fya e anti-Fyb deboli possono essere reattivi solo con dei globuli rossi che presentino lantigene in doppia dose. Nei caucasici, le emazie che esprimono uno solo dei due antigeni sono presunte essere prodotte da un soggetto omozigote per il gene, presentando, quindi, lantigene in doppia dose. Nei neri, queste cellule possono esprimere lantigene in dose singola e non presentare le forti reazioni attese per anticorpo che evidenziano leffetto dose. Per esempio, un paziente tipizzato come Fy(a+b) pu essere FyaFy. Lanti-F3 venne descritto per la prima volta nel siero di una persona di razza bianca che presentava il fenotipo Fy(ab); questo anticorpo specifico per lantigene ad alta frequenza Fy3. Le sole emazie con cui non reattivo sono Fy(ab). Diversamente dagli antigeni Fya e Fyb, lantigene Fy3 non viene alterato dal trattamento enzimatico e lanti-Fy3 reagisce bene con le emazie trattate con enzimi positive per Fya e/o Fyb. Lanti-Fy3 raro ma, in qualche caso, viene prodotto anche da soggetti di razza nera Fy(a b ), privi dellantigene Fy3, immunizzati da trasfusioni multiple. Sono stati descritti due ulteriori anticorpi rari, entrambi reattivi con le emazie trattate con la papaina. Tabella 15.5 - Fenotipi e frequenze nel sistema Kidd Reazioni con antiJk + + 0 0
a
stato riportato un caso di anti-Fy4. Lanticorpo reagiva con le emazie con fenotipo Fy(ab) e con alcuni campioni Fy(a+b ) e Fy(a b+) di soggetti di razza nera, ma non era reattivo con gli eritrociti Fy(a+b+), suggerendo una specificit per il presunto prodotto del gene Fy. Tuttavia, differenti laboratori di riferimento, hanno ottenuto risultati equivoci e, di conseguenza, la dimostrazione dellesistenza dellantigene Fy4 considerata inconsistente. Lanti-Fy5 simile allanti-Fy3, tranne che per il fatto che questo anticorpo non reagisce con le emazie Rhnull, che esprimono un normale antigene Fy3 , mentre non reattivo con le emazie Fy(ab) dei soggetti di razza nera. Esso pu reagire con i globuli rossi dei soggetti di razza bianca Fy(ab). Questo fatto evidenzia una distinzione precedentemente ignota tra il fenotipo Fy(ab), tanto comune nella razza nera, e quello rilevabile, solo eccezionalmente, nei soggetti di razza bianca8(p447). Lanti-Fy6 un anticorpo monoclonale murino che evidenzia un antigene ad alta frequenza nella stessa regione degli antigeni Fya e Fyb. Lanti-Fy6 reattivo con tutte le emazie Fy(a+) e/o Fy(b+), non reagisce con le emazie Fy(a b ) ma, diversamente dallanti-Fy3, non reagisce con le emazie trattate con enzimi proteolitici.
Sistema Kidd
Antigeni Jka e Jkb Gli antigeni Jka e Jkb sono localizzati sulla
Fenotipo
Frequenze fenotipiche (%) Bianchi Neri 57 34 9
Jk 0 + + 0
Jk(a+b) Jk(a+b+) Jk(ab+) Jk(ab)
28 49 23 Rarissimi
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proteina di trasporto dellurea che viene codificata dal gene HUT11, posto sul cromosoma 18. Le emazie Jk(ab), nelle quali manca la proteina JK, sono pi resistenti alla lisi indotta dallurea 2M16. Le emazie con normale fenotipo Jk si rigonfiano e si lisano rapidamente in una soluzione di urea 2M. I quattro fenotipi identificati nel sistema Kidd sono illustrati nella Tabella 15.5. Il fenotipo Jk(a b ) estremamente raro, tranne che in alcune popolazione delle Isole del Pacifico. Due meccanismi genetici si sono dimostrati responsabili della formazione del fenotipo Jk(a b )17. Uno determinato dalla presenza, allo stato omozigote, dellallele silente Jk. Laltro si origina dallazione di un gene inibitore dominante detto In(Jk) . Il gene soppressore dominante degli antigeni Kidd analogo al soppressore In(Lu) del sistema Lutheran. Anticorpi del sistema Kidd Anti-Jka e anti-Jkb Lanti-Jka venne riconosciuto per la prima volta nel 1951, nel siero di una paziente che aveva dato alla luce un neonato affetto da MEFN. Due anni dopo, venne scoperto lanti-Jkb nel siero di un paziente che aveva avuto una reazione trasfusionale emolitica. Entrambi gli anticorpi reagiscono, in modo ottimale, con il test allantiglobulina. Talvolta, tuttavia, pu essere rilevata una reattivit con emazie sospese in soluzione salina in campioni di siero fresco o quando gli anticorpi sono di recentissima formazione. Sia lanti-Jk a che lanti-Jk b sono spesso debolmente reattivi; questo perch, qualche volta, sono pi facilmente evidenziabili in presenza di complemento che fissano attivamente alle emazie. Alcuni esempi non sono ulteriormente rilevabili dopo la conservazione dei campioni. Altri sono preferibilmente reattivi con le emazie omozigoti. Alcuni ricercatori non riferiscono difficolt nel rilevare gli anti-Jka e gli anti-Jkb nei test a bassa forza ionica quando viene impiegato un siero antiIgG. Altri ritengono che pu essere importante, per una determinazione affidabile di questi anticorpi debolmente reattivi, impiegare un siero
antiglobuline che contenga una componente anticomplementare. Le reazioni pi forti possono essere ottenute utilizzando il polietilenglicole (PEG) oppure emazie pre-trattate con enzimi nel test allantiglobulina. Gli anticorpi del sistema Kidd solo occasionalmente causano MEFN, e, di solito, in forma leggera. Essi sono invece ben noti per il coinvolgimento in severe reazioni trasfusionali emolitiche, e particolarmente nelle reazioni trasfusionali emolitiche ritardate (DHTRs, Delayed HTRs). Le DHTRs si verificano quando lanticorpo si sviluppa rapidamente come risposta anamnestica contro gli antigeni delle emazie trasfuse, che sono distrutte quando esse sono ancora presenti nel torrente circolatorio. In molti casi, il riesame del siero pre-trasfusionale del paziente, conferma il fatto che lanticorpo non era evidenziabile negli esami originali. Anti-Jk3 I sieri di alcuni rari soggetti Jk(ab) presentano un anticorpo che reagisce con tutti i campioni di emazie Jk(a+) e/o Jk(b+), ma non reattivo con gli eritrociti Jk(ab). Sebbene qualche volta siano separabili delle componenti minoritarie con specificit anti-Jka o anti-Jkb, la componente anticorpale che ampiamente prevalente specifica per un antigene denominato Jk3, presente sia sulle emazie Jk(a+) che Jk(b+). Tabella 15.6 - Fenotipi e frequenze del sistema Lutheran nei bianchi* Reazioni con antiLua + + 0 0 Lub 0 + + 0 Lu(a+b ) Lu(a+b+) Lu(ab+) Lu(ab) Fenotipo Frequenze fenotipiche (%) 0,15 7,5 92,35 Molto raro
* Non sono disponibili dati sufficienti per un calcolo affidabile delle frequenze nella popolazione di origine africana.
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Altri sistemi gruppoematici eritrocitari

Fino ad ora, questo capitolo stato dedicato ai sistemi gruppoematici eritrocitari, contro i cui antigeni i principali anticorpi possono essere rilevati abbastanza frequentemente nel lavoro di routine dei laboratori di sierologia eritrocitaria. Gli altri sistemi eritrocitari elencati nella Tabella 10.1 verranno di seguito succintamente considerati; il lettore interessato dovr consultare, per informazioni pi dettagliate, anche altri testi e altre pubblicazioni. Sistema Lutheran Antigeni Lua e Lub I fenotipi del sistema Lutheran, come definiti dagli anticorpi anti-Lua e anti-Lub, sono presentati nella Tabella 15.6. Il fenotipo Lu(ab) molto raro e pu essere originato da una di tre diverse circostanze genetiche (Pierce e Macpherson14). Nella prima situazione, un gene Lutheran, presumibilmente amorfo (Lu), viene ereditato da entrambi i genitori. Nella seconda e pi comune circostanza, il fenotipo negativo viene ereditato, come carattere dominante, da un gene inibitore che segrega indipendentemente, In(LU) , che inibisce la normale espressione degli antigeni Lutheran e di alcuni altri antigeni eritrocitari (particolarmente P 1, I, AnWj, Ina ed Inb). Il terzo tipo di fenotipo Lu(a b) determinato da un gene soppressore legato al cromosoma X, con unereditariet di tipo recessivo. Altri antigeni del sistema Lutheran Una serie di antigeni ad alta frequenza (Lu4, Lu5, Lu6, Lu7, Lu8, Lu11, Lu12, Lu13, Lu16, Lu17 e Lu20) sono stati assegnati al sistema Lutheran perch i corrispondenti anticorpi non sono reattivi con le emazie Lu(a b ) di nessuno dei tre substrati genetici. Due antigeni a bassa frequenza, Lu9 e Lu14, sono stati ammessi al sistema Lutheran per la loro apparente correlazione antitetica, rispettivamente, con gli antigeni ad alta frequenza Lu6 e Lu8. Au a (Lu18), antigene con frequenza relativamente elevata [il 90% dei soggetti in tutte
le popolazioni sono Au(a+)] e il suo partner antitetico, Aub (Lu19), che presente nel 50% dei bianchi e nel 68% dei neri, si sono dimostrati appartenere al sistema Lutheran18,19. Biochimica del sistema Lutheran Gli antigeni del sistema sono espressi su una glicoproteina che porta oligosaccaridi sia N- che O-concatenati. Questa proteina esiste in due forme ed stata dimostrata svolgere un ruolo nelladesione cellulare. Gli antigeni vengono distrutti dalla tripsina, dalla alfa-chimotripsina e dai riducenti dei ponti disolfurici20. Questi rilievi, e quelli ottenuti da esperimenti di immunoblotting, suggeriscono lesistenza di legami disolfurici intercatene o intracatene. I test condotti con anticorpi monoclonali antiLub suggeriscono che il numero dei siti antigenici Lub per eritrocita modesto, circa 600-1.600 per ogni globulo rosso Lu(a+b+) e 1.400-3.800 per ogni eritrocita Lu(ab+)21. I loci Lu e Se (secretore) sono stati dimostrati come concatenati nel 1951, costituendo il primo esempio documentato di concatenazione autosomica nelluomo. I due loci sono stati assegnati al cromosoma 19. stato clonato il gene che codifica le glicoproteine Lu22. Anticorpi del sistema Lutheran Il primo esemplare di anti-Lua (-Lu1) venne rilevato nel 1945 in un siero che conteneva una miscela di diversi altri anticorpi. Lanti-Lua e lantiLub non sono rilevati frequentemente. Essi sono, con maggiore frequenza, prodotti in risposta a gravidanze o a trasfusioni, ma sono stati rilevati anche in assenza di evidenti stimolazioni antigeniche eritrocitarie. Gli antigeni Lutheran sono poco sviluppati alla nascita. Non , quindi, sorprendente che lanti-Lua non sia stato riportato come causa di MEFN, e neppure sia stato associato a reazione trasfusionale emolitica. Lanti-Lub stato riportato come causa di una ridotta sopravvivenza delle emazie incompatibili trasfuse, ma non come causa di malattia emolitica neonatale ed , per lo pi, coinvolto in MEFN molto modeste. La maggior parte degli anticorpi antiLua e alcuni anti-Lub agglutinano direttamente le
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emazie con una buona espressione antigenica, sospese in soluzione salina, producendo un tipico quadro di reattivit a campo misto con piccoli e medi agglutinati di emazie dispersi in mezzo alla maggioranza dei globuli rossi non agglutinati. Sistema Diego Antigeni del sistema Diego Il sistema Diego costituito da due coppie di antigeni antitetici indipendenti, denominati Dia/Dib
e Wra/Wrb. Il sistema contiene, inoltre, un ampio numero di antigeni a bassa frequenza, come si pu osservare nellAppendice 6. Gli antigeni sono collocati sulla proteina AE-1 (banda 3), codificata da un gene situato sul cromosoma 17. Gli antigeni Di a e Di b sono ottimi marcatori antropologici, dato che lantigene Dia confinato quasi totalmente nelle popolazioni di origine asiatica e dei nativi nord e sudamericani, nei quali la frequenza dellantigene Dia pu raggiungere una
Tabella 15.7 - Frequenze fenotipiche negli altri sistemi gruppoematici eritrocitari con antigeni antitetici co-dominanti Sistema Yt Reazione con antiYta + + 0 Doa + + 0 Coa + + 0 0 Sc1 + + 0 0 Ina + + 0 Dia + + 0 Ytb 0 + + Dob 0 + + Cob 0 + + 0 Sc2 0 + + 0 Inb 0 + + Dib 0 + + Fenotipo Frequenza fenotipica nei Bianchi (%)* 91,9 7,9 0,2 17,2 49,5 33,3 89,3 10,4 0,3 rarissimi 99,7 0,3 rarissimi rarissimi rarissimi <1 >99 rari rari >99,9
Yt(a+b) Yt(a+b+) Yt(ab+) Do(a+b) Do(a+b+) Do(ab+) Co(a+b) Co(a+b+) Co(ab+) Co(ab) Sc: 1,2 Sc: 1,2 Sc: 1,2 Sc: 1,2 In(a+b) In(a+b+) In(ab+) Di(a+b) Di(a+b+) Di(ab+)
Dombrock
Colton
Scianna
Indian
Diego
* Esistono dati insufficienti per un calcolo attendibile delle frequenze nei soggetti di origine africana.
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frequenza del 54%8(p583). Gli antigeni Wra e Wrb sono localizzati sulla banda 3, in stretta associazione con la glicoforina A (GPA). Lespressione di Wrb dipende dalla presenza della GPA (vedi sistema MNS). Anticorpi del sistema Diego Lanti-Dia pu essere causa di MEFN o della lisi di emazie Di(a+) trasfuse. Lanti-Dib raro, ma clinicamente significativo. Lanti-Wra molto comune e pu presentarsi senza alcuna stimolazione immunizzante. Raramente pu essere causa di reazioni trasfusionali emolitiche o di MEFN. Lanti-Wrb un anticorpo che viene rilevato molto raramente e pu essere prodotto dai rarissimi soggetti Wr(a+b ) e da alcuni soggetti En(a). Lanti-Wrb pu riconoscere un antigene enzimaresistente o enzima-sensibile24. Deve essere considerato come potenzialmente lesivo di emazie Wr(b+)8(p589). Sistema Cartwright Antigeni Cartwright Il sistema Yt (Cartwright) consiste in due antigeni: Yta e Ytb (vedi Tabella 15.7). Un gene posizionato sul cromosoma 7 codifica questi antigeni. Gli antigeni Yt si trovano sullacetilcolinesterasi (AChE) dei globuli rossi 24, che un enzima importante nella trasmissione neurale, ma la cui funzione sui globuli rossi ignota. Gli enzimi proteolitici determinano un effetto variabile sullantigene Yta, ma il trattamento con DTT 0,2M sembra distruggere completamente lespressione antigenica Yta eritrocitaria. Anticorpi Cartwright Alcuni anti-Yta sono benigni. In pochi casi lantia Yt ha determinato una distruzione accelerata delle emazie Yt(a+) trasfuse. La previsione del comportamento clinico di questo anticorpo utilizzando il monocyte monolayer assay (il test che impiega monociti in monostrato) si dimostrata soddisfacente25,26. Lanti-Yta non conosciuto come causa di MEFN.
Lanti-Ytb un anticorpo raro e non mai stato coinvolto in reazioni trasfusionali emolitiche o in MEFN. Sistema Xg Antigene Xga Nel 1962, venne scoperto un anticorpo che identificava un antigene pi frequente tra le donne che tra gli uomini. Questo pu essere il risultato atteso per un carattere legato al cromosoma X, perch le femmine ereditano un cromosoma X da entrambi i genitori, mentre i maschi ereditano un solo X dalla loro madre. Lantigene venne denominato Xga in riconoscimento della sua ereditariet legata al cromosoma X. La Tabella 15.8 fornisce le frequenze fenotipiche tra i maschi e le femmine di razza bianca. Gli enzimi come la papaina e la ficina denaturano lXga. stato clonato il gene che codifica lXga27,28. Anticorpo Xga Lanti-Xga un raro anticorpo che solitamente reagisce solo nel test allantiglobulina. Lanti-Xga non mai stato coinvolto in MEFN o in reazioni trasfusionali emolitiche. Tabella 15.8 - Frequenza dei fenotipi Xg(a+) ed Xg(a) nei maschi e nelle femmine di razza bianca Fenotipo Xg(a+) Xg(a) Frequenza fenotipica (%) Maschi Femmine 65,6 34,4 88,7 11,3
Le frequenze sono basate sui risultati combinati dei test di circa 7.000 campioni ematici random della popolazione di origine Nord Europea. Non vi sono dati sufficienti per un calcolo attendibile delle frequenze nella popolazione di origine africana.
Lanti-Xga pu essere molto utile per tracciare la trasmissione del tratto genetico associato al cromosoma X, quantunque il legame con il locus Xg sia stato dimostrato ad oggi per pochi altri caratteri ereditari.
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Sistema Scianna Antigeni Scianna Cinque antigeni (Sc1, Sc2, Sc3, Rd e STAR) sono stati riconosciuti come appartenenti al sistema gruppoematico eritrocitario Scianna. Gli antigeni Scianna sono espressi sulla proteina di adesione cellulare ERMAP3. Sc1 un antigene ad alta frequenza, mentre Sc2 ricorre molto raramente. Sc1 e Sc2 originano come prodotti di geni allelici (vedi Tabella 15.7). Si ritiene che Sc3 sia espresso sostanzialmente sulle emazie di tutti gli individui che ereditano un gene funzionale Sc1 o Sc2, analogamente a quanto avviene per Fy3. Rd e STAR sono antigeni a bassa frequenza, recentemente assegnati al sistema Scianna. Gli antigeni sono resistenti ai trattamenti enzimatici comunemente utilizzati in sierologia gruppoematica. Il gene che codifica gli antigeni Scianna situato sul cromosoma 1. Anticorpi Scianna Gli anticorpi sono rari. Lanti-SC1 non stato riportato come causa di una reazione trasfusionale emolitica o di MEFN. Lanti-Sc2 ha determinato dei TAD positivi nei neonati, ma non MEFN clinicamente rilevabili. Sistema Dombrock Antigeni Dombrock Inizialmente, questo sistema era costituito dagli antigeni Doa e Dob, con le frequenze fenotipiche mostrate nella Tabella 15.7.
La scoperta che le emazie negative per lantigene ad alta frequenza Gya erano anche Do(a b ) 29 ha determinato il recente ampliamento del sistema Dombrock con linclusione di tre ulteriori antigeni ad alta frequenza: Gya, Hy e Joa. Le reciproche relazioni sono presentate nella Tabella 15.930. Le emazie Gy(a) rappresentano il fenotipo null del sistema. I fenotipi Gy(a+ w), Hy e Jo(a ) sono stati osservati esclusivamente nei neri. Gli antigeni Dombrock sono localizzati su una glicoproteina di 46-48 Kd, la cui funzione sconosciuta. Anticorpi Dombrock Lanti-Doa e lanti-Dob sono anticorpi non comuni che vengono solitamente rilevati in sieri contenti miscele di specificit anticorpali. Questo pu rendere difficoltoso il rilievo e lidentificazione degli anti-Doa ed anti-Dob. Lanti-Doa ha causato sia MEFN che una reazione trasfusionale emolitica31. Non mai stato pubblicato un caso di MEFN sostenuta dallanti-Do b, ma alcuni esempi di questo anticorpo hanno determinato delle reazioni trasfusionali emolitiche. Gli anticorpi specifici per Gya, Hy e Joa possono causare una ridotta sopravvivenza delle emazie trasfuse positive per lantigene bersaglio, ma anche lievi MEFN. La reattivit degli anticorpi del sistema Dombrock pu essere incrementata trattando le emazie test con papaina o ficina, ma viene indebolita o distrutta dal trattamento con reattivi sulfidrilici.
Tabella 15.9 - Correlazioni tra gli antigeni del sistema Dombrock Fenotipo Normale Do(a+b) Normale Do(a+b+) Normale Do(ab+) Gv(a) Hv Jo(a ) (+)
(+) = debole espressione antigenica
Doa + + 0 0 0 (+)
Dob 0 + + 0 (+) +
Gya + + + 0 (+) (+)
Hy + + + 0 0 0
Joa + + + 0 (+)
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Sistema Colton Antigeni Colton Il sistema Colton costituito dal Coa, antigene ad alta frequenza, dal Cob, antigene a bassa frequenza e dal Co3, un antigene (analogo a Fy3) che viene considerato come il prodotto sia del gene Coa che del gene Co b. Questi antigeni costituiscono il prodotto di un gene situato sul cromosoma 7. La frequenza dei fenotipi nei caucasici presentata nella Tabella 15.7. Gli antigeni Colton sono collocati sulla proteina di membrana CHIP 28 (Aquaporin), che funziona come trasportatrice cellulare di acqua allinterno del globulo rosso32. Tabella 15.10 - Fenotipi e frequenze del sistema LW nei Bianchi Reazioni con antiLWa + + 0 0 LWb 0 + + 0 LW (a+b) LW (a+b+) LW (ab+) LW (ab) Fenotipo Frequenze fenotipiche (%) >99% <1% Molto rari Molto rari
Associazione con Rh Lantigene LWa maggiormente espresso sugli eritrociti dei soggetti adulti D+ rispetto a quella che rilevabile sulle emazie D negative. Tuttavia, il gene che codifica gli antigeni LW indipendente da quello che codifica le proteine del sistema Rh. Lindipendenza tra i due geni venne originariamente accertata dallo studio di alcune famiglie informative, nelle quali era dimostrata la segregazione indipendente di LW dai geni RH. Il gene LW stato assegnato al cromosoma 19 ed stato clonato. La glicoproteina che viene codificata da questo gene presenta unomologia con le molecole delladesione cellulare33. Le emazie delle persone con il fenotipo Rhnull sono anche LW(ab). Sembra che la glicoproteina LW richieda, per la sua espressione antigenica, uninterazione con le proteine Rh, bench le basi di questa interazione non siano chiarite (per un aggiornamento sullevoluzione del sistema LW, consultare Storry34). Anticorpi LW Non sono stati riportati casi nei quali lanti-LWa sia stato causa di reazione trasfusionale emolitica o di MEFN ed eritrociti LW(a+), sia D+ che D, sono stati trasfusi con successo in pazienti i cui sieri contenevano lanti-LW a. Una riduzione dellespressione antigenica LW pu verificarsi in corso di gravidanza e in alcune patologie ematologiche. Gli anticorpi anti-LW possono presentarsi come autoanticorpi o come apparenti alloanticorpi nel siero di queste persone. LantiLWab stato identificato in soggetti LW(a b ) come anche in pazienti con antigeni LW soppressi19. Sistema Chido/Rodgers Antigeni Chido/Rodgers Il Chido (Ch) e il Rodgers (Rg) sono antigeni ad alta frequenza, presenti sulla componente C4 del complemento. Questi antigeni non sono parte integrante della membrana eritrocitaria. Negli individui positivi, gli antigeni vengono assorbiti dal plasma sugli eritrociti con un meccanismo di adesione che rimane oscuro35. Il Chido stato suddiviso in sei antigeni e il Rodgers in due. Un
Anticorpi Colton Lanti-Coa stato coinvolto sia in reazioni trasfusionali emolitiche che in MEFN8. Lanti-Cob ha determinato una reazione trasfusionale emolitica e lievi MEFN. Il trattamento enzimatico degli eritrociti incrementa la reattivit degli anticorpi Colton. Sistema LW Antigeni LW La Tabella 15.10 presenta i fenotipi LW e le loro frequenze. Gli antigeni vengono denaturati dai reattivi sulfidrilici come il DTT e dalla pronasi, ma non sono alterati dalla ficina o dalla papaina. Sono stati pubblicati sia casi relativi a soggetti che hanno ereditato il fenotipo LW(ab) sia altri casi nei quali questo fenotipo stato acquisito.
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nono antigene, il WH, necessita dellinterazione tra il Rg1 ed il Ch6 per la propria espressione. Il C4 viene codificato da due geni concatenati, C4A e C4B , che sono situati sul cromosoma 6. Attualmente, i sieri esistenti non sono classificati in modo adeguato, ma la frequenza dei fenotipi pu essere considerata attendibile, cos come descritta nella Tabella 15.11. Gli antigeni vengono distrutti dal trattamento con papaina/ficina ma non sono alterati dal trattamento con DTT/AET. Anticorpi Chido/Rodgers Gli anti-Ch ed anti-Rg sono generalmente benigni ma possono interferire nelle indagini sierologiche. Una identificazione rapida di queste specificit possibile utilizzando globuli rossi ricoperti di C4 oppure mediante linibizione degli anticorpi con un pool di plasmi freschi di individui positivi per lantigene (vedi Metodo 3.9). Gli anticorpi non sono reattivi con eritrociti trattati con enzimi. Sistema Gerbich Antigeni Gerbich Il sistema Gerbich comprende otto antigeni, tre
dei quali sono ad alta frequenza (Ge2, Ge3 e Ge4) e cinque sono a bassa frequenza (Wb, Lsa, Ana, Dha e GEIS). I diversi fenotipi che sono privi di uno o pi degli antigeni ad alta frequenza sono presentati nella Tabella 15.12; tutti e tre sono rari. Le emazie che appartengono ai fenotipi Gerbich o Leach hanno delle espressioni antigeniche indebolite di alcuni degli antigeni del sistema Kell. Ge2, Ge4, Wb, Lsa, Ana, Dha e GEIS vengono distrutti dal trattamento enzimatico con papaina o ficina, ma Ge3 resistente al trattamento dei globuli rossi con le proteasi. Gli antigeni del sistema gruppoematico Gerbich sono sistemati sulla glicoforina C (GPC) e sulla glicoforina D (GPD). La GPC porta GE3 e GE4, mentre la GPD porta Ge2 e Ge3. Ana portato su una forma alterata di GPD. Dha e Wb sono collocati su una struttura alterata della GPC. Lsa espresso su una forma alterata della GPC e della GPD36. Le proteine sono il prodotto di un singolo gene, GYPC, che posto sul cromosoma 2. La GPC approssimativamente quattro volte pi abbondante della GPD. Il meccanismo attraverso il quale queste due proteine originano
Tabella 15.11 - Alcuni antigeni dei gruppi sanguigni con correlazioni fenotipiche Antigeni Fenotipi Frequenza approssimativa (%) Bianchi Chido (ch) e Rodgers (Rg) Ch+,Rg+ Ch,Rg+ Ch+,Rg Ch,Rg Cs(a+),Yk(a+) Cs(a+),Yk(a) Cs(a),Yk(a+) Cs(a),Yk(a) Kn(a+),McC(a+) Kn(a+),McC(a) Kn(a),McC(a+) Kn(a),McC(a) 95,0 2,0 3,0 molto rari 82,5 13,5 2,1 1,9 97,0 2,0 1,0 rari 95,6 3,2 0,6 0,6 95,0 4,0 1,0 rari Neri
Cost (Csa)* e York (Yka)
Knops-Helgeson (Kna) e McCoy (McCa)
Bench Csa non faccia parte del sistema Knops, esiste unassociazione fenotipica tra Yka e Csa.
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Tabella 15.12 - I fenotipi Gerbich Fenotipo Ge: 2, 3, 4 (Yus) Ge: 2, 3, 4 (tipo Gerbich) Ge: 2, 3, 4 (tipo Leach) Anticorpo prodotto Anti-Ge2 Anti-Ge2 o -Ge3 Anti-Ge2, -Ge3 o -Ge4
da un singolo gene presume un sito di inizio alternativo nel gene stesso. GPC e GPD interagiscono direttamente con la proteina banda 4.1 del citoscheletro eritrocitario. evidente che questa interazione importante per il mantenimento della forma del globulo rosso perch la mancanza della banda 4.1 o delle GPC/ D determina lellissocitosi eritrocitaria36. Anticorpi Gerbich Gli anticorpi che i soggetti Ge-negativi possono produrre sono illustrati nella Tabella 15.12; essi possono essere immuni o presentarsi senza alcuna pregressa stimolazione antigenica eritrocitaria. Lanti-Ge solitamente di classe IgG ma pu presentare delle componenti di classe IgM. Il loro Tabella 15.13 - Antigeni ad alta e bassa frequenza nel sistema gruppoematico Cromer Antigene Cra Tca Tcb Tcc Dra Esa IFC WESa WESb UMC GUTI SERF ZENA Frequenza (%) >99 >99 <1 <1 >99 >99 >99 <1 >99 >99 >99 >99 >99
significato clinico variabile. Gli anti-Gerbich possono, in rari casi, essere responsabili di MEFN. Sistema Cromer Antigeni Cromer Al sistema Cromer sono attribuiti 13 antigeni: dieci sono ad alta frequenza e tre sono a bassa frequenza (vedi Tabella 15.13). Tca antitetico allantigene a bassa frequenza b Tc nei Neri e al Tcc nei Bianchi, WESb lantigene ad alta frequenza antitetico a WESa. Cra, Dra, Esa, UMC, GUTI, SERF e ZENA non sono associati ad alcun antigene a bassa frequenza. IFC assente solo nel fenotipo null (Inab). Gli antigeni sono collocati sulla proteina regolatrice del complemento denominata fattore accelerante del decadimento (DAF, decay-accelerating factor). La proteina viene codificata dal gene DAF, uno dei geni regolatori del complesso di attivazione del complemento (RCA), posto sul cromosoma 1. Gli antigeni Cromer sono presenti sui leucociti, sulle piastrine e sui trofoblasti della placenta, come anche vengono espressi, in forma solubile, nel siero/plasma e nelle urine37. Non sono alterati dallazione della ficina o della papaina, mentre il DTT o lAET li possono indebolire ma non distruggere completamente37. Anticorpi Cromer Gli anticorpi specifici per gli antigeni del sistema Cromer sono immuno-mediati ed estremamente rari. La maggior parte degli anti-Cra,-WESb e -Tcc sono stati rilevati nei sieri di soggetti di origine africana. Lanti-GUTI stato rinvenuto nel siero di un
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canadese di origine cilena37. Il significato clinico di questi anticorpi variabile, ed alcuni esemplari hanno determinato una riduzione nella sopravvivenza delle emazie incompatibili trasfuse. Questi anticorpi non sono causa di MEFN perch i tessuti placentari sono una ricca sorgente di DAF, che si ritiene assorba gli anticorpi materni37. Sistema Knops Antigeni Knops La maggior parte degli otto antigeni del sistema Knops (Kna, Knb, McCa, McCb, Sla, Yka, Vil e Sl3) sono situati sul recettore (CR1) dei fattori C3b/ C4b, il recettore primario del complemento sugli eritrociti. Un gene, sistemato sul cromosoma 1, codifica CR1. Kna, McCa, Sla, Yka ed Sl3 sono antigeni ad alta frequenza, mentre Knb, McCb e Vil sono a bassa frequenza. Alcune variazioni nelle frequenze antigeniche sono rilevabili tra i globuli rossi dei Bianchi e quelli dei Neri (vedi Tabella 15.11). Gli antigeni del sistema Knops non vengono distrutti dal trattamento con ficina o papaina, ma vengono indeboliti o distrutti dal trattamento degli eritrociti con DTT o AET. Anticorpi Knops Gli anticorpi Knops presentano, di solito, una reattivit debole, di intensit variabile, nei test con il siero antiglobuline, ma possono continuare a reagire con la medesima debole intensit anche ad alte diluizioni. Moulds et al.38 hanno dimostrato che la reattivit variabile dei sieri anti-CR1-correlati direttamente proporzionale al numero di siti CR1 che, a loro volta, presentano unelevata variabilit tra gli individui e un polimorfismo sia nella dimensione che nellespressione antigenica. Questi anticorpi non sono clinicamente significativi. Sistema Indian In a ed In b sono collocati sulla CD44, una proteina ampiamente distribuita nei tessuti e che presenta le caratteristiche di una molecola di adesione cellulare. Ina a bassa frequenza, mentre Inb ad alta frequenza (vedi Tabella
15.17). In b presenta una ridotta espressione antigenica sulle emazie di fenotipo Lu(ab) di tipo dominante In(Lu) ma viene espresso normalmente sulle emazie Lu(a b ) delle persone omozigoti per il gene amorfo o che possiedono il gene soppressore sul cromosoma X. Gli antigeni vengono distrutti dal trattamento enzimatico con papaina o ficina come anche da sostanze riducenti come il DTT 0,2M. Esiste una limitata documentazione relativa al significato clinico dei relativi anticorpi. Altri sistemi gruppoematici Sistema Ok Il sistema Ok costituito da un singolo antigene ad alta frequenza, Oka. I soggetti Ok(a) sono estremamente rari e sono stati rilevati esclusivamente nella popolazione giapponese. Gli enzimi proteolitici non sembrano indebolire lespressione di Oka nei test di agglutinazione con le procedure di routine. Lanti-Oka reattivo in modo ottimale nel test allantiglobulina e appare clinicamente significativo nella terapia trasfusionale, determinando una rapida distruzione delle emazie Ok(a+). Sistema Raph Il sistema Raph consiste in un singolo antigene: MER2. Lanti-MER2 stato rilevato nel siero di tre ebrei israeliani. Tutti e tre erano pazienti sottoposti a dialisi, fatto che induce a ritenere che la produzione dellanticorpo sia associata ad una patologia renale. MER2 stato rilevato sugli eritrociti del 92% dei soggetti esaminati. MER2 sensibile al trattamento con DTT ma non viene alterato da ficina, papaina o clorochina. Lanti-MER2 di classe IgG e in alcuni casi fissa il complemento. Dai dati pubblicati, non vi sono elementi per stabilire se questi anticorpi sono in grado o meno di causare reazione trasfusionale emolitica o MEFN. Sistema John Milton Hagen Lantigene John Milton Hagen (JMH) situato sulla glicoproteina CD108, che legata alla GPI. JMH diminuisce con il passare degli anni. Il
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fenotipo JMH-negativo pu essere acquisito, essere transitorio oppure essere ereditario. Lantigene viene distrutto, o comunque alterato, dal trattamento dei globuli rossi con la ficina o la papaina, oppure dal trattamento con AET o DTT. Gli anticorpi che reagiscono con lantigene JMH presentano una reattivit variabile e solitamente debole. Anticorpi autoimmuni anti-JMH possono essere rilevati, con maggiore facilit, in pazienti anziani, associata a una mancanza acquisita o a un indebolimento dellespressione antigenica JMH. Lanticorpo non considerato, di norma, in grado di causare reazione trasfusionale emolitica o MEFN. Sistema Gill In questo sistema rappresentato un unico antigene ad alta frequenza, il GIL. Lantigene GIL collocato sullaquaporin 3 (AQP3), che un trasportatore del glicerolo. Lanticorpo non stato riportato come responsabile di MEFN o di reazioni trasfusionali emolitiche.
denaturati dalla ficina, dalla papaina o dal DTT. Lanti-Csa presenta un comportamento simile a quello degli anticorpi specifici per gli antigeni del sistema Knops e non viene considerato clinicamente significativo. Tabella 15.14 - Alcuni antigeni ad alta frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a collezioni Nome August Langereis Sid Duclos Simbolo Ata Lan Sda Jra Emm AnWj PEL MAM
Raccolte gruppoematiche eritrocitarie

Oltre ai sistemi gruppoematici, vi sono raccolte (collection) di antigeni che presentano caratteristiche condivise, ma che ancora non soddisfano i criteri classificativi per lo status di sistema gruppoematico eritrocitario come definiti dallISBT. Essi comprendono le raccolte Cost (ISBT 205), Er (ISBT 208) e Vel (ISBT 211). Cost Csa e Csb sono tutto ci che rimane di questa raccolta dopo che gli antigeni Knops sono stati identificati sul CR1. Il Cs a ricorre con una frequenza superiore al 98% nella maggior parte delle popolazioni, mentre il Csb presenta una frequenza di circa il 34%19. Vi , tuttavia, una non spiegata connessione tra gli antigeni Yta e Csa, per la quale le emazie che sono negative per uno dei due antigeni sono facilmente negative o debolmente positive, per laltro (vedi Tabella 15.11). Gli antigeni del sistema Cost non vengono
Er La raccolta Er comprende due antigeni, che danno origine ai quattro fenotipi Er(a+b ), Er(a+b+), Er(a b+) ed Er(a b ). Er a un antigene ad alta frequenza, presente sui globuli rossi con una frequenza superiore al 99% di tutti gli individui, mentre Erb ha una frequenza inferiore a 1%. La presenza di un terzo allele silente, Er, viene presa in considerazione per spiegare il fenotipo Er(a b ), come dimostrato dagli studi sulle famiglie informative. Gli antigeni non vengono distrutti dal trattamento con la ficina, la papaina o il DTT, ma sono distrutti con lEDTA-glicina acida. Vel La raccolta Vel stata creata di recente, per includere due antigeni ad alta frequenza che sono sierologicamente correlati fra loro: il Vel e lABTI. Il Vel un antigene ad alta frequenza che non viene modificato dal trattamento con gli enzimi proteolitici o i reattivi sulfidrilici. ben sviluppato alla nascita ma lespressione antigenica
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variabile8. Malgrado il fatto che la sua presenza sia rilevabile dopo stimolazioni immunizzanti note, lanti-Vel viene frequentemente rilevato come appartenente alla classe IgM. stato riportato con una variabilit di comportamento tale da determinare nel neonato da un semplice TAD positivo a severe MEFN19. Lanticorpo, inoltre, si dimostrato responsabile di reazioni trasfusionali emolitiche. Lanti-Vel fissa attivamente il complemento, ed spesso rilevabile lemolisi in vitro di emazie incompatibili, quando si analizzino campioni di siero fresco che contengono questo anticorpo. La reattivit dellanti-Vel viene solitamente incrementata dal trattamento con enzimi delle emazie che esprimono il Vel.
Antigene Ata LAta un antigene ad alta frequenza, resistente al trattamento con enzimi proteolitici e al trattamento con DTT 0,2 M. Il fenotipo At(a) stato rilevato esclusivamente in soggetti di origine africana19. Lanticorpo anti-Ata tipicamente di classe IgG. Lanticorpo sembra essere causa solo di moderate reazioni trasfusionali emolitiche e non sembra determinare MEFN clinicamente significative19. Antigene Jra Il Jra un antigene ad alta frequenza che non viene alterato dal trattamento con enzimi proteolitici o con DTT 0,2 M. Il fenotipo Jr(a) stato rilevato con maggiore frequenza in soggetti della popolazione giapponese, ma stato occasionalmente osservato anche in altre popolazioni8(pp805,806). Lanti-Jra in alcuni casi si dimostrato in grado di ridurre la sopravvivenza delle emazie incompatibili trasfuse8(pp805,806). Altri esemplari dellanti-Jra hanno presentato uno scarso o completamente assente significato clinico per MEFN o reazione trasfusionale emolitica8(p806),39. Antigene AnWj LAnWj un antigene ad alta frequenza, resistente al trattamento dei globuli rossi con gli enzimi proteolitico, ma che viene indebolito dal trattamento con DTT 0,2 M19. Lantigene portato sulla proteina CD44, che trasporta anche gli antigeni del sistema Indian. LAnWj presenta una ridotta espressione sugli eritrociti dei soggetti portatori del gene dominante In(Lu) (vedi la sezione sul sistema Lutheran). Alcuni pazienti affetti dal morbo di Hodgkin possono presentare una situazione di soppressione a lungo termine dellAnWj8(pp783-784). AnWj il recettore dell Haemophilus influenzae8(784-785). Lanti-AnWj stato coinvolto in reazioni trasfusionali emolitiche clinicamente severe, ma non causa di MEFN, perch lantigene non presente sugli eritrociti del cordone ombelicale.
Antigeni eritrocitari ad alta frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a raccolte

La Tabella 15.14 elenca gli antigeni ad alta frequenza, indipendenti dai sistemi antigenici eritrocitari o dalle raccolte. I soggetti che producono alloanticorpi reattivi con uno specifico antigene presentano, necessariamente, eritrociti privi di questo antigene. Per questo motivo, gli anticorpi specifici per antigeni ad alta frequenza vengono rilevati solo eccezionalmente. Di solito gli anticorpi corrispondenti a questi antigeni presentano una reattivit ottimale nel test allantiglobulina. Antigene Lan Il Lan un antigene ad alta frequenza che resistente al trattamento con gli enzimi proteolitici e con il DTT 0,2 M. stata riportata una debole espressione antigenica Lan19. Lanti-Lan tipicamente di classe IgG, pu fissare attivamente il complemento ed essere responsabile di reazioni trasfusionali emolitiche. Casi di MEFN sostenuti dallanti-Lan hanno presentato unevoluzione clinicamente lieve, quantunque lantigene Lan sia presente sulle emazie del cordone ombelicale19.
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Antigene Sda Sda un antigene con una frequenza piuttosto elevata, ampiamente diffuso nei tessuti e nei liquidi corporei dei mammiferi. Lantigene presenta unespressione molto variabile sugli eritrociti delle persone Sd(a+). Lespressione antigenica del Sda pu essere diminuita in corso di gravidanze: infatti, il fenotipo Sd(a ) viene rilevato con una frequenza variabile dal 30% al 75% nelle donne gravide. Lantigene non espresso sulle emazie del cordone ombelicale. Le espressioni antigeniche Sda pi marcate sono state rilevate sui globuli rossi che presentano il fenotipo Cad, caratterizzato da una situazione di poliagglutinabilit eritrocitaria. La frequenza del fenotipo Sd(a) considerata attorno al 9%, ma le reazioni debolmente positive sono spesso difficilmente distinguibili da quelle effettivamente negative. Lanti-Sd a pu essere reattivo nel test allantiglobulina. Lesame microscopico delle reazioni positive presenta, di solito, un quadro di agglutinazione a campo misto, con agglutinati di emazie relativamente piccoli e compatti, su un mare di emazie libere. Questi agglutinati sono birifrangenti e possono presentare un aspetto lucente. Poich la maggioranza dei campioni di antiSd a sono di classe IgM, luso di sieri anti-IgG porta al risultato di non rilevare molti esemplari dellanti-Sda. Lanticorpo non viene considerato significativo da un punto di vista clinico. Tuttavia, sono stati pubblicati 8(816-817) casi di reazione trasfusionale emolitica conseguenti a trasfusioni con eritrociti che presentavano una forte espressione antigenica Sd a. Il saccaride immunodominante di Sd a lNacetilgalattosamina (GalNAc), che anche lo zucchero immunodominante del gruppo sanguigno A e della glicoproteina di TammHorsfall, comunemente rilevabile nellurina umana e in quella delle cavie. La reattivit dellanti-Sd a pu essere completamente inibita dallincubazione con le urine di cavia o di persone Sd(a+). Per lesecuzione della neutralizzazione
dellanti-Sda con le urine consultare Metodo 3.11.
Antigeni eritrocitari a bassa frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a raccolte

Sono stati evidenziati numerosi antigeni eritrocitari a bassa frequenza, indipendenti dai sistemi gruppoematici e dalle collezioni, oltre allaccresciuto numero di quelli che sono stati assegnati ai sistemi MNS, Rh e Diego. La Tabella 15.15 elenca quelli che sono stati studiati e che si sono dimostrati trasmessi ereditariamente in modo dominante. Gli anticorpi specifici per questi antigeni a bassa frequenza sono reattivi con un cos scarso numero di campioni eritrocitari, selezionati a caso, che virtualmente non causano mai difficolt nel reperimento di sangue compatibile per le trasfusioni, ma possono essere coinvolti in alcuni rari casi di MEFN. Questi anticorpi sono comunque interessanti per gli immunoematologi per la loro inattesa elevata incidenza, e sono frequentemente presenti nei sieri senza che vi sia stata una stimolazione antigenica identificabile.
Anticorpi specifici per antigeni a bassa frequenza

Gli anticorpi specifici per gli antigeni a bassa frequenza sono stati talvolta implicati in reazioni trasfusionali e in MEFN. Essi sono, di solito, rilevati casualmente, quando le emazie utilizzate per lindividuazione di anticorpi o quelle selezionate per le prove di compatibilit, presentano lantigene corrispondente. Gli anticorpi reattivi con gli antigeni a bassa frequenza possono essere presenti, come insospettati contaminanti, anche nei reattivi diagnostici preparati da sieri di origine umana e utilizzati per tipizzazioni antigeniche eritrocitarie e possono determinare false reazioni positive negli esami se le emazie presentano casualmente
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Tabella 15.15 - Antigeni a bassa frequenza non assegnati a sistemi gruppoematici o a raccolte Batty (By) Biles (Bi) Box (Bxa) Christiansen (Chra) HJK HOFM JFV JONES Jensen (Jea) Katagiri (Kg) Livesay (Lia) Milne Oldeide (Ola) Peters (Pta) Rasmussen (RASM) Reid (Rea) REIT SARA Torkildsen (Toa)
Gli antigeni ricorrono con una frequenza di 1 su 500 o inferiore.
lantigene a bassa frequenza corrispondente. Lesecuzione degli esami con reagenti di produttori diversi pu non eliminare questo tipo di errore, perch non infrequente che un singolo soggetto con un anticorpo non comune, fornisca il proprio siero, utilizzato da differenti produttori per la preparazione dei reattivi. Alcuni anticorpi specifici per antigeni a bassa frequenza reagiscono come agglutinine con gli eritrociti sospesi in soluzione salina. Altri possono presentarsi come anticorpi di classe IgG e reagire solo nel test allantiglobulina, anche se il soggetto non mai stato esposto ad alloimmunizzazione eritrocitaria. un evento piuttosto frequente, per molti anticorpi specifici per gli antigeni a bassa frequenza, quello di presentarsi insieme in miscela in un singolo siero; la presenza di specificit anticorpali multiple particolarmente frequente nei pazienti con patologie autoimmunitarie. Antigeni Bg (Bennett-Goodspeed) Anticorpi specifici per alcuni antigeni leucocitari possono talvolta determinare confuse reazioni nei test sierologici con i globuli rossi. Almeno tre diverse specificit antigeniche sono state indicate come antigeni Bg: Bga che corrisponde allantigene HLA-B7; Bgb corrispondente ad HLA-B17; e Bgc che corrisponde ad HLA-A28. Un quarto anticorpo, presente in alcuni sieri antileucocitari, reagisce con gli eritrociti dei soggetti che esprimono lantigene
HLA-A10. I cosiddetti antigeni Bg sono espressi con ampia variabilit sugli eritrociti, con il risultato di far rilevare reazioni di intensit differente quando un medesimo siero, contenente un anticorpo anti-Bg, viene esaminato con differenti campioni eritrocitari Bg+. La reattivit dellanticorpo viene solitamente rilevata nel test allantiglobulina, ma sieri anti-Bg molto potenti possono agglutinare direttamente le emazie che presentano unespressione antigenica Bg insolitamente potente. Una sicura e precisa classificazione della reattivit resa difficile dalla debole espressione antigenica su alcuni eritrociti, e per la presenza di specificit multiple tra i differenti campioni di anti-Bg. Questi anticorpi possono anche essere presenti come insospettati contaminanti in sieri diagnostici di origine umana, utilizzati per la tipizzazione eritrocitaria, determinando false reazioni positive con le emazie che presentano unespressione eritrocitaria insolitamente forte del corrispondente antigene Bg. Gli antigeni Bgcorrelati sono denaturati dalla clorochina difosfato oppure da una soluzione di glicina-HCl/EDTA.
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Capitolo 16: Gli antigeni e gli anticorpi delle piastrine e dei granulociti
Capitolo 16
Gli antigeni e gli anticorpi delle piastrine e dei granulociti
Gli anticorpi reattivi con gli antigeni espressi sulle piastrine e sui leucociti stanno assumendo unimportanza progressivamente crescente. Alcuni antigeni dei sistemi gruppoematici eritrocitari sono espressi sui globuli rossi, sui globuli bianchi e sulle piastrine; altri sono specifici per alcuni tipi di cellule. Questo capitolo discuter degli anticorpi che sono specifici per gli antigeni espressi sulle piastrine e sui granulociti, con particolare riguardo per quelli che sono specifici per queste cellule. Gli anticorpi e gli antigeni HLA sono esaminati in modo pi approfondito nel Capitolo 17.
Antigeni delle piastrine

Gli antigeni condivisi con altri tessuti Le piastrine esprimono sulla loro superficie una variet di marcatori antigenici. Alcuni di questi sono condivisi con altri tipi di cellule, come nel caso degli antigeni ABH ed HLA, virtualmente condivisi con tutte le cellule nucleate del corpo. Altri sono essenzialmente specifici per le piastrine. Gli antigeni ABH Gli antigeni ABH espressi sulle piastrine sono una combinazione delle strutture intrinseche della plasma-membrana e di quelle assorbite dal plasma. La quantit degli antigeni ABH presenti sulle piastrine assai variabile da individuo a individuo, oscillando dal 5 al 10% nei soggetti non appartenenti al gruppo O, che esprimono delle
quantit estremamente elevate di sostanza A o B sulle loro piastrine. Queste persone sembrano possedere una forma altamente-espressiva della loro glicosiltrasferasi sierica. Sebbene le piastrine siano spesso trasfuse senza rispettare la compatibilit ABO, in alcuni casi, gli anticorpi ABO (particolarmente quelli ad alto titolo di classe IgG nei riceventi di gruppo O) possono reagire con le piastrine che presentano forti quantit di antigeni A o B1. Le piastrine con alta espressivit sono particolarmente vulnerabili a questo tipo di distruzione immune. Gli anticorpi ABO dei riceventi possono anche determinare una ridotta sopravvivenza delle piastrine ABO-incompatibili provenienti da donatori con fenotipo ABO normalmente espresso, causando, su questa base, occasionali situazioni di pazienti apparentemente refrattari alle trasfusioni di piastrine. Altri antigeni eritrocitari, quali Lea, Leb, Ii e P2, come pure gli antigeni del sistema Cromer (associati al fattore accelerante il decadimento)3, vengono rilevati sulle piastrine, ma non sussiste alcuna evidenza che gli anticorpi specifici per questi antigeni possano ridurre significativamente la sopravvivenza delle piastrine in vivo. Gli antigeni HLA Gli antigeni HLA sono rilevati sia sulla superficie delle piastrine sia su quella dei leucociti (vedi Capitolo 17). Infatti, le piastrine sono la fonte principale degli antigeni HLA di Classe I nel sangue intero2. Recenti evidenze indicano che la maggior
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parte delle molecole HLA di Classe I presenti sulle piastrine sono proteine strutturali della plasmamembrana e solo una quantit minoritaria pu essere assorbita dal plasma circostante3. Gli alloanticorpi HLA non sono anticorpi naturali, ma si originano soltanto dopo una sensibilizzazione, determinata da gravidanze o da trasfusioni di sangue. Gli studi condotti sullalloimmunizzazione HLA, che si verifica nei pazienti che sono stati trasfusi con piastrine, documentano lo sviluppo degli anticorpi entro 3 o 4 settimane dopo la stimolazione primaria e nel breve periodo di 4 giorni dopo una stimolazione secondaria, in pazienti precedentemente trasfusi o con precedenti gravidanze4. La probabilit di alloimmunizzazione HLA con le trasfusioni nei pazienti che non sono stati precedentemente sensibilizzati variabile 4,5 e il rischio di alloimmunizzazione HLA appare correlato alla loro patologia di base, cos come agli eventuali effetti immunosoppressivi del regime terapeutico. Le piastrine presentano sulla superficie gli antigeni HLA di Classe I, ma sono prive di quelli di Classe II, che sono necessari per limmunizzazione primaria. Per cui, la causa principale dellalloimmunizzazione HLA primaria costituita dallesposizione, durante la trasfusione, agli antigeni HLA espressi sui leucociti. Refrattariet alle trasfusioni di piastrine Un incremento nel conteggio piastrinico inferiore a quanto atteso si verifica in una percentuale variabile dal 20 al 70% dei pazienti trombocitopenici trasfusi 6 e i pazienti trattati per patologie ematologiche maligne sono particolarmente predisposti per diventare refrattari alle trasfusioni di piastrine. Una definizione ampiamente accettata della refrattariet venne utilizzata in uno studio clinico randomizzato sulla terapia trasfusionale piastrinica, controllato e sponsorizzato dal NIH (National Institutes of Health). Per questo studio due conteggi corretti consecutivi (CCI, Corrected Count Increment), effettuati dopo 1 ora dalla trasfusione di piastrine, che presentino incrementi inferiori alle 5.000 piastrine x m2 della superficie corporea/ L indicano refrattariet7. Altri hanno utilizzato criteri meno restrittivi (per
esempio, tre trasfusioni piastriniche in un periodo di 2 settimane che comportino un conteggio piastrinico post-trasfusionale inadeguato)8,9. La risposta spesso determinata sia dal calcolo del CCI sia dal recupero piastrinico posttrasfusionale (PPR, Post Trasfusion Platelet Recovery) tra i 10 e i 60 minuti dopo la trasfusione (vedi Tabella 16.1). Risposte di 7.500 piastrine x m2 della superficie corporea/ L, o del 20%, possono essere considerate, rispettivamente, accettabili sia dal calcolo del CCI come da quello del PPR. La refrattariet piastrinica alloimmune spesso il risultato di una sensibilizzazione HLA e pu essere diagnosticata dimostrando la presenza di livelli elevati di anticorpi anti-HLA. Il siero dei pazienti viene testato contro un pannello di linfociti (o contro microsfere sintetiche che portano adesi antigeni di Classe I) che rappresentano la maggior parte delle specificit HLA di Classe I presenti nella popolazione. Un anticorpo reattivo con il pannello (PRA, Panel Reactive Antibody) con uno score del 20%, o superiore, costituisce la prova che una sensibilizzazione HLA pu aver contribuito alla refrattariet piastrinica (vedi Capitolo 17). Si ritiene che lalloimmunizzazione sia una delle cause della refrattariet, ma vi sono diverse altre ragioni (non immunologiche) che possono spiegare il motivo per cui le piastrine trasfuse non forniscono lincremento atteso (per esempio, la sepsi, la coagulazione intravascolare disseminata o la somministrazione di alcuni farmaci). Alcune delle cause non immuni di refrattariet, comunemente citate, sono elencate nella Tabella 16.2. Uno studio di pazienti sottoposti al trapianto di midollo ematopoietico indica che alcune variabili correlate al paziente, come lirradiazione corporea totale, un avanzato stato della malattia e la disfunzione epatica, sono elementi altrettanto importanti per prevedere uno scarso incremento della resa piastrinica10,11. Anche quando vengono identificate possibili cause immunologiche di refrattariet, sono spesso contemporaneamente presenti fattori non immunologici. Quando si selezionano piastrine per un paziente che presenta una refrattariet piastrinica immuno-mediata, si possono prendere
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Tabella 16.1 - Determinazione della risposta alle piastrine trasfuse Calcolo del conteggio corretto dellincremento (CCI, Corrected Count Increment) Area della superficie corporea (m2) x incremento del conteggio piastrinico x 1011 CCI = N delle piastrine trasfuse Esempio: se vengono trasfuse 4 x 1011 piastrine in un paziente con una superficie corporea di 1,8 m2 e lincremento del conteggio post-trasfusionale delle piastrine 25.000/L, allora: CCI = 1,8 x 25.000/L x 1011 4 x 10
11
= 11.250 piastrine x m2/L
Calcolo del recupero piastrinico post-trasfusionale (PPR, Post Trasfusion Platelet Recovery) PPR (%) = Volume stimato del sangue totale* x incremento del conteggio piastrinico N delle piastrine trasfuse *Il volume totale del sangue pu essere stimato nel paziente adulto come 75 mL/kg Esempio: se a un paziente di 70 kg vengono trasfuse 4 x 1011 piastrine e lincremento piastrinico nella conta post-trasfusionale di 25.000/L, allora 70 kg x 70 mL/kg x 25.000 piastrine/L x 103 4x1011 piastrine
PPR=
= 30,6%
in considerazione varie strategie. Se si sono evidenziati anticorpi specifici antiHLA, un approccio largamente utilizzato quello di fornire piastrine da aferesi compatibili con il fenotipo HLA del paziente12. Uno svantaggio costituito dalla necessit di disporre, per le aferesi, di un pool di diverse migliaia di potenziali donatori gi tipizzati HLA al fine di reperire piastrine sufficientemente HLA-compatibili per lassortimento. La selezione di donatori sulla base delle caratteristiche HLA pu determinare, inoltre, lesclusione di donatori con fenotipi HLA diversi da quello del paziente, ma, comunque, potenzialmente utili se il paziente alloimmunizzato ad altri differenti antigeni14. Per i pazienti che presumibilmente richiederanno trasfusioni piastriniche multiple, la
tipizzazione HLA deve essere eseguita in anticipo rispetto allo sviluppo pianificato della terapia. importante valutare il grado di compatibilit che pu essere fornito (vedi Tabella 16.3). Le piastrine ricevute dopo una richiesta di piastrine HLA-compatibili, sono necessariamente quelle con la maggiore affinit possibile nellambito delle costrizioni imposte dal tempo disponibile e dalla reperibilit del donatore. In uno studio, il 43% delle piastrine fornite come HLA-compatibili risultava con un livello di compatibilit basso, di grado B o C. Il migliore livello di risposta si verifica con gradi di compatibilit A e B1U o B2U, ma pu essere utile ignorare la compatibilit per alcuni antigeni espressi sulle piastrine (B44, 45). In accordo con gli Standard AABB per le Banche del Sangue e
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Tabella 16.2 - Alcune delle cause non immuni di refrattariet alla trasfusione piastrinica Sanguinamento massivo Febbre Sepsi Splenomegalia (sequestro splenico) Coagulazione intravascolare disseminata Trapianto allogenico Cattiva conservazione delle piastrine prima della trasfusione Effetti dei farmaci (che possono anche comprendere meccanismi immuni) Somministrazione endovenosa di anfotericina B Porpora trombotica trombocitopenica per i Servizi Trasfusionali16(p43), le piastrine HLAcompatibili devono essere irradiate per prevenire la GvHD (Graft-versus-Host Disease) associata alla trasfusione. Un secondo approccio per fornire piastrine efficaci quello di utilizzare una prova di compatibilit piastrinica pre-trasfusionale. Questo approccio pu essere utilizzato per prevedere, e quindi evitare, successive trasfusioni piastriniche inefficaci17. Il test di aderenza eritrocitaria in fase solida (SPRCA, solid-phase red cell adherence test) il metodo prevalentemente utilizzato per il crossmatch piastrinico e i risultati del test sono ragionevolmente predittivi del conteggio piastrinico post-trasfusionale18-20. Confrontato con la selezione basata sullaffinit
HLA, il crossmatch pu dimostrarsi maggiormente utile, oltre che economicamente vantaggioso. Esso evita lesclusione di donatori HLA-non affini (ma compatibili) e ha il vantaggio aggiuntivo di selezionare le piastrine quando lanticorpo o gli anticorpi coinvolti sono reattivi con antigeni propri delle piastrine. Il crossmatch piastrinico, tuttavia, non raggiunge sempre un pieno successo, specialmente quando i pazienti sono pesantemente alloimmunizzati (PRA >50%). In questi casi, il reperimento di unit sufficientemente compatibili pu essere problematico e la selezione di piastrine HLAcompatibili pu essere pi pratica. Sebbene sia molto modesta la frequenza degli anticorpi specificamente anti-piastrine in grado di causare refrattariet in molti o in tutti i tentativi di trasfusione piastrinica, questa possibilit deve essere presa in considerazione, quando la maggior parte delle prove di compatibilit tentate sono positive. Se sono presenti anticorpi piastrino-specifici, devono essere esaminati donatori con fenotipo piastrinico tipizzato o familiari, che, con maggiore probabilit, possono presentare lo stesso fenotipo del paziente. Un approccio alternativo per fornire trasfusioni HLA-compatibili quello di determinare le specificit degli anticorpi anti-HLA del paziente e di selezionare donatori con piastrine che siano prive degli antigeni contro i quali reagiscono gli anticorpi. Questo metodo8 definito predizione basata sulla specificit anticorpale (ASP, Antibody Specificity Prediction). Uno studio comparativo sullefficacia delle piastrine selezionate con il
Tabella 16.3 - Graduatoria del livello di compatibilit per le piastrine HLA-affini Grado di affinit A B1U B1X B2UX C D R Descrizione 4 antigeni identici 1 antigene non noto o assente blank 1 antigene cross-reagente 1 antigene blank e 1 cross-reagente 1 antigene incompatibile 2 o pi antigeni incompatibili Donatore preso a caso (random) Esempi di fenotipi di donatori per un paziente A1, 3; B8, 27 A1, 3; B8, 27 A1, -: B8, 27 A1, 3; B8, 7 A1, -; B8, 7 A1,3; B8, 35 A1, 32; B8, 35 A2, 28; B7, 35
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metodo ASP rispetto a quelle selezionate sulla base dellaffinit HLA, del crossmatch piastrinico o su una base casuale8, ha evidenziato che le piastrine selezionate con il metodo ASP erano ugualmente efficaci a quelle selezionate per laffinit HLA o con il crossmatch piastrinico ed erano di efficacia superiore a quella rilevata per le piastrine selezionate casualmente. Inoltre, da un elenco di donatori tipizzati per HLA con il metodo ASP sono stati identificati un numero maggiore di potenziali donatori di quelli che potevano essere reperiti con i criteri tradizionali della compatibilit HLA, rendendo molto pi facilmente realizzabile lacquisizione di piastrine compatibili per i pazienti alloimmunizzati refrattari. Unulteriore raffinatezza nella selezione HLA stata proposta da Duquesnoy21. Un algoritmo computerizzato e selettivo, denominato HLA Matchmaker, reperibile in http://tpis.upmc.edu/tpis/ HLAMatchmaker viene utilizzato per la valutazione delle similarit e delle differenze molecolari tra gli epitopi HLA di Classe I. Originalmente sviluppato soprattutto per aiutare a individuare organi compatibili in previsione di trapianti renali in pazienti alloimmunizzati, il sistema presenta una strategia basata sul concetto che gli epitopi immunogeni sono rappresentati da triplette di amminoacidi espresse sulle parti esposte della sequenza proteica degli antigeni di Classe I accessibili da parte degli alloanticorpi. Utilizzando questo schema, molti antigeni HLA di Classe I, classificati come incompatibili per il fenotipo HLA di un paziente, non presentano triplette di amminoacidi incompatibili esposte e, perci, non ci si aspetta che evochino una risposta anticorpale. Il pool dei potenziali donatori HLA-compatibili viene, di conseguenza, molto allargato. Si ritiene che questa strategia si possa dimostrare utile anche nella selezione di donatori di piastrine per i pazienti refrattari, ma non stata ancora valutata in un studio clinico specifico per questo scopo e resta, quindi, da validare per tale finalit. Prevenzione dellalloimmunizzazione piastrinica Una volta che la refrattariet determinata dallalloimmunizzazione piastrinica si instaurata,
molto difficile, se non impossibile, tornare indietro. Per questo motivo, oltre allo sviluppo di metodi utili per la selezione di donatori di piastrine compatibili per i pazienti refrattari, sono state valutate diverse strategie per prevenire lalloimmunizzazione contro le piastrine, prima che possa verificarsi. Queste strategie comprendono la riduzione del numero dei leucociti nei prodotti piastrinici e lirradiazione con raggi ultravioletti B (UV-B). La relazione del Gruppo di Studio per Ridurre lAlloimmunizzazione contro le Piastrine (TRAP, Trial to Reduce Alloimmunization to Platelets ) 7 indica che luso sia di filtri per deleucocitare che dellirradiazione UV-B degli emocomponenti riduce la frequenza della produzione di anticorpi anti-HLA dal 45% a valori compresi tra il 17 e il 21%. La frequenza della refrattariet piastrinica viene ridotta dal 16% a valori compresi tra il 7 e il 10%. Sebbene uno studio prospettico 22 ha evidenziato una correlazione tra lalloimmunizzazione ed il numero di donatori cui si viene esposti, un secondo studio23 non ha trovato alcuna correlazione tra il numero delle esposizioni a donatori diversi e il livello di severit dellalloimmunizzazione. Lo studio TRAP ha rilevato che la riduzione dei leucociti, e non il numero di esposizioni a donatori diversi, era significativo nel modificare il tasso di alloimmunizzazione. Perci, ai fini della riduzione al minimo dellalloimmunizzazione primaria, le piastrine ottenute da sangue intero, leucoridotte e miscelate in pool, appaiono essere clinicamente equivalenti alle piastrine ottenute da aferesi24. Gli anticorpi specifici per gli antigeni HLA possono essere evidenziati con test di linfocitotossicit o con molti dei test utilizzati per il rilievo degli anticorpi anti-piastrine che verranno successivamente discussi. I test di linfocitotossicit evidenziano anticorpi fissanti il complemento, in grado di uccidere i linfociti. Una strategia per la gestione di pazienti che stanno ricevendo numerose trasfusioni di piastrine e che hanno sviluppato una refrattariet rilevata clinicamente quella di esaminarli per la presenza di anticorpi HLA, utilizzando uno screening per gli anticorpi linfocitotossici contro un pannello di linfociti che rappresenti la maggior parte degli
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antigeni di Classe I, presenti nella popolazione dei donatori. Una reattivit superiore al 20% con il pannello (PRA>20%) indica che la sensibilizzazione HLA , come minimo, una causa della refrattariet. Non sono mai state adattate ai risultati ottenibili con il PRA tecniche pi sensibili per rilevare anticorpi HLA, come quella Flow PRA25 (One Lambda, Canoga Park, CA, USA); alcuni laboratori HLA utilizzano questi metodi al posto del tradizionale test di linfocitotossicit. Il rilievo, in laboratorio, della presenza di anticorpi linfocitotossici non indica necessariamente che il paziente andr incontro a una ridotta sopravvivenza delle piastrine trasfuse. Per di pi, gli anticorpi HLA possono scomparire dal plasma del paziente malgrado una continua esposizione attraverso le trasfusioni 26. Una completa discussione sugli esami relativi agli anticorpi e agli antigeni HLA pu essere trovata nel Capitolo 17. Alloantigeni piastrino-specifici Attualmente, sono stati definiti 22 antigeni piastrino-specifici, come pure la loro localizzazione sulle strutture glicoproteiche di superficie, la quantificazione della loro densit sulla superficie piastrinica e la determinazione del polimorfismo del DNA nei geni che li codificano (vedi Tabella 16.4)27. Molti altri antigeni sono stati descritti dalla sierologia, ma il polimorfismo genetico sottostante non ancora stato determinato28. Per alcuni di questi marcatori, il termine piastrino-specifico una definizione errata perch essi possono essere ugualmente rilevati su altri tipi di cellule (specialmente sulle cellule endoteliali). Tuttavia, la loro principale importanza clinica resta legata alla presenza sulle piastrine. Delle molte glicoproteine di membrana identificate, solo cinque [GPIa, Ib(alfa e beta), IIb, IIIa, e CD109] sono polimorfiche e si sono dimostrate alloimmunogene28. Inoltre, i rari soggetti che sono privi di una sesta glicoproteina di membrana, la GPIV (CD36), possono essere sensibilizzate a questo antigene29. Approssimativamente dal 3 al 5% degli individui di etnia asiatica o africana sono privi della GPIV sulle loro piastrine30 e possono essere immunizzati
da trasfusioni o da gravidanze31. Sebbene gli anticorpi specifici per queste varie glicoproteine di membrana possano essere, in rari casi, associati alla refrattariet piastrinica, gli anticorpi specifici per un antigene piastrinico vengono associati, con maggiore frequenza, alle sindromi alloimmuni della porpora post-trasfusionale (PPT) e della trombocitopenia neonatale alloimmune (TNAI). Attualmente si conoscono numerosi sistemi antigenici delle piastrine32 (Tabella 16.4)27,33. La nomenclatura adottata dallISBT (International Society of Blood Transfusion) classifica i sistemi numericamente (secondo lordine temporale scoperta) e alfabeticamente, per rispecchiare la loro frequenza nella popolazione34. Come per i globuli rossi, coesistono spesso differenti terminologie. Il primo antigene individuato35, Zwa, attualmente indicato come HPA-1a del sistema HPA-1. LHPA-1a meglio noto come Pl A1. HPA-1a presente sulle piastrine di circa il 98% delle persone di etnia europea e lanti-HPA1a (anti-Pl A1) lanticorpo clinicamente significativo specifico per le piastrine che viene rilevato con maggiore frequenza in questa popolazione. Il suo determinante antitetico, HPA1b (PlA2), ricorre nel 27% della popolazione caucasica. Gli antigeni HPA-1a e HPA-1b sono sistemati, nella membrana piastrinica, sulla glicoproteina GPIIIa. I pazienti con la tromboastenia di Glanzmann Tipo I, che unalterazione della funzionalit piastrinica, mancano di questa glicoproteina e, per questo motivo, non esprimono gli antigeni del sistema HPA-1. Il polimorfismo di HPA-1 origina dalla sostituzione di un singolo paio di basi (la leucina in HPA-1a e la prolina in HPA-1b) al residuo amminoacidico in posizione 33 della sequenza proteica, codificata dal gene pertinente. GPIIIa anche il trasportatore degli antigeni HPA-4, -6, -7, -8, -10, -11, -14, -16. I determinanti allelici di questi sistemi originano anche loro da una singola sostituzione amminoacidica in posizioni diverse. Il sistema antigenico HPA-2 sistemato sulla
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Tabella 16.4 - I polimorfismi allogenici delle glicoproteine delle piastrine che sono stati coinvolti in sindromi alloimmuni* Nome del sistema HPA Antigeni (nomi comuni) Frequenze fenotipiche Localizzazione GP Sostituzione aminoacidica Sindromi alloimmuni
POLIMORFISMI DELLA GLICOPROTEINA IIIa HPA-1 HPA-4 HPA-6 HPA-7 HPA-8 HPA-10 HPA-11 HPA-14 HPA-16 HPA-1a, (PIA1, Zwa) HPA-1b, (PIA2, Zwb) HPA-4a (Pena, Yukb)g HPA-4b (Penb, Yuka) HPA-6bw (Caa, Tua) HPA-7bw (Mo) HPA-8bw (Sra) HPA-10bw (Laa) HPA-11bw (Geoa) HPA-14bw (Oea) HPA-16bw (Duva) 98% 27% 99,9% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% <1% IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa IIIa Leu Pro33 Arg Gln143 Arg Gln489 Pro Ala407 Arg Cys636 Arg Gln62 Arg His633 Lys611 Deleto lle Thr140 TNAI, PPT
TNAI, PPT TNAI TNAI TNAI TNAI TNAI TNAI TNAI
POLIMORFISMI DELLA GLICOPROTEINA IIb HPA-3 HPA-9 HPA-3a (Baka, Leka) HPA-3b (Bakb, Lekb) HPA-9bw (Maxa) 85% 63% 0,6% IIb IIb IIb lle Ser843 Val Met837 TNAI, PPT TNAI
(segue)
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Tabella 16.4 - I polimorfismi allogenici delle glicoproteine delle piastrine che sono stati coinvolti in sindromi alloimmuni* Nome del sistema HPA Antigeni (nomi comuni) Frequenze fenotipiche Localizzazione GP Sostituzione aminoacidica Sindromi alloimmuni
POLIMORFISMI DELLA GLICOPROTEINA Ia HPA - 5 HPA-13 HPA-5a (Brb, Zavb) HPA-5b (Bra, Zava) HPA-13bw (Sita) 99% 20% <0,2 Ia Ia Ia glu Lys505 Thr Met799 TNAI, PPT TNAI
POLIMORFISMI DELLA GLICOPROTEINA Ib HPA-2 HPA-12 HPA-2a (Kob, Sibb) HPA-2b (Koa, SIba) HPA-12bw (iya) 99% 15% 0,3% Ib alfa Ib alfa Ib beta Thr Met145 Gly Glu15 TNAI TNAI
ALTRI PROBABILI ALLOANTIGENI DELLE PIASTRINE HPA-15 HPA-15a (Govb) HPA-15b (Gova) 80% 60% CD109 CD109 Thr Ser703 TNAI, PPT
* Da Kroll27, adattamento autorizzato. GP = glicoproteine; TNAI = trombocitopenia neonatale alloimmune; PPT = porpora post-trasfusionale
GPIb alfa; il sistema HPA-3 sulla GPIIb e il sistema HPA-5 sulla GPIa36,37. Sulla membrana piastrinica, la maggior parte delle glicoproteine che portano questi antigeni piastrino-specifici presente come un composto eterodimerico, cio ognuna costituita da due differenti molecole glicoproteiche (vedi Figura 16.1)38. Perci, i nomi delle glicoproteine delle piastrine sono spesso appaiati (per esempio, Ia/ IIa, IIb/IIIa o Ib/IX), con riferimento alle catene alfa e beta di ogni complesso. GPIb/IX una glicoproteina di membrana ricca di leucina, che serve come recettore sulle piastrine del fattore von Willebrand. I complessi Ia/IIa e IIb/ IIIa sono membri di una famiglia, largamente rappresentata, di molecole di adesione, dette integrine. Le integrine sono essenziali per ladesione e laggregazione delle piastrine perch le molecole servono come recettori per alcuni ligandi, come il fibrinogeno (IIb/IIIa), il fattore von Willebrand (Ib/IX) e il collagene (Ia/IIa). Quando sono presenti su altre cellule, lappaiamento delle glicoproteine pu essere
diverso. Per esempio, sulle piastrine, GPIIIa normalmente appaiata con GPIIb. Sulle cellule endoteliali, sui fibroblasti e sulla muscolatura liscia, peraltro, GPIIIa appaiata con una glicoproteina differente. Perci, queste cellule presentano gli antigeni HPA che sono rilevati sulla molecola GPIIIa, ma non quelli rilevati sulla molecola GPIIb. CD109 costituisce uneccezione alla situazione eterodimerica, presentandosi come una struttura monomerica sulla membrana piastrinica. Questa proteina legata alla GPI viene rilevata, oltre che sulle piastrine39, sulle cellule T attivate, sulle cellule endoteliali in coltura, in numerose linee cellulari neoplastiche. Due antigeni indicati come HPA-15wb (Gova) e HPA-15wa (Govb) sono stati localizzati sulla CD109 delle piastrine39. Diversamente dalla maggior parte degli antigeni piastrino-specifici, entrambi i determinanti allelici sono ampiamente espressi [0,53% (Govb) e 0,47 (Gova)] nei soggetti di etnia europea (Tabella 16.4). La sensibilizzazione contro gli antigeni Gov
Figura 16.1 - Diagramma schematico del complesso glicoproteico IIb/IIIa delle piastrine. I e le lettere (Yuk, Oe, Pla, Ca, Gro, Sr, Bak, Max) indicano le posizioni ed i nomi degli epitopi allotipici riconosciuti. Le regioni molecolari dove sono stati individuati degli autoepitopi sono indicate con parentesi quadre38.
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stata associata alla refrattariet piastrinica, alla TNAI, e alla PPT, anche se, di solito, insieme ad altri alloanticorpi specifici per antigeni piastrinici40. Importanza clinica degli antigeni e degli anticorpi piastrino-specifici Trombocitopenia neonatale alloimmune La trombocitopenia neonatale alloimmune viene descritta nel Capitolo 23. Porpora post-trasfusionale La PPT caratterizzata dallo sviluppo di una drammatica, improvvisa ed autolimitante trombocitopenia che si verifica da 5 a 10 giorni dopo una trasfusione di sangue in pazienti con una storia di sensibilizzazione prodotta da gravidanze o da trasfusioni. In coincidenza con la trombocitopenia, si osserva, nel siero dei pazienti, lo sviluppo di un potente alloanticorpo piastrinospecifico, di solito con specificit anti-HPA-1a. Sono state implicate altre specificit, quasi sempre associate con gli antigeni presenti su GPIIb/IIIa37,41. La PPT si differenzia dalle reazioni trasfusionali sostenute dagli anticorpi anti-eritrocitari, perch vengono distrutte le piastrine stesse, antigenenegative del paziente (di solito HPA-1a negative), cos come qualsiasi concentrato di piastrine antigene-positive trasfuse (con possibili severe reazioni trasfusionali). La trasfusione di piastrine negative per lantigene pu essere presa in considerazione durante la fase acuta della PPT; queste piastrine, hanno, comunque, una ridotta sopravvivenza in vivo42. La plasmaferesi, che una volta era il trattamento di prima scelta, stata ampiamente sostituita dalla somministrazione endovenosa di immunoglobuline (IGIV). Il meccanismo attraverso il quale questi trattamenti sono efficaci sconosciuto. Lesame per gli anticorpi antipiastrine evidenzia nel siero, di solito, un anticorpo con specificit anti-HPA-1a. La tipizzazione delle piastrine del paziente dopo la guarigione dimostrer un fenotipo HPA1a negativo o unanaloga tipizzazione negativa per gli altri sistemi antigenici piastrino-specifici coinvolti. Dopo la guarigione, per le future trasfusioni devono essere somministrate, se possibile, unit di globuli
rossi lavati, negativi per lantigene. Le unit di eritrociti lavati possono offrire qualche protezione dal ripetersi dellevento, bench almeno un caso di PPT determinato da un anti-HPA-5b si sia verificato dopo la trasfusione di una unit di globuli rossi concentrati lavati43. Esami per gli antigeni e gli anticorpi piastrino-specifici Gli esami clinicamente utili per evidenziare anticorpi anti-piastrinici sono stati introdotti successivamente ai test sierologici utilizzati per la diagnosi delle alterazioni immunologiche dei globuli rossi. Questo principalmente perch difficoltoso separare le piastrine dai campioni di sangue intero e differenziare le alterazioni che dipendono da anticorpi e da quei cambiamenti aspecifici che si verificano nelle piastrine durante un test. Sono stati sviluppati44 tre tipi di metodi per il rilievo degli anticorpi anti-piastrinici (Tabella 16.5). Il primo test messo a punto, indicato come Fase 1, coinvolgeva una miscela di siero del paziente con piastrine normali utilizzando, come valore finale differenziante, unalterazione funzionale delle piastrine, come per esempio il rilascio di granuli alfa, laggregazione o lagglutinazione piastrinica. I test in Fase II misuravano la presenza di immunoglobuline sulle piastrine del paziente stesso, oppure quella rilevabile su piastrine normali, dopo la sensibilizzazione con il siero del paziente. Nella Fase III stato sviluppato un test in fase solida nel quale viene evidenziato il legame degli anticorpi con le glicoproteine isolate della superficie piastrinica. Le diverse metodiche dei test sono esempi degli esami eseguiti in Fase I, in Fase II e in Fase III; si sono utilizzate varianti metodologiche di ciascun test. I test di linfocitotossicit sono discussi nel Capitolo 17. Test di emoagglutinazione passiva in miscela (MPHA, Mixed Passive Haemagglutination Assay). Un test in Fase II che viene utilizzato per la determinazione di anticorpi piastrino-specifici, come per il crossmatch piastrinico, il test MPHA. Shibata et al. furono i primi a utilizzarlo per rilevare e identificare gli alloanticorpi anti-piastrinici
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Tabella 16.5 - Test per gli anticorpi piastrinici Esami in Fase I Aggregazione piastrinica Inibizione dellaggregazione delle piastrine Inibizione della retrazione del coagulo Inibizione della migrazione piastrinica Fissazione del complemento Rilascio del fattore 3 delle piastrine Rilascio di 51Cromo Rilascio di 14C-Serotonina Esami in Fase II Rilievo di immunoglobuline fissate sulla superficie delle piastrine Test in immunofluorescenza di sospensioni di piastrine (PSIFT, Platelet Suspension Immunofluorescence Test) Citometria a flusso Test radioimmunologici (125I proteina A stafilococcica, 125I immunoglobuline anti-umane policlonali o monoclonali) Consumo di antiglobuline (test in due stadi) Aderenza dei globuli rossi in fase solida Rilievo di immunoglobuline totalmente associate alle piastrine Nefelometria Elettroimmunotest Immunodiffusione radiale Esami in Fase III Immobilizzazione degli antigeni delle piastrine con anticorpi monoclonali (MAIPA) Cattura dellantigene in ELISA (ACE) Cattura modificata dellantigene in ELISA (MACE) Test con immunosfere Immunoblotting clinicamente significativi 45. Viene largamente utilizzata anche una variazione del test MPHA, quello SPRCA ( Solid Phase Red Cell Adherence)18. In questo test, piastrine intatte vengono immobilizzate sul fondo concavo di un pozzetto di una micropiastra e sensibilizzate con lanticorpo in esame. Dopo i lavaggi, sono aggiunti, come sistema rivelatore, globuli rossi precedentemente rivestiti con un anticorpo specifico per le immunoglobuline umane. Dopo lincubazione (da diverse ore a tutta la notte), la micropiastra viene sottoposta a una lenta centrifugazione ed esaminata visivamente. Se un anticorpo si fissato alle piastrine immobilizzate, le emazie del sistema rivelatore non riescono a formare un bottone compatto al centro del pozzetto perch sono distribuite, uniformemente, come un tappeto, sulle piastrine rivestite dallanticorpo. In una reazione negativa, si forma al centro del pozzetto un bottone di emazie. Una limitazione del test MPHA che non in grado di distinguere gli anticorpi piastrino-specifici da quelli non piastrino-specifici. Una modifica del test MPHA, il Capture-P (Immucor Gamma, Norcross, GA, USA), reperibile come kit commerciale e viene prevalentemente venduto per eseguire il crossmatch fra le piastrine18. Il test SPRCA pu essere modificato trattando le
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piastrine bersaglio con la clorochina o con acidi46,47, che distruggono il complesso trimolecolare, formato dalla catena pesante HLA di Classe I, dal peptide e dalla 2-microglobulina. Ci modifica gli epitopi antigenici, riducendo il legame degli anticorpi specifici per gli antigeni HLA presenti sulle piastrine. Tuttavia, malgrado questo, anticorpi antiHLA particolarmente potenti possono legarsi, dando limpressione che lanticorpo in esame sia diretto contro un antigene non-HLA. Citometria a flusso. Un altro esempio di test in Fase II il rilievo dellanticorpo anti-piastrine mediante limmunofluorescenza. Questo esame era originariamente condotto con una metodologia su vetrino48. Ora la tecnica utilizza la citometria a flusso per rilevare nei sieri dei pazienti lanticorpo reattivo, che si fissa su piastrine intatte49. Nellesecuzione del test, piastrine lavate sono sensibilizzate, per pi di 60 minuti, con il siero del paziente o con un siero di controllo, di solito a temperatura ambiente. Le piastrine sensibilizzate sono poi lavate ripetutamente per rimuovere le immunoglobuline non specifiche e gli anticorpi fissati sulle piastrine vengono rilevati con un anticorpo, policlonale o monoclonale, specifico per le immunoglobuline umane, marcato con un mezzo fluorescente, di solito, lisotiocianato di fluoresceina (FITC, Fluorescein IsoThioCianate). Le piastrine sono poi analizzate con il citofluorimetro a flusso e i risultati possono essere espressi come un rapporto fra le medie o come il rapporto fra il picco del canale della fluorescenza di piastrine normali sensibilizzate con il siero del paziente e quello di piastrine normali incubate con un siero normale. Per prevenire il legame non specifico sulle piastrine bersaglio della sonda immunoglobulinica mediante il recettore Fc, gli anticorpi del sistema rivelatore vengono trattati con enzimi, per rimuovere il frammento terminale Fc della molecola. Si pu, quindi, presumere che il legame della sonda marcata avvenga attraverso il suo frammento F(ab)2 o il terminale antigene-specifico. Un secondo marcatore fluorescente [per esempio, la ficoeritrina (FE)] pu essere legato a un marcatore anti-IgM umane per rilevare gli anticorpi anti-piastrinici di classe IgM. Poich le
fluorescenze di FITC e di FE hanno il picco luminoso a differenti lunghezze donda, quando esposte al laser monocromatico ad argon, nel citofluorimetro a flusso (rispettivamente, a 520-nm luce verde e a 580-nm luce rosso-arancio), le piastrine marcate con il FITC possono essere differenziate da quelle marcate con la FE. Sia lanti-IgG che lanti-IgM, marcati con i due diversi fluorocromi, possono essere aggiunti nella stessa provetta con le piastrine sensibilizzate e lavate, per una determinazione contemporanea degli anticorpi anti-piastrinici di classe IgG ed IgM. La citometria a flusso si dimostrata una metodologia molto sensibile per la determinazione degli alloanticorpi. Lesame capace di rilevare quantit veramente piccole di molecole anticorpali adese alle piastrine, come nel caso degli anticorpi specifici per gli antigeni del sistema HPA-5, che presentano soltanto da 1.000 a 2.000 siti antigenici per piastrina. Inoltre, alcuni alloanticorpi per gli epitopi labili - che non sono evidenziati, in modo attendibile, con gli esami di Fase III - possono essere rilevati sulle piastrine intatte utilizzate nella citometria a flusso. Poich le piastrine bersaglio usate nellesame sono intatte, la citometria a flusso non pu differenziare tra gli anticorpi piastrino-specifici (cio, specifici per le glicoproteine delle piastrine) e gli anticorpi non piastrino-specifici. Esempi di questi ultimi sono gli anticorpi HLA e ABO. Ma ci costituisce un vantaggio, quando il metodo sia usato per rilevare anticorpi che condizioneranno il successo delle trasfusioni piastriniche e, per questa ragione, la citometria a flusso considerata un buon metodo per il crossmatch delle piastrine. Tuttavia, quando utilizzata per indagare casi sospetti di TNAI o di PPT, la metodica ha una potenziale limitazione: gli anticorpi piastrinospecifici di preminente importanza, che sono caratteristici di queste patologie, possono essere oscurati da una reattivit non piastrino-specifica. Immobilizzazione degli antigeni piastrinici con anticorpi monoclonali specifici (MAIPA, Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Platelet Antigen). Un esempio di esame di Fase III il MAIPA50,52 che , forse, il test maggiormente utilizzato per rilevare gli anticorpi piastrino-specifici.
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Lindagine prevede lutilizzo di anticorpi monoclonali (MoAb) murini, che riconoscono gli antigeni bersaglio che interessano ma non sono competitivi con lanticorpo umano da evidenziare. Nellesecuzione dellesame, le piastrine bersaglio vengono simultaneamente sensibilizzate con il siero del paziente e con un anticorpo monoclonale murino che riconosce, sulla superficie delle piastrine, la molecola bersaglio ricercata. Dopo il passaggio iniziale di sensibilizzazione, le piastrine sono lavate e solubilizzate in un detergente anionico. Dopo la centrifugazione per rimuovere i frammenti del citoscheletro, unaliquota del lisato sopranatante viene aggiunto nei pozzetti di una micropiastra che contengono un anticorpo immobilizzato di capra, specifico per le IgG di topo. Lanticorpo monoclonale viene catturato e la glicoproteina piastrinica di superficie, con lanticorpo umano fissato, viene immobilizzata. Dopo una fase di lavaggio, lanticorpo umano viene evidenziato con una sonda costituita da un anticorpo di capra antiIgG umane marcato con enzima. Vi sono numerose altre versioni degli esami in Fase III utilizzate attualmente che comprendono il test ACE (Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent ), il MACE (Modified Antigen Capture ELISA ) 53,54 ed il test reperibile in commercio GTI PAKPLUS55 (GTI, Waukesha, WI, USA). Ognuno di questi test realizzato con anticorpi monoclonali per immobilizzare solamente la glicoproteina che interessa, riducendo o eliminando, in tal modo, le reazioni interferenti dovute ad anticorpi non piastrino-specifici, specialmente HLA, che, se presenti, vengono rilevati solo nei pozzetti contenenti dei pool di antigeni HLA di Classe I immobilizzati. Tipizzazione piastrinica con metodiche molecolari . Per molti antigeni piastrinici, disponibile la tipizzazione molecolare mediante la reazione della polimerasi a catena (PCR, polymerase chain reaction ). Poich limmunofenotipizzazione limitata dalla carenza di sieri tipizzanti adeguatamente caratterizzati e dai bassi conteggi delle piastrine, sono state sviluppate numerose tecniche per la tipizzazione molecolare HPA, come lanalisi del polimorfismo
da lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP, Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e lanalisi sequenza-specifica dei nucleotidi con sonde di ibridazione56.57. Tutte queste tecniche sono affidabili, ma sono anche laboriose e prolisse. Per questo motivo, la genotipizzazione con primer sequenza-specifici (SSP, SequenceSpecific Primers) sembra essere di uso molto pi pratico58,59. In un recente workshop, la metodologia SSP-PCR si dimostrata la pi comune e affidabile per determinare gli antigeni piastrinici60, rendendo realizzabile le genotipizzazioni HPA, indipendentemente dal conteggio delle piastrine del paziente e dalla rarit di sieri tipizzanti61. Disordini autoimmuni delle piastrine Porpora trombocitopenica idiopatica (autoimmune) Autoanticorpi specifici per gli antigeni delle piastrine possono determinare una trombocitopenia. La porpora trombocitopenica idiopatica cronica (PTI), nella maggior parte dei casi una patologia degli adulti, caratterizzata da un esordio insidioso e da una moderata trombocitopenia che pu sussistere per mesi o anni prima della diagnosi. Le femmine hanno il doppio delle probabilit di ammalarsi rispetto ai maschi. Le remissioni spontanee sono rare e, di solito, necessaria una terapia per ripristinare un adeguato livello di piastrine. Il primo intervento terapeutico consiste nella somministrazione di steroidi, di IGIV ad alte dosi o di immunoglobuline Rh (RhIG), seguito dalla splenectomia per i pazienti che non rispondono alla terapia. Molte altre terapie, con esiti variabili, sono state utilizzate nei pazienti che non rispondono alla splenectomia. La trombocitopenia cronica autoimmune pu essere idiopatica o associata ad altre patologie (per esempio, infezione da HIV, neoplasie maligne od altre condizioni autoimmuni). LPTI acuta , invece, prevalentemente, una patologia infantile, caratterizzata dal brusco esordio di una severa trombocitopenia con sintomatologia emorragica, frequentemente dopo uninfezione virale. Nella maggioranza dei casi queste patologie si risolvono spontaneamente in un periodo variabile dai 2 ai 6 mesi. Se si rende
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necessario il trattamento, linfusione di IGIV o di RhIG solitamente efficace nel ripristinare un normale livello di piastrine. Gli steroidi sono utilizzati meno spesso, per i seri effetti collaterali che possono determinare nei bambini. La splenectomia, se praticata, limitata a quei bambini affetti da una severa patologia che si prolunga oltre i sei mesi con un andamento analogo a quello della PTI cronica negli adulti. Gli esami per gli autoanticorpi delle piastrine Sono stati sviluppati numerosi test per gli anticorpi anti-piastrinici in Fase I, II e III allo scopo di evidenziare gli autoanticorpi significativi nei pazienti affetti da PTI. Sebbene molti test si siano dimostrati adeguatamente sensibili, particolarmente nel rilevare la globalit delle immunoglobuline fissate sulla superficie delle piastrine (test in Fase II)62, nessuno di essi risultato sufficientemente specifico per essere particolarmente affidabile sia nella diagnosi che nella gestione delle PTI. Le linee guida applicative della Societ Americana degli Ematologi hanno stabilito che gli esami sierologici non sono necessari per stabilire la situazione di PTI, qualora i rilievi clinici siano compatibili con la diagnosi63. Tuttavia, gli esami sugli anticorpi antipiastrinici possono essere utili nella valutazione dei pazienti sospettati di avere una PTI, quando possono essere presenti altre cause non immunologiche. Lobiettivo dei test sierologici nella PTI quello di evidenziare gli autoanticorpi adesi alle piastrine del paziente stesso, con o senza la dimostrazione di unanaloga reattivit rilevabile nel plasma del paziente. La maggior parte dei test, che non sono mai stati proposti per una valutazione dei pazienti sospettati di avere una PTI, sono gli esami in Fase III, essendo stati realizzati per rilevare delle immunoglobuline fissate a specifici epitopi rilevati sui complessi glicoproteici GPIIb/IIIa, GPIa/IIa e/ o GPIb/IX delle piastrine. Questi test in fase solida, specifici per le glicoproteine, sembrano avere unaumentata specificit nel differenziare le PTI dalle trombocitopenie non immunologiche, se confrontati con i test in Fase II, ma ci viene
spesso bilanciato da una diminuzione della sensibilit64. Tutti questi metodi hanno una limitata utilizzazione nei pazienti con conteggi piastrinici molto bassi che impediscono di disporne di un numero quantitativamente adeguato da utilizzare nei test. Un test commercialmente disponibile, il gi citato GTI PAKAUTO65, utilizza gli eluati preparati dalle piastrine lavate del paziente. Gli eluati sono poi esaminati contro un pannello di complessi piastrinici glicoproteici immobilizzati con anticorpi monoclonali e lanticorpo adeso viene rilevato utilizzando una sonda costituita da antiglobuline umane legate a un enzima. Nella fase indiretta del test, il plasma del paziente viene testato contro il medesimo pannello di glicoproteine. In generale, gli anticorpi plasmatici sono rilevati meno frequentemente di quelli presenti negli eluati. I pazienti con PTI possono presentare anticorpi reattivi con una o con numerose glicoproteine bersaglio. Attualmente, non si sono evidenziate correlazioni tra la specificit degli autoanticorpo e la severit dellPTI. Disordini immunologici delle piastrine indotti dai farmaci La trombocitopenia associata con specifici farmaci non infrequente. I farmaci spesso implicati comprendono chinidina/chinino, medicinali a base di zolfo, eparina e oro colloidale. Possono essere prodotti anticorpi sia farmacodipendenti che farmaco-indipendenti. Gli anticorpi farmaco-indipendenti, sebbene stimolati dai farmaci, non richiedono la presenza continuativa del farmaco per reagire con le piastrine e sono sierologicamente indistinguibili dagli altri autoanticorpi anti-piastrine (diversamente da quelli della tipica trombocitopenia autoimmune, questi anticorpi sono fugaci, tranne quelli indotti dalla terapia con loro, che vengono escreti molto lentamente). Gli anticorpi farmaco-dipendenti sono prodotti quando un farmaco si combina con le piastrine in modo da formare neoantigeni, contro i quali vengono formati gli anticorpi. Il farmaco deve essere presente perch lanticorpo possa reagire.
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Questi anticorpi possono provocare una trombocitopenia a rapido e improvviso esordio, che di solito si risolve quando il farmaco viene sospeso. Esami per gli anticorpi anti-piastrine farmaco-dipendenti Sierologia . Virtualmente, qualunque test sierologico, utilizzato per rilevare le immunoglobuline adese alle piastrine pu essere modificato per essere impiegato nel rilievo degli anticorpi anti-piastrinici farmaco-dipendenti. Nellesecuzione dei test per gli anticorpi farmaco-dipendenti, essenziale stabilire appropriati controlli, positivi e negativi. Ogni campione di siero o plasma, sospettato di contenere anticorpi farmaco-dipendenti, deve essere esaminato contro piastrine bersaglio normali, in presenza e in assenza del farmaco. Inoltre, alla fine deve essere testato un siero normale, con e senza il farmaco, per verificare ogni effetto sulle piastrine correlato al farmaco che non richieda uno specifico anticorpo. Infine, per completare la valutazione, dovrebbe essere testato, con e senza il farmaco, un siero di controllo, noto per essere reattivo con il farmaco. Un risultato positivo deve dimostrare che il siero in esame positivo contro piastrine normali bersaglio in presenza del farmaco, ma non in sua assenza, e che il farmaco non provoca risultati positivi aspecifici sulle piastrine bersaglio. Allo stesso modo, il siero di controllo positivo
deve essere reattivo in presenza del farmaco e non essere reattivo in sua assenza. Citometria a flusso. I test in citometria a flusso possono essere facilmente adattati per rilevare gli anticorpi anti-piastrine farmaco-dipendenti, sia di classe IgG sia di classe IgM53,66. Con queste modifiche, la fluorescenza delle piastrine normali, sensibilizzate con il siero del paziente in presenza del farmaco, pu essere confrontata con quella del campione del paziente in assenza del farmaco o con quella di un siero normale in presenza del farmaco, per determinare lintensit relativa della marcatura fluorescente. La citometria a flusso si dimostrata possedere una sensibilit superiore a quella degli altri test per il rilievo di anticorpo chinidina-chinino e sulfamidico-dipendenti, reattivi con le piastrine53. La Tabella 16.6 presenta altri agenti per i quali sono stati rilevati e confermati, con la citometria a flusso, anticorpi anti-piastrinici farmaco-dipendenti, in numerosi laboratori di riferimento per limmunologia piastrinica. Come altri metodi utilizzati per evidenziare gli anticorpo anti-piastrine, la citometria a flusso ha i suoi limiti nel rilievo degli anticorpi farmacodipendenti. Per molti farmaci, non stata determinata la concentrazione ottimale per dimostrare la fissazione in vitro dellanticorpo. Gli studi pi approfonditi sui farmaci sono, probabilmente, quelli condotti sul chinino o sulla chinidina67. Unaltra causa di scarsa sensibilit determinata dalla fragilit del legame del farmaco
Tabella 16.6 - Farmaci confermati in grado di evocare anticorpi farmaco-dipendenti reattivi con le piastrine utilizzando i test in vitro della citometria a flusso. abciximab acetominofene carbamazepina ceftazidina ceftixozima ciprofloxazima eparina eptifibatide esomeprazolo fenitoina fentanil fexofenadine ibuprofen levofloxacina loracarbef naproxene orbofiban oxaliplatino propoxyphene ranitidina rifampina sulfametoxazolo sulfisoxazolo suramina tirofiban trimetoprim vancomicina xemilofiban
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con le piastrine, che comporta una rapida riduzione del numero di molecole medicinali adese alla superficie piastrinica, una volta che il farmaco viene rimosso dallambiente che circonda la piastrina. Per questo motivo, importante mantenere una concentrazione critica del farmaco in tutte le soluzioni tamponate di lavaggio, prima dellaggiunta del tracciante alla fine di un esame66. Un altro potenziale motivo, che pu determinare una scarsa sensibilit, che il paziente pu non essere sensibilizzato al farmaco nativo ma, piuttosto, a un suo metabolita. Sono stati pubblicati casi di anticorpi dipendenti da un metabolita dellacetaminofene e del sulfametoxazolo68,69. Sono stati adottati numerosi altri test per la determinazione degli anticorpi anti-piastrine farmaco-dipendenti. Tra questi, vi sono lo SPRCA70,71 e anche un test in Fase I, che stato modificato per il rilievo degli anticorpi piastrinici eparina-dipendenti (vedi di seguito). In alcuni casi, la determinazione della specifica glicoproteina contro la quale lanticorpo diretto, utilizzando un test in Fase III, pu fornire utili indicazioni cliniche. Per esempio, un anticorpo farmaco-dipendente specifico per GPIb/IX stato associato ad una trombocitopenia pi acuta, ma reversibile, indotta dal chinino, mentre un anticorpo specifico per GPIIb/ IIIa stato associato ad un decorso pi lungo72. Trombocitopenia indotta dalleparina Sono conosciuti due tipi di trombocitopenie indotte dalleparina (HIT, Heparin-Induced Thrombocytopenia). Il Tipo I, non di origine immunologica, si presenta con una modesta trombocitopenia transitoria, non clinicamente importante, che esordisce da pochi minuti a diversi giorni dopo lesposizione del paziente alleparina, ma che generalmente si risolve, nonostante la prosecuzione della terapia eparinica. Al contrario, la HIT di Tipo II, di natura immunologica, pu condurre a gravi complicazioni trombotiche agli arti, pericolose anche per la vita, e richiede unaccurata valutazione e gestione dei pazienti che ne soffrono. Lesatta frequenza della HIT immune sconosciuta, ma si pu sviluppare in oltre il 3% dei pazienti trattati con leparina non frazionata.
Leparina a basso peso molecolare associata meno frequentemente a entrambe le situazioni, sia con quella con la produzione di anticorpo, come con la sola trombocitopenia transitoria73. Leparina bovina sembra essere, con maggiore probabilit, causa della HIT rispetto alleparina porcina74. Una riduzione del conteggio basale delle piastrine di almeno il 50% avviene generalmente dal 5 al 14 giorno dopo la prima esposizione al farmaco e in un tempo minore dopo unesposizione secondaria. Il conteggio delle piastrine frequentemente inferiore a 100.000/L e, di solito, torna normale dal 5 al 7 giorno dopo la sospensione delleparina. Il 30% circa dei pazienti con la HIT o, approssimativamente, lo 0,9% dei pazienti trattati con eparina, sviluppano una trombosi che pu verificarsi nelle arterie, nel circolo venoso o in entrambi i distretti75,76. I pazienti possono soffrire di problemi cardio-vascolari, infarti del miocardio, ischemie agli arti, trombosi venose profonde o ischemie in altri organi. Le complicazioni trombotiche possono costringere allamputazione di un arto o essere anche letali. La trombosi o uninspiegata riduzione delle piastrine mentre si sotto terapia eparinica, dovrebbe orientare linteresse per una possibile HIT. Leparina, i lavaggi con eparina e i cateteri trattati con eparina, devono essere sospesi e il paziente andrebbe valutato con esami di laboratorio specifici per la HIT e controllato per eventuali sintomi di trombosi. Nelle trombocitopenie leggere o modeste, il monitoraggio delle piastrine e losservazione del paziente possono essere sufficienti ma, a causa dellelevato rischio di trombosi, di solito raccomandato il trattamento con anticoagulanti alternativi. Il warfarin andrebbe evitato nel trattamento iniziale della HIT, perch non previene la trombosi in questa situazione e pu provocare un rischio di gangrena venosa agli arti, riducendo i livelli degli anticoagulanti naturalmente presenti pi rapidamente di quanto il farmaco riduca i fattori attivati della coagulazione. Tuttavia, il warfarin pu, e deve, essere usato, dopo che il paziente stato scoagulato con farmaci alternativi. Gli anticoagulanti adatti, approvati dalla Food and
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Drug Administration (FDA), comprendono lirudina (inibitore naturale della trombina) e largatroban. Alcuni pazienti selezionati possono anche trarre beneficio dalla trombolectomia o dalla terapia trombolitica. La trasfusione di piastrine andrebbe evitata, dato che il sanguinamento una complicazione rara nella HIT, mentre la somministrazione di piastrine pu determinare trombosi77,79. Leparina forma complessi col fattore 4 delle piastrine (PF4), una proteina tetramerica che viene rilasciata dai granuli alfa delle piastrine. Si formano anticorpi (di classe IgG, IgM e, talvolta, IgA), che reagiscono con i diversi epitopi presenti su questo complesso e che attaccano i recettori Fc IIa delle piastrine, che, di conseguenza, si attivano. Lanticorpo pu anche legarsi al complesso in altri siti, particolarmente sulle cellule endoteliali. Perci, la HIT pu coinvolgere e danneggiare non solo le piastrine ma anche gli endoteli, causando unaumentata suscettibilit alla trombosi. Questa nuova nozione sul meccanismo degli anticorpi eparinici stata clamorosamente acquisita dai test in ELISA, nei quali i micropozzetti sono ricoperti con i complessi al posto delle piastrine stesse80. Gli esami per gli anticorpi eparina-dipendenti Il test PF4 ELISA un esempio di test in Fase III per la HIT. Il complesso bersaglio PF4-eparina o molecole eparina-simili sono immobilizzate in fase solida. Per eseguire il test, il siero del paziente viene aggiunto ai complessi (preparati in precedenza) di PF4 ed eparina o alle molecole eparina-simili (per esempio, polivinil-solfato, PVS) da solo e in presenza di alte dosi di eparina (100 U/mL). Gli anticorpi eparina-dipendenti si legano al complesso e vengono rilevati con un siero antiglobuline umane coniugate con enzimi. Un valore di densit ottica superiore a 0,4 nel pozzetto PF4-PVS, che inibito da alte dosi di eparina, conferma la presenza di un anticorpo eparina-dipendente nel campione del paziente. Sebbene gli anticorpi di classe IgG siano quelli pi clinicamente significativi come cause della sindrome81, alcuni pazienti con la HIT sembrano avere solamente anticorpi che non appartengono
alla classe IgG (cio, IgM o IgA)82. Il test PF4 ELISA li evidenzia, ma non in grado di differenziare la classe (IgG, IgM o IgA) degli anticorpi, che si legano al complesso PF4-eparina. Il test 14C-serotonina (SRA, Serotonin Release Assay) un esempio di esame in Fase I, utilizzato per rilevare gli anticorpi eparina-dipendenti83. Piastrine bersaglio, normali e fresche, vengono incubate con 14C-serotonina, che si ottiene dai granuli densi delle piastrine. Successivamente, le piastrine bersaglio sono esposte al siero del paziente in presenza di basse e alte concentrazioni di eparina. Il rilascio di almeno il 20% del tracciante radioattivo a basse dosi di eparina e linibizione di questo rilascio ad alte dosi, confermano la presenza degli anticorpi eparina-dipendenti. Altri test funzionali utilizzati per rilevare gli anticorpi eparina-dipendenti comprendono quello dellaggregazione piastrinica indotta dalleparina e il test di attivazione delle piastrine indotta dalleparina. Il PF4 ELISA e il test SRA presentano entrambi una maggiore sensibilit e specificit del test di aggregazione, per il rilievo degli anticorpi eparinadipendenti nei pazienti, per i quali vi sia un sospetto clinico di HIT83-85. Tuttavia, nei pazienti asintomatici in terapia eparinica o in quelli che non hanno ancora ricevuto il farmaco, nessun test sufficientemente predittivo per la HIT da giustificare il loro uso in uno screening.
Antigeni dei granulociti

Analogamente agli alloantigeni piastrinici, gli alloantigeni dei neutrofili sono implicati in sindromi cliniche che comprendono la neutropenia neonatale alloimmune, la TRALI (TransfusionRelated Acute Lung Injury, cio lesione acuta polmonare correlata alla trasfusione), la neutropenia immune dopo un trapianto di midollo ematopoietico, la refrattariet alla trasfusione dei granulociti e la neutropenia cronica autoimmune benigna dellinfanzia. Non stata descritta, per i granulociti neutrofili, una forma clinica equivalente alla PPT. Attualmente, sono stati descritti sette alloantigeni dei neutrofili, insieme alla loro
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localizzazione sulle strutture delle glicoproteine di superficie e, in alcuni casi, con la determinazione del polimorfismo del DNA per i geni che li codificano (vedi Tabella 16.7). Il primo antigene specifico dei neutrofili, NA1 (HNA-1a), venne pubblicato da Lalezari e Bernard nel 196686. HNA-1a ed il suo antigene antitetico, HNA-1b, sono presenti sulla proteina FcRIIIb. Gli anticorpi specifici per HNA-1a e HNA-1b sono stati coinvolti nella TRALI, nella neutropenia neonatale alloimmune e nella neutropenia autoimmune dellinfanzia. Circa lo 0,1% dei soggetti di etnia europea ha neutrofili nei quali non evidenziabile la FcRIIIb (NAnull). La proteina FcRIIIb trasporta anche lantigene dei neutrofili SH (HNA-1c)87. Lantigene NB1 (HNA-2a) si trova invece su unaltra glicoproteina di superficie, la CD177, la cui funzione non stata ancora determinata. stato riferito di un allele di HNA-2a, NB2, ma il prodotto di questo allele non si potuto identificare in modo affidabile con gli antisieri e non stato evidenziato alcun anticorpo monoclonale specifico per lantigene NB2. Lesistenza di un secondo allele, alternativo ad HNA-2a (NB1), non perci confermata88. LHNA-2a stato associato alla TRALI e alla neutropenia neonatale alloimmune. La sequenza DNA del gene NB1(HNA-2a) stata identificata Tabella 16.7 - Alloantigeni dei neutrofili
come possedere un polimorfismo molecolare associato con HNA-1a, con HNA-1b e con HNA1c sul gene che codifica per FcRIIIb. Per cui, la genotipizzazione per queste specificit pu essere eseguita utilizzando la PRC-SSP89. Nellemoglobinuria parossistica notturna si verifica una riduzione dellespressione antigenica dei granulociti, come nella leucemia mieloide cronica e nei neonati prematuri. Ulteriori antigeni, presenti sui granulociti, sono evidenziabili anche su altre cellule e non sono, quindi, granulocito-specifici. Questi comprendono 5b (HNA-3a), MARTa (HNA-4a) e OND a (HNA-5a). LHNA-3a localizzato su una proteina di 70-95 Kd che non ancora stata clonata. HNA-3a espresso anche sulla superficie dei linfociti. Gli anticorpi specifici per questo antigene sono, di solito, delle agglutinine; vengono occasionalmente rilevati nelle donne dopo una gravidanza e possono essere associati a reazioni febbrili posttrasfusionali. Potenti agglutinine anti-HNA-3a, presenti nel plasma trasfuso, sono state responsabili di TRALI con esito letale90-92. MARTa e ONDa, sono entrambi antigeni ad alta frequenza e sono presenti anche sui monociti e sui linfociti. MARTa stato localizzato sulla catena M alfa (CD11b) del recettore C3bi (CR3) ed
Frequenza antigenica (%) Sistema antigenico Neutrofilo-specifici NA NA SH NB Non specifici 5 MART OND Gene Designazione HNA HNA-1a HNA-1b HNA-1c HNA-2a HNA-3a HNA-4a HNA-5a Bianchi Neri Localizzazione glicoproteica FcRIIIb (CD16) FcRIIIb (CD16) FcRIIIb (CD16) CD177 70-95 kD GP CD11b CD11a
NA1 NA2 SH NB1 5b MARTa ONDa
46 88 5 97 07 98 99
46 84 22 -
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determinato da una singola sostituzione aminoacidica. Di recente, MARTa stato ritenuto coinvolto nella neutropenia neonatale alloimmune93. ONDa espresso sullunit L alfa dellintegrina, molecola 1 associata alla funzione leucocitaria (o CD11a) ed anchesso viene originato da una singola sostituzione nucleotidica. Questo marcatore, che stato rilevato in pazienti con anemia aplastica cronicamente trasfusi, non stato associato a patologie cliniche particolari. Sindromi cliniche nelle quali sono coinvolti gli alloantigeni granulocito-specifici Le reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche sono frequentemente collegate con gli anticorpi anti-granulociti. Sebbene queste reazioni siano con maggior frequenza determinate da anticorpi anti-HLA, specifici per degli epitopi di Classe I presenti anche sui granulociti, gli anticorpi strettamente specifici per gli antigeni dei granulociti sono stati associati a sindromi cliniche analoghe a quelle che vengono osservate per gli anticorpi reattivi con gli antigeni eritrocitari e piastrinici. Neutropenia neonatale alloimmune La neutropenia neonatale alloimmune sostenuta da anticorpi materni reattivi con gli alloantigeni dei neutrofili fetali; le specificit osservate con maggior frequenza sono dirette contro NA1, NA2 e NB1 (vedi Tabella 16.7). La neutropenia neonatale alloimmune si verifica con maggiore frequenza nelle donne che presentano i fenotipi antigenici NA1/NA1 e NA2/NA2; ma pu verificarsi anche nelle pazienti con il raro fenotipo NAnull, che sono prive delle proteina Fc RIII. In tutti questi casi la neutropenia pu occasionalmente essere pericolosa per la sopravvivenza, perch causa un aumento della suscettibilit alle infezioni. Pu essere utile una gestione con antibiotici, IGIV, i fattori di crescita dei granulociti e/o il plasmaexchange. TRALI La TRALI una reazione acuta, spesso
pericolosa per la vita, caratterizzata da distress respiratorio, ipo- o ipertensione ed edema polmonare non cardiogeno, che si verifica entro 6 ore da una trasfusione di un qualsiasi emocomponente che contenga plasma. stato riferito di TRALI indotte da anticorpi antineutrofili, bench pubblicazioni pi recenti indichino come causa pi probabile il coinvolgimento degli anticorpi diretti verso antigeni HLA, sia di Classe I che di Classe II94. Nella TRALI, gli anticorpi responsabili sono rilevati, con maggiore frequenza, nel plasma del donatore di sangue (vedi Capitoli 17 e 27). Recenti pubblicazioni hanno postulato uneziologia alternativa per la TRALI. Questa teoria propone il concorso di due eventi coincidenti per determinarla: 1) il paziente deve avere una condizione clinica di predisposizione per il rilascio delle citochine o di altri fattori che attivano i granulociti neutrofili, determinandone laderenza agli endoteli e 2) il paziente deve ricevere una trasfusione di emocomponenti conservati che contengono lipidi biologicamente attivi (che stimolano anche i neutrofili)95. In uno studio, sono stati rilevati anticorpi antineutrofili soltanto in tre di 10 casi di TRALI e nessuno dei donatori presentava degli anticorpi anti-HLA. Neutropenia autoimmune La neutropenia autoimmune si verifica, di solito, negli adulti, pu essere idiopatica oppure pu essere secondaria ad alcune patologie, come lartrite reumatoide, il lupus eritematoso sistemico o le infezioni batteriche. Nella neutropenia autoimmune dellinfanzia che si verifica, di solito, in bambini con et compresa tra i 6 mesi e i 2 anni, lautoanticorpo presenta una specificit per un antigene dei neutrofili (usualmente, HNA1a e HNA-1b) in circa la met dei casi. La situazione , nella generalit dei casi, autolimitante (con un recupero che di solito si verifica tra i 7 e i 24 mesi) e una situazione clinica relativamente benigna, gestibile con gli antibiotici96. Anche anticorpi farmaco-dipendenti possono essere causa di neutropenia.
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Esami per gli anticorpi dei granulociti Gli esami per laccertamento di anticorpi specifici per i granulociti non sono ampiamente diffusi, sebbene il loro coinvolgimento come causa di TRALI ne abbia incrementato la richiesta. I test di agglutinazione condotti in provetta, in capillari o su micropiastre utilizzano siero inattivato al calore in presenza di EDTA e richiedono la disponibilit di granulociti freschi. Vengono utilizzati anche esami in immunofluorescenza, eseguiti sia con un microscopio a fluorescenza che con il citometro a flusso, entrambi in grado di evidenziare i granulociti che si legano con un siero antiglobuline umane. Una combinazione di test di agglutinazione e accertamenti in immunofluorescenza la soluzione preferibile97. Altri metodi comprendono la chemiluminescenza e un test di immobilizzazione specifica degli antigeni granulocitari con anticorpi monoclonali (MAIGA), analogo al test MAIPA. Un vantaggio del test MAIGA la sua efficacia nel differenziare rapidamente tra gli anticorpi anti-HLA e quelli specifici per i granulociti.
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Capitolo 17: Il sistema HLA
Capitolo 17
Il sistema HLA
Il sistema HLA comprende un complesso insieme di geni e i loro prodotti proteici . Gli antigeni HLA contribuiscono al riconoscimento del proprio e del non-proprio (self and nonself), alla risposta immune, agli stimoli antigenici e a coordinare limmunit cellulare e umorale. I geni HLA, che sono sistemati sul complesso maggiore di istocompatibilit (o MHC, Major Histocompatibility Complex) nel braccio corto del cromosoma 6, codificano per molecole glicoproteiche, che si rinvengono sulla membrana delle cellule. Le molecole HLA di Classe I si trovano sulle piastrine e su tutte le cellule nucleate del corpo. I globuli rossi maturi non hanno, di norma, antigeni HLA dimostrabili con i metodi convenzionali, ma le cellule eritroidi immature li possiedono. Gli antigeni di Classe II sono rinvenibili su alcuni tipi di cellule, le pi importanti delle quali sono i linfociti, i macrofagi e le cellule dendritiche. Sono state utilizzate anche altre denominazioni per questi antigeni: antigeni MHC, antigeni di trapianto, antigeni tessutali. Gli antigeni HLA giocano un ruolo cruciale nella presentazione antigenica. Il riconoscimento immunologico delle differenze fra antigeni HLA rappresenta, probabilmente, il primo passo verso il rigetto di un tessuto trapiantato. Il sistema HLA secondo, per importanza, soltanto al sistema ABO nellinfluenzare la sopravvivenza a lungo termine di organi solidi trapiantati e di capitale importanza nel trapianto di cellule staminali ematopoietiche (CSE). Antigeni e anticorpi HLA sono anche importanti per alcune complicanze trasfusionali, quali la refrattariet piastrinica, le
reazioni febbrili non emolitiche, la TRALI (Transfusion-Related Acute Lung Injury , cio lesione acuta polmonare correlata alla trasfusione), la GvHD (Graft-versus-Host Disease) post-trapianto o post-trasfusionale. Gli studi che hanno collegato i polimorfismi HLA alla suscettibilit o alla resistenza a malattie sono iniziati subito dopo che si erano sviluppate le tecniche di tipizzazione degli antigeni HLA di Classe I. Storicamente, la tipizzazione HLA ha avuto rilievo nei test di paternit e per le indagini forensi. Lanalisi molecolare della regione HLA permette una selezione pi attenta della compatibilit del donatore per un trapianto di CSE, per indagare le associazioni con le malattie e per studi antropologici. Dato lestremo polimorfismo dei geni HLA, si generata una complessa nomenclatura per riferirsi alle sequenze anche di un unico allele, basandosi sui rapporti fra gli alleli e la specificit sierologica dellantigene corrispondente1.
Genetica del complesso maggiore di istocompatibilit

Gli antigeni HLA di Classe I e II sono glicoproteine di membrana cellulare, prodotte da geni strettamente legati, mappati sulla banda p21.3 sul braccio corto del cromosoma 6 (Figura 17.1). Questa regione genica denominata MHC ed , di norma, ereditata in blocco, come aplotipo. Ciascuno dei loci ha diversi alleli, con espressione codominante dei
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prodotti codificati da ciascun cromosoma. Il sistema HLA il sistema pi polimorfico descritto nelluomo. I geni HLA-A, HLA-B ed HLA-C codificano per i relativi antigeni (A, B, C) di Classe I. I geni HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP codificano per i corrispondenti antigeni di Classe II. Situati fra i geni di Classe I e di Classe II vi sono geni non-HLA che codificano per alcune proteine del complemento (C2, Bf, C4A, C4B), per un enzima steroideo (la 21-idrossilasi) e per una citochina (TNF, Tumor Necrosis Factor). Questa regione intermedia denominata MHC di Classe III. Organizzazione delle regioni genetiche HLA La regione HLA di Classe I contiene, in aggiunta ai classici geni HLA-A, HLA-B e HLA-C, altri loci genici, designati HLA-E, HLA-F, HLA-G, HFE, HLA-J, HLA-K, HLA-L, MICA e MICAB. Questultimi geni codificano per proteine HLA non-classiche (o di Classe Ib), caratterizzate da un polimorfismo limitato e da un basso livello di espressivit2. Alcuni geni di Classe I esprimono proteine non-funzionali o sono incapaci di codificare una proteina.
I geni incapaci di produrre proteine funzionali sono detti pseudogeni e, presumibilmente, rappresentano unevoluzione verso una morte programmata. HLA-E regola le cellule NK (Natural Killer). HLA-G espresso sui trofoblasti e potrebbe essere coinvolto nellimmunotolleranza della madre nei riguardi del feto. Lemocromatosi ereditaria, alterazione dovuta a sovraccarico marziale, con una frequenza di portatori pari al 10% nel Nord Europa, associata a due mutazioni di senso in un gene di simil-Classe I 3. Il gene che determina lemocromatosi ereditaria, venne inizialmente denominato HLA-H, designazione che era gi stata assegnata, da parte della Commissione per la Nomenclatura dellOrganizzazione Mondiale della Sanit, a un pseudogene di Classe I4. Oggi, il gene che determina lemocromatosi ereditaria viene chiamato HFE. Ci sono anche molecole di Classe I al di fuori dellMHC, quali le CD1, che possono presentare antigeni non proteici (come i lipidi) alle cellule T. Lorganizzazione genomica dellMHC di Classe II (regione HLA-D) pi complicata. Una molecola di Classe II composta di un complesso
Figura 17.1 - (A) Complesso maggiore di istocompatibilit situato sul braccio corto del cromosoma 6. Il centromero a sinistra. Sono mostrati i principali loci genetici di Classe I, II, III. La regione di classe III contiene i geni del sistema complementare (C2, Bf, C4A, C4B), il gene delle 21-idrossilasi (210H) ed i geni del Tumor Necrosis Factor (TNF). (B) Dettaglio ingrandito della regione di Classe II.
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non-covalente di due catene, strutturalmente simili, la catena e la catena . Entrambe le catene sono codificate dallMHC. Il polimorfismo degli antigeni MHC di Classe II dovuta a differenze riguardanti entrambe le catene ( e ), in relazione alle isoforme di Classe II. Per esempio, per quanto riguarda gli antigeni HLA-DR, la catena monomorfica, mentre quella altamente polimorfica. Loci multipli codificano per le catene o per le catene delle proteine MHC di Classe II. Differenti aplotipi hanno differenti numeri di geni e di pseudogeni di Classe II. Le proteine codificate dal gene DRA e dal gene DRB1 sono gli antigeni da HLA-DR1 sino a HLA-DR18. I prodotti del gene A e del gene B3 (se presente) esprimono il supertipo (sierologico) HLA-DR52 quelli del gene A e del gene B4 (se presente) esprimono il supertipo HLA-DR53, e quelli del gene A e del gene B5 (se presente) esprimono il supertipo HLA-DR51. Gli antigeni da HLA-DQ1 a HLA-DQ9 sono espressi su glicoproteine codificate dai geni DQA1 e DQB1, appartenenti allinsieme (cluster) dei geni DQ. Molti dei geni del cluster DQ sono, probabilmente, pseudogeni. Unorganizzazione consimile si trova anche nellinsieme dei geni HLA-DP. La regione MHC di Classe III contiene 4 geni del complemento, i cui alleli sono, di solito, ereditati congiuntamente come ununit, designata complotipo. Nelluomo i complotipi sono pi di 10. I geni di Classe III C4A e C4B codificano per varianti di C4. Queste varianti hanno struttura proteica e funzioni distinte. La molecola C4A (se presente) porta lantigene Rodgers, mentre quella C4B (se presente) porta lantigene Chido, entrambi assorbiti dai globuli rossi dei soggetti che posseggono i geni pertinenti. Schemi di ereditariet Sebbene lorganizzazione dellMHC sia complessa, la sua ereditariet segue i ben stabiliti principi della genetica. Ogni persona ha due copie differenti di cromosoma 6 e, quindi, possiede due aplotipi HLA, ognuno da ciascun genitore. Ogni aplotipo individuale viene determinato con la tipizzazione delle diverse generazioni dei membri di una famiglia, osservando quali sono gli alleli
ereditati congiuntamente. I prodotti genici espressi costituiscono il fenotipo, che pu essere determinato con la tipizzazione individuale degli antigeni HLA. Dato che i geni HLA sono autosomici e codominanti, il fenotipo rappresenta lespressione congiunta di entrambi gli aplotipi. La Figura 17.2 illustra lereditariet degli aplotipi. Evidenziare fratelli HLA-identici Ciascun figlio eredita una copia del cromosoma 6 da ognuno dei suoi genitori; ne consegue che anche gli aplotipi HLA derivano da ciascun genitore. Quattro sono le combinazioni aplotipiche possibili nella prole (salvo ricombinazioni). Tale schema di ereditariet importante nel predire se membri della famiglia potranno essere donatori compatibili ai fini di un trapianto. La probabilit che due fratelli possano essere HLA-identici del 25%. La probabilit che un paziente con n fratelli possa avere almeno un fratello compatibile eguale a 1-(3/4)n. Avere due fratelli offre il 44% di probabilit di avere un fratello HLA-identico, mentre averne tre offre il 58%. Anche avere molti fratelli (eccezion fatta per i gemelli omozigoti) non offrir mai il 100% di possibilit. Assenza di antigeni Di norma, entrambe le copie dei geni MHC si esprimono come antigeni, tuttavia, in certi soggetti, si pu identificare un solo antigene. Questo pu accadere se il soggetto omozigote per lallele o se non disponibile lantisiero relativo (si parla di allele blank, cio vuoto). estremamente raro che lassenza di un antigene derivi da un allele null. Un allele null dovuto a sostituzioni allinterno della regione codificante,con conseguente mancata espressione di una proteina funzionale sulla superficie cellulare. Linattivazione di un gene pu essere determinata da sostituzioni nucleotidiche, da delezioni o da inserzioni, che causano una mancata sintesi dellantigene. Nella trascrizione del fenotipo, la presenza di un allele blank viene indicata con una x (per il locus A), con una y (per il locus B) o con - (per qualsiasi locus). Per esempio, A1,x; B7,40 o A1,-;B7,40. Per determinare il genotipo corretto, si devono effettuare studi familiari.
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Figura 17.2 - I geni su ogni cromosoma costituiscono un aplotipo. Per identificare quali aplotipi possiede una persona, si deve conoscere quali antigeni presenta e anche le combinazioni ereditarie in una specifica famiglia. I risultati delle tipizzazioni indicano che il padre presenta questo fenotipo: A1,3; B7,8; Cw7-; DR15,17. Lo studio della famiglia rivela che gli aplotipi del padre sono: a = A1; Cw7; B8; DR17 e b = A3; Cw7; B7; DR15. La prole potr avere soltanto una delle quattro possibili combinazioni aplotipiche, ammesso che non siano intervenuti crossing-over. Scambi cromosomici (o crossing-over) I geni della regione HLA possono, talora, mostrare fenomeni di crossing-over, quando frazioni di materiale genetico strettamente collegato si scambiano fra i cromosomi, durante la meiosi (Figura 10.6). Le ricombinazioni vengono trasmesse alla prole, come nuovi aplotipi. La frequenza dei crossing-over correlata, almeno in parte, alla distanza fisica fra i geni. Per esempio, i loci HLA-A, HLA-B e HLA-DR sono vicini fra loro, con un 0,8% di crossing-over fra i loci A e B e un 0,5% fra quelli B e DR. Quando si eseguono studi familiari o ricerche di paternit, si deve tenere presente la possibilit di ricombinazioni. Linkage disequilibrium Il sistema MHC talmente polimorfico che il numero teorico dei possibili fenotipi maggiore dellintera popolazione umana. Inoltre, vengono continuamente scoperti e caratterizzati nuovi alleli HLA. Al 2008 (G. Reali, comunicazione personale) si conoscono 673 alleli HLA-A, 1077 HLA-B e 669 DRB1. In realt, molti aplotipi HLA sono sovrarappresentati, quando paragonati a quelli che ci si aspetterebbe se la distribuzione dei geni fosse casuale. Il fenomeno del linkage disequilibrium rende conto della discrepanza tra frequenze aplotipiche HLA, attese e osservate. Le frequenze attese degli aplotipi HLA derivano dalla moltiplicazione delle frequenze di ciascun allele. Per esempio, in soggetti caucasici, la frequenza del gene che codifica per lantigene HLA-A1 0,15 e quella del gene che codifica per HLA-B8 0,10. Ci si aspetterebbe, quindi, in questa popolazione, una frequenza dell1,5% (0,15 x 0,10 = 0,015). La reale frequenza della combinazione A1-B8 varia fra il 7 e l8%. Certe combinazioni alleliche si riscontrano, con aumentata frequenza, in differenti gruppi razziali e costituiscono gli aplotipi pi rappresentati di queste popolazioni. Tali aplotipi vengono denominati ancestrali, perch derivati da un comune, unico ascendente.
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Il pi comune aplotipo ancestrale del Nord Europa quello A1-B8-DR3-DQ2, che comprende antigeni sia di Classe I che di Classe II. Non chiaro se gli aplotipi ancestrali siano aplotipi relativamente giovani, che non hanno avuto sufficiente tempo per sottostare a ricombinazioni o se, invece, siano vecchi aplotipi resistenti alle ricombinazioni, per motivi di selezione. Il linkage disequilibrium importante negli studi di paternit, dato che le frequenze aplotipiche nella popolazione attinente pu rendere pi frequente la trasmissione di certe combinazioni geniche rispetto ad altre. Il linkage disequilibrium pu anche influire sulla probabilit di reperire donatori non apparentati per trasfusioni di piastrine HLA-compatibili o per trapianti di CSE.
2-microglobulina. Le molecole di Classe II sono composte da una catena e da una catena , entrambe attaccate alla membrana cellulare. La divisione in antigeni di Classe I e di Classe II si basa sulle funzioni, sulla distribuzione nei tessuti e sulle caratteristiche biochimiche. Caratteristiche degli antigeni di Classe I e di Classe II Gli antigeni di Classe I (HLA-A, -B e -C) hanno un peso molecolare di circa 57.000 dalton e sono formati da due catene: da una catena glicoproteica pesante (45.000 dalton), codificata da geni presenti sul braccio corto del cromosoma 6 e da una catena leggera, la 2-microglobulina (12.000 dalton), codificata da un gene portato sul cromosoma 15. La catena pesante attraversa la membrana cellulare, mentre la 2-microglobulina non attaccata alla membrana, associata alla catena pesante attraverso il dominio invariabile 3, ma non legata covalentemente ad esso (Figura 17.3). La porzione esterna della catena pesante formata da 3 domini (1, 2 e 3), dei quali i 2 pi esterni (1 e 2) sono le regioni polimorfiche,
Biochimica, distribuzione tessutale e struttura

Gli antigeni HLA sono glicoproteine di membrana. Le molecole di Classe I presentano due polipeptidi: una catena pesante, strettamente attaccata alla membrana, e una leggera, la
Figura 17.3 - Diagrammi stilizzati delle molecole MHC di Classe I e II che mostrano le catene polipetidiche e , la loro struttura a domini e le unit carboidratiche attaccate alla membrana.
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che conferiscono la specificit antigenica HLA. Le molecole di Classe I si rinvengono sulle piastrine e sulla maggior parte delle cellule nucleate dellorganismo, con alcune eccezioni, quali i neuroni, gli epiteli corneali, i trofoblasti e le cellule germinali. Soltanto quantitativi residuali si rinvengono negli eritrociti maturi, con alcuni tipi meglio espressi di altri. Alcuni polimorfismi di Classe I sono stati riconosciuti, attraverso studi sierologici, come antigeni eritrocitari e denominati antigeni Bg (sistema Bennett-Goodspeed). Le specificit Bga, Bgb e Bgc sono state identificate come gli antigeni HLA-B7, HLA-B17 e HLA-A28, rispettivamente. Le piastrine esprimono principalmente gli antigeni HLA-A e HLA-B, mentre quelli HLA-C sono presenti a livello molto basso. Gli antigeni di Classe II non sono presenti, generalmente, sulle piastrine. Gli antigeni di Classe II (HLA-DR, -DQ, e -DP) hanno un peso molecolare di circa 63.000 dalton e sono formati da due catene glicoproteiche strutturalmente simili, che attraversano, entrambe, la membrana (Figura 17.3). La porzione extracellulare di ciascuna catena possiede due domini amminoacidici, il pi esterno dei quali esprime la variabilit degli alleli di Classe II. Gli antigeni di Classe II hanno una distribuzione pi ristretta, rispetto a quelli di Classe I. Sono espressi, essenzialmente, sui linfociti B, sui monociti, sulle cellule di derivazione monocitaria, quali i macrofagi e le cellule dendritiche, nonch sulle cellule dellepitelio intestinale e delle prime cellule ematopoietiche. Vi sono espressioni di antigeni di Classe II anche su alcune cellule endoteliali, specialmente quelle delle pareti interne nel microcircolo. In generale, tuttavia, lendotelio, soprattutto quello dei grossi vasi, non esprime antigeni di Classe II, sebbene la loro presenza possa essere indotta (per esempio, durante unattivazione immune da parte di -interferon). I linfociti T non hanno antigeni di Classe II, che comunque vengono espressi, in seguito a una loro attivazione. Questi antigeni si esprimono anche, anormalmente, in corso di malattie autoimmuni o in alcune cellule neoplastiche. Nel sangue e nei liquidi organici sono stati ritrovati antigeni HLA solubili, di Classe I e di
Classe II, rilasciati da cellule: tali antigeni solubili possono giocare un ruolo nel modulare le attivit immunitarie5. I livelli degli antigeni HLA solubili aumentano nelle infezioni (compresa quella da HIV), nelle malattie infiammatorie e nel rigetto di trapianti, ma diminuiscono con il progredire delle malattie maligne. Il livello degli antigeni solubili negli emocomponenti in rapporto al numero residuo dei leucociti del donatore e alla durata della conservazione6. Essi possono essere coinvolti negli effetti immunomodulatori della trasfusione. Configurazione Con lanalisi cristallografica ai raggi X di antigeni HLA purificati, si pu ottenere una struttura tridimensionale di queste molecole. I domini esterni, che portano la variabilit amminoacidica e gli epitopi antigenici delle molecole, formano una struttura nota come tasca che lega i peptidi (o tasca combinatoria). Gli alleli definiti dal polimorfismo dei geni HLA possiedono sequenze amminoacidiche uniche e, di conseguenza, formano tasche di legame uniche, ognuna delle quali capace di legare differenti classi di peptidi. La tasca critica per gli aspetti funzionali delle molecole HLA (vedi avanti nel capito Funzione biologica).
Nomenclatura
Un comitato internazionale, sponsorizzato dallOMS, stabilisce la nomenclatura del sistema HLA. La nomenclatura viene regolarmente aggiornata, per inserirvi i nuovi alleli HLA. Gli antigeni sono indicati da un numero che segue la lettera delle varie serie (per esempio, HLA-A1 o HLA-B8). In passato, le specificit non ancora pienamente confermate portavano il prefisso w (per esempio, HLA-Aw33). Quando lidentificazione diventava definitiva, il Comitato per la Nomenclatura toglieva la w. Il Comitato si riunisce regolarmente per aggiornare la nomenclatura, riconoscendo specificit e loci genetici nuovi. Il prefisso w
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non viene pi applicato come in passato ma utilizzato: 1) per Bw4 e Bw6 allo scopo di distinguere questi antigeni pubblici dagli altri alleli al locus B, 2) per tutte le specificit del locus C, al fine di evitare confusioni con i componenti del sistema complementare e 3) per le specificit Dw e DP, che sono definite con le colture linfocitarie miste e con la tipizzazione di linfociti attivati. Le designazioni numeriche delle specificit HLA-A e HLA-B sono state assegnate, in base allordine cronologico della loro scoperta. Split Il perfezionamento delle metodiche sierologiche ha consentito che antigeni, che si ritenevano rappresentare singole specificit, potessero essere suddivisi (split) in specificit sierologicamente (e, perci, geneticamente) distinte. La designazione di un antigene, derivato di un antigene precedentemente ritenuto unico, contiene spesso il numero dellantigene padre, messo tra parentesi [per esempio, HLA-B44 (12)]. Determinanti condivisi Via via che i sieri tipizzanti sono migliorati, si evidenziato che alcuni epitopi (epitopo = parte dellantigene che lega lanticorpo) sono comuni a strutture antigeniche diverse. Gli anticorpi diretti contro questi epitopi identificano antigeni, che fanno parte di un gruppo, i cui singoli componenti potrebbero essere identificati da antisieri con unattivit pi ristretta. Gruppi cross-reattivi In aggiunta agli split , gli antigeni HLA e i gruppi antigenici possono possedere altri epitopi in comune. Gli anticorpi che reagiscono con questi determinanti condivisi possono causare, nei test sierologici delle cross-reazioni. Il termine collettivo per designare questi gruppi antigenici HLA CREG (cross-reactive group). Antigeni pubblici Le proteine HLA, oltre agli split e ai CREG, hanno reattivit comuni a molte specificit HLA.
Le sequenze amminoacidiche comuni, che identificano gli antigeni detti pubblici, sembrano rappresentare la porzione scarsamente variabile della molecola HLA. Due antigeni pubblici, ben caratterizzati, sono Bw4 e Bw6 della serie HLA-B. Lantigene Bw4 stato trovato anche in alcune molecole del locus A.Gli antigeni pubblici rivestono importanza clinica, in quanto soggetti esposti, per gravidanze o trasfusioni, ad antigeni HLA estranei possono formare anticorpi contro di loro. Un singolo anticorpo, diretto contro un antigene pubblico, pu rappresentare la somma di singoli, molteplici, anticorpi. Nomenclatura degli alleli HLA Da quando vengono impiegate sequenze nucleotidiche per indagare il sistema HLA, si identificato un numero, via via crescente, di alleli HLA, molti dei quali condividono fenotipi sierologici comuni. Il requisito minimo per designare un nuovo allele, la sequenza degli esoni due e tre per la Classe I e dellesone due per la Classe II (DRB1). Questi esoni sono quelli che codificano le parti amminoacidiche variabili e conferiscono la specificit antigenica. stata adottata una nomenclatura uniforme che considera il locus, la specificit sierologica pi importante e lallele evidenziato dalla tipizzazione molecolare. Per esempio, lisoelettrofocalizzazione, il sequenziamento amminoacidico e quello nucleotidico hanno identificato singole varianti di HLA-DR4. La prima variante HLA-DR4 evidenziata stata designata DRB1*0401, con ci indicando il locus (DR), la proteina (la catena 1), un asterisco che avverte che segue il nome di un allele, la specificit sierologica maggiore (04 per HLADR4), il numero dellallele (variante 01). Per gli alleli di Classe I, il nome del locus (per esempio HLA-B) seguito da un asterisco e poi da un certo numero di cifre. Le prime due cifre corrispondono alla specificit sierologica di un antigene. La terza e la quarta cifra si usano per indicare i sottotipi, essendo i numeri assegnati in ordine cronologico della determinazione della sequenza del DNA. B*2704 indica, quindi, il locus B, la specificit sierologica di B27 e che si tratta del quarto allele descritto in questa
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famiglia (Tabella 17.1). Questa nomenclatura pu contemplare alleli silenti, per esempio quelli che hanno sequenze DNA differenti ma sequenze amminoacidiche identiche e gli alleli null.
Funzione biologica
Lessenziale funzione biologica del sistema HLA discriminare fra il self e il non-self. Tale discriminazione si realizza attraverso linterazione dei linfociti T con i peptidi antigenici. I linfociti T interagiscono con lantigene soltanto quando il recettore delle cellule T (TCR, T-cell receptor) coinvolge sia la molecola HLA che il peptide antigenico, entrambi contenuti nella tasca combinatoria. Questo fenomeno noto come restrizione MHC. Nel timo, si selezionano i linfociti T il cui TCR si lega a una molecola HLA propria (selezione positiva), con leccezione di quei linfociti, il cui TCR lega anche peptidi provenienti da un antigene proprio, nel qual caso i linfociti vengono soppressi (selezione negativa). Tuttavia, alcune cellule T autoreattive sfuggono alla selezione negativa. Se non vengono funzionalmente inattivate (per esempio, attraverso un meccanismo di energia), le cellule T autoreattive possono essere coinvolte in processi autoimmunitari (vedi Capitolo 11).
Ruolo delle molecole di Classe I Le molecole di Classe I sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico e inserite insieme agli antigeni peptidici nella tasca combinatoria. I peptidi antigenici, che entrano nella tasca combinatoria riservata agli antigeni di Classe I, hanno, caratteristicamente, la lunghezza di otto o nove amminoacidi e derivano da proteine endogene. Tali proteine endogene, che possono essere normali, alterate (come quelle neoplastiche) o di origine virale (come quelle che si rinvengono in cellule infettate), sono degradate nel citosol (sostanza gelatinosa allinterno delle cellule) da parte di una proteasi multifunzionale di grosse proporzioni e trasferite allinterno del reticolo endoplasmatico da un trasportatore coinvolto nei processi di elaborazione dellantigene. I geni per la proteasi e per il trasportatore sono entrambi localizzati allinterno dellMHC. Le molecole di Classe I sono trasportate alla superficie delle cellule quando sono disponibili a interagire con i linfociti T CD8-positivi. Se il recettore di un linfocita T in grado di legare il peptide antigenico, nel contesto della molecola di Classe I che lo presenta, allora questo legame attiva le propriet citotossiche della cellula T, che aggredir la cellula, innescando una tipica risposta infiammatoria.
Tabella 17.1 - Nomenclatura HLA (aggiornata a luglio 2008 da G. Reali) Locus HLA-A HLA-B HLA-C DRA DRB1 DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 Specificit antigenica da A1 a A80 da B7 a B81 da Cw1 a Cw10 da DR1 a DR18 da DQ1 a DQ9 da DPw1 a DPw8 Alleli da A*0101 ad A *8001 da B*0702 a B *8301 da Cw0102 a Cw1802 da DRA*0101 a DRA*0102 da DRB1*0101 a DRB*1608 da DQA1*0101 a DQA*0601 da DQB*10501 a DQB*0402 da DPA1*0103 a DPA1*0401 da DPB1*0101 a DPB1*8901 N di alleli identificati 673 1.077 360 3 669 34 93 27 128 Collocazione polipeptidica

1 1 1
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La presentazione dellantigene, da parte delle molecole di Classe I, particolarmente importante nella difesa contro i virus e contro le neoplasie. Le cellule tumorali che non esprimono antigeni di Classe I sfuggono a questo tipo di immunosorveglianza. Ruolo delle molecole di Classe II Anche le molecole di Classe II sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico, ma i loro peptidi antigenici non sono inseriti nella tasca combinatoria. Vi inserita, invece, una catena invariabile. La molecola della catena invariabile viene trasferita a un endosoma (corpuscolo vescicolare della cellula, il cui compito quello di favorire lendocitosi), dal quale viene rimossa da una molecola specializzata di Classe II, denominata DM (anche il locus per la codifica di DM allinterno dellMHC, HLA-DM). Un peptide antigenico di Classe II si inserisce, quindi, nella tasca combinatoria. I peptidi antigenici di Classe II che entrano nella tasca combinatoria hanno una lunghezza da 12 a 25 amminoacidi e derivano da proteine, che sono assunte dalla cellula per endocitosi (proteine esogene). Tali proteine, che possono essere proteine proprie normali o derivate da patogeni, quali i batteri, vengono degradate a peptidi da enzimi in un ciclo endosomico. Le molecole di Classe II sono, poi, trasferite sulla superficie cellulare, dove sono disponibili per interagire con i linfociti T CD4-positivi, i quali, in risposta, secernono citochine immunostimolanti. Il meccanismo importante, soprattutto per la produzione di anticorpi.
particolare metodo per lindividuazione e la tipizzazione degli antigeni HLA (Tabella 17.2). Metodi basati sul DNA La tipizzazione basata sul DNA presenta parecchi vantaggi rispetto a quelle sierologiche e cellulari: alta sensibilit e specificit, piccoli volumi del campione, minor tempo di esecuzione, ridotto a poche ore, nessuna necessit di unespressione antigenica alla superficie cellulare o di una vitalit della cellula. Sebbene le metodiche sierologiche permettano di distinguere, rapidamente, fra circa 21 specificit, quelle, ad alta risoluzione, basate sul DNA possono individuare oltre 368 alleli. Test basati sulla reazione polimerasica a catena La reazione polimerasica a catena (PCR, polymerase chain reaction ) consente lamplificazione di ampi tratti di un particolare segmento di DNA. La tipizzazione a bassa o intermedia risoluzione individua, con molta accuratezza, le specificit HLA sierologiche equivalenti: per esempio, distingue chiaramente DR15 da DR16, mentre quella ad alta risoluzione distingue i singoli alleli, per esempio, DRB1*0101 da DRB1*0102. Si sono messe a punto numerose metodiche basate sulla PCR, due delle quali vengono descritte qui di seguito. Sonde oligonucleotidiche. La prima tecnica usa le SSOP (Sequence-Specific Oligonucleotide Probes, cio sonde oligonucleotidiche specifiche per sequenze) ed nota anche come ibridazione ASO ( Allele-Specific Oligonucleotide ) 8 . Un prodotto della PCR, amplificato dal DNA genomico, si applica a una membrana o a un filtro sui quali si ibridizzano le sonde. Queste brevi sonde di DNA si ibrideranno con le sequenze che sono loro complementari e identificheranno gruppi di alleli o singoli alleli. I vantaggi sono che tutti i loci di Classe II possono essere tipizzati e si possono ottenere informazioni molto specifiche. Gli svantaggi riguardano le difficolt di interpretazione dei risultati e la necessit di usare numerosi filtri e di eseguire amplificazioni multiple, seguite dalle ibridazioni. Una variante a questa tecnica, libridazione inversa o dot blot (letteralmente, legame
Individuazione degli antigeni e degli alleli HLA

Le tecniche per individuare e investigare gli antigeni e gli alleli HLA rientrano in tre gruppi: test molecolari (DNA), test sierologici e test cellulari. Le procedure dei test, pi frequentemente utilizzati, sono disponibili nel Technical Manual della Societ Americana per lIstocompatibilit e lImmunogenetica. A seconda delle differenti situazioni cliniche, pu essere preferibile un
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Tabella 17.2 - Metodiche di tipizzazione HLA e loro applicazioni cliniche Metodo SSP (PCR) Sequenziamento del DNA Ibridazione SSOP diretta Ibridazione SSOP inversa Microlinfocitotossicit Applicazioni cliniche Trapianto di organi solidi o di CSE da donatori familiari o non apparentati Livello A livello seriologico e allelico, ampia risoluzione con primer
Trapianto di CSE da donatori non apparentati A livello allelico risoluzione di problemi di tipizzazione con altri metodi, caratterizzazione di nuovi alleli Trapianto di organi solidi e di CSE (pu consentire un ampio numero di test) Trapianto di organi solidi e di CSE da donatori familiari o non apparentati Trapianto di organi solidi, valutazione della refrattariet piastrinica, tipizzazione (della sola Classe I) di piastrine di donatori e riceventi A livello sierologico e allelico A livello sierologico, ampia risoluzione con molte sonde Specificit sierologiche
SSP-PCR = reazione polimerasica a catena con innesco sequenza-specifico (Sequenze-specific priming-polymerase chain reaction); SSOP = sonda oligonucleotidica sequenza-specifica (Sequence-specific oligonucleotide pobe); CSE = cellule staminali ematopoietiche.
puntiforme), elimina la necessit di ibridazioni e di filtri multipli, con lincorporazione nel prodotto della PCR, durante la fase di amplificazione del DNA genomico, di una sostanza che faccia da segnale (quale la biotina). Il prodotto della PCR viene, poi, ibridizzato su una membrana che contiene tutte le pertinenti SSOP e libridazione viene rivelata dal segnale incorporato. Negli ultimi anni, comparsa, nei laboratori di tipizzazione, una nuova metodica per stabilire i genotipi HLA: il metodo utilizza sonde oligonucleotidiche in fase solida. Il test a microsfere una SSOP per la tipizzazione degli antigeni HLA-A, -B e -DR. Questo metodo ha anche la capacit di una tipizzazione, a bassa o intermedia risoluzione, basata sul DNA, riducendo, nel contempo, i tempi di lavorazione dei campioni. Primer sequenza-specifici. La seconda tecnica maggiormente utilizzata impiega coppie di primer specifici per sequenze o SSP (Sequence-Specific Primers), che individuano e amplificano una particolare sequenza di DNA9.
Il metodo richiede lesecuzione di molte PCR, nelle quali ogni reazione specifica per un allele o per un gruppo di alleli. La visione diretta degli alleli amplificati si ha dopo unelettroforesi in gel di agarosio. Dato che lSSP ha questi specifici obiettivi, la presenza del materiale amplificato indica la presenza del corrispondente allele. Per determinare la presenza di un allele HLA si esaminano le PCR positive o negative. Sono disponibili set di coppie di primer per tipizzare tutti gli antigeni HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ e -DP. Tipizzazioni basate sulle sequenze Il sequenziamento, ad alta risoluzione, degli acidi nucleici di antigeni HLA genera sequenze a livello allelico, che vengono utilizzate per caratterizzare nuovi alleli. Con una disponibilit sempre maggiore e la facilit duso dei sequenziatori automatici, le tipizzazioni basate sulle sequenze sono diventate routinarie nei laboratori HLA.
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Test sierologici Linfocitotossicit Per tipizzare gli antigeni HLA-A, -B, -C, -DR e -DQ, si pu impiegare il test di microlinfocitotossicit. Nel test si utilizzano linfociti, perch facilmente ottenibili dal sangue periferico anticoagulato e perch danno, a differenza dei granulociti, risultati riproducibili. Si possono anche usare linfociti ottenuti dai linfonodi o dalla milza. I primi sieri tipizzanti sono stati ottenuti da donne multipare; sono anche disponibili alcuni sieri monoclonali murini. I sieri a specificit HLA nota sono sistemati nei pozzetti di una micropiastra test. Ad ogni pozzetto si aggiungano i linfociti in esame, poi si aggiunge complemento di coniglio e, se una quantit sufficiente di anticorpi si legata alla membrana linfocitarie, si attiver la cascata complementare, con attacco alla superficie cellulare e conseguente linfocitotossicit. Il danno cellulare pu essere visionato dallaggiunta di un colorante: le cellule che non hanno anticorpi adesi alla membrana non attivano il complemento e la mancanza di lesioni alla membrana mantiene fuori della cellula il colorante vitale, mentre le cellule con membrana danneggiata gli permetteranno di entrare. Lindividuazione dellesclusione o dellassorbimento del colorante viene effettuata impiegando un microscopio a contrasto di fase. Qualora sia disponibile un microscopio a fluorescenza, si possono utilizzare coloranti vitali fluorescenti. Dato che gli antigeni HLA-DR e HLA-DQ sono rinvenibili sui linfociti B e non su quelli T (se non attivati), le tipizzazioni per tali antigeni richiedono, di norma, che la popolazione linfocitaria iniziale venga manipolata, per ottenere un arricchimento in cellule B. Ci si ottiene, caratteristicamente, con luso di biglie magnetiche, alle quali sono stati fatti aderire anticorpi monoclonali anti-cellule B. Linterpretazione dei risultati dei test sierologici richiede abilit ed esperienza. necessaria la presenza di pozzetti contenenti sieri a specificit nota, nonch lesecuzione di controlli di qualit dei reagenti, specialmente per quanto riguarda lattivit del complemento, che viene impiegato per indurre la linfocitotossicit.
Inoltre, lattribuzione di un antigene si pu conseguire soltanto sulla base delle reazioni ottenute con antisieri a specificit multipla, considerato che sono pochi gli anticorpi monospecifici, da poter essere impiegati da soli. Alle difficolt proprie di una tipizzazione sierologica accurata, contribuiscono molti fattori: lestremo polimorfismo del sistema HLA, le variabilit delle frequenze antigeniche nei diversi gruppi razziali, laffidabilit dei sieri e delle cellule, le complessit collegate allesistenza di splits, di CREG e di antigeni pubblici. Ricerca di anticorpi in pazienti Il test di microlinfocitotossicit pu essere impiegato per analizzare campioni di sieri contro cellule selezionate. Ci viene fatto, di routine, nei test di compatibilit HLA, consistenti nellesaminare il siero di un potenziale ricevente contro linfociti totali (o suddivisi in linfociti T e B) di un possibile donatore. Un test di microlinfocitotossicit che usi unantiglobulina rappresenta una variante, utile per accrescere la sensibilit del crossmatch. Analizzare il siero di un paziente contro un pannello di 30-60 cellule (o pi ampio) pu verificare lampiezza di unalloimmunizzazione HLA. La percentuale di cellule del pannello, contro le quali il ricevente ha prodotto anticorpi citotossici, si indica come livello PRA ( Panel Reactive Antibodies). La determinazione del PRA pu risultare utile nello studio delle reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche, nella gestione delle refrattariet piastriniche, nel seguire i pazienti in attesa di trapianti di organi solidi da cadavere. Questo screening anticorpale non permette soltanto di individuare la presenza di anticorpi ma anche di stabilirne la specificit. Altre tecniche per individuare la presenza di anticorpi sono rappresentate da un test ELISA con antigeni HLA in fase solida o da un test citofluorimetrico, che utilizza biglie rivestite da antigeni. Test cellulari Inizialmente, la coltura linfocitarie mista (o MLC, Mixed Lymphocyte Culture), detta anche cultura leucocitaria mista o reazione linfocitaria mista,
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stata usata per individuare le differenze genetiche nella regione di Classe II. Nella MLC, si coltivano insieme linfociti provenienti da soggetti diversi, dando loro la possibilit di riconoscere antigeni HLA-D differenti e di rispondere proliferando.
Sistema HLA e trasfusione

Antigeni e anticorpi HLA giocano un ruolo importante nelle attivit trasfusionali. Sono, infatti, coinvolti nellimmunizzazione e nelle refrattariet piastriniche, nelle reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche, nella TRALI, nella GvHD post-trasfusionale. Gli antigeni HLA sono fortemente immunogeni. In seguito a gravidanze, trasfusioni o trapianti, molto pi probabile che un normale soggetto immunocompetente formi anticorpi contro antigeni HLA piuttosto che contro antigeni di altri sistemi. Refrattariet piastrinica Lincidenza di unimmunizzazione HLA e della refrattariet piastrinica, fra i riceventi di ripetute trasfusioni di emocomponenti cellulari, varia fra il 20 e il 71%10. La refrattariet si instaura quando una trasfusione di un concentrato piastrinico, conservato correttamente, non aumenta il numero di piastrine nel ricevente. La refrattariet piastrinica pu essere dovuta a fattori clinici quali sepsi, iperpiressia, coagulazione intravascolare disseminata, farmaci, ipersplenismo, distruzione mediata del complemento, una combinazioni di queste cause o pu anche essere dovuta a cause immunologiche (vedi Capitolo 16 per informazioni pi approfondite). Sviluppo anticorpale Gli anticorpi anti-HLA sono la causa pi comune della refrattariet piastrinica, ma, in questa, possono essere coinvolti anche anticorpi diretti contro antigeni specifici delle piastrine (anti-HPA) o contro antigeni ABH. Limmunizzazione HLA pu essere dovuta a gravidanze, trasfusioni o trapianti, dato che gli antigeni estranei sono gli stessi antigeni MHC del donatore. Un esempio comune rappresentato
dalla formazione di anticorpi HLA diretti contro antigeni HLA di Classe I, che segue una trasfusione di piastrine, che, notoriamente, posseggono soltanto antigeni di tale Classe. La presenza, negli emocomponenti, di leucociti che portano antigeni di I e II Classe provoca alloimmunizzazioni. La probabilit di tale immunizzazione pu essere diminuita con la leucodeplezione degli emocomponenti o trattando gli stessi con luce ultravioletta che altera le molecole di stimolazione o deteriora lattivit delle cellule presentanti lantigene. Non chiarito il livello-soglia di leucociti richiesto per provocare una risposta alloimmune, livello che, probabilmente, varia da ricevente a ricevente. Alcuni studi hanno prospettato che 5 milioni di leucociti (per trasfusione) rappresentino una dose immunizzante. In pazienti che siano stati precedentemente sensibilizzati per gravidanze o trasfusioni, probabile che lesposizione anche a numero inferiore di leucociti allogenici provochi una risposta anamnestica. Ricerca di donatori compatibili La risposta anticorpale HLA dei soggetti trasfusi pu essere diretta contro singole specificit presenti nel donatore o contro antigeni pubblici. Pu risultare complicata una precisa caratterizzazione. Una verifica globale del grado di immunizzazione HLA si pu ottenere misurando il livello di PRA nel siero del ricevente. I pazienti refrattari alle trasfusioni di concentrati piastrinici con alto livello di PRA sono largamente immunizzati e pu essere difficile trasfonderli con piastrine. Piastrine HLA-compatibili, ottenute per aferesi, sono utili per alcuni, ma non per tutti i pazienti refrattari. Dato che difficoltoso reperire donatori compatibili per i quattro antigeni HLA in causa, le strategie al riguardo possono variare. stata enfatizzata la selezione di donatori parzialmente compatibili, basata sui CREG sierologici, ma questi donatori possono non fornire unadeguata risposta trasfusionale in vivo. Un approccio alternativo basato sulla compatibilit per le specificit pubbliche piuttosto che per gli antigeni cross-reattivi privati. Si pu dimostrare difficile avere a pronta disposizione un
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numero adeguato di donatori HLA-tipizzati. Si stimato11 che sarebbe necessario disporre di un pool da 1.000 a 3.000 (o pi) donatori, per trasfondere la maggior parte dei pazienti immunizzati. Luso di biglie rivestite da singoli antigeni pu consentire una migliore selezione, con accettabili incompatibilit12. stato raccomandato, in passato che pazienti a rischio di immunizzazione e refrattariet, siano tipizzati per gli antigeni di Classe I precocemente, nel corso della malattia, quando ancora sono presenti sufficienti linfociti, per assicurare una tipizzazione HLA attendibile. Una drastica chemioterapia rende molto difficile ottenere abbastanza cellule per una tipizzazione. Recentemente, con lavvento delle tipizzazioni molecolari, si possono determinare gli alleli HLA del paziente, usando il DNA genomico isolato da pochi leucociti o anche da cellule non ematiche (per esempio, tamponi buccali). I pazienti HLA-immunizzati rispondono spesso positivamente a piastrine compatibili, selezionate impiegando il siero del paziente contro piastrine da aferesi, in un test per la ricerca di anticorpi anti-piastrine. I crossmatch possono verificare la compatibilit nei riguardi di anticorpi HLA e piastrino-specifici13. Le piastrine HLA-compatibili sono discusse ulteriormenta al Capitolo 21. Reazioni trasfusionali febbrili non-emolitiche Nella patogenesi delle reazioni trasfusionali febbrili non-emolitiche, sono stati implicati gli anticorpi HLA, nonch quelli granulocitari e piastrino-specifici. Gli anticorpi del ricevente reagiscono con gli antigeni trasfusi, determinando il rilascio di citochine (per esempio, interleuchina-1), che provocano febbre. Le indagini sierologiche possono richiedere numerose tecniche e cellule-bersaglio da molti donatori differenti (vedi Capitolo 27). TRALI Nella TRALI (acronimo di Transfusion-Related Acute Lung Injury, cio lesione acuta polmonare correlata alla trasfusione), reazione che viene segnalata con sempre maggiore frequenza, si sviluppa un edema polmonare acuto non-cardiogeno, in seguito a una trasfusione.
La patogenesi sembra riflettere la presenza di anticorpi HLA nel sangue del donatore, i quali reagiscono e fissano il complemento ai granulociti del ricevente, determinando una grave perdita di liquido dai capillari polmonari e la comparsa di edema. Pi raramente, sono gli anti-HLA del ricevente a reagire con i leucociti del donatore (vedi Capitolo 27). Sono stati riportati casi di TRALI, causati da anticorpi del donatore contro antigeni di Classe II del ricevente. Dato che gli antigeni di Classe II non sono presenti sui neutrofili, necessario fornire una spiegazione dellattivazione dei neutrofili in tali casi. Unipotesi che siano gli antigeni di Classe II, presenti sui macrofagi polmonari del ricevente, a fornire il bersaglio per gli anticorpi che attivano il complemento. Il successivo rilascio di citochine e chemiochine determina il coinvolgimento e lattivazione dei neutrofili nel polmone14. Chimerismo e GvHD post-trasfusionale Per chimerismo, si intende la presenza di cellule del donatore nel circolo di un soggetto trasfuso. Un chimerismo persistente dopo trasfusione di sangue pu determinare linstaurarsi di una GvHD nel ricevente. Lo sviluppo di GvHD post-trasfusionale dipende da diversi fattori: il grado di compromissione immune del ricevente, il numero e la vitalit dei linfociti trasfusi, il grado di similarit HLA fra donatore e soggetto trasfuso. GvHD intervenute dopo trasfusione di emocomponenti freschi fra consanguinei ha sottolineato il ruolo del sistema HLA in materia. La Figura 17.4 illustra le condizioni di un accresciuto rischio di GvHD. I genitori hanno un aplotipo in comune. Ogni figlio ha, quindi, una possibilit su quattro di ereditare questo aplotipo da ciascun genitore e il figlio 1 , infatti, omozigote per laplotipo condiviso. Trasfusioni di sangue di questa persona a un soggetto non suo consanguineo non dovrebbe avere conseguenze negative. Se, peraltro, il figlio 1 diventa un donatore dedicato a un consanguineo eterozigote per laplotipo in causa (come i genitori o il figlio 3), il ricevente non dovrebbe riconoscere come estranei gli antigeni presenti sui linfociti e, quindi, non dovrebbe eliminarli.
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Figura 17.4 - Aplotipi HLA di una famiglia a rischio GvHD trasfusionale. A differenza della famiglia di Figura 17.2, entrambi i genitori condividono un aplotipo (HLA-A1, B8, DR17). Il primo figlio omozigote per laplotipo condiviso dai genitori e dal figlio 3. I linfociti 1 sono in grado di determinare GvHD trasfusionale se trasfusi sia ai genitori che al fratello 3. Le cellule del donatore, invece, dovrebbero riconoscere come estranei gli antigeni HLA del ricevente, dovrebbero attivarsi, moltiplicarsi e attaccare lospite. Per evitare che ci accada, si raccomanda di irradiare, prima di trasfonderlo, ogni emocomponente cellulare che proviene da un consanguineo. Altri emocomponenti speciali, come concentrati piastrinici HLA-compatibili possono presentare un aumentato rischio di GvHD. La GvHD correlata alla trasfusione interviene molto raramente, invece, dopo trasfusioni di sangue da donatori non consanguinei15. Uno stato di chimerismo stato anche invocato in casi di mantenimento della tolleranza immune in trapiantati dorgano16 e per il prolungarsi di una sensibilizzazione HLA17. Si postulato che la sclerodermia rappresenti una forma di GvHD, indotta da cellule chimeriche che hanno attraversato la placenta nel corso della gravidanza18. Reazioni trasfusionali emolitiche Listoincompatibilit stata, raramente, implicata come causa di una ridotta sopravvivenza di emazie trasfuse a pazienti con anticorpi diretti contro antigeni HLA, quali il Bga (B7), il Bgb (B17) o il Bg c (A28), che sono espressi, sia pur debolmente, sugli eritrociti (vedi Capitolo 15). Una tale incompatibilit pu non essere individuata nei test pre-trasfusionali usuali.
Sistema HLA e trapianti

Le indagini HLA sono parte integrale dei trapianti dorgano. Lestensione di queste indagini dipende dai diversi tipi di trapianto. I trapianti dorgano sono discussi, in maggior dettaglio, al Capitolo 26. Trapianti di cellule staminali ematopoietiche Da molto tempo, si stabilito che le differenze HLA fra donatore e ricevente rappresentano
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unimportante barriera al successo di un trapianto di cellule staminali ematopoietiche19. Al contrario, similarit e compatibilit sono necessarie allattecchimento del trapianto e per prevenire la GvHD, ma, un certo grado di rigetto o di GvHD rimane un problema per i riceventi di CSE allogeniche, nonostante regimi di immunosoppressione. I potenziali donatori e i riceventi vengono tipizzati per gli antigeni HLA-A, -B, -C, -DR e -DQ. Lo scopo quello di armonizzare, il pi possibile, gli alleli del candidato donatore con quelli del ricevente a livello dei loci HLA-A, -B e DRB1, essendo laccoppiamento migliore quello a livello allelico 20. Alcuni programmi di trapianto aggiungono anche i dati sugli alleli HLA-C e -DQ. Per stabilire una compatibilit ottimale per gli antigeni di Classe I e II, si ricorre alle tipizzazioni molecolari. Sebbene i fratelli HLA-identici restino la scelta migliore per i trapianti di CSE, aumenta sempre il numero di donatori non apparentati, che si ricercano fra i 5 milioni di volontari elencati nel registro del National Marrow Donor Program (NMDP). Limpiego di CSE del cordone ombelicale e di CSE che sono state depletate dalle cellule T, pu consentire maggiori incompatibilit fra donatori e riceventi21,22. Trapianti di rene e di pancreas La compatibilit ABO il fattore pi importante per determinare la sopravvivenza immediata di un rene trapiantato. Dato che gli antigeni ABH sono espressi, in vario grado, su tutte le cellule dellorganismo, lorgano ABO incompatibile trapiantato viene in contatto, continuamente, con gli anticorpi ABO del ricevente. Di particolare importante lespressione degli antigeni ABH sugli endoteli vascolari, la vascolarizzazione del trapianto il punto di rigetto pi comune. Di solito, donatore e ricevente sono indagati per gli antigeni ABO, HLA-A, -B, -DQ; di solito si testano anche gli antigeni HLA-C e -DQ. Prima di passare allintervento, richiesto un crossmatch fra il siero del ricevente e i linfociti del donatore. Gli Standard per i Test di Istocompatibilit della
ASHI (American Society for Histocompatibility and Immunogenetics) richiedono che questa prova di compatibilit sia effettuata utilizzando un metodo pi sensibile della microlinfocitotossicit di routine, impiegando incubazioni prolungate, ripetuti lavaggi, uso di reagenti antiglobulinici o la citometria di flusso. Questultima la metodica pi sensibile ed particolarmente utile, perch pu predire un rigetto precoce e una funzione degradata dellinnesto, a loro volta in grado di predire un rigetto cronico o una sopravvivenza a lungo termine del trapianto24. Nei riceventi un nuovo trapianto di rene da cadavere, il tasso di sopravvivenza a 7 anni, con limpiego della citometria a flusso nel crossmatch utilizzato per selezionare il donatore di rene, risultato paragonabile a quello di un primo trapianto di rene da cadavere (68 contro 72%) e significativamente migliore di quello relativo a pazienti ritrapiantati, per i quali si era utilizzato una prova di compatibilit in citotossicit-antiglobulina (45%)25. Dato che le risposte anticorpali HLA sono dinamiche, i sieri usati per i crossmatch sono ottenuti entro le 48 ore dallintervento e conservati, allo stato congelato, per ogni eventuale esame successivo. Unincompatibilit alla prova crociata, eseguita con linfociti totali o con linfociti T, controindica il trapianto di rene. Non chiaro il significato di una prova positiva con linfociti B. Il siero di un paziente in attesa di trapianto di rene da cadavere viene testato, a intervalli regolari, per stabilire il grado di alloimmunizzazione, determinandone il PRA. Molti laboratori, per di pi, identificano anche le specificit degli anticorpi. Se, in un ricevente, sidentifica la specificit dellanticorpo, pratica comune evitare lantigene corrispondente, quando si tratta di collocare il rene di un donatore deceduto. I campioni di siero utilizzati per i test periodici vengono, di solito, congelati. I campioni a livello PRA pi alto sono, di solito, utilizzati insieme al campione pre-trapianto nella prova crociata finale. Si discussa la necessit di prove crociate prospettiche per i riceventi che non presentano alcuna sensibilizzazione HLA. Un rapido trapianto, con tempi dischemia fredda ridotti, pu risultare
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di maggior beneficio al ricevente rispetto al crossmatch, se: 1) si usa un metodo di ricerca degli anticorpi particolarmente sensibile, quale la citometria a flusso26,27 e 2) assolutamente certo che il paziente non ha subito alcun evento sensibilizzante(per esempio, unimmunizzazione o una trasfusione entro 2 settimane prima, oppure, in ogni tempo, da quando il siero stato studiato). Lapproccio a trapianti di rene da donatore vivente diverso. In passato, quando tali trapianti erano numerosi, si eseguivano MLC fra i linfociti del donatore e quelli del ricevente; oggi, ci avviene raramente. La compatibilit HLA fra il ricevente e il donatore (vivente o cadavere) di rene contribuisce a una sopravvivenza del trapianto a lungo termine e diminuisce le probabilit di un rigetto cronico. Nel 1996, il tasso di sopravvivenza dellinnesto proiettato a 20 anni era del 57% per donatori fratelli compatibili per due aplotipi, del 30% per donatori consanguinei compatibili per un aplotipo e del 18% per donatori cadaveri28. Per donatori cadaveri senza incompatibilit con il ricevente per HLA-A, -B e -DR, la sopravvivenza del trapianto proiettata a 20 anni era del 40%. Sorprendentemente, la sopravvivenza per donatori viventi non apparentati simile a quella relativa a donatori consanguinei29. Di recente, il tasso di sopravvivenza a un anno per trapianti da donatori viventi o da cadaveri era, rispettivamente, del 93,9% e dell87,7% e lemivita di un trapianto renale da donatore vivente e da donatore cadavere era, rispettivamente, di 21,6 anni e di 13,8 anni30. Altri trapianti di organi solidi Per i trapianti di fegato, cuore, polmone e cuore/polmone, la compatibilit ABO resta essenziale per la scelta del donatore e la determinazione, prima del trapianto, di tale compatibilit vincolante. anche richiesta la tipizzazione HLA-A, -B e -DR del candidato ricevente e, sempre prima del trapianto, deve essere disponibile una prova crociata qualora il ricevente abbia mostrato una pre-sensibilizzazione, eccetto che nei casi di
massima urgenza. I livelli di compatibilit HLA correlano con la sopravvivenza del cuore trapiantato ma, tale compatibilit si dimostrata difficile da individuare31.
Test di paternit e altre indagini forensi

La tipizzazione HLA (in particolare quella molecolare) si dimostrata utile per le indagini forensi. Nei test di paternit, essa in grado di escludere, da sola, circa il 90% dei maschi falsamente accusati. Insieme alle tipizzazioni eritrocitarie, il tasso di esclusione sale al 95% e supera il 99%, quando si tipizzano enzimi eritrocitari e proteine sieriche. Nei calcoli si utilizzano le frequenze aplotipiche piuttosto che quelle geniche, dato che il linkage disequilibrium tanto comune nel sistema HLA. , comunque, importante tenere presenti le differenze razziali, che esistono nelle frequenze aplotipiche. Deve essere presa in considerazione anche la possibilit di ricombinazioni. Altri test, basati sul DNA, utili ai fini legali, sono quelli che identificano alleli con un numero variabile di ripetizioni a tandem di identiche corte sequenze nucleotidiche (i cosiddetti short tandem repeats o STR) o alleli con variazioni del numero di STR, che interessano altri polimorfismi genetici, non HLA. I test molecolari consentono le identificazioni personali, utilizzando campioni estremamente piccoli di liquidi o di tessuti, quali capelli, cellule epiteliali, sperma.
HLA e malattie
Per alcune malattie, soprattutto per quelle che riconoscono una eziologia autoimmune, esiste un associazione fra fenotipo HLA e la condizione morbosa32-34 (Tabella 17.3). Le malattie associate allHLA hanno molti aspetti in comune. Sono note per essere (o sospettate di essere) ereditarie, hanno un decorso clinico contraddistinto dallalternarsi di esacerbazioni e di remissioni, hanno (usualmente) le caratteristiche delle malattie autoimmuni e la loro
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Tabella 17.3 - Associazioni HLA-malattie Malattia Morbo celiaco Spondilite anchilosante Narcolessia Tiroidite subacuta Diabete tipo I Sclerosi multipla Artrite reumatoide Artrite reumatoide giovanile Morbo di Graves Antigeni HLA DQ2 B27 DQ6 B35 DQ8 DR15, DQ6 DR4 DR8 DR17 Rischio relativo32-37 >250 >150 >38 14 14 12 9 8 4 anchilosante. Altra situazione: la narcolessia fortemente associata allallele HLA DQB1*060237. Come nel caso precedente, oltre il 90% degli affetti da narcolessia possiede lallele DQB1*0602, ma soltanto una minoranza di soggetti con questo marcatore sviluppa la malattia. Il grado di associazione fra HLA e malattie spesso descritto in termini di rischio relativo, che misura quante volte di pi una data malattia colpisce i soggetti con uno specifico tipo HLA, rispetto ai soggetti che non hanno lo specifico tipo HLA. Il calcolo del rischio relativo si basa sul rapporto del prodotto incrociato di una tavola di contingenza 2 x 2. Tuttavia, dato che il sistema HLA estremamente polimorfico, esiste unelevata possibilit di trovare unassociazione fra un antigeni HLA e una malattia soltanto per caso. Il calcolo dei rischi relativi, che riguardano lassociazione HLA-malattie, complesso e viene tipicamente eseguito impiegando la modifica introdotta da Haldane nella formula di Woolf38,39. I valori del rischio relativo di alcune malattie associate agli antigeni HLA sono riportate in Tabella 17.3.
esatta eziopatogenesi ignota. Si sono accumulate evidenze che le stesse molecole HLA siano implicate nella suscettibilit alla malattia. Per esempio, la resistenza alla malaria cerebrale il risultato di una forte risposta delle cellule T citotossiche a particolari peptidi malarici, che sono ristretti da due specifiche molecole HLA (sistemati allinterno della tasca combinatoria)35. Un altro meccanismo, che potrebbe condurre allassociazione fra un fenotipo HLA e una malattia, la presenza di eterodimeri di Classe I e di Classe II codificati da uno specifico allele che presenta, preferenzialmente, autoantigeni ai recettori delle cellule T. Laplotipo ancestrale A1-B8-DR3-DQ2, discusso in precedenza a proposito del linkage disequilibrium, associato alla suscettibilit al diabete di tipo I, al lupus, al morbo celiaco, allimmunodeficienza comune variabile, alla deficienza di IgA, alla miastenia grave e anche a un decorso accelerato dellinfezione da HIV, probabilmente per la presenza di geni multipli36. La tipizzazione HLA ha, tuttavia, una valenza limitata nellassegnare il rischio per molte malattie, perch la loro associazione incompleta, dando spesso risultati falsamente negativi o falsamente positivi. Lassociazione fra HLA-B27 e la spondilite anchilosante , a proposito di soggetti caucasici, altamente istruttiva: pi del 90% dei pazienti affetti possiede lantigene HLA-B27. Daltro canto, la specificit bassa: soltanto un 20% dei soggetti con lantigene B27 svilupper la spondilite
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Capitolo 18: Esami pretrasfusionali
Capitolo 18
Esami pre-trasfusionali
Lo scopo delle indagini pre-trasfusionali quello di selezionare emocomponenti tali da non causare danno al ricevente e che, una volta trasfusi, abbiano un sopravvivenza normale. Se eseguite correttamente, le indagini pre-trasfusionali sono in grado di confermare la compatibilit ABO tra lemocomponente ed il ricevente e di evidenziare la maggior parte degli anticorpi non ABO clinicamente significativi. Gli Standard AABB per le Banche de Sangue e per i Servizi Trasfusionali1 prevedono che prima della consegna degli emocomponenti per la trasfusione, siano eseguite le seguenti procedure: identificazione positiva del ricevente e dei relativi campioni di sangue; determinazione del gruppo ABO e tipo Rh sul sangue del ricevente; ricerca di anticorpi anti-eritrocitari clinicamente significativi, nel siero o plasma del ricevente; confronto tra i risultati ottenuti sul campione del ricevente con quelli di precedenti registrazioni; conferma del gruppo ABO degli emocomponenti contenenti eritrociti; conferma del tipo Rh degli emocomponenti Rh negativi, contenenti eritrociti; selezione di emocomponenti di gruppo ABO e tipo Rh appropriati per il ricevente; esecuzione di un crossmatch sierologico o computerizzato; etichettatura degli emocomponenti con i dati relativi al ricevente;
Richieste trasfusionali
Il modulo di richiesta trasfusionale pu essere cartaceo o trasmesso tramite per via informatica e deve contenere le informazioni sufficienti a garantire lidentificazione sicura del ricevente. Gli Standard1(p36) stabiliscono che sul modulo siano riportati almeno due elementi identificativi indipendenti fra loro. Tali elementi possono essere rappresentati dal cognome e nome di battesimo del ricevente, dalla sua data di nascita, da un codice individuale o altro specifico sistema di identificazione. Altre informazioni necessarie per la valutazione della richiesta comprendono il tipo e la quantit dellemocomponente desiderato, gli eventuali trattamenti specifici quali lirradiazione, il sesso e let del ricevente, (42 CFR 493.1241) ed il nome del medico richiedente. La diagnosi e lanamnesi relativa a precedenti trasfusioni e gravidanze, possono risultare utili in presenza di problemi immunoematologici. Ogni Struttura Trasfusionale deve avere una procedura scritta che stabilisca i criteri di accettabilit delle richieste trasfusionali. Le richieste che non riportino le suddette informazioni, o siano poco accurate o illeggibili, non devono essere accettate1(p36) . Eventuali richieste telefoniche possono essere accettate in situazioni di emergenza, ma devono essere documentate, ad esempio attraverso la compilazione di un registro telefonico, e devono essere seguite dal successivo invio, entro 30 giorni, del modulo di richiesta correttamente compilato2.
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Identificazione del ricevente La raccolta e la corretta identificazione dei campioni di sangue del ricevente rappresentano elementi fondamentali per la sicurezza della trasfusione. La maggior parte delle reazioni trasfusionali di tipo emolitico sono la conseguenza di errori di identificazione del ricevente o dei relativi campioni di sangue3,4. Il personale che preleva il campione deve identificare con sicurezza il ricevente. Ogni Struttura Trasfusionale deve utilizzare qualunque mezzo possibile e deve implementare comportamenti e procedure idonei per la corretta identificazione del ricevente e dei relativi campioni di sangue. La maggior parte degli ospedali identificano i pazienti tramite un braccialetto di identificazione. Normalmente tale braccialetto viene applicato al polso del paziente prima dellesecuzione del prelievo e viene mantenuto in tale sede fino alla dimissione del paziente stesso. I dati anagrafici presenti sul campione di sangue devono essere confrontati e devono essere corrispondenti a quelli riportati sul braccialetto; tali dati verranno riportati sugli emocomponenti assegnati e, al momento della trasfusione, dovranno essere nuovamente confrontati e corrispondere a quelli riportati sul braccialetto. Alcuni ospedali utilizzano un proprio braccialetto di identificazione, altri invece, modelli reperibili in commercio, con laggiunta di un codice specifico della Struttura Trasfusionale allo scopo di consentire lidentificazione univoca del ricevente. I sistemi commerciali possono presentare caratteristiche differenti: numeri con codice-colore su braccialetti, provette e unit, braccialetti idonei per la stampa di etichette, sistemi con codici a barre che consentono lidentificazione positiva del paziente e dei relativi campioni di sangue. Le procedure ospedaliere generalmente prevedono che gli addetti ai prelievi di sangue effettuino il prelievo dei campioni solo a pazienti forniti di un braccialetto di identificazione. possibile tuttavia, in alcune circostanze, che il paziente non possa essere fornito del braccialetto e in tal caso si rendono necessarie misure alternative di riconoscimento positivo del paziente stesso. Luso del braccialetto difficoltoso in
presenza di ustioni estese su tutta la superficie corporea, nel caso di prematuri gravi, o quando il braccialetto non sia accessibile, come ad esempio, nel corso di interventi chirurgici. Alcuni protocolli prevedono che i dati identificativi del paziente possano essere localizzati in sedi alternative al polso, quali caviglia o fronte, e che qualora, nel corso dellintervento chirurgico il braccialetto sia inaccessibile, possano essere utilizzate modalit alternative di riconoscimento. tuttavia importante ricordare a tutti gli addetti, che le trasfusioni non devono essere effettuate a pazienti per i quali non sia stato possibile effettuare con sicurezza il riconoscimento positivo. Nel caso in cui lidentit del paziente sia sconosciuta, pu essere utilizzata una modalit di identificazione di emergenza. Il codice di identificazione deve essere applicato al paziente e applicato o riprodotto sui campioni di sangue. Tale codice di emergenza dovr successivamente essere sempre riportato, abbinato al nome del paziente stesso quando questo sar riconosciuto e al codice attribuito al paziente dalla struttura ospedaliera. Leventuale utilizzo alternativo di mezzi di identificazione rappresentati da pseudonimi o nomi riservati, deve essere regolato in maniera dettagliata dalla struttura ospedaliera attraverso procedure idonee. I pazienti ambulatoriali possono anchessi essere identificati utilizzando un apposito braccialetto. Mezzi alternativi di identificazione positiva del paziente sono rappresentati dalla patente di guida o altri documenti identificativi muniti di fotografia. Ogniqualvolta sia possibile, si deve chiedere al paziente di dichiarare le proprie generalit e di dare conferma circa la data di nascita e la residenza. Nel caso in cui emergano delle discrepanze andr chiarita con certezza lidentit del paziente e solo successivamente potr essere effettuato il prelievo di sangue. Lidentificazione dei campioni di sangue utilizzati per gli esami eseguiti nel periodo precedente il ricovero deve soddisfare gli stessi criteri adottati per i pazienti ricoverati sottoposti alla trasfusione; anche in tale circostanza non deve sussistere
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Capitolo 18: Esami pre-trasfusionali
alcun dubbio riguardo lidentit del paziente e dei relativi campioni di sangue. Le strutture ospedaliere hanno escogitato diversi meccanismi per lidentificazione certa dei pazienti, al momento del ricovero in day surgery, quando i relativi campioni di sangue sono stati raccolti nei giorni o settimane precedenti lintervento chirurgico. Una prima opzione quella di dotare il paziente di un braccialetto didentificazione5. Unaltra possibilit per far s che risultati degli esami di pre-ricovero siano validi ai fini trasfusionali, consiste nellutilizzare un numero identificativo unico sui campioni di sangue e sul modulo di identificazione che il paziente deve consegnare il giorno del ricovero. Una procedura alternativa consiste nel posizionare il braccialetto utilizzato al momento della raccolta del campione nella cartella clinica del paziente. Questo braccialetto dovr essere applicato al polso del paziente al momento del ricovero per lintervento chirurgico, dopo la sua identificazione con una procedura idonea6. Qualunque sia il metodo utilizzato, questo deve essere ben conosciuto a tutti coloro che eseguono i prelievi dei campioni e deve essere applicato di routine. Idealmente, le procedure didentificazione che vengono utilizzate per le trasfusioni dovrebbero rappresentare una pratica univoca nellidentificazione dei pazienti per qualunque altro trattamento terapeutico. Etichettatura del campione Chi ha eseguito il prelievo, prima di allontanarsi dal letto del paziente, deve indicare sulletichetta del campione di sangue almeno due elementi identificativi indipendenti del paziente stesso e la data in cui stato eseguito il prelievo. possibile utilizzare sia etichette scritte a mano che etichette prestampate, purch le informazioni riportate su di esse corrispondano a quelle riportate sul braccialetto e sul modulo di richiesta del prelievo. Colui che ha eseguito il prelievo deve essere chiaramente identificabile, attraverso la firma sulletichetta o sul modulo di richiesta del prelievo oppure tramite i dati contenuti nel sistema informatico.
Controllo presso il Centro Trasfusionale della corretta identificazione del campion e Quando il campione perviene al laboratorio, il personale deve controllare che i dati riportati sulletichetta della provetta corrispondano a quelli del modulo di richiesta. Nel caso in cui si riscontrino discrepanze o vi siano dubbi sullidentit del paziente, deve essere richiesto un nuovo prelievo di sangue (1p37). Non devono essere accettate provette con dati incompleti o con etichette sulle quali siano state fatte delle correzioni. Ogni laboratorio deve definire delle procedure circostanziate relativamente alle informazioni richieste per lidentificazione del campione e per la gestione dei campioni non conformi.
Campioni di sangue
Le indagini pre-trasfusionali possono essere eseguite indifferentemente sul siero o sul plasma. Per le metodiche che utilizzano la tecnologia gel, preferibile tuttavia il plasma. Nei campioni di sangue non perfettamente coagulati possono essere presenti piccoli coaguli di fibrina che intrapopolano i globuli rossi, dando origine ad aggregati difficilmente differenziabili dagli agglutinati. Il plasma di pazienti con alti livelli di fibrinogeno o con disprotidemia pu comportare la formazione di impilamenti ( rouleaux ) che possono essere erroneamente scambiati per agglutinati. La presenza di fibrina pu costituire un problema quando si impieghino campioni che coagulano con difficolt, come si osserva in pazienti in trattamento eparinico. In tali casi per ottenere la formazione di un buon coagulo possibile aggiungere trombina o solfato di protamina. Il campione di sangue pu essere prelevato da una linea di infusione. In tal caso per necessario, prima di raccogliere il campione di sangue, lavare il deflussore con soluzione fisiologica e scartare i primi 5 mL di sangue o un volume di sangue equivalente al doppio di quello contenuto nei tubi, per evitare che sostanze contaminanti possano interferire con le indagini sierologiche.7
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Aspetto del campione Laspetto del campione di siero o plasma pu creare difficolt nellevidenziare lemolisi conseguente alla reazione antigene-anticorpo. Ogni qualvolta sia possibile, un campione emolizzato deve essere sostituito con un nuovo campione. I test effettuati con sieri lipemici possono essere interpretati con difficolt. Occasionalmente tuttavia pu essere necessario esaminare campioni di siero o plasma emolitici o iperlipemici. Leventuale presenza di emolisi nel campione deve essere segnalata nella documentazione relativa al prelievo, al fine di differenziarla dallemolisi indotta da una reazione antigene-anticorpo. Ogni struttura deve approntare una procedura dettagliata in merito alla gestione dei prelievi emolizzati o lipemici. Et del campione Le prove di compatibilit devono essere eseguite su campioni di sangue prelevati non pi di 3 giorni prima della trasfusione che si intende eseguire, ad eccezione dei pazienti che non abbiano avuto gravidanze o trasfusioni nei tre mesi precedenti. Tale regola valida anche nel caso di pazienti la cui storia trasfusionale o ostetrica sia incerta o non disponibile1(p38). Lo scopo quello di assicurare che il campione utilizzato per le prove di compatibilit rifletta lo stato immunologico attuale del ricevente, in quanto le trasfusioni o le gravidanze precedenti possono indurre la formazione di anticorpi irregolari. Il limite di 3 giorni arbitrario dato che non possibile stabilire con precisione il momento in cui gli anticorpi diventano evidenziabili. Tale limite di sicurezza sufficientemente corto per consentire la rilevazione di cambiamenti acuti dello stato immunologico ed abbastanza lungo per permettere lesecuzione dei test in fase di pre-ricovero, come nel caso di test eseguiti il venerd (giorno 0) ed intervento chirurgico eseguito il luned (giorno 3). In molti centri il limite di 3 giorni viene applicato non solo ai pazienti trasfusi o con gravidanze nei 3 mesi precedenti, ma per tutti i campioni utilizzati per le prove di compatibilit per una maggiore standardizzazione delle procedure. Ogni struttura deve avere delle procedure
dettagliate che definiscano lambito temporale nel quale un campione di sangue pu essere utilizzato. La durata di conservazione deve essere conforme a quanto riportato nelle istruzioni alluso dei materiali e deireattivi e deve tener conto della disponibilit di spazi adeguati per la conservazione dei campioni. Conservazione dei campioni Il campione di sangue del candidato alla trasfusione ed un campione delle emazie del donatore devono essere conservati in frigoemoteca a temperatura controllata per almeno 7 giorni dopo ogni trasfusione1(p37). Il campione appartenente al donatore pu essere costituito dal sangue del segmento utilizzato per le prove di compatibilit o da un segmento sigillato staccato subito prima della consegna dellunit. Nel caso si recuperi il segmento utilizzato per le prove di compatibilit questo deve essere riposto in una provetta tappata o sigillata, contrassegnata con il numero dellunit di sangue. La disponibilit dei campioni di sangue del donatore e del ricevente consente la ripetizione delle prove di compatibilit o lesecuzione di ulteriori indagini nel caso di reazioni trasfusionali avverse.
Indagini sierologiche
Le indagini sierologiche devono comprendere la determinazione del gruppo ABO e del tipo Rh del ricevente allo scopo di poter trasfondere emocomponenti ABO ed Rh compatibili. Gli Standard1(p37,38) prevedono che nel caso in cui il paziente debba ricevere emocomponenti contenenti globuli rossi, sia eseguita prima della consegna degli emocomponenti stessi, oltre alla tipizzazione ABO ed Rh, anche la ricerca nel siero o plasma di anticorpi irregolari anti-eritrocitari. In ogni struttura devono essere disponibili procedure scritte per la gestione delle emergenze. Quando devono essere trasfusi solo plasma, piastrine o crioprecipitato AHF possono essere utilizzati i risultati di precedenti indagini, riportati nelle registrazioni relative al paziente.
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Nella Tabella 18.1 sono riportate le regole per la selezione del gruppo ABO dei globuli rossi e del plasma da trasfondere, quando non sono disponibili emocomponenti ABO identici. Tipizzazione ABO ed Rh del ricevente Per determinare il gruppo ABO del ricevente, le emazie devono essere cimentate con antisieri anti-A e anti-B ed il siero o plasma con emazie A1 e B. Le metodiche utilizzate e linterpretazione dei risultati sono riportati nel Capitolo 13. Qualsiasi discrepanza tra i risultati del test deve essere risolta prima della consegna del sangue per la trasfusione. Nel caso in cui sia necessario procedere alla trasfusione prima della risoluzione della discrepanza, devono essere utilizzate emazie di gruppo O. Le emazie del paziente devono essere inoltre cimentate con siero anti-D, con allestimento di opportuni controlli per evitare che un paziente Rh negativo sia erroneamente classificato come Rh positivo. Nel Capitolo 14 sono riportate le metodiche ed i reagenti utilizzati per la tipizzazione Rh, le metodiche di controllo e la descrizione dei gruppi Rh-D debole. In caso di difficolt nella tipizzazione dellantigene D, il paziente dovr essere trasfuso con emazie Rh negative, fintantoch in problema non sia stato risolto. Non necessario ricercare la presenza della variante D debole nel ricevente, in quanto la trasfusione di sangue Rh negativo non comporta pericoli.
Lomissione dei test per la ricerca del D debole previene errori di interpretazione riconducibili alla presenza di un test allantiglobulina diretto (TAD) positivo. Tuttavia, alcuni laboratori nellambito dei test pre-trasfusionali, eseguono la ricerca della variante debole dellantigene D allo scopo di identificare i pazienti che possono essere trasfusi con emazie Rh positive in modo da riservare il sangue Rh negativo ai pazienti D negativi. Non necessario, nella pratica routinaria, la determinazione degli altri antigeni del sistema Rh. Ricerca di anticorpi irregolari anti-eritrocitari Prima di definire le procedure di routine per la ricerca degli anticorpi irregolari, devono essere identificati presso ogni struttura, gli anticorpi ritenuti potenzialmente clinicamente significativi. In generale un anticorpo si definisce clinicamente significativo quando si dimostrato in grado di causare la malattia emolitica del feto e del neonato, reazioni trasfusionali emolitiche o di ridurre significativamente la sopravvivenza degli eritrociti incompatibili trasfusi. Sempre in termini generali si ritiene che gli anticorpi reattivi a 37 C e/o nel test allantiglobulina, siano pi frequentemente significativi dal punto di vista clinico, rispetto agli anticorpi che reagiscono solo a temperatura ambiente o a temperature inferiori8. Sono disponibili numerose metodiche sierologiche idonee a ricercare gli anticorpi diretti contro gli antigeni gruppoematici (vedi
Tabella 18.1 - Scelta dellemocomponente da trasfondere quando non disponibile un prodotto ABO identico Emocomponente da trasfondere Sangue intero Emazie concentrate Concentrato granulocitario da aferesi Plasma fresco congelato* Concentrato piastrinico da aferesi Gruppo ABO dellemocomponente Deve essere identico a quello del ricevente. Devono essere compatibili con il plasma del ricevente. Deve essere compatibile con il plasma del ricevente. Deve essere compatibile con le emazie del ricevente. Qualsiasi gruppo ABO accettabile. preferibile che lemocomponente sia compatibile con le emazie del ricevente. Qualsiasi gruppo ABO accettabile.
Crioprecipitato AHF
* Vedi anche Tabella 21.5.
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Capitolo 12 e Capitolo 19). Gli obiettivi di tale ricerca sono i seguenti: rilevare il maggior numero di anticorpi clinicamente significativi possibile; rilevare il minor numero di anticorpi non clinicamente significativi possibile; completare la procedura in tempi adeguati. Gli Standard1(p38) stabiliscono che i test per la ricerca degli anticorpi irregolari siano eseguiti mediante lutilizzo di emazie suddivise in aliquote distinte e non di miscele riunite in un unico flaconcino, con metodiche capaci di evidenziare gli anticorpi clinicamente significativi, che comprendano lincubazione della miscela siero/plasma-emazie a 37 C e successivamente il test allantiglobulina. Per evitare risultati falsamente negativi, tutti i test allantiglobulina negativi devono essere confermati mediante lutilizzo di emazie sensibilizzate con IgG (check cells). Nel caso si ci si avvalga di metodiche alternative, queste devono possedere un grado di sensibilit equivalente documentata e devono prevedere lutilizzo di specifici controlli di metodica. Il metodo scelto deve avere una sensibilit sufficiente a rilevare la presenza nel siero dei riceventi di anticorpi a titolo molto basso. La trasfusione di emazie incompatibili ad un ricevente con anticorpi molto deboli, pu comportare una risposta immunitaria di tipo secondario, con rapido incremento della produzione anticorpale e conseguente distruzione delle emazie trasfuse. La procedura per la ricerca degli anticorpi anti-eritrocitari deve essere la stessa per tutti le categorie di campioni da esaminare, inclusi i test pre-trasfusionali, i test prenatali, i test sui pazienti e lo screening sui donatori. La procedura adottata infine deve essere descritta dettagliatamente nel manuale delle procedure operative di ogni Struttura Trasfusionale. Lettura e interpretazione dei risultati Le reazioni di agglutinazione ed emolisi, che rappresentano le modalit di evidenziazione in vitro della reazione antigene-anticorpo, devono essere valutate accuratamente e in maniera uniforme. Lintensit di agglutinazione e il grado
di emolisi ( grading ) vanno osservati separatamente per ogni singola emazia test e vanno registrati immediatamente dopo la lettura. Tutto il personale del laboratorio deve usare le stesse modalit di interpretazione e di registrazione dei risultati e deve essere uniforme nellattribuzione del grado (ad esempio da 0 a 4+) di reazione. Alcuni laboratori preferiscono utilizzare un sistema numerico (ad esempio da 0 a 12) per indicare lintensit della reazione (scoring). I riferimenti relativi a grading e scoring sono riportati nel Metodo 1.8. Un ausilio ottico quale una lente risulta utile nella lettura dei test in provetta. La lettura microscopica di routine non viene raccomandata quando si utilizzano mezzi potenzianti. La lettura microscopica tuttavia pu essere utile per differenziare gli impilati ( rouleaux ) dai veri agglutinati. La lettura microscopica pu inoltre consentire di evidenziare specifici pattern di reazione che sono caratteristici di alcuni anticorpi. Per esempio, lanti-Sda produce piccoli agglutinati birifrangenti in un campo di cellule libere con un aspetto a campi misti. Nel caso si utilizzino metodiche gel o in fase solida, lettura e interpretazione dei risultati positivi e negativi devono rispettare le indicazioni contenute nelle istruzioni alluso. Controllo autologo Linserimento del controllo autologo o lesecuzione del test allantiglobulina diretto (TAD) di routine non sono richiesti nellambito delle indagini pre-trasfusionali. Esso sono di limitato valore anche nel caso di pazienti recentemente trasfusi e devono essere utilizzati esclusivamente nel caso in cui sia prevista unidentificazione anticorpale. Considerazioni pratiche La ricerca di anticorpi irregolari pu essere eseguita sia precedentemente che contemporaneamente alla prova crociata pre-trasfusionale tra il siero/plasma del paziente e le emazie del donatore. La ricerca degli anticorpi irregolari prima dellesecuzione delle prove di compatibilit permette tuttavia di riconoscere ed identificare precocemente eventuali anticorpi
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clinicamente significativi. Ci consente lacquisizione di unit tipizzate per uno specifico antigene gruppoematico (ad esempio unit negative per lantigene e) e la selezione delle metodiche sierologiche pi appropriate per il crossmatch. Confronto con precedenti registrazioni I risultati della determinazione ABO-Rh sul campione in esame devono essere confrontati con i dati, in possesso del Servizio Trasfusionale, relativi ad eventuali precedenti registrazioni effettuate nellarco degli ultimi 12 mesi. Il risultato di tale confronto deve essere documentato1(p39) . La discordanza tra i risultati attuali e quelli precedenti pu evidenziare errori di identificazione, di esecuzione o di interpretazione dei test ABO-Rh. Le registrazioni devono essere inoltre esaminate allo scopo di evidenziare il riscontro di eventuali anticorpi clinicamente significativi, linsorgenza di reazioni avverse, la necessit di particolari trattamenti trasfusionali o nel caso di difficolt nellesecuzione dei test1(p39). Anticorpi anti-eritrocitari clinicamente significativi possono risultare non pi rilevabili nel siero di un ricevente dopo un certo periodo di tempo. Il 30-35% degli anticorpi diventa non pi rilevabile entro 1 anno e quasi il 50% dopo 10 o pi anni9.
anticorpale sia nel campione in esame che nelle precedenti registrazioni 1(p40) , richiesta esclusivamente una metodica in grado di rilevare lincompatibilit ABO, come limmediate-spin o il computer crossmatch . In presenza di uno screening anticorpale negativo la probabilit del riscontro di un anticorpo irregolare clinicamente significativo mediante la prova crociata con il test allantiglobulina, assai poco probabile. I potenziali benefici dellomissione della prova crociata con il siero antiglobulina nelle procedure di routine comprendono il risparmio di tempo necessario allesecuzione delle prove di compatibilit, la diminuzione del carico di lavoro, la riduzione dei costi per i reattivi ed un miglior utilizzo delle scorte di sangue. Lomissione della prova crociata comprensiva della fase antiglobulinica per i pazienti che soddisfano i criteri precedentemente riportati, deve essere approvata dal responsabile e deve essere riportata nel manuale delle procedure operative della Struttura Trasfusionale. Per il crossmatch sierologico si possono utilizzare gli stessi metodi impiegati per la ricerca ed identificazione degli anticorpi anti-eritrocitari, oppure possono essere utilizzati metodi differenti. Per esempio la metodica gel pu essere utilizzate per la ricerca e lidentificazione anticorpale, mentre il crossmatch pu essere eseguito utilizzando la metodica in provetta. Ricontrollo degli esami sul sangue dei donatori Prima della trasfusione deve essere effettuata la conferma del gruppo ABO su tutte le unit di emazie e del tipo Rh sulle unit di emazie etichettate come Rh negative. Non sono richiesti test aggiuntivi per la ricerca del D debole. Questi test di conferma devono essere eseguiti su un campione ottenuto da un segmento sigillato connesso alla sacca. Ogni discrepanza dei risultati deve essere risolta prima dellassegnazione dellunit per la trasfusione1(p37). Procedure suggerite per lesecuzione delle prove di compatibilit di routine Le emazie utilizzate per lesecuzione delle prove di compatibilit devono provenire da uno dei
Prove di compatibilit
Prima della trasfusione di sangue intero o di emazie concentrate necessario, con leccezione delle situazioni di emergenza, eseguire le prove di compatibilit mediante lutilizzo di procedure in grado di dimostrare lincompatibilit ABO e leventuale presenza di anticorpi anti-eritrocitari clinicamente significativi. Il paziente deve essere trasfuso con emazie prive del relativo antigene nel caso nel caso in cui siano dimostrabili anticorpi clinicamente significativi, nel campione in esame o in precedenti registrazioni, anche se tali anticorpi non sono al momento dimostrabili1(pp39,40). La prova di compatibilit deve comprendere il test allantiglobulina. In assenza di anticorpi clinicamente significativi nello screening
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collarini sigillati connessi alla sacca. Per la metodica di routine in provetta le emazie devono essere lavate e risospese al 2-5% in soluzione fisiologica. Il lavaggio delle emazie del donatore consente di rimuovere piccoli coaguli di fibrina ed alcune agglutinine fredde che possono interferire con linterpretazione dei risultati. Dato che il rapporto siero-cellule influenza notevolmente la sensibilit dei test di agglutinazione, consigliabile utilizzare sospensioni cellulari al 2-5% o quelle consigliate nelle istruzioni allegate ai reattivi in uso. Ad esempio se nella miscela siero-cellule sono presenti troppe cellule, la presenza nel siero in esame di anticorpi in quantit limitata pu sfuggire perch su ciascuna cellula si lega un numero insufficiente di anticorpi. Molti laboratori ritengono che una sospensione eritrocitaria al 2-3% dia i risultati migliori. Per le metodiche in gel su microcolonna o in fase solida su micropiastre, devono essere seguite le istruzioni allegate ai reattivi in uso. La metodica pi semplice per lesecuzione del crossmatch sierologico la tecnica dellimmediate-spin nella quale il siero in esame mescolato a temperatura ambiente con una sospensione di emazie in soluzione salina e la centrifugazione immediata. Limmediate-spin in grado di evidenziare lincompatibilit ABO tra le emazie del donatore e il siero del ricevente. Pu essere utilizzato come unica metodica se il paziente ha una ricerca anticorpale negativa e non ha segnalazioni di anticorpi clinicamente significativi in precedenti registrazioni. Poich lesame viene eseguito a temperatura ambiente, possono essere rilevati anticorpi freddi quali lanti-M, lanti-N e lanti-P1, non evidenziabili nel caso in cui nella ricerca anticorpale venga omessa la fase a temperatura ambiente. La tecnica dellimmediate-spin descritta nel Metodo 3.1. La tecnica della prova crociata con il test allantiglobulina, conforme ai requisiti degli Standard e valida per tutte le situazioni di routine, descritta nel Metodo 3.2. Type and Screen Il Type and Screen una procedura nella quale il campione di sangue del paziente viene testato
per la determinazione di gruppo ABO ed Rh e per la ricerca di anticorpi irregolari; il campione viene poi conservato presso il Servizio Trasfusionale per lesecuzione delle prove di compatibilit, nel caso in cui si renda necessaria la trasfusione. In base a tale procedura non viene riservata alcuna unit di sangue compatibile per i pazienti sottoposti ad interventi chirurgici che solitamente non richiedono supporto trasfusionale. Il Servizio Trasfusionale deve comunque disporre di un numero di unit di sangue sufficienti per far fronte ad eventuali richieste per questi pazienti. Nel caso in cui si rendesse necessaria la trasfusione, pu essere assegnata ununit ABO ed Rh compatibile, dopo lesecuzione di un immediate-spin o di un computer crossmatch, purch il paziente non presenti anticorpi irregolari nel siero o nelle precedenti registrazioni. Se invece il paziente presenta una ricerca anticorpale positiva lanticorpo o gli anticorpi devono essere identificati e devono essere selezionate e tenute a disposizione unit di sangue prive dellantigene corrispondente. Richieste di sangue per interventi di chirurgia elettiva Il numero di unit di sangue da riservare per gli interventi di chirurgia elettiva pu essere stabilito in base alla quantit di sangue utilizzato per ogni singolo intervento, rilevabile attraverso lanalisi delle precedenti registrazioni. Poich il fabbisogno di sangue per ogni intervento varia da un ospedale ad un altro, lo standard delle richieste deve essere definito in ogni singolo ospedale. Il responsabile del Centro Trasfusionale, i chirurghi, gli anestesisti, devono concordare il numero di unit da richiedere per ogni intervento. Una pi dettagliata discussione sui protocolli di richiesta trasfusionale riportata nel Capitolo 3. Lutilizzo di una richiesta standard ha successo solo quando vi sia cooperazione e fiducia tra i sanitari che hanno concordato il protocollo e la stesura di linee guida condivise. Una volta che la richiesta standard sia stata concordata, il Servizio Trasfusionale potr eseguire le prove di compatibilit solo sul numero di unit stabilite per ciascun paziente, in base al
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tipo di intervento programmato. La richiesta standard potr essere modificata per pazienti con anemia, con coagulopatia o con altre condizioni in cui sia prevedibile un maggior apporto trasfusionale. Cos come per altre situazioni cliniche per le quali possa essere necessario un trattamento trasfusionale urgente, il Servizio Trasfusionale deve essere in grado di fornire ulteriori unit di sangue ogni qualvolta ci sia necessario. Computer crossmatch Quando non sono presenti anticorpi clinicamente significativi nel campione in esame e nei dati storici, possibile omettere la prova crociata in antiglobulina tra siero del ricevente ed emazie del donatore ed effettuare esclusivamente il controllo della compatibilit ABO. Allo scopo pu essere utilizzato il computer crossmatch a condizione che siano rispettati i seguenti requisiti 1(pp40,41): il sistema informatico deve essere validato in sede, per assicurare che solo sangue intero o emazie ABO compatibili, possano essere selezionate per la trasfusione; sia stata eseguita una doppia determinazione del gruppo ABO del ricevente, come specificato negli Standard, una sul campione in esame ed una seconda mediante una delle seguenti modalit: riesame dello stesso campione, esame su un secondo prelievo, confronto con precedenti registrazioni; il sistema informatico deve essere in grado di gestire i seguenti elementi: numero dellunit, tipologia dellemocomponente, gruppo ABO e tipo Rh dellemocomponente, conferma di gruppo ABO dellunit; ed inoltre: almeno due elementi identificativi esclusivi del ricevente, gruppo ABO, tipo Rh e risultati della ricerca anticorpale del ricevente; il sistema informatico deve essere provvisto di una procedura idonea a verificare il corretto inserimento dei dati, prima del rilascio degli emocomponenti; il sistema informatico deve disporre di una procedura in grado di allertare lutilizzatore riguardo eventuali discrepanze tra il gruppo
ABO e il tipo Rh riportati sulletichetta dellunit e il risultato degli esami di conferma del gruppo sanguigno sullunit e leventuale incompatibilit ABO tra il ricevente ed unit assegnata. Butch et al.12,13 e Safwenberg et al.14 hanno descritto in dettaglio un modello di sistema informatico per il computer crossmatch. I potenziali vantaggi del computer crossmatch comprendono la riduzione del carico lavorativo, la riduzione del volume dei campioni di sangue richiesti per i test di laboratorio, la riduzione dellesposizione del personale al rischio biologico, una migliore gestione delle scorte di sangue. Prove di compatibilit per i neonati e per i bambini di et inferiore ai 4 mesi I requisiti delle prove di compatibilit per i neonati e per i bambini di et inferiore ai 4 mesi, sono discussi nel Capitolo 24. Le indagini preliminari pre-trasfusionali prevedono la determinazione del gruppo ABO e del tipo Rh del neonato o del bambino. Per la tipizzazione ABO pu essere utilizzata solo la prova diretta, testando le emazie del paziente con i sieri anti-A e anti-B. Il siero o il plasma del paziente o della madre possono essere indifferentemente utilizzati per la ricerca degli anticorpi irregolari e per le prove crociate. La ricerca nel siero del bambino di anticorpi diretti contro gli antigeni ABO non necessaria, ad esclusione del caso di bambini con gruppo diverso dallo O destinati a ricevere trasfusioni di emazie omogruppo in quanto, possono essere presenti anticorpi anti-A e/o anti-B acquisiti passivamente. Tali anticorpi sono in genere di origine materna, ma possono anche derivare da trasfusione di emazie di gruppo O oppure dal plasma contenuto in piastrine non ABO identiche. Levidenziazione di tali anticorpi pu essere effettuata con una metodica che preveda la fase allantiglobulina, con limpiego delle emazie del donatore o di emazie test di gruppo A1 e B. Se nel plasma/siero del bambino o della madre non sono presenti anticorpi irregolari clinicamente significativi, non necessario eseguire la prova
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crociata con le emazie del donatore, n alla prima trasfusione, n alle trasfusioni successive. La ripetizione degli esami pu essere omessa negli eventuali successivi ricoveri per i bambini con et inferiore ai 4 mesi, a patto che essi vengano trasfusi solo con emazie di gruppo O1(p42).
(vedi pi avanti in questo capitolo Selezione delle unit e Altri sistemi gruppoematici). Quando lanticorpo identificato viene considerato non clinicamente significativo (ad esempio: anti-A1, anti-M, anti-N, anti-P1, anti-Lea e/o anti-Leb) e non reattivo a 37 C 15 , possono essere selezionate unit random, purch la prova crociata risulti negativa.
Interpretazione dei risultati dei test di ricerca anticorpale e delle prove di compatibilit
La maggior parte dei campioni esaminati risultano negativi per la ricerca di anticorpi irregolari e compatibili con le emazie del donatore. Una ricerca di anticorpi negativa tuttavia, non significa che il siero in esame non contenga alcun anticorpo antiertrocitario clinicamente significativo, ma solo che non sono presenti anticorpi reattivi con le cellule test e con la metodica utilizzata. In maniera analoga una prova crociata negativa non garantisce con certezza una normale sopravvivenza delle emazie trasfuse. La Tabella 18.2 riporta le possibili cause di test pre-trasfusionali positivi. La maggior parte di ci che sappiamo sulla reazione tra gli antigeni eritrocitari e i relativi anticorpi deriva dalle conoscenze acquisite con i test in provetta. Tali informazioni non sono necessariamente applicabili alle indagini eseguite con altre tecnologie quali la fase solida in micropiastra o i test in microcolonna. Reazioni spurie o inattese con queste tecnologie possono avere le stesse spiegazioni di quelle dei test in provetta, ma avere anche spiegazioni differenti. In relazione allintensit della reazione antigene/anticorpo e alle differenti modalit operative, le varie metodiche possono dare risultati differenti. Le cause dei problemi sierologici devono essere analizzate ed identificate prima di procedere alla trasfusione. Il Capitolo 19 esamina le tecniche utili per la risoluzione di tali problemi. Nel caso di pazienti con anticorpi anti-eritrocitari clinicamente significativi, devono essere selezionate per la trasfusione unit di emazie prive dellantigene relativo, testate allo scopo, con metodiche validate
Etichettatura e consegna del sangue compatibile

Gli Standard1(p44) prevedono che al momento della consegna siano effettuate le seguenti attivit: apposizione allunit di sangue, ben fissata, di un etichetta o di un cartellino che riportino almeno due elementi identificativi del ricevente, il numero di identificazione dellunit, i risultati della prova crociata, se eseguita; per ogni unit di sangue o emocomponenti consegnata, deve essere compilato un apposito modulo finale di controllo delle registrazioni; tale modulo va trattenuto presso il Servizio Trasfusionale e deve contenere: 1. due elementi identificativi indipendenti del ricevente, uno dei quali in genere rappresentato dal nome del paziente; 2. il gruppo ABO ed Rh del ricevente; 3. il numero di identificazione dellunita o del pool; 4. il gruppo ABO e, se richiesto, il tipo Rh del donatore; 5. il risultato della prova crociata, se eseguita; 6. la data e lora della consegna; 7. eventuali trattamenti specifici sulle unit (ad esempio emocomponenti citomegalovirus negativi, irradiati, negativi per uno specifico antigene); deve essere prevista una procedura che assicuri che i dati identificativi del ricevente, la richiesta, le registrazioni, il prodotto, siano tra loro concordanti e che eventuali discrepanze siano state risolte prima della consegna.
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Tabella 18.2 - Cause di positivit dei test pre-trasfusionali* Ricerca di anticorpi negativa, immediate-spin incompatibile Emazie del donatore ABO incompatibili: errore nelle selezione dellunit, nel campione del ricevente, nelletichettatura dellunit. Emazie del donatore ABO incompatibili: mancata identificazione di antigeni ad espressione debole. Emazie del donatore poliagglutinabili. Presenza di anti-A1 nel siero di riceventi A2 o A2B. Presenza nel siero del ricevente di altri alloanticorpi reattivi a temperatura ambiente (ad esempio anti-M). Formazione di impilamenti (rouleaux). Agglutinine fredde (anti-I), in particolare se limmediate-spin non fa parte della ricerca anticorpale. Ricerca di anticorpi negativa, prova crociata con lantiglobulina positiva Emazie del donatore con test allantiglobulina diretto positivo. Presenza di anticorpi reattivi solo con emazie che posseggono una forte espressione di un determinato antigene, a causa delleffetto dose (ad esempio: antigeni Rh, Kidd, Duffy ed MN) o a causa dellintrinseca variabilit di espressione dellantigene (ad esempio P1). Presenza di anticorpi reattivi con antigeni a bassa frequenza, presenti solo sulle emazie del donatore. Presenza di anticorpi trasferiti passivamente: significativi livelli di anti-A o anti-B possono essere presenti dopo la trasfusione di piastrine ABO incompatibili. Ricerca di anticorpi positiva, prova crociata negativa Auto anti-HI (-H). Anti-LebH. Anticorpi diretti contro i costituenti del reagente. Anticorpi con effetto dose ed emazie del donatore eterozigoti per lantigene relativo (ad esempio espressione dellantigene in singola dose). Ricerca di anticorpi positiva, prova crociata positiva, controllo autologo negativo Presenza di uno o pi alloanticorpi. Reazioni inattese con le emazie test e le emazie del donatore Ricerca di anticorpi positiva, prova crociata positiva, controllo autologo positivo, test allantiglobulina diretto negativo Anticorpi reattivi contro componenti della soluzione potenziante. Ricerca di anticorpi positiva, prova crociata positiva, controllo autologo positivo Presenza di alloanticorpi in un paziente con reazione trasfusionale ritardata sierologica o emolitica. Alloanticorpi trasferiti passivamente tramite trasfusione di plasmaderivati (ad esempio immunoglobuline endovenose). Autoanticorpi freddi. Autoanticorpi caldi. Formazione di impilamenti (rouleaux). Problemi correlati ai reagenti
* Le cause dipendono dalle metodologie utilizzate nei test sierologici.
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Registrazioni aggiuntive che possono essere utilizzate includono quelle che riportano le generalit della persona che consegna e di quella a cui viene consegnato il sangue e la destinazione dellunit. Al termine della trasfusione deve essere fatta unapposita registrazione nella cartella clinica del paziente. Tale registrazione potr far parte di una cartella computerizzata o essere in forma cartacea. Le registrazioni devono contenere le generalit di colui o coloro che hanno eseguito i test, la segnalazione della consegna del sangue prima della risoluzione di eventuali problemi nelle prove di compatibilit, i risultati finali dei test sierologici. Deve essere allestito un sistema in grado di assicurare che lemocomponente giusto sia consegnato al paziente stabilito. Prima di rilasciare lunit di sangue o emocomponenti il personale del Servizio Trasfusionale deve accertarsi che il prodotto sia conforme alluso, che non sia scaduto, che lunit sia stata ispezionata e non presenti anomalie per quanto riguarda il colore o laspetto e che la sacca non sia danneggiata. Il controllo finale sullidentit del ricevente e dellunit di sangue assegnatagli, compete al medico che effettua la trasfusione, il quale deve verificare lidentit del paziente, dellunit di sangue e deve certificare che le informazioni contenute nei moduli, cartellini, etichette, siano concordanti (vedi Capitolo 22).
emazie del ricevente. Nella Tabella 18.1 sono elencate le scelte relative agli emocomponenti da trasfondere e le alternative possibili agli emocomponenti omogruppo. Tipo Rh I pazienti Rh positivi devono essere trasfusi di routine con sangue RhD positivo. Il sangue RhD negativo, bench compatibile, deve essere riservato ai pazienti D negativi, i quali devono ricevere emocomponenti contenenti emazie esclusivamente RhD negativo per evitare limmunizzazione nei confronti dellantigene D. Nei casi in cui non siano disponibili unit di sangue ABO compatibili ed Rh negative, il medico della Struttura Trasfusionale deve consultare il medico curante onde valutare le possibili opzioni alternative. Sulla base dellet del paziente e del volume di emazie trasfuse pu essere indicato somministrare le immunoglobuline Rh ai pazienti D negativi trasfusi con sangue D positivo.16 Altri sistemi gruppoematici Normalmente non necessario tener conto di altri sistemi gruppoematici nella selezione delle unit di sangue da trasfondere, a meno che nel siero del ricevente siano presenti anticorpi irregolari clinicamente significativi. In tal caso devono essere selezionate per la prova crociata unit di sangue prive dellantigene relativo. Se lanticorpo presente nel siero del paziente reagisce debolmente, oppure non pi evidenziabile, indispensabile verificare mediante opportuni sieri tipizzanti validati, che le unit scelte siano prive dellantigene corrispondente. Se vi unadeguata quantit di siero del paziente o di siero di un altro paziente con la stessa specificit anticorpale e lanticorpo presente nel siero reagisce intensamente con le emazie che possiedono lantigene corrispondente, possibile utilizzare tale siero per selezionare le unit prive dellantigene in questione. Lassenza dellantigene su tali unit deve poi essere confermata mediante limpiego di un siero tipizzante validato, quando disponibile. Nel caso in cui non siano disponibili sieri tipizzanti (ad esempio anti-Lan o anti-Yta), si pu ricorrere allutilizzo di sieri scaduti o a campioni di
Selezione delle unit da trasfondere

Gruppo ABO Ogni qualvolta sia possibile il paziente deve essere trasfuso con emocomponenti ABO identici; tuttavia pu rendersi talora necessario operare una scelta alternativa. Se lemocomponente da trasfondere contiene 2 o pi mL di globuli rossi, le emazie del donatore devono essere ABO compatibili con il plasma del ricevente1(p40). Al contrario la trasfusione di emocomponenti contenenti plasma comporta il rischio per le emazie del ricevente e quindi il plasma trasfuso, quando possibile, deve essere compatibile con le
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siero di pazienti o di donatori, che siano stati adeguatamente conservati, a patto che i controlli di metodica previsti per i test diano risultati soddisfacenti. (vedi The Food and Drug Administration Compliance Program Guidance Manual, Capitolo 42, Blood and Blood Products). Nel caso in cui non possano essere reperite unit compatibili, la decisione in merito alla trasfusione deve coinvolgere il responsabile della Struttura Trasfusionale (vedi Capitolo 19 e Capitolo 20 per ulteriori informazioni inerenti la consegna di unit incompatibili). Unit prive dellantigene coinvolto, non sono generalmente richieste per i pazienti con anticorpi irregolari non clinicamente significativi. In alcuni casi i problemi connessi con la prova crociata nei pazienti con tali anticorpi, possono essere evitati utilizzando tecniche alternative idonee per il crossmatch. Assegnazione del sangue in condizioni di emergenza Nei casi in cui il trattamento trasfusionale sia richiesto con estrema urgenza, il medico curante deve valutare se il rischio di trasfondere ununit non compatibilizzata o solo parzialmente compatibilizzata, sia superiore a quello derivante dal ritardo imposto dal completamento delle indagini. inoltre auspicabile la consulenza in merito da parte del medico della Struttura Trasfusionale. Il rischio che le unit trasfuse possano risultare incompatibili pu essere giudicato minore rispetto al rischio derivante dalla mancata trasfusione con conseguente inadeguata capacit di trasporto dellossigeno da parte del sangue (Vedi Capitolo 21). Procedure richieste Quando il sangue viene consegnato prima che le prove di compatibilit siano completate, nella registrazione deve essere riportata la dichiarazione del medico curante che le condizioni cliniche del paziente sono sufficientemente gravi da richiedere la trasfusione con estrema urgenza 1(p46). Tale dichiarazione non solleva comunque il personale della Struttura Trasfusionale dalla responsabilit di rilasciare unit correttamente etichettate e ABO compatibili
con il paziente. Nei casi in cui sia richiesta la trasfusione con estrema urgenza, il personale della Struttura Trasfusionale deve: 1. consegnare il sangue senza le prove di compatibilit secondo i seguenti criteri: a. emazie di gruppo O se il gruppo ABO del paziente sconosciuto. Se anche il tipo Rh sconosciuto, preferibile dare sangue D negativo, soprattutto se il paziente una donna in et fertile; b. sangue ABO ed Rh compatibile, se possibile eseguire la determinazione ABO ed Rh su un campione di sangue del paziente. Il gruppo ABO ed Rh del paziente non deve essere dedotto da precedenti registrazioni o da tessere, medagliette o patente di guida; 2. indicare in maniera evidente sul cartellino o sulletichetta, che al momento del rilascio la prova di compatibilit non stata ancora completata; 3. iniziare immediatamente la prove di compatibilit e portarle a termine non appena possibile (per le trasfusioni massive, vedi di seguito). Se nel corso dellindagine venisse rilevata una incompatibilit, devono essere immediatamente avvertiti il medico curante del paziente ed il medico della Struttura Trasfusionale. Trasfusione massiva Per trasfusione massiva si intende linfusione, in un intervallo di 24 ore, di un volume di sangue pari o superiore al volume ematico totale del ricevente. Anche lex-sanguino trasfusione del neonato pu essere considerata una trasfusione massiva. Dopo una trasfusione massiva, il campione di sangue prelevato prima della trasfusione non pi rappresentativo del sangue presente in circolo e pertanto il suo utilizzo per le prove di compatibilit di scarsa utilit. Tale campione importante solo per confermare la compatibilit ABO delle unit da trasfondere successivamente. Le metodiche utilizzate in questa situazione devono essere approvate dal responsabile della Struttura Trasfusionale, devono essere riportate
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sul manuale delle procedure di laboratorio e devono essere seguite fedelmente da tutto il personale. Selezione del sangue da trasfondere in pazienti trasfusi con sangue non identico Le Strutture Trasfusionali talora rilasciano unit di sangue per la trasfusione prima di aver ricevuto un campione di sangue del paziente sul quale effettuare la determinazione di gruppo; il campione pre-trasfusionale pu pervenire al centro in un momento successivo. Nella maggior parte dei casi tale campione viene analizzato e vengono consegnate unit di sangue dello stesso gruppo ABO, senza tener conto della possibile presenza in quel momento di anticorpi anti-A o anti-B acquisiti passivamente al momento della trasfusione in condizioni di emergenza. Poich la maggior parte delle unit di emazie sono concentrati eritrocitari con quantit relativamente modeste di plasma sopranatante, o concentrati eritrocitari con aggiunta di soluzioni additive, con un contenuto ancora minore di plasma residuo, i rischi legati a tale pratica sono minimi. Per esempio il paziente pu presentare un TAD positivo transitorio. In alcuni casi, quando sono stati trasfusi grossi volumi di concentrati eritrocitari, oppure quando il paziente trasfuso un bambino o un neonato, possono essere presenti anticorpi ABO acquisiti passivamente17; in questo caso la possibilit di trasfondere sangue del gruppo ABO originale del paziente prevede lesecuzione della prova di compatibilit con un campione di siero fresco del paziente. Se si osserva un risultato di incompatibilit necessario proseguire le trasfusioni con sangue di gruppo ABO compatibile con il siero del paziente. Nel caso in cui il sangue trasfuso in precedenza differisca esclusivamente per il tipo Rh, il successivo impiego di sangue dello stesso tipo Rh del paziente non pone problemi in quanto gli anticorpi corrispondenti non sono normalmente presenti nel siero del donatore, n in quello del ricevente. La trasfusione di sangue di tipo Rh diverso da quello del paziente pu essere causa di problemi nel caso in cui la trasfusione venga
eseguita prima che sia stato determinato il tipo Rh del paziente. In questi casi infatti pu risultare difficile determinare il reale tipo Rh del soggetto. Nel caso vi siano dubbi sul reale tipo Rh del paziente, deve essere trasfuso, se possibile, sangue Rh negativo. Deve essere inoltre presa in considerazione lopportunit della somministrazione della profilassi con le immunoglobuline anti-D nei pazienti Rh negativi trasfusi con sangue Rh positivo (Vedi Capitolo 21).
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Capitolo 19: Scoperta ed identificazione degli alloanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari
Capitolo 19
Scoperta ed identificazione degli alloanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari
Si definiscono alloanticorpi irregolari antieritrocitari tutti gli alloanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari, ad eccezione degli anticorpi naturali anti-A ed anti-B. La loro frequenza nella popolazione varia tra lo 0,3 e il 38%, a seconda del gruppo di pazienti o donatori esaminato e della sensibilit della metodica utilizzata 1,2 . Gli alloanticorpi, a differenza degli autoanticorpi che sono diretti contro le emazie autologhe, reagiscono esclusivamente contro antigeni eritrocitari allogenici. Limmunizzazione nei confronti degli antigeni eritrocitari si pu verificare in seguito a gravidanza, trasfusioni, trapianti o inoculazione di materiale immunogeno. In alcuni casi, tuttavia, non identificabile alcun stimolo immunogeno. Tali alloanticorpi naturali sono il risultato dellesposizione ad antigeni ambientali, di tipo batterico o virale, simili agli antigeni gruppoematici. Inoltre anticorpi antieritrocitari rilevabili con i test sierologici, possono essere acquisiti passivamente attraverso la trasfusione di plasma, liniezione di immunoglobuline, oppure possono essere prodotti da linfociti passenger, trasferiti con il trapianto di organi o di cellule staminali emopoietiche.
Significato clinico degli alloanticorpi

Gli alloanticorpi antieritrocitari possono essere evidenziati in campioni di siero o plasma, indipendentemente dallesame in corso (ad esempio: determinazione del gruppo ABO, ricerca anticorpale, prova crociata) oppure in un
campione di eluato preparato da emazie sensibilizzate da alloanticorpi. In ogni caso in cui venga scoperto un anticorpo, fondamentale determinarne la specificit e valutarne il significato clinico. Un anticorpo antieritrocitario viene definito clinicamente significativo, pur con i limiti del caso, quando in grado di ridurre la sopravvivenza delle emazie trasfuse o quando implicato in casi di malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN). La significativit clinica di un anticorpo pu variare anche nellambito di anticorpi che presentano la stessa specificit. Alcuni anticorpi causano la distruzione delle emazie incompatibili entro alcune ore o anche minuti dalla trasfusione, altri ne riducono la sopravvivenza a pochi giorni, altri ancora non causano unevidente distruzione delle emazie trasfuse. Alcune specificit anticorpali sono chiaramente responsabili di MEFN, mentre altre possono determinare solo la positivizzazione del test allantiglobulina diretto (TAD) nel feto, senza alcuna manifestazione clinica di MEFN. La valutazione del significato clinico di un anticorpo pu essere effettuata mediante la lanalisi dei dati presenti in letteratura, relativi ad esempi di anticorpi con la stessa specificit. La Tabella 15.1 descrive in sommario il tipo di reattivit e il significato clinico degli alloanticorpi di pi comune riscontro. Daniels et al.3 hanno pubblicato una review relativa a queste e ad altre specificit anticorpali. Per alcuni anticorpi tuttavia esistono poche o nulle informazioni adeguate e le decisioni si possono basare sulla premessa che gli anticorpi clinicamente significativi sono quelli
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reattivi a 37 C e/o con il test allantiglobulina indiretto (TAI). Ci peraltro non sempre vero in quanto anche anticorpi attivi in vitro a 37 C, e/o in TAI, possono essere non clinicamente significativi. Gli anticorpi rilevati nel corso dei test pretrasfusionali devono essere identificati allo scopo di valutare la necessit o meno di selezionare per la trasfusione globuli rossi privi dellantigene relativo. Pazienti che presentano anticorpi clinicamente significativi devono, allatto pratico, ricevere emazie controllate prive del corrispondente antigene. Nelle indagini prenatali, la conoscenza della specificit e della classe immunoglobulinica cui lanticorpo appartiene, consente di valutare la probabilit che il feto e/o il neonato possano essere affetti da MEFN. Gli anticorpi irregolari identificati nei donatori di sangue infine, possono essere utilizzati per tipizzare preliminarmente le unit di sangue ed etichettarle prima della trasfusione, per ottenere dei reattivi per la tipizzazione gruppoematica o da utilizzare a scopo didattico.
plasma. Il plasma tuttavia, non idoneo per lidentificazione degli anticorpi attivanti il complemento. Normalmente una quantit di 5-10 mL di sangue intero consente di ottenere siero o plasma sufficienti a risolvere semplici problemi di identificazione, ma per la risoluzione di problemi pi complessi, possono rendersi necessari quantitativi maggiori. Per le indagini che prevedono lutilizzo delle emazie autologhe, limpiego di campioni di sangue prelevato in EDTA previene i problemi associati con la fissazione in vitro delle componenti del complemento sui globuli rossi, evento che pu verificarsi nei campioni coagulati. Storia clinica Quando viene eseguita unidentificazione anticorpale utile conoscere la diagnosi clinica, la storia trasfusionale ed ostetrica e la terapia farmacologia recente del paziente in esame. Ad esempio, il sangue di pazienti che hanno ricevuto recenti trasfusioni di concentrati eritrocitari pu contenere una quantit di emazie del donatore, tale da rendere difficoltosa la tipizzazione eritrocitaria del paziente stesso. In tali casi possono essere richieste procedure speciali per separare le emazie autologhe per la tipizzazione (vedi Metodo 2.15). Altre procedure speciali possono essere richieste per i pazienti che presentano autoanticorpi. Reattivi diagnostici Emazie test per la ricerca anticorpale Sono disponibili in commercio emazie test di gruppo O per la ricerca di anticorpi irregolari; tali emazie vengono fornite sotto forma di pannelli costituiti in genere da 2-3 flaconcini contenenti ciascuno aliquote di emazie provenienti da singolo donatore. I preparati costituiti da una singola miscela di emazie (di solito due donatori) possono essere utilizzati per la ricerca di anticorpi nei donatori di sangue. La scelta di utilizzare pannelli composti da due o da tre campioni di emazie test deve essere basata sulla specifica situazione operativa di ogni singolo laboratorio. Le emazie test devono esprimere gli antigeni associati con la maggior
Procedure generali
Le tecniche sierologiche impiegate per la ricerca e per lidentificazione anticorpale sono simili. La scelta dei metodi per lidentificazione deve tener conto del profilo di reattivit osservato nella fase di ricerca anticorpale. Ogni Struttura Trasfusionale deve definire le tecniche da utilizzare per la ricerca e per lidentificazione degli anticorpi nelle procedure di routine. In alcune situazioni risulta vantaggioso, nel corso del processo di identificazione, poter disporre di protocolli operativi (flow-chart) in grado di fornire un chiaro orientamento alloperatore nella scelta di tecniche aggiuntive. Tale approccio utile per rendere pi veloce il processo di identificazione e per ridurre al minimo il ricorso ad esami non strettamente necessari. Requisiti del campione Le indagini per lidentificazione degli anticorpi possono essere condotte sia su siero che su
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parte degli anticorpi di pi comune riscontro. Sulle emazie test approvate allo scopo dalla Food and Drug Administration (FDA) devono essere rappresentati i seguenti antigeni: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka e Jkb.4 Alcuni anticorpi debolmente attivi reagiscono solo con le emazie di donatori omozigoti per il gene che controlla lespressione dei relativi antigeni, fenomeno sierologico definito come effetto dose. Gli anticorpi dei sistemi Rh, Duffy, MNS e Kidd sono quelli che con maggiore frequenza presentano tale effetto dose. Le emazie test devono essere conservate in frigorifero quando non sono in uso e non possono essere utilizzate oltre la loro data di scadenza. Pannelli eritrocitari per lidentificazione anticorpale Lidentificazione degli anticorpi diretti contro gli antigeni eritrocitari prevede che il siero in esame sia cimentato con un pannello di emazie test a composizione antigenica nota, provvisto della maggior parte degli antigeni gruppoematici. Tali pannelli sono in genere reperiti in commercio, ma possono anche essere prodotti presso i singoli laboratori, con limpiego di cellule reperite in sede. Le emazie dei pannelli, con rare eccezioni, sono di gruppo O, in modo da consentire lesame di tutti i sieri, indipendentemente dal loro gruppo ABO. Ciascuna emazia del pannello proviene da un diverso individuo. Le cellule devono essere selezionate in modo tale che lanalisi complessiva del pannello consenta la formazione di un profilo di reazioni positive e negative specifico per ciascuno dei differenti antigeni eritrocitari. Per essere funzionale un pannello di emazie test deve consentire di identificare gli anticorpi clinicamente significativi di pi frequente riscontro come lanti-D, -E, -K e -Fya. La composizione fenotipica delle emazie del pannello deve permettere di identificare con chiarezza le singole specificit degli anticorpi di comune riscontro e contemporaneamente escludere la maggior parte delle altre specificit. Idealmente, il profilo di reattivit per la maggior parte delle singole specificit anticorpali non dovrebbe sovrapporsi
a quello di nessun altro anticorpo: ad esempio i campioni di emazie test K+ non devono esser i soli ed unici ad essere anche E+. Pu essere anche molto utile includere nel pannello campioni di emazie con antigeni in doppia dose per quegli anticorpi che presentano leffetto dose. Per poter escludere la possibilit che un risultato apparentemente definitivo sia casuale, il pannello deve essere composto da un numero sufficiente di cellule che esprimono e di cellule che non esprimono la maggior parte degli antigeni riportati nella Tabella 19.1. I pannelli del commercio sono solitamente preparati e distribuiti ogni 2 o 4 settimane. Ciascun pannello contiene differenti campioni di emazie con differente distribuzione antigenica, per cui essenziale utilizzare la scheda che riporta il fenotipo di ciascuna cellula, allegata al pannello. Le emazie del commercio sono solitamente fornite in sospensioni al 2-5% in un mezzo conservante e possono essere usate direttamente dai flaconcini. In genere non necessario il lavaggio di tali emazie, tranne i casi in cui si sospetti che il mezzo di sospensione possa interferire con lidentificazione degli alloanticorpi. I pannelli eritrocitari non possono essere utilizzati oltre la data di scadenza; tuttavia, ci non sempre possibile. Molti operatori utilizzano le emazie test valide come pannello iniziale per lidentificazione anticorpale e, se necessario, usano emazie test scadute per la conferma o lesclusione della specificit. Ciascun laboratorio deve disporre di un protocollo validato relativo allutilizzo delle emazie test scadute5. Sieri antiglobuline La maggior parte delle metodiche per lidentificazione degli anticorpi clinicamente significativi include la fase dellantiglobulina. Possono essere utilizzati sia i sieri polispecifici ad ampio spettro, che i sieri monospecifici anti IgG. I sieri polispecifici possono evidenziare anticorpi che fissano il complemento o che possono dare con questi anticorpi reazioni pi intense. Ci risulta utile soprattutto nel caso di alcuni anticorpi del sistema Kidd.6
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Tabella 19.1 - Esempio di un pannello di emazie test per lidentificazione di alloanticorpi
Rh Campione Fenotipo Rh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 rr R1W R1 R2 rr r r r r Ro C + + + 0 0 0 0 0 0 0 C

w
Kell D 0 + + + 0 0 0 0 0 + E 0 0 0 + + 0 0 0 0 0 e + + + 0 + + + + + + K 0 + 0 0 0 0 + 0 0 0
Duffy Fy + + + 0 + 0 0 + 0 0
a
Kidd
b
P
b
Lewis Le 0 + 0 + 0 0 0 + 0 0
a
MNS
b
c + 0 0 + + + + + + +
Fy 0 + + + + + + 0 + 0
Jk + 0 + 0 0 + + 0 + +
Jk + + + + + 0 0 + 0 +
P1 + + 0 + 0 + + + 0 +
Le + 0 + 0 + 0 + 0 + 0
M + + + 0 + + + 0 0 +
N + + 0 + + + 0 + + +
S 0 + + 0 + 0 + 0 + +
s + + 0 + 0 + 0 + 0 +
0 + 0 0 0 0 0 0 0 0
+ Indica la presenza dellantigene; 0 indica lassenza dellantigene.
Nonostante questo possa risultare vantaggioso in alcune circostanze, molti laboratori preferiscono usare i sieri monospecifici anti IgG, per evitare reattivit indesiderate determinate dalla fissazione in vitro del complemento ad opera di anticorpi reattivi a freddo. Mezzi potenzianti Sebbene lindagine sierologica di base consista nel cimentare il siero del paziente con le emazie test (emazie fornite dal commercio o emazie sospese in soluzione fisiologica), la maggior parte dei laboratori ricorre allutilizzo di mezzi potenzianti la reazione antigene-anticorpo. Sono disponibili vari tipi di mezzi potenzianti che comprendono le soluzioni a bassa forza ionica (LISS), il polietilenglicole (PEG) e lalbumina bovina al 22 o al 30%. La maggior parte dei laboratori utilizza, nella fase iniziale dellidentificazione anticorpale, la stessa soluzione potenziante impiegata nel corso della ricerca anticorpale. Mezzi potenzianti aggiuntivi possono essere successivamente impiegati in presenza dei casi pi complessi. Le tecniche di potenziamento sono illustrate nei paragrafi successivi di questo capitolo. Controllo autologo (autocontrollo) importante verificare come il siero in esame si comporta con le emazie autologhe. Tale indagine utile per accertare se nel siero sono presenti alloanticorpi, autoanticorpi o entrambi. Quando il siero reagisce unicamente con le emazie test, normalmente sono presenti solo alloanticorpi, mentre il riscontro di reattivit sia con le emazie test che con quelle autologhe, suggerisce invece la presenza di autoanticorpi, da soli o in associazione con alloanticorpi. Il controllo autologo pu risultare inoltre positivo in pazienti recentemente trasfusi nel cui siero siano presenti alloanticorpi diretti contro antigeni presenti sulle emazie trasfuse in quanto le emazie del donatore ancora in circolo sono sensibilizzate. Per evitare che in questi casi il risultato del test sia erroneamente interpretato come conseguente alla presenza di autoanticorpi, in tutti i pazienti con un controllo autologo o con un test allantiglobulina diretto (TAD) positivo deve essere
effettuata una accurata anamnesi trasfusionale. Il controllo autologo, nel quale il siero cimentato con le emazie autologhe nelle medesime condizioni impiegate per le emazie test, non ha lo stesso significato del TAD. La positivit del controllo autologo pu rappresentare esclusivamente un fenomeno in vitro, riconducibile alla fase di incubazione e alla presenza di soluzioni potenzianti. Se il controllo autologo positivo nella fase dellantiglobulina, deve essere eseguito sulle emazie del paziente un TAD. Se questo risulta positivo, nei pazienti recentemente trasfusi o in presenza di chiari segni di emolisi immunomediata o al fine di chiarire risultati non dirimenti delle analisi sierologiche, devono essere allestite le tecniche di eluizione. Un TAD positivo pu indicare inoltre la presenza di autoanticorpi. Se gli autoanticorpi sono presenti anche nel siero, devono essere utilizzate le tecniche di assorbimento per poter escludere leventuale coesistenza con alloanticorpi.
Tecniche sierologiche di base per lidentificazione anticorpale

Nella fase iniziale, in genere, il siero in esame viene cimentato con un pannello di emazie test con le stesse metodiche e nelle stesse fasi in cui si era ottenuto un risultato positivo nel test di ricerca anticorpale o nel crossmatch . Alcuni immonoematologi preferiscono includere nella fase iniziale la lettura dopo centrifugazione immediata e/o dopo incubazione a temperatura ambiente, senza laggiunta di soluzioni potenzianti. In questo modo viene favorita lidentificazione di alcuni anticorpi (anti-M, -N, -P1, -I, -Lea o -Leb) e viene facilitata linterpretazione delle reazioni ottenute nelle altre fasi del test. La maggior parte dei laboratori invece omette queste fasi per evitare di evidenziare anticorpi attivi solo a temperatura ambiente e con poca o nulla rilevanza clinica. Lincubazione della miscela siero-cellule a 37C permette di rilevare la presenza di alcuni anticorpi (ad esempio potenti anti-D, -K, -E) capaci di agglutinare direttamente le emazie test e di altri
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(ad esempio anti-Lea, -Jka) capaci di lisare le cellule che posseggono gli antigeni corrispondenti, durante lincubazione a 37C. Altri immunoematologi ritengono tuttavia che, poich gli anticorpi clinicamente significativi saranno comunque evidenziati con il TAI, la lettura dopo lincubazione a 37C possa essere tranquillamente omessa. Ci consentir di ridurre la presenza indesiderata di reazioni positive prodotte dagli auto ed alloanticorpi freddi, non clinicamente significativi7,8. La valutazione del fenotipo delle emazie test reattive con lanticorpo indicher la possibile specificit o contribuir ad escludere altre specificit ed inoltre permetter di selezionare efficacemente le emazie da utilizzare negli eventuali test successivi. Nel caso di pazienti gi noti per la presenza di determinati anticorpi, la scelta del pannello di emazie test potr essere fatta in maniera selettiva. Ad esempio, nel caso di un paziente con un anti-e, non sar opportuno cimentare il suo siero con un pannello di 10 emazie, di cui nove e+. Lutilizzo di un pannello con un sufficiente numero di emazie e permetter di evidenziare pi facilmente leventuale comparsa di nuove specificit anticorpali. Talvolta la scelta del pannello pu essere influenzata dal fenotipo delle emazie del paziente. Ad esempio, nel caso di un paziente D negativo il cui siero reagisce nel test di screening con tutte le emazie D positive, pu essere utilizzato un pannello ristretto o anche un pannello di sole emazie D negative. Ci consentir di confermare la presenza dellanti-D e nello stesso momento di dimostrare la presenza o lassenza di eventuali anticorpi aggiuntivi, riducendo al minimo i test necessari9. Interpretazione dei risultati I risultati della ricerca anticorpale sono interpretati come positivi o negativi, in base alla presenza o allassenza di reattivit (ad esempio agglutinazione) tra siero in esame ed emazie test. Linterpretazione dei risultati dei pannelli di identificazione rappresenta un processo pi complesso che richiede la combinazione di conoscenze tecniche e capacit intuitive. I risultati
dei pannelli generalmente comprendono la valutazione sia dei risultati positivi che di quelli negativi, nelle differenti fasi del test e ciascun risultato deve trovare spiegazione nelle conclusioni finali. La valutazione del fenotipo delle emazie del paziente e il calcolo delle probabilit possono anchessi giocare un ruolo nellinterpretazione finale. Risultati positivi e negativi Per lidentificazione della specificit anticorpale sono importanti sia le reazioni positive che quelle negative. La valutazione delle reazioni positive in termini di fase del test e di intensit di reazione (vedi Metodo 1.8 per gli score di agglutinazione), pu orientare verso determinate specificit anticorpali. Il confronto delle reazioni positive con il profilo antigenico espresso dalle varie cellule del pannello utile per assegnare la specificit anticorpale. Generalmente quando sono presenti anticorpi singoli le reazioni positive e negative sono ben definite e determinano un profilo di reattivit chiaro con le emazie del pannello, sia con quelle positive che con quelle negative per lantigene corrispondente. Per esempio, se un siero reagisce solo con le emazie 4 e 5 del pannello indicato nella Tabella 19.1, la specificit anticorpale pi probabile lanti-E, poich i due campioni di emazie che reagiscono sono entrambi positivi per lantigene E mentre tutte le altre emazie che non reagiscono con il siero sono E negative. Le reazioni negative sono altrettanto importanti per lidentificazione della specificit anticorpale, poich consentono di formulare la probabile esclusione degli anticorpi diretti contro gli antigeni presenti sui campioni di emazie che hanno fornito reazioni negative. La fase di esclusione rappresenta un momento importante nel processo interpretativo e deve essere sempre eseguita al fine di perseguire la sicura identificazione di tutti gli anticorpi presenti nel siero in esame. Esclusione o crossing out Un primo approccio ampiamente utilizzato nellinterpretazione dei risultati del pannello rappresentato dallesclusione di un certo numero di specificit anticorpali, sulla base della reazione
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negativa del siero in esame con alcune emazie test. Questo metodo viene talvolta indicato come cross out o rule out. Una volta che i risultati siano stati registrati sul foglio di lavoro, viene esaminato il profilo antigenico del primo campione di emazie non reattivo. Se un determinato antigene presente sulla cellula e il siero in esame non reagisce con tale cellula, la presenza dellanticorpo corrispondente pu essere, almeno provvisoriamente, esclusa. Molti operatori, per semplificare lanalisi dei risultati, escludono tale antigene dallelenco allegato al foglio illustrativo del pannello eritrocitario. Dopo che tutti gli antigeni presenti su questo campione di emazie sono stati esclusi, lanalisi procede con la valutazione del successivo campione non reattivo e in tal modo vengono escluse ulteriori specificit anticorpali. Nella maggior parte dei casi con questo procedimento si arriver alla definizione di un certo numero di anticorpi che non possono essere esclusi. Successivamente vengono esaminate le cellule reattive con il siero in esame. Il profilo di reattivit per ciascuna specificit anticorpale che non sia stata esclusa viene confrontato con il profilo di reattivit del siero in esame. Se il profilo di un anticorpo coincide perfettamente con il profilo di reattivit osservato, questa la specificit anticorpale pi probabile nel siero. Tuttavia, se rimangono ulteriori specificit che non possono essere escluse, possono rendersi necessari test aggiuntivi al fine di eliminare le possibilit rimanenti e di confermare la specificit identificata. Questo comporta la necessit di cimentare il siero con cellule appositamente selezionate per specifiche caratteristiche antigeniche. Per esempio, questo approccio pu essere indicato quando il profilo delle reazioni positive coincide perfettamente con un anti- Jka, ma non possibile escludere con certezza lanti-K e lanti-S. Allora il siero dovr essere cimentato contro emazie selezionate per i seguenti fenotipi: Jk(a ), K, S+, Jk(a ), K+, S e Jk(a+), K , S . Il profilo delle reazioni ottenute con queste emazie potr sia confermare la presenza dellanti-Jka che accertare o escludere la presenza dellanti-K e/o dellanti-S. Sebbene tale approccio di esclusione
(cross out) consenta spesso di identificare semplici specificit anticorpali, va considerato solo un passo iniziale, specialmente se il cross out si basa esclusivamente sulla mancata reattivit delle emazie con deboli espressioni antigeniche, come ad esempio nel caso di cellule eterozigoti (vedi in questo capitolo Variazioni nellespressione antigenica). Calcolo delle probabilit Per poter identificare con certezza un anticorpo ed essere certi che il profilo di reattivit non sia casuale, necessario che il siero in esame venga cimentato con un numero sufficiente di campioni di emazie sulle quali non sia presente lantigene corrispondente e con un numero sufficiente di emazie sulle quali invece tale antigene sia presente. Un approccio standard (basato sul metodo esatto di Fisher)10 richiede che per ciascuna specificit identificata, tre campioni di emazie positive per lantigene risultino reattivi e tre campioni di emazie negative per lantigene risultino non reattivi. Questo approccio standard pur non essendo sempre realizzabile, risulta efficace nella pratica, in particolare quando siano disponibili emazie test con forti espressioni antigeniche. Un approccio in qualche modo meno vincolante derivato dalle analisi statistiche di Harris e Hochman11, sulla base delle quali i requisiti minimi per un indice di probabilit (p) di 0,05 sono soddisfatti quando si hanno a disposizione due cellule positive e tre negative, oppure una cellula positiva e sette negative (oppure il reciproco di entrambe le combinazioni). I valori di riferimento degli indici di probabilit (p) sono riportati nella Tabella 19.2. Anche lutilizzo di due cellule positive e due negative considerato un approccio accettabile per la conferma della specificit anticorpale12. Ulteriori dettagli sul calcolo delle probabilit possono essere reperiti nei lavori di Race e Sanger, di Menitove e di Kanter (vedi letture consigliate). Va sempre presa in considerazione la possibilit di risultati falsamente negativi con cellule positive per lantigene, cos come quella di reazioni positive
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Tabella 19.2 - Valori di probabilit N test 5 6 6 7 7 8 8 8 8 9 9 9 10 10 10 10 10 N positivi 3 4 3 5 4 7 6 5 4 8 7 6 9 8 7 6 5 N negativi 2 2 3 2 3 1 2 3 4 1 2 3 1 2 3 4 5 p (Fisher)10 0,100 0,067 0,050 0,048 0,029 0,125 0,036 0,018 0,014 0,111 0,028 0,012 0,100 0,022 0,008 0,005 0,004 p (Harris e Hochman)11 0,035 0,022 0,016 0,015 0,008 0,049 0,011 0,005 0,004 0,043 0,008 0,003 0,039 0,007 0,002 0,001 0,001
inattese, ad esempio falsi positivi, determinati dalla presenza di specificit anticorpali aggiuntive o errori nellinterpretazione dellidentificazione anticorpale. Fenotipo delle emazie autologhe Una volta che sia stato provvisoriamente identificato lanticorpo nel siero, spesso risulta utile dimostrare la presenza o lassenza del corrispondente antigene sulle emazie autologhe. Ad esempio se si sospetta che nel siero di un individuo non trasfuso sia presente un anticorpo ad apparente specificit anti-Fya e le emazie autologhe risultano TAD negative e Fy(a+), siamo in presenza di dati discrepanti e sono necessari ulteriori accertamenti. La determinazione del fenotipo delle emazie autologhe pu risultare difficoltosa se il paziente stato trasfuso di recente, in genere nellarco degli ultimi 3 mesi. La determinazione del fenotipo pu essere effettuata su un campione di sangue prelevato prima della trasfusione, se disponibile. In alternativa le emazie autologhe possono essere separate dalle emazie trasfuse, e
successivamente tipizzate (vedi Metodi 2.15 e 2.16). Luso di potenti reattivi diagnostici, di controlli appropriati e lattenta osservazione delle reazioni a campo misto, permettono spesso la determinazione del fenotipo senza la necessit di separare le cellule. Tuttavia i risultati della tipizzazione eritrocitaria di un campione in pazienti recentemente trasfusi, possono risultare ingannevoli e devono essere interpretati con grande cautela. Nel caso in cui vi sia una presumibile certezza riguardo lidentificazione della specificit anticorpale, non appaiono necessari ulteriori sforzi eccessivi per ottenere la separazione delle emazie e la successiva tipizzazione delle emazie autologhe. La negativit delle prove crociate con il test allantiglobulina14(p40), con emazie di donatori privi dellantigene corrispondente, rappresenta unulteriore conferma della specificit anticorpale. I test definitivi sulle emazie autologhe potranno essere eseguiti dopo adeguato periodo di tempo, in assenza di ulteriori trasfusioni. Nei pazienti sottoposti a trasfusioni continuative i test definitivi potranno essere eseguiti solo dopo un adeguato
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intervallo durante il quale il paziente sia stato trasfuso solo con emazie negative per lantigene; ogni cellula positiva per lantigene rilevata dopo tale periodo di tempo deve essere presumibilmente considerata come una cellula del paziente stesso.
Problemi complessi di identificazione anticorpale

Non tutte le identificazioni anticorpali risultano semplici. La procedura di esclusione non sempre permette di arrivare ad una risposta univoca e per la soluzione del problema possono rendersi necessari approcci alternativi. La Figura 19.1 presenta alcuni possibili approcci per lidentificazione anticorpale in una variet di situazioni in cui il controllo autologo negativo. Ulteriori approcci necessari in presenza di controllo autologo positivo, saranno discussi pi avanti in questo capitolo. Variazioni nellespressione antigenica Per una serie di ragioni, non sempre gli anticorpi reagiscono con tutte le emazie che posseggono lantigene corrispondente. Lapplicazione della regola di esclusione precedentemente descritta, pu comportare lesclusione di una determinata specificit anticorpale se il siero in esame risulta non reattivo con un campione di emazie che esprimono lantigene corrispondente, ci malgrado lanticorpo sia realmente presente. Le possibili cause sono rappresentate da errori tecnici, dalla presenza di anticorpi debolmente reattivi o di varianti antigeniche o antigeni a debole espressione. Per tale ragione, ogni qualvolta sia possibile, una determinata specificit anticorpale deve essere esclusa solo sulla base della mancata reattivit con emazie che notoriamente presentano una forte espressione antigenica. Le tecniche che utilizzano mezzi potenzianti sono spesso utili nella soluzione dei problemi associati alla variabilit dellespressione antigenica (vedi Metodi 3.2.2., 3.2.3., 3.2.4., 3.2.5. e 3.2.6). Zigosit Lintensit di reazione di alcuni anticorpi pu
variare da un campione di emazie ad un altro a causa di un fenomeno noto come effetto dose in base al quale alcuni anticorpi reagiscono preferibilmente con le emazie di individui omozigoti per lallele che determina la presenza dellantigene (portatori cio dellantigene in doppia dose). Tali anticorpi possono non reagire o reagire debolmente con emazie di individui eterozigoti per lallele in questione, sulle quali lantigene espresso in quantit inferiore. Gli alloanticorpi mostrano comportamenti variabili nella loro tendenza a manifestare leffetto dose. Molti anticorpi appartenenti ai sistemi gruppoematici Rh, Duffy, MNS e Kidd presentano questa caratteristica. Variazione negli adulti e nei neonati Lespressione di alcuni antigeni (ad esempio I, P1, Lea e Leb) sulle emazie di differenti donatori adulti pu variare notevolmente da soggetto a soggetto. Tale diversa espressione antigenica non dipende dalla zigosi; tuttavia, le differenze antigeniche possono essere evidenziate sierologicamente. Alcuni anticorpi (per esempio, anti-I, -Lea) reagiscono pi debolmente con le emazie del cordone ombelicale rispetto a quelle di soggetti adulti (vedi Tabella 19.3). Cambiamenti dovuti alla conservazione Talora gli anticorpi gruppoematici possono dare reazioni pi deboli con emazie conservate rispetto a quelle ottenute con emazie fresche. Alcuni antigeni (ad esempio: Fya, Fyb, M, P1, Kna/McCa, Bg)17 si deteriorano pi rapidamente di altri durante la conservazione e lentit del deterioramento varia tra le emazie di differenti donatori. Poich le emazie dei donatori sono di solito pi fresche rispetto alle emazie del commercio, alcuni anticorpi danno reazioni pi intense con sospensioni eritrocitarie di donatori rispetto a quelle delle emazie test. La conservazione degli eritrociti allo stato congelato pu comportare un deterioramento degli antigeni che pu a sua volta causare risultati ingannevoli nellidentificazione delle specificit anticorpali. Il pH o altre propriet delle soluzioni utilizzate per la conservazione possono influire sul grado di
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PANNELLO DI IDENTIFICAZIONE POSITIVO AUTOCONTROLLO NEGATIVO ALCUNE EMAZIE POSITIVE (STESSA INTENSIT E FASE) ALCUNE EMAZIE NEGATIVE Sospetto anticorpo singolo - Esaminare altre emazie selezionate per eliminare le altre specificit. - Esaminare le emazie del paziente per confermare lassenza dellantigene.
TUTTE LE EMAZIE POSITIVE (STESSA INTENSIT E FASE) Sospetto anticorpo specifico per un antigene ad alta frequenza (vedi anche anticorpi multipli) - Esaminare le emazie negative per antigeni ad alta incidenza - Pu essere necessaria lassistenza di un laboratorio di riferimento per lidentificazione o la conferma - Esaminare le emazie del paziente per confermare o escludere la/le specificit anticorpale/i.
Figura 19.1 - Approccio sistematico per lidentificazione degli anticorpi (da Brendel, adattamento autorizzato)15.
TUTTE LE EMAZIE POSITIVE (CON DIFFERENTI INTENSIT E/O FASE) Sospetti anticorpi multipli
PRESENZA DI DEBOLE REATTIVIT CON ALCUN EMAZIE, ESCLUDIBILI TUTTE LE SPECIFICIT Sospetto anticorpo debolmente reattivo o anticorpo che presenta effetto dose - Tecniche potenzianti (pannello in enzimi, incrementare la quantit di siero utilizzato, incrementare il tempo di incubazione). - Esaminare le emazie del paziente per confermare o escludere la/le specificit anticorpale/i.
ALCUNE EMAZIE POSITIVE (CON DIFFERENTI INTENSIT E/O FASE) E ALCUNE EMAZIE NEGATIVE) Sospetti anticorpi multipli
Esaminare delle emazie selezionate per confermare ed eliminare delle specificit Possono essere utili tecniche aggiuntive (enzimi) Esaminare le emazie del paziente per confermare lassenza degli antigeni POSITIVIT DI UN SINGOLO CAMPIONE DI EMAZIE (EMAZIE TEST O DI UN DONATORE) Sospetto anticorpo specifico per un antigene a bassa frequenza o un anticorpo specifico per antigeni HLA
Esaminare le emazie positive per antigeni a bassa frequenza o fortemente positive per antigeni HLA Pu essere necessario il parere di un laboratorio di riferimento per lidentificazione o la conferma.
Tabella 19.3 - Espressione degli antigeni sulle emazie del cordone ombelicale* Espressione Negativa Debole Forte Antigeni Lea, Leb, Sda, Ch, Rg, AnWj I, H, P1, Lua, Lub, Yta, Vel, Bg, McCa, Yka, S1a, Csa, Hy, Gy, Joa, Doa,Dob,Fy3 i, LWa, LWb
* Da Reid e Lomas-Francis16, adattamento autorizzato.
conservazione degli antigeni eritrocitari17,18. Ad esempio, gli antigeni Fya e Fyb possono essere indeboliti quando le emazie sono conservate in un mezzo di sospensione con un basso pH e a bassa forza ionica. Alternativamente, certi anticorpi possono presentare reazioni pi intense o pi deboli con le emazie test fornite da produttori diversi che utilizzino mezzi di sospensione differenti. Let e la natura dei campioni di sangue devono essere tenute in considerazione quando si effettuano le tipizzazioni eritrocitarie. Gli antigeni di emazie derivanti da campioni coagulati tendono a deteriorarsi pi rapidamente rispetto a quelli presenti su campioni di emazie prelevate con anticoagulanti citratati, come lACD o il CPD. I globuli rossi delle unit trasfusionali prelevate con questi anticoagulanti, generalmente assicurano lintegrit dei loro antigeni per una durata pari alla durata standard dellemocomponente. I campioni raccolti in EDTA sono utilizzabili per la tipizzazione antigenica fino al 14 giorno; in ogni caso quando si utilizzano campioni del commercio necessario seguire le istruzioni fornite dai produttori19. Nessuna specificit identificabile Oltre alla variabilit nellespressione antigenica, altri fattori possono contribuire a creare difficolt nellinterpretazione dei risultati dei test di identificazione anticorpale. Se la reattivit rilevata con il siero molto debole e/o il cross out ha portato allesclusione di tutte le probabili specificit, per linterpretazione dei risultati necessario ricorrere ad approcci alternativi.
Antigeni presenti in comune Anzich escludere gli anticorpi specifici per gli antigeni delle cellule non reattive, possibile prendere in considerazione gli antigeni che le cellule reattive presentano in comune. Ad esempio, se tutte le cellule reattive a temperatura ambiente sono P1+, sebbene non tutte le cellule P1+ reagiscano, pu essere presente un anticorpo anti-P1 che non reagisce con le emazie che presentano una pi debole espressione antigenica (talvolta tali cellule sono indicate sulla scheda relativa al pannello con il +w). Sulla base di questa ipotesi, pu essere indicato lutilizzo di un metodo in grado di incrementare la reattivit dellanti-P1, come ad esempio lincubazione a temperature pi basse. Se tutte le cellule reattive sono Jk(b+), ma non tutte le cellule Jk(b+) reagiscono, possibile che la reattivit riguardi solo e tutte le emazie Jk(ab+) che esprimono lantigene in doppia dose. Le metodiche che utilizzano mezzi potenzianti quali enzimi, LISS o PEG, possono consentire di dimostrare la reattivit dellanticorpo anche con le rimanenti emazie Jk(b+). Pu essere estremamente utile eseguire in tal caso la tipizzazione delle emazie del paziente e la conferma che esse sono negative per lantigene corrispondente. Variabilit intrinseca Profili di reattivit incerti, poco chiari, che non sembrano adattarsi ad alcuna particolare specificit, sono caratteristici di anticorpi come gli anti-Bga, che reagiscono con antigeni HLA presenti sui globuli rossi. Questi antigeni presentano unampia variabilit di espressione sugli eritrociti
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di soggetti differenti. Raramente, pur in presenza di un profilo chiaro di reazioni positive e negative, linterpretazioni pu non essere possibile a causa di unerrata tipizzazione antigenica delle emazie test. Se si tratta di un pannello del commercio, il fornitore deve essere immediatamente informato della discrepanza. Antigeni non presenti nellelenco Talvolta un campione di siero reagisce con un antigene non routinariamente riportato nel profilo antigenico allegato al pannello diagnostico, un esempio lYtb. Anche nel caso in cui lesame del siero dia origine ad un chiaro profilo di reazioni positive e negative, la specificit anti-Ytb pu non essere sospettata. In tali circostanze, utile chiedere al produttore del pannello diagnostico ulteriori informazioni sul fenotipo delle emazie risultate reattive. Se disponibile il relativo antisiero, possibile effettuare la tipizzazione per lantigene in questione delle emazie test risultate reattive, di quelle non reattive e delle emazie autologhe. Questo tipo di problematica richiede spesso linvio del campione ad un Centro Immunoematologico di Riferimento. Gruppo ABO delle emazie esaminate Un campione di siero pu reagire con tutte o con la maggior parte delle emazie test di gruppo O, ma non con emazie dello stesso gruppo ABO del soggetto. Questo si osserva molto frequentemente quando sono presenti anticorpi anti-H, -IH e LebH. Le emazie di gruppo O ed A2 esprimono unabbondante quantit di sostanza H, mentre quelle A1 ed A1B ne posseggono solo piccole quantit. (vedi Capitolo 13). Per tale motivo i sieri che contengono anticorpi anti-H o -IH reagiscono intensamente con le emazie di gruppo O, mentre non reagiscono o reagiscono debolmente con le emazie autologhe o le emazie di donatori di gruppo A1 o A1B. Lanti-Le bH reagisce intensamente con le emazie di gruppo O Le(b+), ma non reagisce o lo fa debolmente con le emazie Le(b+) di soggetti di gruppo A1 o A1B. La presenza di tali anticorpi deve essere sospettata quando la ricerca anticorpale eseguita con emazie test di gruppo O risulta
intensamente positiva, mentre le prove di compatibilit con unit di sangue di donatori di gruppo A1 o A1B risultano compatibili. Miscela di anticorpi Quando un siero contiene due o pi alloanticorpi, i risultati ottenuti con un singolo pannello di emazie test possono essere di difficile interpretazione. La presenza di una miscela di anticorpi pu essere suggerita da una variet di risultati. 1. Linsieme di reazioni positive e negative ottenute non coincide con quello di una singola specificit anticorpale. Se il criterio dellesclusione non consente di identificare uno specifico profilo anticorpale, pu essere utile verificare se il profilo delle reattivit ottenute coincide con quello di due anticorpi combinati in miscela. Ad esempio, se le cellule reattive (vedi Tabella 19.1) sono in posizione 2, 4, 5 e 7, nessuna delle specificit non escluse dopo il crossing out soddisfa esattamente tale profilo, ma se vengono considerati insieme lanti-K e lanti-E, si ottiene un profilo coincidente al profilo di reattivit. Le emazie 2 e 7 reagiscono per la presenza dellanti-K, le emazie 4 e 5 per la presenza dellanti-E. Se il profilo di reattivit non coincide con il profilo di due specificit anticorpali, si deve considerare la possibilit della presenza contemporanea di pi di due anticorpi. Quanti pi anticorpi sono presenti in miscela in un siero, tanto pi complessa sar lidentificazione e lesclusione delle specificit anticorpali, ma il procedimento di base rimane lo stesso. 2. La reattivit si manifesta in differenti fasi del test. Se la reattivit si manifesta in fasi diverse del test, ogni fase deve essere valutata separatamente. Il profilo di reattivit a temperatura ambiente pu indicare una specificit anticorpale differente rispetto a quello osservato nella fase dellantiglobulina. inoltre importante osservare anche la variabilit dellintensit delle reazione rilevate in ciascuna fase del test. La Tabella 15.2
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fornisce le informazioni relative alle caratteristiche della varie fasi di reattivit dei singoli anticorpi. 3. Nelle prove condotte per confermare la specificit ipotizzata di un singolo anticorpo si ottengono reazioni inattese. Se un siero in cui si sospetta la presenza di un anti-e reagisce con ulteriori campioni di emazie e, tale siero pu contenere un ulteriore anticorpo, oppure lanticorpo incriminato non un anti-e. Limpiego di un pannello di emazie selezionate e pu risultare utile per evidenziare ulteriori specificit anticorpali. 4. Non si ottiene alcun profilo di reattivit identificabile. Quando le reazioni osservate presentano variazioni di intensit che non possono essere spiegate sulla base delleffetto dose o di altre possibili variazioni dellespressione antigenica, sono indicati approcci e metodi di indagine aggiuntivi. Alcuni passaggi utili sono i seguenti: a. nel caso di reazioni positive intense, utilizzare il criterio dellesclusione valutando le emazie non reattive, in modo da eliminare gi dallinizio alcune specificit anticorpali; b. nel caso di reazioni positive deboli o dubbie, cimentare il siero con emazie che esprimono fortemente gli antigeni corrispondenti ad ogni specificit anticorpale sospetta, associando a ci luso di metodi in grado di potenziare lintensit di reazione; c. se il paziente non stato trasfuso di recente, tipizzare le emazie autologhe ed eliminare dalle ipotesi iniziali tutte le specificit corrispondenti agli antigeni presenti su tali emazie; d. utilizzare metodi per inattivare determinati antigeni eritrocitari (ad esempio trattamento enzimatico per rendere le emazie test negative per antigeni quali Fya, Fyb ed S; e. utilizzare le procedure di assorbimento/ eluizione per separare gli anticorpi presenti nella miscela; f. incrementare la reattivit anticorpale
utilizzando metodi pi sensibili (ad esempio il PEG). Questi ed altri metodi utili alle indagini sono illustrati nei paragrafi successivi. Anticorpi diretti contro antigeni ad alta frequenza La presenza di un alloanticorpo diretto contro un antigene ad alta frequenza deve essere sospettata quando il siero in esame reagisce con tutti i campioni di emazie test, in particolare se fase ed intensit di reazione sono uniformi e il controllo autologo risulta negativo. Gli anticorpi diretti verso tali antigeni possono essere identificati cimentando il siero con emazie di fenotipi rari opportunamente selezionate e tipizzando le emazie del paziente con sieri contenenti anticorpi specifici per gli antigeni ad alta frequenza. La conoscenza della razza o dellorigine etnica del paziente utile per stabilire quali test aggiuntivi possono essere eseguiti. I globuli rossi null, cio privi di tutti gli antigeni di un determinato sistema (ad esempio Rh null o K o) oppure le emazie opportunamente modificate (ad esempio emazie trattate con il ditiotreitolo, vedi Metodo 3.10) possono aiutare a limitare le possibili specificit anticorpali ad un particolare sistema gruppoematico. In alcuni casi, se non sono disponibili le cellule negative per un particolare antigene ad alta frequenza, possono risultare utili le cellule positive per i corrispondenti antigeni a bassa frequenza. Ad esempio, il riscontro di una pi debole reattivit del siero in esame con le emazie Co(a+b+) rispetto a quella espressa con le pi comuni emazie Co(a+b), pu suggerire la presenza di un anti-Coa. Gli anticorpi specifici per gli antigeni ad alta frequenza possono talora essere associati, nello stesso siero, con altri anticorpi diretti verso antigeni comuni e ci pu rendere lidentificazione anticorpale molto pi difficoltosa. Poich la disponibilit di emazie negative per gli antigeni ad alta frequenza limitata, pu rendersi necessario linvio del campione di sangue con sospetti anticorpi specifici per tali antigeni ad un laboratorio di immunoematologia di riferimento, provvisto di tali emazie.
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Indizi sierologici La conoscenza delle caratteristiche sierologiche di particolari anticorpi specifici per antigeni ad alta frequenza pu risultare utile nellorientare efficacemente il processo di identificazione. 1. Le reattivit nei test a temperatura ambiente suggerisce la presenza di anti-H, -I, -P1, -P, -PP1Pk (Tja), -LW (alcuni), -Ge (alcuni), -Sda o -Vel. 2. Lemolisi delle emazie test, quando esaminate con sieri freschi, caratteristica degli anti-Vel, -P, - PP1Pk ed anti-Jk3. Lemolisi stata inoltre osservata con alcuni esempi di anti-H ed anti-I. 3. La perdita o riduzione di reattivit nei test enzimatici si rileva quando sono presenti anti-Ch, -Rg, -Inb e -JMH o -Ge2 e in alcuni casi con anti-Yta. 4. Reazioni deboli o incostanti nei test allantiglobulina sono spesso associate con anti-Kna, -McCa, -Yka e -Csa, ma si osservano anche in presenza di autoanticorpi leganti il complemento, come lanti-I, quando il test venga eseguito utilizzando sieri antiglobuline polispecifici. 5. In pazienti di razza nera deve essere sospettata la presenza di anti-McCa, -Sla, -Jsb, -Hy, -Joa, -Tca, -Cra e -Ata in quanto i relativi antigeni sono assenti quasi esclusivamente nei soggetti di questa razza. I soggetti con anti-Kpb sono quasi sempre di razza bianca. Lanti-Dia viene generalmente trovato tra gli Asiatici, gli Indiani Sudamericani e le popolazioni di Nativi Americani16(pp526,527). Interpretazione di un TAD positivo Quando un paziente produce anticorpi diretti verso antigeni ad alta frequenza dopo una trasfusione, le emazie del campione post-trasfusionale possono presentare un TAD positivo e sia leluato, che il siero, possono risultare reattivi con tutte le emazie test impiegate. Tale profilo di reattivit identico a quello che viene prodotto da molti autoanticorpi caldi, i quali pure possono comparire dopo una trasfusione; questi due differenti scenari possono risultare estremamente difficili da differenziare. In teoria un
alloanticorpo verso un antigene ad alta frequenza dovrebbe produrre un TAD con aspetto a campi misti (ad esempio alcuni agglutinati dispersi tra molte cellule non agglutinate) in quanto solo le emazie trasfuse saranno state sensibilizzate dallalloanticorpo. In pratica, tuttavia, una sensibilizzazione con aspetto a campi misti pu essere difficilmente differenziabile da una sensibilizzazione debole. Nel caso in cui non sia disponibile un campione di sangue pre-trasfusionale, si pu ricorrere alle procedure di separazione per isolare le emazie autologhe sulle quali effettuare i test. Lesecuzione di un TAD sulle emazie autologhe, e/o il test tra le emazie autologhe con TAD negativo ed un campione di siero post-trasfusionale, possono risultare utili per differenziare gli alloanticorpi dagli autoanticorpi. Nel Capitolo 15 sono illustrate ulteriori caratteristiche sierologiche degli anticorpi reattivi con gli antigeni eritrocitari ad alta frequenza. Anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza La reattivit di un campione di siero nei confronti delle emazie di un singolo donatore o di un solo campione di emazie test, pu essere dovuta alla presenza di anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza, come ad esempio lanti-Wra. In questi casi il siero in esame pu essere cimentato con emazie test, se disponibili, note per la presenza dellantigene corrispondente o in alternativa il campione di emazie reattivo pu essere tipizzato con antisieri contenenti anticorpi specifici per gli antigeni a bassa frequenza. Spesso in uno stesso siero sono presenti contemporaneamente pi anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza; in questi casi la conferma delle specificit sospettate richiede lesperienza e i mezzi tecnici di un laboratorio di riferimento. Strategie sierologiche Se si sospetta la presenza di un anticorpo diretto contro un antigene a bassa frequenza, non opportuno procrastinare la trasfusione in attesa dei risultati. Se viene ipotizzata la presenza nel siero di una donna in gravidanza di un anticorpo
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diretto contro tali antigeni, pu essere effettuato lesame di tale siero con le emazie paterne e questo pu essere predittivo di una eventuale incompatibilit materno-fetale, rendendo superflua lidentificazione dalla specificit anticorpale. Se un neonato presenta un TAD positivo, possono essere testati il siero materno o leluato ottenuto dalle emazie neonatali, con le emazie paterne se queste sono ABO compatibili; tali esami possono spiegare la positivit del TAD con la probabile presenza di un anticorpo diretto contro antigeni a bassa frequenza e in tal caso lidentificazione dellanticorpo risulta generalmente di scarsa importanza. Alcuni laboratori di riferimento non procedono allidentificazione degli anticorpi diretti contro gli antigeni a bassa frequenza perch essi sono spesso di solo interesse accademico. possibile procedere allidentificazione se vi una sufficiente disponibilit di tempo e quando sono disponibili i reattivi idonei. Risultati positivi inattesi Quando un campione di siero reagisce con una cellula di un pannello eritrocitario nota per la presenza di un antigene a bassa frequenza, non in genere necessario eseguire ulteriori test per escludere con certezza la presenza dellanticorpo corrispondente. Per ogni antigene a bassa frequenza riportato sulle emazie di un pannello, ce ne sono molti altri non indicati e non escludibili negli esami di routine. La reattivit contro antigeni a bassa frequenza non eccezionale; sebbene tali antigeni siano rari, gli anticorpi diretti contro di essi sono molto meno infrequenti. Spesso vengono evidenziati accidentalmente nel corso della valutazione di un siero contenente qualche altro anticorpo. Ci pu complicare linterpretazione dei risultati ottenuti con un determinato pannello di identificazione, ma raramente richiede la conferma della specificit dellanticorpo o la tipizzazione delle emazie del donatore per escludere la presenza dellantigene corrispondente. Nel caso in cui si ritenga opportuna tale tipizzazione, per dimostrare lassenza dellantigene a bassa frequenza, sufficiente una prova di compatibilit negativa con
il siero del paziente. Molti anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza reagiscono solo a temperature inferiori ai 37 C e sono di dubbio significato clinico. Quando il siero di un paziente reagisce esclusivamente con le emazie di un solo donatore o contro una singola emazia test, deve essere accertato che tali emazie non siano ABO incompatibili e/o non abbiano un TAD positivo o siano poliagglutinabili. Anticorpi diretti contro componenti dei reattivi ed altre reazioni sierologiche anomale La presenza di anticorpi diretti verso farmaci e sostanze additive pu essere causa di risultati positivi nei test di ricerca e di identificazione anticorpale. I meccanismi sono probabilmente simili a quelli discussi nel Capitolo 20. La maggior parte di queste reazioni anomale rappresentano fenomeni in vitro che non hanno alcun significato dal punto di vista trasfusionale, tranne quello di causare difficolt nellinterpretazione dei test con conseguente ritardo nelleffettuazione della trasfusione. Tali reazioni anomale possono talora essere responsabili di una errata interpretazione della tipizzazione ABO, con conseguente reale pericolo per il paziente. Per una discussione pi approfondita, vedi Garratty (letture consigliate). Componenti delle soluzioni conservanti Gli anticorpi che reagiscono con sostanze presenti nella soluzione usata per la conservazione delle emazie test (ad esempio cloroanfenicolo, neomicina, tetracicline, idrocortisone, EDTA, caprilato di sodio o diversi polisaccaridi) possono causare lagglutinazione delle emazie sospese in tali soluzioni. La reattivit pu verificarsi con emazie commerciali fornite da produttori differenti o pu essere limitata alle emazie fornite da un singolo produttore. Il controllo autologo in genere negativo, a meno che le emazie del paziente vengano sospese nella stessa soluzione conservante delle emazie test o in soluzioni similari. Tali reazioni possono in genere essere eliminate con il lavaggio delle emazie test mediante
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soluzione fisiologica, prima dellesecuzione dellesame. La conferma pu essere ottenuta dal fatto che il controllo autologo, precedentemente negativo, diventa positivo se le emazie del paziente vengono sospese nella stessa soluzione conservante delle emazie test. In alcuni casi, tuttavia, il lavaggio degli eritrociti test non annulla totalmente la reattivit e la risoluzione del problema pu risultare pi complessa. Componenti dei mezzi potenzianti Anticorpi diretti contro altre sostanze presenti nei reattivi quali i preparati commerciali di LISS o di albumina bovina, possono causare agglutinazione delle emazie di donatori e/o delle emazie autologhe, quando il test viene eseguito in presenza di tali sostanze. Le sostanze implicate includono i parabenzoati (in alcuni additivi LISS), il caprilato di sodio (in alcune albumine), e il timerosal (in alcune preparazioni LISS/salina). La presenza di anticorpi specifici per tali componenti dei mezzi potenzianti pu essere sospettata se il controllo autologo risulta positivo e il TAD delle emazie autologhe negativo. Lesclusione del mezzo potenziante di solito elimina questo tipo di reattivit. In alcuni casi, anticorpi correlati a particolari sostanze presenti nei reattivi possono presentare una reattivit gruppospecifica, come ad esempio lanti-Jka parabezoato-dipendente e lanti-c caprilato-dipendente. Il controllo autologo pu risultare reattivo se le emazie del paziente esprimono lantigene, ma il TAD deve essere negativo. Reazioni anomale legate ai globuli rossi Let dei globuli rossi pu causare reazioni sierologiche anomale. Esistono anticorpi diretti verso le emazie conservate e tali anticorpi possono causare lagglutinazione delle emazie in tutte le fasi e lintensit della reazione pu venire incrementata dagli enzimi. Tale reattivit non modificata dal lavaggio delle emazie e il controllo autologo risulta normalmente negativo. I test eseguiti utilizzando emazie fresche appena prelevate, ad esempio dal donatore o dal paziente, risultano inoltre negativi.
Paziente con controllo autologo positivo In assenza di trasfusioni recenti La reattivit del siero con le emazie autologhe pu indicare la presenza di un autoanticorpo (vedi Capitolo 20). Se tale reattivit si manifesta a temperatura ambiente o a temperature inferiori, si tratta spesso di autoanticorpi a specificit anti-I o di altre autoagglutinine fredde. La reattivit del controllo autologo nella fase dellantiglobulina, equivale di solito al TAD positivo e suggerisce la possibile presenza di autoanticorpi. Se, in aggiunta, il siero in esame reagisce con tutte le emazie test, pu rendersi necessario lautoassorbimento o altre procedure specifiche allo scopo di evidenziare nel siero eventuali alloanticorpi clinicamente significativi mascherati dagli autoanticorpi. Nel caso in cui il siero non sia reattivo o presenti una reattivit debole, lanalisi delleluato pu consentire una migliore dimostrazione degli autoanticorpi. Un TAD negativo con un controllo autologo positivo nel test allantiglobulina, insolito e pu indicare la presenza di anticorpi diretti contro sostanze presenti nei reattivi; tali anticorpi causano la reattivit in vitro con tutte le emazie utilizzate, comprese le autologhe. Pi raramente tale situazione pu dipendere dalla presenza di autoanticorpi caldi o di autoagglutinine fredde, come lanti-I, -IH o -Pr, che reagiscono nella fase dellantiglobulina in presenza di mezzi potenzianti. Autoanticorpi freddi. Potenti autoagglutinine fredde reattive con tutte le emazie, incluse quelle autologhe, possono creare problemi rilevanti, specialmente quando la reattivit persiste a temperature superiori a quella ambiente. Le autoagglutinine fredde possono essere benigne o patologiche (vedi Capitolo 20 per una discussione pi approfondita). Vi sono differenti approcci per esaminare un siero con una potenti autoagglutinine fredde. Un possibile approccio quello di accertare se lampiezza termica sufficientemente elevata (di solito uguale o superiore a 30 C) da consentire che lautoanticorpo risulti clinicamente significativo.
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Per identificare lautoanticorpo e determinarne lampiezza termica, occorre evitare lautoassorbimento in vitro, utilizzando un prelievo fresco mantenuto a 37C fino al momento della separazione del siero. Al fine di rilevare la presenza nel siero in esame di eventuali alloanticorpi clinicamente significativi, si possono utilizzare metodi semplici che consentono di evitare linterferenza degli autoanticorpi. Le procedure utili per evidenziare eventuali alloanticorpi in un siero in cui siano presenti autoagglutinine fredde, sono discusse nel Capitolo 20 ed includono: 1. tecniche di preriscaldamento, nelle quali le emazie ed il siero da esaminare e la soluzione salina per i lavaggi, sono mantenuti a 37 C prima di procedere allesecuzione dei test (vedi Metodo 3.3); 2. uso di anti-IgG al posto del siero antiglobuline polispecifico. 3. autoassorbimento del siero a freddo, per rimuovere gli autoanticorpi ma non gli alloanticorpi; 4. autoassorbimento del siero con emazie di coniglio. Comportamento in presenza di autoanticorpi caldi. I pazienti che presentano nel loro siero autoanticorpi caldi costituiscono un serio problema in quanto tali anticorpi sono in grado di reagire teoricamente con tutte le emazie utilizzate. Nel caso in cui questi pazienti debbano essere trasfusi, importante riconoscere leventuale presenza nel siero di alloanticorpi clinicamente significativi mascherati dagli autoanticorpi. Le tecniche idonee sono discusse nel Capitolo 20 e nei Metodi 4.9, 4.10, 4.11 e 4.12. La reattivit della maggior parte degli autoanticorpi caldi viene significativamente incrementata con le metodiche che impiegano PEG o enzimi e meno con il LISS e lalbumina. Pu quindi essere vantaggioso eseguire la ricerca anticorpale senza i mezzi potenzianti generalmente utilizzati. Se tale ricerca risulta negativa, pu essere usata la stessa procedura per lesecuzione delle prove di compatibilit, senza necessit di ricorrere allautoassorbimento.
In presenza di trasfusioni recenti Se il controllo autologo positivo nella fase dellantiglobulina, possono essere presenti nel sangue del paziente globuli rossi sensibilizzati che determinano la positivit del TAD con aspetto a campi misti. Pu essere utile eseguire leluizione, specialmente se le indagini sul siero non risultano conclusive. Per esempio, un paziente recentemente trasfuso pu avere un controllo autologo positivo ed un siero che reagisce debolmente con molte, ma non tutte, le emazie Fy(a+). Pu essere possibile confermare la specificit anti-Fya mediante leluizione, la quale concentra in un piccolo volume di liquido le molecole anticorpali presenti in scarso numero sui globuli rossi di un campione di sangue intero. raro che le emazie trasfuse diano un controllo autologo positivo in altre fasi del test, ma ci pu verificarsi, specialmente nel caso di alloanticorpi in via di formazione o di alloanticorpi freddi. Se il TAD positivo non presenta un aspetto a campi misti e in particolare, se il siero reagisce con tutte le emazie test utilizzate, deve essere presa in considerazione la possibilit della presenza di autoanticorpi. In tal caso levidenziazione di eventuali alloanticorpi mascherati pu richiedere lassorbimento con emazie allogeniche opportunamente selezionate. Laccurata fenotipizzazione delle emazie con TAD positivo pu risultare difficoltosa in qualunque paziente, indipendentemente dal fatto che abbia ricevuto o meno trasfusioni recenti. Il TAD positivo determina la reattivit delle emazie in qualunque test che richieda luso del siero antiglobuline e anche con alcuni antisieri ad elevato contenuto proteico (in particolare quelli del sistema Rh). Con rare eccezioni tuttavia, la maggior parte dei reattivi monoclonali non utilizzano il TAI e possono fornire una valida fenotipizzazione, malgrado la positivit del TAD20. Laboratori di immunoematologia di riferimento Quando i problemi di identificazione anticorpale non possono essere risolti in sede o quando si renda necessaria la disponibilit di sangue raro, possibile chiedere lassistenza e la consulenza
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dei laboratori di riferimento per limmunoematologia, i quali hanno possibilit di accesso allAmerican Rare Donor Program (vedi Metodo 3.13).
Selezione del sangue per la trasfusione

Una volta che un anticorpo stato identificato, importante stabilire qual il suo significato clinico. Gli anticorpi reattivi a 37C e/o nel test allantiglobulina sono potenzialmente clinicamente significativi, mentre quelli reattivi a temperatura ambiente o a temperature inferiori non lo sono; vi sono tuttavia molte eccezioni. Ad esempio, gli anticorpi anti-Ch, anti-Rg e molti di quelli appartenenti ai sistemi Knops e Cost hanno poca o nessuna rilevanza clinica malgrado la loro reattivit con il TAI. Gli anti-Vel, -P e PP1Pk (Tja) possono essere reattivi soltanto a basse temperature ma causare la distruzione degli eritrociti in vivo. La valutazione dei dati riportati in letteratura e la consulenza dei laboratori immunoematologici di riferimento, possono fornire importanti indicazioni sul comportamento clinico delle specificit anticorpali in esame di precedenti casi segnalati. Fenotipizzazione delle unit donate Ogni qualvolta sia possibile, le unit di emazie selezionate per la trasfusione in un paziente che presenta un anticorpo potenzialmente significativo dal punto di vista clinico, devono essere esaminate e risultare negative per lantigene coinvolto. In tutte le trasfusioni successive, a questi pazienti devono essere assegnati concentrati eritrocitari privi dellantigene, anche se lanticorpo non pi rilevabile, allo scopo di prevenire una risposta immunitaria di tipo secondario. Il Servizio Trasfusionale deve mantenere la registrazione di tutti i pazienti nei quali sono stati precedentemente identificati degli anticorpi clinicamente significativi14(pp38,72). Nei pazienti con anticorpi clinicamente significativi evidenziabili nel siero in esame o in precedenti registrazioni, deve essere eseguita la prova crociata con la fase
dellantiglobulina tra il siero del paziente e le emazie del donatore. Per identificare le unit di sangue negative per lantigene deve essere utilizzato un anticorpo sufficientemente potente. Spesso si usano antisieri del commercio, ma al fine di risparmiare reattivi costosi o rari, le unit possono essere selezionate in prima istanza con il siero del paziente. Lassenza dellantigene nelle unit non reattive, deve poi essere confermata con i reattivi commerciali. Se lanticorpo presenta una specificit inusuale o non sono reperibili reattivi commerciali, la selezione delle successive unit da trasfondere pu essere effettuata utilizzando campioni conservati del paziente sensibilizzato, in particolare se nei campioni successivi non pi presente lanticorpo. Se il siero di un paziente deve essere utilizzato come reattivo per la tipizzazione, esso deve essere adeguatamente caratterizzato e mantenere la sua reattivit dopo la conservazione; al momento dellesecuzione dei test devono essere allestiti idonei controlli negativi e debolmente positivi. La FDA ha stabilito i seguenti criteri per lautorizzazione alluso di alcuni reattivi21: 1. anti-K, anti-k, anti-Jka, anti-Fya e anti-Cw: la diluizione 1 a 8 deve dare una reazione di intensit almeno 1+; 2. anti-S, anti-s, anti-P1, anti-M, anti-I, anti-c (salina), anti-e (salina) e anti-A1: la diluizione 1 a 4 deve dare una reazione di intensit almeno 1+; 3. la maggior parte delle altre specificit non diluite devono dare una reazione di intensit almeno 2+. Possono essere utilizzati reattivi preparati in loco da sieri che soddisfano i criteri suddetti. Origine degli anticorpi Quando si devono selezionare unit di sangue per pazienti che presentano anticorpi clinicamente significativi, tali unit devono essere tipizzate utilizzando, secondo alcuni immunoematologi, due antisieri di origine diversa; altri considerano ci non necessario, specialmente quando sia disponibile un reattivo sufficientemente potente.
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Lotti differenti dellantisiero forniti dallo stesso produttore, ed anche reattivi commercializzati da produttori diversi, possono essere stati preparati a partire dalla stessa fonte in quanto i produttori condividono spesso le stesse risorse. Etichettatura delle unit Se ununit di sangue proveniente da unaltra Struttura Trasfusionale deve essere etichettata con i risultati di una particolare tipizzazione antigenica, preferibile che la tipizzazione sia stata effettuata con limpiego di reattivi certificati (commerciali). Se tali reattivi non sono reperibili, lunit pu essere etichettata con unappropriata dicitura (ad esempio Tipizzata e classificata come negativa per lantigene XX, mediante limpiego di reattivi non certificati)22. Non vi alcun obbligo di riportare sulletichetta dellunit i risultati delle tipizzazioni antigeniche, ad eccezione delle tipizzazioni ABO e D. La Struttura Trasfusionale pu tuttavia utilizzare una etichetta abbinata allunit di sangue per evidenziare le ulteriori tipizzazioni antigeniche. Quando eseguire gli esami Per certe specificit anticorpali pu non essere necessaria la tipizzazione delle unit dei donatori e per selezionare unit di emazie sierologicamente compatibili pu essere utilizzato il siero del paziente. Questo particolarmente vero per gli anticorpi che tipicamente reagiscono a temperature inferiori ai 37 C (ad esempio anti-M, -N, -P1, -Leb, -A1) e che normalmente non producono una risposta anamnestica dopo la trasfusione di emazie positive per lantigene relativo. Raramente necessario fornire unit negative per un determinato antigene come misura preventiva per pazienti privi di tale antigene sui loro globuli rossi nei quali non sia stato ancora dimostrato il relativo alloanticorpo. Tuttavia, in alcuni casi, in particolare per certi anticorpi del sistema Rh, possono essere necessari speciali accorgimenti. Secondo alcuni immunoematologi, quando un paziente di fenotipo R1R1, presenta nel siero un anti-E, utile selezionare per le trasfusioni successive unit negative sia per lantigene E che
per il c23, sulla base del fatto che, probabilmente, la stimolazione antigenica che ha determinato la produzione dellanti-E pu aver stimolato anche la formazione di un anti-c o di uno anti-cE, non rilevabili negli esami di routine. Per un paziente di fenotipo R 2 R 2 che presenta un anticorpo anti-C pu essere opportuno per la trasfusione, luso di sangue C ed e. Quando una specificit anticorpale non pu essere chiaramente dimostrata, ma neanche definitivamente esclusa, corretto trasfondere sangue privo dellantigene corrispondente. Esami predittivi del significato clinico degli anticorpi Alcune procedure di laboratorio sono state utilizzate al fine di predire il significato clinico di particolari anticorpi. Lesame con i monociti monostratificati (Monocyte monolayer assay), il quale quantifica la formazione di rosette e/o la fagocitosi delle emazie anticorpo-sensibilizzate, pu essere utilizzato per predire il significato clinico in vivo di alcuni anticorpi. Il test per la citotossicit anticorpo-dipendente (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity), che quantifica lemolisi delle emazie anticorposensibilizzate e il test in chemiluminescenza, che misura il rilascio di radicali dellossigeno dopo la fagocitosi di emazie sensibilizzate da un anticorpo, si sono dimostrati utili per predire la reattivit dellanticorpo in vivo, particolarmente per la valutazione della severit di una MEFN. Nel caso di anticorpi freddi, lo studio dellampiezza termica in vitro pu essere indicativo della probabilit dellinsorgenza di problemi in vivo. Possono essere utilizzati anche esami in vivo per stabilire il significato clinico di un dato anticorpo. La tecnica pi comune linfusione di eritrociti positivi per lantigene, radiomarcati solitamente con51 Cr. Con tale tecnica possibile misurare la sopravvivenza di 1 mL o meno, di emazie infuse. Pu essere utilizzata anche la citofluorimetria a flusso per misurare la sopravvivenza delle emazie, ma di solito necessario infondere unaliquota maggiore di emazie (circa 10 mL). Le piccole aliquote di emazie incompatibili
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possono presentare un tasso di distruzione pi veloce rispetto a quello di un unit di sangue intera. Situazioni in cui si rende necessario sangue di fenotipo raro Il sangue di fenotipo raro comprende non solo le unit negative per antigeni ad alta frequenza, ma anche unit negative per particolari combinazioni di antigeni comuni. Quando un paziente presenta una miscela anticorpale, pu essere utile determinare la frequenza dei donatori compatibili. Per il calcolo, la frequenza casuale di donatori negativi per un antigene deve essere moltiplicata per la frequenza dei donatori negativi per ognuno degli altri antigeni. Per esempio, se un siero contiene lanti-c, -Fya, ed -S e tra i donatori random il 18% sono c, il 34% sono Fy(a) e il 45% sono S, la frequenza delle unit compatibili risulta la seguente: 0,18 x 0,34 x 0,45 = 0,028. Se poi il paziente di gruppo O, dato che il 45% dei donatori di gruppo O, solamente l1,3% (0,028 x 0,45) dei donatori random risulter compatibile con il siero del paziente. Se ciascuno di questi tre anticorpi fosse presente da solo, la ricerca di unit compatibili non sarebbe per nulla difficile. Contrariamente quando i tre anticorpi sono presenti contemporaneamente, necessario testare un grande numero di donatori per poter trovare almeno ununit compatibile. Le procedure di calcolo utilizzano le frequenze relative ai gruppi etnici degli Europei. Se la popolazione dei donatori costituita prevalentemente da soggetti di origine diversa, devono essere utilizzate, se disponibili, le frequenze relative a quel gruppo etnico. Quando sono richieste unit di sangue raro (<1 su 5.000) o non comune (<1 su 1.000), pu essere di grande aiuto l American Donor Program. Questo programma, che accessibile soltanto al personale di un Laboratorio Immunoematologico di Riferimento accreditato, pu identificare possibili fornitori di sangue che dispongono sia di unit trasfusionali idonee (di solito emazie congelate) sia di donatori compatibili, che possono essere convocati per la donazione (vedi Metodo 3.13).
I consanguinei rappresentano unulteriore potenziale sorgente di donatori di sangue raro. I fratelli e le sorelle sono spesso la migliore fonte di sangue compatibile per pazienti con miscele anticorpali o con anticorpi specifici per antigeni ad alta frequenza. Lassenza di antigeni ad alta frequenza solitamente riflette lereditariet da entrambi i genitori, dello stesso gene che codifica il raro gruppo sanguigno; i discendenti di questi genitori possono ereditare gli stessi due alleli rari con una probabilit molto pi alta di quella di soggetti appartenenti alla popolazione generale. Nella maggior parte dei casi il sangue dei genitori del paziente o dei suoi figli (o di qualche fratello o sorella), risulta positivo per lantigene in singola dose; se la trasfusione indispensabile e non vi sono alternative allimpiego di sangue incompatibile, questi donatori eterozigoti devono essere preferiti ai donatori random. Occasionalmente, il sangue di uno dei genitori o di un figlio pu anche essere privo dellantigene ad alta frequenza. Nella MEFN o in altri casi problematici legati alla presenza di alloanticorpi nei neonati, la madre, se ABO compatibile, rappresenta spesso il donatore pi idoneo. Se vengono trasfusi i globuli rossi della madre, molto utile conservare il plasma da utilizzare come reattivo raro. Se la situazione clinica lo consente, per i pazienti per i quali difficile reperire sangue compatibile, deve essere presa in considerazione la possibilit di utilizzare il sangue autologo. Per alcuni pazienti con anticorpi multipli, per i quali la trasfusione di sangue autologo non unopzione praticabile, pu rendersi necessario stabilire quale degli anticorpi presenti possa risultare pi distruttivo, e in caso di situazione critica, assegnare sangue incompatibile per quel particolare antigene. Frequenza di esecuzione dei test anticorpali Una volta che nel siero di un paziente sia stato identificato un anticorpo, con quale frequenza devono essere eseguiti i test di ricerca e di identificazione anticorpale? Una risposta immunitaria di tipo primario produce anticorpi rilevabili in un tempo non inferiore ai 7-10 giorni ma, tipicamente, in un periodo di tempo compreso
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tra 2 settimane e diversi mesi. Una risposta immunitaria di tipo secondario produrr anticorpi rilevabili in un tempo pi breve, talora tra i 2 e i 7 giorni, di solito entro 20 giorni. Shulman24 ha osservato che in un piccolo numero di pazienti, nuovi anticorpi possono essere rilevati entro 1-2 giorni dopo la trasfusione. Gli Standard AABB per le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali14(p38) stabiliscono che per i pazienti che abbiano avuto gravidanze o ricevuto trasfusioni nei tre mesi precedenti, la ricerca degli anticorpi irregolari e le prove di compatibilit devono essere eseguite su campioni ottenuti entro 3 giorni dalla successiva richiesta trasfusionale. Il Servizio Trasfusionale pu considerare preferibile usare un prelievo pi fresco se i dati clinici suggeriscono una sopravvivenza in circolo dei globuli rossi trasfusi inferiore al previsto. Nel caso di un paziente con una precedente segnalazione di anticorpi clinicamente significativi, devono essere selezionate per tutte le trasfusioni successive unit di emazie negative per lantigene corrispondente, anche se gli anticorpi non sono attualmente pi rilevabili. Inoltre, deve essere eseguita una prova di compatibilit comprensiva della fase dellantiglobulina tra il siero del paziente e le emazie del donatore negative per lantigene. Raramente necessario ripetere lidentificazione di anticorpi gi noti. Gli Standard AABB stabiliscono che nei pazienti con anticorpi gi identificati, andranno utilizzati metodi di indagine utili a riconoscere ulteriori anticorpi aggiuntivi clinicamente significativi14(p389). Ciascun laboratorio deve definire e validare le procedure per rilevare, in questi pazienti, la presenza degli anticorpi aggiuntivi. In funzione della specificit degli anticorpi noti, la ripetizione dei test sul siero del paziente con i pannelli di emazie test di routine, pu risultare di scarsa utilit. molto pi utile esaminare il siero con emazie negative per gli antigeni verso i contro i quali il paziente presenta gli anticorpi e positive per gli altri antigeni di maggiore rilevanza. Questo permette di evidenziare la maggior parte di anticorpi aggiuntivi che il paziente potrebbe aver sviluppato. Di solito, le emazie appropriate possono essere
selezionate dai pannelli eritrocitari disponibili. La selezione delle emazie test pu essere molto semplificata dalla conoscenza del fenotipo eritrocitario del paziente. Non necessario selezionare emazie positive per gli antigeni presenti sulle emazie autologhe, perch il corrispondente anticorpo non potr essere presumibilmente prodotto.
Procedure sierologiche particolari

Molte tecniche e metodi sierologici possono essere utili nellidentificazione anticorpale. Alcuni dei metodi qui descritti sono comunemente utilizzati nella routine di molti laboratori; altri rappresentano procedure alternative che possono essere usate solo in circostanze particolari. fondamentale tener presente che nessun singolo metodo ottimale per rilevare tutti i possibili anticorpi in tutti i campioni. Ogni laboratorio che esegue la ricerca e lidentificazione anticorpale deve elaborare delle procedure standard per eseguire gli esami di routine ed essere in grado di utilizzare almeno alcuni approcci alternativi. Ulteriori procedure aggiuntive sono consultabili in numerose pubblicazioni (vedi letture consigliate). Tecniche di potenziamento Quando si riscontrano reazioni deboli che non consentono di definire la specificit di un anticorpo, o quando la presenza di un anticorpo pu essere sospettata ma non dimostrata, pu essere utile ricorrere alla seguenti procedure alternative. Ogni test eseguito deve includere il controllo autologo. LISS e PEG Il razionale di queste procedure ed alcuni dettagli tecnici, sono riportati nel Capitolo 12 e nel Metodo 3.2. Entrambe queste sostanze possono essere utilizzate per potenziare la reattivit e ridurre i tempi di incubazione. I metodi LISS prevedono la sospensione delle emazie test in una soluzione salina isotonica a bassa forza ionica o, pi comunemente, in mezzi additivi a bassa forza ionica, forniti dal commercio. Luso di
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una soluzione LISS non richiede alcuna fase preparatoria, ma deve essere posta molta attenzione al rispetto delle istruzioni alluso fornite dal produttore, onde assicurare la proporzione idonea tra il siero ed il LISS. I preparati commerciali delle soluzioni LISS possono contenere ulteriori componenti potenzianti oltre alla soluzione salina a bassa forza ionica. Sono disponibili inoltre additivi PEG forniti dal commercio e anchessi possono contenere ulteriori agenti potenzianti. Poich il LISS e il PEG incrementano la reattivit degli autoanticorpi il loro uso pu determinare problemi nella valutazione di determinati campioni25,26. Tecniche enzimatiche Il trattamento delle emazie test con gli enzimi proteolitici incrementa la reattivit degli anticorpi dei sistemi Rh, P, I, Kidd, Lewis e di alcuni altri sistemi gruppoematici e contemporaneamente annulla o indebolisce quella di altri anticorpi, in particolare quelli dei sistemi Duffy ed MNS (vedi Tabella 19.4). Il significato clinico degli anticorpi che reagiscono solo con le tecniche enzimatiche discutibile. I dati della letteratura indicano che gli enzyme-only antibodies possono essere di nessun significato clinico28. Le procedure per la preparazione e luso delle
soluzioni contenenti enzimi proteolitici sono descritte nei Metodi 3.5, fino al 3.5.6. Riduzione della temperatura di reazione Alcuni alloanticorpi (ad esempio: anti-M, -N, -P1, -Lea, -Leb, -A1) reattivi a temperatura ambiente, reagiscono pi intensamente a temperature pi basse; in alcuni casi la specificit anticorpale pu essere determinata solo a temperature inferiori ai 22 C. Nei test eseguiti a freddo importante inserire il controllo autologo in quanto molti sieri contengono anti-I o altri autoanticorpi che reagiscono a freddo. Aumento del rapporto siero-emazie Lincremento del volume di siero incubato con un volume standard di emazie test pu aumentare lintensit delle reazioni prodotte da anticorpi presenti in basse concentrazioni. Una procedura accettabile quella di mescolare da 5 a 10 volumi di siero con un volume di emazie sospese in fisiologica al 2 al 5%, ed incubare la miscela per 60 minuti a 37 C, agitando periodicamente per favorire il contatto fra le emazie e le molecole anticorpali. opportuno rimuovere il siero prima del lavaggio delle emazie per lesecuzione del test allantiglobulina, in quanto i tre o quattro
Tabella 19.4 - Alterazioni degli antigeni eritrocitari da parte di varie sostanze* Sostanze Enzimi proteolitici*** DTT ZZAP (combinazione di DTT e di enzimi proteolitici)
* **
Antigeni generalmente denaturati o alterati** M, N, S, Fya, Fyb, Yta, Ch, Rg, Pr, Tn, Mg, Mia/Vw, Cla, Jea, Nya, JMH, Ge (alcuni), Inb Yta,JMH, Kna, McCa, Yka, LWa, LWb, Kell (tutti), Lutheran, Dombrock e Cromer Tutti gli antigeni sopraelencati
Da Wilkinson27, adattamento autorizzato. Alcuni degli antigeni elencati possono essere indeboliti anzich completamente denaturati . Vanno allestiti appropriati controlli con le emazie trattate. *** I diversi enzimi proteolitici possono avere effetti diversi su alcuni antigeni.
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lavaggi previsti dalla metodica standard possono risultare insufficienti a rimuovere tutte le immunoglobuline non legate presenti nel volume aggiuntivo di siero. Lesecuzione di un maggior numero di lavaggi non raccomandata in quanto potrebbe favorire il distacco di anticorpi adesi alla membrana eritrocitaria. Laumento del rapporto siero- emazie non appropriato per i test che utilizzano i mezzi a bassa forza ionica o per i test richiedono una specifica proporzione tra il siero ed additivo. Aumento del tempo di incubazione Per la maggior parte degli anticorpi, soprattutto nei test in fisiologica o in albumina, un tempo di incubazione di 15 minuti pu risultare insufficiente per il raggiungimento della fase di equilibrio e pertanto le reazioni che si osservano sono di debole intensit. Laumento del tempo di incubazione a 30 o a 60 minuti pu consentire di ottenere reazioni pi intense ed una pi chiara interpretazione dei profili delle reazioni osservate. Laumento del tempo di incubazione pu avere effetti negativi quando si utilizzino il LISS o il PEG. Se lincubazione supera i tempi raccomandati per queste metodiche, la reattivit anticorpale pu essere annullata. Deve essere posta la massima cura nelluso di tutti i reagenti secondo le istruzioni dei produttori. Variazioni del pH La riduzione del pH del mezzo di reazione a 6,5 aumenta la reattivit di alcuni anticorpi, in particolare di alcuni anti-M29. Se si sospetta la presenza di anticorpi anti-M in quanto solo le emazie M+N vengono agglutinate, lacidificazione del siero con un pH di 6,5 pu evidenziare un chiaro profilo di reattivit dellanti-M. La riduzione del pH intorno ai 6,5 pu essere ottenuta con laggiunta di un volume 0,1 N di HCl a nove volumi di siero. Il siero acidificato deve essere testato contro emazie M, per escludere eventuali agglutinazioni non specifiche. Anche alcuni anticorpi anti-P1 possono dare reazioni pi intense con la riduzione del pH del mezzo di reazione30. Un abbassamento del pH pu tuttavia ridurre
significativamente la reattivit di alcuni anticorpi31. Se si utilizza per la sospensione cellulare e per i lavaggi una soluzione con un pH nettamente inferiore a 6.0, gli anticorpi dei sistemi Rh, Duffy, Kidd ed MNS possono perdere la loro reattivit. Luso di una soluzione salina tamponata ai fosfati (vedi Metodo 1.7) permette di controllare il pH e favorisce levidenziazione di anticorpi scarsamente reattivi a pH pi bassi32. Tecniche per isolare, rimuovere o ridurre la reattivit anticorpale Talvolta risulta vantaggioso ridurre o eliminare la reattivit di un determinato anticorpo. Ci pu essere ottenuto mediante linibizione dellanticorpo con sostanze specifiche, mediante la rimozione fisica delle molecole anticorpali o mediante la rimozione (o indebolimento) dei corrispondenti antigeni sulle emazie test. Questi metodi possono essere utili per confermare le specificit anticorpali ipotizzate e possono favorire lidentificazione di ulteriori anticorpi. Test di inibizione Forme solubili di alcuni antigeni gruppoematici sono presenti nei fluidi organici quali saliva, urine o plasma, oppure possono essere ottenute da altre fonti. Queste sostanze possono essere utilizzate allo scopo di inibire la reattivit degli anticorpi corrispondenti. Se, ad esempio, un sospetto anti-P1 non determina un profilo di reattivit definitivo, la specificit anti-P1 diventa fortemente suggestiva dopo la ripetizione del test con laggiunta di una sostanza solubile P 1 e la conseguente perdita di reattivit. In questi casi comunque essenziale eseguire in parallelo un controllo negativo diluito con soluzione fisiologica. La tecnica di inibizione pu anche essere usata per neutralizzare anticorpi che mascherano la concomitante presenza di altri anticorpi non neutralizzabili. Nei test di identificazione possono essere impiegate le seguenti sostanze solubili gruppospecifiche: 1. sostanze Lewis. Le sostanze Lea e/o Leb sono presenti nella saliva dei soggetti che posseggono il gene Le. La sostanza Lea
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presente nella saliva degli individui Le(a+b ), mentre negli individui Le(a b+) sono presenti sia la sostanza Lea che la sostanza Leb (vedi Metodo 2.5). Preparati di sostanze Lewis sono inoltre reperibili in commercio; sostanza P 1. La sostanza solubile P 1 presente nel liquido della cisti idatidea oppure pu essere preparata dallalbume delle uova di piccione. Anche la sostanza P1 disponibile in commercio; sostanza Sda. La sostanza gruppoematica Sda presente in forma solubile in vari liquidi organici; la fonte pi abbondante costituita dalle urine33. Per confermare la presenza in un campione di siero della specificit anti-Sda pu essere utilizzata, per inibire la reattivit anticorpale, lurina di un individuo Sd (a+) (oppure un pool di campioni durina). Come controllo negativo deve essere utilizzata lurina che non contiene sostanza Sda o soluzione fisiologica (vedi Metodo 3.11); sostanze Chido e Rodgers. Gli antigeni Ch e Rg sono epitopi del quarto componente del sistema del complemento umano (C4)34,35. Gli anticorpi anti-Ch e anti-Rg reagiscono nella fase dellantiglobulina con piccole quantit di C4 presenti sulla membrana degli eritrociti normali. Se i globuli rossi sono ricoperti in vitro con un eccesso di C4 36, questi anticorpi possono agglutinare direttamente le emazie. Un test utile per identificare gli anti-Ch e gli anti-Rg quello di inibirne la reattivit con il plasma di individui Ch+, Rg+ (vedi Metodo 3.9); zuccheri gruppoematici. Gli zuccheri corrispondenti alle regioni immunodominanti degli antigeni A, B, H e di alcune altre strutture eritrocitarie, possono essere utilizzati per inibire le corrispondenti specificit anticorpali. Linibizione dellanti-A o anti-B pu consentire la valutazione della reattivit di un siero anche contro emazie di gruppo diverso dallo O.
Le emazie cos modificate possono essere utilizzate per confermare la presenza di un anticorpo sospetto o per evidenziare la presenza di eventuali ulteriori anticorpi. Ci pu essere particolarmente vantaggioso nel caso siano coinvolti antigeni ad alta frequenza e le emazie negative per tali antigeni siano rare. Gli enzimi proteolitici sono comunemente usati per modificare gli antigeni eritrocitari. La ficina, la papaina, la tripsina e la bromelina, gli enzimi pi frequentemente utilizzati, consentono di rimuovere dalla membrana eritrocitaria antigeni quali: M, N, Fya, Fyb, Xga, JMH, Ch e Rg (vedi Tabella 19.4). In funzione dello specifico enzima e del metodo utilizzato, possono essere distrutti o alterati anche altri antigeni. Gli antigeni eritrocitari possono essere inattivati da un determinato enzima, ma non necessariamente anche dagli altri enzimi proteolitici. I reattivi sulfidrilici come il 2-amino-etilisotiouronio bromuro (AET) o il ditiotreitolo (DTT) (vedi Metodo 3.10) possono essere usati per indebolire o distruggere gli antigeni del sistema Kell ed alcuni antigeni di sistemi gruppoematici37-39 . Il reattivo ZZAP, che contiene enzimi proteolitici e ditiotreitolo40, denatura gli antigeni sensibili al ditiotreitolo(ad esempio tutti quelli del sistema Kell), oltre agli antigeni sensibili agli enzimi (vedi Metodo 4.9). Il trattamento degli eritrociti con glicina-HCl/EDTA distrugge gli antigeni dei sistemi Bg e Kell. Tuttavia, con leccezione dellantigene Era 41, altri antigeni al di fuori del sistema Kell, che sono solitamente distrutti dai reattivi sulfidrilici, restano intatti (vedi Metodo 2.14 e 4.2). La clorochina difosfato pu essere utilizzata per indebolire lespressione eritrocitaria degli antigeni HLA di Classe I (antigeni Bg)42. Il trattamento con la clorochina indebolisce inoltre anche altri antigeni eritrocitari, compresi quelli Rh (vedi Metodo 2.13). Assorbimento possibile rimuovere un anticorpo da un siero assorbendolo con emazie provviste dellantigene corrispondente. Lanticorpo
Inattivazione di antigeni gruppoematici Alcuni antigeni gruppoematici possono essere distrutti o indeboliti mediante appropriati trattamenti dei globuli rossi (vedi Tabella 19.4).
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assorbito forma un complesso con lantigene presente sulla membrana eritrocitaria e quando le emazie vengono separate dal siero, lanticorpo rimane adeso alle emazie. Mediante leluizione possibile quindi recuperare lanticorpo legato alle emazie. Il ricorso a tecniche di assorbimento utile nelle seguenti situazioni: 1. per separare una miscela di anticorpi presente in un singolo siero; 2. per rimuovere autoanticorpi al fine di evidenziare leventuale coesistenza di alloanticorpi; 3. per rimuovere anticorpi indesiderati, specialmente anti-A e/o lanti-B da un siero che contenga un anticorpo utile per la preparazione di un reagente; 4. per confermare la presenza di specifici antigeni sulle emazie, grazie alla loro capacit di assorbire il corrispondente anticorpo in un siero precedentemente caratterizzato; 5. per confermare la specificit di un anticorpo, dimostrando che esso pu essere assorbito solo da emazie appartenenti ad un particolare fenotipo gruppoematico. Le tecniche di assorbimento vengono utilizzate per vari scopi in differenti situazioni, non vi pertanto una singola procedura soddisfacente in tutti i casi. Una procedura standard per lassorbimento di un anticorpo descritta nel Metodo 3.12. Il rapporto siero-emazie che di solito viene utilizzato di un volume di siero con un uguale volume di emazie lavate e sedimentate. Lassorbimento dellanticorpo pu essere aumentato utilizzando un volume maggiore di emazie e quindi aumentando proporzionalmente la quantit di antigene. Lincubazione deve essere effettuata alla temperatura ottimale di reazione dellanticorpo. Il pretrattamento delle emazie con enzimi proteolitici pu incrementare la quantit di anticorpi che si legano alle emazie e quindi di ridurre il numero di assorbimenti necessari per rimuovere completamente gli anticorpi. Poich alcuni antigeni vengono distrutti dalle proteasi, gli anticorpi diretti contro tali antigeni non possono essere adsorbiti da emazie trattate con tali enzimi. Per la separazione di miscele anticorpali
importante scegliere emazie di appropriato fenotipo, sulla base di quello che lobiettivo della separazione. Se nessuno degli anticorpi presenti in un siero stato identificato, possono essere utilizzate emazie cha danno reazioni debolmente reattive, presumendo che esse reagiscano con un singolo anticorpo. La conoscenza del fenotipo eritrocitario dellindividuo che ha prodotto gli anticorpi, potr fornire un indizio sulle specificit anticorpali che possono essere presenti e su tale base potranno essere selezionate le emazie ritenuti utili per separare questi particolari anticorpi. Se uno o pi anticorpi sono stati identificati, vengono di solito utilizzate emazie prive dei relativi antigeni in modo tale che sia possibilmente rimosso un singolo anticorpo. Le procedure di assorbimento richiedono un discreto quantitativo di emazie. Le emazie contenute nelle confezioni dei pannelli eritrocitari non sono generalmente sufficienti e pertanto vengono spesso utilizzati campioni di sangue provenienti dai membri del personale o da donatori di sangue. Eluizione Le tecniche di eluizione consentono di staccare gli anticorpi adesi alla membrana eritrocitaria. Lanticorpo legato pu essere staccato modificando le condizioni termodinamiche della reazione antigene-anticorpo, neutralizzando o invertendo le forze di attrazione che tengono insieme i complessi antigene-anticorpo, oppure alterando la complementariet strutturale fra lantigene e il suo corrispondente sito di legame sulla molecola anticorpale. Lobiettivo principale della procedura quello di recuperare gli anticorpi legati alle emazie, in una forma che risulti utilizzabile per le indagini sierologiche. Sono stati descritti diversi metodi di eluizione, e alcune di queste procedure sono riportate nei Metodi da 4.1 a 4.5. Nessuno di questi metodi consente di ottenere risultati ottimali in tutte le situazioni. Luso del calore o del metodo congelamento-scongelamento generalmente ristretto alle indagini delle MEFN da incompatibilit ABO, in quanto queste modalit di eluizione raramente sono efficaci con anticorpi non
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appartenenti al sistema ABO. La tecnica con lacido e leluizione con solventi organici sono utilizzate per leluizione degli autoanticorpi ed alloanticorpi caldi. I fattori tecnici che possono influire sul successo delle procedure di eluizione includono: 1. tecnica scorretta . Alcuni fattori quali lincompleta rimozione dei solventi organici o lincapacit di rendere un eluato isotonico o di portarlo ad un pH adeguato, possono causare lemolisi delle emazie o a indurne una adesione aspecifica. La presenza di frammenti dello stroma eritrocitario pu interferire con la lettura dei test. Tali problemi possono essere evitati con lesecuzione tecnica accurata e con il rigoroso rispetto dei protocolli; 2. lavaggio incompleto. Gli eritrociti sensibilizzati devono essere lavati accuratamente prima di procedere alleluizione, allo scopo di prevenire la contaminazione delleluato con eventuali anticorpi presenti nel siero. Se certo che il siero non contiene anticorpi, il lavaggio con la soluzione salina pu non essere necessario. Generalmente sono sufficienti sei lavaggi con soluzione salina isotonica, mentre se il siero contiene anticorpi ad alto titolo, possono essere necessari ulteriori lavaggi. Per verificare lefficacia dei lavaggi, il liquido sopranatante dellultimo lavaggio deve essere esaminato per evidenziare uneventuale attivit anticorpale residua e deve risultare non reattivo; 3. adesione delle proteine alla superficie delle provette di vetro. Se un eluato viene preparato nella stessa provetta utilizzata nella fase di sensibilizzazione (ad esempio in un procedimento di assorbimento/eluizione), leventuale anticorpo adeso aspecificamente alla superficie della provetta pu staccarsi nel corso delleluizione. Un simile legame aspecifico pu inoltre verificarsi con un campione di sangue intero, in un paziente con un TAD positivo ed con anticorpo libero nel siero. Per prevenire tale contaminazione, le emazie lavate devono essere trasferite in una provetta pulita prima di iniziare la procedura di eluizione;
4. dissociazione dellanticorpo prima delleluizione. Gli anticorpi di classe IgM, come lanti-A o lanti-M, possono dissociarsi spontaneamente dalle emazie durante la fase di lavaggio. Per ridurre la perdita di tali anticorpi pu essere utilizzata, per i lavaggi, soluzione salina raffreddata (4C). In genere questo evento non si verifica con la maggior parte degli anticorpi di classe IgG, sebbene alcuni anticorpi IgG a bassa affinit possano essere persi durante la fase di lavaggio. Se si sospetta la presenza di tali anticorpi, lesecuzione del lavaggio con una soluzione LISS raffreddata, invece della normale soluzione salina, pu contribuire al mantenimento del legame dellanticorpo al rispettivo antigene; 5. instabilit delleluato. Le soluzioni diluite di proteine, come ad esempio quelle che si ottengono dalleluizione in fisiologica, sono instabili. Pertanto gli eluati devono essere esaminati il pi presto possibile dopo la preparazione. In alternativa pu essere aggiunta alleluato albumina bovina alla concentrazione finale del 6% peso/volume, con successiva conservazione allo stato congelato. Gli eluati infine possono essere preparati direttamente in un plasma privo di anticorpi, in una soluzione di albumina al 6%, oppure in un mezzo proteico anzich in soluzione fisiologica. Le tecniche di eluizione sono utili per: 1. eseguire le indagini relative ad un TAD positivo (vedi Capitolo 20); 2. concentrare e purificare gli anticorpi, ricercare antigeni debolmente espressi e identificare le specificit presenti in una miscela di anticorpi. Per tali scopi leluizione viene eseguita in parallelo con appropriate tecniche di assorbimento, come descritto in precedenza, e nel Metodo 2.4; 3. preparare emazie libere da anticorpi per eseguire la fenotipizzazione o per lutilizzo in procedure di assorbimento autologo. Le procedure usate per eluire dalle emazie gli autoanticorpi freddi o caldi sono discusse nei Metodi 4.6 e 4.9, e la discussione
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sullassorbimento autologo degli autoanticorpi caldi descritta nel Capitolo 20. Assorbimento ed eluizione combinati Le metodiche combinate di assorbimento ed eluizione possono essere utilizzate per separare una miscela di anticorpi in un siero, per evidenziare la presenza di antigeni debolmente espressi sulla superficie dei globuli rossi o per identificare anticorpi debolmente reattivi. La procedura consiste in una prima incubazione del siero con emazie selezionate e nella successiva eluizione dellanticorpo dalle emazie usate per lassorbimento. Sia leluato che il siero assorbito possono essere utilizzati per ulteriori esami. Nelle procedure combinate di assorbimento ed eluizione vengono in genere utilizzati eritrociti non trattati in quanto leluizione delle emazie pretrattate con enzimi o con ZZAP pu causare problemi tecnici. Uso di reagenti sulfidrilici I reagenti sulfidrilici, come il ditiotreitolo e il 2-mercaptoetanolo (2-ME), rompono i ponti disolfurici che uniscono le subunit monomeriche del pentamero IgM. Le molecole di IgM 19S native vengono separate in subunit 7S che presentano una reattivit sierologica alterata43. Al contrario i legami disolfurici allinterno delle catene dei monomeri 7S sono relativamente resistenti allazione dei reagenti sulfidrilici (vedi Capitolo 11 per la struttura delle molecole immunoglobuliniche). I reagenti sulfidrilici sono utilizzati per ridurre o distruggere la reattivit degli anticorpi di classe IgM. Il ditiotreitolo inoltre distrugge determinati antigeni eritrocitari. In campo immunoematologico il ditiotreitolo e il 2-ME vengono utilizzati per: 1. determinare la classe immunoglobulinica di un anticorpo (vedi Metodo 3.8); 2. identificare le specificit in una miscela di anticorpi di tipo IgM ed IgG in particolare nei casi in cui un anticorpo agglutinante IgM maschera la presenza di anticorpi IgG; 3. determinare le quantit relative delle componenti IgM ed IgG di una determinata specificit anticorpale (ad esempio anti-A o -B); 4. dissociare gli agglutinati eritrocitari indotti da
anticorpi IgM, come per esempio lagglutinazione spontanea delle emazie dovuta a potenti autoanticorpi (vedi Metodo 2.11); 5. eluire gli anticorpi IgG adesi alle emazie utilizzando una miscela di ditiotreitolo ed enzimi proteolitici (reagente ZZAP) (vedi Metodo 4.9); 6. convertire anticorpi di tipo IgG non agglutinanti in agglutinine14. Questo trattamento viene utilizzato per lallestimento di preparati commerciali di reagenti chimicamente modificati per la tipizzazione eritrocitaria con test rapidi in provetta, su vetrino o in micropiastra (vedi il Capitolo 12); 7. distruggere determinati antigeni eritrocitari (ad esempio quelli dei sistemi Kell, Dombrock, Cartwright ed LW), per le indagini di identificazione anticorpale (vedi Metodo 3.10). Titolazione Il titolo di un anticorpo viene normalmente determinato cimentando diluizioni seriali per raddoppio del siero in esame con campioni di emazie selezionate. I risultati vengono espressi come il reciproco della diluizione pi elevata del siero in grado di determinare unagglutinazione macroscopica. Il valore del titolo anticorpale pu fornire informazioni circa la quantit di un anticorpo presente in un siero, oppure sulla forza con cui un antigene espresso sulle emazie. Le titolazioni anticorpali sono utili nelle seguenti situazioni: 1. indagini prenatali . Le titolazioni possono contribuire alla decisione di attuare o meno manovre invasive, quali lamniocentesi, quando lanticorpo in causa pu causare MEFN o di significato clinico sconosciuto (vedi Capitolo 23 e Metodo 5.3); 2. identificazione degli anticorpi. Alcuni anticorpi agglutinano virtualmente tutti i campioni di emazie; in tali casi la titolazione pu fornire indicazioni sulla loro specificit, in base alle differenze di intensit di reazione con i differenti campioni di emazie. Ad esempio, potenti autoagglutinine anti-I possono reagire, se non diluite, con emazie sia di adulto che di funicolo, ma la titolazione pu evidenziare una
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reattivit a pi alte diluizioni con le emazie I+ di adulto, rispetto a quelle di funicolo. La maggior parte degli anticorpi debolmente reattivi perdono la loro reattivit quando diluiti anche modestamente; alcuni anticorpi invece, presentano reazioni deboli quando non sono diluiti e continuano a reagire anche diluizioni alte, come 1 a 2048. Tali anticorpi comprendono lanti-Ch, -Rg, -Csa, -Yka, -Kna, -McCa, -JMH ed altre specificit. Quando la debole reattivit osservata con il test allantiglobulina indiretto la titolazione pu essere utilizzata per identificare la specificit anticorpale allinterno di questo gruppo. Non tutti gli anticorpi con le suddette specificit presentano questo comportamento tipico, cio alto titolo, bassa avidit. Perci, sebbene la dimostrazione di queste caratteristiche sierologiche possa essere di aiuto in quanto indirizza verso certe specificit, lassenza di questo tipo di reattivit non le esclude. Talvolta anche anticorpi di altre specificit possono reagire ad alto titolo. I dettagli sulla titolazione sono descritti nel Metodo 3.7 e nel Metodo 3.9; 3. separazione di anticorpi multipli. I risultati della titolazione possono suggerire che un anticorpo in grado di reagire ad una diluizione pi alta rispetto a quella di un altro anticorpo. Questa informazione pu far s che il siero in esame sia diluito prima della valutazione con un pannello eritrocitario, con conseguente eliminazione di una specificit anticorpale ed identificazione dellaltra. Altri metodi Altri metodi oltre alle tecniche tradizionali in provetta, possono essere utilizzati per lidentificazione degli anticorpi. Alcuni metodi sono particolarmente utili per identificare anticorpi di determinate specificit, per lavorare con piccoli volumi di reattivi, per eseguire esami in batch o per limpiego di sistemi automatizzati. Questi metodi comprendono i test in tubi capillari, i test in micropiastra o fase solida, i test immunoezimatici, lagglutinazione in microcolonna (ad esempio la tecnica gel). Altri metodi utili in
laboratori con apparecchiature speciali comprendono: i test radioimmunologici, limmunofluorescenza (compresa la citometria a flusso), l immunoblotting e limpiego di immunoelettrodi biosensoriali. Alcuni di questi metodi sono discussi nel Capitolo 12.
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Capitolo 20: Il TAD positivo e la distruzione immuno-mediata delle emazie
Capitolo 20
Il test allantiglobulina diretto positivo e la distruzione immuno-mediata delle emazie
Il test allantiglobulina diretto (TAD) viene solitamente utilizzato per stabilire se i globuli rossi sono stati sensibilizzati in vivo da immunoglobuline, dal complemento oppure da ambedue. Un TAD positivo, con o senza riduzione della sopravvivenza delle emazie, pu essere determinato da: 1. autoanticorpi reattivi con le emazie autologhe; 2. alloanticorpi presenti nel circolo di un ricevente reattivi con antigeni espressi sulle emazie di un donatore, trasfuse di recente; 3. alloanticorpi presenti nel plasma donato o in plasmaderivati o in emocomponenti che reagiscono con antigeni presenti sui globuli rossi di un ricevente recentemente trasfuso; 4. alloanticorpi presenti nel circolo materno che, superata la placenta, sensibilizzano le emazie fetali; 5. anticorpi specifici per alcuni farmaci che si fissano sulla membrana eritrocitaria (per esempio, penicillina); 6. proteine, comprese le immunoglobuline, assorbite in modo aspecifico e associate a unipergammaglobulinemia o allinfusione endovenosa di dosi elevate di immunoglobuline in un ricevente1,2,oppure alterazioni della membrana eritrocitaria dovute ad alcuni farmaci, per esempio, le cefalosporine; 7. fissazione del complemento sulle emazie che pu essere dovuta allattivazione del complemento da parte di alloanticorpi, autoanticorpi, farmaci, oppure per infezioni batteriche;
8. anticorpi prodotti dai linfociti passenger nei trapianti di organi solidi o di componenti ematopoietiche3. Un TAD positivo non significa, necessariamente, che i globuli rossi abbiano una riduzione della loro sopravvivenza. Piccole quantit di IgG o di complemento, sono normalmente presenti su tutti gli eritrociti normali. Sulle emazie di soggetti in buona salute sono normalmente presenti da 5 a 90 molecole di IgG per globulo rosso4 e da 5 a 40 molecole di C3d per ogni eritrocita5. Il TAD pu rilevare un livello da 100 a 500 molecole di IgG per eritrocita e da 400 a 1.100 molecole di C3d per eritrocita, in funzione dei reattivi e della tecnica utilizzata. TAD positivi senza alcuna manifestazione di distruzione eritrocitaria immunomediata sono riferiti da 1 su 1.000 a 1 su 14.000 donatori di sangue e dall1 al 15% nei pazienti ricoverati in ospedale4. La maggior parte dei donatori di sangue con TAD positivo risulta essere in perfetta salute e, la maggioranza dei pazienti con TAD positivo, non presentano evidenti sintomi di anemia emolitica; alcuni, tuttavia, presentano modesti sintomi di unincrementata distruzione eritrocitaria4,6(p222). Livelli elevati di IgG o di complemento sono stati osservati sui globuli rossi di pazienti affetti da anemia falciforme, da -talassemia, da malattie renali, da mieloma multiplo, da disordini autoimmuni, da AIDS e da altre patologie con elevati livelli di immunoglobuline nel siero o alti livelli ematici di azoto uremico con una correlazione poco chiara tra il TAD positivo e lanemia1,2,7.
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Linterpretazione dei TAD positivi deve comprendere lanamnesi dei pazienti, i rilievi clinici, e i risultati degli altri esami di laboratorio.
parte relativa al TAD e allautocontrollo nella routine degli esami pre-trasfusionali comporta un trascurabile rischio9. Valutazione di un TAD positivo Indagini supplementari Le considerazioni cliniche devono stabilire quando un TAD positivo significativo ed fondamentale il dialogo con il medico curante. Linterpretazione del significato dei rilievi sierologici richiede conoscenze su: diagnosi del paziente, farmaci somministrati di recente, eventuale gravidanza in atto, storia trasfusionale e informazioni sulla presenza di unanemia emolitica acquisita o non chiarita. I risultati degli esami sierologici, da soli, non rivestono valore diagnostico; il loro significato pu essere definito solo congiuntamente con le informazioni cliniche e con altri esami di laboratorio come lematocrito, la bilirubina, laptoglobina e il conteggio dei reticolociti. Quando si indaga su una reazione trasfusionale lesecuzione del TAD sui campioni prelevati dopo la reazione fa parte delle indagini iniziali. Il TAD post-trasfusionale pu risultare positivo se le emazie sensibilizzate non sono state completamente distrutte oppure pu essere negativo se si verificata unemolisi con rapida eliminazione delle emazie incompatibili. I risultati positivi del TAD devono essere, comunque, ulteriormente valutati. La storia clinica del paziente importante nellinterpretazione di un TAD positivo, rilevato dopo una reazione trasfusionale (vedi Capitolo 27). Le risposte alle seguenti domande possono essere utili per decidere quali sono gli adeguati approfondimenti da eseguire nellindagine. 1. Vi qualche prova della distruzione degli eritrociti in vivo? La reticolocitosi, la presenza di sferociti nello striscio di sangue periferico, lemoglobinemia, lemoglobinuria, la riduzione dellaptoglobina sierica, elevati livelli, nel siero, di bilirubina non coniugata o di lattico-deidrogenasi (LDH), specialmente LDH1, possono essere associati a unincrementata distruzione eritrocitaria. Se un paziente anemico con un TAD positivo presenta segni evidenti di emolisi, sono
Il test allantiglobulina diretto

I principi del TAD sono discussi nel Capitolo 12. Sebbene possa essere analizzato qualsiasi campione di sangue, si preferiscono i campioni prelevati in EDTA, per prevenire la fissazione in vitro del complemento. Se gli eritrociti di un campione coagulato presentano un TAD positivo solo per il complemento e devono essere utilizzati a scopo diagnostico, il test deve essere confermato, utilizzando emazie di un prelievo fresco oppure di un campione prelevato in EDTA. La maggior parte dei TAD vengono eseguiti inizialmente con un siero antiglobuline polispecifico (AHG, anti-human globulin) in grado di rilevare sia le IgG sia il C3d (vedi Metodo 3.6). Se il test risulta positivo, opportuno esaminare il campione con reattivi specifici per le IgG e per il complemento. Occasionalmente, il siero antiglobuline reagisce con proteine fissate sugli eritrociti diverse dalle IgG o dal C3d (per esempio, IgM, IgA o altre componenti del complemento); i reattivi specifici per distinguere queste proteine non sono facilmente reperibili nella maggior parte dei laboratori. Se deve essere esaminato un campione di emazie del cordone ombelicale opportuno luso del solo siero anti-IgG, perch la malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN) origina dalla sensibilizzazione delle emazie fetali attaccate dagli anticorpi di classe IgG di origine materna, mentre lattivazione del complemento si verifica solo raramente3. Il TAD pre-trasfusionale ed il controllo autologo Gli Standard AABB per le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali8 e anche quelli delle altre agenzie accreditate, non richiedono un TAD o un controllo autologo (autocontrollo), come parte integrante delle prove di compatibilit pre-trasfusionali. Studi hanno dimostrato che leliminazione della
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appropriati gli esami atti a valutare una possibile eziologia immune. Se non vi evidenza di un incremento della distruzione eritrocitaria non sono necessarie ulteriori indagini, a meno che il paziente non necessiti di trasfusioni e il suo siero contenga anticorpi irregolari anti-eritrocitari non ancora completamente identificati. 2. Il paziente stato trasfuso di recente? Molti operatori tentano di determinare, di routine, la causa di un TAD positivo quando un paziente ha ricevuto trasfusioni nei tre mesi precedenti, perch la prima indicazione per lo sviluppo di una risposta immune pu essere ladesione di un anticorpo ai globuli rossi recentemente trasfusi. Nellimmunizzazione primaria, gli alloanticorpi possono comparire, al pi presto, in un periodo variabile dai 7 ai 10 giorni dopo la trasfusione (ma, tipicamente, compaiono da 2 settimane a diversi mesi dopo) e, nella risposta secondaria, al pi presto, dai 2 ai 7 giorni dopo (ma, di solito, entro 20 giorni dalla trasfusione); questi anticorpi possono ridurre il periodo di sopravvivenza delle emazie precedentemente trasfuse o somministrate successivamente. Studi hanno dimostrato che un TAD positivo ed eluati reattivi possono persistere per oltre 300 giorni dopo una reazione trasfusionale, il che costituisce un periodo di tempo troppo lungo rispetto alla sopravvivenza attesa delle emazie trasfuse: ci suggerisce che le emazie autologhe, come quelle trasfuse, possano risultare sensibilizzate dopo una reazione trasfusionale10,11. Si pu talora osservare, dopo una trasfusione, un TAD a campo misto. 3. Il paziente sta assumendo dei farmaci, come cefalosporine, procainamide, penicillina endovena o l-metildopa? Le cefalosporine sono associate con TAD positivi; le cefalosporine di seconda e terza generazione possono essere associate con la distruzione immune delle emazie12. In uno studio, il 21% dei pazienti che assumevano procainamide hanno sviluppato un TAD positivo (tre di loro con anemia emolitica)13. stata riportata unelevata incidenza (39%) di TAD positivi in
pazienti che assumevano Unasyn14. Sebbene non osservato comunemente negli ultimi anni, circa il 3% dei pazienti in terapia endovenosa con penicillina a dosi molto elevate e dal 15 al 20% dei pazienti in terapia con -metildopa, tendono a sviluppare un TAD positivo. Tuttavia, meno delluno per cento di questi pazienti che sviluppano un TAD positivo presentano unanemia emolitica. TAD positivi associati con altri farmaci sono rari. Se si rileva un TAD positivo in un paziente che assume i farmaci succitati deve esserne avvertito il medico curante per mantenere una sorveglianza adeguata al fine di rilevare leventuale insorgenza di una distruzione eritrocitaria. Se la sopravvivenza dei globuli rossi non ridotta, non sono necessarie ulteriori indagini. 4. Il paziente ha ricevuto un trapianto di midollo ematopoietico, di cellule staminali da sangue periferico o un trapianto dorgano? I linfociti passenger del donatore possono produrre anticorpi specifici per gli antigeni ABO o per altri antigeni presenti sugli eritrociti del ricevente, determinando un TAD positivo3. 5. Il paziente ha ricevuto immunoglobuline endovena (IGIV) o immunoglobuline Rh (RhIG) endovena? Le IGIV possono contenere anticorpi ABO, anti-D o, qualche volta, anticorpi di altre specificit. Le immunoglobuline Rh endovena causano nei pazienti Rh positivi lo sviluppo di un TAD positivo15. 6. Il paziente settico? Lattivazione del complemento pu verificarsi nei pazienti settici, conducendo a una possibile emolisi intravascolare. Questo evento viene osservato con maggiore frequenza nei casi di poliagglutinabilit eritrocitaria determinata da microrganismi che producono neuroaminidasi. Studi sierologici Tre sono gli approcci investigativi utili nella valutazione di un TAD positivo: 1. esaminare le emazie con TAD positivo con i reattivi anti-IgG e anti-C3d per stabilire il tipo di proteina che riveste gli eritrociti;
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2. esaminare il siero/plasma per rilevare e identificare gli anticorpi clinicamente significativi, specifici per antigeni eritrocitari; 3. esaminare un eluato (vedi i Metodi da 4.1 fino a 4.5) preparato dalle emazie sensibilizzate del paziente contro un pannello di emazie test, per definire se la proteina fissata sulle emazie presenta unattivit anticorpale nei confronti degli eritrociti. Quando lunica proteina fissata il complemento, gli eluati non sono di solito reattivi. Tuttavia, un eluato dalle emazie di un paziente che sembrano sensibilizzate solo dal complemento deve, comunque, essere esaminato se vi unevidenza clinica di emolisi mediata da un anticorpo. La preparazione delleluato pu concentrare piccole quantit di IgG, che possono non essere state rilevate nel test diretto con i metodi di routine. I risultati di questi esami, associati con la storia ed i dati clinici del paziente, possono essere utili nellinquadramento del problema in esame. Vedi lAppendice 20.1 come esempio di un algoritmo utile per le indagini relative ad un TAD positivo (escludendo le indagini per la MEFN). Tabella 20.1 - Tecniche di eluizione di un anticorpo Metodo Calore (56C) Vantaggi Ottimale per MEFN ABO; veloce e semplice
Eluizione Leluizione libera gli anticorpi adesi alle emazie sensibilizzate e ne permette il recupero e lutilizzo. I dettagli relativi alla preparazione delleluato sono descritti nel Capitolo 19 e nei Metodi da 4.1 fino a 4.5. Sono disponibili anche kit commerciali per leluizione. La Tabella 20.1 elenca i vantaggi e gli svantaggi dei diversi metodi di eluizione comunemente utilizzati; nessun singolo metodo di eluizione ottimale in tutte le situazioni. Sebbene molte tecniche di eluizione danneggino o distruggano i globuli rossi, altre tecniche (vedi Metodi 2.11, 2.12, 2.13 e 2.14) rimuovono gli anticorpi lasciando le emazie sufficientemente conservate da permetterne la tipizzazione per diversi antigeni eritrocitari o lutilizzo nelle procedure di assorbimento. Tuttavia, alcuni antigeni possono venire alterati dalla procedura di eluizione, rendendo particolarmente importanti gli appropriati controlli. Nei casi di MEFN, o di reazioni trasfusionali emolitiche, lo specifico anticorpo, o gli anticorpi, vengono solitamente rilevati nelleluato, indipendentemente dal fatto che possano essere,
Svantaggi Scarso recupero di alloed autoanticorpi specifici per altri sistemi gruppoematici Scarso recupero di alloed autoanticorpi specifici per altri sistemi gruppoematici Possibile eluizione falsamente positiva (vedi Leger et al.)16 Necessario molto tempo per il lavaggio degli stromi Vapori nocivi
Congelamento e scongelamento Eluizione acida
Ottimale per MEFN ABO; metodo veloce richiede piccoli volumi di emazie Rapido e semplice; adeguato per la maggior parte degli auto ed alloanticorpi; reperibili kit commerciali Non pericolosa; buon recupero della maggior parte degli anticorpi Non cancerogeno, non infiammabile; ottimale per gli auto- ed alloanticorpi di classe IgG
Digitonina acida Diclorometano/ Cloruro di Metilene

Da Judd17 e South et al18 .
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o meno, rilevabili nel siero. Nel caso di reazioni trasfusionali, gli anticorpi di nuova formazione sono inizialmente evidenziabili solamente nelleluato e diventano rilevabili nel siero dopo circa 14-21 giorni. La preparazione delleluato dalle emazie del paziente concentra spesso lattivit dellanticorpo e pu facilitare lidentificazione di anticorpi debolmente reattivi nel siero. Quando un eluato reagisce con tutte le emazie esaminate, la spiegazione pi probabile quella della presenza di un autoanticorpo, specialmente se il paziente non stato trasfuso di recente. Quando non sono presenti nel siero anticorpi inattesi, e se il paziente non stato trasfuso da poco, non necessaria nessuna ulteriore indagine sierologica sullautoanticorpo. Diverse cause possono spiegare un eluato non reattivo, pur essendo stato preparato da emazie sensibilizzate da IgG. Una causa pu essere che leluato non stato cimentato con emazie positive per lantigene corrispondente, in particolare le emazie di gruppo A o B, oppure per antigeni a bassa frequenza, assenti sulla maggior parte delle emazie test di un pannello di identificazione. Se un paziente non di gruppo O ha ricevuto plasma che contiene degli anti-A e/o anti-B (come nella trasfusione di piastrine di gruppo O) e il ricevente presenta unemolisi immune, leluato delle sue emazie deve essere cimentato con emazie A e/o B. Se non vengono rilevati nelleluato gli attesi anticorpi del sistema ABO, devono essere cercate altre cause che spieghino il TAD positivo. Pu essere utile esaminare leluato contro le emazie dei donatori di unit trasfuse di recente perch possono aver causato unimmunizzazione contro un antigene raro oppure, in caso di MEFN, contro le emazie del padre dal quale il neonato pu aver ereditato un gene raro. Non indicato ricercare i motivi di una mancata reattivit degli eluati da emazie di pazienti che non presentino sintomi di emolisi. Toy et al.1 hanno dimostrato che il 79% dei pazienti ospedalieri con un TAD positivo presentano eluati negativi. Questo suggerisce che almeno uno dei fattori responsabili di questi TAD positivi ladesione aspecifica di proteine sugli eritrociti di pazienti con
elevati livelli di gammaglobuline1,2. La reattivit degli eluati pu essere incrementata esaminandoli contro emazie trattate con enzimi proteolitici o utilizzando tecniche potenzianti, come il polietilenglicole (PEG). La reattivit dellanticorpo pu anche essere aumentata utilizzando eluati concentrati, ottenuti modificando il rapporto del liquido rispetto alle emazie eluite oppure utilizzando un set commerciale per concentrare i liquidi. Il lavaggio degli eritrociti con una soluzione salina a bassa forza ionica (LISS) o una soluzione salina di lavaggio fredda pu prevenire la perdita dellanticorpo durante la preparazione delle emazie per leluizione. Alcuni metodi di eluizione danno scarsi risultati con determinati anticorpi. Quando gli eluati non risultano reattivi, anche in presenza di sintomi clinici di una distruzione eritrocitaria, pu essere utile provare a eseguire leluizione con una procedura diversa. Nel caso che il siero e leluato non siano reattivi in tutte le fasi del test e se il paziente ha ricevuto dosi elevate di penicillina endovena o altre terapie farmacologiche, si deve considerare lopportunit di eseguire esami per la ricerca di anticorpi farmaco-indotti.
Emolisi immuno-mediata
Lemolisi immuno-mediata (o emolisi immune) laccorciamento della sopravvivenza dei globuli rossi per opera di prodotti di una risposta immune. Se la compensazione dovuta alla produzione midollare adeguata, la ridotta sopravvivenza eritrocitaria pu non dare luogo ad anemia. Lemolisi immune soltanto una delle cause dellanemia emolitica e molte altre cause di emolisi non sono correlate a una reazione immune. Le indagini sierologiche eseguite in un Servizio Trasfusionale non accertano il fatto che un paziente abbia una anemia emolitica. La diagnosi di anemia emolitica si basa sulle conclusioni cliniche e sui diversi rilievi di laboratorio, come i valori di ematocrito o di emoglobina, il conteggio dei reticolociti, la morfologia eritrocitaria, la bilirubina, laptoglobina ed i livelli di LDH, e, qualche volta, deriva dagli
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studi sulla sopravvivenza delle emazie in vivo. Le indagini sierologiche contribuiscono a stabilire se lemolisi ha una base immunologica e, in questo caso, quale tipo di anemia immuno-emolitica presente. Questo importante perch il trattamento di ogni tipo di anemia emolitica diverso. I termini emolisi ed emolitico sono spesso usati per indicare sia la distruzione eritrocitaria intravascolare sia quella extravascolare; tuttavia, questo pu essere fuorviante. La lisi in vivo delle emazie rilascia emoglobina libera nel comparto intravascolare (per esempio, determinando lemoglobinemia e lemoglobinuria), questo evento non frequente ma, il pi delle volte, drammatico. Lemolisi extravascolare, che pi comune, caratterizzata da un incremento della bilirubina nel siero, ma non presenta emoglobinemia ed emoglobinuria. Come viene rappresentato anche della reattivit
dellanticorpo in vitro, lemolisi o la lisi dei globuli rossi con rilascio di emoglobina libera nel medium circostante tanto evidente quanto rara. Le anemie emolitiche autoimmuni possono essere classificate in molti modi. Un sistema di classificazione presentato nella Tabella 20.2. Le anemie emolitiche autoimmuni (AEA) sono suddivise in cinque tipi principali: lAEA da anticorpi caldi, la sindrome da agglutinine fredde (SAF), lAEA di tipo misto, lemoglobinuria parossistica a frigore (EPF) e lAEA con TAD negativo. Non tutti i casi si possono ricondurre con esattezza a queste categorie. Anche i farmaci (discussi, successivamente, in una sezione a parte di questo capitolo) possono indurre lemolisi immune. La prevalenza di ciascun tipo di AEA pu variare a seconda della popolazione dei pazienti studiati. La Tabella 20.3 presenta le caratteristiche
Tabella 20.2 - Classificazione delle anemie immuno-emolitiche Anemia emolitica autoimmune 1. Anemia emolitica autoimmune (AEA) da anticorpi caldi: a. primaria (idiopatica); b. secondaria [associata a linfoma, lupus eritematoso sistemico (LES), carcinoma o terapie farmacologiche]. 2. Sindrome da anticorpi freddi: a. primaria (idiopatica); b. secondaria (associata a linfoma, pneumopatia da micoplasma, mononucleosi infettiva). 3. AEA di tipo misto: a. primaria (idiopatica); b. secondaria (associata a linfoma, LES). 4. Emoglobinuria parossistica a frigore: a. primaria (idiopatica); b. secondaria (associata a sifilide, a infezioni virali). 5. AEA TAD-negativa: a. primaria (idiopatica); b. secondaria (associata a linfoma, LES). Anemia emolitica indotta da farmaci Anemia emolitica alloimmune 1. Malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN) 2. Reazione trasfusionale emolitica
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sierologiche delle anemie emolitiche autoimmuni e di quelle indotte dai farmaci. I TAD eseguiti con i sieri monospecifici anti-IgG e anti-C3d, cos come gli esami sul siero e sulleluato descritti in precedenza, possono essere utili nella classificazione delle AEA. Possono essere di grande utilit tre ulteriori procedure di indagine: lo studio dellampiezza termica e del titolo di unagglutinina fredda (Metodo 4.7 e 4.8) ed il test di Donath-Landsteiner per la diagnosi dellEPF (Metodo 4.13). La fissazione di un anticorpo ai globuli rossi non comporta, di per s, un danno agli eritrociti. il fenomeno innescato dal complesso antigene/anticorpo che pu eventualmente danneggiare le emazie. Questo fenomeno comprende la fissazione del complemento, ladesione dei recettori Fc ai macrofagi con conseguente fagocitosi e la lisi citotossica. Possono essere significative le sottoclassi di IgG che si sono fissate alle cellule. La sottoclasse IgG1 quella che viene rilevata con maggiore frequenza, qualche volta da sola, ma pi spesso in associazione con altre sottoclassi. Le altre sottoclassi di IgG si rilevano pi spesso in combinazioni associative tra loro piuttosto che da sole. In generale, gli anticorpi di sottoclasse IgG3 hanno gli effetti pi distruttivi, seguiti dalle IgG1 e dalle IgG2, associate a effetti dannosi di minore intensit, e dalle IgG4 che hanno una scarsa o nulla capacit distruttiva. Un ulteriore ruolo viene giocato dal numero di molecole anticorpali adese ad ogni globulo rosso. Il numero di molecole anticorpali adese alle emazie dei donatori di sangue con TAD positivi, ma apparentemente in buona salute (<200 molecole per eritrocita) molto inferiore a quello che comunemente si osserva nei pazienti affetti da AEA4,5. Alcuni pazienti con evidente sintomatologia immuno-emolitica possono, comunque, presentare dei TAD negativi. Anemia emolitica autoimmune da anticorpi caldi Il tipo pi comune di AEA associato ad anticorpi reattivi a caldo (37 C). I tipici rilievi sierologici sono descritti di seguito.
Test allantiglobulina diretto Quando vengono utilizzati sieri diagnostici anti-IgG ed anti-C3d, possono essere rilevati tre possibili profili di reattivit: la fissazione delle sole IgG, la fissazione del solo complemento oppure la fissazione di ambedue. In circa un caso su cento il TAD risulter positivo con il siero polispecifico anti-IgG+C3d ma negativo con i sieri diagnostici monospecifici anti-IgG e anti-C3d. Alcuni di questi casi possono essere determinati dalladesione dei soli anticorpi di classe IgA o IgM agli eritrociti, se queste immunoglobuline non sono state specificamente escluse dal produttore del siero diagnostico3,19. Siero Gli autoanticorpi tipicamente presenti nel siero sono di classe IgG e reagiscono nel test allantiglobulina indiretto (TAI) contro tutte le emazie esaminate3. Se lautoanticorpo stato autoassorbito in vivo dalle emazie del paziente, il siero pu contenere una scarsissima quantit di anticorpi liberi. Lautoanticorpo risulter evidente nel siero solo dopo che tutti i siti antigenici eritrocitari specifici saranno stati occupati e ulteriori molecole anticorpali non si potranno pi fissare in vivo sulle emazie. In questi casi, il TAD , di solito, fortemente positivo. Circa il 50% dei pazienti con AEA calde hanno, nel siero, anticorpi che reagiscono con le emazie non pretrattate, sospese in soluzione salina. Quando vengono esaminati con il PEG, con eritrociti pretrattati con enzimi o con metodi in fase solida la presenza dellautoanticorpo si pu dimostrare in oltre il 90% di questi sieri. Approssimativamente, un terzo dei pazienti sofferenti di questo tipo di AEA hanno autoagglutinine fredde dimostrabili nei test eseguiti a 20 C, ma presentano normali titoli di autoagglutinine a 4 C. La presenza di queste agglutinine fredde non deve indurre a ritenere che il paziente presenti una SAF oltre allAEA calda3. Eluato La presenza dellautoanticorpo di classe IgG sugli eritrociti pu essere confermata utilizzando la procedura delleluizione, dopo almeno una diagnosi iniziale e/o basata sui test
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Tabella 20.3 - Rilievi sierologici nelle anemie emolitiche immuni
AEA calde Percentuale di casi TAD da 48%19 a 70%3 IgG: da 20%3 a 66%19 IgG + C3: da 24%19 a 63%3 C3: da 7%19 a 14%3 IgG (talvolta IgA o IgM, raramente da sole) Anticorpo IgG 57% reattivo in TAI (in fisiologica); 13% emolizza le emazie trattate con enzimi a 37C; 90% agglutinano le emazie trattate con enzimi a 37C; 30% agglutinano le emazie non trattate a 20C; raramente agglutinano le emazie non trattate a 37C3 Specificit Rh; sono state pubblicate altre specificit*
SAF da 16%3 a 32%19 Solo C3: da 91%19 a 98%3
AEA tipo misto da 7%19 a 8%20 IgG+C3: da 71%19 a 100%3 C3: 13%3
EPF Rara negli adulti 32% nei bambini21 Solo C3: da 94%19 a 100%
Farmaco-indotte da 12%3 a 18%19 IgG: 94%19 IgG + C3: 6%19
Tipo di Immunoglobuline Eluato Siero
IgM
IgG, IgM
IgG
IgG Anticorpo IgG Anicorpo IgG simile a quello delle AEA calde3
Specificit
Non reattivo Anticorpo IgG Non reattivo IgM anticorpo IgG Emolisina bifasica agglutinante; titolo reattivo in TAI pi IgG (anticorpo > 1.000 a 4 C; di solito anticorpo IgM Donath-Landsteiner3) reattivo a 30 C in agglutinante, solitamente albumina; anticorpo reattivo a 30-37 C monoclonale nella in salina; alto titolo a 4 C malattia cronica3 (SAF classica) o a basso titolo (<64) a 4 C3,19,20,22 Di solito anti-I ma pu Di solito non ben definita19,20,22 Anti-P (non reattivo essere anti-i; raramente Pu essere anti-I, -i con RBC p e Pk) anti-Pr23 o altre specificit delle agglutinine fredde
Specificit spesso correlate ad Rh23
* Vedi il testo
pre-trasfusionali (vedi Metodi 4.1, 4.2, e 4.5). Tipicamente, leluato reagisce con tutte le emazie esaminate, con un incremento della reattivit contro le emazie pretrattate con gli enzimi o utilizzando il PEG. Leluato non presenter solitamente alcuna reattivit sierologica se lunica proteina adesa agli eritrociti una componente del complemento. Occasionalmente, un anticorpo non rilevato con il TAD potr essere evidenziato con leluato; questa possibilit dovuta alleffetto di concentrazione dellanticorpo nella preparazione delleluato. Specificit degli autoanticorpi Le specificit degli autoanticorpi associati alle AEA da anticorpi caldi sono complesse. Negli esami di routine, tutte le emazie esaminate sono solitamente reattive. Alcuni autoanticorpi che presentano delle reazioni deboli o negative con emazie di fenotipo raro, come D o Rh null sembrano avere una chiara specificit nellambito del sistema Rh. Delle chiare specificit per singoli antigene del sistema Rh (D, C, E, c, e) vengono osservate occasionalmente, sia come autoanticorpi isolati sia come componente predominante, basandosi sulla reattivit di alcuni fenotipi eritrocitari. Questa reattivit viene spesso indicata con il termine di specificit relativa. Una reattivit relativa pu essere confusa con la presenza, nel siero, di un alloanticorpo, ma gli eritrociti apparentemente negativi per lantigene bersaglio dellautoanticorpo possono assorbire completamente e rimuovere la specificit anticorpale che mima la reattivit dellalloanticorpo23,24. Specificit insolite . Prescindendo dalla specificit Rh, sono stati riferiti numerosi altri autoanticorpi con differenti specificit, per esempio, specificit nei sistemi LW, Kell, Kidd, Duffy e Diego24. La diluizione e lassorbimento selettivo degli eluati possono definire le specificit reali o relative degli autoanticorpi. I pazienti con autoanticorpi a specificit per i sistemi Kell, Rh, LW, Ge, Sc, Lu e Lan possono avere delle espressioni antigeniche depresse del corrispondente antigene ed il TAD pu risultare
negativo o molto debolmente positivo24. Significato pratico. Gli esami su emazie di fenotipo raro o con tecniche speciali hanno applicazioni cliniche limitate. In rari casi di AEA da autoanticorpi caldi che coinvolgono agglutinine di classe IgM, la definizione della specificit dellautoanticorpo pu essere utile per differenziare questi casi dalle forme tipiche di SAF25. Raramente (se non mai) necessario accertare la specificit di un autoanticorpi al fine di selezionare unit antigene-negative per le trasfusioni di sangue. Se la specificit diretta contro un antigene ad alta frequenza (per esempio, anti-U), o quando lautoanticorpo reagisce con tutte le emazie tranne quelle di fenotipo raro (per esempio, D , Rhnull), non affatto semplice reperire un donatore di sangue idoneo, vi , quindi, una scarsa motivazione per accertarne la specificit. Questo sangue raro, se reperibile, deve essere riservato ai pazienti alloimmunizzati che presentano questi eccezionali fenotipi. Autoanticorpi stimolati dalla trasfusione. La stessa trasfusione pu indurre la produzione di autoanticorpi che possono persistere e determinare dei TAD positivi per qualche tempo dopo la trasfusione, pur senza causare unevidente distruzione degli eritrociti. Questi autoanticorpi che sensibilizzano le emazie presentano, qualche volta, una specificit per alcuni antigeni (per esempio, E, K, Jka), ma il TAD positivo pu persistere a lungo dopo la scomparsa dal circolo delle emazie trasfuse, con gli autoanticorpi che sono, apparentemente, assorbiti sulle emazie negative per lantigene dello stesso paziente11. Trasfusione di pazienti con autoanticorpi caldi Rischi relativi. I pazienti con autoanticorpi reattivi a caldo variano in un ambito che oscilla da quelli che non manifestano alcuna evidente riduzione della sopravvivenza degli eritrociti, a quelli con unanemia di severit tale da mettere in pericolo la vita stessa del paziente. I pazienti che non presentano o hanno sintomi moderati di una distruzione significativa delle emazie in vivo tollerano perfettamente le trasfusioni.
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Quando un autoanticorpo attivo nel siero, pu essere difficile escludere la contemporanea presenza di eventuali alloanticorpi, il che fa aumentare il rischio di una reazione trasfusionale. La trasfusione pu stimolare la produzione di alloanticorpi, complicando le successive trasfusioni. La trasfusione, inoltre, pu intensificare la reattivit dellautoanticorpo inducendo, o incrementando, lemolisi e rendendo pi difficoltosi gli esami sierologici. Infine, la trasfusione pu deprimere leritropoiesi compensativa midollare, mentre la distruzione delle emazie trasfuse pu incrementare lemoglobinemia e lemoglobinuria. Nei pazienti che presentano unemolisi attiva, le emazie trasfuse possono essere distrutte pi rapidamente delle emazie del paziente stesso e questo pu indurre unipercoagulabilit con la possibile evoluzione nella coagulazione intravascolare disseminata (CID). Le eventuali reazioni trasfusionali, se si verificano, possono essere molto difficoltose da indagare. Le trasfusioni nelle AEA da autoanticorpi caldi . La trasfusione particolarmente problematica per i pazienti che presentano una rapida emolisi in vivo, perch possono presentarsi con una significativa ipotensione e con livelli molto bassi di emoglobina. Una reticolocitopenia si pu accompagnare a una rapida caduta dellematocrito e il paziente pu presentare uninsufficienza coronaria, un arresto cardiaco congestizio, uno scompenso cardiaco o un deterioramento neurologico. In tali circostanze, la trasfusione viene solitamente richiesta come misura salvavita. Le emazie trasfuse possono supportare la capacit ossiforetica fino a che non venga ridotta lemolisi acuta o che altre terapie possano apportare benefici pi duraturi. Questi pazienti rappresentano una significativa sfida perch le indagini sierologiche possono essere complesse, mentre le necessit cliniche sono gravi e urgenti. Le trasfusioni non devono essere rimandate solamente a causa di una incompatibilit sierologica. Il volume di emazie trasfuse deve essere, di norma, della quantit minima necessaria per mantenere unadeguata fornitura di ossigeno e non quello utile per
raggiungere un arbitrario livello di emoglobina. Volumi di 100 mL possono essere adeguati3. Il paziente deve essere accuratamente monitorato durante la trasfusione. Trasfusioni nelle forme croniche. La maggior parte dei pazienti affetti da AEA da autoanticorpi caldi presenta unanemia cronica stabile, spesso con bassi livelli di emoglobina. Quelli con dei livelli emoglobinici superiori a 8 g/dL raramente necessitano di trasfusioni e molti pazienti con 5 g/dL (o livelli ancora pi bassi) possono essere gestiti restando a letto senza essere trasfusi. Le trasfusioni sono necessarie se lanemia progressiva o se accompagnata da sintomi concomitanti come langina severa, la dispnea acuta o lischemia cerebrale. La maggior parte dei pazienti con anemia cronica dovuta ad AEA tollera le trasfusioni senza evidenti reazioni, anche se le emazie trasfuse non possono sopravvivere in circolo meglio dei loro stessi eritrociti. Poich la trasfusione pu causare un sovraccarico circolatorio o incrementare la distruzione degli eritrociti, la decisione di procedere alla trasfusione deve essere accuratamente valutata. Alcuni pazienti, in assenza di emolisi acuta, hanno presentato reazioni emolitiche gravi dopo la trasfusione. Questo pu essere dovuto allimprovvisa disponibilit di ampi volumi di emazie del donatore ed alla curva esponenziale del decadimento, per la quale il numero degli eritrociti emolizzati risulta proporzionale al numero degli eritrociti presenti3,6(pp230,369). Selezione del sangue. Se stata presa la decisione di trasfondere, la selezione del sangue del donatore idoneo essenziale. importante stabilire il gruppo ABO e il fenotipo Rh del paziente e, se c il tempo necessario, rilevare tutti gli eventuali alloanticorpi clinicamente significativi eventualmente presenti. Lassorbimento e le altre tecniche speciali, che saranno descritte successivamente in questo capitolo, possono ridurre di molto il rischio relativo alla presenza di alloanticorpi non evidenziati, ma possono richiedere molto tempo. Se sono presenti alloanticorpi clinicamente significativi, le emazie che vengono trasfuse devono essere prive del corrispondente o dei corrispondenti antigeni.
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Se lautoanticorpo ha una chiara e netta specificit per un singolo antigene (per esempio, anti-e) ed in corso unemolisi attiva, pu essere selezionato sangue privo di questo antigene. Vi sono evidenze cliniche che, in alcuni pazienti, questi eritrociti sopravvivono meglio delle emazie stesse del paziente6(p230),20. In assenza di emolisi, la specificit dellautoanticorpo non importante, sebbene possano essere scelte le unit di donatori negativi per l antigene in causa, dato che, in questo semplice modo, si pu aggirare lautoanticorpo e rilevare la potenziale presenza di alloanticorpo. Se lautoanticorpo presenta unampia reattivit, reagendo con tutte le cellule ma presentando qualche specificit relativa (per esempio, reagisce preferibilmente con emazie e positive), luso del sangue mancante dellantigene corrispondente discutibile. Pu essere inopportuno esporre il paziente ad antigeni Rh assenti sulle emazie autologhe, specialmente il D e particolarmente nelle pazienti che potrebbero avere successivamente dei figli, semplicemente per aumentare la compatibilit sierologica nelle prove con lautoanticorpo (per esempio, quando una paziente D negativa presenta un autoanticorpi anti-e). In molti casi di AEA da autoanticorpi caldi non rilevabile nessuna specificit dellautoanticorpo. Il siero del paziente reagisce con la stessa intensit con tutte le emazie esaminate, oppure reagisce con diversa intensit con i globuli rossi di differenti donatori, per ragioni che non appaiono correlate con i fenotipi Rh. Anche se la specificit stata identificata, le emazie rare utilizzate per tale identificazione non sono reperibili per la trasfusione. La questione pi importante, in questi casi, quella di escludere la presenza di alloanticorpi clinicamente importanti prima di selezionare emazie che siano fenotipicamente simili o dissimili, ma comunque incompatibili alla prova di compatibilit pre-trasfusionale. Solo in casi estremamente rari, nei quali vi sia una severa e progressiva anemizzazione, pu rendersi essenziale trasfondere del sangue che non sia reattivo con l autoanticorpo del paziente Frequenza degli esami. Bench gli Standard AABB8(p38) richiedano che un campione di sangue
sia esaminato ogni tre giorni, alcuni immunoematologi contestano, in questi casi cos difficoltosi, questa disposizione e sostengono che la continua raccolta e gli esami sui campioni di sangue del paziente (comprese le indagini sullanticorpo) non sono necessari26. Altri non concordano con questa opinione. In alcuni studi condotti su pazienti affetti da AEA calde si sono evidenziate dal 12 al 40% dei casi alloimmunizzazioni, con numerosi alloanticorpi sviluppati dopo recenti trasfusioni27,28. Queste due pubblicazioni propongono metodi per supportare il rilievo degli alloanticorpi in presenza di autoanticorpi. Per i pazienti con alloanticorpi clinicamente significativi identificati, gli Standard8(p38) richiedono che i metodi di indagine siano quelli che permettono lidentificazione di ulteriori anticorpi clinicamente significativi. lesclusione di alloanticorpi di nuova formazione ci che interessa. Gli autoanticorpi che reagiscono con tutte le emazie test, anche se debolmente, sono in grado di mascherare la reattivit di un alloanticorpo; la reattivit sierologica non viene necessariamente incrementata29. A causa della presenza degli autoanticorpi, tutte le prove di compatibilit risulteranno incompatibili. Ci improbabile nel caso di alloanticorpi clinicamente significativi, dove possibile ottenere prove crociate compatibili con emazie negative per lantigene. Il monitoraggio per rilevare la distruzione eritrocitaria sostenuta da alloanticorpi difficile in pazienti con AEA, dove sia le emazie del paziente sia quelle trasfuse avranno una ridotta sopravvivenza. Nei pazienti che hanno autoanticorpi senza anemia emolitica, le emazie trasfuse dovrebbero avere una normale sopravvivenza. Un protocollo trasfusionale alternativo, proposto da un gruppo di autori, utilizza unit preventivamente selezionate come antigenicamente compatibili per i pazienti con autoanticorpi caldi, in combinazione con procedure semplificate di assorbimento30. Un tale tipo di protocollo dipende dalla capacit di poter mantenere una scorta adeguata di unit negative per lantigene31.
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Le AEA da IgM calde Le AEA sostenute da agglutinine calde di classe IgM, che reagiscono a 37 C, sono rare, ma sono caratterizzate da unemolisi severa25,32-34. La prognosi per questi pazienti infausta. Test allantiglobulina diretto Le emazie del paziente sono, di regola, spontaneamente autoagglutinate e richiedono la distruzione delle agglutinine IgM con il ditiotreitolo (DTT) per ottenere risultati attendibili con il TAD (e per la tipizzazione ABO/Rh). Il complemento viene di solito costantemente rilevato sulle emazie. In una serie di pazienti le IgG sono state rilevate nel 17% dei casi e le IgM nel 28%. Con il metodo pi sensibile della citometria a flusso, le IgM legate alle emazie sono state rilevate nell82% dei pazienti che presentavano degli eritrociti non reattivi nel TAD, eseguito in provetta con il siero anti-IgM33. Esami sul siero Le autoagglutinine calde IgM sono tipicamente deboli nel siero e, talora, vengono incrementate in presenza di albumina o quando il siero viene acidificato 33. Occasionalmente, la reattivit ottimale viene rilevata tra i 20 ed i 30 C piuttosto che a 37 C. Questi anticorpi hanno titoli bassi o trascurabili; a 4 C titoli <64 differenziano facilmente questi anticorpi caldi di classe IgM da quelli che si osservano nella SAF. Eluato Le agglutinine IgM sono frequentemente rilevate in un eluato, quando questo viene esaminato nella fase agglutinante prima di procedere al test con il siero antiglobuline. Sindrome da agglutinine fredde La sindrome da agglutinine fredde (SAF, detta anche malattia da agglutinine fredde) lanemia emolitica pi comunemente associata con gli autoanticorpi freddi e incide con una frequenza che va dal 16 al 32% di tutti i casi di emolisi immune3,19 (vedi Tabella 20.3). La forma acuta spesso secondaria a patologie linfoproliferative (per esempio, linfoma) o a infezioni da
Mycoplasma pneumoniae. La forma cronica viene frequentemente osservata in pazienti anziani, talvolta associata con il linfoma, la leucemia linfatica cronica o la macroglobulinemia di Waldenstrm. Possono verificarsi lacrocianosi e lemoglobinuria nelle stagioni fredde. La SAF, in molti casi, caratterizzata, nei prelievi in EDTA, da una rapida agglutinazione dei globuli rossi, a temperatura ambiente. Lagglutinazione delle emazie in questi campioni evidente e qualche volta cos forte che le emazie sembrano coagulate. Non sono rari i problemi nella tipizzazione ABO, Rh e in altri esami. Spesso necessario mantenere i prelievi in EDTA a 37 C e lavare ripetutamente le emazie con soluzione salina a 37 C per disperdere lautoagglutinina fredda prima di eseguire le tipizzazioni ABO/Rh e il TAD. Test allantiglobulina diretto In quasi tutti i casi, la sola proteina adesa agli eritrociti individuata il complemento. Se sono rilevate altre proteine, necessario un controllo negativo del TAD, per esempio, albumina al 6 o al 10%, per accertare che lautoagglutinina fredda non stia determinando un esame falsamente positivo. Lautoagglutinina reattiva a freddo solitamente una IgM, che agglutina le emazie alle temperature relativamente fredde del circolo sanguigno periferico e causa ladesione sugli eritrociti delle componenti del complemento (particolarmente C3 e C4). Non appena le emazie raggiungono aree dove la circolazione pi calda, le IgM si staccano dalle emazie, ma le componenti del complemento restano adese. I globuli rossi, con fissato il C3b, possono reagire con i recettori CR1 o CR3 dei macrofagi nel sistema reticoloendoteliale. La maggior parte della distruzione eritrocitaria si verifica nel fegato. Le proteine regolatrici convertono il C3 e il C4 in C3dg e C4d, ed la componente anti-C3d presente nei reattivi AHG polispecifici che determina la positivit del TAD. La presenza del solo C3dg sulle emazie non comporta una riduzione della loro sopravvivenza, perch i macrofagi non possiedono dei recettori per il C3dg o per il C3d.
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Siero Le autoagglutinine IgM reattive a freddo, associate allemolisi immune, reagiscono, di solito, a temperature 30 C con titoli 1.000 quando vengono esaminate a 4 C; molto raramente sono reattive con eritrociti sospesi in soluzione salina a temperature superiori a 32 C. Se viene aggiunta albumina bovina al 30% nel mezzo di reazione, il 100% ed il 70% dei campioni clinicamente significativi reagir rispettivamente a 30 C e a 37 C35. Occasionalmente, le agglutinine fredde patologiche potranno avere titoli anticorpali pi bassi (per esempio <1.000), ma avranno un range termico pi ampio e potranno risultare reattive a 30 C con o senza laggiunta di albumina. Lattivit emolitica su emazie non trattate pu essere qualche volta dimostrata a 20-25 C e, tranne rari casi sostenuti dalla specificit anti-Pr, le emazie pretrattate con enzimi saranno emolizzate in presenza di quote adeguate di complemento. La determinazione della reale ampiezza termica e del titolo di unautoagglutinina fredda necessita che il prelievo del campione sia eseguito e mantenuto a 37C, prima della separazione del siero dalle emazie, per evitare lautoassorbimento in vitro. Alternativamente, pu essere utilizzato il plasma di un campione scoagulato prelevato in EDTA che sia stato scaldato per 10-15 minuti a 37 C (con ripetuti rimescolamenti) e successivamente separato dai globuli rossi, idealmente a 37 C. Questo dovrebbe determinare il distacco dellautoanticorpo, che stato autoassorbito sulle emazie nel plasma. Nella SAF cronica, lautoagglutinina IgM solitamente una proteina monoclonale con catene leggere di tipo kappa. Nelle forme acute indotte dal Mycoplasma o da altre infezioni virali, lanticorpo costituito da immunoglobuline policlonali IgM, con una normale distribuzione di catene leggere di tipo kappa e lambda. Sono stati pubblicati anche rari esempi di autoagglutinine fredde di classe IgA ed IgG. Eluato Leluizione raramente necessaria nei casi di evidente SAF. Se gli eritrociti sono stati prelevati in modo appropriato e sono stati lavati a 37 C,
non vi saranno immunoglobuline adese agli eritrociti e non sar rilevata alcuna reattivit nelleluato. Specificit degli autoanticorpi La specificit degli autoanticorpi nella SAF riveste, di solito, soltanto un interesse accademico. Nella maggior parte dei casi, la sindrome sostenuta da anticorpi con specificit anti-I3,23. Meno frequentemente viene rilevata la specificit anti-i, di solito associata con una mononucleosi 3 . In rare occasioni vengono individuate agglutinine fredde con specificit anti-Pr o con altre specificit3,23 (vedi Metodo 4.7). Pu rendersi necessaria la diluizione del siero per dimostrare la specificit degli anticorpi ad altissimo titolo. La specificit dellautoanticorpo non ha un significato diagnostico nella SAF. Un auto anti-I pu essere rilevato sia in soggetti in buona salute sia in pazienti affetti dalla sindrome. La forma non patologica dellanti-I, tuttavia, raramente reattiva con titoli superiori a 64 a 4 C e, di solito, non reattiva a temperatura ambiente con emazie I negative (emazie i di cordone ombelicale o i di adulto). Al contrario, lauto anti-I, responsabile della SAF, pu essere marcatamente reattivo contro emazie I negative nei test a temperatura ambiente e presentare reazioni con identica intensit, o pi forti, con le emazie I positive. Lautoanticorpo anti-i reagisce in modo contrario, presentando le reazioni pi forti con le emazie I negative rispetto a quelle osservate con dei globuli rossi I positivi. Le procedure per stabilire le specificit e i titoli degli autoanticorpi freddi sono descritte nel Metodo 4.6 e Metodo 4.7. Esami pre-trasfusionali. Gli esami per il rilievo degli anticorpi devono essere eseguiti in modo da minimizzare lattivit dell autoanticorpo reattivo a freddo, permettendo lindividuazione di eventuali alloanticorpi clinicamente significativi. Luso di albumina e di altri potenzianti pu aumentare la reattivit degli autoanticorpi. Per evitare il rilievo del complemento fissato dallautoanticorpo, la maggior parte degli immunoematologi utilizza un siero monospecifico anti-IgG al posto del siero polispecifico.
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Pu essere inoltre opportuno utilizzare una tecnica di preriscaldamento (vedi Metodo 3.3). Procedure di autoassorbimento. Quando la reattivit di un autoanticorpo freddo continua a interferire con gli esami per il rilievo di alloanticorpi (per esempio, reattivo anche quando i test sono eseguiti strettamente a 37 C), possono rendersi utili delle procedure di autoassorbimento a freddo dellautoanticorpo (vedi Metodo 4.6). Uno o due autoassorbimenti dovrebbero rimuovere abbastanza autoanticorpi da rendere possibile il rilievo degli eventuali alloanticorpi a 37C, che verrebbero altrimenti mascherati dalla reattivit dellautoanticorpo freddo. Per rimuovere sufficiente autoanticorpo, cos da poter eseguire degli esami a temperatura ambiente, sono necessari molti pi autoassorbimenti a freddo. Se il paziente stato recentemente trasfuso, si possono utilizzare emazie di coniglio per rimuovere dai sieri gli autoanticorpi anti-I ed anti-IH36; ma con tale metodo37,38 sono stati rimossi anche alloanticorpi clinicamente significativi, particolarmente anti-B, -D, -E, -Vel e altri. Una preparazione di stromi di emazie di coniglio reperibile in commercio. Alternativamente, possono essere condotte indagini di assorbimento con emazie allogeniche, come per le AEA da autoanticorpi caldi (vedi sopra). AEA di tipo misto Bench circa un terzo dei pazienti con AEA da autoanticorpi caldi abbia autoanticorpi di classe IgM non patologici, che reagiscono ad alto titolo alle basse temperature, altri pazienti con tale AEA hanno autoagglutinine che reagiscono a temperature uguali o superiori ai 30 C. Questo ultimo gruppo viene identificato con il termine di AEA di tipo misto e pu essere suddiviso in pazienti con un alto titolo ed un ampio range termico degli autoanticorpi freddi di classe IgM (la forma rara di AEA da autoanticorpi caldi pi la classica SAF) e in pazienti con un normale titolo (<64 a 4 C), ma con ampio range termico degli autoanticorpi freddi19,20,22,39. I pazienti affetti da AEA di tipo misto si presentano, spesso, con una significativa emolisi e una complessa reattivit del siero presente in
tutte le fasi dellindagine. I tipici rilievi sierologici vengono descritti di seguito. Test allantiglobulina diretto Quando un paziente presenta una AEA pi SAF sia le immunoglobuline di classe IgG sia il C3 sono solitamente rilevabili sulle sue emazie. Quando lagglutinina fredda ha un titolo normale, ma un ampio range termico (pi alto o uguale a 30 C), lIgG e/o il C3 possono essere rilevabili sui globuli rossi3. Siero Sia le IgG reattive a caldo, sia gli autoanticorpi agglutinanti di classe IgM sono presenti nel siero. Ci determina, di solito, la reattivit del siero in tutte le fasi del test, praticamente con tutte le emazie utilizzate. Lautoanticorpo agglutinante di classe IgM reagisce a 30C o anche a temperature superiori. Se vengono eseguiti autoassorbimenti per rilevare alloanticorpi caldi, pu rendersi necessario condurli a caldo e anche a freddo. Eluato Un eluato correttamente eseguito conterr un autoanticorpo classe IgG reattivo a caldo. Specificit degli autoanticorpi Linsolita autoagglutinina fredda di classe IgM pu presentare le tipiche specificit della SAF (anti-I o anti-i), ma con maggiore frequenza non presenta una specificit riconoscibile19,20,22. L autoanticorpo caldo di classe IgG appare sierologicamente non differenziabile dalle specificit autoanticorpali solitamente rilevabili nella tipica AEA. Trasfusioni nelle AEA di tipo misto Se sono necessarie trasfusioni, i criteri per la selezione del sangue sono identici a quelli descritti per i pazienti con emolisi acuta determinata dalla AEA da autoanticorpi caldi (vedi in precedenza). Emoglobinuria parossistica a frigore La forma meno frequente di AEA con TAD positivo lemoglobinuria parossistica a frigore (EPF). In passato, era caratteristicamente
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associata alla sifilide, ma questa associazione , attualmente, rilevata con minore frequenza. Pi comunemente, lEPF si presenta come una condizione transitoria acuta, secondaria ad uninfezione virale, particolarmente nei bambini piccoli. In questi casi, lemolisina bifasica (vedi avanti) pu essere rilevata solo fugacemente. LEPF pu presentarsi anche come una patologia idiopatica cronica nei pazienti anziani. Un ampio studio ha rilevato che nessuno dei 531 pazienti adulti affetti da una ben definita anemia emolitica autoimmune presentava lemolisina di Donath-Landsteiner, mentre ben 22 di 68 bambini (il 32%) la presentavano21. Test allantiglobulina diretto LEPF determinata da un autoanticorpo di classe IgG che fissa il complemento, ma, come le agglutinine fredde di classe IgM, reagisce con le emazie nelle zone pi fredde del corpo (di solito, le estremit), determinando il legame irreversibile della frazione C3 del complemento, poi lanticorpo si dissocia dalle emazie non appena il sangue circola nelle aree pi calde del corpo. I globuli rossi lavati nelle procedure di routine per il TAD sono di solito sensibilizzati solamente dalle componenti del complemento, ma lanticorpo di classe IgG pu essere rilevato sui globuli rossi che sono stati lavati con una soluzione salina raffreddata ed esaminati con un siero anti-IgG tenuto a freddo3. Mantenendo il sistema il pi vicino possibile alla temperatura ottimale per il legame dell autoanticorpo freddo di classe IgG si permette che lanticorpo resti fissato al suo antigene. Siero Lautoanticorpo responsabile dellEPF, un anticorpo di classe IgG, classicamente descritto come unemolisina bifasica, perch la fissazione agli eritrociti si verifica a basse temperature, ma lemolisi non avviene fino a quando le emazie sensibilizzate non raggiungono la temperatura di 37C. Questo comportamento costituisce la base del test diagnostico per questa patologia, il test di Donath-Landsteiner (vedi Metodo 4.13). L autoanticorpo pu agglutinare le emazie normali a 4C, ma raramente con titoli superiori a 64.
Poich solo eccezionalmente lanticorpo reattivo sopra i 4C, nelle normali procedure per le prove di compatibilit il siero risulta compatibile con tutte le emazie di donatori presi a caso e non reattivo neppure nella ricerca pre-trasfusionale degli anticorpi irregolari. Eluato Poich le componenti del complemento sono solitamente le sole globuline presenti sulle emazie circolanti, gli eluati preparati dai globuli rossi del paziente con EPF sono quasi sempre non reattivi. Specificit dellautoanticorpo Lautoanticorpo responsabile dellEPF presenta, nella quasi totalit dei casi, una specificit anti-P, reagendo con tutti i campioni di emazie esaminati nel test di Donath-Landsteiner (ivi compresi gli eritrociti dello stesso paziente), con leccezione dei rarissimi fenotipi p e Pk. Sono per stati pubblicati casi eccezionali, in cui erano coinvolte delle altre specificit anticorpali6(p221),23. Trasfusioni nell EPF La trasfusione solo raramente necessaria per i pazienti adulti con EPF, nonostante la severit della loro emolisi. Nei bambini, particolarmente se di et inferiore ai sei anni, lampiezza termica dellautoanticorpo tende ad essere pi larga rispetto agli adulti e lemolisi pi vivace, cos che la trasfusione pu essere richiesta come misura salvavita. Vi qualche evidenza che le emazie p sopravvivono meglio delle emazie P+ (P1+ o P1)6(p221), ma la frequenza del sangue di fenotipo p circa di 1/200.000 e lurgenza della richiesta trasfusionale solitamente preclude la possibilit di ottenere, in tempi idonei, questo sangue raro. La trasfusione urgente nei pazienti con EPF non deve essere ritardata e va utilizzato sangue dei donatori diponibili. Le emazie P devono essere prese in considerazione solo per quei pazienti che non rispondono adeguatamente alla trasfusione con sangue di donatori random3. Le AEA TAD negative In alcuni pazienti si manifesta levidenza clinica di unanemia emolitica pur in presenza di un TAD
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negativo. Molto spesso lautoanticorpo non pu essere evidenziato n nelleluato n nel siero. Ci possono essere molti motivi per i quali il TAD negativo. Lautoanticorpo pu essere una IgA o una IgM3,40. Gli anticorpi con una bassa affinit di legame per lantigene possono dissociarsi dalle emazie durante i lavaggi in fisiologica per il TAD. Il lavaggio con una soluzione salina o una soluzione LISS molto fredda (per esempio, 4 C) pu contribuire a mantenere lanticorpo fissato sulle emazie; necessario un controllo (per esempio, albumina al 6-10%) per confermare che la causa dei risultati positivi non siano delle agglutinine fredde3,40. Vi possono essere troppo poche molecole di anticorpi sui globuli rossi per poterle rilevare con i metodi di routine, ma abbastanza da essere evidenziate con le metodologie in citometria a flusso, con il test allantiglobulina su emazie trattate con enzimi, con un test in fase solida, con il PEG, con il Polibrene, con lagglutinazione in microcolonne o in eluati concentrati. Uso di reattivi non di routine Lanticorpo responsabile pu essere una IgM o una IgA non rilevata con i comuni reagenti antiglobulinici. I reattivi anti-IgG, anti-C3d e la miscela anti-C3b-C3d sono i soli prodotti certificati reperibili negli Stati Uniti e utilizzabili con i globuli rossi umani. Le antiglobuline che reagiscono con le IgA, le IgM o il C4 sono reperibili in commercio, ma sono stati preparati per un impiego con finalit diverse dallagglutinazione. Questi reattivi devono essere utilizzati con precauzione e la loro attivit agglutinante deve essere accuratamente standardizzata dallutilizzatore3. I controlli di qualit devono essere rigorosi perch lagglutinazione con i reattivi AHG pi sensibile degli esami in immunoprecipitazione; un siero che appare come monospecifico nei test di precipitazione pu reagire con diverse proteine quando viene utilizzato nei test di agglutinazione. Depressione antigenica I pazienti con autoanticorpi a specificit Kell, Rh, LW, Ge, Sc, Lu e Lan possono avere forme
depresse dellespressione eritrocitaria dei rispettivi antigeni. Quando questo si verifica, lanticorpo pu essere rilevato nel siero e nelleluato, ma il TAD pu essere negativo o debolmente positivo. Questo pu fornire una forma di protezione in vivo alle emazie autologhe. Le emazie di donatori con una normale espressione della specificit antigenica possono essere distrutte, ma le emazie prive dellantigene corrispondente (di solito ad alta frequenza) possono sopravvivere meglio. Quando lautoanticorpo diminuisce le emazie autologhe tornano ad esprimere una normale quantit dellantigene6(p228),24.
Problemi sierologici con gli autoanticorpi

Negli esami pre-trasfusionali eseguiti su pazienti che presentano autoanticorpi, possono presentarsi i problemi elencati di seguito: 1. gli autoanticorpi freddi possono causare unautoagglutinazione eritrocitaria determinando tipizzazioni ABO ed Rh errate; 2. gli eritrociti fortemente sensibilizzati dalle immunoglobuline possono agglutinarsi spontaneamente in un mezzo ad alto contenuto proteico, come con i reattivi per la tipizzazione Rh e, occasionalmente, anche con diagnostici a pi basso contenuto proteico; 3. la presenza dellautoanticorpo libero nel siero pu rendere difficoltoso il rilievo e linterpretazione delle prove di compatibilit pre-trasfusionali. Se si dispone del tempo necessario, deve essere accertata, prima di trasfondere sangue, la presenza o meno di alloanticorpi irregolari clinicamente significativi (vedi Metodi da 4.9 fino a 4.12). Sebbene la risoluzione di questi problemi sia importante, il ritardo della trasfusione nella speranza di reperire sangue sierologicamente compatibile pu costituire in qualche caso un grave pericolo per il paziente. Solo il giudizio clinico pu risolvere questo dilemma: , perci, importante il dialogo con il medico curante del paziente.
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Risoluzione dei problemi ABO Esistono numerosi possibili approcci per risolvere i problemi di una corretta tipizzazione ABO in presenza di autoagglutinine fredde. Il pi delle volte basta mantenere il campione di sangue a 37 C subito dopo il prelievo e lavare le emazie con fisiologica riscaldata (37 C) prima degli esami. molto utile eseguire un controllo in parallelo, utilizzando una diluizione di albumina dal 6 al 10% in soluzione salina per accertare se persiste lautoagglutinazione. Se il controllo non reattivo i risultati ottenuti con lanti-A e lanti-B sono, di solito, corretti. Se persiste lautoagglutinazione pu rendersi necessario pretrattare le emazie con reattivi sulfidrilici. Poich le autoagglutinine fredde sono quasi sempre di classe IgM e i reattivi sulfidrilici denaturano le molecole IgM per eliminare lautoagglutinazione possono essere utilizzati (vedi Metodo 2.11) reattivi come il 2-mercaptoetanolo (2-ME) o il ditiotreitolo (DTT). Pu essere usato anche un pretrattamento dei globuli rossi con il reattivo ZZAP, come nella preparazione per lautoassorbimento (vedi Metodo 4.10). Sono per essenziali appropriati controlli per tutti gli esami. Quando il siero agglutina le emazie test di gruppo O i risultati degli esami eseguiti sul siero possono essere inattendibili. La ripetizione dellesame utilizzando siero ed emazie test A, B e O, preriscaldate a 37 C, quasi sempre risolver ogni discrepanza, ma deboli anticorpi anti-A e/o anti-B nel siero di qualche paziente potrebbero non essere rilevabili a 37 C. In alternativa, si pu utilizzare un siero assorbito (autoassorbito o assorbito con emazie allogeniche di gruppo O). Poich le emazie di coniglio esprimono un antigene B-simile, i sieri assorbiti con tali emazie o con i loro stromi potrebbero non contenere lanti-B e, quindi, tali sieri non devono essere utilizzati per i test indiretti nella determinazione ABO. Risoluzione dei problemi Rh Lautoagglutinazione spontanea degli eritrociti causata dagli autoanticorpi caldi e/o freddi pu determinare discrepanze anche nella tipizzazione Rh. Possono essere utili le medesime procedure
descritte per la risoluzione dei problemi ABO, con leccezione dellutilizzo delle emazie pretrattate con il ZZAP. Poich gli anticorpi di classe IgG possono essere dissociati dalle emazie anche con il trattamento con clorochina difosfato (Metodo 2.13) o con glicina-HCl/EDTA (Metodo 2.14) anche queste procedure sono idonee, perch lasciano integri i globuli rossi per le successive tipizzazioni. Per evitare lautoagglutinazione spontanea le emazie sensibilizzate dalle IgM possono essere anche trattate con dei reattivi sulfidrilici (come il 2-ME o il DTT, Metodo 2.11). Rilievo degli alloanticorpi in presenza di autoanticorpi reattivi a caldo Se il paziente presenta nel siero autoanticorpi reattivi a caldo e necessita di trasfusioni importante accertare la possibile simultanea presenza di alloanticorpi diretti contro antigeni eritrocitari. Alcuni alloanticorpi possono manifestare la propria presenza reagendo, in fasi differenti dellesame, con una maggiore intensit rispetto allautoanticorpo, ma, molto spesso, le analisi possono non suggerire la presenza di alloanticorpi mascherati dallautoanticorpo29. molto utile conoscere quali dei comuni antigeni eritrocitari sono assenti sulle emazie del paziente per prevedere quali alloanticorpi clinicamente significativi pu, o meno, aver prodotto o produrre il paziente. Gli antigeni assenti dalle emazie autologhe possono essere il bersaglio di alloanticorpi presenti o futuri. Quando i globuli rossi sono sensibilizzati da autoanticorpi di classe IgG, i reattivi diagnostici che utilizzano il siero anti-IgG non sono utilizzabili per le tipizzazioni, senza prima aver rimosso questi autoanticorpi IgG dalle emazie (vedi Metodi 2.13 e 2.14). I sieri a basso contenuto proteico (per esempio, i sieri diagnostici monoclonali), che non richiedono un test allantiglobulina, possono essere utili per tipizzare questi eritrociti TAD positivi. Se il paziente stato trasfuso di recente, possono rendersi necessarie le procedure di separazione dei globuli rossi (vedi Metodi 2.15 e 2.16). I metodi per rilevare alloanticorpi, in presenza di autoanticorpi reattivi a caldo, tentano di
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rimuovere, ridurre o evitare la reattivit dellautoanticorpo. Le procedure per il rilievo di anticorpi che utilizzano PEG, enzimi, microcolonne o ladesione cellulare in fase solida generalmente incrementano la reattivit degli autoanticorpi. Gli esami eseguiti con le emazie risospese in LISS o in soluzione salina possono evitare o ridurre la reattivit degli autoanticorpi e permettere il rilievo di alloanticorpi maggiormente significativi. Altre procedure prevedono lassorbimento, i cui principi sono discussi nel Capitolo 19. Due approcci ampiamente utilizzati sono discussi qui di seguito. Assorbimento con emazie autologhe In un paziente che non sia stato trasfuso di recente, lautoassorbimento (vedi Metodo 4.9) il metodo migliore per rilevare alloanticorpi in presenza di autoanticorpi reattivi a caldo. Il siero assorbito pu essere utilizzato nelle procedure di routine per il rilievo di anticorpi. Di solito, la procedura di autoassorbimento richiede uniniziale preparazione delle emazie del paziente. Poich lassorbimento in vivo a 37 C si gi verificato, tutti i siti antigenici sulle emazie del paziente stesso potrebbero essere bloccati. Pu essere necessario rimuovere lautoanticorpo dalle emazie autologhe per rendere disponibili i siti antigenici necessari per lassorbimento. Una eluizione delicata a 56 C per 5 minuti pu dissociare una parte delle IgG che si sono fissate sulle emazie. Questo pu essere seguito dal trattamento delle emazie autologhe, parzialmente eluite, con enzimi proteolitici per aumentare la loro capacit di assorbire lautoanticorpo dal siero. Il trattamento delle emazie con il reattivo ZZAP, una miscela di papaina oppure ficina e DTT (vedi Metodo 4.9) completa queste operazioni in un unico passaggio; la componente sulfidrilica rende le molecole IgG pi suscettibili allazione delle proteasi e dissocia le molecole anticorpali dalla superficie eritrocitaria. Se il siero contiene livelli elevati di autoanticorpo possono essere necessari autoassorbimenti sequenziali multipli, con nuove aliquote di emazie. Dopo che l autoanticorpo stato rimosso il siero assorbito pu essere esaminato per lattivit alloanticorpale.
Se il paziente sta per essere trasfuso pu essere vantaggioso conservare aliquote supplementari di emazie pre-trasfusionali da utilizzare per successivi autoassorbimenti. Lautoassorbimento non raccomandabile per pazienti che siano stati trasfusi di recente perch possono avere una miscela di emazie trasfuse in grado di assorbire gli autoanticorpi. I globuli rossi normalmente sopravvivono per 110-120 giorni. Nei pazienti affetti da AEA da autoanticorpi caldi ci si aspetta che le emazie abbiano una ridotta sopravvivenza. Tuttavia, non semplice stabilire quanto a lungo le emazie trasfuse possano permanere nel circolo di pazienti che necessitano di trasfusioni ripetute. stato dimostrato che aliquote molto piccole (10%) di emazie positive per lantigene sono in grado di rimuovere la reattivit del corrispondente alloanticorpo nelle indagini in vitro42; per tale motivo consigliabile attendere tre mesi dopo lultima trasfusione prima di eseguire assorbimenti con le emazie autologhe. Assorbimento con emazie allogeniche Luso di emazie allogeniche per lassorbimento pu essere utile quando il paziente stato trasfuso da poco tempo o quando sono disponibili quote di emazie autologhe insufficienti per lautoassorbimento. Lobiettivo quello di rimuovere l autoanticorpo e lasciare lalloanticorpo nel siero assorbito. Le emazie usate non debbono presentare gli antigeni contro i quali reagiscono gli alloanticorpi. Se la specificit dellalloanticorpo sconosciuta, vengono di solito utilizzate, per assorbire differenti aliquote del siero del paziente, emazie di fenotipi diversi. Dato il numero delle potenziali specificit degli alloanticorpi limpresa di selezionare le emazie per lassorbimento pu apparire molto difficile. Tuttavia, le emazie selezionate devono solo evidenziare gli alloanticorpi di rilevanza clinica che potrebbero essere presenti nel siero. Le cellule test devono pertanto comprendere gli antigeni comuni del sistema Rh (D,C, E, c, ed e) e gli antigeni K, Fya e Fyb, Jka e Jkb, S ed s. La selezione delle emazie resa pi semplice dal fatto che alcuni antigeni possono essere eliminati con appropriati pretrattamenti delle emazie (per
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esempio, con gli enzimi) prima di essere utilizzati nelle procedure di assorbimento. Gli eventuali alloanticorpi specifici per antigeni ad alta frequenza non possono essere esclusi con gli assorbimenti allogenici perch le emazie assorbenti quasi inevitabilmente esprimono questi antigeni e assorbono lalloanticorpo insieme con lautoanticorpo. Il fenotipo del paziente sconosciuto. Quando il fenotipo del paziente non conosciuto, devono essere selezionati (vedi Metodo 4.10) campioni di emazie di gruppo O di tre diversi fenotipi Rh (R 1 R 1, R 2 R 2 e rr). Uno deve essere privo dell antigene Jka e un altro dell antigene Jkb. Se queste emazie sono state pretrattate con lo ZZAP saranno prive anche di tutti gli antigeni del sistema Kell e degli antigeni sensibili agli enzimi proteolitici (vedi Tabella 19.3). Se non disponibile il reattivo ZZAP possono essere utilizzate emazie trattate solo con gli enzimi proteolitici, ma almeno uno dei campioni di emazie deve essere K perch gli antigeni del sistema Kell non sono stati distrutti. Possono essere utilizzate anche emazie che non siano state pretrattate, ma lautoanticorpo pu essere pi difficile da rimuovere e le emazie assorbenti, come minimo, devono comprendere almeno un campione che sia negativo per gli antigeni S, s, Fya, Fyb e K oltre ai requisiti per i sistemi Rh e Kidd sopracitati . Ogni aliquota di siero pu dover essere assorbita per due o tre volte. Le aliquote completamente assorbite vengono poi esaminate contro emazie note per presentare (o non presentare) i comuni antigeni dei sistemi Rh, MNS, Kidd, Kell e Duffy. Se unaliquota assorbita risulta reattiva, questa stessa aliquota (o un campione aggiuntivo ugualmente assorbito) deve essere esaminata per identificare lanticorpo. Assorbendo aliquote diverse di siero, con differenti campioni di emazie, si rende disponibile una serie di campioni di siero potenzialmente molto informativi. Per esempio, se laliquota assorbita con emazie Jk(a-) risulta successivamente reattiva solo con emazie Jk(a+) la presenza dellalloanticorpo anti-Jka pu essere confermata con sicurezza.
Il fenotipo del paziente noto. Se i fenotipi Rh e Kidd del paziente sono conosciuti, o possono essere accertati, lassorbimento pu essere eseguito con un singolo campione di emazie allogeniche, pretrattato con lo ZZAP, selezionato in modo che presenti il medesimo fenotipo Rh e Kidd del paziente (vedi Metodo 4.11). Problemi che si possono incontrare. Talvolta, un autoanticorpo potrebbe non essere completamente rimosso anche dopo tre assorbimenti sequenziali. Possono essere eseguiti ulteriori assorbimenti, ma la ripetizione degli assorbimenti pu diluire il siero. Se le emazie assorbenti non sembrano rimuovere lautoantiocorpo pu darsi che questo presenti una specificit infrequente che non reagisce con le emazie utilizzate per lassorbimento. Per esempio, un autoanticorpo con una specificit K, LW o EnaFS non pu essere rimosso da eritrociti che siano stati pretrattati con il ZZAP (vedi la Tabella 19.3 per lelenco degli antigeni che vengono alterati dai vari reattivi chimici od enzimatici). Autoanticorpi che mimano gli alloanticorpi Qualche volta gli autoanticorpi presentano profili di reattivit che possono facilmente essere scambiati per alloanticorpi. Per esempio, il siero di un paziente D negativo pu presentare unapparente reattivit anti-C e anti-e. La reattivit anti-C pu riflettere quella di un autoanticorpo anti-C anche se le emazie del paziente sono prive dellantigene C. La natura autoimmune della reattivit dellanticorpo pu essere dimostrata con studi di assorbimento con emazie autologhe ed emazie allogeniche. In questo caso, lapparente alloanticorpo anti-C potr essere assorbito anche su emazie C , sia autologhe sia allogeniche. Questo comportamento completamente diverso da quello di un vero alloanticorpo anti-C che pu essere assorbito soltanto su eritrociti C+. In uno studio43, il siero preparato da un iniziale autoassorbimento in molti casi faceva conservare nei sieri autoanticorpi che mimavano efficacemente la reattivit degli alloanticorpi oltre a dei veri alloanticorpi contemporaneamente presenti.
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Il siero preparato da un iniziale alloassorbimento il pi delle volte contiene solo alloanticorpi. Le differenze sulla natura auto o alloanticorpale delle specificit rilevate nei sieri autoassorbiti, confrontata con quella dei sieri alloassorbiti, riflette una carenza dellassorbimento con le emazie autologhe. Questo determinato principalmente dai volumi limitati di emazie autologhe disponibili per rimuovere completamente la reattivit autoanticorpale dal siero43. Rilievo di alloanticorpi in presenza di autoanticorpi reattivi a freddo Raramente le autoagglutinine fredde mascherano alloanticorpi clinicamente significativi se gli esami sul siero vengono eseguiti a 37 C e si sono utilizzati, nella fase antiglobulinica, sieri anti-IgG. In rari casi, pu rendersi necessario eseguire lautoassorbimento a 4 C (vedi Metodo 4.6). La rimozione completa di una potente autoagglutinina fredda richiede molto tempo e non , di solito, necessaria. Una sufficiente rimozione di unautoagglutinina fredda pu essere facilitata dal trattamento, prima dellassorbimento, delle emazie del paziente con enzimi o con il ZZAP.
Anemia immuno-emolitica indotta da farmaci

La somministrazione di farmaci qualche volta induce la formazione di anticorpi, sia specifici per gli stessi farmaci sia reattivi con antigeni eritrocitari intrinseci, che possono determinare un TAD positivo, la distruzione immunologica dei globuli rossi o entrambe le situazioni. Alcuni degli anticorpi prodotti sembrano dipendere dalla presenza del farmaco (sono, cio, farmaco-dipendenti) sia per il rilievo della loro presenza sia per la loro capacit distruttiva, mentre altri no (farmaco-indipendenti). In alcuni casi un TAD positivo pu avere origine dagli effetti del farmaco di natura non immunologica. I farmaci che sono stati riportati come causa di anemie emolitiche e/o di TAD positivi sono elencati nellAppendice 20.2.
Teorie sulla risposta immune e sugli anticorpi farmaco-dipendenti Sono state proposte numerose teorie per spiegare perch i farmaci possono indurre una risposta immune e quali relazioni possono avere queste risposte con la positivit del TAD e con la distruzione immuno-mediata dei globuli rossi che si osserva in alcuni pazienti. Per molti anni i TAD positivi associati ai farmaci sono stati classificati in quattro meccanismi: lassorbimento del farmaco (tipo penicillina), la formazione di immunocomplessi, la produzione di autoanticorpi e lassorbimento aspecifico. Questa classificazione stata utile, ma molti aspetti mancano di prove conclusive. Inoltre, alcuni farmaci determinano problemi immunologici con aspetti che coinvolgono pi di un meccanismo. Le teorie pi recenti, tuttora non dimostrate, si orientano verso approcci pi ampi44-48. La maggior parte dei farmaci sono, con ogni probabilit, in grado di legarsi, in modo blando o saldamente, alle emazie circolanti, determinando cos una risposta immune. La Figura 20.1 illustra questo concetto. Gli anticorpi possono essere diretti contro lo stesso farmaco oppure contro il farmaco associato a componenti della membrana cellulare. Quando si formato un anticorpo specificamente diretto sia contro il farmaco sia contro componenti della membrana, lanticorpo pu riconoscere come bersaglio primario il farmaco stesso o il complesso farmacomembrana oppure, prevalentemente, le componenti della membrana. Possono essere presenti uno solo o tutti e tre i tipi di popolazione anticorpale. Classificazione sierologica e clinica Gli anticorpi farmaco-indotti possono essere classificati in tre gruppi, in base alle loro caratteristiche sierologiche e cliniche 3. In un gruppo, il farmaco si fissa solidamente alla membrana e lanticorpo chiaramente specifico per il farmaco stesso. Gli anticorpi anti-penicillina sono quelli meglio descritti in questo gruppo. Il secondo gruppo di anticorpi farmaco-dipendenti
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reagisce con il farmaco che non ben fissato sulla membrana delleritrocita (per esempio, chinidina o ceftriaxone). Il meccanismo della reattivit di questi anticorpi stato descritto come dovuto alla formazione di un immuno-complesso farmaco/anti-farmaco, ma tale teoria non mai stata provata 48. Gli anticorpi appartenenti a questo gruppo possono determinare una crisi emolitica acuta e possono essere difficili da dimostrare sierologicamente. Lindagine per questo tipo di anticorpi anti-farmaco viene ancora riferita come metodo per gli immunocomplessi. Gli anticorpi del terzo gruppo (per esempio, metildopa, procainamide, fludarabina) hanno una reattivit sierologica indipendente dal farmaco nonostante il fatto che sia stato il farmaco a indurre, in origine, la risposta immune. Dal punto di vista sierologico questi anticorpi si presentano come autoanticorpi.
Gli anticorpi farmaco-dipendenti reattivi con gli eritrociti trattati con il farmaco: anticorpi tipo-penicillina Gli elementi diagnostici, clinici e di laboratorio per laccertamento delle anemie emolitiche immuni farmaco-indotte che operano con questo meccanismo sono quelle riportate qui di seguito: 1. il TAD fortemente positivo per la fissazione delle IgG. Possono essere fissate anche delle componenti del complemento; 2. lanticorpo, eluito dalle emazie del paziente, reagisce con i globuli rossi trattati con il farmaco, ma non reattivo con gli eritrociti non trattati; 3. il siero contiene un titolo elevato di anticorpi di classe IgG (specialmente quando il bersaglio dellanticorpo la penicillina o il cefotetan) che sono reattivi con i globuli rossi trattati con il farmaco, ma non reattivi con le emazie non trattate a meno che il paziente
Figura 20.1 - Proposta teorica unificante sulle reazioni anticorpali indotte da farmaci (basato su una vignetta di Habibi, citata da Garratty)23. Le linee pi grosse e scure rappresentano i siti di fissazione dellantigene sulla regione F(ab) dellanticorpo indotto dal farmaco. I farmaci (apteni) si legano blandamente, o solidamente, alle membrane cellulari e gli anticorpi possono essere reattivi con: a) il farmaco [producendo in vitro la tipica reattivit di una reazione da assorbimento del farmaco (tipo penicillina)], b) i componenti della membrana, o i componenti principali della membrana (producendo in vitro le reazioni tipiche di un autoanticorpo) oppure c) i componenti in parte della membrana e in parte del farmaco (producendo in vitro la reazione tipica del cosiddetto meccanismo degli immunocomplessi)23(p55).
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non presenti anche alloanticorpi specifici per gli antigeni eritrocitari; 4. per la penicillina, la dose in grado di indurre lemolisi si misura in milioni di unit giornaliere per una settimana o pi, per gli altri farmaci (per esempio. il cefotetan) singole dosi di 1-2 g hanno determinato emolisi immuni; 5. lemolisi si sviluppa gradualmente, ma pu mettere in pericolo la vita del paziente se non viene riconosciuta la causa e viene continuata la somministrazione del farmaco; 6. la sospensione del farmaco seguita, successivamente, da un incremento della sopravvivenza degli eritrociti, sebbene possa persistere, per diverse settimane, unemolisi eritrocitaria con severit progressivamente decrescente.
Circa il 3% dei pazienti che ricevono alte dosi di penicillina per via endovenosa (per esempio, milioni di unit al giorno) svilupper un TAD positivo, ma solo occasionalmente questi pazienti presenteranno unanemia emolitica 6(p231). Un possibile meccanismo per spiegare il TAD positivo illustrato nella Figura 20.2. La penicillina si fissa, in vivo, con un legame covalente. Se il paziente presenta un anticorpo anti-penicillina, questo si lega alla penicillina, a sua volta legata alla membrana cellulare e il globulo rosso viene sensibilizzato dallanticorpo IgG. Se si verifica la distruzione eritrocitaria, questa si realizza in sede extravascolare, probabilmente nello stesso modo con cui vengono distrutti i globuli rossi sensibilizzati da alloanticorpo. Lemolisi intravascolare rara.
Figura 20.2 - Il meccanismo dellassorbimento del farmaco. Il farmaco si fissa blandamente sulle proteine della membrana. Se il paziente sviluppa un potente anticorpo anti-farmaco, questo reagir con il farmaco fissato sulle emazie. Questi globuli rossi presenteranno un TAD positivo con il siero anti-IgG. Di solito non viene attivato il complemento e lemolisi principalmente di natura extravascolare. La penicillina G il farmaco prototipo.
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Molte cefalosporine, che sono correlate con la penicillina, si comportano in modo simile. Le cefalosporine sono generalmente classificate per generazioni, basate sulla loro efficacia contro i microrganismi Gram-negativi (vedi Tabella 20.4). Circa il 4% dei pazienti che ricevono cefalosporine di prima o seconda generazione sviluppa un TAD positivo48. Una drammatica riduzione della sopravvivenza degli eritrociti stata attribuita alle cefalosporine di seconda e terza generazione12,47,49,53. La frequenza e la severit della distruzione eritrocitaria immune indotta dalle cefalosporine sembra essere in aumento 3. Gli anticorpi farmaco-dipendenti reattivi con il meccanismo dei complessi immuni Sono stati riportati molti farmaci come causa di anemie emolitiche attraverso questo meccanismo. Alcune cefalosporine di seconda e terza generazione reagiscono con questo meccanismo. Lanti-ceftriaxone stato identificato solo con il metodo per rilevare gli immunocomplessi49. Sono tipiche le osservazioni, riportate di seguito: 1. il complemento pu essere lunica globulina che facilmente rilevabile sugli eritrociti, ma possono essere presenti anche IgG; 2. gli anticorpi presenti nel siero possono essere di classe IgM o IgG oppure una miscela di IgM e IgG; 3. il farmaco (o un suo metabolita) deve essere presente nei test in vitro per evidenziare lanticorpo presente nel siero del paziente. L anticorpo pu determinare lemolisi, lagglutinazione diretta e/o la sensibilizzazione delle emazie in presenza del farmaco; 4. al paziente pu essere stata somministrata anche solo una modesta dose del farmaco; 5. lesordio consiste di solito in unemolisi intravascolare acuta con emoglobinemia ed emoglobinuria. Il blocco renale assai frequente; 6. una volta formati gli anticorpi possono ricorrere severi episodi emolitici dopo lesposizione del paziente anche a piccolissime dosi del farmaco.
Tabella 20.4 - Alcune cefalosporine Nome generico Prima generazione Cefadroxil Cafazolina Cephalexina Cefalotina Cefapirina Cefradina Seconda generazione Cefacloro Cefamandolo Cefmetazolo Cefonicid bisodico Cefotetan Cefoxitina Cefuroxime Cefuroxime Axetil Terza generazione Cefixime Cefotaxime Ceftazidime Suprax Claforan Fortaz, Ceptaz, Pentecef, Tazicef, Tazidime Ceftizox Rocephin Cefoperazone sodico Cefobid Ceclor Mandol Zefazone Monocid Cefotan Mefoxin Zinacef, Kefurox, Ceftin Ceftin Duricef Ancef, Kefzol, Zolicef Keflex Keflin Cafadyl Anspor Nome commerciale*
Ceftizoxime Ceftriaxone Quarta Generazione Cefepime
Maxipime
* Numerose sostanze farmacologiche sono vendute con altri nomi commerciali. Questo elenco da intendersi come informativo e non omnicomprensivo.
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Gli anticorpi farmaco-indipendenti: produzione dellautoanticorpo Alcuni farmaci inducono la produzione di autoanticorpi che appaiono sierologicamente indistinguibili da quelli formati nelle AEA da autoanticorpi caldi. I globuli rossi sono sensibilizzati dalle IgG e gli eluati, cos come il siero, sono virtualmente reattivi con tutte le emazie test, in assenza del farmaco. La specificit per gli antigeni gruppoematici stata da tempo dimostrata come analoga a quella che viene rilevata nelle AEA. L anticorpo non presenta, in vitro, una reattivit diretta od indiretta con il farmaco. Le indagini pi approfondite su questi casi sono quelle che sono state condotte con l-metildopa. stata rilevata una stretta correlazione con il farmaco L-dopa, come anche con diversi altri farmaci non correlati con l-metildopa, compresa la procainamide, i farmaci anti-infiammatori non steroidei (per esempio, lacido mefenamico), le cefalosporine di seconda e terza generazione e la fludarabina. In qualche caso sono presenti anche anticorpi farmaco-dipendenti. La dimostrazione che sono i farmaci la causa originale della produzione degli autoanticorpi difficile da ottenere. Le prove sufficienti dovrebbero comprendere la dimostrazione che la produzione di autoanticorpi si verificata dopo la somministrazione del farmaco, la risoluzione del processo autoimmune che si verifica dopo la sospensione del farmaco e la ricomparsa dellanemia emolitica se viene nuovamente somministrato il farmaco. Lultima prova cruciale ed la pi difficile da ottenere. Lassorbimento aspecifico delle proteine La positivit del TAD associata con alcuni farmaci determinata da un meccanismo indipendente dalla produzione anticorpale. Lanemia emolitica associata con questo meccanismo si verifica raramente. Le cefalosporine (sopratutto la cefalotina) sono i farmaci coi quali stato originalmente associato questo meccanismo. I globuli rossi sensibilizzati con la cefalotina vengono incubati con un plasma
normale dal quale assorbono, in modo non immunologico, lalbumina, le IgA, le IgG, le IgM e il C3d. Se questo si verifica, verr rilevato unTAI positivo. Altri farmaci in grado di determinare lassorbimento non immunologico delle proteine ed un TAD positivo comprendono la glicoaldeide, la suramina, il cisplatino, lacido clavulanico (nel Timentin e nellAugmentin), il sulbactam nellUnasyn54 e il tazobactam (nel Tazocin e Zosyn)55,56. Le indagini di laboratorio per gli anticorpi farmaco-indotti I problemi correlati ai farmaci, che vengono rilevati con maggiore frequenza nei Servizi Trasfusionali, sono quelli associati con un TAD positivo. I tipici risultati del TAD sono presentati nella Tabella 20.3. Trasfusioni recenti di sangue e/o drammatici episodi emolitici possono verificarsi anche con un TAD solo debolmente positivo quando si sospetta unemolisi. Il siero del paziente deve essere esaminato per leventuale presenza di anticorpi irregolari con le procedure di routine. Se il siero non reattivo con gli eritrociti non pretrattati gli esami devono essere ripetuti contro emazie ABO compatibili in presenza del farmaco sospettato di essere la causa del problema. Le tecniche di indagine sono descritte nel Metodo 4.14 e 4.15. Se il farmaco stato riportato come possibile causa di anemia emolitica i metodi idonei per lindagine possono essere reperibili nella descrizione del caso pubblicato. Se questa informazione non disponibile, pu essere eseguito un iniziale test di screening con una soluzione del farmaco alla concentrazione approssimativa di 1 mg/mL in soluzione salina tamponata a un pH ottimale per solubilizzare il farmaco. Se questi esami non sono informativi, si possono fare dei tentativi per fissare il farmaco a globuli rossi normali ed esaminarli contro il siero del paziente e un eluato dalle sue emazie pu essere analizzato contro eritrociti rivestiti dal farmaco.
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Questo il metodo di indagine ottimale quando si sospetta che siano coinvolti la penicillina o le cefalosporine. I risultati definitivi per spiegare un TAD positivo indotto dalla penicillina rappresentano la dimostrazione della reattivit delleluato contro emazie rivestite da penicillina e la mancata reattivit con le medesime emazie non rivestite. La risposta immune pu essere specifica per un metabolita del farmaco, invece che per il farmaco stesso. Se il quadro clinico coerente con unemolisi immuno-mediata e i test precedenti non sono informativi, pu essere utile eseguire esami per i metaboliti del farmaco (vedi Metodo 4.16). I sieri normali comunemente agglutinano e/o sensibilizzano gli eritrociti trattati con le cefalosporine per ladesione aspecifica delle proteine che stata discussa precedentemente. Questo problema pu essere superato esaminando una diluizione 1 a 20 del siero del paziente e di un siero normale come controllo, contro emazie trattate con le cefalosporine. Per gli esami eseguiti con eritrociti trattati con cefotetan, deve essere esaminata una diluizione 1 a 100 del siero del paziente, perch stato dimostrato che alcuni sieri normali sembrano contenere anticorpi naturali specificamente reattivi con il cefotetan alcuni dei quali sono ancora in grado di reagire debolmente alla diluizione di 1 a 2057,58. Gli anticorpi specifici per il cefotetan associati con lanemia emolitica farmaco-indotta hanno titoli anticorpali molto alti nel test allantiglobulina (da 4.000 a 256.000)49. Sono state fatte due ulteriori osservazioni relative ai test sugli anticorpi anti-cefotetan: 1) la soluzione fisiologica dellultimo lavaggio per la preparazione delleluato pu risultare reattiva con le emazie trattate con il cefotetan (fatto che pu essere determinato da un elevato titolo dellanticorpo e/o dallaffinit dello stesso per lantigene) e 2) anticorpi farmaco-indipendenti possono essere rilevati sia nel siero sia nelleluato e, erroneamente, lemolisi pu essere attribuita ad una AEA idiopatica49.
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Appendice 20.1 - Un esempio di algoritmo per le indagini su un TAD positivo (escludendo le indagini per la MENF)
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Appendice 20.2 - Alcuni farmaci associati allemolisi immune e/o al TAD positivo determinato da anticorpi farmaco-indotti
Farmaco Acetaminofene Acido mefenamico Acido p-aminosalicilico Aminopirina Ampicillina Anfotericina B Anidride trimellitica Antazoline Apazone (azapropazone) Butizide Carbenicillina Carbamidazolo Carboplatino Carbromal Catergen Cefalosporine di: Prima generazione Seconda generazione Terza generazione Chaparral Chinidina Chinino Cianidolo Ciclofenil Ciclosporina Cisplatino Cloropropamide Cloropromazina Cladribina (clorodeossiadenosina) Clavulanate potassium Diclorofenac Dietilsilbestrolo Categoria terapeutica Analgesico, antipiretico Antinfiammatorio Antitubercolare Analgesico, antipiretico Antibatterico Antimicotico, antibiotico Usata nella preparazione di colori, resine etc. Antistaminico Antinfiammatorio, analgesico Diuretico, anti-ipertensivo Antibatterico Inibitore tiroideo Antineoplastico Sedativo, ipnotico Astringente, epatoprotettivo Antibatteriche Meccanismo possibile FD-IC FI FD-IC FD-IC FD-IC FD-IC ? FD-IC FI, FD-FA FD-IC FD-FA FD-IC FD-FA, FD-IC FD-FA FI ANIP, FD-FA FD-IC, FD-FA, FI FD-IC, FD-FA. FI FI FD-FA, FD-IC FD-IC FI, FD-FA, FD-IC FI FI ANIP FD-IC FI, FD-IC FI ANIP FI, FD-IC FD-IC
(segue)
Depressivo cardiaco, antiaritmico Antimalarico Principio gonadi-stimolante Immunosoppressore Antineoplastico Antidiabetico Antipsicotico Antineoplastico Inibitore della -lactamase, antibatterico Antinfiammatorio Estrogeno
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Farmaco Diglicoaldeide Dipirone Elliptinium (acetato) Eritromicina Etodolac Fenacetina Fenfluramina Fenoprofene Fludarabina Fluorescina Fluorouracile Glafenina Idralazina Idroclorotiazide Ibuprofene Insulina Interferone Isoniazide Levodopa Meflochina Melfalano 6-Mercaptopurina Metadone Meticillina Metotrexate Metildopa Moxalattame (latamoxef) Nafcillina Nomifensina Penicillina G Pentotal Piperacillina Podofillotossina Probenecid Procainamide
Categoria terapeutica Antineoplastico Analgesico, antipiretico Antineoplastico Antibatterico Antinfiammatorio, analgesico Analgesico, antipiretico Anoressico Antinfiammatorio Antineoplastico Colorante iniettabile Antineoplastico Analgesico Antipertensivo Diuretico Antinfiammatorio Antidiabetico Antineoplastico, antivirale Antibatterico, antitubercolare Antiparkinsoniano, anticolinergico Atimalarico Antineoplastico Antineoplastico Narcotico analgesico Antibatterico Antineoplastico, antimetabolita Anti-ipertensivo Antibatterico Antibatterico Antidepressivo Antibatterico Anestetico Antibatterico Antineoplastico, purgante Uricosurico Depressivo cardiaco, antiaritmico
Meccanismo possibile ANIP FD-IC, FD-FA FD-IC FD-FA IC FI, FD-IC ? FI, FD-IC FI FD-FA, FD-IC FD-IC FI, FD-IC FD-IC FD-IC FI FD-FA?, FD-IC FI FD-FA?, FD-IC FI FD-IC FD-IC FD-FA ? FD-FA FD-IC FI FD-IC, FI FD-FA FI, FD-IC FD-FA FD-IC FD-FA, FD-IC ? FD-IC FI
(segue)
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Farmaco Propifenazone Piramidone Ranitidina Rifampicina Stibofene Streptomicina Sulbactam sodico Sulfamidici Sulfoniluree Sulindac Suprofene Suramina Temafloxacina Teniposide Tetraciclina Tiopentotal Tolbutamide Tolmetina Triamterene Zomepirac
Categoria terapeutica Analgesico, antipiretico, antinfiammatorio Analgesico, antipiretico Antagonista dei recettori H2 istaminici Antibatterico, antitubercolare Antischistosomi Antibatterico, anti-tubercolare Inibitore della -lactamasi, antibatterico Antibiotici Antidiabetici Antinfiammatorio Antinfiammatorio, analgesico Antitripanosomi, antifilaria Antibatterico Antineoplastico Antibatterico, antirikettzie, antiamebiasi Anestetico Antidiabetico Antinfiammatorio Diuretico Analgesico, antinfiammatorio
Meccanismo possibile FD-IC FD-IC ? FD-IC FD-IC FI, FD-FA, FD-IC ANIP FD-IC FD-IC FD-FA, FI FD-IC, FI ANIP FD-IC FI, FD-IC FD-FA?, FD-IC FD-IC FD-FA FI, FD-IC FD-IC FD-FA, FD-IC, FI
I meccanismi elencati sono basati su descrizioni pubblicate in letteratura3,44-48. TAD= test allantiglobulina diretto; FD-FA = farmaco-dipendente-farmaco assorbito. Il farmaco viene assorbito sulleritrocita; lanticorpo reagisce con il farmaco sulle emazie; FD-IC = farmaco-dipendente-meccanismo dellimmuno complesso. Richiede farmaco, siero e globuli rossi per la dimostrazione sierologica. Per la maggior parte di questi farmaci, esistono solo una o poche pubblicazioni; FI = farmaco-indipendente. Associata con autoanticorpi simili a quelli dellAEA calde. Il farmaco non necessario per le indagini in vitro. Il meccanismo della produzione dellautoanticorpo pu essere vario; ANIP = assorbimento non immunologico di proteine; ? = meccanismo sconosciuto o non chiaramente definito.
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Capitolo 21: Pratica trasfusionale
Capitolo 21
Pratica trasfusionale
La decisione di trasfondere, come ogni altra decisione terapeutica, dovrebbe basarsi sui rischi, sui benefici e sulle possibili alternative di trattamento. Sfortunatamente, i dati riguardanti le indicazioni alla trasfusione non sempre sono prontamente disponibili e i pazienti corrono il rischio di essere o ipertrasfusi o sottotrasfusi. Destano problematiche, in particolare, le trasfusioni basate esclusivamente sugli indici di laboratorio. Le opinioni di consenso sulluso degli emocomponenti, come quelle emesse dagli Istituti Nazionali della Salute (NIH, National Institutes of Health) possono fornire una guida alla terapia, ma non possono sostituire il giudizio clinico.
O2 di base, in particolare cuore, reni, cervello, fegato e apparato gastro-intestinale, mentre il consumo da parte dei muscoli a riposo molto basso. Il contenuto di O2 del sangue (mL O2/mL di sangue) si misura con lemoglobina, con il coefficiente di legame dellemoglobina per lO2, con lindice di saturazione di O2 dellemoglobina e tenendo conto della piccola quantit di O2 disciolto nel plasma, secondo la formula: contenuto di O2 = (Hb x 1,38 x %sat) + (pO2 x 0,003) Il consumo di O2 da parte dei tessuti viene calcolato dalla differenza fra lO2 del sangue arterioso e quello del sangue venoso: consumo di O2 = gittata cardiaca x Hb x 1,39 x (%satarteriosa %satvenosa)/100 che espresso come: (mL O2/minuto) = L/minuto x g/L x mL O2/g La saturazione in O2 delle emoglobine arteriosa e venosa varia con la pressione parziale di O2 (pO2). In situazioni normali, la pO2 si abbassa da 100 mmHg nel sangue arterioso a 40 mmHg nel sangue venoso, in rapporto allestrazione di O2 da parte dei tessuti e la saturazione dellemoglobina cade da circa il 100% nelle arterie al 75% nelle vene; il tasso di estrazione dellO2 , quindi, 0,25. come dire che lemoglobina cede soltanto il 25% del suo O2. Quando la richiesta di O2 da parte dei tessuti aumenta, o diminuisce il
Trasfusione di globuli rossi

Principi fisiologici Lindicazione primaria di una trasfusione di globuli rossi quella di ristabilire o mantenere la capacit ossiforetica per rispondere alle richieste dei tessuti; la trasfusione di eritrociti per sostituire i globuli rossi distrutti nel corso della malattia emolitica del neonato (MEN) discussa al Capitolo 24. Dato che la richiesta di O2 varia grandemente fra i diversi soggetti e nelle diverse situazioni cliniche, la misura del solo ematocrito (Hct) o concentrazione di emoglobina (Hb) non sono in grado di valutare correttamente la necessit di trasfondere1-3. Fabbisogno e apporto normali di ossigeno Alcuni tessuti a riposo hanno un fabbisogno di
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rifornimento di O2, i tessuti estraggono una quota maggiore di O2 dal plasma e dallemoglobina; ci provoca una pO 2 venosa pi bassa e una diminuita saturazione di O2 nel sangue venoso. Studi sui primati suggeriscono che si raggiunge un punto critico di limitata cessione di O2, quando il tasso di estrazione due volte il normale, cio 0,502. In condizioni normali di riposo, il corpo ha ampie riserve disponibili di O2 in rapporto alle richieste. In media negli adulti, circa 1.000 mL di O2/minuto sono disponibili per i tessuti e soltanto 250 mL/minuto vengono consumati secondo le seguenti formule: disponibilit di O2 (calcolata per una Hb di 140 g/L e una pO2 di 100) = gittata cardiaca x contenutoarterioso di O2 = 5 L/minuto x [140x1,39 x 100%) + (100 x 0,003)] = 5 L/minuto x 200 mL O2/L = 1.000 mL O2/minuto consumo di O2 = gittata cardiaca x (contenuto O2arterioso contenuto O2venoso) = 5 L/minuto x (200 mL O2/L 150 mL O2/L) = 5 L/minuto x 50 mL O2/L = 250 mL O2/minuto Compenso per lanemia Le equazioni precedenti dimostrano che ogni diminuzione nel contenuto di O2 dovuta allanemia pu essere compensata da un aumento della gittata cardiaca1,2. Ci avviene sia per laumentata attivit cardiaca, sia perch lanemia diminuisce la viscosit del sangue e, conseguentemente, le resistenze vascolari periferiche. Una maggiore disponibilit di O 2 , per laccresciuto lavoro del cuore, favorita anche da un aumento dellestrazione di O2. Questa estrazione viene fortemente aumentata dalla diminuita pO2 nei tessuti, che agisce a livello del segmento in ascesa della curva di dissociazione Hb/O2 (vedi Figura 8.1), e dallacidosi, che promuove la dissociazione dellO 2 dallemoglobina. Anche un aumento della concentrazione eritrocitaria di 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) ha, nel tempo, un effetto significativamente positivo sulla cessione di O2.
Misurare ladeguatezza della disponibilit di O2 Molti fattori, come segnalato in precedenza, determinano la cessione di O2 ai tessuti, eccetto ai pi bassi livelli. Di conseguenza, in aggiunta alla determinazione dellemoglobina, debbono essere prese altre misure, per guidare la maggior parte delle decisioni. Ladeguatezza della disponibilit di O2 dipende dalla pressione parziale dellO2 inspirato, dagli scambi gassosi nei polmoni, dalle prestazioni cardiache del paziente, dallemoglobina, dallaffinit O2/Hb e dalla richiesta di O2 del momento. Tutte queste condizioni, al di fuori dellaffinit O2/Hb, sono soggette a variazioni sostanziali. Per i pazienti ricoverati in unit di terapia intensiva o in sala operatoria, la misurazione diretta della gittata cardiaca e della tensione di O2 nelle vene, insieme a quella dellemoglobina, possono costituire dei riferimenti fisiologici pi utili per le decisioni trasfusionali, rispetto al solo livello di emoglobina. Ciononostante, la maggio parte delle decisioni al riguardo continueranno a essere prese, in maggioranza, sulla base dellemoglobina e degli accertamenti clinici standard. I parametri della performance cardiaca comprendono: la volemia intravascolare del paziente, la riduzione delle resistenze vascolari periferiche correlata allanemia, la presenza di coronaropatie o di altre forme di cardiopatia, nonch let del paziente. Quando la domanda di O2 supera la disponibilit, si instaura un debito tissutale di O2. I tessuti si convertono a un metabolismo anaerobico, producendo un aumento di acido lattico. Lacidosi metabolica, da parte sua, peggiora le prestazioni del cuore, diminuendo ulteriormente la perfusione e la cessione di O2, e determinando, in un circolo vizioso, un aumento dellipossia tessutale. Trattamento della cessione inadeguata di O2 La trasfusione di concentrati eritrocitari (CE) il mezzo pi diretto per aumentare la concentrazione di emoglobina. Altre vie per migliorare la disponibilit di O2, relativamente alle richieste, comprendono unaccresciuta perfusione tessutale (aumentando al massimo
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grado le prestazioni cardiache), un aumento della saturazione di O 2 con maggiore apporto di ossigeno o con ventilazione meccanica, e una diminuzione della richiesta di O2 da parte dei tessuti, con riposo a letto, uso di antipiretici e la prevenzione dellipertensione. Per esempio, un malato, con un livello di emoglobina di 6 g/dL e un indice cardiaco di 5 L/minuto/m2, ha una ridotta cessione di O2. Assumendo che lestrazione dellO2 rimanga costante, la sua cessione potrebbe essere normalizzata con un aumento della concentrazione emoglobinica a 9 g/dL o aumentando lindice cardiaco a 7 L/minuto/m2. Un minore aumento di emoglobina ridurrebbe lincremento richiesto dellindice cardiaco. Emocomponenti con globuli rossi Sangue intero Il sangue intero (SI) fornisce le capacit di trasporto dellO2, fattori stabili della coagulazione (le concentrazioni di Fattore V e di Fattore VIII diminuiscono durante la conservazione) e unespansione della volemia: quindi utile per i pazienti con concomitanti deficit di eritrociti e di volemia, come quelli emorragici o che necessitano di un supporto nella coagulazione in particolari situazioni cliniche, come il trapianto di fegato4. In realt, il sangue intero raramente disponibile per trasfusioni allogeniche; concentrati eritrocitari e varie soluzioni sostitutive sono divenuti i mezzi standard per pazienti con emorragia secondaria a trauma o in chirurgia, con eventuale integrazione di emostatici, se
necessari. Il pi frequente utilizzo di sangue intero oggi, negli USA, si registra nelle trasfusioni autologhe (vedi Capitolo 5). Concentrati eritrocitari I concentrati eritrocitari sono indicati per trattare i pazienti che necessitano di aumentare la capacit ossiforetica e la massa globulare5. La trasfusione di concentrati eritrocitari aumenta la capacit di trasportare O2, con minore espansione della volemia per unit, rispetto al sangue intero. Ci importante per pazienti a rischio di sovraccarico circolatorio (come i neonati o i pazienti con scompenso cardiaco congestizio). In un malato adulto, in assenza di emorragie, di emolisi o di grandi modifiche nel comparto dei fluidi, ci si attende che ununit di concentrati eritrocitari aumenti la concentrazione di emoglobina di circa 1 g/dL o lematocrito del 3%. Scelta del sangue intero e dei concentrati eritrocitari Il sangue intero deve essere ABO identico. I concentrati eritrocitari non necessitano di essere ABO identici ma debbono essere compatibili con gli anticorpi (Ab) presenti nel plasma del ricevente. I pazienti Rh negativi dovrebbero ricevere soltanto sangue intero o concentrati eritrocitari Rh negativi. In casi di trauma o di trasfusioni massive pu rendersi necessario utilizzare sangue Rh positivo, come sar discusso pi avanti. Si rimanda alla Tabella 21.1 per i criteri di selezione del gruppo sanguigno nella trasfusione di concentrati eritrocitari. La selezione di unit di concentrati eritrocitari per pazienti con alloanticorpi
Tabella 21.1 - Ordine consigliato nella scelta dei gruppi ABO per trasfusioni di concentrati eritrocitari (CE) Gruppo ABO del ricevente 1a scelta AB A B O AB A B O Gruppo ABO del CE 2a scelta A O O 3a scelta B 4a scelta O
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discussa nel Capitolo 19. Indicazioni alla trasfusione Numerose organizzazioni hanno pubblicato linee guida per la trasfusione di concentrati eritrocitari3,6,7. Sono anche disponibili alcune revisioni sulle indicazioni alla trasfusione1,8,9. Perdite di sangue e trasfusioni perioperatorie Per pazienti con emorragie in atto, lo scopo del trattamento iniziale dovrebbe essere quello di prevenire lo sviluppo di uno shock ipovolemico, fermando le perdite e ristabilendo la volemia. I tentativi di ristabilire la volemia, con linfusione di soluzioni cristalloidi o colloidi, hanno la precedenza sul ripristino delle capacit ossiforetiche e dovrebbero essere iniziati immediatamente. In casi di emorragie acute, le linee guida consigliano di trasfondere i pazienti che hanno perso dal 30 al 40% della volemia, insieme ad altre misure atte a correggere e a mantenere il volume totale di sangue3,6. I pazienti con malattie cardiache o con altre affezioni possono richiedere un ripristino pi rapido. Si dimostrato che adulti sani, a riposo, sono in grado di tollerare unemodiluizione isovolemica acuta, tale da portare la concentrazione di emoglobina a 5 g/dL, senza mostrare segni di inadeguata ossigenazione10. In pazienti che rifiutano le trasfusioni per ragioni religiose e che sono sottoposti a interventi operatori, la mortalit aumenta progressivamente a livelli post-operatori di emoglobina inferiori a 5 o 6 g/dL, soprattutto nei cardiopatici11. Le trasfusioni perioperatorie incidono per il 5565% sul totale delle trasfusioni di concentrati eritrocitari. Indagini randomizzate hanno dimostrato la sicurezza di una soglia trasfusionale di 8 g/dL di emoglobina in pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca13,14, ortopedica15 o con emorragie del tratto gastro-enterico16. Anche prima che fossero disponibili tali evidenze, una consensus conference NIH, sulle trasfusioni di concentrati eritrocitari in periodo perioperatorio7, aveva sottolineato che una emoglobina di 10 g/dL era inappropriata come valore-guida o soglia
trasfusionale nelle situazioni perioperatorie e aveva consigliato un valore di emoglobina di 7 g/ dL come livello al quale la trasfusione veniva pi frequentemente richiesta in soggetti, per altri versi sani, con anemia acuta. I fattori da considerare per decidere una trasfusione prendevano in considerazione la durata dellanemia, la volemia, le caratteristiche dellintervento, la probabilit di perdita massiva di sangue e la presenza di altre condizioni concomitanti, quali una funzione polmonare compromessa, una gittata cardiaca inadeguata, unischemia miocardica, oppure una malattia circolatoria cerebrovascolare o periferica 7. Queste linee guida sottolineavano anche che la trasfusione non favorisce la cicatrizzazione delle ferite, che dipende dalla pO2, piuttosto che dal contenuto totale di O2 del sangue. Una linea guida emessa da una commissione della Societ Americana degli Anestesisti 3 indicava un livello di emoglobina al di sotto dei 6 g/dL come un indice che richiedeva quasi sempre la terapia trasfusionale, mentre un livello al di sopra di 10 g/dL indicava, soltanto raramente, la necessit di trasfondere, con lintervallo fra i due valori, quale regno del giudizio clinico. Unaltra commissione, del Collegio dei Patologi Americani, presentava conclusioni simili e proponeva diverse misure oggettive che potevano indicare la necessit di prescrivere una trasfusione di concentrati eritrocitari per i livelli di emoglobina compresi fra 6 e 10 g/dL, comprendenti: tachicardia o ipotensione in presenza di volemia normale; pO2 venoso inferiore a 25 torr; tasso di estrazione di O2 >50% o consumo totale di O2 inferiore al 50% dei valori basali6. In passato, si discusso se le trasfusioni di una sola unit di concentrati eritrocitari potevano, con ogni probabilit, rappresentare un intervento non necessario. Tuttavia, se la trasfusione di una singola unit pu conseguire lesito clinico desiderato, anche una sola unit dovrebbe essere trasfusa. Il trasfondere unit aggiuntive, in questi casi, non farebbe che aumentare i rischi trasfusionali senza conseguire ulteriori benefici.
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Anemia Fra i pazienti di pertinenza medica, quelli con malattie cardiovascolari o neoplastiche rappresentano il maggior numero di quelli che ricevono unit di concentrati eritrocitari13. In unindagine prospettica randomizzata sulla trasfusione di globuli rossi, pazienti anemici, ma normovolemici, ricoverati in unit di terapia intensiva, venivano assegnati o a un regime trasfusionale restrittivo oppure a uno liberale, in grado di mantenere lemoglobina o fra 7 e 9 g/dL o fra 10 e 12 g/dL, rispettivamente17. Il tasso di mortalit, durante il ricovero in ospedale (ma non a 30 giorni), era significativamente pi basso nel gruppo a politica restrittiva (22,3% contro 28,1%, p = 0,05). Nessuna differenza nella mortalit era stata notata nei pazienti con malattie cardiache clinicamente importanti. Un terzo dei pazienti, appartenenti al gruppo a condizione terapeutica restrittiva, aveva evitato trasfusioni, e il totale delle unit di concentrati eritrocitari usate era stato la met di quelle del gruppo liberale. Gli Autori concludevano che una politica restrittiva sulle trasfusioni di concentrati eritrocitari almeno efficace quanto la politica a conduzione liberale in pazienti critici, con la possibile eccezione di quelli con infarto miocardico (IM) acuto o angina instabile. Una successiva, nuova analisi dei pazienti cardiopatici di questo studio, ha mostrato una tendenza (anche se non statisticamente significativa) verso una maggiore mortalit nel gruppo di pazienti trattati con la politica restrittiva, nel caso in cui fossero affetti da IM o angina instabile18. Uno studio retrospettivo su un alto numero di pazienti anziani (>65 anni), ospedalizzati per IM acuto, suddivisi in gruppi secondo lematocrito al momento del ricovero, ha paragonato il tasso di mortalit a 30 giorni fra i pazienti che avevano ricevuto trasfusioni e quelli che non ne avevano ricevute 19. La trasfusione si dimostrata di beneficio per quei malati con un ematocrito <30%. Questo risultato permaneva, quando i dati sono stati corretti, prendendo in considerazione molteplici fattori clinici e istituzionali. I pazienti con anemia cronica tollerano meglio bassi livelli di emoglobina rispetto a quelli con
anemia acuta, a causa del compenso cardiovascolare e dellaumentata estrazione di O2. Inoltre, i pazienti allettati, non febbrili, che non hanno uno scompenso cardiaco congestizio, e che non sono ipermetabolici, hanno minore richiesta di O2 e possono sopportare lanemia molto meglio. Lalta necessit di O2 da parte del cuore, tuttavia, pu far accelerare langina nei cardiopatici con anemia. Una concentrazione di 8 g/dL risponde adeguatamente allesigenze di O2 della maggior parte dei pazienti con cardiopatia stabile. Per quanto sia desiderabile evitare trasfusioni non necessarie, i pazienti anemici sintomatici debbono ricevere un trattamento appropriato. Lanemia pu causare una sintomatologia caratterizzata da debolezza generalizzata, mal di testa, vertigini, disorientamento, difficolt di respiro, palpitazioni, dolore toracico, pallore (non cianosi) e tachicardia. Elwood et al.20 non sono riusciti a correlare i sintomi con il livello di emoglobina nei pazienti con anemia cronica ferrocarenziale e con una emoglobina bassa (8 g/dL). Uno studio sullimpiego di eritropoietina ha dimostrato un miglioramento dei sintomi quando lemoglobina sale a 10 g/dL, ma nessun cambiamento sopra tale livello 21. I pazienti con anemia cronica iporigenerativa, noti per essere trasfusionedipendenti, dovrebbero essere mantenuti a un livello tale da prevenire la sintomatologia, stabilendo un programma trasfusionale, da adattarsi, volta per volta, secondo le necessit.
Trasfusioni di piastrine
Principi fisiologici Lemostasi si sviluppa in quattro fasi: la fase vascolare, la formazione del tappo piastrinico, lo sviluppo del coagulo di fibrina sul tappo piastrinico e la lisi finale del coagulo. Le piastrine (plt) sono essenziali per la formazione del tappo emostatico primario, che fa da superficie di base, sulla quale si forma la fibrina. Un deficit nel numero e/o nella funzione delle piastrine pu determinare effetti imprevedibili, che vanno da un allungamento,
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privo di significato clinico, del tempo di emorragia ad emorragie massive, che possono mettere in pericolo la vita. La formazione del tappo piastrinico avviene attraverso la combinazione di vari processi che interessano ladesione, lattivazione, il rilascio, laggregazione e lattivit procoagulante 22. Ladesione delle piastrine sullendotelio danneggiato viene mediato per lo pi dal Fattore von Willebrand (vWF), che si lega alla glicoproteina di superficie (GP) del complesso recettore GPIb-IX-V. Il processo di attivazione e rilascio causa modifiche sostanziali nella morfologia delle piastrine (con lemissione di prolungamenti simili a pseudopodi), un cambiamento nelle capacit leganti le proteine di membrana, la secrezione del contenuto dei granuli interni delle piastrine, e lattivazione di alcune vie metaboliche. Queste modifiche determinano molti effetti, ivi compresi il reclutamento di ulteriori piastrine, e laggregazione con laiuto del fibrinogeno o del vWF, che si legano alle GP della membrana piastrinica. Da ultimo, lattivit procoagulante della membrana piastrinica localizza e indirizza la formazione di fibrina. Valutazione delle funzioni piastriniche La diminuzione di numero delle piastrine pu essere causata da una minore produzione, da unaumentata distruzione, dal sequestro splenico. La funzione piastrinica pu essere influenzata negativamente da diversi fattori, quali farmaci, epatopatie o nefropatie, sepsi, prodotti di degradazione della fibrina (e del fibrinogeno), bypass cardio-polmonari, malattie primitive del midollo osseo. Lemostasi piastrinica pu essere valutata dalla storia clinica, dallesame obiettivo, dai test di laboratorio, che comprendono la conta, il tempo di emorragia o lanalisi della funzionalit delle piastrine in vitro (per esempio, con lanalizzatore PFA100). I pazienti con unalterazione del numero o della funzionalit delle piastrine possono presentare petecchie, ecchimosi, emorragie mucose, nasali e gengivali, ematurie. La conta piastrinica eseguita prima di una procedura predittiva di sanguinamento in
alcuni studi23,24, ma non in altri25-27. Il tempo di emorragia misura sia la fase vascolare sia la fase piastrinica dellemostasi. Quantunque il tempo di emorragia possa essere un buon test diagnostico nel valutare i pazienti con note o sospette anormalit piastriniche, esso non in grado di predire i sanguinamenti chirurgici28 e non un indicatore affidabile sulla necessit di ricorrere alla terapia con concentrati piastrinici (CP)29. Anche la valutazione in vitro della funzionalit piastrinica utile, ma, come il tempo di emorragia, non prevede in maniera affidabile linsorgenza di emorragie30. Durata di vita delle piastrine e loro cinetica Di norma, le piastrine circolanti hanno una durata di vita di 10,5 giorni31 e, se sono state raccolte e conservate in modo corretto, hanno una durata di 4-5 giorni, quando ritrasfuse nel donatore originale. Le condizioni che ne possono accorciare la durata sono: splenomegalia, sepsi, farmaci, coagulazione intravascolare disseminata (CID), presenza di auto- o di alloanticorpi, attivazione delle cellule endoteliali e attivazioni piastriniche (come nel caso di by-pass cardiopolmonare o di contropulsatore intra-aortico). Dato che un numero costante di piastrine (7.00010.000/L/giorno) si consuma quotidianamente per tamponare piccoli difetti endoteliali, la frazione del pool di piastrine circolanti, richiesta per il mantenimento delle funzioni, aumenta dopo che il numero di piastrine diminuisce. La durata di vita delle piastrine native o di quelle trasfuse diminuisce, quindi, in presenza di una trombocitopenia progressiva31. La risposta alla trasfusione di concentrati piastrinici viene meglio valutata osservando se il sanguinamento si arresta e misurando lincremento post-trasfusionale nel numero delle piastrine. Questo incremento viene, di solito, misurato fra 10 minuti e 1 ora dopo la fine della trasfusione e viene espresso con lindice CCI (Corrected Count Increment, aumento corretto della conta) o con la percentuale di recupero, come riportato al Capitolo 16. Due consecutive
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risposte insufficienti fanno sospettare la presenza di una refrattariet piastrinica. Concentrati piastrinici Singole unit Un singolo concentrato di piastrine, ottenuto da ununica unit di sangue intero, pu essere sufficiente per la trasfusione di neonati o bambini, ma, per un adulto, necessario riunire in un pool da 4 a 6 di tali singole unit per ottenere una dose maggiore di 3 x 1011 piastrine. Questa dose dovrebbe aumentare la conta da 30.000 a 60.000 plt/L. Piastrine da aferesi I concentrati piastrinici preparati con tecnologia aferetica (piastrine da singolo donatore) hanno un contenuto simile a quello ottenibile riunendo le piastrine in pool di 4-6 donatori e, in base alla tecnica utilizzata, possono essere leucodepleti. Il fatto che una sola unit possa essere sufficiente per una trasfusione, facilita la disponibilit di piastrine compatibili per i pazienti refrattari a causa di unalloimmunizzazione. La trasfusione di pazienti refrattari discussa al Capitolo 16. Selezione delle piastrine Compatibilit ABO Dato che antigeni ABO sono presenti sulla superficie piastrinica, il recupero di piastrine di gruppo A trasfuse in un ricevente O , talora, diminuito32, ma, di solito, questo effetto non clinicamente significativo (vedi Capitolo 16). La trasfusione di plasma ABO incompatibile, presente nel componente piastrinico, pu anche causare un ridotto incremento piastrinico posttrasfusionale33. In questa situazione, lemolisi si verifica raramente, ma si pu avere frequentemente la positivit del test allantiglobulina diretto , il che fa aumentare costi e impegni per le ricerche sierologiche nel ricevente. Unanalisi retrospettiva ha inoltre indicato che la sopravvivenza dopo trapianto di midollo osseo si era ridotta, in modo significativo, nei pazienti che avevano ricevuto, con la trasfusione di concentrati piastrinici, notevoli quantit di plasma
ABO incompatibile34, ed stato anche prospettato che linfusione di antigeni solubili A e B, presenti nei componenti piastrinici e plasmatici, poteva sortire un simile effetto sfavorevole, mediato da immunocomplessi35. Pu essere, perci, prudente impiegare piastrine ABO compatibili, soprattutto per riceventi che necessitano di ripetute trasfusioni. In tutti i casi, le trasfusioni che siano urgentemente necessarie non debbono essere rimandate per tale ragione. Per i piccoli pazienti, consigliabile evitare la somministrazione di plasma incompatibile con gli eritrociti del bambino; se non sono disponibili piastrine contenute in plasma compatibile, la quantit di plasma pu essere ridotta (vedi Metodo 6.15). Questo raramente necessario per riceventi adulti o adolescenti, quantunque siano stati segnalati casi di emolisi importanti dopo trasfusione di concentrati piastrinici da aferesi di gruppo O, con alti titoli di anti-A o anti-B36. Se anticorpi ABO trasfusi sono rinvenibili nel ricevente, pu essere necessario utilizzare concentrati eritrocitari di gruppo O. Compatibilit Rh Lantigene D non si rinviene sulle piastrine ed normale la sopravvivenza di piastrine Rh positive in un ricevente con anticorpi anti-D. Tuttavia, i concentrati piastrinici contengono piccole quantit di emazie, cos un ricevente Rh negativo pu immunizzarsi a causa di componenti provenienti da donatori Rh positivi. Per le bambine e le donne Rh negative in et fertile, particolarmente consigliabile evitare linfusione di piastrine provenienti da donatori Rh positivi; tuttavia, se questo non si pu evitare, dovrebbero essere somministrate immunoglobuline anti-D (RhIG). Qualora si temi la formazione di ematomi da iniezione, si tenga presente che sono anche disponibili preparati di RhIG per uso endovenoso. Una dose piena di RhIG, che considerata profilattica per una quantit di emazie Rh positive fino a 15 mL, dovrebbe essere in grado di proteggere dalle emazie presenti in almeno 30 unit di piastrine da singolo donatore o in almeno
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7 unit di piastrine da aferesi di donatori Rh positivi. Trasfusioni piastriniche terapeutiche Emorragie importanti, dovute a trombocitopenia o ad anormale funzionalit piastrinica, sono indicazioni per trasfusioni terapeutiche di piastrine37. La decisione di trasfondere piastrine dipende dalla causa del sanguinamento, dalla condizione clinica del paziente, dal numero e dalla funzionalit delle piastrine circolanti3,38-40. Le trasfusioni di emocomponenti piastrinici sono particolarmente benefiche, quando la trombocitopenia la causa primaria del difetto emostatico. Lo scopo mantenere una conta sopra le 50.000 plt/L. Possono essere richiesti anche altri emocomponenti, in pazienti che presentino molteplici anomalie. Le emorragie, dovute ai difetti funzionali piastrinici secondari, a un by-pass cardio-polmonare o allingestione di farmaci contenenti aspirina o antagonisti delle glicoproteine IIb/IIIa (per esempio, labciximab) o, ancora, inibitori dellaggregazione piastrinica (quali il clopidigrel o la ticlopidina), spesso rispondono alla trasfusione di piastrine. Altri difetti, quali quelli che intervengono nelluremia o nella malattia di von Willebrand, rispondono meno bene, in quanto le piastrine trasfuse tendono ad acquisire lo stesso difetto. Trasfusioni piastriniche profilattiche Le indicazioni per le trasfusioni profilattiche di piastrine sono pi controverse di quelle terapeutiche. Una soglia di 20.000 plt/L o inferiore per pazienti con piastrinopenia indotta dalla chemioterapia, stata utilizzata da molti medici, ma ricerche prospettiche randomizzate hanno dimostrato che, in pazienti stabilizzati, anche un limite di 10.000 plt/L altrettanto sicuro, determinando una decisiva diminuzione nellimpiego di piastrine41-43. Una soglia pi alta viene spesso utilizzata in pazienti febbrili, con evidenza di un rapido consumo, con una conta leucocitaria alta, con difetti coagulativi, con lesioni intracraniche 38 . Al contrario, molti pazienti
trombocitopenici stabili, possono tollerare conte pi basse, come quelle di 5.000 plt/L41. Nonostante il largo uso di trasfusioni profilattiche di piastrine, pochi sono gli studi che documentino un loro effetto benefico. Una ricerca, che paragonava pazienti trattati con trasfusioni profilattiche a pazienti trasfusi soltanto per sanguinamenti clinicamente significativi, ha documentato unevidente diminuzione delle emorragie, ma il numero dei pazienti era troppo basso per dimostrare, fra i due gruppi, differenze nella sopravvivenza globale o nei casi di morte dovuta a emorragie44. Da notare che il gruppo trattato in via profilattica aveva ricevuto il doppio di trasfusioni di concentrati piastrinici e veniva segnalato che la refrattariet si era sviluppata pi spesso in questo gruppo. Questa osservazione ha determinato lavvertimento che le trasfusioni profilattiche possano essere pi pertinenti in pazienti, nei quali ci si attende che la piastrinopenia sia una condizione transitoria38. Se, invece, ci si aspetta che la trombocitopenia si prolunghi, lo sviluppo di refrattariet pu limitare la risposta alle trasfusioni piastriniche, soprattutto se il sistema immunitario normale, come nei pazienti affetti da anemia aplastica o da piastrinopenie congenite. Si ritiene, in generale, che i pazienti con grave piastrinopenia pre-operatoria trarranno beneficio dalle trasfusioni profilattiche, ma ci non stato dimostrato da studi sperimentali. La soglia per eseguire tali trasfusioni , tipicamente, fissata fra 50.000 e 100.000 plt/L3. Si indagato sulle trasfusioni profilattiche in circostanze, nelle quali si presume che possa svilupparsi una piastrinopenia intra-operatoria, a causa della diluizione45 o per by-pass cardio-polmonare46; in entrambi questi casi, le trasfusioni profilattiche si sono dimostrate inefficaci. Quantunque sia stata approvata la logica che sta alla base delle trasfusioni profilattiche in pazienti trombocitopenici sottoposti a chirurgia, il gruppo degli esperti NIH38 ha indicato che tali trasfusioni sarebbero pi appropriate per pazienti, nei quali lemorragia potrebbe non essere rilevata o potrebbe avvenire, anche in piccola quantit, in luoghi critici, come nel sistema nervoso
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centrale. Le linee guida gi pubblicate suggeriscono una soglia trasfusionale di 50.000 plt/L per la maggior parte dei casi di chirurgia maggiore e una conta intorno a 100.000 plt/L per i malati da sottoporre a interventi di neurochirurgia o di chirurgia oftalmica39. Le trasfusioni profilattiche di piastrine possono essere utili anche in pazienti da sottoporre ad interventi chirurgici e che presentino difetti piastrinici funzionali 39, ivi compresi quelli dovuti al trattamento con abciximab47. Refrattariet piastrinica La refrattariet piastrinica, definita come uno scarso incremento dopo una dose terapeutica di piastrine, pu riconoscere un meccanismo immune o non immune ed descritta, dettagliatamente, al Capitolo 16 o in altre rassegne48,49. Gli anticorpi responsabili delle forme immuni possono essere auto- o alloreattivi, con quelli alloimmuni pi frequentemente diretti contro antigeni HLA di Classe I. Gli autoanticorpi sono responsabili della Porpora Trombotica Immune (PTI) (vedi Capitolo 16). Le cause non immunologiche di refrattariet piastrinica sono dovute ad infezioni, a splenomegalia, a farmaci (in particolare, lanfotericina B) o a un accelerato consumo di piastrine (vedi Tabella 16.3). Controindicazioni alle trasfusioni di piastrine Vi sono diverse condizioni cliniche, nelle quali le trasfusioni di piastrine possono essere richieste, ma sono controindicate. Le controindicazioni relative riguardano condizioni nelle quali le probabilit di beneficio sono remote; la trasfusione in questo contesto spreca solamente un prezioso emocomponente. Possibili esempi sono le trasfusioni profilattiche in pazienti stabili con Porpora Trombocitopenica Immune (PTI)50 o con refrattariet. Per i pazienti affetti da PTI sottoposti a splenectomia, la trasfusione di piastrine dovrebbe essere ritardata, sino a che il peduncolo vascolare non sia stato clampato. Si dovrebbero, anche,
evitare le trasfusioni di piastrine in pazienti affetti da Porpora Trombotica Trombocitopenica (PTT) o da piastrinopenia indotta da eparina, salvo i casi di emorragie che mettono in pericolo la vita o la vitalit di qualche organo. Tali situazioni sono associate alla presenza di trombi piastrinici, e maggiori complicanze trombotiche possono instaurarsi in seguito alle trasfusioni di piastrine51.
Trasfusioni di granulociti
Limpiego delle trasfusioni di granulociti raro in pazienti adulti. Nuovi antibiotici, gli effetti sfavorevoli attribuibili alle trasfusioni di concentrati granulocitari (CG), lavvento dei fattori di crescita tissutali e le difficolt di dimostrarne lefficacia hanno contribuito al loro declino. Ciononostante, in alcuni pazienti selezionati, la trasfusione di concentrati granulocitari pu produrre effetti benefici 52, in particolare se sono disponibili maggiori quantit di granulociti, provenienti da donatori stimolati con fattori di crescita granulocitari53. Per i riceventi alloimmunizzati, si richiede anche la compatibilit HLA54. La preparazione, la conservazione e i test pretrasfusionali da eseguire per i concentrati granulocitari sono discussi al Capitolo 6, mentre il loro uso nei neonati discusso al Capitolo 24. Indicazioni e controindicazioni Gli scopi di una trasfusione di concentrati granulocitari dovrebbero essere chiaramente definiti prima di iniziare un trattamento terapeutico. In genere, il paziente dovrebbe presentare le seguenti condizioni minime: 1. neutropenia (conta granulocitaria inferiore a 500/L); 2. febbre per 24-48 ore, colture batteriche o fungine positive, progressiva infezione parenchimale non rispondente a unappropriata terapia antibiotica; 3. ipoplasia mieloide; 4. una ragionevole possibilit di ripristino delle funzioni midollari. I pazienti con una disfunzione granulocitaria
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Tabella 21.2 - Contenuto medio di leucociti negli emocomponenti (per unit)55-59 Emocomponente Contenuto in leucociti (per unit) 109 108 107 106-107 <5x106 106-108 107 <5 x 106 <8,3 x 105 <5 x 106 <0,6 x 1061,5 x 107
Emocomponenti cellulari speciali

Leucoriduzione Il contenuto medio di leucociti dei comuni emocomponenti sintetizzato in Tabella 21.2. La leucoriduzione stata utilizzata per diverso tempo, per gruppi selezionati di pazienti57,58. Attuali linee guida e gli Standard AABB per centri donatori e Servizi Trasfusionali(59(pp25,28,29,31,32) definiscono leucoridotto un emocomponente con un numero residuo di leucociti del donatore inferiore a 5 x 106 nel prodotto finale (concentrati eritrocitari, concentrati piastrinici da aferesi e concentrati piastrinici da singole unit di sangue intero). Gli Standard AABB59(p31) richiedono meno di 8,3 x 105 per i concentrati piastrinici leucoridotti preparati da singole unit di sangue intero, al fine di corrispondere ai requisiti di un pool da 6 unit. Le indicazioni emesse dalla FDA raccomandano controlli di qualit che dimostrino, con un intervallo di confidenza del 95%, che pi del 95% delle unit esaminate soddisfano i requisiti richiesti. Per confronto, le linee guida del Consiglio dEuropa definiscono leucoridotti gli emocomponenti con meno di 1 x 106 leucociti residui per unit e prescrivono che leventuale mancanza di tale requisito non riguardi pi del 10% delle unit. Dati pubblicati dimostrano che la leucodeplezione riduce i rischi di: 1. reazioni febbrili non emolitiche (vedi Capitolo 27); 2. trasmissione di CMV60; 3. alloimmunizzazione HLA che pu indurre refrattariet alle trasfusioni di piastrine61. Indicazioni controverse e non provate per la leucodeplezione comprendono: 1. riduzione dellimmunomodulazione, che pu condurre ad un aumentato rischio di recidiva neoplastica o di infezioni batteriche62; 2. riduzione del rischio di malattie da prioni; 3. riduzione del rischio di contaminazione dei concentrati eritrocitari da parte della Yersinia enterocolitica63. Molti studi hanno indagato sulla possibilit che la leucodeplezione sia in grado di ridurre lincidenza di esiti clinici negativi indotti dallimmunomodulazione correlata alla
Sangue intero (SI) Concentrati eritrocitari (CE) CE lavati CE deglicerolizzati CE leucoridotti (per filtrazione)* Concentrati piastrinici (CP) da aferesi CP da singole sacche CP da aferesi leucoridotto* CP da singole sacche, leucoridotti Pool di CP leucoridotti Plasma fresco congelato (PFC) dopo scongelamento
* Leucoriduzione effettuata con filtri dassorbimento di terza generazione.
documentata, come quelli affetti da malattia granulomatosa cronica, possono anche essere candidati a ricevere trasfusioni di granulociti, nel corso di episodi infettivi che possono mettere in pericolo la vita o durante lattesa di un trapianto di CSE. Ulteriori considerazioni I concentrati granulocitari contengono quantit rilevanti di globuli rossi, che debbono essere compatibili dal punto di vista ABO ed Rh, particolarmente per donne in et fertile. I concentrati granulocitari debbono essere irradiati per evitare il rischio di GvHD (Graft-versus-Host Disease) trasfusionale. Se la trasmissione di citomegalovirus (CMV) rappresenta un problema, il suo rischio pu essere ridotto impiegando donatori CMV negativi (i filtri per leucodeplezione sono, ovviamente, controindicati). Per i riceventi alloimmunizzati, i donatori debbono essere compatibili con la tipizzazione HLA o con lesecuzione di un crossmatch leucocitario52,54.
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Figura 21.1 - (A) Il modello classico della cascata coagulativa era basato sui dati sperimentali in vitro in un sistema privo di cellule. Il termine estrinseco esprime il concetto che il fattore tessutale non circola nel plasma. (B) Evidenze pi recenti sottolineano che le reazioni coagulative intervengono, nel sito della lesione, sulla superficie delle cellule che portano il fattore tessutale e sulla superficie delle piastrine, successivamente reclutate. TFPI = inibitore del fattore tessutale; HK = chininogeno ad alto peso molecolare; PK = precallicreina; TF= fattore tessutale. (Da Roberts et al.67, adattamento autorizzato). trasfusione, ma i risultati sono contradditori62. Uno dei propositi era che il risparmio di eventi correlati allimmunomodulazione avrebbe potuto equiparare i costi della leucoriduzione, ma ci non stato dimostrato in un ampio studio prospettico randomizzato64. Ciononostante, diversi Paesi si sono convertiti alluso di emocomponenti leucoridotti, e questo argomento rimane controverso65. Emocomponenti irradiati Lirradiazione di un emocomponente cellulare il solo metodo accettato per prevenire la GvHD trasfusionale. La GvHD interviene anche dopo trasfusioni con emocomponenti leucoridotti66. Per maggiori dettagli sulla GvHD e sulle indicazioni allirradiazione, vedi Capitolo 27.
Reintegro dei fattori della coagulazione

Principi fisiologici La coagulazione il risultato di una complessa, ma ordinata, cascata enzimatica, che avviene sulla superficie delle piastrine e delle cellule che esprimono il fattore tissutale (Figura 21.1). La cascata coagulativa viene divisa, tipicamente, nelle vie intrinseche ed estrinseche, la cui attivit in vitro pu essere misurata con il tempo parziale di tromboplastina attivata (o aPTT, activated Partial Thromboplastin Time) e con il tempo di protrombina (o PT, Prothrombin Time), rispettivamente, ma, in vivo, le cascate sono interdipendenti667. Lenzima procoagulante principale la trombina, che viene attivata da entrambe le vie. Per la formazione di fibrina e per lemostasi, sono
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Tabella 21.3 - Fattori della coagulazione Fattore I II V VII VIII IX X XI XIII AT Nome Fibrinogeno Protrombina Proaccelerina1 Proconvertina2 Fattore anti-emofilico Fattore Christmas Fattore Stuart-Prower PTA Fattore stabilizzante la fibrina Antitrombina Emivita in vivo 3-6 gg 2-5 gg 4,5-36 h 2-5 h 8-12 h 18-24 h 20-42 h 40-80 h 12 gg 60-90 h Emivita in vitro (4 C) Anni >21 gg 10-14 gg >21 gg 7 gg >21 gg >21 gg >28 gg >21 gg >42 gg % necessaria per lemostasi 15-20 10-25 10-30 >10 30-40 15-40 10-40 20-30 <5 80-120 % recupero in vivo 50-70 50 circa 80 100 60-70 20 50-95 90 50-100 50-100 Dose terapeutica iniziale 1 crio/7 kg PC 10-20 unit/kg PC 10-20 mL plasma/kg PC 10-20 unit/kg PC Vedi Tabella 21.6 Vedi Tabella 21.6 10-20 unit/kg PC 10-20 mL/kg PC 500 mL plasma ogni 3 settimane 40-50 U/kg PC
Note: 1) Tutti i dosaggi sono forniti come guida generica per una terapia iniziale; la dose esatta e gli intervalli debbono essere adattati al singolo paziente. 2) Ununita di ogni fattore della coagulazione presente in 1 mL di PFC. 3) La desmopressina (DDAVP) il trattamento di scelta per i pazienti con emofilia A responders. 4) I dati sono stati desunti dalle seguenti fonti bibliografiche: a) Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TL, eds. Williams Hematology, 5th ed. New York: McGraw-Hill, 1995:1413-59, 1657. b) Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion in Clinical Medicine. 5th ed. Oxford: Blackwell Sc Publications, 1997: 459-88. c) Huestis DW, Bove JR, Case J, eds, Practical Blood Transfusion. 4th ed. Boston: Little Brown & Co, 1988: 319. d) Counts RB, Haisch C, Simon TL, et al. Hemostasis in massively transfused trauma patients. Ann Surg 1979; 190: 91-9. e) Istruzioni allegate ai farmaci. 1 Fattore labile; 2Fattore stabile. Abbreviazioni: PTA = Precursore plasmatico della tromboplastina; gg = giorni; h = ore; PC = peso corporeo.
richiesti livelli minimi dei fattori della coagulazione (Tabella 21.3), dato che il plasma normale contiene in eccesso i fattori della coagulazione, una riserva che consente ai pazienti di tollerare la sostituzione di uno o pi volumi di eritrociti e di cristalloidi, senza la necessit di dover ricorre al plasma fresco congelato. Gli epatopatici hanno riserve fisiologiche minori e sono, quindi, pi suscettibili alle coagulopatie da diluizione. Monitoraggio dellemostasi Per monitorare lemostasi, vengono usualmente impiegati il PT, laPTT e la misurazione del livello di fibrinogeno. I risultati dovrebbero essere interpretati, tenendo conto delle quattro considerazioni seguenti: 1) un modesto allungamento del PT o dellaPTT si verifica prima che la concentrazione residua dei fattori scenda sotto i livelli normalmente necessari per lemostasi; 2) al contrario, il PT e laPTT sono relativamente insensibili ai bassi livelli di fibrinogeno; 3) deficit significativi dei fattori della coagulazione (o la presenza di inibitori dei fattori della coagulazione) provocano, chiaramente, allungamenti di PT e di aPTT; 4) uninfusione di plasma fresco congelato, che accresca del 20% la concentrazione dei fattori, avr un impatto di gran lunga maggiore su PT e aPTT decisamente prolungati, piuttosto che su PT e aPTT poco allungati. Per esempio, linfusione di due unit di plasma fresco congelato in un paziente con PT di 14,5 secondi (valori normali: da 11 a 13 sec.) assai poco probabile sia in grado di apportare un beneficio clinico e di riportare il PT a valori normali. Come valori soglia, per i quali pu essere indicato un apporto terapeutico o profilattico, in appropriate situazioni cliniche, le linee guida riportano, tipicamente, un PT pi alto di 1,5 volte il limite massimo normale3 o 1,5 volte il valore medio dellampiezza normale 39 , e un aPTT maggiore di 1,5 volte il limite massimo normale3,39. Da notare, tuttavia, come alcuni studi hanno chiaramente dimostrato che PT e aPTT, anche quando allungati a questi valori, hanno scarsa capacit di predire complicazioni emorragiche in
corso di procedure invasive, quali le paracentesi o le toracentesi25, le biopsie epatiche26,27, le angiografie23 o la sistemazione di cateteri venosi centrali24. Componenti e prodotti disponibili per il reintegro dei fattori della coagulazione I componenti plasmatici disponibili si differenziano fra loro secondo i tempi di congelamento e/o di scongelamento e secondo le modalit di preparazione (vedi Capitolo 8). Il plasma fresco congelato contiene tutti i fattori pro-coagulanti, compresi quelli labili, cio FV e FVIII. Altri tipi di plasma hanno livelli inferiori di fattori labili, ma possono essere sostituti del plasma fresco congelato per la maggior parte delle indicazioni, per le quali questultimo viene trasfuso. Il plasma a contenuto ridotto di crioprecipitato contiene poco vWF ed specificamente utilizzato per il trattamento della PTT (vedi Capitolo 6). Plasma da pool, trattato con solvente/ detergente, non pi disponibile negli USA. Il crioprecipitato anti-emofilico (o CRIO) un concentrato di proteine plasmatiche ad alto peso molecolare, che precipitano a freddo e comprende vWF, FVIII, fibrinogeno, FXIII e fibronectina (vedi Capitolo 8). I plasmaderivati sono concentrati di specifiche proteine plasmatiche provenienti da grandi pool di plasma o di crioprecipitati. Il frazionamento secondo Cohn, che consiste nella precipitazione delle diverse plasmaproteine in una miscela fredda di acqua ed etanolo, stato messo a punto durante la II guerra mondiale e viene tuttora utilizzato con poche modifiche68. Dopo il frazionamento, i plasmaderivati subiscono vari procedimenti per purificare e concentrare le proteine e per inattivare i virus contaminanti. La virus-inattivazione comprende il trattamento al calore, la microfiltrazione, luso di solventi e detergenti chimici e la purificazione su colonne di affinit. I Fattori VIII, IX, VIIa e lantitrombina sono anche prodotti con la tecnica del DNA ricombinante. Questultimi prodotti sono efficaci e privi di ogni rischio infettivo.
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Tabella 21.4 - Concentrati dei fattori della coagulazione disponibili Tipo di prodotto FVIII, frazionato Nome Humate P Koate HP Koate-DVI Alphanate Indicazioni approvate Commento
Reintegro di FVIII e vWF Contiene vWF Reintegro di FVIII Contiene vWF Reintegro di FVIII Contiene vWF Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Reintegro di FVIII Trattamento (Tx) inibitori FVIII Reintegro di FIX Reintegro di FIX Reintegro di FIX Reintegro di FIX Reintegro di FIX Tx inibitori FVIII Inversione nel Tx con warfarin Reintegro di FIX Reintegro di FIX e FVII Tx inibitori FVIII Tx inibitori FVIII Tx inibitori FVIII Tx inibitori FVIII Non contiene albumina umana Contiene FII, FX, tracce di FVII Contiene FII, FX, tracce di FVII Contiene tracce di albumina umana Contiene vWF
FVIII, purificato per affinit
FVIII, purificato Hemophil-M per immunoaffinit Monarc M Monoclate-P FVIII, ricombinante Kogenate FS Helixate FS Recombinate (Bioclate) ReFacto Hyate C AlphaNine-SD
Non contiene albumina umana
FVIII, porcino FIX, purificato per affinit
FIX, purificato Mononine per immunoaffinit FIX, ricombinante Complesso di FIX BeneFIX Bebulin VH Konyne 80
Profilnine SD Proplex T Complesso di FIX, attivato FVIIa, ricombinante Autoplex-T FEIBA VH NovoSeven
Contiene FII, FX, tracce di FVII Contiene FII, FVII, FX Contiene FIIa, FVIIa, FXa Contiene FIIa, FVIIa, FXa Non contiene albumina umana
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Tabella 21.5 - Scelte consigliate nella selezione di plasma per la trasfusione Ricevente di gruppo Gruppo ABO del componente plasmatico 1a scelta AB A B O AB A B O 2a scelta (A) AB AB A 3a scelta (B) (B) (A) B 4a scelta (O) (O) (O) AB
(I gruppi fra parentesi indicano le scelte di plasma non compatibile, elencate in ordine di minore incompatibilit)
Lattivit specifica (unit di fattore/mg di proteina) dei concentrati oggi disponibili enormemente cresciuta nei prodotti preparati con le colonne di affinit, o con la tecnologia ricombinante. Inoltre, la trasmissione di HIV, HBV e HCV sembra essere assente in emofilici trattati esclusivamente con questi nuovi prodotti69. Sfortunatamente, anche il loro costo aumentato, in relazione alla complessit delle lavorazioni e alla perdita di proteine come conseguenza delle numerose manipolazioni. I concentrati dei fattori della coagulazione sono forniti liofilizzati e la loro attivit dichiarata sulletichetta69. I prodotti attualmente disponibili per il reintegro dei Fattori VIII e IX sono elencati nella Tabella 21.4. Scelta del plasma ABO compatibile Data la sua lunga conservazione, il plasma gruppo-specifico o compatibile sempre disponibile (vedi Tabella 21.5). (Da notare che i concentrati piastrinici contengono normalmente un volume di plasma equivalente a ununit di plasma fresco congelato e limiti nella disponibilit delle piastrine possono determinare linfusione di plasma incompatibile in questa situazione.) Indicazioni alluso di plasma fresco congelato Esistono linee guida per un uso appropriato del plasma fresco congelato (PFC)3,39,70. Il plasma fresco congelato lunico componente approvato nei deficit, clinicamente significativi, dei Fattori II, V, X e XI. Il plasma viene maggiormente impiegato
nei pazienti con deficit multipli dei fattori, compresi quelli derivanti da epatopatie, da coagulopatie da diluizione o da consumo, o per una rapida neutralizzazione del trattamento con warfarin. invece di limitato beneficio clinico nei pazienti con inibitori diretti contro i fattori della coagulazione. Il plasma a ridotto contenuto di crioprecipitato pu essere pi efficace del plasma fresco congelato per alcuni pazienti sottoposti a trattamento aferetico per la PTT o per la sindrome emolitico-uremica71 (vedi Capitolo 6). Deficit di vitamina K e neutralizzazione del warfarin La causa pi comune di multiple anormalit coagulative, che si riscontrano nei pazienti ospedalizzati, il deficit dei fattori vitamina Kdipendenti per terapie con farmaci antagonisti della vitamina K (tipicamente il warfarin o dicumarolo) o per deficit nutrizionali67. La vitamina K una vitamina liposolubile necessaria per la sintesi, da parte del fegato, dei Fattori II, VII, IX e X e delle proteine C ed S. I depositi organici di vitamina K durano soltanto 2 settimane, cos che il deficit pu colpire pazienti ospedalizzati incapaci di nutrirsi normalmente. Lassorbimento di vitamina K richiede una metabolizzazione da parte di batteri nellintestino e lazione dei sali biliari; il deficit pu, quindi, derivare da una terapia antibiotica, da un ittero ostruttivo o da sindromi dovute a malassorbimento dei grassi. La diminuzione della vitamina K o il trattamento con warfarin causano, di solito, un prolungamento
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del PT, sproporzionato rispetto allaPTT, perch il FVII, che ha unemivita pi breve rispetto ai fattori vitamina K-dipendenti, ha scarsa influenza sullaPTT. Il deficit di vitamina K viene meglio gestito con il trattamento della condizione di base e con la somministrazione della vitamina K67. Se la funzionalit epatica adeguata, i fattori della coagulazione ritorneranno a livelli di efficacia in circa 12 ore. Quantunque la maggioranza dei pazienti con deficit di vitamina K non richieda un trattamento con plasma, la trasfusione di plasma viene occasionalmente richiesta per trattare emorragie in atto o per preparare procedure invasive in casi di emergenza67. Una trasfusione da 10 a 15 mL di plasma per kg di peso corporeo (PC) otterr, generalmente, livelli emostatici dei fattori della coagulazione nei pazienti con coagulopatia indotta dal trattamento con warfarin. Una forma di concentrato del complesso di FIX stato autorizzato per la neutralizzazione del warfarin (Tabella 21.4), ma comporta un rischio significativo di complicazioni trombotiche e viene raramente utilizzata per tale indicazione. Potrebbe anche essere utilizzata una concomitante somministrazione di vitamina K, a meno che non si desideri ottenere una correzione soltanto temporanea. Sebbene lINR (International Normalized Ratio) possa fornire utili informazioni sulla risposta alla terapia, la necessit di trattamenti aggiuntivi dovrebbe essere guidata dalle condizioni cliniche e non dai risultati dei test di laboratorio. Come discusso in precedenza, per ottenere unadeguata emostasi raramente necessario riportare PT e aPTT a valori normali. Epatopatie Gli epatopatici presentano alterazioni multiple che contribuiscono ad unaumentata tendenza al sanguinamento. Tali alterazioni comprendono: ipertensione portale e congestione degli shunt venosi sistemici collaterali; splenomegalia con trombocitopenia secondaria; diminuita sintesi di tutti i fattori della coagulazione, ad eccezione del FVIII; disfibrinogenemia; diminuita eliminazione della fibrina, dei prodotti di degradazione del fibrinogeno
e degli attivatori della fibrinolisi; diminuita sintesi degli inibitori del sistema fibrinolitico. Come nel caso di deficit di vitamina K, la breve emivita del FVII determina che il PT sia maggiormente allungato rispetto allaPTT, e, per tale motivo, linfusione di plasma fresco congelato corregge il PT per sole 4 ore (circa)72. Considerato che, nelle malattie epatocellulari, i difetti riguardano soprattutto la sintesi di proteine, unaddizionale somministrazione di vitamina K non corregge di solito le anormalit. Tuttavia, considerato che il deficit di vitamina K una delle poche cause di coagulopatie trattabili nelle malattie del fegato, un tentativo di somministrare vitamina K pu essere indicato. Il plasma fresco congelato corregge i deficit dei fattori della coagulazione che si riscontrano nelle gravi malattie epatiche, ma spesso utilizzato in maniera impropria. Lerrore pi comune attribuire tutte le emorragie alla coagulopatia e istituire un trattamento sistemico, quando la causa del sanguinamento localizzata. Per esempio, unemorragia nella zona dellintervento dopo cardiochirurgia risponde solitamente meglio a trattamenti emostatici locali piuttosto che a una trasfusione di plasma fresco congelato. Un altro comune errore nel trattare le coagulopatie associate a disfunzioni epatiche, liperdipendenza dal PT. Un valore di PT normale , raramente (se non mai), richiesto per far cessare un sanguinamento grave e lo scopo della terapia con plasma fresco congelato nelle epatopatie gravi dovrebbe essere quello di correggere o prevenire le complicazioni emorragiche. Se il plasma fresco congelato deve essere impiegato prima di una procedura invasiva a scopo profilattico, esso dovrebbe essere infuso immediatamente prima di iniziare la procedura. Gli epatopatici possono anche presentare anormalit nella formazione del tappo piastrinico o nei processi di fibrinolisi. Una grave splenomegalia, inoltre, pu peggiorare la risposta alle trasfusioni di piastrine. La funzionalit piastrinica, in alcuni pazienti epatopatici, pu essere migliorata dalla somministrazione di desmopressina o (1-deamino-8-D-arginina vasopressina, DDAVP)73. Il CRIO anti-emofilico
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dovrebbe essere somministrato quando vi siano una grave ipofibrinogenemia o emorragie causate di disfibrinogenemia. Unaumentata fibrinolisi, associata ad epatopatie gravi, pu non rispondere al solo trattamento con plasma fresco congelato e, in questi pazienti, pu essere utile luso di agenti antifibrinolitici insieme alla terapia con plasma (vedi oltre). Coagulopatia da diluizione Una perdita massiva di sangue e la sua sostituzione con soluzioni cristalloidi e/o colloidi pu causare una coagulopatia da diluizione74, ma la maggior parte dei pazienti pu sopportare perdite e sostituzioni di almeno un volume ematico, senza sviluppare alterazioni nellemostasi75. Anche lo shock che accompagna le emorragie da trauma pu contribuire alla coagulopatia (vedi Capitolo 27). Nel caso di traumi, la trombocitopenia si sviluppa generalmente prima che i fattori plasmatici della coagulazione siano diluiti a livelli tali da alterare lemostasi e, di norma, un reintegro adeguato del numero delle piastrine ha la priorit75. Nei pazienti sottoposti a chirurgia di elezione, tuttavia, i deficit dei fattori della coagulazione possono essere predominanti74. Il plasma fresco congelato pu portare dei benefici se il PT e/o laPTT sono pi alti di 1,5 volte i valori normali3,39. Se non si conseguita unemostasi chirurgica e si sospetti che continui un sanguinamento consistente, pu essere indicata linfusione di plasma fresco congelato39. I pazienti sottoposti a plasmaferesi, senza sostituzione con plasma, possono sviluppare tutta una serie di deficit dei fattori coagulativi, in particolare una ipofibrinogenemia, in relazione al volume e alla frequenza degli scambi76. Quantunque questi scambi possano essere importanti, la maggior parte degli Autori ha concluso che, nei pazienti con funzione epatica normale, la sostituzione con plasma fresco congelato non sia necessaria, particolarmente se le plasmaferesi sono effettuate a giorni alterni. Altre situazioni Lo scambio plasmatico un salva-vita per i
pazienti affetti da PTT (vedi Capitolo 6). Il plasma fresco congelato pu essere un trattamento aggiuntivo nella CID. Ledema angioneurotico ereditario causato da un deficit congenito dellinibitore della C1-esterasi, proteina che regola lattivazione del complemento. I pazienti affetti sviluppano un edema localizzato e possono andare incontro, in seguito allattivazione del complemento, a unostruzione delle vie aeree superiori, che mette in pericolo la vita. Il plasma fresco congelato e il plasma allo stato liquido contengono normali livelli dellinibitore della C1-esterasi e, in uno studio77, la trasfusione di plasma fresco congelato stata ritenuta in grado di prevenire ledema in corso di chirurgia orale. Ci sono anche rari, aneddotici riscontri di esacerbazione delledema angioneurotico in seguito a infusione di plasma fresco congelato. Non frequente la necessit di trattare isolati deficit dei Fattori II, V, VII, X e XI. Nella Tabella 21.3 sono riferite le linee guida per un trattamento iniziale; tuttavia, per trattamenti pi completi, fare riferimento ai testi standard di ematologia e di coagulazione. Il plasma pu anche essere impiegato per reintegrare le proteine C, S e lantitrombina; questi argomenti sono stati trattati separatamente di seguito. Uso non corretto del plasma fresco congelato Il plasma non dovrebbe essere usato per espandere la volemia, n come fonte nutrizionale, o come adiuvante per favorire la guarigione di ferite38,70,75. Trasfondere plasma per espandere il volume ematico comporta un rischio di trasmissione di malattie infettive o di altre reazioni trasfusionali (per esempio, reazioni allergiche), rischi che possono essere evitati usando soluzioni cristalloidi o colloidi. Il plasma non inoltre una fonte adatta di immunoglobuline (Ig) per pazienti affetti da severa ipogammaglobulinemia, dato che esistono preparazioni specifiche, pi efficaci (immunoglobuline per uso endovenoso o intramuscolare). Il plasma fresco congelato viene impiegato spesso, prima di procedure invasive, a scopo profilattico in soggetti con lievi o modesti
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allungamenti del PT e dellaPTT, ma ci sono poche evidenze (se non nessuna) che ci serva a prevenire le complicazioni emorragiche. Considerato che questi test, quando sono modestamente allungati, non predicono, con accuratezza, i rischi di un sanguinamento, vi poca logica nelleseguire una trasfusione intesa a migliorare i risultati dei test.
Trasfusione di crioprecipitato di fattore anti-emofilico

Il crioprecipitato di fattore anti-emofilico (CRIO) il solo preparato, attualmente disponibile, di concentrato di fibrinogeno per uso sistemico e trova il suo principale impiego clinico nella CID. Il secondo maggior uso del CRIO stato nei pazienti con severa malattia di von Willebrand, ma esistono concentrati di FVIII che contengono il vWF che sono molto pi appropriati, ovviamente se disponibili (Tabella 21.4). Il CRIO pu anche essere utilizzato nel deficit isolato di FXIII e per migliorare la disfunzione piastrinica in corso di uremia. Pu anche essere impiegato per uso topico, come colla di fibrina, anche se disponibile una preparazione commerciale. Il CRIO utilizzato raramente nei casi di emofilia, in quanto sono a disposizione concentrati commerciali di FVIII, che sono stati sottoposti a inattivazione, allo scopo di ridurre o eliminare i rischi di trasmissione di malattie infettive; il CRIO usato come ultima risorsa per tale indicazione. Considerato che il CRIO contiene anticorpi ABO, bisogno considerare la compatibilit ABO, quando i volumi infusi potrebbero essere considerevoli, in rapporto alla massa eritrocitaria del ricevente. Calcolo della dose di CRIO nel reintegro di fibrinogeno Ununit di CRIO contiene, in media, circa 250 mg di fibrinogeno; il minimo richiesto dagli Standard AABB di 150 mg59(p30). La quantit di CRIO da trasfondere, per correggere il livello di fibrinogeno, dipende dalle caratteristiche dellepisodio emorragico e dalla gravit del deficit iniziale e pu essere calcolata come segue:
1) peso del soggetto (kg) x 70 mL = volemia (mL); 2) volemia (mL) x (1,0 Hct) = volume plasmatico (mL); 3) mg di fibrinogeno richiesti = (livello di fibrinogeno richiesto in mg/dL livello iniziale di fibrinogeno in mg/mL) x volume plasmatico 100 mL/dL; 4) sacche di CRIO richieste = mg di fibrinogeno richiesti 250 mg di fibrinogeno/sacca di CRIO. Questo calcolo presume che il 100% del fibrinogeno infuso sia recuperato come fibrinogeno vascolare misurabile, ma, dato che il contenuto di CRIO variabile, ulteriori raffinamenti nei calcoli sono improduttivi. Sindromi di von Willebrand Le sindromi di von Willebrand rappresentano le pi comuni rilevanti coagulopatie fra quelle ereditarie78. Queste condizioni sono di solito autosomiche dominanti e rappresentano una serie di anormalit, qualitative e quantitative, del vWF, la proteina di maggior importanza nel mediare ladesione delle piastrine alle superfici endoteliali danneggiate. La proteina trasporta anche il FVIII. Ne consegue che i pazienti con sindromi di von Willebrand hanno vari gradi di anomalie nella formazione del tappo piastrinico emostatico e un deficit parziale di FVIII. La prima anormalit si manifesta con un allungamento del tempo di emorragia, mentre la secondo con un allungamento dellaPTT, ma queste anomalie variano fra le diverse sindromi. Il vWF esiste, nel plasma, come una famiglia di molecole multimeriche, con ampia gamma di pesi molecolari. Le molecole di vWF a pi alto peso molecolare sono quelle emostaticamente pi efficaci. Le valutazioni di laboratorio dimostrano uno specifico deficit nel livello di vWF, che viene misurato spesso come attivit del cofattore della ristocetina, dato che il vWF richiesto, in vitro, per leffetto agglutinante della ristocetina sulle piastrine. Le forme moderate della sindrome di von Willebrand vengono spesso trattate con desmopressina (DDAVP), che provoca un rilascio dei depositi endogeni di FVIII e di vWF. Molti concentrati di FVIII non contengono livelli terapeutici di vWF; ma sono anche disponibili in
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commercio concentrati con livelli soddisfacenti e uno (Tabella 21.4) stato autorizzato proprio a questo scopo. In mancanza di concentrati virus-inattivati terapeuticamente efficaci, le sindromi di von Willebrand gravi possono essere trattate con il CRIO. Le quantit di CRIO, richieste per trattare episodi emorragici o in preparazione ad interventi di chirurgia maggiore, variano ampiamente nei pazienti con sindromi di von Willebrand. Oltre alla risposta clinica del paziente, il tempo di emorragia modificato secondo Ivy (in gergo template , consistente nel praticare 3 piccole incisioni sulla faccia volare dellavambraccio, dopo aver applicato al braccio, con sfigmomanometro, una pressione di 40 mmHg: valori di riferimento 5-7 minuti), nonch il livello di FVIII e lattivit cofattoriale della ristocetina, possono essere di aiuto nel guidare la terapia. Anormalit del fibrinogeno Lipofibrinogenemia pu presentarsi come un raro, isolato deficit congenito; pu essere acquisita nel corso di una CID o pu essere dovuta a complicazioni ostetriche, come l abruptio placentae. Le disfibrinogenemie possono essere congenite o acquisite, e rappresentano situazioni nelle quali il fibrinogeno presente, se misurato con test immunologici, ma funzionalmente difettoso, se misurato con il tempo di trombina. Gli epatopatici gravi presentano spesso disfibrinogenemia. Coagulazione intravascolare disseminata La coagulazione intravascolare disseminata (CID) interviene quando la trombina circolante induce, nel microcircolo, una diffusa formazione di fibrina, con consumo di piastrine e dei fattori della coagulazione, in particolare di fibrinogeno, protrombina, FV e FVIII. I filamenti di fibrina nel microcircolo possono causare danni meccanici ai globuli rossi, condizione denominata emolisi microangiopatica, con formazione di schistociti (eritrociti frammentati) in circolo. I trombi microvascolari disseminati causano ischemia nei tessuti, con liberazione di fattori tessutali che, ulteriormente, attivano la trombina. La lisi della
fibrina microvascolare determina unaumentata immissione in circolo dei prodotti di degradazione della fibrina. Parecchie sono le situazioni cliniche che possono indurre CID: shock, ischemia tessutale, reazioni trasfusionali emolitiche, neoplasie disseminate (in particolare, adenocarcinomi), leucemia promielocitica acuta, sindrome da lisi neoplastica e complicazioni ostetriche, quali lembolia del liquido amniotico. Levento scatenante pi comune un segnale procoagulante per la produzione di trombina, che supera le normali difese fisiologiche contro una diffusa attivit della trombina stessa. Il trattamento della CID si fonda sulla correzione del problema di base e sulla prevenzione di ulteriori condizioni di ipotensione e di ischemia tessutale. La terapia di reintegro si focalizza sui componenti del trombo (cio su piastrine e fibrinogeno) e, secondariamente, sugli altri fattori della coagulazione (FVIII, FXIII, FV, FII). Nei pazienti che sanguinano, quindi, la trasfusione di piastrine indicata quando la conta cade sotto le 50.000 plt/L e il CRIO viene somministrato se il fibrinogeno scende al di sotto di 100 mg/dL. Il plasma fresco congelato indicato, nelle emorragie in corso di CID, una volta che il fibrinogeno sia sopra i 100 mg/dL. Uso topico di fibrina Il fibrinogeno presente nel CRIO stato impiegato, nel corso dinterventi chirurgici, come emostatico locale (cosiddetto sigillante di fibrina o colla di fibrina), partendo da una o due unit di CRIO, che possono anche essere di origine autologa. Il fibrinogeno si converte, per mezzo di trombina bovina, in fibrina nel sito che sanguina o in quello che deve essere sigillato. Sono disponibili, in commercio, preparati di colla di fibrina, con una maggiore concentrazione di fibrinogeno rispetto al CRIO; essi comprendono trombina umana e aprotinina (vedi oltre) bovina per diminuire la lisi della fibrina formatasi. Questi prodotti, derivati da pool e virus-inattivati, sono stati autorizzati per ridurre i sanguinamenti in cardiochirurgia79, per riparare i traumi splenici e per richiudere le colostomie. La colla di fibrina stata anche impiegata per altre diverse
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indicazioni, nella quali si desidera collegare due superfici tessutali, per esempio dura madre e membrana del timpano. Luso di trombina bovina pu stimolare la formazione di anticorpi diretti contro di essa o contro altre proteine contaminanti, ivi compreso il FV80. Questi anticorpi possono cross-reagire con la trombina e il FV umani, determinando tempi di coagulazione anomali e, in alcuni casi, sanguinamenti. Per tali motivi, si suggerisce di utilizzare colle di fibrina home made al posto di quelle commerciali80. Emofilia A Ogni unit di CRIO, preparata da una singola donazione di sangue, dovrebbe contenere un minimo di 80 unit internazionali (UI) di Fattore VIII59(p30). Bench non sia pi il componente di
scelta, il CRIO pu essere utilizzato come terapia sostitutiva nei pazienti affetti da emofilia A, qualora non siano disponibili i concentrati virus-inattivati di FVIII39. Se si usa il CRIO, la quantit richiesta per fornire una dose terapeutica di FVIII si basa sul calcolo che si utilizza per lAHF (vedi oltre). Lemofilia A una malattia recessiva legata al sesso (colpisce i maschi, tramite le femmine portatrici), che causa un deficit di Fattore VIII (o fattore AHF, anti-haemophilic factor)81. I geni responsabili producono, di solito, una proteina ad attivit ridotta, cos che una misurazione immunologica del FVIII Ag d risultati normali, nonostante unattivit coagulante deficitaria dello stesso FVIII. Al contrario, lantigene tipicamente depresso nella malattia di von Willebrand. I risultati di laboratorio evidenziano un aPTT allungato, PT e
Tabella 21.6 - Linee guida generali per il reintegro dei fattori nel trattamento dellemofilia Indicazione Livello minimo iniziale desiderato dei fattori (%) 20-30 30-50 Dose* di FVIII (UI/kg) 10-15 15-25 Dose* di FIX (UI*/kg) 20-30 30-50 Durata terapia (giorni) 1-2 1-3
Epistassi grave, emorragie dalla mucosa orale+ Emartrosi, ematomi, ematuria persistente++, emorragie gastro-intestinali, emorragie retro-peritoneali Traumi senza emorragie, emorragie dalla lingua e/o dal retrofaringe+ Traumi con emorragie, interventi chirurgici, emorragie intracraniche
40-50
20-25
40-50
2-4
100
50
100
10-14
Dati dalla Farmacopea USA69. * Gli intervalli fra i dosaggi sono basati sullemivita del FVIII di 8-12 ore (da 2 a 3 dosi giornaliere) e sullemivita del FIX di 18-24 ore (da 1 a 2 dosi giornaliere). Le dosi di mantenimento (met delle dosi iniziali) possono essere somministrate a questi stessi intervalli. La frequenza, comunque, dipende dalla gravit delle emorragie. + In aggiunta agli antifibrinolitici. ++ Unematuria spontanea, non accompagnata da dolore, non richiede di solito trattamenti. Le somministrazioni di liquidi, per via orale o endovenosa, sono necessarie per mantenere il flusso renale. Deve essere assicurata una somministrazione continua dei fattori. Dopo la dose iniziale di carico, si deve assicurare uninfusione continua, alla dose di 3 UI/kg per ora. Le susseguenti dosi saranno aggiustate secondo i livelli plasmatici dei fattori.
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tempi di emorragia template normali e una diminuita attivit del FVIII. La gravit dellemofilia A dipende dal livello dellattivit di FVIII nel paziente e tale livello varia ampiamente. I pazienti affetti da forma grave hanno un livello di attivit inferiore all1%, mentre in quelli con forme moderate il livello di attivit oscilla, caratteristicamente, fra l1 e il 5%; nelle forme lievi i livelli variano dal 6 al 30%81. Una unit di attivit di FVIII viene definita come il contenuto di Fattore VIII presente in 1 mL di plasma normale, citratato, fresco da pool. Il livello di FVIII pu essere espresso come concentrazione, come percentuale di attivit o come frazione decimale. Per esempio, un paziente affetto da una forma lieve di emofilia A, con un decimo della normale attivit di FVIII, si pu considerare che abbia un livello di attivit di 10 unit/dL o 0,1 unit/mL o, ancora, il 10% di attivit. I pazienti affetti da forme fra lievi e moderate possono spesso essere gestiti senza dover ricorrere alla terapia di reintegro81. Una vigile attenzione allemostasi locale e limpiego di antifibrinolitici topici possono prevenire la necessit di ulteriori reintegri. I livelli sistemici di FVIII possono essere aumentati con limpiego della desmopressina (DDAVP), che stimola il rilascio, dai depositi, del FVIII endogeno. La desmopressina, tuttavia, inefficace nei pazienti affetti da forme gravi di emofilia A; in tali casi si impone il reintegro del FVIII. La quantit di FVIII da infondere dipende dal fatto se la terapia praticata per prevenire emorragie o, in caso di sanguinamento in atto, dalla natura dellepisodio emorragico e dalla gravit del deficit iniziale (Tabella 21.6). Per esempio, il trattamento di unemartrosi richiede di regola maggiori quantit di FVIII di unepistassi. Calcolo delle dosi di FVIII Quando si stabilito il livello desiderato (Tabella 21.6), la dose di FVIII richiesta per una trasfusione pu essere calcolata con una delle seguenti formule: Dose di FVIII (UI/kg) = Aumento % desiderato x 0,5 (1 UI/kg aumenta il livello di FVIII del 2%)
Dose totale = (Massa del paziente x 70 mL/kg x (1-Hct) x (attivit desiderata - attivit attuale) Esempio: un paziente di 70 kg con emofilia grave ha un livello iniziale di FVIII del 2% (0,02 unit/mL). Quante unit di concentrato di FVIII dovrebbero essere somministrate per elevare il livello del suo FVIII al 50% (0,5 unit/mL)? Ecco la risposta: (70 x 70) x (1 0,4) x (0,5 0,02) = 1.411 unit La terapia di scelta per le forme gravi di emofilia A rappresentata dai concentrati di FVIII neutralizzazione (Tabella 21.4). Il CRIO potrebbe essere utilizzato per fornire 1.411 unit di FVIII, ma, a 80 UI per sacca, ne sarebbero necessarie almeno 18 (con conseguente esposizione a 18 donatori allogenici). Lemivita del FVIII di circa 12 ore, cos che le infusioni debbono essere ripetute ogni 8-12 ore per mantenere livelli emostatici. La durata del trattamento con infusioni di FVIII dipende anche dal tipo e dalla sede delle emorragie, dai motivi della profilassi e dalla risposta clinica del paziente (Tabella 21.6). Dopo interventi di chirurgia maggiore, il livello di FVIII deve essere mantenuto fra il 40 e il 50% per almeno 10 giorni. Quando si programmano interventi di chirurgia elettiva, dovrebbero essere a disposizione i test per controllare il FVIII e guidare la terapia. Trattamento degli inibitori del Fattore VIII Dal 10 al 35% dei pazienti con emofilia A, tipicamente quelli affetti dalle forme pi gravi o con difetti genetici che coinvolgono ampie porzioni della molecola, sviluppano degli inibitori del FVIII umano68,81. Questi anticorpi sono diretti verso il sito attivo del FVIII, rendendo il paziente relativamente non rispondente alla terapia. I pazienti che debbono essere sottoposti a procedure invasive, dovrebbero essere indagati riguardo alla presenza di tali inibitori. La loro gestione difficile; gli approcci hanno incluso tentativi di annullare gli inibitori con dosi massicce di FVIII; luso di FVIII porcino (che ha una bassa cross-reattivit con gli
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anticorpi anti-FVIII umano); limpiego di sostanze che aggirano il FVIII, compreso il complesso di Fattore IX, il complesso di FIX attivato e il Fattore VII attivato (Tabella 21.4); limpiego di terapie desensibilizzanti. Queste ultime contemplano luso di larghe dosi di fattore anti-emofilico, somministrate insieme a corticosteroidi o a immunoglobuline endovena e a ciclofosfamide. Sono stati segnalati successi nel 50-80% dei casi. Se unemorragia mette in pericolo la vita, possono essere utilizzati scambi plasmatici intensivi per rimuovere gli inibitori contestualmente alla immunosoppressione, alle infusioni di FVIII e a una possibile terapia antifibrinolitica (vedi oltre). Emofilia B Il deficit di Fattore IX (emofilia B o malattia di Christmas) clinicamente indistinguibile dal
deficit di FVIII, in quanto sono entrambi a trasmissione legata al sesso e caratterizzati da un prolungamento di aPTT, in presenza di un PT e di un tempo di emorragia normali81. La malattia viene confermata dalla misurazione dellattivit del FIX. Negli ultimi due decenni, sono stati impiegati, per il trattamento dellemofilia B, concentrati di complesso di FIX, ma le nuove forme pi pure di concentrati di FIX (Tabella 21.4) sono da preferire, perch presentano un minore rischio di indurre fenomeni trombotici82. La formula per calcolare il dosaggio di FIX simile a quella del FVIII, ma la quantit risultante dovrebbe essere raddoppiata, in quanto solamente la met del FIX infuso si ritrova nello spazio vascolare. Lemivita biologica del fattore di 18-24 ore, per cui le dosi debbono essere infuse 1-2 volte
Tabella 21.7 - Potenziali indicazioni e impiego clinico di immunoglobuline endovena Immunodeficienze congenite Ipogammaglobulinemia e agammaglobulinemia Deficit anticorpale selettivo Deficit di sottoclassi IgG, con infezioni ricorrenti Neonati prematuri Deficit anticorpali acquisiti Neoplasie con deficit anticorpali e infezioni ricorrenti: mieloma multiplo, leucemia linfatica cronica Enteropatia proteino-disperdente Immunodeficienza umorale indotta da farmaci o da radiazioni Profilassi o trattamento di infezioni batteriche e virali Infezioni pediatriche da HIV, per la prevenzione di infezioni batteriche e virali secondarie Infezione da citomegalovirus in trapiantati Sepsi neonatali Altre condizioni Porpora trombocitopenica immune correlata a infezioni da HIV Citopenie immuni (porpora trombocitopenica immune, trombocitopenia neonatale alloimmune, porpora trombocitopenica idiopatica, malattia emolitica autoimmune da autoanticorpi caldi) Sindrome di Kawasaki Sindrome di Guillaime-Barr e neuropatia demielinizzante cronica Presenza di inibitori acquisiti del FVIII Miastenia grave Sclerosi multipla
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al d. Come nel caso dellemofilia A, le dosi raccomandate e il programma di trattamento variano secondo la gravit e il tipo di emorragia (Tabella 21.6). Immunoglobuline endovena Le immunoglobuline endovena (IGEV) si preparano dalla frazione II di Cohn e sono sottoposte ad inattivazione virale. Le preparazioni per uso intramuscolare contengono aggregati che possono attivare, se somministrate per via endovenosa, il complemento e il sistema delle chinine, e determinare, quindi, ipotensione e/o reazioni di tipo anafilattico; i prodotti specifici per uso endovenoso contengono, quasi esclusivamente, molecole IgG monomeriche83. Le indicazioni per limpiego di IGEV sono in via di evoluzione83,84. Alcune condizioni sono riportate in Tabella 21.7. Linfusione di IGEV pu anche indurre effetti sfavorevoli, quali mal di testa, vomito, sovraccarico circolatorio, reazioni allergiche, scompenso renale e reazioni polmonari, ma, di solito, tali effetti possono essere prevenuti, infondendo lentamente e pretrattando il ricevente con difenidramina e idrocortisone. Il trasferimento passivo di allo- o autoanticorpi gruppoematici e/o lipergammaglobulinemie indotta dalla terapia possono causare una positivit del test allantiglobulina diretto nei riceventi, ma soltanto raramente si rileva emolisi significativa. Concentrati di antiproteasi Lantitrombina (AT), nota anche come cofattore eparinico, un inibitore della serin-proteasi ed sintetizzata dal fegato85. Circola nel plasma normale alla concentrazione di 15 mg/dL, ma viene usualmente misurata in percentuale di attivit, con limiti che vanno dall84 al 116%. Lantitrombina inattiva le serin-proteasi, ivi compresi i Fattori IXa, Xa, XIa e XIIa, legandosi covalentemente al sito serinico, con successiva modifica della conformazione86. Questa attivit viene fortemente accelerata dalleparina, che induce modifiche conformazionali nellantitrombina e agevola, contemporaneamente, lavvicinamento della trombina allantitrombina. I pazienti con
deficit di antitrombina sono soggetti a complicazioni tromboemboliche87. Questo deficit pu essere sia congenito sia acquisito. Il deficit acquisito interviene in numerosi stati morbosi, quali: diminuita sintesi per epatopatie o per malnutrizione; perdite per malattie renali o gastrointestinali; accelerati consumi come nella CID; negli interventi operatori o nei traumi; nella pre-eclampsia; in associazione con terapie quali eparina, L-asparaginasi e contraccettivi orali. Lantitrombina stabile nel plasma, cos che il deficit pu essere trattato con plasma fresco congelato, con plasma liquido o con plasma scongelato. anche disponibile un concentrato trattato al calore, mentre le preparazioni ricombinanti e transgeniche sono ancora in studio. Gli usi clinici dellantitrombina sono stati, recentemente, revisionati87. Ne stato approvato limpiego nel deficit ereditario, quale parte del trattamento di episodi trombotici o per profilassi in situazioni perioperatorie, post-operatorie e durante il parto. Esistono diversi impieghi di antitrombina al di fuori delle indicazioni autorizzate (cosiddetti offlabel), per esempio in pazienti con bassi livelli di antitrombina e CID, in neonati partoriti da madri con deficit di antitrombina e in trapiantati di fegato. Lemivita dellantitrombina purificata lunga, andando, approssimativamente, da 60 a 90 ore88, ma si abbrevia quando il suo reintegro dovuto a consumi eccessivi. La dose viene calcolata sulla base di un incremento atteso di 1,4% U/kg, allo scopo di raggiungere il 120%. Un altro concentrato di anti-proteasi disponibile linibitore dellalfa-1-proteinasi ( -1-antitripsina), mentre negli USA non disponibile linibitore della C1-esterasi. Proteina C e proteina S La proteina C e la proteina S sono proteine dipendenti dalla vitamina K, con effetti anticoagulanti86. La proteina S un cofattore per la proteina C attivata, la quale, a sua volta, inattiva i Fattori Va e VIIIa. I pazienti con deficit di proteina C o di proteina S sono predisposti a complicazioni trombotiche e debbono essere trattati, spesso, con anticoagulanti85. Il trattamento con warfarin,
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tuttavia, pu determinare una diminuzione a livelli pericolosi di queste proteine vitamina Kdipendenti, che possono causare necrosi cutanee e lesacerbarsi di trombosi. La trasfusione di plasma fresco congelato pu servire come sorgente immediata e supplementare di proteina C o proteina S in pazienti con deficit gravi. allo studio un concentrato umano di proteina C. I pazienti eterozigoti per un deficit di proteina C, hanno un livello plasmatico che va dal 40 al 60% del patrimonio normale, raramente presentano sintomatologia clinica apprezzabile e, altrettanto raramente, necessitano di un trattamento per lapporto della proteina85. Se, per episodi trombotici, il trattamento si rende necessario, sufficiente luso di anticoagulanti. Il deficit omozigote di proteina C causa una porpora neonatale fulminante che richiede limmediata somministrazione di proteina C, con una regolazione complessa della rimanente cascata coagulativa. Lemivita della proteina C infusa va da 6 a 16 ore. Soluzioni colloidi Lalbumina umana, al 5% e al 25%, e i preparati di plasmaproteine determinano espansione della volemia e un reintegro delle soluzioni colloidi, senza rischi di trasmissione di virus89. I preparati di plasmaproteine hanno una concentrazione proteica maggiore dellalbumina al 5%. Prodotti farmacologici, quali lamido idrossietile e il destrano vengono comunemente usati per espandere la volemia. Fisiologia dellalbumina La massa totale di albumina nel corpo umano di circa 300 g, di cui il 40% (120 g) si trova nel plasma. La sintesi giornaliera di albumina, in un soggetto normale adulto, di circa 16 g. Lalbumina riveste un ruolo complesso sia in fisiologia che in patologia, in aggiunta allazione di mantenimento del volume intravascolare90. Lipoalbuminemia, causata da una diminuita sintesi, da un catabolismo aumentato o da perdite e dello spostamento di fluidi fra i due diversi compartimenti, comune nel corso di malattie acute e croniche.
Reintegro Le soluzioni di albumina sono efficaci espansori della volemia, con una migliore ritenzione di fluidi allinterno del sistema vascolare di quanto non facciano le meno costose soluzioni cristalloidi, quali la soluzione fisiologica normale o la soluzione di Ringer lattato. Dato che lipoalbuminemia coinvolta nella patogenesi di molte malattie e pu influenzare la loro prognosi, sono stati fatti tentativi per cercare di modificarne il decorso con lapporto esogeno di albumina, tenendo particolarmente in conto il suo basso rischio. Questo basso rischio , comunque, in discussione. Le indicazioni per luso di albumina, approvate da un pannello di consenso91, sono quelle elencate qui di seguito: 1. reintegro della volemia in caso di shock non emorragico, non responsivo ai cristalloidi o in presenza di sindrome da iperpermeabilit capillare; 2. reintegro della volemia, dopo il primo giorno, in pazienti con ustioni estese (>50%) e che non rispondono ai cristalloidi; 3. reintegro dopo la rimozione di grandi volumi (>4 L) di ascite in pazienti che non rispondono ai cristalloidi: 4. reintegro del liquido ascitico o trattamento post-operatorio di asciti e di edemi in trapiantati di fegato ipoalbuminemici; 5. come liquido di reintegro in scambi plasmatici di notevole volume; 6. reintegro di volume in pazienti affetti da pancreatite necrotizzante grave; 7. diarrea (>2 L/d) in pazienti ipoalbuminemici (<2,0 g/dL) sotto nutrizione parenterale, che non rispondono al supporto con peptidi a catena corta. In molte delle situazioni sopraelencate, le soluzioni di colloidi non-albuminici sono considerate come prima alternativa, assai meno costosa. A dispetto delle attrattive teoriche, della lunga storia del reintegro di albumina e del consenso al suo uso, diversi studi clinici randomizzati e prospettici hanno sostenuto che il suo impiego non efficace o aumenta la mortalit. Una meta-analisi di 30 studi clinici randomizzati, che includeva
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1.419 pazienti, raggruppati secondo le indicazioni (cio ipovolemie, ustioni, ipoproteinemie) ha dimostrato una maggiore mortalit con limpiego di albumina in ogni gruppo92. In risposta a questi risultati, gli Autori della metaanalisi hanno chiesto una revisione immediata delluso dellalbumina nei pazienti critici.
La trasfusione in particolari situazioni

Talassemia La talassemia e la drepanocitosi sono malattie ereditarie, caratterizzate da deficit o anormalit della struttura emoglobinica ed anemia. La talassemia causata da un deficit nella produzione di catene alfa e beta, che si presenta in forma moderata o grave. Lassenza totale di sintesi di una delle catene alfa letale in utero; lassenza di sintesi di catene beta (o talassemia major ) determina unanemia progressiva nel periodo neonatale. Nel tentativo di compensare la grave anemia che si instaura, il tessuto ematopoietico si espande, determinando caratteristiche anormalit ossee, epato- e splenomegalia. Il ferro si deposita nei tessuti, come risultato finale di un assorbimento aumentato e della terapia trasfusionale (vedi Capitolo 27). La sola cura della talassemia , attualmente, il trapianto di CSE, ma, considerato che lanemia pu essere tenuta sotto controllo dalla terapia trasfusionale e laccumulo marziale dalla terapia chelante, limpiego del trapianto, costoso e non scevro di rischi, controverso. Nel Capitolo 24 viene discusso il trattamento trasfusionale dei talassemici. Drepanocitosi La drepanocitosi dovuta alla sostituzione di una singola base nel gene che codifica per la catena beta dellemoglobina. Lemoglobina dei soggetti omozigoti per questa alterazione genica pu subire una polimerizzazione irreversibile e causare una deformazione dei globuli rossi a falce. Le emazie, cos morfologicamente alterate, possono iniziare a bloccare il microcircolo,
direttamente o in associazione a danni endoteliali e a trombosi. Gli eritrociti hanno anche una ridotta durata di vita, per cui i drepanocitici soffrono di unanemia emolitica, variamente compensata. La falcemizzazione, che pu essere innescata da febbre, infezioni o ipossia, causa una serie di complicazioni e d luogo a tipiche crisi, cio crisi di dolore, dovute a ischemie muscolo-scheletriche o di altri tessuti, sequestri splenici o polmonari (sindrome toracica), crisi aplastiche per la momentanea soppressione midollare indotta da virus (soprattutto da parvovirus), ulcere agli arti inferiori, priapismo, infarti tessutali e stroke. I pazienti con anemia falciforme sono, in maggioranza e per la maggior parte del tempo, asintomatici e non richiedono trattamento trasfusionale. Bench la falcemizzazione possa essere prevenuta o annullata, mantenendo il livello di emoglobina normale fra il 50 e il 70%, i rischi di alloimmunizzazioni, il sovraccarico marziale e la possibile trasmissione di malattie infettive superano i benefici della trasfusione profilattica nella maggior parte dei pazienti. Le crisi di dolore senza complicazioni, inoltre, non rispondono bene a una semplice trasfusione. La trasfusione semplice indicata nellanemia sintomatica, nelle crisi aplastiche e in caso di perdite ematiche. A volte, i pazienti con una storia di stroke o di sindromi polmonari o cardiache sono, talora, trattati con protocolli ipertrasfusionali o con ripetuti scambi eritrocitari, per mantenere il loro ematocrito fra il 25 e il 30% e la percentuale di HbS al di sotto (circa) del 30%. Bisogna fare attenzione a non far salire lematocrito al di sopra del 35%, per il pericolo di iperviscosit. Gli scambi eritrocitari sono usati per gestire e/o prevenire complicazioni, che possono mettere in pericolo la vita o la funzionalit di organi, particolarmente lo stroke e le sindromi polmonari. Leritro-exchange stato anche utilizzato per la preparazione di pazienti ad interventi chirurgici, ma studi controllati e randomizzati non hanno sostenuto tale misura rispetto ad una semplice trasfusione che porti lemoglobina ad un valore di 10 g/dL93. La gestione clinica delle drepanocitosi complessa e al lettore consigliato, per maggiori dettagli, di consultare alcune recenti rassegne94,95.
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I pazienti affetti da talassemia o da anemia falciforme possono ricevere concentrati eritrocitari standard. La leucodeplezione, tuttavia, evita linsorgenza di reazioni trasfusionali febbrili, non emolitiche. La fenotipizzazione estesa delle emazie del paziente e la disponibilit per la trasfusione di unit compatibili a tali antigeni riduce linsorgenza di alloimmunizzazioni o la comparsa di reazioni emolitiche ritardate, sebbene i costi e la logistica di un tale programma possano risultare impraticabili per molte Strutture Trasfusionali. Un compromesso, utilizzato di frequente, quello di ricercare la compatibilit per gli antigeni dei sistemi Rh e Kell. I pazienti drepanocitici dovrebbero ricevere concentrati eritrocitari HbS negativi. Per maggiori dettagli, consultare il Capitolo 24. La trasfusione di sangue incompatibile Talvolta, necessario trasfondere pazienti per i quali non sono disponibili concentrati eritrocitari compatibili. Nella maggioranza dei casi si tratta di pazienti con autoanticorpi, che, caratteristicamente, reagiscono con tutte le emazie; tuttavia, una volta eliminati gli alloanticorpi, ci si attende che le emazie trasfuse abbiano una sopravvivenza pari a quella delle emazie autologhe. Altre situazioni, nelle quali tutte le unit appaiono incompatibili, riguardano la presenza di alloanticorpi diretti verso antigeni ad alta incidenza o di anticorpi a specificit multiple. Se i test sierologici non riescono a risolvere il problema o se, una volta identificato il problema, non si ha tempo sufficiente per acquisire unit compatibili, il medico deve considerare rischi e benefici della terapia trasfusionale e valutare quali terapie alternative sono disponibili. Se la necessit della trasfusione sufficientemente urgente, si possono utilizzare unit dello stesso gruppo ABO e dello stesso tipo Rh del paziente. In rapporto alle caratteristiche degli alloanticorpi, in caso di trasfusione incompatibile non sempre interviene unemolisi immediata e gli eritrociti incompatibili possono permanere in circolo il tempo sufficiente per arrecare un beneficio terapeutico96. Se il tempo a disposizione lo permette e se si dispone della strumentazione adatta, si pu
determinare la sopravvivenza in circolo di aliquote eritrocitarie radiomarcate. In alternativa, si pu ricorrere a una prova di compatibilit in vivo, trasfondendo, precauzionalmente, da 25 a 50 mL di emazie incompatibili, attendendo la risposta clinica del ricevente e controllando un campione di sangue dopo 30 minuti per la presenza di siero emolitico. Questo controllo non garantisce uneventuale sopravvivenza normale, ma pu indicare se si verificher una reazione acuta. Se non si osservano sintomi sfavorevoli o emolisi, la parte restante dellunit pu essere trasfusa lentamente e con attento monitoraggio clinico. Se la necessit di trasfondere vitale, i concentrati eritrocitari possono essere somministrati senza speciali misure, ma lo staff medico deve essere pronto a trattare qualsiasi reazione possa intervenire. La trasfusione dei pazienti con malattia emolitica autoimmune Date le difficolt sierologiche proprie della malattia emolitica autoimmune (MEA) e lattesa breve sopravvivenza delle emazie trasfuse, si raccomanda un atteggiamento conservativo nei riguardi della terapia trasfusionale. Prima di iniziare una trasfusione, si dovrebbe ricercare, tempo permettendo, la contemporanea presenza di alloanticorpi. molto utile stabilire in anticipo il fenotipo eritrocitario del paziente, al fine di semplificare le successive indagini per evidenziare la presenza di eventuali alloanticorpi. Il Capitolo 20 riporta una pi completa trattazione al riguardo. Trasfusioni massive Si definisce massiva la trasfusione di una quantit di sangue che si avvicini o superi la volemia del paziente, entro un intervallo di 24 ore. Il fattore pi importante per sostenere lossigenazione tessutale mantenere un adeguato flusso ematico e la pressione sanguigna, infondendo sufficienti volumi di cristalloidi o di emocomponenti, al fine di correggere o prevenire lo shock ipovolemico. Problemi in situazioni di emergenza Il Servizio Trasfusionale dovrebbe stabilire una
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procedura operativa standard per avere la disponibilit di sangue in situazioni di emergenza. I tempi di esecuzione dei test immunoematologici sono relativamente lunghi, cos che pu essere necessario accorciare tali tempi, in caso di traumi o di altre emergenze emorragiche. Dato che gli emocomponenti ABO compatibili sono completamente compatibili nella maggior parte dei casi, soprattutto se il paziente non stato precedentemente trasfuso, vengono spesso utilizzati concentrati eritrocitari di gruppo O prima del completamento dei test di compatibilit. In questa situazione si dovrebbero utilizzare, per bambine o donne in et fertile, concentrati eritrocitari RhD negativi, considerata la possibilit di una loro alloimmunizzazione e quella di una futura MEN nei loro figli. Per le donne di et superiore a quella fertile e per i maschi, solamente la presenza in circolo di anticorpi anti-D pu costituire un problema. Dato che questo anticorpo non pi comune di certi altri alloanticorpi diretti verso differenti antigeni gruppoematici, si possono impiegare per questi pazienti, con altrettanta sicurezza, emazie Rh positive. Luso di concentrati eritrocitari provenienti da cosiddetti donatori universali, come discusso in precedenza, ha diversi inconvenienti. Le scorte di emazie O sono classicamente scarse, date le differenze demografiche fra le popolazioni di donatori e di riceventi negli USA, e lutilizzo di donatori universali per riceventi di altro gruppo acuisce il problema. La tipizzazione ABO pu essere eseguita molto velocemente e, nella maggioranza dei casi urgenti, c tempo per eseguire una tipizzazione ABO del ricevente e per fornire emocomponenti ABO specifici. In secondo luogo, la trasfusione di grandi quantit di emazie di gruppo O, prima di ottenere un campione dal ricevente, pu ostacolare le successive indagini immunoematologiche. Quindi, se si debbono utilizzare concentrati eritrocitari di donatori universali, si dovrebbe ottenere un campione di sangue dal ricevente prima della trasfusione; questo possibile nella maggior parte dei casi, tolti quelli di dissanguamento per gravissime emorragie. Infine, la presenza di inattesi anticorpi
gruppoematici pu indurre reazioni fatali, particolarmente nei pazienti politrasfusi, come quelli affetti da drepanocitosi o con epatopatie, che si presentino in un Pronto Soccorso con gravi anemie o con gravi emorragie. In queste situazioni, una telefonata al Servizio Trasfusionale, dove il paziente sia stato precedentemente trasfuso, pu essere di vitale importanza. I medici che hanno in cura questi pazienti devono comprendere come lipovolemia abbia la priorit sullanemia. Le situazioni di emergenza non dovrebbero costituire una giustificazione per evitare di fare una precisa identificazione dei campioni di sangue del ricevente. Al contrario, si deve garantire una maggior attenzione alla identificazione del paziente, e la sola indicazione per luso di sangue universale relativa allarrivo contemporaneo di numerose vittime di traumi, momenti nei quali alto il rischio di una errata identificazione dei riceventi. Gli Standard AABB richiedono che i medici, che eseguono trasfusioni prima del completamento delle prove standard, documentino questa necessit sottoscrivendo un modulo di richiesta in emergenza 59(p46) . La documentazione dovrebbe essere richiesta soltanto dopo che lemergenza sia stata superata, specificamente entro 24 ore e le firme su tale modulo non dovrebbero essere interpretate come una liberatoria della responsabilit del Servizio Trasfusionale. Il Servizio Trasfusionale deve insistere sulla precisa identificazione dei campioni, sulla documentazione relativa alla richiesta, e su quella relativa alla situazione di emergenza della trasfusione. Esso ha, tuttavia, anche la responsabilit di eseguire i test di compatibilit in urgenza, fornire consulenze ed evitare procedure restrittive immotivate. Utilizzo di sangue di gruppo diverso Il Servizio Trasfusionale dovrebbe adottare delle linee guida per il passaggio allimpiego di sangue di gruppo diverso, durante le trasfusioni massive. Unalternativa alluso di globuli rossi di gruppo ABO identico lutilizzo di unit ABO compatibili (vedi Tabella 21.1). Et e sesso del paziente sono
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da prendere in seria considerazione. Per esempio, se si deve trasfondere una giovane donna di gruppo B, Rh negativo, preferibile passare ad eritrociti di gruppo O, Rh negativo prima di utilizzare sangue B, Rh positivo. La situazione clinica dovrebbe essere valutata dal medico del Servizio Trasfusionale. Se si suppone che le continue richieste trasfusionali possano eccedere la disponibilit di sangue Rh negativo, la decisione di utilizzare sangue Rh positivo deve essere presa per tempo, cos da conservare sangue per altri riceventi. Una volta che un paziente riceva una o pi unit di concentrati eritrocitari Rh positivi, vi scarso vantaggio a ritornare al sangue Rh negativo. Mantenimento della coagulazione in corso di trasfusioni massive La trasfusione massiva si accompagna spesso ad alterazioni della coagulazione, che possono manifestarsi come emorragie microvascolari, sotto forma di stillicidi dai numerosi punti utilizzati per le infusioni endovenose, mancata coagulazione del sangue presente nei versamenti e sanguinamenti dai tessuti superficiali dove, in precedenza, lemostasi era stata ottenuta. Tali situazioni sono state attribuite alla diluizione delle piastrine e dei fattori della coagulazione, ma anche la coagulopatia da consumo gioca un ruolo importante (vedi Capitolo 27). Un reintegro non adeguato della volemia e una scarsa perfusione tissutale non soltanto promuovono la liberazione di materiale tissutale procoagulante che porta alla CID, ma determinano anche acidosi lattica, acidemia e deficit dellattivit miocardica. Quando intervengono sanguinamenti microvascolari, i risultati del conteggio piastrinico, del livello del fibrinogeno, del PT e dellaPTT dovrebbero guidare la necessit di somministrare componenti emostatici. Immediatamente dopo aver prelevato i campioni, pu essere iniziata una terapia empirica con concentrati piastrinici e/o con plasma. Al fine di valutare la possibile presenza di una CID, possono essere eseguite ulteriori indagini. In tale situazione, un conteggio di piastrine inferiore a
50.000 plt/L e un livello di fibrinogeno al di sotto di 100 mg/dL predicono unemorragia meglio del PT e del aPTT97. I risultati del PT inferiori a 1,5 volte i valori normali sono, di solito, associati ad unadeguata emostasi nel corso di interventi chirurgici3. Nella maggior parte dei pazienti adulti, questi livelli si riscontrano soltanto dopo la trasfusione di 15-20 unit di concentrati eritrocitari (da 1,5 a 2 volte il volume di globuli rossi). Plasma fresco congelato o concentrati piastrinici non dovrebbero essere trasfusi in quantit prefissate, in rapporto al numero dei concentrati eritrocitari trasfusi. Ipotermia, ossigenazione tessutale e 2,3-DPG Lipotermia, quale complicanza della trasfusione, discussa al Capitolo 27. Nello shock ipovolemico, il difetto fisiopatologico di base rappresentato da uninadeguata ossigenazione dei tessuti. Il rifornimento di O2 ai tessuti determinato da molti fattori, i pi importanti dei quali sono il flusso sanguigno (cio la perfusione) e la concentrazione emoglobinica. Il livello di 2,3-DPG diminuisce negli eritrociti conservati, e tale decremento stato ritenuto essere la causa potenziale di una scarsa ossigenazione tessutale dopo trasfusioni massive. Non stato, comunque, dimostrato che un basso livello di 2,3-DPG sia dannoso per i pazienti sottoposti a trasfusione massiva, quantunque per i neonati sottoposti a exsanguino-trasfusione sia frequentemente richiesto sangue con livelli di 2,3DPG molto vicini alla norma. Da 3 a 8 ore dopo una trasfusione, le emazie conservate rigenerano il 50% del 2,3-DPG98.
Alternative farmacologiche alla trasfusione

La preoccupazione riguardo ai rischi e i limiti della trasfusione hanno indotto a prendere in considerazione alternative farmacologiche. Tali alternative potrebbero: 1) stimolare unaumentata produzione o un aumentato rilascio di elementi ematici in sostituzione del rimpiazzo (per esempio,
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eritropoietina); 2) sostituire gli emocomponenti (per esempio, soluzioni colloidi o soluzioni di trasportatori di O 2 , comprese emoglobine chimicamente modificate); 3) alterare i meccanismi fisiologici per ridurre le necessit di terapia sostitutiva (per esempio utilizzando inibitori della fibrinolisi)99. Fattori di crescita ricombinanti I fattori di crescita sono proteine ormonali a basso peso molecolare, in grado di regolare lematopoiesi, interagendo specificamente con i recettori che si trovano sulle cellule progenitrici. Lutilizzo di tali fattori, che stimolano la produzione endogena di cellule ematiche, rappresenta unalternativa importante allimpiego di sangue100. Eritropoietina Leritropoietina ricombinante (EPO) un fattore di crescita che stimola la produzione di globuli rossi100. stata approvata per la somministrazione prima di interventi chirurgici, al fine di aumentare i livelli di emoglobina e di ematocrito; le dosi usuali variano da 300 a 600 U/kg/settimana, per iniezioni sottocutanee. Limpiego di EPO ha ridotto, drasticamente, la necessit di trasfusioni in pazienti con insufficienza renale allultimo stadio ed indicato nel trattamento dellanemia di pazienti infettati con lHIV. Un trattamento intensivo con EPO (40.000 U/settimana) ha ridotto le richieste di trasfusioni per pazienti ricoverati in unit di cura intensiva101. LEPO pu anche giocare un ruolo nel trattamento delle anemie causate da malattie croniche o in risposta ad altri farmaci che possono sopprimere la produzione midollare. Altri fattori ematici di crescita Il GM-CSF (Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor) e il G-CSF (GranulocyteColony-Stimulating Factor) stimolano il midollo a produrre granulociti100. il G-CSF approvato per il trattamento della neutropenia indotta dalla chemioterapia, per i pazienti sottoposti al prelievo di CSE dal sangue periferico e per i pazienti affetti da neutropenia cronica. Luso di questi fattori stimolanti riduce la durata della neutropenia, aumenta la tolleranza ai farmaci citotossici e
diminuisce la necessit di ricorrere a trasfusioni di concentrati granulocitari. approvato luso del GM-CSF in pazienti sottoposti a trapianto autologo di midollo. Un altro potenziale impiego di GM-CSF o di G-CSF il supporto di pazienti sottoposto a trapianto con midollo allogenico o di pazienti che ricevono un trattamento con farmaci antivirali, che hanno azione inibente lattivit midollare. Linterleuchina-1 (IL-1) ricombinante approvata nei pazienti neoplastici con trombocitopenia, mentre altri attivatori dei recettori della trombopoietina si sono dimostrati deludenti e nessuno di essi attualmente disponibile. Trasportatori terapeutici di ossigeno Soluzioni di emoglobina libera, nelle quali lemoglobina stata separata dalle membrane eritrocitarie, hanno diverse caratteristiche che le rendono inservibili quali sostituti del sangue, ivi comprese: una bassa p50 (pressione parziale di O2 necessaria per avere una saturazione del 50%); durata in circolo breve; alta pressione oncotica; propriet vasopressorie e nefrotossiche102,103. Le soluzioni chimicamente modificate di emoglobina possono, tuttavia, aggirare, con successo, tali svantaggi e, al presente, sono in corso esperimenti clinici in Fase III. Pazienti studiati nel corso di tali sperimentazioni sono sopravvissuti a stati di anemia molto gravi (emoglobina cellulare residua di 1 g/dL), senza particolare tossicit, quando trattati con queste soluzioni104. Lemoglobina bovina autorizzata per luso veterinario. Si anche studiata unemoglobina prodotta con tecniche di DNA ricombinante. Infine, sono stati ampiamente studiati prodotti contenenti fluorocarburi che legano lossigeno103. Uno di essi, il Fluosol, era stato approvato dalla FDA per limpiego nella angioplastica percutanea transluminale, ma non pi reperibile negli USA. Desmopressina La desmopressina (DDAVP) un prodotto sintetico, analogo allormone vasopressina, ma privo di significativa attivit vasopressoria99.105.
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Impiegata inizialmente per trattare il diabete insipido, la desmopressina si dimostrata utile nel sostenere lemostasi, data la sua capacit di determinare il rilascio, dal sub-endotelio vascolare, delle riserve endogene del vWF ad alto peso molecolare e il concomitante aumento del FVIII. A causa del suo effetto sul FVIII e sul vWF, la desmopressina viene usata come emostatico nei pazienti affetti da forme lievi-moderate di emofilia A e nei pazienti con sindrome di von Willebrand. Dato che ladesione delle piastrine e la conseguente formazione del tappo emostatico piastrinico dipendono dal vWF, la desmopressina pu anche risultare utile in molti casi di disfunzioni piastriniche, ivi compresi uremia, cirrosi, alterazioni indotte da farmaci (da aspirina, per esempio), alterazioni primitive delle piastrine e sindromi mielodisplastiche99,105,106. La desmopressina pu essere somministrata per via endovenosa, per via sottocutanea o per via intranasale. Generalmente viene iniettata in una singola dose (da 0,3 a 0,4 g/kg) per trattare emorragie o per profilassi prima di alcune procedure. Le dosi non vengono generalmente ripetute entro 24-48 ore, per evitare linstaurarsi di una tachifilassi (cio perdita di effetto biologico per ripetute somministrazioni di una sostanza), e linduzione di ritenzione idrica e di iponatremia. Alcuni pazienti presentano arrossamenti al viso o modica ipotensione, ma le reazioni collaterali sono rare. Gli effetti sul vWF sopravvengono entro 30 minuti e durano sino a 4-6 ore105. Inibitori della fibrinolisi Lacido -aminocaproico (o EACA) e lacido tranexamico -analoghi sintetici della lisinainibiscono, per competizione, la fibrinolisi, saturando i siti di legame della lisina, dove il plasminogeno e la plasmina si legano al fibrinogeno e alla fibrina. Questi due farmaci possono essere utilizzati localmente o per via sistematica e possono essere somministrati per via orale. Laprotinina un polipeptide, preparato dal polmone di bovini, che inibisce le proteinasi quali plasmina, callicreina, tripsina e, in qualche misura, anche lurochinasi.
Ha, quindi, unazione antifibrinolitica, ma pu anche inibire la coagulazione, dato che la callicreina attiva il Fattore XII. Laprotinina viene somministrata per via endovenosa e, dato che un polipeptide, pu provocare reazioni da ipersensibilit99,107. Le sostanze antifibrinolitiche sono state utilizzate, con successo, in cardiochirurgia, nelle prostatectomie e nei trapianti di fegato. LEACA e lacido tranexamico possono essere usati localmente, nei punti dove la fibrinolisi contribuisce al sanguinamento, come nelle lesioni mucose della bocca e del tratto gastrointestinale, e risultano utili nel controllo delle emorragie che seguono le avulsioni dentarie in pazienti con emofilia e nel controllo di emorragie gastro-intestinali. LEACA e lacido tranexamico possono essere anche impiegati per controllare le emorragie in casi di gravi piastrinopenie. La sistematica somministrazione di inibitori della fibrinolisi stata associata a serie complicazioni trombotiche, ivi incluse ostruzioni ureterali causate da formazioni di coaguli e trombosi di grosse arterie e vene. Se usati in dose eccessive, gli inibitori della fibrinolisi possono prolungare il tempo di emorragia. Tali farmaci dovrebbero essere impiegati da medici esperti nel loro uso. Questi tre farmaci antifibrinolitici, cos come la desmopressina, sono stati impiegati allo scopo di diminuire luso di sangue in cardiochirurgia, e delle meta-analisi hanno mostrato una diminuzione del numero di pazienti che avevano ricevuto concentrati eritrocitari allogenici, del numero di unit di trasfuse108,109, delle perdite ematiche108 e del numero di pazienti che avevano richiesto un re-intervento a causa di emorragie108,109. Il maggior numero di dati si riferisce, fra i tre farmaci, alla aprotinina, che quella maggiormente utilizzata. La desmopressina non complessivamente efficace, ma pu essere impiegata in pazienti che assumono aspirina108. stata motivo di preoccupazione una tendenza a un maggior numero di complicanze trombotiche (infarto del miocardio, trombosi di organi trapiantati) con laprotinina, ma tali complicazioni non sono risultate statisticamente significative 107,108.
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Ci vorrebbero, sfortunatamente, studi molto pi ampi per dimostrare se il profilo di rischio di tali sostanze sia superiore a quello del sangue, considerando in particolare i sempre minori pericoli della trasfusione.
Supervisione della pratica trasfusionale

Fra le varie istituzioni che regolano o accreditano i vari aspetti della trasfusione, la JCAHO (Joint Commission for Accreditation of Healthcare Organisations , Commissione Congiunta per lAccreditamento delle Organizzazioni Sanitarie) ha storicamente sottolineato la supervisione della pratica trasfusionale come requisito per laccreditamento. Come parte dei propri standard di miglioramento delle prestazioni, la JCAHO chiede la raccolta dei dati sulluso del sangue e classifica le istituzioni in base alla appropriatezza delle prestazioni e allampiezza dei dati-campione110. Gli standard JCAHO richiedono, inoltre, che lo staff medico assuma un ruolo-guida nel misurare, valutare e migliorare i processi clinici correlati alluso del sangue e degli emocomponenti. Questo processo di valutazione deve comprendere una revisione paritetica, i cui risultati debbono essere comunicati al personale coinvolto, oltre che costituire una parte del loro aggiornamento clinico. Questa funzione stata tipicamente delegata a una commissione formata da personale medico, e spesso a un Comitato Trasfusionale dedicato. Il direttore medico del Servizio Trasfusionale dovrebbe essere un componente del Comitato. Il Comitato dovrebbe esaminare le attivit e le statistiche sulle trasfusioni, le richieste di sangue e le pratiche trasfusionali e dovrebbe prevedere procedure per revisionare le registrazioni riguardanti i pazienti trasfusi con sangue o emocomponenti. Il Comitato dovrebbe tenere sotto controllo i processi pi significativi in Medicina Trasfusionale che potrebbero interessare i pazienti della propria struttura e assumere azioni appropriate, relative a tali progressi. Anche il programma di accreditamento dei
laboratori del CAP ( College of American Pathologists, Collegio dei Patologi Americani) richiede la supervisione delle attivit trasfusionali. Ci imposto dai propri standard generali sul controllo di qualit e sul miglioramento, che stabiliscono che il direttore di un Servizio Trasfusionale deve valutare lappropriatezza dei risultati di ogni laboratorio in maniera multidisciplinare111. La lista di controllo per laccreditamento CAP di una Struttura Trasfusionale richiede, inoltre, di documentare che il direttore medico del Servizio Trasfusionale partecipi attivamente nello stabilire i criteri di verifica e nel rivedere i casi che non soddisfano tali criteri112. Gli Standard AABB, infine, richiedono che ci sia un programma di revisione paritaria per monitorare lappropriatezza nelluso degli emocomponenti59(p86).
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Capitolo 22: Assegnazione e trasfusione di sangue e di emocomponenti
Capitolo 22
Assegnazione e trasfusione di sangue e di emocomponenti
Una buona pratica trasfusionale richiede che siano pianificate esaurienti politiche e procedure di assegnazione del sangue, per prevenire possibili errori. Lo sviluppo di tali politiche dovrebbe provenire da una collaborazione fra direttore medico del Servizio Trasfusionale, i direttori dei reparti clinici, personale infermieristico e medico e tutto lo staff coinvolto. Le politiche e le procedure devono essere accessibili, essere revisionate periodicamente per la loro appropriatezza ed essere monitorate per accertare che vengano rispettate. Oltre a trattare delle politiche e delle procedure di assegnazione del sangue, questo capitolo discute le procedure pre-trasfusionali, la distribuzione degli emocomponenti, i dispositivi utilizzati e le soluzioni endovenose compatibili.
Eventi che precedono la consegna

Istruzione del paziente e ottenimento del consenso I pazienti che vengono informati sulle procedure necessarie per una trasfusione vivranno questa esperienza con meno ansia. Questo importante non soltanto per un adulto, ma anche per un bambino che sia in grado di comprendere il procedimento. In questultima situazione corretto istruire i genitori, in modo che siano meglio preparati nel sostenere e incoraggiare il loro bambino, nel corso della trasfusione. Il medico trasfusore dovrebbe spiegare come sar somministrata la trasfusione, quanto tempo
durer, lesito atteso, quali sintomi potrebbero presentarsi e quali parametri clinici vitali saranno controllati. Il medico ha la responsabilit di spiegare, in modo comprensibile al paziente, benefici e rischi della trasfusione, cos come lesistenza di possibili alternative terapeutiche. Con leccezzione delle situazioni di emergenza, al paziente dovrebbe essere data lopportunit di porre domande e si dovrebbe documentare la sua scelta informata. Leggi statali e locali regolano le procedure relative allottenimento e alla documentazione del consenso del paziente. Alcuni stati hanno requisiti specifici per la trasfusione di sangue. Le istituzioni dovrebbero assicurarsi che le proprie procedure siano conformi alla legge. Le singole istituzioni contemplano differenti requisiti, per quanto riguarda ottenimento e documentazione del consenso, cos come differenti politiche su quanto spesso sia necessario. Alcune strutture richiedono luso di moduli formali, in grado di fornire informazioni in un linguaggio comprensibile, da sottoscrivere da parte del paziente. Altre esigono che sia il medico ad annotare sulla cartella clinica del paziente che gli sono stati illustrati i rischi della trasfusione o le sue alternative e che il paziente ha dato il consenso. Se il paziente non in grado di dare il consenso ci si dovrebbe rivolgere a un familiare responsabile. Se non disponibile nessun familiare, o se lurgenza trasfusionale non concede il tempo per il consenso, prudente segnalarlo nella cartella clinica1-3.
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Prescrizione e istruzioni particolari Ci deve essere la documentazione della richiesta di un emocomponente da parte di un medico4. Sebbene, in situazioni durgenza, sia accettabile una richiesta telefonica, questa deve essere seguita da una richiesta scritta. Nella richiesta dovrebbero essere indicate le caratteristiche precisate di seguito: caratteristiche del componente: lavato, irradiato, leucodepleto, citomegalo negativo; paziente: premedicazione, ora scelta per la trasfusione; procedura: ritmi dinfusione, uso di riscaldatore del sangue o di pompa elettromedicale; necessit di una consegna urgente. Considerazioni relative agli emocomponenti Alcuni emocomponenti richiedono una preparazione speciale prima di essere consegnati per una trasfusione. Dato che tali preparazioni sono lunghe e possono accorciare, in modo rilevante, il tempo di conservazione del componente, le preparazioni dovrebbero essere accuratamente coordinate con il tempo programmato per la trasfusione. Il Servizio Trasfusionale deve fare ogni sforzo per assicurare che lemocomponente sia pronto al momento del bisogno, ma non cos presto presto da scadere prima della somministrazione. Il personale medico e infermieristico deve essere informato sugli speciali requisiti delle preparazioni
e comprendere che i tempi non possono essere accorciati, in modo significativo, neppure in situazioni durgenza. Sono necessarie strette relazioni informative. La Tabella 22.1 illustra alcuni esempi di trattamenti pre-trasfusionali. Considerazioni relative ai pazienti I pazienti con anamnesi di ricorrenti reazioni allergiche alle trasfusioni possono usufruire di premedicazioni con antistaminici o di un rallentamento nel ritmo delle infusioni. Si dovrebbe scoraggiare la premedicazione routinaria con antipiretici, dato che un ritardato aumento della temperatura pu mascherare i sintomi di una reazione emolitica e anche perch la premedicazione pu essere inefficace5-7. Gli antipiretici non mascherano, usualmente, altri sintomi di emolisi, quali mutamenti nella pressione arteriosa, nelle pulsazioni e nel ritmo respiratorio. Le richieste di premedicazioni dovrebbero essere attentamente sincronizzate con i tempi specificati per la trasfusione. Le medicazioni per via endovenosa devono essere somministrate immediatamente prima dellinizio della trasfusione, ma quelle per via orale devono essere date da 30 a 60 minuti prima. Considerazioni relative al procedimento I riscaldatori di sangue e le pompe elettromedicali devono essere disponibili, quando richiesti per una trasfusione.
Tabella 22.1 - Tempi di preparazione di emocomponenti Emocomponente Concentrati eritrocitari: lavati Concentrati eritrocitari: scongelati e deglicerolizzati Plasma fresco congelato: scongelamento Plasma scongelato Concentrato piastrinico da pool CRIO: scongelato (unit singola) CRIO da pool
CRIO = crioprecipitato di fattore anti-emofilico. * Tempo variabile con le diverse procedure dellistituzione. ** Dipende dal metodo impiegato.
Tempo minimo* 45 minuti 75 minuti 30 minuti 15 minuti 15 minuti 15 minuti
Tempo di conservazione 24 ore 24 ore o 2 settimane** 24 ore 5 giorni 4 ore 6 ore 4 ore
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Consegnza in urgenza Se urgentemente necessario per la sopravvivenza del paziente, il sangue pu essere consegnato senza che i test pre-trasfusionali siano completati, a condizione che: 1) la cartella documenti, appropriatamente, la richiesta in urgenza e che 2) le unit distribuite siano di gruppo ABO tale da non causare un immediato danno al ricevente. Accessi venosi Per evitare ritardi nella trasfusione e una possibile scadenza degli emocomponenti, si dovrebbero individuare gli accessi venosi prima della consegna dellemocomponente. Se si deve utilizzare un via preesistente, questa dovrebbe essere controllata per la sua accessibilit, per i segni di infiltrazioni, infiammazioni o infezioni, per la compatibilit con altre soluzioni endovenose da infondere (vedi oltre). Possono essere utilizzati molti tipi di dispositivi per laccesso venoso. La scelta dipende dalla localizzazione, dalla dimensione e dallintegrit delle vene del paziente, dalle caratteristiche del farmaco o della soluzione da infondere, dal tipo di emocomponente da trasfondere, dal volume e dal ritmo della somministrazione, dalle possibili interazioni fra le soluzioni parenterali e dalla durata prevista della terapia endovenosa. Il lume dellago o del catetere utilizzato per la trasfusione dovrebbe essere tale da consentire ritmi di flusso appropriati, senza recare danno alla vena. Non ci sono linee guida cogenti che limitino la dimensione dei cateteri o degli aghi impiegati nella trasfusione. Un catetere di 18-gauge, di diametro 18, fornisce un buon flusso per emocomponenti cellulari, senza eccessivo disturbo per il paziente, ma i pazienti con piccole vene richiedono cateteri di calibro minore. Un flusso ad alta pressione, attraverso aghi o cateteri a lume piccolo, pu danneggiare i globuli rossi8-10, a meno che lemocomponente non sia sufficientemente diluito 10 . Un concentrato eritrocitario non diluito scorre molto lentamente attraverso un ago di 23-gauge, ma la diluizione con fisiologica pu causare unindesiderata espansione della volemia. Anche in pazienti
cardiopatici o con volemia espansa, una trasfusione dovrebbe essere somministrata, in sicurezza entro 4 ore. Per i pochi riceventi, incapaci di tollerare una trasfusione entro 4 ore, si dovrebbero sviluppare politiche locali, prevedendo di frazionare le unit o di eliminare le porzioni non utilizzate. Sono stati approvati specifici modelli di pompe da infusione. Queste pompe mantengono un flusso costante e le analisi non hanno dimostrato evidenze significative di emolisi, in rapporto alla differente dimensione degli aghi11. Si usano cateteri venosi centrali per terapie a medio o lungo termine o per la somministrazione di soluzioni che potrebbero essere tossiche per le vene periferiche, alle diluizioni che si raggiungono con alti flussi di sangue. Alcuni cateteri sono posizionati introducendo aghi speciali o cannule; altri cateteri vengono impiantati chirurgicamente. I cateteri a pi lumi possiedono ingressi di infusione separati, cos da consentire la simultanea immissione di fluidi diversi, senza la possibilit di mescolanze nel corso della somministrazione, evitando, in tal modo, potenziali emolisi indotte da liquidi fra loro incompatibili. Necessita di esecuzione di test di compatibilit Il personale del Servizio Trasfusionale determina quale test pre-trasfusionale richiesto. I test di compatibilit devono essere effettuati per trasfusioni di sangue intero, di emocomponenti con un contenuto significativo di eritrociti e per tutte le unit di globuli rossi. I test e i campioni richiesti sono illustrati al Capitolo 18. I test di compatibilit, se si esclude la determinazione delle caratteristiche ABO ed Rh, non sono richiesti per la trasfusione di concentrati piastrinici o di plasma, sebbene molte strutture richiedono di conoscere (su file) i gruppi ABO ed Rh del ricevente, prima di assegnare tali componenti. Quando possibile, i componenti contenenti plasma dovrebbero essere compatibili con gli eritrociti del ricevente (vedi Capitolo 21).
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Consegna e trasporto del sangue

Consegna del sangue alle aree di degenza Le Strutture Trasfusionali dovrebbero definire le politiche di ritiro e consegna del sangue e approntare adatti programmi di addestramento del personale, al quale vengono affidati questi compiti. Il sangue non deve uscire, di routine, dal Centro Trasfusionale sino a che tutti i test non siano stati completati, il ricevente non sia stato preparato e il medico trasfusore non sia pronto a iniziare la procedura. Al momento della consegna, deve esistere un meccanismo atto a identificare sia il paziente cui la trasfusione dedicata sia il tipo di emocomponente richiesto. Sarebbe cosa ottima identificare lincaricato del trasporto. Il personale del Servizio Trasfusionale analizzer i dati identificativi, ispezioner lemocomponente prima di consegnarlo e si assicurer che esista un sistema in grado di mantenere una corretta temperatura di conservazione durante il trasporto. La pratica pi sicura consegnare, uno alla volta, un emocomponente per un singolo ricevente. Per i pazienti che stanno sanguinando o che hanno accessi venosi multipli, possono essere distribuiti, contestualmente, pi emocomponenti. Si raccomanda di non consegnare, a un singolo trasportatore, emocomponenti destinati a due o pi riceventi, in quanto ci potrebbe aumentare le probabilit di errori. Peraltro, considerazioni logistiche possono rendere ci non facilmente praticabile. Lincaricato del trasporto dovrebbe consegnare il sangue alla destinazione senza ritardi, preferibilmente al medico trasfusore. preferibile sistemare lemocomponente in un contenitore protettivo, in grado di impedire qualsiasi perdita, nel caso di una involontaria rottura durante il trasporto. La responsabilit per una corretta identificazione del componente da trasfondere , congiuntamente, del personale del Servizio Trasfusionele che lo ha consegnato e del medico trasfusore che lo riceve. Prima che ununit sia consegnata, il personale del Servizio Trasfusionale deve completare i passaggi elencati qui di seguito:
1. revisionare le registrazioni che consentano di identificare sia il ricevente sia lemocomponente richiesto; 2. per ciascuna unit vanno registrati, sul modulo trasfusionale, gli operatori che identificano il ricevente, il gruppo ABO ed Rh del ricevente (gli Standard AABB richiedono che siano almeno due), il numero dellunit, il gruppo ABO ed Rh del donatore, linterpretazione dei risultati dei test di compatibilit (se eseguiti). Questo modulo (o una sua copia) diviene parte della cartella clinica del paziente, dopo il termine della trasfusione. In alcune strutture, il modulo trasfusionale viene attaccato allunit e serve, quindi, come il cartellino, descritto al punto 3. Il modulo, caratteristicamente, deve avere specifici spazi dove identificare il medico trasfusore e, se richiesto, il co-identificatore e contenere altre informazioni quali i parametri clinici vitali del paziente da controllare prima e dopo la trasfusione, la quantit di emocomponente trasfuso, le reazioni eventualmente intervenute e quantaltro; 3. si deve attaccare, saldamente, al contenitore dellunit un cartellino o unetichetta con il nome e il numero di identificazione del ricevente, il numero dellemocomponente, linterpretazione dei risultati dei test di compatibilit (se eseguiti); 4. si deve controllare laspetto dellunit prima della sua consegna e questa ispezione deve essere registrata; 5. si deve controllare la data di scadenza dellunit per assicurarsi che lunit sia idonea a essere trasfusa; 6. vanno registrati il nome della persona che ha consegnato il sangue, la data e lora delluscita. ritenuta cosa ottimale registrare il nome del trasportatore al quale stata consegnata lunit. Ritardi nellinizio della trasfusione Si dovrebbe, in teoria, ritirare il sangue al momento nel quale si intende trasfonderlo. Se la trasfusione non pu essere immediatamente iniziata, lemocomponente dovrebbe essere
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restituito al Servizio Trasfusionale per la conservazione, a meno che la trasfusione al paziente, cui destinata, non possa essere completata entro 4 ore. Il sangue non dovrebbe essere tenuto a temperatura ambiente o conservato in un frigorifero non monitorato. Le unit restituite al Servizio Trasfusionale, dopo un periodo di conservazione in un frigorifero non monitorato, saranno inidonee a unulteriore utilizzo, qualora la sterilit del contenitore sia stata compromessa o se la temperatura sia risalita a 10 C (od oltre), il che si considera possa avvenire in meno di 30 minuti. Se le unit sono state mantenute in condizioni idonee, con piastre refrigeranti che siano state validate per parecchie ore di conservazione, si possono accettare anche tempi di permanenza fuori dal servizio pi lunghi. I requisiti per il sangue raccolto durante un intervento operatorio sono differenti (vedi Tabella 5.8). Le unit che sono state aperte dopo il rilascio del Servizio Trasfusionale non possono essere reintegrate nelle scorte per una loro eventuale ulteriore utilizzo.
Eventi che precedono la trasfusione

Identificazione del ricevente e dellunit Unaccurata identificazione dellemocomponente e del ricevente pu rappresentare il singolo momento pi importante, in grado di garantire la sicurezza trasfusionale12-15. La maggior parte delle reazioni trasfusionali emolitiche e delle morti interviene perch sono, inavvertitamente, somministrati globuli rossi ABO incompatibili 14,15. Anche il plasma e le piastrine sono in grado di causare serie reazioni trasfusionali16. Lidentificazione e letichettatura del sangue donato sono discusse nel Capitolo 7, mentre le procedure per identificare i campioni del ricevente da utilizzare per le prove di compatibilit sono discusse nel Capitolo 18. Il punto maggiormente importante per una trasfusione sicura riguarda le trascrizioni, al momento in cui il Servizio Trasfusionale distribuisce il sangue per uno specifico paziente
e quando lemocomponente viene somministrato. Il medico trasfusore che infonde il sangue rappresenta il punto finale, nel quale pu essere evidenziato lerrore di identificazione, prima che la trasfusione inizi. Il medico trasfusore deve controllare tutte le informazioni identificative prima di cominciare a trasfondere e deve registrare, sul modulo trasfusionale, che tali informazioni sono state controllate e trovate corrette. Qualsiasi discrepanza deve essere risolta prima di iniziare la trasfusione. pratica comune, in numerose strutture, che una seconda persona (il cosiddetto co-identificatore) confermi lidentit dellunit del ricevente. Alcune istituzioni possono richiedere che il medico trasfusore controlli il consenso del paziente, prima di trasfondere. anche pratica corrente il controllare il gruppo ABO e il D come trascritto sul modulo trasfusionale, con la registrazione della tipizzazione ABO e D sulla cartella del paziente. Le informazioni che seguono devono essere ricontrollate e trovate corrette: 1. richiesta del medico. Si dovrebbero controllare le caratteristiche del sangue o dellemocomponente riportate sulla richiesta scritta del medico, al fine di accertarsi che al paziente venga dato il prodotto e la dose corretti (numero di unit). Tutti i documenti identificativi attaccati allunit devono restare sul contenitore sino a che la trasfusione non sia terminata; 2. identificazione del ricevente . I dati del ricevente, presenti sul suo braccialetto identificativo, devono corrispondere esattamente a quelli attaccati allunit. consigliabile chiedere al paziente, se in condizioni di farlo, di dichiarare il proprio nome, poich i dati sul braccialetto potrebbero essere errati17; 3. identificazione dellunit . Il numero di identificazione dellunit sul contenitore, il modulo di trasfusione e il cartellino attaccato devono concordare; 4. ABO e D. Le tipizzazioni ABO e D riportate sulletichetta principale dellunit donata devono corrispondere a quelle registrate sul modulo trasfusionale. Le tipizzazioni ABO e
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D del ricevente devono essere registrate sul modulo trasfusionale. Le caratteristiche di gruppo del sangue donato e del ricevente possono non essere identiche (vedi Capitolo 21), ma le informazioni riportate sul modulo trasfusionale e quelle sulletichetta del contenitore devono essere uguali; 5. data di scadenza. Si dovrebbe verificare la data e lora di scadenza dellemocomponente; 6. compatibilit. Sul modulo trasfusionale e sul cartellino attaccato allunit devono essere riportati i risultanti delle prove di compatibilit (se eseguite). Se lemocomponente stato consegnato prima che le prove di compatibilit siano state completate, questo fatto deve essere segnalato con particolare evidenza. Il braccialetto identificativo pu non essere presente, al momento della trasfusione, sui pazienti, in particolari situazioni (in sala operatoria, nelle unit di cura intensiva, in caso di terapia trasfusionale ambulatoriale). Frequentemente, il braccialetto viene rimosso in sala operatoria per la preparazione di un accesso vascolare e lidentit non pu venire confermata in questo modo. Inoltre, non sempre disponibile, per confermare lidentit, un secondo identificatore, come sarebbe augurabile. Le istituzioni dovrebbero prendere in considerazione queste situazioni cliniche e si dovrebbero predisporre pertinenti protocolli trasfusionali18. Inizio della trasfusione Dopo aver controllato tutte le informazioni identificative, il medico trasfusore (insieme con un secondo identificatore) deve indicare sulla cartella clinica che lidentificazione corretta (ad esempio, firmando il modulo trasfusionale), per documentare chi comincia la trasfusione, e deve registrare data ed ora dellinizio. Se non fatto in precedenza, devono essere controllati e registrati i parametri clinici vitali (pressione arteriosa, pulsazioni, frequenza respiratoria, temperatura). Una registrazione della data e dellora della trasfusione, del nome e del volume dellemocomponente e dei parametri clinici vitali pu anche essere richiesta, in base alle diverse politiche istituzionali, su altre parti della cartella
clinica, relative allingresso e alla dimissione del paziente, alle annotazioni sullanestesia, ai fogli informativi su terapie intensive. Questo pu essere sufficiente ai fini della documentazione. Numerose pubblicazioni hanno documentato errori avvenuti al momento della trasfusione del sangue19-22. In particolare, Baele et al.19 hanno esaminato i moduli e le registrazioni relative a 808 pazienti che avevano ricevuto 3.485 unit di sangue nel corso di 15 mesi, per documentare se vi erano stati errori. Gli Autori hanno scoperto 165 errori, avvenuti dopo che le unit avevano lasciato i Centri Trasfusionali, 15 dei quali gravi. Sette di questi errori gravi riguardavano lerrata identificazione del paziente, con la conseguente trasfusione a riceventi sbagliati, con una percentuale dello 0,75 sul totale dei pazienti e dello 0,2 sul totale delle unit. Un caso ha determinato una reazione trasfusionale emolitica per incompatibilit ABO, che non stato segnalato al Servizio Trasfusionale. Gli altri 8 errori gravi si sono verificati in 4 pazienti (0,5%), e comprendono la trasfusione di 5 unit allogeniche a riceventi per i quali era disponibile sangue autologo e una trasfusione di sangue a un paziente anemico, per il quale il medico aveva richiesto soltanto lesecuzione di una prova di compatibilit. I rimanenti errori (150) riguardavano casi di errate registrazioni (61), errate etichettature (6), mancate documentazioni della trasfusione (83). Sono disponibili, in commercio, sistemi-barriera e mezzi elettronici per lidentificazione del paziente e del prodotto, ma questi strumenti non sono in grado di sostituire i procedimenti di identificazione cartacea. Nei sistemi elettronici, gli identificatori, a codice a barre o a radio-frequenza, sono attaccati allemocomponente (e al modulo trasfusionale) che, dopo analisi e lettura, confronter le informazioni del paziente con quelle del braccialetto identificativo24. probabile che questi strumenti elettronici trovino una pi ampia diffusione in futuro. Esperienze empiriche sulla somministrazione di farmaci suggeriscono, tuttavia, di prendere in considerazione gli eventuali, non previsti, effetti collaterali di tale modalit25.
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Laderenza alla politica istituzionale sulla trasfusione di sangue richiede un programma di garanzia e di miglioramento continuo della qualit, attraverso il monitoraggio e laddestramento ccostante del personale, ogni volta che intervengono variazioni nelle procedure. Un approccio simile gi iniziato in alcune strutture, determinando un miglioramento della pratica trasfusionale26. Pu essere anche utile osservare direttamente una trasfusione di sangue 27 o guardare video indicativi al riguardo28.
emocomponenti, ma se la prima unit ha richiesto 4 ore per linfusione, il filtro non pu essere riusato. Il filtro intrappola aggregati di cellule, frammenti cellulari e coaguli proteici, determinando unalta concentrazione di proteine alla sua superficie. Un ambiente altamente proteico e la temperatura ambiente promuovono la crescita di batteri, eventualmente presenti. Inoltre, il materiale che si accumula rallenta il flusso dellinfusione30. Set speciali I set che permettono maggiori flussi per una trasfusione pi rapida hanno filtri ad ampia superficie, tubi a diametro pi largo e possono contemplare anche una pompa manuale in linea. I set studiati per infusioni rapide possono avere dei pre-filtri che trattengono le particelle con diametro superiore ai 300 e che aumentano la vita dei filtri standard, posti a valle. I set a gocciolamento per gravit usati nella somministrazione di concentrati piastrinici o di crioprecipitato posseggono camere di gocciolamento e filtri di dimensioni minori, tubi pi corti e necessitano di piccoli volumi per la loro attivazione. I set che necessitano dellintervento di una siringa per la somministrazione di emocomponenti hanno volumi di attivazione minori e i filtri in linea possono essere poco visibili. Filtri per microaggregati I filtri per microaggregati sono riservati alle trasfusioni di concentrati eritrocitari. I microaggregati, di dimensioni inferiori ai 170 , passano attraverso i filtri standard. I filtri pi selettivi hanno pori da 20 a 40 , in grado di intrappolare microaggregati composti da piastrine, leucociti in degenerazione o da filamenti di fibrina, materiale che si forma dopo 5 o pi giorni di conservazione in frigorifero. I filtri per microaggregati possono essere impiegati anche per altri emocomponenti, qualora ci venga richiesto nelle istruzioni dei produttori. Va, tuttavia, considerato che il gran volume richiesto per lattivazione fa perdere porzioni significative di questi emocomponenti, qualora non sia stata passata, in precedenza, attraverso il filtro, una notevole quantit di soluzione fisiologica. Filtri
Trasfusione di sangue
Set da infusione Ogni emocomponente deve essere trasfuso attraverso un filtro che trattenga i coaguli e le particelle, che potrebbero essere di danno al ricevente4.29(p48). I filtri e i set da infusione devono essere impiegati seguendo le istruzioni dei produttori. Set standard I set da trasfusione di tipo standard hanno, in linea, un filtro (con pori da 170-260 ), una camera di gocciolamento e tubi di varia configurazione. I set dovrebbero essere attivati secondo le istruzioni del produttore, impiegando lo stesso emocomponente da infondere o soluzioni che siano compatibili con il sangue (vedi oltre, il capitolo sulle soluzioni endovenose). Per ottenere flussi e prestazioni ottimali, i filtri dovrebbero essere totalmente bagnati. Le camere di gocciolamento dovrebbero essere riempite a met, per consentire una corretta visione del flusso. Numerose strutture seguono la politica di cambiare set dopo ogni trasfusione o di limitarne luso ad alcune unit o ad alcune ore, al fine di ridurre i rischi di una contaminazione batterica. Un tempo ragionevole di 4 ore; ci conforme al limite di 4 ore che la Food and Drug Administration (FDA) pone per trasfondere unit di sangue tenute a temperatura ambiente, in sistema aperto. La maggior parte dei filtri standard sono costruiti per filtrare da 2 a 4 unit di
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selettivi o qualsiasi altro filtro capace di rimuovere i leucociti non devono essere utilizzati per trasfusioni di concentrati granulocitari 29(p18). stata segnalata30 la comparsa di emolisi con luso di filtri per microaggregati. Filtri per la leucodeplezione Particolari filtri, di terza generazione, sono in grado di ridurre, in concentrati eritrocitari o in concentrati piastrinici, il numero dei leucociti a meno di 5 x 106, un livello che riduce il rischio di alloimmunizzazione HLA e la trasmissione di citomegalovirus, nonch lincidenza di reazioni trasfusionali febbrili non emolitiche31-35 (vedi anche i Capitoli 8, 21 e 27). Questi filtri contengono strati multipli di fibre sintetiche (del tipo tessuto nontessuto), che trattengono, selettivamente, i leucociti ma consentono il passaggio di globuli rossi o di piastrine, in base al tipo di filtro. La selettivit basata sulle dimensioni delle cellule, sulla tensione superficiale, sulle differenze della carica elettrica di superficie, sulla densit delle cellule ematiche e, in certo qual modo, sulle propriet dinterazione cellula-cellula o di attivazione/adesione cellulare36. Dato che i filtri per i concentrati eritrocitari e quelli per i concentrati piastrinici non impiegano la stessa tecnologia di leucodeplezione e richiedono modalit diverse di attivazione e di flusso, essi vanno impiegati soltanto per filtrare gli emocomponenti cui sono destinati e secondo le istruzioni dei produttori37. Luso di questi filtri al letto del malato assai pi complicato di quello dei filtri standard. I filtri bedside sono costosi, possono essere inadeguati e si possono intasare, se usati in modo scorretto 38-40 . Quelli progettati soltanto per trasfusioni per gravit non dovrebbero comprendere pompe o essere impiegati sotto pressione. importante pianificare un programma di controllo di qualit che misuri il livello di leucodeplezione, ma questo non possibile al letto del malato; di conseguenza, si rende necessaria una stretta aderenza a un protocollo appropriato. Riscaldatori per il sangue auspicabile che lo staff medico di un Servizio Trasfusionale partecipi alla valutazione e alla
scelta delle apparecchiature trasfusionali e che tali argomenti siano compresi nei programmi di garanzia di qualit. Le prestazioni di strumenti come i riscaldatori per il sangue o le pompe da infusione devono essere validate prima che tali apparecchi siano usati, devono essere sistematicamente monitorate per evidenziare eventuali malfunzionamenti e per assicurare un loro congruo uso. Ci richiede, ovviamente, la cooperazione fra gli appartenenti a dipartimenti diversi: medici trasfusori, infermieri, anestesisti, addetti ai controlli di qualit, bio-ingegneri. I pazienti che ricevono sangue o plasma con flussi superiori a 100 mL/minuto per pi di 30 minuti sono ad aumentato rischio di arresto cardiaco, a meno che il sangue non sia stato riscaldato41. Linfusione rapida di grandi quantit di sangue refrigerato pu far abbassare la temperatura del nodo seno-atriale al di sotto dei 30 C e, a questo punto, pu intervenire aritmia cardiaca. Trasfusioni a un tale rapido flusso generalmente si effettuano in sala operatoria o in reparti di traumatologia. Non vi sono evidenze che trasfusioni da 1 a 3 unit nel corso di parecchie ore comportino il rischio di aritmia; non viene, quindi, raccomandato luso routinario di sangue riscaldato 42 . Sono disponibili diversi tipi di riscaldatori: bagnomaria a termostato controllato, forni a secco con piastre elettriche, scambiatori di calore in controcorrente con camere dacqua per i grandi volumi43. I riscaldatori non devono raggiungere temperature tali da provocare emolisi28(p6). Le apparecchiature dovrebbero possedere termostati visibili e, possibilmente, un allarme sonoro che entri in funzione prima che venga superato il limite di temperatura fissato dal produttore dellapparecchio. Le procedure operative per riscaldare il sangue dovrebbero comprendere anche linee guida sulle temperature e sul controllo degli allarmi, nonch istruzioni relative alle azioni da intraprendere quando i riscaldatori sono fuori fase o quando si attivano gli allarmi44. I forni convenzionali e gli strumenti a microonde per scongelare il plasma non sono concepiti per riscaldare altri emocomponenti e possono danneggiare gli eritrociti.
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Strumenti elettromeccanici per trasfondere Le pompe meccaniche, che permettono infusioni a ritmo controllato e a bassa velocit, sono utili per trasfusioni pediatriche in neonati o in particolari e selezionati pazienti. Alcune pompe usano strumenti meccanici a vite per avanzare lo stantuffo di una siringa piena di sangue. Altri strumenti simili utilizzano pompe rotanti o differenti forme di pressione applicate ai tubi da infusione. Bench alcuni di questi sistemi possano essere impiegati con i comuni set da infusione standard, molti richiedono speciali apparecchiature di plastica monouso o tubi da infusione forniti dai produttori. Possono essere aggiunti filtri a monte della pompa. Si dovrebbe consultare il produttore prima di trasfondere sangue con pompe da infusione destinate a soluzioni cristalloidi o colloidi. Molte di queste pompe possono causare emolisi, ma una larga parte di esse non arreca danni al paziente43. pi probabile che vadano incontro a emolisi i concentrati eritrocitari ad alto ematocrito e ad alta viscosit, quando infusi sotto pressione, piuttosto che le unit di sangue intero o i concentrati eritrocitari preparati in modo tale da ridurre la viscosit come quelli che contengono soluzioni additive43. I concentrati piastrinici e i concentrati granulocitari non sembrano subire effetti negativi quando sono infusi sotto pressione 46,47. Un opportuno addestramento del personale e procedure appropriate per mantenere e controllare la qualit dovrebbero essere in grado di ridurre i danni agli emocomponenti trasfusi. Apparecchiature per esercitare pressioni Situazioni che richiedono di trasfondere con urgenza possono avere necessit di flussi dinfusione pi veloci di quelli offerti dalla sola gravit. Il metodo pi semplice per velocizzare una trasfusione utilizzare set di somministrazione con una pompa in linea, schiacciata manualmente dal medico trasfusore. Sono anche disponibili sacche speciali progettate come strumenti per comprimere. Questi apparecchi agiscono come cuffie di compressione, con la differenza che fanno parte integrante della sacca e applicano la pressione in modo uniforme su tutta la superficie
del contenitore. Questi dispositivi devono essere accuratamente monitorati durante il loro utilizzo, perch pressioni maggiori di 300 mmHg possono causare danni alla sacca sino a rotture o a perdite: in tali casi lembolia gassosa diventa un problema.Tradizionalmente, si raccomanda, per gli accessi venosi, limpiego di aghi a largo diametro, quando previsto luso di pressioni estreme, ma alcuni dati recenti mettono in discusiione questa pratica11. stato dimostrato45 che forzare manualmente linfusione di emazie attraverso un ago a diametro piccolo pu causare emolisi. I dispositivi per la raccolta intra-operatoria e post-operatoria di sangue sono discussi al Capitolo 5. Compatibilit fra soluzioni endovenose Gli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali 29(p48) e la Circolare Informativa sullUso del Sangue Umano e degli Emocomponenti48 sono espliciti nellaffermare che nessun farmaco deve essere aggiunto al sangue o agli emocomponenti. Se i concentrati eritrocitari devono essere diluiti per ridurne la viscosit o se un emocomponente deve essere raccolto dalla sacca o dai tubi di infusione per risciacquatura, si pu utilizzare la soluzione fisiologica (0,9% di NaCl). I concentrati eritrocitari in soluzioni additive non richiedono, usualmente, di essere diluiti. Di solito, questi concentrati hanno un ematocrito di circa il 60%. Altre soluzioni a uso endovenoso possono essere aggiunte al sangue o possono entrare in contatto con il sangue, soltanto se questo loro utilizzo stato approvato dalla FDA o se si documentato che la loro aggiunta al sangue sicura ed efficace29(p6),48. Possono anche essere impiegate soluzioni di elettroliti, prive di calcio e isotoniche, ma spesso costano pi della soluzione fisiologica e offrono scarsi benefici in campo trasfusionale. Non si dovrebbero aggiungere al sangue soluzioni di ringer lattato, di destrosio al 5% o soluzioni fisiologiche ipotoniche. Le soluzioni di destrosio possono causare lagglutinazione delle emazie nei tubi e, cosa pi importante, il loro rigonfiamento e lemolisi, quando il destrano e lacqua associata si diffondono dal mezzo
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allinterno delle cellule. La soluzione di ringer lattato contiene calcio ionizzato in quantit tale (3 mEq/mL) da superare gli agenti chelanti nelle soluzioni anticoagulanti-conservative o in quelle additive, cos da indurre la formazione di coaguli49-51. Assistenza al paziente durante le trasfusioni Il medico trasfusore deve essere presente o in una posizione tale da osservare strettamente il paziente, almeno per i primi 15 minuti di una trasfusione. La trasfusione va iniziata lentamente, a un ritmo di circa 2 mL/minuto, a meno che non sia urgente ristabilire la volemia. Le gravissime reazioni emolitiche acute, quelle anafilattiche, da TRALI o dovute a contaminazione batterica possono comparire dopo che sono state infuse quantit anche minime di sangue (vedi Capitolo 27). Dopo i primi 15 minuti alcune strutture controllano i parametri vitali, ma ci non si rende necessario, se le condizioni del ricevente sono soddisfacenti. Il flusso della trasfusione pu essere aumentato secondo quanto specificato nella richiesta o per essere conforme alle pratiche dellistituzione (approssimativamente a 4 mL/minuto). Il flusso consigliabile dipende dalla volemia del paziente, dalle sue condizioni cardiache e da quelle emodinamiche. Non esistono dati clinici o sperimentali a supporto di una specifica limitazione del tempo di infusione; la citata Circolare di Informativa48 stabilisce, tuttavia, che una trasfusione duri, al massimo, 4 ore. Il tempo massimo di infusione non dovrebbe essere confuso con i tempi raccomandati. La maggior parte delle trasfusioni di concentrati eritrocitari si esegue in 1-2 ore, mentre le trasfusioni di concentrati piastrinici o di plasma sono usualmente somministrate in tempi assai pi brevi (da 30 a 60 minuti). Non vi sono, tuttavia, motivi fisiologici per somministrare concentrati eritrocitari a un flusso pi lento rispetto alla somministrazione di concentrati piastrinici o di plasma e una rapida infusione di questultimi emocomponenti pu aumentare il rischio di reazioni sfavorevoli. Se si rende necessaria uninfusione veloce, gli emocomponenti possono essere trasfusi tanto rapidamente quanto lo permettono il sistema
circolatorio del paziente e il tipo di accesso venoso. Se preventivato che il tempo di infusione sia maggiore di 4 ore, si deve informare il responsabile del Servizio Trasfusionale, perch valuti questa specifica situazione clinica. I flussi di somministrazione si calcolano contando le gocce per minuto nella camera di gocciolamento e dividendo tale numero per il tasso goccia/mL del sistema di infusione. Il sangue pu scorrere pi lentamente di quanto desiderato, a causa di ostruzioni nel filtro o per eccessiva viscosit del componente. I passi per analizzare e correggere i problemi sono i seguenti: alzare il contenitore per aumentare la pressione idrostatica; controllare la perviet dellago; esaminare il filtro di somministrazione per evidenziare una eccessiva presenza di frammenti; prendere in considerazione laggiunta, a un concentrato eritrocitario, da 50 a 100 mL di fisiologica, se esiste una prescrizione che lo consente. Il personale con compiti clinici dovrebbe continuare a sorvegliare il paziente durante la trasfusione (periodicamente, per esempio ogni 30 minuti) e fino a unora dopo che questa terminata. Comportamenti in caso di sospette reazioni La maggior parte delle trasfusioni procede senza complicazioni, ma, quando interviene una reazione sfavorevole, il medico e gli infermieri devono essere pronti ad attivarsi immediatamente. Diversi sono i tipi di reazione: la loro eziologia, la sintomatologia, il trattamento e la prevenzione sono discussi al Capitolo 27. Dato che la gravit di una reazione varia in modo significativo e la sintomatologia non specifica, si deve monitorare ogni trasfusione, che va fermata immediatamente quando si sospetta una reazione. Pu essere utile elencare, nel modulo trasfusionale che accompagna lunit, le comuni sintomatologie e i provvedimenti da assumere immediatamente. Ci elimina la necessit di cercare le istruzioni al riguardo e aiuta a standardizzare il trattamento del paziente, in situazioni durgenza.
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Eventi che seguono la trasfusione

Dopo che una trasfusione terminata, il personale dovrebbe controllare i parametri clinici vitali del ricevente, registrare i tempi di infusione, il volume e il tipo dellemocomponente trasfuso, annotare le condizioni cliniche del paziente, scrivere lidentit della persona che ha terminato la trasfusione (se non il medico trasfusore), fare eventuali osservazioni, misurare e registrare i parametri clinici vitali. Molti Servizi Trasfusionali richiedono che una copia del modulo di avvenuta trasfusione sia restituita al laboratorio, per documentare, nei registri del laboratorio, leliminazione dellunit. Non necessario restituire al Centro Sangue il contenitore vuoto dopo una trasfusione eseguita senza complicazioni, ma, in caso di complicanze, sacche, tubi, soluzioni impiegate devono ritornare al Servizio Trasfusionale. Alcuni servizi scelgono, in ogni modo, di far rientrate le sacche di tutte le trasfusioni, per essere in grado di investigare su possibili reazioni non evidenziate al momento della trasfusione. Nel maneggiare le sacche vuote e i set usati nelle trasfusioni, dovrebbero essere prese appropriate precauzioni sui rischi biologici. Se possibile, il ricevente dovrebbe restare sotto osservazione, una volta che la trasfusione stata completata. Dato che non tutte le reazioni serie appaiono immediatamente, a tutti i pazienti che ricevono trasfusioni in sede ambulatoriale o a domicilio, o ai loro curanti, devono essere fornite chiare istruzioni scritte relative al trattamento post-trasfusionale, una corretta descrizione della sintomatologia oggettiva e soggettiva delle reazioni acute o ritardate e dei provvedimenti da prendere in questi casi.
preparazione e la consegna dellunit, lidentificazione dellunit e del malato, la scelta e il corretto uso delle apparecchiature, per concludersi con lassistenza al paziente nel corso della trasfusione e dal mantenimento di idonee registrazioni. Le politiche, le procedure, laddestramento e le verifiche sono tutte fasi critiche dellattivit trasfusionale e devono essere monitorate come parte integrante della revisione sulluso del sangue. Allo scopo di individuare lesistenza di non-conformit, si dovrebbero eseguire periodiche revisioni delle procedure di assegnazione del sangue e dei moduli utilizzati. Gli errori, a prescindere dalle conseguenze cliniche dovrebbero essere soggetti a unanalisi delle cause prime, dato che tali errori spesso indicano problemi nel sistema.
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Garanzia di qualit
La somministrazione di emocomponenti dovrebbe iniziare e terminare tenendo in considerazione la sicurezza del ricevente, cominciando con una richiesta appropriata per continuare con la raccolta dei campioni pre-trasfusionali di sangue del paziente, con la
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Capitolo 23: Problemi perinatali nella pratica trasfusionale
Capitolo 23
Problemi perinatali nella pratica trasfusionale
Per un Servizio Trasfusionale, la gravidanza pone alcuni specifici problemi immunoematologici. La gravida pu presentare alloimmunizzazione agli antigeni presenti nelle cellule fetali e, a sua volta, il feto pu essere danneggiato dagli anticorpi materni, indotti da precedenti gravidanze, da precedenti o da recenti trasfusioni, o, infine, dalla gravidanza in atto. In questo capitolo viene trattata la malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN) e la trombocitopenia neonatale alloimmune (TNAI), i due principali problemi immunoematologici del periodo perinatale. inclusa anche una sintetica discussione sulla trombocitopenia neonatale, secondaria alla porpora trombocitopenica idiopatica materna.
Malattia emolitica del feto e del neonato

Nella MEFN, le emazie fetali sono rivestite da anticorpi materni (IgG) diretti contro gli antigeni che il feto ha ereditato dal padre e che sono assenti sugli eritrociti della madre. Le IgG che ricoprono le emazie del feto possono accelerarne la distruzione prima o dopo la nascita, ma la gravit della malattia pu variare da semplici anormalit sierologiche individuate nel neonato asintomatico sino alla morte intrauterina. Fisiopatologia Unaumentata distruzione eritrocitaria stimola la produzione di globuli rossi, molti dei quali entrano prematuramente in circolo come cellule
nucleate, da cui il termine di eritroblastosi fetale. I feti seriamente affetti possono sviluppare un edema generalizzato, denominato idrope fetale. Nella MEFN da anticorpi anti-D, leritropoiesi epatica pu essere cos estesa da danneggiare il circolo portale ed alterare la sintesi di albumina, con conseguente riduzione della pressione colloido-osmotica del plasma. Lanemia grave pu causare scompenso cardiocircolatorio, ipossia tessutale e morte in utero. In tali situazioni, le trasfusioni intrauterine possono essere salvavita. Se vivo, il neonato pu presentare grave anemia e scompenso cardiaco1. Nei neonati colpiti da forme meno gravi la distruzione eritrocitaria continua dopo la nascita, con conseguente produzione di grandi quantit di bilirubina. A differenza della MEFN dovuta ad anti-D, quella causata da anti-K1 determina la soppressione delleritropoiesi fetale, in aggiunta alla distruzione dei globuli rossi nel circolo periferico2. Prima che con la nascita si interrompa la comunicazione fra la circolazione materna e quella fetale, la bilirubina fetale viene metabolizzata dal fegato materno. Dopo la nascita, il fegato immaturo del neonato incapace di coniugare (con lacido glicuronico) la grande quantit di bilirubina prodotta dalla distruzione dei globuli rossi, ricoperti da anticorpo. La bilirubina non coniugata (o diretta) tossica per il sistema nervoso centrale (SNC), e determina un danno al cervello, noto come kernittero. Per il neonato affetto da MEFN e con un aumentato livello di bilirubina non coniugata, il kernittero pone problemi clinici pi gravi di quelli determinati dallanemia3.
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La prematurit, lacidosi, lipossia e lipoalbuminemia aumentano il rischio di danni al sistema nervoso centrale. Le decisioni di eseguire unex-sanguino trasfusione o meno, legata principalmente al livello della bilirubina, piuttosto che alla gravit dellanemia. Recentemente, lAccademia Americana di Pediatria ha emanato delle linee guida4 sulla prevenzione e sulla gestione delliperbilirubinemia in neonati nati dopo la 35a di gestazione. Meccanismo dellimmunizzazione materna La MEFN viene spesso classificata in tre categorie, sulla base della specificit degli anticorpi IgG che la causano. In ordine decrescente di potenziale gravit, si distinguono tre categorie: 1. MEFN causata da anticorpi anti-D isolati o, meno frequentemente, associati ad anti-C o anti-E (il sistema Rh discusso, molto dettagliatamente, al Capitolo 14); 2. malattie emolitiche da anticorpi diretti verso altri antigeni del sistema Rh o verso antigeni di altri sistemi: gli anticorpi anti-c e anti-K1 sono quelli pi frequentemente implicati; 3. MEFN da anticorpi anti-A,B in madre di gruppo O, oppure da anticorpi anti-A o anti-B isolati. In tutte le forme di MEFN, eccetto quelle da ABO, la presenza di anticorpi materni sono il segno di unalloimmunizzazione causata da gravidanze o da trasfusioni. Si pu documentare linnalzamento del titolo degli anticorpi, almeno nella prima gravidanza coinvolta, e il neonato pu essere sintomatico alla nascita in seguito agli effetti subiti in utero. Al contrario, lincompatibilit materno-fetale ABO non pu essere diagnosticata durante la gravidanza e il neonato raramente sintomatico alla nascita. Gravidanza, come stimolo immunizzante La gravidanza causa immunizzazione quando i globuli rossi fetali, in possesso di un antigene paterno non presente nella gestante, entrano nel circolo materno, in seguito ad unemorragia feto-materna (EFM). EFM intervengono nella stragrande maggioranza delle gravidanze, di solito nel terzo trimestre o nel corso del parto6. Il parto levento immunizzante
pi comune, ma emazie fetali entrano nel circolo materno anche dopo amniocentesi, aborti spontanei o indotti, prelievo di villi coriali, cordocentesi, rotture di gravidanze ectopiche e violenti traumi addominali. Specificit immunogeniche. Lantigene che induce pi frequentemente immunizzazione lantigene D, ma, in teoria, ogni antigene gruppoematico eritrocitario, presente sulle emazie fetali e assente su quelle materne, pu stimolare la produzione di anticorpi. Uno studio retrospettivo ha accertato che esiste, in gravidanza, unincidenza dello 0,24% nella produzione di anticorpi clinicamente significativi, esclusi quelli anti-D. Dato che gli altri antigeni eritrocitari sono meno immunogeni del D, molto probabile che limmunizzazione derivi dal contatto con grandi quantit di emazie, come pu avvenire per una trasfusione. Limmunizzazione allantigene D, daltro canto, pu essere indotta da volumi di sangue fetale inferiori a 0,1 mL7. Frequenza di immunizzazione. La probabilit di unimmunizzazione anti-D in relazione alla quantit di emazie D positive entrate nel circolo di una madre D negativa6. Lincidenza globale di una sensibilizzazione anti-D in donne D negative, non profilassate e madri di neonati D positivi, di circa il 16%. Nell1,5-2% dei casi, la sensibilizzazione avviene al momento del loro primo parto, un altro 7% si sensibilizza entro sei mesi dal parto e il restante 7% si sensibilizza nel corso di una seconda gravidanza D positiva8. La sensibilizzazione durante questa seconda gravidanza riflette, probabilmente, limmunizzazione primaria intervenuta durante la prima gravidanza D positiva, con parto avvenuto, peraltro, senza evidenziare un livello individuabile di anticorpi. Lo scarso numero di emazie fetali che entra in circolo nei primi tempi della successiva gravidanza D positiva rappresenta uno stimolo secondario sufficiente a suscitare una chiara produzione di IgG anti-D. In donne D negative, che non si immunizzano dopo due gravidanze D positive, le successive gravidanze possono portare a una produzione di anticorpi anti-D, ma con unincidenza sempre minore.
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La frequenza dei pi comuni genotipi riguardanti soggetti D positivi riportata nella Tabella 14.4. Questa tabella pu essere utilizzata per avere unidea generale della probabilit con la quale un figlio, con un padre D positivo e una madre D negativa, esprimer lantigene D. Una volta instauratasi unimmunizzazione, le successive gravidanze D positive manifesteranno MEFN di gravit crescente, in particolare fra la prima e la seconda delle gravidanze coinvolte. Dopo la seconda gravidanza D positiva, la storia predittiva sullesito, sebbene, in rari casi, alcune donne abbiano, in successive gravidanze, quadri clinici di malattia stabili o anche meno gravi. Effetto dellincompatibilit ABO. Limmunizzazione Rh di donne non profilassate avviene meno frequentemente, dopo il parto di un neonato D positivo ABO incompatibile, di quanto avviene quando le emazie fetali sono ABO compatibili con quelle materne. Lincompatibilit ABO fra madre e feto esercita un sostanziale, anche se non assoluto, effetto protettivo nei riguardi dellimmunizzazione materna, a causa dellaumentata distruzione delle emazie fetali da parte degli anticorpi anti-A o anti-B. Il tasso di immunizzazione scende dal 16 all1,5-2%. La trasfusione come stimolo immunizzante estremamente importante evitare di trasfondere sangue D positivo a bambine o donne in et fertile in quanto gli anticorpi anti-D indotti da trasfusioni causano, tipicamente, forme gravi di MEFN nelle successive gravidanze con feto D positivo. Anche gli eritrociti presenti nei concentrati piastrinici o granulocitari possono costituire uno stimolo immunizzante; se necessario luso, in giovani donne D negative, di tali emocomponenti, provenienti da donatori D positivi, si dovrebbe prendere in considerazione limmunoprofilassi anti-Rh: il problema pi ampiamente discusso al Capitolo 21. Il rischio di immunizzazione ad antigeni diversi dal D, dopo trasfusioni allogeniche di concentrati eritrocitari, stata valutata fra l1 e il 2,5%, nella popolazione ospedaliera globale7. Il feto sar danneggiato nel solo caso che gli anticorpi
siano IgG e diretti contro un antigene presente sulle sue emazie. Per una coppia che programmi la nascita di un figlio, la donna non dovrebbe essere trasfusa con eritrociti provenienti dal partner o da un suo consanguineo. Questa forma di donazione dedicata accresce il rischio che la madre si sensibilizzi agli antigeni del padre (eritrocitari, leucocitari o piastrinici), con conseguenti citopenie alloimmuni nei figli che portano gli stessi antigeni paterni. I programmi che utilizzano i genitori come donatori dedicati per i loro neonati ammalati meritano una speciale considerazione a causa di questo problema generato dal forte desiderio dei genitori di donare il proprio sangue 9,10. Anticorpi ABO Gli anticorpi IgG, che provocano una MEFN da incompatibilit ABO, si ritrovano quasi sempre nel circolo materno senza che vi sia stato un precedente contatto con le emazie. Una MEFN da ABO pu intervenire in qualsiasi gravidanza, compresa la prima. Interviene, quasi sempre, in neonati di gruppo A o B, nati da donna di gruppo O, dato che i soggetti di gruppo O formano IgG anti-A,B. Madri di gruppo A o B con feti A- o B incompatibili formano di solito IgM, con soltanto piccole quantit di IgG in grado di superare la barriera placentare. Valutazioni prenatali Anamnesi materna Nella valutazione dei rischi fetali, raccogliere notizie su precedenti gravidanze o trasfusioni riveste unimportanza essenziale. Test invasivi, che comportano rischi per il feto, dovrebbero essere effettuati solamente in gravidanze nelle quali il feto a rischio di MEFN, in base alle notizie anamnestiche o agli esami sierologici. Per una donna con storia di un neonato con idrope fetale da anti-D, vi il 90% e pi di probabilit che il feto successivo sia egualmente colpito5. Inversamente, durante la prima gravidanza con immunizzazione, la probabilit di un feto idropico va dall8 al 10%. Le esperienze con altri anticorpi
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non sono state tanto estese come quella con anticorpi anti-D. A parte quelle da anti-D, da alcune analisi si visto che gli anticorpi anti-c e anti-K1 sono stati, di gran lunga, le cause pi comuni di gravi MEFN5,11. Studi sierologici Gli anticorpi, causa di MEFN, possono essere individuti nel corso della gravidanza. Dovrebbero essere eseguite, il pi presto possibile, indagini iniziali su tutte le donne gravide. Tali indagini dovrebbero includere una tipizzazione ABO e D e una ricerca di anticorpi antieritrocitari12. Se le emazie della donna non vengono direttamente agglutinate dai sieri anti-D, non richiesto eseguire la ricerca per evidenziare il fenotipo D debole. Quando questa ricerca non viene eseguita, le donne D deboli vengono etichettate come D negative, anche se, in effetti, sono D positive; la sola potenziale conseguenza negativa che tali donne riceveranno, senza averne necessit, immunoglobuline Rh (RhIG). Quelle con alcuni fenotipi D parziali vengono, anchesse, con ogni probabilit, tipizzate come D negative nei test diretti e, in assenza di un test per il D debole, anche queste donne sono candidate a ricevere limmunoprofilassi antenatale con RhIG. Da quando si applicano tecniche molecolari, la conoscenza sul gene RHD si sta evolvendo. Non tutti i fenotipi D deboli sono il risultato di unespressione ridotta dellantigene D, ma alcuni, piuttosto, presentano proteine RhD alterate. Di conseguenza, questi soggetti sono esposti a rischio di immunizzazione se vengono a contatto con lantigene D, spiegando, cos, la formazione di anticorpi anti-D da parte di alcuni pazienti classificati come D deboli. Man mano che aumentano le conoscenze sullantigene D, la distinzione fra D parziali e D deboli sta diventando sempre pi sfocata13,14. Si ignora se la profilassi su donne D parziali abbia successo. Si discute anche sulla dose appropriata. Ne consegue che alcuni medici somministrano RhIG a queste donne, mentre altri ritengono ci non necessario. rarissimo che una donna D parziale produca, in seguito a una
gravidanza, anticorpi anti-D. Se si esegue la ricerca del D debole e il test chiaramente positivo, la donna dovrebbe essere considerata D positiva. Qualora la ricerca non sia eseguita, le donne, le cui emazie non reagiscono nel test diretto con anti-D, possono essere considerate come candidate allimmunoprofilassi con RhIG. Per evitare confusioni nella valutazione di una EFM nelle indagini post-partum, alcuni laboratori continuano a effettuare il test per il D debole12. Il Capitolo 14 riporta argomenti molto pi esaurienti e completi sul sistema Rh. Una donna dovrebbe essere considerata D positiva quando i test per lantigene D o per il fenotipo D debole sono positivi. Se una donna D negativa ha una ricerca di anticorpi inizialmente negativa, il test pu essere ripetuto alla 28a settimana di gestazione, prima di somministrarle RhIG, per evidenziare una eventuale sensibilizzazione che si sia sviluppata prima della 28a settimana, seguendo le raccomandazioni AABB. Dato che leventualit di unimmunizzazione, prima della 28a settimana, estremamente bassa, l American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG, Collegio Americano degli Ostetrici e dei Ginecologi) sottolinea che non esistono dati a sostegno di un efficace rapporto costo-benefico di questa pratica15. Si possono raccomandare ripetute ricerche anticorpali in donne D positive quando vi una storia di presenza di anticorpi clinicamente significativi con MEFN, di precedenti trasfusioni, di traumi addominali. Specificit degli anticorpi. Ogni test di screening positivo per la presenza di anticorpi antieritrocitari, richiede lidentificazione della specificit anticorpale12. La sola presenza di un anticorpo non significa, peraltro, che si avr una MEFN. Le IgM, soprattutto quelli con specificit anti-Lea e anti-I, relativamente comuni in corso di gravidanza, non superano la barriera placentare. Inoltre, le emazie fetali possono non presentare lantigene corrispondente allanticorpo materno. La probabilit di un coinvolgimento del feto pu essere predetta con la tipizzazione degli eritrociti paterni 16. I referti di laboratorio dovrebbero
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contenere informazioni sufficienti ad aiutare il clinico nel determinare la significativit dellanticorpo identificato. Tipizzazione eritrocitaria del feto. Il fenotipo D del feto pu essere determinato utilizzando la PCR (Polymerase chain reaction), che amplifica il DNA fetale ottenuto dal liquido amniotico o dal campionamento dei villi coriali, oppure dalla tipizzazione sierologica di emazie fetali ottenute per cordonocentesi 17 . Si dissuade dal campionamento dei villi coriali (villocentesi), perch ci pu causare emoraggia feto-materna ed stato spesso associato a forme gravi di MEFN. Viene raccomandato lesame del liquido amniotico, piuttosto che la cordonocentesi, che determina, quattro volte tanto (se non di pi), la perdita del feto18. Luso di tecniche biomolecolari pu essere di grande aiuto nellidentificare eventuali varianti del gene RHD, che possono sfuggire a una ricerca sierologica. preferibile che i campioni di sangue della madre e del padre accompagnino i campioni di sangue fetale19. Una tipizzazione del DNA fetale anche disponibile per gli antigeni Jka/Jkb20, K1/K2 21, c 22 ed E/e 23. Recenti sviluppi sulla tipizzazione D del feto consistono nellisolamento, dal siero materno, di DNA fetale libero. Nonostante attualmente non sia di facile disponibilit negli USA, questa tecnica probabilmente rimpiazzer, nel prossimo futuro, lamniocentesi al fine di eseguire le genotipizzazioni fetali24. Titolazioni degli anticorpi materni Le titolazioni anticorpali possono favorire le decisioni sullesecuzione e sul momento di attuare procedure invasive, specialmente se lanticorpo anti-D. Il titolo anticorpale dovrebbe essere determinato nel primo trimestre e servire da dato di partenza iniziale, e il campione di siero dovrebbe essere congelato per le comparazioni future (vedi Metodo 5.3)7. Dato che le indagini invasive non possono essere intraprese prima della 16a-18a settimana di gestazione, non indicato eseguire ulteriori titolazioni sino a questo tempo. Il vero significato del titolo anticorpale nel siero materno controverso, in quanto alcuni studi hanno
dimostrato che esiste una scarsa correlazione fra il livello del titolo e gli effetti sul feto. Non sono stati individuati livelli critici per gli anticorpi diversi dallanti-D, sebbene vengano spesso utilizzati livelli critici del tutto similari25. Si continua a seguire tale comportamento, dato che si tratta di sistemi non invasivi, utili a valutare presenza e severit dellalloimmunizzazione. Se si eseguono le titolazioni, importante che quelle successive vengano effettuate con la stessa tecnica e con emazie dello stesso fenotipo delle emazie test usate in precedenza. Testare i campioni di siero materno congelato in parallelo con quello attuale minimizza le variazioni nei risultati dei titoli, che possono essere indotte dalluso di tecniche differenti. Ogni struttura dovrebbe scegliere il livello critico di anti-D (quello, al disotto del quale una MEFN o lidrope fetale vengono ritenuti cos improbabili da non richiedere ulteriori procedure invasive), che viene individuato, di solito, in un titolo di 1/16 o di 1/32 nelle ricerche allantiglobulina26,27. Si raccomanda di controllare, ripetendo i test, tutti i casi con un titolo superiore a 826. Il titolo critico per anticorpi anti-K1 pu essere inferiore a quello degli anticorpi anti-D e viene fissato, di solito, a 825,28. Non si raccomanda, al momento, di utilizzare per le titolazioni la tecnica di gel-sedimentazione, considerato che mancano dati in grado di dimostrare una correlazione fra i titoli in gel e quelli in fase liquida12. Altri criteri per valutare la gravit di una MEFN Sono state analizzate diverse procedure di laboratorio per migliorare laccuratezza delle predizioni sulla gravit della MEFN29. Il titolo degli anticorpi, discusso qui sopra, non sempre affidabile, n lo sono le sue variazioni. Sono stati analizzati test funzionali, come ad esempio i test di aderenza, di fagocitosi, di citotossicit anticorpo-mediata e di chemiluminescenza, ma il loro utilizzo assai limitato e resta controverso. Queste procedure vengono, di solito, eseguite in centri di riferimento e possono rivelarsi utili, quando sono richieste informazioni aggiuntive, per la gestione di casi difficili e complessi.
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Analisi del liquido amniotico Un buon indice di emolisi intrauterina e di benessere del feto il livello di bilirubina trovato nel liquido amniotico, ottenuto per amniocentesi. Lamniocentesi viene eseguita, di solito, nelle gravide alloimmunizzate, che hanno unanamnesi di gravidanze con feti affetti da MENF e un titolo di anticorpi pari o superiore a quello ritenuto critico28. Dato che lanemia fetale secondaria ad unalloimmunizzazione anti-K1 non sempre si associa a livelli elevati di bilirubina nel liquido amniotico, si raccomanda di usare un campione di sangue fetale al posto del liquido amniotico, quando si evidenzia un anti-K1 in una gravida2. Il liquido amniotico si ottiene inserendo un lungo ago attraverso la parete addominale e lutero per giungere alla cavit uterina, sotto costante guida di un apparecchio a ultrasuoni. Il liquido viene analizzato allo spettrofotometro a lunghezze donda comprese fra 350 e 700 nm. Il picco di assorbimento della bilirubina a 450 nm.
Un aumento della densit ottica dalla linea basale di 450 nm (o OD450) misura la concentrazione del pigmento biliare30,31. Il valore della OD450 viene espresso su un grafico contro il tempo stimato della gestazione, in quanto la concentrazione della bilirubina ha un diverso significato clinico a seconda del periodo della gravidanza. Per molti decenni si utilizzato lo schema di Liley (Figura 23.1)31 per predire, sulla base della OD450, la gravit della malattia fetale. Lo schema include tre zone: la zona in alto (o zona 3) indica una forma grave; la zona in basso (o zona 1) indica che non vi malattia o che questa moderata; la zona intermedia (o zona 2) indica la necessit di ripetute determinazioni per stabilire come orientarsi. Il metodo viene applicato a partire dalla 27 a settimana sino al termine della gravidanza. Queenan et al.32 hanno proposto un sistema di gestione delle gravidanze con immunizzazione anti-D, basto sullanalisi della OD450 a partire dalla 14a settimana di gestazione.
Figura 23.1 - Schema di Liley sui dati raccolti dagli studi del liquido amniotico. Si dovrebbe eseguire una trasfusione intrauterina quando il valore di OD450 si trova nella parte alta (top zone) prima della 32a settimana di gestazione. Dopo la 34a settimana i valori nella zona alta indicano di procedere al parto immediato. Fra la 32a e la 34a settimana la scelta fra trasfusione intrauterina o parto immediato dipendono dagli studi della maturit fetale.Da Liley, adattamento autorizzato31.
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Figura 23.2 - Valutazione prognostica in base ai dati del OD450 (da Queenan et al32, riproduzione autorizzata). Essi identificano 4 zone (Figura 23.2), raccomandando un precoce intervento invasivo se i valori della OD450 cadono nella zona pi alta. Con entrambi i metodi, la gravit di una MEFN viene predetta con maggiore accuratezza eseguendo misurazioni in serie della OD450 (piuttosto che con una sola osservazione), potendo cos valutare se i valori decrescono, sono stabili o aumentano. In generale, pi alta la concentrazione della bilirubina, pi grave lemolisi intrauterina. importante effettuare un controllo ecografico per stabilire lesatta et gestazionale, cos da poter interpretare i test e poter stabilire una terapia appropriata per particolari valori della OD450. Alternativamente, un valore della OD450, che si ponga nella zona alta o in quella intermedia dello schema di Liley, indica la necessit di ricorrere a un campione di sangue fetale. Lamniocentesi, in particolare quando lago attraversa la placenta, o la cordonocentesi possono causare EFM, che pu incrementare il titolo degli anticorpi o indurre immunizzazione verso ulteriori antigeni gruppoematici18. Quindi, quando amniocentesi o cordonocentesi vengono effettuate in gravide D negative senza anticorpi, dovrebbe essere eseguita limmunoprofilassi. Campionamento percutaneo del sangue cordonale Nei primi anni 80, limpiego di sofisticati strumenti a ultrasuoni ha reso possibile posizionare un ago allinterno di un vaso del cordone ombelicale, preferibilmente la vena, alla sua inserzione nella placenta, per ottenere un campione di sangue fetale. Il campionamento percutaneo del sangue cordonale (o cordonocentesi) permette di misurare direttamente alcuni parametri ematologici e biochimici. La determinazione dellematocrito fetale fornisce unaccurata verifica della gravit dellemolisi nel feto18. importante accertarsi che il campione ottenuto provenga sicuramente dal feto. Le emazie del feto possono essere distinte da quelle della madre, per le differenti dimensioni, per il fenotipo gruppoematico e per la presenza di emoglobina fetale33.
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stato riportato che il campionamento del sangue fetale intrauterino comporta una mortalit del feto che va dall1 al 2%34 e, in pi, la procedura comporta un alto rischio di EFM. Il suo uso raccomandato soltanto in certe circostanze, quando gli esami sul liquido amniotico indicano una grave MEFN, quando presente idrope, quando il titolo degli anticorpi anti-D alto o si sta incrementando, quando vi sono state MEFN in precedenti gravidanze. Oltre allimpiego diagnostico, la cordonocentesi consente il trattamento terapeutico del feto. Studi sul flusso sanguigno mediante doppler Considerando che lanemia fetale comporta un aumento della gittata cardiaca, diversi ricercatori hanno misurato le velocit del flusso sanguigno nel feto, utilizzando lultrasonografia doppler per valutare lo stato clinico del feto in maniera non invasiva18,35. Studi recenti34 hanno confermato che esiste una buona correlazione fra il picco di velocit del flusso di sangue nellarteria cerebrale media (ACM), lemoglobina fetale e i valori di OD450. Molti centri utilizzano un valore di picco sistolico nellACM superiore di una volta e mezzo la media per procedere a verificare, con la cordonocentesi, se il feto anemico. In questi centri, lamniocentesi viene effettuata soltanto dopo la 35a settimana di gestazione, quando il doppler ACM si associa a unalta incidenza di risultati falsamente positivi per la diagnosi di anemia fetale (Moise K., comunicazione personale). Soppressione dellalloimmunizzazione materna Sono stati tentati molti approcci per sopprimere lalloimmunizzazione materna, due dei quali riportano un modesto beneficio clinico riducendo il livello del titolo anticorpale: lesecuzione intensiva di plasmaexchange e la somministrazione di immunoglobuline endovena (IGIV)5,18. Lo scambio plasmatico in grado di ridurre il livello degli anticorpi sino al 75%; sfortunatamente, per, si assiste, di solito, a un effetto rebound, perch gli anticorpi IgG sono principalmente extravascolari ed lesposizione allantigene pu essere continua.
Il plasmaexchange stato proposto come mezzo per ritardare gli interventi sul feto, specialmente quando vi stata una gravidanza precedentemente complicata da unidrope fetale precoce 37 . In tale situazione, lo scambio plasmatico pu ritardare, sino al secondo trimestre, la necessit di interventi invasivi. Sia lAABB che la Societ Americana di Aferesi considerano il plasmaexchange come un trattamento di III categoria, dato che non sono state provate n efficacia n sicurezza per questa indicazione (vedi Capitolo 6). Con le trasfusioni intrauterine (TIU) sempre pi sicure, guidate da apparecchiature a ultrasuoni e con la diminuita incidenza di MEFN ottenuta con limmunoprofilassi, limpiego dello scambio plasmatico, come mezzo terapeutico, andato via via diminuendo. Linfusione endovenosa di immunoglobuline ha mostrato di poter stabilizzare i livelli di anticorpi anti-D, con i migliori risultati ottenibili, iniziando questo trattamento prima della 28a settimana di gestazione e quando il feto non idropico38. In uno studio limitato, eseguito per verificare lefficacia delle IGIV, si dimostrato che tale infusione ben tollerata e si ottenuta una diminuzione dellemolisi39. Non chiaro il meccanismo dazione delle IGIV, sebbene esse potrebbero agire saturando i recettori Fc della placenta e inibendo il trasferimento transplacentare degli anticorpi materni, o sopprimendo la distruzione degli eritrociti rivestiti da anticorpi da parte del sistema reticoloendoteliale del feto. Una spiegazione alternativa che lintroduzione di anticorpi anti-idiotipo modifichi lanticorpopoiesi della madre. Le IGIV sono state anche utilizzate insieme al plasmaexchange per ridurre il rebound anticorpale che segue, solitamente, lo scambio plasmatico18. Fintanto che non si possono condurre studi pi ampi su sicurezza ed efficacia di questi trattamenti, la trasfusione intrauterina resta la migliore terapia standard. Trasfusione intrauterina La trasfusione intrauterina pu essere effettuata per via intraperitoneale (TIP) o, direttamente, per via intravascolare (TIV),
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attraverso la vena ombelicale. In molti casi, la TIV la procedura di scelta, anche se ci possono essere problemi di accesso che rendono preferibile la TIP. Pu anche essere utilizzata una combinazione delle due procedure, al fine di evitare variazioni in alto e in basso dellematocrito fetale tra le procedure. Raramente una TIU eseguibile prima della 20a settimana di gestazione. Una volta iniziate, le trasfusioni sono, di solito, eseguite periodicamente sino alla nascita. importante che il sangue sia disponibile e pronto, al momento della prima cordonocentesi diagnostica e per quelle successive (terapeutiche). Se viene individuata unanemia fetale, la TIU pu essere eseguita immediatamente, per minimizzare i rischi fetali. Gli intervalli fra le TIU dipendono dalla presenza (o dallassenza) di idrope, dallet gestazionale e dalla quantit di sangue trasfuso. Esiti positivi si ottengono nell80% dei casi e il 94% dei feti non-idropici sopravvive 40 . Dato che le TIU comportano la perdita del feto nell1-2% dei casi, esse devono essere eseguite soltanto dopo accurate valutazioni cliniche18,34,41,42. Con la TIU sono state trattate anche altre condizioni perinatali, quali le infezioni da parvovirus, le estese EFM, lalfa talassemia43. Tecniche LA TIP viene eseguita con un ago che attraversa, sotto controllo ecografico, la parete delladdome materno e giunge nella cavit addominale del feto. Le emazie infuse entrano nel circolo fetale attraverso i vasi linfatici, che drenano la cavit peritoneale. Nella TIV, si penetra la vena ombelicale, sotto controllo ultrasonico, e si aspira un campione di sangue per verificare il posizionamento (dellago) nel sistema vascolare del feto. Anche linfusione di fisiologica pu confermare un corretto posizionamento, in quanto pu essere visualizzata con gli ultrasuoni. Il sangue viene infuso direttamente, sia come in una semplice trasfusione, sia come in una exsanguino trasfusione parziale. La tecnica intravascolare particolarmente valida per le gravi forme di MEFN associate a idrope fetale.
Nei feti idropici, infatti, il sangue infuso con la TIP non viene assorbito in maniera efficace. Scelta delle emazie Gli eritrociti da utilizzare dovrebbero essere di gruppo O, D negativi o negativi per lantigene verso il quale sono diretti gli anticorpi materni, qualora la specificit non sia anti-D. Il sangue per una TIU dovrebbe essere irradiato (vedi Capitolo 27) e a basso rischio di trasmettere citomegalovirus (CMV). anche auspicabile che non possegga emoglobina S, allo scopo di trasfondere sangue con la massima capacit di trasportare ossigeno, in un ambiente a bassa tensione di O2. Per una sopravvivenza ottimale delle emazie trasfuse, il sangue impiegato in una TIU, dovrebbe essere prelevato il pi recentemente possibile, in genere da non pi di 7 giorni. Lematocrito del sangue utilizzato solitamente alto, al fine di non sovraccaricare la volemia fetale. Anche il sangue materno, lavato e irradiato, pu essere utilizzato in una TIU44. Al fine di rimuovere gli anticorpi responsabili, gli eritrociti sono lavati e risospesi in fisiologica, in modo da avere un ematocrito finale compreso fra il 75 e l85%. Sono state anche impiegate preparazioni di eritrociti lavati e deglicerolizzati al fine di rimuovere plasma, soluzioni anticoagulanti/conservanti o gli elettroliti in eccesso, che si possono accumulare nel corso di conservazioni prolungate. Il sangue delle TIU e tutti gli emocomponenti che saranno successivamente trasfusi nel periodo neonatale dovrebbero essere irradiati per prevenire la Graft versus Host Disease associata alla trasfusione, dato che il neonato si deve considerare immunologicamente vergine e tollerante45.46. Volume da somministrare Il volume da trasfondere varia secondo la tecnica impiegata, le dimensioni del feto, lematocrito (Hct) iniziale e let gestazionale. Per le TIP il volume di emazie da trasfondere (V) calcolato con la formula seguente: V = (settimane di gestazione 20) x 10 mL appare essere ben tollerato dal feto.
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Il volume di emazie da trasfondere per una TIV pu essere calcolato con la formula seguente47: Volume fetoplacentare (VFP in mL) = peso fetale stimato agli ultrasuoni (g) x 0,14 da cui: V (in mL) = VFP x Hct dopo TIV Hct prima della TIV Hct del sangue trasfuso La trasfusione viene ripetuta in base al decremento stimato dellematocrito fetale (approssimativamente 1% al giorno) nel tentativo di mantenere lematocrito del feto fra il 27 e il 30%. Valutazioni post-partum Pu essere consigliabile raccogliere nei neonati a rischio di MEFN (per esempio neonati Rh positivi nati da madre Rh negative o neonati di gruppo A o B nati da madri O) un campione di sangue cordonale, incannulando, alla nascita, un vaso ombelicale. Il campione dovrebbe essere identificato come sangue cordonale ed etichettato, in sala parto, con il nome della madre, la data e almeno due dati di identificazione del neonato (per esempio, nome e numero di registrazione sanitaria). Quando si sospetta una MEFN, si dovrebbero analizzare i campioni di sangue cordonale e di sangue materno. Se noto che la madre presenta degli anticorpi in grado di causare una MEFN, si dovrebbero anche determinare lemoglobina, lematocrito e il livello di bilirubina del sangue cordonale. Se la madre D negativa e il neonato D positivo, si dovrebbe analizzare il sangue materno per definire lentit dellEFM, come sar discusso pi avanti. Le analisi sul sangue cordonale possono presentare alcuni problemi specifici, che descriveremo di seguito. Tipizzazione ABO La determinazione ABO dei neonati viene eseguita esclusivamente con il test sugli eritrociti, in quanto nel siero del cordone sono quasi sempre presenti soltanto gli anticorpo ABO materni (IgG).
Tuttavia, quando si indaga su una possibile MEFN da incompatibilit ABO, il siero cordonale dovrebbe essere analizzato per gli anticorpi ABO che reagiscono allantiglobulina. Anche quando il neonato ricever emazie non O, i test devono essere effettuati con il metodo dellantiglobulina49(p42). Tipizzazione D I neonati che hanno ricevuto, con successo, TIU alla nascita, vengono spesso tipizzati come D negativi (o positivi molto deboli), in quanto pi del 90% degli eritrociti circolanti sono quelli del donatore. Anche la tipizzazione ABO e il test diretto allantiglobulina possono fornire risultati fuorvianti. Qualora i globuli rossi del neonato siano rivestiti, ampiamente, da anticorpi, anche la tipizzazione D pu fornire risultati falsamente positivi o falsamente negativi (vedi Capitolo 14). Test allantiglobulina Di solito, in caso di MEFN, il test allantiglobulina diretto (TAD) fortemente positivo, per la presenza di anticorpi anti-D o di anticorpi diretti verso altri antigeni gruppoematici. Le reazioni sono assai pi deboli, o anche negative, nelle MEFN da incompatibilit ABO. Il grado di positivit di un TAD, tuttavia, non correla con la gravit dellemolisi, soprattutto nel caso di MEFN ABO. I neonati che hanno ricevuto una trasfusione intrauterina possono avere un TAD debolmente positivo, con immagini di agglutinazione a campo misto. Quando il TAD positivo, gli anticorpi possono essere eluiti dalle emazie e testati per la specificit. Non necessario eseguire e analizzare un eluato, quando il siero materno ha dimostrato di contenere un singolo anticorpo. Si devono tenere nella giusta considerazione tutti gli anticorpi antieritrocitari clinicamente significativi (vedi pi avanti in questo Capitolo, il paragrafo dedicato alla scelta del sangue). Se il TAD positivo e la ricerca di anticorpi irregolari nel siero materno negativa, lindagine deve riguardare gli anticorpi ABO o una possibile MEFN dovuta ad anticorpi diretti verso antigeni a bassa frequenza, non presenti nel pannello delle emazie test. Valutazione degli anticorpi ABO. Una MEFN ABO pu essere sospettata su base clinica, anche
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quando il TDA negativo. Una ricerca di anticorpi anti-A 1 e anti-B dalleluato delle emazie del cordone potrebbe confermare la diagnosi di MEFN ABO. Si dovrebbe analizzare il siero del sangue cordonale o del sangue periferico con il test allantiglobulina indiretto (TAI), utilizzando, come emazie test, globuli rossi A1, B e O. La presenza di anticorpi anti-A, anti-B o anti-A,B, conferma una possibile MEFN ABO. spesso possibile eluire anticorpi anti-A e/o anti-B dalle emazie del neonato, nonostante un TAD negativo, ma tale ricerca non necessaria per porre, in via presuntiva, la diagnosi. Nei rari casi di MEFN ABO che richiedano trasfusioni, si dovrebbe utilizzare sangue O, D compatibile, sia nel caso in cui la diagnosi confermata sierologicamente sia in caso negativo. Per un neonato con TAD negativo, si dovrebbero prendere in considerazione cause non immunologiche di iperbilirubinemia o di emolisi, prima di concludere che siano dovute a MEFN ABO, in quanto potrebbero essere presenti altri disordini ematologici50. Anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza. Quando si esclude una MEFN ABO, si dovrebbe sospettare la presenza di un anticorpo diretto verso un antigene a bassa incidenza. Analizzare, con TAI, un eluato o il siero materno contro le emazie del padre pu fornire una risposta. Se si utilizza il siero materno, questo deve essere, ovviamente, ABO compatibile. Se uno o entrambi i test sono positivi, ci significa che il neonato possiede un antigene di origine paterna, non presente nella madre, che ha formato un anticorpo contro tale antigene. A meno che la madre non sia stata esposta ai globuli rossi del padre o a quelli di suoi consanguinei, la trasfusione dovrebbe rappresentare un evento immunizzante molto improbabile. Dato che non ci dovrebbero essere difficolt a reperire sangue compatibile, le ricerche diagnostiche possono essere eseguite dopo che si sono risolti i problemi clinici. In caso di TAD positivo e quando tutti i tentativi di identificazione degli anticorpi che rivestono gli eritrociti non hanno conseguito risultati, si dovrebbero prendere in considerazione le cause di TAD falsamente positivi (vedi Capitolo 20).
Ex-sanguino trasfusione Con lex-sanguino trasfusione per MEFN si ottengono diversi effetti positivi: 1) rimozione delle emazie fetali ricoperte da anticorpi; 2) rimozione degli anticorpi materni; 3) rimozione della bilirubina; 4) sostituzione degli eritrociti e pertanto trattamento dellanemia. Gli eritrociti utilizzati nellex-sanguino trasfusione devono essere compatibile con lanticorpo in causa. Viene impiegato, frequentemente, plasma fresco congelato per ricostituire il sangue intero e per apportare i fattori della coagulazione. Dovrebbe essere anche monitorato il numero delle piastrine e, qualora necessarie, dovrebbero essere eseguite trasfusioni piastriniche. Pu essere impiegato anche plasma congelato entro 24 h dalla raccolta, tenendo, comunque, presente che potrebbe esservi una diminuita attivit dei fattori labili (FV e FVIII). Scelta del sangue Nella maggior parte dei casi, per eseguire le prove di compatibilit, viene utilizzato il siero della madre e gli eritrociti scelti per lex-sanguino trasfusione devono essere compatibili con gli anticorpi ABO materni o con lanticorpo (o gli anticorpi) responsabile dellemolisi. Di solito si utilizzano emazie O, risospese in plasma AB. Nella MEFN ABO, le emazie usate nellex-sanguino trasfusione devono essere di gruppo O. Se lantigene un anti-D, le emazie devono essere D negative, ma non sempre unex-sanguino trasfusione richiede emazie di gruppo O. Se la madre e il neonato hanno lo stesso gruppo ABO, si possono usare eritrociti o sangue intero di eguale specificit. Se lanticorpo implicato non anti-D, si possono impiegare emazie D positive per un neonato D positivo. Il siero o il plasma materno rappresenta il campione di scelta per eseguire le prove di compatibilit nelle ex-sanguino trasfusione; se disponibile in buona quantit, il suo impiego diminuisce, infatti, la necessit di raccogliere sangue dal neonato, presenta lanticorpo implicato
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in alta concentrazione e pu essere analizzato accuratamente e approfonditamente prima della nascita. Daltro canto, il siero materno pu creare problemi se contiene, per altre cause di sensibilizzazione, anticorpi diretti contro antigeni assenti dagli eritrociti del neonato o se contiene anticorpi IgM che non superano la barriera placentare. Questi anticorpi aggiuntivi potrebbero complicare il quadro sierologico. Se il sangue materno non disponibile o non adatto per le prove di compatibilit, pu essere usato il siero del neonato e/o, preferibilmente, leluato dalle sue emazie. La concentrazione dellanticorpo nel siero neonatale pu essere bassa, soprattutto quando la maggior parte delle molecole anticorpali adesa alle emazie. Luso delleluato o del siero (o di entrambi) pu essere indicato, quando il tentativo di ottenere il campione di sangue materno potrebbe far ritardare lintervento terapeutico. Il sangue utilizzato per una ex-sanguino trasfusione dovrebbe essere irradiato. Di solito per una ex-sanguino trasfusione si utilizza un volume doppio rispetto alla volemia del neonato51. Trasfusioni successive La bilirubina si pu rapidamente accumulare di nuovo dopo unex-sanguino trasfusione eseguita con successo e nonostante la fototerapia. Ci accade perch la maggior parte della bilirubina nei liquidi extravascolari si riequilibrer entrando nello spazio intravascolare, e anche perch le emazie con gli anticorpi rimasti adesi continuano a emolizzare. In caso di aumento dei livelli di bilirubina si rende necessario eseguire una seconda o anche una terza ex-sanguino trasfusione, con tutte le stesse considerazioni illustrate sopra, per quanto riguarda la scelta dei globuli rossi e leffettuazione delle prove di compatibilit. I neonati che hanno subito trasfusione intrauterina devono essere seguiti con particolare attenzione perch la trasfusione intrauterina sopprime leritropoiesi fetale. Si dovrebbero eseguire, settimanalmente, valutazioni dellematocrito e conte reticolocitarie, per un periodo di 1-3 mesi18. Molti di questi neonati
svilupperanno di conseguenza anemia e dovranno essere trasfusi con concentrati eritrocitari, finch non inizier la produzione dei propri eritrociti, che sar evidenziata dalla conta reticolocitaria e da livelli di emoglobina consoni allet18,52. Anticorpi diretti contro antigeni ad alta frequenza Raramente, lanticorpo materno reagisce contro un antigene ad alta incidenza, nel qual caso non si dispone di sangue compatibile. Se questo problema viene identificato prima del parto, i fratelli della madre possono essere studiati per la compatibilit e lidoneit a donare sangue o si possono rinvenire soggetti compatibili negli elenchi di donatori rari. Possono anche essere raccolti e congelati gli eritrociti materni. Ogni prodotto raccolto da consanguinei deve essere irradiato. Se questo evento, rarissimo, non viene identificato, se non dopo la nascita, sono disponibili le tre scelte elencate qui di seguito: 1. prelevare sangue alla madre, se lostetrico acconsente. Rimuovere quanto pi plasma possibile, preferibilmente con lavaggi in fisiologica, e risospendere i globuli rossi in plasma compatibile e allematocrito desiderato; 2. se il tempo lo permette, studiare i fratelli della madre o altri suoi congiunti per la compatibilit e lidoneit alla donazione del sangue; 3. se la situazione clinica urgente, utilizzare un donatore incompatibile per lex-sanguino trasfusione. Lex-sanguino trasfusione ridurr la bilirubina, rimuover la maggior parte delle emazie pesantemente rivestite dallanticorpo e il maggior numero di molecole anticorpali non adese. Tuttavia, gli anticorpi residui attaccheranno le emazie trasfuse incompatibili e si renderanno necessarie, con ogni probabilit, ulteriori ex-sanguino trasfusione per un nuovo accumulo di bilirubina. Immunoglobuline Rh Le immunoglobuline Rh sono un concentrato, in massima parte, di IgG anti-D, ottenute da pool di plasma umano.
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Una dose piena di anti-D (in genere di 300 g, pari a 1.500 unit internazionali o il reale contenuto di una dose secondo le indicazioni del produttore)53 sufficiente per neutralizzare leffetto immunizzante di 15 mL di emazie D positive; ci corrisponde a 30 mL di sangue (intero) fetale. Le immunoglobuline Rh sono disponibili anche in dosaggi inferiori, approssimativamente di 50 g, protettive sino a circa 2,5 mL di emazie fetali D positive. Questa dose pu essere utilizzata per aborti spontanei o terapeutici al terzo trimestre, quando la volemia totale del feto minore di 2,5 mL. Tuttavia, per timore di un errato calcolo dellet gestazionale e per problemi relativi ad errori involontari nelle scorte, che possono provocare trattamenti inadeguati, vengono somministrate, solitamente, dosi piene e le dosi ridotte non vengono mai approvvigionate. Lazione protettiva delle RhIG su individui D negativi esposti a cellule D positive probabilmente dovuta a interferenza con il riconoscimento dellantigene, nellinduzione della fase primaria dellimmunizzazione54. Le RhIG sono disponibili in due preparazioni: 1. solamente per uso intramuscolare (IM); 2. per somministrazioni sia intramuscolari (IM) sia endovenose (EV). Le dosi per le preparazioni di immunoglobuline Rh EV sono espresse in unit internazionali (5 UI sono equivalenti a 1 g), con 1.500 UI (300 g) in grado di neutralizzare 15 mL di emazie D positive, secondo le istruzioni contenute nelle confezioni. Somministrazione antenatale Il largo impiego della immunoprofilassi post-natale ha ridotto limmunizzazione allantigene D, indotta dalla gravidanza, all1-2%8. Il rischio ulteriormente diminuito allo 0,1% se limmunoprofilassi viene eseguita in periodo prenatale, alla 28a settimana di gestazione7. LACOG raccomanda di eseguire la profilassi prenatale alla 28 a settimana di gestazione, basandosi sul fatto che il 92% delle donne, che sviluppano una sensibilizzazione anti-D in corso di gravidanza, lo fanno a questa settimana di gestazione o dopo7,15.
Il campione di sangue prelevato prima di somministrare RhIG dovrebbe essere tipizzato per ABO e D. Le donne D negative che hanno anticorpi ad altra specificit (per esempio, anti-G) sono comunque candidate allimmunoprofilassi anti-D. Quando la madre riceve RhIG durante la gravidanza, il figlio pu nascere con un TAD positivo, ma senza segni di emolisi. Anche il siero materno potr mostrare una reattivit anti-D. Ci deve essere una buona comunicazione fra il medico curante e lo staff della Struttura Trasfusionale dellospedale dove la donna partorir, al fine di una corretta interpretazione dei test di laboratorio, che si eseguono al momento del parto. Lemivita di una dose di RhIG, in assenza di una significativa EFM, di circa 21 giorni. Quindi, dei 300 g di anti-D somministrati alla 28a settimana, 20-30 g potrebbero permanere al momento del parto, 12 settimane dopo. Alcuni specialisti somministrano unulteriore dose di RhIG, quando il parto ritarda oltre la 40 a settimana18. Lanti-D si pu ritrovare nel circolo materno, sino a 6 mesi dopo la somministrazione. Somministrazione post-natale Il sangue cordonale di un neonato partorito da una madre D negativa dovrebbe essere tipizzato per lantigene D. Una madre D negativa con un neonato D positivo dovrebbe ricevere una dose intera di RhIG entro 72 ore dal parto, a meno che non si sappia che gi sensibilizzata allantigene D. La presenza di anti-D residuo dalla somministrazione antenatale non indica una protezione in atto. Anticorpo attivo o passivo? Alcuni segni in vitro possono aiutare a distinguere un anticorpo passivamente somministrato come RhIG da un anti-D frutto di unimmunizzazione attiva. Lanti-D passivo formato esclusivamente da IgG. Se lanti-D della donna attivo in fisiologica o pu essere inattivato (totalmente o parzialmente), trattando il siero con 2-mercaptoetanolo o ditiotreitolo, significa che possiede una componente IgM e rappresenta, con ogni probabilit, unimmunizzazione attiva. Lanti-D acquisito passivamente raggiunge
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soltanto raramente titoli superiori a 4, cos che un titolo pi alto o che si incrementa indica, probabilmente, una sensibilizzazione attiva. auspicabile poter ottenere conferma dalle registrazioni del medico curante, ma quando esiste un dubbio di non facile soluzione le RhIG dovrebbero essere sempre somministrate. Esse dovrebbero anche essere somministrate se vi sono problemi riguardanti le tipizzazioni Rh. Valutazioni post-partum. Si dovrebbe prelevare alla madre un campione di sangue, preferibilmente entro 1 ora dal parto, e valutare uneventuale EFM di quantit maggiore di quella per la quale una dose di RhIG di 300 g immunosoppressiva. Se questa ricerca conferma la presenza di emazie fetali, si deve determinare il grado dellEFM, cos da poter somministrare una dose appropriata di RhIG49(pp48,49),55. La somministrazione di RhIG dovrebbe avvenire entro 72 ore dal parto. Se la profilassi ritardata, la probabilit di prevenire limmunizzazione diminuisce. Nonostante ci, lACOG raccomanda che la somministrazione avvenga comunque, in quanto alcuni studi hanno documentato una protezione parziale dopo 13 giorni dallesposizione allantigene e anche dopo 28 giorni15. Non sono candidate a ricevere RhIG, le donne elencate qui di seguito: 1. le puerpere D negative, il cui neonato sia D negativo; 2. ogni puerpera D positiva. Sono stati riportati rari casi di MEFN in neonati la cui madre aveva un fenotipo D debole o parziale, ma lesecuzione di una sistematica profilassi con RhIG non viene raccomandata in donne con tali fenotipi12; 3. una donna D negativa, che si sa essere gi immunizzata allantigene D. Altre indicazioni per le RhIG Le RhIG dovrebbero essere somministrate a ogni gravida D negativa dopo ogni evento ostetrico che possa consentire il passaggio di emazie fetali in circolo materno: aborti spontanei o terapeutici, gravidanze ectopiche, amniocentesi, campionamento di villi coriali (villocentesi),
presenza di mola vescicolare, cordonocentesi, emorragie antepartum, traumi diretti sulladdome, morte fetale55. Come accennato in precedenza, alla 12a settimana di gestazione o anche prima, una dose di 50 g di RhIG dovrebbe adeguatamente proteggere contro il piccolo volume di sangue fetale nel primo trimestre di gravidanza. Dalla 13a settimana fino al termine della gravidanza, si dovrebbe somministrare una dose piena di RhIG. Prima della 20a settimana, la volemia fetale raramente supera i 30 mL56, quantit tale che una singola dose di 300 g di RhIG dovrebbe essere sufficiente per la profilassi di ogni tipo di EFM. Non , quindi, necessario quantizzare le emazie fetali nel circolo materno, prima della 20a settimana di gestazione57. Amniocentesi Unamniocentesi pu causare una EFM e, di conseguenza, unimmunizzazione Rh. Le gravide D negative sottoposte ad amniocentesi fra la 16a e la 18a settimana di gestazione per indagini genetiche dovrebbero ricevere una dose piena di RhIG in questa circostanza, una seconda dose piena alla 28a settimana e lusuale dose post-partum, se il neonato D positivo. Se una gravida D negativa, non immunizzata, viene sottoposta, per qualsiasi motivo, ad amniocentesi, nel secondo o nel terzo trimestre di gravidanza, indicata la somministrazione di una dose piena di RhIG. Se lamniocentesi viene ripetuta dopo pi di 21 giorni, si dovrebbe somministrare unulteriore dose piena di RhIG18. Se lamniocentesi viene effettuata per valutare la maturit fetale e se il parto previsto entro 48 ore dalla procedura, la somministrazione di RhIG pu essere ritardata sino alla nascita del neonato e alla conferma che D positivo. Se trascorrono pi di 48 ore prima del parto, le RhIG dovrebbero essere somministrate dopo lamniocentesi. Se il parto avviene entro 21 giorni dopo e non vi sono evidenze di EFM massive15, pu non essere essenziale una somministrazione aggiuntiva di RhIG, ma un comportamento prudente suggerisce di ripeterla al parto.
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Screening di una EFM di notevole volume La somministrazione post-partum di RhIG pu non prevenire limmunizzazione, se la quantit di sangue fetale D positivo entrata in circolo materno supera le capacit immunosoppressive delle RhIG. Una dose di 300 g di RhIG protegge contro 15 mL di emazie D positive, cio contro 30 mL di sangue fetale. Viene stimato che soltanto nello 0,3% delle gravidanze intervengono EFM con volume maggiore di 30 mL, ma le EFM notevoli sono la causa pi importante e prevedibile di fallimento della profilassi. LACOG raccomanda di indagare per una EFM post-partum solamente le gravidanze ad alto rischio15, ma Ness et al.58 hanno dimostrato che, basandosi esclusivamente su questi criteri ACOG, si perderebbe il 30% delle madri esposte a EFM di ampio volume. Gli Standard AABB prevedono di esaminare, dopo il parto, un campione di sangue della madre D negativa a rischio di immunizzazione per individuare la presenza di una EFM che necessiti di pi di una dose di RhIG49(p49). In casi rari, una massiccia EFM pu causare la morte del feto e infondere tanto sangue fetale in circolo materno da simulare un fenotipo D debole in una paziente D negativa 15,59 . Se tali casi non vengono riconosciuti e trattati con adeguate dosi di RhIG, condurranno, con ogni probabilit, ad unimmunizzazione. D debole microscopico. In passato, alcuni ricercatori indagavano la presenza di emazie D positive nel sangue di madri D negative impiegando il test allantiglobulina denominato D debole microscopico. La presenza di unagglutinazione a campo misto indicava una sicura mescolanza con emazie D positive. Tale test non dovrebbe, comunque, essere utilizzato per identificare EFM massive, in quanto privo di attendibilit60. Il test delle rosette. Il test delle rosette in grado di evidenziare un numero limitato di emazie D positive in una sospensione di eritrociti D negativi. La sospensione viene incubata con un reagente anti-D di origine umana e le molecole anticorpali si attaccano ai siti antigenici D delle emazie D positive presenti. Alla sospensione si aggiungono, come indicatori, emazie D positive,
che reagiscono con le molecole anticorpali legate alla superficie dei globuli rossi D positivi gi presenti, formando agglutinati ben visibili (le rosette) tuttintorno ad essi (vedi Metodo 5.1). Il test in grado di evidenziare EFM di circa 10 mL60, una sensibilit che fornisce un desiderabile margine di sicurezza per un test di screening. Le cellule D deboli non reagiscono cos fortemente come le normali emazie D positive. Se il neonato ha un fenotipo D debole, lEFM pu essere valutata con il test di eluizione acida secondo Kleihauer-Betke (vedi avanti), che identifica lemoglobina fetale, non un antigene di superficie. In tutti i casi, il test delle rosette fornisce soltanto risultati qualitativi e questi devono essere seguiti da test quantitativi, come in grado di fare il test di eluizione acida. Si possono utilizzare altri test per identificare e/o quantificare unEFM: la citofluorometria, la gel-agglutinazione, lELAT (Enzyme-Linked Antiglobulin Test) che di limitato impiego. Ognuna di queste metodiche presenta vantaggi e svantaggi, che ciascuna struttura deve valutare. Limpiego di tecniche di amplificazione degli acidi nucleici per individuare quantitativi molto limitati di emazie fetali resta, per ora, a livello di ricerca sperimentale61-63. Quantificazione di una EFM Storicamente, la quantificazione di una EFM si ottenuta con il test di eluizione acida di Kleihauer-Betke, che evidenzia le differenze fra emoglobina fetale ed emoglobina adulta nei riguardi di uneluizione acida (vedi Metodo 5.2). I risultati vengono riferiti come percentuale di emazie fetali, ma accuratezza e precisione di questa procedura possono essere scarse. Dato che 300 g di RhIG sono in grado di proteggere da unEFM di 30 mL di sangue fetale D positivo, il numero di dosi di RhIG da somministrare si ottiene dividendo il volume stimato di sangue fetale presente per 30. Per esempio: 1) il test di Kleihauer-Betke riporta una percentuale dell1,3%; 2) (1,3/100) x 5.000 mL (volume arbitrariamente assegnato al sangue materno) = 65 mL di sangue fetale;
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3) 65/30 mL per dose = 2,2 dosi di RhIG necessarie. Poich la quantificazione che si ottiene con questa procedura , intrinsecamente, imprecisa e poich le conseguenze di un trattamento inadeguato possono essere gravi, auspicabile ottenere un margine di maggior sicurezza nel calcolare le dosi di RhIG. Quanto specificato di seguito pu rappresentare un approccio utilizzabile: 1. quando il numero, che segue la virgola decimale, minore di 5, arrotondare e aggiungere una dose di RhIG (per esempio, se il calcolo indica 2,2 dosi arrivare a 3 dosi); 2. quando il numero, che segue la virgola decimale, 5 o pi alto, arrotondare sino al numero che segue e aggiungere una dose di RhIG (per esempio, se il calcolo indica 2,8 dosi, arrotondare a 3 e aggiungere una dose, cio arrivare a 4 dosi). (Vedi Tabella 23.1). Per via intramuscolare non possono essere iniettate pi di 5 dosi di RhIG alla volta. Per quantit maggiori, e per il confort del paziente, le dosi possono essere distanziate fra loro nello spazio di 72 ore: una sequenza temporale ottimale non stata stabilita. Quando sono richieste dosi maggiori, si possono impiegare le preparazioni endovenose di RhIG. Secondo le istruzioni contenute nelle confezioni, dovrebbe essere iniettata una dose massima di 300 UI per volta, ogni 8 ore, sino a che non si somministrata la dose totale calcolata.
Trombocitopenia neonatale immune

Le IgG materne dirette contro le piastrine possono superare la placenta e causare una grave piastrinopenia prenatale e neonatale. Si conoscono due tipi di piastrinopenia alloimmune e la loro distinzione importante dal punto di vista terapeutico. Trombocitopenia neonatale alloimmune Il meccanismo della trombocitopenia neonatale alloimmune (TNAI) simile a quella della MEFN. Le piastrine fetali che esprimono un antigene paterno assente sulle piastrine della madre, possono entrare nel circolo materno nel corso della gravidanza o al momento del parto. Se la madre si immunizza, le IgG materne superano la placenta e causano una piastrinopenia fetale e neonatale. Il conteggio delle piastrine materne resta normale. La frequenza della TNAI di circa 1 caso su 1.500-2.000 nati vivi64,65. La TNAI causa la maggior parte dei casi di emorragie intracraniche, con un numero pi alto rispetto a tutte le altre piastrinopenie ad eziologia differente, considerate congiuntamente66. A differenza della MEFN, la TNAI colpisce spesso il primo nato, in una percentuale che varia dal 50 al 60%. La piastrinopenia autolimitante e si risolve entro 2-3 settimane. Il quadro clinico vario, e va da trombocitopenia moderata con nessun segno clinico fino a sanguinamenti evidenti.
Tabella 23.1 - Dosi di RhIG per massive emorragie feto-materne, in base al test di eluizione acida % di Cellule fetali Fiale da somministrare Dosi In g 0,3 - 0,8 0,9 - 1,4 1,5 - 2,9 2,1 - 2,5 2 3 4 5 600 900 1.200 1.500 In UI 3.000 4.500 6.000 7.700
Note 1. Numeri basati su una volemia materna di 5.000 mL. 2. necessaria 1 fiala da 300 g (1.500 UI) per ogni 15 mL di emazie fetali o 30 mL di sangue intero fetale.
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stato riportato che lemorragia intracranica interviene nel 10-30% dei casi, di cui circa la met in utero 65,67. La ricomparsa in successive gravidanze frequente, in forma simile o di gravit maggiore, tanto che una donna, nota per essere immunizzata, deve essere seguita, nel periodo antenatale, con particolare attenzione. Test sierologici Qualora si pianifichino ulteriori gravidanze, su una donna il cui figlio ha avuto una TNAI si dovrebbero eseguire test sierologici. Diversi antigeni piastrino-specifici sono stati associati alla TNAI, con lantigene HPA-1a (ex PlA1) responsabile della stragrande maggioranza dei casi nei caucasici64. Pi che la trasfusione, levento solitamente immunizzante rappresentato dalla gravidanza. Il 2% circa della popolazione HPA-1a-negativo e circa il 10% di donne con questo fenotipo con figlio HPA-1a-positivo si immunizzer68. Alcuni studi66,68 hanno dimostrato unassociazione fra il fenotipo HLA DRw52a e la tendenza a sviluppare anticorpi anti-HPA-1a. Il Capitolo 16 riporta maggiori informazioni sugli antigeni piastrinici. Sebbene in gravidanza si evidenzino frequentemente anticorpi contro antigeni HLA di Classe I e gli antigeni HLA di Classe I siano espressi sulle piastrine, tali anticorpi sono raramente causa di TNAI e il ruolo degli anticorpi HLA, al proposito, resta controverso69,70. Ogni famiglia con figli nati con una conta piastrinica inferiore a 50.000/L dovrebbe essere valutata. I test sierologici sono condotti su campioni di siero materno e di sangue intero materni e paterni, dai quali separare le piastrine. Sul siero materno si ricercano gli anticorpi sia piastrino-specifici che non piastrino-specifici, contro le piastrine paterne e contro pannelli di piastrine fenotipizzate. La tipizzazione delle piastrine materne e paterne si esegue con metodiche sierologiche o biomolecolari. Alcuni clinici hanno proposto di tipizzare le gravide per la presenza dellantigene HPA-1a, lantigene pi frequentemente coinvolto nelle incompatibilit nei soggetti caucasici.
Questo suggerimento non largamente adottato, in quanto soltanto il 10% delle donne HPA-1a-negative a rischio certo di formare anticorpi e, fra queste, soltanto un terzo ha figli con trombocitopenie clinicamente importanti. Inoltre, il costo e la difficolt logistica di una tipizzazione piastrinica ne impediscono una larga utilizzazione65,71. Considerazioni prenatali Conoscendo la specificit anticorpale e le frequenze geniche, si possono predire le probabilit che la prole possa essere affetta da TNAI (vedi Tabella 16.1). Gli antigeni piastrino-specifici sinora noti appartengono a sistemi diallelici, cosicch la tipizzazione delle piastrine paterne indica la zigosit. Se il padre omozigote per un antigene, non necessario determinare lo stato antigenico fetale, in quanto tutti i figli saranno affetti. Se il padre eterozigote, ci sar il 50% di possibilit che la prole possegga lantigebe coinvolto. In una gravidanza a rischio, il genotipo del feto (e, per deduzione, il suo fenotipo piastrinico) pu essere determinato con la tipizzazione DNA delle cellule fetali ottenute con amniocentesi. Quando il rischio di una TNAI alto, un campione di sangue fetale per un conteggio piastrinico pu essere ottenuto con una cordonocentesi gi alla 20 a settimana di gestazione. Dato che la cordonocentesi comporta il rischio di unemorragia grave in un feto piastrinopenico, devono essere disponibili piastrine compatibili al momento della procedura e spesso sono utilizzate se la conta piastrinica bassa. Alcune strutture infondono piastrine, prima di conoscere la conta piastrinica, considerato il rischio di sanguinamenti durante lincannulamento. Quando il feto piastrinopenico, vengono spesso infuse alla madre IGIV, alla dose settimanale di 1g/kg (con o senza steroidi) sino al termine della gravidanza 64-67,72 . Altri, alternativamente, raccomandano un trattamento empirico con IGIV in caso di genotipo omozigote del padre per lo specifico antigene piastrinico o quando una PCR sul liquido amniotico rivela che il feto porta tale antigene.
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Molti centri, per eseguire una conta piastrinica, procedono, verso il termine della gravidanza, a un taglio cesareo di elezione piuttosto che ricorrere alla cordonocentesi. Fonti di piastrine. Spesso, per un eventuale impiego al momento della cordonocentesi o del parto, le piastrine vengono prelevate dalla madre. La madre dovr sottoporsi agli usuali test per i marcatori delle malattie infettive. La precedente somministrazione di alte dosi di IGIV pu causare false positivit ai test immunologici; , quindi, consigliabile eseguire i test sulla madre, prima di iniziare la terapia con IGIV. Le madri con test confermati positivi (per esempio, per lHCV, che trasmesso pi frequentemente per via trasfusionale piuttosto che per via verticale) non dovrebbero essere utilizzate come fonte per le piastrine, perch questi risultati indicano, con ogni probabilit, uninfezione materna. Da notare, che la gravidanza, di per s, pu causare falsi risultati positivi nei test sierologici per le malattie infettive. Le piastrine possono essere raccolte sia dalla madre che da altri donatori negativi per lantigene in causa e con plasma compatibile con le emazie del feto. Se si utilizzano le piastrine della madre, il plasma (che contiene gli anticorpi) deve essere rimosso o ridotto e le piastrine devono essere risospese in plasma compatibile o in fisiologica a volume ridotto (vedi Metodo 6.15). Tutti gli emocomponenti per trasfusioni intrauterine devono essere irradiati (vedi Capitolo 27) e dovrebbero essere a ridotto rischio di trasmissione di CMV73. Programmazione della terapia. Sono impiegate svariate strategie nella gestione di una piastrinopenia fetale. Sebbene, nel passato, siano state utilizzate trasfusioni settimanali di piastrine, il rischio connesso con cordonocentesi ripetute rende preferibile, negli USA, la somministrazione di IGIV alla madre. Il comportamento differente in Europa, dove vengono ancora effettuate trasfusioni settimanali. Le trasfusioni di piastrine e le ripetute cordonocentesi sono riservate a quei pazienti, per i quali non risultano efficaci le altre forme non invasive di terapia. Un altro approccio comporta lesecuzione di una singola trasfusione piastrinica
subito prima del parto, quando la cordonocentesi rivela una grave piastrinopenia. Tale approccio viene, di solito, riservato alle gravidanze a rischio molto alto di emorragie intracraniche. Gestione dopo la nascita La conta piastrinica pu continuare a diminuire dopo la nascita e dovrebbe essere monitorata. Ai pazienti, con aumentato rischio di sanguinamenti per una grave piastrinopenia, dovrebbero essere effettuate, per profilassi, trasfusioni di piastrine compatibili. Se non sono disponibili piastrine compatibili, si dovrebbe prendere in considerare lutilizzo di alte dosi di IGIV, ma la risposta a questo trattamento variabile. Nei pazienti che rispondono, la conta piastrinica inizia ad aumentare dopo 24-48 ore, bench possa essere pi tardiva in qualche caso64. Dato che la risposta lenta, il neonato con urgente necessit di trasfusione, se non sono disponibili piastrine compatibili, pu ricevere piastrine da donatori random, frequentemente con il risultato di risposta adeguata. Per pazienti che necessitano di trasfusioni piastriniche, la contestuale somministrazione di IGIV pu accelerare il recupero delle proprie piastrine e ridurre il periodo di dipendenza dalle trasfusioni. I pazienti con trombocitopenia modesta e senza sanguinamenti possono essere gestiti senza interventi terapeutici specifici. Piastrinopenia secondaria a una porpora trombocitopenica idiopatica materna I neonati da madri affette da una porpora trombocitopenica idiopatica (PTI) attiva, di origine immunologica, spesso non sono piastrinopenici e hanno un rischio minore di emorragie rispetto a quelli affetti da TNAI69,74. Gli anticorpo nella PTI sono di solito IgG e superano facilmente la barriera placentare. Occasionalmente, il parto di un neonato gravemente piastrinopenico conduce alla diagnosi di una PTI materna di moderata entit (75.000-100.000 piastrine/L), non sospettata in precedenza. Questi casi di modesta PTI vanno distinti dalle trombocitopenie gravidiche, nelle quali la madre, senza alcuna storia di piastrinopenia autoimmune, presenta un conteggio inferiore a
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150.00 piastrine/L. In casi di PTI materna, il rischio di una severa trombocitopenia fetale (definita, di solito, per un conteggio inferiore a 50.000 piastrine/L), del 7-10%74,75. Il rischio di una emorragia intracranica nei neonati nati da madri con PTI basso (1%), con solo pochi casi riportati in letteratura. Lincidenza pi bassa di quella che si verifica nella TNAI, perch, di solito, i nati da madri con PTI hanno una conta piastrinica pi alta e la funzionalit delle loro piastrine non alterata, come sembra accadere nella TNAI. Non si raccomanda il controllo routinario delle piastrine fetali e il taglio cesareo riservato soltanto per indicazioni ostetriche74,76. Gli anticorpi nella PTI hanno un ampio spettro di reattivit contro gli antigeni piastrinici. Se il neonato ha unalta concentrazione di anticorpi, ci sar, uniformemente, una ridotta sopravvivenza delle piastrine trasfuse provenienti sia da donatori random, sia dalla madre, sia da altri membri della famiglia. Talora si hanno risposte positive e, in presenza di emorragie, una trasfusione piastrinica potr essere usata come terapia demergenza69. Nei casi di trombocitopenia grave di origine autoimmune, pu essere efficace anche il trattamento con IGIV 66,72,74,76.
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Capitolo 24: Pratica trasfusionale in neonatologia e pediatria
Capitolo 24
Pratica trasfusionale in neonatologia e pediatria
Molti cambiamenti fisiologici accompagnano il passaggio dal feto al neonato, dal neonato al lattante e, poi, allintera et infantile. I parametri ematologici, la massa sanguigna e le risposte fisiologiche a stress, quali lipovolemia e lipossia, variano ampiamente. I mutamenti pi rapidi e pronti intervengono durante la prima infanzia. Di conseguenza, il dibattito sulle trasfusioni pediatriche normalmente suddiviso in due periodi: i neonati che vanno dalla nascita allet di 4 mesi, gli infanti di et superiore ai 4 mesi ed infine i bambini. Alcuni problemi riguardanti le trasfusioni in neonatologia si sovrrappongono a quelli relativi al periodo perinatale, discussi al Capitolo 23. I progressi nei trattamenti medici permettono, oggi, la sopravvivenza di neonati molto prematuri. La Struttura Trasfusionale deve essere in grado di offrire prodotti adeguati alle specifiche necessit di pazienti con basso peso corporeo alla nascita (<1.500 g) o di peso estremamente basso (<1.000 g), quando i piccoli volumi e le funzioni di organi danneggiati o immaturi offrono ben pochi margini alla sicurezza. I neonati malati sono, rispetto ai pazienti ospedalizzati di altri gruppi di et, quelli che ricevono soprattutto trasfusioni di concentrati eritrocitari (CE)1. I progressi conseguiti nella cura di neonati critici, come la terapia tensioattiva, i trattamenti con monossido di azoto, luso di ventilatori ad alta frequenza, il rispetto delle lineeguida sulla pratica trasfusionale, hanno fatto diminuire il numero delle trasfusioni, la maggior parte delle quali vengono utilizzate per neonati di peso, alla nascita, inferiore a 1.000 g1.
La Tabella 24.12 riporta i dosaggi dei vari emocomponenti per trasfusioni semplici e di piccolo volume.
Eritropoiesi fetale e neonatale

I siti prevalenti di ematopoiesi dellembrione si spostano, nelle prime 24 settimane di gestazione, dalle pareti del sacco vitellino, al fegato e, infine, al midollo osseo3. Lematopoiesi regolata dallaumento graduale dei livelli di eritropoietina (EPO), stimolati dalla bassa tensione di ossigeno (O2) durante la vita intrauterina. Gli eritrociti fetali, ricchi di HbF, si adattano bene alle basse tensioni di O2 presenti in utero. Lalta affinit dellemoglobina fetale per lO2 favorisce, nel corso della gravidanza, il trasferimento dellO2 dagli eritrociti materni a quelli fetali. Il cambiamento da emoglobina fetale a emoglobina adulta inizia intorno alla 32a settimana di gestazione e, alla nascita, dal 60 all80% dellemoglobina totale costituita da HbF. I neonati prematuri, quindi, nascono con livelli di HbF pi alti di quelli nati a termine. Lemoglobina media nel sangue cordonale di un neonato a termine sano di 16,9 1,6 g/dL mentre quella di un prematuro di 15,9 2,4 g/dL4. Nelle prime settimane di vita, il livello di emoglobina diminuisce gradualmente. Si tratta della cosiddetta anemia fisiologica del neonato a termine e della anemia fisiologica del prematuro. Lanemia considerata fisiologica in quanto autolimitante, solitamente
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Tabella 24.1 - Dosi per trasfusioni semplici e di piccolo volume in neonati Emocomponente Concentrati eritrocitari (CE) Concentrati piastrinici (CP) Concentrati granulocitari (CG) Plasma fresco congelato (PFC) Crioprecipitato (CRIO)
(Da Roseff2, adattamento autorizzato)
Volumi 10-15 mL/kg 5-10 mL/kg 1 x 10 neutrofili in 10-15 mL/kg

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Modifiche stimate Hb 2-3 g/dL Piastrine 50.000-100.000/L Da ripetersi sino a risultato ottenuto del 15-20% nellattivit dei fattori 60-100 mg/dL di fibrinogeno nellinfante e di 5-10 mg/dL nel bambino
10-15 mL/kg 1-2 unit/10 kg
ben tollerata e non associata ad eventi nocivi nei neonati. Lattivit eritropoietica diminuisce in seguito allaumento del flusso sanguigno polmonare e della pO2 arteriosa, del contenuto eritrocitario di 2,3difosfoglicerato (2,3-DPG) e dellHbA, che migliorano la cessione di O2 ai tessuti. Via via che lossigenazione tessutale migliora, i livelli di EPO diminuiscono e cala leritropoiesi. Questo determina, unitamente alla diminuita sopravvivenza di emazie fetali e allespansione della volemia in seguito a un rapido accrescimento, una caduta della concentrazione emoglobinica. Il tasso di diminuzione dipende dallet gestazionale alla nascita. Il livello di emoglobina pu calare, a 4-8 settimane di vita, sino a 8 g/dL nei prematuri con peso alla nascita compreso fra 1.000 e 1.500 g e sino a 7 g/dL in quelli con peso alla nascita inferiore a 1.000 g3. Nonostante tali livelli, che indicherebbero, in bambini pi grandi o in adulti, uno stato anemico, i neonati si sviluppano normalmente e mantengono, di solito, unossigenazione tessutale adeguata. Le anemie fisiologiche richiedono un trattamento soltanto se il grado o il tempo di comparsa provocano nel paziente una sintomatologia evidente.
85 mL/kg, mentre i prematuri di basso peso alla nascita hanno una volemia di circa 100 mL/kg. Dato che il tasso di sopravvivenza, per i neonati che pesano 1.000 g (o meno) alla nascita, continua ad aumentare, viene sempre pi spesso richiesto alle Strutture Trasfusionali di fornire emocomponenti per pazienti, la cui volemia minore di 100 mL. La necessit di eseguire frequenti esami di laboratorio ha reso la sostituzione di queste perdite iatrogene lindicazione pi comune di trasfusione in neonati prematuri e di basso peso corporeo. Tuttavia, alla pratica precedente di rimpiazzare, mL per mL, il sangue perso si sta sostituendo quella di mantenere, in certe situazioni cliniche, un ematocrito di riferimento1. I neonati non compensano lipovolemia come gli adulti. In un neonato, dopo una perdita del 10% della propria volemia, il volume di sangue in uscita dal ventricolo sinistro diminuisce, senza che aumenti la frequenza cardiaca. Per mantenere una buona pressione arteriosa, aumentano le resistenze vascolari periferiche e ci, insieme a una gittata cardiaca diminuita, determina scarsa perfusione e scarsa ossigenazione dei tessuti e la comparsa di acidosi metabolica5. Risposta alleritropoietina La risposta allEPO dei neonati differente da quella degli adulti o dei bambini di et pi
Aspetti specifici della fisiologia neonatale

Volume corporeo e volemia del neonato I neonati a termine hanno una volemia di circa
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avanzata. Negli adulti e nei bambini di et pi avanzata, i recettori dellO2 presenti nel rene riconoscono la diminuita cessione dellO 2 e rilasciano, in circolo, EPO. Nel feto, si ritiene che i recettori dellO2 che stimolano lEPO si trovino nel fegato, organo che sembra programmato per lambiente ipossico intrauterino. La scarsa risposta allipossia protegge il feto dal diventare policitemico in utero. Col tempo, la produzione di EPO si trasferisce dal fegato al rene, un cambiamento che si ritiene regolato sul tempo del concepimento e non sulla nascita e che, forse, non inizia prima del termine della gravidanza. I neonati molto prematuri producono EPO in quantit sufficiente per ogni grado di anemia; ci potrebbe rispecchiare il mancato trasferimento del luogo di produzione dellEPO dal fegato al rene6. I neonati prematuri malati, che ricevono numerose trasfusioni subito dopo la nascita, hanno ridotti livelli di emoglobina fetale in circolo. Nei prematuri con alte proporzioni di HbA, rispetto allHbF, i livelli di EPO sono pi bassi e ci favorisce il rilascio di O2 ai tessuti6. I progenitori eritroidi nel midollo ipoproliferativo di questi prematuri mostrano una normale intrinseca sensibilit allEPO. Studi clinici sperimentali sullEPO ricombinante umana (rHuEPO), condotti in neonati prematuri, hanno evidenziato che il numero di trasfusioni e la gravit dellanemia possono essere diminuiti7. Anche gli effetti sfavorevoli indotti dalla rHuEPO sono differenti nei pazienti di questo gruppo det rispetto ai bambini di et maggiore o rispetto agli adulti, e sono caratterizzati da una neutropenia transitoria e reversibile. Da quando ci si basa su una scrupolosa adesione alle linee guida trasfusionali e sulla diminuzione dei prelievi nei neonati a bassissimo peso corporeo alla nascita, il definitivo ruolo giocato dalla rHuEPO nel trattamento della anemia del prematuro rimane non chiarito. Un recente studio multicentrico, condotto in Europa, ha evidenziato una diminuita necessit di trasfusioni quando lEPO viene somministrata neonati a peso estremamente basso alla nascita fra il 3 e il 5 giorno di vita (somministrazione precoce dellEPO), e continuata per 9 settimane8.
Il numero medio di trasfusioni sceso da 2,66 a 1,86, con diminuita esposizione al numero dei donatori da 2 a 1. Restano aperte le questioni relative alla dose ottimale, alla via di somministrazione e allimpiego di una terapia marziale supplementare1,7-10. In ogni caso, con lenorme progresso ottenuto diminuendo, con una politica trasfusionale restrittiva, il numero di esposizioni per i neonati, il ruolo dellEPO, per questo scopo, potrebbe non essere pi rilevante. Stress da freddo Un abbassamento della temperatura corporea del neonato causa effetti rilevanti: aumento del metabolismo, ipoglicemia, acidosi metabolica, tendenza a crisi di apnea che possono portare a ipossia, ipotensione e arresto cardiaco. Il sangue impiegato nelle ex-sanguino trasfusioni (ET) deve essere riscaldato, perch quello tenuto a temperatura ambiente pu indurre una diminuzione nella temperatura corporea del neonato da 0,7 a 2,5C. Il metodo pi comune quello di utilizzare un riscaldatore in linea. Il sangue, sia di grandi o piccoli volumi, non dovrebbe essere riscaldato a calore radiante, per il rischio di provocare emolisi in un apparecchio non monitorato. Quando sono somministrate trasfusioni a neonati sotto fototerapia, il set di infusione dovrebbe essere posizionato in modo da minimizzare lesposizione alla luce fototerapica per evitare lemolisi11. Stato immunologico del neonato Gli infanti hanno un sistema immune, sia cellulare che umorale, immaturo ed inesperto. Gli anticorpi (Ab) presenti derivano, quasi esclusivamente, dal circolo materno. Il passaggio transplacentare di immunoglobuline (Ig) o di altre proteine indipendente dalle dimensioni molecolari: le IgG (150 kD) passano pi prontamente e pi velocemente dellalbumina (64 kD). Nelluomo le IgM materne non giungono al feto e le IgA non sono trasferite prontamente, anche se si sono reperite, a bassi livelli, nel neonato. Tutte e quattro le sottoclassi delle IgG attraversano la placenta, ma la percentuale di
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passaggio varia fra le singole coppie madre-feto. Nella prima fase della gravidanza (nelle prime 12 settimane, circa), le IgG superano la barriera placentare probabilmente per diffusione, e la loro concentrazione nel siero fetale bassa per tutte le sottoclassi12. Fra la 20a e la 33a settimana di gestazione, il livello delle IgG nel feto aumenta considerevolmente, per la maturazione di un sistema selettivo di trasporto, che coinvolge, in parte, i recettori specifici per le proteine presenti sulla membrana delle cellule placentari. Le IgG1, che sono la sottoclasse predominante nel sangue materno, attraversano per prime la placenta e sono trasportate in grande quantit. Il sangue cordonale ha una concentrazione di anticorpi pi alta di quella del sangue materno. Il catabolismo delle IgG avviene pi lentamente nel feto che nella madre, cos che gli anticorpi materni trasferiti si mantengono nel periodo neonatale. Un feto che sia stato esposto, in utero, a un processo infettivo o un neonato, parimenti esposto subito dopo la nascita, possono produrre piccole quantit di IgM (svelabili con metodiche sensibili), ma alloanticorpi antieritrocitari inattesi, sia IgG che IgM, si formano raramente nel periodo neonatale. I meccanismi responsabili della mancata produzione anticorpale nel neonato non sono perfettamente chiariti e sono molto probabilmente multifattoriali, comprendendo un deficit della funzione delle cellule T helper, unaumentata attivit delle cellule T suppressor e una scarsa funzione delle cellule che presentano lantigene (Ag)13. La risposta immune cellulare importante per linsorgenza della Graft-versus-Host Disease associata alla trasfusione (TA-GvHD). Nel neonato, la TA-GvHD stata, molto spesso, associata ad uno stato, confermato o sospetto, di immunodeficienza congenita. Si raccomanda che i neonati con documentata o sospetta immunodeficienza delle cellule T ricevano emocomponenti irradiati. La maggioranza dei casi di TA-GvHD in soggetti immunocompromessi si manifestata in neonati che avevano ricevuto trasfusioni intra-uterine (TIU), seguite da exsanguino trasfusione nel periodo post-natale14. Una spiegazione possibile che i linfociti
somministrati durante le TIU potrebbero aver indotto una tolleranza nel ricevente, indebolendo il rigetto dei linfociti, presenti nelle successive exsanguino trasfusioni. Sono stati segnalati anche rari casi di TA-GvHD in associazione ad unestrema prematurit neonatale, a trombocitopenia neonatale alloimmune e allimpiego dellossigenazione extracorporea a membrana14,15. I neonati presentano la TA-GvHD dopo un periodo di latenza pi lungo rispetto agli adulti, con la febbre che interviene, in media, dopo 28 giorni dallesposizione e non dopo 10, come avviene per gli adulti immunocompetenti. Vi sono, altri fattori di rischio, oltre allo stato immunologico, che predispongono un ricevente alla TA-GvHD, quali il numero e la vitalit dei linfociti trasfusi e la compatibilit HLA fra donatore e ricevente. Non nota lesatta frequenza della TA-GvHD nei neonati. Tuttavia, sulla base dei dati giapponesi, sembra che tale incidenza sia pi bassa di quanto atteso 15 . Si ritiene che il meccanismo di questa, apparentemente minore, suscettibilit del neonato alla TA-GvHD sia una semitolleranza, di natura extratimica e/o timica, ai linfociti del donatore. Gli emocomponenti dedicati, provenienti da consanguinei debbono essere irradiati, come avviene per tutti i pazienti15,16. Non esistono dati che indichino la necessit di irradiare tutti gli emocomponenti da trasfondere a infanti o a bambini. Problemi metabolici Dopo trasfusioni di grandi volumi di sangue intero o di plasma, possono intervenire stati di acidosi o di ipocalcemia, perch il fegato immaturo del neonato non metabolizza il citrato in maniera efficace. I reni immaturi hanno una ridotta capacit di filtrazione glomerulare e di concentrazione e i neonati possono trovare difficolt nelleliminare eccessi di potassio, di acidi e/o di calcio. Potassio Bench i livelli di potassio (K+) aumentino rapidamente nel plasma dei globuli rossi conservati, le trasfusioni di piccoli volumi, somministrate lentamente, hanno scarso effetto sulla concentrazione sierica del K+ nei neonati.
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Si calcolato che una trasfusione di 10 mL/kg di emazie (Hct 80%), ottenute da unit di sangue conservato per 42 giorni, libererebbe 2 mL di plasma contenente soltanto 0,1 mmol/L di K+. Questa quantit molto minore della richiesta giornaliera di K+, che va da 2 a 3 mmol/L per kg di peso del paziente17. Il livello del K+ sierico, tuttavia, pu aumentare rapidamente dopo uninfusione di grandi quantit di globuli rossi, come avviene in alcune circostanze, come in corso di interventi operatori, nelle ex-sanguino trasfusioni o nella circolazione extracorporea, in rapporto al livello di K+ plasmatico del sangue e alle manipolazioni cui vengono sottoposti gli emocomponenti18,19. Ununit di concentrati eritrocitari, conservata in soluzione additiva (SA), liberer meno K+ extracellulare rispetto a un concentrato eritrocitario conservato in CPDA-116,20. Nelle unit irradiate, il problema della perdita di K+ maggiore; per particolari pazienti, preferibile lavare le cellule irradiate, qualora debbono essere conservate per pi di 24 ore19. Sono stati riferiti episodi aneddotici su infanti, che, avendo ricevuto vecchie unit di concentrati eritrocitari o unit irradiate da oltre un giorno prima della trasfusione, hanno presentato gravissime reazioni (arresto cardiaco, morte) dopo la trasfusione, con cateteri in linea o intracardiaci, di tali prodotti21,22. Debbono, comunque, essere prese in considerazione le conseguenze sfavorevoli del lavaggio, quali la riduzione dellemivita del prodotto o la possibile contaminazione batterica. preferibile eseguire lirradiazione il pi vicino possibile al momento della trasfusione, per evitare il rischio di avere alti livelli di K+ nel prodotto da infondere. 2,3-difosfoglicerato I neonati con sindrome da distress respiratorio o con shock settico hanno livelli ridotti di 2,3-DPG. Alcalosi e ipotermia possono accrescere, ulteriormente, laffinit per lO 2 da parte dellemoglobina, deviando la curva di dissociazione a sinistra e rendendo lO2 ancora meno disponibile per i tessuti. Lossigenazione arteriosa pu essere ulteriormente compromessa
dalla sindrome da distress respiratorio o da altre patologie polmonari. I meccanismi in grado di compensare lipossia nelladulto, come, per esempio, una maggior frequenza cardiaca, sono limitati nei neonati. Quando la maggior parte del volume ematico di un piccolo bambino costituita da sangue trasfuso, fortemente depauperato di 2,3-DPG, questo pu causare problemi che non si riscontrano nei bambini di et maggiore o negli adulti. Dato che il livello di 2,3-DPG diminuisce rapidamente dopo la prima settimana di conservazione, per unex-sanguino trasfusione in un neonato si dovrebbe utilizzare il sangue pi fresco disponibile (non oltre il 14 giorno). Per le trasfusioni di piccoli volumi, non si dimostrata la necessit clinica di utilizzare sangue fresco e numerose argomentazioni sono state sviluppate per suggerire che ci non necessario1,16,19.
Infezione da citomegalovirus
Si pu verificare uninfezione perinatale da citomegalovirus (CMV), acquisita o in utero o al momento del parto. I neonati si possono infettare durante lallattamento e per stretti contatti con la madre o con il personale del reparto di neonatologia. Il CMV pu anche essere trasmesso con le trasfusioni, quantunque questo rischio sia piccolo23,24. Linfezione da CMV ha, nei neonati, manifestazioni estremamente variabili, andando da una sieroconversione asintomatica, sino alla morte. Gli studi condotti sullinfezione trasfusionale da CMV nei neonati hanno prodotto le seguenti osservazioni: 1. il rischio globale di uninfezione trasfusionale asintomatica da CMV sembra essere inversamente proporzionale al tasso di sieropositivit nella popolazione locale. Quantunque molti adulti siano sieropositivi, la quota di infezioni asintomatiche da CMV nei neonati bassa; 2. linfezione sintomatica da CMV, durante il periodo neonatale, rara in figli di madri sieropositive25; 3. il rischio di uninfezione sintomatica post-
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trasfusionale alto nei prematuri ripetutamente trasfusi, quando pesano meno di 1.200 g, anche se nati da madri sieronegative17,26; 4. il rischio di acquisire uninfezione da CMV direttamente proporzionale al numero totale di donatori, cui si esposti per via trasfusionale; 5. nel sangue, il CMV contenuto nei leucociti. Il rischio di trasmettere linfezione pu essere ridotto impiegando donatori sieronegativi o utilizzando emocomponenti leucoridotti. Quantunque le emazie deglicerolizzate e lavate abbiano, anche loro, un ridotto rischio di trasmettere uninfezione da CMV, la leucoriduzione per filtrazione si dimostrata il metodo di scelta16,27-30.
Trasfusioni eritrocitarie nei bambini di et inferiore ai 4 mesi

I concentrati eritrocitari sono lemocomponente pi frequentemente trasfuso durante il periodo neonatale. Molte delle considerazioni fisiologiche menzionate in precedenza influenzano direttamente le decisioni sulle indicazioni alla trasfusione, sulla selezione e sulla somministrazione dei concentrati eritrocitari, cos come sui requisiti dei test di compatibilit. Test di compatibilit Dato che il neonato e il bambino sono immunologicamente immaturi, lalloimmunizzazione agli antigeni eritrocitari rara nel periodo neonatale. Uno studio condotto su 90 neonati, che avevano ricevuto, complessivamente, 1.269 trasfusioni da donatori differenti, non ha evidenziato alcun caso di produzione anticorpale, neanche con luso di tecniche sierologiche molto sensibili 31. Altri ricercatori hanno confermato la relativa rarit di alloanticorpi, diretti sia contro antigeni eritrocitari che HLA13,28. Considerata la rarit delle alloimmunizzazioni e che ripetute analisi causano perdite iatrogene di sangue, gli Standard AABB per le Banche del Sangue e i Servizi Trasfusionali32(p42) prevedono
soltanto pochi test sierologici pre-trasfusionali per i piccoli pazienti sotto i 4 mesi di et. I test iniziali debbono includere la tipizzazione eritrocitaria ABO e D e uno screening anticorpale, utilizzando il siero o il plasma della madre o dellinfante. Durante ogni ricovero ospedaliero, i test di compatibilit e le ripetute tipizzazioni ABO e D possono essere omessi, nelle seguenti condizioni: la ricerca per gli anticorpi antieritrocitari negativa; il sangue trasfuso O oppure ABO identico o ABO compatibile; le emazie sono D negative o D identiche a quelle del paziente. Non necessario ricercare, come parte della tipizzazione ABO, gli anticorpi anti-A e/o anti-B nel siero del bambino. Prima di trasfondere eritrociti non-O, si deve controllare il siero del neonato per la presenza di anticorpi anti-A e/o anti-B materni, passivamente acquisiti, utilizzando il test allantiglobulina. Se sono presenti tali anticorpi, si debbono utilizzare, sino a che il test non si negativizzi, emazie compatibili che non presentino gli antigeni A o B corrispondenti. In queste situazioni, non necessario eseguire la prova crociata. Se, nel campione dellinfante, si ritrova un anticorpo non diretto contro gli antigeni ABO o se il siero materno contiene un anticorpo clinicamente significativo, al piccolo debbono essere trasfuse emazie prive dellantigene (o degli antigeni) corrispondenti o unit risultate compatibili alle prove crociate eseguite con test allantiglobulina. Si deve mantenere questo comportamento sino a quando lanticorpo materno permane nel circolo del neonato. La politica delle singole istituzioni stabilir con quale frequenza si deve ricontrollare la presenza di anticorpi antieritrocitari; una volta ottenuto un risultato negativo, non pi necessario eseguire le prove crociate o trasfondere sangue privo dellantigene in causa. importante evitare di trasfondere ai neonati emocomponenti che possano trasferire anticorpi inattesi o ABO-incompatibili. Indicazioni per la trasfusione di eritrociti In periodo perinatale, alcuni eventi possono causare anemia, per la quale la trasfusione di
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concentrati eritrocitari indiscutibile. Si tratta di: emorragie feto-materne o fetoplacentari; trasfusioni da gemello a gemello; incidenti ostetrici; emorragie interne. Un valore di emoglobina venosa inferiore a 13 g/dL nelle prime 24 ore di vita indica unanemia rilevante33. Nei neonati gravemente anemici con scompenso cardiaco congestizio, necessario rimuovere quote del loro sangue diluito e trasfondere concentrati eritrocitari. Questa ex-sanguino trasfusione parziale sar in grado di prevenire un sovraccarico volemico. La maggior parte delle trasfusioni di concentrati eritrocitari nei neonati, tuttavia, si esegue o per rimpiazzare le perdite iatrogene di sangue o per trattare il calo fisiologico di emoglobina (anemia della prematurit), quando insorgono problemi clinici. Dato che le esigenze di O2 da parte dei tessuti non si possono misurare direttamente, e dato che molte variabili influenzano la disponibilit di O2, non esistono criteri, universalmente accettati, per la trasfusione di neonati prematuri o a termine. Nonostante lesteso impiego di micrometodi nei test di laboratorio o di strumenti di monitoraggio bedside e non invasivi, i neonati subiscono tuttora pesanti perdite di sangue per la raccolta dei campioni. Per un neonato malato, deve essere preso in considerazione il rimpiazzo di eritrociti, quando stato rimosso il 10% circa della volemia. La decisione di ricorrere alla terapia trasfusionale per un neonato anemico dovrebbe valutare il livello atteso di emoglobina, in relazione allet e allo stato clinico del paziente, come pure la quantit di sangue perso. Le trasfusioni possono essere pi aggressive nei neonati con sindrome da distress respiratorio, che sono ipossici e pi esposti a emorragie cerebrali. Esistono molte controversie relative alla correlazione fra i sintomi di anemia nel neonato prematuro (tachicardia, tachipnea, bradicardia, apnea ricorrente, scarso incremento ponderale) e la risposta alle trasfusioni di eritrociti1. Quando si trasfondono concentrati eritrocitari, essi sono infusi in piccola quantit, da 10 a 15 mL/kg (o anche in quantit minori se il paziente non pu tollerare tali volumi). Lematocrito del concentrati eritrocitari dipender dalla soluzione
anticoagulante/conservante utilizzata e da come lunit di partenza stata manipolata per preparare il piccolo componente da trasfondere al neonato. Una trasfusione di 10 mL/kg di eritrociti, con un ematocrito all80% subito prima della distribuzione, dovrebbe essere in grado di far aumentare la concentrazione emoglobinica di circa 3 g/dL. Una trasfusione di 10 mL/kg di emazie risospese in soluzione additiva, con un ematocrito approssimativamente del 60%, determiner un incremento post-trasfusionale di emoglobina inferiore a 3 g/dL. Concentrati eritrocitari utilizzati per le trasfusioni neonatali I piccoli volumi richiesti per le trasfusioni nei neonati rendono possibile preparare pi aliquote da una singola unit, limitando in tal modo lesposizione a pi donatori e diminuendo i rischi connessi con i donatori stessi. Sono disponibili numerose tecniche per realizzare tali vantaggi e per limitare gli sprechi34. Aliquote per trasfusioni di piccoli volumi La tecnica pi comune per preparare trasfusioni di piccoli volumi di concentrati eritrocitari utilizzare un sistema a sacche multiple34,35. Per aumentare il numero di trasfusioni a un neonato con sangue proveniente da un solo donatore, si possono utilizzare una sacca, dove viene raccolta una singola unit di sangue intero, che porta attaccati 4 contenitori satelliti. Poich la saldatura iniziale rimane integra, ciascun contenitore satellite avr una data di scadenza eguale a quella dellunit originale. Dopo la preparazione dellemocomponente, utilizzando un connettore sterile, si possono attaccare stabilmente al concentrato eritrocitario, sacche multiple (denominate sacche pediatriche) o sistemi di siringhe speciali. In questo modo, si mantiene un sistema chiuso e si pu aumentare ulteriormente il numero delle unit di piccolo volume, derivate da un solo donatore. I connettori sterili, impiegati per preparare le aliquote, possono essere utilizzati nella Struttura Trasfusionale. Se le aliquote sono invece preparate perforando la sacca, esse avranno una scadenza di 24 ore, semprech siano
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refrigerate. Ciascuna aliquota deve essere, al momento della preparazione, perfettamente etichettata, con le indicazioni del tempo di scadenza. Lorigine e la destinazione di ogni aliquota devono essere registrate. Con queste metodiche, un paziente pu essere trasfuso, sino alla data di scadenza della sacca originale, con pi unit provenienti da ununica donazione, riducendo cos il numero delle esposizioni34,36. Lo svantaggio del metodo che prepara aliquote da una singola donazione che ogni possibile patogeno trasmissibile, non individuato, potenzialmente presente nella sacca originale, pu essere diffuso a pi riceventi. Per evitare sprechi, molte Strutture Trasfusionali assegnano unit di eritrociti a uno o pi neonati, sulla base del loro peso corporeo. Per esempio, a uno o a due neonati a peso pi basso pu essere assegnata unintera unit perch, molto probabilmente, avranno necessit di ricevere pi trasfusioni, mentre questa stessa unit pu essere riservata a quattro infanti di maggior peso, dato che le loro necessit trasfusionali non saranno cos ingenti37,38. Concentrati eritrocitari in soluzioni additive Gli eritrociti per trasfusioni pediatriche sono, tradizionalmente, conservati in CPDA-135. Le soluzioni additive usate come anticoagulanti/ conservanti contengono, in aggiunta, adenina e destrosio, e, alcune, mannitolo. Esistono problemi circa i possibili effetti collaterali di questi additivi, dato che grosse quantit di adenina o di mannitolo si sono dimostrate nefrotossiche. Il mannitolo anche un potente diuretico e, a causa di questo suo effetto sulla dinamica dei liquidi nei prematuri, pu causare fluttuazioni significative nel flusso ematico cerebrale. I vari costituenti di queste soluzioni additive sono illustrati al Capitolo 8. Comunque, quando la dose di concentrati eritrocitari trasfusi piccola (da 5 a 15 mL/kg), il ricevente viene esposto a quantit relativamente scarse di soluzioni conservanti. Studi clinici, che hanno confrontato eritrociti conservati nella SA-1 e nella SA-3, non hanno dimostrato chiari effetti nocivi nei neonati trasfusi, e, dopo aggiustamento dellematocrito per gli
emocomponenti con valore basso, asportando una quota di additivo, questi si sono dimostrati altrettanto efficaci, nellaumentare lemoglobina, come quelli conservati in CPDA-1. Si dimostrato, inoltre, che gli zuccheri aggiunti aiutano lomeostasi del glucosio, rispetto a concentrati eritrocitari conservati in CPDA-139. Sono stati pubblicati studi38,40 sulla sicurezza, nei neonati, degli eritrociti conservati in SA-3. Dato che i componenti delle SA-5 sono gli stessi delle altre soluzioni additive, questa soluzione considerata accettabile per i neonati. Utilizzando calcoli teorici in differenti situazioni cliniche, Luban et al.41 hanno dimostrato che gli eritrociti preservati in soluzioni a conservazione estesa non presentano alcun rischio evidente, se impiegati per trasfusioni di piccolo volume. Per i prematuri, con gravi insufficienze epatiche o renali, pu essere, tuttavia, utile rimuovere il plasma che contiene ladditivo. Questo riveste un particolare valore, se le trasfusioni saranno ripetute, per evitare un possibile effetto di accumulo. Non stata indagata la sicurezza degli eritrociti conservati in soluzione additiva, utilizzati per trasfusioni massive, come avviene in cardiochirurgia o nelle ex-sanguino trasfusioni. Permangono, tuttora, preoccupazioni sulluso di sangue conservato in soluzione additiva, al di fuori del suo impiego per trasfusioni semplici, di piccolo volume 40,41. Considerandone, tuttavia, luso sempre pi ampio da parte dei Servizi Trasfusionali, non sono stati riferiti effetti deleteri, provocati dallinfusione di soluzione additiva42,43. Rimane da verificare se il sangue del cordone ombelicale potr essere utilizzabile per la trasfusione dei neonati. Quantunque limpiego di tale tipo di sangue autologo eliminerebbe i rischi legati alla trasmissione di malattie infettive, i dubbi su quantit, qualit e sterilit suscitano preoccupazioni relativamente a sicurezza ed efficacia18. Esecuzione delle trasfusioni spesso difficoltoso reperire un accesso vascolare nei piccoli neonati o negli infanti, sottoposti a infusioni endovenose protratte o ripetute. Entro breve tempo dalla nascita, si pu
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incannulare larteria ombelicale. Si dimostrato che le trasfusioni eseguite con aghi da 25-gauge o attraverso un catetere da 24-gauge provocano scarsa emolisi e sono sicure, se il flusso viene mantenuto costante. Non stato valutato a fondo limpiego di cateteri a diametro ancora pi piccolo. Di solito, non necessario riscaldare il sangue delle trasfusioni di piccolo volume, che sono somministrate lentamente, ma importante controllarne quantit e flusso di infusione. Questi parametri possono essere tenuti sotto controllo utilizzando pompe elettromeccaniche a siringa per infusioni a flusso che provocano minime emolisi, anche quando si usano con filtri in linea per la leucoriduzione44,45. La lunghezza dei tubi in plastica del set pu far aumentare significativamente il volume richiesto per la trasfusione. I set da infusione, adatti per trasfondere concentrati piastrinici o emocomponenti, hanno minori spazi morti rispetto a quelli standard, dato che sono pi corti e possiedono un piccolo filtro da 170. I filtri per microaggregati (20 o 40), utilizzati nelle trasfusioni pediatriche, sono impiegati perch necessitano di scarsi volumi di priming, pi che per eliminare gli aggregati. Pu prodursi emolisi quando il sangue conservato viene infuso sotto pressione negativa, attraverso tali filtri46. Non sono stati approfonditamente studiate le velocit di somministrazione dei concentrati eritrocitari, n esistono standard al riguardo. La velocit di trasfusione e i sistemi utilizzati variano nelle diverse strutture. La velocit di somministrazione del sangue e degli emocomponenti nei neonati e negli infanti dovrebbe essere personalizzata in base alle loro esigenze cliniche. Le preoccupazioni teoriche, relative ai rapidi mutamenti della volemia e del patrimonio elettrolitico di questi piccoli e delicati pazienti, riguardano soprattutto un aumentato rischio di emorragie intracraniche. Questo rischio, comunque, non stato dimostrato con sicurezza. Per trasfusioni semplici di concentrati eritrocitari, solitamente adeguato infondere il prodotto entro 2-4 ore. Quando ci sono necessit urgenti per
linsorgenza di shock o per gravi emorragie, linfusione dovrebbe essere fatta il pi rapidamente possibile. Gli emocomponenti possono essere trasfusi, in tutta sicurezza, con una variet di dispositivi. importante che i sistemi meccanici siano controllati e convalidati per il loro uso con il sangue e con gli emocomponenti. Ex-sanguino trasfusione per iperbilirubinemia Il fegato fetale ha scarse capacit di coniugare la bilirubina. In utero, la bilirubina non-coniugata attraversa la placenta per essere eliminata dal sistema epato-biliare della madre. Dopo la nascita, si instaura, di norma, nella prima settimana di vita una modica iperbilirubinemia transitoria, definita ittero fisiologico. Nei neonati prematuri, la funzionalit epatica meno matura e littero pi grave. Quando il livello di bilirubina non-coniugata eccessivo, essa pu superare la barriera ematoencefalica e concentrarsi nei nuclei della base e nel cervelletto; il danno inferto al sistema nervoso centrale (SNC) del neonato detto kernittero. La fototerapia con luce blu fluorescente il trattamento pi comune delliperbilirubinemia neonatale. Lex-sanguino trasfusione viene riservata ai casi di fallimento della fototerapia. La causa pi comune di ex-sanguino trasfusione in un neonato , quindi, la correzione di uniperbilirubinemia. I processi patologici che possono portare, nei neonati, ad eccessivi livelli di bilirubina nonconiugata sono: emolisi immuno-mediate, emolisi non immunologiche, ostacoli alleliminazione della bile, legame alterato con lalbumina. Lexsanguino trasfusione rimuove la bilirubina nonconiugata e apporta ulteriore albumina per il legame con la bilirubina residua. Se liperbilirubinemia causata da emolisi immuno-mediata, lex-sanguino trasfusione offre lulteriore vantaggio di rimuovere gli anticorpi liberi e le emazie rivestite dagli anticorpi, mentre fornisce al neonato eritrociti Ag-negativi, che avranno una sopravvivenza normale. Lex-sanguino trasfusione dovrebbe essere
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attuata prima che la bilirubina raggiunga livelli ritenuti dannosi per il SNC. Parecchi fattori influenzano la soglia della tossicit. I danni neurologici intervengono a livelli pi bassi, quando si tratta di prematuri, se diminuita la capacit legante dellalbumina, o se vi sono condizioni che complicano lo stato clinico, quali sepsi, ipossia, acidosi, ipotermia o ipoglicemia. Nei neonati a termine, si sviluppa raramente un kernittero con livelli di bilirubina inferiori a 25 mg/dL, ma, in neonati non sani a bassissimo peso corporeo, il kernittero pu intervenire a livelli molto pi bassi, da 8 a 10 mg/dL47. Il ritmo con cui la bilirubina aumenta pi predittivo sulla necessit di ricorrere immediatamente allex-sanguino trasfusione, piuttosto che il livello assoluto raggiunto. I neonati con anemia grave e con aumento rapido della bilirubina, nonostante la fototerapia, necessitano di essere sottoposti a ex-sanguino trasfusione. Unex-sanguino trasfusione di due volumi rimuove approssimativamente dal 70 al 90% degli eritrociti circolanti e circa il 25% della bilirubina totale. In conseguenza del riequilibrio fra la bilirubina extravascolare (tessutale) e quella plasmatica, i livelli possono di nuovo risalire, richiedendo una seconda ex-sanguino trasfusione48. Le indicazioni per ripetere lo scambio sono simili a quelle relative alla prima ex-sanguino trasfusione. LAccademia Americana di Pediatria ha recentemente pubblicato delle nuove linee guida relative alla gestione di neonati nati dopo la 35a settimana di gestazione con iperbilirubinemia. Ci si augura che la consapevolezza relativa alla potenziale incidenza delliperbilirubinemia in questo gruppo di pazienti possa ridurne lincidenza e offrire schemi per un suo trattamento ottimale, che comprenda, oltre la fototerapia, anche lex-sanguino trasfusione e luso di immunoglobuline endovena (IGIV)49. Ex-sanguino trasfusione per altre cause Dovrebbe essere valutata, caso per caso, sulla base di linee guida pubblicate in letteratura, la sicurezza e lefficacia dellex-sanguino trasfusione in periodo neonatale, per altre
indicazioni. Sono state elencate diverse categorie di condizioni morbose, sulla base degli effetti benefici accertati o teorici (vedi Tabella 6.1). Il trattamento della coagulazione intravascolare disseminata (CID) con ex-sanguino trasfusione ha fornito risultati variabili, probabilmente perch si sono trattati soltanto i neonati pi gravi. Laspetto pi importante, in casi di CID neonatale, di trattare la malattia di base. Lex-sanguino trasfusione stata impiegata, occasionalmente, per rimuovere sostanze tossiche, quali farmaci o altri prodotti chimici dati alla madre in prossimit del parto, o somministrati al neonato in dose tossica o sostanze come lammoniaca che si pu accumulare nel neonato per prematurit o per disordini metabolici ereditari50,51. Tecnica dellex-sanguino trasfusione Scelta dellemocomponente Lex-sanguino trasfusione viene eseguita con eritrociti risospesi in plasma fresco congelato (PFC) compatibile, dopo il suo scongelamento. Quando si utilizzano concentrati eritrocitari in soluzione additiva, in alcune condizioni cliniche, alcune Strutture Trasfusionali potranno scegliere di rimuovere il plasma contenente ladditivo, per ridurre il volume da trasfondere. Come discusso in precedenza, pu non essere necessario lavare gli emocomponenti. Molte Strutture Trasfusionali utilizzano eritrociti privi di HbS, al fine di evitare la loro possibile falcemizzazione intravascolare. La quantit di glucosio somministrato nel corso di unex-sanguino trasfusione pu essere molto alta. Questo stimola il neonato a secernere insulina, che pu essere alla base di una ipoglicemia reattiva. importante monitorare i livelli di glicemia nelle prime ore dopo la procedura. Dato che la bilirubina non-coniugata si lega allalbumina, questultima viene impiegata per incrementare il legame intravascolare. Con albumina supplementare in circolo, la bilirubina si diffonde dallo spazio extravascolare a quello intravascolare. Ci aumenta la quantit totale di bilirubina rimossa durante lo scambio.
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Si sono avuti, tuttavia, risultati contrastanti sullefficacia di somministrare albumina sia prima che durante unex-sanguino trasfusione per aumentare la rimozione della bilirubina. Uno studio ha confrontato 15 neonati iperbilirubinemici, cui era stata somministrata albumina, con 27 che non lavevano ricevuta e si avuta la stessa efficienza di rimozione nei due gruppi 52. Linfusione di albumina aumenta la pressione colloido-osmotica ed incrementa la volemia. Lalbumina dovrebbe, quindi, essere somministrata con prudenza a neonati o a infanti gravemente anemici, in quelli che presentano unaumentata pressione venosa centrale o che hanno uno scompenso renale o cardiaco congestizio. Lex-sanguino trasfusione pu causare una piastrinopenia e/o una coagulopatia da diluizione, che richiedono la trasfusione di concentrati piastrinici (CP) e/o linfusione di plasmaderivati che contengono fattori della coagulazione. Dopo unex-sanguino trasfusione dovrebbero essere monitorati la conta piastrinica e i parametri coagulativi. Volume ed ematocrito Per i neonati viene usualmente raccomandata unex-sanguino trasfusione equivalente a due volte la volemia del paziente: raramente viene richiesta pi di ununit di sangue donato. Nella pratica, il volume calcolato per lex-sanguino trasfusione il prodotto di una stima. Lematocrito finale del sangue trasfuso dovrebbe essere, approssimativamente, del 40-50% con una quantit sufficiente di plasma per fornire, se necessario, i fattori della coagulazione. Nella rara situazione che il neonato necessiti di un ematocrito alto post-scambio, possono essere effettuate trasfusioni di piccolo volume dopo lo scambio o possono essere utilizzate, nellex-sanguino trasfusione, unit ad alto ematocrito. Durante lo scambio, importante mantenere il sangue in agitazione: se sistemate in un contenitore statico, le aliquote finali non avranno lematocrito desiderato. Lematocrito del neonato e il livello della sua bilirubina dovrebbero essere misurati sullultima
aliquota rimossa nellex-sanguino trasfusione. Accessi vascolari Nel neonato, lex-sanguino trasfusione viene eseguita, di norma, utilizzando un catetere nei vasi ombelicali. E pi semplice eseguire il cateterismo entro poche ore dalla nascita, ma possibile utilizzare questo accesso anche parecchi giorni dopo. I cateteri dovrebbero essere radio-opachi per facilitare il monitoraggio radiografico durante e dopo il loro posizionamento. Se non sono disponibili, per lex-sanguino trasfusione, cateteri ombelicali, possono essere impiegati piccoli cateteri venosi centrali o cateteri safeni. Metodi utilizzati Due sono i metodi utilizzati comunemente, per eseguire unex-sanguino trasfusione. Nel metodo isovolumetrico, si utilizzano, per laccesso vascolare, due cateteri di dimensione identica. Prelievo e infusione avvengono in contemporanea, regolati da una singola pompa peristaltica. Di solito si usa larteria ombelicale per il prelievo e la vena ombelicale per linfusione. La tecnica manuale (preleva e infondi) pu essere realizzata, utilizzando un solo accesso vascolare. Una siringa a tre vie (con rubinetti) collega lunit di sangue da trasfondere, il paziente e un tubo collegato con un contenitore graduato per il sangue da eliminare. Un riscaldatore in linea e un filtro standard per sangue dovrebbero essere incorporati nel set da infusione. Il volume massimo di ogni singolo prelievo e di ogni singola infusione sar regolato in base al peso del neonato e al suo stato emodinamico. La velocit con il quale viene eseguita lex-sanguino trasfusione, pu alterare lo stato emodinamico del paziente. importante che siano garantite accurate registrazioni nel corso di unex-sanguino trasfusione. La procedura dovrebbe durare da unora a unora e mezza.
Trasfusione di altri emocomponenti

Bench sia diminuita, a partire dagli anni 80,
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la percentuale di neonati di peso molto basso o di bassissimo peso corporeo alla nascita da sottoporre a trasfusione, ci si attende ancora che una percentuale compresa fra il 61 e il 94% di tali infanti debba ricevere numerose trasfusioni di eritrociti. I pazienti pi piccoli sono quelli che ricevono il pi alto numero di trasfusioni. Si ritiene che una percentuale notevolmente pi bassa di infanti ricever altri emocomponenti1,9,53,54. Trasfusioni piastriniche La normale conta piastrinica dei neonati simile a quella di un adulto. Un conteggio inferiore a 150.000 piastrine (PLT) per microlitro, in un neonato a termine o in un prematuro, da considerare anormale. Circa il 20%, dei neonati ricoverati presso unit di terapia intensiva mostra una piastrinopenia, da lieve a moderata: questa trombocitopenia la pi comune anomalia emostatica nellinfante malato55. La piastrinopenia neonatale pu essere causata da unalterata produzione o da unaumentata distruzione di PLT, da anormale distribuzione o da un effetto di diluizione provocato da trasfusioni massive, quali lex-sanguino trasfusione. La causa pi comune rappresentata da una accresciuta distruzione, indotta da molte condizioni e, di norma, transitoria. La trombocitopenia neonatale alloimmune viene discussa nel Capitolo 23. Indicazioni La trasfusione di concentrati piastrinici indicata in neonati o in infanti, con una conta di PLT inferiore a 50.000/L, e con emorragie in atto 55. Luso profilattico della trasfusione di concentrati piastrinici resta controverso. Negli adulti piastrinopenici, il rischio di una grave emorragia raro, a meno che la conta non scenda sotto le 10.000 PLT/L56. Al contrario, i prematuri e gli infanti affetti da malattie, che ne complicano lo stato clinico, possono sanguinare anche con conteggi pi alti di piastrine. I fattori, che contribuiscono a questo aumentato rischio di emorragie, comprendono: una bassa concentrazione dei fattori della coagulazione; la presenza in circolo di anticoagulanti che
inibiscono la trombina; le anomalie funzionali intrinseche o estrinseche delle PLT; unaccresciuta fragilit vascolare57. Il problema di maggiore preoccupazione dato dallemorragia intraventricolare, che colpisce oltre il 40% dei prematuri nelle prime 72 ore di vita. Quantunque le trasfusioni profilattiche aumentino il numero delle piastrine e accorcino il tempo di sanguinamento in tali prematuri, lincidenza e la dimensione dellemorragia intraventricolare non vengono ridotte57. A causa dellapparente mancanza di benefici clinici, luso di trasfusioni di concentrati piastrinici in tali condizioni cliniche resta controverso, cos come la scelta della dose ottimale. Per valutare la sopravvivenza in circolo delle piastrine trasfuse, si pu procedere a un conteggio subito dopo linfusione, ma questo non ne predice lefficacia emostatica. Senza un appropriato aumento nel conteggio, le trasfusioni di concentrati piastrinici possono non essere vantaggiose. Caratteristiche dei concentrati piastrinici Una dose da 5 a 10 mL di concentrati piastrinici per kg di peso corporeo dovrebbe far salire la conta in un neonato a termine da 50.000 a 100.000 PLT/L, ci dipendendo dalla concentrazione di piastrine nellemocomponente trasfuso17,57. Il concentrato piastrinico dovrebbe essere, se possibile, gruppospecifico e non dovrebbe contenere anticorpi antieritrocitari clinicamente significativi. La trasfusione di plasma ABOincompatibile pi pericolosa negli infanti che negli adulti, a causa della loro volemia molto ridotta. Se necessario trasfondere concentrati piastrinici contenenti plasma incompatibile (per presenza di anticorpi ABO o diretti verso altri antigeni gruppoematici), il plasma deve essere rimosso (vedi Metodo 6.15) e le piastrine debbono essere risospese in soluzione fisiologica. Se il ricevente richiede anche fattori della coagulazione, pu essere utilizzato, come mezzo di sospensione, il plasma fresco congelato, che comporta, peraltro, il rischio di trasmissione di malattie infettive. Normalmente non necessaria la centrifugazione per ridurre il volume del concentrato53,55. Se il componente
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di ridotto volume ed posto in una siringa, si registra un calo rapido del pH, il che costituisce un problema potenziale per il ricevente malato e affetto da acidosi58. Pertanto, se esiste la necessit di ridurre il volume delle piastrine da trasfondere, necessario farlo subito prima della trasfusione e il componente va infuso entro 4 ore, qualora sia preparato in un sistema aperto. Trasfusione di granulociti I neonati sono pi suscettibili alle gravi infezioni batteriche rispetto a bambini di et maggiore, a causa di difetti, sia quantitativi che qualitativi, delle funzioni dei neutrofili (cellule polimorfonucleate o PMN) e, in caso di assenza di anticorpi materni patogeno-specifici, anche di deficit dellimmunit umorale. Gli streptococchi di gruppo B sono la causa pi frequente di precoci sepsi neonatali e, nonostante i miglioramenti nelle terapie antimicrobiche e nelle cure intensive, le sepsi sono tuttora associate a un alto tasso di mortalit. Le trasfusioni di concentrati granulocitari (CG) presentano numerose e controverse problematiche riguardanti le dosi, il livello di neutrofili sotto il quale trasfondere e la loro efficacia, quando paragonate ad altre forme di terapia 59. Poich sembra che lefficacia sia correlata alla dose, la minore volemia di neonati e bambini pu essere determinante, in questi pazienti, per ottenere una risposta migliore a questa forma di terapia. Una meta-analisi, pubblicata nel 1996 60, ha concluso che dosi maggiori di 1 x 109 di PMN/kg danno una risposta clinica migliore60. Sono preferibili i concentrati granulocitari ottenute per aferesi, rispetto a quelli preparati da buffy-coat, in quanto consentono raccolte pi consistenti17,60. I prodotti raccolti da donatori stimolati con fattori di crescita granulocitaria (GCSF) e con steroidi possono essere pi abbondanti rispetto a quelli prelevati a donatori non stimolati. Ci sono state alcune incoraggianti osservazioni sulluso di IGIV nel trattamento delle sepsi neonatali precoci, quantunque dati contradditori abbiano determinato un mancato consenso sul loro impiego59.61-64. Studi preliminari sullutilizzo dei fattori di crescita ematopoietici (G-
CSF) si sono dimostrati promettenti nel trattamento di infezioni batteriche catastrofiche nel neonato59,61,65,66. Per gli adulti e per i bambini di et maggiore, si raccomanda una dose minima di 1 x 1010 PMN/kg60,67,68. Indicazioni Quantunque il ruolo preciso delle trasfusioni di granulociti nelle sepsi neonatali non sia chiaro, esistono alcune situazioni cliniche per le quali la trasfusione di concentrati granulocitari pu essere presa in considerazione, in associazione alla terapia antibiotica. I candidati per una potenziale trasfusione di concentrati granulocitari sono gli infanti con grave setticemia batterica, quelli con una conta di neutrofili inferiore a 3.000/L e una diminuita riserva midollare, che abbiano, nel pool midollare di cellule nucleate, meno del 7% di granulociti, allo stato di metamielociti o di forme pi mature18,69. Caratteristiche dei concentrati granulocitari I granulociti vengono raccolti con le tecniche aferetiche standard. Per gli infanti, viene raccomandata una dose di 10-15 mL/kg, che equivale a circa 1- 2 x 109 PMN/kg17,70. Poich le funzioni dei neutrofili nei neonati sono spesso alterate, limpiego di trasfusioni granulocitarie pu essere vantaggioso nei pazienti di questo gruppo det17,60,67,70-72. La somministrazione deve essere continuata quotidianamente fino a che non si raggiunga unadeguatamassa leucocitaria o non si consegua un miglioramento clinico nel paziente. Sulla base della presenza, nei concentrati granulocitari, di un gran numero di linfociti, vi generale consenso sul fatto che tutti i concentrati granulocitari debbano essere irradiati per prevenire una graft versus host disease. Per le trasfusioni granulocitarie ai neonati, i donatori vengono, di solito, scelti fra quelli CMV-negativi e ABO-compatibili con il paziente, secondo i requisiti degli Standard AABB32(p40), considerato il gran numero di eritrociti presenti in questi emocomponenti. Molte Strutture Trasfusionali forniscono concentrati granulocitari compatibili anche per lantigene D (vedi Capitolo 21).
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Trasfusioni per potenziare lemostasi Gli elementi del sistema emostatico del neonato sono simili a quelli dei bambini di et maggiore e a quelli delladulto, ma la concentrazione di molte proteine plasmatiche pi bassa. I fattori della coagulazione non superano la barriera placentare, ma sono sintetizzati, indipendentemente, dal feto. I livelli plasmatici di queste proteine aumentano progressivamente con let gestazionale. Alla nascita, il tempo di protrombina e il tempo di tromboplastina parziale attivata sono prolungati, rispetto a quelli dei bambini di et maggiore e degli adulti, soprattutto a causa dei bassi livelli fisiologici dei fattori vitamina K-dipendenti (II, VII, IX e X) e dei fattori di contatto (XI, XII, precallicreina, chininogeno ad alto peso molecolare)73. Anche gli inibitori della coagulazione (proteina C, proteina S e antitrombina) hanno una concentrazione pi bassa. Questi due sistemi normalmente sono in equilibrio tra di loro, cos che sanguinamenti spontanei e trombosi sono rari nel neonato sano, ma vi una scarsa capacit di risposta a situazioni patologiche. Di conseguenza, possono intervenire gravi emorragie nella prima settimana di vita di un prematuro malato, come risultato di unimmaturit emostatica associata a un difetto acquisito dellemostasi. Oltre ad avere bassi livelli dei fattori vitamina K-dipendenti, i neonati possono anche presentare, durante i primi giorni di vita (dal 2 al 5), un deficit di vitamina K, che li mette a rischio di emorragie. Questa malattia emorragica del neonato rara nei Paesi sviluppati, dove, alla nascita, viene somministrata di routine vitamina K per via intramuscolare. Se non viene eseguita la somministrazione di vitamina K, nei neonati, soprattutto se nutriti al seno, possono insorgere delle emorragie, che ne mettono in pericolo la vita. Queste emorragie vengono trattate con plasma fresco congelato2,74. Quantunque i deficit ereditari dei fattori della coagulazione possono evidenziarsi nel neonato, rari sono i sanguinamenti importanti. Le coagulopatie neonatali dipendono, pi frequentemente, da difetti acquisiti, come malattie epatiche o CID74. Sebbene la terapia di rimpiazzo
possa correggere, temporaneamente, i problemi emostatici, il trattamento della malattia di base ridurr, fondamentalmente, la necessit di trattare il difetto acquisito. I neonati, eterozigoti per un deficit delle proteine inibitrici, hanno raramente delle complicanze in assenza di altre situazioni patologiche. Lomozigosi per il deficit di proteina C ha tuttavia causato, nel periodo neonatale, complicazioni di tipo trombotico, rischiose per la vita. Nei Paesi in cui sono disponibili, i concentrati di proteina C preparati da plasma umano dovrebbero essere usati per il trattamento di neonati omozigoti con deficit di proteina C e che presentano una porpora fulminante. Negli USA, i concentrati di proteina C possono essere disponibili per un uso compassionevole. In alternativa viene utilizzata la trasfusione di plasma per liniziale trattamento di un evento acuto, con la successiva terapia anticoagulante a lungo termine74,75. Plasma fresco congelato Il plasma fresco congelato (PFC) pu essere utilizzato per ricostituire nei neonati i fattori della coagulazione, particolarmente quando sono coinvolti pi fattori, come nel caso di deficit di vitamina K. La dose abituale va da 10 a 15 mL/kg ed in grado di aumentare lattivit dei fattori dal 15 al 20%, a meno che non sia presente una seria coagulopatia da consumo74. Come nel caso delle trasfusioni di concentrati eritrocitari, esistono parecchi metodi per effettuare trasfusioni di piccole quantit di plasma fresco congelato, limitando il numero di donatori a cui si esposti e lo spreco di emocomponenti. Il sangue pu essere raccolto in sistemi con sacche multiple, in modo da avere cos pi aliquote di plasma da congelare 34. Una volta scongelate, queste aliquote possono essere ulteriormente suddivise e utilizzate, entro 24 ore, per diversi pazienti. Se non utilizzate entro 24 ore, il plasma scongelato (mantenuto fra 1 e 6 C) pu essere ancora impiegato con lo scopo di diminuire il numero di esposizioni. Come per tutti i pazienti, il plasma deve essere
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ABO-compatibile col neonato e privo di anticorpi inattesi, clinicamente significativi. Viene spesso utilizzato plasma fresco congelato di gruppo AB, in quanto una singola unit in grado di fornire, contemporaneamente, piccole aliquote compatibili per neonati diversi, che richiedano plasma contemporaneamente. Crioprecipitato Il CRIO ricco di fibrinogeno, di FVIII, di FXIII e di Fattore von Willebrand. Questo componente viene spesso impiegato, insieme a trasfusioni di concentrati piastrinici, per trattare la CID nei neonati. Nella CID, il fibrinogeno e le piastrine sono gli elementi pi frequentemente e seriamente diminuiti. Il plasma, nel quale sono risospese le piastrine, una fonte di fattori stabili della coagulazione. Il CRIO fornisce livelli concentrati di ulteriore fibrinogeno e di FVIII, che labile alla conservazione. Per un neonato, sufficiente una sacca di CRIO per ottenere buoni livelli emostatici. Come per il plasma fresco congelato e le piastrine, il CRIO deve essere ABO-compatibile con il neonato. Non consigliabile, come terapia di primo livello in un neonato con emofilia A, luso di CRIO proveniente da donatore dedicato, in quanto sono disponibili alternative pi sicure. Il trattamento standard si basa sul FVIII ricombinante o virus-inattivato, su concentrati purificati con anticorpi monoclonali, su plasmaderivati76. Per trattare la malattia di von Willebrand, il CRIO dovrebbe essere usato, soltanto come ultima risorsa, quando non si hanno a disposizione prodotti pi sicuri. Maggiori informazioni sulluso del CRIO si possono trovare al Capitolo 21.
in rapporto allet gestazionale o nati da madri diabetiche, hanno un rischio maggiore di sviluppare una policitemia. Quando lematocrito sale oltre il 65%, la viscosit ematica aumenta in modo esponenziale e fa diminuire il trasporto di O2. Laumento pu intervenire, nei neonati, anche con un ematocrito vicino al 40%77. I neonati hanno una limitata capacit di aumentare la gittata cardiaca per compensare liperviscosit e possono sviluppare uno scompenso cardiaco congestizio. Il peggioramento del flusso sanguigno pu causare danni al SNC, scompensi polmonari e renali, enterocoliti necrotizzanti. Il salasso pu essere utilizzato per normalizzare lematocrito a valori del 55-60% e per migliorare la perfusione tessutale, mentre viene mantenuta la volemia. Nel trattamento della policitemia, il sangue viene rimosso dal circolo e sostituito da soluzioni cristalloidi (come la soluzione fisiologica) in quantit necessarie, tenendo conto delle condizioni cliniche dellinfante. Non si raccomanda luso di plasma, perch la quantit utilizzata sar insufficiente a correggere in tutti i casi qualsiasi tipo di coagulopatia e perch stato riportato un caso di enterocolite necrotizzante utilizzando questa procedura78. La seguente formula47 pu fornire indicazioni sul volume delle soluzioni colloidi di sostituzione (e sul volume di sangue da sottrarre): volume liquido di sostituzione = volemia x (Hct osservato Hct desiderato) Hct osservato
Ossigenazione extracorporea a membrana

Lossigenazione extracorporea a membrana o ECMO (ExtraCorporeal Membrane Oxygenation) una tecnica di by-pass cardio-polmonare per trattare, a breve termine, scompensi cardiaci o respiratori. Si esegue presso centri specializzati e soltanto in pazienti nei quali la terapia medica convenzionale fallita, e la sopravvivenza, legata a terapia convenzionale, si prevede limitata (vedi
Policitemia neonatale
Un ematocrito venoso maggiore del 65% o una emoglobina maggiore di 22 g/dL, in qualsiasi momento della prima settimana di vita, definiscono una policitemia, condizione che si presenta nel 5% circa di tutti i neonati. I neonati di basso peso
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Tabella 24.2). Al di fuori dei neonati, limpiego dellECMO non diffuso. Tabella 24.2 - Stati morbosi trattati con ECMO Aspirazione di meconio Ernia diaframmatica Ipertensione polmonare permanente del neonato Grave sepsi da streptococchi di gruppo B
Gli specialisti ECMO dovrebbero essere in stretto contatto con il personale delle Strutture trasfusionali, e dovrebbe esservi un mutuo consenso sui protocolli, al fine di verificare la validit del trattamento. Molti neonati che necessitano del trattamento ECMO sono trasferiti da altri ospedali, dove potrebbero essere stati sottoposti a ripetute trasfusioni. Tabella 24.4 - Controindicazioni dellECMO
La terapia riporta maggiori successi negli infanti, i cui piccoli volumi di sangue permettono unassistenza cardio-polmonare globale e il cui problema respiratorio principale spesso si risolve dopo 1 o 2 settimane di assistenza. LECMO fornisce uno scambio di gas indipendentemente dai polmoni del paziente, dando tempo per il miglioramento e la guarigione senza esporlo a tecniche di ventilazione aggressiva e senza danni ai polmoni, che tali tecniche possono determinare79. Ogni centro ECMO stabilisce i criteri per le trasfusioni e la scelta degli emocomponenti, mentre si abbandonano le pratiche trasfusionali standard. Considerato linsieme dei numerosi fattori presenti (eparinizzazione sistematica, alterata funzionalit piastrinica, trombocitopenia, altri difetti coagulativi) cos come gli stessi circuiti dellECMO, le complicanze emorragiche sono frequenti. Tabella 24.3 - Rischi dellECMO Emorragie Trombosi Trombocitopenia Neutropenia Alterata funzionalit piastrinica Stroke Accessi epilettici Embolie gassose Emolisi Ipertensione sistemica Complicazioni infettive connesse con la trasfusione
Alto rischio di emorragia intraventricolare Pneumopatia irreversibile Sanguinamento sistematico Asfissia grave Presenza di malformazioni letali
Linsieme del supporto trasfusionale con concentrati eritrocitari, concentrati piastrinici e plasma fresco congelato, necessario per mantenere gli equilibri ematologici ed emodinamici, varier in base alla situazione clinica del paziente, sempre seguendo i pertinenti protocolli delle diverse strutture68. In corso di trasfusione piastrinica, molti medici, per evitare danni alle piastrine, ritengono sia importante infonderli attraverso un accesso periferico, mentre altri li trasfondono direttamente nel circuito ECMO, dove tutto il sangue, in definitiva, circola. anche importante monitorare il livello del calcio ionizzato e, se necessario, somministrarlo47,79 (vedi Tabelle 24.3 e 24.4).
Leucoriduzione
Rimangono controversi gli effetti benefici della leucoriduzione degli emocomponenti da trasfondere ai neonati e ai piccoli infanti. La difficolt di individuare le reazioni trasfusionali in questa categoria di pazienti rende il problema difficile da studiare. Inoltre, i neonati raramente si immunizzano, data limmaturit del loro sistema
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immune durante questo periodo di sviluppo. Nei neonati, il ridotto rischio di trasmissione del CMV il solo beneficio ben documentato16,30,80 della leucoriduzione, come discusso in precedenza16,30,80. di particolare interesse uno studio recente81, condotto in Canada, che ha paragonato i risultati clinici in prematuri che pesavano meno di 1.250 g, prima e dopo limplementazione della leucoriduzione globale in quel Paese. Bench non vi fosse stata nessuna diminuzione nella mortalit e nellincidenza di batteriemie, alcuni risultati clinici sono migliorati, come quelli relativi alla retinopatia dei prematuri e alla displasia broncopolmonare. Anche la durata delle degenze diminuita con la leucoriduzione globale81.
ulteriori condizioni cliniche, che possono aumentare il rischio di sviluppare unipossia. Se sono richieste trasfusioni di volumi piccoli, si potrebbero applicare molti dei metodi descritti per le trasfusioni nei neonati. Prima di una trasfusione di concentrati eritrocitari, tutti i pazienti pediatrici di et superiore a 4 mesi di et debbono essere tipizzati per il gruppo ABO e D e analizzati per la presenza di anticorpi antieritrocitari clinicamente significativi. I test di compatibilit debbono essere condotti secondo le metodiche descritte negli Standard AABB 32(pp37-41). da segnalare un abstract che ha riportato come la leucoriduzione diminuisca lincidenza delle reazioni trasfusionali febbrili non-emolitiche in pazienti pediatrici affetti da malattie ematologiche o neoplastiche82. Supporto eritrocitario nei bambini affetti da emoglobinopatie In alcune condizioni pediatriche, viene effettuato un supporto trasfusionale cronico con concentrati eritrocitari non solamente per trattare lipossia, ma anche per sopprimere la produzione endogena di emoglobina. Dal 6% al 10% dei bambini affetti da drepanocitosi vanno incontro ad accidenti cerebrovascolari (stroke), che, nei due terzi dei casi, tendono a ripetersi83. Lo scopo delle trasfusioni in questi pazienti quello di ridurre il rischio di stroke, diminuendo la percentuale in circolo di eritrociti in grado di falcemizzare, mentre si evita, contestualmente, un aumento della viscosit ematica. importante ricordare che laumento dellematocrito, senza una riduzione significativa delle cellule falcemiche, potrebbe accrescere la viscosit e annullare ogni effetto benefico della trasfusione83,84. Nei bambini che hanno sofferto di accidenti cerebro-vascolari, lincidenza di stroke ricorrenti pu essere ridotta a meno del 10%, mantenendo il livello di emoglobina fra 8 e il 9 g/dL, con un tasso di HbS inferiore al 30%. Questo pu di norma essere ottenuto con una semplice trasfusione o con una parziale exsanguino trasfusione, ogni 3-4 settimane. Il trattamento trasfusionale deve essere continuato indefinitivamente, dato che la sua cessazione pu
Pratiche trasfusionali nei bambini di et superiore a 4 mesi

Le indicazioni relative alle trasfusioni di concentrati eritrocitari o di altri emocomponenti negli bambini di et superiore ai 4 mesi sono simili a quelle degli adulti, ma si debbono prendere in considerazione le differenze di volemia, la loro capacit di tollerare perdite di sangue, e i livelli di emoglobina e di ematocrito appropriati allet. La pi comune indicazione per la trasfusione di concentrati eritrocitari nei bambini quella di trattare o prevenire lipossia tissutale, dovuta a una diminuita massa eritrocitaria in seguito ad interventi chirurgici o ad anemie causate da malattie croniche o da forme ematologiche maligne. Bisogna tenere presente che i livelli normali di emoglobina e di ematocrito sono pi bassi nei bambini rispetto agli adulti. I pazienti pediatrici possono rimanere asintomatici anche con livelli estremamente bassi di emoglobina, in particolar modo se lanemia si sviluppata lentamente. La decisione di trasfondere si dovrebbe basare non soltanto sul livello di emoglobina, ma anche sulla presenza o sullassenza di sintomatologia, sulle capacit funzionali del bambino, sulleziologia dellanemia, sulle possibilit di impiegare terapie alternative, sulla presenza o sullassenza di
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portare a un successivo stroke83,84. Considerati i problemi relativi al sovraccarico marziale, alcuni trasfusionisti hanno fatto seguire, dopo diversi anni di terapia trasfusionale mirata a mantenere il livello di HbS al di sotto del 30% e senza effetti sfavorevoli, protocolli meno aggressivi, che mantengono lHbS fra il 40 e il 50%84. Leritrocitoaferesi si dimostrata in grado di migliorare il bilancio marziale in un piccolo gruppo di pazienti85. Adams et al.86 hanno dimostrato che mantenere, in bambini con risultati anomali al Doppler trans-craniale a ultrasuoni, il livello di HbS al di sotto del 30% riduce il rischio di un primo accidente cerebro-vascolare. I benefici di questa terapia trasfusionale devono essere tuttavia soppesati con le complicazioni della trasfusione, quali il sovraccarico marziale, le alloimmunizzazioni e i rischi di aumentare, con le eritrocitoaferesi, lesposizione a pi donatori. La trasfusione semplice aumenta la viscosit ematica, mentre lo scambio eritrocitario no. Il sangue da trasfondere a un paziente drepanocitico dovrebbe, in teoria, essere selezionato per la presenza di HbS. Oggi, inoltre, la maggioranza delle Strutture Trasfusionali fornisce, per i pazienti affetti da anemia falciforme, sangue leucoridotto per prevenire unalloimmunizzazione piastrinica, che potrebbe complicare un eventuale trapianto87. Le trasfusioni di concentrati eritrocitari sono anche impiegate per il trattamento delle complicazioni acute della drepanocitosi, quali il sequestro splenico e le crisi aplastiche88. La sindrome toracica acuta, costituita da nuovi infiltrati polmonari nei pazienti falcemici, oltre che dallatelettasia, con ulteriore sintomatologia polmonare e febbre, comporta, se non trattata, una prognosi sfavorevole. Per migliorare lossigenazione, si possono impiegare, come primo mezzo terapeutico, trasfusioni semplici. Per i pazienti che continuano a peggiorare o che non migliorano, si dovrebbe ricorrere allo scambio eritrocitario. Al riguardo, non esistono studi randomizzati e controllati che paragonino le trasfusioni semplici agli scambi89. Uno studio, volto a valutare i protocolli trasfusionali pre-operatori, ha evidenziato come un protocollo
conservativo, dove lemoglobina veniva portata sino a 10 g/dL, sia stato ugualmente efficace nel prevenire complicazioni peri-operatorie rispetto ad un protocollo aggressivo in grado di diminuire i livelli di HbS al di sotto del 30%90. I pazienti drepanocitici sono a rischio anche di serie reazioni trasfusionali emolitiche ritardate, che potrebbero essere fatali per la simultanea soppressione delleritropoiesi. Quando il livello di emoglobina di un paziente diminuisce dopo una trasfusione, si dovrebbe sospettare lesistenza di una sindrome iperemolitica, nella quale sembra che gli eritrociti autologhi siano distrutti attraverso un meccanismo tipo spettatore innocente. In tale situazione, la terapia trasfusionale dovrebbe essere sospesa e dovrebbero essere prese in considerazione o una terapia con corticosteroidi o una terapia combinata di steroidi e IGIV, sulla base di alcune segnalazioni sulla loro efficacia clinica91,92. In questi pazienti si possono anche sviluppare, dopo la trasfusione, autoanticorpi93. Nella speranza che diminuisca la necessit di trasfusioni, dovrebbero essere ricercate altre alternative mediche. Una terapia consiste nellimpiego di idrossiurea, nel tentativo di aumentare la percentuale di HbF. In presenza di una pi alta percentuale di cellule con HbF, la produzione di polimeri di HbS si riduce. Si trovato, inoltre, che la concomitante diminuzione dei neutrofili, indotta dalla somministrazione didrossiurea, si associa, indipendentemente, a una riduzione di frequenza delle crisi94. Anche il trapianto di midollo osseo stato impiegato in alcuni pazienti e pu giocare, in futuro, un ruolo importante nel trattamento dei pazienti affetti da anemia falciforme95,96. Nei bambini affetti da talassemia, con anemia grave, la trasfusione non migliora soltanto lossigenazione tessutale, ma sopprime anche leritropoiesi. Sopprimendo leritropoiesi inefficace, molte delle complicazioni associate alla malattia migliorano. Il regime cosiddetto ipertrasfusionale, nel quale il livello di emoglobina pretrasfusionale viene mantenuto fra 8 e 9 g/dL, permette crescita e sviluppo normali, come pure normali livelli di attivit in relazione allet del bambino.
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Il regime supertrasfusionale ha lo scopo di mantenere una concentrazione emoglobinica pretrasfusionale fra 11 e 12 g/dL, al fine di ridurre lassorbimento di ferro da parte del tratto gastroenterico. Sono ancora oggetto di controversie i risultati relativi al mantenimento di unemoglobina a livelli quasi normali. Il sovraccarico marziale una complicazione del trattamento e richiede la terapia chelante, da iniziare precocemente nellinfanzia97. Produzione di anticorpi nei pazienti affetti da drepanocitosi e da talassemia La frequenza di alloimmunizzazione antieritrocitaria nei bambini politrasfusi varia in rapporto alla malattia, allet di inizio della terapia trasfusionale, al numero di trasfusioni effettuate e allorigine etnica dei donatori e dei riceventi, quantunque i pazienti affetti da anemia falciforme siano quelli con una maggiore frequenza di alloimmunizzazione rispetto ad altri gruppi di pazienti98-100. Gli anticorpi pi frequentemente identificati sono diretti verso antigeni dei sistemi Rh, Kell, Duffy e Kidd. Pu essere prudente, quindi, prima di iniziare la terapia trasfusionale, tipizzare il pi largamente possibile, per i vari fenotipi, le emazie del paziente, e conservare la registrazione di tali risultati. Questo aiuter nel selezionare sangue compatibile quando si verifica una alloimmunizzazione. Vi sono evidenze che il trasfondere eritrociti K, C ed E negativi riduce sensibilmente lincidenza delle immunizzazioni101. La pratica di trasfondere soltanto unit di eritrociti fenotipicamente compatibili , tuttavia, controversa, soprattutto in quei riceventi che non hanno ancora sviluppato anticorpi, considerando la difficolt di reperire tali unit83,102. Una recente indagine, condotta da 50 centri universitari statunitensi e canadesi, ha trovato che la pratica maggiormente impiegata quella di utilizzare unit compatibili per gli antigeni C, E e K103. Per prevenire ulteriori sensibilizzazioni, un approccio razionale pu essere quello di usare unit fenotipicamente compatibili nei pazienti gia immunizzati e per i quali vi un alto rischio di
produrre ulteriori anticorpi102. Per fenotipizzare gli eritrociti autologhi in pazienti recentemente trasfusi si pu impiegare il Metodo 2.16. Gli afro-americani, affetti da drepanocitosi, si immunizzano di frequente, dato che la maggior parte delle unit a loro trasfuse proviene da donatori caucasici, con una pi alta esposizione ad antigeni differenti. In alcune zone, per le raccolte di sangue sono stati sviluppati specifici programmi per reclutare soggetti afro-americani perch donino sangue ai riceventi drepanocitici e per limitare, cos, lincidenza delle immunizzazioni101. Gli emocomponenti leucodepleti sono di particolare utilit in questi soggetti cronicamente trasfusi. Un primo beneficio dovrebbe essere dato dalla diminuzione dellincidenza di immunizzazioni anti-HLA, in vista di un possibile, futuro trapianto di midollo osseo87. Esistono dati contrastanti sulla possibilit che la leucodeplezione possa prevenire limmunizzazione eritrocitaria104,105. Prevenire le reazioni febbrili nei pazienti altrettanto importante quanto ricevere unit fenotipicamente compatibili. Scartare ununit di questo tipo potrebbe essere molto sconveniente ed avere un impatto negativo sulla possibilit di trasfondere appropriatamente il paziente106. Trasfusioni di piastrine e di plasma Le indicazioni alle trasfusioni di plasma fresco congelato e di concentrati piastrinici, per i bambini di et superiore ai 4 mesi, sono le stesse previste per gli adulti. Le trasfusioni di concentrati piastrinici sono, molto spesso, somministrate a scopo profilattico nei bambini sottoposti a chemioterapia. Le trasfusioni piastriniche profilattiche sono raramente somministrate, quando la conta superiore a 10.000-20.000 PLT/L, ma come per le trasfusioni di concentrati eritrocitari e il rapporto con lemoglobina, anche per le trasfusioni di concentrati piastrinici lindicazione non si dovrebbe basare solo sulla conta piastrinica. Quando sono presenti fattori di rischio aggiuntivi, quali febbre, sepsi, CID o anomalie nella coagulazione, la conta piastrinica dovrebbe essere tenuta pi elevata, per evitare emorragie spontanee. Al contrario, in assenza di questi fattori di maggior rischio, conte pi basse possono offrire
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sufficiente sicurezza56. Studi recenti hanno dimostrato che lutilizzo di piastrine ABO compatibili si associa a risultati clinici migliori107-109.
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Capitolo 25: Terapia cellulare e trapianti di cellule
Capitolo 25
Terapia cellulare e trapianti di cellule
La terapia cellulare si avvale della raccolta e della lavorazione di cellule allo scopo di fornire effetti terapeutici particolari. Lesempio pi classico rappresentato dallutilizzo di cellule staminali ematopoietiche (CSE) totipotenti, capaci di autoreplicarsi e differenziarsi in tutte le diverse linee ematologiche. Queste cellule staminali ematopoietiche - trapiantate partendo da midollo osseo, da sangue periferico dopo stimolazione o da sangue di cordone ombelicale - possono anche dare vita ad altri tessuti rigenerativi, come a epatociti, a cellule endoteliali o ad altri tessuti, in adatte situazioni di microambiente1. Anche altre popolazioni cellulari possono servire a scopi terapeutici, come avviene per la modulazione immune in trapiantati, quando si impiegano i linfociti del donatore nella cosiddetta DLI ( Donor Lymphocyte Infusion ). Le CSE, commissionate verso una data linea ematica, sono state studiate, innanzitutto, in laboratorio per le loro capacit di dare origine, se fornite in quantit sufficiente, a un attecchimento ematopoietico completo e valido. Questo capitolo verter, essenzialmente, sulla ripopolazione ematopoietica. Si ritiene che un trapianto di CSE contenga sia le cellule totipotenti in grado di auto-replicarsi sia le cellule gi indirizzate alle diverse linee progenitrici ematopoietiche. Queste cellule progenitrici (CPE, cellule progenitrici ematopoietiche), gi commissionate, perdono peraltro la capacit di auto-mantenersi o di differenziarsi in altre e diverse linee progenitrici; sono, comunque, di notevole importanza per
accelerare lattecchimento2. I metodi attualmente impiegati non sono in grado di separare, con facilit, le due popolazioni, ed entrambe sono riferite, in questo capitolo, come CPE. Quelle raccolte, in aferesi, dal sangue periferico sono denominate PBSC (Peripheral Blood Stem Cells), mentre quelle prelevate dal midollo osseo sono riportate come CPEm e quelle dal sangue del cordone ombelicale come CPEsc. Il trapianto di CPE passato da una procedura riservata a pochi centri a una pratica medica comune, attuata in molte strutture ospedaliere di terzo livello. Un trapianto di CPE pu essere classificato, a seconda della fonte delle cellule utilizzate, come autologo, allogenico, singenico o eterologo. Dal punto di vista tecnico, limpiego di CPE autologhe configura, pi che un trapianto, un salvataggio per il paziente con luso delle sue proprie cellule, che sono prelevate e conservate, congelate o meno, per essere successivamente infuse a protezione degli effetti letali delle irradiazioni o della chemioterapia, siano queste terapeutiche o ablative. Il prodotto autologo pu essere manipolato per conservare le CPE ed eliminare le cellule neoplastiche o quelle immuni danneggiate. Le cellule autologhe sono re-infuse per ripopolare il midollo del paziente, dopo irradiazioni o chemioterapie letali o sub-letali, e sono somministrate al paziente per trattare neoplasie midollari e tumori solidi, metastatici o ricorrenti. Nel caso speciale di un donatore gemello del
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paziente, si parla di trapianto singenico. Il trapianto allogenico riguarda linfusione di CPE da un altro soggetto (HLA compatibile, apparentato o estraneo) per ottenere un chimerismo con le CPE del donatore, al fine di salvare un paziente da una terapia intensiva e/o da una immunoterapia attiva contro una malattia, dopo irradiazioni o chemioterapie potenzialmente letali. Questo tipo di trapianto indicato per pazienti affetti da leucemia mieloide acuta (LMA), da leucemia linfatica acuta (LLA), da immunodeficienza grave, da anemia aplastica (AA), da neoplasie midollari o per pazienti non in grado di produrre CSE normali, come gli affetti da emoglobinopatie (talassemia, drepanocitosi). Mentre si individuano ulteriori indicazioni, altre sono state superate da nuove scoperte. Per esempio, i pazienti affetti da leucemia mieloide cronica (LMC) erano i pazienti pi frequentemente trapiantati: limatinib mesilato (inibitore delle tirosinochinasi) ha avuto un successo tale che il numero di trapianti per LMC diminuito consistentemente, da quando stato autorizzato limpiego del medicamento3. Un ulteriore progresso in materia di trapianti ematologici si avuto quando si sono riconosciuti e sfruttati gli effetti positivi delle cellule immunitarie allogeniche trapiantate in pazienti affetti da tumori. Dato che trapiantare cellule rappresenta una modalit di cura, la preparazione al trapianto necessita solamente di modificare il sistema immune del ricevente, in modo da permettere lattecchimento delle nuove cellule. Questo tipo di trapianto, non mieloablativo, ha allargato il numero di pazienti eleggibili, accettando malati di et pi avanzata e con maggiori problemi di salute. Questi ultimi due tipi di pazienti non sono in grado di sopportare regimi mieloablativi particolarmente tossici, dato che il rischio del trattamento sarebbe troppo alto. In tale situazione, chemioterapia e irradiazione totale, entrambe a basse dosi, sono dirette contro i linfociti T del ricevente, al fine di indurre tolleranza verso linnesto allogenico. Nei trapianti che conseguono un esito positivo, le cellule trapiantate inducono un chimerismo totale nel midollo del paziente e attaccano ed eliminano, per via immunologica, le cellule tumorali4-6. Nei
pazienti, nei quali lintento solamente quello di fornire cellule sane, come nei bambini affetti da immunodeficienze, il metodo permette di ottenere il risultato senza dover sottoporre i bambini al pericolo di una mieloablazione totale. In questi casi, il ricevente non sperimenta lunghi periodi di citopenia, con conseguente rischio di infezioni o di emorragie. Le cellule attecchite diventano mezzi terapeutici, consentendo chemioterapie e irradiazioni a basse dosi e, quindi, a tossicit relativamente bassa. Questo approccio utilizza la ricostituzione immune come mezzo per controllare la malattia, ma non privo di rischi, in quanto le cellule immuni possono attaccare i tessuti sani del ricevente e indurre una GvHD (Graft-versus-Host Disease)7. Il numero dei trapianti non-mieloablativi aumentato da 20 (nel 1997) a 870 (nel 2001), secondo quanto riportato dal Centro Internazione per le Ricerche sui Trapianti di Sangue e di Midollo3. I trapianti eterologhi (o xeno-trapianti) dovrebbero riguardare lutilizzo di CSE provenienti da specie non umane. Ma, in considerazione delle insormontabili barriere immunologiche ancoroggi esistenti, questi trapianti non sono, al momento, possibili. Le fonti dei progenitori ematopoietici sono: midollo osseo, sangue periferico, sangue di cordone ombelicale e fegato fetale (quantunque questultima sorgente sia del tutto sperimentale e non abbia applicazioni cliniche) 1. Una volta raccolte, le CPE possono essere sottoposte a manipolazioni ex vivo , come, per esempio, allallontanamento degli eritrociti o del plasma incompatibili o a una selezione cellulare (il cosiddetto purging, cio purificazione) prima del trapianto. In alcuni casi, la popolazione cellulare viene selezionata positivamente (isolamento selettivo), per particolari effetti terapeutici. I linfociti T, per esempio, possono essere isolati e, in seguito, infusi (in dosi calibrate) per ottenere un effetto antitumorale e per limitare la GvHD. La separazione delle popolazioni cellulari si pu ottenere usando strumenti approvati dalla Food and Drug Administration (FDA), quale il sistema
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Isolex (Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Alternativamente, alcune popolazioni possono essere selezionate negativamente (scegliendole o distruggendole), mediante lisi delle cellule neoplastiche o utilizzando la loro separazione in citofluorimetria, come avviene in alcune sperimentazioni cliniche.
sia duraturo, sicuro ed efficace. CPE da midollo (autologhe) Attualmente, soltanto un 5% dei trapianti autologhi viene eseguito con CPEm. Questa fonte stata abbondantemente rimpiazzata dalle PBSC autologhe. CPE da midollo (allogeniche) I trapianti allogenici risolvono il problema di ottenere un prodotto privo di cellule tumorali, da utilizzare per un trapianto autologo in un paziente affetto da una malattia neoplastica, e di conseguire un aiuto immunologico da un effetto Graft-versus-Tumour. Per altri pazienti, quali quelli affetti da aplasia midollare, immunodeficienza, errori congeniti del metabolismo o da emoglobinopatie, il trapianto allogenico il solo tipo appropriato di trapianto. Le CPEm sono raccolte da donatori, apparentati o volontari, compatibili o parzialmente compatibili per gli antigeni HLA. Trapianti con donatori compatibili non consanguinei Si pu iniziare una ricerca di donatori compatibili, non apparentati, per quel 60-70% di pazienti che non dispone di un consanguineo (di solito, un fratello) HLA compatibile. Sono disponibili, in tutto il mondo, numerosi registri di volontari. Il pi grande quello dellNMDP (National Marrow Donor Program, Programma Nazionale Donatori di Midollo) statunitense. Sin dalla sua fondazione nel 1986, lNMDP ha permesso lesecuzione di circa 12.000 procedure trapiantologiche. disponibile presso lNMDP un elenco dei centri trapianto, dei risultati ottenuti e dei costi. Dopo la ricerca iniziale, l80% circa dei candidati al trapianto trova, di solito, un donatore HLA fenotipicamente identico. I pazienti di razze o etnie minoritarie hanno, tuttavia, minori possibilit di successo in questa ricerca (secondo i dati dellNMDP le percentuali sono le seguenti: caucasici: 81%; ispanici: 64%; asiatici e abitanti delle isole del Pacifico: 55%; afro-americani: 47%;
Malattie trattate con trapianto di CSE

Numerose malattie sono state trattate con il trapianto di CSE8. La pi frequente indicazione rappresentata dalle emopatie maligne. Quantunque questo trapianto sia stato utilizzato anche per forme non maligne, questultime rappresentano meno del 15% di tutti i trapianti3,9. Lindice di successo di un trapianto di CPE dipende dalle condizioni cliniche e dallet del ricevente, dal tipo e dallo stadio della malattia, dalla dose cellulare e dal grado di compatibilit HLA fra donatore e paziente. Globalmente, il tasso di sopravvivenza a lungo termine varia dal 30 al 60%, per malattie peraltro fatali. La Tabella 25.1 illustra gli esiti per le singole malattie.
Fonti di CPE
Dal punto di vista storico, il midollo osseo stato il primo tessuto utilizzato per raccogliere CPE a scopo di trapianto. I trapianti con PBSC hanno rappresentano, nel periodo 1998-2000, approssimativamente il 90% dei trapianti autologhi in adulti e circa la met di quelli allogenici, secondo quanto riferito dal Registro Internazionale3. I dati sui trapianti con sangue di cordone ombelicale hanno mostrato risultati promettenti in pazienti pediatrici, per i quali non siano disponibili donatori non consanguinei di CPEm o CPEsc. Sono in corso studi clinici per stabilire: 1) sicurezza ed efficacia dei trapianti con CPEsc, 2) se anche gli adulti possono essere trapiantati con esito favorevole, utilizzando CPEsc, e 3) se lesistenza di incompatibilit per gli antigeni HLA pu consentire un attecchimento dellinnesto, che
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Tabella 25.1 - Esempi di malattie che rispondono a un trapianto di CSE10 Malattia LMA LLA (in bambini) LLA (ad alto rischio) LMC in fase cronica (FC) LMC in fase accelerata LMC in fase blastica Sindrome mielodisplastica Anemia aplastica LLC Tipo di trapianto Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico Allogenico o Autologo Autologo Momento Prima RC Seconda RC Prima RC Fase cronica Individuale Seconda FC Meno di 60 anni Individuale Partecipazione a esperimenti Risultati clinici ST 40-50% ST 40-65% ST 50% ST 50-80% ST 30-40% ST 15-25% ST 40% ST 70-90% Sotto osservazione piccole serie di pazienti in RC; trapianti non ablativi ST 40-50% ST 50-60% SLM 25-50% a 5 anni Piccola serie con tasso di RC al 25-50% Piccola serie con RC stabile SLM 15-25% ST 50% a 5 anni; SLM 20% ST migliorata in controlli non confermati da sperimentazioni Piccole serie con RC ST 75% senza cirrosi ST 75% Piccole serie di remissioni
LNH di grado medio
Ricaduta sensibile al trattamento LNH ad alto rischio Autologo Prima RC LNH di basso grado Allogenico Ricaduta sensibile o Autologo al trattamento Linfoma a cellule del mantello Allogenico o Autologo Prima RC sperimentale Linfoma linfoblastico Allogenico o Autologo Ricaduta sensibile sperimentale al trattamento LNH e Malattia di Hodgkin Allogenico Malattia refrattaria sperimentale avanzata Mieloma multiplo Autologo Ricaduta sensibile al trattamento o prima RC Cancro mammario, testicolare Autologo Malattia sensibile od ovarico ad alto rischio sperimentale al trattamento Carcinoma renale Talassemia Drepanocitosi Malattie autoimmuni Allogenico non ablativo Allogenico Allogenico Allogenico Sperimentazione clinica Sperimentazione clinica Sperimentazione clinica Sperimentazione clinica
LMA = Leucemia mieloide acuta; LLA = Leucemia linfatica acuta; LMC = Leucemia mieloide cronica; LLC = Leucemia linfatica cronica; LNH = Linfoma non-Hodgkin; RC = Remissione completa; FC = Fase cronica; ST = Sopravvivenza totale; SLM = Sopravvivenza libera da malattia.
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indiani americani e nativi dellAlaska: 50%). Il tempo medio che passa fra linizio di una ricerca e lesecuzione del trapianto di 120 giorni, ma si sta realizzando un nuovo tipo di ricerca e un nuovo programma per la preparazione del donatore, allo scopo di ridurre tale intervallo. LNMDP sta conducendo uno studio sulla raccolta delle PBSC da volontari HLA compatibili, dopo la loro stimolazione con fattori di crescita granulocitari (G-CSF o filgrastim)11. Lo studio tiene sotto controllo la sintomatologia clinica, indotta nei donatori, nonch le loro opinioni e sensazioni al riguardo. Lutilizzo di PBSC migliora lattecchimento e accresce leffetto detto GvL ( Graft-versus-Leukaemia , trapianto contro leucemia). Negli studi clinici sperimentali (relativi a trapianti allogenici fra consanguinei), che hanno paragonato i trapianti di CPEm a quelli di PBSC, questi ultimi hanno mostrato una sopravvivenza migliore. Quantunque la GvHD cronica si sia dimostrata un problema nella casistica dei trapianti con PBSC, stato trattato un numero sufficiente di casi tale da poter accertare, per i pazienti, una maggiore sopravvivenza12. Nei primi periodi, la diagnosi pi comune, nei pazienti che venivano sottoposti a trapianto da donatore non consanguineo, era la LMC. La scoperta dellimatinib mesilato ha rivoluzionato il trattamento della LMC in modo tale che lattuale pi comune indicazione al trapianto rappresentata dalle leucemie acute, seguite dai linfomi non-Hodgkin, dal mieloma multiplo e da altre forme morbose di deficienza midollare, come lanemia aplastica13. La tipizzazione HLA, per gli antigeni di I Classe (HLA-A e HLA-B), viene tradizionalmente effettuata con metodiche sierologiche. , tuttavia, assai probabile che le complicazioni post-trapianto, come la GvHD o il mancato attecchimento, derivino dallimpiego di donatori non consanguinei, fenotipicamente compatibili, ma con disparit significative per allantigeni, non evidenziabili con metodiche sierologiche14. La tipizzazione molecolare a risoluzione intermedia per gli antigeni HLA-A e HLA-B e quella, ad alta risoluzione, per gli antigeni di Classe II rappresentano lo standard attuale,
particolarmente per i trapianti fra non consanguinei. Il rischio di GvHD maggiore quando esistono disparit per gli antigeni di Classe II rispetto a quelle per antigeni di Classe I15, e, infatti, le tipizzazioni per antigeni HLA-DR e HLA-DQ, vengono eseguite, ormai di routine, con tecniche che impiegano il DNA. La tecnologia molecolare permette una maggior risoluzione e lidentificazione di sottotipi di alleli, che le tecniche sierologiche convenzionali tendono ad includere nei gruppi cross-reagenti. Le incompatibilit per un solo antigene, sia esso di I o di II Classe, non hanno effetto sulla sopravvivenza, ma la mortalit aumenta con pi di una incompatibilit per gli antigeni di Classe I o per incompatibilit concomitanti per antigeni di I e di II Classe15. Studi recenti hanno avvalorato limportanza, nello sviluppo della GvHD, delle disparit con gli alleli HLA-DRB1 e HLA-DQB1 del ricevente16,17. Ulteriori esperienze sulla tipizzazione molecolare e sui risultati dei trapianti, potranno spiegare, in futuro, sino a quale grado le cellule trapiantate possono tollerare le disparit per specifici alleli. Sebbene limportanza delle disparit per gli antigeni HLA-A, -B e -DR siano ben note, si sta ancora indagando il significato di quelle relative agli antigeni HLA-C. La tipizzazione HLAC stata ostacolata dalle scarse possibilit di identificazione usando metodi sierologici e si ritenuto, sino a poco tempo fa, che questi antigeni giocassero un ruolo minore nella risposta immune delle cellule T, dato il loro scarso polimorfismo e il basso livello di espressione sulle membrane cellulari. Studi precedenti avevano documentato che gli antigeni HLA-C possono essere riconosciuti dai linfociti T citotossici e dalle cellule NK (natural killer ), che si possono accompagnare a un aumentato rischio di fallimento dellinnesto18. Graft-versus-Host Disease Linsuccesso di un trapianto HLA incompatibile dovuto a: rigetto, reazione dellospite contro il trapianto, reazione del trapianto contro lospite (o GvHD). Nella forma acuta di GvHD, le cellule
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trapiantate possono attaccare i tessuti del ricevente, in fase molto precoce, entro 100 giorni dopo lattecchimento iniziale. Pelle, tratto gastro-intestinale e fegato sono i tessuti pi comunemente coinvolti, anche se, di solito, non contemporaneamente. Localizzazione e gravit determinano le forme cliniche di una GvHD acuta. Il rischio di GvHD pi alto nei trapianti (fra soggetti apparentati o non apparentati) con incompatibilit HLA, piuttosto che nei trapianti HLA-identici19. La GvHD cronica si sviluppa, tipicamente, in modo spontaneo, dopo mesi dal trapianto o dopo una GvHD acuta (che interviene, di solito, dopo 50 giorni) e pu influenzare negativamente e pesantemente la qualit di vita del paziente. In aggiunta ai sintomi descritti per la GvHD acuta, nelle forme croniche possono svilupparsi malattie autoimmuni, quali la sindrome di Sjgren, la cirrosi biliare o una sclerodermia, che intervengono quando le cellule immuni trapiantate attaccano le cellule epiteliali secretorie delle ghiandole salivari, o quelle dellalbero biliare o, ancora, il tessuto connettivo del paziente. In un ampio studio2 stato riferito che la GvHD cronica interviene nel 55-65% nei riceventi un trapianto allogenico, nel caso di sopravvivenza oltre il centesimo giorno dal trapianto. Ambedue le forme di GvHD (acuta o cronica) influenzano negativamente la risposta immune del paziente e lo predispongono a infezioni. Al fine di diminuire o eliminare la GvHD, le CPE possono essere sottoposte a procedure che riducono la presenza di cellule T (deplezione) e il paziente pu essere trattato, profilatticamente, con farmaci immunosoppressivi di diverso tipo. La GvHD, se relativamente modesta, stata associata sia a una diminuzione delle ricadute sia a una globale migliore sopravvivenza nei pazienti leucemici. Si ritiene che leffetto GvL sia provocato dallattacco contro le cellule neoplastiche residue, da parte dellinnesto. Unimportante sfida aumentare leffetto GvL e diminuire, contestualmente, le sequele sfavorevoli di una GvHD. Il meccanismo della GvL non totalmente chiarito, ma i linfociti T citotossici del donatore, specifici per gli antigeni di istocompatibilit minori presenti nel ricevente, potrebbero contribuire a
questo effetto. Per indurre un effetto GvL, stata tentata20, a scopo terapeutico, linfusione di linfociti T del donatore nei pazienti leucemici in ricaduta, dopo trapianto allogenico. Esistono dati contrastanti circa il fatto che un effetto GvL possa intervenire indipendentemente da una GvHD. Una strategia utilizzata per aumentare leffetto GvL e diminuire una GvHD stata quella di conteggiare il numero di linfociti T del donatore sino a indurre GvHD di II e III grado, al fine di creare un effetto GvL senza determinare una grave GvHD. Non noto, tuttavia, il numero ottimale di linfociti del donatore in grado di indurre leffetto GvL senza che intervenga una GvHD significativa. Limmunosoppressione, il numero delle cellule T infuse, il loro fenotipo, la mielosoppressione, il momento in cui si attua una DLI terapeutica giocano un ruolo negli equilibri fra effetto GvL e GvHD. Leffetto GvL stato ben documentato nella LMC, ma assai meno nella LMA, nella LLA e in altre neoplasie linfoidi. Tuttavia, dato che difficile identificare una buona compatibilit HLA, il trapianto allogenico associato a un maggior rischio che le cellule T del donatore, che reagiscono contro i tessuti del ricevente, determinino una GvHD. Anche nel caso di coppie donatore/riceventi HLA-identici (6 antigeni compatibili), in oltre il 6% dei casi il trapianto fallir e una GvHD interverr nel 20-60% di tali trapianti, come conseguenza dellintervento di antigeni minori di istocompatibilit, che non sono collegati con lMHC, presenti nelle cellule nucleate 21. Le migliorate tecniche di tipizzazione HLA impiegano, attualmente, metodiche molecolari che offrono un quadro pi completo della mappa antigenica e del rapporto compatibilit/incompatibilit, ma la stima del numero delle compatibilit, basata su criteri sierologici, viene tuttora frequentemente utilizzata come riferimento nelle descrizioni cliniche. La GvHD pu intervenire, nonostante la terapia immunosoppressiva sia somministrata per parecchi mesi dopo le procedure22. Si stanno esplorando nuove ed emergenti manipolazioni delle cellule immuni, da sfruttare per controllare gli effetti antineoplastici di queste cellule, mentre si cerca di evitare le conseguenze indesiderabili della GvHD. Si sta utilizzando la fotoferesi
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extracorporea per trattare i pazienti con GvHD e per ridurre le dosi richieste di farmaci immunosoppressivi23. PBSC autologhe La raccolta di PBSC autologhe prevede la mobilizzazione delle CPE del paziente dal midollo al sangue circolante, che si ottiene con limpiego di fattori di crescita, di solito il filgrastim (G-CSF), preceduto o meno da chemioterapia. Una volta presenti in circolo queste cellule sono raccolte mediante. Questo tipo di raccolta non comporta rischi anestesiologici, meno invasiva e contiene un numero minore di cellule tumorali rispetto alla raccolta di CPEm. PBSC allogeniche Trapianti da donatori consanguinei Nei trapianti allogenici in adulti, i migliori risultati clinici si ottengono con un donatore consanguineo, totalmente HLA compatibile. La migliore probabilit di reperire un soggetto compatibile per 6 antigeni HLA si consegue, indagando fra le sorelle o i fratelli del paziente. Fra genitori e figli ci sar, almeno, un aplotipo in comune. Dal punto di vista genetico, c il 25% di probabilit che un fratello sia totalmente compatibile e un 50% di probabilit che abbia un aplotipo in comune con il paziente, mentre nel 25% dei casi un fratello sar del tutto incompatibile. I pazienti pediatrici tollerano meglio trapianti parzialmente incompatibili e, conseguentemente, dispongono di un pool pi ampio di possibili donatori24. In rari casi, il paziente dispone di un gemello ed possibile eseguire un trapianto singenico, che ottimale, in quanto donatore e ricevente sono geneticamente identici e il rischio di GvHD ridotto. I trapianti singenici, peraltro, non offrono leffetto GvL o anti-tumore, che si ha nei trapianti allogenici. Le PBSC hanno largamente rimpiazzato le CPEm nei trapianti fra consanguinei25. Si anche dimostrato che la somministrazione di G-CSF in donatori sani comporta una mobilizzazione di PBSC sufficiente per un trapianto allogenico26, evitando la necessit dellanestesia richiesta dalla raccolta dal midollo. I dati, che hanno paragonato
la raccolta di PBSC a quella di CPEm da fratelli identici, hanno dimostrato un attecchimento pi rapido, una migliore ricostruzione immunologica, una pi bassa morbilit legata al trapianto e unanaloga incidenza di GvHD2,27. Le analisi retrospettive hanno riportato unincidenza maggiore di GvHD croniche nei riceventi PBSC da donatori consanguinei28. Una recente indagine prospettica randomizzata, tuttavia, non ha osservato differenze nel rischio di GvHD croniche12. CPE da sangue del cordone ombelicale Nonostante pi di 3 milioni di volontari siano registrati presso lNMDP, i candidati ad un trapianto hanno una probabilit 85% di reperire un donatore compatibile. Trovare e qualificare un volontario per una raccolta di PBSC o di CPEm richiede, di solito, alcune settimane. Dato che tempo e disponibilit sono vincolanti, si rivolta lattenzione a una terza sorgente, quella dei progenitori ematopoietici presenti nel sangue del cordone ombelicale (CPEsc). Il sangue del cordone ombelicale, che nella pratica clinica viene di solito eliminato, pu essere conservato, come fonte alternativa di CPE, soprattutto per pazienti pediatrici, per i quali anche un numero minore di cellule adeguato per ottenere con successo un attecchimento. I vantaggi del sangue cordonale quale fonte di CPE per trapianti comprendono: nessun rischio per il donatore, disponibilit di fenotipi di CPE non rappresentate o sottorappresentate nei registri, pronta disponibilit e, forse, minori rischi di infezioni virali e di GvHD. La materia relativa alle CPEsc comprende una serie di problematiche: i problemi etici e di consenso informato, la velocit di attecchimento, una maggiore mortalit nel periodo post-trapianto, la capacit di attecchimento in adulti dato il limitato numero di cellule nucleate nel sangue cordonale. Il sangue derivato da una placenta noto per essere ricco di CPE precoci e gi commissionate29. Da quando stato impiegato per la prima volta sangue cordonale in un caso di anemia di Fanconi30, pi di 2.500 pazienti hanno ricevuto CPEsc per tutta una serie di neoplasie
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ematologiche o di altre affezioni non maligne31. Il sangue del cordone si raccoglie al momento del parto, utilizzando diverse tecniche, ma il sistema preferito quello di immetterlo in piccole sacche (da 150 a 250 mL) che contengano una soluzione anticoagulante appropriata. I dati in vitro hanno suggerito che il sangue placentare ha una spiccata capacit di proliferare32. Il volume medio delle unit conservate compreso, di solito, fra gli 80 e i 100 mL (variando da 40 a 240 mL), la conta media di cellule nucleate di 1,2 x 109 e quella di cellule CD34+ di 2 x 105 per kg di peso del ricevente33. Studi clinici hanno confermato i successi nellattecchimento nei bambini34,35. Il tempo medio per un attecchimento dei neutrofili (500/L) di 30 giorni, mentre quello delle piastrine (50.000/L) di 56 giorni36. Se paragonati agli attecchimenti osservati in trapianti allogenici di CPEm, quelli di neutrofili e piastrine appaiono essere pi tardivi. Studi clinici hanno anche indicato che i trapianti di CPEsc da non consanguinei hanno un rischio minore di GvHD rispetto ai trapianti di CPEm da non correlati, anche considerando il pi basso rischio di GvHD nei pazienti pediatrici31,34,36.37. Due studi38,39 hanno paragonato attecchimento ed esito, in adulti, di trapianti di CPEsc con uno o due incompatibilit, di trapianti di CPEm senza incompatibilit e di trapianti di CPEm con una incompatibilit. Quanto osservato nei due studi era simile: i riceventi trapianti di CPEm recuperavano i neutrofili al 18 o 19 giorno, mentre quelli che avevano ricevuto CPEsc li recuperavano al 26 o 27 giorno. Lattecchimento delle piastrine ricalcava le precedenti osservazioni, nel senso che i trapianti di CPEm conseguivano un recupero pi rapido: 29 giorni invece dei 60 giorni per i trapianti di CPEsc. Entrambi questi studi hanno evidenziato che i trapianti di CPEsc si paragonano favorevolmente con quelli di CPEm con una incompatibilit, con sopravvivenze sovrapponibili. Un trapianto di CPEm senza incompatibilit si dimostrato superiore nei riguardi di uno con CPEsc o di uno di CPEm incompatibile, ma il vantaggio era piccolo. Ci di incoraggiamento per gli adulti, in attesa
di trapianto di CPEm, che abbiano molte difficolt a reperire un donatore compatibile. Studi sperimentali in corso stanno analizzando se limpiego in adulti di due unit di sangue cordonale pu facilitare un attecchimento pi rapido. Uno studio su 23 riceventi pi unit, con malattia in fase avanzata, ha mostrato un attecchimento dei neutrofili di 23 giorni in media e un 57% di possibilit di sopravvivenza libera da malattia dopo un anno dal trapianto. In questi trapianti di due unit, la popolazione cellulare di una unit prevaleva sullaltra e determinava un attecchimento duraturo40. Donatori consanguinei di sangue cordonale Il sangue cordonale di fratelli stato utilizzato, in Europa e in Nord America, per pi di 250 trapianti allogenici, rappresentando il 15% di tutti i trapianti di CPEsc allogenici31,35. La cinetica del recupero ematologico sovrapponibile a quella che si osserva nei trapianti di CPEsc da non consanguinei 31. I tempi di attecchimento di neutrofili e piastrine sono pi lenti di quelli che si osservano nei trapianti di CPEm da fratelli. I riceventi trapianti di CPEsc da fratelli HLA-identici hanno, peraltro, unincidenza minore di GvHD, sia acuta che cronica, rispetto a quelli che ricevono CPEm da fratelli HLA-identici31. Sangue cordonale autologo Alcune ditte stanno commercializzando apparecchiature e metodiche per congelare e conservare a lungo termine le cellule del sangue cordonale di un neonato per conto dei genitori, nel caso che il bambino ne possa avere necessit41,42. La probabilit che un soggetto possa aver bisogno, sino a 18 anni, di un trapianto di cellule cordonali, viene stimata di un caso su 200.00042. Il primo caso di un trapianto autologo di CPEsc, eseguito con successo, avvenuto in un bambino di 14 mesi affetto da neuroblastoma43. Banche di sangue cordonale Il primo, ampio programma di conservazione di sangue cordonale stato messo in opera presso il Centro Sangue di New York, che ha iniziato la raccolta di prodotti placentari nel 1992.
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Sono state conservate oltre 14.000 unit di sangue cordonale e sono stati effettuati 1.500 procedure di trapianto. I risultati delle prime 562 procedure sono stati pubblicati in dettaglio34. LNMDP ha creato un registro, con i dati delle Banche di Sangue Cordonale che vi partecipano. La Banca Nazionale di Sangue Cordonale della Banca del Sangue di New York, il NetCord, il BMDW (Bone Marrow Donors Worldwide) e il Registro Caitlin Raymond sono ulteriori siti di ricerca, attualmente disponibili.
diversificano per il sesso, si accompagna a unaumentata incidenza di GvHD, cos come nel caso di unanamnesi, nel donatore, positiva per trasfusioni44-46. Si debbono, quindi, preferire donatori compatibili CMV negativi (se il ricevente CMV negativo), dello stesso sesso del ricevente, che non abbiano partorito, che non siano stati trasfusi. Test per malattie infettive I donatori autologhi e allogenici debbono essere sottoposti ad analisi per alcune malattie infettive47. Nel CFR (Code of Federal Regulations), al titolo 21, sezione che riguarda le normative pertinenti ai donatori coinvolti nella terapia cellulare, le norme sono relative allo Screening sui Donatori (1271.75), alle Analisi Generali (1271.80) e alle Analisi Speciali (1271.85). La FDA descrive queste norme come esaurienti, ma flessibili. Le regole sullo screening sono conformi alle linee guida dei CDC (Centers for Disease Control and Prevention) del 1994 per impedire la trasmissione di HIV e con quelle del 1993, relative ad HBV e ad HCV. Sono richiesti anche i test per la sifilide e i prodotti ricchi di leucociti vanno testati anche per HTLV e CMV. Le linee guida contengono anche la richiesta di interrogare il donatore sui fattori di rischio per la trasmissione della variante della malattia di Creutzfeldt-Jacob, sui nuovi, emergenti patogeni, come il West Nile virus, sulla sindrome respiratoria acuta grave (o SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome), e i requisiti del test per individuare i portatori di queste malattie, non appena tali test siano disponibili. Regolamenti e linee guida sono esaurienti e si conformano alla dichiarazione della FDA di un approccio stratificato che rapporti la quantit degli screening e dei test sul donatore al livello dei rischi, ai quali un ricevente pu essere esposto. I donatori allogenici non consanguinei, quindi, rappresentano il livello di rischio pi alto, mentre i familiari o i partner sessuali regolari vengono considerati a pi basso rischio come possibili fonti di nuove esposizioni per un paziente. I donatori debbono essere analizzati per limitare il rischio di trasmissione di malattie infettive in riceventi, che sono immunocompromessi. Le
Idoneit del donatore

Valutazione del donatore autologo In materia di trapianti autologhi, il problema pi rilevante, che riguarda lidoneit del pazientedonatore, legato alle sue condizioni cliniche. Per le CPEm, innanzi tutto, si deve verificare la presenza di cellule neoplastiche e la cellularit del midollo. I pazienti, per i quali si programma un trapianto autologo, dovrebbero essere sottoposti a unapprofondita anamnesi e a un accurato esame clinico al fine di evidenziare qualsiasi rischio connesso alla raccolta dal midollo e/o alle procedure aferetiche. Per le PBSC, il pazientedonatore va valutato circa le probabilit che possa essere sottoposto, con sicurezza, alla mobilizzazione e alla raccolta. Valutazione del donatore allogenico I donatori allogenici debbono essere scelti in base al grado di compatibilit HLA, alle normative FDA, agli Standard AABB, NMDP e FACT (Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy), alle loro capacit fisiche e alla loro volont di sottoporsi alle procedure di raccolta. In teoria, si dovrebbero reperire donatori totalmente compatibili (per sei antigeni HLA) con il ricevente; peraltro, sono stati eseguiti, con successo, trapianti utilizzando donatori incompatibili per un antigene o aploidentici. Anche la situazione sierologica per CMV (citomegalovirus), un fattore decisivo nella selezione del donatore, qualora il ricevente sia CMV negativo. Limpiego di pluripare come donatrici o di coppie donatore-ricevente che
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normative FDA specificano che un campione di sangue appartenente a un donatore di CPE dovrebbe essere studiato entro 7 giorni dalla raccolta o al momento di questa, ma prima che il prodotto venga rilasciato. I campioni appartenenti a donatori di PBSC possono essere esaminati sino a 30 giorni prima della raccolta per poter disporre dei risultati dei test per le malattie infettive prima che il ricevente inizi la chemioterapia mieloablativa [21 CFR 1271.80(b)]. Al fine di conseguire una selezione ottimale dei donatori, consigliabile testare il donatore anche allinizio del periodo cosiddetto del workup (periodo che comprende, estensivamente, tutte le attivit da svolgere per prepararlo al trapianto)48,49. Limpiego dei test (approvati) NAT per HIV e HCV ha ridotto notevolmente la fase finestra (FF) nei donatori che potrebbero avere contratto le infezioni da questi virus, ma i cui esami sugli anticorpi (Ab) non risultano ancora positivi. I donatori stimolati con filgrastim presentano rapporti campione/cut-off pi alti. Questo rende pi probabile la presenza di risultati falsamente positivi nei test immunologici correntemente utilizzati in pratica. Falsi risultati positivi nei test per HBsAg e per anticorpi anti-HCV sono stati segnalati dopo la somministrazione di G-CSF50,51. I donatori confermati positivi per HIV non dovrebbero essere utilizzati come fonte di CPE per un trapianto. Positivit per altri marcatori non inibiscono necessariamente la raccolta da alcuni donatori (per esempio, da soggetti con anti-HBc) e lNMDP sta attualmente valutando tali donatori. Il prodotto allogenico proveniente da questi donatori pu essere usato, quando il medico che trapianta informa il ricevente della situazione del donatore e ottiene, da lui, un documentato consenso. Dopo il prelievo e sino allinfusione, si debbono adottare, per il materiale che presenta pericolo biologico, metodi di segregazione, cos da prevenire una contaminazione crociata con altri prodotti conservati48(p78),49,52. Nel caso di trapianto allogenico di CPEsc, si deve ottenere, entro 48 ore dalla raccolta del sangue cordonale, un campione di sangue della madre del donatore, cos da poter eseguire i test.
Ogni risultato positivo dovrebbe essere riferito alla madre e al suo medico curante. Una donazione di CPEsc che coinvolga una madre o un bambino che abbiano unanamnesi o risultati positivi per malattie infettive dovrebbe essere scartata o il paziente dovrebbe essere sottoposto a particolari procedure di notifica e di consenso52. Nei caso dei trapianti allogenici, dovrebbe essere preso in attenta considerazione lo stato CMV del donatore e del ricevente. Un paziente pu sviluppare uninfezione primaria da CMV, se CMV negativo e riceve un trapianto CMV positivo, ma pu essere, in qualche modo, protetto dallo stato immunologico del prodotto. I soggetti CMV positivi, che ricevano un prodotto CMV negativo, possono sviluppare una grave infezione primaria da CMV nellinnesto, indotta dal virus presente nei tessuti del ricevente46.
Raccolta dei prodotti

Raccolta di CPEm Una raccolta di sangue midollare la stessa per un donatore allogenico o per un paziente autologo. La procedura viene effettuata in condizioni di sterilit, in camera operatoria. La cresta iliaca posteriore il posto utilizzato per la raccolta. Nel paziente autologo, una precedente radioterapia sui siti di aspirazione pu determinare una raccolta povera di cellule. In generale, questi siti non sono adatti alla raccolta e dovrebbero essere evitati. Una volta aspirato, il sangue midollare dovrebbe essere mescolato e diluito nella soluzione anticoagulante (in genere eparina priva di conservanti e/o ACD). Le varie aliquote di midollo raccolte vanno riunite in un recipiente sterile o in una sacca munita di filtri a pori calibrati. Il midollo viene poi immesso in una sacca per la raccolta del sangue, che portata nel laboratorio di lavorazione e dalla quale sono prelevati i campioni per le valutazioni relative al trapianto, per i test di garanzia di qualit, per le possibili manipolazioni, per letichettatura finale e/o per la crioconservazione. Obiettivi della raccolta
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Il peso corporeo del ricevente e le eventuali manipolazioni determineranno il volume di midollo da raccogliere. Il quantitativo minimo pi comunemente usato, dopo la lavorazione, sia nei trapianti autologhi che in quelli allogenici, di 2,0 x 108 cellule nucleate per chilo di peso del ricevente. Le raccolte di midollo da donatori autologhi, cui siano stati somministrati farmaci alchilanti, possono fornire poche cellule progenitrici rispetto al totale delle cellule nucleate. In questi casi si dovrebbe ottenere, se possibile, una quantit extra di cellule midollari 53. Qualora il midollo raccolto debba essere manipolato (per esempio, per ridurre le cellule T o per purificarlo ex vivo da cellule tumorali) si dovrebbero raccogliere addizionali quantit di midollo, sino a raddoppiare la dose prevista per la reinfusione. LNMDP limita il volume della raccolta dai suoi donatori a un massimo di 1.500 mL. Molte strutture utilizzano, per determinare il volume finale della raccolta, il numero delle cellule richieste per il trapianto e il conteggio delle cellule nel prodotto. Considerazioni cliniche Let del donatore e, nel caso di trapianto autologo, la malattia di base e il regime del trattamento impiegato condizionano la raccolta di CPE (Tabella 25.2). I donatori (autologhi o allogenici) possono necessitare di trasfusioni di concentrati eritrocitari (CE) per rimpiazzare le perdite indotte dalla raccolta del midollo.
Frequentemente, i donatori allogenici di midollo hanno a disposizione ununit autologa di concentrati eritrocitari, prelevata 2 o 3 settimane prima della raccolta del midollo. La maggior parte delle trasfusioni si attua dopo la raccolta per evitare una diluizione del sangue midollare. Gli emocomponenti allogenici debbono essere irradiati, se somministrati prima o durante le procedure di raccolta, per rendere i linfociti del donatore incapaci di moltiplicarsi e attaccare i tessuti del ricevente il trapianto. inducendo una possibile GvHD. Nei trapianti che richiedono una manipolazione del prodotto da trapiantare, come lallontanamento degli eritrociti, questi possono essere reinfusi al donatore. Raccolta di PBSC Le CPE possono essere mobilizzate nel sangue periferico con limpiego di fattori di crescita (ricombinanti), ed essere raccolte in numero sufficiente da consentire un attecchimento duraturo nel ricevente. CD34 Con antigene CD34 si definisce linsieme (cluster) di glicoproteine di transmembrana, che sono presenti sulle cellule ematopoietiche immature, su alcune cellule endoteliali, e su cellule stromali55. Lantigene ha un peso molecolare di circa 110 kD e ha carica negativa. Le cellule che esprimono CD34 comprendono sia le CPE gi commissionate che quelle pluripotenti. Cellule CD34 positive purificate di origine
Tabella 25.2 - Fattori che possono influenzare la mobilizzazione delle cellule ematopoietiche 1. Tecnica di mobilizzazione a. Chemioterapia (grado di mielosoppressione transitoria) b. Fattori di crescita (tipo, protocollo, dosi) c. Uso combinato di chemioterapia e di fattori di crescita 2. Effetto cumulativo delle precedenti chemioterapie e radiazioni 3. Caratteristiche della malattia di base 4. Et del paziente 5. Presenza di metastasi nel midollo
(Da Lane54, adattamento autorizzato)
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midollare sono in grado di ricostituire, nelluomo, le tre linee ematopoietiche55. Dall1 al 3% delle cellule del midollo normale esprimono questo antigene. Nel sangue periferico le cellule CD34+ sono a livelli inferiori (0,01-0,1%)56. Sono stati prodotti anticorpi monoclonali (MonoAb) anti-CD34, per essere utilizzati nel test in citofluorometria al fine di misurare il contenuto di CPE nelle raccolte e la concentrazione di cellule CD34+ nel sangue periferico57. Raccolta di PBSC autologhe In tema di trapianti autologhi, i donatori di PBSC sono, di norma, mobilizzati con i fattori di crescita ematopoietici (con o senza chemioterapia associata), che comprendono il G-CSF o il GMCSF ( Granulocyte-Macrophage ColonyStimulating Factor ) o una combinazione di entrambi. La stimolazione o con sola chemioterapia o con soli fattori di crescita determina un aumento di CPE, da 10 a 30 volte, rispetto allo stato dequilibrio8. La mobilizzazione combinata (chemioterapia e fattori di crescita) aumenta la concentrazione di CPE da 50 a 200 volte tanto58. Il trapianto con PBSC autologhe richiede un tempo minore per il ripristino ematologico rispetto a quello con CPEm59. La ripopolazione piastrinica molto pi rapida e il ricovero del paziente si riduce da 7 a 10 giorni. Schwella et al.60 hanno documentato che il tempo medio per una conta piastrinica 20.000/L (che non necessita di supporto trasfusionale) era di 10 giorni per il gruppo di pazienti che avevano ricevuto PBSC mobilizzate con chemioterapia e G-CSF, rispetto ai 17 giorni nel gruppo di pazienti che aveva ricevuto CPEm. Unefficace stimolazione in un ricevente autologo influenzata da precedenti chemioterapie o irradiazioni. Esiste una relazione lineare fra la conta di CD34 nel sangue periferico prima della raccolta e la quantit di sangue da processare per raggiungere la dose richiesta. Ci si attende che i grafici o i modelli predittivi varino, in rapporto allefficienza di una raccolta di cellule CD34+, a seconda della apparecchiatura impiegata e del software
utilizzato. Ci si dovrebbe anche attendere che essi siano meno predittivi sulla concentrazione di CD34+, quando la conta meno accurata. La conta leucocitaria, il numero delle cellule mononucleate, quello delle cellule CD34+ circolanti sono stati impiegati, come marcatori surrogati, per stabilire il momento della raccolta di PBSC59,61-63. stato suggerito che il momento ottimale, per iniziare una raccolta di PBSC da pazienti stimolati con chemioterapia, sia quando la conta leucocitaria superiore a 5 x 109/L59. La concentrazione leucocitaria, peraltro, non correla con il numero di CPE nel sangue periferico. Lanalisi fenotipica delle cellule CD34+, eseguita in citofluorimetria, fornisce una misura pi esatta, e in tempo reale, sul contenuto di cellule CD34+ in una raccolta o in un trapianto ematopoietico. Si possono utilizzare diverse tecniche atte a indicare il momento dinizio della prima raccolta e il numero totale di cellule CD34+ raccolto alla fine (in funzione del volume di sangue processato)56,57,64-66. Il tempo di attecchimento correla con il numero di cellule CD34+ nel prodotto raccolto65,67-69. In generale, ci si attende che una concentrazione di CD34+ nel sangue periferico di 10 cellule per L possa assicurare una raccolta di almeno 1,0 x 106 CD34+ per chilo di peso corporeo60,61.64. Nella maggioranza dei pazienti autologhi, laccesso venoso si ottiene con un catetere centrale (per aferesi) a doppio o triplo lume. Gli operatori processano, in genere, da due a tre volumi di sangue, nel corso di ogni aferesi. In ambito pediatrico, pu essere necessario innescare il separatore con eritrociti compatibili e irradiati. Il donatore sar sottoposto a procedure quotidiane della durata di 2-5 ore. Per diminuire il numero totale di raccolte, in molti centri vengono eseguite leucoaferesi di grandi volumi, processando tre volumi ematici o 15-20 litri di sangue. Alcuni studi70-72 hanno indicato che, durante una raccolta su grandi volumi, c un passaggio nel sangue periferico di CPE non circolanti. Hillyer73 ha riportato un aumento di 2,5 volte, rispetto alla raccolta del primo volume ematico, nel numero (per mL) delle unit granulocitarie-macrofagiche formanti colonie (GM-
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CFU), quando il volume del sangue processato era di 15 litri. Obiettivi della raccolta. Ladeguatezza della raccolta di CPE autologhe misurata dalla dose di cellule CD34+ (numero di CD34+ per chilo di peso corporeo del ricevente). La soglia minima di cellule CD34+ necessaria a determinare, nel trapianto autologo, lattecchimento dei neutrofili e delle piastrine viene riportata in un ambito che va da 0,75 a 1 x 106/kg8,64. Questo obiettivo minimo serve da linea guida grossolana e dosi maggiori sono state associate a un pi rapido attecchimento piastrinico 74, minori complicazioni febbrili e diminuito impiego di terapia antibiotica nel posttrapianto75. Dati recenti segnalano anche benefici economici, collegati a raccolte pi abbondanti di CD34+ (maggiori o eguali a 5,0 x 106/kg), rispetto a raccolte limitate alla quantit minima accettabile (1,0 x 10 6/kg) per lattecchimento. Anche le caratteristiche delle procedure aferetiche influenzano il volume della raccolta. Scarsa mobilizzazione delle CPE autologhe. I pazienti, pretrattati con drastici regimi di chemioterapia o di irradiazione, possono mobilizzare in maniera insufficiente, dopo stimolazioni con fattori di crescita e chemioterapia. Non nota la via migliore per ottenere una mobilizzazione adeguata nei pazienti che mobilizzano scarsamente. La raccolta di CPEm, insieme o al posto di quella di PBSC, spesso inefficace per migliorare lattecchimento77. Secondi tentativi, eseguiti utilizzando soltanto G-CSF, hanno avuto successo nellottenere un conteggio adeguato di cellule CD34+ e possono essere altrettanto efficaci dellimpiego di G-CSF e chemioterapia78. Anche aumentare le dosi di G-CSF o associare GM-CSF pu essere valido in alcuni donatori autologhi, che hanno, in precedenza, fallito la mobilizzazione79. In alcuni pazienti, soprattutto se pretrattati pesantemente o se pi anziani, la mobilizzazione pu essere molto difficile da conseguire. Un ulteriore approccio, per accrescere la produzione di CSE o di CPE indotta dai fattori di crescita, quello di manipolare le chemochine, che attaccano
le cellule nel loro micro-ambiente. Linterazione del fattore di crescita 1 di derivazione stromale (SDF-1, Stromal-Derived Growth Factor-1) con il suo ligando CXCR4 [Chemochine (C-X-C motif) Receptor 4] controlla la mobilizzazione. La molecola AMD (ActinoMycin D) 3100 era stata prodotta come potente e selettivo inibitore di CXCR4, allo scopo di controllare la replicazione delle cellule contenenti HIV. Si osservato, come effetto collaterale del farmaco, un rapido aumento della conta leucocitaria. Broxmeyer at al.80 hanno misurato, dopo liniezione di AMD 3100 in volontari, un aumento di 40 volte delle CPE. Sono in corso sperimentazioni cliniche, in fase I e in fase II, sullimpiego di AMD 3100, insieme a G-CSF, per accrescere la mobilizzazione e la raccolta di PBSC in pazienti che mobilizzano scarsamente81. Considerazioni cliniche sulla raccolta autologa di PBSC. La frequenza e la durata delle raccolte di PBSC possono essere disagevoli e avere effetti collaterali per il donatore. Prima e dopo ciascuna aferesi, vanno eseguiti esami emocromocitometrici per monitorare i valori dellematocrito e delle piastrine. Possono rendersi necessarie trasfusioni di CE o di concentrati piastrinici (CP). La perdita in eritrociti dovrebbe essere minima nelle procedure di raccolta di PBSC, ma la conta piastrinica, tipicamente, diminuisce dal 25 al 40%, dato che le CPE sono contenute nel buffy-coat insieme alle piastrine. La raccolta pu essere effettuata utilizzando accessi venosi periferici o centrali. I pazienti che hanno precedentemente ricevuto chemioterapia sono quelli che maggiormente necessitano di cateteri venosi centrali, per la scadente accessibilit periferica. Le trombosi, sia nel catetere sia nelle vene che lo circondano, rappresentano la complicazione pi comune di una raccolta di PBSC82 eseguita con tale mezzo. Raccolta di PBSC allogeniche Si esegue la raccolta di PBSC da un consanguineo HLA compatibile dopo mobilizzazione con G-CSF. Caratteristicamente, al donatore vengono
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somministrati da 10 a 16 g/kg di G-CSF, per iniezione sottocutanea, una o due volte al giorno. La concentrazione di CD34+ nel sangue periferico aumenta a partire dal terzo giorno di somministrazione e raggiunge il picco dopo 5-6 giorni. Una leucoaferesi, che processi un volume standard di 8-9 litri di sangue, produce un emocomponente con i seguenti valori medi: leucociti, 32,4 x 10 9; cellule mononucleate, 31,4 x 109; cellule CD34+, 330 x 106; piastrine, 470 x 109; eritrociti, 7,6 mL83. Indagini cliniche84 hanno indicato, come quantit adeguata a un trapianto allogenico di PBSC, una dose minima di cellule CD34+ pari a 2,0 x 106 . I donatori allogenici con insufficienti accessi venosi possono richiedere limpiego di cateteri centrali. LNMDP ha riferito che in una raccolta normale di CPE, il 5% dei donatori e il 20% delle donatrici hanno necessitato di cateteri venosi centrali per la raccolta85. Esiste l1% di rischio di complicazioni (associate ai cateteri) che vanno da infezione, emorragie, a pneumotorace. Sono state segnalate piastrinopenie, in donatori sani, quali complicazioni della somministrazione di G-CSF e della raccolta di PBSC86,87. Esiste anche un rischio nellesporre donatori sani al G-CSF. Il 90% dei donatori accusa effetti collaterali88. Il disturbo pi comune rappresentato dai dolori ossei, seguiti da mal di testa, dolori diffusi al corpo, stanchezza, nausea e/o vomito. Dolori ossei, mal di testa e dolori diffusi al corpo possono essere trattati con successo impiegando analgesici non steroidi, come il paracetamolo. Come ricordato in precedenza, sono stati riportati casi di esami sierologici falsamente positivi per marcatori di malattie infettive51. I gravi effetti sfavorevoli sono rari, ma sono stati riferiti: rotture di milza89,90, infiltrazione neutrofila della pelle (o sindrome di Sweet)91, trombosi arteriose82 e una reazione anafilattoide93. Si osservato che donatori con emoglobinopatie complesse (trait drepanocitico e talassemia +) presentano complicazioni quando stimolati con G-CSF94,95. Raccolta di CPEsc Il sangue del cordone ombelicale pu essere
raccolto da placente secondate o non ancora secondate96. La raccolta di sangue cordonale non dovrebbe interferire con i trattamenti ostetrici di madre e di neonato. Se si intende raccogliere il sangue cordonale, si deve preventivamente pianificare la non esecuzione della raccolta, nel caso che madre o neonato necessitino di cure e attenzioni. Se si vogliono ottenere volumi adeguati, la raccolta del sangue dalla placenta, dopo il secondamento, va iniziata preferibilmente entro 15 minuti dal parto97. Per limitare i rischi di una contaminazione batterica, la superficie del cordone dovrebbe essere detersa con alcol e poi disinfettata come si fa con la cute del donatore per un prelievo di sangue. Si inserisce nella vena ombelicale un ago, ad ampio calibro, connesso a una sacca da prelievo, contenente CPDA, CPD o ACD, cos che il sangue placentare possa defluire, per gravit, nella sacca. Alternativamente, la placenta secondata va tenuta sospesa al di sopra della sacca di raccolta. CPDA e CPD sono le soluzioni anticoagulanti da preferirsi, in quanto isotoniche e con pH neutro. Tuttavia, in alcuni centri sono in uso altri sistemi chiusi che impiegano ACD o eparina. Si deve ottenere, preferibilmente prima del parto, il consenso informato dalla madre biologica o dal legale rappresentante del bambino. Prima della raccolta o, comunque, entro 48 dalla stessa, si deve ottenere e documentare la storia clinica della madre biologica e, se disponibile, anche quella del neonato. Sempre se disponibile, si dovrebbe ottenere anche quella del padre biologico. Non si pu accettare luso allogenico di CPEsc se vi una storia familiare (madre, padre o fratelli) di malattie genetiche, che possano compromettere la validit dellinnesto o, altrimenti, esporre il ricevente a unalterazione genetica trasmessa dal trapianto. Si debbono tipizzare per ABO/Rh gli eritrociti contenuti nella raccolta di CPEsc o quelli del neonato e deve essere eseguita una ricerca per anticorpi inattesi, utilizzando sia il siero o il plasma della madre o quelli del neonato o della sacca di raccolta52.56.
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I leucociti del sangue cordonale debbono essere tipizzati per gli antigeni HLA (pi precisamente, HLA-A e HLA-B e tipizzazione molecolare degli antigeni di Classe II) da parte di un laboratorio accreditato dallASHI ( American Society of Histocompatibility and Immunogenetics ) o da equivalenti organizzazioni accreditate49,52. Perch il sangue cordonale possa rappresentare una reale alternativa ai trapianti allogenici di CPEm e di PBSC, indispensabile avere a disposizione una giacenza congelata di CPEsc HLA-tipizzate e pronte alluso. Si dovrebbero congelare dei campioni, costituiti preferibilmente da segmenti di tubo attaccati alle sacche che contengono il sangue cordonale, per confermare la tipizzazione HLA da parte delle strutture che eseguiranno il trapianto. Molti centri congelano anche campioni del siero della madre per permettere lesecuzione di test per nuovi marcatori di malattie infettive, qualora si siano resi disponibili dopo la raccolta delle CPEsc e si ritengano importanti quando il trapianto viene programmato. Un esempio fornito dallimprovvisa comparsa del West Nile virus, come pericolo per madri, neonati e riceventi. Pu essere utilizzato un campione del sangue materno, che contenga cellule o DNA ( adeguato un campione su carta da filtro essiccata), qualora sorgano problemi circa la tipizzazione HLA del bambino. I campioni di sangue materno si sono dimostrati estremamente utili per delucidare fenotipi dubbi dellinfante, quando la tipizzazione HLA era stata effettuata impiegando metodiche sierologiche. Al momento dello scongelamento, si deve anche effettuare un conteggio delle cellule CD34+, per valutare il contenuto di cellule staminali di un trapianto di CPEsc, ma tale conta si rivela utile soltanto se si impiega un marcatore della vitalit, in modo che solamente le cellule vitali vengano contate. Il desiderio di accrescere la dose di cellule staminali nel CPEsc ha focalizzato linteresse sullespansione cellulare ex vivo, in laboratorio98. Le prime sperimentazioni cliniche di espansione delle CPEsc sono promettenti, dato che si sono ottenuti, con successo, attecchimenti. Tuttavia,
non si sono segnalati miglioramenti nella sopravvivenza dei pazienti trapiantati99,100. Lespansione ex vivo del sangue di cordone unarea di indagini sperimentali in piena attivit.
Manipolazioni sulle cellule progenitrici ematopoietiche

Tecniche di selezione delle cellule e/o di purificazione delle CPE Selezione delle cellule CD34+ Via via che una CPE si differenzia e matura, il livello dellantigene CD34 diminuisce. Questa propriet, insieme alluso di anticorpi monoclonali specifici per differenti epitopi della molecola CD34, permette di attuare procedure di separazione fisica. Sono disponibili numerose metodiche di selezione immunologica, quali la separazione cellulare in immunofluorescenza (FACS, Fluorescence-Activated Cell Sortine) o luso di biglie immunomagnetiche101. La selezione di CPE CD34+ si pu associare a una riduzione delle cellule neoplastiche (trapianto autologo) o delle cellule T (trapianto allogenico). Si sta investigando lutilit clinica della selezione di cellule CD34 e AC133 (un marcatore di superficie), al fine di ridurre le cellule tumorali o i linfociti T102. Separazione immunomagnetica . Sono disponibili diverse tecniche, dirette e indirette, di separazione immunomagnetica. In genere, si lega a una biglia magnetica un anticorpo anti-CD34. Il complesso (anticorpo-biglia) va incubato con cellule mononucleate e quelle che esprimono lantigene CD34 si legano alle biglie rivestite dallanticorpo, formando rosette. Per separare le cellule CD34+ che hanno formato rosette da quelle che non lo hanno fatto, si applica un magnete. Il distacco dalle biglie, per il quale esistono diverse modalit, si pu attuare con frammenti anti-Fab o con un trattamento enzimatico (per esempio, con chimo-papaina)103. Il sistema Isolex 300 (Baxter Healthcare Immunotherapy Division, Irvine, CA, USA), per la separazione magnetica delle cellule, uno strumento semiautomatico usato per applicare, in clinica, la selezione di cellule CD34+.
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Il metodo utilizza biglie paramagnetiche Dynal rivestite da anticorpi al fine di creare rosette di cellule CD34+. Sono disponibili anche, per uso clinico, uno strumento totalmente automatico (Isolex 300i, Baxter) e un prodotto che rilascia peptidi104. Altre tecniche di separazione magnetica utilizzano microbiglie superparamagnetiche, che restano attaccate alla superficie delle CPE105. Una tale metodica, denominata MACS (Magnetic Cell Sorting), della ditta Miltenyi Biotec (Bergisch, Germania), e stata introdotta primitivamente, in rari esempi, da Miltenyi et al.106. Il ClinicMACS (Miltenyi Biotec) una versione, per uso clinico, del MACS, ed disponibile, ma esclusivamente a scopo di ricerca, anche negli USA. Questo sistema utilizza microbiglie di ferrodestrano, rivestite da anticorpi. Le cellule, magnetizzate, vengono separate su una colonna magnetica ad alto gradiente e un microprocessore controlla leluizione delle cellule CD34+. Elutriazione per centrifugazione controcorrente. Lelutriazione per centrifugazione controcorrente una metodica per separare cellule in base alle loro dimensioni e alla loro densit. Una centrifuga a flusso continuo (Beckman Instruments, Palo Alto, CA o Gambro Golden, CO, USA) e ununica camera si basano sul principio fondamentale di questo tipo di separazione: due forze opposte (forza centrifuga e forza centripeta determinata dal flusso controcorrente) agiscono, contemporaneamente, sulle cellule. Come le cellule vengono pompate allinterno della camera (in direzione centripeta), si sovrappongono in base alle loro propriet di sedimentazione. Aggiustando il ritmo del flusso controcorrente, le forze centrifughe e centripete si bilanciano e si crea un gradiente di flusso allinterno della camera. Aumentando con gradualit il ritmo di flusso del liquido o diminuendo la velocit del rotore, le cellule possono essere eluite dalla camera ed essere raccolte. Le cellule pi piccole, a lenta sedimentazione, si eluiscono per prime. Quantunque questa tecnica sia stata applicata, primitivamente, per ridurre il numero delle cellule T, stata anche impiegata per la selezione delle cellule CD34+. Le CD34+ sono
eterogenee e si eluiscono in sottofrazioni, utili negli esperimenti di ripopolazione e in quelli di espansione ex vivo107. Selezione delle cellule tumorali autologhe Con il termine purificazione ( purging ) o selezione negativa si indica la rimozione delle cellule neoplastiche che possono contaminare un trapianto autologo. Nei pazienti affetti da malattie o da neoplasie ematologiche, che coinvolgono frequentemente il midollo (per esempio i linfomi), un residuo anche minimo di cellule malate contribuisce alle ricadute 108. Quantunque le raccolte di PBSC abbiano una minore probabilit di contaminazione neoplastica rispetto a quelle di CPEm e un numero minore di cellule maligne per mL, esse possono contenere ancora un rilevante numero di cellule neoplastiche vitali. Alcune ricerche hanno documentato che le cellule tumorali possono essere mobilizzate dal midollo nel circolo periferico109,110. controverso il fatto che il purging tumorale sia in grado di diminuire le ricadute. Dato che alcuni metodi di rimozione delle cellule tumorali possono danneggiare le CPE, le probabilit di malattia residua o di ricaduta debbono essere accuratamente valutate contro una maggiore probabilit di fallimento del trapianto o una maggiore mortalit per lo stato di aplasia prolungata, che si pu associare alle tecniche di purificazione111. Sono a disposizione numerose tecniche per il purging autologo. Lo scopo di tutte queste metodiche (fisiche, immunologiche o farmacologiche) quello di distruggere o rimuovere il clone maligno, mantenendo lefficienza delle CPE, assolutamente necessaria per lattecchimento112. Tecniche farmacologiche . Le terapie antineoplastiche, in vivo, determinano la maggiore distruzione di cellule tumorali, data la differente sensibilit a i farmaci che hanno le cellule maligne rispetto a quelle normali. Il purging farmacologico, in vitro, rappresenta uno sforzo per aumentare questo tipo di trattamento terapeutico. La purificazione in vitro consente un aumento delle dosi e dellesposizione, senza problemi di tossicit per gli organi del paziente, dato che si possono usare maggiori
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concentrazioni di farmaco sul prodotto ematologico ex vivo, che verr, poi, somministrato in vivo. La concentrazione del farmaco, tuttavia, non deve essere a livelli di tossicit, prima della reinfusione. Le ossazofosforine attivate (quali, la 4-idroperossifosfamide o la mafosfamide) sono stati i composti pi frequentemente utilizzati, ma non sono pi impiegati negli USA. Sono state studiate altre sostanze chemioterapiche, ma esclusivamente a scopo di ricerca e non per uso clinico. I risultati di trapianti autologhi purificati per LMA con entrambi questi composti hanno mostrato una prolungata fase di aplasia, con una sopravvivenza minore dell1% di GM-CFU112. Tecniche fisiche. I metodi di separazione, basati sulla dimensione e densit delle cellule, utilizzando gradienti o la tecnica di elutriazione non determinano unadeguata rimozione delle cellule neoplastiche111. Luso congiunto di tecniche fisiche e immunologiche richiede, tuttavia, ulteriori studi. Tecniche immunologiche. La produzione di anticorpi monoclonali, insieme alla scoperta di antigeni associati ai tumori, ha aperto la via alla purificazione immunologica 113. Gli anticorpi monoclonali possono essere diretti contro antigeni tumore-specifici o verso antigeni di differenziazione cellulare111. In primo luogo, le tecniche immunologiche differiscono, fra loro, per i metodi di rimozione delle cellule-bersaglio. Gli anticorpi monoclonali sono utilizzati insieme al complemento, legano le tossine, si accoppiano alle biglie magnetiche. La scelta dellanticorpo monoclonale e leterogeneit dellespressione antigenica a livello della cellula-bersaglio influenza il successo della purificazione o il livello della rimozione. Molti ricercatori utilizzano un cocktail di anticorpi monoclonali, nel tentativo di accrescere lefficacia del purging 114,115 . Se lanticorpo di classe IgM o se il livello atteso di densit antigenica alto, si usa, di frequente, la citotossicit mediata dal complemento111. La separazione cellulare immunomagnetica, sia di tipo diretto che indiretto, utilizza biglie magnetiche rivestite da anticorpi diretti verso uno o pi antigeni di particolare interesse. Uno studio recente114 ha descritto una rimozione di cellule tumorali di 5 logaritmi con doppio ciclo del metodo
indiretto impiegato per i linfomi a cellule B. Le analisi sulle colonie hanno documentato soltanto una riduzione del 20% delle GM-CFU e di altre unit multipotenziali (GEMM-CFU, cio, unit formanti colonie per progenitori gi commissionati). Rimozione di cellule T La GvHD una complicazione rilevante di un trapianto di CPE allogeniche. Dato che tale complicazione mediata dalle cellule T del donatore, che reagiscono contro i tessuti del ricevente, si sono adoperate strategie per individuare e rimuovere queste cellule, nel tentativo di diminuire lincidenza, o almeno lintensit, della GvHD. Molte tecniche utili per la selezione positiva e per la purificazione dalle cellule tumorali si possono applicare alla rimozione delle cellule T (vedi Tabella 25.3). Tabella 25.3 - Metodiche per la rimozione di cellule T Metodiche non immunologiche Elutriazione per centrifugazione controcorrente Uso di farmaci citotossici Metodiche immunologiche Anticorpi monoclonali insieme o senza il complemento Immunotossine Biglie immunomagnetiche Nei trapianti T-depleti, i due maggiori problemi sono il fallimento del trapianto e la ricaduta leucemica. Il fallimento (precoce o tardivo) di un trapianto dovuto, nella maggioranza dei casi, a rigetto. I primi trapianti con prodotti T-depleti avevano coinvolto pazienti affetti da leucemia mieloide cronica e avevano mostrato unincidenza di ricadute del 50% o pi alta. Inversamente, nei riceventi con GvHD lincidenza delle ricadute era pi bassa. Successivi studi clinici e dati forniti da indagini hanno evidenziato leffetto immunomediato della GvL116. Ricerche e applicazioni migliorative si sono focalizzate sul determinare il livello ottimale di una rimozione delle cellule T.
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Dreger et al.115 hanno riferito su un confronto fra i diversi metodi di T-deplezione (uso del MonoAb CAMPATH-1 pi complemento, selezione immunomagnetica di cellule CD34+, selezione di cellule CD34+ mediata da biotina-avidina). La metodica immunomagnetica ha fornito una deplezione di 4 logaritmi contro una di 3,1 log con biotina-avidina, mentre il trattamento con CAMPATH-1 e complemento autologo una di 2,1 log. Sono in corso studi per limitare la gravit della GvHD, mantenendo leffetto GvL. Ricerche supplementari stanno indagando il ruolo delle sottopopolazioni T e/o delle citochine nel potenziare leffetto GvL117. Incompatibilit ABO La compatibilit HLA cruciale per il buon attecchimento in riceventi mielodepressi o
mielosoppressi, mentre la compatibilit ABO non lo . Le CPE totipotenti e quelle gi commissionate, ma in fase molto iniziale, non posseggono antigeni ABH, permettendo cos un attecchimento positivo, senza tener conto della compatibilit ABO fra donatore e ricevente. Lincompatibilit ABO non influenza lattecchimento di neutrofili o piastrine o il fallimento e il rigetto del trapianto. Tuttavia, lattecchimento eritrocitario pu verificarsi in ritardo e pu intervenire unemolisi ritardata, dopo un trapianto ABO-incompatibile minore, nel quale il donatore possiede anticorpi diretti contro le emazie del ricevente (Tabella 25.4). Incompatibilit ABO maggiore Unincompatibilit maggiore si ha quando il ricevente possiede anticorpi ABO o altri anticorpi
Tabella 25.4 - Possibili problemi in caso di trapianti di CPE ABO ed Rh incompatibili Incompatibilit Esempi Donatore ABO (maggiore) Gruppo A Ricevente Gruppo O Emolisi delle emazie del donatore, ritardo dellattecchimento eritrocitario, emolisi al momento dellattecchimento. Emolisi delle emazie del paziente dal plasma dal donatore; in casi pediatrici, emolisi delle emazie del paziente, 7-10 giorni dopo il trapianto, causata da iso-agglutinine prodotte dai linfociti passenger. Emolisi delle emazie del paziente da parte di anticorpi anti-D prodotte dal trapianto. Problemi possibili
ABO (minore)
Gruppo O
Gruppo A
Rh Rh
Negativo Positivo
Positivo
Negativo Emolisi delle emazie del donatore da parte (con anti-D) delle nuove CPE attecchite (rara) o ritardato attecchimento eritrocitario. Positivo Emolisi delle emazie del paziente da parte di anticorpi del donatore presenti nel plasma e prodotti dopo attecchimento. Emolisi delle emazie del donatore da parte delle nuove CPE attecchite (rara) o ritardato attecchimento eritrocitario.
Per altri Ag eritrocitari
Negativo
Positivo
Negativo (con Ab)
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antieritrocitari (come anti-D o anti-K), diretti contro antigeni presenti sulle emazie del donatore. I prodotti contenenti CPE possono essere manipolati per rimuovere gli eritrociti maturi. Un paziente di gruppo O, che ha ricevuto un trapianto da un donatore di gruppo A, pu continuare a produrre anticorpi anti-A e anti-B per 3-4 mesi (o, in rari casi, pi a lungo) e la presenza di anticorpi anti-A ritarder leritropoiesi da parte del trapianto di gruppo A; le emazie A compariranno in circolo quando saranno scomparsi gli anticorpi anti-A del ricevente. La formazione di granulociti e di piastrine non ne influenzata119. Lattecchimento eritrocitario pu essere ritardato di 40 giorni dopo il trapianto120. Gli eritrociti utilizzati per trasfusioni nel ricevente debbono essere compatibili sia con il donatore che con il ricevente. Per evitare confusioni, in alcuni centri si utilizza sangue di gruppo O, in caso di trapianti con incompatibilit ABO maggiore. Le raccomandazioni per la scelta ottimale degli emocomponenti sono riassunte nella Tabella 25.5. Incompatibilit ABO minore Unincompatibilit ABO minore si ha quando il donatore presenta anticorpi diretti contro gli eritrociti del ricevente (per esempio, donatore di gruppo O e ricevente di gruppo diverso da O). Prima di infondere un trapianto contenente plasma incompatibile per il ricevente, il plasma deve essere rimosso, allo scopo di evitare linfusione degli anticorpi anti-A e/o anti-B presenti. Un trapianto con incompatibilit ABO minore pu essere caratterizzato da uninattesa emolisi immune, che compare da 7 a 10 giorni dopo il trapianto e che pu durare sino a 2 settimane. Il test allantiglobulina diretto (TAD) positivo; negli eluati si possono ritrovare gli anticorpi antiA e/o anti-B, possono intervenire emoglobinemia e/o emoglobinuria. Un 30% dei pazienti che ricevono questo tipo di trapianti pu presentare un TAD positivo senza evidente emolisi. Questultimo fenomeno dovuto alla produzione di anticorpi anti-eritrocitari da parte dei linfociti passenger presenti nel prodotto trapiantato121. Sono stati riportati anche anticorpi,
prodotti da linfociti passenger , diretti contro antigeni non ABO122. Sebbene transitoria, lemolisi pu perdurare sino a due settimane e richiedere trasfusioni di emazie di gruppo O. I trapianti con incompatibilit ABO minore possono essere caratterizzati da un maggior rischio di emolisi, causata probabilmente da un pi alto contenuto di cellule B123. In ogni caso, tuttavia, il plasma deve essere compatibile con il donatore e con il ricevente. In alcuni centri, in caso di incompatibilit ABO minore, viene utilizzato regolarmente plasma di gruppo AB, per evitare confusioni. Con linizio del regime di condizionamento, le trasfusioni di eritrociti dovrebbero essere tutte del gruppo del donatore. Le raccomandazioni per una selezione ottimale degli emocomponenti sono riportate nella Tabella 25.5. Chimerismo Nonostante chemioterapie e irradiazioni intensive prima del trapianto, alcune cellule ematopoietiche dellospite possono sopravvivere e coesistere, di conseguenza, con le cellule prodotte dalle CPE trapiantate. Questa doppia popolazione, che determina ci che viene denominato chimerismo ematopoietico parziale, pu avere effetti sulla tolleranza immunologica124. Tale tolleranza si manifesta nei trapianti a esito positivo e permette una normale ricostituzione immunologica. Un chimerismo globale (totale sostituzione delle cellule midollari del ricevente da parte delle cellule del donatore) interviene nei trapianti di CPEm eseguiti con successo. Trattamenti in presenza di una incompatibilit ABO Incompatibilit ABO maggiore. Due sono stati gli approcci impiegati in caso di incompatibilit ABO maggiore: 1) rimozione o diminuzione delle isoagglutinine nel ricevente e, 2) rimozione delle emazie dalla raccolta di CPEm. Questi trattamenti non sono, in genere, necessari in caso di trapianto con PBSC, data la scarsa quantit di eritrociti presente nel prodotto. I tentativi di rimuovere o diminuire il titolo delle
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Tabella 25.5 - Supporto trasfusionale a pazienti che hanno ricevuto trapianto ABO incompatibile Fase I Emocomponenti Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Ricevente Fase II PLT (scelte successive)* AB, B, O AB, B, O A, B, O A, B, O B, A, O AB, B, O AB, A, O A, B, O A, B, O B, A, O A, B, O B, A, O Fase III Emocomponenti Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore Donatore
Ricevente Donatore Incompatibilit A B AB AB AB O O O A B A B O O O A B A B AB AB AB B A Minore Minore Minore Minore Minore Maggiore Maggiore Maggiore Maggiore Maggiore
Eritrociti O O O A, O B, O O O O A, O B, O O O
PLT (1a scelta) A, AB B, AB AB AB AB A B AB AB AB AB AB
PFC A, AB B, AB AB AB AB A, AB B, AB AB AB AB AB AB
Minore e maggiore Ricevente Minore e maggiore Ricevente
* I concentrati di PLT debbono essere selezionati nellordine presentato. (Da Fridberg et al.121, modificato.) Fase I = Momento in cui il paziente viene preparato al trapianto. Fase II = Dallinizio della terapia mieloablativa fino a: per gli eritrociti, quando il test allantiglobulina diretto negativo e le agglutinine contro il donatore non sono pi rinvenibili (la tipizzazione indiretta del tipo donatore); per il PFC, quando gli eritrociti del ricevente non sono pi rinvenibili (la tipizzazione diretta conferma il gruppo ABO del donatore). Fase III = Dopo che entrambe le tipizzazioni ABO (diretta e indiretta) confermano il gruppo del donatore. Iniziando dalla Fase I, tutti gli emocomponenti debbono essere irradiati e leucodepleti. PLT = Piastrine; PFC = Plasma fresco congelato
isoagglutinine richiede limpiego di uno o pi scambi plasmatici di notevole volume, insieme (o meno) a uninfusione di emazie del gruppo del donatore, quale secondo tentativo di assorbire ulteriori isoagglutinine125,126. Un altro approccio di diminuire gli eritrociti presenti nel prodotto ABO-incompatibile. A tale scopo, la metodica pi largamente utilizzata quella della sedimentazione delle emazie. Alcune strutture di trapianto realizzano la deplezione eritrocitaria, utilizzando la separazione su gradiente di densit e con strumenti di lavaggio delle cellule (Gambro BCT, Lakewood, CO, USA). Altre impiegano apparecchiature da aferesi, quali lo Spectra (Gambro), il Fenwal CS-3000 (Baxter Healthcare), con recuperi di cellule mononucleate del 94% e dell87% e con deplezioni eritrocitarie del 99% e del 98%, rispettivamente. Incompatibilit ABO minore. In teoria, il livello di emolisi dipende dal volume delle CPEm infuse, in rapporto al volume di plasma del ricevente, e dal titolo delle IgM del donatore. Il plasma incompatibile pu essere facilmente rimosso per centrifugazione. Con la centrifugazione si pu allontanare, approssimativamente, il 75% del volume di plasma, recuperando, nel contempo, pi del 70% della conta iniziale di cellule mononucleate.
La rimozione di plasma non , di solito, richiesta nel trapianto di PBSC, considerato che il volume di plasma incompatibile di solito molto ridotto. Trattamenti sul sangue di cordone ombelicale I progressi relativi ai trattamenti sul sangue di cordone ombelicale hanno risolto, con le manipolazioni, molti dei problemi iniziali, che riguardavano, soprattutto, pesanti e inaccettabili perdite di CPE127. A differenza dei laboratori di crioconservazione, che conservano pochi prodotti di CPEm e di PBSC (di solito, meno di poche centinaia) ci si aspetta che una valida banca di CPEsc sia in grado di conservarne migliaia, e per lunghi periodi. Si stanno, quindi, perseguendo attivamente strategie per ridurne la massa totale (con risparmio di spazi, azoto liquido e costi). Attualmente, molte strutture stanno seguendo lapproccio utilizzato dal New York Blood Center, che riguarda sedimentazioni e riduzioni di volume del prodotto prima della crioconservazione128. Colture per la contaminazione microbica essenziale che gli emocomponenti da infondere a pazienti immunodepressi siano sterili. Ci particolarmente importante per le CPEm, raccolte usualmente a cielo aperto, e per i prodotti che necessitano di molteplici manipolazioni (Tabella 25.6)129-134.
Tabella 25.6 - Percentuali di contaminazioni microbiche in prodotti per la terapia cellulare Fonte delle CPE Midollo N di prodotti esaminati 291 227 317 194 1.380 560 576 1.040 1.000 % contaminati 0 1,3 6,0 <0,1 0,65 0,7 0,5 0,2 <1,0* Riferimento bibliografico 129 130 131 132 129 130 131 133 134
Sangue periferico
Cordone ombelicale
* Inizialmente la percentuale era del 28%; con il miglioramento delle tecniche e della selezione dei donatori, il tasso sceso sotto l1%.
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La positivit delle colture pu derivare da contaminazioni che intervengono durante la raccolta e le lavorazioni del prodotto o, ancora, risultare da cateteri infetti o da sepsi presenti nel paziente. I microbi pi frequentemente isolati in queste colture sono i commensali della cute. In tutti i casi, importante individuarne la fonte, il grado di contaminazione e il microrganismo responsabile, considerato che il prodotto destinato a un paziente immunodepresso. Ogni prodotto deve essere analizzato, per la contaminazione batterica, almeno una volta nel corso delle lavorazioni, in genere appena prima del congelamento o dellinfusione per il trapianto46. Una coltura positiva non richiede limmediata eliminazione del prodotto, trattandosi di cellule spesso non rimpiazzabili135. I risultati positivi, quindi, necessitano di essere sottoposti al vaglio di un medico esperto che valuti, caso per caso, sulla base di test sensibili, per meglio definire il microrganismo e per permettere unappropriata gestione clinica al momento del trapianto. Ci potrebbe anche servire da spunto per rivedere tutte le procedure e le tecniche, al fine di prevenire le contaminazioni. Conteggio delle cellule staminali: analisi delle CD34, analisi dellespressione dellaldeide-deidrogenasi e altre analisi Man mano che le cellule staminali si differenziano nelle diverse linee ematopoietiche, compare il marcatore di superficie CD34. Con il prosieguo della differenziazione, le cellule acquisiscono altri marcatori di superficie, mentre lespressione CD34 diminuisce. Ne risulta che gli stadi di differenziazione possono essere studiati analizzando lespressione e la co-espressione di altri antigeni o di altre propriet. Sono disponibili, al presente, due test per CD34, autorizzati dalla FDA, per uso diagnostico in vitro. Queste misurazioni delle cellule CD34+, sono le pi largamente utilizzate per valutare levoluzione del trapianto, hanno un impiego storicamente pi lungo e mostrano le maggiori correlazioni cliniche nella letteratura pertinente ai trapianti ematologici. Per valutare la qualit di un trapianto di CPE, si
sono utilizzate acquisizione e successiva perdita dellespressione CD34 da parte delle cellule. Lattuale approccio prevede una metodica basata sulla citometria a flusso (a parametri multipli) per determinare il numero delle cellule CD34+ e per calcolarne la quantit, in base al peso corporeo del paziente. Esistono numerose analisi citofluorimetriche per contare le cellule CD34+56,136,137. Dato che le tecniche di conteggio differiscono fra loro, la correlazione fra i valori delle dosi di CD34+, da centro a centro, spesso inattendibile. Molti studi hanno documentato le variabilit di metodi e risultati delle analisi delle CD34 ed esaminato le possibili cause della variabilit56,57,138,139. Per la natura di evento raro del conteggio di CD34, molte componenti procedurali possono giocare un ruolo critico nelle analisi. Le scelte dellanticorpo anti-CD34, del reattivo fluorescente, della soluzione litica, del metodo di lavaggio per la lisi, della strategia di apertura/chiusura dei canali (gating) e del numero degli eventi analizzati rappresentano alcuni dei fattori che possono influenzare il risultato finale140. La crescente consapevolezza sui problemi pertinenti e sulla necessit di standardizzare le analisi per le CD34 ha spinto numerosi gruppi collaborativi, quale quello della Societ Internazionale per la Terapia Cellulare (ISCT, International Society for Cellular Therapy) a proporre linee guida per la determinazione delle cellule CD34+, utilizzando la citometria a flusso 56,141. Sono anche disponibili approcci alternativi, e se questi si continueranno a sviluppare e a studiare, si apprenderanno sempre maggiori nozioni sullantigene CD34 e su altri marcatori delle cellule staminali pluripotenti142. Un secondo metodo di conteggio delle CPE precoci ha ottenuto la licenza dalla FDA. stato evidenziato che lespressione citoplasmatica dellaldeide-deidrogenasi (ALDH, Aldehyde Dehydrogenase ) nelle staminali protegge le propriet delle CPE quando i pazienti sono trattati con ciclofosfamide e preserva le stesse cellule durante i procedimenti di purging con 4-idrossiciclofosfamide. Lanalisi citometrica a flusso delle cellule ALDH-positive, con
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stimolazione enzimatica e inserimento allinterno delle cellule staminali di un substrato fluorescente (dato che lelemento fluorescente entra nella cellula e non si diffonde liberamente) permette di misurare una popolazione arricchita di cellule progenitrici formanti colonie. Vengono arricchite entrambe le popolazioni cellulari -sia quelle che hanno ripopolato a lungo termine, sia quelle dei progenitori commissionati - e le cellule ALDH-positive isolate (note come ALDHbr) contengono la popolazione responsabile per lattecchimento ematologico nel topo NOD/ SCID (Non Obese Diabetic/Severe Combined Immuno Deficient, cio topo diabetico non obeso, affetto da immunodeficienza combinata grave)143,144. Il metodo per contare le cellule ALDHbr e a scarsa dispersione laterale (cio SSClo, Cell with low Side Scatter) identifica esclusivamente cellule con membrane intatte e correla bene con lattecchimento di un trapianto di PBSC145. Unaltra tecnica di conteggio, che coinvolge limpiego del marcatore Flk-2 e dellantigene timico Thy 1.1lo, ha provato che le cellule Flk-2 e con antigene timico Thy 1.11o rappresentano quelle che ripopolano a lungo termine, mentre quelle Flk-2+ con Thy 1.1lo quelle che ricostituiscono a breve termine. Questi tipi di analisi possono essere ulteriormente sviluppate allo scopo di disporre di strumenti da impiegare nei futuri approcci dingegneria trapiantologica, per separare distintamente le popolazioni cellulari precoci146. Test sulle cellule che formano colonie Sono disponibili sistemi colturali in grado di dimostrare la capacit proliferativa, in vitro, di un campione di cellule ematopoietiche. Si ritiene che il potenziale di ripopolazione a breve termine (in genere, entro due settimane) appartenga alle CPE gi commissionate, mentre la ricostituzione a lungo termine sia opera di CPE pluripotenti, necessarie, soprattutto, per un attecchimento completo e duraturo. Le colture possono essere utili per valutare possibili attecchimenti; tuttavia, dato che terreni, tecniche di coltura e identificazione delle colonie sono assai variabili, i confronti interistituzionali sono difficili. La quantit di GM-CFU, al di sotto della
quale lattecchimento pu essere ritardato, varia da 1,5 x 105 a 5,0 x 105/kg147. La colture a lungo termine non sono utilizzate, di routine, in clinica, in quanto richiedono da 5 a 8 settimane di incubazione. Tuttavia, possono essere utili per valutare lo sviluppo di procedure che coinvolgono la manipolazione dei prodotti.
Congelamento e conservazione
Bench eseguita con facilit da molti Servizi Trasfusionali, la crioconservazione e la successiva infusione di CPE non sono esenti dal rischio di una loro perdita. Linfusione di CPE crioconservate comporta anche altri rischi per il ricevente, molti dei quali possono metterne in pericolo la vita ed alcuni dei quali non sono ben compresi. La perdita di CPE dovuta alla crioconservazione e leffetto di tale perdita sulla velocit di attecchimento non sono stati quantificati. Vi sono molteplici aspetti per una crioconservazione efficace di CPE. Ognuna di queste variabili influenza il recupero delle cellule durante le varie fasi della crioconservazione e, come le procedure di manipolazione, deve essere rigidamente controllata per poter ottenere risultati riproducibili. Il problema che le strutture di crioconservazione debbono ancora fronteggiare comprendere se altre soluzioni o altre procedure tecniche potrebbero permettere una migliore sopravvivenza delle cellule crioconservate, costi minori, maggiore semplicit o minore tossicit sia per il ricevente che per le caratteristiche delle cellule da congelare. Le PBSC, le CPEm e le CPEsc si congelano e si conservano utilizzando le stesse tecniche. I parametri generali riguardano la crioconservazione con DMSO (dimetilsulfossido) e proteine plasmatiche, con o senza amidoidrossietile, con raffreddamento al ritmo da 1 a 3 C/minuto e conservazione a 80 C o a temperature pi basse. Le variabili a questa tecnica riguardano la concentrazione alla quale le cellule vengono congelate, la quantit e la fonte delle proteine plasmatiche e le tecniche di raffreddamento impiegate148. La maggior parte di
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queste variabili ha, probabilmente, uno scarso effetto sulla sopravvivenza delle CPE, come dimostrato dai consistenti attecchimenti di componenti crioconservati. La crioconservazione, peraltro, determina una perdita di una indefinibile ma potenzialmente sostanziosa proporzione di CPE e potrebbe determinare un ritardo nellattecchimento, quando il componente da congelare ha un numero di CPE al limite inferiore. Vi anche una considerevole (ma in genere non alta) tossicit associata allinfusione di CPE crioconservate, che deve essere presa in considerazione quando si sviluppano tecniche di crioconservazione. Prodotti allogenici La raccolta di CPE allogeniche , in genere, regolata nei tempi, per coincidere con il completamento del regime di preparazione del ricevente al trapianto. Dato che si richiede un breve periodo di conservazione, il prodotto viene mantenuto allo stato liquido. Le CPEm, ancora non separate, possono essere conservate allo stato liquido sino a tre giorni, sia a 4 che 22 C, senza perdite significative di vitalit dei progenitori commissionati o non commissionati. La capacit di conservare midollo non manipolato, a queste condizioni, vitale per lNMDP e per gli altri registri, quando si prelevano CPEm da donatori volontari non consanguinei, un prodotto che pu essere trasportato a grandi distanze per un trapianto. Anche le unit di PBSC possono essere conservate sino a 3 giorni a 4 C 149,150. La concentrazione delle cellule importante nel determinare i tempi e le temperature di conservazione, che queste cellule sono in grado di tollerare. Unalta concentrazione di leucociti, nella conservazione allo stato liquido a temperatura ambiente, esaurisce rapidamente le riserve di ossigeno e di glucosio e determina, nel mezzo di conservazione, un decremento di pH, condizione tossica per le cellule. Una pi bassa concentrazione cellulare, un maggior volume del mezzo di sospensione (spesso rappresentato dal plasma autologo) e una conservazione in frigorifero sono protettivi.
Prodotti autologhi Per la durata richiesta dal trattamento e/o dalla raccolta di CPE, i prodotti autologhi sono, in genere, conservati congelati sino al momento della reinfusione. La crioconservazione permette, anche, di raccogliere le CPE autologhe quando il malato in remissione e di conservarle, per utilizzarle poi in caso di ricaduta (cosiddetta conservazione profilattica). Attualmente, non stata definita una precisa data di scadenza per questi prodotti; sono state, tuttavia, utilizzate CPEm conservate per 11 anni, con elevate percentuali di attecchimento151. Crioconservazione controllata da computer Lo scopo della crioconservazione di congelare le cellule in modo tale da consentire una loro conservazione a lungo termine, con minima perdita di vitalit e con capacit di ricostituzione cellulare dopo scongelamento. Lostacolo maggiore al mantenimento della vitalit cellulare, nel corso del congelamento e della conservazione, la formazione di cristalli di ghiaccio allinterno della cellula, per il concomitante aumento dellosmolarit esterna, che causa una fuoriuscita di acqua dalla cellula: questi due eventi causano lisi cellulare. Anche lo shock termico, il tempo richiesto per il cambiamento di stato (da liquido a solido), il ritmo con il quale il mutamento di stato si verifica presentano specifiche condizioni da gestire per una buona crioconservazione152. Gli effetti sfavorevoli indotti dalla formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio o dalla disidratazione della cellula si possono limitare con un lento ritmo di raffreddamento e con laggiunta di agenti crioprotettivi, quali il DMSO. Il DMSO previene la formazione di cristalli di ghiaccio di grande dimensione, penetrando allinterno della cellula e bilanciando, in qualche modo, le condizioni di iperosmolarit esterna nel liquido congelante che circonda la cellula153. Un crioprotettivo di uso comune quello formato dal 20% di DMSO e dal 20% di plasma o albumina, in una soluzione elettrolitica tamponata o in un mezzo di coltura tissutale. Il plasma o lalbumina forniscono un apporto proteico, che aiuta a prevenire danni alla cellula durante il
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congelamento e lo scongelamento. Il crioprotettivo viene mescolato, immediatamente prima del congelamento, a un eguale volume di prodotto: ne risulta una sospensione cellulare finale che contiene un 10% di DMSO e un 10% di plasma. La fase di transizione rappresenta un fenomeno fisico legato al congelamento dellacqua, durante la quale i cristalli di ghiaccio formatisi rilasciano energia nella soluzione cellulare e che necessario controbilanciare con un raffreddamento continuo per prevenire cristallizzazione, scongelamento e ricristallizzazione durante gli scambi di energia, situazioni che possono danneggiare la membrana delle cellule152. Questo metodo di congelamento necessita di speciali condizioni fisiche che sostengano la procedura. Ci pu essere ottenuto programmando, al computer, una camera di congelamento che aggiunga azoto liquido in quantit sufficiente da stimolare il congelamento attraverso una fase armonica del cambiamento di stato. Lapparecchio programmato per congelare le cellule al ritmo di 1-3 C al minuto, fino a raggiungere temperature da 90 a 100 C154-156. Con limpiego combinato di un crioprotettivo e di un ritmo programmato di congelamento, si rende possibile una crioconservazione a lungo termine, con danni minimi alle CPE. Congelamento a controllo passivo Un congelamento meccanico con immersione in un bagno di metanolo (cosiddetto congelamento a controllo passivo) viene ritenuto da alcuni Autori come un metodo semplice, affidabile, economico e valido per gestire le condizioni fisiche del congelamento, in alternativa alluso di strumenti a ritmo controllato157-159. Il principio che i prodotti possono essere congelati senza luso di congelatori programmabili o di azoto liquido, se le condizioni di congelamento sono predeterminate, misurate e effettuate secondo procedure operative standard. I prodotti sono conservati in un congelatore meccanico a 80 C (o a temperature inferiori). CPE cos conservate hanno avuto attecchimenti positivi dopo un periodo di conservazione di 2 anni159. In alcuni casi, la combinazione fra contenitore metallico che
contiene la sacca, la sacca stessa e il volume del prodotto determina un ritmo di congelamento di circa 3 C/minuto, che cade entro lambito ottimale, come discusso in precedenza160. Il maggior deterrente allimpiego di congelatori meccanici il timore di un guasto allapparecchio e la conseguente perdita di dati relativi alla conservazione a lungo termine e allattecchimento. Conservazione dei prodotti congelati I prodotti congelati con controllo passivo vengono conservati in congelatori meccanici a temperature che vanno da 80 a 150 C, mentre quelli congelati con luso di un congelatore programmabile vengono, in genere, conservati in un contenitore di azoto liquido. La temperatura di conservazione in vapori dazoto, sebbene non cos bassa come quella in fase liquida, , in media, di 140 C, temperatura che consente di conservare vitale il midollo per lunghi periodi151. I maggiori inconvenienti della conservazione in vapori dazoto sono determinati dalle ampie fluttuazioni della temperatura, quando si apre il contenitore e dalle variazioni della temperatura allinterno del contenitore stesso, che dipendono dalle sue caratteristiche di costruzione e dalle modalit seguite per introdurre e togliere le unit. I tempi di risalita delle temperature nei prodotti, in caso di emergenze elettriche o per mancato rifornimento di azoto liquido, sono significativamente pi brevi di quelli di prodotti immersi nellazoto. Il vantaggio della conservazione in vapori dazoto la possibilit di diminuire il rischio di una contaminazione crociata, che si rivelata un problema nella conservazione in fase liquida161. Conservazione di prodotti non testati o infetti Normative [21 CFR 1271.60 (a) e 1271.65(a)] e Standard48(p35),49 richiedono una conservazione separata per i prodotti non analizzati o che sono risultati positivi ai test sui marcatori di malattie infettive. Alcune strutture si conformano a tale requisito, conservando tutti i prodotti in vapori dazoto e separando fisicamente i prodotti per singole
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categorie. Altre istituzioni utilizzano un imballaggio supplementare, ponendo i prodotti in questione dentro una sacca di plastica che viene saldata prima della conservazione. Una terza alternativa di utilizzare contenitori separati per i prodotti non analizzati o risultati positivi ai test sui marcatori delle malattie infettive. Giudizio finale di idoneit Prima che ununit (autologa o allogenica) venga rilasciata, deve essere revisionata e deve corrispondere ai criteri di cessione predeterminati, descritti nel piano sulla qualit proprio dellistituzione. Si deve nuovamente analizzare quanto di pertinenza alla selezione del donatore, alla raccolta del prodotto, alla sua lavorazione e alla sua conservazione. Letichetta sul contenitore e le relative informazioni debbono descrivere accuratamente il tipo di prodotto, il liquido di conservazione e preservazione del contenitore finale, il contenuto del prodotto (di solito, il contenuto in cellule) e i risultati dei test finali di idoneit, ivi compresi quelli sui marcatori delle malattie infettive. Se vengono fatte eccezioni alle pratiche standard, esse debbono essere esplicitate sia sulletichetta che sui documenti di accompagnamento.
utilizzare i contenitori speciali per azoto liquido, denominati dry shippers (contenitori a secco). Si tratta di recipienti che contengono materiale che assorbe lazoto liquido, il quale viene sistemato fra le pareti ed in grado di mantenere una temperatura interna intorno ai 180 C per 10-14 giorni, sempre che il materiale assorbente sia stato appropriatamente imbevuto di azoto liquido e che il contenitore sia mantenuto diritto. Inclinare o rovesciare il contenitore nel corso delle spedizioni permette allazoto liquido di defluire, con conseguente riscaldamento del contenitore indotto dalla temperatura ambiente.
Scongelamento e infusione
Lidentificazione finale dei componenti ematopoietici va effettuata da chi esegue linfusione (personale infermieristico o medico). Ci si avvale di un catetere venoso centrale e le cellule sono infuse o per gocciolamento da gravit o utilizzando una pompa calibrata o per spinta manuale, con o senza un filtro in linea ( accettabile il filtro standard da 170 micron, usato nelle trasfusioni di eritrociti). Nonostante il DMSO fosse un tempo ritenuto tossico per le CPE, si sa attualmente che, alla concentrazione utilizzata per la crioconservazione, non tossico se lesposizione breve (per non pi di 1 ora)162. Esposizioni prolungate ex vivo al DMSO, a temperature comprese fra 22 a 37 C, possono, tuttavia, risultare nocive per le CPE. Per limitare lesposizione al DMSO di cellule scongelate, molti centri scongelano rapidamente le sacche al letto del ricevente. Alcuni centri sistemano, prima dello scongelamento, le sacche contenenti il prodotto in sacche aggiuntive, altre le immergono completamente (salvo le parti con le vie di accesso) in bagnomaria di acqua o di fisiologica sterili, a 37-40 C152. La sacca viene massaggiata delicatamente, sino a che tutti gli aggregati non si siano disciolti. Le cellule vengono, poi, infuse (in genere, al ritmo di 10-15 mL al minuto). Per evitare laggregarsi delle cellule, le unit possono anche essere lavate e risospese in laboratorio, prima
Trasporto e spedizione
In alcuni casi, un componente ematopoietico deve essere trasportato da un centro a un altro. Il prodotto deve essere chiaramente identificato, quando viene rimosso dalle giacenze per essere spedito. In ogni caso, dovrebbero essere prese precauzioni al fine di proteggere il componente da trattamenti brutali, da temperature fuori scala, da controlli con raggi X, da rotture o da perdite. Il contenitore usato per la spedizione deve essere sottoposto a controlli di qualit, per essere sicuri che in grado di mantenere la temperatura richiesta durante tutto il viaggio. In caso di componenti crioconservati, consigliabile
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dellinfusione152. Gli effetti collaterali indotti dallinfusione possono essere: nausea, diarrea, rossore, bradicardia, ipertensione, dolore addominale. In linea generale, questi effetti collaterali giustificano il rallentamento, ma non linterruzione, dellinfusione, sino a quando la sintomatologia non cessata. Si raccomanda di non superare, per ogni somministrazione, il limite di 1 grammo di DMSO per kg di peso del ricevente, cos che questi possa tollerare sia il DMSO che gli effetti indotti dal volume dellinfusione. In carenza di unadeguata premedicazione con antistaminici, possono intervenire improvvise e gravi ipotensioni. Il paziente dovrebbe ricevere liquidi e trattamenti che assicurino che le urine siano alcalinizzate. Questo facilita lescrezione dellemoglobina, che deriva dalla lisi eritrocitaria intervenuta durante il congelamento, e riduce il rischio di complicazioni renali. Se il volume totale da infondere supera i 10 mL per kg di peso corporeo del ricevente, molti centri suddividono il volume in due infusioni, da eseguirsi una al mattino e una al pomeriggio o in due giorni consecutivi. meglio raccogliere i campioni per il laboratorio dalla sacca scongelata da infondere piuttosto che congelare singoli campioni individuali, dato che i campioni dalla sacca sono identici al prodotto infuso163.
forniscono i valori in modo pi rapido e pi accurato. Tuttavia, gli aggregati piastrinici presenti nei campioni di PBSC o particelle di grasso presenti nei campioni di CPEm possono aumentare o diminuire i conteggi135,165. In questi casi, preferibile ricorre alle conte manuali. importante che la conta delle cellule non sia sovrastimata, perch ci pu determinare una valutazione non precisa dei tempi di attecchimento o il fallimento del trapianto. Dati sullattecchimento Lattecchimento di neutrofili, piastrine e globuli rossi , fondamentalmente, ci che determina la qualit del trapianto. FACT 49 e AABB 48(p41) richiedono, per concedere laccreditamento, il monitoraggio e la documentazione dei giorni necessari allattecchimento dei neutrofili e delle piastrine. Individuazione delle cellule neoplastiche Sono state sviluppate tecniche per individuare le cellule tumorali nei prodotti sospettati di contaminazione neoplastica e per valutare le unit purificate. La maggior parte di queste metodiche usa anticorpi monoclonali, che si legano, specificamente, agli antigeni tumorali. La loro individuazione e la loro quantificazione possono essere fatte con citometria a flusso, con immunofluorescenza o con colorazioni immunoistochimiche. La sensibilit varia dallo 0,1% allo 0,0004% di cellule esaminate166. Studi preliminari indicano che la presenza di cellule neoplastiche pu associarsi a una ridotta sopravvivenza libera da malattia167.
Valutazione e controllo di qualit dei prodotti ematopoietici

Conta cellulare Ogni prodotto ematopoietico va analizzato per determinare la concentrazione di tutte le cellule e quella delle cellule mononucleate, per calcolare il numero delle cellule per kg del ricevente o la dose cellulare di ciascun prodotto48(p55),49. Questi conteggi, insieme con altri test, determinano il numero di raccolte necessarie per conseguire lattecchimento 135. Sono, inoltre, utilizzati per calcolare le percentuali del recupero, fornendo indirettamente un controllo di qualit sulle procedure e sulle apparecchiature usate164. In generale, i contatori cellulari automatici
Normative
Nel 1997 la FDA ha annunciato un nuovo, esauriente approccio per regolamentare i prodotti composti da cellule e da tessuti168. Anche le CPEsc e le PBSC sono state incluse in questo documento. Molte sono le pubblicazioni 47,169-173 sulle politiche, sulle normative e sulle linee guida
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necessarie a realizzare questo approccio. Le regolamentazioni richiedono la registrazione delle aziende e lelenco delle strutture che raccolgono, lavorano e distribuiscono prodotti di terapia tessutale e cellulare. Bench le norme siano simili a quelle relative alla qualificazione dei donatori di sangue, sono da prendere in considerazione differenze appropriate alla specifica fonte dei tessuti. Le attuali norme di buona prassi per i tessuti (cGTP, current Good Tissue Practice) - rinvenibili al Titolo 21 CFR da 1271.145 a 1271.320 - danno specifiche istruzioni tese ad assicurare che le strutture stabiliscano e mantengano un programma di qualit, in grado di documentare che il personale, le procedure, le apparecchiature, le forniture e i reagenti sono stati sistemati e conservati in maniera accettabile e standard. richiesto un controllo delle procedure, che debbono essere scritte e validamente documentate. Si richiede anche che i prodotti siano raccolti, analizzati, etichettati e conservati in modo da tale da preservarne lidentit e prevenirne le contaminazioni, semplici o crociate. Durante le ispezioni della FDA, pu essere necessario dimostrare laderenza alle norme regolamentari. Si richiede ancora che gli eventi sfavorevoli siano riferiti entro 15 giorni dal ricevimento della notizia, qualora levento sia stato grave, secondo la definizione rinvenibile nel Titolo 21 CFR 1271.350. Linsieme di queste norme sottolinea lo sforzo della FDA per assicurare che i prodotti per le terapie tessutali e cellulari siano sicuri per i riceventi.
i problemi relativi ai programmi clinici di trapianto di CPE e ai servizi di laboratorio, sempre relativi a raccolta, lavorazione, conservazione e distribuzione delle CPE. Entrambi gli organismi (AABB e FACT) forniscono, a richiesta, programmi per ispezioni e certificazioni. Tali programmi danno uno sguardo importante, esteriore e imparziale, ai piani organizzativi e a come questultimi possono influenzare lesito clinico nei trapiantati. Come ampliamento delle procedure standard scritte, i rappresentanti dei due organismi (AABB e FACT) hanno cooperato a stendere una circolare dinformazione sullimpiego dei prodotti per la terapia cellulare174, da loro uniformemente sottoscritta. In questa circolare, le due organizzazioni sono daccordo su molti principi, ivi compreso un elenco comune di definizioni per i prodotti di terapia cellulare. Questo accordo ha consentito alla ICCBBA (International Committee on Commonality of Blood Bank Automation, cio Commissione Internazionale delle Comunit delle Banche del Sangue) nordamericana di approvare le caratteristiche delle etichette di identificazione delle CPE.
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Standard
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604
Capitolo 26: Il trapianto di organi e tessuti
Capitolo 26
Il trapianto di organi e tessuti
Nel corso degli ultimi anni, lincidenza delle donazioni e dei trapianti 1-3 di cornea, osso, pelle, valvole cardiache ed altri tessuti, ha superato quella degli organi solidi 4, come il rene, il fegato, il cuore e i polmoni. La Banca del Sangue delle strutture ospedaliere, il
Servizio Trasfusionale, i centri di lavorazione del sangue, ed i Centri Trasfusionali regionali sono le uniche strutture qualificate per fornire il supporto essenziale per il trapianto degli organi e dei tessuti e per essere impiegate come banche dei tessuti (Tabella 26.1)5.
Tabella 26.1 - Adeguate capacit e competenze per istituzioni che svolgono la funzione di banche dei tessuti Supporto comunitario Responsabilit pubblica Istituzioni pubbliche con attivit di informazione di ampia base popolare Reclutamento dei donatori Consulenza legale Supervisione medica Selezione del donatore Esami sul donatore comprendenti i test virologici automatizzati per prevenire errori di trascrizione Crioconservazione cellulare Stoccaggio a temperatura controllata e monitorata Conformit alla normativa Infrastrutture per il trasporto Relazioni finanziarie con gli ospedali Controllo computerizzato degli inventari Tracciabilit delle registrazioni Gestione logistica Indagini relative a reazioni avverse Accurata revisione delle pratiche mediche, scientifiche ed operative Compatibilit dei riceventi Gestione del bilancio tra idoneit e sicurezza del prodotto Reputazione per laffidabilit del servizio Impegno per la ricerca e lo sviluppo Operativit per 24 ore al giorno, 7 giorni alla settimana
Da Warwick et al.5, riproduzione autorizzara
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una prassi comune per le Banche del Sangue ospedaliere fornire il supporto trasfusionale per i riceventi dei trapianti di organi o tessuti, e in alcuni casi di conservare, tenere le registrazioni e rilasciare tessuti destinati a trapianto. Gli Standard AABB per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali6(pp8,14,15,60,79) indicano le procedure per laccettazione, la conservazione, il trasporto e la registrazione dei tessuti destinati al trapianto. Ulteriori indicazioni per la raccolta e la preparazione degli organi e dei tessuti destinati al trapianto sono reperibili nei regolamenti statali e federali, nelle Linee Guida del Servizio di Sanit Pubblica, negli standard e nei manuali tecnici di altre organizzazioni nazionali o locali7-14.
Le malattie trasmissibili con il trapianto e le misure preventive

La maggiore disponibilit di organi e tessuti per il trapianto ha incoraggiato nuovi impieghi clinici e messo in luce non solo la loro efficacia ed utilit, ma anche i problemi correlati, gli effetti indesiderati, e le loro complicazioni. Gli organi ed i tessuti possono trasmettere patologie sostenute da batteri, virus, miceti e prioni dal donatore al ricevente 3,15-26 (Tabella 26.2), ma uno screening accurato e gli esami condotti sui donatori, unitamente alle procedure di disinfezione e sterilizzazione per specifici tessuti, possono significativamente ridurre questo rischio.
Tabella 26.2 - Malattie infettive per le quali stata riportata trasmissione con gli allotrapianti di organi e tessuti15-26 Trapianto Osso Malattia infettiva/Agente patogeno HIV-1 Epatite C Epatite di tipo non specificato Batteri Tubercolosi Epatite B Malattia di Creutzfeldt-Jakob Rabbia Citomegalovirus (?) Batteri Funghi Malattia di Creutzfeldt-Jakob Epatite B Tubercolosi Batteri Citomegalovirus (?) HIV-1 (?) Malattia di Creutzfeldt-Jakob Batteri
(segue)
Cornea
Dura madre Valvole cardiache Cute
Pericardio
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Trapianto Organi solidi (quali rene, fegato, cuore)
Malattia infettiva/Agente patogeno HIV-1 Epatite B Epatite C Citomegalovirus Virus di Epstein-Barr Parvovirus Toxoplasmosi Malattia di Chagas Malaria Batteri Tubercolosi HHV-8 Strongiloidosi Sarcoidosi West Nile Virus Rabbia Coriomeningite linfocitica Batteri Epatite B Epatite C (?) Gonorrea Sifilide (?) HIV-1 HTLV-I (?) Virus del papilloma umano (?) Trichomonas vaginalis Clamydia trachomatis Citomegalovirus (?) Ureaplasma urealyticum HSV-2 Mycoplasma hominis Streptococco di gruppo B 1. Revisione della storia sanitaria del donatore potenziale attraverso interviste con i parenti stretti e/o altre persone di riferimento, preferibilmente con le persone che si sono occupate delle cure sanitarie, e revisione della documentazione sanitaria. La revisione comprende una valutazione (peraltro non necessariamente ostativa per le voci elencate con *) del potenziale donatore per: a. anamnesi relativa a infezioni*, tumori
Isole pancreatiche Sperma
La riduzione del rischio per i tessuti La valutazione dellidoneit del potenziale donatore cruciale per la sicurezza del tessuto trapiantato. Nella lista successiva sono elencate le domande, le ispezioni e gli esami utilizzati per assicurare che il tessuto proveniente da un potenziale donatore comporti un basso rischio nella trasmissione di malattie. Alcune ulteriori misure precauzionali vengono applicate per i tessuti riproduttivi dei donatori10,11.
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3.
4.
5.
maligni*, o patologie neurodegenerative; b. anamnesi relativa a patologie autoimmuni*; c. anamnesi relativa allesposizione a ormoni derivati dalla ghiandola pituitaria oppure al trapianto della dura madre. Valutazione di evidenze di comportamenti personali ad alto rischio (esclusione per ognuno dei criteri di esclusione del donatore compresi nelle voci 9c, 9e e 10 degli Standard 5.4.1A degli Standard per le Banche del sangue e dei Servizi Trasfusionali6(pp62-65)). Esami sierologici sui campioni ematici disponibili10 (vedi di seguito per maggiori dettagli): a. antigene di superficie per lepatite B (HBsAg); b. anticorpi per i virus 1 e 2 della immunodeficienza umana (anti-HIV-1 e 2); c. anticorpi per i virus dellepatite C (anti-HCV); d. anticorpi per i virus linfotropici di tipo I e II per i linfociti T umani (anti-HTLV-I e -II); e. test sierologici per la sifilide. Esame fisico per rilevare: a. evidenze dellassunzione di droghe per via endovenosa; b. ittero; c. segni esterni di infezione; d. segni di AIDS. Valutazione dei risultati dellesame autoptico, se stato eseguito.
Il consenso e lidoneit del donatore Il consenso scritto per luso clinico di ogni tessuto o organo deve essere ottenuto da un donatore vivente o da un parente stretto di un donatore deceduto (formalmente indicato come donatore cadavere), tranne quando le cornee sono ottenute per consenso stabilito dalla legge. Esistono leggi statali, federali e regolamenti che obbligano gli ospedali a: 1) avere procedure per fornire le informazioni alle organizzazioni per la raccolta degli organi e alle competenti banche dei tessuti, comprese le banche degli occhi, quando imminente, o si verificato, il decesso di un paziente, e 2) identificare personale qualificato per proporre ai familiari la donazione di organi o
tessuti. Devono essere osservate tutte le leggi federali, statali e locali relative al consenso alla donazione da parte del parente pi stretto del deceduto. Quando il parente pi stretto firma il consenso per la donazione dei tessuti, lui o lei, deve specificare per quali tessuti si acconsente alla donazione e se il consenso comprende limpiego del tessuto a scopo di ricerca o per altri usi specifici. I donatori viventi ed i familiari dei donatori deceduti non sono responsabili per i costi relativi al prelievo e per la processazione dei tessuti e degli organi donati. I donatori non devono ricevere alcun compenso per la donazione, tuttavia i donatori di tessuti riproduttivi sono spesso compensati per il loro tempo, i rischi e gli inconvenienti, e le famiglie dei donatori deceduti possono ricevere degli incentivi, come per esempio un contributo per le spese funerarie dei donatori. I tessuti possono essere prelevati fino a 24 ore dal decesso se il corpo viene refrigerato entro 12 ore dalla morte, oppure possono essere prelevati fino a 15 ore dal decesso se il corpo non stato refrigerato. Gli organi devono essere prelevati da un donatore per il quale stato effettuato laccertamento della morte cerebrale e la cui circolazione corporea stata mantenuta artificialmente (vedi Tabella 26.3). Gli occhi, come fonte di cornee per allotrapianto devono essere rimossi al pi presto dopo la morte per assicurare la vitalit delle cellule endoteliali. Ogni prevedibile decesso di un potenziale donatore deve essere valutato per i criteri di idoneit per lo/gli specifico/i tessuto/i ed organo/i da prelevare; per esempio, un neonato deceduto non idoneo per la donazione dellosso a causa della sua struttura scheletrica cartilaginea, ma pu essere un candidato per la donazione delle valvole cardiache. Bench in specifici casi possano essere fatte eccezioni, lidoneit medica per un donatore viene stabilita sulla base dellassenza di infezioni o patologie neoplastiche come rilevabile dalla storia clinica, dalla visita medica, dagli esami di laboratorio e dallautopsia, se viene eseguita. La donazione di organi e di tessuti non deve di norma essere causa di ritardo nelle esequie o impedire la visione del corpo da parte dei familiari.
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Tabella 26.3 - Tipologia dei donatori che hanno donato organi e tessuti per trapianto Donatore vivente Donatore deceduto (morte cerebrale) Donatore deceduto (morte cerebrale e cardiorespiratoria) Osso Cartilagine Cornea Dura madre Fascia lata Valvola cardiaca Midollo osseo Pericardio Cute Tendine Tessuti vascolari
Membrana amniotica Osso Tessuti fetali (la donatrice la madre) Prepuzio Rene Fegato Polmone Midollo osseo Latte Pancreas Paratiroidi (spesso autologo) Cellule progenitrici dal sangue periferico Tessuti riproduttivi Sangue del cordone ombelicale Vene ombelicali
Cuore Rene Fegato Polmone Pancreas (con o senza piccolo intestino)
Gli esami sierologici Le leggi federali richiedono che i donatori di tessuti siano esaminati per lHBsAg, anti-HIV-1/ 2, anti-HCV e per un test di screening per la sifilide, con test certificati dalla Food and Drug Administration (FDA). Gli esami devono essere eseguiti in un laboratorio che certificato per le disposizioni del Clinical Laboratory Improvement Amendments del 19887,8 o che sia in possesso di requisiti equivalenti a quelli stabiliti dai Center for Medicare and Medicaid Services . Se disponibile, deve essere utilizzato un test di screening validato per lapplicazione in campioni da cadavere27. Le organizzazioni nazionali per la selezione degli standard, come lAmerican Association of Tissue Banks (AATB)10, lEye Bank Association of America (EBAA)12 e la United Network for Organ Sharing (UNOS)13, possono richiedere ulteriori accertamenti per i marker di malattie trasmissibili.
Anche la American Society for Reproductive Medicine ha emesso raccomandazioni per la donazione di gameti ed embrioni11. Per i donatori anonimi di sperma, gli esami per lanti-HIV-1/2 e lanti-HCV devono essere ripetuti con nuovi campioni 6 mesi dopo la donazione, e devono risultare negativi prima che le cellule seminali possano essere rilasciate per lutilizzo9,10. Su questi campioni devono inoltre essere eseguiti i test per lanti-HBc, con lo scopo di escludere uninfezione da epatite B nel periodo della donazione. La determinazione di gruppo ABO viene richiesta per il trapianto degli organi. La tipizzazione HLA essenziale per il trapianto di organi e di progenitori emopoietici13, ma non per i tessuti28. Altri esami, come laccertamento per gli anticorpi specifici per il citomegalovirus (antiCMV), vengono di solito eseguiti sul donatore di organi. Per i donatori cadaveri, gli esami sono eseguiti in condizioni ottimali su campioni di sangue prelevati prima della somministrazione di
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trasfusioni o infusioni di liquidi; questi pazienti possono aver ricevuto infusioni massive di liquidi per il ripristino della volemia poco prima della morte, e la conseguente diluizione del plasma pu determinare risultati falsamente negativi19,20. Se non disponibile da altre fonti il siero del donatore prelevato prima della somministrazione di trasfusioni o linfusione endovenosa di fluidi, un campione pre-trasfusionale spesso reperibile presso le Banche del Sangue, perch queste conservano i prelievi inviati per le prove di compatibilit per almeno 7 giorni. Per i campioni ematici ottenuti dopo trasfusioni o infusione di liquidi, sono utilizzabili algoritmi per determinare lattendibilit dei prelievi disponibili 7,8. Per esempio, il prelievo non attendibile per esaminare i marker delle patologie infettive se sussiste una delle seguenti situazioni: 1. il volume totale dei colloidi trasfusi nelle 48 ore (plasma, destrano, piastrine o hetastarch), sommato al volume totale dei cristalloidi che sono stati infusi nellora precedente al prelievo di sangue disponibile, supera il volume totale del plasma del paziente; 2. la somma del sangue trasfuso (globuli rossi, sangue intero) e dei colloidi trasfusi nelle 48 ore, pi il volume totale dei cristalloidi infusi nellora precedente al prelievo, supera il volume totale del sangue del paziente. Gli esami dei campioni di sangue da cadavere possono essere complicati dallemolisi che si verifica dopo il decesso, potendo determinare risultati ingannevoli (per esempio falsi risultati positivi per HBsAg)15,29. Molti esami validati per limpiego in campioni ematici del donatore non sono validati per limpiego in campioni ematici prelevati dal cadavere, mentre sono disponibili test validati per lesame dei campioni post mortem per lanti-HIV-1/2, HBsAg e per gli acidi nucleici HIV-1/HCV27.
Le banche dellosso
Con leccezione delle cellule ematiche, quello che viene trapiantato con maggiore frequenza il tessuto1 osseo. Quando si rende necessario un
trapianto di tessuto osseo, il materiale considerato pi idoneo per il trapianto generalmente rappresentato da un frammento osseo fresco autologo che viene di solito rimosso dalla cresta iliaca durante lintervento chirurgico. Come per il sangue, limpiego di materiale osseo autologo per il trapianto non esente da rischi, perch si possono verificare malattie e complicazioni infettive. Per alcune procedure chirurgiche, la quantit di materiale osseo che si rende necessario per il trapianto pu rendere impraticabile luso dellosso di origine autologa. Per questi pazienti, e per quelli nei quali il prolungamento del tempo necessario per lintervento chirurgico, limportante sanguinamento e le possibili complicanze del prelievo autologo vengono considerati svantaggiosi, si procede con lallotrapianto. Il trapianto di osso di origine allogenica ha trovato una diffusa applicazione clinica come supporto acetabolare e femore-prossimale, nonch nella revisione di protesi artificiali dellanca non riuscite, come riempimento di cisti ossee benigne, nellartrodesi vertebrale finalizzata al consolidamento di una patologia discale, nella correzione di una scoliosi, nella ricostruzione di difetti del blocco maxillo-facciale e nella correzione di fratture mal consolidate (healed). La polvere di osso demineralizzato viene comunemente utilizzata nella chirurgia periodontale per la ricostruzione dellosso alveolare delle tasche periodontali. Attualmente il chirurgo ha accesso ad unampia scelta di preparati ossei per i trapianti: osso trabecolare o corticale, congelato-liofilizzato o congelato con o senza un pretrattamento con agenti sterilizzanti. Le comuni preparazioni del materiale osseo comprendono cubetti, frammenti o scaglie di osso trabecolare congelati o congelati-liofilizzati, supporti di osso corticale, blocchi di osso cortico-trabecolare e stecche. Losso pu essere conservato congelato oppure, se viene congelato e liofilizzato con un basso contenuto di umidit (6% o meno con lanalisi gravimetrica, oppure 8% con spettrometria nucleare a risonanza magnetica), pu essere mantenuto a temperatura ambiente per 5 anni (Tabella 26.4). Losso congelato viene processato
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in asepsi, in alcuni casi senza un passaggio di inattivazione microbica. Questi tessuti sono gravati da un pi elevato rischio di contaminazione batterica. Alcune segnalazioni di complicanze infettive, compreso un caso con esito letale, collegate ad allotrapianti muscolo-scheletrici processati asetticamente, sottolineano limportanza di effettuare, al momento del prelievo, controlli microbiologici sui tessuti che vengono donati24. I tessuti liofilizzati sono sottoposti ad unestensiva ed approfondita lavorazione finalizzata alla rimozione del sangue residuo e del midollo osseo e possono essere esposti allalcool. In questo modo, il rischio di trasmissione di malattie viene ridotto. La maggior parte degli allotrapianti ossei negli Stati Uniti rappresentata da materiali congelati-liofilizzati per semplificarne la conservazione. Alcuni innesti surgelati, o congelati-liofilizzati, possono essere trattati con le radiazioni gamma, oppure con ossido di etilene, per ridurre il rischio di trasmissione di malattie infettive. Si ritiene che le ossa demineralizzate possano rendere pi facilmente disponibili le proprie proteine ed i fattori di crescita, incrementando in questo modo la capacit di accelerare la guarigione e la formazione di osso. Limpianto di alloinnesti ossei surgelati ha stimolato in alcuni riceventi la produzione di alloanticorpi specifici per certi antigeni dei gruppi sanguigni che sono stati successivamente coinvolti in casi di malattia emolitica del neonato. Gli innesti ossei surgelati, ma non processati, contengono una quantit di globuli rossi sufficiente per stimolare la produzione di anticorpi per gli antigeni del sistema Rh ed altri. Quando opportuno, il rischio dellalloimmunizzazione eritrocitaria pu essere evitato utilizzando gli alloinnesti surgelati, dopo unadeguata preparazione, o tessuto osseo congelatoliofilizzato, essendo entrambi i preparati privi di cellule ematiche e del midollo. Con questi tipi di innesti, non necessaria la compatibilit antigenica eritrocitaria dei donatori e dei riceventi. Quando si utilizza un innesto osseo surgelato, ma non processato, per pazienti Rh negative in et fertile, opportuno utilizzare innesti provenienti
da un donatore Rh negativo per prevenire lalloimmunizzazione oppure somministrare una immunoprofilassi con immunoglobuline anti-RhD. Non vi evidenza che lincompatibilit ABO o Rh tra linnesto osseo del donatore ed il ricevente costituisca un ostacolo per il successo nellattecchimento del trapianto osseo30.
Le banche della cute

Un allotrapianto di cute umana costituisce la migliore copertura per le ustioni profonde, se non disponibile una sufficiente quantit di cute autologa per un autotrapianto. Un allotrapianto di cute fornisce una copertura temporanea dellustione: accelera la riepitelizzazione; agisce come una barriera metabolica contro la perdita dacqua, elettroliti, proteine e calore, fornendo una barriera fisica contro le infezioni batteriche. Lallotrapianto di cute viene periodicamente sostituito fino a quando non si rende disponibile una quantit di cute autologa sufficiente per un autotrapianto. Un allotrapianto di cute pu anche essere utilizzato per autoinnesti di cute nel sito di prelievo del donatore di un lembo vascolarizzato (per un transfer), per aree decorticate traumaticamente, o per le aree cutanee inguaribili perch sottoposte a lesioni croniche, come le piaghe da decubito. Dopo la preparazione, la donazione della cute richiede la rimozione di uno strato approssimativamente dello spessore di 0,38 mm (0,015 pollici). Dopo il prelievo la cute pu essere conservata per non oltre 14 giorni ad una temperatura compresa tra 1C e 10C. Per la sua conservazione a bassa temperatura, vengono utilizzati medium nutrienti standard utilizzati per le colture tissutali, con laggiunta di antibiotici. La cute pu essere congelata subito dopo il prelievo, di solito con una soluzione dal 10% al 15% di glicerolo, sebbene il dimetilsulfossido (DMSO) sia unaccettabile alternativa 31. La cute viene frequentemente criopreservata su garza a trama sottile in sacche piane per criopreservazione. I danni da congelamento vengono minimizzati con una velocit di congelamento controllata di circa
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Tabella 26.4 - Condizioni di conservazioni raccomandate e tempi di scadenza per i tessuti e gli organi umani Condizione di conservazione Tessuto Osso Tempi di scadenza
40 C 20 C 1-10 C Azoto liquido Liofilizzato, a temperatura ambiente 40 C Liofilizzato, a temperatura ambiente 40 C 40 C 1-10 C Immersa in azoto liquido 1-10 C 40 C Liofilizzata, a temperatura ambiente 2-6 C Immerse in azoto liquido In vapori di azoto liquido Immerse in azoto liquido In vapori di azoto liquido 100 C Liofilizzata, a temperatura ambiente
5 anni* 6 mesi 5 giorni Non definita 5 anni* 5 anni* 5 anni* 5 anni* 5 anni* 5 giorni Non definita 14 giorni Non definita Non definita 14 giorni Non definita Non definita Non definita Non definita Non definita Non definita
Tendine Fascia lata
Cartilagine articolare
Cute
Cornea Cellule emopoietiche Cellule seminali Valvole cardiache, vene, arterie Dura madre
Organo Rene Fegato Cuore Cuore-polmoni Pancreas
Refrigerato Refrigerato Refrigerato Refrigerato Refrigerato
48-72 ore 8-24 ore 3-5 ore 3-5 ore 12-24 ore
*A meno che sia stato validato dal preparatore un periodo di scadenza pi lungo.
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1 grado al minuto, oppure utilizzando per il congelamento un metodo validato per ottenere labbassamento della temperatura, seguito dalla conservazione in azoto liquido o in congelatore meccanico a temperature inferiori ai 40C. Alternativamente, la cute posta su piatti di allumino, allinterno di scatole termicamente isolate, pu essere posta direttamente in un congelatore meccanico a 40C. Questa semplice procedura consente anche una lenta e prevedibile velocit di congelamento mantenendo la sopravvivenza cellulare. La procedura ottimale per il congelamento ed il massimo periodo di conservazione mantenendo la vitalit e lintegrit strutturale allo stato congelato non sono ancora stati stabiliti. La cute pu essere trasportata in sala operatoria in ghiaccio, se stata conservata a 4C, o in ghiaccio secco se stata crioconservata. Una variante sostitutiva di cute bioingegnerizzata, come gli alloinnesti o gli autoinnesti di cheratociti in coltura, disponibile per il trattamento di ferite acute o croniche. I cheratociti estratti dal prepuzio possono essere seminati su piattaforme biodegradabili per formare prodotti tissutali bioingegnerizzati poi utilizzati per la guarigione delle ferite o come sostituto della cute da cadavere per le ustioni32.
trapianti delle valvole cardiache umane stato rallentato a causa delle difficolt tecniche dellimpianto valvolare, che richiede unappropriata dimensione della valvola da impiantare non sempre facilmente reperibile. Per disporre di valvole per i trapianti, il cuore viene prelevato in asepsi in una camera operatoria, una sala autoptica o un obitorio. Successivamente, nella banca dei tessuti, le valvole aortica e polmonare vengono isolate, congelate con DMSO e conservate in azoto liquido. Confrontandole con le valvole conservate a 5C in un medium di coltura cellulare addizionato con antibiotici, le valvole cardiache crioconservate presentano una maggiore vitalit cellulare, una ridotta frequenza di degenerazione valvolare, di rotture o perforazioni del foglietto valvolare ed una ridotta mortalit al trapianto correlata alle valvole cardiache33.
Le registrazioni dei tessuti conservati per gli allotrapianti

In due casi in cui si verificata la trasmissione dellHIV e dellHCV (attraverso allotrapianti di osso non processato e congelato o di organi e di tendine) provenienti rispettivamente da due donatori cadavere ed assegnati a riceventi multipli22,23, le successive indagini evidenziarono che molti ospedali prevedono registrazioni insufficienti al fine di identificare i riceventi dei diversi tessuti provenienti dal medesimo donatore infetto. Gli standard volontari delle associazioni professionali nazionali ed i regolamenti governativi richiedono che le banche dei tessuti siano in possesso di un sistema di archiviazione delle registrazioni che consenta di identificare il donatore e permetta la tracciabilit di ogni tessuto proveniente dal donatore (oppure della fonte originale fornitrice) fino al ricevente cui assegnato6(pp12,47,79)10,14,34. Le registrazioni devono evidenziare facilmente la struttura di origine, il numero di identificazione del donatore o del lotto, le temperature di conservazione e la validazione finale di ogni
Le valvole cardiache
I trapianti di valvole cardiache permettono una funzionalit a lungo termine delle valvole sostituite che superiore a quella delle valvole meccaniche o di origine porcina. I riceventi dei trapianti di valvole cardiache umane non necessitano della terapia anticoagulante e la frequenza di episodi tromboembolici bassa. Questi trapianti solo raramente possono trasmettere infezioni batteriche o micotiche. Essi costituiscono il migliore trapianto possibile per i bambini, evitando una terapia anticoagulante a lungo termine; per le pazienti in gravidanza, per evitare i rischi teratogeni degli anticoagulanti, e per i pazienti che presentano infezioni alla radice dellaorta. Malgrado i vantaggi, un ampio utilizzo dei
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tessuto. Queste registrazioni devono essere conservate in qualunque caso per almeno 10 anni dopo la data di distribuzione, trapianto, validazione o scadenza. Le registrazioni relative allidoneit del donatore di dura madre devono essere conservate indefinitamente. Gli ospedali devono inoltre prevedere registrazioni che identificano i riceventi di tessuti trapiantati provenienti da uno specifico donatore o da uno specifico lotto. Gli ospedali devono disporre localmente di procedure idonee in grado di riconoscere gli esiti avversi relativi alluso dei tessuti, e devono riferire queste informazioni alla banca dei tessuti che li ha forniti.
Regolamentazione FDA sui tessuti

La FDA regolamenta il prelievo dei tessuti destinati al trapianto7,8. Vi sono requisiti relativi agli esami da eseguire per le malattie trasmissibili, per lo screening dei donatori e per il mantenimento delle registrazioni. Unistituzione per il prelievo dei tessuti deve avere e deve seguire procedure scritte e certificate per la prevenzione delle contaminazioni e della contaminazione crociata che pu verificarsi durante la lavorazione7,35. La FDA ha pubblicato i regolamenti per accertare lidoneit per la donazione di cellule umane, dei tessuti e dei prodotti derivati dalle cellule e dai tessuti (HCT/Ps)36 che sono entrati in vigore il 25 maggio 2005. I regolamenti federali richiedono inoltre che tutte le strutture che prelevano, processano, conservano o distribuiscono HCT/Ps, selezionano o esaminano il donatore ne forniscano registrazione allagenzia elencando i prodotti ottenuti mediante il modulo FDA 3356 spedito per posta o via fax37. Le informazioni possono essere inviate anche in forma elettronica nel sito web della FDA www.fda.gov/cber/tissue/tisreg.htm. I prodotti che non sono sottoposti a questi regolamenti comprendono i tessuti di origine xenogenica, gli organi vascolarizzati, i prodotti ematici trasfondibili, i prodotti per la proliferazione delle cellule e dei tessuti e infine i prodotti che
sono secreti o estratti da cellule o tessuti. Il midollo osseo minimamente manipolato, come un midollo sottoposto alla separazione cellulare, le cui caratteristiche principali non sono state modificate dal processo, non sottoposto a questi regolamenti. Gli esami da eseguire per laccertamento delle malattie trasmissibili con i tessuti allogenici, sono prescritti dalla regolamentazione federale, tranne che per i tessuti riproduttivi provenienti dal partner sessuale allinterno della coppia. Sono state messe a punto le regole per le buone pratiche di orientamento relative ad unappropriata gestione, conservazione e preparazione dei tessuti34. Fino a quando lesauriente struttura regolamentare inerente alle cellule umane, ai tessuti ed ai prodotti di derivazione cellulare e tissutale operativa, comprendendo i requisiti per lidoneit del donatore, i regolamenti per le buone pratiche relative a tessuti, appropriati approvvigionamenti attuativi, la dura madre umana e le valvole cardiache umane rimarranno soggette ai requisiti dei servizi medici secondo il Federal Food, Drug, and Cosmetic Act38. I regolamenti federali delle banche dei tessuti, che precedentemente erano sottoposti alla supervisione dellFDA Center for Biologics Research and Review, Office of Blood Research and Review, sono ora sotto la responsabilit del Center for Biologics Evaluation and Research, Office of Cellular, Tissue, and Gene Therapies Division of Human Tissues.
Limportanza della compatibilit ABO

Gli antigeni ABO sono importanti nella pratica trapiantologica perch sono forti antigeni di istocompatibilit ben espressi anche sugli endoteli vascolari. Unincompatibilit ABO maggiore pu causare un rapido rigetto del trapianto determinata dal danneggiamento endoteliale dovuto agli alloanticorpi ABO con conseguenti estese trombosi allinterno dellorgano trapiantato. La compatibilit ABO quindi importante per il successo dei trapianti di organi vascolarizzati (per esempio, rene39, cuore, fegato e pancreas), ma
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la compatibilit ABO non importante nei trapianti dei tessuti (per esempio, fascia, osso, valvole cardiache, cute e cornea)40. La definizione di un trapianto ABO compatibile la stessa che viene utilizzata per la trasfusione dei globuli rossi. Un donatore di tessuti, od organi, di gruppo O un donatore universale i cui espianti possono essere trapiantati in riceventi di qualunque gruppo sanguigno ABO. La casistica pubblicata riporta solo rari successi nel trapianto di organi che presentano unincompatibilit maggiore nel sistema ABO, ma con uno scarso numero di casi esaminati41. In alcuni casi, un donatore di reni di gruppo A2 pu essere trapiantato con successo in un ricevente di gruppo O, con una sopravvivenza del trapianto che risulta analoga a quella dellespianto fornito da un donatore di reni di gruppo O42. I trapianti ABO incompatibili si sono verificati accidentalmente, spesso con esiti fatali, a causa di errori nelle registrazioni o nelletichettatura dellespianto. stato valutato che i trapianti di cuore o di rene inconsapevolmente ABO incompatibili si verificano con una frequenza di 1 su 1.000 43. Ci sottolinea limportanza di un controllo ABO finale del sangue del donatore e del ricevente nella predisposizione del trapianto per ridurre questo rischio.
dellimpianto renale attraverso meccanismi, tuttora non del tutto chiariti45,46, che indurrebbero una tolleranza. Tuttavia, con la disponibilit delle ciclosporine e di altri agenti immunosoppressivi, linteresse per questo tipo di approccio diminuito47. Nel caso venga intrapresa la pratica - pur controversa - di trasfondere sangue per indurre limmunotolleranza nei pazienti prima del trapianto, dovrebbero essere utilizzati dei concentrati eritrocitari che non siano leucodepleti48,49. Lintroduzione delleritropoietina ha tuttavia ridotto la necessit trasfusionale di concentrati eritrocitari nei pazienti in attesa del trapianto renale.
Il trapianto di fegato
Un programma di trapianto di fegato rappresenta una delle pi grosse sfide per i Centri Donatori e per i Servizi Trasfusionali ospedalieri, richiedendo il massimo impegno in termini di preparazione, supporto e rapidit di risposta. La perdita massiva e lipocoagulabilit del sangue determinata dalla preesistente patologia epatica e/o la durata della fase anepatica durante lintervento chirurgico, creano problemi complessi per il servizio trasfusionale. Il fegato lorgano principale per la sintesi dei fattori della coagulazione ed altre proteine essenziali, ed uno dei principali regolatori dellequilibrio acidobase, degli elettroliti e dellomeostasi del glucosio. Le tre fasi chirurgiche della procedura per il trapianto (epatectomia del ricevente, intervallo anepatico e ricostruzione delle vie biliari) alterano seriamente tutte queste funzioni. Il supporto necessario Per ottenere un completo successo in un programma di trapianto di fegato, necessario fornire il massimo impegno nel supporto dellintervento. Lesito favorevole del trapianto necessita della collaborazione e dellefficace interazione allinterno dellamministrazione ospedaliera, la sala operatoria e lunit di terapia intensiva, nonch unadeguata terapia
Il ruolo della trasfusione nel trapianto di rene

Nel 1973, Opelz et al.44 rilevarono una riduzione della sopravvivenza del rene trapiantato quando lo staff operativo che eseguiva le sedute di emodialisi tendeva ad evitare il riempimento del set da dialisi con il sangue e a limitare le trasfusioni di sangue prima del trapianto. Lassociazione tra la diminuzione delle trasfusioni e la riduzione della sopravvivenza del trapianto indusse i centri di trapianto a dare inizio, dalla met degli anni 70, a protocolli che prevedessero deliberatamente le trasfusioni di sangue prima del trapianto. Studi successivi hanno sostenuto lipotesi che le trasfusioni di sangue prima del trapianto incrementino la sopravvivenza
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respiratoria, un servizio di radiologia e gastroenterologia, il laboratorio per il monitoraggio della coagulazione, il Servizio Trasfusionale e il Centro Regionale dei donatori di organi. Limpegno istituzionale deve essere esteso per 24 ore al giorno, 365 giorni allanno, perch pu esserci un intervallo di tempo non superiore a poche ore dalla notizia della disponibilit dellorgano per eseguire un trapianto di fegato. La garanzia della disponibilit dello staff operativo della Banca del Sangue in un breve intervallo di tempo essenziale per ottemperare alle necessit trasfusionali. In molti casi, le procedure chirurgiche iniziano durante la notte o durante i fine settimana per la disponibilit dellorgano del donatore, allo scopo di evitare di compromettere il programma operatorio gi previsto. Le procedure chirurgiche occupano uno spazio di tempo variabile da 6 a 8 ore, ma possono richiedere anche 24 ore, con un utilizzo massivo di sangue e diverse quipe chirurgiche in avvicendamento. La Banca del Sangue deve essere informata al pi presto della disponibilit dellorgano per il trapianto e della decisione di procedere al trapianto. Alla Banca del Sangue deve essere fornito un cospicuo prelievo di sangue del ricevente per le prove di compatibilit, ma vi pu essere pi di un paziente in attesa del trapianto di fegato ed i chirurghi possono essere indecisi sullo specifico ricevente da sottoporre allintervento. Per questo motivo, la Banca del Sangue pu essere costretta ad eseguire numerose prove di compatibilit pre-trasfusionali per pi pazienti che possono avere diversi gruppi sanguigni ABO o differenti fenotipi Rh. I programmi di intervento per il trapianto di fegato possono utilizzare inizialmente centinaia di unit di sangue ed emocomponenti per il paziente. Bench limpiego delle unit di sangue sia gradualmente diminuito nellarco degli anni, le procedure per il trapianto di fegato utilizzano frequentemente un volume di emocomponenti uguale allintera massa circolatoria del paziente, e qualche volta pari a diversi volumi della massa circolatoria. In questi casi le procedure per il recupero intra-operatorio del sangue giocano
spesso un ruolo fondamentale nella conservazione della massa eritrocitaria. Considerazioni relative allABO e Rh Tranne che nelle emergenze, il fegato del donatore deve essere ABO compatibile con il ricevente. Vengono solitamente utilizzati dei globuli rossi e del plasma fresco congelato (PFC) ABO identico per il supporto trasfusionale dei riceventi di gruppo O ed A. I pazienti di gruppo B, che necessitano di grandi quantit di emazie, possono essere supportati con eritrociti di gruppo O. I riceventi di gruppo AB che richiedano trasfusioni massive sono spesso supportati con globuli rossi di gruppo A, per conservare scorte di gruppo O utilizzabili per altri pazienti. Se il supporto di plasma fresco congelato di gruppo AB insufficiente, corretto luso precoce di globuli rossi di gruppo A, seguito dallutilizzo del plasma fresco congelato di gruppo A. La gestione delle trasfusioni massive prevede prima la trasfusione di eritrociti con un gruppo sanguigno ABO compatibile, anche se non identico, poi la trasfusione di plasma compatibile con il gruppo ABO utilizzato, procedendo poi in ordine inverso la riconversione degli emocomponenti (prima il plasma e poi le emazie) per ritornare al gruppo ABO originale del paziente46. Si devono applicare alcune considerazioni particolari per il ricevente di un trapianto di fegato di un gruppo sanguigno ABO compatibile, ma diverso da quello del paziente. Se un paziente di gruppo A riceve un fegato di gruppo O, i linfociti di origine del donatore possono produrre anticorpi ABO che possono causare unemolisi che inizia diversi giorni dopo il trapianto e pu continuare per due settimane ed oltre50. Bench i linfociti passenger possano produrre alloanticorpi in ogni combinazione di trapianto di gruppo ABO compatibile ma non identico, unemolisi eritrocitaria clinicamente significativa stata osservata nella maggior parte dei casi nei riceventi di un trapianto di fegato proveniente da un donatore di gruppo O. Il supporto trasfusionale di un paziente Rh negativo non precedentemente immunizzato per lantigene D non standardizzato46. Poich si
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verificata una gravidanza portata a termine dopo un trapianto di fegato, la maggior parte dei protocolli prevede che sia preferibile fornire unit trasfusionali Rh negative per le pazienti D negative che sono in et potenzialmente fertile, se le richieste di sangue sono prevedibilmente moderate. Nel caso si verifichi una perdita di sangue massiva durante lintervento, se necessario, la paziente potr essere trasfusa massivamente con sangue D positivo nel corso dellintervento chirurgico. Per le pazienti D negative non ancora in menopausa, alcuni protocolli riservano una disponibilit di 10 unit di emazie D negative; se si rendono necessarie pi di 10 unit di sangue, si trasfonder sangue D positivo46. La produzione degli anticorpi anti-D nelle pazienti D negative sottoposte ad un trapianto di fegato che sono state esposte allantigene D, avviene con una frequenza minore rispetto alla frequenza delle alloimmunizzazioni per lantigene D che si verificano in altri pazienti D negativi ugualmente esposti 51. In alcuni programmi, le pazienti D negative in menopausa che non presentano lalloanticorpo anti-D, come i maschi D negativi, vengono trasfuse esclusivamente con sangue D positivo. Gli alloanticorpi contro i globuli rossi I pazienti che devono essere sottoposti a trapianto di fegato, ma presentano alloanticorpi antieritrocitari clinicamente significativi, rappresentano un impegno particolare per la Banca del Sangue. Qualche volta, pu essere resa disponibile una sufficiente quantit di sangue negativo per lantigene prima dellintervento chirurgico. Alcuni protocolli di intervento prevedono un numero limitato di unit negative per lantigene bersaglio dellalloanticorpo da utilizzare allinizio dellintervento chirurgico, quando presente lalloanticorpo, e alla fine della perdita massiva di sangue quando ci si aspetta che le emazie trasfuse permangano nel circolo del ricevente. Lo screening degli alloanticorpi irregolari durante lintervallo della perdita massiva di sangue pu guidare utilmente il momento per limpiego delle unit di sangue antigene positivo nel corso dellintervento chirurgico.
Considerazioni sulla coagulazione Durante lintervento chirurgico, lemodiluizione, il consumo piastrinico, le alterazioni nei meccanismi regolatori dellattivit trombinica e la fibrinolisi alterano gravemente il processo emostatico. La coagulopatia particolarmente severa nella fase anepatica e nello stadio precoce della riperfusione dellorgano. I seguenti test sono estremamente utili: il valore di ematocrito orienta limpiego delle unit trasfusionali delle emazie, dei colloidi e dei cristalloidi; il conteggio piastrinico orienta la trasfusione delle piastrine; il tempo di protrombina ed il tempo parziale di tromboplastina attivata guidano lutilizzo del plasma fresco congelato; la determinazione del fibrinogeno indica luso del crioprecipitato AHF e degli agenti antifibrinolitici46,52,53.
Trapianto di altri organi

Il supporto della Banca del Sangue per il trapianto di cuore molto simile a quello che si verifica nella routine degli altri interventi chirurgici nei quali viene utilizzato un by-pass cardiopolmonare. La Banca del Sangue pu inoltre provvedere allaccertamento del gruppo ABO e supervisionare al momento della consegna di organi ABO compatibili, per la prevenzione del trapianto di organi ABO incompatibili. I trapianti di pancreas hanno al confronto minori necessit trasfusionali, ma un prelievo del ricevente deve comunque essere esaminato di routine per la ricerca di eventuali alloanticorpi antieritrocitari irregolari clinicamente significativi; in alcune strutture, il protocollo prevede la prova di compatibilit per diverse unit di sangue. Supporto trasfusionale per il trapianto di organi La Banca del Sangue fornisce un supporto vitale per i programmi clinici di trapianto degli organi. essenziale una stretta comunicazione con i chirurghi e con gli altri professionisti coinvolti nel programma. Le pratiche trasfusionali nel periodo peri-trapiantologico hanno effetti importantissimi correlati alla probabilit di
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morbilit, mortalit e alla sopravvivenza del trapianto. I potenziali riceventi dei trapianti di organi solidi sono generalmente reperibili ben prima dellattuazione della procedura, cos vi un ampio margine di tempo per raccogliere lanamnesi ed eseguire gli esami di laboratorio. importante per il Servizio Trasfusionale essere a conoscenza se vi sono state precedenti gravidanze, trapianti o trasfusioni. Gli esami di laboratorio eseguiti di routine comprendono: la tipizzazioni ABO ed Rh, il test allantiglobulina diretto (TAD), uno screening per gli anticorpi irregolari e la determinazione della situazione sierologica per il CMV. La tipizzazione HLA e le indagini sugli anticorpi anti-HLA sono eseguite di routine per i riceventi di organi. Lemolisi dovuta ai linfociti passenger (tipica emolisi da incompatibilit ABO), come stato precedentemente discusso in relazione al trapianto di fegato, pu verificarsi anche con il trapianto di altri organi solidi come il polmone, il cuore e il rene. Nel caso dei riceventi di un organo ABO compatibile, ma non identico al gruppo sanguigno del ricevente, stato proposto limpiego trasfusionale intra- e post-operatorio di eritrociti reciprocamente ABO compatibili (compatibili per il ricevente e per il donatore), per il primo mese post-operatorio o alla comparsa di un anticorpo. Attualmente non vi consenso su questa questione. importante ricordare che viene eseguita di routine una prova di compatibilit mediante centrifugazione rapida (immediate-spin) o un crossmatch computerizzato dopo un trapianto ABO non identico, ma uneventuale incompatibilit ABO dovuta a questi anticorpi, se sono di classe IgG, potrebbe essere misconosciuta. In questi casi, raccomandabile luso nella routine di una prova di compatibilit che preveda lutilizzo del siero antiglobuline, oppure lesecuzione di un TAD (che in grado di evidenziare queste situazioni in anticipo rispetto ad una prova di compatibilit pretrasfusionale). Se presente unemolisi ABO, il paziente deve essere trasfuso con eritrociti di gruppo O. Le infezioni da CMV nei riceventi di trapianti allogenici costituiscono una grave complicanza,
spesso letale, che correlata sia alla presenza del CMV nel donatore e nel ricevente, sia al grado di immunosoppressione nel quale si trova il ricevente. Il test principale utilizzato per laccertamento del CMV costituito dal rilievo dello specifico anticorpo. I riceventi CMV sieronegativi che vengono trapiantati con lorgano di un donatore CMV sieronegativo, devono ricevere emocomponenti che sono stati processati per ridurre il rischio della trasmissione del CMV, o provenienti da donatori sieronegativi, o mediante la leucoriduzione dellemocomponente a livelli di 5 x 106 leucociti/emocomponente o inferiori.
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Capitolo 27: Le complicanze non infettive della trasfusione di sangue
Capitolo 27
Le complicanze non infettive della trasfusione di sangue
Questo capitolo definisce le quattro principali categorie di reazioni trasfusionali: 1) le reazioni trasfusionali acute immunologiche, 2) le reazioni trasfusionali acute non immunologiche, 3) le reazioni immunologiche ritardate e 4) le complicanze trasfusionali ritardate non immunologiche, come viene illustrato nella Tabella 27.11,2. Per ogni singolo tipo di reazione vengono discusse la fisiopatologia, il trattamento e la prevenzione. Informazioni ulteriori e pi particolareggiate sono reperibili altrove1. I rischi infettivi della trasfusione sono discussi nel Capitolo 28.
Manifestazioni
Tutto il personale coinvolto nel processo di preparazione e nella somministrazione delle trasfusioni deve essere in grado di riconoscere i sintomi di una reazione trasfusionale, in modo da poter intraprendere con prontezza gli appropriati interventi. Di seguito vengono elencati i segni obiettivi e i sintomi soggettivi tipicamente associati alle reazioni trasfusionali acute, che possono risultare utili per il loro riconoscimento. In generale, si deve considerare ogni manifestazione avversa che si verifica durante la trasfusione come una reazione trasfusionale, fino a quando non se ne sia dimostrata una causa diversa. Febbre, con o senza brividi, associata alla
trasfusione (definita di solito, ai fini della sorveglianza, come laumento di 1C della temperatura corporea). La febbre il pi comune dei sintomi in una reazione trasfusionale emolitica (RTE) 3. Ma, con maggiore frequenza, determinata da altre cause. Brividi scuotenti (di freddo) con o senza febbre. Dolore nella zona di infusione, al petto, alladdome o in sede lombare. Variazioni della pressione sanguigna, di solito acute, sia come ipertensione che come ipotensione. Lo shock cardio-circolatorio associato a febbre, con brividi scuotenti e riduzione della gittata sistolica indicano una setticemia acuta, ma possono essere causati anche da una RTE acuta. Il collasso cardiocircolatorio, senza febbre e brividi, pu essere il sintomo preminente di una anafilassi. La sindrome da compromissione respiratoria, compresa dispnea, tachipnea, sibili o ipossiemia. Le alterazioni cutanee, compresa lorticaria, il prurito, le vampate di calore o un edema localizzato (angioedema). Nausea con o senza vomito. Urine scure o ittero. Le urine scure possono essere la prima indicazione di una reazione emolitica acuta in un paziente anestetizzato. Il sanguinamento o le altre manifestazioni di una coagulopatia da consumo.
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Tabella 27.1 - Categorie e gestione delle reazioni trasfusionali avverse* Tipo Frequenza Eziologia Presentazione Test diagnostici Approccio terapeutico/ profilattico Mantenere lemissione durina >100 mL/ora con liquidi e diuretici (furosemide) EV Analgesici (pu necessitare morfina) Ipertensivi (dopamina a basse dosi) Emostatici (PLT, crio, PFC) per le emorragie
622
Reazioni trasfusionali acute (<24 ore) immunologiche Emolitica 1:38.000 Incompatibilit 1:70.000 eritrocitaria
Brividi, febbre, emoglobinuria, ipotensione, danno renale con oliguria, CID (con stillicidio nel sito dellinfusione), dolore lombare e lungo la vena di infusione, ansia
Febbrile non emolitica
CE 1:200-1:17 (0,5-6%) CP 1:100-1:3 (1-38%) 1:100-1:33
- Ab anti-leucociti del donatore - Citochine accumulate nel CP
Febbre, brividi, mal di testa, vomito
Orticariode
Ab diretti contro le proteine del plasma del donatore
Orticaria, prurito, arrossamento
- Controllo documenti - TDA - Ispezione visiva (per Hb libera) - Ripetere gruppo ABO su campioni pre- e post-trasfusionali - Analisi per definire altre incompatibilit - Test per individuare emolisi (LDH, bilirubina etc.) - Escludere emolisi (TDA, ispezione visiva per emoglobinemia, ripetere gruppo ABO del paziente) - Escludere una contaminazione batterica - Ricerca Ab anti-leucociti - Escludere emolisi (TDA, ispezione visiva per emoglobinemia, ripetere gruppo ABO del paziente)
Premedicare con antipiretici (paracetamolo, non aspirina) Deleucocitare le unit
Trattamentoo premedicazione con istamina (PO o EV) Si pu riprendere lentamente la trasfusione se i sintomi si risolvono
(segue)
Tipo Anafilattica
Frequenza 1:20.000 1:50.000
Eziologia Ab diretti contro proteine del plasma del donatore (compresi IgA, aptoglobina, C4)
Presentazione Ipotensione, orticaria, broncospasmo (dispnea, sibili respiratori, edema locale, ansia)
Test diagnostici
Approccio terapeutico/ profilattico
TRALI
1:5.000 1:190.000
Ab anti-leucociti del donatore (talora del ricevente), agenti attivanti i leucociti
- Escludere emolisi (TDA, - Mettere il paziente in posizione ispezione visiva per di Trendelenburg emoglobinemia, ripetere - Liquidi gruppo ABO del paziente) - Epinefrina (in adulti 0,3-0,5 mL - Anti-IgA di una sol. 1:1.000 SC o IM; - Dosaggio IgA in casi gravi 1:10.000 EV) - Antistaminici (corticosteroidi, beta-2 agonisti) - Emocomponenti privi di IgA Ipossia, scompenso respiratorio - Escludere emolisi (TDA, - Ricovero in ununit ipotensione, febbre, edema ispezione visiva per di terapia intensiva polmonare bilaterale emoglobinemia, ripetere - Escludere dalle donazioni gruppo ABO del paziente) i volontari implicati - Ricerca Ab anti-leucociti in donatore e ricevente. Se positiva pu essere indicata la tipizzazione - Inter-reazione leucocitaria - Radiografia toracica Colorazioni di Gram Emocolture dei componenti Emocolture dai pazienti Escludere emolisi (TDA, ispezione visiva per emoglobinemia, ripetere gruppo ABO del paziente) Antibiotici ad ampio spettro (sino a individuarne la sensibilit) Trattamento delle complicazioni (per lo shock)
Reazioni trasfusionali acute (<24 h) non immunologiche Sepsi Varia a seconda Contaminazione Febbre, brividi, ipotensione degli batterica emocomponenti (Capitolo 28)
623
(segue)
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Tipo Ipotensione legata ad ACE-inibitori
Frequenza Dipende dalle situazioni cliniche
Eziologia
Presentazione
Test diagnostici
Approccio terapeutico/ profilattico
Sovraccarico circolatorio
<1%
Metabolismo della Rossore, ipotensione bradichinina inibito per infusione di bradichinina (filtri caricati negativamente o attivazione della precallicreina) Sovraccarico Dispnea, ortopnea, tosse, volumetrico tachicardia, ipertensione, cefalea
- Escludere emolisi (TDA, - Sospendere la ACE-inibizione - Evitare il ripristino volumetrico ispezione visiva per emoglobinemia, ripetere con albumina nelle gruppo ABO del paziente) plasmaferesi Evitare le filtrazioni bedside
- Radiografia del torace
Emolisi non immunologica
Distruzione fisica Emoglobinuria o chimica delle Emoglobinemia cellule ematiche (per calore, congelamento aggiunta di soluzioni o farmaci emolizzanti) Embolia gassosa Rara Aria nella linea Mancanza di respiro, cianosi, di infusione dolore, tosse, ipotesione, aritmia cardiaca Ipocalcemia Dipende dalle Infusione rapida di Parestesie, tetania, (Ca ionizzato) situazioni cliniche citrato (trasfusioni aritmie cardiache massive,mancato metabolismo del citrato, aferesi)
Rara
- Escludere emolisi (TDA, ispezione visiva per emoglobinemia, ripetere gruppo ABO del paziente) - Analisi sullunit per emolisi
Posizione eretta Ossigeno Diuretici EV (furosemide) Salassi (di 250 mL) Identificare ed eliminare le cause
- Radiogradia per individuare - Sistemare il paziente sul suo laria nei vasi lato sinistro con le gambe al di sopra del torace e del capo - Ca ionizzato - Infusione lenta di calcio, - Prolungamento monitrandone i livelli (calcio dellintervallo Q-T ionizzato) nei casi gravi allelettrocardiogramma - Somministrare Ca per os con modesta sintomatologia durante le aferesi
(segue)
Tipo Ipotermia
Frequenza Dipende dalle situazioni cliniche
Eziologia Infusione rapida di sangue freddo
Presentazione Aritmia cardiaca
Test diagnostici - Rilevare temperatura corporea centrale - Screening anticorpale - TDA
Approccio terapeutico/ profilattico - Impiegare un riscaldatore per sangue
Reazioni trasfusionali immunologiche ritardate (>24 ore) Alloimmunizzazione 1:100 (1%) Risposta immune eritrocitaria ad Ag eritrocitari, estranei Alloimmunizzazione 1:10 (10%) Risposta immune ad Ag HLA ad Ag leucocitari (HLA) estranei Emolitica
Ricerca Ab irregolari positiva
Refrattariet piastrinica, reazioni emolitiche ritardate, MEFN
- Evitare le trasfusioni non necessarie - Emocomponenti leucodepleti - Test di linfocitotossicit - Evitare le trasfusioni non - Ricerca Ab anti-piastrinici necessarie - Emocomponenti leucodepleti Identificare lAb Trasfondere emazie compatibili in caso di necessit
GvDH
1:11.000 - 1:5.000 Risposta Febbre, Hb decrescente, - Ricerca Ab anamnestica ad Ag screening anticorpale positivo, - TDA eritrocitari ittero lieve - Test per emolisi (ispezione visiva per emoglobinemia, LDH, emosiderina urinaria) Rara I linfociti del Eritrodermia, eruzione - Biopsia della cute donatore si molecolo-papulare, anoressia, - Tipizzazione HLA impiantano nel nausea, vomito, diarrea, epatite, ricevente e pancitopenia, febbre attaccano i tessuti dellospite
Corticosteroidi, agenti citotossici Irradiazione degli emocomponenti da trasfondere a pazienti a rischio (compresi i consanguinei del donatore e i prodotti selezionati HLA)
(segue)
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Tipo
Frequenza
Eziologia Gli Ab anti-PLT del ricevente (di solito anti-HPA-1), distruggono le PLT autologhe
Presentazione
Test diagnostici
Approccio terapeutico/ profilattico - IGIV - Uso di PLT negative per HPA-1 - Plasmaferesi
Porpora Rara post-trasfusionale
8-10 giorni dopo una trasfusione, - Ricerca e identificazione comparsa di porpora degli Ab anti-PLT trombocitopenica e di emorragie
Interazione (non Sopravvivenza aumentata nei completamente trapianti renali, aumento nota) fra i leucociti delle infezioni, aumento delle del donatore o ricadute tumorali dopo chirurgia fattori plasmatici e (controversa) e il sistema immune del ricevente Reazioni trasfusionali non immunologiche ritardate (24 ore) Sovraccarico Tipicamente dopo Trasfusioni multiple Diabete, cirrosi epatica, marziale pi di con inevitabile cardiomiopatia 100 trasfusioni sovraccarico di CE marziale in pazienti trasfusione-dipendenti
Immunomodulazione
Ignota
Nessun test specifico
- Evitare le trasfusioni non necessarie - Autotrasfusioni - Usare eritrociti e PLT leucodepleti
Ferritina sierica - Desferioxamina Enzimi epatici Test su funzioni endocrine
* Per la refrattariet piastrinica, vedi il Capitolo 16; per le reazioni trasfusionali da sepsi, vedi la Tabella 28.1; per una revisione recente delle reazioni trasfusionali, vedi Popovsky1. Abbreviazioni (in ordine di comparsa): CID = coagulazione intravascolare disseminata; TDA = test diretto allantiglobulina; Hb = emoglobina; LDH = latticodeidrogenasi; PLT = piastrine; PFC = plasma fresco congelato; EV = endovena; CE = concentrati eritrocitari; CP = concentrati piastrinici; PO (per os) = per bocca; Ab = anticorpo/i; SC = sottocute; IM = intramuscolo; ACE = enzima convertitore dellangiotensina; TRALI = Transfusion-Related Acute Lung Injury, danno polmonare acuto correlato alla trasfusione; Ca = calcio; Ag = antigene; MEFN = malattia emolitica del feto e del neonato; GvHD = Graft versus Host Disease, malattia dellinnesto contro lospite; IGIV = immunoglobuline endovena.
Reazioni trasfusionali acute

Emolisi immuno-mediata Fisiopatologia e manifestazioni Le reazioni trasfusionali emolitiche pi severe si verificano quando le emazie trasfuse interagiscono con anticorpi preformati, presenti nel ricevente. In contrasto, linterazione tra gli anticorpo trasfusi e i globuli rossi del ricevente solo raramente determinano una sintomatologia clinica. Tuttavia, si pu verificare un incremento nella distruzione dei globuli rossi del ricevente, e prodotti che contengano nel plasma un titolo elevato di anticorpo ABO possono causare unemolisi acuta. Linterazione dellanticorpo con un antigene presente sulla membrana del globulo rosso pu innescare lattivazione della cascata complementare (vedi Capitolo 11), attivare le citochine, avere effetti sulla coagulazione e coinvolgere altri elementi della risposta infiammatoria sistemica 4, esitando nelle manifestazioni cliniche di una severa RTE acuta. Si possono manifestare severi sintomi dopo linfusione di quantit anche modeste (10-15 mL) di eritrociti ABO incompatibili. Nei pazienti anestetizzati, che non sono in grado di evidenziare i primi sintomi, la manifestazione iniziale di una RTE acuta pu essere lemoglobinuria, lipotensione o un diffuso sanguinamento nel campo operatorio. Queste gravi RTE acute sono di solito causate dallincompatibilit ABO5 ma, occasionalmente, possono essere determinate da anticorpi con altre specificit6. In contrasto, lemolisi di unintera unit trasfusionale pu anche verificarsi in assenza di tipici sintomi7 e pu svilupparsi con un processo relativamente lento. In questi casi, lemolisi tipicamente extravascolare, senza la produzione di livelli significativi dei mediatori del processo infiammatorio sistemico. Attivazione del complemento. La fissazione degli anticorpi sugli antigeni dei diversi gruppi sanguigni pu attivare il complemento in funzione delle caratteristiche sia dellanticorpo sia dellantigene, che comprendono la specificit dellanticorpo, la sua classe e sottoclasse, il titolo e la densit della distribuzione dellantigene sulla
membrana eritrocitaria. Lattivazione del C3 rilascia lanafilotossina C3a (vedi Capitolo 11) e le emazie, sensibilizzate con il frammento C3b, vengono rimosse con la fagocitosi mediata dai recettori del complemento, in modo pi rapido di quanto si verificherebbe se fosse presente il solo anticorpo. Se la cascata enzimatica del complemento procede fino al completamento e viene assemblato il complesso di attacco alla membrana eritrocitaria, si verifica unemolisi intravascolare, con la produzione di C5a, unanafilotossina 100 volte pi potente del frammento C3a3. Questa la sequenza tipica per lincompatibilit ABO che causa la manifestazione cardinale dellemoglobinemia e, se viene superata la soglia renale per lemoglobina, lemoglobinuria 8(p182) . Le anafilotossine interagiscono con numerosi tipi di cellule, compresi i monociti/macrofagi, i granulociti, le piastrine, le cellule dellendotelio vascolare e le cellule dei muscoli lisci; queste ultime determinano lipotensione e il broncospasmo. Le anafilotossine provocano anche il rilascio o la produzione di numerosi mediatori, con effetti locali e sistemici, cio granuli enzimatici, istamina e altre ammine con effetti vasoattivi, chinine, radicali ossidanti, leucotrini, ossido di azoto e citochine3. Questo meccanismo pu determinare manifestazioni cliniche che simulano un fenomeno allergico, come vampate di calore e, meno frequentemente, fenomeni orticarioidi, sibili respiratori, dolore toracico o senso di costrizione, dolore addominale, nausea e vomito. Con la maggior parte degli anticorpi non ABO che sono specifici per antigeni di altri sistemi gruppoematici, lattivazione del complemento , di solito, incompleta; lemoglobinemia assente o modesta, ma le conseguenze dellattivazione del complemento, in particolare il rilascio delle anafilotossine e lopsonizzazione dei globuli rossi, possono, comunque, determinare effetti sfavorevoli. Citochine. Limportanza del ruolo delle citochine nella risposta infiammatoria (vedi Capitolo 11), che comprende le RTE acute, viene sempre pi riconosciuta9,10. Le ben note attivit delle citochine infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale
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(TNF- , Tumor Necrosis Factor alfa ), linterleuchina-1 e -6 (IL-1, IL-6), le chimochine come lIL-8 e le proteine chemiotattiche per i monociti (Monocyte Chemoattractant Protein, MCP), indicano che esse mediano alcuni degli effetti implicati nel processo dellemolisi alloimmune. Linterleuchina IL-1 ed il TNF causano la febbre e lipotensione (particolarmente se agiscono in modo sinergico), stimolano le cellule endoteliali ad incrementare lespressione delle molecole di adesione e lattivit pro-coagulante, partecipando, inoltre, al reclutamento e allattivazione dei neutrofili e delle piastrine, probabilmente attraverso linduzione dellinterleuchina IL-8 e dei fattori MCP. Si dimostrato che lincubazione in vitro di sangue intero con globuli rossi lavati ABO incompatibili causa un drammatico incremento del TNF, dellIL-8 e delle MCP. Questa risposta complemento-dipendente. Un analogo modello di emolisi indotto dallanti-D (di classe IgG) presenta un diverso schema di produzione delle citochine, con una risposta ad alto livello di IL-8 e di MCP ed una risposta a basso livello di IL-1, IL-6 e TNF-9,10. Limportanza di questi modelli in vitro delle RTE, che si verificano in vivo, indicata dal caso di un paziente di gruppo O, che ricevette 100 mL di emazie di gruppo A, nel quale vennero rilevati alti livelli di TNF- e di elastasi neutrofila; laumento dellelastasi neutrofila coerente con lattivit dellIL-811. Questi rilievi possono condurre a nuove opzioni terapeutiche per i pazienti. Tuttavia, resta ancora da definire completamente il ruolo giocato dalle citochine sulle conseguenze indotte dallemolisi immune. Attivazione della coagulazione . Diversi meccanismi, compresi quelli elencati pi avanti, possono essere responsabili delle alterazioni della coagulazione nel corso di RTE4. Linterazione tra antigene e anticorpo pu attivare la cascata coagulativa intrinseca, attraverso il fattore di Hageman. Inoltre, Il fattore di Hageman attivato (Fattore XIIa) agisce sul sistema delle chinine per produrre la bradichinina, che incrementa la permeabilit dei capillari e dilata le arteriole, determinando una diminuzione della pressione
arteriosa sistemica. Numerose sostanze, precedentemente citate, possono incrementare lespressione del fattore tessutale da parte dei leucociti e delle cellule endoteliali, comprese le componenti del complemento attivate, il TNF-, e lIL-1. I fattori tessutali attivano la via della coagulazione estrinseca e la sua attivazione correlata con la coagulazione intravascolare disseminata (CID), che pu, di seguito, causare: 1) la formazioni di trombi nel microcircolo e danni ischemici a tessuti e organi, 2) il consumo del fibrinogeno, delle piastrine e di altri fattori della coagulazione e 3) lattivazione del sistema fibrinolitico e la generazione dei prodotti di degradazione del fibrinogeno. Il risultato finale pu esitare in una diatesi emorragica, caratterizzata da uno stillicidio generalizzato o da un sanguinamento incontrollabile. Shock e scompenso renale. Considerando la massa assoluta di antigene e anticorpo - e lelenco dei mediatori che possono essere coinvolti nelle RTE comprendente le anafilotossine, le ammine vasoattive, le chinine e le citochine - non sorprendente che si verifichi uno shock. Lipotensione provoca una risposta compensatoria del sistema nervoso simpatico, che determina vasocostrizione negli organi e nei tessuti con un letto vascolare ricco di recettori alfaadrenalinici, particolarmente nel circolo renale, splenico, polmonare e dei capillari cutanei, aggravando lischemia in questi distretti vascolari. Lo scompenso renale unaltra sequela della RTE acuta. Tuttavia lemoglobina libera, che stata storicamente considerata come la causa del blocco renale, ne indebolisce le funzioni12, alle quali poi viene correntemente attribuito il conseguente blocco renale che, in realt, ampiamente sostenuto dallipotensione, dalla vasocostrizione renale, dalla deposizione di complessi immuni antigene-anticorpo e dalla formazione di trombi nel letto vascolare che, come conseguenza, compromettono lafflusso sanguigno nella corteccia renale. Frequenza Gli errori di trascrizione e di documentazione, cos come altri tipi di errori umani che comportino
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unerrata identificazione, sono le cause pi comuni delle trasfusioni ABO incompatibili, errori che si possono verificare durante il prelievo dei campioni di sangue pre-trasfusionali o allinterno del Servizio Trasfusionale o al momento della trasfusione. Unindagine documentale sugli errori trasfusionali che si sono verificati nellarco di 10 anni nello Stato di New York (nel decennio 19901999) ha stimato una frequenza di 1 trasfusione di emazie ABO incompatibili ogni 38.000. La correzione della frequenza attesa, dovuta alle trasfusioni fortunosamente risultate ABO compatibili, comporta una stima della frequenza di trasfusioni errate pari a 1:14.0007. Unindagine su 3.601 strutture, condotta dal College of American Pathologists, ha rilevato 843 RTE acute documentate in un periodo di tempo di 5 anni, e di queste ben 50 (6%) con esito letale 13. Il programma SHOT ( Serious Hazards of Transfusion), condotto in Inghilterra e in Irlanda, ha documentato, nellarco di 5 anni, un totale di 161 casi di trasfusioni ABO incompatibili con nove casi letali (cinque dei quali definiti come correlati al decesso, uno come probabilmente correlato al decesso e tre come possibilmente correlati al decesso) 14. Sebbene non sia disponibile un preciso denominatore per questi rilievi confidenziali, si ritiene che siano stati riesaminati i dati relativi a oltre il 90% delle trasfusioni eseguite, distribuendo circa 2,5 milioni di unit di emocomponenti ogni anno, con una frequenza di errore non inferiore a 1 su 78.000 trasfusioni. Queste valutazioni sottostimano, con ogni probabilit, la vera frequenza, perch, presumibilmente, ulteriori RTE acute non sono state riconosciute come tali o non sono state riferite. La stima della probabilit di un esito letale determinato da RTE acute viene, in generale, valutato nellambito di 1 su 1.000.000 trasfusioni5,7,14. Trattamento Il trattamento di una RTE dipende dalla sua gravit4. Gli obiettivi primari sono un energico trattamento dellipotensione e il mantenimento di un adeguato flusso ematico a livello renale. Se lo shock pu essere prevenuto o viene, comunque,
trattato adeguatamente, pu essere evitata la progressione verso il blocco renale. Ladeguatezza della perfusione renale pu essere monitorata misurando lemissione di urine, con lobiettivo di mantenere un rapporto del flusso urinario superiore ai 100 mL/ora nelladulto, per almeno 18-24 ore. Il supporto, che viene di solito utilizzato per primo, la somministrazione endovenosa di soluzione salina isotonica, ma lipofunzionalit cardiaca e/o renale latente possono complicare la terapia, ed importante evitare un sovraccarico cardiocircolatorio indotto dalliperidratazione. Si raccomanda un monitoraggio invasivo (con catetere) della pressione intravascolare nei vasi capillari polmonari, per lorientamento nella somministrazione di liquidi, a fronte di una instabilit emodinamica. I diuretici contribuiscono allincremento del flusso ematico renale e aumentano lemissione di urina. La somministrazione endovenosa di furosemide, a dosi da 40 a 80 mg/kg per un adulto o da 1 a 2 mg/kg per un bambino, non ha soltanto effetti diuretici, ma incrementa anche il flusso ematico nella corteccia renale. Questi dosaggi possono essere ripetuti una volta, permettendo al paziente di essere adeguatamente idratato. Il mannitolo, come diuretico osmotico, stato utilizzato in passato, ma, per il mantenimento del flusso ematico corticale, la furosemide da preferirsi. Se non si ha una risposta della diuresi entro poche ore dallinizio della terapia idratante e diuretica, vi una forte probabilit che si sia verificata una necrosi tubulare acuta: di conseguenza, unulteriore somministrazione di liquidi pu essere pericolosa. Il trattamento dellipotensione, utilizzando agenti ipertensivi che riducano il flusso renale, come la dopamina ad alte dosi, deve essere possibilmente evitata. Luso dopamina a basso dosaggio (2-5 g/kg/minuto), come agente protettivo della funzione renale, stata proposta nella gestione delle RTE acute4. Tuttavia, le prove indicano che essa non efficace in tale funzione e presenta molti effetti tossici15. La CID, con il conseguente sanguinamento o lo stillicidio generalizzato, pu essere il principale
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rilievo clinico in alcune RTE e pu essere il sintomo di esordio che si rileva in un paziente anestetizzato. Leparina stata raccomandata da alcuni sia per la prevenzione della CID, quando per prima viene precocemente rilevata unincompatibilit ABO, sia per il trattamento di una coagulopatia ormai manifesta. Altri ritengono che la pericolosit della somministrazione di eparina superi i suoi potenziali benefici, soprattutto perch levento immune che ha provocato la CID si autolimita. Pu rendersi necessaria la somministrazione di piastrine, di plasma fresco congelato e di crioprecipitato anti-emofilico, come fonti di fibrinogeno e di Fattore VIII. La procedura di scambio eritrocitario pu essere presa in considerazione per i pazienti con un carico significativo di globuli rossi incompatibili in circolo. Le RTE sono rare e pochi clinici hanno unesperienza diretta per il loro trattamento. Poich la gestione medica di una RTE acuta spesso complicata e pu richiedere interventi aggressivi come lemodialisi, il consulto con medici di maggiore esperienza sui sistemi organici maggiormente danneggiati, o con specialisti in terapia intensiva, pu essere un comportamento prudente per il trattamento di un paziente con una severa RTE acuta. Prevenzione Poich gli errori di identificazione causano la maggioranza delle RTE acute immuno-mediate, la migliore opzione per evitarle basata sulla prevenzione o sulla individuazione degli errori, in ogni fase del processo trasfusionale. In ogni struttura, vi devono essere sistemi concepiti per prevenire e rilevare gli errori di identificazione dei pazienti e delle unit trasfusionali al momento del salasso (acquisizione del campione), in ogni fase esecutiva degli esami di laboratorio, al momento della distribuzione e quando viene eseguita la trasfusione. I documenti del programma SHOT evidenziano errori multipli nella maggioranza degli incidenti trasfusionali ed enfatizzano, in modo particolare, limportanza di controlli al letto del paziente al momento della trasfusione14. La certezza che tutto lo staff clinico riconosca i sintomi delle reazioni acute e interrompa immediatamente
la trasfusione prima che sia somministrato un volume critico di sangue incompatibile essenziale per prevenire gravi danni al paziente. Laddestramento e la valutazione del personale che opera nellambito trasfusionale sono elementi cruciali per la prevenzione degli incidenti trasfusionali. essenziale lattiva partecipazione dei medici e del personale direttivo, tanto quanto quella del personale infermieristico, tecnico e clinico. Lemolisi non immuno-mediata Cause I globuli rossi possono andare incontro a unemolisi in vitro se lunit viene esposta a temperature incongrue durante il trasporto o durante la conservazione, oppure se viene maldestramente manipolato al momento della somministrazione. Il malfunzionamento dei riscaldatori del sangue, luso di forni a microonde, di bagni termostatici caldi, oppure congelamenti non rilevati, possono determinare un danneggiamento, correlato alla temperatura. Unemolisi di tipo meccanico pu essere causata dalluso di pompe a rulli (come quelle utilizzate per i by-pass negli interventi cardiochirurgici), per limpiego di pompe da infusione a pressione, di manicotti per incrementare la pressione, oppure di aghi con un lume troppo stretto16. Unemolisi di tipo osmotico pu essere indotta nella sacca di sangue, o nel set da infusione, per laggiunta di farmaci o di soluzioni ipotoniche. Una scorretta deglicerolizzazione o una procedura di congelamento inadeguata dei globuli rossi possono determinare unemolisi delle emazie dopo linfusione. Infine, lemolisi eritrocitaria pu indicare una contaminazione batterica nellunit di sangue. In un paziente che presenta unemolisi associata alla trasfusione, per la quale siano state escluse sia cause immunoematologiche che non immunoematologiche, deve essere considerata la possibilit che i globuli rossi del paziente stesso, o del donatore, possano presentare un difetto intrinseco, come un deficit di glucosio-6-fosfato deidrogenasi, che determina la concomitante emolisi.
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Trattamento Il trattamento commisurato alla gravit della reazione. Se il paziente sviluppa una reazione severa con ipotensione, shock e disfunzione renale, si rende necessario un suo trattamento intensivo, ancor prima che sia stata indagata la causa dellincidente. Se il paziente presenta soltanto emoglobinemia ed emoglobinuria, pu essere sufficiente una terapia di supporto. Prevenzione Devono esserci procedure operative scritte per tutti gli aspetti relativi alla raccolta, alla lavorazione e alla somministrazione di unit trasfusionali. Tutto il personale operativo deve essere addestrato per luso appropriato delle strumentazioni, delle soluzioni e dei farmaci per uso endovenoso che vengono utilizzati durante la trasfusione di sangue e di emocomponenti. Lequipaggiamento deve essere adeguatamente mantenuto in efficienza e devono essere tenute registrazione relative a come, e quando, le diverse componenti delle strumentazioni sono state utilizzate. I medicinali per somministrazione endovenosa non devono essere iniettati nella sacca di sangue, salvo approvazione della Food and Drug Administration (FDA) o certificati come idonei a questo scopo17(p48) e deve essere posta molta attenzione nella selezione e nellutilizzo dei dispositivi per laccesso venoso. Il Capitolo 22 esamina i particolari relativi alla somministrazione delle trasfusioni. Sepsi associate alla trasfusione La contaminazione batterica del sangue trasfuso deve essere presa in considerazione se il paziente presenta brividi scuotenti, specialmente se associati a uno scompenso cardiovascolare e/o a febbre sopra i 40 C. Per una discussione pi dettagliata di questa complicanza trasfusionale, che potenzialmente letale, vedi il Capitolo 28. Reazioni febbrili non emolitiche Fisiopatologia e manifestazioni Una reazione trasfusionale febbrile non emolitica (RTFNE) viene spesso definita come un incremento della temperatura corporea >1C che
sia correlato alla trasfusione, senza che esista nessunaltra spiegazione. Queste reazioni sono spesso associate a una sensazione di freddo o a brividi. La definizione di incremento di 1C arbitraria; il medesimo evento pu determinare incrementi di temperatura corporea inferiori. Infatti, alcuni Autori discutono le reazioni caratterizzate da brividi o da altri sintomi in assenza di febbre, come RTFNE, presumendone un comune meccanismo di attivazione2. In uno studio che comprendeva 108 reazioni caratterizzate da tremori, da freddo o da brividi, solo in 18 casi si era verificata una variazione della temperatura corporea19. Le reazioni febbrili sono complicanze che interessano dallo 0,5 al 6% del totale delle trasfusioni di concentrati eritrocitari non leucodepleti. Stimolazioni precedenti, particolarmente gravidanze o trasfusioni multiple, incrementano, nelle trasfusioni di concentrati eritrocitari, lincidenza delle RTFNE. La frequenza di questo tipo di reazioni molto pi elevata (1-38%) dopo trasfusioni di concentrati piastrinici. Per la maggior parte, le RTFNE sono benigne, sebbene in alcuni casi possano provocare un significativo malessere e alterazioni emodinamiche o respiratorie. Lincremento della temperatura pu iniziare precocemente durante la trasfusione oppure essere ritardato, con un intervallo anche di ore, dopo la conclusione della stessa. Si ritiene che molte reazioni febbrili siano determinate da uninterazione tra gli anticorpi presenti nel plasma del ricevente, specifici per antigeni, di solito del sistema HLA, che sono espressi sui linfociti, sui granulociti o sulle piastrine trasfuse. Vi , inoltre, evidenza che le reazioni febbrili, in particolare quelle causate dalle piastrine, possono essere determinate dallinfusione di modificatori della risposta biologica, che comprendono le citochine, le quali si accumulano nella sacca di sangue durante la conservazione. Le citochine, rilasciate nel circolo del ricevente, contribuiscono indubbiamente alle reazioni, iniziate da un anticorpo del ricevente attivo contro i leucociti del donatore2,20-22. Poich la febbre pu essere il sintomo iniziale di una RTE acuta, oppure di una reazione trasfusionale
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determinata dalla contaminazione batterica del sangue che si trasfonde, qualunque rilievo relativo a un aumento della temperatura corporea associato alla trasfusione giustifica unattenzione tempestiva. La diagnosi di una RTFNE viene posta soltanto dopo lesclusione di ogni altra possibile spiegazione della febbre, specialmente nei confronti di una reazione emolitica o settica. Le linee guida per la valutazione di una sospetta reazione trasfusionale acuta sono discusse pi avanti in questo capitolo. Trattamento Tradizionalmente, quando si verifica una RTFNE, la trasfusione viene interrotta23. Tuttavia, alcuni clinici ritengono che la febbre da sola non debba automaticamente determinare linterruzione della trasfusione2,24, dipendendo da quali sintomi (soggettivi o obiettivi) o rilievi di laboratorio presentati dal paziente possano essere indicativi di unemolisi, di un danno polmonare acuto correlato alla trasfusione (TransfusionRelated Acute Lung Injury, TRALI) o di una contaminazione batterica. La febbre determinata da una RTFNE risponde, di solito, agli antipiretici. Alluso dei salicilati, viene preferito il paracetamolo (acetominofene) perch non altera la funzionalit piastrinica. Pu essere molto utile uniniezione di meperidina nei pazienti che presentano brividi scuotenti. Gli antistaminici non sono indicati perch, nella maggior parte delle RTFNE, non si ha liberazione distamina. Prevenzione Le reazioni febbrili in un soggetto alloimmunizzato possono essere spesso prevenute con trasfusioni di emocomponenti leucodepleti. La prevenzione delle reazione determinate dalle citochine, che si accumulano durante la conservazione del sangue, richiede che la leucoriduzione venga eseguita prima della conservazione 2,19, anche se alcuni pazienti possono essere ancora reattivi. Con piastrine non leucodeplete, le reazioni mediate dalle citochine possono essere meno frequenti quando lemocomponente di recente preparazione o, al massimo, ha 3 giorni di conservazione. La
rimozione del plasma pu anchessa ridurre la frequenza delle reazioni febbrili. Il paracetamolo viene solitamente somministrato prima della trasfusione, ma non vi prova che la pre-medicazione riduca lincidenza delle RTFNE che si verificano con piastrine leucodeplete prima della conservazione25. Allergie: dalle reazioni orticarioidi allanafilassi Fisiopatologia e manifestazioni Le reazioni allergiche alla trasfusione formano un tuttuno, con la stragrande maggioranza degli eventi di modesta entit, nelle forme orticarioidi o pruriginoso-eritematose; le lesioni rilevate sono nettamente circoscritte e, nella maggior parte dei casi, localizzate nella parte superiore del tronco e sul collo. Possono essere pruriginose, e, di solito, non sono associate a febbre o ad altri rilievi avversi. Dallaltro lato, vi sono le reazioni anafilattiche, con sintomi sistemici che comprendono lipotensione, la perdita di coscienza, lo shock e, in rari casi, la morte. Queste reazioni possono iniziare dopo linfusione anche di solo pochi millilitri, ma le reazioni meno severe tendono a svilupparsi pi lentamente. Il termine anafilattoide viene usato in Medicina Trasfusionale per indicare le reazioni che sono confinate tra questi due estremi, ma viene utilizzato anche per indicare le reazioni che presentano unanalogia clinica con lanafilassi, bench sostenute da meccanismi differenti. Le manifestazioni di queste reazioni possono coinvolgere uno solo oppure diversi sistemi, in particolare: la pelle (con orticaria, arrossamento generalizzato o eruzione orticarioide, gonfiore localizzato o angioedema), il tratto respiratorio (con ostruzione di quello superiore o di quello inferiore con tosse, raucedine, stridore, affanno, costrizione toracica, dolore al petto, dispnea), il tratto gastrointestinale (con crampi, nausea, vomito, diarrea), oppure il sistema cardiocircolatorio (con tachicardia e altre aritmie, compreso larresto cardiaco) 26. La febbre tipicamente assente, e questa una caratteristica che aiuta a differenziare queste reazioni dallipotensione determinata da una reazione
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emolitica, dalla contaminazione batterica o dalla TRALI (vedi pi avanti). La severit delle reazioni trasfusionali allergiche pu aumentare con successive trasfusioni. Le reazioni allergiche sono attribuite allesposizione ad antigeni solubili che sono presenti nel plasma del donatore e si legano ad anticorpi preformati di classe IgE, presenti sulle mastcellule del ricevente, con il risultato di attivarle e rilasciare istamina. Tale ipotesi basata sul fatto che queste reazioni tendono ad essere ricorrenti nei pazienti che ne soffrono, e possono essere prevenute con la rimozione del plasma dagli emocomponenti cellulari o, nel caso di reazione orticarioide, con antistaminici. Le reazioni anafilattiche o anafilattoidi sono qualche volta associate ad alloanticorpi con specificit per la classe, la sottoclasse e gli allotipi delle immunoglobuline IgA, particolarmente nei pazienti privi di questa classe anticorpale27. Anticorpi di classe IgE con specificit anti-IgA sono stati dimostrati in due pazienti con una comune e variabile immunodeficienza che presentavano reazioni alle preparazioni di immunoglobuline28. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi di classe IgA ai quali sono attribuite le reazioni anafilattiche sono in realt appartenenti alle classi IgG o IgM27 e tali anticorpi sono dimostrabili solamente in una minoranza dei casi di anafilassi indagati (17,5% nella serie studiata da Sandler et al.)27. Per di pi, gli anticorpi di classe IgA sono comuni mentre le reazioni anafilattiche non lo sono. Per questo motivo, la dimostrazione di anti-IgA in un soggetto, che non sia mai stato trasfuso, non predittiva di una reazione anafilattica. Sono altrettanto probabili altri allergeni o altri meccanismi. Sono state riportate severe reazioni allergiche in pazienti che presentavano anticorpi specifici per i determinanti antigenici del C4 29,30, dellaptoglobina31 e di sostanze di origine non biologica, come lossido di etilene utilizzato nella sterilizzazione dei set trasfusionali32. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, lantigene responsabile non stato identificato. Raramente sono state documentate reazioni causate dal trasferimento passivo dellanticorpo responsabile dal donatore al paziente33,34.
Reazioni ipotensive, che mimano lanafilassi, sono state osservate in pazienti che assumono gli inibitori dellenzima convertitore dellangiotensina (ACE) quando viene loro somministrata albumina in corso di plasmaexchange35. Si ritiene che questo sia dovuto allinibizione del catabolismo della bradichinina, dovuta agli ACE-inibitori, combinata con lattivazione della bradichinina per i bassi livelli dellattivatore della pre-callicreina (un frammento del fattore XII o fattore di Hageman) presenti nellalbumina utilizzata per la sostituzione. Allo stesso modo, lattivazione della bradichinina per lattivit della pre-callicreina nella frazione proteica del plasma stata anchessa implicata nelle reazioni ipotensive36, e un analogo meccanismo probabilmente responsabile per i casi pubblicati, relativi ai numerosi pazienti che assumono ACE inibitori, perch avevano presentato crisi ipotensive quando avevano ricevuto emocomponenti leucodepleti con i filtri bedside37-39. Analoghe reazioni sono state osservate in associazione al contatto del plasma con membrane per dialisi, con colonne per lassorbimento di lipoproteine a bassa densit e con colonne immunoassorbenti di proteina A stafilococcica. Altri meccanismi proposti riguardano linfusione di anafilotossine di origine complementare e di istamina26. La diversificazione e lappropriata classificazione di queste differenti reazioni richiederanno ulteriori ricerche e una ridefinizione degli strumenti diagnostici. Frequenza Lorticaria pu complicare dall1 al 3% delle trasfusioni, la frequenza osservata dipendendo da quanto approfonditamente viene ricercata. Lincidenza delle reazioni anafilattiche fortunatamente bassa, ed stimata tra 1 su 20.000 a 1 su 50.000 unit. I rilievi dello SHOT indicano che lanafilassi una complicanza molto pi frequente nelle trasfusioni di plasma e di piastrine rispetto alle trasfusioni di globuli rossi14. Bench queste reazioni possano aver contribuito al decesso di rari pazienti gravemente malati, esse non costituiscono una causa principale di morte. La frequenza della mortalit
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pubblicata dalla FDA di circa 1 caso di decesso allanno26. Trattamento Se la reazione orticarioide costituisce lunico evento sfavorevole rilevato, la trasfusione pu essere temporaneamente interrotta mentre viene somministrato oralmente, o per via parenterale, un antistaminico (per esempio, difenidramina 25-50 mg). Se i sintomi sono lievi e sono stati precocemente rilevati, la trasfusione pu essere ripresa, prevedendo che linfusione, temporaneamente interrotta, possa essere completata in un tempo accettabile (vedi Capitolo 22). Se il paziente sviluppa una severa orticaria, un gonfiore localizzato significativo, sintomi respiratori o gastrointestinali, oppure unipotensione, la trasfusione deve essere interrotta26. La terapia immediata di una reazione anafilattica durante una trasfusione deve essere linterruzione della trasfusione e il trattamento dellipotensione, ponendo il paziente nella posizione di Trendelenburg (piedi sollevati) e somministrandogli liquidi. Se la pressione sanguigna non aumenta immediatamente, deve essere somministrata epinefrina. Nei casi lievi o moderati, lepinefrina (1:1.000) dovrebbe essere somministrata sottocute o intramuscolo, con una dose iniziale da 0,3 a 0,5 mL/kg negli adulti o di 0,01 mL/kg nei bambini. Questa dose pu essere ripetuta una seconda e una terza volta, a intervalli da 5 a 15 minuti. Nelle reazioni severe (pressione sistolica inferiore a 80 mmHg, edema laringeo con compromissione delle vie aeree superiori,o blocco respiratorio), il farmaco dovrebbe essere somministrato endovena (1:10.000) per un effetto pi rapido, dato che lassorbimento del farmaco nei pazienti ipotesi non affidabile. Pu rendersi necessaria la somministrazione per aerosol o endovena di beta-2 agonisti e di teofillina per quei pazienti selezionati nei quali il broncospasmo non risponde alla terapia con epinefrina, o nei quali lepinefrina inefficace, per una preesistente terapia beta-bloccante. Si deve somministrare ossigenoterapia, con intubazione endotracheale, se vi una significativa ostruzione delle vie aeree
superiori. Il permanere di uninstabilit emodinamica pu rendere necessario un monitoraggio invasivo. Per nessun motivo deve essere ripresa la trasfusione. Si devono prendere in considerazione eventuali eventi concomitanti, quali un infarto miocardico, unembolia polmonare, o altre gravi situazioni cliniche, che possono presentarsi insieme allipotensione e alla compromissione respiratoria26. Prevenzione I riceventi che presentano frequentemente reazioni orticarioidi associate alla trasfusione possono rispondere bene alla somministrazione di antistaminici mezzora prima della trasfusione, (per esempio, 25-50 mg di difenidramina). Tuttavia, la difenidramina non deve essere somministrata routinariamente, senza che vi sia una precedente storia di reazioni allergiche, particolarmente nei pazienti anziani 40. Se la somministrazione di un antistaminico insufficiente, pu essere utile la somministrazione di 100 mg di idrocortisone, unora prima della trasfusione. Se le reazioni sono severe e ricorrenti oppure sono associate ad altre manifestazioni allergiche nonostante unadeguata premedicazione, le trasfusioni di concentrati eritrocitari o di concentrati piastrinici lavati, oppure di emazie che sono state congelate, scongelate, e deglicerolizzate saranno, di solito, ben tollerate. I pazienti che hanno presentato, in passato, una severa reazione anafilattica e sono privi delle immunoglobuline di classe IgA o hanno un accertato anticorpo anti-IgA, dovrebbero ricevere emocomponenti privi di IgA, ottenuti mediante il lavaggio o con la preparazione di emocomponenti provenienti da donatori con deficit di IgA. Le severe reazioni allergiche sostenute da anti-IgA possono essere prevenute solamente con una massiccia immunosoppressione anti-allergica o dal lavaggio degli emocomponenti. Una richiesta di globuli rossi pu essere soddisfatta utilizzando unit di emazie lavate, oppure congelate, scongelate e deglicerolizzate 26. Concentrati piastrinici lavati non sono di solito disponibili rapidamente e possono comportare una riduzione
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quantitativa delle piastrine utilizzabili, una diminuzione della loro funzionalit, e della loro sopravvivenza in circolo41; per tali motivi, dopo la prima reazione, se non si dimostrato che la causa dovuta ad anticorpi anti-IgA, alcuni Centri Trasfusionali preferiscono riprovare con il paziente sotto stretta sorveglianza medica. La prevenzione delle reazioni anafilattoidi nei pazienti come quelli affetti da porpora trombotica trombocitopenica e che necessitano assolutamente delle componenti plasmatiche, pu rappresentare una sfida tremenda, se non sufficiente la scorta di plasma da donatori con deficit di IgA. Pu essere utile il pretrattamento con antistaminici, con corticosteroidi (iniziando con 100 mg di idrocortisone) e con efedrina. Infine, pu essere possibile la raccolta precauzionale e la conservazione di emocomponenti autologhi, ottenuti da pazienti noti per aver precedentemente sofferto di reazioni anafilattiche. Lesione polmonare acuta correlata alla trasfusione Fisiopatologia e manifestazioni La lesione polmonare acuta correlata alla trasfusione, universalmente nota come TRALI (Transfusion-Related Acute Lung Injury) una complicanza trasfusionale, che deve essere presa in considerazione ogni volta che il ricevente di una trasfusione manifesta uninsufficienza respiratoria acuta e/o quando i rilievi radiografici sono indicativi di un edema polmonare bilaterale, senza evidenza di scompenso cardiaco o di altre cause di insufficienza respiratoria. La severit del danno respiratorio , di solito, sproporzionata rispetto al volume di sangue trasfuso. La reazione presenta tipicamente febbre, brividi e ipotensione, e si verifica durante o entro 1-2 ore dopo la trasfusione, spesso con uninsorgenza istantanea e drammatica. Gli emocomponenti implicati nella TRALI hanno sempre contenuto tracce di plasma, ma il volume pu essere modesto, come quello presente in ununit di crioprecipitato o in un concentrato eritrocitario risospeso in soluzione additiva42,43. Poich le manifestazioni patologiche di una TRALI sono variabili e possono sovrapporsi con
quelle gi presenti nel paziente per concomitanti problemi medici, estremamente utile definire le caratteristiche della sindrome, soprattutto per approfondire gli studi su epidemiologia e patogenesi. In una consensus conference dei Servizi Trasfusionali canadesi, stata data la seguente definizione44: Il quadro che definisce una sindrome di lesione polmonare acuta (Acute Lung Injury, ALI) presenta: 1) un esordio acuto, 2) lipossiemia (PaO 2 /FIO 2 <300 mmHg, o saturazione di O2 <90% in atmosfera ambiente, oppure altre evidenze cliniche), 3) infiltrati polmonari bilaterali ai raggi X e 4) nessuna evidenza di un sovraccarico circolatorio. La TRALI , quindi, definita come: 1) una nuova ALI che si verifica durante la trasfusione o entro 6 ore dalla sua conclusione e 2) nessun altro fattore di rischio di ALI, contemporaneamente associato. Se questi ultimi sono presenti, il caso viene considerato come possibile TRALI. I fattori di rischio per ALI prevedono laspirazione di liquidi, le polmoniti, le inalazioni di tossici, i traumi polmonari, il quasi annegamento, le setticemie gravi, lo shock, i politraumi, i danni da ustione, la pancreatite acuta, il by-pass cardio-polmonare e loverdose da farmaci. Si osservato che una definizione come questa non comprender n i casi di leggere difficolt respiratorie che presentano una patogenesi analoga, n i casi di ALI in pazienti con un sovraccarico circolatorio, e neppure i casi nei quali un processo correlato alla trasfusione determina un peggioramento di una ALI preesistente44. La TRALI pu essere determinata da diversi meccanismi. Sono stati dimostrati45-47 anticorpi nel donatore specifici per gli antigeni HLA di Classe I o II presenti nel ricevente, o specifici per gli antigeni dei suoi granulociti, che sono ritenuti causa di una sequela di eventi che incrementano la permeabilit del microcircolo polmonare, cosicch liquido ad alto contenuto proteico penetra nellinterstizio e negli spazi alveolari. Pi raramente, anticorpi presenti nel circolo del ricevente, specifici per gli antigeni HLA o granulocitari del donatore, danno inizio alla medesima sequela di eventi45,46,48. Sebbene ci si aspetti che gli anticorpi responsabili siano pi
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frequentemente presenti nei riceventi che nei donatori, la rarit della TRALI determinata dagli anticorpi del ricevente pu essere dovuta al fatto che il pool dei leucociti-bersaglio forniti dal donatore quantitativamente molto minore, in un singolo emocomponente cellulare trasfuso, di quello che presente nel circolo del paziente. stata dimostrata lattivazione dei monociti, con liberazione di citochine, comprendenti lIL-1, il TNF-,e i fattori tessutali, e che queste reazioni sono altamente specifiche per le cellule che presentano gli antigeni-bersaglio48. La perfusione di granulociti neutrofili, di complemento, e di anticorpi specifici per gli antigeni dei neutrofili in un preparato polmonare ex vivo di coniglio determina un severo edema 49, e le indagini autoptiche dimostrano laggregazione dei granulociti neutrofili nei polmoni dei pazienti deceduti per la TRALI 50 . Queste e altre osservazioni fanno pensare che ledema polmonare nella TRALI sia causato da un danno endoteliale mediato dai neutrofili, iniziato dallattivazione anticorpale diretta dei neutrofili oppure attraverso lattivazione dei monociti, dei macrofagi polmonari, e/o delle cellule endoteliali. Se si amplia lo spettro degli anticorpi coinvolti nella TRALI, molti altri casi appaiono essere anticorpi-mediati. Tuttavia, sono stati proposti altri meccanismi come causa dello scompenso respiratorio correlato alla trasfusione. Sono state riferite severe reazioni polmonari dopo linfusione di granulociti, in pazienti noti per non presentare infezioni polmonari o in condizioni analoghe a quelle idonee per determinare una rapida attivazione del complemento51. Altri fattori possono comprendere le anafilotossine C3a e C5a, laggregazione dei granulociti in emboli leucocitari presenti nel sistema microvascolare polmonare, oppure la trasfusione di citochine che si sono accumulate negli emocomponenti durante la conservazione. Recentemente, sono stati coinvolti nella patogenesi della TRALI, come potenziali attivatori dei granulociti, prodotti lipidici reattivi originati dalle membrane delle cellule ematiche del donatore52. Queste sostanze, accumulatesi durante la conservazione, indurrebbero i granulociti neutrofili a produrre mediatori vasoattivi
in risposta a una stimolazione secondaria, quale uninfezione. Uno studio di controllo casistico ha rilevato che il periodo di conservazione degli emocomponenti e i livelli dei lipidi bioattivi, ma non il livello degli anticorpi antileucocitari, erano associati con la TRALI53. La frequenza della TRALI non conosciuta, ma i dati raccolti da una struttura negli anni 80, sostiene unincidenza di 1 caso su 5.000 trasfusioni45. I dati della sorveglianza passiva raccolti dal programma SHOT14 in un arco di tempo di 5 anni comprendono 70 casi di TRALI (approssimativamente 1 caso su un totale di 250.000 emocomponenti trasfusi), dei quali 18 casi con esito letale (che comprendevano sei casi sicuri, due probabili e dieci possibili di esiti letali correlati con la TRALI). In questa serie, la TRALI era la causa pi comune di morbilit e di mortalit, precedendo la Graft-versus-Host-Disease (GvHD) associata alla trasfusione (TA-GvHD), lincompatibilit ABO e la contaminazione batterica. I dati dello SHOT indicano che la frequenza della TRALI pi elevata dopo le trasfusioni di plasma e di piastrine. Le conclusioni relative alla frequenza e allincidenza della mortalit sono, ovviamente, dipendenti dalla definizione di TRALI che viene utilizzata. Trattamento Se si sospetta un qualunque tipo di reazione polmonare acuta, la trasfusione deve essere immediatamente fermata e, anche se si attenuano i sintomi inizialmente rilevati, la stessa unit non deve essere infusa ulteriormente. La gestione clinica focalizzata sulla regressione della progressiva ipossiemia con lossigeno terapia e, se necessario, con la respirazione assistita. Il ruolo degli steroidi endovena non dimostrato. Diversamente dalle altre forme di sindromi da scompenso respiratorio acuto, la maggior parte dei pazienti recupera unadeguata funzionalit polmonare nellambito di 2-4 giorni42,45 e lincidenza di mortalit rilevata risulta inferiore al 6-23% dei casi (Holness L., comunicazione personale). Prevenzione Se pu essere dimostrato nel plasma di un
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donatore di sangue un anticorpo che ha causato una reazione respiratoria acuta in un paziente, il sangue di questo donatore non deve essere ulteriormente utilizzato per la preparazione di emocomponenti che contengano plasma. Non necessaria alcuna particolare precauzione per il paziente se il problema limitato a quello specifico donatore e gli emoderivati che sono ottenuti da altri donatori sono normalmente utilizzabili per le necessit di quel paziente. La politica abituale in Inghilterra quella di evitare di produrre plasma ottenuto da donatrici. Sovraccarico circolatorio Fisiopatologia e manifestazioni La terapia trasfusionale pu essere causa di edema polmonare acuto per un sovraccarico volumetrico nel circolo e ci pu determinare gravi conseguenze, compresa la morte. Sono reperibili pochi dati relativi allincidenza, nella popolazione generale, del sovraccarico circolatorio indotto dalla trasfusione, ma i bambini piccoli e gli anziani sono considerati i soggetti a maggior rischio. stata osservata una frequenza superiore all1% in uno studio condotto su pazienti ortopedici anziani 54. Un rapido incremento del volume circolatorio viene mal tollerato, particolarmente da pazienti con situazioni di compromissione cardiaca o polmonare, e/o con unanemia cronica e una massa plasmatica espansa. Linfusione di albumina al 25%, che causa il drenaggio di ampi volumi di fluido extravascolare nello spazio intravascolare, pu anchessa causare un sovraccarico circolatorio. Deve essere considerata la possibilit di unipervolemia se durante la trasfusione, o poco dopo, intervengono dispnea, cianosi, ortopnea, cefalea severa, ipertensione, o uno scompenso cardiaco congestizio. Nei casi di sovraccarico circolatorio possono essere rilevati alti livelli di peptide natriuretico cerebrale55, e tale esame pu essere utile per differenziare questi casi da quelli determinati dalla TRALI. Trattamento La sintomatologia migliora, in genere, quando si sospende la trasfusione, che non dovrebbe
essere ripresa fintanto che non si preso in considerazione il volume del sovraccarico. Pu essere utile mettere il paziente in posizione seduta. Sono spesso, indicati diuretici e ossigenoterapia e, qualora i sintomi non si attenuino, possono essere necessari interventi medici multipli, compreso il salasso. Prevenzione Salvo le condizioni di perdite rapide di sangue in corso, i pazienti anemici dovrebbero essere trasfusi lentamente, con particolare attenzione al bilancio idrico in entrata e in uscita. Pu essere di aiuto la somministrazione di diuretici prima e durante la trasfusione. Complicazioni indotte da trasfusioni massive Tra le numerose complicanze che si possono verificare nelle trasfusioni massive, le alterazioni metaboliche ed emostatiche costituiscono una particolare materia di discussione. Alcune o tutte le seguenti alterazioni metaboliche possono deprimere la funzionalit del ventricolo sinistro: lipotermia indotta dal sangue refrigerato, la tossicit da citrato, lacidosi lattica prodotta dallipoperfusione sistemica e dallischemia tessutale, spesso complicata dalliperpotassiemia. Si pu verificare, dopo trasfusioni massive, unalchilosi causata dal metabolismo del citrato ma, con ogni probabilit, non clinicamente significativa. I pazienti che hanno perdite di sangue rapide e massive possono avere patologie emostatiche preesistenti o coesistenti, oppure svilupparle durante la rianimazione. Le anormalit emostatiche possono comprendere la coagulopatia da emodiluizione, la CID e disfunzioni epatiche e piastriniche. Tossicit da citrato Fisiopatologia e manifestazioni . Quando vengono trasfusi rapidamente grandi volumi di plasma fresco congelato, di sangue intero o di piastrine, specialmente in presenza di una patologia epatica, i livelli di citrato nel plasma possono elevarsi, legando il calcio ionizzato e determinando dei sintomi. Il citrato viene
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rapidamente metabolizzato, cos queste manifestazioni sono comunque transitorie56. Lipocalcemia pu pi facilmente causare manifestazioni cliniche nei pazienti sotto shock oppure in ipotermia. Le procedure di aferesi prolungate espongono i pazienti, e occasionalmente anche i donatori di sangue, a qualche rischio. Lex-sanguino trasfusione, particolarmente nei neonati sottopeso e gi malati, richiede di fare la massima attenzione a tutti gli elettroliti. Una riduzione del calcio ionizzato determina un incremento delleccitabilit neuronica inducendo, nei pazienti svegli o nei donatori sottoposti ad aferesi, sintomi di formicolio periorale e periferico, tremore e una leggera confusione mentale, seguiti da una diffusa sensazione di vibrazione, da sintomi di tetania, quali crampi muscolari, contrazioni fascicolari, spasmi e nausea. Per quanto riguarda il sistema nervoso centrale, si ritiene che lipocalcemia incrementi la sensibilit alla CO2 dei centri respiratori, determinando uniperventilazione. Poich la contrazione miocardica dipende dal movimento intracellulare del calcio ionizzato, lipocalcemia deprime anche la funzionalit cardiaca57. Trattamento e prevenzione. I pazienti trasfusi pesantemente, in particolare quelli con severe patologie epatiche, oppure sottoposti a procedure rapide di aferesi come nella raccolta di cellule ematopoietiche progenitrici dal sangue periferico, possono trarre beneficio dal ripristino del calcio. Si deve osservare, tuttavia, che la terapia del ripristino del calcio che veniva eseguita empiricamente negli anni passati, prima che fosse disponibile un accurato monitoraggio del calcio ionizzato, stata associata a casi di mortalit iatrogena58. Comunque, di solito, a meno che il paziente o il donatore non presentino una condizione predisponente che impedisca il metabolismo del citrato, lipocalcemia indotta dalleccesso di citrato non richiede altro trattamento oltre a quello di ridurre la velocit di infusione. Il calcio, comunque, non deve mai essere aggiunto direttamente nel contenitore di sangue perch ne provocherebbe la coagulazione.
Ipotermia Fisiopatologia e manifestazioni. Nei pazienti che ricevono una rapida infusione di grandi volumi di sangue refrigerato possono verificarsi aritmie ventricolari, che possono essere prevenute pre-riscaldando il sangue59. Si presume che gli effetti negativi del sangue refrigerato siano verosimilmente pi marcati se il sangue viene somministrato con cateteri centrali posizionati in prossimit del sistema cardiaco di conduzione60. Lipotermia incrementa la tossicit cardiaca causata dallipocalcemia o delliperpotassiemia, che possono determinare una riduzione delle prestazioni del ventricolo sinistro. Altre complicanze determinate dallipotermia possono comportare uno squilibrio nellemostasi61 e un aumento della suscettibilit a contrarre infezioni sulle ferite62. Il pre-riscaldamento del sangue , quindi, una necessit durante la trasfusione massiva di sangue refrigerato. Trattamento e prevenzione. Laritmia indotta dallipotermia viene ridotta evitando uninfusione rapida di sangue freddo nellatrio cardiaco. Gli effetti generalizzati dellipotermia possono essere prevenuti utilizzando dei pre-riscaldatori di sangue. Gli Standard AABB per le Banche de Sangue e per i Servizi Trasfusionali dispongono che i pre-riscaldatori di sangue abbiano una temperatura monitorata e un sistema di allarme per rilevarne leventuale malfunzionamento, prevenendo lemolisi 17(p6) . Lattenzione nellapplicare il protocollo appropriato costituisce un elemento critico durante luso dei pre-riscaldatori del sangue trasfusionale, perch una temperatura eccessiva distrugge gli eritrociti e ha causato decessi5 . Iperpotassiemia e ipopotassiemia Fisiopatologia. Quando i globuli rossi vengono conservati a temperature comprese tra 1 C e 6 C, il livello di potassio nel plasma o nelle soluzioni additive aumenta. Bench la concentrazione nella porzione plasmatica/ anticoagulante di ununit di globuli rossi possa essere elevata (vedi Capitolo 8) a causa del piccolo volume di liquido, il carico totale di potassio extracellulare nellunit trasfusionale inferiore a
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0,5 mEq per ununit appena prelevata e di soli 5-7 mEq per le unit alla data di scadenza. Questo determina raramente dei problemi di iperpotassiemia nel ricevente per la rapida diluizione nel circolo, la ridistribuzione tra le cellule, e lescrezione. Lipopotassiemia viene probabilmente rilevata con maggiore frequenza63, perch i globuli rossi, impoveriti di potassio, ripristinano livelli intracellulari di questo ione, e il metabolismo del citrato causa lo spostamento intracellulare del potassio in risposta al consumo di protoni. Liperpotassiemia pu costituire un problema nei pazienti affetti da insufficienza renale, nei neonati prematuri e nei neonati che ricevono trasfusioni relativamente massive, come durante degli interventi cardiochirurgici o nelle ex-sanguino trasfusioni; a parte questo, liperpotassiemia pu essere dimostrata solamente come effetto transitorio che si verifica nelle trasfusioni eseguite molto velocememte. Trattamento e prevenzione. Di solito, non necessario alcun trattamento n una strategia preventiva, prestando al paziente una rianimazione adeguata a qualsiasi situazione sia stata determinata da una trasfusione massiva63. Per trasfusioni che comportino la somministrazione di grandi volumi di sangue in infanti malati o in adulti a rischio, molti professionisti preferiscono utilizzare globuli rossi che non abbiano un periodo di conservazione superiore a 5-14 giorni, oppure eritrociti lavati. Tuttavia, per i neonati che ricevono modesti volumi trasfusionali, somministrati lentamente, possono essere utilizzate in sicurezza le unit di sangue fino alla loro data di scadenza64. Non sussiste alcuna prova che le emazie utilizzate nella routine trasfusionale richiedano manipolazioni per abbassare il livello di potassio, persino nei pazienti privi di funzione renale. Coagulopatia nella trasfusione massiva Fisiopatologia. Linsorgenza di una coagulopatia in corso di trasfusioni massive costituisce materia di grande preoccupazione. Classicamente, questa coagulopatia viene attribuita allemodiluizione delle piastrine e dei fattori della coagulazione che si verifica, comportando la perdita dellattivit
emostatica nel sangue del paziente. La perdita di sangue inizialmente viene compensata con trasfusioni di concentrati eritrocitari e linfusione di liquidi non ematici. Le classiche ricerche, condotte da strutture militari65 e civili66, su pazienti politraumatizzati che hanno ricevuto sangue intero conservato, evidenziano un progressivo incremento della frequenza di un sanguinamento microvascolare che caratteristico di una coagulopatia, in progressivo incremento con le trasfusioni e che si verifica, tipicamente, dopo la sostituzione di due o tre volte il volume della massa circolatoria del paziente (da 20 a 30 unit di sangue intero). Sebbene il conteggio delle piastrine, i tempi di coagulazione e i livelli di alcuni fattori della coagulazione siano tutti correlati direttamente con il volume di sangue trasfuso, diversamente da quanto ci si attenderebbe da un semplice modello basato sulla emodiluizione, le correlazioni sono pesantemente caratterizzate da una variabilit incredibile. Il controllo dei parametri di laboratorio nei pazienti che stanno sviluppando una diatesi emorragica, cos come la risposta a varie componenti emostatiche, indicano che il deficit piastrinico molto pi importante, come causa preminente di sanguinamento, di quanto possa esserlo la carenza dei fattori della coagulazione. Il sanguinamento microvascolare si verifica, tipicamente, quando il conteggio piastrinico scende al di sotto di 50.000-60.000/L. Ma, daltra parte, nessuna semplice correlazione pu essere stabilita tra gli esami emostatici di un paziente e lesordio del sanguinamento. Studi successivi hanno ridefinito queste osservazioni. Si dimostrata una significativa disfunzionalit piastrinica nei pazienti politraumatizzati massicciamente trasfusi67,68. Negli studi di Counts e collaboratori66,69, i bassi livelli di piastrine e di fibrinogeno risultavano pi predittivi dellimminente perdita delle capacita emostatiche di quanto non lo fosse un allungamento del tempo di protrombina (TP) o di quello di tromboplastina parziale (TTP), indicando che una coagulopatia da consumo era un importante fattore addizionale dellemodiluizione. Conclusioni analoghe sono state ottenute da
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Harke e Rahman70, che hanno dimostrato che il livello delle piastrine e quello delle anormalit emostatiche erano correlate con la lunghezza del periodo di tempo nel quale il paziente permaneva in condizioni di ipotensione. Indagini condotte su gruppi di pazienti che avevano ricevuto analoghi volumi trasfusionali, hanno indicato, inoltre, che la causa preminente era la CID, determinata dallo shock. Riunendo queste osservazioni, Collins71 ha concluso che la coagulopatia nei pazienti pesantemente trasfusi determinata dallipoperfusione e non dalle trasfusioni. Questi rilievi non possono essere applicati anche a quei pazienti che sono sottoposti a trasfusioni massive nellambiente asettico di una sala operatoria, dove lipotensione, dovuta a perdite del volume ematico, viene costantemente prevenuta. Nellambiente chirurgico, i livelli dei fattori della coagulazione possono effettivamente avere una priorit sui problemi piastrinici72. Trattamento e prevenzione . Il modello dellemodiluizione, correlato con linsorgenza della coagulopatia durante le trasfusioni massive, dovrebbe indicare che il ripristino profilattico delle componenti emostatiche, basato sui volumi trasfusi di emazie o di sangue intero, sarebbe in grado di prevenire lo sviluppo di una diatesi emorragica. Tuttavia, studi prospettici hanno concretamente dimostrato che questo regime non efficacemente operativo 73 a causa della variabilit dei pazienti. Viceversa, il ripristino delle piastrine e dei fattori della coagulazione nei pazienti politraumatizzati, o in quelli chirurgici, sottoposti a trasfusioni massive, deve essere basato sulla caratterizzazione della carenza specifica con il conteggio delle piastrine, lesecuzione del TP (espresso come rapporto internazionale normalizzato), del TTP attivato e la determinazione dei livelli di fibrinogeno. La tromboelastografia pu anchessa essere utile. essenziale, comunque, che il laboratorio completi rapidamente gli esami. La terapia empirica con piastrine e/o plasma pu essere iniziata immediatamente dopo il prelievo dei campioni. Embolia gassosa Lembolia gassosa si pu verificare se il sangue
viene infuso sotto pressione in un sistema aperto o se entra dellaria in un catetere centrale, mentre vengono sostituiti i contenitori oppure i set per la somministrazione del sangue. Questo evento stato associato anche allimpiego dei sistemi di recupero intra-operatorio e perioperatorio del sangue, che possono consentire limmissione di aria nella sacca di infusione7. Il volume minimo di embolia gassosa che pu potenzialmente risultare letale per un adulto di circa 100 mL74. I sintomi comprendono tosse, dispnea, dolore toracico e shock. Se si sospetta unembolia gassosa, il paziente deve essere posto sul lato sinistro con la testa abbassata, per spostare la bolla daria dalla valvola polmonare. Qualche volta viene tentata laspirazione dellaria. Tuttavia, limpiego appropriato delle pompe di infusione, dellequipaggiamento per il recupero del sangue o nelle procedure dellaferesi e degli accoppiatori dei set sempre essenziale per prevenire questa complicanza.
Valutazione di una sospetta reazione trasfusionale acuta

Il ruolo del personale clinico che assiste il paziente Il personale medico che assiste il paziente , di solito, il primo a sospettare che si stia verificando una reazione trasfusionale ed il primo ad entrare in azione. Le azioni appropriate devono essere specificate nel manuale delle procedure istituzionali per la cura del paziente e il personale del Servizio Trasfusionale deve essere preparato ad agire per consulenze: 1. se si sospetta una reazione trasfusionale, la trasfusione deve essere interrotta per limitare il volume del sangue infuso; 2. si devono verificare tutte le etichette, i documenti di accompagnamento e lidentificazione del paziente per accertare che lemocomponente trasfuso fosse quello assegnato a quel ricevente; 3. una via di accesso endovenoso deve essere mantenuta pervia con soluzione salina
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isotonica (0,9% cloruro di sodio), almeno fino a quando non sia stata conclusa una valutazione medica del paziente; 4. il Servizio Trasfusionale ed il medico del paziente devono essere immediatamente avvertiti. Un medico responsabile deve valutare il paziente per stabilire se sussiste la possibilit di una reazione trasfusionale, di quale tipo possa essere e quali azioni immediate debbano essere intraprese. Le possibilit di una RTE acuta, anafilattica, settica e di TRALI devono essere tenute presenti, perch queste condizioni richiedono una gestione medica aggressiva e devono essere prontamente riferite al laboratorio; 5. Se gli eventi rilevati sono limitati a una reazione orticarioide o a un sovraccarico circolatorio, il Servizio Trasfusionale non necessita, per gli accertamenti, di un prelievo post-trasfusionale. Se vi sono segni o sintomi al di l di una reazione orticarioide o di un sovraccarico circolatorio, specialmente se sussiste una qualsiasi possibilit di RTE, di anafilassi, di TRALI, di sepsi indotta dalla trasfusione o di altri problemi gravi, dovr essere inviato al laboratorio, per le pertinenti valutazioni, un prelievo di sangue successivo alla reazione. Il campione deve essere accuratamente prelevato, per evitare unemolisi meccanica ed essere adeguatamente etichettato. Inoltre, il contenitore della trasfusione, con qualunque residuo rimasto, il set trasfusionale utilizzato per la somministrazione (senza lago), e le annesse soluzioni endovenose devono essere inviate al laboratorio, seguendo le precauzioni standard. In alcuni casi, potr essere necessario un campione di urine prelevato dopo la reazione. Il ruolo del laboratorio Quando possibile sia intervenuta unemolisi, il laboratorio deve eseguire al pi presto tre passaggi, dopo aver ricevuto la comunicazione e il materiale clinico: controllare per eventuali errori di identificazione, verificare visivamente i campioni per lemolisi e verificare lesistenza di
unincompatibilit gruppoematica, eseguendo un test allantiglobulina diretto (TAD) e riconfermando il gruppo ABO del ricevente. Alcuni laboratori non seguono questa sequenza operativa, quando le sole manifestazioni cliniche sono costituite da reazioni orticarioidi o febbrili in seguito alla trasfusione di concentrati piastrinici ABO compatibili. Controllo per lidentificazione di errori Lidentificazione di ogni campione del paziente e di ogni emocomponente deve essere controllata per lesistenza di eventuali errori. Se viene rilevato un errore, il medico del paziente o un altro professionista responsabile delle cure per il paziente deve essere immediatamente informato, e deve essere iniziata una ricerca delle registrazioni appropriate per determinare quale errore di identificazione o risultato scorretto o campione errato o emocomponente consegnato possono mettere a rischio altri pazienti. Solo dopo il superamento della crisi acuta, ogni passo del processo trasfusionale dovr essere rivisto per identificare lorigine dellerrore. Controllo visivo per lemolisi Il siero o il plasma di un campione di sangue prelevato dopo una reazione deve essere ispezionato per evidenziare unemolisi ed essere confrontato con un campione precedente alla reazione, qualora disponibile. Una colorazione rosea o rossa posteriore, ma non antecedente alla reazione, indica la distruzione di globuli rossi ed il rilascio di emoglobina libera. Lemolisi intravascolare di una piccola quantit di emazie, pari a 2,5 mL, pu produrre una emoglobinemia visibile75. Lemolisi prodotta da una maldestra tecnica di prelievo o da altri interventi medici, pu determinare unemoglobinemia: se si sospetta un campionamento eseguito scorrettamente, lesame di un secondo campione pu risolvere il problema. La mioglobina, rilasciata da un muscolo lesionato, pu anchessa determinare una colorazione rosea o rossa del plasma e dovrebbe essere sospettata se il paziente ha sofferto di un grave trauma o di lesioni muscolari76(p369). Se il campione non viene prelevato entro 5-7
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ore da un episodio di emolisi acuta, possono essere presenti nel torrente circolatorio i prodotti di degradazione dellemoglobina, particolarmente la bilirubina, e determinare una colorazione gialla o marrone del plasma. Lincremento della bilirubina pu iniziare presto, anche dopo una sola ora dalla reazione, presentare il picco a 5-7 ore, e scomparire dopo 24 ore, qualora la funzionalit epatica sia normale. Nellesame di un campione di urine dopo la reazione, importante differenziare tra ematuria (globuli rossi intatti presenti nelle urine), emoglobinuria (emoglobina libera nelle urine) e mioglobinuria (mioglobina libera nelle urine). Nelle RTE acute, lemoglobina libera, rilasciata degli eritrociti danneggiati, pu superare i glomeruli renali e diffondersi nelle urine, ma lematuria e la mioglobinuria non sono correlate a questi eventi. Lesame delle urine deve essere eseguito sul liquido sopranatante dopo aver centrifugato un campione fresco appena prelevato; si pu verificare uninterpretazione errata se viene rilasciata emoglobina libera in un campione dove emazie, precedentemente integre, vengono emolizzate in vitro durante il trasporto o la conservazione del campione. Controllo sierologico per incompatibilit Deve essere eseguito un TAD su un campione di sangue prelevato dopo la reazione, preferibilmente scoagulato con un agente chelante (come lEDTA), per evitare la fissazione in vitro sui globuli rossi di proteine del complemento. Se il TAD risulta positivo dopo la reazione, deve essere eseguito un TAD sui globuli rossi del campione pre-trasfusionale (a meno che questo non sia stato precedentemente eseguito come parte dei test pre-trasfusionali) e devono essere confrontati i due esami. Se le emazie incompatibili sono state sensibilizzate dallanticorpo, ma non sono state immediatamente distrutte, il test successivo alla reazione sar verosimilmente positivo, frequentemente con un quadro di reattivit a campo misto. Se le emazie trasfuse sono state distrutte rapidamente, il TAD successivo alla reazione potr risultare negativo, specialmente se il campione viene prelevato molte
ore dopo levento. Se sia il prelievo pre- che quello post-reazione risultano positivi, sono necessari ulteriori accertamenti per escludere una incompatibilit. Il confronto dellintensit di reazione di questi due esami non costituisce un metodo affidabile per escludere unincompatibilit immunologica. Unemolisi non immunologica (per esempio da shock termico o da danneggiamento meccanico) determina unemoglobinemia, ma non un TAD positivo. Il gruppo ABO del ricevente deve essere confermato anche sul campione successivo alla reazione. Valutazioni aggiuntive del laboratorio Se qualcuno dei tre iniziali accertamenti ed esami (ricerca degli errori, ispezione visiva per lemoglobinemia, TAD e conferma del gruppo ABO) fornisce risultati positivi o sospetti, si deve perseguire approfonditamente la diagnosi di una RTE acuta. Anche se non viene trovato alcun errore, o nessuna evidente incompatibilit, la possibilit di una RTE acuta deve essere ancora presa in considerazione, quando la situazione clinica del paziente suggerisce questo tipo di reazione. Gli esami elencati qui di seguito sono utili per accertare la causa della RTE, se uno di questi risolve, o aiuta a chiarire, la situazione sierologica e immunologica del paziente nel quale la diagnosi non chiara. Alcuni di questi esami, o tutti, possono essere eseguiti seguendo un protocollo istituzionale scritto oppure a discrezione del medico del Servizio Trasfusionale. 1. Se la tipizzazione ABO e Rh del campione precedente e di quello successivo alla reazione non sono concordanti, si verificato un errore nellidentificazione del paziente o del campione, oppure nellesecuzione negli esami. Se un campione stato scambiato, o stato erroneamente etichettato, il campione di un altro paziente pu essere anchesso erroneamente etichettato; importante il controllo delle registrazioni di tutti i campioni ricevuti, approssimativamente, nello stesso periodo. 2. Eseguire la tipizzazione ABO e Rh sul sangue dellunit trasfusionale o di un segmento del tubo di prelievo connesso alla sacca.
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Se il sangue presente nel contenitore non del tipo ABO evidenziato nelletichetta, si verificato un errore nelletichettatura della sacca. 3. Eseguire un test di ricerca di anticorpi anticorpi irregolari sui campioni del paziente precedenti e successivi alla reazione, e sul sangue del donatore. Se viene scoperto un anticorpo precedentemente non rilevato, questo deve essere identificato. Una volta identificato lanticorpo, il campione di sangue dellunit che stata trasfusa al paziente deve essere esaminato per lantigene pertinente. Se un anticorpo precedentemente non rilevato presente in un campione dopo la reazione, ma non lo in un campione precedente alla reazione, la ragione pu essere: 1) un errore di identificazione del campione, 2) la produzione anamnestica di un anticorpo dopo una trasfusione recente o, meno probabilmente, 3) un anticorpo passivamente trasferito da unemocomponente trasfuso da poco tempo. Pu essere utile, quando viene riesaminato il campione precedente alla reazione, luso di tecniche che incremintano lintensit di reazione, come un aumento del rapporto siero-emazie, le soluzioni a bassa forza ionica, il polibrene, il polietilenglicole, oppure luso di tecniche enzimatiche. 4. Ripetere linterreazione con il campione precedente e con quello successivo alla reazione, eseguendo i test in parallelo e utilizzando la tecnica allantiglobuline. Una prova di compatibilit positiva, in contrasto con uno screening anticorpale negativo, pu indicare la presenza di un anticorpo specifico per un antigene a bassa frequenza. 5. Eseguire il TAD e la ricerca anticorpale su ulteriori campioni ottenuti a differenti intervalli dopo la reazione trasfusionale Un primo campione, subito dopo la reazione, pu avere livelli sierologici non rilevabili di un anticorpo clinicamente significativo, specialmente se tutte le molecole anticorpali sono adese alle emazie incompatibili trasfuse. In questo caso, il livello anticorpale incrementer rapidamente nel siero, ed il rilievo e lidentificazione
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dellanticorpo diventeranno possibili entro pochi giorni. Eseguire controlli frequenti del valore dellemoglobina del paziente, per stabilire in quale quantit si verifica latteso recupero terapeutico determinato dalle emazie trasfuse, oppure se si verifica un declino dopo un incremento iniziale. Nei pazienti con anemia falciforme, la sopravvivenza delle emazie trasfuse pu essere seguita con la valutazione dei livelli di emoglobina A. Per monitorare la sopravvivenza delle emazie trasfuse, sono state utilizzate, nei casi complicati, le differenze fenotipiche tra le emazie autologhe e quelle trasfuse, quantificandole con la citometria a flusso77. Sono stati utilizzati studi di sopravvivenza eritrocitaria in vivo per dimostrare la situazione eccezionale di una RTE acuta in assenza di un alloanticorpo rilevabile 78 . Quando il paziente viene fenotipizzato in preparazione di questi studi importante che il campione contenga esclusivamente i globuli rossi autologhi. Questo pu essere difficoltoso se il paziente ha ricevuto delle trasfusioni nelle settimane precedenti. Il Metodo 2.15 fornisce una tecnica utile per ottenere emazie autologhe da un paziente trasfuso di recente. Se un antigene presente sui globuli rossi del donatore ed assente su quelli del paziente, la sua presenza o la sua assenza nei campioni prelevati dopo la reazione indicano se le emazie trasfuse sono sopravvissute e permangono nel circolo del paziente. I marcatori dellemolisi, compresa la latticodeidrogenasi, la bilirubina non coniugata ed i livelli di aptoglobina, possono essere utili, particolarmente se sono disponibili i valori ottenuti sul campione precedente alla reazione e sui numerosi campioni prelevati dopo la reazione. Esaminare il sangue rimasto nellunit e nel set per linfusione per evidenziare lemolisi, specialmente se non pu essere dimostrata una causa immunologica dellemolisi. In relazione a quali e quante manipolazioni il
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sangue stato sottoposto quando stato somministrato, pu essere presente unemolisi nel contenitore e nel set di infusione, oppure solo nel set di infusione. Per esempio, se lunit stata scorrettamente riscaldata nel contenitore, sia il sangue del contenitore che quello presente nel set di infusione sar emolizzato. Se stato utilizzato un set di infusione difettoso durante la somministrazione del sangue, lemolisi potr essere rilevabile nel set di infusione ma non nel contenitore. Esami ulteriori possono essere utili per indagare le reazioni clinicamente significative ma non emolitiche. 1. Se la presentazione del caso indica una reazione anafilattica, esaminare il siero del paziente per la presenza di anticorpi anti-IgA. Dal dosaggio delle IgA, possono essere ottenute informazioni preliminari, perch i pazienti che presentano reazioni anafilattiche correlate con le IgA presentano, in maggioranza, deficit da IgA 27. Si deve osservare, tuttavia, che anticorpi specifici per le sottoclassi o per gli allotipi delle IgA possono essere prodotti da pazienti con normali livelli di IgA 26. Se sono necessarie ulteriori trasfusioni, le componenti cellulari possono essere lavate; nel caso venga richiesto plasma (o piastrine; vedi sopra), pu essere utilizzato plasma privo di IgA. 2. Esaminare la sacca restituita per ogni apparente anomalia, compresa la presenza di coaguli, di una colorazione tendente al marrone, di opacit, di torbidit o di un colore purpureo. Se la presentazione clinica della complicanza trasfusionale fa sospettare una setticemia batterica, deve essere eseguita una colorazione di Gram e lesame colturale della sacca, anche se laspetto dellunit trasfusionale normale. Lesame colturale deve essere eseguito anche sul sangue del paziente79. Il trattamento terapeutico per una sospetta contaminazione batterica deve essere basato su considerazioni di carattere clinico, perch un ritardo nella terapia pu esitare in una severa patologia o nella morte
del paziente. Il trattamento prevede limmediata somministrazione endovenosa di antibiotici ad ampio spettro, dopo aver ottenuto il prelievo di sangue e i materiali necessari per altri eventuali esami colturali, associata alla terapia per lo shock, se presente. 3. Se la sintomatologia clinica indica una TRALI, si deve esaminare il campione di sangue pre-trasfusionale del paziente e un campione di plasma del donatore per gli anticorpi anti-HLA e per quelli specifici per gli antigeni dei granulociti neutrofili. La prova di compatibilit tra i linfociti o i granulociti del ricevente con il siero del donatore coinvolto pu fornire una prova in supporto della diagnosi di TRALI.
Le conseguenze ritardate della trasfusione

Alloimmunizzazione contro antigeni eritrocitari Fisiopatologia Lalloimmunizzazione primaria, che evidenziata dalla comparsa di un nuovo anticorpo specifico per gli antigeni eritrocitari, diventa rilevabile dopo settimane o mesi dalla trasfusione. Si stimato che lalloimmunizzazione si verifichi nei riceventi immunocompetenti, non selezionati, con un rischio variabile dall1 all1,6% per ogni unit di globuli rossi, a condizione che ai riceventi D negativi siano state somministrate unit di emazie D negative. Sono stati pubblicati casi di reazione emolitica in situazioni di immunizzazione primaria, ma queste pubblicazioni sono controverse81 e, se anche si verifica, il fenomeno deve essere molto raro ed espresso solitamente a livello sub-clinico. Osservazioni sierologiche . Dopo che si verificata lalloimmunizzazione, gli anticorpi specifici per gli antigeni eritrocitari immunizzanti possono diventare non rilevabili, in particolare quelli del sistema Kidd. Unindagine ha riferito che questo si verifica, per il 29% degli anticorpi, dopo un tempo medio di 10 mesi82 e per il 41% degli anticorpi dopo 5 anni o pi83. Se successivamente
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si trasfondono eritrociti che esprimono lantigenebersaglio dellanticorpo, si verifica, comunque, una risposta anamnestica che pu determinare la comparsa, in un breve intervallo di ore, o di giorni, di anticorpi di classe IgG che reagiscono con le emazie trasfuse. In uno studio prospettico, alloanticorpi che non erano stati precedentemente rilevati sono stati osservati entro sette giorni dalla trasfusione in 58 di 2.082 (2,8%) riceventi (il 37% dei quali erano noti per pregresse trasfusioni e il 36% per precedenti gravidanze)84. In due dei 58 soggetti era positivo il solo TAD, ma, in tutti gli altri, la ripetizione dello screening anticorpale ha evidenziato un nuovo anticorpo. necessario uno studio condotto su un eluato ottenuto dalle emazie circolanti del paziente, perch lalloanticorpo pu essere presente sugli eritrociti, ma non essere ancora rilevabile nel suo siero. Se il laboratorio rileva una risposta di tipo anamnestico, sia il direttore del Servizio Trasfusionale che il medico curante del paziente devono essere informati e deve essere indagata la possibilit di una RTE ritardata (RTER). Reazioni ritardate. Nella maggioranza dei casi, la produzione di un anticorpo indotto dalla risposta anamnestica non determina unemolisi eritrocitaria rilevabile: si tratta di una reazione sierologica trasfusionale ritardata (RSTR)85. Tuttavia, in alcuni pazienti, si pu verificare unemolisi clinicamente evidente per la combinazione di livelli significativi di un anticorpo potenzialmente emolitico con un quantitativo rilevante di emazie trasfuse ancora presenti in circolo. Nello studio precedentemente citato, solo uno dei 58 riceventi con un nuovo anticorpo, prodotto entro 7 giorni dalla trasfusione, presentava evidenze cliniche di emolisi84. Questo conferisce una frequenza di 1 caso di RTER su 2.082 riceventi o di 1 caso su 11.328 unit di sangue trasfuse. Come ci si pu attendere, gli studi retrospettivi, con i quali si pu simulare lesperienza routinaria di un Servizio Trasfusionale, indicano una frequenza inferiore di RSTR, ma la frequenza dei casi di emolisi post-trasfusionale rilevabile pu essere, grossolanamente, equivalente 85-87 . La presentazione pi comune di una RTER la progressiva riduzione del livello di emoglobina e il
rilievo della positivit di un nuovo screening anticorpale, ma possono essere presenti febbre, leucocitosi e un leggero colorito itterico. Alcune RTER vengono rilevate per lassenza dellatteso incremento dellemoglobina dopo la trasfusione. Altri problemi clinici sono infrequenti; occasionalmente, viene osservata emoglobinuria, ma il blocco renale acuto raro. Tuttavia le RTER possono essere particolarmente problematiche nei pazienti che sono affetti da anemia falciforme. In questi pazienti, lemolisi pu interessare anche le emazie autologhe, con un fenomeno che viene indicato come sindrome da RTE delle emazie falcemiche (vedi Capitolo 24)88. Se si sospetta una RTER, deve essere esaminato un campione fresco di sangue del paziente per la ricerca degli anticorpi irregolari sia nel siero che con un TAD sui globuli rossi. Il rilievo di un nuovo alloanticorpo antieritrocitario specifico in un paziente trasfuso di recente, che presenta unemolisi, fortemente indicativo per una RTER e la diagnosi viene confermata dalla dimostrazione della presenza dellantigene, corrispondente allanticorpo, sulle emazie conservate del segmento di controllo di una o pi delle unit di emazie trasfuse. La tipizzazione antigenica delle emazie circolanti del paziente pu indicare quante emazie, ormai divenute incompatibili, sono state eliminate o in che quantit sono ancora presenti nel circolo del paziente. La ripetizione dello screening anticorpale sul campione di sangue del paziente precedente alla trasfusione escluder la possibilit di errori tecnici. Trattamento Raramente si rende necessario uno specifico trattamento, bench possa essere prudente il monitoraggio dellemissione delle urine e della funzionalit renale del paziente, oltre allosservazione di eventuali modifiche nella funzione emo-coagulativa. Se si rende necessaria unulteriore trasfusione, le emazie del donatore devono essere negative per lantigene corrispondente al nuovo anticorpo rilevato. Lemolisi indotta dai linfociti passenger, che pu essere osservata dopo il trapianto di un organo
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solido, una variante della RTER e viene discussa nel Capitolo 26. Prevenzione Le future trasfusioni per il paziente devono essere prive dellantigene responsabile della risposta anamnestica, anche nel caso in cui lanticorpo non sia pi rilevabile. Alcune strutture forniscono al paziente un documento, da portare con s e da presentare in occasione del ricovero in ospedale o di una trasfusione da eseguirsi in una differente struttura, per informare i medici della sua situazione clinica. al fine di prevenire questi problemi che gli Standard per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali dispongono la conservazione permanente delle registrazioni relative agli anticorpi clinicamente significativi e la revisione delle registrazioni precedenti prima di consegnare unit di globuli rossi per una trasfusione17(pp39,72). In prospettiva, la compatibilit antigenica preventiva pu evitare le RTER in gruppi selezionati di pazienti, particolarmente in quelli sofferenti di anemia falciforme (vedi Capitoli 21 e 24). 89 Autoanticorpi post-trasfusionali Occasionalmente, la trasfusione di globuli rossi allogenici e di piastrine stimola la produzione di autoanticorpi; in alcuni di questi pazienti, pu verificarsi unanemia emolitica o una trombocitopenia autoimmune90. Vedi Capitolo 20 per ulteriori particolari. Lalloimmunizzazione per gli antigeni dei leucociti e la refrattariet alle trasfusioni di piastrine Vedi Capitolo 16 e Capitolo 17. La Graft-versus-Host Disease associata alla trasfusione La GvHD associata alla trasfusione solitamente una complicanza trasfusionale immunologica con esito letale, determinata dallattecchimento e dalla proliferazione dei linfociti del donatore in un ricevente suscettibile91. Lattecchimento dei linfociti determina unaggressione immunologica contro i tessuti
dellospite, ivi comprese le cellule ematopoietiche, conducendo a una pancitopenia refrattaria con conseguente sanguinamento e con complicazioni infettive che costituiscono la causa principale di mortalit nei pazienti colpiti, che valutata dal 90 al 100% dei casi. La GvHD associata alla trasfusione (TA-GvHD) rara nei riceventi statunitensi, ed stata osservata quasi esclusivamente in pazienti immunocompromessi. Al contrario, oltre 200 casi di TA-GvHD sono stati pubblicati in Giappone92, con una incidenza che arriva a 1 caso su 660 nei pazienti sottoposti a interventi di chirurgia vascolare93. Lelevata omogeneit genetica della popolazione giapponese e luso frequente di sangue intero fresco da donatori consanguinei rappresentano, presumibilmente, la causa principale per la sorprendente frequenza di TA-GvHD in questa nazione. I dati dello SHOT14 dimostrano una significativa riduzione nella frequenza della TA-GvHD dopo lintroduzione generalizzata della leucodeplezione, ma, nonostante la leucodeplezione, si sono verificati due ulteriori casi. Nei primi tre anni di questo studio, la frequenza di TA-GvHD era approssimativamente di 1 caso per 600.000 emocomponenti cellulari trasfusi e, nei primi cinque anni, stata accreditata per un numero di decessi pi elevato rispetto a quelli causati dalle RTE acute e solo leggermente inferiore a quello determinato dalla TRALI. Fisiopatologia e manifestazioni La fisiopatologia della TA-GvHD complessa e non completamente compresa. Il meccanismo principale prevede la sopravvivenza dalleliminazione immunologica, da parte del sistema immunocompetente del ricevente, dei linfociti T del donatore che sono presenti in un emocomponente cellulare, con successiva proliferazione di queste cellule, che portano un attacco immunologico ai tessuti dellospite. I sintomi comprendono febbre, enterocolite, eruzioni cutanee, epatite, pancitopenia. Le manifestazioni cutanee iniziano, tipicamente, con impallidimento di alcune zone della pelle e, successivamente, da eritemi maculo-papulari sulla parte superiore del tronco, del collo, del palmo
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delle mani, della pianta dei piedi e dei lobi auricolari, che diventano confluenti, con ulteriori rilievi che variano dalledema a una vescicolazione diffusa. La biopsia della pelle evidenzia linfiltrazione del derma superiore da parte di cellule mononucleate e il danneggiamento dello strato basale delle cellule epiteliali. Lepatite si manifesta con un incremento dellalanina e dellaspartato aminotransferasi, della fosfatasi alcalina e della bilirubina. Lenterocolite determina anoressia, nausea e diarrea secretiva di oltre 3-4 litri al giorno. La pancitopenia associata a un midollo ipocellulare. I sintomi appaiono tipicamente entro 8-10 giorni dalla trasfusione ma possono manifestarsi, al pi presto, dopo 3 giorni o, al pi tardi, dopo 30 giorni. La diagnosi confermata dalla dimostrazione, mediante la tipizzazione HLA, della presenza di linfociti del donatore nel sangue periferico del paziente o nei suoi tessuti91. I fattori che determinano un rischio per la TA-GvHD in un determinato paziente comprendono: il fatto che il ricevente sia in condizioni di immunodeficienza, il grado di compatibilit HLA tra il donatore ed il ricevente e quale sia il numero ed il tipo di linfociti T trasfusi, capaci di replicarsi91. La TA-GvHD pu verificarsi anche in un ricevente immunologicamente normale se il donatore omozigote per un aplotipo HLA per il quale il ricevente eterozigote, per la cosiddetta affinit HLA a una-via e se lemocomponente contiene linfociti T vitali (quanto pi fresca lunit trasfusionale, tanto pi elevato il rischio). La cattiva funzionalit delle citochine, il reclutamento delle cellule dellospite nella reazione immune e il rilascio di mediatori biologici, in particolare dellossido di azoto, tutti giocano un ruolo nella patogenesi 94. interessante losservazione che la TA-GvHD non stata descritta nei pazienti affetti da AIDS. Trattamento e prevenzione stata tentato, ma con scarso successo, il trattamento della TA-GvHD con agenti immunosoppressivi cos che si rende necessaria la prevenzione. Lirradiazione degli emocomponenti cellulari del sangue il metodo
standard accettato per la prevenzione della TA-GvHD. La dose indicata dallFDA prevede un minimo di 25 Gy diretti al centro del contenitore e una dose minima di 15 Gy distribuita su tutte le altre parti95. Questo rende i linfociti T incapaci di replicarsi, senza alterare sostanzialmente la funzionalit dei globuli rossi, delle piastrine e dei granulociti. Gli Standard AABB per le Banche del Sangue ed i Servizi Trasfusionali richiedono lirradiazione di routine degli emocomponenti cellulari, ottenuti da unit prelevate a consanguinei del ricevente, e dei donatori che sono stati selezionati per la compatibilit HLA, accertata con la tipizzazione o con linterreazione17(p43). La politica trasfusionale deve definire gli altri gruppi di pazienti che devono ricevere degli emocomponenti cellulari irradiati e deve esistere una procedura che garantisca, una volta che un paziente sia stato classificato come soggetto esposto al rischio per la TA-GvHD, che tutti gli emocomponenti cellulari saranno irradiati fino a quando sar clinicamente necessario. I parametri pubblicati96 raccomandano, inoltre, lirradiazione degli emocomponenti per: 1) i riceventi di un trapianto (sia allogenico che autologo) di cellule staminali ematopoietiche (CSE), 2) i pazienti con patologie ematologiche candidati a un trapianto allogenico di CSE, 3) le trasfusioni intrauterine, 4) i neonati sottosti ad exsanguino trasfusione o allimpiego di membrane extracorporee di ossigenazione, 5) i pazienti con linfoma di Hodgkin e 6) i pazienti con immunodeficienza congenita. La TA-GvHD stata riferita anche in pazienti con leucemie linfoidi e mieloidi, con leucemia linfatica cronica (in particolare in quelli che ricevono fludarabina fosfato)91, con patologie ematologiche riguardanti i linfociti B, compresi i linfomi non-Hodgkin, il mieloma e la macroglobulinemia di Waldenstrm14, i neonati prematuri o sottopeso alla nascita senza immunodeficienze specifiche e i bambini in trattamento per neuroblastoma e per rabdomiosarcomi91. La porpora post-trasfusionale Fisiopatologia e manifestazioni Sebbene ne siano stati pubblicati oltre 200 casi, la porpora post-trasfusionale (PPT) un evento
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infrequente. Essa caratterizzata dal brusco esordio di una trombocitopenia severa (con conteggio delle piastrine solitamente inferiore a 10.000/L) e un tempo medio di insorgenza di 9 giorni dopo la trasfusione (limiti, 1-24 giorni)97. Gli emocomponenti che di solito provocano questa complicanza trasfusionale sono i concentrati eritrocitari o il sangue intero, ma la PPT e stata riferita anche dopo trasfusioni di concentrati piastrinici, di plasma e di globuli rossi scongelati e deglicerolizzati. Per la maggior parte, si tratta di pazienti gi trasfusi o con precedenti gravidanze. frequente una porpora umida (cio con sanguinamento) e possono verificarsi emorragie intracraniche letali. Il rapporto tra i pazienti affetti da PPT di cinque donne a un uomo e let media di 51 anni (limiti, 16-83). La maggior parte dei casi coinvolge pazienti privi del comune antigene piastrinico HPA-1a (ex Pl A1 ) (<2% della popolazione), in grado di produrre il corrispondente anticorpo. Tuttavia, limmunizzazione per lantigene HPA-1b viene rilevata nel 10% dei casi e altri anticorpi anti-piastrinici, compresi anticorpi HLA, sono stati ugualmente associati con la sindrome. La PPT di solito autolimitantesi, con un pieno recupero entro 21 giorni. Dal punto di vista storico, stato riferito che una percentuale, variabile dal 10% al 15% dei pazienti, muore per emorragia intracranica a causa della PPT; per questo motivo opportuno un trattamento terapeutico. Il motivo della distruzione delle piastrine autologhe del paziente, da parte di quello che appare essere un alloanticorpo anti-piastrinico, controversa. Sono stati proposti tre possibili meccanismi, che prevedono: 1) la formazione di immunocomplessi (fra gli anticorpi del paziente e gli antigeni solubili del donatore) che si fissano ai recettori Fc sulle piastrine del paziente e mediano la loro distruzione, 2) la conversione delle piastrine autologhe del paziente, negative per lantigenebersaglio, mediante antigeni solubili presenti nellemocomponente trasfuso e 3) una cross-reattivit degli anticorpi del paziente con le piastrine autologhe (per esempio, per la presenza di una componente autoanticorpale). Lultima di queste teorie quella che ha ricevuto il maggiore consenso.
Trattamento Poich la PPT presenta una remissione spontanea, il trattamento terapeutico pu apparire falsamente efficace. Spesso vengono somministrati steroidi, ma il loro ruolo controverso. Il plasmaexchange pu determinare, in 1 o 2 giorni, un aumento nel conteggio delle piastrine sino a 20.000/ L 98, ma la somministrazione di alte dosi di immunoglobuline endovena (IGIV) ha attualmente sostituito questa terapia98,99. Utilizzando le IGIV, il recupero nel conteggio piastrinico, attorno a dei valori di 100.000/L, viene solitamente ottenuto in 3-5 giorni. Come si verifica in altre patologie come nella porpora trombocitopenica immune, le IGIV sembrano bloccare la distruzione anticorpo-mediata delle piastrine bersaglio, sebbene il meccanismo di azione non sia stato ancora ben chiarito. Se vengono trasfuse piastrine non selezionate, il paziente pu presentare reazioni trasfusionali febbrili e, in unampia maggioranza dei casi, queste trasfusioni non si sono dimostrate efficaci. Nella PPT, possono essere utili piastrine antigene-negative, e, in associazione con le IGIV, attualmente realizzabile la remissione di questa patologia in un giorno 100,101 . Sfortunatamente, il tempo necessario per disporre di queste piastrine ne limita spesso lutilit. Dopo il recupero, alcuni Autori hanno indicato lopportunit che le trasfusioni successive dovrebbero essere eseguite con emoderivati prelevati da donatori privi dellantigene-bersaglio o, se questi non sono reperibili, con unit di piastrine lavate97. Effetti immunomodulanti della trasfusione Le trasfusioni sono note per la loro capacit di indurre un effetto che modula la risposta immune, sin dal 1973 per le osservazioni di Opelz e collaboratori 102 relative allaumento della sopravvivenza del trapianto renale nei pazienti trasfusi. Questo effetto benefico della trasfusione nellindurre la tolleranza immunologica, sollev il sospetto che la trasfusione potesse indurre anche effetti sfavorevoli in situazioni cliniche diverse da quelle del trapianto, compreso un incremento delle recidive post-operatorie di tumori solidi e di
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infezioni batteriche 103. Malgrado numerose indagini retrospettive e ampi studi prospettici, il significato clinico dellimmunomodulazione indotta dalla trasfusione e lutilit di eventuali strategie preventive, come la leucodeplezione degli emocomponenti trasfusi, permane controversa104,105. Sovraccarico di ferro Ogni unit di globuli rossi contiene circa 200 mg di ferro. I pazienti trasfusi cronicamente, in particolare quelli che presentano emoglobinopatie, hanno un progressivo e continuo accumulo di ferro e nessun mezzo fisiologico per la sua eliminazione. Laccumulo si verifica inizialmente nelle strutture reticolo-endoteliali, ma quando queste sono sature, si verifica un deposito nelle cellule parenchimali. La soglia per un danneggiamento clinicamente significativo determinata dallesposizione a pi di 50-100 unit di concentrati eritrocitari nellarco della vita di una persona che non presenta emorragie106. I depositi di ferro interferiscono con le funzioni del cuore, del fegato e delle ghiandole endocrine (per esempio, delle isole pancreatiche e della ghiandola pituitaria). Linsufficienza epatica e il cancro del fegato, il diabete mellito e la tossicit cardiaca sono i principali responsabili della morbilit e della mortalit di questi pazienti. Livelli elevati di ferritina indicano un incremento dei depositi marziali e il danno tessutale pu essere dimostrato con esami organo-specifici, come il livello degli enzimi epatici o quelli della funzionalit delle ghiandole endocrine (per esempio, con la determinazione della glicemia o dellormone tireo-stimolante). Il trattamento finalizzato alla rimozione del ferro senza ridurre lemoglobina circolante del paziente. Linfusione sottocutanea di desferoxamina, un agente chelante del ferro, mediante un dosatore automatico pu ridurre i depositi marziali in questi pazienti, ma la conduzione dellinfusione sottocutanea notturna mediante una pompa difficile e costosa, spesso con una scarsa collaborazione da parte dei malati. Nei pazienti trasfusione-dipendenti che presentano delle emoglobinopatie, lo scambio
eritrocitario pu minimizzare il sovraccarico addizionale di ferro e ne pu ridurre il carico totale107. stato studiato un chelante del ferro per somministrazione orale, ma non ancora disponibile negli Stati Uniti.
Le registrazioni delle complicanze trasfusionali

Ogni Servizio Trasfusionale deve conservare indefinitamente le registrazioni dei pazienti che hanno presentato complicanze trasfusionali o hanno sviluppato alloimmunizzazioni. Gli eventuali casi di contaminazioni del sangue devono essere riferiti alle strutture che hanno fornito le unit trasfusionali. Le registrazioni devono essere permanenti, ed essere consultate per prevenire che i pazienti che hanno presentato reazioni trasfusionali possano subire ulteriori conseguenze con le successive trasfusioni. Per esempio, un paziente con una storia di reazioni anafilattiche correlate con le IgA deve essere trasfuso con prodotti plasmatici privi di IgA. Unanamnesi di ripetute o gravi RTFNE deve comportare luso sistematico di emocomponenti cellulari leucodepleti. Come stato precedentemente discusso 82,83 , gli alloanticorpi specifici anti-eritrocitari possono, con il tempo, non essere pi rilevabili, cos che le pertinenti registrazioni devono essere conservate per poter assegnare del sangue compatibile e prevenire una RTER. Il controllo di routine dei risultati di esami precedenti, relativi alle tipizzazioni ABO e Rh, possono evidenziare un errore nellesecuzione delle analisi o nellidentificazione di un nuovo campione. Registrazione di pazienti con necessit particolari Oltre alle registrazioni delle reazioni trasfusionali, i Servizi Trasfusionali devono mantenere quelle relative ai pazienti che necessitano di particolari preparazioni o manipolazioni degli emocomponenti. Questo particolarmente importante nelle strutture nelle quali i medici si avvicendano frequentemente, e
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la necessit per lirradiazione, la leucodeplezione, o degli emocomponenti provi di IgA, possono non essere noti al medico che compila una richiesta individuale. Relazione sulle trasfusioni con esito letale Quando si conferma che una complicanza dovuta alla trasfusione di sangue ha comportato un esito letale, ci deve essere al pi presto (comunque, entro 7 giorni) riferito al Direttore, allUfficio delle Conformit, al Centro FDA per la Valutazione Biologica e la Ricerca, mediante un rapporto scritto (vedi Capitolo 28 per il trasferimento delle informazioni). I pazienti che si trovano in condizioni critiche e sono prossimi al decesso, ricevono spesso trasfusioni in stretta prossimit temporale con la morte e si possono sollevare, in alcune occasioni, dei sospetti clinici di causa-effetto. La stragrande maggioranza di questi decessi non correlata con la trasfusione, ma se sussiste il sospetto che la trasfusione possa aver contribuito alla morte del paziente, pu essere prudente condurre unindagine. In assenza di errori, come la somministrazione di sangue ABO incompatibile o di eventi fisiologici chiaramente attribuibili allemolisi acuta, allanafilassi, alla TRALI o alla sepsi, altamente improbabile che la trasfusione possa essere direttamente causa del decesso. La revisione del caso deve, comunque, comprendere tutte le registrazioni mediche e di laboratorio reperibili e i risultati dellautopsia, quando viene eseguita. Daltra parte, se unindagine dovesse evidenziare la prova o la possibilit di unemolisi, di unanafilassi, di eventi polmonari, di una setticemia inspiegabile o di registrazioni ambigue relative allidentificazione, il caso pu giustificare inchieste pi approfondite.
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Capitolo 28: Le malattie trasmesse con la trasfusione
Capitolo 28
Le malattie trasmesse con la trasfusione
Sono stati realizzati molti progressi negli esami del sangue per la diagnosi delle malattie trasmissibili con le donazioni di sangue. Tuttavia, il rischio della trasmissione di patologie virali, batteriche e parassitarie esiste ancora e nuovi agenti patogeni possono comparire in ogni momento. Per questo, le complicanze infettive della trasfusione restano un importante argomento di attenzione per la Medicina Trasfusionale.
Lepatite
Lepatite uninfiammazione del fegato che pu essere causata da numerose tossine, da processi immunologici oppure da agenti infettivi. Lepatite correlata alla trasfusione quasi esclusivamente determinata da virus. Questi virus comprendono quelli classificati dallepatite A fino alla E (HAV, HBV, HCV, HDV, HEV), il citomegalovirus (CMV), il virus di Epstein-Barr (EBV) e nuovi virus recentemente descritti come possibili responsabili di epatite (come il TTV e il SEN-V). Gli agenti infettivi costituiscono una seria minaccia per i riceventi, se persistono nel circolo di donatori di sangue asintomatici, e sono in grado di causare nei riceventi malattie acute o croniche di rilevanza clinica. Nel passato la maggior parte delle epatiti posttrasfusionali era attribuibile ai virus HBV e HCV, entrambi in grado di determinare nei donatori un quadro stabile di portatore caratterizzato da un elevato titolo viremico in assenza dei sintomi clinici. I virus HBV ed HCV sono anche
responsabili della morbilit epatica a lungo termine e della connessa mortalit1,2. Questi virus vengono esaminati dettagliatamente di seguito. LHAV e lHEV sono virus vengono trasmessi per via gastro-enterica e circolano transitoriamente nel sangue durante la fase acuta dellinfezione. Poich il soggetto viremico di solito clinicamente ammalato, e non quindi un candidato per la donazione, gli HAV e gli HEV non costituiscono una seria minaccia per i riceventi. Tuttavia, la viremia da HAV pu essere presente fino a 28 giorni prima dello sviluppo della sintomatologia: casi isolati di trasmissione virale sono stati segnalati a seguito di trasfusione di emocomponenti cellulari3 e di concentrati di Fattore VIII4. Poich manca di un involucro lipidico lHAV , non viene inattivato dal trattamento con solventi/detergenti; per questo sono in corso di sviluppo ulteriori metodi di inattivazione per prevenire la ricorrenza di questi episodi. LHEV raro negli Stati Uniti e nessun caso di trasmissione del virus correlata alla trasfusione vi mai stato documentato. LHDV, indicato come agente delta, pu causare infezioni e gravi epatiti a seguito di trasfusioni o di altro tipo di esposizioni parenterali. Tuttavia, poich lHDV un virus difettivo rilevato solo nei portatori di HBV, lo screening dei donatori per linfezione da HBV elimina simultaneamente il rischio per lHDV5. LHGV, detto anche GBV-C, lontanamente imparentato con lHCV e ha unampia diffusione (>1%) tra i donatori asintomatici. LHGV inequivocabilmente trasmissibile con
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la trasfusione6, ma non mai stata stabilita una relazione causale tra HGV ed epatite o altre manifestazioni di malattia, nonostante ampi studi condotti in merito. l TTV appare simile allHGV per frequenza, trasmissibilit e assenza di rilevanza clinica. Per questo motivo, lo screening dei donatori di sangue per HGV o TTV non viene raccomandato correntemente. Lepatite associata al CMV o allEBV di solito moderata, senza quadri severi di immunosoppressione. La frequenza e la gravit di queste epatiti non giustifica quindi ladozione routinaria di misure di screening7. Il SEN-V stato associato, in uno studio, ad unepatite posttrasfusionale non A/non E8, tuttavia non stata accertata alcuna associazione casuale, n il SENV risultato associato ad altre epatiti croniche non A/non E. Il SEN-V appare lontanamente simile al TTV e appartiene ad una famiglia di piccoli virus con DNA circolare che vengono indicati come Circoviridae. Lo screening per questi agenti non viene correntemente raccomandato perch non sono state accertate associazioni con quadri patologici. Le manifestazioni cliniche dellepatite La maggior parte degli individui che contraggono uninfezione da HBV o HCV presentano uninfezione primaria subclinica senza chiari sintomi o evidenza di malattia. Altri sviluppano unepatite evidente con ittero, nausea, vomito, disturbi addominali, faticabilit, urine scure ed aumento degli enzimi epatici. I segni ed i sintomi di solito regrediscono spontaneamente. Lepatite acuta di tipo C tende ad essere pi moderata di quella di tipo B. Sporadicamente il decorso clinico dellHBV, e pi raramente quello delle infezioni da HCV, pu essere complicato da unepatite fulminante. Pi frequente la tendenza dellepatite C ad evolvere in epatite cronica (dal 75% all85% degli individui affetti), con un numero significativo di casi che evidenziano una progressione a lungo termine verso la cirrosi, linsufficienza epatica o in carcinoma epatocellulare. Lepatite A tende ad essere clinicamente moderata in soggetti altrimenti in buona salute e non nota per progredire verso lepatite cronica o uno stato di portatore cronico9.
Linfezione HEV pu determinare una malattia severa nelle donne in gravidanza 10 . La vaccinazione disponibile per lepatite di tipo A e per lepatite B, mentre le immunoglobuline specifiche per lepatite B si sono dimostrate efficaci per la profilassi dopo unesposizione a rischio di contagio, cos come il siero iperimmune per lepatite A. I portatori cronici di HBV Dopo uninfezione iniziale da HBV, una parte dei pazienti non riesce ad eliminare il virus dal sangue e diventa portatore cronico per molti anni o per tutta la vita. I portatori cronici di HBV, oltre alle particelle virali infettive, producono grandi quantit di proteine dellinvolucro, non infettive, che sono rilevate negli esami per gli antigeni di superficie dellepatite B (HBsAg). Il rischio di diventare un portatore di HBsAg fortemente dipendente dallet: 5% dei soggetti infettati con lHBV da adulti diventano portatori cronici di HBsAg, mentre 95% guariscono completamente e sviluppano un anticorpo protettivo contro lHBsAg (anti-HBs). Al contrario, prima che fosse introdotta di routine la somministrazione profilattica delle immunoglobuline e limmunizzazione, il 90% ed oltre dei neonati infettati nel periodo perinatale diventavano portatori cronici ed erano esposti al rischio di progressione verso la cirrosi ed il carcinoma epatocellulare. Secondo le stime dellOrganizzazione Mondiale della Sanit, il numero dei portatori di HBsAg approssimativamente di 400 milioni in tutto il mondo11, con una prevalenza fino al 10% in alcune nazioni asiatiche, da 0,1 a 0,5% nella popolazione generale degli Stati Uniti e da 0,02 a 0,04% tra i donatori di sangue statunitensi. Una piccola percentuale (<10%) dei portatori di HBsAg sviluppa dei sintomi clinici come linsufficienza epatica, la cirrosi o il carcinoma epatocellulare. I portatori cronici di HCV I soggetti che si sono inizialmente infettati con lHCV diventano, per la maggior parte, portatori cronici e il 75-85% di essi mantiene lHCV RNA nel siero e nel fegato per anni o decenni. Almeno il 50% di questi portatori di HCV
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presentano levidenza biochimica ed istologica di uninfiammazione epatica cronica12. Nonostante questo processo infiammatorio cronico, la maggior parte degli individui infetti resta asintomatica. Durante i primi 20 anni dopo linfezione, lHCV di solito indolente ed associato con una bassa mortalit e morbilit. Uno studio ha documentato che le persone con una malattia epatica a livello clinico rappresentano circa il 10% del totale dei soggetti infettati13. Il rischio relativo alla frequenza con cui lepatite cronica possa, di per s, evolvere in cirrosi epatica sconosciuto, ma si ritiene che lalcool possa giocare un ruolo sinergico nellesacerbare lepatite cronica di tipo C. LHCV post-trasfusionale nei bambini che si sono infettati dopo interventi di chirurgia cardiaca sembra risolversi con una frequenza maggiore rispetto a quanto rilevato per gli adulti, presentando una infezione moderata dopo almeno 20 anni di controlli periodici14. Le raccomandazioni per la gestione clinica delle persone con linfezione cronica da HCV sono state sviluppate da una consensus conference del National Institutes of Health15 e sono state arricchite ed ampliate successivamente da altri autori. 16 I marcatori di infezione virale Gli esami di laboratorio possono identificare i marcatori di uninfezione pregressa o in atto per lHBV e lHCV che risultano utili ai fini dello screening e della diagnosi. La Tabella 28.1 elenca i marcatori molecolari e sierologici comunemente utilizzati per la diagnosi di epatite. La Figura 28.1 illustra landamento dei risultati degli esami tipici dei soggetti con uninfezione acuta da HBV che si risolve. Il periodo intercorrente tra lesposizione allHBV e linsorgenza dei marcatori dellinfezione nel sangue (HBV DNA o HBsAg) di solito di circa 6 settimane3,9. Il DNA dellHBV rilevabile con la tecnica dellamplificazione di acidi nucleici (NAT) mediante pool il primo marcatore che si evidenzia, seguito dallHBsAg. Il test NAT in singolo (ID-NAT) in grado di rilevare il DNA HBV circa 19 giorni prima di quello evidenziabile in un minipool NAT (MP-NAT)17. Lanticorpo specifico per la proteina del core dellHBV (anti-HBc) di solito compare diverse settimane dopo, prima
come IgM e poi come IgG. La scomparsa dellHBsAg e la comparsa dellanti-HBs indicano la risoluzione dellinfezione. Tuttavia, stato pubblicato un caso con esito letale dopo la riattivazione dellHBV in un paziente, trattato con rituximab, che era risultato precedentemente reattivo per lanti-HBs 18. Lo specifico virus presentava mutazioni multiple nei principali siti antigenici ed era stato ipotizzato che fosse riuscito a sfuggire allimmunit endogena del paziente. Due ulteriori marcatori dellHBV, lHBeAg oppure il suo anticorpo (anti-HBe), sono utili per la diagnosi e la prognosi, ma non vengono utilizzati per lo screening dei donatori. Un individuo HBsAgpositivo asintomatico pu trovarsi o nella fase precoce di uninfezione acuta da HBV (senza antiHBc o con le IgM anti-HBc), oppure essere un portatore cronico di HBV (con le IgG anti-HBc). Le particelle di HBsAg vengono prodotte in eccesso durante linfezione acuta o cronica; il sangue di un individuo con in circolo lHBsAg pu infettare altri individui. Gli attuali test immunologici rilevano approssimativamente da 0,2 a 0,7 ng/mL di HBsAg oppure 3 x 107 particelle3. Il numero delle particelle di HBsAg nella maggior parte delle infezioni acute o croniche supera questo livello, ma stata descritta la trasmissione dellHBV da parte di donatori risultati HBsAg sieronegativi. Gli esami NAT permettono di rilevare fino a meno di 10 copie genomiche di DNA dellHBV. La validit del NAT per indagare i donatori sieronegativi che sono infettati con lHBV in corso di valutazione ma pu essere di impiego limitato per lelevata sensibilit degli esami che vengono attualmente utilizzati per lHBsAg e per la lenta crescita dei livelli di DNA HBV, diversamente dallHIV e dallHCV. possibile che leffettivo riscontro dei donatori risultati sieronegativi, ma in realt infetti per lHBV, richieder lesame NAT a livello di singola donazione 19. I vaccini per lHBV contengono le proteine HBsAg non infettanti che possono determinare dei falsi positivi nei risultati dei test di screening per lHBsAg per pochi giorni dopo linoculazione. Gli anticorpi protettivi risultanti dalla vaccinazione sono specifici solo per lHBsAg e la vaccinazione non determina la produzione di anticorpi anti-HBc.
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Tabella 28.1 - Gli esami molecolari e sierologici nella diagnosi dellepatite virale Virus HBV DNA + + + +/ +/ HDV RNA + RNA HBsAg + + + HBsAg + Reattivit dei test Anti-HBc Totale +/ + + + + + Anti-HBc + + IgM +/ + + Anti-HBs + + Anti-HBs + Antigeni ricombinanti (RIBA) 5-1-1 c100-3 Non disponibile + + c33c c22-3 Probabile infezione HCV acuta o cronica (se lRNA positivo) Falso positivo Probabile falso positivo (se lRNA negativo); possibile infezione acuta (se lRNA positivo)
(segue)
Interpretazione HBeAg +/ + +/ +/ Anti-HBe +/ +/ +/ Anti-Delta + + Periodo finestra Infezione acuta iniziale HBV/portatore cronico Infezione acuta Convalescenza iniziale dellinfezione/possibile portatore cronico iniziale Portatore cronico* Infezione risolta Vaccinato o infezione risolta Infezione risolta? Falso positivo?
Infezione acuta o cronica HDV Infezione risolta
HCV
Anti-HCV (screening EIA) + + +
+/ +/
Virus HCV RNA +/ + HAV RNA + HEV RNA + Anti-HCV (screening EIA) + + + Anti-HAV Totale IgM + + + Anti-HEV Totale IgM + + +
Reattivit dei test Antigeni ricombinanti (RIBA) + +/ + +/ + + + + + +
Interpretazione
Infezione acuta o cronica iniziale (se lRNA positivo); falso positivo o risoluzione ritardata (se lRNA negativo) Infezione acuta o cronica Infezione HCV risolta
HAV acuta HAV risolta/vaccinato

HEV acuta HEV risolta
HBsAg = antigene di superficie dellepatite B; anti-HBc = anticorpo contro lantigene core dellepatite B; anti-HBs = anticorpo contro lHBsAg; HBeAg = antigene e dellepatite B; anti-delta = anticorpo contro lantigene delta; anti-HAV = anticorpo contro il virus dellepatite A; anti-HCV = anticorpo contro il virus dellepatite C; anti-HEV = anticorpo contro il virus dellepatite E. * I soggetti con lHBeAg sono pi infettivi e con maggiore probabilit di trasmettere verticalmente.
Anti-5-1-1 e anti-c100-3 generalmente compaiono pi tardi dellanti-c22-3 e anti-c33c durante la sieroconversione e possono scomparire spontaneamente, durante limmunosoppressione o dopo una terapia antivirale conclusa con successo.
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Figura 28.1 - Marcatori sierologici in corso di infezione da virus dellepatite B risolta senza complicazioni. Nella fase acuta, spesso i marcatori appaiono prima della comparsa delle alterazioni degli esami epatici (IFE) e dei sintomi (SINT). Lanti-HBs e lanti-HBc persistono dopo la guarigione ed indicano limmunizzazione. Nei portatori cronici (non rappresentati) lHBsAg persiste e lanti-HBc di solito presente, ma lanti-HBs assente (lHBeAg e lanti-HBe possono essere presenti, vedi Tabella 28.1). Il DNA dellHBV (non rappresentato) pu essere rilevato circa 1 o 2 settimane prima dellHBsAg. Gli esami per lHCV sono test immunoenzimatici (EIA) che utilizzano antigeni ricombinanti dellHCV fissati in fase solida come nel reagente capture. Gli esami attuali rilevano gli anticorpi specifici per c200 (comprendendo c33c e c100-3), c22-3 e NS-5. Lanti-HCV rilevabile con il test EIA di terza generazione circa 10 settimane dopo linfezione. LHCV RNA presente in concentrazione elevata nel plasma durante la maggior parte del periodo intercorrente tra lesposizione e la sieroconversione anticorpale. Lanti-HCV viene rilevato nel 40-50% dei pazienti che sono nella fase iniziale della diagnosi di epatite acuta, sia nei casi trasmessi con la trasfusione che in quelli acquisiti in comunit20. Il significato clinico di un test di screening risultato positivo per lanti-HCV in un donatore di sangue in buona salute non definitivo senza ulteriori indagini. Circa lo 0,21% dei donatori statunitensi presentano risultati ripetutamente reattivi nel test EIA21. Diverse generazioni di test ricombinanti in immunoblot (RIBA) sono state approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) per ulteriori accertamenti su risultati ripetutamente reattivi in EIA. Un soggetto che risulta positivo con il RIBA viene considerato vero positivo per anti-HCV; nel 70-90% di questi casi, lacido nucleico dellHCV risulta rilevabile con i metodi NAT. Linfettivit delle unit positive per lHCV RNA si avvicina al 100%22. Al contrario, i donatori ripetutamente reattivi in EIA con risultati negativi o indeterminati con il RIBA 3.0, che rappresentano il 37% dei donatori risultati ripetutamente reattivi in EIA, sono solo raramente infetti o infettanti. Indipendentemente dai risultati del RIBA, una donazione con un ripetuto risultato reattivo in EIA non pu essere utilizzata per la trasfusione. I donatori con risultati RIBA negativi possono essere considerati per la riammissione (vedi Tabella 28.2). Nel 1999, il NAT per HCV RNA venne introdotto come esame di screening per il donatore sotto il controllo della FDA. Lesame venne condotto in minipool di campioni da 16 a 24 donazioni di sangue intero. Il rapido aumento della viremia e lelevata carica virale di donatori in fase acuta di
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infezione, ma ancora sieronegativi, ha permesso il riscontro dellHCV RNA anche in questi pool diluiti. Il periodo finestra per il rilievo dellHCV con il NAT in pool viene ridotto di 10-30 giorni. 17 Dopo aver testato pi di 39 milioni di donatori, circa 1:270.000 soggetti risultato positivo al test NAT e ancora nel periodo finestra sieronegativo23. I risultati NAT possono essere utilizzati in circostanze specifiche al posto degli esami supplementari. necessaria una modifica di procedura da parte della FDA24. stato anticipato che gli esami NAT HCV possano essere utilizzati in futuro per la riammissione. I marcatori surrogati Prima che fosse identificato il virus HCV e che fossero possibili gli esami per lanti-HCV, vennero introdotti due test sul sangue del donatore non specifici o surrogati per ridurre il rischio dellepatite non-A, non-B (NANB) dopo la trasfusione. Nel 1986 e nel 1987, lAABB richiese lintroduzione, tra gli esami per le donazioni di sangue intero, la determinazione dellalanina aminotransferasi (ALT) e dellanti-HBc come surrogati in luogo della determinazione diretta dellagente patogeno responsabile dellepatite NANB. I test attuali, molto sensibili per lanti-HCV, hanno sostanzialmente eliminato lutilit dei test surrogati nella prevenzione dellepatite25, ma il test per lanti-HBc viene ancora raccomandato dalla FDA per prevenire la trasmissione dellHBV. Il virus HBV proveniente da un trapianto di fegato di un donatore risultato positivo nel test per anti-HBc, ma negativo per lHBsAg, venne trasmesso al ricevente del trapianto e svariate pubblicazioni della letteratura scientifica dimostrano che trasfusioni di sangue reattivo per lanti-HBc, ma negativo per lHBsAg, sono state associate in alcuni riceventi con lo sviluppo di unepatite B. Vi pu essere un piccolo numero di donatori potenzialmente infetti con HBsAg mutanti del virus B che possono non essere rilevati in modo ottimale con i test per HBsAg attualmente autorizzati26. I donatori risultati ripetutamente reattivi per lanti-HBc in due diverse occasioni, o risultati ripetutamente reattivi con due tipologie di reagenti diversi, devono essere sospesi.
Il rischio attuale di epatite post-trasfusionale Il rischio di uninfezione post-trasfusionale da HBV o HBC si ridotto in modo drammatico fino ad un rischio stimato fra 1 su 60.000 e 1 su 100.000 prima dellapplicazione della metodologia NAT HCV27. Dal 1994 non stato rilevato dai CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Centri per la prevenzione ed il controllo delle malattie) Sentinel Countries Viral Hepatitis Surveillance System (M. Alter, comunicazione personale, 3/04) 1 nessun nuovo caso di trasmissione di HCV tramite trasfusione. Lo sviluppo di test per HCV sempre migliori e le misure restrittive di selezione dei donatori hanno contribuito a questa notevole diminuzione ed attualmente la trasfusione non viene pi considerata come il fattore di maggior rischio per la trasmissione dellHCV. 28 Lo screening per lacido nucleico dellHCV stato applicato dai Centri Trasfusionali nel 1999. In tre anni di esami NAT, sono state identificate negli Stati Uniti 170 donazioni sieronegative NAT positive nello screening di 39,7 milioni di donazioni 23 . La NAT ha probabilmente ridotto il rischio residuo per la trasmissione dellHCV a 1 su 2.000.000 di emocomponenti trasfusi29,30. La quarantena e la tracciabilit del ricevente Le donazioni con risultati ripetutamente reattivi dei test di screening (HBsAg, anti-HBc e/o antiHCV) non possono essere utilizzate per la trasfusione. Inoltre pu essere necessario porre in quarantena, come di seguito indicato, gli emocomponenti non scaduti raccolti nei periodi precedenti allattuale donazione e pu essere richiesto linvio di una notifica per la rintracciabilit del ricevente (look back)31,32. Per HCV: estensione retroattiva indefinita della verifica, fino a quando esistono registrazioni elettroniche per donazioni ripetutamente reattive e confermate per HCV o donazioni ripetutamente positive per le quali non sono stati eseguiti i test supplementari di conferma;
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Tabella 28.2 - La riammissione di donatori con test di screening ripetutamente reattivi Ripetutamente reattivo per Anti-HIV-1 o -1/2 Campione iniziale Western blot positivo o indeterminato o reattivo IFA Western blot IFA NR Anti-HIV-2 HIV-1-Ag HBsAg Anti-HCV Riammissione
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Diversi HIV-2 EIA RR Diversi HIV-2 EIA NR e Western blot o IFA NR (Prelevato dopo 6 mesi) RR HIV-1 o diversi HIV-2 EIA RR o un Western blot o IFA reattivo o indeterminato
Confermato con test di neutralizzazione Non confermato con test di neutralizzazione
Confermato con test di neutralizzazione o anti-HBc RR Non confermata la specificit HBsAg con test di neutralizzazione e anti-HBc NR (Prelevato dopo 8 settimane ) HBsAg RR o anti-HBc RR
RIBA positivo o indeterminato RIBA negativo
Non idoneo per la riammissione Da valutare per la riammissione
Controllo successivo (Prelevato dopo 6 mesi) EIA RR o Western blot positivo o indeterminato o IFA reattivo
(Prelevato dopo 8 settimane ) HIV-1-Ag RR, con test di neutralizzazione confermato o non confermato
(Prelevato dopo 6 mesi) EIA RR o RIBA positivo o indeterminato Non idoneo per la riammissione
(segue)
Ripetutamente reattivo per Anti-HIV-1o -1/2 (Prelevato dopo 6 mesi) Metodo originale EIA NR e lisato dellintero virus anti-HIV-1 EIA NR e Western blot o IFA NR Anti-HIV-2 (Prelevato dopo 6 mesi) Test di screening e diversi HIV-2 EIA NR e Western blot o IFA NR HIV-1-Ag (Prelevato dopo 8 settimane ) HBsAg (Prelevato dopo 8 settimane ) Anti-HCV (Prelevato dopo 6 mesi) Metodo EIA multiantigenico NR e RIBA negativo
Riammissione
HIV-1-Ag e anti-HIV-1 EIA HBsAg NR e anti-HBc NR NR o HIV-1 Ag RR, non confermato (temporaneamente e sospeso per altre 8 settimane)
Idoneo per la riammissione
NR = non reattivo; RR = ripetutamente reattivo; RIBA = test immunoblot ricombinante; IFA = test in immunofluorescenza; EIA = test immunoenzimatici; anti-HIV-1 = anticorpo specifico per il virus dellimmunodeficienza umana, tipo 1; anti-HIV-2 = anticorpo specifico per il virus dellimmunodeficienza umana, tipo 2; HIV-1-Ag = antigene HIV-1; HBsAg = antigene di superficie dellepatite B; anti-HCV = anticorpo specifico per il virus dellepatite C; anti-HBc = anticorpo specifico per lantigene core dellepatite B.
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estendere retroattivamente la verifica fino al 1 gennaio 1988 se non sono disponibili registrazioni elettroniche. Per HbsAg e anti-HBc: sugli emocomponenti non scaduti verificare retroattivamente per 5 anni, o 12 mesi dal risultato negativo pi recente sulle unit ripetutamente reattive o confermate, oppure per le quali non siano stati eseguiti i test di conferma. Sulla base dei risultati ottenuti con test supplementari certificati, e test di screening precedenti, le unit in quarantena possono essere rese idonee per trasfusione o ulteriori lavorazioni, oppure possono essere distrutte. I riceventi informati del controllo di look back dellHCV devono avere unadeguata consulenza sulla natura dei risultati successivi dei test del donatore e deve essere loro offerta la possibilit di eseguire gli opportuni controlli. Se i loro test risultano positivi, devono essere raccomandati cambiamenti dello stile di vita (ad esempio astensione dal consumo di alcool) e devono essere suggeriti controlli per documentare uneventuale malattia epatica cronica che giustificherebbe ladozione di una terapia antivirale finalizzata a ridurre le probabilit di progressione della malattia. Le esperienze precedenti in Canada ed in diverse nazioni europee evidenziano che il numero dei riceventi che hanno effettivamente beneficiato dellimpegno necessario per le procedure di look back modesto33. Unindagine sui Servizi di Raccolta del Sangue statunitensi e sui Servizi Trasfusionali ospedalieri dopo lintroduzione mirata del look back per HCV ha rilevato che la notifica ai riceventi di 98.484 emocomponenti ha comportato lidentificazione di 1.520 persone infettate che erano precedentemente ignare della loro infezione34. Questo potrebbe rappresentare meno dell1% dei 300.000 riceventi ancora viventi che potrebbero aver acquisito linfezione con trasfusioni di sangue. Pi recentemente, dallo 0,9 al 5,0% dei pazienti esaminati per epatite C sono stati trovati positivi in una revisione delle indagini look back in Canada, dove i riceventi erano informati per tutte le precedenti trasfusioni del rischio per HCV e dove era offerta anche la
possibilit di eseguire indagini di controllo: dal 42 al 58% dei casi erano di nuova identificazione35.
I virus dellimmunodeficienza umana

I virus dellimmunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) e di tipo 2 (HIV-2) sono gli agenti eziologici dellAIDS. La sindrome AIDS venne riconosciuta nel 1981, ben prima della scoperta nel 1984 del virus responsabile. Le ampie implicazioni dellalterazione immunologica furono rilevate quando, nel 1982, venne riportata la sindrome AIDS in tre pazienti affetti da emofilia36 e in un bambino di 17 mesi che aveva ricevuto alla nascita trasfusioni multiple che comprendevano ununit di piastrine proveniente da un donatore che successivamente aveva sviluppato lAIDS37. In pochi anni, le indagini stabilirono che ben pi del 50% dei pazienti con emofilia che avevano ricevuto nel periodo precedente al 1980 concentrati di fattori della coagulazione avevano sviluppato uninfezione HIV-138. In alcune regioni degli Stati Uniti, poco prima del 1980 39, pi dell1% delle unit trasfusionali da singolo donatore erano risultate infette per lHIV. Le manifestazioni cliniche dellinfezione da HIV LHIV un retrovirus citopatico che infetta preferenzialmente i linfociti T CD4-positivi (cellule T helper) nei linfonodi e negli altri tessuti linfoidi40. Dopo linfezione primaria, lHIV si replica e si diffonde inizialmente come virione libero dalle cellule e da 10 giorni a 3 settimane dopo linfezione diventa rilevabile per la prima volta nel plasma. Durante questo tempo circa il 60% delle persone infettate sviluppa una sindrome retrovirale acuta, caratterizzata da una sintomatologia di tipo simil-influenzale caratterizzata da malessere con febbre, ingrossamento dei linfonodi, mal di gola, rash cutaneo, dolore muscolare ed alle articolazioni con o senza mal di testa, diarrea e vomito. Non appena compaiono gli anticorpi anti-HIV-1, la malattia entra in uno stato clinicamente latente; tuttavia, la replicazione virale e la sua disseminazione
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continuano. Durante questa fase, il virus pu essere trasmesso attraverso il sangue o le secrezioni genitali (Figura 28.2). Il periodo in cui linfezione persiste in uno stato clinicamente asintomatico stato valutato con una media variabile dai 10 ai 12 anni in assenza di trattamento41. Dopo anni di infezione asintomatica, la viremia plasmatica e la percentuale dei linfociti T infettati aumentano. La perdita delle funzioni sostenute dalle cellule T helper scompensa la reattivit immunologica e si pu verificare unattivazione immune inappropriata con la secrezione di citochine. Alla fine si verifica una forte riduzione nel numero dei linfociti T CD4+ e la gran parte degli individui infettati soccombe per malattie opportunistiche favorite dalla profonda immunosoppressione.
Il conteggio della carica virale e delle cellule CD4+ viene utilizzato per orientare la gestione clinica e terapeutica delle persone infette da HIV. Il sistema di classificazione per lAIDS ideato dai CDC basato sul numero delle cellule T CD4+ (<200/L definisce una AIDS conclamata), sulla presenza o lassenza dei sintomi sistemici e sullesistenza di una qualsiasi delle 26 condizioni cliniche considerate caratteristiche della AIDS conclamata42. Tra queste condizioni vi sono dei tumori maligni insoliti, come il sarcoma di Kaposi, il linfoma del sistema nervoso centrale ed unampia serie di devastanti infezioni opportunistiche potenzialmente letali come le micosi e le parassitosi, la pi comune delle quali la polmonite da Pneumocystis carinii. I progressi nel trattamento dellHIV e delle
Figura 28.2 - Eventi virologici durante linfezione primaria da HIV. Dopo linfezione iniziale e la diffusione del virus HIV nei linfonodi, un donatore di sangue diventa contagioso (definito come giorno 0), con lHIV RNA che comincia ad essere rilevabile nel plasma dai giorni 14-15, lHIV DNA rilevabile nei linfonodi dai giorni 17-20 e gli anticorpi anti-HIV rilevabili tra i giorni 20 e 25. Gli anticorpi anti-HIV permangono indefinitamente, ma possono essere persi nella fase preterminale della malattia, parallelamente con unimpennata della carica virale che indica il collasso definitivo del sistema immunitario. HIV = virus dellimmunodeficienza umana; RT-PCR = reazione della polimerasi a catena con transcriptasi inversa; PBMC = cellule mononucleate del sangue periferico.
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infezioni opportunistiche hanno aumentato in modo radicale la sopravvivenza delle persone infette. Sfortunatamente, la malattia si diffusa rapidamente in tutto il mondo e, per la maggior parte degli individui infetti che vivono nei Paesi in via di sviluppo, una terapia efficace risulta non a disposizione o economicamente non sostenibile. I fattori di rischio per lHIV LHIV pu essere trasmesso tramite i rapporti sessuali, al momento del parto, tramite lallattamento naturale e lesposizione parenterale a sangue infetto. I soggetti identificati da subito come a rischio maggiore sono stati gli omosessuali maschi, le prostitute e i loro clienti, i tossicodipendenti, i pazienti affetti da emofilia che hanno ricevuto concentrati di fattori della coagulazione e, in misura minore, i riceventi di trasfusioni di sangue. Dal 1989, in ogni gruppo a rischio la frequenza di infezioni non si ulteriormente incrementata in modo esponenziale e sembra aver raggiunto un plateau nella popolazione esposta a maggiore rischio43. La sieroprevalenza HIV si stabilizzata nella maggior parte delle citt degli Stati Uniti. La trasmissione eterosessuale dellHIV rappresenta attualmente una quota progressivamente in espansione delle infezioni HIV e dei casi di AIDS riportati negli USA negli anni 9044. Ci costituisce un fatto di grande importanza in Medicina Trasfusionale, perch lo screening per gli eterosessuali con comportamenti sessuali ad alto rischio pi problematico dello screening per omosessuali e per tossicodipendenti per via endovenosa45. LHIV-2 e lHIV-1, gruppo O LHIV-2, scoperto per la prima volta nel 1985, responsabile di uninfezione endemica in molte nazioni dellAfrica Occidentale. Sebbene lHIV-2 fosse inizialmente confinato nellAfrica Occidentale, studi recenti in nazioni europee come la Gran Bretagna e la Francia (che hanno una significativa immigrazione dallAfrica Occidentale) hanno rilevato un aumento della frequenza di HIV2 e di ulteriori sottotipi dellHIV-146,47. Il primo caso di infezione da HIV-2 negli Stati
Uniti stato riportato nel marzo 1988 in un giovane africano occidentale immigrato recentemente negli Stati Uniti48. Il quadro dei sintomi attribuibili allHIV2 analogo a quello determinato dallHIV-1; tuttavia, lHIV-2 sembra presentare unincubazione pi prolungata ed una minore frequenza di progressione verso lAIDS. LHIV-2 viene trasmesso per via sessuale e da madre a figlio, ma la trasmissione del virus meno efficace di quella dellHIV-1. Gli esami sui tossicodipendenti per via endovenosa, sulle persone affette da malattie a trasmissione sessuale, sui neonati e sui maschi omosessuali confermano la bassa frequenza della trasmissione di questo agente patogeno. Test combinati per lHIV-1 e lHIV-2 sono stati introdotti negli Stati Uniti nel 1992. Da allora, sono stati identificati tre donatori con infezione da HIV-2; ma nessuno di loro sembrava essersi infettato negli Stati Uniti49. Al momento, sono stati identificati tre gruppi di virus HIV-1: il gruppo M (il pi rappresentato), il gruppo O e, pi recentemente, il gruppo N. Inoltre, vi sono 10 sottotipi del gruppo M (indicati con le lettere da A a J). Nessuno dei 97 donatori identificati retrospettivamente come HIV-1 nel 1985 e 3 (1%) su 383 donatori identificati prospetticamente tra il 1993 e il 1996 sono stati trovati infetti da sottotipi non-B (due sottotipi As ed un sottotipo C)50. In particolare, questa indagine non ha rilevato un aumento nella variabilit nel tempo del gene env allinterno dellHIV-1 del gruppo B ed ha richiamato lopportunit della prosecuzione della sorveglianza per leventuale insorgenza di sottotipi non-B e lo sviluppo di sistemi di indagine per la loro evidenziazione. Una indagine da parte di questi stessi autori ha documentato la caratterizzazione dei sottotipi HIV in 291 donatori infetti identificati negli Stati Uniti dal 1997 fino al 2000 e ha rilevato che sei (2%) erano sottotipi non-B dellHIV-1 ed uno era HIV2 51. In Camerun e nelle nazioni circostanti dellAfrica Occidentale, viene valutato che dall1 al 2% delle infezioni da HIV sono causate dal tipo virale di gruppo O52. Come per lHIV-2, solo raramente il gruppo O isolato stato osservato al di fuori di questa area geografica. Si creato
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allarme quando alcuni studi hanno dimostrato che isolati virali di gruppo O non erano rilevati in modo affidabile da numerosi test EIA utilizzati per lo screening dei donatori di sangue. Dei due test certificati dalla FDA per la NAT, entrambi sono stati verificati dai produttori per il rilievo dei sottotipi non-B, compreso il gruppo O ed N, ma utilizzando un numero limitato di campioni, bench n luno n laltro dei test rilevi lHIV-2. Tuttavia, fino a quando non verr stabilita unaffidabile rilevazione delle infezioni di tipo O, la FDA raccomanda la sospensione a tempo indeterminato dei donatori di sangue e plasma che siano nati, abbiano risieduto o abbiano lavorato dal 1977 in Africa Occidentale, oppure abbiano avuto dei rapporti sessuali con chiunque corrisponda a questi criteri53. Il rischio di un infezione di tipo O negli Stati Uniti molto bassa. In unindagine di sorveglianza sui donatori di sangue statunitensi per un periodo di due decenni, solo tre sottotipi non-B sono stati identificati. Due di questi tre donatori erano nati in Africa50. Considerazioni trasfusionali La trasmissione trasfusionale dellHIV-1 Tutti gli emocomponenti possono trasmettere lHIV-1. Sebbene circa l1% di tutti i casi di AIDS siano derivati dalla trasfusione, oppure dal trapianto di organi o tessuti, lintroduzione dellMPNAT nel 1999 ha virtualmente eliminato il rischio della trasmissione trasfusionale dellHIV54. I pochissimi casi di infezione HIV che sono stati documentati dal 1999 sono stati attribuiti al basso livello di viremia che verosimilmente sarebbe stato rilevato con lID-NAT55,57. La maggior parte dei soggetti, ma non tutti, che ha ricevuto trasfusioni di sangue infetto stata contagiata. In unampia indagine, si visto che linfezione da HIV si sviluppata nell85% dei pazienti che hanno ricevuto sangue da donatori anti-HIV positivi58. La probabilit di trasmissione correlata con il tipo di emocomponente e con la carica virale nella donazione. Con leccezione dei concentrati di fattori della coagulazione, i plasmaderivati (come lalbumina e le immunoglobuline) non sono stati riferiti come
causa di trasmissione dellinfezione HIV. Nessuna ulteriore trasmissione di HIV attribuibile ai fattori della coagulazione stata documentata negli Stati Uniti dopo lapplicazione dello screening di massa dei donatori e delle tecniche di inattivazione virale adottate dal 198759. La trasmissione trasfusionale dellHIV-2 e HIV-1, gruppo O Sono stati riportati due casi di possibile trasmissione dellHIV-2 attraverso luso di emocomponenti, entrambi verificatisi in Europa. Due donne sono state infettate con sangue intero ottenuto da un donatore che ha sviluppato lAIDS almeno 16 anni dopo essere stato infettato con lHIV-2; entrambe le donne sono risultate asintomatiche 14 anni dopo la trasfusione60. Due pazienti emofilici che hanno ricevuto fattori della coagulazione sono anchessi stati infettati. A causa della loro frequenza estremamente bassa, nessuna trasmissione di HIV-2 o HIV-1 gruppo O attraverso la trasfusione di sangue o ogni altra via di trasfusione stata riportata negli Stati Uniti. Il rischio attuale di infezione da HIV post-trasfusionale Con i test di screening disponibili prima del 1992, lintervallo sieronegativo (periodo finestra) raggiungeva in media i 45 giorni. Ladozione di test di screening pi sensibili per lanticorpo antiHIV ha ridotto il periodo finestra anticorpo-negativo a circa 22 giorni 17. Lintroduzione nel 1996 del test per lantigene p 24 nello screening dei donatori ha ulteriormente ridotto il periodo finestra di circa 6 giorni61, anche se sembra che siano state individuate meno unit HIV infette, con lintroduzione di questo test, di quanto ci si aspettasse sulla base dei calcoli sulla riduzione del periodo finestra. Il rischio di una donazione sieronegativa infettante varia in proporzione alla incidenza di infezioni HIV nella popolazione dei donatori. La stima generale del rischio di HIV post-trasfusionale negli Stati Uniti dopo lapplicazione dellHIV NAT approssimativamente di 1 su 2 milioni di donazioni sottoposte allo screening23,30.
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Gli esami HIV dei donatori di sangue Gli Standard AABB per le Banche del Sangue e Servizi Trasfusionali62(pp33,34) ed i regolamenti FDA63 richiedono che tutte le unit di sangue ed emocomponenti risultino non reattive per lantiHIV-1 e lanti-HIV-2 prima di essere consegnate per la trasfusione. Lesame per lantigene HIV-1 (HIV-1-Ag) non viene pi richiesto dalla FDA o dallAABB dopo lintroduzione del test HIV-NAT. La Figura 28.3 illustra la sequenza dello screening e dei test di conferma per lanti-HIV-1/2. Poich le conseguenze della perdita anche di un solo vero positivo grave, i test di screening sono concepiti per avere unelevata sensibilit sia per le varianti immunologiche virali sia per gli anticorpi rilevabili a basso titolo durante la sieroconversione. Gli anticorpi rilevabili con i test EIA si sviluppano da 2

a 4 settimane dopo lesposizione58, impiegano da giorni a una settimana dopo lesordio di sintomi nei soggetti che hanno una malattia acuta riconoscibile64 e circa 12 giorni dopo una viremia rilevabile con lID-NAT oppure 9-10 giorni con lMPNAT17,65. Pochi giorni dopo, gli anticorpi HIV-1 diventano rilevabili con le tecniche in Western blot HIV-1. Tutte le persone infettate con lHIV, con rarissime eccezioni, sviluppano una reattivit antiHIV rilevabile con le metodologie EIA e Western blot che persiste per tutta la vita. Gli esami pi sensibili che utilizzano la tecnologia NAT hanno dimostrato di rilevare degli ulteriori donatori che sono potenzialmente infettivi. Nel febbraio 2002, la FDA ha approvato il primo sistema NAT per lo screening dei donatori di
ESAME EIA REATTIVO NEGATIVO OK per luso Ripetere in doppio Entambi negativi Uno o entrambi REATTIVI ELIMINARE LUNIT Identificazione e quarantena degli emocomponenti Eseguire il test di conferma HIV-1 della/e donazione/i (WB, IFA, etc.) precedente/i NEGATIVO INDETERMINATO POSITIVO

Informare il donatore ed il dipartimento sanitario se richiesto dalla legge Iniziare la procedura di look-back sulle unit prelevate precedentemente
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Figura 28.3 - Schema decisionale per gli esami anti-HIV-1/HIV-2 dei donatori di sangue. IFA = test in immunofluorescenza; WB = Western blot. Se lesame EIA non reattivo, lesame NAT deve anchesso non essere reattivo prima di rendere idonea una donazione.
Esame per anti-HIV-2
Esame per anti-HIV-2 NEGATIVO

NEGATIVO

Considerare la riammissione
RIPETUTAMENTE REATTIVO

RIPETUTAMENTE REATTIVO

Notificare ed ulteriore esame per lHIV-2
Sospendere come per HIV-1
Notificare ed ulteriore esame per lHIV-2
sangue intero ed emesso una prima bozza orientativa per le Strutture Trasfusionali; la guida definitiva stata emessa nellottobre 200466,67. Si valutato che lHIV-NAT ha ridotto il periodo finestra da 16 a 10 giorni17. Luso della tecnologia NAT per gli esami dei donatori non ha semplicemente incrementato la sensibilit, ma ha anche ridotto il numero degli esami falsamente positivi, aumentando la specificit. Durante i tre anni di indagini con lHIV NAT, sono stati confermati 12 donatori HIV-1 RNA-positivi anticorpi-negativi che sono stati rilevati su 37 milioni di donazioni sottoposte allo screening, oppure 1 su 3,1 milioni, dei quali solo due erano rilevabili con lantigene HIV-1 p2423. I test di conferma per gli anticorpi anti-HIV-1/2 Se una malattia ha una bassa prevalenza nella popolazione esaminata, vi unelevata probabilit che la maggior parte dei risultati positivi nei test di screening siano dei falsi positivi. Sono quindi necessari ulteriori esami pi specifici per confermare i risultati dei test di screening. Tra questi il pi comunemente utilizzato per gli anticorpi specifici per lHIV-1/2 il Western blot (vedi il Capitolo 7). Secondo gli attuali criteri della FDA e del CDC, un campione viene definito come anti-HIV positivo se sono presenti almeno due delle seguenti bande: p24, gp41 e/o gp 120/16068. I risultati Western blot negativi non presentano bande. I risultati Western blot che sono classificati come indeterminati hanno alcune bande presenti, ma non hanno il quadro che definisce la positivit per HIV. I soggetti infetti per HIV possono presentare nelle fasi iniziali di infezione quadri indeterminati, ma sviluppano ulteriori bande nellambito di 6 settimane. I soggetti sani con quadri iniziali indeterminati continuano ad avere risultati negativi o indeterminati sui successivi campioni e sono negativi sia agli esami clinici sia ai test aggiuntivi, compresa la coltura virale e la NAT. I donatori in buona salute che continuano a presentare il medesimo quadro indeterminato per oltre tre mesi possono essere rassicurati sul fatto che molto improbabile che abbiano uninfezione da HIV, ma non sono attualmente idonei per donare il sangue.
Numerosi gruppi di lavoro hanno identificato tracciati Western blot in donatori di sangue identificati come risultati falsamente positivi; per questi soggetti, viene raccomandato lesame (utilizzando il NAT) per risolvere definitivamente laccertamento dello stato infettivo del donatore69. Circa il 50% di tutti gli esami HIV dei donatori risultati ripetutamente positivi nello screening EIA presentano risultati indeterminati con gli esami Western blot certificati per lHIV-1. Tuttavia, quando queste donazioni sono state riesaminate con ID-NAT, meno dello 0,1% ha dimostrato di contenere RNA HIV-1 (1 solo RNA-positivo su 1.450 donatori indeterminati). Se si aggiungano le donazioni Western blot negative, la frequenza di un donatore con un esame HIV ripetutamente reattivo, risultato Western blot indeterminato o negativo con dimostrabile RNA virale nel sangue, di 1 caso su 4,27 milioni (S. Stramer, comunicazione personale, 17/3/04). La FDA ha approvato protocolli per riammettere donatori con risultati di conferma negativi alla donazione (vedi Tabella 28.2)70. La riammissione richiede attualmente la ripetizione degli esami dopo almeno 6 mesi per rilevare uneventuale sieroconversione ritardata, luso degli esami EIA basati sul lisato dellintero virus e lutilizzo delluno o dellaltro dei metodi Western blot certificati dalla FDA per assicurare unadeguata sensibilit metodologica, oppure un esame in immunofluorescenza certificato dalla FDA71. Lultimo campione deve anche risultare non reattivo in un test EIA per lanti-HIV-2, nel caso in cui gli esami standard non comprendano lHIV-2. La FDA ha recentemente pubblicato la bozza delle linee guida per la riammissione che condurranno al reinserimento dei donatori con risultati indeterminati con il Western blot, eliminando la necessit dei test EIA con il lisato virale, ed includendo gli esami con HIV-1 NAT. I risultati NAT possono essere utilizzati al posto dei test supplementari in specifiche circostanze. stata richiesta una variazione delle direttive FDA24. stato anticipato che gli esami NAT HIV1 saranno utilizzati nel futuro per la riammissione dei donatori.
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Gli esami positivi nei donatori autologhi un argomento controverso se le donazioni autologhe risultate ripetutamente reattive nei test EIA oppure NAT positive debbano essere escluse dalla trasfusione72. Queste unit possono essere fornite per uso autologo se sono soddisfatte le seguenti condizioni: 1) deve esserci una richiesta scritta, firmata e datata del medico del paziente che autorizzi questa assegnazione, 2) deve esserci una dichiarazione scritta del Servizio Trasfusionale indicante la volont di ricevere questo prodotto e 3) il Servizio Trasfusionale si assume la responsabilit di assicurare che vi sia una verifica documentata dellidentit del ricevente della trasfusione. Questa unit deve essere etichettata come RISCHO BIOLOGICO e PER SOLO USO AUTOLOGO. Lofferta di procedure di predeposito di sangue autologo decisione propria di ogni Servizio Trasfusionale. Le istituzioni devono tuttavia considerare che, per quanto possibile nellinteresse del paziente, viene generalmente accettato che il paziente possa avere lopzione di utilizzare il suo sangue. Inoltre, una decisione della Corte Suprema degli Stati Uniti ha stabilito nel caso Bragdon contro Abbott che gli individui HIVpositivi sono protetti dall Americans with Disabilities Act 73. Resta controverso che questa norma debba essere applicata alle donazioni HIVpositive che possono rappresentare un rischio per i pazienti ospedalieri trasfusi. La rintracciabilit dei riceventi (look back) Lidentificazione delle persone che hanno ricevuto sangue sieronegativo o sangue non testato di un donatore successivamente riscontrato infetto per HIV viene indicato con il termine di look back. Poich lintervallo tra la somministrazione di una trasfusione infetta e lesordio dellAIDS pu essere molto lungo, di solito i riceventi ignorano la loro situazione e possono trasmettere inconsapevolmente linfezione ad altre persone. Per identificare questi soggetti, i Servizi Trasfusionali devono avere procedure per informare i pazienti in merito alla pregressa trasfusione di unit di donatori riscontrarti successivamente positivi per anti HIV
o per HIV-NAT. Se noto che un paziente con AIDS ha donato precedentemente, i riceventi del sangue o degli emoderivati provenienti da queste donazioni devono essere rintracciati ed informati. Il reperimento dei riceventi e gli esami vengono normalmente attuati con la collaborazione del medico del paziente e non attraverso un contatto diretto con il paziente. Nelle linee guida la FDA ed i Centers Medicare and Medicaid Services stabiliscono i tempi e gli standard che definiscono la procedura di look back74-77. Se i riceventi delle unit trasfusionali donate almeno 12 mesi prima dellultimo test di screening risultato negativo vengono esaminati e trovati negativi, i riceventi delle donazioni antecedenti non sono probabilmente a rischio perch uninfezione antecedente a 12 mesi prima di un test di screening negativo estremamente improbabile.
I virus linfotropici umani per le cellule T

HTLV, Tipo I Il virus linfotropico umano per le cellule-T, di tipo I (HTLV-I) stato il primo retrovirus umano isolato ed il primo ad essere riconosciuto come causa associata ad una malattia maligna della specie umana, la leucemia-linfoma a cellule-T delladulto (ATL) 58. LHTLV-I anche associato con la situazione neurologica della mielopatia HTLVcorrelata (HAM), che viene spesso indicata come paraparesi spastica tropicale (TSP). La ATL venne descritta prima della HAM. Entrambe queste condizioni patologiche si verificano in una piccola minoranza (non pi del 2-4%) delle persone che sono portatrici del virus. Linfezione durante linfanzia un aspetto importante, e un possibile requisito per lo sviluppo della ATL molti anni dopo, mentre linfezione infantile oppure in et adulta pu causare la HAM con un periodo variabile di latenza. La prevalenza dellinfezione HTLV-I presenta evidenti raggruppamenti geografici, con sacche di elevata endemia in alcune parti del Giappone meridionale e in alcune isole del Pacifico, nellAfrica sub-Sahariana, nel bacino caraibico, nellAmerica Centrale e nel Sud America. La
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trasmissione si verifica attraverso lallattamento al seno da madre a figlio o con rapporti sessuali (prevalentemente da maschio a femmina) oppure con lesposizione a sangue infetto. HTLV, Tipo II Il virus linfotropico umano per le cellule-T, di tipo II (HTLV-II) stato descritto diversi anni dopo lHTLV-I. Vi almeno il 60% di similarit della sequenza genetica con quella dellHTLV-I; gli anticorpi di entrambi i tipi presentano una forte cross-reattivit con i relativi lisati virali. Anche il virus HTLV-II presenta raggruppamenti, ma in popolazioni differenti. Unelevata frequenza stata rilevata negli Stati Uniti in alcune popolazioni di nativi americani e tra i tossicodipendenti per via endovenosa nei quali la sieroprevalenza compresa tra l1 e il 20%. La HAM raramente associata con HTLV-2 e ancor pi raramente con HTLV-I58. I rilievi epidemiologici indicano che vi un aumento di manifestazioni infettive (per esempio bronchiti, infezioni urinarie e polmoniti) tra i donatori di sangue infettati da HTLV-I o II. 78-81 Osservazioni cliniche Sia per lHTLV-I, sia per lHTLV-II, linfezione permane per tutta la vita, come anche lanticorpo. Le indagini di prevalenza e sulla trasmissione utilizzano la sieroconversione come criterio finale per la diagnosi. Linfezione non determina alcun evento acuto riconoscibile e con leccezione dei soggetti che sviluppano lALT o la HAM, gli individui infetti presentano poche o nessuna conseguenza per la salute. La maggior parte dei portatori sono asintomatici e completamente ignari dellinfezione. Trasmissione Entrambi i virus sono fortemente associati alle cellule. Il contatto con linfociti vitali infetti pu causare linfezione, ma il plasma non sembra infettivo o lo molto meno. Le componenti cellulari di un donatore infetto causano la sieroconversione in almeno il 50% dei riceventi in Giappone, ma apparentemente solo in una pi piccola proporzione dei riceventi statunitensi58. Dopo la
conservazione refrigerata dellunit trasfusionale per 10 o pi giorni, i globuli rossi trasfusi di un donatore infetto sono molto meno capaci di determinare la sieroconversione, forse a causa della degradazione dei linfociti che trasmettono il virus82-83. Linfezione HTLV-I trasmessa con la trasfusione stata associata alla HAM con uninsorgenza piuttosto rapida e ad almeno un caso di ATL. Esami per i donatori Lo screening per lanti-HTLV-I per i donatori iniziato negli Stati Uniti alla fine del 1988; a quel tempo, la frequenza dei test confermati positivi era circa dello 0,02%, o di 1 unit su 5.000 raccolte, un quadro che da allora si ridotto di almeno 10 volte dopo lesclusione delle persone sieropositive dal pool dei donatori84. Il rischio combinato della trasmissione per via trasfusionale dellinfezione da HTLV-I/II stato stimato in circa 1 caso su 641.000 unit84 . Ci si pu attendere unulteriore riduzione del rischio dalla introduzione del test combinato HTLV-I/II EIA nello screening dei donatori di sangue. Il primo di questi test stato certificato negli Stati Uniti nel 1988. Utilizzando i lisati virali di entrambi i virus HTLV-I e HTLV-II, lesame offre unadeguata sensibilit per entrambi gli anticorpi anti-HTLV-I e anti-HTLV-II, mentre il test EIA originalmente certificato per lo screening dellanti-HTLV-I potrebbe aver perso pi del 50% delle infezioni HTLV-II85. Una donazione che risulta ripetutamente positiva con lEIA non deve essere utilizzata per la trasfusione. Se il test di un donatore risulta ripetutamente reattivo con lesame di screening EIA in due o pi occasioni il donatore, o la donatrice, deve essere informato e definitivamente sospeso85. Un altro approccio raccomandato quello di esaminare il siero del donatore con un secondo kit del test EIA di un altro produttore86. Se anche questo test risulta ripetutamente reattivo, il donatore deve essere sospeso definitivamente sulla base di questa singola donazione. Ulteriori esami sierologici ripetutamente reattivi per lantiHTLV-I/II contro preparazioni antigeniche specifiche per i due agenti virali (HTLV-I o HTLVII) o con una NAT eseguita con materiale ottenuto
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da cellule mononucleate del sangue periferico, possono caratterizzare lagente infettante. La met ed oltre dei donatori statunitensi che sono risultati infetti dopo uno screening EIA sono stati confermati per linfezione da HTLV-II. Bench non vi sia un requisito FDA per lesecuzione di esami ulteriori (nessun test di conferma per HTLV certificato), la maggior parte dei centri lo fa eseguendo un test di indagine supplementare oppure con una serie di test: se gli esami della donazione risultano ripetutamente reattivi al primo controllo e ad un secondo esame EIA HTLV-I/II, il donatore viene sospeso definitivamente (vedi Tabella 28.3). Indipendentemente dai risultati di questi esami supplementari, un donatore che corrisponde ai criteri EIA per una sospensione definitiva come precedentemente descritta deve comunque essere sospeso. Quarantena e look back Le precedenti e non scadute donazioni di sangue e di emocomponenti di donatori che sono risultati ripetutamente reattivi per anti-HTLV-I/II devono essere poste in quarantena. Poich i riceventi delle unit provenienti da donatori sieropositivi non sieroconvertono costantemente e poich molti donatori sieropositivi hanno uninfezione permanente per tutta la vita, lintervallo di tempo per il look back non di per s chiaro. Non stato stabilito alcun requisito per lindividuazione del ricevente e per la sua informazione85. Lo screening, che operativo dal 1988, ha probabilmente rimosso dal pool dei donatori attivi la maggior parte dei donatori con uninfezione che permane per tutta la vita.
Il West Nile virus

Il West Nile virus (WNV) un flavovirus che viene originariamente trasmesso tra gli uccelli attraverso la puntura delle zanzare; gli esseri umani sono ospiti occasionali. Negli umani, i sintomi presentano un range che variabile da una leggera malattia febbrile, allencefalite, al coma e anche alla morte, malgrado il fatto che
circa l80% degli individui infetti resti asintomatica. Sono stati riportati episodi di diffusione da WNV in Europa, in Medio Orientale e in Russia, durante il passato decennio sono stati associati con lencefalite umana e la meningite (<1% dei casi), sebbene non sia stato riportato alcun caso associato con la trasfusione. Il WNV stato osservato negli Stati Uniti nel 1999 nellarea metropolitana di New York. Successivamente, si diffuso rapidamente verso lOvest in tutto il Paese, trasmesso dagli uccelli infetti. Nel 2001 si sono verificati 66 casi di infezione umana in 10 Stati. Nel 2002, 4.161 casi di malattia WNV sono stati riferiti in 39 Stati, comportando 284 decessi. Nel 2002, 23 casi risultavano correlati con la terapia trasfusionale (con un donatore infetto identificato): gli eritrociti, il plasma fresco congelato e le piastrine sono tutti risultati implicati 87. Le donazioni responsabili dellinfezione si sono verificate tra il 22 luglio e il 6 ottobre 2002. La rivalutazione statistica dei dati disponibili, riguardanti le date di insorgenza dei casi durante la fase epidemica del 2002, sono stati utilizzati per calcolare una stima del rischio trasfusionale relativo alla trasmissione del WNV (per 10.000 donazioni) in sei stati e sei aree metropolitane selezionate, con risultati oscillanti, rispettivamente, in un range dal 2,12 al 4,76 e dall1,46 al 12,3388. Una linea guida della FDA emessa nel maggio 2003 raccomandava la sospensione dei donatori con una diagnosi di infezione da WNV per 28 giorni dopo lesordio dei sintomi o per 14 giorni dopo la successiva guarigione e raccomandava di accertare se i donatori avevano sofferto di mal di testa con febbre nella settimana precedente alla donazione89. Tuttavia, poich la maggioranza delle persone infette asintomatica, ci si aspettava che i risultati di queste misure cautelative sarebbero stati limitati e venne quindi richiesta lesecuzione di un test come il metodo migliore per identificare i donatori infetti. Durante lestate e lautunno del 2003, quasi 5 milioni di donazioni che costituivano oltre il 95% di quelle raccolte negli Stati Uniti vennero esaminate per il WNV con la procedura NAT in minipool di sei o sedici campioni secondo uno dei due protocolli IND, uno di questi utilizzava
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Tabella 28.3 - Azioni raccomandate per gli esami HTLV-I/II Prima donazione da esaminare per gli anticorpi HTLV-I/II EIA Ripetutamente reattivo Ripetutamente reattivo WB/RIPA Positivo Donazione Distruggere tutti gli emocomponenti* Distruggere tutti gli emocomponenti* Donatore Sospendere e informare Nessuna azione EIA Non applicabile /Donatore sospeso Ripetutamente reattivo Non reattivo Pos. Qualunque risultato Non eseguito Distruggere tutti gli emocomponenti* Accettabili tutti gi emocomponenti Sospendere e informare Nessuna azione Donazione successiva/e Secondo produttore WB/RIPA Donazione Donatore
Negativo o indeterm
Neg.
HTLV-I = virus linfotropico delle cellule-T umane, tipo I; HTLV-II = virus linfotropico delle cellule-T umane, tipo II; EIA = esame immunoenzimatico; WB = Western blot; RIPA = test ricombinante di immunoprecipitazione. * Distruggere lunit a meno che non venga adeguatamente etichettata come positiva per gli anticorpi specifici per HTLV-I/II. Etichettare a scopo di ricerca di laboratorio o per ulteriori lavorazioni nellambito della preparazione dei reattivi diagnostici in vitro. Presumendo che le donazioni precedentemente frazionate siano risultate ripetutamente reattive per lanticorpo anti-HTLV-I/II per non pi di ununica volta. Se donazioni separate sono risultate precedentemente reattive per gli anticorpi anti-HTLV-I/II in due o pi occasioni, il donatore deve essere sospeso definitamente.
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il metodo della reazione della polimerasi a catena e laltro utilizzava il metodo dellamplificazione trascrizione-mediata. Nel 2003, sono stati confermati come viremici per il WNV circa 1.000 donatori e circa 1.500 emocomponenti sono stati eliminati come probabilmente infetti90. Tuttavia sei casi confermati o probabilmente correlati con la trasfusione sono stati riportati nel 2003; quattro riceventi soffrirono di encefalite dovuta al WNV, uno ebbe manifestazioni febbrili e un paziente in condizioni critiche non present una riconoscibile patologia correlabile al WNV malgrado la conferma dellinfezione da WNV91. Alcuni donatori furono identificati con esami retrospettivi di campioni individuali, dimostrando che tutti erano correlati con campioni dal virale molto basso. Il numero di casi associati alla trasfusione sarebbe stato certamente molto pi elevato di quanto si verificato se non fossero stati iniziati su vasta scala i test sottoposti ai protocolli IND. Durante tutto questo periodo si verificarono negli Stati Uniti 9.862 casi di WNV con 264 decessi. Il persistente basso livello di trasmissione del WNV con la trasfusione nel 2003 ha indotto nel 2004 allutilizzo dellID-NAT nelle regioni altamente epidemiche. Questo sforzo ha eliminato con successo le unit a basso livello viremico che non sarebbero state rilevate con la metodologia MPNAT92,93. Nel 2004, il virus comparso prevalentemente negli stati occidentali con la California accreditata per il 31% dei casi94. Solo tre stati (Hawaii, Alaska, e Washington) sono rimasti liberi da casi di infezione umana o animale (mammiferi ed uccelli). Un totale di 2.470 casi di infezione umana WNV sono stati riferiti in 40 stati pi il Distretto di Columbia, con 88 casi letali: molto meno rispetto ai casi dellanno precedente. Sono stati identificati un totale di 192 donatori WNV-positivi, quasi tutti provenienti dagli stati ad ovest del fiume Mississippi 94 . Di questi donatori tre hanno successivamente riportato una malattia neuroinvasiva da WNV e 55 hanno presentato una febbre WNV 94. stato riportato un caso probabilmente associato alla trasfusione95. Lesperienza evidenzia che lo screening per il WNV ha incrementato la sicurezza della
trasfusione. Tuttavia, permane un modesto rischio di trasmissione trasfusionale di WNV. Se il numero di casi di WNV continuer a ridursi in modo radicale, la necessita degli esami per il WNV sar rivalutata. La FDA ha concordato che laccertamento relativo al mal di testa con febbre nella settimana precedente alla donazione pu essere abbandonata (K. Gregory, comunicazione personale, 30/3/05).
Gli herpesvirus e i parvovirus

Citomegalovirus Il citomegalovirus (CMV), un membro della famiglia degli herpesvirus umani, un virus a DNA ubiquitario che causa infezioni diffuse; la trasmissione pu verificarsi attraverso secrezioni corporee, comprese le urine, secrezioni orofaringee, lallattamento, il sangue, lo sperma e secrezioni cervicali. Circa l1% dei neonati vengono infettati per passaggio transplacentare o per lesposizione alle secrezioni cervicali infette alla nascita, oppure con il latte materno. Nella prima infanzia, il CMV viene spesso acquisito attraverso contatti stretti, specialmente durante la pulizia quotidiana; in et adulta, attraverso rapporti sessuali. La prevalenza degli anticorpi anti-CMV nella popolazione generale oscilla tra il 50 e l80%96. Il tasso incrementa con let ed generalmente pi elevato nei gruppi di livello socioeconomico modesto, nelle aree urbane e nelle nazioni in via di sviluppo. Osservazioni cliniche Nelle persone con un sistema immunitario integro, linfezione da CMV pu essere asintomatica e restare latente nei tessuti e nei leucociti per molti anni. Linfezione, sia quella primaria, come anche la riattivazione di uninfezione latente, pu essere associata ad una sindrome simil-mononucleosica con mal di gola, ingrossamento dei linfonodi, linfocitosi, febbre, viremia, eliminazione del virus per vie urinarie ed epatite. Le infezioni intrauterine possono causare ittero, trombocitopenia, calcificazioni cerebrali e disabilit motoria; la sindrome da infezione
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congenita causa ritardo mentale e sordit e pu essere anche letale. Linfezione da CMV pu progredire verso la malattia da CMV e determinare una grave morbilit e mortalit nei neonati prematuri, nei riceventi di trapianti di organi, di midollo o trapianto di cellule progenitrici ematopoietiche ottenute dal sangue periferico, come nei pazienti affetti dallAIDS96. Polmoniti, epatiti, retiniti e malattia multiorgano costituiscono le manifestazioni della malattia da CMV. Linfezione da CMV pu originare dalla trasfusione di sangue. Tuttavia, altre fonti di infezione, come il trapianto di organi da donatori CMV positivi o la riattivazione di virus latenti, possono costituire un rischio ben maggiore di quello determinato dalla trasfusione. Trasmissione trasfusionale del citomegalovirus Linfezione da CMV estremamente variabile in funzione dello stato socioeconomico e della regione geografica. Bench ci si aspetti che circa il 50% dei donatori possa essere CMV positivo, si valutato che attualmente meno dell1% degli emocomponenti cellulari sieropositivi sia in grado di trasmettere il virus96,97. Raramente, unepatite post-trasfusionale pu essere determinata dal CMV. La sindrome da mononucleosi postperfusione che per prima ha focalizzato lattenzione sul CMV presente negli emocomponenti trasfusi nei primi anni del 1960 viene oggi osservata raramente. Linfezione da CMV post-trasfusionale non determina alcuna conseguenza clinica nei riceventi immunocompetenti e non giustificata la selezione specifica del sangue con un ridotto rischio per il CMV (vedi di seguito). Alla luce della possibilit di una malattia da CMV severa nei pazienti immunocompromessi, sono state identificate numerose categorie di riceventi che devono essere protetti dalla trasmissione per via trasfusionale del CMV7. Queste comprendono i neonati prematuri sottopeso nati da madri sieronegative, i riceventi sieronegativi di cellule progenitrici ematopoietiche da donatori CMVnegativi, le pazienti gravide sieronegative perch il feto a rischio di infezione transplacentare ed i riceventi di trasfusioni intrauterine. In alcuni casi,
devono essere anche compresi i riceventi sieronegativi di trapianti di organi da donatore sieronegativo, gli individui sieronegativi candidati per il trapianto autologo o allogenico di cellule ematopoietiche progenitrici e anche quei pochi pazienti con AIDS liberi dallinfezione da CMV. Misure preventive Il sangue di donatori con un test negativo per lanticorpo anti-CMV ha un rischio molto basso di trasmissione, ma la disponibilit di sangue sieronegativo limitata 96,97. Un approccio alternativo quello di rimuovere i leucociti dal sangue donato (perch i leucociti costituiscono il principale serbatoio per il CMV)98-100. Sebbene la precisa popolazione leucocitaria che ospita il virus non sia stata definita, la rimozione dei leucociti con filtri ad alta efficienza (5 x 106 leucociti per emocomponente o meno), pu ridurre significativamente, se non prevenire, la trasmissione del CMV post-trasfusionale nei neonati ad alto rischio e nei trapiantati trasfusi. Bench largomento sia controverso98-100, di fatto le componenti cellulari leucodeplete sono considerate da molti esperti come equivalenti alle componenti sottoposte allo screening sierologico. Il beneficio aggiuntivo degli esami sierologici, quando viene aggiunto alla leucodeplezione, non stato quantificato. La sieroprofilassi con le immunoglobuline anti-CMV e luso profilattico di agenti antivirali, iniziano ad essere esaminati come possibili opzioni per i riceventi immunosoppressi, di trapianto di organi ad alto rischio96,97. Virus di Epstein-Barr Il virus di Epstein-Barr (EBV) causa la maggioranza dei casi di mononucleosi infettiva ed strettamente associato con la forma endemica del linfoma di Burkitt in Africa e con il carcinoma nasofaringeo. La maggior parte delle persone vengono infettate nel periodo in cui raggiungono let adulta; sebbene in modo asintomatico, linfezione persiste. Linfezione viene diffusa per contatto con saliva infetta. Linfezione primaria nei bambini asintomatica oppure caratterizzata dal mal di gola e dallingrossamento
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dei linfonodi. Linfezione primaria nei soggetti pi adulti, persone immunologicamente mature, causa di solito una sindrome sistemica, la mononucleosi infettiva, con febbre, infezione tonsillare qualche volta con ulcere necrotiche, ingrossamento dei linfonodi, anormalit ematologiche ed immunologiche e talvolta epatite o coinvolgimento di altri organi. Il bersaglio dellEBV sono i linfociti B, che sono sottoposti ad una proliferazione policlonale e successivamente inducono una risposta dei linfociti T, osservati come linfociti atipici. Linfezione da EBV trasmessa con la trasfusione di solito asintomatica, ma si sono verificati dei rari casi di sindrome post-trasfusionale in seguito a trasfusioni massive di sangue fresco, durante interventi cardiochirurgici, e costituisce una causa rara di epatite post-trasfusionale101. LEBV gioca un ruolo nello sviluppo del carcinoma nasofaringeo, e almeno in una forma del linfoma di Burkitt, ed in vitro possiede la capacit di rendere immortali i linfociti B. LEBV contribuisce allo sviluppo dei disordini linfoproliferativi nei riceventi immunosoppressi di trapianti di cellule ematopoietiche o di organi. Data una incidenza di sieropositivit del 90% per lEBV tra i donatori di sangue, ed essenzialmente nessun rischio di malattia clinica per la trasmissione trasfusionale del virus nei riceventi immunocompetenti, lo screening sierologico per questo virus non stato considerato utile. Come nel caso del CMV, ci si aspetta che la leucodeplezione degli emocomponenti cellulari del sangue riduca il rischio dellinfezione da EBV nei pazienti sieronegativi con severa immunosoppressione che possono essere esposti al rischio di malattia con manifestazioni cliniche. Tuttavia, non vi sono studi per verificare uneffettiva riduzione di questo genere di rischio. Herpesvirus umani 6 ed 8 Come per il CMV e lEBV, lherpesvirus 6 (HHV6) un virus associato alle cellule che si integra con il genoma dei linfociti. La sieroprevalenza in alcune popolazione adulte si avvicina al 100%. Linfezione primaria nei bambini immunocompetenti viene riconosciuta come un
esantema acuto, una malattia febbrile caratterizzata da rash raramente complicata dal coinvolgimento di altri organi. I pazienti immunocompromessi (per esempio trapiantati oppure affetti dallAIDS) possono avere riattivazioni della infezione da HHV-6 in diversi organi. Alcuni studi hanno cercato unassociazione tra la sclerosi multipla e linfezione da HHV-6, ma questo argomento permane controverso. Data lubiquit degli anticorpi specifici per lHHV-6 e lassenza di associazione con una malattia dopo la trasmissione trasfusionale, non stata fatta alcuna raccomandazione per la protezione dei riceventi sieronegativi dalla trasmissione con emocomponenti102. LHHV-8 (conosciuto anche come KSHV o herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi) associato come causa sia del sarcoma di Kaposi, sia di linfomi nelle sedi corporee cavitarie. Il virus stato identificato in donatori di sangue apparentemente sani, ma la propagazione sembra essere principalmente per via venerea. Bassi titoli di anticorpi anti-HHV-8 sono stati rilevati nell11% di 91 donatori di sangue statunitensi in buona salute. Tra le donne HHV-8 positive, luso di droghe per via endovenosa e lattivit sessuale costituivano fattori di rischio indipendenti dallinfezione HHV-8 104. In questo studio, lassociazione con luso di droga per via endovenosa indica che possibile la trasmissione dellinfezione HHV-8 con il sangue. La trasmissione con la donazione di organi stata dimostrata105-107. Le indagini epidemiologiche evidenziano che sussiste un piccolo rischio di trasmissione dellHHV-8 associato con la trasfusione108. Parvovirus Il Parvovirus B19 la causa delleritema infettivo o quinta malattia, una malattia febbrile contagiosa della prima infanzia. Le infezioni negli adulti possono essere associate con lartrite, ma generalmente sono benigne. Pi minacciosamente, il parvovirus B19 pu infettare ed emolizzate i precursori midollari dei globuli rossi109. Questo pu esitare in unimprovvisa e severa anemia nei pazienti con un latente
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disordine emolitico cronico che dipende da uneritropoiesi iperattiva per compensare la ridotta sopravvivenza degli eritrociti. I pazienti con unimmunodeficienza cellulare, compresi quelli con infezione da HIV, sono a rischio di viremia cronica e di unassociata anemia ipoplastica. Le infezioni durante la gravidanza predispongono allaborto spontaneo, a malformazioni fetali e ad idrope per la severa anemia e deficit circolatorio110. Lantigene P eritrocitario costituisce il recettore cellulare del parvovirus B19 e i soggetti che non possiedono lantigene P sono naturalmente resistenti allinfezione111. Dal 30 al 60% circa dei normali donatori di sangue hanno anticorpi specifici per il parvovirus B19, che indicano unimmunit piuttosto che uninfezione cronica persistente109. La viremia si verifica solo nella fase precoce dellinfezione e non vi prova che si verifichi un quadro di portatore; la frequenza della viremia nei donatori di sangue stata valutata con unincidenza compresa tra 1 su 3.300 e 1 su 40.000110. Il parvovirus B19 manca di un involucro lipidico e per questo motivo non viene inattivato da un trattamento con solvente/detergente o con linattivazione al calore utilizzando temperature inferiori ai 100C109. Il virus regolarmente rilevato nei concentrati dei fattori della coagulazione ed stato trasmesso a persone con emofilia. Sono state pubblicate rare trasmissioni trasfusionali con emocomponenti cellulari del sangue e del plasma, ma non con la somministrazione endovenosa di albumina o immunoglobuline110. Dopo la descrizione della sieroconversione per il parvovirus B19 (senza malattia clinica) in alcuni volontari durante la fase IV della valutazione clinica del plasma trattato con solvente/detergente, i produttori di plasmaderivati (con la collaborazione della FDA) hanno iniziato lo sviluppo e lapplicazione di uno screening NAT in minipool per le donazioni viremiche B19 ad alto titolo. Il razionale di questa scelta, supportata delle osservazioni derivate dalla valutazione della fase IV, che le donazioni con unelevata viremia inibiscono gli anticorpi neutralizzanti presenti nel pool di plasma, permettendo la trasmissione di questi virus altamente resistenti con alcuni plasmaderivati. La FDA ha classificato questo
MP-NAT come un controllo nel processo di produzione, piuttosto che un test di screening del donatore. Lo screening delle donazioni di sangue intero non ha avuto una priorit alta a causa sia della natura benigna e/o transitoria nella stragrande maggioranza della malattia da parvovirus, sia della disponibilit di un trattamento efficace (immunoglobuline endovena) per le sequele nelle patologie ematologiche croniche, sia dellestrema rarit dei casi di trasmissione del parvovirus B19 tramite i singoli emocomponenti112.
Le encefalopatie spongiformi trasmissibili

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE) sono disordini cerebrali degenerativi causati da agenti spesso indicati come prioni, che sono ritenuti essere delle proteine infettanti. Essi sono caratterizzati da lunghi periodi di incubazione, misurabili in anni o decenni, e dallestrema resistenza dei patogeni allinattivazione con metodi chimici e fisici solitamente sufficienti per i classici patogeni. Due tipi di TSE sono di particolare interesse nella Medicina Trasfusionale: la malattia di Creutzfeld-Jakob (CJD) e la variante della malattia di Creutzfeld-Jakob (vCJD). Malattia di Creutzfeld-Jakob classica La malattia di Creutzfeld-Jakob classica (CJD) un disordine cerebrale degenerativo che diventa rapidamente letale non appena si sviluppano i sintomi della demenza progressiva e dei disturbi motori. Circa l85% dei casi sono sporadici. I sintomi non si sviluppano per molti anni o diversi decenni dopo linfezione iniziale. Dal dieci al quindici per cento dei casi sono familiari e sono associati allereditariet di una delle almeno 20 mutazioni che sono state descritte nel gene prione che, nella sua forma non mutata, codifica per una normale proteina cellulare. In tutto il mondo si verifica circa un caso di CJD per milione di persone allanno e quasi tutti in soggetti anziani. Nella CJD sporadica per la maggioranza dei casi, la modalit di acquisizione sconosciuta. Lagente che causa la CJD resistente ai disinfettanti e agli sterilizzanti che vengono usati comunemente. La CJD
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iatrogena stata trasmessa con la somministrazione dellormone della crescita e dellormone gonadotropinico ottenuto da pool di tessuto pituitario umano, oppure attraverso lallotrapianto della dura madre ed anche attraverso la riutilizzazione di elettrodi elettroencefalografici intracerebrali che erano stati precedentemente utilizzati per pazienti infetti113. I primi studi sperimentali sugli animali indicarono la possibilit che la CJD potesse essere trasmessa con la trasfusione di sangue. Inoltre, venne osservata la trasmissione iatrogena con liniezione periferica di ormoni derivati dalla ghiandola pituitaria umana. Ci nonostante, diversi studi di popolazione basati su casi/controllo non hanno evidenziato alcuna prova che la trasfusione sia un fattore di rischio per lo sviluppo della CJD114-116. Gli individui con un maggiore fattore di rischio per la CJD vengono esclusi dalla donazione del sangue; questo gruppo comprende le persone che hanno ricevuto tessuti o derivati tissutali conosciuti per essere fonte dellagente responsabile della CJD (per esempio trapianto di dura madre, ormone della crescita di origine umana) e le persone con una storia familiare di CJD117-119. Al fine di esclusione del donatore, della quarantena dellunit e della sua distruzione, la anamnesi familiare stata definita come laver avuto un consanguineo con questa diagnosi. Tuttavia, un donatore con un membro della famiglia affetto dalla CJD pu essere accettato, se stata esaminata la sequenza del gene prione ed stata rilevata come normale. Variante della malattia di Creutzfeld-Jakob Nel 1996, venne descritto in Inghilterra (UK) il primo di un insolito gruppo di casi di CJD. Questi casi vennero successivamente indicati con il termine di variante della malattia di CreutzfeldJakob (vCJD) e sembravano essere causati dal medesimo prione che responsabile dellencefalopatia spongiforme bovina (BSE). Questo prione diverso da quello rilevato nella CJD classica. Un donatore infettato dal regime alimentare per esposizione alla BSE, durante il periodo di incubazione della vCVD potrebbe teoricamente infettare un paziente trasfuso. Di
conseguenza, le autorit sanitarie UK proibirono luso del plasma UK per ulteriori produzioni, limitarono luso del plasma UK per i bambini (nati durante o dopo il 1 gennaio 1996) ed applicarono la leucodeplezione totale delle componenti cellulari (per ridurre i prioni che noto siano presenti nei leucociti). stata riportata la trasmissione sperimentale della BSE tra due pecore (e quattro casi di trasmissione di scrapie naturale, una malattia prionica della pecora)120. La trasmissione si era verificata con il sangue prelevato nello stadio preclinico e clinico dellinfezione. Negli esseri umani sono stati osservati, in Inghilterra, due casi di trasmissione trasfusionale della BSE121,122 come risultato della sorveglianza di 48 soggetti che avevano ricevuto una componente labile del sangue da un totale di 15 donatori che successivamente avevano sviluppato i sintomi la vCJD. Nel primo caso di possibile trasmissione, il ricevente svilupp i sintomi della vCJD 6 anni e mezzo dopo aver ricevuto una trasfusione di emazie donate da un soggetto 3 anni e mezzo prima che manifestasse i sintomi della vCJD. Sebbene la fonte dellinfezione potesse essere di origine alimentare, per esposizione allagente responsabile della BSE, let del paziente era ben lontana da quella della maggior parte dei casi di vCJD, e la probabilit di osservare un caso di vCJD in un ricevente in assenza di una trasmissione trasfusionale dellinfezione venne valutata attorno a valori da 1 su 15.000 a 1 su 30.000, rendendo la trasmissione alimentare in questo caso improbabile121. Nel secondo caso probabile, il soggetto ricevette una trasfusione di sangue nel 1999 da un donatore che successivamente svilupp la vCJD. Questo paziente mor per cause non correlate con la vCJD, ma lesame post-mortem rilev la presenza della proteina prionica anormale nella milza e nei linfonodi del paziente123. In particolare, diversamente da tutti i casi precedenti di vCJD (originati da qualunque mezzo di trasmissione), nei quali tutte le persone coinvolte risultavano omozigoti per la metionina (MM) al codone 129 del gene codificante la proteina prionica (PRNP), questo soggetto era eterozigote (metionina-valina-MV). Tra gli Inglesi
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la distribuzione di questo gene nella popolazione risulta MM 42%, MV 47% e VV 11%123. Negli Stati Uniti, i donatori di sangue che si trovavano in Inghilterra o in Europa durante gli anni della potenziale esposizione allagente della BSE sono stati sospesi sulla base della durata della loro permanenza in quei luoghi. Bilanciando il rischio teorico, con le considerazioni relative alladeguatezza della disponibilit del supporto trasfusionale, la sospensione viene raccomandata per 3 mesi di permanenza cumulativa in Inghilterra tra il 1980 ed il 1996 (ed attuale, oltre che precedente, per il personale militare statunitense, il personale civile con impieghi militari e per i loro dipendenti che erano assegnati a basi europee per 6 mesi o pi durante questo periodo) oppure per 5 anni cumulativi di residenza in Europa. Sono inoltre esclusi i potenziali donatori che possono essersi iniettati insulina bovina proveniente dallInghilterra oppure hanno ricevuto trasfusioni in questo Paese durante la fase epidemica della BSE119.
La contaminazione batterica
La contaminazione batterica rimane una causa importante di morbilit e di mortalit della terapia trasfusionale. La contaminazione batterica degli emocomponenti ritenuta la causa di 29 trasfusioni (16%) con esito letale pubblicate dalla FDA tra il 1986 ed il 1991. Tuttavia, nel solo 2002, si sono verificati 17 decessi riportati alla FDA come causati dalla contaminazione batterica degli emocomponenti con maggiore frequenza costituiti da piastrine da aferesi contaminate e da piastrine preparate da sangue intero124,125. Sebbene i virus dellepatite, dellHIV e del WNV siano stati molto evidenziati sui mezzi di comunicazione e restino la principale preoccupazione dellopinione pubblica, la contaminazione batterica ritenuta essere la pi comune causa di morbilit e mortalit correlata alla trasfusione. Per dare unidea comparativa del rischio di contaminazione batterica, nel 2002 si sono verificati negli Stati Uniti 23 casi di trasmissione trasfusionale di WNV87. Di questi 23 riceventi, sette sono deceduti, ma
solo cinque di questi decessi erano associati alla meningoencefalite da WNV. Invece, i decessi determinati dalla contaminazione batterica sono stati oltre tre volte pi comuni di quelli dovuti al WNV. Per quanto possa essere accurata lesecuzione del prelievo di sangue, la sua processazione e la conservazione, la completa eliminazione degli agenti microbici impossibile. Si ritiene che i batteri provengano pi frequentemente dal donatore, in particolare dal sito della venipuntura o da una batteriemia asintomatica 126 . La moltiplicazione batterica pi probabile negli emocomponenti che vengono conservati a temperatura ambiente rispetto agli emocomponenti che sono mantenuti refrigerati126.I microrganismi che si moltiplicano negli emocomponenti refrigerati sono spesso degli organismi criofili Gram negativi (come la Yersinia enterocolitica , la Serratia liquefaciens e lo Pseudomonas fluorescens). I microrganismi Gram positivi sono pi spesso rilevati nelle piastrine conservate a temperature comprese tra i 20 e i 24C. Per i globuli rossi, la CDC valuta una frequenza di contaminazione sintomatica di circa 1 caso per milione di unit, principalmente per Yersinia Enterocolitica, seguita da S. liquefaciens127. In Nuova Zelanda lincidenza di una contaminazione sintomatica da Yersinia Enterocolitica nelle unit di globuli rossi stata valutata di 1 su 65.000 unit e con una frequenza di letalit di 1 su 104.000128. La trasfusione di ununit che pesantemente contaminata con un microrganismo Gram negativo determina spesso un evento rapido e catastrofico, con un veloce esordio della setticemia ed una frequenza di mortalit che superiore al 60% dei casi 129,130. Poich le piastrine sono conservate tra i 20 e i 24C per mantenere la loro efficacia e funzionalit, esse costituiscono uneccellente mezzo di coltura per i batteri. Le sepsi determinate dalla trasfusione di piastrine contaminate vengono ritenute essere sottovalutate e sottodescritte. La setticemia che si verifica dopo la trasfusione di piastrine contaminate non di solito un evento catastrofico, ma pu verificarsi diverse ore dopo la trasfusione e anche oltre, rendendo pi complessa la
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correlazione tra la trasfusione e la setticemia. Poich molti pazienti infettati con batteri provenienti dalla trasfusione delle piastrine sono immunocompromessi dalla loro patologia sottostante e dal trattamento (per esempio chemioterapia), levento viene spesso attribuito ad altre cause, come per esempio un catetere infetto che spesso coinvolge il medesimo microrganismo. Negli Stati Uniti, vengono trasfusi annualmente 4 milioni di unit di piastrine (1 milione di piastrine da aferesi e 3 milioni di piastrine separate da unit di sangue intero)130. Dato che approssimativamente da 1:1.000 a 1:2.000 unit di piastrine sono contaminate da batteri (come viene rilevato dalle colture aerobiche condotte in numerose indagini prima del 2002), ci si deve attendere che da 2.000 a 4.000 unit contaminate da batteri verranno trasfuse131. Si
stima che una parte di queste unit determiner segni o sintomi in circa 1 caso su 10. Tuttavia, nellunica indagine che ha prospettivamente messo in coltura le piastrine che erano state trasfuse, i sintomi si sono verificati in 3 casi su 8 (35,8%) dei pazienti che avevano ricevuto pool di piastrine risultati positivi in coltura, ma Gram negativi132. In particolare, sei pool di piastrine con batteri Gram positivi sono stati bloccati e mai trasfusi. Cos, dai prodotti contaminati ci si deve attendere che, se trasfusi, determinino una sepsi clinicamente rilevabile da forse 1/10 fino a 2/5 dei casi (da 200 a 1.600 casi). I rilievi pubblicati delle indagini nazionali condotte negli Stati Uniti, Gran Bretagna e Francia (Tabella 28.4) indicano che di queste forse da 1/5 a 1/3 avranno un esito fatale (da 40 a 533 decessi allanno)127,133,134.
Tabella 28.4 - Sommario dei microrganismi identificati negli studi* BaCon, SHOT e BACTHEM Microrganismo Gram positivi Bacillus cereus Staphylococci Coagulasi-negativo Streptococcus sp Staphylococcus aureus Propionibacterium acnes Subtotale Gram negativi Klebsiella sp. Serratia sp. Escherichia coli Acinetobacter Enterobacter sp. Providencia rettgeri Yersinia enterocolitica Subtotale Totale Stati Uniti127 1 9 3 (1) 4 17 (1 = 6%) Inghilterra133 Francia134 Totale
4 (1) 6 (1) 2 2 (1) 14 (3 = 21%)
2 5
3 10 (0 = 0%) 2 (1) 1 (1) 1 1 1
7 (1) 20 (1) 5 (1) 6 (1) 3 41 (4 = 10%)
2 (1) 3 (3) 2 (1) 8 (2) 1 2 (1) 1 (1) 4 (2) 1 (1) 1 (1) 1 1 1 (5 = 45%) 3 (2 = 67%) 6 (2 = 33%) 20 (9 = 45%) 28 (6 = 21%) 17 (5 = 29%) 16 (2 = 13%) 58 (13 = 14%) 2 (2) 5 (1)
* Viene elencato il numero dei casi (letali) e la percentuale dei casi subtotali e totali. Questa tabella evidenzia che, sebbene i microrganismi Gram positivi siano responsabili della maggioranza dei casi riferiti (41/58 = 71%), i microrganismi Gram negativi sono la causa della maggior parte dei decessi (9/11 = 82%). Da Brecher e Hay131, adattamento autorizzato. Vi sono 17 casi di microrganismi Gram positivi identificati negli studi negli Stati Uniti; tuttavia, solo un caso (1/17 = 6%) ha avuto esito fatale.
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Questo porta a un rischio di morte calcolabile tra 1:7.500 e 1:100.000 casi determinati da trasfusioni di unit di piastrine contaminate dai batteri. Le osservazioni cliniche degli ospedali universitari con unelevata conoscenza delle sepsi correlate con le trasfusioni di piastrine confermano queste stime. Una frequenza di letalit di 1:17.000 stata riferita da Ness et al. , dal Johns Hopkins, con i pool di piastrine preparati dal sangue intero e di 1:61.000 con concentrati piastrinici da aferesi 135. Gli Ospedali Universitari di Cleveland rilevano unanaloga frequenza di letalit di circa 1:48.000 per i concentrati di piastrine derivati dal sangue intero 136. Con lapplicazione dellindagine batteriologica sulle piastrine (vedi di seguito), si prevede che questa frequenza potr essere molto ridotta. Considerazioni cliniche Le reazioni severe sono caratterizzate da febbre, shock e da coagulazione intravascolare disseminata (DIC). Se si sospetta una contaminazione batterica, la trasfusione deve essere interrotta immediatamente e deve essere eseguito al pi presto, dopo il rilievo della reazione, uno striscio con la colorazione di Gram ed unemocoltura da un prelievo del paziente e da un campione prelevato dallunit trasfusionale (non dal segmento di deflussore perch la sacca pu essere contaminata, ma da un segmento direttamente collegato allunit). La moltiplicazione batterica pu determinare il consumo dellossigeno nellunit di globuli rossi con la conseguente desaturazione dellemoglobina e lemolisi eritrocitaria, eventi che contribuiscono entrambi ad un inscurimento dellunit se si confronta con il colore del sangue nel segmento collegato e saldato. Le variazioni di colore (dal porpora scuro al nero), la presenza di coaguli nella sacca oppure lemolisi indicano una contaminazione, ma laspetto del sangue nella sacca spesso non significativo. La presenza di batteri nello striscio dellemocomponente con la colorazione di Gram conferma linquinamento, ma lassenza di microrganismi osservati non ne esclude la possibile presenza. La colorazione di Gram ha una
sensibilit solo da 106 a 107 CFU/mL. Deve quindi essere eseguita la coltura del sangue del paziente, dellemocomponente sospetto e delle soluzioni somministrate endovena in tutti i tubi deflussori utilizzati per linfusione. Il trattamento non deve attendere i risultati di queste indagini e deve comprendere la somministrazione immediata per via endovenosa di antibiotici associati alla terapia per lo shock, per il blocco renale e per la DIC, se sono presenti. Misure preventive La prevenzione delle reazioni settiche si basa sulla riduzione preventiva della contaminazione batterica degli emocomponenti. Il primo e pi importante passo costituito dallaccurata selezione dei donatori in buona salute. Laspetto del donatore e la recente anamnesi medica devono rilevare uno stato di buona salute; ulteriori chiarimenti possono rendersi necessari se vi una storia recente relativa alluso di antibiotici, o di interventi medici o chirurgici, o di un qualunque sintomo sospetto. Le domande per chiarire la possibilit di una batteriemia sono particolarmente importanti per i donatori di trasfusione autologhe che sono stati ricoverati recentemente in ospedale, sottoposti a una terapia antibiotica o a procedure diagnostiche o terapeutiche invasive; vi sono diverse segnalazioni di complicazioni per setticemie da Yersinia Enterocolitica dopo linfusione di sangue autologo conservato. Una scrupolosa attenzione deve essere applicata alla selezione e alla detersione dellarea per la flebotomia del donatore. La preparazione della pelle riduce, ma non elimina completamente, la possibile contaminazione batterica degli emocomponenti. Aree con abrasioni cutanee causate da precedenti dermatiti o cicatrici determinate da ripetute flebotomie possono ospitare batteri e devono quindi essere evitate. Il sapone naturale non deve essere usato per la preparazione dellarea da utilizzare per la flebotomia. stata proposta leliminazione della prima aliquota di sangue del donatore (deviazione) come misura cautelare per ridurre la
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contaminazione batterica degli emocomponenti. Questa misura intende rimuovere i frustoli di pelle che possono entrare nellunit di sangue dalla cavit dellago utilizzato nella flebotomia. Il sistema stato pensato per semplificare lapplicazione di questo approccio e ci si aspetta che riduca la contaminazione dovuta alla pelle (dove presente la stragrande maggioranza dei microrganismi Gram positivi). La fagocitosi dei batteri contaminanti da parte dei leucociti del donatore negli emocomponenti pu essere importante nella riduzione della contaminazione batterica di significato clinico. La leucodeplezione, con la contemporanea eliminazione dei batteri aderenti o fagocitati, stata sostenuta come un approccio utile per la riduzione della contaminazione da Yersinia Enterocolitica dei globuli rossi137,138. Laccuratezza nella preparazione degli emocomponenti e nella manipolazione dei materiali utilizzati nella somministrazione del sangue essenziale. Se viene utilizzato un bagnomaria, gli emocomponenti devono essere protetti con un involucro, le vie di scarico devono essere ispezionate per lassenza di fluidi stagnanti e il bagnomaria deve essere frequentemente svuotato e disinfettato. In tutto il mondo, lo screening per la contaminazione batterica delle piastrine sta cominciando ad essere applicato. Lo screening obbligatorio in molte nazioni [per esempio Belgio (Croce Rossa Fiamminga), Paesi Bassi, Hong Kong (Croce Rossa) e Galles]139. Negli Stati Uniti, la Commissione per lAccreditamento dei Laboratori del Collegio dei Patologi Americani (CAP, College of American Pathologists ) ha aggiunto una richiesta alla checklist della Medicina Trasfusionale per assicurare la presenza di una procedura di laboratorio per il rilievo dei batteri nei concentrati piastrinici (TRM. 44955)140. Analogamente, lAABB richiede la ricerca dei batteri62(p11). Attualmente, sono state approvate dalla FDA, e sono disponibili negli Stati Uniti, due tecniche colturali per il controllo qualitativo delle piastrine leucodepleti. A causa degli elevati costi e per motivi logistici le piastrine ottenute dal sangue intero vengono
spesso esaminate negli Stati Uniti con procedure meno sensibili, ma pi rapide, come lesame dello striscio colorato oppure i marcatori surrogati del metabolismo batterico (per esempio, il pH ed il glucosio). Diverse altre strategie per un rilievo pi veloce e sensibile sono in fase di sviluppo o non sono ancora disponibili. Nella Figura 28.4 viene delineato un possibile algoritmo per la conferma dopo la rilevazione di una coltura positiva di ununit di piastrine. La prospettiva di conservazione prolungata Lestensione della crescita batterica negli emocomponenti piastrinici correlata alla durata della conservazione. Nel 1983, in riconoscimento delle migliorate condizioni tecniche di conservazione, la FDA ha aumentato i limiti di conservazione delle piastrine a temperatura ambiente da 3 a 7 giorni. Tuttavia, ha poi ridotto i limiti a 5 giorni nel 1986, rispondendo alle segnalazioni sulla contaminazione batterica dopo pi di 5 giorni di conservazione142. Limpiego di sistemi di rilevazione della contaminazione batterica stato fornito come fondamento logico per una estensione del periodo di conservazione delle piastrine fino a 7 giorni in molte nazioni Europee e sta iniziando ad essere applicato negli Stati Uniti139.
La sifilide
La sifilide determinata da una spirocheta, il Treponema pallidum , che viene tipicamente trasmessa con i rapporti sessuali. La fase di spirochetemia breve e il microrganismo sopravvive solo per pochi giorni a 4C. Tuttavia la trasmissione trasfusionale possibile, anche se la sua incidenza estremamente rara (lultimo caso riferito negli Stati Uniti si verificato nel 1965). La prevenzione della trasmissione trasfusionale della sifilide non pu essere efficacemente prevenuta sottoponendo il sangue del donatore a degli esami sierologici standard per la sifilide (STS), perch la sieroconversione si verifica spesso dopo la fase della spirochetemia.
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Coltura batterica positiva
2 1
Inizio dellidentificazione della colonia isolata
No
Quarantena degli altri emocomponenti
La ripetizione della coltura non presenta flora batterica: falso positivo della coltura iniziale
Eliminare gli emocomponenti in quarantena. Nessuna azione La ripetizione della coltura presenta ulteriore. diversi microrganismi (nellipotesi che la coltura iniziale, quella ripetuta o Vai a1 entrambe, siano falsamente positive, ritestare unaltra aliquota presa dallunit).
La coltura ripetuta presenta lo stesso Eliminare gli emocomponenti microrganismo: la coltura iniziale in quarantena viene confermata
Il microrganismo probabilmente un contaminante della pelle (per esempio Staph). Oppure verosimilmente penetrato con una batteriemia (per esempio enterico)?
Flora cutanea
Non necessaria alcuna notificazione al donatore
*Se stato coltivato in pool, se possibile, ripetere le colture sulle singole unit o loro aliquote.
Figura 28.4 - Possibile strategia investigativa per una coltura positiva in ununit di piastrine. Adattamento autorizzato141.
Ripetizione della coltura dellunit (automatizzato)
Accertare se lunit di piastrine stata trasfusa
Rapportarsi con i clinici ospedalieri. Richiesta dei dati del follow-up del paziente
Conservare unaliquota* della coltura, se possibile, recuperata dal sistema automatico
Vai a2
La batteriemia probabile
oppure il donatore coinvolto in pi casi
Contattare il donatore: - anamnesi sullo stato di salute ed esposizioni recenti; - emocoltura; - considerare la sospensione.
Considerare: - indagine sulle precedenti donazioni/trasfusioni; - quarantena degli emocomponenti non scaduti reperibili.
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La maggior parte dei risultati STS positivi riflette anormalit immunologiche che non sono correlate con la sifilide (falsi positivi biologici), oppure correlano con una sifilide non infettiva trattata inadeguatamente che costituisce pi una minaccia per il soggetto che viene esaminato che per un ricevente, oppure rappresenta il residuo sierologico di uninfezione che stata efficacemente trattata. Un recente articolo descrive lesame del DNA e dellRNA del Treponema pallidum di 169 aliquote provenienti da concentrati piastrinici reattivi con gli STS e confermati positivi con lassorbimento in fluorescenza dellanticorpo per il Treponema143. Questa serie comprendeva 48 donatori positivi con il test reaginico rapido su plasma (compatibile con una malattia recente o attiva). Nessun campione conteneva il DNA o lRNA del Treponema pallidum , indicando una bassa probabilit che il sangue dei donatori che hanno un esame per la sifilide confermato come positivo sia effettivamente infettivo per la sifilide. Ci nonostante, uno studio del CDC ha evidenziato che dal 1995 al 2000, 22 casi di sifilide primaria, 81 sifilidi secondarie e 413 casi prima latenti di sifilide sono stati identificati attraverso lo screening del sangue o del plasma dei donatori negli Stati Uniti144. Per questo motivo, lo screening dei donatori per la sifilide pu avere ampie implicazioni di salute pubblica. Attualmente, lesecuzione degli STS ancora richiesto62(pp33,34).
Le infezioni trasmesse dalle zecche

Poich molti agenti patogeni delle infezioni trasmesse dalla puntura delle zecche circolano nel sangue, teoricamente possibile che possano essere trasmessi con la trasfusione degli emocomponenti. Babesia Eventi clinici Negli Stati Uniti, linfezione trasmessa dalle zecche che con maggiore frequenza viene riconosciuta associata con la trasfusione la babesiosi154. La babesiosi viene trasmessa di
solito con la puntura di una zecca infetta, parassita del cervo e viene rilevata con frequenza maggiore nelle aree costiere e sulle isole del Nord-Est degli Stati Uniti, comprendendo Marthas Vineyard, Cape Cod e Long Island. Le aree geografiche dei vettori e dei portatori sembrano essere in espansione146. La babesiosi trasmessa con la trasfusione stata documentata in oltre 50 casi determinati prevalentemente dalla Babesia microti nel Nord-Est, ma anche dal parassita Babesia di tipo-WA1 recentemente riconosciuto e rilevato in alcuni donatori di sangue infetti, ma asintomatici145-147. Quanto pi gli uomini continuano a entrare negli habitat dei vettori e nelle riserve naturali dellinfezione [per esempio cervi (ed altri cervidi) e popolazioni di topi presenti nel Nord-Est degli Stati Uniti], tanto pi la frequenza della trasmissione trasfusionale della babesiosi pu aumentare. Il vettore e il bacino della Babesia individuati pi recentemente nel Nord-Ovest e nellOvest degli Stati Uniti devono essere ancora definiti. La specie della Babesia sopravvive durante la conservazione del sangue almeno per 35 giorni ed oltre, e pu essere trasmessa sia con i globuli rossi che con i concentrati piastrinici. La babesiosi determina tipicamente una malattia febbrile con anemia emolitica, ma linfezione pu anche determinare una parassitemia cronica asintomatica o lievemente sintomatica. Gli studi evidenziano che le persone non trattate possono ospitare il DNA della Babesia microti per lunghi periodi con una sintomatologia lieve o del tutto assente, e possono trasmettere linfezione per mesi o anche pi a lungo148. I sintomi sono spesso cos modesti che linfezione non viene riconosciuta, il che spiega la bassa frequenza di casi riportati di trasmissione trasfusionale della babesiosi. I pazienti sintomatici presentano la febbre da 2 a 8 settimane dopo la trasfusione, qualche volta associata con brividi, mal di testa, emolisi oppure emoglobinuria. Raramente, si sviluppa unanemia emolitica pericolosa per la vita, blocco renale e coagulopatia, in particolare nei pazienti che sono stati splenectomizzati o sono severamente immunocompromessi. 14
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Misure preventive Lo stato di portatore di Babesia pu essere asintomatico e pu superare un anno di durata. Le persone con unanamnesi di babesiosi vengono sospese definitamente, perch dopo la guarigione di una malattia sintomatica pu seguire una parassitemia di lunga durata, anche per tutta la vita. Politiche restrittive, come la rinuncia alla raccolta di sangue durante i mesi primaverili ed estivi nelle aree dove i vettori della malattia sono endemici e quando le punture delle zecche sono pi frequenti, vengono praticate in alcune aree, ma probabilmente sono di scarsa utilit. Nessun test disponibile per degli screening di massa utili per individuare i portatori asintomatici della specie Babesia. Altri agenti stato documentato un caso di trasmissione trasfusionale della febbre a macchie delle Montagne Rocciose (Rickettsia rickettsii), mentre nessun caso di erlichiosi monocitica (causata dallErlichia chaffeensis) mai stato riferito150. stato riportato un singolo caso di possibile trasmissione trasfusionale dellanonimo agente patogeno dellerlichiosi umana granulocitica151. Nel 1997, la febbre a macchie delle Montagne Rocciose e/o lerlichiosi monocitica umana si sono sviluppate tra i tirocinanti della Guardia Nazionale a Fort Chaffee, AR. Dieci emocomponenti che erano stati donati da tirocinanti infetti vennero trasfusi prima che fossero richiamati; ma nessuna delle persone che ricevettero il sangue dai donatori infetti divenne clinicamente ammalata152. La malattia di Lyme linfezione da zecche pi comune negli Stati Uniti. La Borrelia burgdorferi, la spirocheta patogena responsabile, viene trasmessa attraverso le punture delle zecche dei cervi. Non stato riferito nessun caso di trasmissione trasfusionale, ma possono verificarsi infezioni croniche con un andamento subclinico e microrganismi inoculati sperimentalmente hanno dimostrato di poter sopravvivere alle condizioni di conservazione tramite congelamento, raffreddamento oppure a temperatura ambiente153. Daltra parte, la fase della spirochetemia sembra essere associata con i sintomi della malattia che
renderebbero non idoneo un potenziale donatore e nei due casi riferiti nei quali il donatore ha manifestato la malattia poco dopo la donazione, il ricevente non ha sviluppato linfezione149. I donatori potenziali con unanamnesi di malattia di Lyme devono essere completamente asintomatici e aver completato un protocollo completo di terapia antibiotica prima che sia loro permesso di donare. La trasmissione trasfusionale degli agenti patogeni che sono veicolati dalla puntura delle zecche biologicamente plausibile e, per alcuni agenti, stata dimostrata. Tuttavia, variazioni nellattuale screening dei donatori non sono probabilmente utili a causa del loro scarso valore predittivo e per la potenzialit di domande imprecise che possono comportare la sospensione di un ampio numero di donatori per un modesto incremento della sicurezza trasfusionale153.
Altre complicanze infettive non virali della trasfusione del sangue

Malaria La malaria causata da diverse specie di protozoi intraeritrocitari del genere Plasmodium. La trasmissione si verifica di solito attraverso la puntura di una zanzara anofele, ma linfezione pu anche essere conseguente alla trasfusione di sangue infetto da parassita. Bench sia molto rara negli Stati Uniti, la malaria probabilmente la complicanza parassitologica della trasfusione pi frequentemente riconosciuta; il rischio negli Stati Uniti viene valutato essere <0,3 casi per milione di trasfusioni154,155. Dal 1963 al 1999, negli Stati Uniti sono stati riferiti dal CDC 155 93 casi di malaria trasmessa con le trasfusioni (in 10 casi con esito letale)155. Le specie coinvolte nei casi di trasmissione trasfusionale della malaria negli Stati Uniti sono: P. falciparum (35%), P. malariae (27%), P. vivax (27%), P. ovale (5%)155. Nel 3% dei casi si trattava di parassitosi miste e nel 2% dei casi non venne identificata la specie di Plasmodium. La febbre, i brividi, il mal di testa e lemolisi si verificano da una settimana e un mese dopo la trasfusione infetta; la morbilit variabile, ma pu essere
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grave, e il decesso si verificato in alcuni pazienti soprattutto a causa del P. falciparum. Il rischio di un esito letale pu essere aumentato dalla mancanza della risposta immune da parte del paziente che riceve la trasfusione infetta, dalle condizioni di base del paziente, da un ritardo nella diagnosi per lassenza di un sospetto diagnostico e dalla scarsa familiarit con la malattia nelle aree dove il parassita non endemico. Il parassita malarico sopravvive per almeno una settimana negli emocomponenti conservati a temperatura di laboratorio o a 4C. Il Plasmodium pu sopravvivere anche alla criopreservazione in glicerolo ed al successivo scongelamento. Ogni emocomponente che contenga globuli rossi pu trasmettere linfezione per via non gametica del parassita intracellulare. I portatori asintomatici della malattia costituiscono di solito la fonte della malaria trasmessa con la trasfusione anche se la densit dei parassiti a livello ematico molto bassa. Le infezioni asintomatiche persistono raramente per pi di tre anni, ma le infezioni asintomatiche da P. falciparum e P. vivax possono persistere per 5 anni, da P. ovale per 7 anni e il P. malariae pu risultare trasmissibile per tutta la vita di un individuo asintomatico. In casi estremi, le trasmissioni di P. vivax, P. ovale, P. falciparum e P. malariae sono state riferite rispettivamente a distanza di 27, 7, 13 e 53 anni156. Non vi alcun adeguato test sierologico utile a rilevare la trasmissibilit della malaria da parte di donatori asintomatici. La trasmissione della malaria viene prevenuta con lesclusione dei donatori che presentano un possibile rischio di infettivit aumentato, sulla base di una valutazione della loro anamnesi e dei loro viaggi. LAABB richiede che i donatori con pregressa diagnosi di malaria, oppure che siano vissuti o abbiamo viaggiato in aree dove la malaria endemica e abbiamo sintomi non chiari che possano essere suggestivi per la malaria, siano sospesi dalle donazioni per tre anni dopo essere divenuti asintomatici62(p65). I soggetti che sono vissuti per almeno 5 anni consecutivi in aree nelle quali la malaria considerata endemica secondo il CDC Malarial Branch devono essere sospesi per 3 anni dopo
la partenza da queste aree. Gli individui che hanno viaggiato in zone dove la malaria endemica devono essere sospesi per 12 mesi dopo la partenza da queste zone. Il periodo di sospensione deve essere applicato indipendentemente dallassunzione della profilassi antimalarica da parte del soggetto.Informazioni ulteriori relative al rischio della malaria in tutto il mondo sono reperibili presso il CDC, e sono disponibili anche delle risorse on-line nel sito (http://www.cdc.gov/travel/ yb/outline.htm#2). Malattia di Chagas La tripanosomiasi americana, o malattia di Chagas, una patologia endemica nel Sud e nel Centro America ed causata da un protozoo parassita, il Tripanosoma cruzi. Linfezione viene trasmessa allessere umano con la puntura della cimice reduvid (detta cimice dal naso a cono o che bacia) che di solito vive nelle cavit degli alberi, sugli alberi di palma, nei rivestimenti di paglia e fango oppure nelle abitazioni di legno. Lacquisizione per via naturale della malattia di Chagas eccezionalmente rara negli Stati Uniti. Solo cinque casi sono stati riconosciuti dal 1955, ed il pi recente si verificato nel Tennessee nel 1998157. Eventi clinici Il Tripanosoma cruzi infetta gli esseri umani attraverso la pelle o le mucose che siano entrate in contatto con le feci di una cimice reduvid infetts, di solito questo si verifica con una puntura da parte dellinsetto. Le infezioni recenti sono di solito asintomatiche oppure con segni molto modesti, ed i sintomi generalmente non vengono rilevati. Raramente, il punto di ingresso si evolve in un nodulo eritematoso che viene detto chagoma, che pu essere accompagnato da una linfoadenopatia. Pu seguire la febbre con lingrossamento della milza e del fegato. Un bambino piccolo infettato da poco pu andare incontro al rischio di una miocardite acuta o di una meningoencefalite. Linfezione acuta di solito si risolve senza terapia, ma frequente la permanenza di una parassitemia a basso livello e fino a un terzo degli
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individui infettati sviluppano una forma cronica che associata a una sintomatologia cardiaca ed intestinale che si manifesta dopo anni o decenni158. Considerazioni trasfusionali La trasfusione di sangue ha costituito unimportante fonte di infezione da Tripanosoma cruzi nei centri urbani Sud Americani che ricevono un grande numero di immigranti provenienti dalle zone rurali dove il parassita endemico. Tuttavia, in molte nazioni, lo screening sierologico si dimostrato efficace nella riduzione del rischio della trasmissione trasfusionale della malattia di Chagas. Negli Stati Uniti sono stati riferiti quattro casi di trasmissione trasfusionale della malattia di Chagas 158, verificatisi a New York, Los Angeles, in Texas e in Florida. Tutti si sono manifestati in pazienti immunocompromessi. Due ulteriori casi si sono verificati in Manitoba, Canada. In uninteressante indagine sono stati esaminati con il test EIA alcuni campioni di sangue post-operatori provenienti da 11.430 pazienti sottoposti a interventi di cardiochirurgia, i campioni risultati ripetutamente reattivi con il test EIA sono stati verificati con un test di radioimmunoprecipitazione. Sei campioni post-operatori vennero confermati positivi (0,05%). Tutti e sei i pazienti sieropositivi erano stati apparentemente infettati dal Tripanosoma cruzi prima dellintervento chirurgico; tuttavia, una diagnosi pregressa della malattia di Chagas, non era nota e nemmeno ipotizzata per nessuno di questi pazienti. Non si rilev alcuna prova di uneventuale trasmissione trasfusionale del Tripanosoma cruzi159. Sono stati sviluppati test di screening EIA ragionevolmente sensibili e specifici per rilevare gli anticorpi contro il Tripanosoma cruzi e anche un test di conferma Western blot ed uno di radioimmunoprecipitazione158. Gli esami eseguiti in numerosi Centri Trasfusionali degli Stati Uniti che sono collocati in aree con una popolazione che comprende unampia componente di immigrazione della popolazione proveniente dal Centro e Sud America, hanno rilevato una sieroprevalenza variabile dal 0,1 al 0,2% tra donatori a rischio, identificati tramite questionario160,161.
Tuttavia, le indagini in look back non hanno rilevato riceventi infetti ed anche probabile che non tutti i donatori a rischio siano stati identificati con il questionario160. Di conseguenza, se il test di screening dovesse essere applicato, si renderebbe necessario esaminare tutti i donatori. Altri parassiti La toxoplasmosi causata da un parassita ubiquitario il Toxoplasma gondii e la sua infezione stata riferita come uninsolita complicanza trasfusionale che si verificata in alcuni pazienti immunocompromessi162 . La malattia non stata considerata un problema significativo nella routine della pratica trasfusionale. Vi sono state segnalazioni occasionali di trasmissioni per via trasfusionale di infezioni dovute a vermi in Paesi diversi dagli Stati Uniti162. La microfilariasi costituisce un potenziale rischio trasfusionale nelle zone tropicali, potendo essere acquisita dai donatori attraverso le punture degli insetti che ospitano la Wuchereria bancrofti. La trasmissione trasfusionale delle speci di Leishmania un raro rischio che presente nelle nazioni dove questo parassita endemico. Attualmente, lAABB sospende i potenziali donatori che sono stati in Iraq nei precedenti 12 mesi, in conseguenza della possibile esposizione alla Leishmania163.
La riduzione del rischio di trasmissione di malattie infettive

In generale, il rischio per unit di trasmettere una malattia con la trasfusione significativamente modesto (Tabella 28.5). Questa bassa incidenza dovuta allo screening clinico dei donatori e agli esami che vengono eseguiti per le specifiche malattie. Nondimeno, negli emoderivati che vengono prodotti dai pool, i quali possono contenere componenti provenienti da migliaia di donatori, il rischio della trasmissione di malattie aumentato. Per questo motivo, sono state sviluppate ed applicate diverse strategie per ridurre ulteriormente il rischio di trasmissione di malattie
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Tabella 28.5 - Il rischio infettivo della trasfusione di sangue negli Stati Uniti Agente infettivo o risultato Rischio stimato per unit trasfusa Stima % delle unit infette che trasmettono o causano sequele cliniche* Bibliografia
Virus HIV-1 e -2 HTLV-I e -II HAV HBV HCV B19 parvovirus
1:1.400.000-1:2.400.000 1:256.000-1:2.000.000 1:1.000.000 1:58.000-1:147.000 1.872.000-1:1.700.000 1:3.300-1:40.000
90 30 90 70 90 Bassa 1:10.000.000 letale > 40% esitano in sequele cliniche
23, 29, 30 84 164 29 23, 29, 30 110 165 30, 132, 166
Batteri Globuli rossi 1:1.000 Piastrine (screening con 1:2.000-1:4.000 colorazione di Gram, pH o concentrazione di glucosio) (screening con precoci <1:10.000 colture aerobiche) Parassiti Babesia e malaria Trypanosoma cruzi <1:1.000.000 Non noto
Non noto
Non noto <20
145, 156, 164 158
* Unit confermate positive per lagente infettante. Il rischio pi elevato nelle aree in cui la Babesia endemica. Nota: il WNV non stato compreso in questa tabella per la differenze temporali e analitiche (per esempio minipool rispetto a esami in singolo), per la riduzione della frequenza di infezioni e per il fatto che tutti gli esami negli Stati Uniti stanno iniziando ad essere condotti sotto un nuovo protocollo di indagine sui farmaci.
attraverso emoderivati acellulari provenienti da pool e, in alcuni casi, anche attraverso emocomponenti cellulari. Inattivazione/distruzione degli agenti patogeni negli emoderivati o nei prodotti del plasma Il primo intervento che stato specificamente introdotto per ridurre il rischio della trasmissione di epatite stato il riscaldamento (a 60C per 10 ore), utilizzato per la produzione dellalbumina gi dal 1948167. La procedura risult solo parzialmente
affidabile per quei rari casi nei quali linfezione si verificava anche con le frazioni plasmaproteiche che erano state preparate con questo trattamento. Immunoglobuline Il processo di frazionamento del plasma utilizzato per la maggior parte dei prodotti immunoglobulinici utilizza la precipitazione a freddo con etanolo dopo la rimozione del crioprecipitato. Storicamente, quando erano presenti nel plasma di anticorpi anti-HCV, questo processo concentrava lHCV nel crioprecipitato
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ricco di Fattore VIII ed in altre frazioni, lasciandone ben poco nella frazione immunoglobulinica. La frazione immunoglobulinica presenta anche unelevata concentrazione di anticorpi che neutralizzano il virus ed il prodotto che ne risulta per uso intramuscolare ha un rischio particolarmente basso168 di trasmissione del virus. Ci si aspettava che le preparazioni delle immunoglobuline per la somministrazione endovenosa (IGIV) fossero analogamente incapaci di trasmettere le malattia. Tuttavia, nel 1980, durante i primi studi clinici per i prodotti IGIV, si verific negli Stati Uniti la trasmissione dellepatite NANB, come era successo anche in Europa con i prodotti IGIV realizzati di routine169. Alla fine del 1993, e allinizio del 1994, in tutto il mondo si verific un episodio di oltre 200 casi di infezione da HCV tutte originate da una singola preparazione di IGIV certificata negli Stati Uniti170,171. In questo caso, la trasmissione virale si era verificata apparentemente per la mancanza di un passaggio di inattivazione virale nel processo specifico di preparazione di questo prodotto172,oltre che per la mancanza degli anticorpi anti-HCV, in grado di complessare e neutralizzare il virus, in conseguenza allo screening per lanti-HCV eseguito per il plasma dei donatori, con il risultato di un accumulo di particelle virali infettive nella frazione immunoglobulinica170. Il plasma source anti-HCV positivo era stato escluso dai produttori di IGIV sin dal 1992. Limportanza del metodo di preparazione viene evidenziato anche dagli episodi di infezioni da HCV in conseguenza della somministrazione di immunoglobuline anti-D che si sono verificate in Germania alla fine del 1970 ed in Irlanda dalla fine degli anni 70 allinizio degli anni 90173,174. Entrambi i prodotti erano stati preparati con una procedura di cromatografia a scambio ionico invece del frazionamento con etanolo freddo (Cohn)175. Per prevenire ulteriori infezioni da HCV, la FDA ha richiesto, sin dal 1994, un passaggio idoneo per leliminazione dei virus nel processo della produzione manifatturiera delle immunoglobuline, oppure la dimostrazione, utilizzando una metodologia NAT, dellassenza dellHCV nel prodotto finito. Inoltre, la tecnologia
NAT viene utilizzata attualmente per lo screening di plasma source come livello supplementare di sicurezza. I fattori della coagulazione Fino allinizio del 1980, i concentrati dei fattori della coagulazione trasmettevano frequentemente infezioni virali. Non appena venne riconosciuta limportanza della trasmissione dellHIV, venne applicato un passaggio di inattivazione virale pi rigoroso per il Fattore VIII e per gli altri concentrati dei fattori della coagulazione, anche se inizialmente questi passaggi vennero introdotti nella speranza di ridurre la trasmissione dellepatite virale. Sfortunatamente, unampia parte della popolazione di emofilici (oltre il 50%) che avevano ricevuto i concentrati dei fattori prodotti prima che il processo venisse attuato, si era ormai infettata con lHIV. Lepatite cronica era una complicanza aggiuntiva in quasi tutti i pazienti emofilici che avevano ricevuto i vecchi prodotti dei fattori della coagulazione176. Linstabilit termica del Fattore VIII rendeva difficile lo sviluppo di unefficace trattamento al calore, fino a quando un approccio pratico venne universalmente adottato nel 1985. Da allora sono stati introdotti molti passaggi di inattivazione virale ed ora i fattori della coagulazione sono generalmente considerati prodotti molto sicuri. Ogni procedura ha i propri vantaggi e svantaggi. Luso di solventi e detergenti organici inattiva i virus che hanno un involucro lipidico (per esempio: HIV, HBV, HCV, HTLV, EBV, CMV, HHV-6, HHV-8), ma inefficace contro gli agenti patogeni che non hanno un involucro, come lHAV ed il parvovirus B19. I passaggi di inattivazione virale hanno la potenziale controindicazione di ridurre la forza e lefficacia biologica del prodotto. Unulteriore preoccupazione deriva dalla possibilit che i passaggi di inattivazione virale possano alterare limmunogenicit del prodotto, specialmente per quanto riguarda linduzione di inibitori del Fattore VIII nei pazienti emofilici. I rischi attuali dei derivati del plasma umano. Molti metodi sono altamente efficaci contro i virus capsulati, ma sporadiche segnalazioni di
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trasmissione virale continuano a verificarsi, probabilmente attribuibili ad incidenti od errori durante il processo di produzione. La combinazione del trattamento al calore, del trattamento con solventi/detergenti ed il passaggio di purificazione con anticorpi monoclonali, fornisce concentrati dei fattori della coagulazione con un rischio di trasmissione dellepatite e dellHIV inferiore a quello determinato dalluso del Fattore antiemofilico crioprecipitato ottenuto dalla donazione individuale volontaria di sangue intero. La trasmissione documentata di HBV, HCV o di HIV con derivati del plasma certificati negli Stati Uniti rara dopo lintroduzione delle efficaci procedure di inattivazione virale e del potenziamento dello screening virologico. Sebbene lassoluta sicurezza dei prodotti derivati dal plasma umano non possa essere garantita, partire con la massima sicurezza possibile del plasma donato, comporta la riduzione della carica virale e contribuisce al raggiungimento di eccellenti risultati di sicurezza dei prodotti assoggettati allinattivazione/rimozione dei virus177. Prodotti non derivati da plasma umano. Il concentrato di Fattore VIII prodotto con la tecnologia del DNA ricombinante stato certificato per lutilizzo e ha iniziato ad essere impiegato come preparazione di prima scelta per pazienti emofilici non precedentemente trattati178. I batch di lavorazione vengono prodotti tramite colture con cellule di mammiferi ingegnerizzate per secernere Fattore VIII nel medium sopranatante che viene successivamente purificato con la cromatografia a scambio ionico e con la cromatografia per immunoaffinit utilizzando un anticorpo monoclonale di topo. Ad eccezione di quando lalbumina umana viene aggiunta come additivo stabilizzante del Fattore VIII, il prodotto non contiene altre proteine umane, HIV, virus dellepatite ed altri agenti indesiderati, evitando in questo modo molti dei rischi che sono associati alluso del plasma umano. Daltro canto, i prodotti ricombinanti hanno una storia di utilizzo relativamente breve e non vi garanzia che siano esenti da rischi.
Plasma Le fasi di riduzione virale, originalmente sviluppate per purificare le proteine del plasma, sono state applicate anche per il plasma da utilizzare a scopo clinico. Sono stati studiati approcci alternativi che comprendono i solventi ed i detergenti organici e luso di agenti fotochimici. Il trattamento con solventi/detergenti, efficace contro i virus capsulati, comporta laggiunta di Triton X-100 all1% e di tri-n-butil-fosfato all1% (TNBP) al pool di plasma, seguita dallestrazione con olio del TNPB e dallassorbimento cromatografico del Triton X-100. Dopo diversi anni di utilizzo di questo metodo in Europa, il plasma trattato con solvente/detergente stato reso provvisoriamente disponibile negli Stati Uniti. Tuttavia, la preoccupazione determinata dalluso di prodotti da pool, i costi, la scarsa penetrazione del mercato ed i possibili eventi trombotici (o di sanguinamento eccessivo) hanno indotto allabbandono di questo prodotto. Uno psoralene (S-59) che viene attivato dalla luce A ultravioletta viene attualmente sottoposto a studi clinici negli USA per linattivazione dei patogeni nelle piastrine e nel plasma ed disponibile in alcune nazioni europee. Il trattamento delle componenti cellulari Le procedure fotochimiche e chimiche di inattivazione dei patogeni sono teoricamente applicabili anche agli emocomponenti cellulari del sangue; un altro composto chimico-organico (S303) ed un composto che ha come bersaglio gli acidi nucleici (PEN 110) hanno iniziato ad essere sottoposti alla valutazione clinica per linattivazione dei patogeni nei globuli rossi. Questi metodi hanno la potenzialit di unefficace inattivazione di batteri, virus e parassiti, compresi quelli intracellulari179,180. Tuttavia, entrambi i prodotti hanno dimostrato di indurre la formazione di anticorpi nei riceventi. Gli esperimenti relativi alla riduzione dei patogeni nelle piastrine (per esempio con S-59) hanno rilevato una diminuzione della durata della conservazione e della sopravvivenza delle piastrine e la necessit di un aumento di trasfusioni piastrinche. Questi effetti indesiderati della riduzione dei patogeni hanno comportato linterruzione di alcuni
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esperimenti e possono causare in definitiva leliminazione di queste molecole da una diffusa applicazione clinica. Il resoconto delle infezioni associate alla trasfusione Quando un ricevente mostra segni di malattie infettive non altrimenti spiegabili, necessario porre lipotesi che la causa sia da ricercare nella trasfusione62(pp83,85). Ci si aspetta che lepatite presenti sintomi da 2 settimane a 6 mesi dopo la terapia se stata determinata da una trasfusione, ma anche allinterno di questo intervallo la causa non necessariamente uninfezione originata dal sangue trasfuso. I Centri del Sangue ed i Servizi Trasfusionali devono avere una procedura che incoraggi il riconoscimento e la trasmissione dellinformazione di ogni possibile infezione che possa essere correlabile con la trasfusione. Uninfezione da HIV che si ritiene conseguenza di una trasfusione deve essere riferita al Servizio Trasfusionale che ha fornito lunit, anche se lattesa fra un intervallo tra la trasfusione e il riconoscimento dellinfezione, oppure dellinsorgenza dei sintomi, pu essere molto lunga. Linfezione di un ricevente dovrebbe essere comunicata allautorit competente in modo che i donatori dimostrati, o sospettati, di essere infetti possano essere valutati e i riceventi degli altri emocomponenti derivati dalla donazione coinvolta, oppure da altre donazioni precedenti, possano essere contattati ed esaminati , se necessario. Un donatore che stato dimostrato avere risultati positivi durante lindagine deve essere posto in un appropriato elenco di sospensione. Il resoconto di eventi infausti Il Codice dei Regolamenti Federali [21 CFR 606.170 (b)] richiede che gli esiti letali attribuiti a complicanze trasfusionali (per esempio epatite, AIDS e reazioni emolitiche) siano riferite al Dirigente del Centro per le Valutazioni Biologiche e Ricerche (CBER), Ufficio delle Complicanze e Qualit Biologiche, Attn: Fatality Program Manager (HFM-650), 1401 Rockville Pike, Suite 200N, HFM-650, Rockville, MD 20852-1448. Un rapporto deve essere inoltrato il pi presto
possibile per telefono (301-827-6220), fax (301827-6748) o email a fatalities2@cber.fda.gov ed un rapporto scritto deve essere inviato entro 7 giorni. Le informazioni aggiornate possono essere consultate in internet allindirizzo http:// www.fda.gov/cber/gdlns/bldfatal.pdf. La gestione delle infezioni post-trasfusionali I donatori coinvolti Se viene dimostrato che una trasfusione correlata con unepatite, una infezione HIV o da HTLV-I/II e che si verificata in un paziente che ha ricevuto solo una singola unit trasfusionale, questo donatore deve essere escluso permanentemente dalle future donazioni e il nominativo deve essere inserito in un file di soggetti esclusi in via permanente. Se linfezione virale post-trasfusionale si verifica dopo esposizione a sangue proveniente da diversi donatori, non necessario escludere tutti i donatori potenzialmente coinvolti. Se sono coinvolti solo pochi donatori, pu essere opportuno richiamarli per ottenere le informazioni mediche rilevanti e perseguire esami aggiuntivi. I donatori che risultano coinvolti in pi di un caso di infezione trasmessa con la trasfusione devono essere adeguatamente esaminati ed possibilmente sospesi in via permanente in accordo con le procedure stabilite dal Servizio Trasfusionale. Informazione Un donatore che sar escluso in modo permanente come futuro donatore di sangue perch coinvolto in uninfezione virale trasmessa con la trasfusione, e presenta un esame positivo, deve essere informato di questo fatto. Gli esami di controllo devono, idealmente essere prescritti dal medico personale del donatore stesso e il Servizio Trasfusionale deve ottenere il consenso del donatore per rilasciare le informazioni disponibili alloperatore sanitario designato. Se il donatore non ha un medico personale, un medico della Banca del Sangue, o un membro addestrato dello staff, dovr provvedere alla consulenza iniziale e a fornire un adeguato riferimento medico. Il processo di informazione e di consulenza dovr essere fornito con tatto e comprensione.
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Il donatore dovr sapere con chiarezza perch lui o lei stata sospeso/a e, quando opportuno, dovr essere informato/a della possibilit che possa essere infettivo/a per altre persone. Linformazione deve essere fornita con prontezza, perch un ritardo nella sua trasmissione pu ritardare linizio dellopportuno trattamento oppure linstaurazione di misure idonee per prevenire la diffusione dellinfezione ad altri. Luso delle immunoglobuline Non una pratica raccomandata quella di somministrare immunoglobuline o HBIG per via intramuscolare o endovenosa a scopo profilattico per prevenire unepatite post-trasfusionale181: questi mezzi non hanno dimostrato di essere efficaci per prevenire lepatite B post-trasfusionale e la documentazione disponibile contraddittoria circa il loro effetto sullepatite C postt r a s f u s i o n a l e 1 8 2 , 1 8 3 . Se si verificata unaccidentale trasfusione di sangue nota per avere marcatori positivi, oppure unesposizione a materiale infetto per la puntura di un ago, lHBIG pu prevenire od attenuare linfezione da HBV184. La profilassi con le immunoglobuline non efficace nella prevenzione della trasmissione dellHCV conseguente ad unesposizione lavorativa e non viene raccomandata per questo scopo185.
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Metodi
Includere i metodi in questa edizione del Technical Manual stata una decisione soggettiva dellUnit Programmatica del Manuale. Si incoraggiano i lettori a fare riferimento alle precedenti edizioni del Manuale per i metodi che non compaiono in questa edizione, poich la loro esclusione non significa che il loro impiego sia da evitare. Alcune procedure, tuttavia, come le metodiche di eluizione allo xilene e al cloroformio sono state rimosse, in quanto le sostanze chimiche utilizzate potrebbero presentare rischi per la sicurezza. I lettori sono pregati di usare cautela quando si riferiscono a procedure elencate nelle edizioni precedenti, dato che esse non sono state
revisionate per il contenuto e la sicurezza. Spesso, vi sono numerose differenti modalit per effettuare la stessa procedura. Bench alcuni operatori possano preferire altre metodiche, quelle qui illustrate si sono dimostrate affidabili, semplici e di provata validit. Sebbene le ricerche su problemi sierologici non usuali richiedano una certa flessibilit nella progettazione e nello svolgimento del metodo, imperativo adottare metodi uniformi nel lavoro routinario del laboratorio. Perch il personale possa ottenere risultati comparabili e riproducibili essenziale che ciascun operatore in laboratorio svolga sempre la stessa procedura nella stessa maniera.
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Metodi sezione 1: Generalit sui metodi di laboratorio
Metodi sezione 1
Generalit sui metodi di laboratorio
Introduzione
I metodi presentati nelle sezioni che seguono rappresentano esempi di procedure accettabili, ma le strutture possono utilizzare altri procedimenti, qualora lo desiderino. Nella maggior parte dei casi, le procedure scritte sono conformi alle Linee guida dei Manuali sulle Procedure Tecniche nei Laboratori Clinici emesse dalla Commissione Nazionale per gli Standard nei Laboratori Clinici. Come indicato al Titolo 21 del Codice dei Regolamenti Federali (CFR, Code of Federal Regulations ) Parte 606.65(e), si dovrebbero seguire le istruzioni dei produttori (per esempio gli inserti) relative a forniture e a reagenti approvati dalla FDA ( Food and Drug Administration ). Ogni modifica deve essere validata, utilizzando controlli appropriati, e deve essere inclusa nelle procedure operative standard prima dellapprovazione da parte del direttore medico (nota: le modifiche possono anche richiedere la cooperazione della FDA). importante utilizzare le Precauzioni Standard (vedi Capitolo 2), se necessario. Preparazione dei reagenti Molte procedure comprendono formule per la preparazione di reagenti. Le etichette dei reagenti preparati in proprio devono contenere le indicazioni che seguono: nome della soluzione; data di preparazione; data di scadenza (se nota);
temperatura e/o condizioni di conservazione; sistema per identificare la persona che ha preparato la soluzione; etichetta universale per le sostanze pericolose. Temperature Ogni volta che si richiede una specifica temperatura per le incubazioni o per la conservazione, i seguenti limiti di variabilit sono considerati soddisfacenti: Temperatura stabilita 4 C Temperatura ambiente 37 C 56 C Limiti accettabili 2-8 C 20-24 C 36-38 C 54-58 C
Variabilit nelle centrifugazioni Le velocit (forza centrifuga relativa) e i tempi di centrifugazione devono essere standardizzati per ciascuna apparecchiatura (vedi Metodi Sezione 8).
Bibliografia Guidelines for clinical laboratory technical procedure manuals. 3rd ed. (NCCLS Document GP2-A3, Vol. 12, No. 10.) Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1996.
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Metodo 1.1 Spedizione e trasporto di materiali pericolosi

Molte agenzie definiscono i requisiti per confezionare e spedire materiali pericolosi o rischiosi, in relazione a come questi materiali vengono spediti (per posta, per via terrestre o per via aerea). Per i trasporti postali di materiale infetto, di campioni clinici o di prodotti biologici si devono seguire le Regole per le Merci Pericolose emesse dallUSPS (United States Postal Service)1,2. Per il trasporto, fra gli Stati federali, di materiale infetto per via terrestre o aerea, si applicano le regole del DOT (Department of Transportation) statunitense3. La maggior parte degli spedizionieri aerei applica le norme della IATA (International Air Transport Association)4 e le istruzioni tecniche della ICAO (International Civil Aviation Organization)5. Queste agenzie di spedizione seguono, per i trasporti internazionali di materiale infetto o di campioni clinici, le raccomandazioni del Comitato degli Esperti sul Trasporto di Merci, istituito dalle Nazioni Unite (ONU). I CDC ( Centres for Disease Control and Prevention) e la IATA7 forniscono i requisiti per limballaggio e per letichettatura di materiale infetto allo scopo di proteggere la salute pubblica, minimizzando il possibile contatto diretto con tale materiale, la contaminazione dellambiente e la diffusione di malattie. I CDC servono anche da Centro di Riferimento per la Biosicurezza e lAddestramento dellOrganizzazione Mondiale della Sanit (OMS) e dellONU 9 . LOSHA (Occupational Safety and Health Administration)9 regola la sicurezza dei lavoratori addetti al trattamento, allimballaggio e al trasporto. Sia il DOT che la IATA richiedono un addestramento fattivo per chiunque sia addetto al confezionamento di materiale infetto o tossico da spedire3,4. I documenti DOT e IATA forniscono consigli generali sulla spedizione di tutti i materiali pericolosi, considerato che le norme sono simili e che la maggior parte degli spedizionieri segue le linee guida per il trasporto emesse dalle Norme IATA per i Materiali Pericolosi4 e le linee guida per la Spedizione di Materiale Infetto7. Per ulteriori requisiti, le strutture dovrebbero consultare anche
gli spedizionieri locali. In generale, tutte le norme sulle sostanze pericolose si basano sul rischio che deriva alle persone e, di conseguenza, tali norme hanno requisiti specifici su imballaggi, etichettature e relative documentazioni. responsabilit di chi spedisce materiale biologico o infetto classificare, impacchettare, etichettare e documentare in modo appropriato la sostanza da spedire. Classificazione delle merci pericolose La IATA classifica le merci pericolose in nove categorie: 1. esplosivi; 2. gas compressi; 3. liquidi infiammabili; 4. altre sostanze infiammabili; 5. materiale ricco di O2, ossigenatori e perossidi organici; 6. materiali che possono danneggiare la salute, veleni e sostanze infette; 7. materiali radioattivi; 8. materiale corrosivo; 9. sostanze pericolose varie4. La categoria dei materiali infetti comprende i seguenti: sostanze infette: agenti microbici o loro tossine che causano o possono causare malattie, denominati anche agenti eziologici; prodotti biologici: prodotti preparati e spediti in conformit con i provvedimenti: 9 CFR parte 102 (Prodotti Biologici Veterinari Autorizzati), 9 CFR parte 103 (Prodotti Biologici per il Trattamento di Animali da Esperimento), 9 CFR parte 104 (Prodotti Biologici Importati); 21 CFR parte 312 (Indagini su Nuovi Farmaci), 21 CFR parti da 600 a 680 (Sostanze Biologiche), 29 CFR parte 1910.1030 (Esposizione Professionale a Patogeni Ematici), 42 CFR Parte 72 (Spedizione fra Stati Federali di Agenti Patogeni), o 48 CFR Parti da 171 a 178 (Norme per Materiali Pericolosi); campioni clinici o diagnostici: materiale umano o animale (ivi compresi escreti, secreti, sangue ed emocomponenti, liquidi organici, tessuti) spedito a scopo diagnostico; organismi geneticamente modificati; rifiuti clinici e medici.
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Applicazioni in campo trasfusionale Sebbene le norme USPS regolino alcuni prodotti biologici, quali il vaccino vivo per il virus della poliomielite e quelle DOT e IAT prendano posizione sul fatto che prodotti biologici e diagnostici possono essere spediti con requisiti di imballaggio ed etichettatura meno cogenti, ci non di meno tali prodotti contengono, o si ritiene ragionevolmente possano contenere, sostanze infette. I CDC hanno proposto norme per armonizzare tali requisiti con altre norme federali e internazionali10. Si possono spedire, senza restrizioni precauzionali, unit di sangue che soddisfino i requisiti sulle malattie infettive o sangue non ancora controllato proveniente da donatori che corrispondono ai criteri di eleggibilit FDA e cos anche i loro campioni per esami di screening. Campioni spediti per diagnosi iniziali e a bassa probabilit di contenere agenti infettivi sono confezionati come campioni diagnostici (istruzioni IATA sulle confezioni 650), mentre campioni appartenenti a soggetti noti o sospetti di avere una malattia infettiva vanno spediti come sostanze infette (istruzioni IATA sulle confezioni 602). Per la spedizione di campioni biologici, si devono consultare le Norme IATA per le pi recenti modifiche. Metodo 1.1.1 Spedizione di campioni diagnostici e di sostanze infette Principio Il trasporto sicuro di materiali pericolosi richiede che questi siano confezionati in modo da proteggere il materiale e le persone che li maneggiano. Viene richiesto di prevenire le perdite e le rotture per evenienze accidentali. Il contenitore primario dovrebbe essere a prova di perdite e con chiusura garantita. Il contenitore primario dovrebbe essere sistemato in un contenitore secondario impermeabile. Fra i due contenitori va piazzato materiale in grado di assorbire lintero contenuto liquido. Limballaggio esterno dovrebbe avere sufficiente robustezza, in rapporto alluso e alle capacit prefissati, ed essere etichettato secondo le norme. I requisiti sul confezionamento di campioni clinici
sono simili a quelli relativi a sostanze infette, con leccezione che gli standard di esecuzione sono meno rigorosi. Materiali 1. Contenitore primario a prova di tenuta e impermeabile (per esempio, provetta per analisi), saldato, chiuso strettamente o altrimenti rinforzato, per impedire la perdita del tappo. 2. Contenitore secondario a prova di tenuta e impermeabile (per esempio, sacca plastica saldabile o contenitore con tappo a vite). 3. Materiale assorbente non parcellizzato (per esempio, tovaglioli di carta, garze, pannolini monouso). 4. Per sostanze infette o spedizione di volumi maggiori di 50 mL (ma minori di 4.000 mL o di 4 kg) materiale per assorbire gli urti in quantit eguale a quello assorbente non parcellizzato. 5. Imballaggio esterno: a. per sostanze infette o spedizione di volumi maggiori di 50 mL (ma minori di 4.000 mL o di 4 kg) un imballaggio esterno di cartone ripiegato, di fibra, di legno, di metallo o di plastica rigida che corrisponda ai requisiti di robustezza dellONU; b. per campioni biologici o diagnostici di volume inferiore a 50 mL un contenitore esterno non certificato. 6. Materiale refrigerante (se necessario): a. ghiaccio fondente, immesso in sacche sigillate per prevenire le perdite; b. ghiaccio secco, che non superi i 2,5 kg (per le spedizioni aeree). 7. Lista dettagliata del contenuto. 8. Etichetta che riporti i nomi, gli indirizzi, le persone da contattare, i numeri di telefono sia del mittente sia del destinatario. 9. Etichette speciali, applicabili alle specifiche situazioni (vedi Tabella 1.1.1.1): a. campioni diagnostici; b. sostanze infette; c. ghiaccio secco; d. azoto liquido; e. solo per trasporto aereo. 10. Documenti specifici di trasporto, come polizza aerea o dichiarazione di materiale pericoloso.
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Tabella 1.1.1.1 - Speciali etichette per le spedizioni
Campioni clinici (diagnostici) I campioni raccolti per diagnosi, ricerche o altre finalit devono essere etichettati come biologicamente pericolosi. Il contenitore primario e limballaggio esterno debbono portare letichetta pertinente (biohazard). Letichetta sullimballaggio esterno deve riportare quanto segue: 1. il colore del materiale sul quale letichetta viene stampata deve essere arancione brillante, con il simbolo del biohazard e le stampe in nero; 2. letichetta deve essere rettangolare e misurare 5 cm in altezza e 10 cm in larghezza; 3. il simbolo biohazard (4 cm di diametro) deve essere centrato su un quadrato di 5 cm per ciascun lato. 4. la misura delle lettere, stampate in font Helvetica, deve essere: Biohazard 16 pt Campioni clinici 14 pt Imballaggio conforme a 42 CFR parte 72 6 pt Notifica per casi di danneggiamento o perdite 10 pt Nome del mittente e del destinatario 10 pt Sostanze infette (agenti eziologici) Per sostanze note per contenere agenti infettivi (o ragionevolmente previste di contenerli) le etichette biohazard devono essere sistemate sul contenitore primario e sullimballaggio esterno. Letichetta sullimballaggio esterno deve riportare quanto segue: 1. il colore del materiale su cui stampata letichetta deve essere bianco, mentre il simbolo biohazard e le stampe devono essere neri; 2. letichetta deve essere a punta di diamante e di misura minima di 10 cm per lato; 3. il simbolo biohazard, di 2 cm di diametro, deve essere centrato su un quadrato di 5 cm per ciascun lato; 4. il simbolo Classe 6 per sostanze infette deve essere centrato sulla parte inferiore delletichetta; 5. la misura delle lettere, stampate in font Helvetica, deve essere: Sostanza infetta 16 pt Imballaggio conforme a 42 CFR parte 72 5 pt Notifica per casi di danneggiamento o perdite 7 pt Notifica immediata 7 pt Notifica alle Autorit Sanitarie Pubbliche 7 pt In USA 5 pt CDC 5 pt Atlanta, Georgia 5 pt 1-800-232-0124 (telefono CDC) 5 pt 6 24 pt Ghiaccio secco Gli imballaggi contenenti ghiaccio secco devono essere etichettati con le informazioni che seguono: 1. il simbolo, a forma di diamante, di Classe 9 per prodotti eterogenei pericolosi; 2. le parole Ghiaccio secco o Anidride carbonica solida; 3. UN 1845 la categoria ONU di materiale pericoloso per il ghiaccio secco (se inviato fuori dalla nazione);
(segue)
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4. il nome dei contenuti da refrigerare; 5. il peso del ghiaccio secco (che non deve superare i 2,2 kg, se spedito per via aerea). Azoto liquido Gli imballaggi contenenti azoto liquido devono essere etichettate con letichetta verde IATA che dichiara Contiene liquido criogenico. Soltanto aereo da trasporto merci Se il trasporto avviene per via aerea e riguarda sostanze infette di un volume superiore a 50 mL, limballaggio deve avere unetichetta che avverta Soltanto con aereo da trasporto merci per impedire che lo spedizioniere trasporti il pacco su un aereo passeggeri.
Procedure 1. Sistemare il contenitore primario, chiuso perfettamente, dentro il contenitore secondario. 2. Aggiungere intorno al contenitore primario (e fra i due contenitori) materiale assorbente sufficiente a coprire tutte le parti del contenitore primario e in grado di assorbire lintero contenuto del contenitore primario, qualora si verifichi una perdita. 3. Chiudere saldamente il contenitore secondario. 4. Sistemare il contenitore secondario in un imballaggio esterno. 5. Per la spedizione di sostanze infette con un volume maggiore di 50 mL, sistemare i materiali per assorbire gli urti sopra, sotto e di fianco, fra il contenitore secondario e limballaggio esterno (vedi Figura 1.1.1.1).
6. Sistemare ogni materiale refrigerante (ghiaccio fondente o secco) fra il contenitore secondario e quello esterno. Fornire un supporto interno in grado di assicurare il contenitore secondario nella posizione originale, dato che il ghiaccio, anche quello secco, si scioglie e si disperde. 7. Inserire la lista dettagliata del contenuto fra il contenitore secondario e quello esterno. 8. Chiudere saldamente limballaggio esterno ed etichettarlo con lindirizzo di destinazione e con ogni altra speciale etichetta necessaria. 9. Riempire i moduli di viaggio idonei e spedirli con lintera confezione. Note 1. Impacchettare i campioni allinterno del contenitore in modo che restino in posizione verticale cos da prevenire eventuali perdite. 2. Le chiusure dei contenitori primari possono essere rinforzate con nastro adesivo o paraffina. Non necessario rinforzare le provette di raccolta campioni vuote e non aperte. 3. In caso di spedizione di sostanze infette, devono apparire sul contenitore secondario e su quello esterno, il nome, lindirizzo e il numero di telefono del mittente. 4. La spedizione di sostanze infette pu prevedere contenitori secondari multipli, ma il volume totale della spedizione non deve superare 4 L o 4 kg, escludendo i pesi dellimballaggio e del materiale refrigerante. 5. I contenitori primari e limballaggio secondario devono essere in grado di resistere a una
Figura 1.1.1.1 - Confezione appropriata di campioni di materiale clinico
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pressione differenziale interna di 95 kPA (chilopascal) a temperature comprese fra 40 e +55 C. 6. Non sono accettabili, quali imballaggi esterni, involucri di polistirolo, sacche di plastica o di carta. 7. I contenitori certificati ONU devono essere in grado di resistere, senza perdite da parte delle provette situate allinterno, a un test di caduta da unaltezza di 9 metri, come specificato nel 49 CFR 178.609. Il numero di certificazione ONU deve apparire sul contenitore. I contenitori non certificati devono essere in grado di resistere almeno a una caduta da 1,2 metri su una superficie dura non flessibile, senza rilasciare i contenuti dal contenitore. 8. Assicurarsi che siano seguite tutte le norme statali e locali. 9. Si possono applicare alcune eccezioni in caso di trasporti terrestri. 10. Se non si certi su come imballare e spedire i materiali, contattare i CDC. 11. Se durante il trasporto interviene una rottura, il pacco deve essere maneggiato con estrema cautela (far indossare al personale equipaggiamenti protettivi) e lintero pacco (contenitori, contenuti e materiale da imballaggio) dovrebbe essere autoclavato prima di essere eliminato. Si dovrebbe segnalare al personale di supervisione se il contenuto stato perso durante il viaggio, o se il danno in relazione a un imballaggio non appropriato, effettuato dal mittente. 12. Chi spedisce, chi riceve o chiunque maneggi imballaggi danneggiati o che lascino fuoriuscire liquido deve isolare il pacco e avvertire, immediatamente, sia il mittente sia il destinatario. Informare inoltre, in caso di sostanze infette, i CDC, il pi presto possibile. In caso di notifica ai CDC, chi telefona dovrebbe fornire una descrizione sulle condizioni dellimballaggio, il nome, lindirizzo e il numero di telefono del mittente e ogni altra informazione pertinente, cosi da predisporre le procedure di decontaminazione e di eliminazione.
Ulteriori considerazioni sulluso del ghiaccio secco 1. Lanidride carbonica solida o ghiaccio secco viene considerata un materiale pericoloso, in quanto pu causare ustioni da contatto ed emettere anidride carbonica quando volatilizza. 2. Quando si maneggia ghiaccio secco, si devono indossare guanti isolanti. Quando si frantumano pezzi di ghiaccio secco o suoi piccoli frammenti si devono usare maschere per la protezione degli occhi. 3. Si dovrebbe maneggiare ghiaccio secco in aree ben ventilate: il gas emesso pu causare cefalea e, in casi estremi, asfissia. 4. Se mantenuto in un contenitore strettamente sigillato, il ghiaccio secco pu provocare la rottura dellimballaggio. Deve essere sistemato fuori dal contenitore secondario o in un pacco ulteriore con uno (o pi) imballaggi completi. Limballaggio esterno deve essere a prova di perdite. Le procedure per imballaggi con ghiaccio secco devono comprendere istruzioni su come sigillare il contenitore esterno, in modo tale da permettere al gas di fuoriuscire e da prevenire perdite del contenitore secondario, quando il ghiaccio secco si dissolve. Consultare il Manuale della Posta Interna (sezione C023) 2, 49 CFR 173.218 e 175.10 (a) (13)3, le norme IATA sulle Merci Pericolose4 e le istruzioni IATA 904. 5. I requisiti per laddestramento HAZMAT (norme su HAZardous MATerials, materiali pericolosi) relativi al ghiaccio secco si rinvengono in 49 CFR 172.704 3 . Laddestramento per il personale che viene a contatto con il ghiaccio secco dovrebbe comprendere le informazioni elencate di seguito: potenziali pericoli; equipaggiamento protettivo per il personale, da usarsi quando si maneggia o si frantuma il ghiaccio secco; procedure per imballare, suggellare, etichettare e maneggiare scatole contenenti ghiaccio secco; particolari considerazioni nellimpiego dei
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veicoli usati per trasportare scatole contenenti ghiaccio secco; procedure per la conservazione o leliminazione di ghiaccio secco (per esempio, permettere al gas di dissolversi per vie naturali in un ambiente ben areato) dopo che si ricevuta una spedizione. Ulteriori considerazioni sulluso di azoto liquido 1. Lazoto liquido viene classificato come un liquido criogenico. 2. Si devono indossare guanti isolanti, protezioni per gli occhi e vesti protettive quando si lavora con lazoto liquido. 3. Per il contenitore primario si deve impiegare materiale impermeabile in grado di resistere alle temperature criogeniche. Il contenitore deve mantenere integro il suo contenuto alla temperatura del refrigerante, cos come alla temperatura e alla pressione del trasporto aereo, qualora venga perduta la refrigerazione. 4. Limballaggio secondario deve essere studiato in modo tale da resistere a temperature criogeniche. 5. Limballaggio esterno deve permettere la liberazione del gas, quando lazoto liquido evapora. Si possono impiegare o un coperchio del contenitore ampio, ma sicuro, o una valvola di fuoriuscita del gas.
Documents 9284 and 9284SU, 2002. Code of Federal Regulations. Title 42 CFR Part 72. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). 7. Infectious substances and diagnostic specimens shipping guidelines. 4th ed. Montreal, Canada: International Air Transport Association, 2003. 8. World Health Organization. Guidelines for the safe transport of infectious substances and diagnostic specimens. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1997. 9. Code of Federal Regulations. Title 29 CFR 1910.1030. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). 10. Centers for Disease Control and Prevention. Packaging and handling of infectious substances and select agents, notice of proposed rulemaking. Fed Regist 1999;64(208):58022-31. 6.
Metodo 1.1.2 Monitoraggio della temperatura durante il trasporto di sangue Principio auspicabile che si adottino alcune forme di rilevamento o di monitoraggio della temperatura quando si invia sangue. Si pu accertare, al momento del ricevimento, la temperatura del contenuto di un contenitore utilizzato per inviare sangue intero o concentrati eritrocitari allo stato liquido con la procedura elencata qui sotto. Procedura 1. Aprire il contenitore di spedizione e applicare prontamente la parte sensibile di un termometro di vetro o elettronico fra due sacche di sangue o di emocomponenti (non dal lato delle etichette) e assicurare il sandwich con due elastici. 2. Chiudere il contenitore. 3. Leggere la temperatura dopo circa 3-5 minuti. 4. Se la temperatura dei concentrati eritrocitari supera i 10 C, mettere in quarantena le unit sino a che non se ne disponga unappropriata eliminazione. Note Altri metodi di monitoraggio delle spedizioni sono: 1. impiegare indicatori di tempo e temperatura, come quelli usati per le scatole di trasporto. Questi indicatori cambieranno colore o
Bibliografia 1. Code of Federal Regulations. Title 39 CFR. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). Etiologic agent preparations, clinical specimens, and biological products. Domestic Mail Manual (section C023), issue 57, July 10, 2003. Code of Federal Regulations. Title 49 CFR Part 171-180. Washington, DC: US Government Printing Office, 2004 (revised annually). Dangerous goods regulations. 45th ed. Montreal, Canada: International Air Transport Association, 2004 (revised annually). Technical instructions for the safe transport of dangerous goods by air. 2002-2004 ed. Montreal, Canada: International Civil Aviation Organization,
2.
3.
4.
5.
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segnaleranno, in altri modi visibili, che la temperatura ha superato i 10 C; 2. Sistemare un termometro a minima e massima nel contenitore di spedizione. Questo termometro, semplice e riutilizzabile, misura e registra la temperatura pi alta e quella pi bassa durante il periodo considerato.
Metodo 1.2 Trattamento di campioni parzialmente coagulati

Principio La generazione di fibrina pu proseguire nel siero separato da sangue non totalmente coagulato, specialmente durante le incubazioni a 37 C. Ci determina la produzione di filamenti proteici che intrappolano i globuli rossi e rendono difficile valutare unagglutinazione. Il sangue di pazienti cui sia stata somministrata, di recente, eparina, pu non coagulare per niente e quello di pazienti con uneccessiva attivit fibrinolitica pu liquefarsi nuovamente o contenere frammenti proteici che interferiscono nelle analisi per lagglutinazione. Materiali 1. Trombina: trombina umana o bovina secca o soluzioni di trombina (50 unit/mL in fisiologica). 2. Perline di vetro. 3. Solfato di protamina: 10 mg/ml in fisiologica. 4. Acido -aminocaproico (EACA): 0,25 g/mL in fisiologica. Procedura 1. Per accelerare la coagulazione, si possono impiegare le tecniche segnalate di seguito: a. aggiungere al campione una quantit di trombina secca che aderisca alla punta di un bastoncino applicatore o una goccia di soluzione di trombina per ogni mL di sangue intero o di siero. Attendere 10-15 minuti che si formi il coagulo. Centrifugare per separare il coagulo dal siero;
b. agitare delicatamente, per diversi minuti a 37 C, il siero separato con le palline di vetro. Trasferire il siero in unaltra provetta. 2. Per neutralizzare leparina, si pu aggiungere al campione solfato di protamina. Un eccesso di solfato di protamina favorisce la formazione di impilati e un eccesso ancor maggiore inibisce la coagulazione. Aggiungere una goccia della soluzione di solfato di protamina a 4 mL di sangue intero e attendere 30 minuti per valutarne leffetto sulla coagulazione. Se questa non avviene, aggiungere unulteriore, limitata, quantit di solfato di protamina. Nota: il solfato di protamina pu agire meglio, dopo una breve (5-10 minuti) incubazione a 37 C. 3. Per inibire lattivit fibrinolitica, aggiungere 0,1 mL di EACA a 4 mL di sangue intero. Note 1. Limpiego di provette con anticoagulante (ACD o EDTA) pu essere di aiuto a evitare i problemi derivati da campioni non completamente coagulati. Limpiego di campioni anticoagulati deve essere convalidato secondo le procedure operative standard. 2. Dato che le preparazioni di trombina umana possono contenere anticorpi antieritrocitari, i risultati dei test devono essere esaminati attentamente per rilevare eventuali reazioni falsamente positive. Si dovrebbero effettuare controlli di qualit sui reagenti trombinici prima o contestualmente al loro impiego per individuare quelli contaminati da anticorpo.
Metodo 1.3 Preparazione delle soluzioni - Istruzioni

Principio Le definizioni di base, i calcoli e le istruzioni dati qui di seguito servono a ripassare i principi semplici, che sono necessari nella preparazione di soluzioni: 1. mole, peso grammo-molecolare: peso, espresso in grammi, uguale al peso atomico o molecolare di una sostanza; 2. soluzione molare: una soluzione uno-molare
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3.
4.
5.
6.
7. 8. 9.
(1 M) contiene una mole di soluto in 1 litro di solvente. Si presume che il solvente sia acqua distillata o deionizzata, se non diversamente specificato; peso grammo-equivalente: peso, in grammi, di una sostanza che produrr o reagir con 1 mole di ione idrogeno; soluzione normale: una soluzione uno-normale (1 N) contiene un grammo-equivalente di soluto in un litro di soluzione; soluzioni percentuali: la designazione percentuale di una soluzione d il peso o il volume di soluto presente in 100 unit di soluzione. Questa percentuale pu essere espressa come indicato di seguito: a. peso/peso (p/p), indica il peso in grammi di soluto in 100 g di soluzione; b. volume/volume (v/v), indica i mL di soluto presenti in 100 mL di soluzione; c. peso/volume (p/v), indica il peso in grammi di soluto in 100 mL di soluzione. Se non altrimenti specificato, si presume che una soluzione percentuale sia espressa in p/v; acqua di cristallizzazione, acqua di idratazione: molecole dacqua che fanno parte integrale della struttura di cristallizzazione di una sostanza. Una data sostanza pu avere varie forme di cristallizzazione, con differente numero di molecole dacqua intrinseche allintera molecola. Il peso dellacqua deve essere compreso nel calcolo del peso molecolare di una sostanza idratata; anidro: il sale di una sostanza senza acqua di cristallizzazione; peso atomico (arrotondato a numero intero): H 1,0; O 16; Na 23; P 31; S 32; Cl 35; K 39; pesi molecolari: HCl: 1 + 35 = 36; NaCl: 23 + 35 = 58; KCl: 39 + 35 = 74; H2O (2 x 1) + 16 = 18; NaH2PO4: 23 + (2 x 1) + 31 + (4 x 16) = 120; NaH2PO4 H2O: 23 + (2 x 1) + 31 + (4 x 16) + (2 x 1) + 16 = 138; KH2PO4: 39 + (2 x 1) + 31 + (4 x 16) = 136; H2SO4: (2 x 1) + 32 + (4 x 16) = 98.
Esempi 1. Soluzioni molari: KH2PO4 1M = 136 g di soluto in 1 L. KH2PO4 0,15M = (136 x 0,15) = 20,4 g di soluto in 1 L. NaH2PO4 0,5 M = 60 g di soluto in 1 L. 2. Soluzione molare con sale idrato: NaH2PO4 H2O 0,5 M = (138 x 0,5) = 69 g di cristalli monidrato in 1 L. 3. Soluzioni normali: HCl 1N = 36 g di soluto in 1 L. Una mole di HCl dissociata in 1 mole di H+ cos che il peso grammo-equivalente e quello grammo-molecolare sono gli stessi. HCl 12 N = (36 x 12) = 432 g di soluto in 1 L. H2SO4 1N = 49 g di soluto in 1 L: una mole di H2SO4 dissociata per dare 2 mole di H+, cos che il peso grammo-equivalente la met del peso grammo-molecolare. 4. Soluzione percentuale: NaCl 0,9% (p/v) = 0,9 di soluto in 100 mL di soluzione. Note Risultati accurati richiedono accurate preparazioni dei reagenti. importante leggere attentamente e seguire tutte le istruzioni: 1. pesare soltanto le quantit appropriate per ottenere risultati accurati. Il manuale per gli operatori dovrebbe fornire le specifiche al riguardo; 2. preparare volumi maggiori di quelli strettamente necessari. Vi maggior accuratezza nel preparare grandi volumi piuttosto che piccoli volumi. Se lequilibrio di un reagente gioca su 0,01 g, un potenziale errore nel pesare 0,05 g (50 mg) sar del 20%, mentre un potenziale errore nel pesare 0,25 g (250 mg) sar solamente del 4%. Qualora la soluzione sia in grado di mantenere la sua attivit se viene conservata in maniera idonea, , di solito, preferibile prepararne grandi volumi. Se la soluzione si deteriora rapidamente, sono da preferirsi piccoli volumi, per evitare sprechi; 3. rilevare se una sostanza in forma idratata o anidra. Se le istruzioni danno il peso del soluto per una forma e il reagente a disposizione nellaltra forma, essere certi di aggiustare le
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misurazioni correttamente. Per esempio, se le istruzioni per NaH2PO4 0,5 M indicano 60 g e il reagente NaH2PO4 H2O, trovare il rapporto fra i pesi delle due forme. Il peso molecolare di NaH2PO4 H2O 138 e quello di NaH2PO4 120. Il rapporto , quindi, 138 diviso 120, cio 1,15. Moltiplicare il peso dato per il rapporto (60 g x 1,15 = 69 g) per ottenere il peso finale necessario; 4. sciogliere completamente il soluto prima di portare la soluzione al volume finale. Questo particolarmente importante per le sostanze, come i fosfati, che si sciolgono lentamente. Per esempio, per preparare 500 mL di KH2PO4 0,15 M, agire come specificato di seguito: a. pesare 10,2 g di soluto in una vaschetta per pesate o in un piccolo contenitore di vetro [(0,15 x 136) diviso 2], dato che si prepareranno solamente 500 mL; b. mettere 350 mL di acqua in un contenitore volumetrico fornito di agitatore magnetico. Inserire la barretta per agitare e regolare la velocit a un ritmo lento e costante; c. aggiungere 10,2 g di sale da sciogliere, risciacquando la vaschetta con ripetute aliquote dacqua sino a che non rimane pi sale. Piccoli e ripetuti risciacqui rimuovono molto pi materiale aderente piuttosto che usare grandi volumi. Aggiungere lacqua di risciacquo al contenitore volumetrico e agitare sino a che tutto il sale non sia completamente sciolto; d. se non necessario misurare il pH, aggiungere acqua sino al segno che indica i 500 mL, aggiustare il volume per la presenza della barretta agitatrice e mescolare accuratamente. Per le soluzioni che necessitano di regolare il pH, vedi il punto che segue (5); 5. regolare il pH di una soluzione prima di portarla al volume finale, cos che laggiunta di acqua (o di un altro solvente) non cambi marcatamente la molarit. Per esempio, per portare 500 mL di glicina 0,1 M a pH 3, agire come specificato di seguito: a. aggiungere in un beaker, contenente da
400 a 475 mL dacqua, 3,75 g di glicina (H2NCH2COOH, peso molecolare 75). Sciogliere totalmente usando lagitatore magnetico; b. aggiungere poche gocce di HCl (12 N) e misurare il pH, dopo che lacido cloridrico stato accuratamente mescolato. Continua ad aggiungere HCl sino a pH 3,0; c. trasferire la soluzione in un contenitore volumetrico da 500 mL. Risciacquare il beaker e la barretta agitatrice con piccole aliquote dacqua e aggiungere questa acqua di risciacquo al contenitore, usandola come contributo per giungere al volume finale di 500 mL; d. misurare il pH della soluzione al volume finale.
Bibliografia 1. Remson ST, Ackerman PG. Calculations for the medical laboratory. Boston, MA: Little, Brown & Co., 1977. Henry JB, ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 18th ed. Philadelphia: WB Saunders, 1991.
2.
Metodo 1.4 Diluizione di sieri

Principio Il siero viene talora diluito in fisiologica (o in altri diluenti) per determinare la concentrazione relativa di un anticorpo. usuale esprimere la diluizione come una parte di siero contenuta nel totale di parti della diluizione. Per esempio, per analizzare un siero a un decimo della sua concentrazione originale, la diluizione pu essere ottenuta mescolando 1 mL di siero con 9 mL di fisiologica. Il volume finale 10 e questa diluizione pu essere espressa come 1 in 10. La diluizione contiene un decimo (1/10 o 0,1) del siero originale. Spesso usuale riportare il titolo di un anticorpo come il reciproco della diluizione pi alta che mantiene unagglutinazione di grado 1+.
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Quindi, il siero che reagisce ancora a una diluizione di 1/32 viene considerato avere un titolo anticorpale di 32. Notare: 1 in 10 1 parte su 9 parti, mentre 1 a 10 (o 1:10) 1 parte in 10 parti. Procedura 1. Diluire una diluizione gi esistente. a. Una nuova diluizione, pi alta, si pu preparare partendo da materiale gi diluito aggiungendo quantit di diluente. La formula per calcolare sia una nuova diluizione pi alta sia la quantit di diluente da aggiungere per ottenere la nuova diluizione finale la seguente: reciproco della diluizione attuale del siero volume della diluizione usata di siero = reciproco della nuova diluizione finale volume finale totale b. Esempio. La diluizione del siero 1 parte su due e il volume del siero 1 mL. Se si aggiungono 4 mL di fisiologica, quale sar la diluizione finale? 2 X = 1 5 dove X uguale a 10, cio una diluizione di 1 a 10. 2. Diluire a uno specifico volume. a. La formula per calcolare il volume del diluente da aggiungere a una diluizione per ottenere una data quantit di una nuova, maggiore diluizione : reciproco della diluizione attuale volume della diluizione da ottenere = reciproco della nuova diluizione finale totale del volume finale richiesto b. Esempio. Lattuale diluizione del siero di 1 a due, il volume totale finale 100 mL e la nuova diluizione finale del siero di 1 a 10. Quanto siero (diluito 1 a 2) dovr
aggiungere per ottenere un volume finale di 100 mL ad una diluizione di 1 a 10? 2 = 10 X 100 X = 20, cio 20 mL di siero (diluito uno a due) devono essere aggiunti a 80 mL di diluente per ottenere 100 mL ad una diluizione 1 a 10.
Metodo 1.5. Soluzioni a diluizioni percentuali

Procedura 1. Si possono preparare delle diluizioni da soluzioni pi concentrate usando la formula seguente: V1 x C1 = V2 x C2 dove V1 e C1 rappresentano il volume e la concentrazione iniziale, mentre V 2 e C 2 indicano il volume e la concentrazione desiderata. 2. Esempio. Dispongo di albumina al 30% ma necessito di albumina al 6%. Come dovr operare? V1 x 30 = 2 x 6 30 V1 = 12 V1 = 12 diviso 30 = 0,4 Dovr, quindi, mescolare 0,4 mL di albumina al 30% con 1,6 mL di fisiologica per ottenere 2 mL di albumina al 6%. Per quantit minori, mescolare 4 gocce di albumina al 30% con 16 gocce di fisiologica per ottenere 20 gocce di albumina al 6%.
Metodo 1.6. Preparazione di una sospensione eritrocitaria al 3%

Principio Per molti esami di sierologia immunoematologica, una sospensione di globuli rossi al 3% un reagente di uso molto comune.
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Non necessario che la sospensione sia esattamente al 3%; in molti test anche sospensioni approssimative ottengono lappropriato rapporto siero-cellule e un numero adeguato di globuli rossi, cos da poter leggere e graduare le reazioni (cio dare loro un valore numerico). I punti elencati successivamente servono a fornire una personale sicurezza nel valutare visivamente sia una sospensione di eritrociti approssimativamente al 3%, sia la dimensione del sedimento cellulare che si ottiene dopo una centrifugazione. Materiali 1. Campione di sangue intero. 2. Provette. 3. Pipette monouso (da 1 e da 10 mL). 4. Fisiologica. 5. Centrifuga (3.000 giri/minuto o equivalente). 6. Preparazione commerciale di una sospensione eritrocitaria al 3%. Procedura Per preparare 10 mL di una sospensione eritrocitaria al 3%, agire come specificato di seguito: 1. trasferire almeno 1 mL di sangue intero in una provetta da 10 mL; 2. lavare i globuli rossi in fisiologica o in fisiologica tamponata ai fosfati (PBS, phosphate-buffered saline), centrifugare per 5 minuti al fine di far sedimentare le cellule. Ripetere il lavaggio 2 o 3 volte. Il sovranatante deve essere limpido ed essere rimosso completamente per aspirazione; 3. trasferire 0,3 mL di globuli rossi lavati in una provetta che contenga fisiologica o PBS o soluzione di Alsever; 4. tappare o chiudere con parafilm la provetta. Invertire pi volte, delicatamente, la provetta per mescolare i globuli rossi e la soluzione; 5. per paragonare, a occhio, il colore e la densit di una sospensione, trasferire un volume della sospensione preparata in una provetta di 10 x 75 mm. Trasferire anche un eguale volume di una sospensione
sicuramente al 3% (quella di origine commerciale) in unaltra provetta sempre di 10 x 75 mm. Mantenere le due provette davanti a una sorgente di luce per paragonarle fra loro; 6. per paragonare le dimensione del sedimento eritrocitario che ci si attende da una sospensione al 3%, trasferire una goccia della sospensione preparata in una provetta di 10 x 75 mm ed, egualmente, trasferire una goccia della sospensione commerciale (nota per essere al 3%) in unaltra provetta delle stesse dimensioni. Centrifugare le due provette in una centrifuga da sierologia. impiegando il tempo previsto per fisiologica. Le dimensioni dei due sedimenti dovrebbero essere molto simili. Nota Per ottenere i risultati migliori, impiegare la sospensione eritrocitaria soltanto nel giorno della preparazione, a meno che la sua stabilit non sia stata convalidata per tempi pi lunghi.
Metodo 1.7 Preparazione e impiego di una soluzione tamponata ai fosfati

Principio Si possono preparare mescolanze di acidi e di basi a specifici valori di pH e usarle per tamponare (rendere) altre soluzioni al pH previsto. La procedura che riportiamo di seguito serve a preparare fisiologica tamponata ai fosfati (PBS), che pu essere impiegata come diluente nei test sierologici. Reagenti 1. Preparare una scorta di soluzione acida (soluzione A) sciogliendo, in 1 litro di acqua distillata, 22,16 g di NaH2PO4 H2O. Questa soluzione (0,16 M) di fosfato monobasico (monoidrato) ha un pH di 5,0. 2. Preparare una scorta di soluzione alcalina (soluzione B), sciogliendo in 1 litro dacqua
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distillata 22,7 g di NaH2PO4. Questa soluzione (0,16 M) di fosfato bibasico (anidro) ha un pH di 9,0. Procedimento 1. Preparare le soluzioni tampone di lavoro al pH desiderato, mescolando appropriati volumi delle sue soluzioni. Di seguito alcuni esempi. pH 5,5 7,3 7,7 Soluzione A 94 mL 16 mL 7 mL Soluzione B 6 mL 84 mL 93 mL
Metodo 1.8 Lettura e graduazione di una agglutinazione in provetta

Principio Lo scopo di graduare le reazioni quello di permettere comparazioni sulla loro potenza. Ci utile per individuare specificit anticorpali multiple o per dosare gli anticorpi. La graduazione delle reazioni dovrebbe essere standardizzata fra tutti i membri del personale di laboratorio, per ottenere uniformit e riproducibilit nei risultati dei test. La maggioranza dei laboratori definisce una propria versione del sistema di graduazione, riportata in una procedura scritta, disponibile per tutti i componenti dello staff. Alcuni laboratori usano assegnare un valore numerico (score o punteggio) alle reazioni osservate. Materiali 1. Test sierologici di agglutinazione dopo centrifugazione. 2. Agglutinoscopio. Procedimento 1. Agitare o inclinare delicatamente la provetta e risospendere il bottone di globuli rossi. La tecnica di inclinazione impiega la particolare conformazione assunta dal liquido in provetta (il cosiddetto menisco) per distaccare il
2. Controllare il pH della soluzione di lavoro, prima del suo impiego. Se necessario, aggiungere piccoli volumi di soluzione A o di soluzione B, per conseguire il pH desiderato. 3. Per preparare PBS a un pH desiderato aggiungere un volume di tampone fosfato a quel dato pH a 9 volumi di fisiologica normale.
Bibliografia 1. Hendry EB. Osmolarity of human serum and of chemical solutions of biologic importance. Clin Chem 1961;7:156-64. Dacie JV, Lewis SM. Practical haematology. 4th ed. London, England: J and A Churchill, 1968: 540-1.
2.
Tabella 1.8.1 - Interpretazione delle reazioni di agglutinazione Osservazioni macroscopiche Unico agglutinato solido Numerosi grossi agglutinati Agglutinati di media grandezza in un liquido limpido Piccoli agglutinati in un liquido torbido Agglutinati molto piccoli in un liquido torbido Agglutinazione appena visibile in un liquido torbido Nessuna agglutinazione Mescolanza di emazie agglutinate e non agglutinate Emolisi totale Emolisi parziale, con alcune emazie intatte Designazione 4+ 3+ 2+ 1+ 1W w o +/ 0 campo misto ET EP Punteggio (Score) 12 10 8 5 4 2 0
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bottone di emazie dalle pareti della provetta. 2. Osservare il modo con il quale le cellule si disperdono dal bottone eritrocitario. 3. Registrare la reattivit, paragonando gli agglutinati secondo le descrizioni di Tabella 1.8.1. La reattivit dovrebbe essere valutata quando i globuli rossi si sono completamente distaccati dal bottone Interpretazione Vedi Tabella 1.8.1. Note 1. Un agglutinoscopio pu agevolare la lettura dei test in provetta. Si devono, tuttavia, seguire le raccomandazioni dei produttori dei test per interpretarne i risultati. 2. Si deve ispezionare il siero che sovrasta il bottone delle cellule per evidenziare eventuale emolisi, che segno di una reazione antigeneanticorpo, semprech il siero prima del test
non fosse gi emolizzato e/o non si fosse aggiunta, durante il test, una sostanza emolizzante. 3. Si dovrebbero osservare e registrare le caratteristiche dellagglutinazione. Questa informazione pu fornire utili indicazioni per lindagine, quali, per esempio, la tipica agglutinazione rifrangente in presenza di anticorpi anti-Sda. 4. Ci si attende una agglutinazione a campo misto quando si usano mescolanze di emazie test per lindividuazione di anticorpi o quando si aggiungono emazie di controllo a un test allantiglobulina risultato negativo.
Bibliografia 1. Race RR, Sanger R. Blood groups in man. 6th ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1975.
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Metodi sezione 2: Tipizzazioni eritrocitarie
Metodi sezione 2
Tipizzazioni eritrocitarie
Metodo 2.1 Test su vetrino per la determinazione su globuli rossi del gruppo ABO
Principio Per una discussione sui principi relativi alla tipizzazione ABO, vedi il Capitolo 15. Campioni Si devono seguire le istruzioni dei produttori dei reagenti, prima di effettuare un test su vetrino. Alcuni produttori raccomandano di eseguire questo test su sangue intero, mentre altri specificano di usare globuli rossi risospesi ad alta concentrazione, in fisiologica, in siero o in plasma. Reagenti 1. Anti-A. 2. Anti-B. 3. Anti-A,B (opzionale). Si devono usare tutti i reagenti seguendo le istruzioni dei produttori. Procedimento 1. Posare una goccia di siero test anti-A su un vetrino, ben pulito e contrassegnato. 2. Posare una goccia di siero test anti-B su un altro vetrino, ben pulito e contrassegnato. 3. Posare una goccia di siero test anti-A,B su un terzo vetrino, se si vogliono eseguire analisi in parallelo con questo reagente, o su un unico vetrino, ben pulito e contrassegnato, qualora questa sia lunica analisi da effettuare. 4. Aggiungere a ciascuna goccia di siero test sul
vetrino una goccia di una sospensione (in salina, siero o plasma), ben miscelata, di globuli rossi da testare (consultare le istruzioni dei produttori circa la concentrazione eritrocitaria corretta da usare). 5. Mescolare accuratamente i reagenti e le emazie utilizzando un bastoncino ben pulito per ogni reagente su unarea approssimativa di 20 mm per 40 mm. 6. Oscillare con delicatezza e continuamente il vetrino per 2 minuti. Durante questo periodo, non sistemarlo su una superficie riscaldata come un agglutinoscopio per Rh. 7. Leggere, interpretare e registrare i risultati delle reazioni di ciascun vetrino. Interpretazione 1. Unevidente agglutinazione eritrocitaria indotta da ogni reagente ABO costituisce un risultato positivo. 2. Una sospensione omogenea dei globuli rossi alla fine dei due minuti indica una reazione negativa. 3. I campioni che danno reazioni deboli o dubbie devono essere ricontrollati con il Metodo 2.2. Note 1. I test su vetrino comportano un pi alto rischio di esposizione a campioni infetti. Il personale dovrebbe seguire le misure di sicurezza contenute nel manuale interno delle procedure. 2. I test su vetrino non sono adatti alla ricerca degli anticorpi ABO su siero o plasma.
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Metodo 2.2 Test in provetta per la determinazione del gruppo ABO su globuli rossi e su siero
Principio Per una discussione sui principi relativi alla tipizzazione ABO, vedi il Capitolo 13. La procedura riportata di seguito rappresenta un metodo accettabile, ma, per ogni singolo reagente, devono essere consultate le istruzioni dei produttori. Campioni Circa i requisiti dei campioni, si devono consultare le istruzioni dei produttori riportate negli inserti che accompagnano le confezioni dei reagenti. Generalmente possono essere usati campioni di sangue coagulato o anticoagulato per la determinazione di gruppo ABO. I globuli rossi possono essere sospesi nel siero autologo, in plasma o in fisiologica o possono essere lavati e risospesi in soluzione salina. Reagenti 1. Anti-A. 2. Anti-B. 3. Anti-A,B (luso di questo reagente opzionale). 4. Emazie test A1, A2 e B. Queste emazie si possono ottenere dal commercio o essere preparate, per ogni giorno di utilizzo, in laboratorio, risospese dal 2 al 5% in salina (limpiego di emazie A2 opzionale). Tutti i reagenti devono essere impiegati seguendo le istruzioni dei produttori. Procedimento Test sulle emazie 1. Mettere una goccia di siero anti-A in una provetta, pulita e contrassegnata. 2. Mettere una goccia di siero anti-B in una provetta, pulita e contrassegnata. 3. Mettere una goccia di siero anti-A,B in una provetta pulita e contrassegnata, nel caso si usi questo reagente. 4. Aggiungere a ciascuna provetta una goccia di una sospensione dal 2 al 5% (in fisiologica, in siero o in plasma) delle emazie da tipizzare. Alternativamente,
unequivalente quantit di emazie pu essere trasferita nelle provette con un bastoncino pulito. 5. Mescolare delicatamente il contenuto di ciascuna provetta e centrifugare le provette per il tempo e la velocit stabiliti. 6. Risospendere, con delicatezza, il sedimento di emazie ed esaminarlo per lagglutinazione. 7. Leggere, interpretare e registrare i risultati, che vanno paragonati a quelli dei test su siero/plasma (vedi sotto). Test su siero/plasma 1. Contrassegnare due provette ben pulite con A1 e con B (contrassegnare unulteriore provetta con A2 se si utilizza questo test opzionale). 2. Aggiungere 2 o 3 gocce di siero o plasma a ciascuna provetta. 3. Aggiungere una goccia di emazie test A1 alla provetta contrassegnata A1. 4. Aggiungere 1 goccia di emazie test B alla provetta contrassegnata B. 5. Aggiungere 1 goccia di emazie test A2 alla provetta contrassegnata A2, se si utilizza questo test opzionale. 6. Mescolare delicatamente i contenuti di ciascuna provetta e centrifugare le provette per i tempi e la velocit stabiliti. 7. Esaminare i liquidi sovranatanti per evidenziare uneventuale emolisi. Risospendere delicatamente i sedimenti di emazie ed esaminarli per lagglutinazione. 8. Leggere, interpretare e registrare i risultati dei test, paragonandoli a quelli dei test sulle emazie (vedi sopra). Interpretazione 1. Lagglutinazione delle emazie tipizzate e lemolisi o lagglutinazione delle emazie test con siero/plasma costituiscono un risultato positivo. 2. Una sospensione eritrocitaria omogenea, dopo risospensione del sedimento di emazie, indica una reazione negativa. 3. Linterpretazione dei risultati ABO con siero/plasma riportata nella Tabella 13.1.
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4. Ogni discrepanza fra i test sulle emazie e quelli sul siero/plasma per donatori o pazienti deve essere risolta prima di registrare i risultati (Capitolo 13). Nota Le reazioni con i sieri test ABO danno gradi di agglutinazione di 4+ o 3+, mentre le reazioni di siero/plasma con emazie test danno, spesso, reazioni pi deboli. I test su siero/plasma possono essere incubati da 5 a 10 minuti a temperatura ambiente per rinforzare le reazioni deboli. Vedi Capitolo 13 per una discussione sui campioni che reagiscono debolmente.
Metodo 2.3 Test in micropiastre per la determinazione del gruppo ABO su globuli rossi e su siero
Principio Per una discussione sui principi relativi alla determinazione ABO, vedi il Capitolo 13. Le tecniche in micropiastre possono essere usate per la determinazione degli antigeni sulle emazie e degli anticorpi nel siero. Una micropiastra pu essere considerata come una matrice a 96 provette test corte; gli stessi principi che si applicano allagglutinazione in provetta valgono anche per i test in micropiastra. Le micropiastre possono essere rigide o flessibili, con pozzetti a forma di U o di V. Quelli con pozzetti a U sono usati pi diffusamente, perch i risultati possono essere letti sia dopo la centrifugazione della piastra (osservando le caratteristiche delle emazie risospese) sia osservando il fluire degli eritrociti quando la piastra posta ad angolo. Entrambe queste tecniche di lettura permettono di valutare la potenza di unagglutinazione. Campioni Vedi metodo 2.2. Attrezzature 1. Dispensatori (opzionali). Per dispensare uguali volumi per ciascuna linea di pozzetti
sono disponibili dispensatori semiautomatici. Si possono acquistare speciali trasportatori di piastre, adatti alle comuni centrifughe da tavolo. 2. Lettori di micropiastre (opzionali). Sono disponibili apparecchiature fotometriche in grado di leggere i risultati utilizzando lassorbanza (densit ottica) della luce da parte dei sedimenti nei pozzetti a U, per distinguere i risultati positivi da quelli negativi. Un microprocessore, componente del fotometro, interpreta le reazioni e stampa i risultati. Per la raccolta e la preparazione dei campioni di siero/plasma e di globuli rossi, si devono seguire le indicazioni dei produttori. 3. Centrifughe. Per ogni centrifuga si devono stabilire le condizioni pi appropriate. Si consigliano i tempi e le forze di centrifugazione (espresse in g) riportate di seguito. Consultare le istruzioni del produttore per informazioni specifiche. Per micropiastre flessibili con pozzetti a U: 700 x g per 5 secondi per i test sulle emazie e per quelli su siero/plasma. Per micropiastre rigide con pozzetti a U: 400 x g per 30 secondi per i test sulle emazie e per quelli su siero/plasma. Reagenti Molti produttori forniscono reagenti, autorizzati dalla Food and Drug Administration (FDA) per le determinazioni ABO ed Rh da usarsi, indiluiti, per i test in micropiastre. 1. Anti-A. 2. Anti-B. 3. Anti-A,B (opzionale) 4. Emazie test di gruppo A1, A2 (opzionale), B, che si possono acquistare dal commercio o che possono essere preparati in laboratorio, ogni giorno di utilizzo, in sospensioni dal 2 al 5%. Procedimento Test sulle emazie 1. Mettere 1 goccia di anti-A e 1 di anti-B in separati pozzetti, ben puliti, di una micropiastra a U. Se si utilizza il siero anti-A,B, si aggiunga questo siero test in un terzo pozzetto. 2. Aggiungere una goccia di una sospensione eritrocitaria (2-5% in fisiologica) a ciascun
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pozzetto che contiene lantisiero tipizzante. 3. Mescolare i contenuti dei pozzetti con delicati colpetti sui lati della piastra. 4. Centrifugare la piastra alle condizioni stabilite per ogni tipo di centrifuga. 5. Risospendere il bottone di cellule con colpetti manuali o con laiuto di uno scuotitore meccanico oppure sistemare la piastra ad angolo, utilizzando il metodo tilt and stream (cio, oscillare e fluire). 6. Leggere, interpretare e registrare i risultati. Paragonare i test sulle emazie con quelli ottenuti testando il siero/plasma. Test su siero/plasma 1. Mettere una goccia di una sospensione (2-5%) di emazie test A1 e B a ciascun pozzetto, ben pulito, della micropiastra. Se si utilizzano anche emazie test A2, aggiungere queste a un terzo pozzetto. 2. Aggiungere una goccia di siero o plasma a ciascun pozzetto. 3. Mescolare i contenuti dei pozzetti con delicati colpetti sui lati della piastra. 4. Centrifugare la piastra alle condizioni stabilite per ogni tipo di centrifuga. 5. Risospendere il bottone di cellule con colpetti manuali o con laiuto di uno scuotitore meccanico oppure sistemare la piastra ad angolo, utilizzando il metodo tilt and stream (cio, oscillare e far fluire). 6. Leggere, interpretare e registrare i risultati. Confrontare i test sul siero/plasma con quelli ottenuti testando le emazie. Nota Per rafforzare le reazioni deboli che si hanno con siero/plasma, le piastre possono essere incubate a temperatura ambiente da 5 a 10 minuti; ripetere, poi, centrifugazione, lettura e registrazioni. Interpretazione 1. Lagglutinazione delle emazie test in ogni pozzetto e lemolisi o lagglutinazione indotta di un test con siero/plasma costituiscono un risultato positivo.
2. Una sospensione eritrocitaria omogenea, dopo risospensione del sedimento di emazie, indica una reazione negativa. 3. Linterpretazione dei risultati ABO con siero/plasma riportata nella Tabella 13.1. 4. Ogni discrepanza fra i test sulle emazie e quelli sul siero/plasma per donatori o per pazienti deve essere risolta prima di registrare i risultati (Capitolo 13).
Metodo 2.4 Confermare un sottogruppo debole di A o di B con tecniche di assorbimento/eluizione

Principio Vedi il Capitolo 13 per i principi che riguardano i gruppi ABO. Campioni Vedi Metodo 2.2. Reagenti 1. Siero umano anti-A e/o anti-B. Dato che alcuni sieri tipizzanti monoclonali ABO sono sensibili ai cambiamenti di pH e di osmolarit, essi non sono adatti per i test di assorbimento/eluizione. 2. Per le sostanze da usarsi per le eluizioni, consultare i Metodi della Sezione 4. Procedimento 1. Lavare, almeno tre volte in fisiologica, 1 mL di emazie da testare. Rimuovere ed eliminare il sovranatante dopo lultimo lavaggio. 2. Aggiungere 1 mL di siero anti-A (se si sospetta una variante debole di A) o 1 mL di anti-B (se si sospetta una variante debole di B) alle emazie lavate. 3. Mescolare emazie e antisiero e incubare a 4 C per 1 ora, rimescolando saltuariamente. 4. Centrifugare per impaccare le emazie. Rimuovere tutto il siero test sovranatante. 5. Trasferire le emazie in una provetta pulita. 6. Lavare le cellule almeno 8 volte con abbondante (10 mL o pi) fisiologica fredda (4 C). Tenere unaliquota del liquido
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dellultimo lavaggio e testarla in parallelo con leluato. 7. Usare una metodica di eluizione adatta a recuperare gli anticorpi ABO, per esempio la tecnica al calore o la tecnica di Lui (congelamento-scongelamento) per rimuovere gli anticorpi dalle cellule (vedi Metodi, Sezione 4). 8. Centrifugare per impaccare le emazie e trasferire leluato sovranatante in una provetta pulita. 9. Testare in parallelo leluato e il liquido dellultimo lavaggio (vedi punto 6) contro 2 campioni di emazie O e 2 campioni di cellule con lantigene pertinente (emazie A1 se si sospetta la presenza di anti-A, emazie B se si sospetta la presenza di anti-B). Aggiungere 2 gocce delleluato o del liquido di lavaggio a 1 goccia di emazie e leggere per lagglutinazione, dopo centrifugazione immediata. Se il test negativo, incubare da 15 a 30 minuti a temperatura ambiente. Se entrambe queste fasi danno esito negativo pu essere utilizzata unincubazione di 15 minuti a 37 C o il test allantiglobulina. Interpretazione 1. La presenza di anti-A o di anti-B nelleluato, quindi la presenza di determinanti A o B sulle emazie in esame, viene confermata: a) se leluato reagisce, sempre, con i due campioni di cellule contenenti lantigene relativo; b) se leluato non reagisce, mai, con i 2 campioni di emazie O e c) se il liquido del lavaggio finale non reagisce mai con tutte 4 le cellule. Qualora leluato non reagisca con le cellule A o B, ci indica che le emazie test non esprimono lantigene relativo e non possono assorbire lanticorpo pertinente. Oppure, ci potrebbe indicare che leluato non stato preparato correttamente. Se leluato reagisce con una o entrambe le cellule A o B, ma anche con una o entrambe le cellule O, ci sta a indicare il recupero di un altro anticorpo addizionale nella procedura di assorbimento/eluizione. 2. Se la soluzione finale di lavaggio reagisce con le emazie A o B, i test sulleluato non si possono considerare validi. Questo pu
accadere se lanticorpo non legato non stato adeguatamente rimosso prima di iniziare leluizione, se le cellule non sono state perfettamente lavate o se intervenuta, durante i lavaggi, una distacco dellanticorpo legato. 3. Le emazie A e B possono essere utilizzate, durante le procedure di assorbimento/eluizione, quali controlli positivi/negativi. Anche le emazie O possono essere utilizzate come controllo negativo. Nota Leluato pu essere colorato per presenza di emoglobina; in questo caso la lettura difficoltosa a meno che non si ricorra al test allantiglobulina indiretto.
Bibliografia 1. Beattie KM. Identifying the causes of weak or missing antigens in ABO grouping tests. In: The investigation of typing and compatibility problems caused by red blood cells. Washington, DC: AABB, 1975:15-37.
Metodo 2.5 Test sulla saliva per le sostanze gruppospecifiche A, B, H, Lea e Leb
Principio Il 78% circa dei soggetti possiede il gene Se, che codifica per la secrezione degli antigeni idrosolubili ABH in tutti i fluidi dellorganismo con leccezione del liquido cerebro-rachidiano. Questi antigeni secreti si possono documentare nella saliva impiegando i test di inibizione con antisieri ABH e Lewis (vedi Capitolo 13). Campioni 1. Raccogliere da 5 a 10 mL di saliva in un piccolo beaker o in una provetta a bocca larga. La maggioranza delle persone in grado di fornire un tale volume in parecchi minuti. Per favorire la salivazione, si pu chiedere al soggetto di masticare cera, paraffina, elastici
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2. 3.
4.
5.
ma non chewing-gum o altre sostanze che contengono zucchero o proteine. Centrifugare la saliva da 900 a 1.000 giri/minuto per 8-10 minuti. Trasferire il sovranatante in una provetta pulita da mettere in un bagnomaria bollente per 8-10 minuti, allo scopo di inattivare gli enzimi salivari. Ricentrifugare il sovranatante da 900 a 1.000 giri/minuto, rimuovere la parte limpida o soltanto leggermente opalescente del sovranatante, scartando il materiale opaco o semisolido. Diluire il liquido separato con un volume eguale di fisiologica. Se la ricerca viene effettuata entro poche ore, refrigerare il liquido. Se il test non viene eseguito nel giorno stesso della raccolta, congelare il campione e conservarlo a 20 C. Il campione congelato mantiene lattivit per parecchi anni.
aggiungere una goccia di una sospensione in fisiologica (dal 2 al 5%) delle emazie test. Impiegare emazie A1, B od O per determinare, rispettivamente lo stato di secretore di A, di B o di H. Impiegare emazie Le(a+b ) per determinare lo stato di secretore Lewis. 3. Centrifugare ogni provetta e leggere, microscopicamente, per lagglutinazione. 4. Scegliere la diluizione pi alta che dia un agglutinazione 2+. Test dinibizione per determinare lo stato di secretore 1. Aggiungere 1 goccia del reagente appropriatamente diluito a ciascuna di 4 provette. Per gli studi sulle secrezioni ABH, le 4 provette devono essere cos etichettate: Secretore, Non secretore, Fisiologica, Stato ignoto (cio, In esame). Per la secrezione Lewis, le 4 provette vanno cos etichettate: Lewis positivo, Lewis negativo, Fisiologica, In esame. 2. Aggiungere 1 goccia dellappropriata saliva alle provette Secretore, Non secretore, In esame e una goccia di soluzione salina alla provetta Fisiologica. 3. Mescolare i contenuti delle provette. Incubare le provette, da 8 a 10 minuti, a temperatura ambiente. 4. Aggiungere 1 goccia di una sospensione, dal 2 al 5% in fisiologica, delle emazie test lavate da usarsi come indicatori; le emazie saranno di gruppo A, B, od O per lo stato di secretore ABH e Le(a+) per quello Lewis. 5. Mescolare il contenuto delle provette e incubarle (da 30 a 60 minuti) a temperatura ambiente. 6. Centrifugare ogni provetta e leggere, macroscopicamente, il sedimento eritrocitario per lagglutinazione. Interpretazione 1. Lagglutinazione delle emazie indicatrici da parte dellanticorpo nelle provette che contengono saliva indica che questa non contiene lantigene corrispondente. 2. La mancata agglutinazione delle emazie
Reagenti 1. Sieri umani (policlonali) anti-A e anti-B. Nota: alcuni sieri monoclonali possono non essere adatti a questo uso; sono, quindi, essenziali appropriati controlli. 2. Lectina anti-H, da Ulex europaeus, acquistata dal commercio o preparata in laboratorio dai semi di Ulex con estrazione salina. 3. Siero anti-Lea di coniglio, di capra o umano. Non esistono dati sulla idoneit degli anticorpi Lewis monoclonali. 4. Emazie test A1 e B, come quelle utilizzate nel Metodo 2.2. 5. Emazie O, Le(a+b), come utilizzate per la ricerca e lidentificazione degli anticorpi (vedi Capitolo 19). 6. Campioni (congelati o freschi) di saliva, provenienti da soggetti secretori e da soggetti non-secretori, da utilizzare come controlli positivi e negativi. Procedimento Scelta della diluizione dei reagenti gruppoematici 1. Preparare diluizioni per raddoppio dei reagenti appropriati. 2. A una goccia di ciascuna diluizione,
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indicatrici da parte dellanticorpo noto dopo lincubazione con la saliva, indica che questa contiene lantigene corrispondente. 3. La mancata agglutinazione delle emazie indicatrici da parte dellanticorpo contenuto nella provetta di controllo Fisiologica invalida i risultati. Di solito ci avviene quando i reagenti sono troppo diluiti. Rideterminare la diluizione appropriata del reagente e ripetere lintero procedimento, come descritto sopra. 4. Per ulteriori interpretazioni, vedi Tabella 2.5.1 Note 1. Utilizzare, come controlli, saliva di soggetto noto per essere secretore e di soggetto noto per essere non secretore. Per lo stato di secretore ABH, usare saliva di persone in possesso del gene Se e di persone di genotipo sese. Per i test Lewis usare saliva proveniente da soggetti di fenotipo Le(a+b) o Le(ab+) come controllo positivo e da soggetti Le(ab) come controllo negativo. La saliva di secretori si pu congelare e impiegare per un successivo uso. 2. Questa procedura di screening pu essere adattata per determinare lattivit quantitativa con diluizioni in serie della saliva. Pi alta la diluizione necessaria a rimuovere lattivit di Tabella 2.5.1 - Interpretazione di test sulla saliva
inibizione, maggiore la quantit di sostanza di gruppo presente nella saliva. La saliva dovrebbe essere diluita prima di incubarla con lanticorpo. Per individuare o misurare la sostanze A o B nella saliva oltre a quella H si pu utilizzare lo stesso procedimento impiegando reagenti anti-A o anti-B diluiti. La diluizione appropriata si ottiene titolando il reagente con emazie test A 1 oppure, rispettivamente, B. 3. Si ritiene che una persona secretore ABH abbia sia sostanza Lea che Leb nella propria saliva, mentre una persona Le(+), di genotipo sese, avr soltanto sostanza Lea nella propria saliva. 4. I campioni ad alto contenuto di sostanze gruppospecifiche solubili possono dare falsi risultati negativi ed necessario eseguire le diluizioni prima di effettuare i test.
Metodo 2.6 Determinazione dellantigene Rh D su vetrino

Principio Per una discussione sulla tipizzazione Rh, vedi Capitolo 14.
Test con anti-H Saliva in esame 2+ 0 Saliva di secretore 0 0 Saliva di non secretore 2+ 2+ Test con Anti-Lea Saliva in esame 2+ 0 Saliva di secretore 0 0 Saliva di non secretore 2+ 2+ Fisiologica (per controllo) 2+ 2+ Interpretazione Lewis negativo Lewis positivo* Fisiologica (per controllo) 2+ 2+ Interpretazione Non secretore di H Secretore di H
* Si ritiene che una persona che secerne sostanza ABH abbia sia sostanza Lea sia sostanza Leb nella propria saliva, mentre una persona Le(+) di genotipo sese e, quindi, non secretore ABH, abbia soltanto sostanza Lea nella propria saliva.
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Campioni Fare riferimento al Metodo 2.2. Apparecchiatura Visore. Reagenti 1. Reagenti anti-D: reagenti adatti sono i sieri policlonali ad alto contenuto proteico o quelli monoclonali a basso contenuto proteico. Seguire le istruzioni dei produttori del siero anti-D prima di eseguire una tipizzazione su vetrino. Il metodo qui presentato soltanto un esempio di procedura. 2. Reagente di controllo: le istruzioni dei produttori indicheranno il tipo di reagente da impiegare, se necessario. Procedimento 1. Mettere una goccia di anti-D su di un vetrino, pulito e contrassegnato. 2. Quando necessario, mettere una goccia dellappropriato reagente di controllo su un secondo vetrino contrassegnato. 3. Su ciascun vetrino, aggiungere 2 gocce di una sospensione dal 40 al 50% (nel siero o in plasma autologo oppure gruppo-compatibile) di emazie da tipizzare. 4. Mescolare accuratamente emazie e reagente. Usare un bastoncino pulito per ogni reazione e distendere la sospensione su unarea di 20 x 40 mm. 5. Sistemare entrambi i vetrini sul visore e sottoporli a oscillazioni lente e continue per osservare lagglutinazione (vedi la nota 1). La maggioranza dei produttori dei reagenti stabilisce che la lettura deve avvenire entro 2 minuti, in quanto il prosciugarsi della sospensione pu determinare la formazione di impilati, che possono essere erroneamente scambiati per agglutinati. 6. Interpretare e registrare i risultati delle reazioni ottenute su entrambi i vetrini. Interpretazione 1. Lagglutinazione con lanti-D e una sospensione omogenea sul vetrino di controllo
costituiscono un risultato positivo e indicano che le emazie in esame sono D positive. 2. Nessuna agglutinazione sul vetrino con anti-D e su quello di controllo fanno ritenere che le emazie siano D negative. Lanalizzare le emazie con il test allantiglobulina (vedi Metodo 2.9) potr dimostrare espressioni deboli dellantigene D, presenti sulle emazie non agglutinate su vetrino. 3. Se c agglutinazione sul vetrino di controllo, non si deve interpretare come positivo il risultato con lanti-D, senza eseguire ulteriori indagini. 4. Emazie secche ai bordi della mescolanza non devono essere confuse con unagglutinazione. Note 1. I test su vetrino comportano un rischio biologico molto alto. Il personale addetto deve seguire le misure cautelative indicate nel manuale delle procedure, proprio della struttura. 2. Per i test su vetrino condotti con anti-D a basso contenuto proteico, un risultato negativo con siero anti-A o anti-B serve da controllo.
Metodo 2.7. Determinazione dellantigene Rh D in provetta

Principio Per una discussione sui principi della tipizzazione Rh, vedi Capitolo 14 Campioni Fare riferimento al Metodo 2.2. Reagenti 1. Reagenti anti-D: reagenti adatti sono i sieri policlonali ad alto contenuto proteico o quelli monoclonali a basso contenuto proteico. Seguire le istruzioni dei produttori dei sieri anti-D prima di eseguire una tipizzazione in provetta. Il metodo qui presentato soltanto un esempio di procedura.
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2. Reagente di controllo: le istruzioni dei produttori indicheranno il tipo di reagente da impiegare, se necessario. Procedimento 1. Mettere una goccia di reagente anti-D in una provetta, pulita e contrassegnata. 2. Se necessario, mettere una goccia di appropriato siero di controllo in una seconda provetta, contrassegnata. 3. Aggiungere a ciascuna provetta 1 goccia di una sospensione dal 2 al 5%, in fisiologica, in siero o in plasma, delle emazie da tipizzare. Alternativamente, la medesima quantit di emazie pu essere trasferita in ciascuna provetta utilizzando un bastoncino pulito. 4. Mescolare delicatamente e centrifugare per il tempo e alla velocit specificati dai produttori. 5. Risospendere delicatamente il sedimento cellulare ed esaminarlo per lagglutinazione. Se stato usato un bastoncino per trasferire gli eritrociti, aggiungere una goccia di fisiologica a ciascuna provetta per facilitare la risospensione del sedimento cellulare. 6. Graduare la reazione e registrare i risultati del test e del controllo. Interpretazione 1. Lagglutinazione nella provetta contenente il siero anti-D insieme a unomogenea sospensione eritrocitaria nella provetta di controllo indicano che le emazie in esame sono D positive. 2. Unomogenea sospensione cellulare in entrambe le provette costituisce un risultato negativo. A questo punto, i campioni provenienti da pazienti possono essere designasti come D negativi. Il sangue di donatori deve essere ulteriormente indagato per la possibile presenza di un antigene D debole. La mescolanza siero-emazie che si usa dal punto 2 al punto 5 (come indicato sopra), pu essere usata per indagare sulla presenza del D debole, a condizione che le indicazioni dei produttori stabiliscano che il reagente idoneo per questa ricerca.
Note 1. La maggioranza degli antisieri commerciali danno unagglutinazione 2+ o maggiore con emazie D positive. Una struttura pu scegliere di utilizzare test suppletivi quando un risultato d agglutinazioni pi basse di 2+. Gli ulteriori test devono essere definiti nel manuale delle procedure della struttura. 2. Un test negativo con siero anti-A e/o anti-B pu servire come controllo valido quando si sono utilizzati sieri anti-D a basso contenuto proteico.
Metodo 2.8. Determinazione dellantigene Rh D in micropiastra

Principio Per una discussione sui principi della tipizzazione Rh, vedi Capitolo 14 Campioni Fare riferimento al Metodo 2.2. Per questa ricerca possono essere impiegati campioni coagulati o anticoagulati. Seguire le istruzioni dei produttori per la preparazione dei campioni, quando si utilizzano lettori semiautomatici di micropiastre. Reagenti Usare esclusivamente sieri anti-D approvati per test in micropiastre (vedi la discussione nel Metodo 2.3). Procedimento Il seguente un esempio di procedura; si dovrebbero seguire le istruzioni dei produttori degli specifici reagenti e delle attrezzature adatte. 1. Mettere 1 goccia di anti-D in un pozzetto pulito della micropiastra. Se il reattivo richiede limpiego di un siero di controllo, aggiungere 1 goccia di questo in un secondo pozzetto. 2. Aggiungere, a ciascun pozzetto, 1 goccia di una sospensione dal 2 al 5% in fisiologica delle emazie da tipizzare. 3. Mescolare i contenuti dei pozzetti con delicati colpetti sui lati della piastra.
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4. Centrifugare la piastra alle condizioni stabilite per il tipo di centrifuga. 5. Risospendere il bottone di cellule con colpetti manuali o con laiuto di uno scuotitore meccanico oppure sistemando la piastra ad angolo, utilizzano il metodo tilt and stream (cio, oscillare e fluire). 6. Leggere, interpretare e registrare i risultati. 7. Incubare i test negativi a 37 C per 15 minuti. 8. Centrifugare la piastra alle condizioni idonee stabilite per la centrifuga usata. 9. Risospendere il bottone di cellule con colpetti manuali o con laiuto di uno scuotitore meccanico oppure sistemando la piastra ad angolo, utilizzando il metodo tilt and stream. 10. Leggere, interpretare e registrare i risultati. Paragonare i test sulle emazie con quelli ottenuti testando il siero. Interpretazione Una agglutinazione con lanti-D, dopo centrifugazione immediata o dopo incubazione a 37 C, indica una reazione positiva, semprech non vi sia agglutinazione con il reagente di controllo. Vedi Tabella 14.3 per la determinazione del fenotipo Rh, utilizzando le reazioni che si osservano con i sieri per le tipizzazioni gruppoematiche. Nota Fare riferimento alle istruzioni dei produttori, quando vi necessit di ricercare il D debole.
Campioni Vedi Metodo 2.2. Procedimento Se il test iniziale stato condotto in provetta, questa stessa provetta pu essere utilizzata per la ricerca del D debole, semprech le istruzioni dei produttori lo consentano. In questo caso, procedere direttamente dal punto 4, dopo aver registrato che la provetta originale ha fornito un risultato negativo con lanti-D. 1. Mettere 1 goccia di siero anti-D in una provetta pulita e contrassegnata. 2. Mettere 1 goccia dellappropriato reagente di controllo in una seconda provetta, contrassegnata. 3. Aggiungere, a ciascuna provetta, 1 goccia di una sospensione (dal 2 al 5%) delle emazie da testare. Come controllo, ammesso utilizzare un test allantiglobulina diretto (TAD), ma preferibile impiegare un TAI, perch questo assicura che sono rappresentati tutti i reagenti che possono essere causa di risultati falsamente positivi. 4. Mescolare e incubare entrambe le provette secondo le istruzioni dei produttori. Lincubazione , tipicamente, da 15 a 30 minuti, a 37 C. 5. Se si desidera leggere il test dopo lincubazione a 37 C, centrifugare la provetta seguendo le istruzioni dei produttori. 6. Risospendere delicatamente il bottone cellulare ed esaminare per lagglutinazione. Se le emazie sono fortemente agglutinate nella provetta contenente il siero anti-D ma non nella provetta di controllo, registrare il campione come D positivo e non procedere alla fase antiglobulinica. 7. Se le emazie non sono agglutinate o se la reazione dubbia, lavare le emazie 3-4 volte con abbondante fisiologica. 8. Aggiungere lantiglobulina, seguendo le istruzioni dei produttori. 9. Mescolare delicatamente e centrifugare per le velocit e per i tempi previsti. 10. Risospendere delicatamente il bottone cellulare ed esaminare per lagglutinazione;
Metodo 2.9 Indagini per il D debole

Principio Alcune emazie esprimono cos debolmente lantigene D, che la maggioranza dei sieri anti-D non determina direttamente lagglutinazione. Le espressioni deboli del D possono essere identificate, in modo molto pi affidabile, utilizzando il test allantiglobulina indiretto (TAI), dopo aver incubato i globuli rossi in esame con il siero anti-D.
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classificarne il grado e registrare il risultato. 11. Se il test negativo, aggiungere (per controllo) emazie test rivestite da IgG. Interpretazione 1. O il reagente di controllo o un TAD devono accompagnarsi a un test per il D debole. Una agglutinazione nella provetta con siero anti-D e nessuna agglutinazione in quella che contiene il reagente di controllo costituiscono una risposta positiva. Se la struttura ha scelto di effettuare il test per il D debole e il risultato chiaramente positivo, le emazie testate sono da classificarsi come D positive. Non corretto registrare che tali emazie sono D negative - D deboli oppure D negative - Du. 2. Lassenza di agglutinazione nella provetta con siero anti-D costituisce un risultato negativo, che indica che tali emazie non esprimono lantigene D e si dovrebbero classificare come D negative. 3. Se c agglutinazione (in qualsiasi fase del test) nella provetta di controllo, non si pu trarre alcuna conclusione. Se il campione proviene da un possibile ricevente di una trasfusione, a questo paziente dovrebbe essere assegnato sangue Rh negativo fin tanto che non sia stato possibile determinare con sicurezza il suo stato D. Se il campione proviene da un donatore, il suo sangue non dovrebbe essere utilizzato per una trasfusione. Nota Alcune strutture possono scegliere di effettuare una lettura aggiuntiva dopo lincubazione a 37 C, prima della fase antiglobulinica. Fare riferimento alle istruzioni dei produttori. Se si esegue la lettura aggiuntiva opzionale, il manuale delle procedure della struttura dovrebbe indicare questa prassi da adottare per linterpretazione dei risultati e sullobbligo di eseguire tale esame addizionale.
reagiscono, specificamente, con i carboidrati della membrana eritrocitaria e divengono utili reagenti tipizzanti, che, ad appropriate diluizioni sono altamente specifici. Estratti diluiti di Dolichos biflorus agglutinano gli eritrociti A1 ma non quelli A2: lestratto di Ulex europaeus reagisce con la sostanza H e in maniera proporzionale alla quantit di sostanza H presente sui globuli rossi (O>A2>B>A1>A1B sui globuli rossi). Altre lectine si utilizzano a scopi differenti: Arachis hypogea (come anti-T), Glicine soja (anti-T; anti-Tn); Vicia graminea (anti-N) e le lectine di Salvia (Salvia horminum anti-Tn/Cad; Salvia sclarea anti-Tn). Per indagare la poliagglutinazione eritrocitaria preparare e testare le emazie con lectine da Arachis, Glicine, Salvia e Dolichos. Le reazioni con emazie poliagglutinabili sono illustrate nella Tabella 2.10.1. Se si usano lectine commerciali, seguire le istruzioni dei produttori. Reagenti I semi si possono ottenere da negozi che vendono cibi naturali, da farmacie o da societ (commerciali) che trattano sementi. I semi dovrebbero essere crudi, non trattati. Procedimento 1. Sminuzzare i semi in un tritatutto o in un miscelatore sino a che le singole particelle non appaiano come una sabbia grossolana. Pu essere usato un mortaio o un pestello o i grani Tabella 2.10.1 - Reazioni fra lectine ed emazie poliagglutinabili Lectine Arachis hypogea1 Dolichos biflorus2 Glycine soja (max) Salvia sclarea Salvia horminum
1
T + 0 + 0 0
Th + 0 0 0 0
Tk + 0 0 0 0
Tn Cad 0 + + + + 0 + + 0 +
Metodo 2.10 Preparazione e uso di lectine

Principio Estratti in soluzione fisiologica di alcuni semi
Le emazie T e Th danno reazioni pi deboli con lArachis se pretrattate con enzimi, mentre la reattivit Tk aumenta con il trattamento enzimatico. Emazie A e AB possono reagire, in rapporto allattivit anti-A del Dolichos.
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di semi possono essere usati interi. 2. In una provetta a bocca larga o in un piccolo beaker sistemare i semi sul fondo e aggiungere fisiologica sino a tre-quattro volte il loro volume. I semi si comportano diversamente nei riguardi della loro capacit di assorbire la soluzione salina. 3. Incubare a temperatura di laboratorio da 4 a 12 ore, mescolando e invertendo saltuariamente. 4. Trasferire il liquido sovranatante in provette da centrifuga e centrifugarle per 5 minuti, al fine di ottenere un liquido limpido. Raccogliere e filtrare il liquido e scartare i residui dei semi. 5. Testare le diluizioni dellestratto per individuare la diluizione con lattivit desiderata. Determinare tale attivit, utilizzando le appropriate emazie, come specificato qui di seguito. Per il Dolichos biflorus: a. aggiungere 1 goccia di una sospensione dal 2 al 5% in salina di emazie A1, A2, A1B, A 2B, B e O alle pertinenti provette, correttamente contrassegnate; b. aggiungere 1 goccia dellestratto a ciascuna provetta; c. centrifugare per il tempo stabilito; d. esaminare per lagglutinazione e registrare i risultati; e. la lectina dovrebbe agglutinare i globuli rossi A1 e A1B ma non quelli A2, A2B, B e O. Lestratto indiluito agglutina, spesso, tutti i campioni di globuli rossi testati. Per rendere il prodotto un utile reattivo, aggiungere sufficiente soluzione salina perch lestratto agglutini (con reattivit 3+ o 4+) le emazie A1 e A1B ma non quelle A2, A2B, B o O. Per lUlex europaeus: a. aggiungere 1 goccia di una sospensione dal 2 al 5% in salina di emazie A1, A2, A1B, A 2 B, B e O alle pertinenti provette correttamente contrassegnate; b. aggiungere 1 goccia dellestratto a ciascuna provetta; c. centrifugare per il tempo stabilito; d. esaminare per lagglutinazione e registrare i risultati; e. la forza dellagglutinazione essere, in ordine: O>A2>B>A1>A1B;
f. se necessario, diluire con salina sino al punto che i globuli rossi O diano unagglutinazione da 3+ a 4+, quelli A2 e B diano un agglutinazione fra 2+ e 1+ e quelli A1B e A1 non vengano agglutinati. Note 1. Per facilitare la frantumazione di semi particolarmente coriacei, si possono ricoprire con soluzione salina e lasciarli immersi per parecchie ore prima di tritarli. Il contenitore usato per limmersione non dovrebbe essere ermeticamente chiuso, perch durante questa fase alcuni semi rilasciano gas che potrebbero provocare lesplosione del contenitore. 2. Gli estratti possono essere conservati in frigorifero per parecchi giorni; in congelatore possono essere conservati indefinitivamente. 3. I test dovrebbero prevedere controlli positivi e negativi.
Metodo 2.11 Uso di reagenti sulfidrilici per disperdere le autoagglutinazioni

Principio Vedi il Capitolo 20 per la discussione sulla dispersione di autoagglutinati. Campioni Globuli rossi ricoperti da immunoglobuline. Reagenti 1. Ditiotreitolo (DTT) 0,01 M: 0,154 g di DTT sciolti in 100 mL di soluzione salina tamponata ai fosfati (PBS) a pH 7,3 o 2-mercaptoetanolo (2-ME) 0,1 M, 0,7 mL di una soluzione madre di 2-ME 14 M diluita in 100 mL di PBS a pH 7,3. 2. PBS a pH 7,3. Procedimento 1. Diluire i globuli rossi al 50% in PBS. 2. Aggiungere alle emazie uneguale quantit di DTT 0,01 M in PBS o di 2-ME 0,1 M in PBS. 3. Incubare a 37 C per 10 minuti (2-M) o per 15 minuti (DTT).
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4. Lavare tre volte le emazie con salina e risospenderle in PBS. 5. Diluire i globuli rossi cos trattati a concentrazioni dal 2 al 5% per eseguire le tipizzazioni. Verificare che non si autoagglutinino spontaneamente prima di tipizzarli. Nota Questa procedura si usa, di solito, per la tipizzazione ABO diretta (cio, eseguita sulle emazie), per le tipizzazioni Rh e per lesecuzione del test allantiglobulina diretto. A questa concentrazione di DTT, alcuni antigeni, il particolare Jsa e Jsb, possono risultare indeboliti o distrutti dal DTT 0,01 M.
Campioni Emazie positive al TAD. Procedimento 1. Mettere, in una provetta di appropriata capacit, un volume di emazie rivestite da anticorpi (lavate) e tre volumi di soluzione fisiologica normale. In unaltra provetta, mettere gli stessi volumi di soluzione salina e di emazie positive per lantigene da tipizzare. Questultima provetta controller che la tecnica di eluizione non abbia distrutto o alterato la reattivit antigenica. 2. Incubare il contenuto delle due provette a circa 45 C da 10 a 15 minuti, agitando frequentemente. Il tempo di incubazione deve essere grossolanamente proporzionato al grado di adesione degli anticorpi alle emazie, come indicato dalla intensit della reazione allantiglobulina. 3. Centrifugare le provette e scartare la fisiologica sovranatante. 4. Testare le cellule per graduare la rimozione anticorpale, paragonando un TAD sulle emazie trattate con i risultati di un TAD su cellule non trattate. Se il rivestimento di anticorpi ridotto ma ancora presente, ripetere le fasi 1-3; anche le cellule di controllo devono essere risottoposta a questo secondo trattamento. 5. Tipizzare i globuli rossi trattati per lantigene che si desidera determinare. Note 1. Questa procedura pu essere non necessaria, se si impiegano sieri test monoclonali di classe IgM. Questi reagenti, infatti, agglutinano direttamente e di solito non subiscono linfluenza da parte delle immunoglobuline adese ai globuli rossi. 2. Cos come per emazie non trattate al calore provenienti da pazienti, i risultati di una tipizzazione antigenica di cellule provenienti da pazienti trasfusi devono essere interpretati con la massima cautela, data la possibile presenza in circolo di eritrociti del donatore.
Bibliografia 1. Reid ME. Autoagglutination dispersal utilizing sulfhydryl compounds. Transfusion 1978;18:353-5.
Metodo 2.12 Eluizione delicata al calore per tipizzare globuli rossi con TAD positivo
Principio Emazie, pesantemente rivestite da IgG, possono autoagglutinarsi spontaneamente in presenza di reagenti ad alto contenuto proteico e causare falsi risultati positivi nei test allantiglobulina. Per poter eseguire la tipizzazione di questi eritrociti necessario distaccare gli anticorpi dalle cellule con tecniche di eluizione, senza danneggiare lintegrit della membrana e senza alterare le espressioni antigeniche. Una delicata eluizione al calore la procedura utilizzata per ottenere globuli rossi privi di immunoglobuline: essa differisce dalle tecniche impiegate per recuperare immunoglobuline potenzialmente attive. Reagenti Antiglobulina umana.
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Metodo 2.13 Distacco di IgG con clorochina per la tipizzazione antigenica di globuli rossi con TAD positivo
Principio Le emazie con TAD positivo non possono essere testate se si devono tipizzare con sieri test che richiedono luso di un TAI. In opportune e controllate situazioni, il difosfato di clorochina distacca le IgG dalla membrana eritrocitaria, con lieve o nessun danno alla sua integrit. Questo procedimento permette la completa tipizzazione fenotipica di emazie rivestite da autoanticorpi caldi, comprese le tipizzazioni che richiedono luso di TAI. Campioni Emazie a TAD positivo per presenza di IgG adese. Reagenti 1. Soluzione di clorochina difosfato, preparata sciogliendo 20 g di questo sale in 100 mL di fisiologica. Aggiustare a pH 5,1, utilizzando NaOH (idrossido di Na); conservare da 2 a 6 C. 2. Eritrociti di controllo con una singola espressione degli antigeni che si vogliono tipizzare nei campioni in esame. 3. Antiglobuline anti-IgG. Procedimento 1. Aggiungere, a 0,2 mL di emazie rivestite da IgG (lavate), 0,8 mL della soluzione di clorochina difosfato. Trattare in modo analogo le emazie di controllo. 2. Mescolare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. 3. Rimuovere una piccola aliquota (per esempio, 1 goccia) delle emazie trattate e lavarla 4 volte in soluzione fisiologica. 4. Testare le emazie lavate con anti-IgG. 5. Se il trattamento ha reso le emazie non reattive allanti-IgG, lavare per tre volte, in fisiologica, lintero volume delle emazie trattate e le emazie di controllo e preparare una
sospensione dal 2 al 5% in salina, da utilizzarsi per le successive tipizzazioni. 6. Se le emazie continuano a reagire con lanti-IgG, ripetere le fasi di incubazione (fasi 3 e 4) a singoli intervelli di 30 minuti (per un massimo di 2 ore), fino a che il campione da tipizzare non reagisce con lanti-IgG. Procedere, quindi, come descritto al punto 5. Note 1. Il difosfato di clorochina non dissocia le proteine del complemento dalla membrana eritrocitaria. Se le emazie sono rivestite sia da IgG che da C3, si devono utilizzare esclusivamente reagenti anti-IgG per effettuare tipizzazioni dopo un trattamento con clorochina. 2. Le incubazioni con clorochina difosfato non dovrebbero prolungarsi oltre le 2 ore. Incubazioni pi prolungate a temperatura ambiente o unincubazione a 37 C possono provocare emolisi e perdita della reattivit antigenica. 3. Il trattamento pu denaturare gli antigeni Rh. 4. Molti sierologi trattano con clorochina le emazie di controllo per ogni antigene testato. Selezionare cellule di controllo che siano positive per lantigene pertinente e che reagiscano con il siero che sar utilizzato per tipizzare le emazie del paziente. 5. Il difosfato di clorochina pu non rimuovere totalmente lanticorpo dai globuli rossi sensibilizzati. I risultati del TAD su globuli rossi provenienti da alcuni pazienti, particolarmente da quelli con un TAD iniziale fortemente positivo, possono essere soltanto diminuiti in potenza. 6. Oltre che essere utilizzato per rimuovere autoanticorpi, questo metodo pu essere impiegato per rimuovere gli antigeni Bg (HLAcorrelati) dai globuli rossi. Si devono utilizzare appropriati controlli per tali antigeni. 7. Se si usano kit commerciali, seguire scrupolosamente le istruzioni dei produttori sia per le emazie in esame che per i controlli.
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Bibliografia 1. Edwards JM, Moulds JJ, Judd WJ. Chloroquine diphosphate dissociation of antigenantibody complexes: A new technique for phenotyping rbcs with a positive direct antiglobulin test. Transfusion 1982;22:59-61. Swanson JL, Sastamoinen R. Chloroquine stripping of the HLA-A,B antigens from red cells (letter). Transfusion 1985;25:439-40.
2.
Metodo 2.14 Metodo alla glicina acida/EDTA per rimuovere anticorpi dai globuli rossi
Principio Glicina acida pi EDTA possono essere utilizzati per distaccare molecole anticorpali dalla membrana eritrocitaria. Questa procedura viene solitamente impiegata in testi di tipizzazione gruppoematica o nei test di assorbimento. Dopo un trattamento con glicina acida/EDTA, si possono determinare tutti i pi comuni antigeni eritrocitari, con lesclusione di quelli del sistema Kell e degli antigeni Bg e Er. Ne consegue che gli eritrociti cos trattati non possono essere impiegati per la determinazione di questultimi fenotipi. Campioni Emazie con TAD positivo. Reagenti 1. Soluzione al 10% di EDTA, preparata sciogliendo 2 g di acido etilendiaminicotetracetico, sale bisodico (Na2EDTA) in 20 mL di acqua distillata o deionizzata. 2. Tampone alla glicina acida (HCl) 0,1 M, preparato diluendo 0,75 g di glicina in 100 mL di una soluzione salina non tamponata. Aggiustare il pH a 1,5 usando HCl concentrata. 3. TRIS-NaCl 1,0 M, preparato sciogliendo 12,1 g di tris (idrossimetil) aminometano (TRIS) e 5,25 g di NaCl (cloruro di Na) in 100 mL di acqua distillata o deionizzata.
Procedimento 1. Lavare sei volte, con fisiologica isotonica, le emazie da trattare. 2. Mescolare, in una provetta, 20 volumi di glicina-HCl 0,1 M (pH 1,5) con 5 volumi di EDTA al 10%. Questa mescolanza rappresenta il reagente glicina acida/EDTA. 3. Mettere 10 volumi di globuli rossi lavati in una provetta pulita. 4. Aggiungere 20 volumi di glicina acida/EDTA. 5. Mescolare accuratamente il contenuto della provetta. 6. Incubare la mescolanza a temperatura ambiente per non pi di 2-3 minuti. 7. Al contenuto della provetta, aggiungere un volume di TRIS-NaCl 1.0 M. 8. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per 2-3 minuti, quindi aspirare e scartare il liquido sovranatante. 9. Lavare le emazie 4 volte con fisiologica. 10. Testare le emazie lavate con anti-IgG; se non reagiscono con lanti-IgG, le emazie sono pronte per essere impiegate nelle procedure di tipizzazione o assorbimento. Se il TAD ancora positivo si deve procedere a un trattamento aggiuntivo. Note 1. Uneccessiva incubazione dei globuli rossi con glicina acida/EDTA pu causare danni irreversibili alla membrana eritrocitaria. 2. Impiegare reagenti di controllo, quali albumina bovina o plasma inerte, quando si tipizzano emazie cos trattate. 3. Nella fase illustrata al punto 10, usare sieri specificamente anti-IgG e non antiglobuline polispecifiche. 4. Molti operatori usano cellule di controllo trattate con glicina acida/EDTA per ogni antigene testato. Selezionare cellule di controllo che siano positive per lantigene e reattive al siero che sar utilizzato per tipizzare le emazie del paziente. 5. Se si usano kit commerciali, seguire scrupolosamente le indicazioni dei produttori per le tipizzazioni e per i controlli.
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Bibliografia 1. Louie JE, Jiang AF, Zaroulis CG. Preparation of intact antibody-free red cells in autoimmune hemolytic anemia (abstract). Transfusion 1986;26:550. Champagne K, Spruell P, Chen J, et al. EDTA/ glycine-acid vs. chloroquine diphosphate treatment for stripping Bg antigens from red blood cells (abstract). Transfusion 1996;36 (Suppl):21S. Reid ME, Lomas-Francis C. The blood group antigen factsbook. New York: Academic Press, 2004.
2.
3.
Metodo 2.15 Separazione con centrifugazione semplice dei globuli rossi trasfusi da quelli autologhi
Principio I globuli rossi autologhi di recente formazione hanno un peso specifico pi basso di quelli trasfusi e possono essere separati dalla popolazione infusa con una semplice centrifugazione. Quando si centrifugano in provette per microematocrito, le emazie autologhe di recente formazione si sistemano nella parte alta della colonna eritrocitaria, fornendo cos un metodo semplice per separarle da quelle trasfuse. Nota: emazie provenienti da pazienti affetti da drepanocitosi o da sferocitosi non si separano efficacemente con questo metodo (vedi il successivo Metodo 2.16 per una procedura alternativa). Campioni Globuli rossi da sangue intero raccolto in EDTA. Materiali 1. Centrifuga per microematocrito. 2. Provette in vetro semplice (non eparinizzato) o in plastica per ematocrito. 3. Sigillante. Procedimento 1. Lavare le emazie tre volte in soluzione fisiologica. Lultimo lavaggio va effettuato da 900 a 1.000 per g per 5-15 minuti. Rimuovere pi sovranatante possibile, senza alterare il buffy-coat. Mescolare accuratamente.
2. Riempire, con le emazie lavate e ben miscelate, le provette da microematocrito fino alla tacca 60 mm. 3. Saldare, al calore o con sigillante, le estremit delle provette. 4. Centrifugare, per 15 minuti, tutte le provette in una centrifuga da microematocrito. 5. Tagliare le provette 5 mm al di sotto della parte alta della colonna eritrocitaria. Questo segmento di 5 mm conterr la popolazione meno densa, quindi pi giovane, dei globuli rossi circolanti. 6. Sistemare i tubicini tagliati in provette pi grandi (10 o 12 x 75 mm), aggiungere fisiologica, mescolare bene per far uscire i globuli rossi dai tubicini. Poi, a) o centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto e rimuovere i tubicini vuoti, oppure b) trasferire la sospensione eritrocitaria in una provetta pulita. 7. Lavare tre volte, in fisiologica, le emazie separate prima di risospenderle al 2-5% in salina per i test. Note 1. preferibile effettuare la separazione tre o pi giorni dopo la trasfusione piuttosto che ottenere il campione immediatamente dopo. 2. I globuli rossi dovrebbero essere continuamente miscelati quando si stanno riempiendo le piccole provette da microematocrito. 3. Questa tecnica di separazione efficace soltanto se il paziente produce un numero normale o superiore al normale di reticolociti, mentre sar inefficace se il paziente ha pochi reticolociti. 4. Alcuni antigeni eritrocitari potrebbero non essere efficacemente espressi sui reticolociti, come lo sono sulle cellule pi vecchie. Una particolare attenzione deve essere riservata ai seguenti antigeni: E, e, c, Fya, Jka e a quelli Ge.
Bibliografia 1. Reid ME, Toy P. Simplified method for recovery of autologous red blood cells from transfused patients. Am J Clin Pathol 1983;79:364-6.
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2.
Vengelen-Tyler V, Gonzales B. Reticulocyte rich RBCs will give weak reactions with many blood typing antisera (abstract). Transfusion 1985;25:476.
di NaCl in 1 L di acqua distillata. Procedimento 1. Mettere 4-5 gocce di emazie in una provetta di 10-12 x 75 mm. 2. Lavare le emazie sei volte con la soluzione allo 0,3% di NaCl o sino a che il sovranatante non contenga pi emoglobina visibile. In ogni lavaggio centrifugare a 1.000 x g per 1 minuto. 3. Lavare le emazie due volte con soluzione fisiologica allo 0,9% di NaCl per ristabilire la tonicit. In ogni lavaggio centrifugare a 200 x g per 2 minuti, per facilitare la rimozione degli stromi residui. 4. Per eseguire le fenotipizzazioni, risospendere i globuli rossi intatti residui a una concentrazione dal 2 al 5%. Nota Utilizzando provette di 16 x 100 mm, si possono lavorare volumi maggiori da usarsi nei test di assorbimento.
Metodo 2.16 Separazione dei globuli rossi trasfusi da quelli autologhi appartenenti a pazienti con emoglobina S
Principio I globuli rossi di soggetti affetti da drepanocitosi (anemia falciforme), sia con emoglobina SS che con emoglobina SC, sono resistenti alla lisi indotta da una soluzione fisiologica ipotonica, a differenza degli eritrociti dei soggetti normali o di quelli che hanno solamente un trait HbS. Il procedimento che segue consente lisolamento delle emazie con emoglobina SS o SC da quelle trasfuse di recente. Campione Globuli rossi da valutare.
Bibliografia
Reagenti 1. Soluzione fisiologica ipotonica (NaCl 0,3% p/v): sciogliere 3 g di NaCl in 1 L di acqua distillata. 2. Soluzione fisiologica normale: sciogliere 9 g
1.
Brown D. A rapid method for harvesting autologous red cells from patients with hemoglobin S disease. Transfusion 1988;28:21-3.
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Metodi sezione 3: Ricerca e identificazione di anticorpi e test sierologici di compatibilit
Metodi sezione 3
Ricerca e identificazione di anticorpi e test sierologici di compatibilit
Metodo 3.1 Test di compatibilit con centrifugazione immediata per evidenziare unincompatibilit ABO
Principio Per la discussione sui principi delle prove di compatibilit, vedi Capitolo 18. Campioni Si pu usare il siero o il plasma del paziente. Il tempo dal prelievo del campione deve essere conforme ai requisiti richiesti dagli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali1(p38). Reagenti 1. Soluzione fisiologica normale. 2. Globuli rossi del donatore risospesi dal 2 al 5% in fisiologica normale o in EDTA. Alcuni sierologi preferiscono le sospensioni in EDTA, in quanto un alto titolo di anti-A o anti-B pu causare ladesione del complemento, che pu determinare un ostacolo sterico allagglutinazione 2 . Luso del campione del paziente raccolto in EDTA rappresenta un approccio alternativo atto a prevenire questo problema. Procedimento 1. Etichettare la provetta per ogni sospensione delle emazie del donatore da testare con il siero del paziente.
2. Aggiungere due gocce del siero (o del plasma) del paziente a ogni provetta. 3. Aggiungere una goccia della sospensione delle emazie del donatore alla provetta appropriata. 4. Mescolare il contenuto della provetta (o delle provette) e centrifugare in base alla calibrazione della centrifuga. 5. Verificare la presenza di uneventuale emolisi, risospendere delicatamente il sedimento eritrocitario ed esaminare per lagglutinazione. 6. Leggere, interpretare e registrare i risultati. Interpretazione 1. Lagglutinazione o lemolisi rappresentano un risultato positivo (di incompatibilit). 2. Una sospensione omogenea delle emazie dopo risospensione del sedimento indica un risultato negativo e compatibilit alla prova crociata con la tecnica della centrifugazione immediata.
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23 rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005. Judd WJ, Steiner EA, ODonnell DB, Oberman HA. Discrepancies in ABO typing due to prozone; how safe is the immediate-spin crossmatch? Transfusion 1988;28:334-8.
2.
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Metodo 3.2 Test allantiglobulina indiretto per lindividuazione di anticorpi antieritrocitari

Principio Per una discussione sui principi che regolano le ricerche con il test allantiglobulina indiretto (TAI) in soluzione salina, in albumina, in soluzioni a bassa forza ionica (LISS) o in polietilenglicole (PEG), vedi i Capitoli 12, 18 e 19. Campioni Si pu usare il siero o il plasma del paziente. Il tempo del prelievo del campione deve essere conforme ai requisiti richiesti dagli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali1(p38). Reagenti 1. Fisiologica normale. 2. Albumina bovina (al 22 o al 30%). 3. Il LISS si prepara come segue: a. in una beuta da 1 litro immettere 1,75 g di NaCl e 18 g di glicina; b. aggiungere 20 mL di tampone fosfato, preparato combinando 11,3 mL di KH2PO4 0,15 M e 8,7 mL Na2HPO4 0,15 M; c. aggiungere acqua distillata sino a 1 litro; d. aggiustare il pH a 6,7 0,1 con NaOH; e. aggiungere 0,5 g di sodiazide come preservante. Nota. Il LISS pu essere usato come additivo (Metodo 3.2.2) o come soluzione di sospensione per le emazie (Metodo 3.2.3). Sono disponibili preparazioni commerciali di LISS. 4. Preparazione del PEG al 20% p/v. A 20 g di PEG di peso molecolare (PM) 3350, aggiungere, portando a 100 mL il volume totale, soluzione fisiologica tamponata ai fosfati (PBS) a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). Il PEG disponibile anche in commercio. 5. Sieri antiglobuline umane (AHG). Si possono impiegare sieri polispecifici o anti-IgG, se non diversamente indicato. 6. Eritrociti di gruppo O (disponibili in commercio) per lindividuazione di anticorpi. Si possono
usare anche pool di tali eritrociti, ma soltanto per i test sui donatori. I test sui pazienti non devono essere condotti con cellule in pool. 7. Eritrociti rivestiti da IgG. Metodo 3.2.1 Test allantiglobulina indiretto in fisiologia Procedimento 1. Aggiungere 2 gocce di siero o plasma alle provette appropriatamente etichettate. 2. Aggiungere 1 goccia di emazie O risospese in fisiologica al 2-5% o le emazie del donatore a ciascuna provetta e mescolare. 3. Centrifugare e osservare per emolisi e per agglutinazione. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 4. Incubare a 37 C da 30 a 60 minuti. 5. Centrifugare e osservare per emolisi e agglutinazione. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 6. Lavare le cellule tre o quattro volte con fisiologica e decantare completamente il liquido del lavaggio finale. 7. Aggiungere AHG al bottone secco di emazie, seguendo le indicazioni dei produttori. Mescolare bene. 8. Centrifugare e osservare per emolisi e agglutinazione. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 9. Confermare la validit dei test negativi, aggiungendo le emazie rivestite da IgG. Metodo 3.2.2 Test allantiglobulina indiretto con albumina o con LISS additivo Procedimento 1. Aggiungere 2 gocce di siero o plasma alle provette appropriatamente etichettate. 2. Aggiungere un volume equivalente di albumina bovina al 22 o al 30% o di LISS (a meno che le indicazioni dei produttori non indichino diversamente). 3. Aggiungere 1 goccia di una sospensione al 2-5% in fisiologica delle emazie reattive o di quelle del donatore a ciascuna provetta e mescolare.
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4. Con lalbumina, incubare a 37 C da 15 a 30 minuti. Con il LISS incubare da 10 a 15 minuti o seguire le indicazioni dei produttori. 5. Centrifugare e osservare per emolisi e per agglutinazione. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 6. Procedere come per il test descritto nel Metodo 3.2.1 dal punto 6 al punto 9. Metodo 3.2.3 Test allantiglobulina indiretto in LISS Procedimento 1. Lavare tre volte in fisiologica normale le emazie reattive o del donatore; decantare completamente la fisiologica. 2. Risospendere al 2-5% le emazie in LISS. 3. Aggiungere 2 gocce di siero a una provetta correttamente etichettata. 4. Aggiungere 2 gocce di emazie risospese in LISS e incubare da 10 a 15 minuti a 37 C o seguire le istruzioni dei produttori 5. Centrifugare, osservare per emolisi e agglutinazione, risospendendo con delicatezza il fondello di emazie. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 6. Procedere come per il test descritto nel Metodo 3.2.1 dal punto 6 al 9. Metodo 3.2.4 Test allantiglobulina indiretto in PEG Procedimento 1. Per ogni campione da tenere ricontrollato, mescolare 2 gocce di siero con 4 gocce di PEG al 20% in fisiologica e con 1 goccia di una sospensione di emazie al 2-5%. 2. Incubare a 37 C per 15 minuti. 3. NON CENTRIFUGARE. 4. Lavare le emazie 4 volte in fisiologica, decantando completamente la soluzione del lavaggio finale. 5. E s e g u i r e i l t e s t a l l a n t i g l o b u l i n a , utilizzando anti-IgG, come descritto nel Metodo 3.2.1 dal punto 7 al 9. Nota. Si devono seguire le istruzioni dei produttori per un appropriato impiego delle soluzioni commerciali di PEG.
Interpretazione (per i test allantiglobulina descritti nei Metodi dal 3.2.1 sino al 3.2.4) 1. La presenza di agglutinazione o emolisi dopo unincubazione a 37 C indica un test positivo. 2. La presenza di agglutinazione dopo aggiunta di AHG indica un test positivo. 3. I test allantiglobulina sono negativi quando non si osserva nessuna agglutinazione dopo la centrifugazione, e quando le emazie rivestite da IgG, aggiunte successivamente, risultano agglutinate. Se queste ultime emazie di controllo non sono agglutinate, il test non valido e deve essere ripetuto. Controlli Il procedimento utilizzato nei test pretrasfusionali per evidenziare anticorpi inattesi dovrebbe essere ricontrollato ogni giorno, impiegando sieri con anticorpi deboli. I sieri di controllo possono essere preparati da sieri tipizzanti diluiti con albumina bovina al 6% cos da fornire unagglutinazione di grado 2+ in TAI. anche accettabile luso di anticorpi di tipo IgG umani. Note 1. I tempi di incubazione, i volumi e le concentrazioni degli eritrociti riportati sopra sono desunti dalla letteratura. Singoli laboratori possono scegliere di standardizzare questi metodi con valori differenti. Quando si modificano le procedure, fare riferimento anche al Capitolo 12 per altre limitazioni. In tutti i casi, prima di modificare un procedimento, si dovrebbero consultare i foglietti con le istruzioni del produttore, inseriti in ogni confezione. 2. Per i TAI in fisiologica, si pu omettere il punto 3, al fine di evitare il rilievo di anticorpi reattivi a temperatura ambiente. 3. Per le procedure con PEG: a. omettere la centrifugazione dopo lincubazione a 37 C, perch gli eritrociti non si risospendono prontamente; b. usare unantiglobulina anti-IgG piuttosto che un siero polispecifico, per evitare reazioni positive indesiderate dovute al legame di autoanticorpi contro il C3.
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4. Le fasi dal numero 6 al 9 del Metodo 3.2.1. devono essere eseguite senza interruzioni.
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005:38.
3. Eritrociti di gruppo O (disponibili in commercio) per lindividuazione di anticorpi. Si possono usare anche pool di tali eritrociti, ma soltanto per i test sui donatori. I test sui pazienti non devono essere condotti con cellule in pool. 4. Eritrociti rivestiti da IgG. Procedimento 1. Riscaldare a 37 C una bottiglia di fisiologica. 2. Etichettare le provette per ciascun reagente o per ciascun campione da testare. 3. Aggiungere 1 goccia di una sospensione di emazie al 2-5% in fisiologica. 4. Sistemare a 37 C le provette contenenti i globuli rossi, una provetta che contenga un piccolo volume del siero del paziente e una pipetta; incubare per 5-10 minuti. 5. Usando la pipetta preriscaldata, trasferire 2 gocce del siero preriscaldato in ciascuna provetta che contenga gli eritrociti preriscaldati. Miscelare, senza rimuovere le provette dallincubatore. 6. Incubare a 37 C da 30 a 60 minuti. 7. Senza rimuovere le provette dallincubatore, riempire ogni provetta con fisiologica preriscaldata a 37 C. Centrifugare e lavare per tre-quattro volte con fisiologica a 37 C. 8. Aggiungere lanti-IgG, secondo le istruzioni dei produttori. 9. Centrifugare, osservare la reazione, classificarne il grado e registrarla. 10. Confermare la validit dei risultati negativi, aggiungendo gli eritrociti rivestiti da IgG. Note 1. La procedura di preriscaldamento descritta qui sopra non individuer alloanticorpi che agglutinano a 37 C o a temperature inferiori e non sono reattivi allantiglobulina. Se si desidera rilevare questi anticorpi, necessario testare e centrifugare a 37 C. Se i tempi lo consentono, una provetta contenente una miscela preriscaldata di siero e cellule pu essere incubata a 37 C da 60 a 120 minuti e le emazie sedimentate possono essere esaminate per lagglutinazione risospendendole senza centrifugare.
Metodo 3.3 Tecnica di preriscaldamento

Principio Preriscaldare le sospensioni pu essere utile per rilevare e identificare anticorpi antieritrocitari che si legano soltanto a 37 C. Ci particolarmente utile per indagare sieri di pazienti che presentano unattivit autoanticorpale, che pu venire mascherata dalla presenza di anticorpi clinicamente significativi. Limpiego del preriscaldamento per tale applicazione , tuttavia, controverso 1,2 . Si dimostrato che il preriscaldamento pu diminuire la reattivit di alcuni anticorpi potenzialmente significativi e che si possono perdere anticorpi deboli3. Questa tecnica deve essere impiegata con cautela e non va utilizzata per eliminare reattivit non identificate. Potenti autoanticorpi freddi possono reagire nei test preriscaldati. Pu essere richiesto, per individuare la presenza nascosta di anticorpi clinicamente significativi, limpiego di altre tecniche, come lallo- o lautoassorbimento a freddo, o il trattamento del plasma con ditiotreitolo. Campioni Si pu usare il siero o il plasma del paziente. Il tempo del prelievo del campione deve essere conforme ai requisiti richiesti dagli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali1(p38). Reagenti 1. Soluzione fisiologica normale. 2. Anti-IgG.
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2. Gli anticorpi che reagiscono a freddo possono non essere rilevabili, se viene usata nelle fasi di lavaggio, fisiologica a temperatura ambiente invece che riscaldata a 37 C2. Limpiego di fisiologica a temperatura ambiente pu evitare leluizione dagli eritrociti di anticorpi clinicamente significativi, che pu intervenire, invece, con luso di fisiologica a 37 C. Alcuni potenti autoanticorpi freddi, tuttavia, possono essere ancora reattivi e richiedere, quindi, limpiego di fisiologica a 37 C al fine di evitare la loro individuazione.
determina impilati.Nella tecnica della sostituzione del siero con fisiologica, si incubano siero ed emazie per permettere ladesione dellanticorpo, ma, successivamente, il siero viene rimosso e si aggiunge fisiologica come mezzo di risospensione. Reagenti Soluzione fisiologica. Procedimento Quando, dopo le normali procedure di incubazione e risospensione, laspetto delle emazie risospese faccia sospettare la presenza di impilati, procedere come descritto qui di seguito: 1. ricentrifugare la miscela siero-emazie; 2. rimuovere il siero, senza toccare il sedimento di emazie; 3. sostituire il siero con un eguale volume (2 gocce) di fisiologica; 4. risospendere delicatamente il sedimento di emazie e leggere per lagglutinazione. Gli impilati si dissolveranno quando risospesi in fisiologica, mentre le agglutinazioni rimarranno.
Bibliografia 1. Judd WJ. Controversies in transfusion medicine. Prewarmed tests: Con. Transfusion 1995; 35:271-7. Mallory D. Controversies in transfusion medicine. Prewarmed tests: Pro-why, when, and how-not if. Transfusion 1995;35:268-70. Leger RM, Garratty G. Weakening or loss of antibody reactivity after prewarm technique. Transfusion 2003;43:1611-14. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005.
2.
3.
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Bibliografia 1. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology. 4 th ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1998:1135.
Metodo 3.4 Sostituzione con fisiologica per individuare alloanticorpi in presenza di impilati
Principio Gli impilati sono aggregati di globuli rossi che, caratteristicamente, aderiscono gli uni agli altri, assumendo laspetto di una sorta di pila di monete, quando esaminati al microscopio. La loro formazione un fenomeno in vitro, dovuto ad anormalit nella concentrazione delle sieroproteine. Spesso il paziente affetto da epatopatie, da mieloma multiplo o da altre condizioni morbose con tassi anomali di globuline. Pu essere difficile rilevare agglutinazioni indotte da anticorpi, da un test effettuato con un siero che
Metodo 3.5 Tecniche enzimatiche

Per una descrizione dei principi relativi alle tecniche enzimatiche, vedi Capitolo 19. Metodo 3.5.1 Preparazione di una soluzione madre di ficina all1% p/v Principio La preparazione di enzimi da usare in un Servizio Trasfusionale differisce da lotto a lotto. Ogniqualvolta si prepara una soluzione madre di enzimi, si
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dovrebbe saggiare la sua reattivit e dovrebbero essere standardizzati i tempi di incubazione per ottimizzare lefficacia dei test. Vedi Metodo 3.5.3. Reagenti 1. Polvere di ficina, 1 g. 2. PBS a pH 7,3; vedi Metodo 1.7. 3. Tampone fosfato a pH 5,4. Procedimento 1. Mettere 1 g di polvere di ficina in un contenitore da 100 mL. Maneggiare con attenzione la ficina, in quanto pericolosa se viene a contatto con gli occhi o viene inalata. consigliabile utilizzare guanti, maschere e grembiuli o lavorare sotto cappa. 2. Per dissolvere la ficina, aggiungere PBS a pH 7,3 sino a 100 mL. Agitare vigorosamente, per inversione, per 15 minuti o mescolare con un agitatore magnetico sino a che la maggior parte della polvere si sia dissolta. Lo scioglimento pu non essere completo. 3. Separare il liquido, chiarificandolo per filtrazione o centrifugazione, e prepararne piccole aliquote. Conservare queste aliquote in congelatori a 20 C o a temperature pi basse. Non refrigerare nuovamente una soluzione gi scongelata. Metodo 3.5.2 Preparazione di una soluzione madre di papaina all1% p/v Principio La preparazione di enzimi da usare in un Servizio Trasfusionale differisce da lotto a lotto. Ogniqualvolta si prepara una soluzione madre di enzimi, si dovrebbe saggiare la sua reattivit e dovrebbero essere standardizzati i tempi di incubazione per ottimizzare lefficacia dei test. Vedi Metodo 3.5.3. Reagenti 1. Idrocloridrato di L-cisteina 0,5 M: 0,88 g in 10 mL di acqua distillata. 2. Polvere dellenzima, 2 g. 3. Tampone fosfati 0,067 M a pH 5,4 preparato combinando 3,5 mL di Na2HPO4 con 96,5 mL di KH2PO4.
Procedimento 1. Aggiungere 2 g di papaina in polvere a 100 mL di tampone fosfato (pH 5,4). Maneggiare la papaina con cautela. Essa pu essere pericolosa per le mucose e richiede luso di equipaggiamenti protettivi. 2. Agitare la soluzione enzimatica per 15 minuti, a temperatura ambiente. 3. Separare il liquido chiarificato per filtrazione o per centrifugazione. 4. Aggiungere lidrocloridrato di L-cisteina e incubare la soluzione a 37 C per 1 ora. 5. Aggiungere tampone fosfato (a pH 5,4) sino al volume finale di 200 mL. Conservare aliquote in congelatori a 20 C o a temperature pi basse. Non refrigerare nuovamente una soluzione scongelata. Metodo 3.5.3 Standardizzazione delle procedure enzimatiche Principio Per le procedure enzimatiche a due tempi, il tempo ottimale di trattamento deve essere determinato per ogni nuovo lotto di soluzione madre. La tecnica riportata qui di seguito (per la ficina) pu essere modificata per un uso con altri enzimi. Reagenti 1. Soluzione madre di ficina in PBS a pH 7,3. 2. Numerosi sieri noti per non contenere anticorpi inattesi. 3. Anti-D che agglutini esclusivamente emazie D+ trattate con lenzima e che non agglutini emazie D+ non trattate. 4. Anti-Fya di reattivit da moderata a forte. 5. Campioni di emazie D+ e Fy(a+b). 6. Siero antiglobuline umane (AHG). Se non diversamente indicato, si possono utilizzare AHG anti-IgG o polispecifici. 7. Emazie rivestite da IgG. Procedimento 1. Preparare una soluzione di ficina allo 0,1%, diluendo un volume di soluzione madre in nove volumi di PBS a pH 7,5.
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2. Etichettare tre provette: 5 minuti, 10 minuti, 15 minuti. 3. Aggiungere a ciascuna provetta un uguale volume di emazie lavate e di ficina allo 0,1%. 4. Miscelare e incubare a 37 C per i tempi predefiniti. I tempi di incubazione sono controllati pi facilmente se prima di prepara la provetta 15 minuti, poi la provetta 10 minuti e, infine, quella 5 minuti. Lincubazione finir allo stesso tempo per le tre provette. 5. Lavare immediatamente le emazie per tre volte con abbondante fisiologica. 6. Risospendere le emazie trattate al 2-5% in fisiologica. 7. Etichettare quattro provette per ogni siero da testare: non-trattate, 5 minuti, 10 minuti, 15 minuti. 8. Aggiungere 2 gocce del siero appropriato alle provette cos etichettate. 9. Aggiungere, alle provette cos etichettate, 1 goccia della sospensione eritrocitaria appropriata. 10. Miscelare e incubare per 15 minuti a 37 C. 11. Centrifugare e leggere per agglutinazione, risospendendo delicatamente il sedimento eritrocitario. 12. Procedere con il test allantiglobulina descritto nel Metodo 3.2.1. dal punto 6 al punto 9. Interpretazione La Tabella 3.5.3.1 mostra i possibili risultati
con i sieri indicati ed emazie D+ e Fy(a+b). Per questultime cellule, il tempo ottimale di incubazione sarebbe di 10 minuti, in quanto lincubazione di 5 minuti pu non abolire completamente la reattivit Fya e rafforzare a sufficienza quella anti-D. Lincubazione di 15 minuti causa una falsa positivit allantiglobulina con un siero inerte. Se unincubazione di 5 minuti determina un trattamento in eccesso delle emazie, preferibile utilizzare una soluzione madre pi diluita piuttosto che ridurre il tempo di trattamento, in quanto difficile monitorare correttamente tempi molto brevi. Si possono valutare test addizionali con singole diluizioni a differenti tempi di incubazione cosi come un singolo tempo di incubazione pu essere impiegato con differenti diluizioni dellenzima. Metodo 3.5.4 Valutazioni sui globuli rossi trattati con enzimi Principio Dopo che si sono determinati i tempi ottimali di incubazione per un dato lotto di una soluzione enzimatica, le emazie trattate dovrebbero essere valutate prima di usarle, per dimostrare che si sono adeguatamente (ma non eccessivamente) modificate. Un trattamento soddisfacente fornisce cellule che vengono agglutinate da un anticorpo che causa una reattivit, soltanto al TAI, di emazie non
Tabella 3.5.3.1 - Ipotetici risultati con globuli rossi D+ e Fy(a+b) Emazie ed enzimi Non trattate Trattate per 5 minuti Trattate per 10 minuti Trattate per 15 minuti Incubazione a 37 C Test allantiglobulina Incubazione a 37 C Test allantiglobulina Incubazione a 37 C Test allantiglobulina Incubazione a 37 C Test allantiglobulina Siero inerte 0 0 0 0 0 0 0 w+ Anti-D 0 1+ 1+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Anti-Fya 0 3+ 0 1+ 0 0 0 w+
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trattate, che non sono agglutinate n aggregate dal siero inerte. Campioni Globuli rossi trattati da enzimi. Reagenti 1. Sieri conosciuti per contenere anticorpi in grado di agglutinare eritrociti trattati da enzimi. 2. Sieri privi di qualsiasi anticorpo inatteso. 3. Siero antiglobuline umano (AHG). Si pu utilizzare del tipo polispecifico oppure anti-IgG, se non differentemente specificato. 4. Emazie rivestite da IgG. Procedimento 1. Scegliere un anticorpo che agglutini emazie trattate con enzimi, contenenti lantigene verso il quale lanticorpo diretto, ma che dia una reazione positiva soltanto con il test allantiglobulina quando cimentato con emazie non trattate. Numerosi esempi di anti-D si comportano in questo modo. 2. Aggiungere, in una provetta etichettata test positivo, 2 gocce del siero selezionato. 3. Aggiungere, in una provetta etichettata test negativo, 2 gocce di siero privo di anticorpi inattesi. 4. Aggiungere a ciascuna provetta 1 goccia di una sospensione al 2-5% di emazie trattate con enzimi. 5. Mescolare e incubare a 37 C per 15 minuti. 6. Esaminare macroscopicamente per la presenza di agglutinazione. 7. Eseguire, sulla provetta etichettata test negativo, un TAI come descritto nel Metodo 3.2.1 dal punto 6 al punto 9. Interpretazione Ci dovrebbe essere agglutinazione nella provetta test positivo e nessuna agglutinazione nella provetta test negativo. Se si osserva unagglutinazione nella provetta test negativo, questo significa che i globuli rossi sono stati trattati in eccesso; se non si riscontra agglutinazione nella provetta test positivo, ci significa che il trattamento stato inadeguato.
Metodo 3.5.5 Tecnica per test enzimatici a un solo tempo Campioni Siero o plasma da analizzare. Reagenti 1. Emazie test. 2. Siero antiglobuline umano (AHG), del tipo polispecifico o anti-IgG, se non differentemente indicato. 3. Globuli rossi rivestiti da IgG: Procedimento 1. Immettere 2 gocce di siero in una provetta appropriatamente etichettata. 2. Aggiungere 2 gocce di una sospensione in fisiologica al 2 al 5% di emazie test. 3. Aggiungere 2 gocce di una soluzione di papaina allo 0,1% e mescolare bene. 4. Incubare a 37 C per 15 minuti. 5. Eseguire un TAI come descritto nel Metodo 3.2.1. dal punto 6 al punto 9. Metodo 3.5.6 Tecnica per test enzimatici a due tempi Campioni Siero o plasma da analizzare. Reagenti 1. Emazie test. 2. Siero antiglobuline umano (AHG) del tipo polispecifico o anti-IgG, se non differentemente indicato. 3. Globuli rossi rivestiti da IgG. Procedimento 1. Preparare una soluzione diluita dellenzima (papaina o ficina), aggiungendo 9 mL di PBS a pH 7,5 a 1 mL di soluzione madre dellenzima. 2. Aggiungere un volume della soluzione diluita a un volume di sedimento eritrocitario lavato. 3. Incubare a 37 C per il tempo ottimale che si determinato per quellenzima. 4. Lavare con abbondante fisiologica, almeno tre volte, le emazie trattate e risospenderle
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al 2-5% in soluzione salina. 5. Immettere 2 gocce di siero o plasma in una provetta appropriatamente etichettata. 6. Aggiungere 1 goccia della sospensione al 2-5% in salina delle emazie pretrattate con lenzima. 7. Mescolare e incubare a 37 C per 15 minuti. 8. Centrifugare, sospendere delicatamente le emazie ed esaminarle per lagglutinazione. Classificare il grado della reazione e registrare il risultato. 9. Procedere con un TAI, come descritto nel Metodo 3.2.1, dal punto 6 al punto 9. Note 1. Una tecnica alternativa per i punti 4 e 5 del Metodo 3.5.5 o dei punti 7 e 8 del Metodo 3.5.6 di incubare, a 37 C per 60 minuti, siero e emazie trattate ed esaminarle per lagglutinazione senza centrifugare. Questo pu essere utile nel caso di sieri che contengono potenti agglutinine fredde, prevenendo levenienza di un risultato falsamente positivo. 2. Non viene raccomandato di leggere, nella routine, i risultati al microscopio, il che particolarmente inappropriato per i test enzimatici: con questi test, infatti, si potrebbero evidenziare reazioni falsamente positive. 3. Sia la papaina che la ficina possono essere usati nel test in due tempi. 4. In commercio, sono disponibili preparazioni di enzimi. Per un loro appropriato uso e per i controlli di qualit si dovrebbero seguire le indicazioni dei produttori.
Metodo 3.6 Test allantiglobulina diretto

Principio Per una discussione sui principi che riguardano il test allantiglobulina diretto (TDA) vedi il Capitolo 20. Campioni Globuli rossi da sangue anticoagulato. Reagenti 1. AHG: antisieri del tipo polispecifico, anti-IgG, anti-complemento. 2. Quando tutti gli antisieri danno risultato positivo, si richiede un reagente di controllo (per esempio, PBS). 3. Globuli rossi rivestiti da IgG. Procedimento 1. Dispensare 1 goccia di una sospensione di emazie al 2-5% in ciascuna provetta. 2. Lavare, tre-quattro volte, con abbondante fisiologica le emazie. Decantare totalmente la soluzione dellultimo lavaggio. 3. Aggiungere immediatamente gli antisieri e mescolare. Per le quantit degli antisieri da usare riferirsi alle istruzioni dei produttori. 4. Centrifugare, seguendo le indicazioni dei produttori delle centrifughe. 5. Esaminare i globuli rossi per lagglutinazione. Classificare il grado della reazione e registrare il risultato. 6. Quando si usano AHG polispecifici o anti-C3d, incubare i test negativi per 5 minuti a temperatura ambiente, poi centrifugare di nuovo e rileggere. 7. Confermare la validit dei test negativi aggiungendo emazie rivestite da IgG ai test condotti con anti-IgG. 8. Centrifugare seguendo le istruzioni dei produttori. 9. Esaminare le emazie per lagglutinazione e registrare il risultato della reazione. Interpretazione 1. Il TAD positivo se vi agglutinazione, sia subito dopo la centrifugazione immediata, sia
Bibliografia 1. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology, 4 th ed. Durham, NC: Montgomery Scientific, 1998. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2 nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific, 1994.
2.
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dopo lincubazione a temperatura ambiente. Le emazie rivestite da IgG danno risposte immediate, mentre il rivestimento di frazioni complementari si dimostra pi facilmente dopo incubazione 1,2 . Sono necessari reattivi monospecifici per confermare di quali globuline si tratti. 2. Il TAD negativo se non vi agglutinazione in qualsiasi fase del test e quando le emazie di controllo, rivestite da IgG, aggiunte (vedi punto 7) sono agglutinate. Se queste emazie di controllo non sono agglutinate, il TAD da ritenersi non valido e deve essere ripetuto. Un TAD negativo non sta a significare che nessuna globulina adesa ai globuli rossi. I reagenti polispecifici e anti-IgG evidenziano da 200 a 500 molecole di IgG per emazia, ma alcuni pazienti possono soffrire di anemie emolitiche autoimmuni quando le IgG adese sono sotto questo livello. 3. Non si pu trarre nessuna conclusione, quando i risultati con tutti i reagenti usati (compreso quello di controllo) sono positivi. Ci indica la presenza di agglutinazioni spontanee, le cui cause bisogna risolvere, prima di procedere con ulteriori test. Note 1. I punti dal 2 al 7 si possono eseguire senza interruzioni. 2. Il test iniziale pu essere condotto con il solo reagente polispecifico. Se questo TAD negativo, non necessario condurre ulteriori analisi. Se, invece, positivo, eseguire il test con reagenti monospecifici, con anti-IgG e con anti-complemento, per determinare quali globuline sono presenti. 3. Si raccomanda di controllare i test negativi con lanti-C3d. Fare riferimento alle istruzioni dei produttori per i controlli appropriati.
2.
England: Blackwell Scientific Publications, 1997. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemia. Philadelphia: Churchill-Livingstone, 2004.
Metodo 3.7 Titolazione degli anticorpi

Principio La titolazione una metodica semi-quantitativa, impiegata per determinare la concentrazione di un anticorpo in un siero o per paragonare la forza espressiva degli antigeni su differenti campioni di emazie. Le applicazioni pi comuni delle titolazioni riguardano: 1) stima dellattivit anticorpale nelle gravide alloimmunizzate per stabilire se e quando intervenire con metodiche pi invasive al fine di investigare le condizioni del feto (vedi Capitolo 23); 2) chiarire la specificit di un autoanticorpi (vedi Capitolo 20); 3) caratterizzare gli anticorpi cosiddetti HTLA (High-Titer, Low-Avidity, cio ad alto titolo ma a bassa avidit), che ricorrono nei sistemi gruppoematici Knops, Chido/Rodgers, Csa e JMH (vedi Capitolo 15); e, 4) osservare leffetto dei reagenti sulfidrilici sul comportamento degli anticorpi, per determinare la classe delle immunoglobuline (IgG o IgM). Vedi il Metodo 5.3 per gli studi di titolazione, specificamente indirizzati al monitoraggio di anticorpi clinicamente significativi nelle gravide. Campioni Siero o plasma, su cui titolare gli anticorpi. Reagenti 1. Globuli rossi, in soluzione salina al 2-5%, che esprimono gli antigeni verso i quali sono diretti gli anticorpi. Luniformit delle sospensioni eritrocitarie essenziale per assicurare risultati comparabili. 2. Soluzione fisiologica. (Nota: se si desidera, le diluizioni possono essere fatte con albumina). Procedimento La tecnica base per eseguire gli studi di titolazione quella descritta qui di seguito.
Bibliografia 1. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M, eds. Blood transfusion in clinical medicine. 10th ed. Oxford,
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1. Etichettare 10 provette, indicando la diluizione del siero (per esempio, 1 su 1; 1 su 2, e cos via). La diluizione 1 su 1 sta a significare che il siero non diluito, mentre quella 1 su 2 indica un volume di siero in un volume finale di due, ossia diluizione del siero al 50%. Vedi Metodi 1.4 e 1.5. 2. Dispensare 1 volume di fisiologica in tutte le provette, eccetto che nella prima (dove vi siero non diluito). 3. Aggiungere un uguale volume di siero alle prime due provette (siero non diluito e siero diluito 1 su 2). 4. Usando una pipetta pulita, miscelare, pi volte, il contenuto della provetta 1 su 2 e trasferirne un volume nella provetta che segue (diluizione 1 su 4). 5. Continuare la stessa procedura, sempre usando una nuova pipetta pulita per miscelare e trasferire ogni diluizione. Conservare un volume del siero diluito dellultima provetta, in caso siano necessarie ulteriori diluizioni. 6. Etichettare le 10 provette con la diluizione appropriata. 7. Usando pipette separate per ciascuna diluizione, trasferire 2 gocce di ciascuna diluizione del siero in provette appropriatamente etichettate e aggiungere a ogni provetta 2 gocce di una sospensione eritrocitaria al 2%. Alternativamente, per convenienza, aggiungere 1 goccia di una sospensione eritrocitaria al 3-4%, come fornita dal produttore, sebbene questo metodo sia meno preciso. 8. Mescolare bene e analizzare con la metodica appropriata per la ricerca di anticorpi (vedi Capitolo 19). 9. Esaminare i risultati macroscopicamente e registrarli. Il fenomeno di pro-zona (vedi Capitolo 12) pu determinare reazioni pi deboli a concentrazioni pi alte del siero piuttosto che a diluizioni maggiori. Per evitare interpretazioni errate, pu essere preferibile esaminare per prima la provetta che contiene il siero pi diluito e procedere verso i campioni con siero pi concentrato, sino alla provetta con il siero non diluito.
Interpretazione 1. Osservare la diluizione pi alta che d unagglutinazione macroscopica di grado 1+. Il titolo si riporta come il reciproco della diluizione, per esempio, 32 e non 1 su 32 o 1:32 (vedi Tabella 3.7.1). Se vi agglutinazione nella provetta che contiene il siero pi diluito, non si determina il titolo finale ma necessario preparare ulteriori diluizioni. 2. Una differenza significativa negli studi comparativi di tre o pi diluizioni. Modifiche nella tecnica e una variabilit biologica inerente possono determinare che, in test duplicati, vi sia una variazione del titolo (in alto o in basso) di una diluizione. Un siero con anticorpi a titolo accertato di 32, pu mostrare, in un test replicato, un titolo finale di 32, di 64 o di 16. 3. La valutazione del solo titolo pu condurre a conclusioni errate, se non si prende considerazione la forza dellagglutinazione. Alla forza dellagglutinazione osservata si pu dare un numero e la somma dei numeri costituisce il punteggio ( score ), altra misurazione semi-quantitativa della reattivit anticorpale. Il limite, assegnato arbitrariamente, per stabilire la significativit in studi comparativi di 10 (o maggiore) fra diversi campioni. Vedi Tabella 3.7.1. 4. Anticorpi ad alto titolo e bassa affinit hanno, usualmente, un titolo maggiore di 64, con numerose provette che mostrano reattivit molto deboli. La Tabella 3.7.1 mostra i risultati ottenuti con tre sieri, nessuno dei quali ha mostrato agglutinazione oltre 1:128. Le differenze nel punteggio, tuttavia, indicano considerevoli variazioni nella forza della reattivit. Note La titolazione una tecnica semi-quantitativa. Le variabili tecniche influenzano profondamente i risultati e bisognerebbe avere molta diligenza per ottenere procedure il pi possibili uniformi. 1. Pipettare accuratamente essenziale. particolarmente raccomandato luso di pipette
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Tabella 3.7.1 - Esempi di titoli anticorpali, titoli finali e punteggi (score)
Reciproco della diluizione del siero 1 Forza Campione 1 Score Forza Campione 2 Score Forza Campione 3 Score 5 5 5 5 3 3 3 2 2 0 12 1+ 12 1+ 12 1+ 10 1+ 10 8 8 5 3 0 0 8(256) 33 10 4+ 10 4+ 10 4+ 8 3+ 8 3+ 8 2+ 5 2+ 3 1+ 2 0 0 128(256) 80 3+ 2 3+ 4 3+ 8 2+ 16 2+ 32 2+ 64 1+ 128 256 512 Titolo* Score 0 64(256) 64
* Il titolo spesso determinato dalla diluizione pi alta del siero che d una reazione = 1+ (score 5). Questo pu differire significativamente dalla diluizione finale (qui segnalata fra parentesi), come nel caso dellanticorpo del campione 3, con caratteristiche simili a quelle degli anticorpi ad alto titolo e bassa avidit (HTLA).
con puntali monouso, che si cambiano a ogni diluizione. 2. Devono essere presi in considerazione il tempo e la temperatura ottimale delle incubazioni; il tempo e la forza delle centrifugazioni devono essere usati in conformit. 3. Et, fenotipo e concentrazione delle emazie test influenzeranno i risultati. Quando si devono paragonare i titoli di differenti sieri contenenti anticorpi, tutti questi sieri devono essere testati con globuli rossi raccolti, preferibilmente freschi, dallo stesso donatore. Se questo non possibile, le analisi dovrebbero impiegare un pool di emazie test dello stesso fenotipo. Quando un singolo siero deve essere testato contro differenti campioni di emazie, tutti i campioni dovrebbero essere raccolti e conservati allo stesso modo e diluiti alla stessa concentrazione, prima delluso. 4. praticamente impossibile ottenere risultati totalmente riproducibili. I paragoni sono validi soltanto quando i campioni sono analizzati contestualmente. Nelle analisi dove un singolo
siero viene testato contro campioni differenti di emazie test, si deve usare, per tutte le analisi, materiale proveniente dalla stessa diluizione-madre. 5. Le titolazioni sono pi accurate impiegando larghi volumi piuttosto che piccoli volumi. La tecnica delle diluizioni-madre (vedi sopra) da risultati molto pi affidabili delle diluizioni individuali per un singola serie di test. Si dovrebbe calcolare il volume necessario per tutti i test programmati e si dovrebbe preparare unadeguata quantit di ogni diluizione. 6. Per le titolazioni di un siero anti-D, vedi Metodo 5.3.
Metodo 3.8 Uso di reagenti sulfidrilici per distinguere gli anticorpi IgM da quelli IgG
Principio Trattare anticorpi IgM con reagenti sulfidrilici ne abolisce tutte le attivit agglutinanti e quelle di
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legare frazioni complementari. Studiare lattivit di un anticorpo prima e dopo un trattamento con reagenti sulfidrilici utile per definire la classe immunoglobulinica. Il trattamento con sulfidrili pu anche essere impiegato per abolire lattivit delle IgM e per permettere di individuare anticorpi IgG coesistenti. Per una discussione sulle strutture di IgM e IgG, vedi Capitolo 11. Campioni Due mL di siero o plasma da trattare. Reagenti 1. Soluzione salina tamponata ai fosfati (PBS) a pH 7,3. 2. Soluzione di ditiotreitolo (DTT) 0,01 M, preparata sciogliendo 0,154 g di DTT in 100 mL di PBS (a pH 7,3). Conservare a 18 C o a temperature pi basse. Procedimento 1. Immettere 1 mL di siero o di plasma in ciascuna di due provette. 2. Alla provetta, etichettata diluizione di controllo, aggiungere 1 mL di PBS. 3. Allaltra provetta, etichettata test, aggiungere 1 mL di DTT 0,01 M. 4. Mescolare e incubare a 37 C da 30 a 60 minuti. 5. Usare, nella procedura, il campione trattato con DTT e la diluizione di controllo.
Interpretazione 1. Una reattivit con la diluizione di controllo e nessuna reattivit con il siero trattato con DTT indica la presenza di IgM. 2. Una reattivit con la diluizione di controllo e con il siero trattato con DTT indica la presenza di anticorpi IgG o di una mistura di IgG e di IgM. Possono rendersi necessari studi di titolazione per una distinzione fra loro. Vedi Tabella 3.8.1. 3. Nessuna reattivit con la diluizione di controllo indica la presenza di un anticorpo molto debole e un test non valido. Controlli Si dovrebbe analizzare e trattare, in parallelo, sieri o plasmi noti per contenere IgM. Note 1. A questo scopo di pu anche usare il 2-mercaptoetanolo (2-ME). Per la sua preparazione, vedi Metodo 2.11. 2. I reagenti sulfidrilici usati a basse concentrazioni possono indebolire gli antigeni del sistema Kell. Per le analisi su anticorpi del Sistema Kell, pu essere necessario usare altri metodi. 3. Durante il trattamento, plasma e siero possono gelificare. Ci accade quando il DTT stato preparato in modo non corretto e presenta una concentrazione superiore a 0,01 M. La
Tabella 3.8.1 - Effetto del ditiotreitolo sugli anticorpi gruppoematici Campioni 1/2 Siero + DTT Siero + PBS Siero + DTT Siero + PBS Siero + DTT Siero + PBS 3+ 3+ 0 3+ 2+ 3+ 1/4 2+ 2+ 0 2+ 1+ 2+ Diluizioni 1/8 2+ 2+ 0 2+ 0 2+ 1/16 1+ 1+ 0 1+ 0 1+ 1/32 0 0 0 0 0 0 IgG IgM IgG + IgM* Interpretazione
*Pu anche indicare una parziale inattivazione delle IgM.
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gelificazione pu anche intervenire se lincubazione fra siero e DTT troppo lunga. Unaliquota del campione trattato pu essere analizzata dopo 30 minuti di incubazione: se scomparsa lattivit presumibilmente legata alla presenza di IgM, non c necessit di incubare pi a lungo. I campioni gelificati non possono essere analizzati per le attivit anticorpali, in quanto il trattamento in eccesso con DTT determina la denaturazione di tutte le sieroproteine.
Bibliografia 1. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M, eds. Blood transfusion in clinical medicine. 10 th ed. Oxford, England: Blackwell Scientific Publications, 1997.
Metodo 3.9 Inibizione con plasma per distinguere gli anticorpi anti-Ch e anti-Rg dagli anticorpi con caratteristiche HTLA
Principio Per una discussione sui principi della inibizione con plasma di anticorpi anti-Ch e anti-Rg, vedi Capitolo 19. Campioni Siero o plasma da analizzare. Reagenti 1. Campioni di emazie reattive. 2. Un pool di sei o pi campioni di plasma normale. 3. Albumina bovina al 6%. Vedi Metodo 1.5. 4. Anti-IgG. 5. Emazie rivestite da IgG. Procedimento 1. Preparare una serie di diluizioni per raddoppio in fisiologica del siero test. Lampiezza della
diluizione dovrebbe andare da 1 a 2 sino a 1 a 512, o di una provetta in pi rispetto al titolo noto, determinato secondo il precedente Metodo 3.7. La quantit preparata non dovrebbe essere inferiore a 0,3 mL, per ogni campione di emazie test. 2. Per ogni campione di emazie test, immettere 2 gocce di ogni diluizione del siero in ognuna di due serie di provette 12 x 75 mm, appropriatamente etichettate. 3. A una serie, aggiungere 2 gocce del plasma in pool in ogni provetta. 4. Allaltra serie, aggiungere 2 gocce di albumina al 6% in ogni provetta. 5. Agitare delicatamente i contenuti di ciascuna provetta e incubare le provette a temperatura ambiente, per almeno 30 minuti. 6. Aggiungere, a ciascuna provetta, una sospensione al 2-5% delle emazie reattive. 7. Agitare con delicatezza il contenuto di ciascuna provetta e incubare le provette a 37 C per unora. 8. Lavare le emazie quattro volte con fisiologica, aggiungere lanti-IgG e centrifugare secondo le istruzioni dei produttori. 9. Risospendere il bottone di emazie ed esaminare per lagglutinazione. Confermare al microscopio i test non reattivi. Classificare il grado dei risultati e registrarli. 10. Confermare la validit dei test negativi con laggiunta delle emazie rivestite da IgG. Interpretazione 1. Linibizione dellattivit anticorpale nelle provette dove stato aggiunto plasma suggerisce una specificit anti-Ch o anti-Rg. Tale inibizione spesso totale. 2. La presenza di uninibizione parziale suggerisce la possibile presenza di ulteriori anticorpi. Questa si pu analizzare preparando larghi volumi di siero inibito, da testare con un pannello di emazie test per verificare se lattivit non neutralizzabile mostra specificit antigeniche. 3. La mancata reattivit del controllo in albumina indica una diluizione di un anticorpo debole e invalida il test.
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Note 1. Anche anticorpi diretti verso antigeni plasmatici possono essere inibiti parzialmente dal plasma1. 2. Unalternativa rappresentata da assorbimenti, condotti con emazie rivestite da C4, in grado di far identificare anticorpi anti-Ch ed eventuali altri alloanticorpi2.
Dividere in aliquote da 1 mL a congelare a 18 C o a temperature inferiori. 2. PBS a pH 7,3. Vedi Metodo 1.7. 3. Eritrociti noti per essere positivi per gli antigeni in causa, e, come controllo, emazie note per essere positive per lantigene K, che efficacemente distrutto dal DTT. 4. Anti-K, sia come reagente tipizzante, sia presente in un siero a forte reattivit. Procedimento 1. Lavare, con PBS, un volume delle emazie test e di quelle di controllo. Dopo aver decantato il liquido di lavaggio, aggiungere quattro volumi di DTT 0,2 M a pH 8,0. 2. Incubare a 37 C da 30 a 45 minuti. 3. Lavare quattro volte con PBS. Pu intervenire una modesta emolisi. Se lemolisi massiccia, ripetere il procedimento, utilizzando emazie fresche e un volume minore di DTT, per esempio due o tre volumi. 4. Risospendere le emazie al 2-5% in PBS. 5. Testare le emazie trattate con DTT, con un siero che contenga lanticorpo pertinente. Nella fattispecie, testare eritrociti Kell positivi con un anti-K. Interpretazione 1. Le emazie di controllo K+ non dovrebbero reagire con lanti-K; se ci avviene, significa che il trattamento con DTT stato inadeguato. Anche altri antigeni del sistema Kell possono essere impiegati come controllo. 2. Se la reazione del siero test viene eliminata, si pu confermare la specificit dellanticorpo sospettato. Si dovrebbe analizzare un numero consistente di campioni di eritrociti per escludere la maggior parte degli anticorpi clinicamente significativi. Nota Il trattamento dei globuli rossi con DTT 0,2 M a pH 8,0, un ottimo sistema per denaturare tutti gli antigeni dei sistemi Kell, Cartwright, LW e Dombrock, e la maggior parte degli antigeni del sistema Knops. Concentrazioni minori di DTT possono,
Bibliografia 1. Reid ME, Lomas-Francis C. The blood group antigen factsbook. 2nd ed. New York: Academic Press, 2004. Ellisor SS, Shoemaker MM, Reid ME. Assorption of anti-Chido from serum using autologous red blood cells coated with homologous C4. Transfusion 1982;22:243-5.
2.
Metodo 3.10 Trattamento di globuli rossi con ditiotreitolo

Principio Il ditiotreitolo (DTT) una sostanza riducente efficace che pu spezzare la struttura terziaria delle proteine, degradando, irreversibilmente, i legami disolfurici a gruppi sulfidrici liberi. Private della struttura terziaria, le proteine che contengono antigeni non sono pi in grado di legare gli anticorpi specifici diretti contro tali antigeni. I globuli rossi trattati con DTT non legano pi gli anticorpi del sistema Kell, la maggior parte di quelli del sistema Knops e la maggior parte degli anti-LWa, -Yta, -Ytb, -Doa, -Dob, -Gya, -Hy e anti-Joa. Questa metodica pu essere utile per identificare alcuni di questi anticorpi e anche per determinare se un siero contiene ulteriori alloanticorpi. Campioni Globuli rossi da trattare. Reagenti 1. Preparare DTT 0,2 M, sciogliendo 1 g di polvere di DTT in 32 mL di PBS a pH 8,0.
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selettivamente, denaturare particolari antigeni (per esempio, una concentrazione 0,002 M di DTT denatura soltanto gli antigeni Jsa e Jsb). Tale propriet pu essere di aiuto nello studio di certi anticorpi.
Bibliografia 1. Branch DR, Muensch HA, Sy Siok Hian S, Petz LD. Disulfide bonds are a requirement for Kell and Cartwright (Yta) blood group antigen integrity. Br J Haematol 1983;54:573-8.
scongelata e di PBS. 4. Incubare le provette a temperatura ambiente per 30 minuti. 5. Mescolare 1 goccia di ciascun campione di globuli rossi con 4 gocce di ciascuna delle provette che conterranno: siero neutralizzato, siero con PBS, urina con PBS. Analizzarle, seguendo le procedure standard. Interpretazione 1. Se persiste agglutinazione nel campione con siero incubato con lurina, significa che si ottenuta soltanto una parziale neutralizzazione o non se ne ottenuta alcuna o che sono presenti ulteriori anticorpi. Pu essere utile esaminare microscopicamente i risultati; lagglutinazione con anti-Sda fragile, e appare a campo misto. 2. Se non vi agglutinazione nella provetta contenente il siero neutralizzato, mentre persiste lagglutinazione nella provetta di controllo e non vi n emolisi n agglutinazione nella provetta contenente urina di controllo, ci indica che lanticorpo stato neutralizzato e, con ogni probabilit, si tratta di un anti-Sda. 3. Lassenza di agglutinazione nella provetta contenente la diluizione di controllo sta a significare che la diluizione stata troppo spinta per la quantit di anticorpi presente e i risultati dei test non sono validi. La provetta contenente urina di controllo assicura che nessuna sostanza presente nellurina in grado di agglutinare o di emolizzare i globuli rossi. Nota Lurina pu contenere sostanze gruppospecifiche ABO e Lewis, secondo le caratteristiche secretorie del donatore.
Metodo 3.11 Neutralizzazione dellanti-Sda con lurina

Principio Per una discussione su questo tipo di neutralizzazione, vedi Capitolo 15. Campioni Siero o plasma che si sospetti contenere anti-Sda. Reagenti 1. Urine di un soggetto Sd(a+), o da un pool di almeno sei soggetti, dei quali si ignora il fenotipo Sd a , preparate come segue. Raccogliere lurina e bollirla, immediatamente, per 10 minuti. Dializzarla contro PBS a pH 7,3 a 4 C per 48 ore. Durante la dialisi, cambiare pi volte il PBS. Centrifugare, suddividere il sovranatante in aliquote che possono essere conservate a 20 C sino allo scongelamento. 2. PBS a pH 7,3. Vedi Metodo 1.7. Procedimento 1. Mescolare eguali volumi di urina scongelata e di siero test. 2. Preparare una diluizione di controllo in una provetta che contenga un eguale volume di siero e di PBS. 3. Preparare una provetta di controllo che contenga un eguale volume di urina
Bibliografia 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994.
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Metodo 3.12 Procedure di assorbimento

Principio Vedi Capitolo 19. Campioni Siero o plasma contenenti lanticorpo da assorbire. Reagenti Globuli rossi (autologhi o allogenici) che portino lantigene corrispondente alla specificit anticorpale da assorbire. Procedimento 1. Lavare le emazie scelte almeno tre volte in fisiologica. 2. Dopo lultimo lavaggio, centrifugare, da 800 a 1.000 x g, per almeno 5 minuti, e rimuovere quanta pi soluzione fisiologica possibile. Unulteriore quantit di soluzione si pu rimuovere, toccando il sedimento eritrocitario con un piccolo pezzo di carta da filtro. 3. Miscelare appropriati volumi di sedimento eritrocitario e di siero e incubare, alla temperatura desiderata, da 30 a 60 minuti. 4. Mescolare periodicamente siero ed eritrociti, durante la fase di incubazione. 5. Centrifugare i globuli rossi, da 800 a 1.000 x g per 5 minuti, al fine di compattare il sedimento eritrocitario. Centrifugare, se possibile, alla temperatura di incubazione, per prevenire la dissociazione dellanticorpo dalla membrana eritrocitaria. 6. Trasferire il liquido sovranatante (che il siero assorbito) in una provetta pulita. Se si deve condurre uneluizione, i globuli rossi vanno conservati. 7. Testare unaliquota del siero assorbito preferibilmente contro unulteriore aliquota delle emazie utilizzate per lassorbimento, per verificare se tutto lanticorpo stato rimosso. Interpretazione Se permane una reattivit, lanticorpo non stato totalmente rimosso, mentre una mancata
reattivit indica che tutto lanticorpo stato allontanato. Note 1. Lassorbimento pi efficiente quanto maggiore larea di contatto fra globuli rossi e siero. Viene raccomandato di usare provette ad ampio calibro (13 mm o pi). 2. Per rimuovere completamente un anticorpo possono essere necessari multipli assorbimenti, ma ogni assorbimento successivo aumenta la probabilit che il siero si diluisca e che gli anticorpi non assorbiti si indeboliscano. 3. Gli assorbimenti successivi dovrebbero utilizzare emazie fresche e non quelle impiegate nei precedenti assorbimenti. 4. Si pu adottare il pre-trattamento enzimatico degli eritrociti da utilizzare nellassorbimento, al fine di accrescere la capacit di captazione da parte di antigeni che non vengono distrutti dagli enzimi.
Metodo 3.13 Uso del programma americano di donatori rari

Principio LARDP (American Rare Donor Program, cio il programma americano relativo a donatori di gruppo raro) aiuta a individuare emocomponenti per pazienti che necessitano di sangue raro o non usuale. LARDP mantiene un database di questi donatori, seguendo le informazioni che giungono dai laboratori immunoematologici di riferimento, accreditati dallAABB o dallARC (American Red Cross, Croce Rossa Americana). Si considerano rari i donatori che sono privi di antigeni ad alta
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frequenza, degli antigeni pi comuni o se sono privi di IgA. Tutte le richieste allARDP devono partire da un laboratorio immunoematologico di riferimento, accreditato AABB o ARC, per assicurare che il paziente stato valutato e registrato accuratamente. I costi delle unit rare e della loro spedizione vengono stabiliti dalla struttura che fornisce le unit. Procedimento 1. Un Servizio Trasfusionale ospedaliero o un Centro Sangue identificano un paziente che necessita di sangue raro. 2. La struttura contatta il pi vicino laboratorio immunoematologico di riferimento accreditato AABB o ARC per ottenere il sangue necessario. 3. Se il laboratorio di riferimento non pu fornire tale sangue, contatta, a sua volta, lARDP. Tutte le richieste allARDP devono provenire da un laboratorio accreditato AABB o ARC (o da un altro programma simile, relativo a donatori rari). Le richieste ricevute direttamente da una struttura non accreditata devono essere riferite allistituzione accreditata pi vicina. 4. Le strutture che contattano lARDP (strutture
richiedenti) devono confermare lidentificazione dellanticorpo (o degli anticorpi) con ricerche sierologiche o esaminando lattivit sierologica condotta da unaltra struttura. 5. Il personale dellARDP ricerca, nel proprio database, i centri che hanno identificato donatori con il fenotipo richiesto e li contatta per verificare se le unit sono disponibili. Il personale ARDP fornisce, alla struttura richiedente, il nome (o i nomi) del centro (o dei centri) di spedizione. 6. La struttura richiedente e quelle di spedizione dovrebbero confrontarsi e concordare, prima delle spedizioni, i costi e le analisi da effettuare. 7. Se una ricerca iniziale non fornisce un numero sufficiente di unit, per ottenere le unit necessarie, si possono adottare, da parte del personale ARDP, le seguenti misure: 1) comunicare il problema a tutti i centri che partecipano allARDP, invitandoli a ricercare nei loro elenchi o a reclutare donatori con il fenotipo necessario e 2) contattare altri file di donatori rari, come quelli dellOrganizzazione Mondiale della Sanit, della Croce Rossa Giapponese o simili.
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Metodi sezione 4: Indagini su un test allantiglobulina diretto positivo
Metodi sezione 4
Indagini su un test allantiglobulina diretto positivo
Tecniche di eluizione
Lo scopo di tutte le tecniche di eluizione quello di interferire con le forze di legame non covalenti che fissano i complessi antigene-anticorpo sulla superficie esterna dei globuli rossi. La membrana eritrocitaria pu essere fisicamente smembrata da calore, ultrasuoni, congelamenti-scongelamenti, detergenti o solventi organici. I complessi antigene-anticorpo possono essere separati anche da variazioni del pH o della concentrazione salina. Per paragonare vantaggi e svantaggi delle diverse tecniche di eluizione, vedi Capitolo 20. Di seguito, elenchiamo metodiche selezionate di eluizione, compresa una tecnica con solvente organico. Il metodo delleluizione acida a freddo (Metodo 4.1) la base di kit rinvenibili in commercio, comunemente utilizzati negli Stati Uniti. Dato che nessun metodo porter allidentificazione di tutti gli anticorpi, pu essere indicato limpiego di metodi di eluizione alternativi (per esempio, con solvente organico), quando un eluato non reattivo non congruente coi dati clinici. Il lettore dovrebbe fare riferimento al Capitolo 2, dove descritto il corretto comportamento da tenere nel maneggiare sostanze chimiche pericolose, che vengono talora usate in questi metodi. Quando si usano solventi organici, auspicabile la disponibilit di una cappa per fumi chimici. essenziale condurre lavaggi molto minuziosi per essere certi che lanticorpo ritrovato nelleluato provenga esclusivamente dagli eritrociti e non sia di altra provenienza (per esempio dal plasma).
Un controllo a dimostrazione che tutti gli anticorpi liberi sono stati rimossi con i lavaggi si pu ottenere preservando la fisiologica dellultimo lavaggio e conducendo su questa indagini in parallelo con leluato. Trasferire, in aggiunta, i globuli rossi in una provetta pulita, appena prima delleluizione, elimina la possibilit di dissociazione di un anticorpo che pu essere legato, non specificamente, al vetro della prima provetta durante le fasi di un assorbimento o di quelle iniziali delleluizione.
Metodo 4.1 Eluizione acida a freddo

Principio La dissociazione di un anticorpo dagli eritrociti consente di identificare allo- o autoanticorpi. Le metodiche di eluizione condotte insieme a quelle di assorbimento sono anche utili per evidenziare espressioni antigeniche deboli sulle cellule impiegate per assorbire e nella separazione di misture di anticorpi diretti contro antigeni gruppoematici. Campioni Globuli rossi positivi al test allantiglobulina diretto (TAD), lavati sei volte con abbondante fisiologica (mantenere la soluzione dellultimo lavaggio). Reagenti 1. Soluzione di glicina-HCl (0,1 M, pH 3,0), preparata sciogliendo 3,75 g di glicina e 2,922 g di cloruro di sodio in 500 mL di acqua
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deionizzata o distillata. Aggiustare a pH 3,0 con HCl 12 N. Conservare a 4 C. 2. Tampone fosfato (0,8 M, pH 8,2), preparato sciogliendo 109,6 g di Na2HPO 4 e 3,8 g di KH2PO4 in approssimativamente 600 mL di acqua deionizzata o distillata, portando poi al volume finale di 1 L. Se necessario, aggiustare il pH con NaOH 1 N o con HCl 1 N. Conservare a 4 C (vedi nota 2). 3. Cloruro di sodio 0,9%, a 4 C. 4. Sovranatante della soluzione dellultimo lavaggio delle emazie da testare. Procedimento 1. Immettere 1 mL di globuli rossi in una provetta 13 x 100 mm e raffreddare in un bagnomaria a ghiaccio fondente per 5 minuti, prima di aggiungere la soluzione di glicina-HCl. 2. Aggiungere ai globuli rossi, 1 mL di fisiologica fredda e 2 mL di soluzione fredda di glicina-HCl. 3. Mescolare e incubare la provetta, per 1 minuto, in un bagnomaria a 0 C. 4. Centrifugare rapidamente la provetta da 900 a 1.000 x g per 2-3 minuti. 5. Trasferire leluato sovranatante in una provetta pulita e aggiungere 0,1 mL di tampone fosfato a pH 8,2 per ogni mL di eluato (vedi nota 3). 6. Mescolare e centrifugare da 900 a 1.000 x g per 2-3 minuti. 7. Trasferire leluato sovranatante in una provetta pulita e testarlo in parallelo con il sovranatante della soluzione del lavaggio finale. Note 1. Mantenere la soluzione di glicina-HCl in un bagnomaria a ghiaccio fondente per conservare il pH corretto. 2. Durante la conservazione a 4 C il tampone fosfato cristallizzer. Prima delluso, ridiscioglierlo a 37 C. 3. Laggiunta di tampone fosfato restituisce la neutralit alleluato acido. Lacidit pu causare lemolisi dei globuli rossi utilizzati per testare leluato. Laggiunta di albumina bovina al 22% (una parte su quattro parti di eluato) pu ridurre questa emolisi.
Bibliografia 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2 nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994. Rekvig OP, Hannestad K. Acid elution of blood group antibodies from intact erythrocytes. Vox Sang 1977;33:280-5.
2.
Metodo 4.2 Eluizione alla glicina-HCl/EDTA

Principio Vedi Metodo 4.1. Campioni Globuli rossi positivi al TAD, lavati sei volte con abbondante fisiologica (mantenere la soluzione dellultimo lavaggio). Reagenti 1. EDTA disodico (10% p/v): 10 g di Na2EDTA in acqua distillata sino a 100 mL. 2. Glicina-HCl (0,1 M, pH 1,5): 0,75 g di glicina diluita in 100 mL di soluzione fisiologica al 9% di NaCl; aggiustare il pH a 1,5 con HCl 12 N. 3. TRIS-NaCl (1 M): 12.1 g di Tris(idrossimetil) aminometano (TRIS) o TRIZMA BASE; 5,25 g di NaCl; acqua distillata a 100 mL. 4. Sopranatanti della soluzione del lavaggio finale dei globuli rossi da testare. Procedimento 1. In una provetta, mescolare 20 volumi (per esempio, 20 gocce) di glicina-HCl 0,1 M con 5 volumi di una soluzione di EDTA al 10%. Questa la soluzione eluente. 2. In una provetta 12 x 75 mm, immettere 10 volumi di sedimento dei globuli rossi. 3. Aggiungere, ai globuli rossi, 20 volumi della soluzione eluente, mescolare bene, incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Non prolungare lincubazione. 4. Aggiungere 1 volume di TRIS-NaCl, mescolare, e centrifugare immediatamente da 900 a 1.000 x g per 60 secondi.
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5. Trasferire leluato sovranatante in una provetta pulita e aggiustare accuratamente il pH da 7,0 a 7,4 con TRIS-NaCl 1 M, aggiunto goccia a goccia. Il pH pu essere controllato con la carta apposita. 6. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per 2-3 minuti per rimuovere il precipitato. 7. Trasferire leluato sovranatante in una provetta pulita e testarlo in parallelo con la fisiologica sovranatante del lavaggio finale. Note 1. Una volta che le emazie si sono negativizzate al TAD, esse possono essere testate per gli antigeni gruppoematici, tolti quelli del sistema Kell, che vengono denaturati dal trattamento con glicina-HCl/ EDTA, cosi come lantigene Era. Lavare le emazie almeno tre volte prima delluso. 2. I globuli rossi modificati dalla glicina-HCl/EDTA possono essere trattati con proteasi e impiegati negli studi di autoassorbimento. 3. Un prolungamento dellincubazione della soluzione eluente (punto 3 del procedimento) dannegger irreversibilmente i globuli rossi. 4. Il TRIS-NaCl molto alcalino e sono sufficienti poche gocce per ottenere il pH desiderato (punto 5). 5. Aliquote dei reagenti possono essere conservate congelate e una provetta di ciascun reagente pu essere scongelata appena prima delluso. La soluzione di EDTA al 10% pu precipitare se conservata fra 2 e 8 C. 6. Leluato, conservato a 4 C o congelato, pu essere reso pi stabile con laggiunta di albumina (1 volume di albumina bovina al 30% ogni 10 volumi di eluato). Se si aggiunge albumina, questo va fatto dopo lultimo lavaggio.
Metodo 4.3 Eluizione al calore

Principio Leluizione al calore utilizza laumento di temperatura per dissociare gli anticorpi dagli eritrociti. Questo metodo particolarmente adatto per le indagini sulla MEN da incompatibilit ABO e per leluizione di anticorpi di classe IgM. Non si dovrebbe utilizzare per indagare su alterazioni provocate da auto- o a da alloanticorpo di classe IgG. Campioni Globuli rossi positivi al TAD, lavati sei volte con abbondante fisiologica, conservando la soluzione dellultimo lavaggio (vedi nota). Reagenti 1. Albumina bovina al 6% (vedi Metodo 1.5). 2. Sopranatanti della soluzione del lavaggio finale dei globuli rossi da testare. Procedimento 1. Mescolare, in una provetta di 13 x 100 mm, volumi eguali di emazie lavate e impaccate e di albumina bovina al 6%. 2. Mettere la provetta a 56 C per 10 minuti, agitandola periodicamente. 3. Centrifugare la provetta da 900 a 1.000 x g, usando, possibilmente, una centrifuga riscaldata. 4. Trasferire immediatamente leluato sovranatante in una provetta pulita e testarlo in parallelo con la soluzione salina dellultimo lavaggio. Nota Per un recupero ottimale di anticorpi reattivi a freddo, i globuli rossi dovrebbero essere lavati, prima di iniziare leluizione, con fisiologica ghiacciata (0 C) per prevenire la dissociazione di tali anticorpi.
Bibliografia Bibliografia 1. Byrne PC. Use of a modified acid/EDTA elution technique. Immunohematology 1991;7:46-7. [Correction note: Immunohematology 1991;7:106.] 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific
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2.
Publications, 1994. Landsteiner K, Miller CP Jr. Serological studies on the blood of primates. II. The blood groups in anthropoid apes. J Exp Med 1925;42:853-62.
2.
Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994. Feng CS, Kirkley KC, Eicher CA, et al. The Lui elution technique: A simple and efficient method for eluting ABO antibodies. Transfusion 1985;25:433-4.
Metodo 4.4 Eluizione (congelamento-scongelamento) tramite Lui

Principio Quando i globuli rossi vengono congelati, si formano cristalli di ghiaccio, che attirano acqua dallambiente circostante. Ci fa aumentare losmolarit dei fluidi extracellulari, che estraggono acqua dalle emazie. Le emazie si contraggono e si lisano. Con la rottura della membrana, gli anticorpi si dissociano. Questo metodo impiegato soprattutto nello studio della MEN da incompatibilit ABO. Campioni 1. Globuli rossi lavati sei volte con abbondante fisiologica 2. Sopranatanti della soluzione del lavaggio finale dei globuli rossi da testare. Procedimento 1. Mescolare, in una provetta, 0,5 mL di globuli rossi da analizzare con 3 gocce di fisiologica. 2. Tappare la provetta e ruotarla per rivestire con le emazie le sue pareti interne. 3. Porre la provetta, in posizione orizzontale, in un congelatore da 6 a 70 C per 10 minuti. 4. Levare la provetta dal congelatore e scongelarla rapidamente sotto un rubinetto di acqua corrente calda. 5. Centrifugare, per 2 minuti, da 900 a 1.000 x g. 6. Trasferire il sovranatante in una provetta pulita e testarlo in parallelo con la soluzione salina dellultimo lavaggio.
Metodo 4.5 Eluizione al diclorometano

Principio I solventi organici possono influenzare la dissociazione antigene-anticorpo mediante parecchi meccanismi, ivi compresa lalterazione della struttura terziaria delle molecole anticorpali, portando alla loro dissociazione dalla membrana eritrocitaria. Questo metodo particolarmente adatto a dissociare auto- e alloanticorpi di classe IgG. Campioni Globuli rossi, positivi al TAD, lavati sei volte con abbondante fisiologica (conservare la soluzione dellultimo lavaggio). Reagenti 1. Diclorometano. 2. Fisiologica sovranatante del lavaggio finale dei globuli rossi da testare. Procedimento 1. Mescolare, in una provetta (13 x 100 mm), 1 mL di globuli rossi, 1 mL di fisiologica e 2 mL di diclorometano. 2. Tappare la provetta e mescolare delicatamente per 1 minuto. 3. Rimuovere il tappo e centrifugare la provetta a 1.000 x g, per 10 minuti. 4. Rimuovere, con una pipetta, lo strato pi basso di diclorometano e scartarlo. 5. Mettere la provetta a 56 C per 10 minuti. Nei primi minuti, agitare costantemente leluato con una bacchetta di legno per evitare che bollendo fuoriesca; in seguito, agitare saltuariamente. 6. Centrifugare a 1.000 x g per 10 minuti. 7. Trasferire leluato sovranatante in una provetta
Bibliografia 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed.
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pulita e testarlo in parallelo con la soluzione fisiologica dellultimo lavaggio.
complemento dalle emazie autologhe e scopre siti antigenici che possono essere utilizzati per legare autoanticorpi liberi nel siero. Campioni 1. 1 mL di siero (o plasma) da assorbire. 2. Aliquote di 2 mL di globuli rossi autologhi. Reagenti 1. Papaina all1% attivata da cisteina o ficina all1% (vedi Metodi 3.5.1 e 3.5.2). 2. Soluzione fisiologica tamponata ai fosfati (PBS) a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 3. Ditiotreitolo (DTT) 0,2 M, preparato sciogliendo 1 g di DTT in 32,4 mL di PBS a pH 7,3. Suddividere in aliquote da 3 mL da conservare congelate a 18 C o a temperature inferiori. Procedimento 1. Preparare il reagente ZZAP, mescolando 0,5 mL di papaina all1%, attivata da cisteina, con 2,5 mL di DTT 0,2 M e con 2 mL di PBS a pH 7,3. Alternativamente, usare 1 mL di ficina all1%, 2,5 mL di DTT 0,2 M e 1,5 mL di PBS a pH 7,3. Il pH dovrebbe attestarsi fra 6,0 e 6,5. 2. Aggiungere 2 mL di ZZAP a 1 mL di globuli rossi autologhi. Miscelare e incubare a 37 C per 30 minuti. 3. Lavare le emazie tre volte con soluzione fisiologica. Centrifugare lultimo lavaggio per almeno 5 minuti da 900 a 1.000 x g e rimuovere quanto pi sovranatante possibile (vedi nota 1). 4. Nella provetta contenente le emazie trattate con ZZAP aggiungere 1 mL di siero autologo, mescolare e incubare a 4 C per 30 minuti. 5. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per 4-5 minuti e trasferire il siero in una provetta pulita. 6. Le fasi da 2 a 5 possono essere ripetute, se il primo autoassorbimento non rimuove in maniera soddisfacente lattivit autoanticorpale. 7. Dopo lautoassorbimento, analizzare il siero con emazie test per evidenziare unattivit alloanticorpale.
Metodi per ricerche relative ad anemie emolitiche immunologiche

Qui di seguito sono illustrate le metodiche per rimuovere la reattivit di autoanticorpi caldi e freddi (per esempio con autoassorbimento), cos che sia possibile eseguire test in grado di differenziare le diverse anemie emolitiche immunoglobuliniche. Vedi il Capitolo 20, per una discussione sulle anemie emolitiche immunologiche.
Metodo 4.6 Autoassorbimento a freddo

Principio Sebbene la maggior parte degli autoanticorpi freddi non ponga problemi nei test sierologici, alcuni potenti autoanticorpi, reattivi a freddo, possono mascherare la contestuale presenza di alloanticorpi clinicamente significativi. In questi casi, assorbire il siero a freddo, utilizzando i globuli rossi autologhi, pu rimuovere gli autoanticorpi e permettere lindividuazione degli alloanticorpi sottostanti. Nella maggior parte dei casi di autoanticorpi freddi, non patologici, un semplice e rapido assorbimento del siero del paziente con emazie autologhe trattate con enzimi sar in grado di rimuovere gli autoanticorpi. Vedi Metodo 3.5.6. Un metodo pi efficace utilizza il reagente cosiddetto ZZAP, una mistura di enzimi proteolitici e di una potente sostanza riducente. Il trattamento con ZZAP rimuove le IgM e il
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Note 1. Per evitare una diluizione del siero e una possibile perdita di alloanticorpi deboli, importante, nella fase 3, rimuovere pi fisiologica possibile. 2. Se la reattivit degli autoanticorpi non diminuisce, lautoantigene bersaglio pu essere stato distrutto sia dallenzima sia dal DTT. Lautoassorbimento dovrebbe essere ripetuto contro globuli rossi autologhi non trattati e lavati pi volte con fisiologica calda.
4. Globuli rossi dello stesso gruppo ABO del paziente, se non di gruppo O. Se il paziente A o AB, usare emazie A1 e A2. 5. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). Procedimento 1. Preparare delle serie di diluizioni per raddoppio in fisiologica o in PBS del siero o del plasma. Lambito delle diluizioni va da 1:2 a 1:4-096 (12 provette) e le quantit preparate dovrebbero essere maggiori del volume totale necessario per testare tutte le cellule. Vedi Metodo 3.7. 2. Etichettare le serie di 12 provette con il tipo di diluizione (per esempio: 2, 4, 8 etc.) per ciascuna delle emazie da testare (per esempio, di adulto, di cordone, autologhe). 3. Dispensare 2 gocce di ciascuna diluizione dentro le provette appropriate. 4. Aggiungere una goccia di una sospensione in fisiologica (al 4-5%) di ciascun campione di globuli rossi alla serie appropriata di provette. 5. Mescolare e incubare da 30 a 60 minuti, a temperatura ambiente. 6. Centrifugare da 15 a 20 secondi a 900-1.000 x g. Esaminare, ad una ad una, macroscopicamente, le provette per lagglutinazione, iniziando con la serie di provette che presenta la diluizione pi alta per ciascuna cellula testata (cio, leggere tutte le provette per ogni diluizione, come fossero una serie). Definire lo score dei risultati e registrarlo. 7. Trasferire le provette a 4 C e incubarle da 1 a 2 ore. 8. Centrifugare da 15 a 20 secondi a 900-1.000 x g. Immergere immediatamente, in un bagnomaria a ghiaccio fondente, un porta-provette con le provette. Esaminarle come specificato al punto 6; definire lo score dei risultati e registrarli. Interpretazione La Tabella 4.7.1 sintetizza le reazioni comunemente incontrate con autoanticorpi freddi. Nella sindrome da agglutinine fredde, si riscontrano, pi frequentemente, anti-I, ma si possono anche incontrare anticorpi anti-i.
Bibliografia 1. 2. Branch DR. Blood transfusion in autoimmune hemolytic anemias. Lab Med 1984;15:402-8. Branch DR, Petz LD. A new reagent (ZZAP) having multiple applications in immunohematology. Am J Clin Pathol 1982;78:161-7.
Metodo 4.7 Determinazione della specificit di autoagglutinine fredde

Principio Per una discussione sulla specificit degli autoanticorpi freddi, vedi Capitolo 20. Campioni 1. Siero, separato a 37 C, da un campione di sangue che stato fatto coagulare a 37 C, o plasma separato da un campione anticoagulato, dopo ripetute inversioni a 37 C per circa 15 minuti. 2. Globuli rossi autologhi. Reagenti Globuli rossi test dei fenotipi elencati qui di seguito. 1. Pool di due campioni di emazie O I di adulto; si possono usare le emazie test impiegate correntemente per la rilevazione di alloanticorpi. 2. Globuli rossi di gruppo O i da cordone ombelicale. 3. Emazie autologhe del paziente, lavate almeno tre volte con fisiologica calda a 37 C.
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Tabella 4.7.1 - Schemi della reattivit relativa tipica degli autoanticorpi freddi Emazie test Anti-I O I adulto O i cordone O i adulto A1 I adulto Autologhe O I trattate con enzimi + 0/ 0/ + +
Specificit dellanticorpo Anti-i 0/

+ +
Anti-IT 0/
+
Anti-IH
+
Anti-Pr
+
+
+
0/ 0/
0/ 0/ 0/
+
+
+ = reattive; 0 = non reattive; = reattivit pi debole; = reattivit pi forte
Quando le emazie da cordone ombelicale reagiscono pi fortemente di quelle di adulto, la specificit potrebbe essere anti-i, ma necessario testare emazie i di adulto per avere una conferma che la reattivit dovuta allantii e non allI T . Alcuni anti-I reagiscono pi fortemente con globuli rossi che esprimano maggiormente la sostanza H (come le emazie O oppure A2): questi anticorpi sono detti antiIH. Raramente la specificit potrebbe essere anti-Pr, che sar sospettata se tutte le cellule reagiscono allo stesso modo. Una specificit anti-Pr sar confermata testando emazie trattate con enzimi; gli anticorpi anti-Pr non reagiscono con emazie trattate con enzimi, al contrario degli anti-I e anti-i che danno reazioni pi intense con globuli rossi trattati con enzimi. Lanti-Pr reagisce egualmente con gli eritrociti di fenotipo I o i, non trattati con enzimi. Note 1. Quando si preparano serie di diluizioni, importante utilizzare pipette diverse o pipette con puntali a perdere, perch il siero passato da una provetta a quella successiva utilizzando una sola pipetta pu determinare errori nella diluizione finale. Le differenze possono essere tali che una diluizione vera di 4.000 (usando pipette diverse) pu trasformarsi in 100.000 se si impiega una sola pipetta per i passaggi da
una provetta a unaltra. 2. Le diluizioni del siero possono essere preparate pi accuratamente con ampi volumi (per esempio, di 0,5 mL), piuttosto che con piccoli volumi. 3. Autoanticorpi freddi, molto potenti, in genere non mostrano una chiara specificit sino a quando non si sono fatte le titolazioni; tale specificit pu anche non chiarirsi con diluizioni condotte a temperatura ambiente o a 4 C. In queste situazioni, i test possono essere incubati da 30 a 37 C. La reattivit differenziale pu apparire pi chiara se i tempi di incubazione si prolungano e lagglutinazione viene valutata dopo una sedimentazione, senza centrifugare. Questo tipo di lettura pi accurato dopo 2 ore di incubazione. 4. Questa procedura pu essere adottata per determinare sia il titolo sia la specificit. Se si inizia incubando a 37 C (con materiale preriscaldato e le letture vengono fatte in sequenza, per esempio: a 37 C, a 30 C, a temperatura di laboratorio, a 4 C), si possono determinare su di una sola serie di diluizioni specificit, titolo e ampiezza termica dellautoanticorpo. 5. Se il test verr condotto anche a 30 C e a 37 C, includere anche una provetta con il siero non diluito.
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Bibliografia 1. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemias 2 nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2004.
Metodo 4.8 Titolazione delle agglutinine fredde

Principio Gli autoanticorpi freddi, se ad alto titolo, possono far sospettare la presenza di una malattia da agglutinine fredde. Si possono avere chiara emolisi e sintomatologia sistemica, che possono indicare la presenza di unemopatia neoplastica da cellule B. Campioni Siero separato a 37 C da un campione lasciato coagulare a 37 C o plasma separato da un campione scoagulato, invertendo ripetutamente la provetta, a 37 C, per circa 15 minuti. Reagenti 1. Pool di due campioni di eritrociti lavati di fenotipo I, di gruppo O (ad esempio emazie test per la rilevazione di anticorpi). 2. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). Procedimento 1. Preparare una serie di diluizioni per raddoppio del siero o del plasma del paziente con PBS. Le diluizioni dovrebbero andare da 1 a 2 sino a 1 a 4.096 (12 provette). Vedi Metodo 3.7. 2. Miscelare 2 gocce di ciascuna diluizione con 1 goccia di una sospensione eritrocitaria al 3-5%. 3. Mescolare e incubare a 4 C da 1 a 2 ore. 4. Centrifugare le provette per 15-20 secondi da 900 a 1.000 x g , poi sistemarle in un porta provette tenuto in un bagnomaria a ghiaccio fondente. Esaminare per lagglutinazione, ad una ad una, macroscopicamente, le singole provette, iniziando da quella che contiene la diluizione pi alta. Definire lo score dei risultati e registrarli.
Interpretazione Il titolo il reciproco della pi alta diluizione del siero nella quale si osserva una agglutinazione macroscopica. Titoli superiori a 64 sono considerati elevati, ma raramente si determina unanemia emolitica dovuta ad autoagglutinine fredde con titoli inferiori a 1.000. Titoli inferiori a 1.000 si possono osservare quando lautoanticorpo ha una differente specificit (per esempio anti-i) o quando si tratta di agglutinine fredde del tipo (meno comune) a basso titolo ma ad alta ampiezza termica. Se il paziente ha un TAD positivo dovuto al solo complemento, e ha segni clinici di anemia emolitica, si dovrebbero effettuare studi sulla specificit e sullampiezza termica (vedi Metodo 4.7). Note 1. Quando si preparano le diluizioni del siero, importante utilizzare pipette diverse per ogni diluizione, perch lutilizzo della stessa pipetta per trasferire il siero da una provetta a quella successiva pu determinare titoli falsamente elevati. 2. Le diluizioni del siero sono pi accurate se si preparano volumi maggiori (per esempio, 0,5 mL) piuttosto che minori.
Bibliografia 1. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemias. 2nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2004.
Metodo 4.9 Assorbimento autologo di autoanticorpi reattivi a caldo

Principio La presenza, in un siero, di autoanticorpi caldi pu mascherare quella concomitante di alloanticorpi clinicamente significativi. Un assorbimento del siero con i globuli rossi autologhi pu rimuovere gli autoanticorpi dal siero e permettere di rilevare gli alloanticorpi. I globuli rossi circolanti, comunque, sono rivestiti di
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autoanticorpi. Lassorbimento autologo di autoanticorpi caldi pu essere facilitato con la dissociazione degli autoanticorpi dalla membrana eritrocitaria, il che espone, di conseguenza, i siti antigenici, che possono legare gli autoanticorpi liberi e rimuoverli dal siero. Alcuni autoanticorpi si possono dissociare con una delicata eluizione al calore (a 56 C) da 3 a 5 minuti. Un trattamento successivo con enzimi rafforza il processo di assorbimento, rimuovendo strutture di membrana che possono, altrimenti, nascondere il legame fra antigeni e anticorpi. La procedura pi efficace contempla luso del reattivo ZZAP, una miscela di un enzima proteolitico e un reagente sulfidrilico. Il trattamento con ZZAP rimuove le immunoglobuline e il complemento dai globuli rossi e rafforza lassorbimento. Per lautoassorbimento, non si dovrebbero utilizzare emazie di pazienti trasfusi negli ultimi tre mesi, perch le emazie trasfuse, presenti in circolo, assorbono, con ogni probabilit, gli alloanticorpi che si stanno ricercando (vedi Capitolo 20). Campioni 1. Siero, plasma o eluato (1 mL) da assorbire. 2. 2 mL di globuli rossi autologhi. Reagenti 1. Papaina all1% attivata da cisteina o ficina all1% (vedi Metodi 3.5.1. e 3.5.2). 2. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 3. DTT 0,2 M preparato sciogliendo 1 g di DTT in 32,4 mL di PBS a pH 7,3. Suddividere in aliquote da 3 mL da conservare a 18 C o a temperature inferiori. Procedimento 1. Preparare il reagente ZZAP, mescolando 0,5 mL di papaina all1% attivata da cisteina con 2,5 mL di DTT 0,2 M e con 2 mL di PBS. Alternativamente, usare 1 mL di ficina all1%, 2,5 mL di DTT 0,2 M e 1,5 mL di PBS a pH 7,3. Il pH della mescolanza dovrebbe attestarsi fra 6,0 e 6,5. 2. Aggiungere, a ciascuna di due provette che contengono 1 mL di emazie, 2 mL di ZZAP. Mescolare e incubare a 37 C per 30 minuti,
agitando periodicamente. 3. Lavare le emazie per tre volte in fisiologica. Centrifugare lultimo lavaggio per almeno 5 minuti da 900 a 1.000 x g, e rimuovere pi sovranatante possibile. 4. Aggiungere, a volumi eguali, siero alle emazie trattate con ZZAP, mescolare, incubare a 37 C da 30 a 45 minuti. 5. Centrifugare e rimuovere accuratamente il siero. 6. Se la reattivit del siero originale era di 1+, passare direttamente alla fase 7. In caso contrario, ripetere, ancora una volta, le fasi 4 e 5, usando il siero del paziente gi assorbito una volta e una seconda aliquota di globuli rossi trattati con ZZAP. 7. Testare il siero contro un campione di emazie test di gruppo O. Se persiste una reattivit, ripetere le fasi 4 e 5. Interpretazione Uno o due assorbimenti rimuovono, di solito, in quantit sufficiente, lautoanticorpi cos da rendere prontamente rilevabile una specificit alloanticorpale, se presente. Se il siero, autoassorbito due volte, reagisce con una definita specificit, come testimoniato da indagini condotte con un piccolo pannello di identificazione anticorpale, la definitiva specificit dellanticorpo probabilmente dovuta a un alloanticorpo. Se il siero reagisce con tutte le cellule del panello, o si sono resi necessari autoassorbimenti aggiuntivi, il siero contiene un anticorpo diretto contro un antigene ad alta frequenza, oppure contiene un autoanticorpo (per esempio anti-Kpb) che non reagisce con emazie trattate con ZZAP, e che, quindi, non sar assorbito da questo procedimento. Per controllare questultima possibilit, analizzare il siero autoassorbito contro emazie test che siano state pretrattate con ZZAP. Note 1. Il trattamento con ZZAP distrugge tutti gli antigeni del sistema Kell e tutti gli altri antigeni sensibili alle proteasi (come, per esempio, M, N, Fya e Fyb). Lo ZZAP denatura anche gli antigeni dei sistemi LW, Cartwright, Dombrock
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e Knops. Se si sospetta che lautoanticorpo sia diretto contro questi antigeni, un procedimento alternativo consiste nel condurre lautoassorbimento con emazie autologhe non trattate o trattate soltanto con ficina all1% o con papaina all1% attivata da cisteina. 2. Non necessario lavare il sedimento di emazie prima di trattarlo con ZZAP. 3. Autoanticorpi freddi, reattivi anche a temperatura ambiente, possono essere presenti nel siero di circa il 30% dei pazienti con autoanticorpi caldi. La rimozione di questi autoanticorpi freddi pu essere facilitata ponendo la sospensione di siero e globuli rossi a 4 C per circa 15 minuti, dopo unincubazione a 37 C. 4. Come consiglio, quando la reattivit del siero originale di 1+ nel test allantiglobulina indiretto con LISS (TAI-LISS), di solito sufficiente un solo autoassorbimento. Se la reattivit di 2+ o di 3+, questa verr rimossa da dueo tre autoassorbimenti. Effettuare pi di quattro autoassorbimenti aumenta il rischio di diluire la reattivit alloanticorpale.
di emazie test. Questa procedura pu essere impiegata per rilevare alloanticorpi concomitanti, se il paziente stato recentemente trasfuso, o se non sono disponibili quantit sufficienti di globuli rossi autologhi ed sconosciuto il fenotipo completo del paziente. Trattare con enzimi o con ZZAP le cellule deputate allassorbimento aumenta la potenziale efficacia del procedimento. I globuli rossi cos trattati perderanno gli antigeni distrutti dal DTT e/o dagli enzimi (vedi Capitolo 19). Campioni Siero o plasma contenenti autoanticorpi caldi o eluati ottenuti da globuli rossi positivi al TAD. Reagenti 1. Papaina all1% attivata da cisteina o ficina all1% (vedi Metodi 3.5.1 e 3.5.2). 2. ZZAP (papaina o ficina pi DTT 0,2 M). Vedi Metodo 4.9. 3. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 4. Emazie di gruppo O con fenotipi R1R1, R2R2 ed rr, una di queste emazie dovrebbe essere Jk(ab+) e unaltra Jk(a+b). Per di pi, se i globuli rossi sono soltanto trattati con enzimi, un campione almeno dovrebbe essere K negativo. Questi globuli rossi possono essere utilizzati come emazie test o provenire da campioni in grado di fornire un volume eritrocitario sufficiente. Procedimento 1. Lavare 1 mL di ogni campione di globuli rossi con abbondante fisiologica, centrifugare per sedimentare le emazie, rimuovere la soluzione salina sovranatante. 2. A ciascun volume di sedimento di emazie lavate, aggiungere un volume di soluzione di enzimi all1% o due volumi di ZZAP. Per mescolare bene, invertire pi volte le provette. 3. Incubare a 37 C: 15 minuti per gli enzimi e 30 minuti per il ZZAP. Durante le incubazioni, mescolare pi volte. 4. Lavare le emazie tre volte con abbondante fisiologica. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per almeno 5 minuti e rimuovere quanto pi
Bibliografia 1. Branch DR, Petz LD. A new reagent (ZZAP) having multiple applications in immunohematology. Am J Clin Pathol 1982;78:161-7.
Metodo 4.10 Assorbimento selettivo a caldo usando globuli rossi allogenici trattati con enzimi o con ZZAP
Principio
Lassorbimento del siero con globuli rossi di fenotipo noto rimuover gli autoanticorpi e lascer gli anticorpi diretti contro la maggior parte degli antigeni gruppoematici. La specificit degli anticorpi, dopo assorbimento, potr essere confermata dalle analisi condotte con un pannello
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possibile la soluzione del lavaggio finale, per prevenire la diluizione del siero. 5. Per ognuno dei tre campioni di eritrociti, mescolare un volume dei globuli rossi trattati, con un volume del siero del paziente, incubare a 37 C per 30 minuti, rimescolando saltuariamente. 6. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per circa 5 minuti e raccogliere il siero sovranatante. 7. Testare i tre campioni di siero assorbito contro campioni dei globuli rossi (non trattati) che si sono usati per lassorbimento. Se presente reattivit, ripetere le procedure illustrate dal punto 5 al punto 7 con campioni freschi di emazie trattate sino a che la reattivit scomparir. I tre campioni di siero assorbito possono, poi, essere testati contro un pannello di emazie test e i risultati paragonati fra loro per dimostrare la persistenza dellattivit alloanticorpale e la sua rimozione. Per lassorbimento allogenico vedi Capitolo 20. Note 1. Se lautoanticorpo molto potente, si dovrebbero preparare tre o pi aliquote delle emazie per lassorbimento. Se il primo assorbimento stato inefficace, luso di una maggior proporzione di emazie per il siero o leluato pu essere efficace. 2. I globuli rossi per lassorbimento dovrebbero essere perfettamente impaccati per allontanare la soluzione salina, che potrebbe diluire gli anticorpi rimasti nel siero o nelleluato. 3. Durante lincubazione, agitare la miscela siero/emazie per ottenere la massima superficie di contatto. 4. Un indizio visibile dellefficacia dellassorbimento fornito dallagglutinazione totale (clumping) delle emazie trattate con enzimi o con ZZAP, quando vengono mescolate con il siero, soprattutto quando sono presenti anticorpi potenti. 5. Come consiglio, quando la reattivit del siero iniziale di 1+ nel TAI-LISS, di solito sufficiente un solo assorbimento. Quando la reattivit di 2+ o di 3+, saranno, in generale,
richiesti due o tre assorbimenti. Effettuare pi di quattro autoassorbimenti aumenta il rischio di diluire la reattivit alloanticorpale. 6. Se lassorbimento con globuli rossi trattati con enzimi o con ZZAP non ha effetto, si pu tentare un assorbimento con emazie non trattate.
Bibliografia 1. Branch DR, Petz LD. A new reagent (ZZAP) having multiple applications in immunohematology. Am J Clin Pathol 1982;78:161-7. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994.
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Metodo 4.11 Assorbimento allogenico con un campione di una sola cellula trattata con enzimi o con ZZAP
Principio Se sono noti o possono essere determinati i fenotipi Rh e Kidd di un malato trasfuso di recente, lattivit autoanticorpale pu essere rimossa dal siero, eseguendo un assorbimento su un singolo campione di emazie allogeniche, cos che il siero possa essere analizzato per la presenza di alloanticorpi. Queste emazie dovrebbero avere gli stessi fenotipi Rh e Kell del paziente; esse possono essere trattate con enzimi o con ZZAP per denaturare gli antigeni (vedi Capitolo 19). Questo metodo una versione semplificata di quello precedente, ma si dovrebbe impiegare soltanto quando sono conosciuti i fenotipi Rh e Kidd del paziente (vedi la nota). Campioni Siero, eluato o plasma da analizzare. Reagenti 1. Papaina all1% attivata da cisteina o ficina all1% (vedi Metodi 3.5.1 e 3.5.2). 2. ZZAP (papaina o ficina pi DTT 0,2 M). Vedi Metodo 4.9.
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3. Globuli rossi ABO compatibili, con gli stessi fenotipi Rh e Kidd del paziente. Essi possono essere anche emazie test o possono provenire da altri campioni eritrocitari dei quali vi sia una sufficiente disponibilit. Procedimento 1. Lavare, con abbondante fisiologica, i globuli rossi scelti e centrifugare per impaccarli. 2. Aggiungere un volume della soluzione di enzima scelto o due volumi di ZZAP a un volume di questi globuli rossi impaccati. Invertire pi volte la provetta per miscelare bene. 3. Incubare a 37 C per 15 minuti (enzimi) o per 30 minuti (ZZAP). Durante lincubazione mescolare saltuariamente. 4. Lavare le emazie tre volte con fisiologica. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per almeno 5 minuti e allontanare il pi possibile la soluzione dellultimo lavaggio per prevenire la diluizione del siero. 5. A un volume di emazie trattate, aggiungere un eguale volume del siero del paziente, mescolare e incubare a 37 C per 30 minuti, miscelando saltuariamente. 6. Centrifugare da 900 a 1.000 x g per circa 5 minuti e separare il siero sopranatente. 7. Testare il siero assorbito con globuli rossi (non trattati) eguali a quelli usati per lassorbimento. Se persiste una reattivit, ripetere le procedure illustrate dal punto 5 al punto 7 con aliquote fresche di emazie trattate sino a che il siero non risulti pi reattivo. Nota Lantigene s pu non essere denaturato dal trattamento di un particolare enzima o dalla soluzione di ZZAP. Pu essere necessario prendere in considerazione la situazione dellantigene s delle emazie impiegate per assorbire.
lassorbimento di anticorpi da parte di globuli rossi non trattati. Analizzare unaliquota assorbita contro un pannello di emazie test pu permettere lidentificazione della specificit degli anticorpi che restano dopo un assorbimento. Questo metodo pu essere impiegato sia per assorbimenti autologhi sia per quelli allogenici. Campioni Siero o plasma da esaminare. Reagenti 1. PEG al 20% (20 g di PEG di 3.350 di peso molecolare in 100 mL di PBS a pH 7,3) o PEG di provenienza commerciale. 2. Globuli rossi autologhi o allogenici (ABO compatibili), dei quali sia noto il fenotipo. Procedimento 1. Lavare, almeno tre volte, aliquote di globuli rossi con abbondante fisiologica e centrifugare da 5 a 10 minuti a 1.000 x g. Rimuovere tutta la soluzione salina residua. 2. A 1 volume (per esempio, 1 mL) di eritrociti aggiungere 1 volume di siero e un volume di PEG. Mescolare bene e incubare a 37 C per 15 minuti. 3. Centrifugare la mescolanza (siero/PEG/emazie) per 5 minuti e raccogliere la mescolanza siero assorbito/PEG. 4. Per analizzare il siero assorbito, aggiungere 4 gocce di siero a 1 goccia di emazie test, incubare per 15 minuti a 37 C ed eseguire un TAI utilizzando un siero anti-IgG. richiesto questo maggior volume (4 gocce) di siero assorbito per tener conto della sua diluizione da parte del PEG. Vedi le note. 5. Per verificare lavvenuto assorbimento, testare il siero assorbito con emazie identiche a quelle usate nellassorbimento. Se il test positivo, ripetere lassorbimento, aggiungendo al siero assorbito unaliquota di emazie fresche, ma non aggiungere ulteriore PEG. Se il test negativo, analizzare il siero assorbito con un panel di emazie test.
Metodo 4.12 Assorbimento con polietilenglicole

Principio Il polietilenglicole (PEG) favorisce
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Note 1. Se si desidera denaturare alcuni antigeni, i globuli rossi da utilizzare nellassorbimento possono essere preventivamente modificati per via chimica (per esempio con enzimi o con ZZAP). 2. Le emazie che assorbono dovrebbero essere totalmente impaccate per allontanare tutta la soluzione salina, che potrebbe diluire gli anticorpi rimasti nel siero. 3. Analizzare il siero assorbito nello stesso giorno nel quale si proceduto allassorbimento. Si pu perdere, durante la conservazione di un siero assorbito con PEG, la reattivit di anticorpi deboli, probabilmente per la precipitazione di proteine dopo conservazione a 4 C. 4. Quantunque molti laboratori usino con successo la metodica di assorbimento con PEG, alcuni operatori hanno riferito di indebolimenti della reattivit anticorpale o della sua scomparsa, se si fanno comparazioni con altre tecniche. Per contrastare questo potenziale indebolimento, alcuni operatori usano 6 gocce del siero assorbito con PEG. 5. Quando si usa PEG, pu non intervenire lagglutinazione delle emazie che assorbono. Non vi , quindi, nessun indizio visibile dellefficacia del processo di assorbimento. Come consiglio, quando la reattivit di un siero di 1+ in TAI-LISS, di solito sufficiente un solo assorbimento. Anticorpi con reattivit da 2 a 3+ richiedono, in genere, due assorbimenti per essere rimossi.
Metodo 4.13 Il test di Donath-Landsteiner

Principio Gli autoanticorpi IgG che causano lemoglobinuria parossistica a frigore (EPF) agiscono, in vitro , come emolisine bifasiche. Questi autoanticorpi IgG si legano ai globuli rossi a basse temperature e, quando il test viene portato a 37 C, si attiva il complemento e interviene la lisi eritrocitaria. I pazienti per i quali si pu prendere in considerazione questo test, presentano un TAD positivo, per presenza di C3 sulle emazie. Presentano emoglobinemia o emoglobinuria (o entrambe) ma nessuna evidenza di attivit autoanticorpale nel siero o nelleluato ottenuto dalle emazie positive al TAD. Per una discussione sullEPF, vedi Capitolo 20. Campioni Siero separato da un campione di sangue fresco, conservato a 37 C. Reagenti 1. Pool di sieri normali freschi, noti per non possedere anticorpi inattesi, da usarsi come fonte di complemento. 2. Sospensione al 50% di globuli rossi lavati, di gruppo O, che esprimono lantigene P, per esempio emazie test. Procedimento 1. Etichettare tre serie di tre provette 10 x 75 mm, come segue: A1, A2, A3; B1, B2, B3; C1, C2, C3. 2. Alle provette 1 e 2 di ciascuna serie aggiungere 10 volumi (per esempio 10 gocce) del siero del paziente. 3. Alle provette 2 e 3 di ciascuna serie, aggiungere 10 volumi di siero normale fresco. 4. A tutte le provette, aggiungere un volume della sospensione al 50% di emazie P positive lavate e mescolare bene. 5. Sistemare le provette A in un bagnomaria a ghiaccio fondente per 30 minuti, poi portarle a 37 C per 1 ora. 6. Sistemare le tre provette B in un bagnomaria
Bibliografia 1. Leger RM, Garratty G. Evaluation of methods for detecting alloantibodies underlying warm autoantibodies. Transfusion 1999;39:11-6. Leger RM, Ciesielski D, Garratty G. Effect of storage on antibody reactivity after adsorption in the presence of polyethylene glycol. Transfusion 1999;39:1272-3.
2.
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a ghiaccio fondente e l mantenerle per 90 minuti. 7. Sistemare le tre provette C a 37 C e l mantenerle per 90 minuti. 8. Centrifugare tutte le provette ed esaminare, per emolisi, il liquido sovranatante. Interpretazione Si considera positivo un test di DonathLandsteiner, quando il siero del paziente, con o senza aggiunta di complemento, determina emolisi nelle provette tenute prima a ghiaccio fondente e poi a 37 C (provette A1 e A2), mentre non vi emolisi nelle provette mantenute sempre a 37 C (provette C1 e C2) o in quelle mantenute sempre nel ghiaccio fondente (provette B1 e B2). Le provette A3, B3 e C3 servono come controllo dei sieri normali come fonte di complemento e non dovrebbero mostrare emolisi. Note 1. La natura bifasica dellemolisine associate allEPF richiede che il siero incubato con le emazie sia, per prima cosa, mantenuto a freddo (cio nel ghiaccio fondente) e, poi, portato a 37 C. 2. Per la dimostrazione dellanticorpo essenziale il complemento. Dato che i pazienti affetti da EPF possono possedere bassi livelli di complemento, si deve includere siero fresco normale nel medium di reazione, quale fonte di complemento. 3. Per non perdere lanticorpo, prima del test, a causa di un autoassorbimento a freddo, il sangue del paziente dovrebbe coagulare a 37 C e si dovrebbe separare il siero dal coagulo sempre alla stessa temperatura. 4. Se sono disponibili soltanto limitate quantit di sangue (per esempio, in caso di bambini), allestire le provette A1, A2 e A3 e C1, C2; se la quantit soltanto per due test (cio, 20 gocce) allestire le provette A2, A3 e C2. 5. Per dimostrare la specificit P dellanticorpo di Donath-Landsteiner, si dovrebbero testare globuli rossi ABO compatibili di fenotipo p in
una seconda serie di provette A1, A2 e A3. Non dovrebbe intervenire nessuna emolisi, confermando, quindi, la specificit P dellanticorpo.
Bibliografia 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994. Dacie JV, Lewis SM. Practical hematology. 7th ed. New York: Churchill Livingstone, 1991:500-1.
2.
Metodo 4.14. Individuazione di anticorpi anti-penicillina o anti-cefalosporine analizzando globuli rossi trattati con farmaci
Principio Per una discussione sui meccanismi che determinano TAD positivi farmaco-indotti, vedi Capitolo 20. Il medicinale dovrebbe essere, per quanto possibile, quello stesso somministrato al paziente. Per medicinali diversi dalla penicillina o dalle cefalosporine, fare riferimento ai lavori pubblicati pertinenti per i metodi impiegati per trattare i globuli rossi. Campioni Siero o plasma ed eluato (pi soluzione dellultimo lavaggio) da analizzare. Reagenti 1. Tampone al sodio barbital 0,1 M a pH da 9,6 a 9,8, preparato sciogliendo 2,06 g di sodio barbital in 80 mL di acqua distillata o deionizzata. Aggiustare in pH fra 9,6 e 9,8 con HCl 0,1 N. Portare il volume totale a 100 mL, Conservare fra 2 e 8 C. 2. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 3. Farmaco: per esempio, penicillina, cefalosporina. 4. Globuli rossi di gruppo O lavati e impaccati. 5. Sieri o plasmi normali. 6. Emazie rivestite da IgG.
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Procedimento 1. Per globuli rossi trattati con penicillina, sciogliere 600 mg di penicillina in 15 mL di tampone al sodio barbital. Lalto pH di questo tampone ottimale, ma se non disponibile tampone al barbital, si pu usare PBS a pH 7,3. Aggiungere 1 mL di globuli rossi. In una provetta separata, preparare le emazie di controllo, aggiungendo 1 mL di globuli rossi non trattati con il farmaco a 15 mL dello stesso tampone. Incubare entrambe le provette per 1 ora a temperatura ambiente, mescolando saltuariamente. Lavare tre volte con fisiologica e conservare in PBS fra 2 e 8 C sino a una settimana. Vedi nota 1. 2. Per i globuli rossi trattati con cefalosporine, sciogliere 400 mg del farmaco in 10 mL di PBS a pH 7,3. Aggiungere 1 mL di emazie. In una provetta separata, preparare le emazie di controllo, aggiungendo 1 mL di globuli rossi non trattati con il farmaco a 10 mL di PBS. Incubare entrambe le provette per 1 ora a 37 C, mescolando saltuariamente. Lavare tre volte con fisiologica e conservare in PBS, fra 2 e 8 C, sino a una settimana. Vedi note 1 e 2. 3. Mescolare 2 o 3 gocce di ogni campione in esame (siero, eluato e soluzione dellultimo lavaggio) e dei controlli con 1 goccia di sospensione al 5% in fisiologica dei globuli rossi trattati con i farmaci. 4. In parallelo, controllare ogni campione e i controlli con emazie non trattate. Vedi note 3 e 4. 5. Incubare i test, per 1 ora, a 37C. Centrifugare ed esaminare per emolisi e agglutinazione. Registrare i risultati. 6. Lavare le emazie quattro volte in fisiologica e testarle con il TAI, usando antiglobuline polispecifiche o anti-IgG. Centrifugare ed esaminare per agglutinazione. Registrare i risultati. 7. Confermare la validit dei test negativi, aggiungendo le emazie rivestite da IgG. Interpretazione La reattivit (emolisi, agglutinazione e/o positivit al TAI) presentata dalle emazie trattate
ma assente da quelle non trattate, indica che sono presenti anticorpi farmaco-indotti (vedi note 3 e 4). Non si osserver emolisi nei test condotti sul plasma o sulleluato. Gli anticorpi indotti da penicillina o da cefalotina possono cross-reagire con laltro farmaco (cio gli anticorpi anti-penicillina reagire con emazie trattate con cefalotina e viceversa). Anticorpi diretti contro altre cefalosporine possono reagire con emazie trattate con cefalotina. bene trattare i globuli rossi con il farmaco sospettato. I risultati negativi senza un controllo positivo possono soltanto voler dire che non si sono trovati anticorpi farmaco-indotti. Il farmaco pu o non pu essersi legato alle emazie test. Note 1. Il volume dei globuli rossi trattati con il farmaco pu essere scalato se il rapporto di 40 mg/mL della soluzione con il medicinale costante rispetto ai globuli rossi; per esempio: 120 mg di penicillina in 3 mL di tampone al barbital pi 0,2 mL di globuli rossi oppure 100 mg di cefalosporina in 2,5 mL di PBS pi 0,25 mL di emazie1. 2. Per ricoprire efficacemente i globuli rossi, le cefalosporine non richiedono un pH alto. Infatti, un pH inferiore (da 6 a 7) diminuisce lassorbimento aspecifico di proteine che si osserva quando si utilizzano soluzioni tampone ad alto pH. Un minor assorbimento aspecifico di proteine si otterr quando si usa un tampone a pH 6,0, ma questo porta a unadesione leggermente minore da parte del farmaco. 3. Utilizzare pool di sieri normali e PBS come controlli negativi e, se disponibile, un campione noto per contenere un anticorpo diretto contro il farmaco pertinente come controllo positivo. 4. Per controllare lassorbimento proteico aspecifico e lagglutinazione non specifica che si osserva talora con sieri normali in presenza di alcune cefalosporine (come, per esempio, la cefalotina), analizzare un siero normale e il siero in esame a diluizione 1 a 20 in PBS. I sieri normali, diluiti 1 a 20, di norma non
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reagiscono in maniera aspecifica. Di conseguenza, una reattivit del siero in esame diluito con emazie trattate con il farmaco ma non con cellule non trattate indica che si in presenza di anticorpi farmaco-indotti. 5. Quando si analizzano globuli rossi trattati con cefotetan (una cefalosporina), necessario impiegare il siero diluito 1 a 100 in PBS per prevenire risultati falsamente positivi. In aggiunta alladesione non specifica di proteine alle emazie trattate con cefotetan, alcuni sieri normali sembrano possedere anticorpi naturali anti-cefotetan2, che reagiscono debolmente alla diluizione 1 a 20 di tali sieri. I casi di anemia immunoemolitica indotta da cefotetan si accompagnano a titoli anticorpali molto alti (per esempio, titolo in TAI pari a 16.000)3. 6. Il 30% circa dei pazienti con anticorpi anticefotetan ha anche anticorpi3 non indotti dal farmaco. In questi casi, il siero e/o leluato, se analizzati non diluiti, possono reagire con globuli rossi trattati e non trattati con il farmaco. 7. Il controllo con la soluzione dellultimo lavaggio pu, talora, reagire con emazie trattate con cefotetan se sono presenti anticorpi anticefotetan, qualunque sia la soluzione di lavaggio utilizzata (soluzione commerciale del kit per leluizione acida, LISS a 4 C, PBS a 4 C) o il numero dei lavaggi effettuati3. 8. Preparare le soluzioni dei farmaci subito prima del loro impiego. 9. Le emazie trattate con il farmaco possono essere conservate in PBS a 4 C per una settimana; tuttavia, ci pu essere qualche riduzione delladesione del farmaco durante la conservazione. I globuli rossi trattati e non trattati con il farmaco possono essere conservati anche congelati. 10. Quando non si rinvengono anticorpi diretti contro emazie trattate con il farmaco, eseguire il test per gli immunocomplessi (vedi Metodo 4.15). Gli anticorpi diretti contro alcune cefalosporine (per esempio, il ceftriaxone) non reagiscono con le emazie trattate con il farmaco.
Bibliografia 1. 2. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemias. 2nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2004. Arndt P, Garratty G. Is severe immune hemolytic anemia, following a single dose of cefotetan, associated with the presence of naturally occurring anti-cefotetan? (abstract) Transfusion 2001;41(Suppl):24S. Arndt PA, Leger RM, Garratty G. Serology of antibodies to second- and third-generation cephalosporins associated with immune hemolytic anemia and/or positive direct antiglobulin tests. Transfusion 1999;39:1239-46.
3.
Metodo 4.15 Dimostrazione della formazione di immunocomplessi indotti da farmaci

Principio Per una discussione sul meccanismo che determina la formazione di immunocomplessi farmaco-indotti, vedi Capitolo 20. Campioni Sieri di pazienti. Reagenti 1. Farmaco in esame, nella stessa forma (polvere, compressa, capsula) somministrata al paziente. 2. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 3. Siero fresco normale, conosciuto per non possedere anticorpi inattesi, come fonte di complemento. 4. Pool di globuli rossi di gruppo O, in sospensione al 5%, di cui unaliquota trattata con enzimi proteolitici (vedi Metodo 3.5.6) e una non trattata. 5. Siero antiglobuline polispecifico. 6. Emazie rivestite da IgG. Procedimento 1. Preparare una soluzione (1 mg/mL) in PBS del farmaco, Centrifugare per eliminare eventuali particelle e aggiustare il pH del liquido sovranatante a circa 7 con NaOH 1 N
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o con HCl 1 N, se il pH sotto 5 o sopra 8. 2. Etichettare due serie di provette con le miscele riportate qui di seguito: a. siero del paziente + farmaco; b. siero del paziente + PBS; c. siero del paziente + complemento (siero normale) + farmaco; d. siero del paziente + complemento (siero normale) + PBS; e. siero normale + farmaco; f. siero normale + PBS. 3. Aggiungere due volumi (per esempio, 2 gocce) di ciascuna miscela (per esempio, 2 gocce di siero + 2 gocce di farmaco) allappropriata provetta. 4. Aggiungere 1 goccia della sospensione eritrocitaria al 5% di emazie O non trattate alla prima serie di provette. Aggiungere 1 goccia della sospensione eritrocitaria al 5% di emazie O trattate con enzimi alla seconda serie di provette. 5. Mescolare e incubare a 37 C da 1 a 2 ore, agitando con delicatezza, periodicamente. 6. Centrifugare, esaminare per emolisi e agglutinazione, registrare i risultati. 7. Lavare le emazie quattro volte con fisiologica e testare con antiglobulina polispecifica. 8. Centrifugare, esaminare per agglutinazione e registrare i risultati. 9. Confermare la validit dei test negativi, aggiungendo le emazie rivestite da IgG. Interpretazione Lemolisi, lagglutinazione diretta o una positivit al TAI possono avvenire insieme o separatamente. La reattivit dei test che contengono il siero del paziente al quale stato aggiunto il farmaco e la mancata reattivit nei test di controllo che contengono PBS al posto del farmaco, indicano che presente lanticorpo anti-farmaco. Vedi nota 4. Note 1. Un farmaco pu sciogliersi molto pi facilmente dopo unincubazione a 37 C e dopo vigorosi scuotimenti della soluzione. Se il farmaco in compresse, sbriciolarlo in un mortaio con un pestello e rimuovere qualsiasi
2.
3.
4.
5.
6.
materiale di rivestimento, prima di aggiungere PBS. Non tutti i farmaci si sciolgono completamente in PBS. Consultare il produttore o pubblicazioni di riferimento (quale lIndice Merck) sulla solubilit del farmaco in questione. Precedenti pubblicazioni su anemie immunoemolitiche indotte dal farmaco in esame possono fornire informazioni su come preparare la soluzione del farmaco. Si dovrebbe includere, quale controllo positivo, siero/plasma, noto per contenere anticorpi specifici per il farmaco in esame (ovviamente, se disponibile). I test senza farmaco aggiunto possono essere positivi se sono presenti, nel campione del paziente, autoanticorpi o complessi immuni anti-farmaco circolanti. Una reattivit autoanticorpale potrebbe persistere nel tempo, anche quando i complessi immuni circolanti sono transitori. Le analisi condotte con globuli rossi trattati con enzimi e con laggiunta di siero normale fresco (quale fonte di complemento), possono aumentare la sensibilit dellesame. Se gli esami per gli anticorpi farmaco-indotti ricercati con il metodo degli immunocomplessi non sono informativi, prendere in considerazione il successivo Metodo 4.16.
Bibliografia 1. Petz LD, Garratty G. Immune hemolytic anemias. 2 nd ed. Philadelphia: Churchill Livingstone, 2004.
Metodo 4.16 Dimostrazione ex vivo di complessi farmaco anti-farmaco

Principio Gli immunocomplessi farmaco/anti-farmaco possono attivare il complemento e causare emolisi in vivo. Questi immunocomplessi si possono
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dimostrare con analisi sierologiche in presenza del farmaco, ma per alcuni farmaci (in particolare per la nomifensina), gli anticorpi possono essere diretti contro i loro prodotti metabolici piuttosto che contro il farmaco nativo. Come sorgente di questi metaboliti si possono utilizzare il siero o le urine di soggetti che hanno ingerito i farmaci a un livello terapeutico e si prestano volontariamente. Vedi nota 1. Questa procedura viene utilizzata per investigare sulle emolisi immuni farmaco-indotte, soprattutto quando il metodo precedente non stato informativo. Campioni Sieri dei pazienti. Reagenti 1. Siero antiglobuline polispecifico. 2. Metaboliti del farmaco da soggetti che lo hanno ricevuto. Vedi nota 2. a. Siero dei volontari (SV) ottenuto subito prima (SV0), dopo 1 ora (SV1) e dopo 6 ore (SV6) dalla somministrazione del farmaco. Suddividere i sieri in aliquote da 1 mL e conservarle per poche ore da 2 a 8 C o conservarle congelate a 20 C o a temperature inferiori, fino al momento delluso. b. Urine dei volontari (UV) ottenute immediatamente prima (UV0) dopo 1 ora (UV1), dopo 3 ore e mezza (UV3,5), dopo 7 ore (UV7), e dopo 16 ore (UV16) dalla somministrazione del farmaco. Suddividere le urine in aliquote da 1 mL e conservarle da 2 a 8 C per poche ore o conservarle congelate a 20 C o a temperature inferiori, fino al momento delluso. 3. Siero normale fresco, noto per non contenere anticorpi inattesi, quale sorgente di complemento. 4. PBS a pH 7,3 (vedi Metodo 1.7). 5. Pool di emazie di gruppo O, lavate tre volte in fisiologica e risospese al 5% in PBS. 6. Pool di emazie di gruppo O trattate con enzimi e risospese al 5% in fisiologica.
7. Emazie rivestite da IgG. Procedimento 1. Per ogni campione di siero o di urina dei volontari, etichettare due serie di provette contenenti le miscele indicate di seguito: a. siero del paziente + siero del volontario (SV) o urina del volontario (UV); b. siero del paziente + PBS; c. siero del paziente + complemento (siero fresco normale) + SV (o UV); d. siero del paziente + complemento + PBS. e. complemento + SV (o UV); f. complemento + PBS. 2. Aggiungere, alla provetta appropriata, 0,1 mL delle predette miscele. 3. Aggiungere 1 goccia della sospensione al 5% in fisiologica delle emazie di gruppo O non trattate con enzimi alla prima serie di provette. Aggiungere 0,1 mL della sospensione al 5% in fisiologica delle emazie trattate con enzimi alla seconda serie di provette. 4. Mescolare i contenuti di ciascuna provetta e incubare a 37 C da 1 a 2 ore, miscelando periodicamente. 5. Centrifugare, esaminare per agglutinazione e/o emolisi, e registrare i risultati 6. Lavare le emazie per quattro volte in fisiologica ed eseguire un TAI con siero antiglobuline polispecifico. 7. Centrifugare, esaminare per lagglutinazione, registrare i risultati. 8. Confermare la validit dei risultati negativi con laggiunta delle emazie rivestite da IgG: Interpretazione Lemolisi, lagglutinazione diretta o la positivit al TAI in ognuna delle provette che contengono il siero in esame o il SV o lUV, e lassenza di reattivit in tutte le provette di controllo, indicano la presenza di un anticorpo diretto contro i metaboliti del farmaco in esame. Note 1. Si deve ottenere lapprovazione del Comitato Etico della struttura istituzionale per utilizzare volontari allo scopo di ottenere da loro i
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metaboliti del farmaco. 2. I tempi indicati per la raccolta dei campioni di urine sono quelli ottimali per i metaboliti della nomifensina; altri farmaci possono richiedere tempi diversi. 3. Il complemento pu essere omesso nella fase 1 delle procedure, se i campioni di SV sono stati tenuti congelati o utilizzati entro 8 ore dalla raccolta. 4. Condurre i test con globuli rossi trattati con enzimi e laggiunta di siero fresco normale come sorgente di complemento, possono
aumentare la sensibilit dei test.
Bibliografia 1. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994. Salama A, Mueller-Eckhardt C. The role of metabolite-specific antibodies in nomifensinedependent immune hemolytic anemia. N Engl J Med 1985;313:469-74.
2.
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Metodi sezione 5: Malattia emolitica del feto e del neonato
Metodi sezione 5
Malattia emolitica del feto e del neonato
Metodo 5.1 Test delle rosette per lemorragia feto-materna

Principio Questo test individua le emazie D positive nel sangue di una donna D negativa, il cui feto o il cui neonato sia D positivo. Quando al sangue materno che contiene globuli rossi fetali D positivi, si aggiunge un siero anti-D, le emazie fetali si rivestono del reagente. Se, successivamente, si aggiungono ulteriori emazie D positive, si formano con facilit rosette visibili, con numerosi globuli rossi che si raggruppano intorno ad ogni emazia rivestita dallanti-D. Bench il numero delle rosette sia, soltanto grossolanamente, proporzionale al numero delle emazie D positive presenti nella soluzione originale, il test d soltanto informazioni qualitative circa lesistenza di una miscela fra globuli rossi materni e globuli rossi fetali. I campioni con un risultato positivo dovrebbero essere sottoposti ad altri test, in grado di quantificare il numero delle cellule fetali. La procedura di eluizione acida (illustrata di seguito) e la citometria a flusso rappresentano scelte accettabili. Se si dispone di un test commerciale, si debbono seguire le istruzioni contenute negli inserti. Campione Una sospensione al 2-5% in fisiologica di emazie lavate provenienti dalla madre.
Reagenti Sono disponibili preparati commerciali. Per preparare in proprio i reagenti, si pu seguire quanto illustrato di seguito: 1. controllo negativo: una sospensione, al 2-5% in fisiologica, di emazie lavate D negative; 2. controllo positivo: una sospensione, al 2-5% in fisiologica, di una miscela, che contenga approssimativamente 0,6% di emazie D positive e 99,4% di emazie D negative. Tale controllo positivo si pu preparare aggiungendo una goccia di una sospensione, al 2-5% in fisiologica, di emazie D positive di controllo a 15 gocce di una sospensione dal 2 al 5% di emazie D negative di controllo. Mescolare bene e, successivamente, aggiungere una goccia di questa miscela a 9 gocce di una sospensione al 2-5%, di emazie D negative. Mescolare bene; 3. globuli rossi rivelatori: una sospensione, al 2-5%,di emazie di gruppo O, R2R 2. Si possono usare o globuli rossi trattati con enzimi o globuli rossi non trattati, risospesi in un mezzo potenziante; 4. sieri anti-D modificati chimicamente o in mezzo iperproteico. Alcuni sieri monoclonali o policlonali, miscelati, non sono adatti per questo test. Quelli scelti dovrebbero essere valutati idonei, prima di introdurli nella procedura del test. Procedimento 1. In ciascuna di tre provette, aggiungere 1 goccia (o il volume indicato nelle istruzioni dei produttori) di siero anti-D.
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2. Aggiungere una goccia di emazie materne, una di emazie del controllo negativo e una di emazie del controllo positive alle appropriate provette, debitamente etichettate. 3. Incubare, da 15 a 30 minuti, a 37 C o come specificato nelle istruzioni dei produttori. 4. Lavare le sospensioni cellulari almeno 4 volte con abbondante fisiologica per rimuovere tutto il siero anti-D che non si legato. Decantare completamente la soluzione dellultimo lavaggio. 5. Al sedimento secco di emazie, aggiungere una goccia di globuli rossi rivelatori e mescolare bene per ottenere una risospensione accurata. 6. Centrifugare le provette per 15 secondi fra 900 e 1.000 x g. 7. Risospendere il sedimento cellulare ed esaminare la sospensione eritrocitaria al microscopio, a 100-150 ingrandimenti. 8. Leggere almeno 10 campi e contare il numero di rosette eritrocitarie presenti in ogni campo. Interpretazione Lassenza di rosette indica un risultato negativo. Quando si impiegano globuli rossi rivelatori trattati con enzimi, si pu riscontrare, in campioni negativi, fino a una rosetta in tre campi. Con globuli rossi rivelatori non trattati con enzimi, risospesi in un mezzo rafforzante, si possono riscontrare, in campioni negativi, sino a sei rosette in cinque campi esaminati. La presenza di un numero superiore di rosette indica un risultato positivo e il campione dovrebbe essere analizzato con un metodo in grado di precisare la quantit di cellule fetali presenti. La presenza di rosette o di agglutinati nella provetta contenente il controllo negativo sta a indicare un lavaggio non adeguato dopo lincubazione, che consente al siero anti-D rimasto di agglutinare i globuli rossi rivelatori D positivi. Un risultato fortemente positivo si evidenzia con emazie di una donna che abbia un fenotipo D debole piuttosto che D negativo. Una massiccia emorragia feto-materna (EFM) pu determinare un quadro difficilmente distinguibile da quello indotto da un fenotipo D debole; in tal caso, si dovrebbe condurre un test quantitativo.
Se i globuli rossi del neonato risultano avere un fenotipo D debole, un risultato negativo sul campione materno deve essere interpretato con molta cautela. In questa situazione, si dovrebbe effettuare un esame che non sia in relazione con lespressivit del D.
Bibliografia 1. Sebring ES, Polesky HF. Detection of fetal maternal hemorrhage in Rh immune globulin candidates. Transfusion 1982;22:468-71.
Metodo 5.2 Test di eluizione acida (Test di Kleihauer-Betke, modificato)

Principio Lemoglobina fetale resiste alleluizione acida, mentre lemoglobina di un adulto viene eluita. Quando uno striscio sottile viene esposto a un tampone acido, lemoglobina di emazie di adulto si disperde nel tampone e restano soltanto gli stromi eritrocitari. Le emazie fetali trattengono la loro emoglobina e possono essere riconosciute dopo una colorazione. Si pu calcolare la quantit approssimativa dellEFM dalla percentuale di emazie fetali rilevabili nello striscio di sangue materno. Campione Campione di sangue intero materno, scoagulato. Reagenti Sono disponibili, in commercio, kit di reagenti pronti. Per prepararli in proprio si pu seguire quanto illustrato di seguito: 1. soluzione madre A (acido citrico 0,1 M). Diluire 21,0 g di C6H8O 7 H 2O in 1 L di acqua distillata. Conservare in frigorifero; 2. soluzione madre B (fosfato di sodio 0,2 M). Diluire 53,6 g di Na2HPO4 7 H2O in 1 L di acqua distillata. Conservare in frigorifero;
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3. tampone di McIlvaine a pH 3,2. Aggiungere 75 mL di soluzione madre A a 21 mL di soluzione madre B. Preparare una soluzione fresca per ogni test. La miscela dei due tamponi dovrebbe essere portata a temperatura ambiente o a 37 C; 4. eritrosina B allo 0,5% in acqua; 5. ematossilina di Harris (filtrata); 6. alcol etilico all80%; 7. campione di controllo positivo: dieci parti di un campione di sangue scoagulato di adulto mescolato a una parte di sangue di cordone ombelicale ABO compatibile; 8. campione di controllo negativo: sangue scoagulato di adulto. Procedimento 1. Preparare sottili strisci del sangue in esame, diluendolo con un eguale volume di fisiologica. Seccare allaria. 2. Fissare gli strisci con alcol etilico all80%, per 5 minuti. 3. Lavare gli strisci con acqua distillata. 4. Immergere gli strisci nel tampone di McIlvaine a pH 3,2 per 11 minuti a temperatura ambiente o per 5 minuti a 37 C. La reazione sensibile alla temperatura. 5. Lavare gli strisci con acqua distillata. 6. Immergerli in eritrosina B, per 5 minuti. 7. Lavarli completamente in acqua distillata. 8. Immergerli in ematossilina di Harris, per 5 minuti. 9. Esaminare gli strisci, al microscopio con obiettivi a secco (40 ingrandimenti) e contare un totale di 2.000 globuli rossi, registrando il numero di emazie fetali osservate. 10. Calcolare la percentuale di emazie fetali sul totale di quelle contate. Interpretazione 1. Le emazie fetali appaiono di color rosa brillante e sono rifrangenti, mentre le emazie di adulto normale appaiono come ombre vuote. 2. Il fattore di conversione usato per indicare il volume (mL di sangue intero) dellEFM la percentuale di emazie fetali osservate su 50 campi.
Nota Laccuratezza e la precisione di questa metodica sono scarse e la decisone circa le dosi di immunoglobuline Rh (IgRh) da somministrare in caso di massive EFM deve essere presa con molta cautela. Se vi qualche dubbio circa la necessit di una dose aggiuntiva di IgRh, preferibile somministrarla per evitare un trattamento deficitario (vedi Tabella 23.1 per i dosaggi).
Bibliografia 1. Sebring ES. Fetomaternal hemorrhage - incidence and methods of detection and quantitation. In: Garratty G, ed. Hemolytic disease of the newborn. Arlington, VA: AABB, 1984:87-118.
Metodo 5.3 Titolazione di anticorpi per la precoce individuazione di una malattia emolitica del feto e del neonato
Principio La titolazione degli anticorpi una metodica semiquantitativa che determina la loro concentrazione. Si prepara una serie di diluizioni per raddoppio del siero in esame al fine analizzare lattivit anticorpale. Il titolo rappresentato dal reciproco della diluizione pi alta che d una reattivit di grado 1+ (cio, se 1 su 128 di diluizione, il titolo uguale a 128). In gravidanza, la titolazione degli anticorpi viene effettuata per identificare le donne con un livello anticorpale significativo che possono comportare linsorgenza di una malattia emolitica del feto e del neonato (MEFN). In caso di titoli anticorpali bassi, la titolazione serve come linea basale per comparazioni fra i titoli che si osserveranno nel corso della gravidanza. La titolazione di anticorpi non Rh dovrebbe essere eseguita dopo aver discusso con lostetrico luso dei dati per una corretta gestione clinica della gravidanza. La significativit dei titoli si stabilita, in modo
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abbastanza sufficiente, soltanto per gli anticorpi anti-D (usando le tecniche in fisiologica). Campione Un mL di siero (che si sospetta contenere anticorpi antieritrocitari inattesi, potenzialmente significativi). Se possibile, analizzare il siero in esame in parallelo con il campione precedentemente studiato nel corso della gravidanza in atto. Materiali 1. Siero antiglobuline IgG; non vi necessit di sieri specifici per le catene pesanti. 2. Soluzione salina isotonica. 3. Pipette volumetriche, o di tipo consimile, che dispensino da 0,1 a 0,5 mL, con puntali a perdere. 4. Emazie di gruppo O in sospensione al 2% (vedi nota 1, circa la scelta delle emazie per il test). Evitare luso di emazie Bg positive, dato che possono fornire valori falsamente elevati, in particolare con sieri di multipare. 5. Globuli rossi rivestiti da IgG. Controlli di qualit 1. Analizzare, in parallelo, il campione attuale con quello precedente. 2. Preparare le diluizioni usando, per ogni provetta, pipette diverse. Non farlo fornir titoli erroneamente alti a causa del trasporto passivo. 3. Confermare tutte le reazioni negative con emazie rivestite da IgG (vedi, sotto, punto 9 del procedimento). Procedimento 1. Usando 0,5 mL, preparare serie di diluizioni per raddoppio in fisiologica dei sieri in esame. La provetta iniziale deve contenere siero non diluito, poi le diluizioni vanno da 1 a 2 fino a 1 a 2.048 (in totale, 12 provette). Vedi il Metodo 3.7. 2. Porre 0,1 mL di ciascuna diluizione in provette appropriatamente etichettate. 3. Aggiungere 0,1 mL di una sospensione eritrocitaria al 2% in ciascuna provetta.
4. 5.
6. 7. 8. 9.
Alternativamente, per convenienza, aggiungere una goccia di una sospensione al 3-4% di emazie test fornite da produttori, quantunque questo metodo sia meno preciso. Agitare delicatamente il contenuto delle provette e incubare a 37 C per 1 ora. Lavare le emazie quattro volte in fisiologica; decantare completamente la soluzione dellultimo lavaggio. Al sedimento eritrocitario aggiungere siero anti-IgG, seguendo le istruzioni dei produttori. Centrifugare per lagglutinazione. Esaminare macroscopicamente, definire lo score dei risultati e registrarli. Aggiungere le emazie rivestite da IgG a tutte le provette negative. Ricentrifugare ed esaminare i risultati. Ripetere gli esami se i test con le emazie rivestite da IgG sono negativi.
Interpretazione Il titolo il reciproco della diluizione pi alta del siero che d una agglutinazione di 1+. Un titolo = 16 (questo valore pu variare da laboratorio a laboratorio) viene ritenuto significativo e pu richiedere ulteriori monitoraggi per la MEFN. Note 1. controversa la scelta del fenotipo eritrocitario pi idoneo da utilizzare nelle titolazioni per MEFN. Alcuni operatori, nel caso di titolazioni di anticorpi anti-D, scelgono le emazie con espressione pi alta dellantigene, come quelle R2R2. Altri scelgono globuli rossi con il fenotipo che ci si attende essere quello del feto, cio quello che esprime una dose singola di D, come nel caso di eritrociti R1r. Qualsiasi scelta si faccia, importante che il laboratorio sia coerente con tale scelta e utilizzi globuli rossi dello stesso fenotipo per le successive titolazioni di sieri appartenenti agli stessi soggetti. 2. Le titolazioni si eseguono dopo liniziale individuazione di un anticorpo; conservare un aliquota (appropriatamente etichettata) del siero, congelandola a 20 C (o a temperature inferiori) per gli studi
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comparativi sul campione successivo. 3. Quando il titolo (per esempio > 16) viene messo in relazione con una MEFN, si raccomanda di eseguire titolazioni ogni 2-4 settimane, a partire dalla 18a settimana di gestazione. Conservare unaliquota del siero congelandola a 20 C (o a temperature inferiori) per gli studi comparativi sul campione successivo. 4. Se procedure invasive (quali, per esempio, lamniocentesi) hanno dimostrato una compromissione fetale e sono utilizzate per monitorare la gravidanza, impiegare il metodo migliore per il controllo dello stato clinico del feto. Se le analisi iniziali non dimostrano una compromissione fetale o la curva di Liley ai limiti, studi di titolazione aggiuntivi possono rappresentare un mezzo utile e non invasivo per seguire la gravidanza. 5. Ogni struttura dovrebbe avere una propria politica per assicurare uniformit nel riportare e interpretare i titoli anticorpali. 6. Per anticorpi diretti contro antigeni a bassa frequenza, prendere in considerazione il possibile utilizzo delle emazie paterne, se esprimono lantigene in causa. 7. Non usare potenzianti [albumina, polietilenglicole (PEG), soluzione a bassa forza ionica (LISS)] o emazie trattate con enzimi, perch si possono ottenere titoli
erroneamente pi alti. Non si raccomandano titolazioni con le metodiche in gel. 8. Il LISS non dovrebbe essere utilizzato come liquido di diluizione; in sieri diluiti con LISS si pu verificare un legame aspecifico di globuline alle emazie. 9. Risultati non corretti si possono avere per 1) tecnica errata, in particolare il mancato uso di pipette diverse per ogni singola diluizione o 2) una non adeguata miscelazione di un siero dopo scongelamento.
Bibliografia 1. Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology. 4 th ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1998:1067-9. Judd WJ, Luban NLC, Ness PM, et al. Prenatal and perinatal immunohematology: Recommendations for serologic management of the fetus, newborn infant, and obstetric patient. Transfusion 1990;30:175-83. Judd WJ. Methods in immunohematology. 2nd ed. Durham, NC: Montgomery Scientific Publications, 1994. Judd WJ. Practice guidelines for prenatal and perinatal immunhematology, revisited. Transfusion 2001;41:1445-52.
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Metodi sezione 6: Prelievo di sangue, conservazione e preparazione di emocomponenti
Metodi sezione 6
Prelievo di sangue, conservazione e preparazione di emocomponenti
Metodo 6.1 Metodica al solfato di rame al fine di controllare i donatori per anemia
Principio Questa metodica stima il contenuto ematico di emoglobina in base alla gravit specifica del sangue. Una goccia di sangue messa a contatto con una soluzione di solfato di rame con peso specifico di 1,053 si riveste di proteinato rameico, che impedisce la sua dispersione nel liquido e qualsiasi cambiamento di peso specifico per circa 15 secondi. Se la gravit specifica della goccia di sangue maggiore di quella della soluzione, la goccia andr a fondo entro 15 secondi; in caso contrario, la goccia rester sospesa nel liquido o salir alla superficie. Una gravit specifica di 1,053 corrisponde a una concentrazione di emoglobina pari a 12,5 g/dL. Il test non quantitativo; dimostra soltanto che lemoglobina del candidato donatore sopra o sotto il livello accettabile di 12,5 g/dL. Le reazioni falsamente positive sono rare: i donatori la cui goccia va a fondo hanno, pressoch sempre, un livello di emoglobina accettabile. Le reazioni falsamente negative capitano con maggiore frequenza e possono determinare esclusioni non corrette. Misurare lemoglobina con altre metodiche o determinare lematocrito rivelano, talora, che il donatore accettabile. Reagenti e materiale 1. Soluzione di solfato di rame alla specifica gravit di 1,053, disponibile in commercio.
Conservarlo in contenitori perfettamente tappati, per evitarne levaporazione. La soluzione dovrebbe essere conservata a temperatura ambiente o portata a questa temperatura prima delluso. 2. Garze sterili, fazzolettini antisettici e lancette sterili. 3. Contenitori per lo smaltimento del materiale tagliente o a rischio biologico. 4. Capillari con contagocce o altri dispositivi in grado di raccogliere il sangue senza contatto. Procedimento 1. In una provetta o bottiglia, pulita, asciutta e opportunamente etichettata, mettere una quantit sufficiente (almeno 30 mL) della soluzione di solfato di rame, per permettere alla goccia di cadere per circa 7-8 cm. Cambiare la soluzione ogni giorno o dopo 25 determinazioni. Assicurarsi che la soluzione sia perfettamente miscelata prima di iniziare, ogni giorno, i test. 2. Pulire con soluzione antisettica e asciugare con garza sterile il punto della digito-puntura. 3. Pungere con fermezza il dito, alla sua sommit, ma leggermente di fianco, con una lancetta sterile monouso o con un dispositivo a molla, fornito di aghi monouso. importante che il sangue scorra liberamente. Non schiacciare ripetutamente il dito dopo la puntura, perch ci pu far diluire la goccia di sangue con i liquidi tessutali e abbassare la gravit specifica. 4. Raccogliere il sangue nel capillare senza
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permettere allaria di entrare. 5. Lasciare che la goccia cada delicatamente dal capillare da unaltezza di 1 cm circa sulla superficie della soluzione di solfato di rame. 6. Osservare per 15 secondi. 7. Eliminare lancette e capillari in contenitori adatti per il rischio biologico. Eliminare in modo appropriato le garze: una garza, contaminata con poche gocce di sangue che successivamente si essiccano in modo tale da macchiarla ma non bagnarla, pu essere considerata non pericolosa. Interpretazione 1. Se la goccia di sangue affonda, lemoglobina del donatore accettabile per una donazione. 2. Se la goccia non affonda, lemoglobina del donatore pu non essere accettabile. Se tempo e attrezzature lo consentono, consigliabile eseguire determinazioni quantitative di emoglobina ed ematocrito. Note 1. Si deve ottenere dal produttore un certificato di idoneit per ogni nuovo lotto di soluzione di solfato di rame. 2. Le soluzioni usate dovrebbero essere smaltite come materiale a rischio biologico o chimico, in quanto contengono sangue. Per lo smaltimento, fare riferimento alle norme locali e statali. 3. Fare attenzione che il sangue non contamini le superfici di lavoro, gli indumenti del donatore o di altre persone o gli strumenti. 4. Tappare il contenitore per evitare levaporazione.
Metodo 6.2 Preparazione del braccio per la raccolta del sangue

Ogni produttore fornisce dettagliate istruzioni, che vanno seguite secondo le indicazioni. Il procedimento che segue ha valenza generale e serve da esempio. Principio Prima di iniziare la raccolta del sangue, si usano composti iodati o altre sostanze antisettiche per sterilizzare la cute nel punto della venipuntura. Materiali 1. Soluzione di lavaggio: soluzione monouso di povidone-iodine allo 0,75% o tamponi monouso imbevuti di povidone-iodine al 10%. Sono rinvenibili in commercio in confezioni per uso singolo. 2. Soluzione preparatoria del braccio: povidone-iodine al 10%, rinvenibile in commercio in confezioni per uso singolo. 3. Garza sterile. Procedimento 1. Applicare un laccio emostatico o il bracciale di uno sfigmomanometro; identificare il punto della venipuntura; rilasciare il laccio o il bracciale. 2. Strofinare, per almeno 30 secondi, con il composto iodato allo 0,75%, in tutte le direzioni, larea scelta per una superficie di 8 cm di diametro. Si pu rimuovere leccesso di schiuma, ma il braccio non deve essere asciugato prima di passare alle manovre successive. 3. Iniziando dal posto dove si intende effettuare la venipuntura e movendosi a spirale verso lesterno, applicare la soluzione preparatoria, mantenerla per 30 secondi o per il tempo indicato dai produttori. 4. Coprire larea con garza sterile asciutta fino al momento della venipuntura. Dopo che la pelle stata preparata non la si deve pi toccare. Non palpare nuovamente la vena nel sito della venipuntura.
Bibliografia 1. Lloyd H, Collins A, Walker W, et al. Volunteer blood donors who fail the copper sulfate screening test: What does failure mean, and what should be done? Transfusion 1988;28:467-9. Morris MW, Davey FR. Basic examination of blood. In: Henry JB, ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2001:479-519.
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Note 1. Per i donatori sensibili allo iodio (tintura o povidone), utilizzare altri disinfettanti (per esempio, spugna imbevuta di clorexidina al 2%, alcol isopropilico al 70%), secondo le indicazioni del medico del Servizio Trasfusionale. Non si dovrebbe usare sapone naturale. 2. Per i donatori sensibili sia allo iodio che alla clorexedina, considerare luso dellalcol isopropilico. La procedura consigliata di strofinare avanti-indietro per 30 secondi, lasciando poi che la pelle si asciughi. Poi, effettuare una seconda passata. Questa metodica pu richiedere varianti da parte della Food and Drug Administration (FDA). 3. I metodi di preparazione del braccio, approvati dalla FDA, sono rinvenibili al sito http:// www.fda.gov/cber/infosheets/armprep.htm.
5. Provette dove raccogliere i campioni di sangue per gli esami. 6. Strumenti per mescolare il sangue nei tubi. 7. Saldatore dielettrico (opzionale). Procedimento 1. Chiedere al donatore di confermare la propria identit. 2. Assicurarsi che tutte le etichette (sulla sacca, sui segmenti di tubo dove eseguire gli esami, sui segmenti da conservare e sul modulo di registrazioni) siano corrette. 3. Preparare il braccio del donatore come descritto nel Metodo 6.2 4. Ispezionare la sacca per ogni possibile difetto e per eventuali decolorazioni. Le soluzioni anticoagulanti e additive devono essere controllate per la presenza di particelle contaminanti. 5. Posizionare la sacca al di sotto del braccio del donatore: a. se si utilizzano bilance, assicurasi che il contrappeso sia a livello e adattarlo alla quantit di sangue da prelevare. A meno che non si usino clip metalliche e saldatori a mano, fare un nodo molto lasso nel tubo. Appendere la sacca e serrarla con le pinze. Si dovrebbero usare pinze emostatiche per chiudere il tubo di raccordo con la sacca prima di incappucciare lago, per impedire che laria entri nel sistema; b. se non si usano bilance, essere certi del volume di sangue prelevato. 6. Riapplicare il laccio emostatico o gonfiare il bracciale dello sfigmomanometro. Chiedere al donatore di aprire e chiudere la mano fino a che la vena scelta non si sia gonfiata. 7. Scoprire lago ed eseguire immediatamente la venipuntura. Per raccogliere unintera unit, priva di coaguli, essenziale eseguire venipunture semplici e corrette. Una volta che lago, introdotto obliquamente, sia penetrato nella pelle, si possono effettuare palpazioni al di sopra dellago con dita coperte da guanti, semprech non si tocchi lago. Una volta accertatasi che lago in posizione corretta,
Bibliografia 1. Goldman M, Roy G, Frechette N, et al. Evaluation of donor skin disinfection methods. Transfusion 1997;37:309-12.
Metodo 6.3 Flebotomia e prelievo di campioni per i test di validazione e di compatibilit

Principio Il sangue a uso trasfusionale e i campioni che laccompagnano vengono prelevati dalle vene sporgenti del braccio di un donatore, rinvenibili, di solito, nella fossa anticubitale. Materiali 1. Sacche di raccolta, sterili, contenenti soluzione anticoagulante e munite di tubi e aghi saldamente attaccati. 2. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 3. Bilance per monitorare la quantit di sangue prelevato. 4. Garze sterili e strumentazioni pulite (forbici, pinze emostatiche, tenaglie).
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fissare il tubo di prelievo al braccio del donatore per tenerlo in posizione e ricoprire il sito con garza sterile. 8. Sbloccare la pinza emostatica, aprendo la temporanea chiusura fra il tubo di prelievo e linterno della sacca. 9. Richiedere al donatore di aprire e chiudere la mano ogni 10-12 secondi durante il prelievo. 10. Mantenere sotto osservazione il donatore durante lintero periodo del prelievo. Il donatore non dovrebbe mai essere lasciato incustodito durante e immediatamente dopo la donazione. 11. Mescolare sangue e anticoagulante delicatamente e periodicamente (ogni 45 secondi circa). La miscelazione pu essere eseguita a mano o con sistemi meccanici continui. 12. Assicurarsi che il flusso ematico si mantenga vivo e continuo, in modo tale che non si inneschino attivit coagulative. Se il flusso del sangue adeguato e il mescolamento costante, non si rendono necessari tempi rigidi di raccolta. Le unit che richiedono pi di 15 minuti per la raccolta, tuttavia, non sono idonee per la preparazione di concentrati piastrinici (CP), di plasma fresco congelato (PFC) o di crioprecipitato anti-emofilico (AHF). Il tempo richiesto per il prelievo, pu essere monitorato indicando, sul modulo di prelievo del donatore, il tempo impiegato o quello massimo consentito (15 minuti dallinizio). 13. Monitorare il volume di sangue da raccogliere. Se si usa una bilancia, lo strumento stesso provvede a interrompere il flusso di sangue una volta raggiunta la quantit prefissata. Un mL di sangue pesa almeno 1,053 g, secondo il peso specifico minimo consentito per una donazione. conveniente utilizzare un valore di 1,06 g/mL; ununit che contenga da 405 a 550 mL di sangue dovrebbe pesare da 429 a 583 g, pi il peso della sacca e dellanticoagulante. Per una sacca da 500 mL, il peso totale varia da 565 a 671 g. 14. Chiudere il tubo in vicinanza dellago, usando una pinza emostatica, clip metalliche o altri tipi di pinze. Aprire il laccio emostatico o il
bracciale sino a un valore di 20 mmHg o inferiore e riempire le provette per gli esami con una metodica che impedisca una possibile contaminazione della sacca. Ci si pu ottenere in vari modi: a. se la sacca di raccolta contiene un ago in linea, provvedere a una chiusura supplementare con una pinza emostatica, con clip metalliche, con saldatori a mano o serrando il nodo lasso precedentemente preparato, a distanza giusta dallago. Aprire il connettore separando i due aghi, inserendo lago per la raccolta dei campioni adibiti ai test, rimuovere la pinza emostatica, permettere alle provette di riempirsi e richiudere il tubo. A questo punto, lago inserito nel braccio del donatore pronto per essere rimosso; b. se la sacca di raccolta contiene un ago in linea dedicato alle provette per i test, accertarsi che il tubo connesso a questo ago sia pieno quando la raccolta terminata e che il sistema di chiusura originale sia sistemato vicino allago del donatore. Lintero sistema pu essere ora rimosso dal braccio del donatore; c. se si utilizza un set composto da pi sistemi di tubi, si dovrebbe procedere come segue. Sistemare una pinza emostatica sul tubo, lasciando circa 4 segmenti fra la pinza emostatica e lago. Stringere il nodo lasso preparato come descritto al punto 5.a. Rilasciare la pinza emostatica e spremere un segmento di tubo in modo da renderlo libero da sangue tra il nodo e lago (circa 2,5 cm in lunghezza). Riapplicare la pinza emostatica e tagliare il tubo nella parte strippata. Riempire il tubo rilasciando la pinza e quindi richiuderlo utilizzando la pinza . Poich il sistema aperto, devono essere devono essere seguite le istruzioni relative al livello 2 di sicurezza biologica. 15. Sgonfiare il manicotto dellapparecchio dello sfigmomanometro o rimuovere il laccio emostatico. Levare lago dal braccio del
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donatore, se non gi rimosso. Premere la garza sopra il punto della venipuntura e chiedere al donatore di sollevare il braccio, a gomito dritto, e di tenere, con laltro braccio, la garza ben premuta sul punto della flebotomia. 16. Eliminare lago con connesso leventuale sistema in un contenitore idoneo a prevenire ferite accidentali o contaminazioni al personale. 17. Spremere, il pi completamente possibile, il sangue del tubo allinterno della sacca, iniziando dal punto di saldatura. Agire rapidamente, per evitare che il sangue coaguli allinterno del tubo. Capovolgere pi volte la sacca per mescolarne accuratamente il contenuto; riempire, quindi, il tubo con il sangue anticoagulato proveniente dalla sacca. Ripetere questultima manovra una seconda volta. 18. Saldare il tubo attaccato alla sacca in pi segmenti, lasciando, sui segmenti, le etichette con il numero del prelievo chiaramente leggibili. Letichetta con il numero di prelievo va attaccata anche al segmento che deve essere conservato a lungo. Per preparare segmenti di tubi utili per le prove di compatibilit, si possono impiegare nodi, clip metalliche o saldatori dielettrici. I segmenti devono essere separati dalla sacca senza comprometterne la sterilit. Se si usa un saldatore dielettrico, nodi e clip devono essere rimossi dalla fine distale del tubo, dopo aver creato una saldatura ermetica. 19. Ispezionare, ancora una volta, la sacca per la presenza di eventuali difetti. 20. Ricontrollare i numeri sul contenitore, sui tubi, sul modulo di donazione e sul segmento da conservare. 21. Collocare il contenitore alla temperatura idonea. A meno che non si debbano separare piastrine, il sangue intero va posto immediatamente, subito dopo il prelievo, fra 1 e 6 C. Se si devono separare piastrine, il sangue non va raffreddato, ma conservato fra 20 e 24 C, sino a che queste non siano state rimosse. Le piastrine vanno separate entro 8 ore dalla raccolta di ununit di sangue intero.
Note 1. Se si scarta lago e si deve eseguire una seconda venipuntura, la preparazione del sito per la flebotomia va ripetuta come indicato nel Metodo 6.2. 2. Oltre che per prelievi a scopo di donazione, questo procedimento pu essere adattato ai salassi terapeutici.
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005. Smith LG. Blood collection. In: Green TS, Steckler D, eds. Donor room policies and procedures. Arlington, VA: AABB, 1985:25-45. Huh YO, Lightiger B, Giacco GG, et al. Effect of donation time on platelet concentrates and fresh frozen plasma. Vox Sang 1989;56:21-4. Sataro P. Blood collection. In: Kasprisin CA, LairdFryer B, eds. Blood donor collection practices. Bethesda, MD: AABB, 1993:89-103.
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Metodo 6.4 Preparazione di concentrati eritrocitari

Principio I concentrati eritrocitari si ottengono rimovendo il plasma sovranatante dopo centrifugazione di unit di sangue intero. La quantit di plasma rimosso determina lematocrito dellemocomponente. Quando i concentrati eritrocitari sono conservati in CPDA-1, la massima vitalit per la conservazione richiede che sia mantenuto un appropriato rapporto fra cellule e soluzione preservante. Un ematocrito dell80 % o minore assicura una quantit adeguata di glucosio per il metabolismo eritrocitario sino a 35 giorni di conservazione. Materiali 1. Sangue intero fresco, raccolto come descritto al Metodo 6.3. Prelevare il sangue in contenitori con attaccate sacche satelliti (di trasferimento).
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2. Estrattore per il plasma. 3. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 4. Strumenti ben puliti (forbici, pinze emostatiche). 5. Saldatore dielettrico (opzionale). 6. Centrifuga refrigerata. 7. Bilancia. Procedimento 1. Centrifugare, a 4 C, la sacca di sangue intero ad alta velocit (vedi Metodo 7.4). 2. Sistemare la sacca madre con il sangue centrifugato in un estrattore di plasma e rilasciare la molla, consentendo al piatto dellestrattore di venire a contatto con la sacca. 3. Chiudere temporaneamente il tubo fra la sacca madre e le sacche satelliti con una pinza emostatica e, se non si utilizza un saldatore metallico, facendo un sovrastante nodo lasso nel tubo. 4. Se sono annesse due o pi sacche satelliti, applicare la pinza emostatica in modo che il plasma fluisca in una sola sacca satellite. Aprire la perviet della sacca madre. Una comune bilancia in grado di misurare la quantit di plasma espresso. Separare plasma in quantit appropriata per ottenere lematocrito desiderato. 5. Applicare nuovamente la pinza emostatica, quando la quantit desiderata di plasma fluita nella sacca satellite. Saldare il tubo, in due punti, fra la sacca madre e la sacca satellite. 6. Controllare che la sacca satellite porti lo stesso numero del donatore della sacca madre e tagliare il tubo fra i due punti di saldatura. Note 1. Se il sangue stato raccolto in una sacca singola, modificare, come segue, le istruzioni date qui sopra: dopo aver posto la sacca nellestrattore di plasma, applicare una pinza emostatica al tubo di una sacca da trasferimento, inserire asetticamente la cannula della sacca transfer alla porta di uscita della sacca che contiene il sangue, aprire la pinza e continuare come descritto sopra. Ovviamente, la data di scadenza cambier. 2. Un prelievo in soluzione additiva consente la
rimozione di una maggiore quantit di plasma di quanto descritto al punto 4 del procedimento. Dopo la separazione del plasma, si permette alla soluzione additiva di fluire nella sacca con le emazie. Ne risulter un ematocrito compreso fra il 55 e il 65%. Assicurarsi che si utilizzino etichette e date di scadenza appropriate. 3. La separazione fra 230 e 256 g (pari a 225 e 250 mL) di plasma e la successiva conservazione nelle soluzioni preservanti determiner, di norma, un ematocrito compreso fra il 70 e l80%. 4. Vedi Tabella 6.4.1 per preparare concentrati eritrocitari con uno specifico, desiderato ematocrito. Tabella 6.4.1 - Rimozione di plasma da unit di sangue intero per preparare concentrati eritrocitari a ematocrito noto Ematocrito del segmento dellunit di sangue intero 40% 39% 38% 37% 36% 35% 34% 33% Volume di plasma da rimuovere Ematocrito finale della unit del concentrato eritrocitario 56% 55% 55% 54% 54% 54% 55% 55%
150 mL 150 mL 160 mL 165 mL 170 mL 180 mL 195 mL 200 mL
Metodo 6.5 Preparazione di concentrati eritrocitari leucoridotti prima della conservazione (Pre-storage)
Principio Si applicano il principio generale e i materiali del Metodo 6.4, eccetto che i globuli rossi vengono filtrati utilizzando filtri speciali per la rimozione dei
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leucociti. Tutti i filtri autorizzati negli Stati Uniti rimuovono, in qualche misura, le piastrine. Il sangue intero pu essere filtrato, cos da ottenere, soltanto, plasma povero di piastrine, leucociti e concentrati eritrocitari. Alternativamente, si possono filtrare concentrati eritrocitari in soluzione additiva, consentendo potenzialmente la preparazione di plasma, di concentrati piastrinici e di concentrati eritrocitari. Concentrati eritrocitari inizialmente non leucoridotti possono esserlo successivamente, attaccando un filtro alla sacca con limpiego di un connettore sterile. Procedimento 1. Prima della centrifugazione, il sangue intero pu essere filtrato, appendendo la sacca capovolta e permettendo al sangue di fluire, per gravit, attraverso un filtro, in una sacca secondaria. Poi, si seguono i punti illustrati nel Metodo 6.4 (vedi la nota 2 per quanto riguarda laggiunta di una soluzione additiva). 2. Il sangue intero pu essere centrifugato in sacche che comprendono un filtro in linea. Dopo la centrifugazione, si separa il plasma. Si aggiunge, poi, la soluzione additiva e le emazie sono filtrate per gravit, come illustrato al precedente punto 1. 3. Un concentrato eritrocitario preparato utilizzando il Metodo 6.4, sia nel proprio plasma residuo che in soluzione additiva (AS-1, AS-3, AS-5) pu possedere un contenitore secondario con un filtro in linea, attaccato utilizzando un connettore sterile. Si pu procedere alla filtrazione, secondo le istruzioni del produttore, usando la gravit, come illustrato al punto 1. La tempistica di questa filtrazione , spesso, entro 24 ore, ma pu essere eseguita sino a 5 giorni dal prelievo. 4. I concentrati eritrocitari sottoposti a leucoriduzione sono etichettati emazie leucoridotte. Non vi sono etichette specifiche per i prodotti leucoridotti pre-storage. Note 1. Se il sistema di prelievo non comprende un filtro in linea, pu essere impiegato un
connettore sterile per inserire nel sistema il filtro per deleucocitare. Il filtro va impiegato seguendo le istruzioni del produttore. 2. I concentrati piastrinici da sangue intero vanno preparati prima di deleucocitare (vedi Metodo 6.14).
Metodo 6.6 Ringiovanimento dei globuli rossi

Principio Il ringiovanimento una procedura tesa a recuperare i metaboliti esauriti e a migliorare le funzioni e la sopravvivenza post-trasfusionale dei globuli rossi conservati. Le soluzioni di ringiovanimento non sono destinate a essere somministrate endovena; dopo unincubazione a caldo i globuli rossi vanno lavati e poi, o sono glicerolizzati per essere congelati o sono mantenuti fra 1 e 6 C per essere trasfusi entro 24 ore. Le soluzioni di ringiovanimento, approvate dalla FDA, contengono piruvato, inosina, fosfati e adenina. Il loro impiego consentito soltanto per globuli rossi preparati da sangue intero raccolto in CPD, CP2D o CPDA-1, e le soluzioni possono essere aggiunte in un qualsiasi momento, compreso fra i 3 giorni dopo la raccolta e i 3 giorni dopo la data di scadenza. Il loro impiego, peraltro, non normalmente accettato prima del 14 giorno di conservazione, poich le emazie cos trattate possono comportare livelli anomali di 2,3-difosfoglicerato, che altera la captazione di O2. Reagenti e materiali 1. Globuli rossi conservati fra 1 e 6 C, provenienti da sangue intero, raccolto in CPD o in CPDA-1. Dopo la raccolta, si possono utilizzare i GR risospesi in CPD (dal giorno 3 al giorno 24) o in CPDA-1 (dal giorno 3 al giorno 38). La soluzione ringiovanente non pu essere impiegata per globuli rossi conservati in soluzioni additive. 2. Soluzione di ringiovanimento, in fiale sterili da 50 mL (Rejuvesol, Citosol Laboratories, Baltimora, MA, USA).
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3. Sacche impermeabili di plastica. 4. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 5. Cappa sterile. Procedimento 1. Connettere il contenitore della soluzione di ringiovanimento con i globuli rossi, utilizzando set di trasferimento sterili e una tecnica asettica. 2. Consentire che 50 mL di soluzione di ringiovanimento fluiscano, per gravit, nel contenitore dei globuli rossi. Agitare delicatamente la mescolanza durante questa fase. Nota: se la soluzione in bottiglia, richiesto luso di una cappa sterile. 3. Saldare il tubo di connessione vicino alla sacca contenente i globuli rossi e incubare la miscela per 1 ora a 37 C. Si possono utilizzare sia incubatori a secco che bagnomaria a circolazione dacqua. Se la sacca viene posta in un bagnomaria, essa dovrebbe essere totalmente immersa. Per prevenire eventuali contaminazioni, essenziale avvolgere la sacca con materiale impermeabile. 4. Per un impiego entro 24 ore, i globuli rossi ringiovaniti si lavano in fisiologica (2 L di soluzione di NaCl allo 0,9%), utilizzando un protocollo approvato. La conservazione da 1 a 6 C di globuli rossi lavati non dovrebbe superare le 24 ore dallinizio della procedura di lavaggio. 5. Se i globuli rossi ringiovaniti devono essere congelati, i protocolli di glicerolizzazione standard rimuovono, in maniera adeguata, le soluzioni di ringiovanimento dalle cellule. La data di scadenza resta di 10 anni dalla data di raccolta dellunit. 6. Assicurarsi che unit le siano etichettate appropriatamente e che le registrazioni richieste siano complete.
Metodo 6.7 Crioconservazione di globuli rossi impiegando glicerolo ad alta concentrazione. Metodologia Meryman
Principio Le sostanze crioprotettive rendono possibile una conservazione dei globuli rossi, allo stato congelato, per lunghi periodi di tempo (10 o pi anni). A tale scopo, limpiego di unalta concentrazione di glicerolo si dimostrato particolarmente conveniente. Qui di seguito, si descrive un metodo pratico per il congelamento di globuli rossi raccolti in una sacca da 450 mL. Materiali (Vedi il Capitolo 6 per ulteriori informazioni sugli emocomponenti congelati). 1. Sangue di donatori raccolto in CPD, CP2D, CPDA-1 o in soluzione additiva. a. Completare tutte le procedure relative al sangue donato sulle unit che si intendono congelare. b. I globuli rossi in CPD o in CPDA-1 possono essere conservati, fra 1 e 6 C, sino a 6 giorni prima di essere congelati. c. I globuli rossi in AS-1 o in AS-3 possono essere conservati, fra 1 e 6 C, sino a 42 giorni prima di essere congelati. d. I globuli rossi sottoposti a ringiovanimento (vedi Metodo 6.6) possono essere congelati sino a 3 giorno dopo la data della loro scadenza. e. I globuli rossi, in qualsiasi soluzione preservante, la cui sacca sia stata perforata, devono essere congelati entro 24 ore dal momento della perforazione. 2. Contenitori per la conservazione allo stato congelato, sia di polivinilcloride che di poliolefin. 3. Soluzione di lattato di glicerolo (400 mL) 6,2 M. 4. Contenitori di cartone o di metallo adatti al congelamento. 5. Soluzione ipertonica (12%) di cloruro di sodio. 6. 1 litro di NaCl all1,6% per il lavaggio in serie.
Bibliografia 1. Valeri CR, Zaroules CG. Rejuvenation and freezing of outdated stored human red cells. N Engl J Med 1972;287:1307-13.
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7. Soluzione isotonica (0,8%) di NaCl con 0,2% di destrosio. 8. Bagnomaria o termostato a secco, entrambi a 37 C. 9. Strumenti per il lavaggio in serie o continuo al fine di deglicerolizzare i globuli rossi, congelati in glicerolo ad alta concentrazione. 10. Nastro di registrazione del congelamento. 11. Congelatore a 65 C (o a temperature inferiori). Procedimento Preparazione dei globuli rossi per la glicerolizzazione 1. Preparare i globuli rossi, partendo da unit di sangue intero, rimovendo il sovranatante costituito dalle soluzioni anticoagulanticonservanti o dalle soluzioni additive. Pesare lunit e stabilire il peso dei globuli rossi. Il peso complessivo, delle cellule e della sacca dovrebbe essere compreso fra 260 e 400 g. 2. Unit di peso inferiore possono essere portate a un peso approssimativo di 300 g sia aggiungendo soluzione di NaCl allo 0,9% che rimovendo meno plasma del solito. Registrare il peso e, se del caso, documentare la quantit di fisiologica aggiunta. 3. Registrare il numero dellunit di sangue intero, il gruppo ABO e il tipo Rh, lanticoagulante usato, la data del prelievo, la data del congelamento, la data di scadenza, lidentificazione della persona che ha eseguito la procedura. Se del caso, documentare il numero di lotto della sacca di trasferimento. 4. Riscaldare i globuli rossi e il glicerolo ad almeno 25 C, sistemandoli in un termostato a secco per 10-15 minuti o tenendoli a temperatura ambiente per 1-2 ore. La temperatura non deve superare 42 C. 5. Applicare letichetta globuli rossi congelati alla sacca dove lunit verr congelata. Letichetta deve portare anche: nome della struttura che congela lunit; numero dellunit di sangue intero; gruppo ABO e tipo Rh; data di raccolta; data di congelamento; criopreservate utilizzato; data di scadenza.
Glicerolizzazione 1. Documentare il numero di lotto del glicerolo, le sacche da congelamento e, se usata, la soluzione fisiologica (0,9% di NaCl). 2. Sistemare il contenitore dei globuli rossi su un agitatore e aggiungere circa 100 mL di glicerolo ai globuli rossi, mentre sono delicatamente scossi. 3. Fermare lagitatore e permettere alle cellule di riequilibrarsi, senza agitarle, lasciandole ferme, da 5 a 30 minuti. 4. Far fluire, per gravit, i globuli rossi parzialmente glicerolizzati allinterno della sacca da congelamento. 5. Aggiungere lentamente, e con brevi soste, i restanti 300 mL di glicerolo alla sacca da congelamento. Aggiungere piccoli volumi di glicerolo a piccoli volumi di globuli rossi. La concentrazione finale di glicerolo sar del 40% peso/volume. Rimuovere completamente laria dalla sacca. 6. Permettere ad alcune cellule glicerolizzate di fluire nel tubo cos da poter preparare dei segmenti. 7. Mantenere i globuli rossi glicerolizzati fra 25 e 32 C sino al momento del congelamento. Lintervallo raccomandato fra togliere lunit di globuli rossi dal frigorifero e sistemare le cellule glicerolizzate nel congelatore non deve superare le 4 ore. Congelamento e conservazione 1. Sistemare lunit glicerolizzata in un cartone o in un contenitore metallico e porla in un congelatore a 65 C o a temperature inferiori. 2. Etichettare il margine superiore del contenitore con il nastro di registrazione del congelamento, che riporta: numero dellunit di sangue intero, gruppo ABO e tipo Rh, la data del congelamento e la data di scadenza. 3. Non sottoporre lunit a movimenti o a trattamenti bruschi. 4. Il ritmo del congelamento deve essere inferiore a 10 mL/minuto. 5. Conservare i globuli rossi congelati a 65 C o a temperature inferiori sino a 10 anni. Per unit con fenotipi rari, il direttore medico della
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struttura pu estendere il periodo conservazione. Si devono documentare peculiare natura di questultime unit e ragione per estendere il loro periodo conservazione oltre gli usuali 10 anni.
di la la di
Scongelamento e deglicerolizzazione 1. Fasciare con materiale impermeabile il contenitore protettivo che contiene lunit congelata e sistemarla in un bagnomaria a 37 C o in un termostato a secco, sempre a 37 C. 2. Agitare delicatamente il contenuto per accelerarne lo scongelamento. La procedura di scongelamento richiede almeno 10 minuti. I concentrati eritrocitari scongelati devono essere posti a 37 C. 3. Dopo che i globuli rossi sono stati scongelati, usare uno strumento commerciale per il lavaggio in serie o a flusso continuo, allo scopo di deglicerolizzare le cellule. Seguire le istruzioni dei produttori. 4. Registrare il numero di lotto e il produttore di tutte le soluzioni e dei software impiegati. Applicare, alla sacca di trasferimento, unetichetta contrassegnata da globuli rossi deglicerolizzati e assicurarsi che tale etichetta riporti gli estremi di identificazione della struttura che ha prelevato lunit di sangue intero, quelli di identificazione della struttura che ha deglicerolizzato le cellule, il gruppo ABO e il tipo Rh di queste cellule, il numero dellunit di sangue intero, data e tempo di scadenza. 5. Diluire lunit con una quantit di una soluzione ipertonica (12%) di NaCl appropriata al volume dellunit. Consentirne il riequilibrio per circa 5 minuti. 6. Lavare le cellule con una soluzione di NaCl all1,6% sino a deglicerolizzazione completa. A tale scopo sono richiesti circa 2 litri di soluzione di lavaggio. Controllare il glicerolo residuo (vedi Metodo 6.8). 7. Risospendere i globuli rossi deglicerolizzati con soluzione fisiologica isotonica (0,9% di NaCl) con aggiunto un 2% di destrosio. 8. Riempire, con unaliquota di cellule, il tubo strettamente attaccato al contenitore e saldarlo in pi punti per poter disporre di
campioni da utilizzare per le prove di compatibilit. 9. I globuli rossi deglicerolizzati non possono essere conservati per pi di 24 ore a 1-6 C. (Recentemente stato autorizzato un sistema chiuso che consente la conservazione, a 1-6 C, dei globuli rossi deglicerolizzati per 2 settimane). Note 1. Si dovrebbe congelare e conservare, a 65 C o a temperature inferiori, unaliquota del siero o del plasma del donatore per poter eseguire eventuali nuove analisi, nel caso si rendessero disponibili. 2. Quando si mettono a punto nuovi test diagnostici e le unit conservate non dispongono di quantit di siero/plasma sufficienti per eseguire tali analisi, lunit deve essere distribuita con unetichetta che dichiari che il test non stato eseguito. Si deve documentare la ragione che ha portato a distribuire lunit senza aver effettuato il test. Se si pu ottenere un nuovo campione dal donatore e questo viene testato dopo che lunit era stata conservata, si deve segnalare la data del test, al momento della distribuzione dellunit.
Bibliografia 1. Meryman HT, Hornblower M. A method for freezing and washing RBCs using a high glycerol concentration. Transfusion 1972;12:145-56.
Metodo 6.8 Crioconservazione di globuli rossi impiegando glicerolo ad alta concentrazione. Metodica di Valeri
Principio Globuli rossi, raccolti in una sacca primaria da 800 mL con CPDA-1 e conservati a 1-6 C da 3 a 38 giorni, possono essere ringiovaniti
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biochimicamente e congelati con glicerolo al 40% peso/volume nello stesso contenitore primario. Vedi il Metodo 6.6 per informazioni supplementari. Materiali 1. Sacche quadruple, in plastica, con la sacca madre (primaria) da 800 mL. 2. Clip per saldature. 3. Flaconi vuoti da 600 mL di polietilene criogenico (tipo Corning 25702 o Fisher 033746). 4. Connettore sterile con lamine per saldare. 5. Nastro di registrazione. 6. Sacca di trasferimento da 600 mL. 7. 50 mL di soluzioni di ringiovanimento (Rejuvesol, Cytosol Laboratories, Braintree, MA, USA). 8. Sacche di plastica, saldabili al calore, 20,32 x 39,50 cm. 9. Inserimento per la soluzione di ringiovanimento (Fenwal 4C1921 o Cutter98052). 10. Ago sterile con filtro per laria (BD 5200), utilizzabile esclusivamente con Fenwal 4C1921. 11. 500 mL di soluzione Fenwal 4A7833 (Glycerolyte 57) o 500 mL di Cytosol PN5500 6,2 M (soluzioni di glicerolizzazione). 12. Etichette: Globuli rossi congelati ringiovaniti. 13. Box di cartone increspato delle dimensioni esterne di 18 x 14 x 5 cm. 14. Strumento per saldare al calore. 15. Sacca di plastica per fasciare le unit. Procedimento Preparazione dei globuli rossi per la glicerolizzazione 1. Prelevare 450 mL di sangue intero nella sacca primaria. Capovolgere la sacca e piegarne la base di circa 5 cm e porla, dritta, in una centrifuga. Centrifugare e rimuovere tutto il plasma sovranatante visibile. Lematocrito dellunit deve essere del 75% 5%. 2. Conservare i globuli rossi fra 1 e 6 C nella sacca primaria (da 800 mL) insieme alladattatore sul punto dingresso del tubo che connette la sacca primaria alla sacca di trasferimento.
3. Centrifugare nuovamente le cellule conservate per rimuovere tutto il plasma visibile, prima di iniziare il ringiovanimento. Il peso lordo e quello netto dei globuli rossi non devono superare 352 g e 280 g, rispettivamente. 4. Trasferire il plasma nella sacca satellite strettamente connessa alla sacca primaria, piegare il tubo e risistemare la clip per la saldatura manuale, senza stringerla. 5. Attaccare una sacca transfer vuota, da 600 mL, al tubo di connessione con la sacca primaria, utilizzando un connettore sterile. 6. Trasferire 1 mL di plasma in ciascuna di tre fiale criogeniche da usarsi per future analisi. Modificazioni biochimiche dei globuli rossi 1. Se si utilizza il sistema Fenwal per la soluzione di ringiovanimento, inserire, asetticamente, lago a Y Fenwal nel tappo di gomma di una bottiglia da 50 mL di soluzione per il trattamento di cellule ematiche ( Red Blood Cell Processing Solution, RBCPS) e laccoppiatore del set nella porta dingresso della sacca primaria. Inserire lago con filtro per laria nel tappo di gomma della RBCPS. 2. Se si impiega il sistema Cutter per la soluzione di ringiovanimento, inserire, asetticamente, la punta bianca di sfiato con inserito il gocciolatoio nel tappo di gomma della bottiglia che contiene la RBCPS e la punta non ventilata (senza sfiato) nella porta dingresso della sacca primaria. 3. Agitando manualmente, con delicatezza, consentire a 50 ml della soluzione RBCPS di fluire direttamente nei globuli rossi. 4. Saldare, al calore, il tubo del set dinserimento che connette la soluzione RBCPS alla porta dingresso. Il secondo tubo del set a Y si usa per aggiungere glicerolo (vedi avanti). 5. Fasciare completamente la sacca primaria da 800 mL, la sacca transfer connessa e vuota, e il complesso del set a Y e incubarli in un bagnomaria a 37 C per 1 ora.
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Tabella 6.8.1 - Quantit di glicerolo necessarie per pesi differenti di unit di globuli rossi Peso lordo dellunit (grammi)* 222-272 273-312 313-402 Peso netto dellunit (grammi) 150-200 201-240 241-330 Aggiunta iniziale di glicerolo (mL) 50 50 50 Seconda aggiunta di glicerolo (mL) 50 50 50 Terza aggiunta di glicerolo (mL) 250 350 400 Glicerolo totale aggiunto (mL) 350 450 500
*Il peso di una sacca primaria vuota da 800 mL con attaccata una sacca di trasferimento e ladattatore di 72 g (in media).
Glicerolizzazione 1. Rimuovere i segmenti numerati per le prove di compatibilit, lasciando attaccato alla sacca di raccolta (primaria) soltanto il segmento iniziale, numerato. Pesare lunit. 2. Determinare la quantit di glicerolo da aggiungere, in base al peso lordo e a quello netto dellunit (vedi Tabella 6.8.1). 3. Inserire, asetticamente, laccoppiatore del sistema di ringiovanimento nel punto di uscita del tappo di gomma sulla bottiglia che contiene il glicerolo. Soltanto per il sistema Fenwal, inserire un ago che filtra laria nella zona di sfiato del tappo di gomma sulla bottiglia contenente il glicerolo. 4. Porre la sacca su un agitatore. Aggiungere, come primo volume, la quantit di glicerolo specificata in Tabella 6.8.1, mentre la sacca sta oscillando a bassa velocit (180 oscillazioni/minuto). 5. Consentire alla mescolanza di equilibrarsi, senza oscillazioni per 5 minuti; aggiungere il secondo volume di glicerolo. Equilibrare ancora per 2 minuti, poi aggiungere il terzo volume di glicerolo, agitando la sacca manualmente e con vigore. 6. Saldare al calore il tubo che connette la bottiglia (vuota) di glicerolo e il tubo prossimale dinserimento al punto dingresso. Assicurarsi che la sacca di trasferimento resti strettamente connessa alla sacca primaria. 7. Centrifugare la mistura di globuli rossi e glicerolo, trasferire tutto il glicerolo sovranatante visibile alla sacca transfer, risospendere e mescolare.
8. Saldare il tubo a 10 cm dalla sacca di raccolta primaria, staccare la sacca di trasferimento che contiene il liquido sovranatante ed eliminarla. 9. Attaccare al rivestimento esterno le seguenti etichette: quella del tipo di emocomponente, quella della struttura, quella del gruppo ABO e del tipo Rh. Registrare su unetichetta anche la data di scadenza. 10. Pesare lunit subito prima di congelarla e registrarne il peso. 11. Ripiegare, di circa 5 cm, la parte superiore della sacca primaria, sistemarla in una sacca plastica avvolgente e saldare al calore la sacca esterna nella sua parte alta, in modo tale che vi sia la minor quantit possibile di aria fra le due sacche. 12. Porre una fiala di plasma e la sacca di plastica che contiene i globuli rossi glicerolizzati in un contenitore di cartone. Conservare altre due fiale, facilmente identificabili, a 65 C o a temperature inferiori per eventuali ulteriori test, se necessari. 13. Attaccare alla scatola esterna, letichetta globuli rossi congelati ringiovaniti, letichetta ABO/Rh, letichetta della struttura, il numero originale del prelievo. Registrare separatamente o affiggere allesterno del contenitore di cartone le date di raccolta, di congelamento e quella di scadenza. 14. Congelare lunit in un congelatore a 80 C. Non devono trascorrere pi di 4 ore fra quando lunit rimossa dal frigorifero a 4 C e quando essa viene sistemata nel congelatore a 80 C.
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Scongelamento e deglicerolizzazione Vedi Metodo 6.7. Va notato, peraltro, che il glicerolo sovranatante va rimosso prima del congelamento. Di conseguenza, soltanto due soluzioni saline (quella ipertonica al 12% e quella allo 0,9% pi 0,2% di destrosio) vengono impiegate nel procedimento di deglicerolizzazione.
Materiali ed equipaggiamento 1. Strumentazione semi-automatica per deglicerolizzare globuli rossi criopreservati. 2. Tubi semitrasparenti, quale parte di materiale a perdere da utilizzare per deglicerolizzare singole unit. 3. Blocchetti di colore-campione, rinvenibili in commercio. Procedimento 1. Interrompere il ciclo dellultimo lavaggio quando il liquido di lavaggio si rende visibile nel tubo collegato con la sacca da eliminare. 2. Mantenere il blocchetto del colore-campione vicino al tubo e contro una sorgente illuminata di luce bianca. 3. Notare il colore del liquido di lavaggio, che non dovrebbe essere pi intenso di quello del blocchetto, il che indica unemolisi del 3% (il 3% delle emazie sono emolizzate). 4. Se il livello di emolisi maggiore, continuare il lavaggio sino a che il colore non rientra in limiti accettabili. 5. Registrare le osservazioni relative alle singole unit e al programma garanzia di qualit. 6. Se intervengono ripetutamente emolisi inaccettabili, documentare le azioni correttive intraprese.
Bibliografia 1. 2. Rejuvesol Package insert. Braintree, MA: Cytosol Laboratories, 2002. Valeri CR, Ragno G, Pivacek LE, et al. A multicenter study of in vitro and in vivo values in human RBCs frozen with 40% (wt/vol) glycerol and stored after deglycerolization for 15 days at 4 C in soluzione additiva-3: Assessment of RBC processing in the ACP 215. Transfusion 2001; 41:933-9.
Metodo 6.9 Valutazione delladeguatezza della glicerolizzazione dei globuli rossi

Principio La glicerolizzazione dei globuli rossi per la loro conservazione allo stato congelato provoca fluidi intracellulari con alta osmolarit, che bisogna riportare a livelli fisiologici prima che le cellule siano trasfuse. Globuli rossi non adeguatamente deglicerolizzati si emolizzeranno a contatto con soluzione fisiologica normale o con siero o plasma al momento delle prove di compatibilit. Lultima soluzione usata nella deglicerolizzazione una fisiologica normale. Il sistema pi semplice per determinare se la deglicerolizzazione stata adeguata quello di valutare il livello (mg/dL) di emoglobina libera nellultimo lavaggio. Un sistema idoneo per stimare lemoglobina di paragonare il colore del liquido dellultimo lavaggio con i blocchetti di colore-campione acquisibili in commercio. Alternativamente, si pu aggiungere normale fisiologica a una quota di cellule deglicerolizzate e valutare il colore del liquido sovranatante contro questi blocchetti.
Metodo 6.10 Preparazione di plasma fresco congelato da unit di sangue intero

Principio Il plasma viene separato dagli elementi cellulari del sangue e viene congelato per preservare i fattori labili della coagulazione. Il plasma deve essere posto in congelatore entro il minor tempo possibile richiesto per le procedure di anticoagulazione e raccolta. Materiali 1. Sangue intero fresco, raccolto con flebotomia, come descritto nel Metodo 6.3, in un contenitore con attaccate saldamente una o pi sacche satelliti di trasferimento.
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2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Clip metalliche e pinze per saldature manuali. Forbici e pinze emostatiche ben pulite. Saldatore dielettrico (opzionale). Estrattore di plasma. Apparecchiature per il congelamento. Centrifuga refrigerata. Bilancia.
partendo da plasma appena raccolto. La crioprecipitazione si ottiene con un lento scongelamento, da 1 a 6 C, di un plasma che sia stato congelato entro il tempo richiesto per le procedure di raccolta e di anticoagulazione. Materiali 1. Sangue intero, appena raccolto, ottenuto per flebotomia, come descritto nel Metodo 6.3, in un contenitore che possegga almeno due sacche satelliti, saldamente attaccate. 2. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 3. Forbici e pinze emostatiche ben pulite. 4. Saldatore dielettrico (opzionale). 5. Estrattore di plasma. 6. Centrifuga refrigerata. 7. Apparato di congelamento che comprenda un congelatore automatico o meccanico in grado di mantenere una temperatura di 18 C, o inferiore, ghiaccio secco da solo o in un bagno di etanolo. In un bagno di etanolo al 95% con frammenti di ghiaccio secco, il congelamento si completa in circa 15 minuti. 8. Bagnomaria a circolazione dacqua o frigorifero a 1-6 C. 9. Bilancia. Procedimento 1. Raccogliere il sangue in un contenitore che abbia, saldamente attaccate, due sacche satelliti. 2. Centrifugare, ad alta velocit, la sacca di sangue subito dopo il prelievo in una centrifuga refrigerata (da 1 a 6 C). Separare almeno 200 mL di plasma (205 g) privo di cellule per procedere alla crioprecipitazione. 3. Sistemare rapidamente il plasma in un congelatore, cos che il congelamento inizi entro il tempo richiesto per le procedure di raccolta e anticoagulazione. I contenitori di plasma immersi in liquidi devono essere protetti con involucri di plastica. 4. Consentire al plasma congelato di scongelarsi, sistemando il contenitore da 1 a 6 C in un bagnomaria a circolazione dacqua o in un frigorifero. Se si impiega un
Procedimento 1. Centrifugare, ad alto numero di giri (vedi Metodo 7.4), lunit di sangue intero subito dopo il prelievo. Utilizzare una centrifuga refrigerata da 1 a 6 C, a meno che non si debbano preparare piastrine (vedi Metodo 6.13). 2. Sistemare la sacca madre (primaria) centrifugata in un estrattore di plasma e collocare la sacca satellite su una bilancia, portata a zero. Trasferire il plasma nella sacca satellite e pesarlo. 3. Saldare il tubo che unisce la sacca satellite con il saldatore dielettrico o con le clip metalliche ma non coprire il numero sui segmenti del tubo. Sistemare unaltra saldatura il pi vicino possibile alla sacca transfer. 4. Etichettare la sacca satellite con il numero dellunit, prima di separarla dalla sacca primaria. Trascrivere il volume del plasma sulletichetta. 5. Tagliare il tubo fra le due saldature. Il tubo deve essere attorcigliato e sigillato contro il contenitore del plasma, lasciando i segmenti disponibili per poter eseguire tutte le analisi desiderate. 6. Sistemare il plasma in un congelatore a 18 C o a temperature inferiori, entro il tempo richiesto per le procedure di raccolta e di anticoagulazione.
Metodo 6.11 Preparazione di crioprecipitato anti-emofilico da sangue intero

Principio Il Fattore VIII (fattore anti-emofilico, AHF) pu essere concentrato, per crioprecipitazione,
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bagnomaria, usare un involucro di plastica (o altri mezzi) per impedire che le porte dingresso del contenitore si bagnino. 5. Quando il plasma presenta una consistenza flaccida, separare il plasma liquido dal crioprecipitato, impiegando una delle procedure segnalate qui di seguito. a. Centrifugare, ad alta velocit, il plasma in una centrifuga refrigerata da 1 a 6 C. Appendere la sacca capovolta per permetter al plasma scongelato di fluire con rapidit nella sacca satellite, lasciando il crioprecipitato adeso alle pareti della sacca di partenza. Separare rapidamente il crioprecipitato per prevenire un suo scioglimento e la sua fuoriuscita dalla sacca di partenza. Quindici mL di plasma possono essere lasciati nella sacca per la risospensione del crioprecipitato, dopo lo scongelamento. Ricongelare, immediatamente, il crioprecipitato, b. Sistemare il plasma scongelato in un estrattore di plasma. quando circa un decimo del contenuto ancora congelato. Con la sacca in posizione diritta, permettere al plasma sovranatante di fluire nella sacca satellite, utilizzando, come filtri, cristalli di ghiaccio. La pasta di crioprecipitato aderir alle pareti della sacca o ai cristalli di ghiaccio. Saldare la sacca quando circa il 90% del plasma, ridotto nel suo contenuto di crioprecipitato, stato rimosso e ricongelare, immediatamente, il crioprecipitato. 6. Il crioprecipitato dovrebbe essere ricongelato entro 1 ora dallo scongelamento. Conservare a 18 C o a temperature inferiori (ma, preferibilmente, a 30 C o a temperature inferiori) sino a 12 mesi dalla data della raccolta del sangue. Nota Il crioprecipitato AHF pu essere preparato da plasma fresco congelato, in ogni momento, entro 12 mesi dalla raccolta. La data di scadenza del crioprecipitato di 12 mesi dal momento del prelievo del sangue e non dalla data di preparazione.
Metodo 6.12. Scongelare e riunire crioprecipitati AHF

Principio Il crioprecipitato AHF pu essere scongelato rapidamente da 30 a 37 C, ma non pu essere mantenuto a queste temperature, una volta scongelato. Il metodo descritto di seguito consente uno scongelamento rapido e la riunione (pooling) di pi crioprecipitati. Materiali 1. Bagnomaria a circolazione dacqua a 37 C (questi bagnomaria sono disponibili in commercio, cos come lo sono termostati a secco specificatamente studiati). 2. Punti dingresso per medicinali. 3. Cloruro di sodio sterile allo 0,9% per iniezione. 4. Siringhe e aghi. Procedimento 1. Fasciare il contenitore con un rivestimento di plastica per impedire la contaminazione dei punti di entrata da parte di acqua non sterile o usare un mezzo che consenta al contenitore di stare diritto con i punti dingresso al di sopra dellacqua. 2. Risospendere, accuratamente e completamente, il crioprecipitato scongelato, sia risospendendolo, con lievi massaggi, nei residui 10-15 mL di plasma, sia aggiungendo circa 10 mL di soluzione di NaCl allo 0,9% e poi risospendendolo delicatamente. 3. Preparare il pool, inserendo un punto di ingresso per medicinali in una delle vie dentrata di una sacca. Aspirare in una siringa il contenuto di una sacca e trasferirlo nella sacca successiva. Usare volumi crescenti di crioprecipitato sciolto quanto pi possibile nel passaggio da una sacca alla successiva fino a che tutto il pool non sia contenuto nella sacca finale. 4. Il crioprecipitato AHF deve essere conservato a temperatura ambiente. Una volta preparato il pool, questo deve essere
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somministrato entro 4 ore. Unit singole scongelate, non perforate, devono essere somministrate entro 6 ore dallo scongelamento, se utilizzate per rimpiazzare Fattore VIII carente. I pool di singole unit scongelate non possono essere ricongelati.
2.
Metodo 6.13 Preparazione di unit piastriniche partendo da sangue intero

Principio Il plasma ricco di piastrine viene separato dal sangue intero con centrifugazione a bassa velocit e le piastrine vengono concentrate con unulteriore centrifugazione ad alta velocit e con successiva rimozione del plasma sovranatante (vedi Metodo 7.4). Materiali 1. Sangue intero, ottenuto per flebotomia, come descritto al Metodo 6.3, prelevato di fresco in una sacca di raccolta con sacche satelliti strettamente connesse. Il contenitore finale deve essere di una plastica approvata per la conservazione di piastrine. Mantenere il sangue a temperatura ambiente (fra 20 e 24 C), prima di separare il plasma ricco di piastrine dai globuli rossi. Tale separazione deve avvenire entro 8 ore dalla flebotomia. 2. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 3. Forbici, pinze emostatiche. 4. Estrattore di plasma. 5. Saldatore dielettrico (opzionale). 6. Centrifuga, calibrata come descritto nel Metodo 7.4. 7. Bilancia. 8. Agitatore rotante per piastrine. Procedimento 1. Non raffreddare il sangue, in nessun momento, prima o durante la separazione delle piastrine. Se la temperatura della centrifuga compresa fra 1 e 6 C, impostare
3. 4.
5.
6.
7. 8.
il termostato a 20 C e attendere che la temperatura si approssimi il pi possibile ai 20 C. Centrifugare il sangue a bassa velocit (vedi Metodo 7.4). Usando lestrattore di plasma, far fluire il plasma ricco di piastrine in una delle sacche satelliti (in plastica adatta per la conservazione di plasma ricco di piastrine). Saldare il tubo in due punti fra la sacca primaria e il connettore ad Y di due sacche satelliti e tagliare fra le due saldature. Sistemare i globuli rossi fra 1 e 6 C. Centrifugare, ad alta velocit, il plasma ricco di piastrine a 20 C (vedi Metodo 7.4). Far fluire il plasma povero di piastrine in una seconda sacca satellite e saldare il tubo di connessione. Un po di plasma dovrebbe restare con il fondo di piastrine, ma non si pu indicarne il volume esatto. Gli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali richiedono che resti una quantit di plasma sufficiente a mantenere il pH a 6,2 o a valori pi alti per tutto il periodo della conservazione. Ci comporta un minimo di 35 mL di plasma se la conservazione avviene fra 20 e 24 C, ma 50-70 mL sono preferibili. Il concentrato piastrinico deve essere lasciato a riposo, per circa 1 ora, a temperatura ambiente, mettendo in basso il lato con le etichette. Risospendere le piastrine utilizzando una delle modalit descritte qui di seguito. a. Massaggiare delicatamente il contenitore delle piastrine per ottenere una risospensione uniforme. b. Sistemare il contenitore su un agitatore rotante, a temperatura ambiente. Unagitazione lenta e delicata dovrebbe conseguire una risospensione completa entro 2 ore. Mantenere la sospensione piastrinica fra 20 e 24 C, in continua delicata agitazione. Prima di consegnarli, i concentrati piastrinici devono essere ispezionati per accertarsi che non presentino aggregati visibili.
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Note Il plasma povero di piastrine pu essere immediatamente congelato e conservato come plasma fresco congelato, se la separazione e il congelamento sono completati nei tempi richiesti per le procedure di raccolta e di anticoagulazione. Il volume di plasma fresco congelato, ottenuto dopo la preparazione di concentrati piastrinici, sar chiaramente minore di quello preparato direttamente da sangue intero.
Metodo 6.15 Rimozione del plasma (riducendone il volume) dai concentrati piastrinici
Principio Sebbene una conservazione ottimale delle piastrine richieda un adeguato volume di plasma, alcuni pazienti non tollerano infusioni di grandi quantit di liquidi. I concentrati piastrinici conservati possono essere centrifugati e molto plasma pu essere rimosso subito prima della trasfusione, ma essenziale una risospensione appropriata delle piastrine. Le piastrine devono rimanere a temperatura ambiente, a riposo senza essere agitate, da 20 a 60 minuti, prima di essere risospese nel plasma rimasto. La trasfusione deve essere eseguita entro 4 ore dal momento della perforazione della sacca. La riduzione del volume pu essere effettuata sullunit singola o sul pool. Non esiste parere unanime circa la velocit ottimale per la centrifugazione. Uno studio1 ha riferito una perdita dal 35 al 55% di piastrine in molte unit centrifugate a 500 x g per 6 minuti, paragonate a una perdita dal 5 al 20% in unit centrifugate a 5.000 x g per 6 minuti o a 2.000 x g per 10 minuti. Gli Autori raccomandano 2.000 x g per 10 minuti, al fine di evitare che una forza centrifuga maggiore possa alterare il contenitore di plastica. Uno studio di Moroff et al.2 ha osservato una perdita media di piastrine inferiore al 15% in 42 unit centrifugate a 580 x g per 20 minuti. Forze centrifughe di maggiori g determinano problemi, in quanto possono danneggiare le piastrine premendole contro le pareti della sacca e anche determinando possibili rotture del contenitore. Materiali 1. Concentrati piastrinici preparati come descritto nel Metodo 6.13. 2. Clip metalliche e pinze per saldature manuali. 3. Forbici, pinze emostatiche. 4. Saldatore dielettrico (opzionale). 5. Centrifuga, calibrata come descritto nel Metodo 7.4.
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005:30.
Metodo 6.14 Preparazioni di piastrine ottenute da sangue intero e leucoridotte prima della conservazione
Principio Piastrine leucoridotte prima della conservazione (pre-storage) si possono ottenere da sangue intero filtrando, in linea, plasma ricco di piastrine. Ne risultano concentrati piastrinici leucoridotti e plasma anchesso leucoridotto. Materiali e procedimento sono gli stessi del Metodo 6.13, con leccezione che il plasma ricco di piastrine viene fatto passare attraverso un filtro in linea.
Bibliografia 1. Sweeney JD, Holme S, Heaton WAL, Nelson E. Leukodepleted platelet concentrates prepared by in-line filtration of platelet rich plasma. Transfusion 1995;35:131-6. Sweeney JD, Kouttab N, Penn LC, et al. A comparison of prestorage leukoreduced whole blood derived platelets with bedside filtered whole blood derived platelets in autologous stem cell transplant. Transfusion 2000;40:794-800.
2.
795
6. Estrattore di plasma. Procedimento 1. Trasferire le piastrine in una sacca satellite usando una tecnica standard. I singoli concentrati piastrinici possono richiedere una riduzione di volume per pazienti pediatrici. I concentrati piastrinici da aferesi possono essere processati direttamente. 2. Centrifugare, fra 20 e 24 C, usando uno dei protocolli seguenti: a) 500 x g per 20 minuti; b) 2.000 x g per 10 minuti; c) 5.000 x g per 6 minuti. 3. Senza scuotere il contenuto, trasferire la sacca allestrattore di plasma. Rimuovere da ogni unit singola il plasma, lasciandone 10-15 mL o un volume maggiore, proporzionatamente, nel caso di pool o concentrati piastrinici da aferesi. 4. Segnalare il tempo di scadenza sulla sacca: 4 ore dal momento che la sacca stata perforata. 5. Lasciare riposare la sacca fra 20 e 24 C, senza agitazione, per 20 minti se stata centrifugata a 500 x g o per 1 ora se stata centrifugata a 2.000 o a 5.000 x g. 6. Risospendere le piastrine come descritto nel Metodo 6.13.
Note 1. Se, per rimuovere il plasma da un concentrato piastrinico da aferesi o da singola unit, si usa un connettore sterile, lunit pu essere considerata sterile e non necessario imporre il termine di scadenza di 4 ore, come per le sacche perforate. Non esistono, comunque, dati a sostegno di concentrati piastrinici di volume ridotto; , quindi, preferibile trasfonderli entro il minor tempo possibile. 2. Concentrati piastrinici di volume ridotto non possono essere distribuiti come prodotto autorizzato. 3. I concentrati piastrinici da pool devono essere utilizzati entro 4 ore dopo che lunit stata perforata, siano essi o meno di volume ridotto. I concentrati piastrinici da pool non possono essere distribuiti come prodotto autorizzato.
Bibliografia 1. 2. Simon TL, Sierra ER. Concentration of platelet units into small volumes. Transfusion 1984;24:173-5. Moroff G, Friedman A, Robkin-Kline L, et al. Reduction of the volume of stored platelet concentrates for use in neonatal patients. Transfusion 1984;24:144-6.
796
Metodi sezione 7: Controlli di qualit
Metodi sezione 7
Controlli di qualit
Metodo 7.1 Controllo di qualit per la soluzione di solfato di rame

Entrambi i metodi presentati di seguito sono accettabili per eseguire il controllo di qualit della soluzione di solfato di rame. Metodo 7.1.1 Validazione funzionale della soluzione di solfato di rame Principio La soluzione di solfato di rame pu essere utilizzata per stabilire laccettabilit di un donatore, osservando il comportamento (andata a fondo o galleggiamento) di una goccia di sangue a una concentrazione di emoglobina nota. Materiali 1. Solfato di rame (1,053 di peso specifico). 2. Capillari. 3. Registro dove riportare i risultati. Procedimento 1. Ottenere alcuni campioni (da tre a sei, se possibile) di sangue a concentrazione emoglobinica nota. Tali campioni dovrebbero comprenderne alcuni a concentrazione leggermente superiore e leggermente inferiore a 12,5 g/dL. 2. Far cadere, delicatamente, una goccia di ciascun campione in una provetta contenente una soluzione di solfato di rame dal peso specifico di 1,053.
3. Le gocce di sangue con valore di emoglobina a 12,5 g/dL (o superiore) debbono affondare nella soluzione, mentre quelle a valori inferiori debbono galleggiare. 4. Registrare la data dellanalisi, il produttore, il numero di lotto e la data di scadenza della soluzione di solfato di rame, lidentificazione del campione, i risultati, lidentit delloperatore che ha eseguito il test. 5. Documentare le azioni correttive messe in atto, quando i risultati sono al di fuori di limiti di accettabilit. Metodo 7.1.2 Impiego di strumenti per misurare il peso specifico, la densit o lindice di rifrazione di una soluzione di solfato di rame Principio Il peso specifico, la densit o lindice di rifrazione di una soluzione di solfato di rame possono essere misurati direttamente e i risultati ottenuti si possono paragonare ai valori stabiliti dai produttori. Un errore di 0,0001, nella lettura del peso specifico, corrisponde a 0,06 g/dL di emoglobina nel sangue intero (SI)1. Ne consegue che una soluzione di solfato di rame con peso specifico di 1,053 0,0003 corrisponder a un ambito di variazione emoglobinica di 12,5 0,18 g/dL. Materiali 1. Soluzione di solfato di rame a peso specifico di 1,053. 2. Strumenti di misurazione.
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3. 4. 5. 6.
Per il peso specifico: idrometro ad alta precisione con gradazioni di 0,0005 o inferiori. Per lindice di rifrazione: rifrattometro. Pipette. Per il peso specifico: cilindro graduato o altro contenitore adatto, da utilizzare con un idrometro. Alcol per pulire lidrometro. Registro dove riportare i risultati.
Procedimento Per il peso specifico (impiego di un idrometro): 1. pulire con alcol lidrometro e asciugarlo; 2. immergere delicatamente lidrometro nella soluzione sino a che galleggia spontaneamente. La presenza di gocce di soluzione nello stelo pu determinare letture non corrette; 3. per leggere il risultato osservare il punto subito al di sotto della superficie del liquido, alzare poi la linea di visione fino a che la superficie viene vista come una linea diritta piuttosto che unellisse. Leggere al punto dove la linea interseca la scala sullo strumento. Per lindice di rifrazione: 1. seguire le istruzioni del produttore per luso e la manutenzione del rifrattometro; 2. aggiungere una goccia di solfato di rame al rifrattometro; 3. osservare lindice di rifrazione. Nota: alcuni rifrattometri preparati per le analisi sulle urine sono in grado di fornire sia un indice di rifrazione sia un peso specifico. Non leggere il peso specifico direttamente da questo rifrattometro; 4. una soluzione di solfato di rame con un peso specifico di 1,053 avr un indice di rifrazione di circa 1,3425 a temperatura ambiente2. Per entrambi i metodi: 1. registrare: i risultati, la data delle analisi, il produttore, il numero di lotto e la data di scadenza della soluzione di solfato di rame, lidentit delloperatore che ha condotto lanalisi, lidentificazione dello strumento utilizzato per le misurazioni; 2. documentare le azioni correttive messe in atto quando i risultati sono al di fuori dei limiti di accettabilit. Nota Per misurare direttamente la densit si pu
utilizzare un densimetro liquido. A 4 C, la densit di una soluzione sar esattamente la stessa del peso specifico (peso specifico = densit della soluzione/densit dellacqua; densit dellacqua a 4 C = 1 g/mL). Quando la densit viene misurata a temperatura ambiente, si usa un fattore di conversione pari a 0,9970 (la densit dellacqua a 25 C) per calcolare il peso specifico2. Il peso specifico di una soluzione di solfato di rame a 25 C pari alla densit osservata in g/mL diviso 0,9970 g/mL.
Bibliografia 1. Phillips RA, Van Slyke DD, Hamilton PB, et al. Measurement of specific gravities of whole blood and plasma by standard copper sulfate solutions. J Biol Chem 1950;183:305-30. Blood hemoglobin screening (specific gravity method). Technical Reference Document 12. Arlington, TX: Ricca Chemical Company, 2002.
2.
Metodo 7.2 Standardizzazione e calibrazione dei termometri

Principio I termometri usati in un laboratorio di sierologia e nelle attivit connesse alla raccolta (idoneit del donatore), lavorazione e conservazione degli emocomponenti e dei reagenti debbono essere calibrati e standardizzati, per assicurare indicazioni corrette delle temperature. La calibrazione deve avvenire a una temperatura la pi vicina possibile alla temperatura alla quale il termometro sar impiegato. Nel corso del tempo, i termometri liquidi, in vetro, possono dare differenti letture a una data temperatura, a causa di modifiche nel volume del bulbo indotte da rilassamenti del vetro1. Ogni termometro dovrebbe essere calibrato prima del suo uso iniziale e, poi, periodicamente, ogniqualvolta si sospettino modifiche o danneggiamenti. La calibrazione deve essere effettuata su tutti i termometri elettronici, compresi quelli descritti come auto-calibrantisi.
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Materiali 1. Termometri certificati dal NIST (National Institute of Standards and Technology) o termometri muniti di un certificato di calibrazione rilasciato dal NIST. 2. Termometri da calibrare. 3. Contenitori idonei: per esempio, becker da 250500 mL. 4. Acqua. 5. Ghiaccio in pezzi. 6. Bagnomaria a 37 C. 7. Registro dove riportare i risultati. Metodo 7.2.1 Termometri in vetro contenenti liquido (termometri comuni) impiegati in laboratorio Procedimento 1. Prima di scegliere un termometro per applicazioni particolari, prendere in considerazione tutti i fattori pertinenti, per essere certi che il termometro verr impiegato a immersione appropriata e seguendo le istruzioni del produttore per un suo uso corretto. Quando si impiega un termometro certificato, leggere e seguire le note relative. Accertarsi di includere tutti i fattori di correzione riportati sul certificato NIST del termometro e applicarli nei calcoli. 2. Classificare i termometri per fattori-chiave, quali limmersione, gli incrementi e la temperatura adatta allutilizzo previsto. Testarli a gruppi, confrontando quelli riuniti. Non tentare di paragonare far loro, in una sola procedura, termometri con caratteristiche differenti. 3. Numerare ogni termometro da testare (sistemando, per esempio, un numero su un nastro nella parte alta del termometro o utilizzando il numero di serie del produttore). 4. Eseguire la calibrazione con acqua a una temperatura vicina a quella alla quale il termometro sar impiegato. a. Per calibrare a 37 C, porre i termometri da testare e il termometro NIST alla stessa profondit in un bagno a 37 C standard, assicurandosi che le punte di tutti gli strumenti siano, nel liquido, allo stesso livello. b. Per calibrare termometri da 1 a 6 C,
riempire un contenitore adatto con acqua. Aggiungere ghiaccio in pezzi fino a raggiungere la temperatura desiderata. Sistemare i termometri da testare e quello NIST a uneguale profondit nella mistura acqua/ghiaccio, assicurandosi che le punte di tutti gli strumenti siano allo stesso livello nel liquido e non a diretto contatto con il ghiaccio. 5. Agitare con movimenti costanti e casuali, finch la temperatura non si equilibra (circa 3-5 minuti). 6. Osservare le temperature. Registrare gli estremi di identificazione di ogni termometro e i risultati. Laccettabilit dei risultati dipende dal livello di precisione richiesto, ma, per la maggior parte delle applicazioni nei servizi trasfusionali, una concordanza entro 1 C fra due termometri si pu considerare accettabile. Se la lettura si diversifica per pi di 1 grado, il termometro pu essere restituito al fornitore (se acquistato di recente), etichettato con il fattore di correzione (i gradi che lo diversificano dal termometro NIST) che si deve applicare a ogni lettura o scartato. 7. Completare la registrazione sulla calibrazione con la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito lesame. Note 1. Se un termometro deve essere usato per temperature ad ampio raggio di gradi (per esempio 10 gradi), si dovrebbero eseguire calibrazioni a tre punti. Utilizzare acqua alla temperatura appropriata. Testare le temperature appena al di sotto, appena al di sopra e a met dei punti desiderati. Per essere ritenuti accettabili, tutti i risultati dovrebbero variare essere entro 1 C rispetto al termometro NIST. 2. I termometri debbono essere osservati regolarmente per eventuali rotture nelle colonne, dato che ci pu determinare letture non corrette. Le metodiche al riguardo possono essere trovate negli Standard NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) 12-A22. Documentare le azioni correttive intraprese e calibrare nuovamente i termometri.
799
Bibliografia 1. Wise JA. A procedure for the effective recalibration of liquid-in-glass thermometers. NIST Special Publication 819. Gaithersburg, MD: National Institute of Standards and Technology, 1991. Temperature calibration of water baths, instruments, and temperature sensors. 2nd ed; approved standard I2-A2 Vol. 10 No. 3. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1990.
2.
Metodo 7.2.2 Termometri orali elettronici Procedimento 1. Per verificare la calibrazione, utilizzare uno dei metodi descritti qui di seguito: a. seguire le raccomandazioni dei produttori per verificare la calibrazione; b. usare un calibratore del commercio, seguendo scrupolosamente le istruzioni del produttore; c. calibrare il termometro, inserendolo in un bagnomaria a 37 C insieme a un termometro certificato NIST. 2. Un risultato pu essere ritenuto accettabile se la lettura sul termometro corrisponde a quello del termometro NIST con uno scarto di 0,1 C. Se non si ottengono i risultati attesi, i termometri dovrebbero essere restituiti al distributore. Documentare le azioni correttive messe in atto. 3. Registrare: la data del test, i numeri di identificazione dei termometri, le letture delle temperature e lidentit delloperatore che ha effettuato lesame.
Metodo 7.3 Controllo degli allarmi degli apparecchi di conservazione del sangue
I frigoriferi e i congelatori adibiti alla conservazione di emocomponenti debbono essere muniti di un sistema per monitorare continuamente la temperatura e di allarmi sonori. Se lapparecchio di conservazione va in allarme, essenziale che il personale conosca le azioni appropriate da
prendere. Le istruzioni per una tale eventualit debbono essere largamente disponibili e si deve istruire il personale a iniziare le azioni pertinenti, se la temperatura non pu essere corretta rapidamente. Per un funzionamento corretto, lallarme di ogni singolo apparecchio di conservazione deve essere controllato periodicamente. Si ritengono appropriati controlli mensili sino a che il buon funzionamento di un dato apparecchio di conservazione si dimostrato continuo. Anche gli allarmi, inoltre, debbono essere regolarmente e frequentemente controllati, cos da ottenere e mantenere la competenza del personale, insieme alla capacit di evidenziare malfunzionamenti. Per apparecchi in buone condizioni, sono di solito sufficienti controlli trimestrali. Dato che gli allarmi possono essere scollegati durante le riparazioni, prudente verificare la funzionalit degli allarmi dopo aggiustamenti. Si debbono controllare le temperature minime e massime che attivano gli allarmi e registrarne i risultati. Gli Standard AABB per i Centri e i Servizi Trasfusionali1(p5)* richiedono che gli allarmi siano regolati in modo da attivarsi a temperature che permettano di intervenire, in maniera appropriata, prima che il sangue e gli emocomponenti raggiungano temperature non idonee. Poich sono disponibili apparecchiature diverse, non possibile fornire istruzioni specifiche valide per tutti i tipi di allarmi. Se il manuale di istruzione di un apparecchio non fornisce informazioni su come controllare gli allarmi, consultare il produttore o un esperto di apparecchi da conservazione. Il manuale sulle procedure in uso presso una struttura deve riportare una descrizione dettagliata delle metodiche impiegate (vedi Appendice 10 per quanto riguarda gli intervalli fra i controlli di qualit). Metodo 7.3.1 Controllare gli allarmi dei frigoriferi Principio Le temperature dei frigoriferi possono aumentare oltre limiti accettabili per le ragioni riportate di seguito. 1. Scorretta chiusura delle porte. 2. Scarsit di refrigerante. 3. Guasti al compressore. 4. Sporcizia nello scambiatore di calore o suo blocco.
800
5. Mancanza di energia elettrica. Materiali 1. Termometro calibrato. 2. Bacinella sufficientemente capiente da contenere una termocoppia. 3. Acqua. 4. Ghiaccio in pezzi. 5. Sale da tavola. 6. Registro dove riportare i risultati. Procedimento 1. Verificare che i circuiti degli allarmi siano operativi. Si accende lallarme, con una temperatura di partenza compresa fra 1 e 6 C. Immergere, nel contenitore che porta la termocoppia dellallarme, un termometro calibrato e di facile lettura. Attivazione degli allarmi per le basse temperature: 2. sistemare il contenitore con la termocoppia e il termometro in una bacinella che contenga acqua e ghiaccio sciolto a una temperatura di 4 C o inferiore. Per raggiungere questa temperatura, aggiungere alcune cucchiaiate di sale da tavola; 3. chiudere la porta del frigorifero per evitare cambiamenti di temperatura nel settore adibito alla conservazione. Mantenere il contenitore nella bacinella con la soluzione fredda e agitare con delicatezza e periodicamente fino a che lallarme non suona; 4. registrare la temperatura come quella di attivazione dellallarme a bassa temperatura. Attivazione degli allarmi per le alte temperature: 5. sistemare il contenitore con la termocoppia e il termometro in una bacinella che contenga acqua fredda (per esempio, fra 12 e 15 C); 6. chiudere la porta del frigorifero. Consentire al liquido del contenitore di riscaldarsi lentamente, con periodiche agitazioni; 7. registrare la temperatura alla quale lallarme suona, come limite di attivazione di temperatura elevata; 8. registrare: la data del test, la identificazione del frigorifero, lidentificazione del termometro, lidentit delloperatore che ha condotto il test; 9. se le temperature di attivazione sono o troppo basse o troppo alte, adottare le azioni correttive
opportune, quali quelle suggerite dal produttore, registrare le caratteristiche di queste azioni e ripetere il controllo degli allarmi, per documentare che le correzioni sono state efficaci. Note 1. La termocoppia dovrebbe essere facilmente accessibile e dotata di un cordone sufficientemente lungo da essere maneggiata agevolmente. 2. Non necessario che la termocoppia per monitorare la temperatura con continuit sia nello stesso contenitore dellallarme. Se si trova nello stesso contenitore, questo dovrebbe essere annotato nelle registrazioni, al fine di spiegare ogni temperatura al di fuori della media quale risultato del controllo dellallarme. 3. Quando si controllano le temperature di attivazione degli allarmi, potrebbero intervenire modifiche molto lente, cos che le misurazioni e le registrazioni saranno accurate. Modifiche troppo rapide, invece, possono creare la falsa impressione che lallarme non suoni, fintanto che non si registrata una temperatura non appropriata. 4. La bassa temperatura di attivazione dovrebbe essere maggiore di 1 C (per esempio 1,5 C) e quella alta minore di 6 C (per esempio 5,5 C). 5. Gli allarmi dovrebbero suonare simultaneamente nel posto dove situato il frigorifero e, se lo si impiega, nel luogo dove installato lallarme remoto. 6. La quantit di liquido dove viene immersa la termocoppia non deve essere maggiore del volume del pi piccolo emocomponente conservato in un dato frigorifero. La termocoppia pu essere immersa in volume di liquido minore, ma ci comporta che lallarme cesser di funzionare con modifiche minori di quelle registrate in volumi maggiori di liquido. Una eccessiva sensibilit pu creare disguidi. 7. Con lassistenza di un elettricista qualificato, i richiesti controlli degli allarmi su unit praticamente inaccessibili potranno essere condotti utilizzando la modifica citata da Wenz e Owens2.
801
Bibliografia 1. Silva MA, ed. Standards for blood banks and transfusion services. 23rd ed. Bethesda, MD: AABB, 2005. Wenz B, Owens RT. A simplified method for monitoring and calibrating refrigerator alarm systems. Transfusion 1980;20:75-8.
2.
Metodo 7.3.2 Controllare gli allarmi dei congelatori Principio La temperatura di un congelatore pu aumentare a livelli inaccettabili per una serie di motivi; le cause pi comuni sono elencate qui di seguito: 1. scorretta chiusura della porta o del coperchio del congelatore; 2. scarsit di refrigerante; 3. guasti al compressore; 4. sporcizia nello scambiatore di calore o suo blocco; 5. mancanza di energia elettrica. Materiali 1. Protezioni per il contenuto del congelatore (per esempio un telo). 2. Termometro calibrato o termocoppia indipendenti da quelli del sistema. 3. Acqua calda o un guanto da forno. 4. Registro dove riportare i risultati. Procedimento 1. Proteggere, durante il test, i prodotti congelati da temperature elevate. 2. Usare un termometro o una termocoppia, indipendenti da quelli inseriti nel sistema, in grado di indicare con accuratezza la temperatura di attivazione dellallarme. Paragonare quanto osservato con le temperature riportate sul registratore. 3. Riscaldare lentamente la sonda dellallarme (per esempio, in acqua calda, con la mano ricoperta da un guanto da forno o con lesposizione allaria). La specifica temperatura di attivazione non si pu determinare accuratamente con un veloce riscaldamento e la temperatura visibile risulter troppo alta.
4. Registrare: la temperatura alla quale lallarme suona, la data del test, lidentit delloperatore che ha eseguito lesame, lidentificazione del congelatore e degli strumenti di calibrazione e ogni altra osservazione che possa indicare unattivit impropria. 5. Far ritornare il congelatore e il sistema di allarme alle loro condizioni normali. 6. Se lallarme suona a temperature troppo alte, mettere in atto azioni correttive appropriate, come quelle suggerite dal produttore, registrare le caratteristiche delle azioni correttive, ripetere i controlli sullallarme per documentare che le correzioni messe in atto siano state efficaci. Note 1. Gli allarmi dovrebbero suonare simultaneamente nel locale dove situato il frigorifero e, se lo si impiega, nel luogo dove installato lallarme remoto. Se si usa lallarme remoto, il controllo degli allarmi dovrebbe verificare anche che lallarme suoni nel luogo dove inserito lallarme remoto. 2. Controllare la funzionalit delle batterie, i circuiti elettrici e gli allarmi di energia carente molto pi frequentemente dei controlli di attivazione delle temperature. Registrare: funzionalit, identificazione del congelatore, data del test, identit delloperatore che ha eseguito lesame. 3. Per congelatori con i sensori installati nelle pareti o allesterno, riscaldare il sito o permettere che la temperatura salga sino al punto da far suonare lallarme. Rimuovere il contenuto congelato o proteggerlo, isolandolo, mentre la temperatura aumenta. 4. Per congelatori con termocoppie immerse in soluzioni anticongelanti, togliere il contenitore e i cavi dallinterno del congelatore, lasciando le porte chiuse e il materiale ben protetto. 5. Per congelatori con allarmi che suonano ogni volta che la temperatura raggiunge livelli pi alti di quanto regolato dallapparecchio di controllo, sistemare il controllore a una temperatura pi alta e annotare a quale temperatura gli allarmi suonano. 6. I congelatori ad azoto liquido debbono aver sistemi di allarme in grado di attivarsi quando
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lazoto a livelli non sicuri.
Metodo 7.4. Calibrazione funzionale delle centrifughe impiegate per la separazione di piastrine
Principio Una corretta preparazione di concentrati piastrinici (CP) richiede una centrifugazione idonea, ma non eccessiva; lapparecchiatura impiegata deve agire in modo costante e affidabile. Tutte le centrifughe usate per preparare piastrine (PLT) dovrebbero essere calibrate alinizio e controllate dopo ogni modifica od ogni riparazione. Una calibrazione funzionale della centrifuga, sia per preparare plasma ricco di PLT (PRP) da SI che per la successiva preparazione di CP da PRP, pu essere effettuata durante lo stesso procedimento. Materiali 1. SI, prelevato di recente, ottenuto con flebotomia e raccolto in una sacca con due sacche satelliti. 2. Un campione di sangue del donatore, raccolto in EDTA, in aggiunta ai campioni prelevati per gli esami di routine. 3. Clip metalliche e pinze per saldature manuali o saldatori dielettrici.
4. Strumenti puliti (forbici, pinze emostatiche, pinze rotanti per spremere il sangue lungo i tubi). 5. Estrattore di plasma. 6. Centrifuga adatta alla preparazione di CP. 7. Registro sul quale riportare i risultati. Procedimento Preparazione di plasma ricco di piastrine 1. Eseguire un conteggio del numero di PLT su un campione anticoagulato. Se la conta inferiore a 133.000/L, non utilizzare il sangue di questo donatore per la calibrazione. 2. Calcolare e registrare il numero di PLT dellunit di SI: PLT/L x 1.000 x mL di SI = numero di PLT nellunit. 3. Preparare il PRP alla velocit di centrifugazione e per il tempo selezionati (vedi Tabella 7.4.1 alla voce bassa velocit o seguire le istruzioni fornite dal produttore della centrifuga). 4. Sistemare un morsetto temporaneo sul tubo di una sacca satellite cos che essa non sia pervia. Spingere il PRP nellaltra sacca satellite. Saldare il tubo vicino alla sacca madre (primaria), lasciando una lunga porzione di tubo (la cosiddetta coda). Staccare le due sacche satelliti dalla sacca primaria. Non rimuovere il morsetto temporaneo fra le due sacche satelliti sino a che le PLT non siano state preparate (vedi la successiva sezione Preparazione delle PLT).
Tabella 7.4.1 - Centrifugazioni per la preparazione di emocomponenti Alta velocit Globuli rossi PLT da SI
} }
5.000 x g per 5 minuti* 5.000 x g per 7 minuti*
Plasma senza cellule Crioprecipitato
Bassa velocit Plasma Ricco di PLT (PRP)
2.000 x g per 3 minuti+
Per calcolare la forza relativa di centrifugazione in g: 28,38 x R (raggio della centrifuga) x (numero giri per minuto/1.000)2
* I tempi riportati comprendono laccelerazione ma non la decelerazione e sono soltanto indicativi. Ogni singola centrifuga va valutata per la preparazione dei diversi emocomponenti.
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5. Spremere pi volte il tubo e la coda cos che contengano un campione rappresentativo di PRP. 6. Saldare un segmento della coda e staccarlo, cos che la sacca contenente il PRP resti sterile. 7. Eseguire un conteggio piastrinico sul segmento saldato. Calcolare e registrare il numero di PLT nella sacca contenente PRP: PLT/L x 1.000 x mL di PRP = numero di PLT nel PRP. 8. Calcolare e registrare la percentuale della resa (numero di PLT nel PRP x 100) diviso il numero di PLT nel SI = % di resa). 9. Ripetere la procedura illustrata al punto 8 per tre o quattro volte su donatori differenti, usando differenti velocit e tempi di centrifugazione e paragonare le diverse rese ottenute. 10. Selezionare i tempi pi brevi e le velocit pi basse che forniscono percentuali di resa pi alte, senza rilevante presenza di globuli rossi nel PRP. 11. Registrare: le caratteristiche identificative della centrifuga, la tecnica di calibrazione scelta, la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito la calibrazione. Preparazione delle piastrine 1. Centrifugare il PRP (preparato come descritto sopra) per il tempo e alla velocit scelti (vedi centrifugazione ad alta velocit nella Tabella 7.4.1 o seguire le direttive fornite dal produttore). 2. Rimuovere il morsetto temporaneo fra le due sacche satelliti e passare il plasma povero di piastrine (PPP) nella seconda sacca satellite, lasciando circa da 55 a 60 mL di plasma nella sacca con le piastrine. Saldare il tubo, lasciandone un lungo segmento attaccato alla sacca con le piastrine. 3. Consentire alle piastrine di restare a riposo per circa unora. 4. Sistemare le piastrine su un agitatore orbitante per almeno unora, consentendone una risospensione uniforme. Una conta piastrinica effettuata subito dopo la centrifugazione non sarebbe accurata. 5. Spremere pi volte il tubo, mischiando il suo contenuto con quello della sacca delle piastrine.
Saldarne un segmento e staccarlo, cos che la sacca contenente le piastrine rimanga sterile. 6. Eseguire un conteggio piastrinico del contenuto del segmento. 7. Calcolare e registrare il numero di piastrine nel concentrato: PLT/L x 1.000 x mL di PLT = numero di piastrine nel concentrato. 8. Calcolare e registrare la percentuale di resa. 9. Ripetere il procedimento illustrato in precedenza per il PRP, utilizzando donatori diversi, differenti tempi e velocit di centrifugazione, comparandone le rese ottenute alle diverse condizioni. 10. Selezionare il tempo pi breve e la velocit pi bassa che determinano le rese maggiori in piastrine nel CP. 11. Registrare: le caratteristiche identificative della centrifuga, la tecnica di calibrazione scelta, la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito la calibrazione. Note 1. Non necessario sottoporre a nuova calibrazione una centrifuga, a meno che lo strumento non sia stato sottoposto ad adattamenti o a riparazioni o se il controllo di qualit degli emocomponenti indica conte piastriniche al di sotto di un livello accettabile. La calibrazione dei tempi, della velocit e della temperatura, tuttavia, dovrebbe essere condotta a cadenza regolare (vedi Appendice 10). 2. Ogni centrifuga utilizzata per preparare piastrine deve essere calibrata singolarmente. Impiegare le condizioni determinate come ottimali per ogni singolo strumento. 3. Quando si contano piastrine su uno strumento impiegato per contare cellule su sangue intero, pu essere necessario impiegare un fattore di correzione per ottenere risultati accurati. 4. Quando si determinano tempi e velocit di centrifugazione appropriati per la preparazione di concentrati piastrinici, si dovrebbero prendere in considerazione anche gli altri emocomponenti ottenibili da sangue intero. La quantit finale, lematocrito eritrocitario e il volume del plasma disponibili per altre procedure, rappresentano fattori
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importanti da prendere in considerazione.
Bibliografia 1. Kahn R, Cossette I, Friedman L. Optimum centrifugation conditions for the preparation of platelet and plasma products. Transfusion 1976;16:162-5. McShine R, Das P, Smit Sibinga C, Brozovic B. Effect of EDTA on platelet parameters in blood and blood components collected with CPDA-1. Vox Sang 1991;61:84-9.
Controllo positivo. Globuli rossi D positivi sospesi in fisiologica dal 2 al 5%. Controllo negativo. Globuli rossi D negativi sospesi in fisiologica dal 2 al 5%. Procedimento 1. Per ciascuna serie di test (per anticorpi attivi in fisiologica o in mezzo iperproteico), etichettare cinque provette per le reazioni positive e cinque per le reazioni negative. 2. Utilizzando le quantit normalmente impiegate, aggiungere il siero anti-B diluito a ciascuna di dieci provette per i test in fisiologica e il siero anti-D diluito a ciascuna di 10 provette per i test in mezzo iperproteico. Aggiungere siero e reagenti nelle quantit impiegate routinariamente. 3. Aggiungere le sospensioni appropriate di globuli rossi di controllo alle serie di provette (una serie positiva e una negativa per i test in fisiologica e una serie positiva e una negativa per i test in mezzo iperproteico). Centrifugare immediatamente per il tempo prescelto (per esempio per 10 secondi). 4. Esaminare ogni provetta per lagglutinazione e registrare i risultati (vedi esempi in Tabella 7.5.1). 5. Ripetere i punti 2 e 3 con altri tempi (per esempio, 15, 20, 30 e 45 secondi). Non lasciare ad incubare sieri e cellule prima della centrifugazione. 6. Scegliere il tempo ottimale di centrifugazione, che quello pi breve in grado di corrispondere ai criteri elencati di seguito. a. Lagglutinazione nelle provette dei test positivi potente, come determinato nel preparare i reagenti. b. Non vi sono n agglutinazioni n quadri ambigui nelle provette dei test negativi. c. Il bottone cellulare chiaramente delineato e il contorno ben definito e non sfrangiato. d. Il sovranatante limpido. e. Il bottone cellulare si risospende con facilit. Negli esempi riportati in Tabella 7.5.1, questi criteri vengono rispettati da centrifugazioni da 30 a 45 secondi. Il tempo ottimale di 30 secondi.
2.
Metodo 7.5 Calibrazione funzionale di una centrifuga per test sierologici

Principio Ogni centrifuga dovrebbe essere calibrata subito dopo lacquisto, dopo qualsiasi modifica o riparazione e periodicamente. La calibrazione valuta il comportamento dei globuli rossi in soluzioni di differente viscosit, ma non la reattivit di differenti anticorpi. Per i test di agglutinazione immediata Materiali 1. Provette di 10 x 75 mm o di 12 x 75 mm (qualsiasi sia il tipo usato di routine nel laboratorio). 2. Registro dove riportare i risultati. 3. Per anticorpi attivi in fisiologica: Siero di un soggetto di gruppo A (cio, antiB) diluito con 6% di albumina, capace di dare unagglutinazione di grado 1+ macroscopicamente (3 mL di albumina bovina al 22% + 8 mL di fisiologica = albumina bovina al 6%). Vedi Metodo 1.5. Controllo positivo. Globuli rossi di gruppo B sospesi in fisiologica dal 2 al 5%. Controllo negativo. Globuli rossi di gruppo A sospesi in fisiologica dal 2 al 5%. 4. Per anticorpi attivi in mezzo iper-proteico Anti-D diluito con il 22% o il 30% di albumina, capace di dare unagglutinazione macroscopica di grado 1+.
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Tabella 7.5.1 - Esempi di risultati conseguiti con test su centrifughe da sierologia* Tempi in secondi Criteri Sopranatante limpido Bottone cellulare ben delineato Cellule che si risospendono con facilit Agglutinazione osservata Negativit nelle provette negative 10 No No S S 15 No No S S 20 S No S 1+ S 30 S S S 1+ S 45 S S S 1+ Risospensione grossolana
*In questi esempi, il tempo ottimale di centrifugazione di 30 secondi.
7. Registrare: lidentificazione della centrifuga, i tempi scelti, la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito la calibrazione. Per i lavaggi e i test allantiglobulina I test nei quali si aggiunge ai globuli rossi lantiglobulina (AHG) possono richiedere centrifugazioni differenti da quelle utilizzate nellagglutinazione immediata. Si possono determinare, sia per il lavaggio sia per il test allAHG, appropriate centrifugazioni. Notare che, in tali procedimenti, non si controlla la completezza di un lavaggio; laggiunta di emazie rivestite da IgG nei test negativi allAHG serve da controllo a questo scopo. Il procedimento illustrato pi sotto prende in considerazione soltanto i meccanismi delle centrifugazioni. Materiali 1. Reagente antiglobuline umane, non modificato. 2. Soluzione fisiologica, in grande quantit. 3. Provette da 10 x 75 mm o 12 x 75 mm, (quelle in uso nel laboratorio). 4. Registro dove riportare i risultati. 5. Controllo positivo. Sospensione dal 2 al 5% di globuli rossi D positivi, incubati, per 15 minuti a 37 C, con siero anti-D diluito al punto da dare unagglutinazione macroscopica di 1+, dopo aggiunta dellAHG. 6. Controllo negativo. Sospensione dal 2 al 5% di globuli rossi D positivi, incubati, per 15 minuti a 37 C, con albumina al 6%. (Nota: come
controllo negativo si possono anche impiegare globuli rossi D negativi, incubati con siero antiD diluito). Procedimento 1. Preparare cinque provette che contengano 1 goccia di globuli rossi positivi e cinque provette che contengano 1 goccia di globuli rossi negativi di controllo. 2. Riempire le provette con soluzione fisiologica e centrifugarle in coppia (una con emazie positive e una con emazie negative), con tempi differenti (per esempio, per 30, 45, 60 e 120 secondi). I globuli rossi debbono formare un bottone chiaramente delineato, con pochissime cellule che si trascinano lungo le pareti della provetta. Dopo che si eliminata la fisiologica, il bottone di emazie si dovrebbe risospendere nel liquido rimasto. Il tempo ottimale per il lavaggio quello pi breve che consegue questi obiettivi. 3. Ripetere la procedura di lavaggio su entrambe le coppie per altre tre volte, impiegando il tempo che si dimostrato ottimale. 4. Eliminare completamente la fisiologica. 5. Aggiungere lAHG alla provetta di controllo positivo e a quella di controllo negativo. Centrifugare immediatamente, per il tempo scelto (per esempio 10 secondi) 6. Esaminare ciascuna provetta per lagglutinazione e registrare quanto osservato. 7. Ripetere i punti 5 e 6 per i diversi tempi (per
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esempio, 15, 20, 30 e 45 secondi). Non lasciare ad incubare cellule e AHG prima della centrifugazione. 8. Selezionare il tempo ottimale per una agglutinazione immediata. 9. Registrare: lidentificazione della centrifuga, i tempi selezionati, la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito la calibrazione. Note Si debbono effettuare calibrazioni periodiche per verificare che i tempi usati continuino a essere quelli ottimali. Ci si pu realizzare usando una versione abbreviata della procedura riferita sopra. Per esempio, utilizzare il tempo in uso per una particolare centrifuga e per ciascun tipo di medium e tempi appena al di sopra o appena al di sotto di quelli correntemente utilizzati.
allAHG. 5. Fisiologica normale. 6. AHG, del tipo anti-IgG o polispecifico. 7. Registro dove riportare i risultati. Procedimento 1. A ciascuna di 12 provette, aggiungere ladditivo potenziante e il siero umano in quantit che rispettino il loro uso di routine e 1 goccia di globuli rossi rivestiti da IgG. 2. Sistemare le provette sul porta-provette della lavacellule, porlo nella centrifuga e iniziare i cicli di lavaggio. 3. Dopo laggiunta di fisiologica del secondo ciclo di lavaggio, fermare la lavacellule. Osservare i contenuti di ciascuna provetta. Vi deve essere lo stesso volume, circa, di salina in tutte le provette; sono accettabili piccole variazioni. Le provette dovrebbero essere piene per l80% della loro capienza al fine di evitare schizzi e contaminazioni incrociate. (Riferirsi alle istruzioni del produttore per specifici requisiti.) Registrare quanto osservato. 4. Osservare attentamente tutte le provette per vedere se i globuli rossi si sono risospesi completamente. Registrare quanto osservato. 5. Continuare il ciclo di lavaggio. 6. Dopo laggiunta di fisiologica nel terzo ciclo, fermare la lavacellule e ispezionare le provette, come precedentemente segnalato. Registrate quanto osservato. 7. Completare il ciclo di lavaggio. 8. Alla fine dellintero ciclo di lavaggio, ispezionare tutte le provette per verificare che la fisiologica sia stata totalmente eliminata e che ciascuna provetta contenga un bottone secco di emazie. Registrare quanto osservato. 9. Aggiungere lAHG, secondo le istruzioni del produttore, centrifugare ed esaminare ciascuna provetta per la presenza di agglutinazione. Se la lavacellule ha funzionato in maniera idonea, la dimensione di ciascun bottone eritrocitario dovrebbe essere la stessa in tutte le provette. Tutte le provette dovrebbero mostrare lo stesso grado di agglutinazione. Registrare quanto osservato. 10. Registrare: lidentificazione della centrifuga, la
Metodo 7.6 Analisi delle prestazioni di lavacellule automatiche

Principio LAHG viene rapidamente inattivata da immunoglobuline non legate (alle cellule). I globuli rossi, cui verr aggiunta lAHG, devono essere privati, con i lavaggi, di tutte le proteine e debbono essere risospesi in un mezzo non contenente sostanze proteiche. Una lavacellule automatica funzionante deve aggiungere grandi volumi di fisiologica a ciascuna provetta, risospendere i globuli rossi, centrifugarli in maniera idonea, al fine di evitare una loro eccessiva perdita ed eliminare la soluzione salina in modo da lasciare un bottone secco di emazie. Materiali 1. Provette del tipo usato di routine nel laboratorio (da 10 x 75 mm o da 12 x 75 mm). 2. Additivi, utilizzati routinariamente, per potenziare le reazioni antigene-anticorpo. 3. Siero umano, proveniente da pazienti o da donatori. 4. Globuli rossi rivestiti da IgG e noti per dare unagglutinazione di grado 1+ o 2+ ai test
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data dellesame e lidentit delloperatore che ha eseguito lesame. Note 1. Sono necessarie altre indagini se: a. la quantit di fisiologica varia significativamente da provetta a provetta o da ciclo a ciclo. b. Il bottone di cellule non si risospende completamente dopo laggiunta di fisiologica. c. Alcune provette presentano una agglutinazione debole (o nessuna agglutinazione) nella fase antiglobulinica. d. Alcune provette presentano una significativa diminuzione del bottone cellulare. 2. Le lavacellule che aggiungono, automaticamente, lAHG, dovrebbero essere anche controllate per controllare che la quantit di AHG aggiunta sia uniforme. Nel precedente punto 9, laggiunta di AHG potrebbe avvenire automaticamente e la mancata aggiunta dovrebbe essere testimoniata dallassenza di agglutinazione. Si dovrebbe verificare che il volume di AHG aggiunto sia eguale in tutte le provette. La quantit di AHG aggiunta automaticamente dovrebbe essere controllata ogni mese, per assicurarsi che ci avvenga secondo le istruzioni del produttore e che la quantit aggiunta uniforme in ogni provetta. 3. Alcuni produttori colorano di verde lAHG usata nelle lavacellule automatiche, cos che appaia evidente la mancata aggiunta del reagente.
3. 4. 5. 6. 7.
saldatori dielettrici. Pinze rotanti per spremere i tubi. Strumenti puliti (forbici, pinze emostatiche). Provette. Strumenti per il conteggio delle cellule. Registro dove riportare i risultati.
Procedimento 1. Assicurarsi che il contenuto della sacca con lemocomponente sia ben miscelato. 2. Spremere il tubo attaccato alla sacca almeno quattro volte, per mescolare il contenuto del tubo con quello della sacca, al fine di assicurarsi che il contenuto del tubo rappresenti, in modo corretto e accurato, il contenuto della sacca. 3. Saldare, a distanza di 5-8 cm dalla sacca di raccolta, un segmento di tubo. Il segmento dovrebbe contenere circa 2 mL di liquido. Eseguire una doppia saldatura in prossimit della sacca di raccolta e distaccare il segmento. 4. Riempire con il contenuto del segmento una provetta correttamente etichettata. 5. Calcolare e registrare le conte (cellule/mL). a. Per i risultati riferiti come cellule/L, cambiare i valori in cellule/mL moltiplicando per mille (o x 103). b. Per i risultati riferiti come cellule/L, cambiare i valori dividendo per mille (o x 103). 6. Moltiplicare cellule/mL per il volume (in mL) del componente per ottenere il numero totale di cellule contenute. 7. Registrare: le caratteristiche del componente, la data del test e lidentit delloperatore che ha eseguito il procedimento. Nota Per ogni requisito aggiuntivo, fare riferimento alle istruzioni del produttore.
Metodo 7.7 Monitoraggio delle conte cellulari negli emocomponenti da aferesi

Principio Quando si preparano emocomponenti cellulari tramite aferesi, essenziale determinare quanto raccolto senza compromettere la sterilit del componente. Materiali 1. Emocomponente raccolto in aferesi. 2. Clip metalliche e pinze per saldare a mano o
Metodo 7.8 Metodica manuale per contare i globuli bianchi residui nel sangue e negli emocomponenti leucoridotti
Principio Il contenuto dei globuli bianchi residui nel SI o in
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emocomponenti leucoridotti pu essere determinato impiegando un emocitometro ad ampio volume. Per gli emocomponenti che contengono globuli rossi, le emazie vanno prima lisate nellaliquota scelta per il conteggio. Si utilizza il cristal violetto per colorare i nuclei dei leucociti. La camera di Nageotte, usata per i conteggi, ha un volume 56 volte un emocitometro standard. Laccuratezza del conteggio si migliora esaminando maggiori volumi di campioni scarsamente diluiti e paragonandone i risultati con quelli ottenuti con metodiche di conteggio standard. Materiali 1. Camera di conteggio per volumi di 50 L (per esempio, camera di Nageotte). 2. Cristal violetto: 0.01% peso/volume di cristal violetto nell1% peso/volume di acido acetico (per esempio, soluzione di Trk). 3. Sostanza lisante i globuli rossi (per esempio, Zapoglobin, Counter Electronics, Hialeah, FL, USA), per i soli componenti che contengono eritrociti. 4. Pipettatori (da 40 L e da 100 L) con puntali monouso. 5. Guanti privi di talco, provette pulite, carta da filtro. 6. Microscopio, con oculare 10x e obiettivo 20x. 7. Registro dove riportare i risultati. Procedimento 1. Diluire e colorare campioni di emocomponenti leucoridotti, seguendo le istruzioni date di seguito. a) Per componenti che contengono globuli rossi Pipettare 40 L di sostanza lisante in una provetta pulita. Mettere un campione (che sia rappresentativo) del componente da esaminare in una provetta pulita: Lematocrito del campione da analizzare non dovrebbe superare il 60%. Pipettare 100 L del campione in una provetta che contenga 40 L di sostanza lisante. Favorire, pipettando pi volte (dentro-fuori), la miscela dei due liquidi, sin tanto che il puntale della
2.
3.
4.
5.
6.
pipetta non sia pi rivestito di globuli rossi intatti. Pipettare 360 L di cristal violetto nella miscela e mescolare i due liquidi con ripetute pipettature (dentro-fuori). Il volume finale , ora, di 500 L. b. Per concentrati piastrinici Mettere un campione (che sia rappresentativo) della sospensione piastrinica in provetta pulita. Pipettare 100 L di tale campione in una provetta pulita. Pipettare 400 L di cristal violetto nei 100 L del campione piastrinico e mescolare i due liquidi con ripetute pipettature (dentro-fuori) per diverse volte. Il volume finale , ora, di 500 L. Coprire la camera emocitometrica con un vetrino e, usando una pipetta, riempire con la miscela (ma non farla traboccare) la zona di conteggio. Coprire con un involucro umido lemocitometro, per prevenire eventuali evaporazioni (una capsula di Petri in plastica, avvolta da carta da filtro umida, serve egregiamente allo scopo) e lasciarlo a riposo per 10-15 minuti, al fine di permettere ai leucociti di sedimentare nella camera di conteggio, Rimuovere linvolucro, piazzare lemocitometro su di un microscopio e, usando un obiettivo 20x, contare i leucociti presenti nellintero volume (50 L) contenuto nella camera di conteggio. Calcolare e registrare i risultati. a. Concentrazione leucocitaria: leucociti/L = cellule contate/50 L x 5 = cellule contate/ 10, dove 50 L sono il volume contato e 5 il fattore di diluizione indotto dallaggiunta della sostanza lisante e del colorante. b. Totale contenuto di globuli bianchi nellemocomponente leucoridotto: leucociti/ componente = leucociti/L x 1.000 L/mL x volume in mL del componente. Registrare: le caratteristiche del componente, la data del test e lidentit delloperatore che ha condotto lanalisi.
Note 1. I leucociti si deteriorano durante la
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conservazione; i conteggi su sangue conservato o emocomponenti con globuli rossi possono fornire risultati non accurati. 2. Si raccomanda di usare guanti privi di talco, dato che particelle di questa sostanza possono contaminare la camera di conteggio ed essere scambiate per leucociti. 3. Si pu acquisire esperienza nellidentificare globuli bianchi colorati con cristal violetto, esaminando campioni di emocomponenti che non sono stati leucoridotti. 4. Laccuratezza del metodo usato per i conteggi si pu convalidare con un campione di riferimento ad alto contenuto di leucociti, che sia stato quantificato con altre metodiche. Il campione di riferimento pu essere utilizzato eseguendo diluizioni scalari su sangue o emocomponenti resi precedentemente leucoridotti con una doppia filtrazione. Le conte ottenute sui campioni diluiti
in modo scalare possono essere confrontate con la concentrazione attesa derivata dal calcolo teorico. 5. Non noto se questa tecnica di conteggio sia accurata a una concentrazione inferiore a 1 globulo bianco/L.
Bibliografia 1. Lutz P, Dzik WH. Large-volume hemocytometer chamber for accurate counting of white cells (WBCs) in WBC-reduced platelets; validation and application for quality control of WBC-reduced platelets prepared by apheresis and filtration. Transfusion 1993;33: 40912. Dzik WH, Szuflad P. Method for counting white cells in white cell-reduced red cell concentrates (letter). Transfusion 1993;33:272.
2.
810
Appendici
Appendici
Appendice 1 - Valori normali negli adulti

Test Alanino aminotrasferasi Bilirubina, totale Aptoglobina Ematocrito (Hct) Maschi Femmine Emoglobina (Hb) Maschi Femmine Emoglobina A2 Emoglobina F Emoglobina nel plasma Immunoglobuline IgG IgA IgM IgD IgE Meta-emoglobina Conta piastrinica Conta eritrocitaria Maschi Femmine Conta reticolocitaria Viscosit, relativa Conta leucocitaria Unit internazionali 4-36 U/L a 37 C 2-21 mol/L 0.6/2.7 g/L 0,40-0,54 0,8/0,47 135-180 g/L 120-160 g/L 0,015-0,035 dellHb totale 0-0,01 dellHb totale 5-50 mg/L 8,0-18,0 g/L 1,1-5,6 g/L 0,5-2,2 g/L 5,0-30 mg/L 0,1-0,4 mg/L <0,01 dellHb totale 150-450 x 109/L 4,6-6,2 x 1012/L 4,2-5,4 x 1012/L 25-75 x 109/L 1,4/1,8 x acqua 4,5-11,0 x 109/L Unit convenzionali 4-36 U/L a 37 C 0,1/1,2 mg/dL 60-270 mg/dL 40-54% 38-47% 13,5-18,0 g/dL 12,0-16,0 g/dL 1,5-3,5% dellHb totale <1% dellHb totale 0,5-5,0 mg/dL 800-1801 mg/dL 113-563 mg/dL 54-222 mg/dL 0,5-3,0 mg/dL 0,01-0,04 mg/dL <1% dellHb totale 150-450 x 103/ L 4,6-6,2 x 106/ L 4,2-5,4 x 106/ L 25-75 x 103/ L 1,4/1,8 x acqua 4,5-11,0 x 103/ L
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Appendice 2 - Selezione di valori normali nei bambini

Unit internazionali Bilirubina (totale) Cordone ombelicale 0-1 giorno 1-2 giorni 3-7 giorni 7-30 giorni Dopo Pretermine A termine Pretermine A termine Pretermine A termine Pretermine A termine Pretermine A termine Pretermine A termine <30 mmol/L <30 mmol/L <137 mmol/L <103 mmol/L <205 mmol/L <137 mmol/L <274 mmol/L <205 mmol/L <205 mmol/L <120 mmol/L <34 mmol/L <17 mmol/L Unit convenzionali <1,8 mg/dL <1,8 mg/dL <8 mg/dL <6 mg/dL <12 mg/dL <8 mg/dL <16 mg/dL <12 mg/dL <12 mg/dL <7 mg/dL <2 mg/dL <1 mg/dL
Emoglobina 26-30 settimane di gestazione A termine 1-3 giorni 2 settimane 1 mese 2 mesi 6 mesi 6 mesi - 2 anni 2-6 anni 6-12 anni 12-18 anni Maschi Femmine 11,0-15,8 g/dL 13,5-19,5 g/dL 14,5-22,5 g/dL 13,4-19,8 g/dL 10,7-17,1 g/dL 9,4-13,0 g/dL 11,1-14,1 g/dL 10,5-13,5 g/dL 11,5-13,5 g/dL 11,5-15,5 g/dL 13,0-16,9 g/dL 12,0-16,0 g/dL
Leucociti 1,7-7,1 x 109L 9-30 x 10 /L 9,4-34 x 109/L 5-20 x 109/L 4-19.5 x 109/L
9
Piastrine 180.000-327.000/ L 192.000/ l (media) 252.000/ l (media)
6-17,5 x 109/L 6-17 x 109/L 5-15.5 x 10 /L 4,5-13,5 x 109/L 4,5-13,5 x 109/L 4,5-13,5 x 109/L
9
150.000-350.000/ L 150.000-350.000/ L 150.000-350.000/ L 150.000-350.000/ L 150.000-350.000/ L

(segue)
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Appendici
Appendice 2 - Selezione di valori normali nei bambini

IgG Neonati 1-3 mesi 4-6 mesi 7-12 mesi 13-24 mesi 25-36 mesi 3-5 anni 6-8 anni 9-11 anni 12-16 anni 831-1231 mg/dL 312-549 mg/dL 241-613 mg/dL 442-880 mg/dL 553-971mg/dL 709-1.075 mg/dL 701-1.157 mg/dL 667-1.179 mg/dL 889-1.359 mg/dL 822-1.070 mg/dL IgM 6-16 mg/dL 19-41 mg/dL 26-60 mg/dL 31-77 mg/dL 35-81mg/dL 42-80 mg/dL 38-74 mg/dL 40-80 mg/dL 46-112 mg/dL 39-79 mg/dL IgA <3 mg/dL 8-34 mg/dL 10-46 mg/dL 19-55 mg/dL 26-74 mg/dL 34-108 mg/dL 66-120 mg/dL 79-169mg/dL 71-191 mg/dL 85-211mg/dL
Tempo di tromboplastina parziale attivata Pretermine 70 secondi A termine 45-65 secondi Tempo di protrombina Pretermine A termine
12-21 secondi 13-20 secondi
Da The Harriet Lane Handbook 15th Ed, St. Louis, MO, Mosby 2000, ristampa autorizzata
Appendice 3 - Tipici valori normali nei test di emostasi e coagulazione (adulti)

Test Tempo di tromboplastina parziale attivata Tempo di emorragia Fattori della coagulazione Prodotti di degradazione della fibrina Fibrinogeno D-dimeri (nel plasma) Proteina C Proteina S (totale) Tempo di protrombina Tempo di trombina Valori normali 25-35 secondi 2-8 minuti 500-1.500 U/L <10 mg/L 2,0-4,0 g/L <200 mg/L 70-1.400 U/L 70-1.400 U/L 10-13 secondi 12-25 secondi
Da Henry JB, Clinical Diagnosis and Management by Laboratry Methods, 20th Ed, Philadelphia, PA, WB Saunders, 2000, ristampa autorizzata
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Appendice 4 - Fattori della coagulazione nei concentrati piastrinici

Fattore/proteina II % V% VII % VIII % IX % X% XI % XII % C% S% Antitrombina % Plasminogeno % Fibrinogeno mg/dL Co-fattore della ristocetina % Limiti normali 78-122 47-153 51-168 48-152 62-138 58-142 52-148 46-126 57-128 83-167 88-126 60-140 198-434 50-150 Giorno 0 104 78-98 108 98-126 72-105 66-101 91-111 117 106 95 103 140 217-308 106 Giorno 1 Giorno 2 Giorno 3 91-96 69-78 93-117 85-99 100-109 93-94 106-108 107-112 102 75 99 133 278-313 124 96 50 88 76 95 92 109 116 101 61 101 126 310 125 85-94 36-47 80-103 68-76 91-98 85-88 96-98 106-123 98 40 102 122 265-323 133 Giorno 4 Giorno 5 90 28 75 75 93 84 101 123 99 32 103 124 302 116 90 24-35 72 39-70 63-97 60-83 86-110 131 100 31 97 117 221-299 127
Note: percentuale dei fattori della coagulazione = 100 x unit/mL del fattore Da Brecher ME (ed.) Collected Questions and Answers, 6th Ed, Bethesda, MD, AABB, 2000, ristampa autorizzata.
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Appendici
Appendice 5 - Valori normali approssimativi dei volumi di eritrociti, di plasma e di sangue totale
Volumi Neonati1 Prematuri A 72 ore dalla nascita a termine 50 58 108 40 47 87 Adulti2 Maschi Femmine 26 40 66 24 36 60
Eritrocitario (mL/Kg) Plasmatico (mL/kg) Sangue totale (mL/kg)
I volumi degli adulti dovrebbero essere corretti nelle situazioni seguenti: 1. sotto i 18 anni: aumentare i volumi del 10%; 2. perdita di peso: a. perdita marcata entro 6 mesi: il calcolo deve essere eseguito rispetto al peso iniziale; b. perdita graduale in tempi pi lunghi: il calcolo deve essere eseguito sul peso attuale e aumentato del 10-15%; 3. obesi e di bassa statura: i valori vanno ridotti del 10%; 4. anziani: i valori vanno ridotti del 10%; 5. gravidanza3. Stima della superficie corporea (BSA, Body Surface Area)4: BSA (m2) =
Altezza (cm) x Peso (kg) 3.600
Cambiamenti percentuali dai livelli di donne non gravide
Settimane di gestazione
Bibliografia 1. Miller D. Normal values and examination of the blood: Perinatal period, infancy, childhood and adolescence. In: Miller DR, Baehner RL, McMillan CW, Miller LP, eds. Blood diseases of infancy and childhood. St. Louis: C.V. Mosby, 1984:21,22. Albert SN. Blood volume. Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1963:26. Peck TM, Arias F. Hematologic changes associated with pregnancy. Clin Obstet Gynecol 1979;22:788. Mosteller RD. Simplfied calculation of bodysurface area. N Engl J Med 1987;317:1098. Shoemaker WC. Fluids and electrolytes in the acutely ill adult. In: Shoemaker WC, Ayres S, Grenvik A, et al, eds. Textbook of critical care. 2nd ed. Philadelphia: WB Saunders Co., 1989:1130. Mollison PL, Englefriet CP, Contreras M. Blood transfusion in clinical medicine. 9th ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1993.
2. 3.
Volume totale (volemia)5: Maschi = 2.740 mL/m2: Femmine = 2.370 mL/m2 Ematocrito (Hct)6: Hct venoso = HV (sangue ottenuto da vena o da digitopuntura) Hct sangue totale = HB HB = (HV) x (0,91)
4. 5.
6.
815
Appendice 6 - Antigeni gruppoematici ascritti a sistemi

Nel 1980 lISBT (International Society of Blood Transfusion) ha formato un Gruppo di Lavoro sulla Nomenclatura degli Antigeni di Superficie della Membrana Eritrocitaria. Lo scopo del Gruppo era quello di definire una nomenclatura uniforme che fosse leggibile ad occhio e da apparecchiature. Il sistema numerico proposto non intendeva sostituirsi alla terminologia tradizionale, ma permettere le comunicazioni fra sistemi informatici, dove sono necessari simboli numerici. La nomenclatura ISBT usa lettere maiuscole e numeri arabi per codificare sistemi e antigeni. Ad ogni sistema, gruppo o serie di antigeni assegnato un numero (per esempio, A = 001, B = 002). Gli zero a sinistra possono essere omessi. Nella terminologia ISBT, quindi, lantigene A potr essere scritto, usando un codice informatico, 001001 o 1.1 o, ancora, usando il simbolo del sistema ABO1. Periodicamente il Gruppo di Lavoro si incontra per aggiornare lattribuzione di antigeni a sistemi, gruppi o serie. La Tabella sottostante elenca i sistemi gruppoematici e gli antigeni assegnati a tali sistemi. Altri antigeni gruppoematici eritrocitari sono attribuiti a gruppi o alle serie di antigeni ad alta e a bassa frequenza. Sebbene tutte le sigle elencate nella tabella siano accettabili, il Technical Manual e la rivista Transfusion hanno scelto di impiegare, nella maggioranza dei casi, la terminologia tradizionale. Ulteriori informazioni sulla terminologia dei gruppi sanguigni, su quali antigeni vengano assegnati ai sistemi e sulle serie di antigeni ad alta e bassa frequenza, possono essere reperite nella bibliografia.
Sistema (simboli/numeri ISBT) ABO (ABO/001) A (ABO1) B (ABO2) A,B (ABO3) A1 (ABO4) M (MNS1) N (MNS29 S (MNS3) s (MNS4) U (MNS5) He (MNS6) Mia (MNS7) Mc (MNS8) Vw (MNS9) Mur (MNS10) Mg (MNS11) Vr (MNS12) P1 (P1)
Antigene (numeri ISBT)
MNSs o MNS o MN (MNS/002)
Me (MNS13) Mta (MNS14) Sta (MNS15) Ria (MNS16) CIa (MNS17) Nya (MNS18) Hut (MNS19) Hil (MNS20) Mv (MNS21) Far (MNS22) sD (MNS23) Mit (MNS24)
Dantu (MNS25) Hop (MNS26) Nob (MNS27) Ena (MNS28) ENKT (MNS29) N (MNS30) Or (MNS31) Dane (MNS32) TSEN (MNS33) MINY (MNS34) MUT (MNS35) SAT (MNS 36)
ERIK (MNS37) Osa (MNS38) ENEP (MNS39) ENEH (MNS40) HAG (MNS41) ENAV (MNS42) MARS (MNS43)
P (P/003)
(segue)
816
Appendici

Sistema (simboli/numeri ISBT) Rh (RH/004) D (RH1) C (RH2) E (RH3) C (RH4) e (RH5) f (RH6) Ce (RH7) CW (RH8) CX (RH9) V (RH10) EW (RH11) G (RH12) Antigene (numeri ISBT) Hro (RH17) Hr (RH18) hrS (RH19) VS (RH20) CG (RH21) CE (RH22) DW (RH23) c-like (RH26) cE (RH27) hrH (RH28) Rh29 (RH29) Goa (RH30) hrB (RH31) Rh32 (RH32) Rh33 (RH33) HrB (RH34) Rh35 (RH35) Bea (RH36) Evans (RH37) Rh39 (RH39) Tar (RH40) Rh41 (RH41) Rh42 (RH42) Crawford (RH43) Nou (RH44) Riv (RH45) Sec (RH46) Dav (RH47) JAL (RH48) STEM (RH49) FPTT (RH50) MAR (RH51) BARC (RH52) JAHK (RH53) DAK (RH54) LOCR (RH55) CENR (RH56) Aua (LU18) Aub (LU19) Lu20 (LU20) Lu21 (LU21)
Lutheran (LU/005)
Lua (LU1) Lub (LU2) Lu3 (LU3) Lu4 (LU4) Lu5 (LU5) K (KEL1) k (KEL2) Kpa (KEL3) Kpb (KEL4) Ku (KEL5) Jsa (KEL6) Jsb (KEL7) Lea (LE1) Leb (LE2) Leab (LE3) Fya (FY1) Fyb (FY2) Fy3 (FY3) Jka (JK1) Jkb (JK2) Jk3 (JK3)
Lu6 (LU6) Lu7 (LU7) Lu8 (LU8) Lu9 (LU9) Lu11 (LU11) UIa (KEL10) K11 (KEL11) K12 (KEL12) K13 (KEL13) K14 (KEL14) K16 (KEL16) Wka (KEL17) LebH (LE4) ALeb (LE5) BLeb (LE6) Fy4 (FY4) Fy5 (FY5) Fy6 (FY6)
Lu12 (LU12) Lu13 (LU3) Lu14 (LU14) Lu16 (LU16) Lu 17 (LU17) K18 (KEL18) K19 (KEL19) Km (KEL20) Kpc (KEL21) K22 (KEL22) K23 (KEL23) K24 (KEL24)
Kell (KEL/006)
VLAN (KEL25) TOU (KEL26) RAZ (KEL27) VONG (KEL28)
Lewis (LE/007)
Duffy (FY/008)
Kidd (JK/009)
(segue)
817

Sistema (simboli/numeri ISBT) Diego (DI/010) Dia (DI1) Dib (DI2) Wra (DI3) Wrb (DI4) Wda (DI5) Rba (DI6) Antigene (numeri ISBT) WARR (D17) ELO (D18) Wu (DI9) Bpa (DI10) Moa (DI11) Hga (DI12) Vga (DI13) Swa (DI14) BOW (DI15) NFLD (DI16) Jna (DI17) KREP (DI18) Tra (DI19)* Fra (DI20) SW (DI21)
Yt o Cartwright (YT/011)
Yta (YT1) Ytb (YT2) Xga (XG1) Sc1 (SC1) Sc2 (SC2) Sc3 (SC3) Doa (D01) Dob (D02) Gya (D03) Hy (D04) Joa (D05) Coa (C01) Cob (C02) Co3 (C03) LWa (LW5) LWab (LW6) LWb (LW7) Ch1 (CH/RG1) Rg1 (CH/RG11) Ch2 (CH/RG2) Rg2 (CH/RG12) Ch3 (CH/RG3) Ch4 (CH/RG4) Ch5 (CH/RG5) Ch6 (CH/RG6) WH (CH/RG7)
(segue)
Xg (XG/012) Scianna (SC/013)
CD99 (XG2) Rd (SC4) STAR (SC5)
Dombrock (DO/014)
Colton (CO/15)
LW o Landsteiner-Wiener (LW/016)
Chido/Rodgers (CH/RG/017)
818
Appendici

Sistemi (simboli/numeri ISBT) H (H/018) Kx (XK/019) Gerbich (GE/020) H (H1) Kx (XK1) Ge2 (GE2) Ge3 (GE3) Ge4 (GE4) Cra (CROM1) Tca (CROM2) Tcb (CROM3) Tcc (CROM4) Kna (KN1) Knb (KN2) Ina (IN1) Inb (IN2) Oka (OK1) MER2 (RAPH1) JMH (JMH1) Wb (GE5) Lsa (GE6) Ana (GE7) Dha (GE8) GEIS (GE9) Antigene (numeri ISBT)
Cromer (CR/021)
Dra(CROM5) WESb (CROM9) ZENA (CROM13) a Es (CROM6) UMC (CROM10) IFC (CROM7) GUTI (CROM11) WESa(CROM8) SERF (CROM12) McCa (KN3) SIa (KN4) Yka (KN5) McCb (KN5) SI2 (KN7) SI3 (KN8)*
Knops (KN/022)
Indian (IN/024)
Ok (OK/24) Raph (RAPH/025) JMH o John Milton Hagen (JMH/026) I (I/027) Globoside (GLOB/028) GIL (GIL/029)
I (I1) P (GLOB1) GIL (GIL1)
* Provvisorio - Daniels GL, Anstee DJ, Cartron JP, et al. International Society of Blood Transfusion working party on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang 2001;80:193-6. - Daniels GL, Fletcher A, Garratty G, et al. Blood group terminology 2004. From the ISBT committee on terminology for red cell surface antigens. Vox Sang 2004;87:304-16. - Garratty G, Dzik W, Issitt PD, et al. Terminology for blood group antigens and genes-historical origins and guidelines in the new millennium. Transfusion 2000;40:477-89. - Issitt PD, Anstee DJ. Applied blood group serology. 4th ed. Durham, NC: Montgomery Scientific, 1998.
819
Appendice 7 - Esempi di termini per geni, antigeni e fenotipi

Sistema ABO Rh MN P Lewis Kell Kell Scianna Kidd Geni A A1 A2 B DCEce MNSs P1 Le le K k Kpa Jsa K1 K2 K3 Sc1 Sc2 Sc Jka Jkb Jk3 Antigeni A A1 A2 B DCEce MNSs P1 Lea Leb K k Kpa Jsa K1 K2 K3 Sc1 Sc2 Jka Jkb Jk3 Fenotipi A A1 A2 B D+C+Ec+e+ M+N+Ss+ P1+ P1 Le(a+)Le(ab+) Kk+Kp(a+)Js(a) K: 1, 2, 3 Sc: 1, 2, 3 Jk(a+)Jk(a+b+)Jk:3
Modificato da: - Denomme G, Lomas-Francis C, Storry J, Reid ME. Approaches to blood group molecular genotyping and its applications. In: Stowell C, Dzik W, eds. Emerging diagnostic and therapeutic technologies in transfusion medicine. Bethesda, MD: AABB Press, 2003:95-129. - Garratty G, Dzik W, Issitt PD, et al. Terminology for blood group antigens and genes-historical origins and guidelines in the new millennium. Transfusion 2000;40:477-89. - Zelinski T. Chromosomal localization of human blood group genes. In: Silberstein LE, ed. Molecular and functional aspect of blood group antigens. Bethesda, MD: AABB, 1995:41-73.
Appendice 8 - Esempi di terminologia corretta e scorretta*

Termine Fenotipo Fenotipo Anticorpo Antigene Anticorpo Fenotipo Fenotipo Fenotipo Fenotipo Terminologia corretta Fy(a+) Fy(a+b) Anti-Fya K Anti-K K:1, K:2 A Rh+, B Rh M+N Rh:1,2,3,4,5 Terminologia scorretta Fya+, Fy(a+), Fya(+), Fya+, Fya (+), Duffya+, Duffya-positivo Fya+b-, Fy(a+b-), Fya(+)b(), Fya(+)b(-) Anti Fya, Anti-Duffy Kell (nome del sistema) Anti-Cellano K1+, K:1+, K(1), K:(1), K1, K:1, K1-negativo A+ (significa positivo per lantigene A) B (significa negativo per lantigene B) M(+), MM (implica un genotipo non provato) Rh:1,2,3,+4,+5 Rh:1,2,3,4+,5+
Nota: gli esempi mostrati non rappresentano lunica terminologia corretta. Nel sistema Rh, per esempio, anche accettabile luso della terminologia CDE che pi comunemente utilizzata. Lesempio riportato sul fenotipo Rh dimostra luso corretto della nomenclatura numerica. * Issit L. Blood Group Nomenclature. In: Blood Groups. Refresher and updates. Bethesda, MD, AABB, 1995.
820
Appendice 9 - Distribuzione dei fenotipi ABO/Rh per razza o etnia*

Distribuzione percentuale dei fenotipi1 Razza o etnia Bianchi non ispanici Ispanici2 Neri non ispanici Asiatici
3
Numero 2.215.623 259,233 236.050 126.780 19.664 3.086.215
O Rh+ 37,2 52,6 46,6 39,0 50,0 39,8
O Rh 8,0 3,9 3,6 0,7 4,7 6,9
A Rh+ 33,0 28,7 24,0 27,3 31,3 31,5
A Rh 6,8 2,4 1,9 0,5 3,8 5,6
B Rh+ 9,1 9,2 18,4 25,0 7,0 10,6
B Rh 1,8 0,7 1,3 0,4 0,9 1,6
AB Rh+ 3,4 2,3 4,0 7,0 2,2 3,5
AB Rh 0,7 0,2 0,3 0,1 0,3 0,6
Indiani Nord-americani Totale donatori
* Da Garratty et al. del Gruppo di Studio su Epidemiologia delle Infezioni da Retrovirus nei donatori. ABO and Rh(D) phenotype frequencies of different racial/ethnic groups in the United States. Transfusion 2004; 44: 703-6, ristampa autorizzata. 1 Le percentuali possono non raggiungere il 100% a causa degli arrotondamenti. 2 Gli ispanici includono: messicani (68,8%), portoricani (5,0%), cubani (1,6%) e altri donatori ispanici (24,6%) 3 Gli asiatici includono: cinesi (29,8%), filippini (24,1%), indiani (13,8%), giapponesi (12,7%), coreani (12,5%) e vietnamiti (7,1%)
Appendici
821
Appendice 10 - Intervalli di tempo consigliati per i controlli di qualit

Apparecchiature o reagenti I. Frigoriferi, congelatori, incubatori per piastrine A. Frigoriferi 1. Registratore 2. Rilevamento manuale della temperatura 3. Sistema dallarme (se applicabile) 4. Grafici di rilevamento temperatura (da osservare ogni giorno) 5. Attivazione degli allarmi B. Congelatori 1. Registratore 2. Rilevamento manuale della temperatura 3. Sistema dallarme (se applicabile) 4. Carte rilevamento temperatura (da osservare ogni giorno) 5. Attivazione degli allarmi C. Incubatori per piastrine 1. Registratori 2. Rilevamento manuale della temperatura 3. Sistema dallarme (se applicabile) 4. Carte rilevamento temperatura (da osservare ogni giorno) 5. Attivazione degli allarmi D. Temperatura nellarea di conservazione delle piastrine II. Apparecchiature di laboratorio A. Centrifughe/Lavacellule 1. Velocit 2. Temporizzatori (timer) 3. Funzionamento 4. Livello riempimento provette (sierologia) 5. Volume riempimento fisiologica (sierologia) 6. Volume dispensato di siero antiglobuline (se applicabile) 7. Controllo temperatura (centrifughe refrigerate) 8. Verifica sulla temperatura (centrifughe refrigerate) B. Riscaldatori/Bagnomaria/Visori 1. Temperatura 2. Controlli nellarea e nel settore C. Componenti di strumenti per lo scongelamento D. pHmetri E. Irradiatori per sangue 1. Calibrazione 2. Piattaforma girevole (visivamente a ogni uso) 3. Timer 4. Fonte di decadimento 5. Analisi delle perdite 6. Controllo delle dosi erogate 7. Verifica delle dosi erogate a. Cesio 137 b. Cobalto 60 c. Altra sorgente Frequenza
Quotidiana Quotidiana Quotidiana Settimanale Trimestrale Quotidiana Quotidiana Quotidiana Settimanale Trimestrale Quotidiana Quotidiana Quotidiana Settimanale Trimestrale Ogni 4 ore
Trimestrale Trimestrale Annuale Giorno dimpiego Settimanale Mensile Giorno dimpiego Mensile Giorno dimpiego Periodicamente Giorno dimpiego Giorno dimpiego Annuale Annuale Mensile/Trimestrale Dipende dalla fonte Due volte lanno Ad ogni uso Annuale Due volte lanno Secondo istruzioni
(segue)
822
Appendici
Appendice 10 - Intervalli di tempo consigliati per i controlli di qualit

Apparecchiature o reagenti F. Termometri [contro quelli certificati dal NIST (National Institute of Standards and Technology) o similari] 1. In vetro con liquido 2. Elettronici G. Timer e allarmi H. Ricalibrazione delle pipette I. Termo-saldatore sterile 1. Controllo delle saldature 2. Controllo della funzionalit J. Riscaldatori per emocomponenti 1. Temperatura duscita 2. Temperatura del riscaldatore 3. Attivazione dellallarme III. Apparecchiature per la raccolta di sangue A. Raccolta sangue intero 1. Agitatori 2. Bilance/piatti 3. Peso (in grammi, contro certificati NIST) B. Centrifughe per micro-ematocrito 1. Controllo del timer 2. Calibrazione C. Contatori cellule/emoglobinometri D. Manicotti dei misuratori di pressione E. Apparecchi per aferesi Lista dei controlli richiesti IV Reagenti A. Globuli rossi test B. Antisieri C. Siero antiglobuline D. Test sui marcatori delle malattie trasmissibili col sangue V. Miscellanea A. Peso specifico del solfato di rame B. Contenitori per il trasporto di unit di sangue (a temperature estreme) Frequenza
Annuale Mensile Annuale Annuale Ad ogni uso Annuale Trimestrale Trimestrale Trimestrale
Giorno dimpiego Giorno dimpiego Annuale Trimestrale Annuale Giorno dimpiego Periodicamente Come specificato dal produttore Giorno dimpiego Giorno dimpiego Giorno dimpiego Ad ogni serie di esame Giorno dimpiego 2 volte lanno
Nota: le frequenze elencate qui sopra indicano gli intervalli consigliati, non i requisiti. Per ogni nuova apparecchiatura devono essere effettuate le procedure di installazione, di controllo del funzionamento e le procedure di qualificazione. Dopo che lapparecchiatura stata qualificata allimpiego, dovrebbero essere eseguiti regolari controlli di qualit (CQ). In rapporto alle metodologie operative e alle procedure di qualificazione i CQ possono essere effettuati, inizialmente, con una frequenza maggiore rispetto a quella stabilita per luso routinario dellapparecchiatura. Quando si sono stabilite le modalit di registrazione dei risultati (sia di quelli relativi alla qualificazione dellapparecchiature sia di quelli dei CQ continuativi), si pu ridurre la frequenza dei controlli, ma, come minimo, tale frequenza deve corrispondere a quanto consigliato dal produttore dellapparecchio. Se il produttore non ha fornito dati al riguardo, potrebbero essere impiegati gli intervalli elencati in questa tabella.
823
Finito di stampare nel mese di dicembre 2009 Stampa: Grafica Briantea Srl, Usmate Velate (MI)
824

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TECHNI TECHNICAL MAN MANUAL

Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide

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Technical Manual Program Unit

Coordinamento editoriale Massimo Ripamonti e Claudio Velati

Organizzazione della qualit

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Donazione di sangue e raccolta

115 124 127 131 132

137 138 142 154

159 166 169 170

171 173 174 180 185 189 192 194 197

Principi di immunologia e genetica

219 220 228 232 233 235 236

237 240 240 250 257 261 262 263

266 269 271 275 280

AABB Technical Manual

351 367 373

Sierologia e Medicina Trasfusionale

411 412 415 419 428 431 438 440

442 445 456 460 465 467 468 469

Considerazioni cliniche nella pratica trasfusionale

AABB Technical Manual

500 503 503

509 512 513 515 519 519 519

523 538 541

611 613 613 614 614 615 615 617 618

621 627 640 644 649 650

703 704 710 710 712 713 713 714 715

AABB Technical Manual

753 753 754 755

773 774 775

AABB Technical Manual

797 798 800 803 805 807 808 808

Capitolo 1: Sistemi qualit

Controllo di qualit, garanzia di qualit e gestione della qualit

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Problemi di fornitori e clienti

Controllo delle procedure

Documentazioni e registrazioni Deviazioni, non conformit, complicazioni Verifiche: interne ed esterne

Miglioramento dei processi

* La tabella rappresenta soltanto una modalit di comparazione fra i due sistemi.

Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

Applicazione pratica dei principi della qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit

Controllo dei processi

Deviazioni, non conformit, complicazioni

Miglioramento del processo Strutture e sicurezza

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Capitolo 1: Sistemi qualit

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Capitolo 1: Sistemi qualit