Universidade Federal de So Joo Del Rei Campus Alto Paraopeba

ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS

Carla Tatiane Valadares-------094250036 Rosana Gonalves Maia-------104200009

Campus Alto Paraopeba Maro 2013

Introduo Na natureza encontramos vrias espcies de micro-organismos (bactrias, fungos, algas e protozorios) convivendo no mesmo ambiente,fora deste ambiente biolgico natural, isto , em laboratrios, estes micro-organismos so cultivados em material nutriente denominado meio de cultura, o qual um substrato nutritivo que permite a nutrio e o crescimento destes microrganismos [1,2]. Os micro-organismos so encontrados em culturas mistas na natureza .Para estudar as propriedades de um determinado micro-organismo em particular, deve-se primeiramente isol-lo em cultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as clulas parenteral) .[1]. O isolamento de um determinado microrganismo em cultura pura a partir de uma populao mista envolve, em geral,o uso de meios de cultura slidos e o recurso a tcnicas de isolamento de colnias(designa-se por colnia, uma populao de clulas descendentes de um nico microrganismo ), realizado de diferentes maneiras, tais como tcnica de semeadura por estrias, por espalhamento, por derramamento e em profundidade [5]. O mtodo de semeadura por estrias, tambm chamado como esgotamento de ala efetivado com uma ala de platina ou at mesmo um swab. Com a ala de platina coleta-se uma pequena parcela do inculo e espalha-se o material sobre a placa de Petri com gar em movimentos de zigue-zague, iniciando em uma das bordas e percorrendo a ala at a outra borda da placa. Esta a forma contnua de fazer estas estrias. A forma descontnua ou estrias compostas um mtodo feito em uma placa de Petri dividida em quatro partes [5]. As bactrias podem ser autotrficas, as quais requerem luz para produo de energia e dixido de carbono, ou heterotrficas, as quais utilizam compostos orgnicos como principal fonte de carbono. O meio selecionado reflete as caractersticas da bactria em estudo [1,2]. Geralmente, os meios de cultivo para fungos possui uma maior concentrao de glicose (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6) quando comparado com o meio para o cultivo de bactrias. Esta combinao, alm da presena de um antibacteriano no meio, inibe o crescimento da maioria das bactrias [1,2]. Os fungos so quimioheterotrficos, isto , necessitam de compostos orgnicos para obteno de energia e carbono. Geralmente so organismos aerbicos ou anaerbicos facultativos, filamentosos e multicelulares [3]. na populao sejam idnticas (originrias de uma mesma clula

Os fungos podem crescer sobre substncias com baixo grau de umidade, o que pode causar a inibio do crescimento de bactrias. So capazes de metabolizar carboidratos complexos e necessitam de menos nitrognio para o seu desenvolvimento quando comparados com as bactrias [3]. As bactrias podem sobreviver em condies ambientais extremas quando se encontram na forma de endsporos. Entretanto, o esporo de um fungo se separa da clula parental e origina um novo fungo filamentoso. Estes ltimos podem ser assexuais, formados pelas hifas do microrganismo, ou sexuais, que resultam da fuso de ncleos de tipos opostos de cruzamento de uma mesma espcie do fungo [3]. Os fungos so de dois tipos morfolgicos: leveduras, que so unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, que so multicelulares . Existe um subgrupo dentro dos filamentosos, chamados fungos dimrficos, que se apresentam sob ambas as formas,dependendo principalmente da temperatura, mas sob influncia tambm do teor de CO2 e condies nutricionais. As leveduras tm como estrutura primria, clulas que se reproduzem por brotamento, nico ou mltiplo, em geral, de forma arredondada. Estas clulas so esporos de origem assexual e se denominam blastocondios. Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte bsico a hifa, que pode ser septada ou no septada (cenoctica). A partir da hifa formam-se esporos, para propagao das espcies. Na grande maioria dos fungos, os esporos podem ser chamados de condios, pois nascem diretamente delas ou sobre estruturas ligas a elas.[6,7]. Esses conceitos fundamentais representam a base para a identificao de um fungo, pois a classificao de filamentosos feita, em regra, pelas caractersticas morfolgicas, tanto macroscpicas (cor, aspecto, textura da colnia, etc.), quanto microscpicas (forma e cor da hifa, presena ou no de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.), alm da velocidade de crescimento (lenta, moderada ou rpida). A identificao de leveduras, ao contrrio, feita, principalmente, por caractersticas fisiolgicas, desde que, a morfologia destes fungos no muito variada e no permite distino entre espcies e, em regra, entre gneros.[7]. Apesar de existirem algumas tcnicas para identificar fungos utilizando a morfologia, a tcnica de microcultivo (ou cultivo em lmina) empregada por alguns taxonomistas de fungos. Esta tcnica consiste na preparao de culturas de fungos em lminas de microscopia para observao direta em microscpio de campo claro. O microcultivo permite na ntegra o estudo das estruturas de reproduo (tanto sexuadas quanto assexuadas) da maioria dos fungos; facilitando a observao das principais caractersticas utilizadas para identificar tais micro-organismos. [7].

Materiais e Mtodos Esterilizou-se ala de repicagem (flambar e ala e a resfriar)para coleta assepticamente colnia isolada de uma placa contendo colnias previamente crescidas .Transferiu-se a colnia contida na ala de repicagem para a superfcie do meio NA em uma nova placa.Espalhou utilizando a tcnica de estria simples,ou seja, com a ala de repicagem e o seu material,espalhou-se o inoculo na parte superior da placa,como se estivesse limpando ala de repicagem,esgotando o inoculo,em movimento de zig-zag,bem prximos deslizando a ala de repicagem levemente sobre o Agar com cuidaddos para no perfur-lo. Continou-se o movimento de zig-zag,aproveitando toda superfcie da placa. Isolamento de cultura Pura Estrias em Placa Flambou-se a ala de repicagem e resfriou-se a encostando no gar em uma regio sem microrganismos. Com o auxlio da ala de repicagem, coletou-se assepticamente uma amostra da colnia oriunda da coleta de saliva, a qual estava contida no gar nutriente com colnias bacterianas previamente crescidas. Transferiu-se esta colnia bacteriana contida na ala de repicagem para a superfcie do meio gar nutriente, para uma nova placa de Petri. Primeiramente utilizou-se a tcnica estrias simples. Com a ala de repicagem e o seu matrial, espalhou-se o inculo na parte superior de toda a placa, como se estivesse limpando a ala de repicagem, esgotando o inculo, em movimento de zig-zag levemente sobre o gar com cuidados para que o gar no fosse perfurado. Continou-se o movimento de zigzag,aproveitando toda superfcie da placa. Posteriormente utilizou-se a tcnica estria composta. Dividiu-se a placa em quatro quadrantes. Em seguida espalhou-se o inoculo no primeiro quadrante esgotando com a ala de repicagem, fazendo movimentos de zig-zag. Flambou-se novamente a ala e a resfriou. Girouse a placa 90 graus e tocou a ala no canto final da estria do primeiro quadrante e a deslizou vrias vezes, repetindo o movimento zig-zag at o outro extremo do segundo quadrante da placa. Flambou-se se novamente a ala e a resfriou. Girou-se a placa 90 graus e estriou-se no terceiro quadrante da placa, e repetiu-se o procedimento anterior. Flambou-se novamente a ala e a resfriou. No quarto quadrante da placa estriou-se espaadamente a partir do terceiro quadrante, sem que tocasse nenhuma das estrias previamente formadas. Aps fazer as estrias, esterilizou-se a ala de repicagem. Identificou-se as placas na borda com os nomes das integrantes do grupo e a data. Incubou-se as placas em posio invertida, a 37 C por 24 horas.

Tcnica do microcultivo para observao microscpica de fungos Esterilizou-se a pina ao bico de Bunsen e com ela depositou-se a lmina de vidro ao fundo da placa de Petri sobre um palito em forma de V. Com uma esptula flambada e resfriada ,cortou-se um fragmento do gar solidificado em placa em placa (1 a 1,5 cm) e depositou o fragmento sobre a lamina, dentro da placa de Petri. Flambou-se e resfriou-se a ala de repicagem. Com a ala de repicagem inoculou-se na poro mediana de cada lado do fragmento do gar uma amostra de cultura pura do fungo que se desejava cultivar. Com a pina colocou-se sobre o gar inoculado uma lamnula estril. Umedeceu-se o algodo do interior da placa de Petri com gua estril e fechou-se a placa. Incubou-se a placa temperatura ambiente durante uma semana, onde observou-se diariamente o crescimento.

Figura 1:Placa com microcultivo Na segunda aula removeu-se a lamnula com uma pina e a depositou em uma lmina para microscopia com lcool 95% e esperou-se evaporar,logo em seguida corou-se a lamnula com uma gota de azul de metileno conforme figura 2 e observou-se as estruturas de frutificao ao microscpio ptico.

Figura2:Lmina de microcultivo corada

Resultados e discusso Aps o perodo de incubao das placas, o resultado obtido pelo isolamento de cultura, utilizando o mtodo de estrias simples apresentado na Figura 3.

Figura 3: Cultura obtida pelo estriamento simples Analisando a Figura 3 pode-se dizer que o resultado obtido pode ser considerado satisfatrio. Pois ao final do estriamento observam-se algumas colnias isoladas. Analisando o resultado obtido pelo mtodo de estria composta, apresentado na Figura 4, observa-se que a tcnica aplicada foi eficiente. Pois como mostrado na figura foi possvel o isolamento de colnias, bem espalhadas. o nmero de bactrias coletado (inculo) para o estriamento foi quantidade boa , com crescimento de microrganismos foi observado que as bactrias ficou

Figura 4: Cultura obtida pelo estriamento composto

Utilizando-se esta tcnica, espera-se que a cada esgotamento do material haja uma reduo no nmero de microrganismos, para que no quarto esgotamento obtenha-se uma cultura pura. Analisando-se a figura 5 na placa prximo ao microcultivo foi observado colnias filamentosas pulverulentas e formatos com pequenas raizes em forma de tubo que so as hifas.Esta tcnica de isolamneto importante para identificao e para estudo de exigncias nutricionais e metablicos do micro-organismo.

Figura 5: Placa de microcultivo aps incubao Aps o perodo de incubao da placa de Petri, contendo o microcultivo de fungos, observouse na visualizao microscpica apenas estruturas hifas de fungos filamentosos (bolores) no sendo possvel identificar a espcie cultivada ,a lmina apresentou sinais de danificao provavelmente devido problema durante a colorao e tentativa de retirada da lamnula.

Figura 6: Estrutura de hifas de fungo

Na Figura 6 mostrada a imagem hifas de fungo visualizada no microscpio ptico. Contudo fica claro como dever ser preciso, a excurso das praticas nos laboratrios, deve-se seguir as normas corretamente respeitando as particularidades de cada uma tcnica. E as tcnicas de isolamento para obteno de cultura pura muita importante, pois possvel estudar com mais preciso os microrganismos trabalhados e quando se tem apenas uma espcie na placa o manuseio do material fica fcil e a contaminao praticamente se anula.

Referncias Bibliogrficas 1. JNIOR, M. J. P.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia conceitos e aplicaes. 2 edio, So Paulo: Pearson Makron Books, 1997. 2. TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia. 3. Idjane S. Oliveira; Edna Dora M.N. Luz; Romero M. Moura; Leonor C. Maia.
4. Distribuio geogrfica e diversidade morfolgica de culturas de Penicillium

sclerotigenum em inhames no Brasil. Disponvelem:<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0100->. Acesso em 08 de maro de 2013.

5. (http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos ). Acesso em 08 de maro de 2013. 6. http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_7_2004.pdf

Acesso em 09 de maro de 2013. 7. Andr RodriguesRIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia Prtica: roteiro e manual. Editora Atheneu: So Paulo, 2000. 112p.