LAPORAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

MAKALAH DISKUSI PRAKTIKUM KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

PENETAPAN KADAR LAMOTRIGIN

LABORATORIUM KROMATOGRAFI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA 2011

ABSTRAK
Tiga metode yang handal, cepat dan selektif telah dikembangkan dan divalidasi untuk penentuan lamotrigin di hadapan kenajisannya, 2,3-asamdichlorobenzoic. Metode pertama adalah metode spektrofotometrimenggunakan asam p-chloranilic membentuk produk berwarna dengan maks5192 nm. Semua variabel yang mempengaruhi reaksi memiliki telah diselidiki dan kondisi yang dioptimalkan. Hukum Beer adalah dipatuhi selama rentang konsentrasi 10 - 200g/ml dengan akurasi rata-rata 100,130,44%. Rasio molar dari ion-asosiasi yang dibentuk kompleks ditemukan menjadi 1: 1 seperti yang disimpulkan dengan metode Job. Kondisi stabilitas konstan (Kf), standar energi bebas, molar absorptivitas ( ), dan indeks sensitivitas dievaluasi. Metode kedua adalah didasarkan pada pemisahan KLT dikutip dari obat (Rf = 0,750,01) dari kenajisannya (Rf = 0,230,01) diikuti dengan pengukuran densitometri dari utuhobat bintik-bintik pada 275 nm. Pemisahan dilakukan pada pelat silika gel menggunakan etil asetat: metanol:amonia 35% (17: 2: 1 v/v/v) sebagai fase gerak. Rentang Linearitas adalah 0,5-10g / spot dengan akurasi rata-rata 99,991,33%. Metode ketiga adalah akurat dan sensitif stabilitas-menunjukkan HPLC metode yang didasarkan pada pemisahan lamotrigin dari pengotor pada kolom fase terbalik C18, menggunakan fase gerak asetonitril : metanol : 0.01Mkalium orthophosphate (pH 6,70,1) (30: 20: 50 v / v / v) pada suhu ambien 255 C dan deteksi UV pada 275nm dalam waktu analisis keseluruhan dari sekitar 6 menit, berdasarkan pada daerah puncak.. Pengulangan injeksi, intraday dan interday pengulangan dihitung. Prosedur ini memberikan respon linier selama rentang konsentrasi 1-12g/ml dengan akurasi, rata-rata 99,501,30%. Metode yang diusulkan telah berhasil diterapkan untuk penentuan dari lamotrigin dalam bubuk massal, dalam bentuk dosis dan di hadapan pengotornya. Hasil yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA untuk menilai bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara masing-masing tiga metode dan melaporkan satu. Validasi dilakukan sesuai dengan pedoman USP.

PENDAHULUAN
A. Tinjauan Pustaka Saat ini Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau biasa juga disebut HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionic, maupun switter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element) dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri. KCKT merupakan metode tidak desktruktif dan dapat digunakan baik dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi merupakan teknik yang mana solute (zat terlarut) terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Interaksi KCKT pada dasarnya terdiri atas 8 komponen pokok, yaitu : wadah fase gerak, system penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom, detector, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, suatu computer atau integrator atau penekan. (Rohman & Ganjar, 2009) KCKT sangat cocok untuk memisahkan minyak atsiri dan kadang-kadang menunjukkan keuntungan yang berarti kesetimbangan metode kolom terbuka (kapiler) dan KG yang sekarang dipakai, pendadahan keudara minimum, hasil urai karena suhu tinggi dicegah, senyawa yang tidak atsiri dapat dipisahkan, dan laju perolehan kembali cuplikan tinggi. Akan tetapi, minyak atsiri sering terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongangolongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponennya. (Hostettmann, 1995) Pada kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam dimeter. KCKT berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter kecil, 2-8mm dengan ukuran partikel penunjang penunjang 50mm, sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi. (Khopkar, 1990) Terdapat 2 mode operasional HPLC yaitu mode isokratik dan metode gradient. Mode isokratik serupa dengan instrumental dalam KG, hanya dalam HPLC komposisi fase geraknya yang sama selama pengukuran berlangsung. Sebaliknya, dalam mode gradient komposisi fase gerak divisualisaikan selama pengukuran berlangsung. (Hendayana, 2006) KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan ataupun padat. Kelebihan KCKT antara lain dapat dilaksanakan pada suhu kamar, cepat dan mudah pelaksanaannya, peka dari detector KCKT dapat divariasi dan unik, pelarut pengembang dapat dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya, ideal untuk molekul besar dan ion, mudah memperoleh cuplikan, daya pisahnya baik, dan dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis. (Harbone, 1987) Berdasarkan sistem peralatannya maka HPLC termasuk kromatografi kolom karena dipakai pada fase diam yang terpacking dalam kolom sedangkan berdasarkan proses

pemisahannya HPLC digolongkan sebagai kromatografi adsorbs dan partisi. Prinsip kromatografi partisi linarut antara 2 pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut yang tidak tercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, linarut akan tersebar antara dua fase. (Anonim, 1995) B. Tujuan Diharapkan mampu memahami : 1. Cara pemisahan dan identifikasi suatu senyawa (analisis kualitatif) dengan menggunakan KCKT/HPLC 2. Penetapan kadar suatu senyawa (analisis kuantitatif) menggunakan KCKT

METODOLOGI
A. Alat dan Bahan Alat : Gelas ukur Corong Kertas saring Pipet ukur Mikropipet Mikrosyringe (syringe Hamilton)

Shimadzu UV / VIS spektrofotometer 1601 Labu ukur Split injector Bahan : asam 2,3-diklorobenzoic etil asetat metanol amonia asetonitril kalium orthophosphate 0,01M Lamotrigin Lamictal tablet Aseton Silika C-18

B. Preparasi Sampel 10 tablet ditimbang seksama dan digerus halus Diambil 100mg lamotrigin dimasukkan dalam labu takar 100ml Dilarutkan dalam 50 ml aseton atau methanol

Larutan diaduk dengan pengaduk magnetic selama 10 menit Disaring dan diukur volumenya Dilakukan replikasi tiga kali C. Prosedur dan Sistem Kromatografi Prosedur Fase diam: silica C18 Fase gerak: campuran asetronitril:methanol:kalium ortophosfat 0,01M (pH 6,70,1 ) (30:20:50 v/v/v) Deteksi: digunakan sebuah model 600LC pompa seri dan 600 kontroler unit,detector absorbansi uv 275 nm,745 modul data. Flow rate : 1,5ml/min Pengkondisian kolom 30 menit dilakukan pada suhu kamar 255C Volume injeksi 20l Pembuatan fase gerak Dilakukan pencampuran asetonitril:Metanol:Kalium ortophosfat 0,01M (30:20:50 v/v/v) dengan pH 6,70,1 Disaring menggunakan membrane filter 0,45 m Degassed dalam ultrasonic sebelum digunakan Kalibrasi Larutan baku 0,04mg/ml (setara dengan 0,01-0,12 mg lamotrigin) dipindah ke labu ukur, diadkan 10ml dengan fase gerak Disuntikkan 20l dari masing-masing konsentrasi Dihitung daerah puncak rata-rata dan diplot terhadap konsentrasi Didapatkan persamaan regresi linier Dilakukan Aplikasi tablet sesuai dengan preparasi sampel

HASIL PERCOBAAN
tabel 2. Hasil kesesuaian sistem HPLC
Tabel 1.Validasi laporan HPLC untuk penentuan lamotrigin Tabel 3. Penentuan kadar lamotrigin dalam campuran sintesis

PEMBAHASAN
Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan campuran asam 2,3-dichlorobenzoic. Untuk mengoptimalkan HPLC dilakukan uji parameter,untuk komposisi fase gerak dan pH. Pemisahan yang memuaskan diperoleh dengan fase gerak asetonitril: metanol: 0,01 M kalium orthophosphate pH 6,7 0,1 (30: 20: 50 v / v / v) menggunakan kolom C18 di suhu ruang. Analisis dilakukan oleh elusi isokratik dengan laju aliran 1,5 ml / menit dan dideteksi pada 275 nm (Gambar 6). Jangkauan linier 1-12g ml-1 Diperoleh dengan akurasi rata-rata 99,50 1,30% seperti yg ditunjukkan pada Tabel 1. Tes kesesuaian sistem metode HPLC dievaluasi pada Tabel 2. Hasil dalam (Tabel 4) menunjukkan tidak ada gangguan dari eksipien tablet seperti kalsium karbonat, hidroksipropil selulosa, aluminium magnesium silikat, povidone, natrium glikolat pati,sakarin natrium dan magnesium stearat. Selain itu, Asam 2,3-dichlorobenoic ditemukan kurang dari batas 0.2%.

KESIMPULAN
Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan campuran asam 2,3-dichlorobenzoic. Ditemukan asam 2,3-diklorobenzoik kurang dari batas 0,2% Diperoleh akurasi rata-rata lamotrigin 99,50 1,30%