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PRACTICAS LABORATORIO DE BIOQUMICA PRCTICA # 1 SOLUCIONES BUFFER Objetivo 1.

Fundamento terico Las disoluciones capaces de mantener firmemente la estabilidad de la concentracin de los iones hidrogeno (pH) cuando sobre ellas actan cantidades relativamente pequea de cido o lcalis fuertes, como tambin durante la dilucin, se denominan disoluciones amortiguadora1. Esta capacidad es debida gracias a la presencia de sustancias amortiguadoras en la composicin de la disolucin, cuyo papel es desempeado por las mezclas que constan de: - cidos dbiles y sales muy disociables de estos cidos; por ejemplo, el amortiguador de acetato es cido actico/acetato sdico; el amortiguador de bicarbonato es cido carbnico/bicarbonato sdico; el amortiguador de borato es cido brico/borato sdico; el amortiguador de barbitricos es medinal/veronal y as consecuentemente. - Bases dbiles y sales muy disociables de estas bases; por ejemplo, el amortiguador amnico es hidrxido amnico/cloruro amnico. - Sales mono y disustituidas de cidos polibsicos; por ejemplo, el amortiguador de fosfato es NaH2PO4 /Na2HPO4 La capacidad amortiguadora la poseen los electrolitos anfteros, por ejemplo, los aminocidos, protenas y algunas otras sustancias. El pH de las disoluciones amortiguadoras depende de la proporcin de stas entre cido y sal, y a una proporcin dada ser siempre invariable. De aqu que, cuando se preparan las disoluciones amortiguadora, se puede calcular tericamente el pH segn la frmula:

donde Ccido es la concentracin del cido, Csal es la concentracin de la sal, Cbase es la concentracin de la base y K es la constante de disociacin electroltica del cido o base segn el caso. De aqu se deduce que al cambiar las proporciones entre las concentraciones de los componentes de la mezcla amortiguadora, es posible preparar disoluciones con diferentes pHs dentro de los lmites determinados por la constante de disociacin de los cidos o bases. La proporcin de los componentes que constituyen la mezcla amortiguadora se quedan invariables. Cada disolucin amortiguadora se caracteriza por una capacidad amortiguadora determinada. Esta capacidad es la medida de la accin amortiguadora de la disolucin y se expresa por el nmero de equivalentes gramo de cido o de base que deben ser agregados a 1 L de disolucin amortiguadora para desplazar su pH en una unidad. La capacidad amortiguadora de las disoluciones depende de su concentracin absoluta y con la dilucin disminuye de una manera directamente proporcional al grado de dilucin.

2. Reactivos y materiales (por grupo) - 2 Pipetas graduadas de 10 mL - 1 Soporte para tubos de ensayo - 14 Tubos de ensayo - 60 mL de disolucin 0,15 M de fosfato potsico monosustituido - 30 mL de disolucin 0,15 M de fosfato sdico disustituido - 28 mL de disolucin 0,1 N de cido actico - 35 mL de disolucin 0,1 N de acetato sdico - pH metro 3. Procedimiento 3.1. Preparacin soluciones Buffer cidas. En seis tubos de ensayo previamente numerados, verter las disoluciones de cido actico y acetato sdico en las proporciones dadas en la Tabla 10.2:

Tabla 10.1 Soluciones buffer cidas

Con la ayuda de un pH metro, determine el pH experimental de cada muestra. 3.2. Preparacin de soluciones Buffer bsicas. En ocho tubos de ensayo previamente numerados, verter las disoluciones de fosfato potsico monosustituido y fosfato sdico disustituido en las proporciones dadas en la Tabla 10.2

Tabla 10.2 Soluciones buffer bsicas

Con la ayuda de un pH metro, determine el pH experimental de cada muestra. 4. Expresin de resultados 4.1 De acuerdo con la expresin matemtica dada en el Fundamento Terico, halle y escriba el pH calculado para cada una de las soluciones preparadas tanto para el buffer cido como bsico.

4.2 Compare los valores de pH calculados con los valores experimentales determinados con el pH metro. 5. Cuestionario 5.1 Para un mismo tipo de solucin amortiguadora, por qu varia el pH de las diferentes soluciones preparadas?

PRACTICA # 2 DETERMINACIN DE VITAMIAN C1 Reactivos, materiales y equipos:

Material de vidrio Gradilla

Material biolgico

Reactivos

Equipos de Termmetros

Jugo de naranja, Solucin limn, tomate, almidn al 5% zanahoria y durazno Tabletas Vitamina C. de Lugol

Tubos de ensayo

Papel indicador

Pipetas Tapones de caucho

Gotero Mecheros Mallas

1. Procedimiento: 1. Disuelva 0.5 g de almidn en 10.0 mL de agua. 2. En un tubo de ensayo adicione 2.0 mL de la solucin de almidn y 1.0 mL de lugol. Adicione media tableta de vitamina C. Registre sus observaciones. La decoloracin de la mezcla es una indicacin de la presencia de vitamina C; tenga en cuenta este resultado como patrn de referencia. 3. Identifica cinco tubos de ensayo como A, B, C, D y E y coloca en cada uno de ellos 1.0 mL de la solucin de almidn y 1.0 mL de lugol. Aada unas gotas de jugo de naranja al tubo A; unas gotas de jugo de limn al tubo B; 1.0 mL de jugo de tomate al tubo C; 1.0 mL de jugo de zanahoria al tubo D; y 1.0 mL de jugo de durazno al tubo E. Tape cada tubo con un tapn de caucho y agtelos. Registre sus observaciones para cada tubo. Anlisis y cuestionario:
Munera, R: (2008). GUA PARA PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA. Palmira: Universidad Nacional Abierta y a Distancia.
1

1. Identifique cual de los alimentos empleados contiene mayor cantidad de vitamina C. 2. Consulte un mtodo sencillo de laboratorio para identificar otras vitaminas diferentes a la C. PRACTICA # 2 DETERMINACIN DE VITAMINA C EN FRUTAS Y VERDURAS2 Objetivo Determinar el contenido de esta vitamina en frutas y verduras utilizando el mtodo de Moor. Marco terico El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: 1. Vitaminas 2. Acido ascrbico 3. Oxidacin del cido ascrbico 4. Determinacin de vitamina C por la 2-nitroanilina diazotada Reactivos 2-nitroanilina 0.16% en actico HCI Nitrito de sodio 0,08% en H2O Etanol 96% Acido oxlico 0.15% Solucin de vitamina C, recin preparada (0.2 mg/mI) 1. Procedimiento Cada grupo traer una fruta y una verdura de acuerdo con lo convenido previamente con el profesor. Para obtener el extracto problema se procede de la siguiente manera: En el caso de las frutas ctricas se toma 1 ml de jugo, se pesa y luego se agregan 4 ml de cido oxlico al 0,15%, se mezcla bien y se filtra, el filtrado se conserva para hacer la determinacin colorimtrica.

Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.

Para otras frutas y verduras, se pesa lg que se macera en mortero lo mejor posible con 4 ml de solucin de cido oxlico al 0,15%. Despus de filtrar completar el filtrado con la solucin de oxlico hasta un volumen final de 5 ml. De ah tomar 1 ml de cada extracto problema para tubos D1 (fruta) y D2 (verdura). Si la extraccin se va a hacer en licuadora, se recomienda pesar 6 g y adicionar 30 ml de cido oxlico al 0.15%. Si el extracto exhibe coloracin se recomienda adicionar una pequea cantidad de carbn activado (aproximadamente 1 g por cada 10 mI de extracto coloreado) se agita y luego se centrifuga a 2500 rpm durante 10 minutos. La solucin patrn de cido ascrbico contiene 0.2 mg/ml y debe estar recientemente preparada. El nitrito de sodio tambin debe estar fresco y debe asegurarse que la 2-nitro anilina se diazotice bien. Esto se logra cuando al mezclar esta con el nitrito se decolora la solucin. Rotular 9 tubos de ensayo y adicionar los siguientes reactivos:

Tubos Condiciones B 0.1 0.1 1 0.1 0.1 2 0.1 0.1 3 4 5 0.1 0.1 6 0.1 0.1 Fruta Verdura D1 D2 0.1 0.1 0.1 0.1

2-nitroanilina, ml Nitrito de sodio, ml Mezclar y esperar la decoloracin Etanol 96%, ml Patrn vitamina C, ml cido oxlico, ml Extracto problema, ml

0.1 0.1 0.1 0.1

3.8 1.0

3.8 0.1 0.9

3.8 0.2 0.8

3.8 3.8 0.4 0.6 0.6 0.4

3.8 0.8 0.2

3.8 1.0

3.8 1.0

3.8 1.0

Mezclar bien y dejar en reposo cinco minutos NaOH 10%, ml Agua destilada, ml 1.2 3.8 1.2 3.8 1.2 3.8 1.2 1.2 3.8 3.8 1.2 3.8 1.2 3.8 1.2 3.8 1.2 3.8

Se mezcla bien el contenido de cada tubo y se lee en el espectrofotmetro las Absorbancias correspondientes a una longitud de onda de 540 nm. Elabore la curva de calibracin e interpole las Absorbancias de sus muestras. 2. Expresin de resultados

De acuerdo con los resultados calcular el contenido de vitamina C en la fruta y verdura correspondiente, expresndolo como mg/100 g de fruta o verdura o como mg/100 ml de jugo. Finalmente compararlo con el valor reportado en la bibliografa. 3. Cuestionario 1. Compare el mtodo que utiliz con otro mtodo de determinacin de la misma vitamina. 2. Qu ocurrira si no se decolora por completo la solucin de 2-nitroanilina al adicionar nitrito de sodio? 3. Cul es la funcin del hidrxido de sodio en la determinacin de la vitamina C? 4. Cmo se afectara la determinacin si la muestra ha sido tratada previamente con calor? 5. Cmo se encuentra la vitamina C generalmente en los materiales vegetales? 6. Cite seis alimentos (verduras, frutas, leguminosas, tubrculos) ricos en vitamina C.

PRACTICA # 3 HIDRLISIS DE POLSACARIDOS3 Objetivo Comparar tres mtodos de hidrlisis de polisacridos, determinando la cantidad de azcar reductor formado mediante la reaccin de la glucosa con 3,5-dinitrosalicilato de sodio. Marco teorico El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: 1. estructura y funcin biolgica del almidn, glucgeno y celulosa. 2. incremento en azcares reductores mediante el reactivo 3,5-dinitrosalicilato en solucin alcalina. Reactivos Solucin de almidn soluble (6 mg/ml) en buffer fosfato de sodio 0.02 M y pH 6.9 NaOH2, 4 N HCI 4 N

Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.

Reactivo 3,5-dinitro salicilato de sodio: (disolver 5 g de cido 3,5-dinitro saliclico en 100 ml de NaOH 2N, calentar. Por separado, adicionar 150 g de tatrato de sodio y potasio a 250 ml de H2O, calentar. Mezclar las dos soluciones y completar a 500 ml) Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH 6.9 en NaCI 0.005 M. NaOH 20% Reactivo de Lucas. (134 g de ZnCI2 en 89 ml de HCI concentrado)

1. Procedimiento El profesor en el momento de la prctica distribuir el trabajo de tal manera que cada grupo realice una hidrlisis diferente sobre el mismo polisacrido; por ejemplo el grupo 1 efectuar hidrlisis cida sobre almidn proveniente de maizena y el grupo 2 efectuar la hidrlisis enzimtica sobre la misma muestra a fin de que puedan comparar los resultados. La solucin del polisacrido tendr una concentracin de 6 mg/ml y se preparar en Buffer fosfato de sodio 0.02 M pH = 6,9. Todos los grupos realizarn la hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCl2 (o reactivo de Lucas) 1.1 Hidrlisis cida Rotular ocho tubos de ensayo y agregar en orden los siguientes reactivos:

Tubos Condiciones B Solucin almidn, ml Agua destilada, ml NaOH, 2.4 N HCl 4N, ml 0.4 1 0.6 0 0.4 1 0.6 1 0.4 0.6 2 3 4 0.4 0.6 5 0.4 0.6 6 0.4 0.6

0.4 0.4

0.6 0.6

Colocar los tubos 1 a 6 en un bao mara a ebullicin y dejarlos en los siguientes tiempos: Tiempo de incubacin, minutos 0 0 3 6 9 12 15 25

Finalizado el tiempo de incubacin, sacar cada tubo y detener la hidrlisis agregando: NaOH, 2.4N, ml Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Introducir todos los tubos en el bao a ebullicin durante cinco minutos, enfriar y agregar 7 ml de agua destilada. Agitar y medir transmitancia a 540 nm. Utilice el B para ajustar el 100% de transmitancia.

1.2 Hidrlisis enzimtica Recoger 2 ml de saliva en un vaso de precipitados. Cuando est todo listo para la hidrlisis enzimtica, diluya la saliva original tomando 0.3 ml de saliva y 19.7 ml de buffer de fosfato de sodio pH 6.9 en NaCI 0.005 M. Use inmediatamente la saliva diluida. Si la velocidad de hidrlisis es muy rpida para obtener una rata lineal en los primeros minutos o demasiado lenta, para observar una rata apreciable, repita el ensayo usando otra dilucin de saliva. Rotular ocho tubos de ensayo y agregar los siguientes reactivos:

Tubos Condiciones B Solucin almidn, ml Agua destilada, ml Saliva diluida, ml 0.4 0.6 0 0.4 0.6 1 0.4 0.6 2 3 4 0.4 0.6 5 0.4 0.6 6 0.4 0.6

0.4 0.4

0.6 0.6

Inmediatamente adicione la saliva a los tubos B y 0, agregue el siguiente reactivo: Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml 1 1

Agite todos los tubos y deje incubar a temperatura ambiente: Tiempo de incubacin, minutos 0 0 3 6 9 12 15 25

Luego de terminar la incubacin, agregue: Reactivo 3,5-dinitrosalicilato, ml 1 1 1 1 1 1

Coloque todos los tubos en un bao a ebullicin durante cinco minutos, enfre y agregue 8 ml de agua destilada. Mida la transmitancia a 540 nm y use el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia.

1.3 Hidrlisis cida de la celulosa en presencia de ZnCI2 Colocar en una cpsula un trozo de algodn bien desmenuzado o vanos pedacitos pequeos de papel de filtro. Agregue 3 ml del reactivo de Lucas y caliente durante tres

minutos, agitando energticamente. Deje enfriar y neutralice rpidamente con NaOH al 20%. Si se forma un precipitado centrifugue a 2.500 rpm durante 10 minutos y luego pase 0.5 ml del sobrenadante a un tubo, adicione 1 ml de NaOH 2,4 N y 1 ml del reactivo, 3,5-dinitro salicilato y proceda en igual forma a la utilizada en las hidrlisis anteriores. Repita el procedimiento calentando durante 6 minutos. 1.4 Expresin de resultados La glucosa libre que queda despus de la hidrlisis completa del almidn, (tubo No. 6 de la hidrlisis cida), representa el 100% de conversin del polisacrido en glucosa. Tomando el valor de absorbancia de este tubo como el 100% de hidrlisis, calcule el porcentaje de hidrlisis en los dems tubos de las diferentes hidrlisis. Grafique el porcentaje de hidrlisis o formacin de azcar reductor vs tiempo para la hidrlisis cida y enzimtica del almidn. Compare el porcentaje de hidrlisis a los 3 minutos de cada polisacrido para la hidrlisis cida, la hidrlisis cida en presencia de ZnCI2 e hidrlisis enzimtica. 1.5 Cuestionario 1. Cules son los productos de la hidrlisis enzimtica parcial y total del almidn, del glicgeno y de la celulosa? 2. Cul es el efecto de la adicin de NaCI al buffer fosfato usado para diluir la saliva? 3. Explique la diferencia estructural entre la celulosa y el almidn. Cmo puede degradarse enzimticamente la celulosa? 4. Qu son los compuestos llamados dextrinas y cul es su importancia en la elaboracin de alimentos?

PRACTICA # 4 FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD 4 Objetivos Realizar la extraccin fraccionada de los componentes protenicos de las semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de solubilidades de los diferentes tipos de protenas. Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de Biuret. Marco terico El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los
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Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.

siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: 1. Solubilidad y precipitacin de las protenas 2. Clasificacin de Osborne de las protenas, por el criterio de solubilidad 3. Mtodo Biuret

Reactivos, materiales y equipos: H2O desmineralizada, NaCI al 1%, Etanol al 75%, NaOH 0.1 N, reactivo Biuret, solucin patrn de albmina de huevo de concentracin conocida. 1. Procedimiento Recordar que el tratamiento de la harina, con cada uno de los siguientes solventes, extrae la fraccin indicada as:

Solvente Extractor Agua desmineralizada Cloruro de sodio al 1% Etanol al 75% Hidrxido de sodio 0.1 N

Fraccin Extrada Albminas Globulinas Prolaminas Glutelinas

Preparacin de la muestra Pesar 2.0 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de: arveja, soya, frjol, haba, trigo, cebada, etc.); pasarla a un tubo de ensayo, agregar 10 ml de H2O desmineralizada, agitar manualmente durante 10 minutos y centrifugar la suspensin a 2500 rpm por 3 minutos. Vaciar el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 ml de H2O desmineralizada y repetir exactamente el proceso anterior. Despus de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extraccin se adiciona al baln que contiene al primer sobrenadante. Se completa su volumen a 25 ml con H2O desmineralizada hasta el enrase. As se tiene separada la fraccin de las albminas.

Proceso de Extraccin

Fuente: Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur. Sobre el residuo que queda de la separacin de las albminas, se repite ahora todo el proceso anterior, pero agregando esta vez NaCl al 1%. Despus de centrifugar, los sobrenadantes de la primera y segunda extraccin con NaCl al 1%, se llevan a otro baln aforado de 25 ml y se completa hasta el enrase con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fraccin de las globulinas. Sobre el residuo anterior se extrae en idntica forma la fraccin de las prolaminas, usando esta vez alcohol etlico al 75% y una temperatura de extraccin cercana a 60 C. Por ltimo sobre el mismo residuo, con la adicin de solucin de NaOH 0.1 N y aplicando el mismo procedimiento general, se separa la fraccin de las glutelinas. Mtodo de Biuret Sobre cada uno de los extractos que contienen las diferentes fracciones cada grupo proceder a la determinacin de protenas, aplicando el mtodo de Biuret.

La curva de calibracin se har utilizando como patrn una solucin de albmina de huevo de concentracin conocida. Para las muestras de soya, arveja y frjol, de las fracciones de albminas y glutelinas deber tomarse para cada una y por aparte, una alicuota de 0,5 ml y llevarse a un volumen de 5 ml (dilucin 1 a 10) con agua desmineralizada para las albminas y con NaOH 0,1 N para las glutelinas. Estas diluciones se usarn como extractos problemas para dichas fracciones. En 15 tubos de ensayo rotulados pipetear en c/u las cantidades de reactivos que se indican en el siguiente cuadro. Mezclar bien y dejar en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o introducir los tubos en un bao de agua a 30 C durante 10 minutos para desarrollo del color. Leer en cada tubo porcentaje de transmitancia a 540 nm usando el tubo B para ajustar el 100% de transmitancia. 2. Clculos y resultados Consultar tablas de conversin para pasar porcentajes de transmitancia a los correspondientes valores de absorbancia o calclelos utilizando la frmula: A = 2 - log (%T) Trazar en papel milimetrado la grfica de calibracin (absorbancia en ordenadas vs. concentracin (mg/mI) en abcisas) e interpolar las Absorbancias de los tubos problemas; proceder, teniendo en cuenta las diluciones de cada caso, a calcular los porcentajes de cada fraccin protenica.

Condicion es Sol. patrn albumina, ml Fraccin albuminas, ml Fraccin globulinas, ml Fraccin prolaminas, ml Fraccin glutelinas, ml

Tubos B 1 0. 1 2 0. 3 3 0. 5 4 0. 7 5 0. 9 6 1. 2 7 8 9 10 11 12 13 14

0. 5

1. 0

0. 5

1. 0

0. 5

1. 0

0. 5

1. 0

H2O destilada, ml

1. 9

1. 7

1. 5

1. 3

1. 1

0. 8

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

1. 5

1. 0

Reactivo de Biuret en todos los tubos: 4 ml Debern compararse los valores obtenidos con los que se hallen en la literatura consultada. Calcular tambin los rendimientos de las extracciones, los cuales se deducen de la comparacin con los porcentajes de protena total, obtenidos por micro Kjeldahl, en la siguiente prctica (No.6). 3. Cuestionario 1. Qu se entiende por pl de una protena? Explique por qu las protenas precipitan en este punto. 2. Discuta un mtodo colorimtrico alternativo para la determinacin de protenas indicando en que se fundamenta. 3. Cmo se clasifican las protenas de origen animal de acuerdo con su solubilidad? 4. Qu ventajas en panificacin ofrece el hecho de que una harina de leguminosa tenga mayor o menor contenido de glutelinas y de prolaminas?

PRACTICA # 5 ESTUDIO CINTICO DE LA UREASA5 Objetivos Determinar el efecto del pH, la concentracin del sustrato y la temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica de la ureasa. Determinar la presencia de ureasa en leguminosas y tortas de oleaginosas midiendo su actividad biolgica.

Marco terico El estudiante como parte de su autogestin en el desarrollo de su aprendizaje autnomo, se servir investigar antes de la prctica y a manera de pre informe los siguientes temas, enfatizando en la reacciones qumicas que tienen lugar y el principio del mtodo: 1. ureasa 2. presencia de grupos SH. 3. Oxidacin de los grupos SH

Prez, G. Navarro, Y. (1992). Bioqumica. Santa Fe de Bogot DC: Unisur.

Reactivos Solucin de Ureasa en buffer fosfato 0.05 M y pH 6.3 Buffer fosfato 0.05 M, a pH 5.0; 6.0; 7.2; 8.0 y 10.0. Solucin de Urea 0.25 M Solucin de HgCI2 al 1% Indicador de tashiro Solucin de HCI aproximadamente 0.1 N (titulada exactamente)

Procedimiento El trabajo experimental se har en dos sesiones consecutivas de laboratorio as: En la primera sesin se determinar el efecto del pH, concentracin de sustrato, temperatura sobre la velocidad de la reaccin enzimtica. En la segunda sesin se determinar la presencia de ureasa en leguminosas y tortas de oleaginosas midiendo su actividad por el mismo mtodo utilizado en la sesin anterior.

1. Primera sesin 1.1 Determinacin de la actividad a diferentes pH Preprese 2 series de 5 tubos: 5 servirn como blanco y 5 para determinar el efecto de pH. (Tubos p) rotulados claramente. Agregue lo indicado en el cuadro, incubndolos como se indica. Terminada la incubacin transfiera el contenido de cada tubo a un erlenmeyer diferente, agregando a cada uno 3 gotas de indicador de tashiro; finalmente titule con HCI de normalidad conocida. Primera Serie Condiciones 1 Urea 0.25 M, ml Buffer Fosfato pH 5, ml Buffer Fosfato pH 6, ml Buffer Fosfato pH 7.2, ml Buffer Fosfato pH 8, ml Buffer Fosfato pH 10, ml HgCl2 1%, gotas 5 4.5 4 2 5 4.5 4 3 5 4.5 4 4 5 4.5 4 5 5 4.5 4 TUBOS BLANCO Tubo

Incubar a 50 C durante cinco minutos agitando. Extracto de Ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Incubar a 50 C durante 25 minutos. Titular con HCl 0.1 N Volumen de HCl gastado en la titulacin

Segunda Serie Condiciones

TUBOS PROBLEMA Tubos P 1p 2p 5 4.5 0.5 3p 5 4.5 0.5 4p 5 4.5 0.5 5p 5 4.5 0.5

Urea 0.25 M, ml Buffer Fosfato pH 5, ml Buffer Fosfato pH 6, ml Buffer Fosfato pH 7.2, ml Buffer Fosfato pH 8, ml Buffer Fosfato pH 10, ml Extracto de Ureasa, ml

5 4.5 0.5

Incubar a 50 C durante 30 minutos. Titular con HCl 0.1 N HgCl2 1%, gotas Titular con HCl 0.1N 4 4 4 4 4

1.1.1 Expresin de resultados Tabular los resultados obtenidos as: Tubo nmero ml de HCl gastado 1p 2p 3p 4p 5p Titulacin corregida Micromoles/ml de HCl gastado

El valor corregido de la titulacin es la diferencia entre el volumen de HCl 0.1 N gastado en el blanco y el gastado en el problema (p) al mismo pH. Exprese grficamente (grfica 1 de su informe) en papel milimetrado, los micromoles de urea hidrolizados (en las ordenadas) vs el pH (en las abscisas). De acuerdo con los resultados de su grfica, deduzca el pH ptimo, con el cual va a trabajar en las siguientes etapas.

Tubo nmero 1p 2p 3p 4p 5p

Micromoles de urea hidrolizada

pH correspondiente

1.2 Efecto de la concentracin de sustrato en la velocidad de reaccin enzimtica En 8 tubos de ensayo marcados, pipetear en cada uno las cantidades de reactivos que a continuacin se indican:

Tubos Condiciones B Urea 0.25 M, ml Buffer de fosfato pH ptimo, ml HgCl2, gotas 5 5 4 1 1.0 8.5 2 1.5 8.0 3 2.0 7.5 4 3.0 6.5 5 6.0 3.5 6 8.0 1.5 7 9.5

Colocar todos los tubos en un bao mara a 50 C por cinco minutos y sin sacarlos agregar: Ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final agregar: HgCl2 1%, gotas Mezclar y sacar los tubos del bao 4 4 4 4 4 4 4 4

Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, agregar a cada uno 3 gotas de indicador, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferentes titulaciones con el blanco. 1.2.1 Expresin de resultados Tabular los resultados obtenidos as:

Tubo Micromoles ml de HCl Titulacin nmero de urea gastados corregida 1 2 3 4 5 6 7

Micromoles de HCl gastados

Titulacin corregida, corresponde a: ml de HCl gastados - ml de HCl del blanco. Tubo nmero Micromoles Velocidad de urea en hidrolizada moles/min 1/v [S] moles de urea inicia/ml 1/[S]

1 2 3 4 5 6 7

En papel milimetrado y con datos de la tabla anterior construir las siguientes grficas:

Grfica No. 2 de su informe: En ordenadas datos de y o sea micromoles de urea hidrolizados por minuto. En abscisas datos de [S] o sea micromoles de urea iniciales/ml. Grfica No. 3 de su informe: Siguiendo el procedimiento Lineweaver-Burk, en ordenadas datos de 1/v y en abscisas 1 / [S].

De estas dos grficas, deducir la constante de Michaelis y la velocidad mxima para esta reaccin. El valor de Km (constante de Michaelis) debe expresarse en moles/litro. 1.3 Determinacin de la actividad a diferentes temperaturas Se usarn cinco baos de agua a diferentes temperaturas y cada tubo se incubar como se indica a continuacin: Tubo nmero 1 2 3 4 5 Incubar en: bao de agua con hielo bao de agua a temperatura ambiente aproximadamente 16 C bao de agua a 37 C bao de agua a 60 C bao mara (92 C)

Luego proceda a agregar los reactivos y a mantener las condiciones que se indican enseguida: Tubos Condiciones B Urea 0.25 M, ml Buffer de fosfato pH ptimo, ml HgCl2, gotas Temperatura de incubacin, C 5 4.5 4 16 1 5 4.5 0 2 5 4.5 16 3 5 4.5 37 4 5 4.5 60 5 5 4.5 92

Colocar cada tubo en bao de agua a la temperatura indicada por cinco minutos y sin sacarlos agregar. Solucin de ureasa, ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Agitar e incubar por 25 minutos a la temperatura correspondiente HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4 4

Titular con HCl (normalidad conocida)

Resultados, ml de HCl

1.4 Expresin de resultados Con los resultados de la anterior serie de temperaturas y el obtenido a 50 C (ver determinacin de la actividad a diferentes pH, tubo No. 3p), grafique en papel milimetrado (grfica No. 4 de su informe) los micromoles de urea hidrolizada (ordenadas) vs temperatura C (abscisas). Explique el efecto de cada temperatura en la actividad de la ureasa. 2. Segunda sesin 2.1 Extraccin de la ureasa Pesar 5 g de muestra (en cada caso ser una de las harinas de leguminosas o de las tortas de oleaginosas), pasarla a un erlenmeyer, agregar 10 ml de NaCl 1%; agitar mecnicamente durante 15 minutos y centrifugar la suspensin a 2.500 rpm por 15 minutos; transferir el sobrenadante a un baln aforado de 25 ml. Al residuo agregar de nuevo otros 10 mI de NaCI 1% y repetir exactamente el procedimiento anterior. Reunir los dos sobrenadantes y completar a 25 ml con NaCI 1%. Este es el extracto que contiene ureasa. En 5 tubos de ensayo marcados pipetear en cada uno las cantidades de reactivos como en la tabla siguiente se indica. Mezclar y sacar los tubos del bao. Transferir cuantitativamente el contenido de cada tubo a un erlenmeyer marcado, titular con el HCI (normalidad conocida) y comparar las diferentes titulaciones con el blanco. Tubos Condiciones Urea 0.25 M, ml Buffer de PO4 pH ptimo, ml HgCl2 1%, gotas 5 5 4 5 5 5 4.5 5 4 5 2.5

Colocar todos los tubos en bao mara a 50 C por cinco minutos y sin sacarlos agregar: Extracto de ureasa, ml 0.5 0.5 1 1.5 3

Dejar en bao mara a 50 C durante 25 minutos y al final agregar: HgCl2 1%, gotas 4 4 4 4

Nota: Si la actividad de la enzima es muy baja con las alcuotas utilizadas, repetir el ensayo usando una alcuota del extracto de ureasa mayor. Por el contrario si la enzima presenta una actividad afta repita el ensayo utilizando una dilucin del extracto de ureasa (por ejemplo: 1:5 v/v). 2.2 Expresin de resultados Determine la actividad uresica de la leguminosa o la torta analizada, expresndola como micromoles de urea hidrolizado / ml del extracto de ureasa. Compare la actividad uresica de su extracto con los obtenidos por los dems grupos y con los datos bibliogrficos. 2.3 Cuestionario 1. Qu tipo de inhibicin enzimtica se presenta con el uso de metales pesados? 2. Qu representan los valores de Vm y Km? 3. Qu entiende por metalo-enzimas? D ejemplos. 4. Qu sucedera si se reemplaza el HgCl2 por CaCI2? Explique su respuesta. 5. Todas las enzimas tienen CySH en su sitio activo? Especifique cules son los aminocidos presentes en el sitio activo de las enzimas cuyos sitios activos usted conoce. 6. Para qu se utiliza generalmente el test de la ureasa?

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