Examenul bacteriologic Examenul bacteriologic presupune izolarea, cultivarea si identificarea germenilor bacterieni din diferite alimente suspecte de contaminare.

Fata de examenul microscopic, care permite decelarea prezentei agentului etiologic, metodele bacteriologice complexe permit, pe lnga izolare si cercetarea diferitelor insusiri biologice care-l caracterizeaza. Faptul are o deosebita importanta si din punct de vedere epidemiologic, prin aceste examene evitindu-se, de exemplu darea n consum a unor produse animaliere care pot provoca la om infectii sau toxiinfectii, uneori cu evolutie grava. Este suficient sa se aminteasca perico lul pe care-l prezinta, mai ales carnea animalelor sacrificate de necesi tate, la care intreruperea procesului patologic, prin sacrificare, face ca modificarile organoleptice si organice sa nu trezeasca suspiciune la examinare. Un examen bacteriologic insa poate pune in evidenta agentii unei salmoneloze, leptospirozei, antraxului etc. toate transmisibile la om. Examenul bacteriologic da adesea si indicii referitoare la sursa de infectie si permite deci, eliminarea ei. Ca tehnici de insamintare pot fi aplicate mai multe procedee: a) Cu pipeta Pasteur. Se cauterizeaza suprafafa probei cu o spatula incalzita, se extrage cu ajutorul unei pipete Pasteur, flambata si ea si racita, o cantitate de lichid organic din profunzime si se insaminteaza inti pe mediul lichid (bulion), iar apoi pe mediul solid (agar inclinat, agar cu singe, agar ou ser etc.). La inchiderea si deschiderea tuburilor se iau toate masurile de asigurare a sterilitatii, flambnd gura lor imediat dupa deschidere si inainte de inchidere. b) Cu ajutorul acului de insamintare drept. Se cauterizeaza suprafaa organului si se sterilizeaza acul prin incalzire la rosu (tija se trece si ea de 3 ori prin flacara), iar dupa racire se inteapa organul prin suprafaa cauterizata, facnd cteva miscari spre interior. Se scoate acul din organ si se face insamntarea prin clatirea acestuia in mediul lichid. Fara a se flamba, acul se introduce apoi in tubul cu mediul solid, facndu-se pe suprafaa acestuia miscari in zig-zag, incepnd de la baza mediului spre partea superioara, sau se clateste acul in lichidul de condensare, dupa care se umecteaza intreaga suprafaa a mediului cu acest lichid, prin inclinari repetate. Dupa fiecare proba, acul se sterilizeaza prin inrosire la flacara. c) Cu poriuni de organ. Cnd organul a fost recoltat in conditii de sterilitate (mai ales in cazul animalelor mici) se poate recurge la secionarea unor bucai cu ajutorul unor instrumente sterile, iar cu una din suprafeele sectiunii se disperseaza materialul patologic pe suprafaa unei placi cu mediu. In unele laboratoare aceasta tehnica este folosita aproape in exclusivitate. d) Prin introducerea direct, in mediu a portiunilor de organ. Metoda se foloseste mai rar, in special cind se banuieste saracia in germeni a Tehnica samnarii materialului patologic. Recoltarea si manipularea acestuia trebuie sa se faca in conditii de sterilitate perfecte.

Ca principiu general, se va evita deschiderea organelor sau secionarea tesuturilor inainte de recoltarea materialului pentru examenul bacteriologic. Tehnica transplantarilor. Are ca scop fie izolarea din culturile mixte a diferitilor germeni in stare pura, fie meninerea lor in timp, in conditii de laborator (tulpini de colectie). Din culturile pe medii lichide, transplantarea se face cu pipeta Pasteur sau cu ansa de insamintare. In primul caz, se recolteaza o cantitate arbitrara (cteva picaturi) din cultura veche, care apoi se insamnteaza in mediul proaspat. In cel de al doilea, se introduce ansa flambata si ra cita in cultura veche, dupa care se face insamntarea pe mediile proaspete (inti in mediul lichid si apoi in mediul solid, daca este cazul). Din culturile pe medii solide, transplantarea se face cu ansa, raclnd o cantitate foarte redusa de cultura, care apoi se depune pe mediile proaspete. In timpul insamntarilor de orice natura, este necesar sa se aiba in vedere cteva reguli general valabile: nsmnrile se execut n boxe sterile sau n hote speciale care permit sterilizarea periodic i nu permit formarea de cureni de aer n timpul lucrului; n timpul operaiunilor de nsmnare se evit pe ct posibil conversaia i orice micare de prisos n jurul operatorului; ansa cu care se execut nsmnarea nu trebuie s fie atins de nici un obiect nesteril (mn, halat, mas de lucru, etc.); nsmnrile se vor executa ct mai repede, cu scopul de a reduce la minim contactul materialului de nsmnat cu atmosfera ambiant; n timpul ct recipientele sau tuburile de cultur, sterile sau nsmnate sunt deschise, vor fi inute n poziie nclinat ct mai aproape de flacr pentru a evita contaminarea cu germeni sau spori din atmosfer; imediat dup nsmnare se face notarea tuburilor cu creioane speciale fr a se omite data nsmnrii.

Mediile de culture folosite pentru izolarea diferitelor tipuri de bacterii Pentru a pune un diagnostic bacteriologic corect, sigur si prompt, folosirea unor medii de cultivare corespunzatoare este de o importanta hotrtoare. Cunoscnduse insusirile germenilor cautati, conditiile lor optime de dezvoltare, bacteriologul trebuie sa foloseasca mediile cele mai eficiente si indicate de izolare, in funcie de specia microorganismului in cauza. Un mediu de cultura trebuie sa asigure substratul nutritiv pentru cresterea si multiplicarea microbilor, sa aibe un pH care sa permita desfasurarea normala a proceselor metabolice microbiene (in general 7,27,4), sa asigure condiiile de aerobioza sau anaerobioza, sa fie pastrate in recipiente care sa impiedice contaminarea cu alti microbi si sa fie usor de manevrat. In general, microbii patogeni se dezvolta optim la temperature corpului speciei de la care sunt izolati.

Sunt insa si specii microbiene care prefera temperaturi mai joase ( ex. leptospirele se multiplica la 2830C). Mediile de cultura se pot imparti in doua categorii: medii uzuale (obinuite), pe care se dezvolta majoritatea germenilor patogeni. Ele pot fi: pentru bacterii aerobe; pentru bacterii anaerobe; medii speciale, destinate izolarii, cultivarii si cercetarii insusirilor biologice ale anumitor specii de germeni. Ele pot fi: de izolare, de imbogatire, selective, diferentiale ; mediile speciale de izolare favorizeaza dezvoltarea anumitor germeni, care nu se pot cultiva de la inceput pe mediile obisnuite, ei necesitnd anumite condiii speciale sau anumii ,,factori de plecare". Mediile de imbogire sunt folosite pentru cazurile in care in produsul patologic de examinat se bnuieste o cantitate mica de germeni patogeni si un numar mare de germeni din flora de asociaie. Astfel de medii sint mediul KaufmannMuller (pentru enterobacteriaceae), mediul Chapman (pentru stafilococi patogeni). Mediile selective favorizeaza, prin compoziia lor chimica, dezvoltarea anumitor germeni. Astfel sint mediul WilsonBlair si Drigalski (pentru salmonele), mediul Istrati Meitert (pentru Escherichia, Shigella, Salmonella), mediile Czapek, Sabouraud (pentru ciuperci). Mediile diferenfiale permit cresterea difereniata a unor specii microbiene sau pun in evidena anumite particularitati metabolice cu semnificaie diagnostic. Ele evideniaza anumite procese biochimice caracteristice metabolismului anumitor specii de bacterii, permitnd in acest fel identificarea lor (fenomene proteolitice, zaharolitice, oxidoreductoare etc.). Includerea in componena acestor medii a unor substane indicatoare sau revelatoare este menita sa faca vizibil procesul respectiv. Dupa starea lor fizica mediile se pot imparti in: solide, semisolide, lichide. Dupa compozitie pot fi: medii simple si complexe. Exista si medii ,,sintetice" bazate pe componente cunoscute din punctul de vedere al structurii lor chimice. In comparatie cu bulionul, agarul sau alte medii ale caror componente nu sunt identificate chimic in totalitate, mediile sintetice au avantajul ca permit anumite determinari capabile sa ofere relatii asupra metabolismului bacterian (prin dozarea inainte si dupa cultivare a diferitelor componente se poate cunoaste ce anume a fost consumat in cursul multiplicarii si in ce cantitate). Dintre cele mai frecvent folosite medii de cultura sunt : Apa peptonata - este unul din cele mai simple medii de cultura, dar care are largi utilizari, in special cnd i se adauga zaharuri, in vederea determinarii spectrului zaharolitic al diferitelor specii de bacterii. Se prepara din: - apa distilata - peptona - NaCl 100,0 ml 1,0 g 0,5 g

Se ajusteaza pH-ul la 7,27,4, se incalzete 15 minute la 115C pentru precipitare, se filtreaza prin hrtie de filtru si se sterilizeaza din nou !a autoclav.

Cnd se adauga zaharurile, acestea se pun in proportie de 1% in balonane separate, se adauga albastru de bromtimol (12 ml la 1 litru de mediu) ca indicator si se sterilizeaza prin tindalizare 30 de minute, 3 zile consecutiv. Soluia de albastru de bromtimol folosita in acest scop se prepara din: 1 g albastru de bromtimol + 25 ml NaOH n/10 + 475 ml apa distilata. Bulionul de carne se prepara mai ales din came de bovine i cabaline, mai rar din cea de pasare. Muschii se curaa de aponevroze, tendoane, fascii si grasime, se taie bucati mici, sau se toaca la masina de tocat came. La 500 g tocatura, se adauga 1000 ml apa de robinet, se tine 24 de ore la rece, pentru macerare, apoi se fierbe 30 minute, se decanteaza i se stoarce, iar lichidul obtinut se filtreaza prin mai multe straturi de tifon si se completeaza cu apa la volumul iniial. Se incalzeste la 8090C si se adauga peptona 10 g si NaCl 5 g la 1000 ml lichid. Se ajusteaza pH-ul cu o solutie de NaOH n :1 (la 7,27,6) prin metoda colorimetrica. Se incalzeste la autoclav la 115C timp de 15 minute. Incalzirea in prezenta NaOH produce o precipitare abundenta, ceea ce impune o filtrare prin hirtie de filtru. Apoi se face repartizarea in tuburi, in cantitate de cca 5 ml, in sticle sau baloane, care se astupa cu dopuri de vata si se sterilizeaza 30 minute la auitoclav la 115C. Pentru repartizare se pot folosi pipete de 2550 mil, dar cel mai practic este sa se folosesca dispozitive speciale constnd din vase cu tubulura inferioara sau plnii suspendate, prevazute cu un tub de cauciuc si clem. In unele laboratoare exista dispozitive automatizate care asigura un debit constant, reglabil (aa numitele turntoare de medii). Bulionul astfel preparat are un aspect asemanator cu untdelemnul si trebuie sa fie perfect limpede. Pastrarea lui se poate face vreme indelungata in vase bine inchise, in incaperi reci si la adapost de lumina. La ora actuala, este din ce in ce mai raspindita folosirea extractelor de carne care sint livrate in stare deshidratata, purificata si standardizata, ceea ce asigura obinerea unor medii de o calitate superioara (extractele Merck, Oxoid etc.). Agarul nutritiv (geloza) este un mediu solid obtinut prin adaugarea la bulionul de carne a agarului (fibre sau pulvis). Acesta nu are nici un rol nutritiv, dar determina solidificarea mediului. La 1 litru de bulion, se calculeaza 30 g agar fibre sau 25 g agar pulvis, care se topeste apoi prin incalzire la 115C, timp de 15 minute la autoclav. Se filtreaza prin vata, in autoclavul cu capacul deschis (pentru a evita solidificarea pe parcursul filtrarii). Se repartizeaza in eprubete sau alte recipiente unde urmeaza a fi pastrat. Se astupa cu dopuri de vata, se sterilizeaza 20 de minute la 120C dupa care eprubetele se pun in pziie inclinata pentru solidificare. Pastrarea se poate face in flacoane inchise etans pentru a evita pierderea apei, dar in general este bine sa nu se prepare sarje prea mari pentru a dispune de mediu ct mai proaspat.

Examenul caracterelor culturale

Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si uneori condiiile de cultivare. Pentru unele specii, o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor. In mediile lichide, in aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafaa. Turbiditatea poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca. Depozitul ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germeni lor care s-au dezvoltat in mediu. El poate fi discret sau abundent, granular, viscos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului. Suprafata mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda, sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

Pe mediile solide, germenii constituie, prin multiplicare, aglomerri cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea. Sub aspectul dimensiunii, coloniile pot fi de talie variabila, pina la ciiva milimetri diametru.

Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata. Profilul (in seciune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform. Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata. Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri. Culoarea coloniilor este diferita in funcie de prezenta si natura pigmentului pe care eventual il conin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.). Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existind grade intermediare. Consistenta este si ea variabila: untoasa, viscoasa, uleioasa, grunjoasa, friabila, filanta, ea determinind cel mai adesea si gradul de

aderenta la suprafaa mediului. In timp ce coloniile de consistent untoasa i granulara se desprind cu usurinta, cele visooase adera, determinind o dificultate in desprinderea lor. Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica sa fie omogene sau neuniforme. Citeva exemple in acest sens, pot fi edificatoare.

In medii lichide: mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi); mediul poate fi tulbure cu un inel pe perete la limita superioara a mediului (E. coli); mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi); mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul antraxului); mediul prezinta un val subtire la suprafaa (vibrionul holeric); mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis); mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la suprafaa, restul lichidului raminnd limpede (M. tuberculosis); mediul este colorat in verde-albastrui (b.piocianic). Pe medii solide: E. coli da colonii rotunde cu margini si suprafee netede de 35 mm diametru, de culoare alba-laptoasa, lucioase; Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente, uneori usor albastrui, aderente la mediu; antraxului da colonii cu suprafata aspra si cu margini avind prelungiri laterale, efilate, care privite cu lupa, au aspectul unor ondula^ii ale firelor de par; stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafe|;e netede, unele din ele pigmentate in alb, auriu sau citrin; streptococii dau colonii mici bombate; b. tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu mar gini neregulate. Bacteriile anaerobe ofera i ele aspecte variabile in functie de me diul folosit in cultivarea lor. In cazul mediilor lichide, in general, se produce o tulburare uniforma cu sau fara producie de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimi tatea lui, fie la suprafata. In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata prezenta mobilitatii . Bacteriile mobile ( Cl. tetani ) produc colonii pufoase aspect sferoid , in timp ce cele imobile ( Cl. perfringens ) produc colonii aspect lenticular , de talie variabila de de de de

Tehnica efectuarii frotiurilor Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite produse patologice (organe, lichide patologice etc.), sau din culturi ale diferitilor germeni, care permite punerea in evidenta a formatiunilor celulare i cerecetarea nsuirilor lor morfologice si tinctoriale. Tehnica efectuarii frotiurilor difer n funcie de materialul din care se face i de natura germenilor in cauz. Din lichide frotiurile se realizeaza prin intinderea materialului respectiv intr-un strat subtire, cu ajutonil unei anse bacteriologice sau a unei lame lefuite pe lame de microscop obinuite. Pelicula de material patologic este recomandabil sa fie cit mai fina i sa aibe o intindere mai redusa decat marginile lamei de microscop. Dac este vorba de frotiuri ce se practica din culturi, in cazul mediior lichide frotiul se face cu ansa bacteriologica, sau cu pipeta Pasteur, din mediul de cultura, iar in cazul mediilor solide se face prelevarea cu ansa bacteriologica a unei cantitati reduse de cultura care se emulsioneaz bine intr-o picatura de apa distilata, pusa in prealabil pe o lama de microscop bine degresata si apoi se intinde suspensia in strat subtire. In cazul culturilor in medii solidificate in pozitie vertical (de exemplu geloza Veillon) se recurge la o pipeta Pasteur la care se adapteaza un tub de cauciuc, in asa fel ca el sa permita manipularea pipetei in profunzimea mediului sub control vizual. Materialul microbian se recolteaza prin aspirarea coloniilor izolate, care se gasesc in diferite puncte ale mediului. Din organe, frotiul se poate realiza in mod diferit in functie de natura acestora. Cel mai frecvent se face prin aplicarea unei lame de microscop pe suprafafa de sectiune a probei de examinat, in acest fel raminind o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lama sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine). Se poate recurge, de asemenea, la glisarea unei portiuni de organ, tiat geometric, pe suprafaa unei lame de microscop, avndu-se grij de a nu se atinge marginile lamei. Si n acest caz se prefera frotiurile cit mai fine. Uneori, frotiurile se executa prin strivirea intre doua lame (in cazul unor leziuni de tip nodular. In acest scop, se depune o formatiune nodulara suspecta pe o lama si cu o a doua se strivete prin compresiune. Efectuarea frotiului din organe In cazul unor organe bogate in lichide (snge, exsudate) frotiul se poate face prin depunerea cu ajutorul unei anse bacteriologice sau a unei pipete Pasteur pe lama de microscop a unei cantitati reduse de material patologic si etalarea lui in strat subtire. Frotiurile astfel obtinute se fixeaza dupa uscare la flacara i se coloreaza. Fixarea este necesara pentru a realiza o buna aderenta a materialului patologic pe lama si implicit evitarea desprinderii de catre solutiile colorante a materialului de examinat pe de o parte si inactivarea germenilor etalati pe de alta. Fixarea se poate obtine prin mijloace termice sau chimice.

Fixarea termica presupune trecerea frotiului uscat de 34 ori prin flacara unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, avnd grija ca lama sa fie orientata spre flacara cu partea opusa celei pe care s-a etalat materialul. Viteza de trecere este moderata, in asa fel ca in final temperatura lamei sa fie in jur de 60C. Fixarea termica se poate face si prin flambare, punnd pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si dindu-li-se foc imediat dupa scurgerea excesului de alcool. Fixarea chimica se realizeaza prin folosirea unor substance fixatoare (alcool etilic, amestec de alcool etilic, eter si alcool metilic). Acestea se pun in cantitate suficienta pentru a acoperi pelicula de material de pe lama si se lasa pna la evaporarea totala. Trebuie mentionat ca unii coloranti (de exemplu soluia Giemsa din metoda cu acelasi nume) au si capacitates de a fixa frotiurile, asa incit in acest caz nu mai este necesara fixarea prealabila. Dupa fixarea si racirea frotiului urmeaza colorarea, care este bine sa se faca ct mai curnd dupa efectuarea frotiurilor.

Metodele cele mai importante de colorare pentru examenul bacteriologic Prin colorare se pot stabili unele particularii morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaiile cu esuturile n care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului. Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat, in funcie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica n mod curent si metode speciale, mai pretentioase si aplicate numai in anumite situatii. Coloratia Gram se foloseste pentru diferentierea germenilor Gram pozitivi de cei Gram negativi din frotiurile efectuate din diferite tesu turi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica. Ea consta in: colorare cu solute de violet de Gentiana lo/ 0 timp de 1 minut varsarea colorantului de pe lama tratarea frotiului cu solutie Lugol timp de 2 minute decolarea cu amestec de alcool-acetona pna cind amestecul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat spalare cu apa de robinet recolorare cu fucsina diluata 1/10 timp de 2030 secunde spalare cu apa de robinet uscare examinarea la microscop. Germenii Gram pozitivi vor aparea colorati in albastru-violet iar cei Gram negativi in rosu. Aceasta diferenta de colorare rezulta din fap tul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. Coloratia cu albastru de metilen (Loffler) - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i dife rentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. In acest scop se acopera frotiul fixat cu o solutie de albastru de metilen 3% i, dupa 25 minute, se spala cu apa, se usuca, se examineaza. Germenii vor aparea colorati in albastru, uniform. Metoda per mite si observarea unor particularitati morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole.

Coloraia ZiehlNeelsen - se foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obis nuite (mai ales micobacteriile): acoperirea frotiului, in prealabil fixat la flacara, cu soluie de fucsina Ziehl incalzirea la flacara pna la aparitia vaporilor si mentinerea prin incalziri repetate timp de 510 minute (se va avea grija ca soluia coloranta sa nu fiarba si sa se completeze in caz c s-a evaporat de pe anumite portiuni de frotiu) varsarea colorantului decolorarea cu o solutie de acid sulfuric 1/4 sau acetic 1/3, timp de cca 2 minute spalare cu apa tratare cu alcool absolut timp de 5 minute spalare cu apa recolorare cu solutie de albastru de metilen 1% timp de 23 minute spalare cu apa uscare si examinare cu imersie.

La examenul frotiurilor, germenii se pot prezenta colorai in rou (acidorezistenti) sau in albastru (neacidorezistenti). Primii fixeaza fucsina Ziehl si nu se decoloreaza sub aciunea acidului, in timp ce ceilali se decoloreaza sub influenza tratarii cu acid. Acidorezistenta rezida in structura chimica particulara a peretelui celular al germenilor, in sensul ca in cazul acidorezistenilor acesta fiind bogat in substane lipoide impiedica patrunderea acidului decolorant ca dealtfel si a coloranilor (fucsina patrunde datorita concentraiei ridicate si a caldurii). Pentru acest motiv, germenii acidorezistenti nu sunt colorabili prin metode obisnuite. Alte metode de colorare: Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda TribondeauFontana - se foloseste pentru colorarea leptospirelor Pentru colorarea capsulei bacteriene: coloraia Giemsa, metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu verde de malahit Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill

Determinarea bacteriilor din genul Salmonella

Metoda stabilete prezena sau absena unei ncrcturi bacteriene din genul Salmonella n produsele cercetate, acestea fiind un pericol pentru sntatea consumatorului n cazul consumului de alimente contaminate. Metoda se aplic urmtoarelor produse: Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt, smntn fermentat, lapte btut, kefir, sana) Iaurt cu fructe Smntn dulce pentru fric i fric btut Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal) Brnzeturi cu past filat (cacavaluri), afumate i neafumate Brnzeturi fermentate Unt Margarin de consum Margarin cu lapte ngheat, torturi de ngheat Praf de ngheat Lapte concentrat cu zahr creme vegetal (nlocuitori de fric) Carne tocat i semipreparate din carne tocat (hamburger, past de mititei, crnai proaspei etc.) Preparate din carne srate i/sau afumate Mezeluri (prospturi, salamuri semiafumate) Mncruri gtite congelate i mncruri gtite, servite calde Preparate din carne, mixte sau simple, gata pregtite, care se consum reci, fr alt prelucrare (piftii, pateuri din carne i organe, biftec) Produse crude (niel, cacava pane)

Pete proaspt, decapitat i eviscerat Produse semiconservate (marinate reci, marinate calde nepasteurizate, marinate calde pasteurizate, produse din icre i din lapi) Icre srate Salat de icre cu adaos de ulei Pete srat Pete srat cu ceap Pete afumat la cald, pete afumat la rece Preparate culinare din pete Ou umplute, salate cu maionez Gelatin alimentar Prjituri cu crem Torturi cu diferite creme, fric, fructe Maionez Pulberi de maionez (nlocuitori de maionez) Vegetale congelate Vegetale deshidratate Prafuri de budinci i creme deshidratate, nlocuitori de fric Paste finoase (macaroane, fidea) Paste finoase cu umplutur (ciuperci, carne brnz) Condimente i amestecuri Buturi rcoritoare i sucuri de fructe cu termen de valabilitate mai mic de 14 zile Pulberi pentru sucuri Ape minerale i carbogazoase, ghia artificial Bere nepasteurizat, filtrat i nefiltrat Bere pasteurizat Finuri alimentare altele dect finuri pentru panificaie (fin de orez, orezin, fosfarin) Produse de panificaie cu umpluturi Derivate din cereale tratate termic (fulgi de porumb, orez, produse expandate) Biscuii uscai i biscuii glazurai Biscuii, pateuri Fursecuri, napolitane cu diferite creme Cacao, pudr, ciocolat tablete, ciocolat cu adaos, bomboane fine i extrafine de ciocolat Ciocolat umplut cu crem Specialiti din ciocolat umplute cu crem gras sau de tip fondant Bomboane altele dect ciocolat Jeleuri, rahat, gemuri, erbeturi, dulceuri, fructe confiate Arome alimentare naturale sau sintetice

Emulsie pentru buturi rcoritoare Concentrate alimentare (supe, cuburi de carne) Oet alimentar Ceai (plant) Bor Cafea crud prjit i instant Melanj din ou praf Produse din gru germinat Fructe de mare refrigerate Pepsin (pulbere n maestec cu sare) sandviciuri, mncruri tip fast-food.

Documente de referin: - ISO 17025/2001 - SR EN 12824/2001 - ISO 6887/96 ISO 7218

Principiul metodei: Germenii din genul Salmonella pot fi prezeni n numr mic i sunt deseori nsoii de un numr mult mai mare de alte microorganisme din familia Enterobacteriaceae sau din alte familii. n consecin este necesar mbogirea selectiv n plus deseori este necesar prembogirea pentru a evidenia acei germeni Salmonella care au fost supui alterrii. Aparatur i sticlrie folosit Termostat 35oC; 37o +-0,5oC; 42oC dezvoltarea microbian aparat electric pentru

Etuv 160 180oC - asigur sterilizarea cu cldur uscat a obiectelor de sticl, porelan, hrtie, vat, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60 minute Autoclav - realizeaz sterilizarea prin nclzire cu vapori prin presiune pentru: medii de cultur, produse patologice obiecte de cauciuc. Temperatura este de 121oC timp de 20-30 minute Lamp U.V. - radiaii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului ncperilor i a suprafeelor de lucru Balan analitic - balan electronic cu reglare automat funcie de temperatura camerei Sterilizator electric pentru instrumente

Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix de nalt turaie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile Baie de ap reglabil la temperatur 35 oC sau 37oC, 45oC, 55oC i 70oC Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml Aparat pentru sterilizare uscat sau umed ISO 7218 Etuv ventilat prin convecie reglabil la 37 oC i la 55oC pH metru cu compensare de temperatur cu exactitate 0,1 uniti de pH la 25o C Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platin-iridiu sau nichel-crom Eprubete de 16 x 160 mm sterile Flacoane pentru medii de cultur Eprubete cu diam de 8/160 mm Pipete cu scurgere total cu capacitate nominal de 1 ml i 10 ml Mojar cu pistil, sterile Eprubete gradate Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 i 250 ml

Eantionarea - este important ca laboratorul s primeasc un eantion cu adevrat reprezentativ, nealterat sau modificat n timpul transportului sau depozitrii n corelaie cu standardul internaional specific al produsului. Reguli de procedur Modul de analiz, acceptare i nregistrare a comenzilor eantioanele trebuie s fie etichetatei iar procesul verbal de prelevare probe s conin urmtoarele date:produsul recoltat, examenul cerut, locul prelevrii, ziua i data prelevrii, data de valabilitate, sigiliul, martorii prelevrii, cine a prelevat proba. Pentru a obine o cultur pur de germeni este necesar ca materialul de laborator folosit (recipiente, instrumente, sticlrii) s fie steril. Sticlria ntrebuinat este sterilizat la etuv la

180oC timp de 30 minute, iar mediile sterilizate la 121 oC timp de 30 minute. Pregtirea eantionului pentru analiz. Eantionul se pregtete conform standardului internaional specific al produsului respective: lapte materie prim i produse lactate se cntresc 25 g eantion ntr-un balon Erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (APT), lapte praf, zer dulce i lactoz se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 g mediu de prembogire, brnza i brnza topit se cntresc 25 g prob ntr-un mojar steril, se mojareaz, se transfer ntrun balon steril, peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire, untul se cntresc 25 g eantion ntr-un balon erlenmayer steril, se nclzete ntr-o baie de ap la 45 oC peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire. Alimentul cu consisten solid se mrunete n buci mici nainte de mojarare. Din proba de analizat se introduc n mojar 25 g. Se mojareaz, se transfer ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adaug 225 ml mediu de prembogire (ATP)

Aciuni i/sau msuri preventive Protecia personalului Obligatorie purtarea halatului Folosirea lampei de U.V. (nainte i dup nsmnare) Folosirea hotei de nsmnare Pipetele sunt prevzute cu dop de vat nehidrofil pentru a preveni aspirarea accidental a eantionului Flambarea ansei se face nti la baza flcrii i apoi la vrf pentru a mpiedica rspndirea germenilor Dezinfecia suprafeelor de lucru cu soluii dezinfectante

Protecia mijloacelor de ncercare i/sau msurare Modul de lucru Sticlria steril se pstreaz n dulapuri speciale Sticlria steril se folosete maxim 6 zile Executarea periodic a serviciilor de ntreinere i curire zilnic a aparaturii Verificarea i nregistrarea temperaturii din ncperea de lucru

Pregtirea eantionului pentru analiz - se efectueaz conform standardului internaional pentru produsul de analizat. nsmnare i incubare 1. Faza de prembogire neselectiv.

Se cntresc 25 g produs ntr-un balon erlenmayer steril peste care se adug 225 ml mediu APT . Se incubeaz la temperatura de 35 o 37oC timp de 1620 h. 2. Faza de mbogire selectiv Din cultura obinut conform 10.3.1. se trec 0,1 ml n 10 ml mediu RV i 10 ml ntr-un flacon ce conine 100 ml mediu SC. Se incubeaz cele dou medii nsmnate dup cum urmeaz:. a) mediul RV nsmnat la temperatura de 42 oC timp de 24 h b) mediul SC nsmnat la temperatura de 35 o 37oC (conform acordului)timp de 48 h 3. Izolare i identificare. Din cultura obinut n mediu RV dup 24 h de incubare cu o ans bacteriologic se nsmneaz suprafaa primului mediu de nsmnare selectiv (ARFVB) n cutii Petri sterile. Se procedeaz la fel cu cel de-al doilea mediu de izolare selectiv (AMC) folosindu-se o alt prelevare cu ansa bacteriologic i cutii Petri sterile de dimensiuni adecvate.Se incubeaz cele dou medii selective nsmnate la temperatur de 35 o 37oC timp de 24 h. Din cultura obinut n mediu SC, dup 48 h incubare se repet operaiunile descrise mai sus.Dup 24 h incubare n ambele situaii se examineaz cutiile pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristic de Salmonella.

Interpretare

Coloniile caracteristice de Salmonella dezvoltate pe mediu ARFVB provoac virarea culorii mediului de la roz la rou. Dac dezvoltarea este slab sau nu se evideniaz coloniile caracteristice de Salmonella cutiile Petri nsmnate se incubeaz n continuare la temperatura de 35 o 37oC (conform acordului) timp de 18-24 h.Se reexamineaz cutiile Petri pentru a cerceta prezena coloniilor caracteristice de Salmonella. Test de confirmare

Pentru confirmare, din fiecare cutie Petri din fiecare din cele dou medii selective se recolteaz cte 5 colonii considerate caracteristice sau suspecte. Dac se gsete o cutie cu mai puin de 5 colonii caracteristice sau suspecte, se rein toate coloniile caracteristice sau suspecte.Se striaz coloniile selecionate pe suprafaa agarului nutritiv din cutii Petri n prealabil uscate astfel nct s se obin o dezvoltare de colonii bine izolate. Se incubeaz cutiile astfel nsmnate la temperatura de 35 o 37oC, timp de 18-24 h. Pentru conformrile biochimice i serologice se utilizeaz culturi pure. Confirmri biochimice Cu ajutorul ansei efilate se nsmneaz mediile indicate de la pn la cu fiecare din culturile obinute din coloniile reinute 1. Agar TSI Se nsmneaz coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare. Se incubeaz la temperatura de 35 o 37oC timp de 24 h. Se interpreteaz modificrile care se produc n mediu n modul urmtor: Baza mediului galben glucoz pozitiv (fermentarea glucozei) - roie sau nemodificat glucoz negativ (lipsa fermentrii glucozei) - neagr formare de hidrogen sulfurat - bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoz Panta mediului galben lactoz i/sau zaharoz pozitiv - roie sau nemodificat lactoz i zaharoz negativ (neutilizarea lactozei i a zaharozei Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roie) cu formare de gaz i a unei baze acide (galben) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (nnegrirea agarului. Atunci cnd se izoleaz o Salmonella lactoz pozitiv panta agarului TSI este galben, n consecin o confirmare preliminar a culturilor de Salmonella nu trebuie s se bazeze doar pe rezultatele obinute pe agarul TSI. 2. Agar cu uree. Se nsmneaz panta agarului n striuri. Se incubeaz la 35 o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h i se examineaz din cnd n cnd. n cazul reaciei pozitive descompunerea ureei produce degajarea amoniacului, fcnd s vireze rou de fenol la roz apoi la rou nchis Reacia este deseori vizibil dup 2 pn la 4 h. 3. Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei Se nsmneaz mediul lichid sub suprafa. Se incubeaz la 35o sau 37 C timp de 24 h. O culoare violet aprut dup incubare indic o reacie pozitiv. O culoare galben indic o reacie negativ.
o

4. Evidenierea betagalactozidazei

Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet ce conine 0,25 ml soluie salin, se adaug o pictur de toluen i se agit eprubeta. Se introduce eprubeta n baie de ap reglat la 35 o sau 37oC (conform acordului) i se las s stea cteva minute. Se adaug 0,25 ml Reactiv pentru evidenierea betagalactozidazei i se amestec. Se reintroduc eprubetele n baia de ap la 35o sau 37oC (conform acordului) i se las 24 examinndu-le din timp n timp. O culoare galben indic o reacie pozitiv, deseori reacia este vizibil n 20 minute. n cazul folosirii discurilor de hrtie gata preparate se respect instruciunile fabricantului. 5. Mediu pentru reacia VP Se disperseaz o ans din colonia suspect ntr-o eprubet coninnd 0,2 ml VP, se incubeaz la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 2 picturi din soluia de creatin, 3 picturi din soluia alcoolic de l-naftol i apoi 2 picturi din soluia de hidroxid de potasiu agitnd dup adugarea fiecrui reactiv. Formarea unei coloraii roz pn la rou aprins ntr-un interval de 15 minute indic o reacie pozitiv 6. Mediu pentru evidenierea indolului Se nsmneaz o eprubet ce conine 5 ml mediu tripton-triptofan cu colonia suspect Se incubeaz la 35 o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. Dup incubare se adaug 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel rou indic o reacie pozitiv. Formarea unui inel galben brun indic o reacie negativ.

Tabelul 1 Test1) Reacie pozitiv sau negativ Procentajul nsmnrilor de Salmonella care prezint reacia2) 100 99,93) 99,24) 99,5 91,6 99,0 94,65) 98,54)

Glucoz,TSI (formare de acid) Glucoz, TSI (formare de gaz) Lactoz, TSI Zaharoz, TSI Hidrigen Sulfurat, TSI Descompunerea ureei Decarboxilarea lizinei Evidenierea betagalactozidazei

pozitiv + pozitiv + negativ negativ pozitiv + negativ pozitiv + negativ

Reacia Voges Prostkauer Evidenierea Indolului

negativ negativ -

100 98,9

2) Aceste procentaje indic doar faptul c toate speciile de Salmonella nu dau reacii pozitive sau negative. Acest procentaj poate varia de la o ar la alta i de la un produs la altul 3) Salmonella typhi este anaerogen (nu produce gaze n anaerobioz) 4) Germeni Salmonella din subgenul 3(arizona) dau reacie lactoz pozitiv sau negativ, dar sunt betagalactozidaz pozitiv. Germenii Salmonella din subgenul 2 dau reacie lactoz negativ, dar dau reacia betagalactozidaz pozitiv. Pentru studiul speciilor poate fi util efectuarea unor teste biochimice suplimentare. 5) Salmonella paratyphi A este negativ

Confirmare serologic Cercetarea prezenei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectueaz prin aglutinare pe lam cu seruri adecvate din colonii pure i dup eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lam de sticl curat o pictur de soluie salin, se disperseaz n aceast pictur o fraciune din colonia de testat aa fel nct s se obin o suspensie omogen i tulbure prin micarea lamei timp de 30-60 secunde. Dac bacteriile se adun n grmezi, tulpina este considerat autoaglutinabil i nu mai trebuie supus examinrilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru Evidenierea antigenelor O. Dintr-o colonie pur cunoscut ca neaglutinabil se procedeaz ca mai sus, dar n locul soluiei saline se folosete o pictur de antiser O. Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv. Se utilizeaz serurile poli i monovalente unul dup altul. Evidenierea antigenelor Vi. Se procedeaz ca mai sus utiliznd o pictur de antiser Vi. Dac se produce aglutinarea reacia este pozitiv.

Evidenierea antigenelor H. Se nsmneaz un agar nutritiv semisolid cu o colinie pur neautoaglutinabil, se incubeaz la 35 o 37oC timp de 24 h, se utilizeaz aceast cultur pentru examenul antigenelor H procedmd ca mai sus, dar folosind o pictur antiser H.Dac se produce aglutinarea reacia este considerat pozitiv.

Interpretarea reaciilor biochimice i serologice Tabelul prezint interpretrarea testelor de confirmare pe colonii selecionate. Reacii biochimice tipice Autoaglutinare nu Reacii serologice antigene O, Vi sau H pozitive toate reaciile negative neefectuate tipice lipsa reaciilor tipice da nu antigene O,Vi sau H pozitive toate reaciile negative lipsa reaciilor tipice nu nu sunt considerate ca fiind Salmonella ar putea fi Salmonella Interpretare tulpini considerate ca fiind Salmonella

tipice

nu

Confirmare definitiv Tulpinile considerate ca fiind Salmonella sau c ar putea fi Salmonella (a se vedea tabelul 2) se trimit la un centru agreat pentru identificarea germenilor din genul Salmonella, pentru determinarea definitiv a serotipului. Aceast expediere trebuie nsoit de toate informaiile disponibile referitoare la tulpin (tulpini).

Exprimarea rezultatelor n funcie de rezultatele interpretrii se indic prezena sau absena germenilor din genul Salmonella n x grame de prob de analizat.

Genul Salmonella

Salmonella este genul cel mai mare din familia Enterobacteriaceae, cuprinzand peste 2400 serotipuri. Datorita patogenitatii pe care membrii acestui gen o prezinta pentru om si faptulu ca ei contamineaza frecvent cele mai diverse produse alimentare, genul Salmonella prezinta interes deosebit pentru microbiologia alimentelor, in special a celor de origine animala. Taxonomia genului Salmonella ramane incerta. Totusi, in prezent, pentru scopuri practice se foloseste clasificarea propusa de Popoff si Le Minor care admit existenta a doua specii: S.enterica si S.bongori. S.enterica include 6 subspecii diferentiate pe criterii enzimatice: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae si indica. S.bongori nu are subspecii. S.enterica subspecia enterica este cea mai cuprinzatoare, incluzand 1435 serotipuri din cele 2435 descrise pana in 1997. Ea reprezinta peste 90 % din izolatele de la om si animalele cu sange cald. Celelalte subspecii, ca si S.bongori reprezinta un procent redus si se izoleaza mai ales de la pasari, animale cu sange rece si din mediul inconjurator, de unde pot contamina rareori omul si mamiferele. Ponderea numerica a serotipurilor de Salmonella pe specii i subspecii este redata in tabelul urmtor:

Specia enterica

Subspecia

Numar de serotipuri 485 94 321 69 11 20 2435

bongori TOTAL

Bacteriile din acest gen au forma de bastonase sau cocobacili, de 2-3/0,6 microni, sunt acapsulogene, asporogene, Gram negative, mobile, cu exceptia unui serotip (S.gallinarum (pullorum)) sau a unor mutante imobile. Se dezvolta bine pe mediile nutritive obisnuite cu pH in jur de 7,0, la temperatura de 37C. In bulionul nutritiv produce o turbiditate uniforma destul de evidenta, cu depozit neaderent. Pe suprafata agarului nutritiv formeaza colonii netede, cu diametrul de 2-4 mm la cele mai multe serotipuri sau de 1mm (colonii pitice) la cateva serotipuri (S.abortus equi, S.typhi si S.abortus ovis) , semitransparente, cu un usor reflex albastrui, fcarte puin bombate, nepigmentate. Se dezvolta in medii in a caror compozitie intra diferite substante inhibitoare pentru bacteriile Gram pozitive, pentru bacteriile Gram

negative ce nu apartin familiei Enter -obacteriaceae sau chiar pentru unii membrii ai acestei familii. Aceste substane sunt: bila, sarurile biliare, dezoxicolatul, verdele de briliant. sulfitul de bismut, selenitul, tetrationatul s.a. folosite pentru prepararea mediilor de imbogatire selectiva si de izolare a salmonelelor din alimente sau alte produse, unde se afla in numar mic si in asociatie cu cantitati mult mai mari de alte organisme. Salmonelele fermenteaza glucoza cu producere de gaze - (exceptii S.typhi si S. gallinarum care nu produc gaze) -, maltoza, manitolul si folosesc citratul ca unica sursa de carbon (exceptii: S.paratyphi A si unele tulpini de S.gallinarum). Produc hidrogen sulfurat (exceptii: S.paratyphi A, S.abortus equi, S.abortus ovis, S.cholerae suis si unele tulpini de S.typhi si S.gallinarum). Nu fermenteaza lactoza, nu produc indol, nu efaboreaza ureaza si gelatinaza. Salmonelele sunt microorganisme sensibile la factorii de mediu. Temperaturile mai mari de 60C le distrug in cateva minute. Adaugarea de trehaloza le mareste capacitatea de a se dezvolta la temperaturi inalte, datorita stabilizarii proteinei. Congelarea si decongelarea distrug o parte din celulele unei populatii. Un singur ciclu de congelare-decongelare reduce numarul celulelor vii dintr-o cultura in bulion cu 3-4 logaritmi, cultura sterilizandu-se dupa 4-5 asemenea cicluri. Distrugerea este cu atat mai accentuata cu cat congelarea se face mai lent si la temperaturi nu prea coborate (la - 7-10C distrugerea este mai mare decat la -18 - -20C). Salmonelele nu se multiplic la temperaturi mai mici de +8 - +10C. Sunt relativ rezistente in mediu cu pH moderat acid, dar nu se inmultesc in medii cu pH mai mic de 4,5 - 5,0. Sunt distruse relativ repede in mediul extern sub influenta luminii solare si a uscaciunii. Desinfectantele obisnuite le distrug in scurt timp. Persists timp indelungat pe alimentele depozitate in conditii obisnuite de pastrare. Salmonelele se gasesc in tubul digestiv al omului sj animalelor bolnave trecute prin boala sau complet sanatoase. Starea de purtator de salmonele la om si animale este foarte frecventa, intereseaza cele mai diverse serotipuri i constituie o veriga importanta in lantul epidemiologic al salmonelelor in natura. Bolnavii, ca si purtatorii sanatosi, contamineaza mediul exterior, solul, apa, furajele si alimentele. Salmonelele ii exercita patogenitatea prin ambele mecanisme cunoscute la bacterii: virulenta si toxicitate. Invazia epiteliului intestinal de catre salmonele determina un aflux pronuntat de fagocite in peretele intestinal, ceea ce produce fenomene inflamatorii locale insotite de hipersecretie de mucus i eliberarea de prostaglandine. Se blocheaza astfel retroresorbtia sodiului din lumenul intestinal ceea ce determina acumularea de lichid la acest nivel. Virulenta reprezinta mecanismul major de agresiune a salmonelelor i consta din capacitatea lor de a se ataa, multiplica si invada peretele intestinal. Inflamatia peretelui sj acumularea lichidelui in intestin accelereaza peristaltismul intestinal i aparitia crampelor. instalarea diareei s.i a varsaturilor.

Toxigenitatea salmonelelor este determinata de cele doua tipuri de toxine pe care ea le produc: exotoxine i endotoxine. Exotoxinele sunt reprezentate de enterotoxina si citotoxina. Enterotoxina este o termolabila de 90 - 110 kDa, cu configurate asemanatoare enterotoxinei LT de V.cholerae, dar determinata de alte gene codificante (cromosomale i ice). Ea este constituita din doua subunitati: B cu care se fixeaza gangliozidul G84; din peretele celulei epiteliului intestinal si A care patrunde in celula s.i activeaza ciclaza. In acest mod se blocheaza mecanismele energetice ale celulei gazda, ca rezultat blocarea retroabsorbtiei Na + din lumenul intestinal, acumularea de lichid i diareea. Endotoxinele salmonelice eliberate in urma fagocitarii bacteriei exercita rolul toxic prin lipopolizaharidele componente pe mai multe cai: - activarea complementului ce are ca efect citoliza urmata de coagulari intravasculare si eliberarea de mediatori vaso-paralitici; - declansarea unor efecte citolitice in lant prin eliberarea TNF de catre macrofage si celule epiteliale; - declansarea febrei prin factorii eliberati de macrofage. Datorita efectului toxic al endotoxinelor apar fenomenele clinice care variaza ca de la sindromul febril caracteristic la coagularea intravasculara diseminata, in febra tifoida i in cazurile grave de toxiinfectie alimentara (213). Izolarea salmonelelor din cazurile septicemie este simpla i consta in inocularea in nutritive obinuite (bulion i agar nutritiv inclinat) a unei picaturi de sange (bolnavi) sau fragmente de tesut din organe (splina, ficat) sau de maduva osoasa, recoltate de la cadavre in conditii stricte de asepsie. Dupa 24 ore incubare, culturile dezvoltate se testeaza direct prin cateva examene minimale, din care seroaglutinarea cu seruri specifice este cea mai importanta, reprezentand si mijloc de confirmare. Izolarea salmonelelor din alimente sau diferite materiale patologice contaminate cu microflora de asociatie impune totdeauna faza de imbogajire selectiva i strierea culturii. obtinute pe medii agarizate selective si indicatoare. Aceste operatiuni necesita timp indelungat pana la cunoaterea rezultatelor, pentru scurtarea caruia s-au pus la punct matode rapide. Controlul curent al alimentelor pentru detectarea salmonelelor se face conform metodelor stabilite de standarde, din care mentionam pe cea descrisa in SR/ISO/6579/1995 Preimbogatire: 25g (ml) proba + 225 ml pa peptonata tamponata, incubare 16 - 20 ore la 35 sau 37C; Imbogafire selectiva: a) 0,1 ml cultura obtinuta in faza de preimboga|ire + 10 ml mediu Rappaport Vasiliadis se incubeaza 24 ore la 42C;

b) 10 ml cultura obtinuta in faza de preimbogatire + 100 ml bulion selenit-cistina se incubeaza 24 ore la 35- 37C; Izolare pe medii selective agarizate: a) o ansa de cultura obtinuta in mediul Rappaport Vasiliadis se striaza pe agar cu rosu fenol si verde briliant Edel si Kampelmacher si se incubeaza 24 - 48 ore la 35- 37C; b) o ansa de cultura obtinuta in bulionul selenit-cistina se striaza pe al doilea agar selectiv de izolare (Istrati-Meitert, Leifson s.a.) si se incubeaza 24 - 48 ore la 35- 37C; Identificare-confirmare: 5 colonii caracteristice din fiecare cutie cu agar selectiv se tree pe agar nutritiv inclinat care se incubeaza 18-24 ore la 3537C. Cultura obtinuta se supune testelor biochimice si serologice specifice i se interpreteaza rezultatele obtinute. In ultimul timp s-au pus la punct mai multe tehnici imunoenzimatice si de genetica moleculare, suficient de sensibile pentru detectarea salmonelelor in alimente (73, 236

Metoda se aplic urmtoarelor produse: Lapte crud Lapte praf Produse lactate praf pentru copii Produse lactate acide (iaurt, smntn fermentat, lapte btut, kefir, sana) Iaurt cu fructe

Smntn dulce pentru fric i fric btut Brnzeturi proaspete din lapte praf pasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnzeturi proaspete din lapte praf nepasteurizat (ca, telemea proaspt) Brnz proaspt din zer Brnz maturat n saramur din lapte pasteurizat Brnz maturat n saramur din lapte nepasteurizat Brnz fermentat cu past tare (svaier), semitare (moeciu), moale (Camembert, taga, nasal)