Antes de hablar de tinciones histolgicas debemos conocer cual es el proceso de preparacin de un tejido histolgico Se deben seguir los siguientes

pasos: OBTENCIN DE LA PIEZA - Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar. - Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica.

FIJACIN La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima.

Fijacin de la muestra. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan para tal fin. Cualidades que debe tener un fijador: 1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.). 2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar. 3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo. 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.). 5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella. 6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales. 7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos. Manera de actuar de los fijadores Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro). La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula de hidrgeno con su cromforo). Fijadores qumicos Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitucin. FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos. b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.

c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.). d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%. FIJADORES COMPUESTOS: En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica. b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica. c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica. e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico. FIJADORES FSICOS: 1. Desecacin. 2. Calor seco. 3. Calor hmedo. 4. Fro. 5. Congelacin y desecacin. DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA Deshidratacin Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.

Se dispone una lmina en un cassette de deshidratacin.

Deshidratacin en alcoholes sucesivos. Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin) Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto cerciorndonos que realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe enturbiarlo.

Penetracin de la parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.

Penetracin de la parafina a 56-58C. Inclusin definitiva o formacin del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.

Barras de Leuckart A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos los bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y ya podemos realizar los cortes con el micrtomo.

Factura del taco para cortar.

OBTENCIN DE CORTES

El objeto de la inclusin que hemos descripto anteriormente es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones. Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el de congelacin, y el cristato o critomo. - Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. - Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

Corte en micrtomo tipo Minot.

- Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se comunica.

- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la disposicin horizontal de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia de un sistema antienrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. En los modelos ms modernos es posible optar por el corte manual o motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra a -60 C gracias a la existencia de una placa de congelacin instantnea. Frente al micrtomo convencional de congelacin, el cristato posee la gran ventaja de permitir la obtencin de cortes mucho ms delgados (por lo general de 4 m y, en manos experimentadas, hasta 2 m).

Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos, previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a continuacin se lo levanta.

COLORACIN Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin. Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solucin colorante.

Batera de Coloracin H&E. MONTAJE Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes. La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto. Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.

DIAGRAMA DE TECNICA HISTOLOGICA

A continuacin veremos cuales son los tistintos ripos de tinsiones que existen en la histologa. Tipos de tinciones Existen mltiples mtodos de tincin histolgica, unos generales y otros especficos, que permiten poner de manifiesto tanto la topografa tisular, como tipos celulares concretos, determinados orgnulos o estructuras intracelulares. Las tinciones histolgicas propiamente dichas utilizan colorantes, la mayor parte de ellos derivados de la industria textil, que se eligen en funcin de su capacidad de interaccionar con los diferentes constituyentes de los tejidos. Tcnicas de tincin ms complejas como las histoenzimticas o inmunocitoqumicas se basan en el empleo de sustratos, lectinas, anticuerpos, etc. Que es un colorante? Un colorante es una molcula que tiene la capacidad de absorber radiaciones electromagnticas dentro de la regin del espectro visible es decir entre 400 y 650 nm. Los colorantes que absorben todas las radiaciones entre estos mrgenes, no transmiten ningn tipo de luz y se ven por lo tanto de color negro. Aquellos colorantes que absorben una franja ms estrecha, transmiten un color determinado. Por ejemplo el cido pcrico absorbe predominantemente la luz azul-violeta del final del espectro visible, dando como resultado una luz transmitida de color amarillo. Cundo se habla de un buen mtodo de tincin? Un buen mtodo de tincin es aquel que cuando se reproduce da un alto porcentaje de xito con resultados equiparables. Todos lo mtodos de tincin requieren siempre una adapatacin o modificacin para ser utilizados correctamente. Para reproducir un mtodo de tincin hay que utilizar siempre reactivos, colorantes y agua destilada de calidad y preparar las soluciones colorantes en material de vidrio extremadamente limpio. Conviene tener presente que la tcnica de tincin en s misma no es una tcnica aislada sino que forma parte integral de todo el proceso histolgico. Los protocolos de tincin deben escribirse de forma concisa, anotando de forma muy precisa indicando claramente todos los pasos necesarios para preparar todas las soluciones empleadas, tiempos de actuacin, temperatura, condiciones, etc... Puede la fijacin interaccionar con la tcnica de tincin? Los diferentes fijadores interactan de forma diferente sobre las molculas que componen los tejidos produciendo modificaciones. En un mismo tejido, los colorantes se comportan de forma diferente en funcin del grado de fijacin y de la naturaleza del fijador utilizado. Por ejemplo, se conoce que tanto la formalina como el tetroxido de osmio inducen basofilia en los tejidos, mientras que las soluciones colorantes a base de

dicromato inducen acidofilia. En comparacin con la formalina, el fijador de Carnoy incrementa la avidez del tejido por los colorantes, mientras que el fijador de Zenker disminuye el grado de coloracin. Que es una tincin progresiva y una tincin regresiva? Una tincin progresiva es aquella en las que los cortes histolgicos se sumergen en la solucin colorante durante el tiempo necesario hasta que adquieren el grado de tincin deseada. Cuanto ms tiempo estn los cortes en la solucin colorante, ms fuerte es la tincin. Una tincin regresiva es aquella en la que los cortes se "sobretien" dejndolos en la solucin colorante durante un tiempo excesivo y posteriormente se procede a retirar el exceso de colorante (proceso que se llama "diferenciacin") mediante tratamiento con una solucin cida o alcohlica. En este caso se ajusta el tiempo de diferenciacin. Qu diferencia hay entre una tincin fsica y una tincin qumica? En una tincin fsica, el colorante se disuelve en el sustrato. Por ejemplo el Sudn III se disuelve en las grasas, y es empleado para demostrar gotas lipdicas. En una tincin qumica, el colorante interacciona qumicamente con el sustrato a travs de fuerzas de van der Waals, puentes de hidrgeno, enlaces covalentes o enlaces electrostticos. Qu es una tincin directa y una indirecta? En una tincin directa el colorante interacciona directamente con el sustrato. En una tincin indirecta se hace interaccionar en primer lugar a una sustancia qumica denominada "mordiente" con el sustrato la cual permite la posterior interaccin del colorante. Usualmente los mordientes son sales, hidrxidos o alumbres de metales bivalentes o trivalentes. Qu es una tincin tricroma? Las tinciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante, o mltiples cuando se usan dos o ms colorantes. En una tincin tricroma se emplean tres colorantes, cada uno de ellos con unas particularidades, de tal manera que se consigue teir con colores diferentes, estructuras diferentes, permitiendo as su rpida identificacin en el microscopio. Qu es una tincin supra vital? Es aquella que se realiza sobre clulas frescas, recin obtenidas, con objeto de realizar una observacin de las estructuras teidas con las clulas vivas. Por ejemplo, se puede teir las mitocondrias de clulas vivas con el colorante Verde Jano y observarlas con el microscopio mientras las clulas permanecen vivas.

Qu es una tincin vital? Es aquel procedimiento por el cual un colorante no-txico, como el Carmn de litio o el Azul Tripn, se inyecta en un organismo vivo para estudiar procesos vitales de clulas capaces de acumularlo por pinocitosis o fagocitosis. En qu consiste una tincin negativa? Esta forma de tincin se basa en que el colorante no-tie la estructura que se desea estudiar, de tal forma que la morfologa externa o los contornos de esa estructura quedan delimitados por el propio colorante que se encuentra a su alrededor. Qu es una tincin de cortes "en flotacin"? Usualmente los cortes histolgicos se montan sobre portaobjetos antes de ser teidos lo cual facilita su manipulacin. Sin embargo en ocasiones, sobre todo cuando se utilizan cortes gruesos de 30-50 micras, obtenidos con un criostato o con un vibratomo, conviene realizar determinado tipo de tinciones "en flotacin". Para ello los cortes de tejido se mantienen sumergidos (en flotacin) en el interior de la solucin colorante lo cual permite la accesibilidad del colorante por ambas superficies. Este tipo de tcnica es poco comn cuando se utilizan colorantes pero es habitual cuando se realizan tcnicas de tincin histoenzimticas o inmunocitoqumicas. Qu es una tincin en placa? Es aquella que se realiza utilizando placas de cultivo celulares. Es decir, la tincin se realiza sobre clulas que se han mantenido vivas en condiciones in vitro. En qu consiste una tincin "en bloque"? En ocasiones, en algunos tipos de impregnaciones metlicas, tcnicas de Golgi, etc... Conviene realizar la tincin no sobre cortes histolgicos sino sobre la pieza o bloque de tejido. Para ello el bloque de tejido se sumerge en la solucin colorante durante un tiempo determinado. Los resultados finales no se pueden valorar, sin embargo, hasta que no se han confeccionado los cortes y se realiza la observacin microscpica. Qu es una tincin para microscopa electrnica? Para la observacin de los cortes ultra finos con el microscopio electrnico de transmisin, es preciso "contrastar" los cortes con objeto de incrementar las diferencias de densidad electrnica de las diferentes partes de la muestra. Para ello se recurre al empleo de sales de metales pesados como uranio, wolframio o plomo.

Qu es una tincin histoenzimtica? El objetivo de una tincin histoenzimtica es detectar la presencia de un enzima. Para ello se recurre a una serie de reacciones qumicas que demuestran la presencia del producto de la activida de enzimtica. Qu es una tincin inmunocitoqumica? Las tinciones inmunocitoqumicas o inmunohistoqumica pretenden detectar la presencia de una molcula con caractersticas antignicas. Para ello se recurre al empleo de anticuerpos que interaccionan directamente con los antgenos. Estos anticuerpos pueden estar marcados con una sustancia fluorescente y en este caso se trata de una tincin de inmunofluorescencia.

TECNICAS DE TINCIONES HISTOLOGICAS

Hematoxilina-eosina La hematoxilina es un colorante catinico mientras que la eosina es un colorante aninico perteneciente a los xantenos. Se teirn los ncleos de azul, citoplasmas en rosa, msculo en tonos rojizos a rosados fucsia, glbulos rojos en naranja o rojo y la fibrina en rosa intenso. 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min.

5- Lavar en H2O-2min.

6-Eosina alcohlica-1min.

3- Lavar en H2O destilada.

7-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 8- Montaje.

4- Hematoxilina-5min.

Giemsa La tcnica radica en la disociacin controlada de las sales de eosinato que ocurre al insolubilizar la mezcla del giemsa por disolucin en H2O destilada; la eosina as liberada colorea el componente extracelular y determinadas extructuras acidfilas; y los derivados de azur, las estructuras de carcter basfilo. La cromatina nuclear adopta una tincin azul violeta. 1- Desparafinar. Estufa durante 30 min. a 60C Sumergimos en xilol durnate 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96 -5min. Alcohol 70 -5min. 3- Lavar en H2O destilada. 4- Solucin Giemsa al 20 %- 45 min. 5 -Lavar con agua corriente 5 - 10min. 6-Alcohol 70 - 2-3 pases rpidos

7- Alcohol de 96- 2-3 pases rpidos.

8- Alcohol isoproplico -3 min.

9 - Alcohol isoproplico -3 min. 10- Xilol. 11- Montar.

Gram Permite la observacin de bacterias, pero no su identificacin especfica. Permite observar su morfologa, e incluso si una vez teidos son gram + gram - cido alcohol resistentes. Tie los organismos Gram+ de azul negruzco, Gram- de rojo y el fondo rosa. SOLUCIONES:
1.- Solucin Cristal Violeta: -Cristal violeta-------------------------------------------2 gr. - Alcohol96 -------------------------------------------20 ml - Agua destilada --------------------------------------78 ml 2.- Solucin Lugol: - Yodo ----------------------------------------------1.5 gr. - Yodato potsico ---------------------------------3 gr. - Agua destilada --------------------------------450 ml 4.- Solucin Fucsina bsica al 0.5 % : - Fucsina bsica---------------------------------------3.- Solucin de Eter Acetona : 0.5 gr. - Etil-ter ( concentrado ) ------------------------------125 ml - Alcohol95 ---------------------------------------------5 - Acetona--------------------------------------------------375 ml. ml - Agua destilada ---------------------------------------95 ml 5.- Solucin de cido pcrico acetona : 6.- Solucin Acetona xilol: -cido pcrico------------------------------------------------0.1 -Acetona --------------------------------------------50 ml gr. - Xilol -------------------------------------------------50 ml - Acetona---------------------------------------------------100 ml

TCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar. 8.- Lavar en agua corriente 9.- Sumergir en acetona para que empiece la diferenciacin, y continuarla 2.- Solucin cristal violeta ( filtrado ) - 2 con la solucin de acetona-cido min. pcrico, hasta que los cortes estn amarillo-rosado. 3.- Lavar rpidamente con agua 10.- Lavar rpidamente en acetona. corriente. 4.- Solucin Lugol -1 min. 11.- Lavar en solucin acetona-xilol. 5.- Lavar en agua corriente. 12.- Aclara con xilol 6.- Decolorar con solucin ter-acetona, gota a gota, hasta que no suelte ms 13.- Montar. color. 7.- Solucin Fucsina bsica ( filtrada ) - 3 min.

Tricromico de Masson Es una tcnica para la coloracin de fibras colgenas y elsticas. Se observan tres colores distintos; tejido conjuntivo de verde, tejido muscular de verde pardo, eritrocitos de rojizo, ncleos azul negro y citoplasma y fibras musculares rosa. 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada. 4- Hematoxilina de Weigert 5 min. 5- Lavar con agua corriente 10 min. 6- Fucsina de Ponceau 5 min.

7- cido fosfomolbdico 5 min.

8- cido fosfomolbdico 5 min. 9- Verde luz 5-7 min. 10-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Xilol. 11- Montaje.

Tincin para reticulina 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada. 5- Lavar con agua destilada 1-2 pases 7- Lavar con agua destilada 1-2 pases 8 - Alumbre frrico al 2% - 2 min.

11- Lavar con agua destilada 1-2 pases.

12- Formol al 10 % -5 min. 13- Lavar con agua destilada 1-2 pases. 15 Lavar con agua destilada 1-2 pases. 17- Tiosulfato sdico al 2%-- 1 min. 18- Lavar con agua corriente 5 min.

4- Permanganato potsico al 1% -1 min. 14- Cloruro de oro al 0.2%-2 min. 6- Metabisulfito potsico al 2% - 1 min. 16 Metabisulfito potsico al 2%-2 min.

19-Deshidratar. Alcohol de 70 9- Lavar con agua destilada -1-2 pases. Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 10- Reactivo de Wilder - 2 min. 20- Montaje. RESULTADOS: Reticulina: negro. Ncleos: grisceo. Colgena: prpura grisceo.

PAS Se usa como tcnica de rutina para observar las membranas basales que separan el tejido epitelial del corin. Tie los ncleos de color azul, el glucgeno de color prpura y el material PAS + (polisacridos simples, mucopolisacridos neutros, mucoprotenas, glucoprotenas y glucolpidos) rojo rosa. SOLUCIONES: 1 .- cido peridico al 0.5 % 3.- cido sulfuroso : 2.- Hematoxilina de Mayer 4.- Reactivo de Shiff

- Metabisulfito sdico al 10 % ------------------ - Fucsina bsica ----------------------------------6 ml. 1 gr. - cido hidroclrico 1N al 10 % ---------------- - Metabisulfito sdico anhidro -----------------5 ml 1 gr. - Agua destilada -------------------------------- - Agua destilada ----------------------------------100 ml 200 ml - cido hidroclrico 1 N ------------------------20 ml Hervir el agua destilada, aadir la fucsina bsica, agitar y enfriar a 50C. Filtrar y aadir cido hidroclrico, enfriar a 25C Aadir metabisulfito sdico. sta solucin est lista para usarse cuando se torna casi incolora, lo cual puede llevar hasta 2 das, en un lugar oscuro. TCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar. 2.- cido peridico al 5 % --------------5 min. 3.- Lavar en agua corriente--------------5 min. 7.- Hematoxilina de Mayer ------------ 10 min. 8.- Lavar con agua corriente -----------5 min. 9.- Deshidratar.

4.- Reactivo de Shiff --------------------- 15 min.

10.- Aclarar con xilol.

5.- Bisulfito sdico al 2 % ------------------5 11.- Montar. min. 6.- Lavar en agua corriente --------------5 min.

Elstica de Van Gieson

Es una tcnica para la coloracin de fibras colgenas y elsticas. El colgeno parece que capta un colorante cido. Tie el colgeno de rojo, ncleos y fibras elsticas de negro y citoplasma de amarillo.

1.- Hematoxilina de Verhoeff: - Hematoxilina alcohlica:

SOLUCIONES: 2.- Solucin de Picrofucsina: - Fucsina cida al 1 % ---------------------------1.3 ml

Hematoxilina ------------------------------------10 gr. - cido pcrico a saturacin ---------------------9.7 ml Alcohol96 -------------------------------------100 ml -Cloruro frrico al 10 %: Cloruro frrico ----------------------------------10 gr. Agua destilada ---------------------------------100 ml - Yoduro potsico al 10 %: Yoduro potsico --------------------------------10 gr. Agua destilada ---------------------------------100 ml - Alcohol 50 TCNICA: 1.- Desparafinar e hidratar 2.- Hematoxilina de Verhoeff ---------30 min. 3.- Lavar ----------------------------------1 pase 4.- Cloruro frrico al 1 % ---------------1 pase 6.- Picrofucsina -------------------1 pase 7.- Deshidratar 8.- Aclara con xilol 9.- Montar

5.- Lavado en agua corriente ---------1 pase

Azul Alcian SOLUCIN: Azul alcian---------- 1 gr. Acido actico------- 3 c.c Agua destilada----- 97 c.c TCNICA 1-. Desparafinar. Estufa durante 30 min. a 60C Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 5- Lavar con agua corriente 10 min.

6 - Azul alcian al 2% - 10 min. 7-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 8- Montaje.

3- Lavar en H2O destilada.

4-. Hematoxilina de Harris 10 min.

Grocott Para la tincin de hongos (candida, aspergillus). 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada 4- Solucin de cido crmico al 4% - 1 hora 5- Lavar en agua corriente 5 min. 6 Bisulfito sdico al 1% - 1 min.

10- Lavar con agua destilada 6 pases.

11- Cloruro de oro al 0.2 % - 2-5 min. 12 Lavar con agua destilada 5 min. 13- Tiosulfato sdico al 2% - 2-5 min. 14- Lavar con agua corriente 15- Solucin verde luz al 1% - 30-40 seg. 16-Deshidratar. Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 17- Montaje.

7- Lavar agua corriente 5 min. 8- Lavar con agua destilada 3-4 pases 9- Solucin argntica de trabajo: En estufa 60--------------------------------- 1 hora En microondas (descongelacin) -------- 1-2 min.

Hierro coloidal 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada. 4- Solucin actica 3 min.

7- Mezcla ferrocianuro-clorhdrico 20 min.

8- Lavar con agua corriente -5 min. 9- Lavar en agua destilada 3-4 pases. 10- Si se desea se puede contrastar con: Van Gieson 10 min. Rojo neutro 10 min.

11-Deshidratar. Alcohol de 70 5 - Solucin de trabajo de Hierro coloidal 1 Alcohol de 96. hora. Alcohol absoluto. Xilol. 6- Solucin actica 4 lavados ( 3 min./lavado ) 12- Montaje.

Mucicarmin de Mayer Las mucinas o mucoprotenas son protenas con H.C. en una proporcin superior al 4 %. La tcnica del mucicarmn de Mayer sirve para identificar globalmente las mucinas, pero no reconoce su naturaleza bioqumica. 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 6 - Solucin diluida de mucicarmn ( 1:4 ) 30 min.

7 - Lavar con agua corriente 10 min.

3- Lavar en H2O destilada.

8-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol.

4- Teir con Hematoxilina de Weigert 10 9- Montaje. min. 5 - Lavar con agua corriente 3 min.

Hemalumbre de Mayer 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min.

5-Lavar con agua corriente 5 min.

6 Contracolorear ( si se quiere ) con hematoxilina-eosina u otro colorante.

3- Lavar en H2O destilada.

7-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol.

4- Colorear con hemalumbre de Mayer de 8- Montaje. 5 -10 min.

Orceina ORCEINA (fibras elsticas, virus, hepatitis, cobre) 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada 4- Permanganato potsico ----10 min. 5 - cido oxlico al 2 % - 1 pase 6- Lavar en agua corriente

7- Solucin de Orcena --1:30 h. en estufa.

8 - Lavar en agua corriente y dejar secar.

9 - Alcohol clorhdrico al 1% ---- 1 pase 10- Deshidratar a partir de alcohol absoluto. 11- Xilol 12- Montar

Perls 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada.

6 - Hematoxilina de Mayer -10 min.

7- Lavar en agua corriente hasta que vire. 8- Eosina 1 pase. 9-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 10- Montaje.

4 - Reactivo de perls 30 min.

5 - Lavar con agua corriente 5 min.

RESULTADOS: Hierro: azul.

Rojo congo 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada.

7- Lavar en agua corriente - 5 min.

8- Yoduro potsico --3-4 min.

9- Lavar con agua corriente.

10-Deshidratar. Alcohol de 70 4- Hematoxilina de Carazzi o de Weigert 10 Alcohol de 96. min. Alcohol absoluto. Xilol. 5- Lavar en agua corriente - 10 min. 11- Montaje. 6- Solucin Rojo Congo - 10 min. (en el momento del uso se cogen 8 ml de rojo congo y se mezclan con 2 ml de glicerina. Filtrar)

Plata metenamina o Hexamina 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada. 4- cido per ydico al 0.5 % - 15 min. 5- Solucin de Ag-Metenamina: . En estufa - 60 min. (controlar la tincin hasta que alcance un color tabaco y comprobar al microscopio que se han teido los glomrulos) .En microondas - 1-2 min. (descongelacin) 14-Deshidratar. Alcohol de 70 Alcohol de 96. Alcohol absoluto. Xilol. 15- Montaje. 9- Tiosulfato sdico o hiposulfito sdico 5 min.

10- Lavar en agua destilada. 11- Hematoxilina de Mayer 10 min. 12- Lavar en agua corriente

13- Eosina - 3 min.

6-Lavar en agua corriente

7- Cloruro de oro al 0.2 % -- 2 min. 8- Lavar en agua destilada.

Sudan III 1-Desparafinado. Estufa durante 30 min. a 60. Sumergimos en xilol durante 10 o 15 min. 2- Hidratacin. Alcohol absoluto-5min. Alcohol 96-5min. Alcohol 70-5min. 3- Lavar en H2O destilada.

5- Lavar con agua corriente.

6- Hematoxilina o carmn (para el contraste)--5-10 min. 7- Lavar en agua corriente 5 min.

4 Sudan III + 40 gotas de rojo escarlata - 8- Montaje en glicerina levulosa, 24 horas. gelatina, etc. RESULTADO: Las grasas neutras se tien.

Violeta de Cresilo 1- Desparafinado. Estufa durante 30 min.a 60. Sumergimos en xilol durante 10-15 min.

4- Violeta de cresilo 0.1% entre 20-30 min.

2-Deshidratacin. Alcohol absoluto durante 5 min. Alcohol 96 5 min. Alcohol 70 5 min. 3- Lavar en H2O destilada.

5- Lavar en agua corriente.

6- Montar en medio acuoso.

Tincin de Semifinos

Contraste de Ultrafinos

Verde de Metilo - Pironina

Se trata de una solucin de Verde de Metilo asociada con Pironina G segn TarfKurnick. Colorante Histolgico. Empleado para la investigacin histolgica del cido nucleico contenido en los tejidos, as como para demostrar la presencia de clulas de la serie linftica y clulas plasmticas. Tambin es til en la identificacin de clulas plasmticas y RNA en secciones de tejidos y preparaciones citolgicas.

Mucicarmin

Mucicarmn Concentrada Biopur Actica de Tartrazina Biopur Colorante Histolgico. Usado en la identificacin de sitios de tumores primarios, ayudando a la distincin de clulas escamosas indiferenciadas mucina-negativas de los adenocarcinomas mucina-positivos. RESULTADOS La cpsula de los criptococos (hongos) se tie de rosa oscuro. La tartrazina tie el citoplasma de amarillo.

Ziehl

Fucsina Bsica

Decolorante Azul de Metileno Mtodo tradicional para la deteccin del bacilo tuberculoso. Para empleo con esputo, concentrado o por extensin directa, lquido cefalorraqudeo u otros fluidos corporales, incluyendo orina cateterizada y material homogeneizado de tejidos.

Shorr Coloracion del Papanicolaou

Coloracin de Papanicolaou

Se trata de una tcnica citolgica compuesta por 3 soluciones: Hematoxilina Biopur Colorante nuclear. Las caractersticas y recomendaciones para el uso de Hematoxilina Biopur fueron expuestas en la seccin anterior. Rogamos referirse a la misma para informacin adicional.

OG Biopur Se trata de una solucin alcohlica de cido fosfotngstico y Orange G. El cido fosfotngstico acidifica la solucin y aumenta la unin del Orange G a zonas citoplasmticas densas.

EA Biopur Se trata de una solucin alcohlica, fotoestable que elimina los problemas causados por las tradicionales e inestables frmulas numeradas EA-36/50/65/etc. No requiere filtracin. Listo para usar. Tie selectivamente el citoplasma de clulas que tuvieron actividad metablica poco antes de la recoleccin de la muestra. Tie de rosa a rojo las clulas escamosas superficiales, cilios, nucleolo y eritrocitos.

Feulgen

Tcnica utilizada en histologa para teir selectivamente el DNA de las clulas. Esta tcnica consiste en la hidrolizacin del DNA mediante una dilucin dbil de cido clorhdrico que libera las bases pricas, quedando libres los radicales aldehdos de las pentosas, y en la coloracin con leucofuscina, que pone de manifiesto los grupos aldehdo.

Tincion Fluorescente

PARA LA TINCIN FLUORESCENTE Solucin de Auramina Solucin 1 Manipular la auramina con guantes, debe evitarse todo contacto porque es cancergena - Auramina 0,1 g - Etanol 95% 10 ml Disolver la auramina en el etanol Solucin 2 - Cristales de fenol 3 g - Agua destilada 87 ml Disolver los cristales de fenol en el agua. Mezclar las soluciones 1 y 2. Guardar el colorante as preparado en una botella color mbar bien tapada, alejada del calor y de la luz. Rotular con el nombre Solucin de Auramina-O y las fechas de preparacin y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no ms de 3 meses. No filtrar con papel. Puede detectarser alguna turbidez que no afecta la coloracin. Solucin decolorante - cido clorhdrico 0,5 ml - Etanol 70% c.s.p. 100 ml Agregar siempre el cido al alcohol, suavemente, y no al revs porque la temperatura de la solucin aumenta explosivamente. Rotular la botella con el nombre del reactivo y con las fechas de preparacin y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente. Colorantes de contraste Pueden usarse solucin de permanganato de potasio o solucin de naranja de acridina. Solucin de Permanganato de potasio Permanganato de potasio 0,5 g Agua destilada 100 ml Disolver y guardar en una botella color mbar bien tapada. Rotular con el nombre y las fechas de preparacin y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no ms de 3 meses.

Solucin de naranja de acridina Fosfato dibsico de sodio anhidro 0,01 g Agua destilada 100 ml Naranja de acridina 0,01 g Disolver el fosfato de sodio en agua destilada. Agregar el naranja de acridina y disolver. Guardar el colorante as preparado en una botella color mbar bien tapada alejada del calor y de la luz. Rotular con el nombre y las fechas de preparacin y vencimiento. Almacenar a temperatura ambiente no ms de 3 meses.

REFERENCIAS

Horobin RW, Kiernan JA (2002) Conn's Biological Stains. A Handbook of Dyes Stains and Fluorochromes for Use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford: BIOS. ISBN 185996-099-5 http://elprofedebiolo.blogspot.mx/2010/01/tecnicas-de-tincion.html http://es.scribd.com/doc/15606061/Tarea-4-tincion http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n http://html.rincondelvago.com/histoquimica.html http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/5-histoquimica.php http://www.bu.edu/histology/m/append02.htm http://www.uam.es/departamentos/medicina/patologia/Tecnicas.htm http://www.uv.es/histomed/practicas/04-adip/04-adip.htm Penney DP, Powers JM, Frank M, Churukian C (2002) analysis and testing of Biological Stains - the Biological Stain Commission Procedures. Biotechnic & Histochemistry 77: 237-275.