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Universit degli Studi di Roma Tor Vergata

DOTTORATO DI RICERCA IN BIOTECNOLOGIE MEDICHE E MEDICINA DI LABORATORIO XII CICLO

SILENZIAMENTO VS INIBIZIONE FARMACOLOGICA DELLA POLI (ADP-RIBOSIO) POLIMERASI (PARP-1): DIFFERENTI EFFETTI SULLA CHEMIO-SENSIBILIT TUMORALE, IN VIVO ED IN VITRO

Docente Guida/Tutor: Prof.ssa: GRAZIA GRAZIANI Coordinatore: Prof.: GIORGIO FEDERICI

A.A. 2009/2010

PARP-1 e PARP-2

RUOLO DI PARP NEL RIPARO DEL DNA

Temozolomide and methylation of DNA


TEMOZOLOMIDE DNA Damage

70% N7-Methylguanine

5% O6-Methylguanine O6-methylguanineDNA Methyltransferase (MGMT)


S-CH3 SH

9% N3-Methyladenine Base Excision Repair (BER)

DNA Repair

OBIETTIVI DELLO STUDIO (I)

1. Confrontare l'influenza del silenziamento dellespressione di PARP-1, con quella dell'inibizione farmacologica dell'attivit PARP usando inibitori di PARP-1 e PARP-2, sulla chemio-sensibilit delle cellule tumorali ad agenti metilanti ad ampio spettro come la Temozolomide (TMZ), e ad agenti metilanti selettivi per la N3adenina.

2. Studiare le modificazioni del ciclo cellulare e i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta delle cellule tumorali silenziate per PARP-1 e -2 ai trattamenti con gli agenti metilanti singoli o in combinazione con gli inibitori di PARP.

CARATTERIZZAZIONE DEI CLONI DI MELANOMA

CHEMIO-SENSIBILIT, IN VITRO, DEI CLONI DI MELANOMA SILENZIATI PER PARP-1

Clone Clone 1 Babe 3 Babe 6 SiP G SiP N

TMZ IC50 (M) 1175 13416 1208 725 703

SiP O

656

MODIFICAZIONI DEL CICLO CELLULARE CON TMZ


24 h

100% 80% 60% 40% 20% 0% 100% 80% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

48 h

100% 80% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

72 h

100% 80% 60% 40% 20% 0%

0.5

2.5 0.5

2.5

0.5 1

2.5 0.5

2.5

mM

G+T

G+T

Babe

B16

SiP-1

P-p53 e P-Chk-1

P-Chk-1 P-p53 Tubulina

B16
1

Babe

SiP-1
1 0,8

P-Chk-1/ tubulina

0,8

Pp53/ tubulina
T Babe G+T T SiP-1 G+T

0,6 0,4 0,2 0

0,6 0,4 0,2 0

T Babe

G+T

T SiP-1

G+T

UCN-01
Babe
G2/M: 6% G2/M: 20% G2/M: 8% G2/M: 60%

T
G2/M: 10%

G
G2/M: 5%

G+T
G2/M: 30%

Numero di cellule

G2/M: 2%

U+T

U+G

U+G+T

Sip-1
G2/M: 6% G2/M: 45%
G2/M: 10% G2/M: 65%

C
G2/M: 5%

T
G2/M: 20%

G
G2/M: 6%

G+T
G2/M: 33%

U+T

U+G

U+G+T

Contenuto di DNA

MODIFICAZIONI DEL CICLO CELLULARE CON Me-Lex


24h
100% 80% 60% 40% 20% 0%
100% 80% 60% 40% 20% 0%

48h
100% 80% 60% 40% 20% 0%
100% 80% 60% 40% 20% 0%

G+L

G+L

Babe B16

SiP-1

P-p53 e P-Chk-1

P-Chk-1p P-53p Tubulina


B16
2

Babe

SiP-1
2 1,6 1,2 0,8 0,4 0

PChk1/ tubulina

1,2 0,8 0,4 0

L Babe

G+L

L SiP-1

G+L

Pp53/ tubulina

1,6

L Babe

G+L

L SiP-1

G+L

PARP-2 ED INIBITORI
24h
100% 80% 60% 40% 20% 0%

B16
100% 80% 60% 40%

48h

PARP-2

20% 0%
100% 80% 60% 40% 20% 0%

Tubulina

72h

U U+T G G+T

OBIETTIVO (II)

METILANTE

BER

Pol b

Lig III

PARP-1
INFIAMMAZIONE ANGIOGENESI

CRESCITA TUMORALE

Stabilire il ruolo di PARP-1 nell'aggressivit e chemio-resistenza in vivo del melanoma utilizzando i cloni stabilmente silenziati per l'espressione di PARP-1.

CRESCITA DEL MELANOMA IN UN MODELLO ORTOTOPICO

3500

Volume tumorale (mm3)

3000 2500 2000 1500 1000 500 0


C T Babe G+T C T SiP-1 G+T

Linea cellulare

Trattamento

Inibizione della crescita tumorale vs CTR (%)

Inibizione della crescita tumorale vs TMZ (%)

Regressioni

Babe Babe SiP-1 SiP-1

TMZ TMZ + GPI 15427 TMZ TMZ + GPI 15427

25 58 72 82

44 34

0/6 0/6 1/6 6/6

RUOLO DI PARP-1 NELLA CRESCITA TUMORALE E CHEMIO-SENSIBILIT IN UN MODELLO INTRACRANICO


Babe TMZ SiP-1 TMZ

Babe

SiP-1

ISTOLOGIA DEL TESSUTO MUSCOLARE E DEL ISTOLOGIA DELK

TESSUTO CEREBRALE

IMMUNOISTOCHIMICA CON ANTICORPI ANTI POLIMERI DI ADP-RIBOSIO

PECAM/CD31

TNF- - GITR

CONCLUSIONI E PROSPETTIVE
Questi risultati forniscono nuove evidenze di un coinvolgimento diretto di PARP-1 nell'aggressivit dei tumori a cui contribuisce, almeno in parte, la modulazione del processo angiogenico.

I risultati confermano, inoltre, il ruolo di PARP-1 nel riparo dei danni al DNA indotti dai metilanti e nella chemio-resistenza. Infine, l'ulteriore potenziamento della chemio-sensibilit da parte degli inibitori di PARP osservato nelle cellule silenziate per PARP1, dimostra il coinvolgimento di PARP-2 nel riparo degli addotti metilici.

Questi dati suggeriscono l'utilit di inibire sia PARP-1 che PARP-2 per aumentare l'efficacia della chemioterapia e per ridurre la progressione tumorale attraverso un meccanismo anti-angiogenico

RINGRAZIAMENTI

Prof.ssa GRAZIA GRAZIANI Prof. LUCIO TENTORI Dott.ssa ALESSIA MUZI

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