In : Acorbat. Memorias XV reunin. Realizada en Cartagena de Indias, Colombia. 27 de octubre al 02 noviembre 2002.

Medelln (COL) : Asociacin de Bananeros de Colombia AUGURA, 2002

Propagacin clonal de bananos en Biorreactores de Inmersin T emporal

Clonal propagation of bananas by biorreactors of temporary inmersion

D. Castro*, J. Daz y N. Montoya*

RESUMEN
Desde hace tres dcadas, se emplean las tcnicas in vitro para el saneamiento y propagacin clonal de musaceas. Sin embargo, la expansin de las tcnicas de micropropagacin depende de la adaptacin de nuevas metodologas, que permitan automatizar parte de los procesos y se mejore la calidad de las plantas. En la unidad de Biotecnologa Vegetal de la Universidad Catlica de Oriente se ha desarrollado una metodologa para la propagacin in vitro en biorreactores de inmersin temporal (BIT) para la multiplicacin de los clones Williams y Giant Cavendish. Esta tcnica se efecta en dos etapas: a) Proliferacin durante un perodo de ocho semanas; b) Elongacin y enraizamiento durante cuatro semanas. Con la aplicacin de esta nueva tecnologa se logran coeficientes de multiplicacin de 9.4, lo cual permite obtener ms de 400 brotes competentes en recipientes de 5L de capacidad. Con el objeto de optimizar la tecnologa se evalu el efecto del nmero de explantes, volumen de medio de cultivo sobre algunas variables como coeficiente de multiplicacin, nmero total de brotes, calidad de los brotes respecto a tamao y porcentaje de prendimiento en la fase de aclimatizacin.

ABSTRACT
For three decades, the in vitro techniques for the cleaning and clonal propagation of musaceas have been being used. Nevertheless, the expansion of the micropropagation techniques depends on the adaptation of new methodologies, that allow automating part of the processes and improves the quality of the plants. In the Unidad de Biotecnologa de la Universidad Catlica de Oriente a methodology for the in vitro propagation of clones like Williams and Giant Cavendish in biorreactors of temporary immersion (BTIs) has been developed. This technique takes place in two stages: a) Proliferation during a period of eight weeks; b) Elongation and rooting during four weeks. With the application of this new technology coefficients of multiplication of 9,4 are obtained, which allows obtaining more than 400 competent shoots in containers of 5L of capacity. With the intention of optimizing the technology the effect of the number of explantes and the volume of culture media were evaluated on some variables like multiplication coefficient, total number of shoots, quality of the shoots and survival percentage in the phase of acclimatization.

Las tcnicas comerciales de micropropagacin de bananos y pltanos hacen parte de la modernizacin de la agricultura en muchos pases y han contribuido a mejorar las condiciones sanitarias de las plantaciones e incrementar su productividad. Los primeros trabajos sobre la regeneracin de plantas de banano mediante las tcnicas de organognesis se informaron en 1972 (Ma y Shii, 1972); a partir de estos se han cultivado gran nmero de variedades y clones in vitro del genero Musa sp (George, 1996).
*

INTRODUCCIN

La aplicacin a escala comercial de estas tcnicas se ha visto limitada por factores tales como las bajas tasas de multiplicacin, calidad de los explantes y altos costos ocasionados por el uso intensivo de mano de obra en las etapas de multiplicacin y enraizamiento (Hahn y Lee, 1996). La automatizacin de una o ms etapas en los procesos de micropropagacin es una opcin para la reduccin de costos de manipulacin, reduccin del espacio e incrementar volmenes de produccin. La utilizacin de medios de cultivo lquidos es una condicin para lograr desarrollar esta alternativa (Aitken-Christie et al., 1995; Kurata, 1995).

Universidad Catlica de Oriente, Unidad de Biotecnologa. Apartado areo 008, Rionegro (Antioquia). Colombia. Tel: (94) 5316666; Fax: (94) 5313972. E-mail: dcastro@uco.edu.co

44

S E S I N O R A L F I TO M E J O R A M I E N TO Y B I OT E C N O L O G A

Teisson et al. (1996) desarrollaron un equipo sencillo de inmersin temporal, cuyo nombre comercial es RITA (rcipient immersion temporaire automatis), el cual ha sido empleado para el cultivo de microesquejes y embriognesis somtica en varias especies de inters hortcola, con altas tasas de multiplicacin, lo cual ha permitido disminuir los costos de produccin y reducir riesgos de contaminaciones. El objetivo de la presente investigacin fue evaluar algunos factores crticos del proceso de propagacin, en biorreactores de inmersin temporal, tales como son el tipo de explantes, nmero de explantes y volumen de medio de cultivo que tiendan a optimizar la produccin y calidad de los brotes los bananos williams y Giant cavendish.

les efectu un corte longitudinal y un grupo de brotes con tres yemas sin corte longitudinal. Las variables a evaluar correspondieron a: coeficiente de multiplicacin, nmero total de brotes y tamao. Se emple un diseo completamente al azar con tres repeticiones, cada una con 15 unidades experimentales.

Influencia del nmero de explantes y volumen de medio sobre la tasa de multiplicacin y calidad de los brotes
Se emple un experimento bifactorial en diseo completamente al azar con tres repeticiones, donde se evaluaron los factores correspondientes a nmero de brotes: 5, 10 y 15 grupos de explantes cada uno compuesto por 3 brotes axilares; y el volumen del medio de cultivo: 250, 500 y 750 mL. La frecuencia de inmersin fue cada 6 horas con una duracin de tres minutos cada una. El medio de cultivo utilizado para la fase de proliferacin consisti en las sales minerales de MS (Murashige y Skoog, 1962). Los constituyentes orgnicos incluyeron las vitaminas MS, sacarosa (30 gL -1) y benciladenina (BA, 5.0 mgL-1). Para la fase de elongacin y enraizamiento se emple el mismo medio de cultivo, excepto que la BA se sustituy por el cido indol butrico (AIB). En todos los casos el medio de cultivo se esteriliz por autoclave (25 min., 121C), el pH se ajust previamente a 5,8 1 con NaOH. Los cultivos se incubaron a 24 1C con un fotoperiodo de 12 horas luz: 12 horas oscuridad. Como fuente de luz se emple bombillos de luz fluorescente (75 molm-2s-1). Se evaluaron las variables correspondientes a: coeficiente de multiplicacin y tamao de las plantas Para la aclimatizacin se utiliz un sistema de cmaras hmedas donde se mantuvieron las plntulas durante cuatro semanas. Las condiciones ambientales fueron 28C, 90% de humedad relativa y un FFF de 90 mmol m-2s-1; transcurrido este tiempo se destaparon paulatinamente y se dejaron completamente descubiertas bajo las mismas condiciones de aclimatizacin descritas anteriormente. A los treinta das despus de sembradas las plntulas se les evalu el porcentaje de supervivencia. Las variables analizadas se sometieron a la prueba de normalidad y chequeo de la varianza mediante las pruebas de Cochran y Bartlet (Montgomery, 1991). La informacin obtenida se 45

MATERIALES Y MTODOS Descripcin del sistema de inmersin temporal

Se utilizaron explantes procedentes de micropropagacin convencional de los clones Williams y Giant Cavendish. El sistema de inmersin temporal empleado fue el propuesto por Alvard et al. (1993), con algunas modificaciones. Como recipientes se utilizaron frascos de cinco litros de capacidad, los cuales se interconectaron por parejas mediante mangueras de silicona. En un frasco se coloc el medio de cultivo lquido y en el otro los brotes. Cada frasco se conect a un sistema de entrada de aire proveniente de un compresor, el cual se accion por un programador automtico para el control de la frecuencia, la duracin de las inmersiones, la luminosidad y el flujo de gases. El aire entrante o saliente se esteriliz a travs de filtros hidrfobos de 0.2 mm, de tal manera que cada recipiente se manipul independientemente sin riesgos de contaminacin.

Determinacin del tipo de explantes para proliferacin en BITs

Con el propsito de determinar el tipo de explante ms adecuado para la proliferacin de bananos Williams y Giant Cavendish se evaluaron tres tipos de explantes: brotes individuales a los cuales se les realiz un corte longitudinal para estimular la brotacin; grupo de cinco brotes (clusters) con tres yemas cada uno, a los cuales se

proces por anlisis de varianza de un diseo completamente al azar con arreglo multifactorial y prueba de rangos mltiples de Duncan para la comparacin de medias.

RESULTADOS Y DISCUSIN 1. Efecto del tipo de explantes sobre la proliferacin y calidad de los brotes
De acuerdo con los resultados que se presentan en la tabla 1 el tipo de explante tuvo influencia sobre las variables que se evaluaron. Cuando se emple como tipo de explantes grupos de brotes (clusters) se presentaron los mayores coeficientes de multiplicacin y mejor calidad de los brotes. Esta respuesta se debe a un menor dao de los tejidos meristemticos y una mejor interconexin vascular entre los brotes. Cuando se realiz la comparacin de realizar corte longitudinal no se observaron diferencias. En los sistemas convencionales es recomendable realizar cortes longitudinales con el propsito de romper la dominancia apical de los brotes y estimular la formacin de brotacin axilar mltiple (Wong, 1986); sin embargo, en los BIT se encontr que este procedimiento no es necesario, pues no hubo diferencias significativas en el nmero de brotes, ni en la calidad referida al tamao de estos. Por lo tanto para los siguientes experimentos se emplearan grupos de tres brotes

sin realizar corte longitudinal. Los datos representan la media error estndar de tres repeticiones, cada una con 15 brotes. Los tratamientos con letras diferentes presentan significacin para p < 0.05 por el test de Duncan

2. Efecto del volumen de medio de cultivo y nmero de explantes sobre la proliferacin y calidad de los brotes.
De acuerdo con los resultados de la figura 1 se encontr interaccin entre los factores y las variables evaluadas. En todos los casos con el empleo de 500 mL de medio de cultivo se logr el mayor coeficiente de multiplicacin. Cuando se emple un volumen de 250 mL con 10 y 15 explantes se present una disminucin del coeficiente de multiplicacin, debido a un efecto de competencia de los explantes por nutrientes. Kozai et al. (1995) informan resultados similares en el cultivo de papa (Solanum tuberosum), quienes sealaron que el volumen inicial del medio de cultivo y la concentracin de sales en el medio afectaron los contenidos iniciales de iones, el desarrollo de los brotes, la fotosntesis y la absorcin de iones. Cuando el volumen de medio se increment a 750 mL hubo una leve tendencia a presentarse hiperhidricidad en los brotes, posiblemente ocasionado por una mayor absorcin de iones de amonio (Ziv y Ariel, 1994).

Tabla 1. Evaluacin del tipo de explante sobre el coeficiente de multiplicacin, total de brotes y calidad en la proliferacin de bananos Williams y Giant Cavendish

Tipo de explante

Coeficiente de multiplicacin

Total brotes > 6 cm

Tamao de los brotes 3-5 cm 15.0b 0.57 3-2 cm 28.5b 0.57

Brotes 7.2 b 0.37 individuales con corte longitudinal Grupo de brotes 8.6 ab 0.11 con corte Grupo de brotes 9.4 a 0.11 sin corte
46

58.3c 2.02

14.6c 0.72

132b 1.73 139a 0.66

32.0b 0.57 42.5a 0.57

60a 0.57 57.5a 0.57

40.0a 0.57 39.5a 0.57

F I TO M E J O R A M I E N TO Y B I OT E C N O L O G A

Figura 1. Efecto del nmero de explantes y del volumen de medio de cultivo sobre el coeficiente de multiplicacin en brotes de banano Williams y Giant Cavendish propagados en BITs. Los datos representan la media error estndar (EE) de tres repeticiones. Los tratamientos con letras diferentes presentan significacin para p< 0.05 por el test de Duncan.

Respecto al tamao de los brotes y la supervivencia de las plntulas durante la fase de aclimatizacin, no se encontraron interacciones entre los factores evaluados (tabla 2). Cuando se emple un volumen de medio de 500mL se logr un mayor porcentaje de brotes con tamao ma-

yor de 6 cm, lo cual implica plantas de muy buena calidad para la fase de aclimatizacin. La supervivencia en todos los casos fue superior al 95.5%, lo cual muestra que mediante esta tcnica se obtienen plntulas competentes en todos los casos.

Tabla 2. Evaluacin del efecto del volumen de medio de cultivo y nmero de explantes sobre el tamao de los brotes y supervivencia de las plntulas durante la fase de aclimatizacin.

( A ) Volum en de m edio (m L)
> 6 cm

Tamao delos brot es

3-5 c m 3-2 c m

Sup ervivenci a (%) 21 .1 11 .1 23 .8 1. 8 95 .5 1 0 00 . 97 .0 0. 1 5

250 500 750 EE (B) Explant s e (N) 5 10 15 EE AxB

24 b .4 30 a .0 22 b .2 1.1 5

5 44 . 5 88 . 5 38 . 1.3 6

32 a .2 20 b .0 24 b .4 1.1 5 NS

5 33 . 5 83 . 5 83 . 1.3 6 NS

14 20 21 1.3 0 NS

95 .5 97 .0 1 0 00 . 0. 1 5 NS
47

Tabla 3. Comparacin del coeficiente de multiplicacin y porcentaje de supervivencia de brotes de bananos Williams y Giant Cavendish en sistemas convencionales de micropropagacin y BITs.

Sis t ma de e prop in agac Conven al cion BITs

Coeficiente d e multip licac in 1. 5 9. 4

Total brot es (d espu d t r s e es meses) 4 75 . 423

BIBLIOGRAFA

% supe rviven cia 85 9 75 .

Los datos representan la media error estndar de tres repeticiones. Los tratamientos con letras diferentes presentan significacin para p < 0.05 por el test de Duncan En la tabla 3 se muestran algunas comparaciones en la eficiencia de multiplicacin y porcentajes de supervivencia entre los sistemas convencionales y los biorreactores de inmersin temporal, donde evidentemente se observa como despus de tres meses en los BITs se logran obtener ms de 400 brotes, mientras que en los sistemas convencionales se obtuvieron 47 brotes; de igual manera la supervivencia de las plntulas fue mayor en los BITs, debido a la mejor calidad de los brotes. Esto se debe a que el proceso de inmersin temporal para la proliferacin de diferentes especies vegetales permite un mejor intercambio gaseoso, una mejor asimilacin de los nutrientes; adicionalmente se presenta un mayor contacto entre los tejidos y el medio de cultivo y una mayor difusin de sustancias txicas, lo cual incide en mejorar los coeficientes de multiplicacin y calidad de los brotes.

CONCLUSIONES
La tecnologa de los biorreactores de inmersin temporal se presenta como una novedosa alternativa que permite mejorar los coeficientes de multiplicacin, desarrollo de las plntulas, calidad fisiolgica y un mayor porcentaje de supervivencia en bananos Giant Cavendish y Williams, que tienen gran importancia para los programas de exportacin del sector bananero.

Aitken-Christie, J., T. Kosai and S. Takayama. 1995. Automation in plant tissue culture. General introduction and overview. p. 1-18. In: Aitken-Christie, J., T. Kozai, and M.A.L. Smith (eds.) In: Automation and environmental control in plant tissue culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. George, E.F. (1996) Plant propagation by tissue culture part 2. In practice. 2nd edition. Exegenetics Limited England pp. 1031 1034. Hahn, E.J., and Y.B. Lee. 1996. A new method on mass production of micropropagated chrysanthemum plants using microponic system in plant factory. Proc. Int. Sym. Plant Production in Closed Ecosystems. Acta Hort. 440. ISHS. pp. 527-532. Kozai, T., B.R. Jeong., CH.Kubota., Y. Murai. (1995). Effects of volume and initial strength of medium on the growth, photosynthesis and ion uptake of potato ( Solanum tuberosum) plantlets in vitro J. Japan. Soc. Hort. Sci. 64(1): 63-71 Kurata, K. 1995. Automated systems for organogenesis. p. 257272. In: Aitken-Christie, J., T. Kozai, and M.A.L. Smith (eds.) In: Automation and environmental control in plant tissue culture. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands Ma S.S., C.T. Shii (1972). In vitro formation of adventitious buds in banana shoot apex following decapitation. J. Chin. Soc. Hort. Sci. 18: 135-142. Teisson, C., Alvard, D., B. Berthouly, F. Cote, J.V. Escalant, H. Etienne, and M. Lartaud. 1996. Simple Apparatus To Perform Plant Tissue Culture By Temporary Immersion. Acta Hortic. 440:521-526. Wong, W.C. 1986. In vitro propagation of banana (Musa spp): Initiation, proliferation and development of shoot-tip cultures defined media. In: Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Vol. 6, N 2: 159 166. Ziv, M., T. Ariel. (1994) Vitrification in relation to stomatal deformation and malfunction in carnation leaves in vitro. In: Lumsden, P.J.R. Nicholas, W. J. Davies (eds). Physiology, growth and development of plants in culture, 143 154. Kluwer Academic Publishers. Netherlands.

48