I'NIVERSIDAD DE SAN CARLOSDE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIASMEDICAS CLIRSO PATOLOCE_ TNNCERAO, FASE II DE Raimundo Garca del Moral

il CAPTULO

REPR'DUCID.D'.ENTES .'NFINES Mtodos en patologa

Carca Raimundo delMoral

captulo

II pginas: 13-48

Introduccin p y Auto sioclnica mdiurforense mdicolegal Autopsia Autopsia clnica quirrgica Patologa macroscpico biopsias de Examen para observacin su de Procesamientolostejidos microscpica Citopatologa patolgica en de Mtodos coloracn anatoma de Microscopa luz polarizada Histoqumica pa de Mtodos microsco electrnica umrcos s Mtado inmunohistoq Fluorescencia lnmunohistoqumica Cito tray citoluorometra me de citometra flujo sobre Aspectos bsicos Bibliografia

de los Enestesentido, departamentos anatom tecnolg de han patolgica pasado serun pramo de principalrnente la hab dependa co,cuyaeficacia a de de manual lostcnicos laboratorio, un con liclad c:t de plejomutrdo procedimientos laboratorio de no los teiidos sloparas de la facilita preparacin parasu anlisi sino microscpico, tambin estudio molecular. inmunohistoqumico Y puede realiza. enfermos cle El estuclio los tejidos anatr de distintas material sea partirde tresformas bJ procedente c) autopsias; biol de: nopatolgico citolgicas. y sias, c')extersiones de adems lasautoi modernos, Enloshospitales Patr de Anatorna al se sias, remiten Departamento en que los fragmentos seresecan el qu todos lgica y patolgicas gra rfano,todas las secreciones cua de clnicas prcticamente de nmero biopsias de La quicrtejidou rgano. introduccin la puncit histr de y aspiracin la necesidad la comprobacin t:a clnicos de lgica la mayora losdiagnsticos cle d geomtrico nrnero del un condicionaclo aumento y/o citolgico anatotnt pararjiagnstico muestras patolgico.

clnica Autopsia y mdicqlg1qse

con de Dependiendo la finalidad quesellevea cal: y distintas cl dos existen modalidades la autopsia, o fore mdico-legal autopsia ramente diferenciadas: clnica. sey autopsia

Introduccin

todas Autopsia anatornopatolgco mdico-legal^ comomaterial Sedesigna enferprocedentes individuos de muestras aquellas el para el diagnstico investigacin Tratade investigar origende la muerteen l< o mos utilizadas penales civilt o irnplicaciones en que De de etiolgica la enfermedad padecen. igual casos queexisten del a la propiacausa fallecimienl se de modo,bajo la denominacin ffisrotecnologa tantoreferentes d a tcnicosy como en lo que respecta Ias circunstancias incluyeel estudiode los fundamentos la el Desde puntodevistatcnico, realiza paraque pueda mismo. necesaria metodolgica secuencia judicial. indicabionr Las por forense orden rnclico anatomopatologco. a llevarse caboel anlisis

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patolgica general Anatoma

unclde los patok;{aqttese observacrl cacla c o s c i l a ns e g nl a l e g i s l a c i n i ec a d a p a s ;d e s t a c a n tlifcreritte a p e r o d o sc l e s c r i t o sA s p o r e j t ' t n p l < l1 ,s m a l f o r n a . entreotros motivos: r:tin incomtatil-rlcs la virla extratr cong:nitas criones q c i e 1 ) l . a s m u e r t e sq L l eo c L l r r e n n m e d i a t a t t t e l t ta l t t : r i n as o t te l e i c c e t t t r a l l e l l r i t t r c r r u p o ;l o s t u t n o y sbita <le snclrotttrt lnlri-'rte , d e i n g r e s o e u n p a c i e t t t e n e l h o s p i t a l a s c o n t oe n e l res linfoicles lt:ttr:elttias, d n s n i s c a s oc l er e c i n a c i d o s n g r e s a d oe n f a s et e r n r i n a l . e i n f e c r : i o n es o l t l a c a t t s a t a sf r e c t t e n t e e m u e r t e carcliovascttlares y lteridts por Irtuer' en el segutttlo, las enfr,:rtnetlatles o con grancles 2) I-osfallecidos ls y p r o c e s o s c I l t c e r o s oy c l e { e r l e r r a t i v oo s m s s tes violentas. 'l'odos de Por otra lrartr:, la necropsia en conruncs el aclulto. los fallecimicntos causadesconocicla cle 3) el formi perinatalhabitualmente ltarte funclahrental o sospcchr-rsa. t i r c o n s e j og e n t i c t f i t t a l ,c o s q t r ( r l o e s t a n t r a s c e n 4) Todoslos suicidios. g p c l e n t e a r al o s r e s t a n t e s r L l l ) o s . r E , x i s t e n a r i a s t c n i c a st l e a u t t . r p s i i p,e r o t o d a s v a c tn i e l l a s ,s i s e r e a l i z a l a t l e c u a c l a t . n t t n to : , d u c e n l c l s clnica Autopsia radien 1,as resrtltacios. variaciotttls la t:cnica rnismos y l a f o r r r r a l er l i s t : t l r : i L a e x p e r i e n n. < conoccr c a n e n e l o r t l c l n tatnbi:nprctr:rtclc Al igualque la anterior, c t ) la causaclela tnuerte,aunquccn estecasoitrlportart c i a c l c b ep c r u t i t i rr : r lc a t l c a s ot t r t a t t a r sIe I r a o n nlsfre[.rs F , nl o s scguirlos finestle fortttatttinut. t(:cnicas s s m e n o sl a s c i r c u n s t a r l c i ac l t t t t t r o b r e v i r t o . s tt c l t i m o sa o ss e h a n e s t a n c l a r i z a rtlro s g r a n < l e{sr t r - c u r ) n t e n r c n ue i l i z a r l as o n : pos clcuecrolrsias clllicas: 'l'(rcnir:a t:n Virchow.Consiste' la diseccincle 1. der (lrgattot; por corl){.tt'izaIt(lo Ia cavi, l . N e c r o r s ip e r i n a t a lq u e e s t u d i al o s c a c l l v e r e s It.rs a tor sttparatlt), to y , perinatalclef ilricltl en couprencliclos el peroclo l lor la d a r lr : r a t t e a l s i r L r i e n <rl o r c r l c l l r l c a v i c l a r l r c i c i y abrlontett. O M S ( f e t o s o r e c i n u a c i d o s t l e l t e s t 's t t l l c r i r ) r r ( t i ( 2 . T : c n i c a l r ' , l l r o l r . l o n s i s t e t ) L r xrfa e r l o s r g a 5 0 0 g r a r n o sh a s t a l o s s i c t e p r i n t e r o sc l a sr l c v i d a y Lrlorltrcs, ctrelloy trrlx, abrlrlmen rctronos cn tres extriuterina), < e lc r e a l i z r t r l o s a t l i s e c < ' i r isn l l a r a d a l e p , c 2 . N e c r o p s i a e t l i t r i c ar c l a t i v aa l < t s a d i t v t : r c s r r : r i t o r r c o , dt: sietetlas clt:vjtla ], hasta los c a d ab k r q t t e . de neonatosrle nrs 'l'cnica e r L ' L c l r . r l l e .et r a t trl t rl a e x t r a c c i r r tn S li. 15airos. l a : s el 3 . N e c r o p s i ad e a t l u l t o , t : o t r i l t r e t t c l e r t r s t o t l e r u n o l o b l o c l u t< l et o c l rl s sv s t : c r a sl l r r ar e a l i z a r a l r f rliseccitinr,reralcl catliLr'(:r. r:arlvcres. viertedeterLa necrsoidacl estasistenlatizacirn cle r , m i r a d a p r r rv a r i o sf a c t o r e s e n t r e l o s r u cr e s a l t al a A n t e s d e r c a l i z a r l i t a t r t o t s i at,: l p a t l o g oc l e b e ( : o u o c c r o s d a t o s c l r l i t : o st,: o t tt r t r l t l s r r l t t e l l ri,n t c rs l

Figura 2.1, lntagen nedionte pico t1e n u rtcrosct to eslereosc o r:ilittlro de biotsirt rettal. Se atlui erlen losflculosglomerulctresett fonnode un ouilloirregular t' roiizo tlt cupiktres.

en Mtodos patologia

l5

Figura2.2. Linfomaen el hilictde lcs de un bazo.La diseccin todr,s eset:tl del cotnponentes hilkt e.s plra un correcto estudic ln dt'
pte.zd.

l l q r r o g a n t e s u e s e p l a n t e a r o l t i t t r a l l t ec l c t t r s od c l a d r o s o l i t e n i r l o s l o r p r r t r c i r td e r g a n ' r s ,q u e l l o . (loll la histo- c o r n r r c n i l eln t o t a l i r l a td e u n a l e s i r n E j e r n ; l c s a l Adenrs precisorenlitir es enfermcdacl. r p y fi r t n a c l o o r l a fa t n i l i a s o n l r sc i l i l l r l r o s l c l t t t t c i r r c n a l( f i g .2 . 1 )y h e l r t i e n u riaclnica n perrniso scrito a c s cle Despus realizarla tlutrrJlslrt, c a . l a s l t i o l t s i a s t l t r l t ' ae n d e r l n a t o s i si , s I l l u e s del clirccta paciente. a, q u c p u c c l e u r a r e n t r e t t n ay l n e d i ay c t t a t r t ih t l r r s . t r a s o b l c n i c l a s ) o r f i l r r: rl l r o n t : o . s c o p i e n d o s c o l i a l d et p u s e r e a l i z a n d i a g n s t i c o r o v i s i o r l atl: o nl o s h a l l a z - r l i l e s t i r , a , t ' . tamatl,pttes'' lir; tuirrrqir. son rle n)aYor I-aspiezas q o s m a c r o s ( : p i c o s .a a t t t o l s i a c c o n l l l l e t a , l e s c s L e rr g ; r t l t l e n t e r o s i l r c l u i r s n p u s d e l e s t u d i om i c r o s c p i c ot l c l eo t r a s t c r t i c l i s t o q r t es u e l c r c o m r r t ' t t r i e ( rl l e l a l c s i i r t a a n a l i z a r f i q 2 . 2 ) H a l l i t r . r a l r ittmttnohistocluntica, l a t o t a l i r l a r electrnica, como micros<rota por <:iruj;rno rararealizarel def diagnstico i- ner)te,solt oltttttlitlts erl del etc.,con la remisirn protocolo,etl , f d c a d ac a s o . t r a t a n t i e u t o e u t r ae r r e r m e c l a ds i b i e n c ( ) l l l oc o t l l a a n i t i v o y l a c o r r e l a c i n n a t o m o c l n i cd e d de y rlefirlitivo ull;t p l e m e n t oi n t p r t s c i n d i l : l e e b er e a l i z a r s e l e s t u c l i o Un ejemplode tristoria cliagnstico t a n a t o n o p a t o l g i c tc r r nl a f i n a l i < l a dl e c o n f i r m a te l r en aparece las tablas2.1y'2.2. autopsia y l <1 E l r n a t e r i a ld e a u t o p s i a sr e c i b e e l I n i s n l ot r a t a - d i t q n s t i ce s t,a l t l r : c tt:r n p r o n s t i c o c o n t r i b u i ra ulterior. clt:l o , m i e n t oq u e e l m a t e r i a ld e b i o p s i a s c l c p e n d i e n dd e la planificacirn tratrnietlto q l : a l . a sl t i o r s i ats n t ot l e m a t c r i a l t t i r r g i c tc o t l l t lt l e l, m s l a s l e s i o n e s a c r o s c p i c ae n c o n t r a d r sa e x i s t e n r a r n r l i c ' t J e l t c rri l n l i t i r s e l D e p a r t a m e n t ol e u cle previrl,ncr:esidarl correla- o r i g e n cia o Ito de diagnstico s tl P a t o l { i c ai r t n l e c l i a t a t n e n cee s p u r i e p c i n c l n i c ae i n t e r se s p e c f i c o o r u n t i p o c l e t e r m i - A n a t o m a con Irabersicioextrarlas. el fin cltlque el anatomopan a d od e l e s i o n e s . le v tlogo l.rueda alorat ;idecuaclamentas lesiones para las e rnacroscpicas indicrr tcnicasnecesarias quirrgica el cliagnstico. Patologa d U n a b i o p s i ae s u n a p o r c i nd e t e j i d o o b t e n i c l a e un individuovivo rarasu estudio anatomopatolgil a e c o . S e g n l o b j e t i v op e r s e g u i d o l r e a l i z a r a t c l m a , a) de existendos tipos fundamentales bioisias: biopy b) piezasquirrgicas. siasde diagnstico, L a s b i o p s i a s d e d i a g n s t i c os e r e a l i z a t rc o n c l o b e t i v of u n d a m e n t a ld c c o n c r e t a rc l d i a g n s t i c o histopatolgico(microscpico)clettna enfernleda(l y a l c u a l n o s e h a p o d i d o l l e g a rp o r l o s n e d i o s c l n i p , . c o s h a b i t u a l e sE n g e n e r a l s e c a r a c t e r i z a n o r s e r s d e p e q u e ot a m a o ,e n o c a s i o n e s e t r a t a d e c i l i n -

de macroscpico bioPsias Examen

quide macroscDii:o biopsiasy riezas El estuclio un rrgicassc componedt,r coniuntode mtodosperque definenuna sisiemtiestructurarlos fet:tautente r l c a c o n s t a t t t ci l e ta t : t r . r a c i pla r a c a d a m u e s t r a .d e seanreproduciobtcniclos qut lcs resulttrl,.ls fr-rrma patilogos. blesentrr:clistintos cunplir quc Los objetivosgenerrales se preterrden s nacroscPicoon: conel estudio

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patolgica general Anatoma

aJ Describir exactamentetifrode material el renli- el efecto ltico de la autlisishastaconseguir total la tidopara estudio, incluyendo dimensiones nlismo destruccincelular. clel que y delaslesiones contiene. adems especificar La filacintjsular consistecn interrumpir los prode sumorfologa, y, aspecto, coloracin enel caso las cesosdegradativos aparecen la mucrte celuque de tras piezas quirrgicas, relaciones estructuras lar, tratando de conservarla arrluitectLlra composus con y vecinas. debe No que olvidarse en ciertos casos la sicintisularlo msprxirnaposiblea la normalidad, descripcin macroscpica aporta tantos nrs o datos de fornla que si se considera ai procesovicla-nluerquela microscpica, y comoocurreen la patolo- t e - d e g r a d a c i o r g n i c ac ( ) l n ou n a s e c u e n c i a i n e tal n c gavascular cardaca. y matogrfica, fijacinen url nlomentodeterminado la J Seleccionar detalladamente reas las sobre las del procesoproporcionararrnaimagenestticadel quevaa realizarse estudio el microscpico. pro- m i s m oq u e d e b e m o s p r o c r l r rcro m p r e n d al o s f o t c l Este tambin ceso, conocido comomuestreo "tdllado" gramassituadosen mayor proximidadal instantede o rjelmaterial, practicado formaobligatoria es por la muertey, por tanto,al estaclo de vital de los tejiclos. el pcrsonal facultativo. Deformagenrica, se{irrlsu lnecanismo actuay de
c i n , l o s a g e n t e s i j a d o r e s e r : l a s i f i c ae n d o s { r a n f n s des grupos:fijadores pur rntodos fsicosy fijadores por mtodoscunricos. el trimercasoernplean Procesamiento lostejidos En de el por con(elar:irin tejiclocomo mtoenfriamientrt del parasuobservacin microscpica d o p a r a c l e t e n e r a a u t l i s i sv p u t r e f a c c i n i s u l a r . l t E l m i c r o s c o i t i ce s u n i n s t r u m e n t o l t i c o r u e , l,stetipo de proccdinrientos lii actualidad esenl t:n es como su nombreindica(del qriegonloo, pequeo, e is v c i a l p a r ap r e s e r v a r n c : o r r d i c i o n ed n e a se l m a t e skopein,observar),permite ver objetos que por su r i a l c l ee s t u r l i o a r a l r o c e d i r n i e n t ol s o l e r : u l a r etse p n l p e q u e ot a m a o e s c a p a na I a p e r c c p c i nd e l o j o diagnrstico, h u m a n o .F u ed e s c u b i e r t o t o r A n t o n v o n L e e u r v e n q s l , o s a g e n t e s i j a d o r e s r r r n i r : oa c t a ni n s o l u l ; i l i f 3)e h o c k ( 1 6 1 3 2 - 1 7 2q u , c o n s t r u y v a r i o s c i e n t o sr l e : zandol;rsprotenirs tisul;rres, cual bloqueala autlo microscopios basetle clrientarlentesclearrntcnto. l i s i s p o r i n a c t i v a c i t n n z i r r h t i c aD e r n a n e r a c l i c i o a e . a E l m i c r o s c o p i o r p t i c oe s e l i n s t r u r n e n l rd e t r a l t a j r , t n a l , a l g u n o sd e e s t o s l c u i c l o si j a d o r e si m p i c l e n l f e caracterstico los patlogos. de cret:illientobacteriano. [ x i s t e n d o s t i p o s d e m i c r o s r : o p i o p t i c o so l o t s A u n q u ee x i s t e nq r a r )c a f r t i ( l a rc l el q u i d o sf i j a d o l n i c o s :m i c r o s c o p i o i m p l e ,e s t e r e o s c < i l i c o u t ay s ol y r e s s i m p l e s , r l i f e r e n t e su t : z c l a s e l o s m i s m o s ,e l l d el microscopiocompuestoo coniln, cuepcrrrritel;r n l s u t i l i z a r i or r s u a l l n e n t e s e l f o r m a l c l e h d o , a s g c observacinjde secciones y translcidas cr,rlorcadas i n c o l o r o , q u e s e c o m e r c i r l i ze n s o l u c i n a c u o s a a d e t e j i d o , y \ p o r e l l o e s e l i n s t r u m e n t od e t r a b a j o saturadaal lJ7-40% (formalin;rconcentracl,.r). anaEn caracteristico los patlogos. de a t o t n a p r a t o l g i c s e u t i l i z a a l 1 0 %e n s o l u c i n d e para que un tejido puedaser obser- nuever Sin enrbargo, volnlenesde aguaclt un volumende formalivado al microscopiose recuieren dos condiciclnes na. Estasolucirndel-e taniprinada un pH de 7, ser a p r e v i a se l e m e n t a l e sa J q u e e l t e i i d o c o n s e r v es u que evitala formacindel piqntcntoformolado, : espee s t r u c t u r a n a v e z s e p a r a d o e l o r g a n i s m o e p r o - c i a l m e n t ee n l a s p r e p a r l c i o n erso n d e h a y m u c h a u d d l c e d e n c i a y b ) q u e p u e d a s e r s e c c i o n a d o n f i l l a s sanqre. , e Otros fijadorcsmcnos utilizadosson soluciolminas ya translcidas, que por lo comn los tejidos n e s d e c i d o a c t i c o ,c l er n c r c u r i o , l ea l c o h o ly d e c s o n o p a c o s E n e l p r i m e rc a s oe s n e c e s a r i ol r e v c r r i r osrnio(fig 2.3). . l d e f o r m a i n m e d i a t ad o s f e n r n e n o s l e g r a d a t i v o s E l t e j i d o s e o d e s p u s e f i j a c l o e d e c a l c i f i c a n c d s e muy relacionados aunrue conceptualmente diferen- sohlciones decalcificantes conlo rcidofrmico,cido tes, que llevana la completadestruccinde los teji- c l o r h c l r i c o c i d o n t r i c o , r c . s i n a s e i n t e r c a m b i o , d y rlos:auttilisis putrefaccir.rn. inico o en una pila electroltica. Autlisis es el proceso por el cual clestus la de Unavez fijadaslas nluestrastisulares para estudio muerte se producela autodigestin p enzimtica celu- m i c r o s c p i c o u e d e n s e r p r e p a r a d a s e u n a g r a n d lar tras la salidadel contenidolisosomial citoplas- variedad formas,aullqueen su mayorparterequieal cle ma por rotura de la membranadelimitantede estrs ren la inclusinen-Un nledio sliclo. Estetipo de proorgnulos. denominaputrefaccinal efectoque ceder confiel-e los tejiclos Se a una durezaque impide la produce la accin de determinaciastoxinas y enzi- fragmentacin los misll.ros de duranteel corte, manmas procedentesde microorganismossaprofitos tiene las relacionesarquitecturales entre los distinsobre los tejidosde forma que stascomplementat tos elementos aseguraIa olttencinde cortesmuy y 4

en Mtodos patiloga I 7

;ffi$,J.i$lbt:;i:*''i' $'t'-ffi .-,t: i;li'*'-,Sffi-ftffi "; ffiii ,, ." t;i;-r :,,iF*ffi "**ihi:;:' t{
que cr.'tt qIandes: f ijartct IJ,5; f iirtrto ltrnr\. Ntc'se en Iu praparocin con B) A) Figura 2.3. Linktma dilusorit;rttlulas celukre's' losdettilles nt<:iar oprecian fuidaconforrnolse. o en las i E y f i n o s ,r e g u l a r e s h t t t u o g r i n e o s .l p r i n c i p a la g e n t e a r e a l i z a rt c t t i c a sn l n u n o h i s t o q u m i c a s orl roPer;tt as. p a r a f i n a , p r o v $ biopsias re a e m p l e a d op a r a l a i n c l u s i r ne s l a o intraoperatoria es Ia que Posee(le ellcolltrarse en fo ri,lrq-Ut!49&ttoria chando la prclriedad envael ciruiano cluranteuua intervcncilnctriC e a l e s t a c l o q u i c l o t e m p e r a t u r a s l l t { ) r n oa 5 5 - 6 0 " y qr-re o se rrgicacon el f ill <lccttr: realice confirrneun diagambiellte. a solidificar temperatLrra Ia que tlcpcttcle continuacilnde la itltereste n,:riticorlcl Patolgica cle En los Deltartantentos Anatotna qui["]s auto- vencilt.l. nuv fi'ct:tltltlteen las intervenciones tratamientose realizaInediarltelrocclsadores de ittlollasiaspara diagnosticar la' vas(lspara realizar r r q i c a s mticosque contienenmrltiples de la aft:cticirn losr y y los baosde deshiclratacirrtaclararniento Ltnsis- t'nfcrnterlad,llara tleterntinar o cluirrgicos I)araascgtlrar rer{tl- extrcrnosrl:rest:ct:iln travscleellos tema mecnicode transporte r <lt' la ariecuaciltl la Ittuestratotnadapara cliagntstihorario. lado por un progralrlador a lrstasmu:stras soll collgeladas, t:ontid p a r a d i a g n s t i c o e e n fe r m e - co posterittr. L a s b i o p s i a s s e a s qutl cortescon ellcriostato, varios sollre leiido lic.r nuacinse realizan suelenestudiarse dadesmetablicas con nal)ituLlnlente hematoxilina-eosiincluidoen sustancias clecalcificado, lllsticiisdtrras, se suelentenir ell se .Acttlahncnte lltrede, caso na v azulcletoluiclina. del tipo del metacrilato. tcnicahistolgica, casicualrr-rier realizrrr t t L a o b t e n c i nd e s e c c i o n e s i s u l a r e s r a n s l i r c i d a s neiesario, a r d c a c l a c a c c i n t r a v sd r : o t c s e r e a l i z a o r tu n i n s t r u m e n t od e p r e c i s i r nl e n o n l i - a c o r t a r t c lk r s l i t ' t l r l l r l s e nunleron a d o m i c r t o m o( f i g .2 . 4 ) .A u n q u ee x i s t e r t sos tipos de microtomos,el corte del materialincluie d o e n p a r a f i n as e r e a l i z af u n d a m e n t a l m e n tc o n e l cle clerotacino tipo Minot.La obtenr:ltl rnicrotomo se sobre teiido congelaclo realizantedianteel cortes , d e n o n i n a d oc r i t l s t a t o y l a o b t e n c i nd e s e c c i o n e s en electrnica, el llamadoultramipara microscopa crotom0. utilizaclos Puestoque la mayorade los colorantes l n o s o n s o l u b l e se n p a r a f i n a , o s t e j i d o s ,t r a s h a b e r en debenser desparafinados xilenoy sido cortaclos, a previamente la tincin. rehidratados El criostatoes un instrumentoque permitela realizacinclecortes de 4-5nlicras de grosorett biopsias adecuado' elt en lresco,previacongelacin un tneclio E s t em i c r o t o m or e a l i z al r l s c o r t e s t r a s e l l c a s t r a rt . l tejido en un mediohidrosolubley aproximadamentc se a -20' C, El microtomode congelacin utilizaen la preparacinde cortes de biopsiasen las que se van

ffi *}i-,"* ;5;:-','';;ffig .,lru#ffi ffi$ ;1l'd*1;ffk,

o tle Figura 2.4. hli::rtt,ttno rotocin de titoMinot ie fue'rpuru induciru.ta tlttttle rotat:in tle u oliser el tyon t't inciLl'a fonno de pinzo,qu.e e"t il te itercia pctrtthlctqtle's al perpendicular plano de 'la ctkt<:atlct Iu sabre cuc'hilla. irnaen.

18

patolgica general Aatoma

su realizacin un hornode microondas. la en lln peroperatorias puede mayora lasbiopsias de se ralizar diagnstico un anatomopatolgico o 5 minuen4 tos.La calidad lasmuestras metror conlas de es clue diferidas, mismo qlle tcnicas al tiernpo es limitada la cantidad tejidoqueseestudia, lo queeuun por cle pequeo porcentaje casos, inferior 5l), diagde a[ el nstico anatomopatolgico realizado sujeto est a En errores. estos casos diagnstico el definitivo se 24-18 horashasta difiere estudiar DreDaraciones las pernanentes.

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Figura 2.1-r. ltqrt e rfrl i t,rt qi ttttc Citc irtl olqicaltt ida cot [,a citopatologa la parte clela anatorna es patol cl nttr'tk Putrtrticokut. rtl.seruatt rlt .<t, clulasdisplosig i c ac u e e c l i a n t d i v e r s o s r o c e c l i n r i e n t o s t u d i a cos ettlt:lioles ttttables m e p es t' un di[t:r,.tncas el Iurnuo en las alteraciones morfolgicas las c(lulas de despren- coloracin junto tI Ltbuttdantt:s grnttulor:itos nuclear neudiclaslibrenlentede los eritelios revestirniento lrfiks. cle o cxtradas distintaszonasdel cuel'pohumano. de Aunqueel estuclio citolgicocomr:llz realizarst: a e n e l s i g l oX l X e l v e r d a t l e r on i p u l s o rr l e l a c i t o l o g a f o r n a e s r o n t n e a l o s c l e n l i n t o sc l e s c a n t a d o s , i a c l n i c a a c t u a l f u e P a p a n i c o l a u( 1 8 8 11 9 6 2 ) ,q u e ( e s p u t o o r i n a ,e t c . ) . f , publicen 1943 una nlonografa sobreDirgnstico del 3 ) f ' o r m e c l i oc l ei n s t r u r n l n t o sr l e e x r k r r a c i r o n canceruterinc A l q tor el frotis uctqiru!. rarlir rle esta " l i t n r : i q u c e x t r a r re l c o r r r l ; , r r n e n lte u i c l or : c . r n n f e c h a ,l o s e s t u c l i o c i t o l q i c o s t : f u e r o na r n l t l i a r r t l r i r : l u l a s r r s r r s t e n s i l rr o t ' r , r l c r r tc l ez o n a so f r l n i s s c l e m e c l i a n t e l c s t u c i i r r l e o t r a s c : l u l a sr l r : s i ' a l n a t l a s c a s j n tr : r n a s t r a < : t o c s1 tr at r rl i o , l r r L r o a s t o - i n t e s , e ( g r r ! (lrs cspontnearnentclrecor.{i tor rlivcrso::-r e rot:ctl i- t i n a l ,r : a v i c l a d ts c r o s r s , r ' . ' ) i.) c c s t a n l a l l e r a o s :s el l m i e n t o sc o n l o r a s p a ( l or l t s r r t e r f i e s ,c ep i l l a r l oy ic t e r r it r l r i c . ro r r l nc o s n l r sf r . t , <t::u t e n l e n t en t e r t r c s i n i l a v a d o e n e x p l o r a c i o n e se n d c s c p i c a s , e n e l t l < l o s n r : i t t i r a t o l o g t : x f l i l t i v a s o n :a p a r a t oq t t n i y a o e n o n e n t oa c t u a l ,c o n l a i n t r Q r l u c c i ( r n ,g r a t re s c a l a , t a l fr r n r e i:nr . i r l r or c s l - r i to r i o , a l t a r a o d i g e s t i v c l , a l a ro t t l e l a p u n c i n . q o n g u j af i n a y s u e n r p l e o l i r i { i d o a v a sr r r i n a r i a y t r r s t t r t ,tt.i e ly < : a v i c l a c lo : s n i c a s a r s trq , t r a v s d e I a v i s i n g a r n m a g r f i c ac c o q r f i c ao c o n ) oi ) r n t t ) t r c o , l e r r r a,r o ; r : a r r l i o a r l u i s a r t i c u y r, lt r n e d i a n t e o m o g r a f a x i a l c o n r p r r t a r i z a r l au c l r a n l a c i o n e s . t a r el tlc.srosibilitaclo accesoa rganosqurrno pire<ir:n caniarsus clulas una superficie cavirlacl. a o La c i lg_iqgia2lf1-p.Lliir rI-.rs1 i r 1crl n c o n a(uj a f i na r lt i D e p e n r l i e n d d e l n l a t e r i a ld e e s t u d i oy f o r r n ac l e J } A D t i e n ep o r o b j c t oc l c s l u r l i or l e c l u l a s e p a r a o s obtencinde las nruestras distinguen se clostipos de < i a sc l e k r s ( r r q a t r o s n ( t c s e a s i e n t a nn l e t l i a n t e c preparaciones topatolr gicas'. i topatoktgfu exfo ci c p lia- e x t r a c c r n o r p u n c i nc o n r r q L l ifan ad e 0 , 6 - 0 , 8 m i m tiua y cibpatulogo prtr puncirtuspiraci(utcon uguju c l ec l i n l e t r o ,e g u i t l a l r : s t i r i r t : i fn r z a d a o n u n a s c a o c fina (PAAil. e l c l e r i n g a h a l t i t u a l n l e n tc o n t ' c t , r c aau l l s i s t e r n a i e L a c i t o p a t o l o g e x f o l i a t i v ai e n e l o r o b j e t oi n t e r - v a c oo p i s t o l ac i u er e a l i z ;lra s L rr : i n . i s t at c n i c a e a t c l s p r e t a rl a s c l u l rtse l c u e r p oh u r n a n o l e s l t r e n d i d a s d e s a r r o l l n i c i a l m e n t e e l r i r l oa l a n e c e s i d a d e l r i d d d e l a e p i d e n n i s , o s e p i t e l i o s l u er e v i s t c ne s t r u c t u - r e s u l t a d o s l i a g n ( i s t i c ors l r i d o sc o n u n m n i m od e I c c ras orgnicas abiertasal cxterior y el ntesotelioque t r a u l n ap a r ae l p a c i e n t , :p ,a r t i c u l a r m e n te n s i t u a ' e taliza las cavidadesr:orporalescerraclas(pieura, c i o n e se n l a s q u e n o p o d a r l i s p o n e r s e e u n a b i o p d peritoneo, articulaciones, espacioraqudeo, etc.).De s i a a r J e c u a d a , s u m a y o r n r t e t u r o v i n o ,p o r u n a y p forma genrica, clulaspuedenobti:nerse: las p a r t e ,d e i h r s t i t u t oK a r c l i n s kc { e u e c i ay p o r o t r a , ;r S , (]enter for Cancr:rand Allied Diseases clelfi'lemorial 1) Por exfoliacin forzadamecliantc irotanriento o de Nueva Y<lrk. raspadocon diversosinstrumentos nivel rle Ia etia E n p r i n c i p i o , l a P A A . F s a p l i c a b l ea c u a l q u i e r e dermisy epiteliosen continuacin con ella. t e r r i t o r i o o r g n i c on o c o n i u n i c a c l f u n c i o n a l m e n t e o 2) Aprovechando los fluidos que vehiculan de c o n l a s u p e r f i c i ec o r p o r a l , a l t l t q u el o s t e r r i t o r i o s

en Itorios patologa l9

s m e x p l o r a d o s s h a b i t u a l m e n t e o n m a m a ,t i r o i d e s , hgado, pulmn, tumores de tejidos blandos y prstata. D e f o r m a g e n e r a l ,l a c i t o p a t o l o g ac o m o p r o c e d i n i i e n t o d i a g n s t i c op e r m i t e l a d e t e c c i nd e s t u m o r e s ,l e s i o n e sp r e n e o p l s i c a y d i v e r s o st i p o s , d e i n f e c c i o n e ss i e n d o d e g r a r t u t i l i d a d p a r a l a p d e t e c r : i n r e c o zd e l c n c e r( { i g 2 . 5 ) .P o r e l l o , l a a p l i c a c i nd e e s t a t c n i c ae n e s t u d i o sc i t o l g i c o s d e c e r v i x u t e r i n o d e g r a n p a r t e d e l a p o b l a c i nh a l h e c h o d e s c e n d e r a m o r t a l i d a dp o r c n c e rd e c e r vix. El materialcitolgicose obtienede forma rpiday inmediay deberealizarse sencilla, su proce.samiento t a m e n t ep a r a e v i t a r e l d e t e r i o r oc l el a s c l u l a s .S e cantidadde la muestrasobre un colocauna pequea p o r t a o b j e t o se f e c t u a n d ou r t a c x t e n s i n m u y f i n a citose sobreel mismo.En el casode lcluiclos utilizarr d e i i l t r a c i nr l u c c o n c e n t r a n o centrfugas nrtodos se Paraevitar su desecacin introducelr las clulas. e x t e n s i ne n u n l q u i d o f i j a d o r - a l c o h o l , a l c o h c l 1/2 ter...-duranteaproxintadamentc itora o bien se C p u l v e r i z aa s u p e r f i c i e o n u n n e b u l i z a d o r . o nJ l o s l c (v:ase ms a terioridad puedepasarse la colora<:in adelarrte).

u c u a l l a s e s t r u c t u r a sa d r l u i e r e n n a t o n a l i d a dp o l croma. Los s0-l-qra$es-!Ldi!ll!:s son aquellos que coloo r e a nl o s t e j i d o sp o r u n u t t : c a n i s md e i m p r e g n a c i n fsica. de tcnicascombinadas Aunqueexistenrnltiples los teiidos,descle tirrcinruecolorean Sllt.,balmente d e m u y a n t i g u ol o s h i s t o p a t r l o g o s m p l e a n e f o r n a rutinariauna sola de ellas:la clehenlatoxilina-eosina r ( f i g .2 . t i ) . s t oe s d e b i t l oa l a e x t r a o r d i n a r i ai q u e z a E c l em a t i c e s r o s a d o sy r r l i o sq u e p r o v o c al a c o l o r a d c i n c o n e o s i n au n i c l oa l a t : x c e l e n t e e f i n i c i nn u exioEn por Ia ltelttatoxilina. citologa clearoriginarla g i n e c o l g i c a ,l e y e l i a t i v a , e s p e c i a l m e n tc n c i t o l o g a mts utilizadoes el de l'allareconlenciabltl rntoclo ' c n i c o l a o ur l u eu t i l i z al a h t l n a t o x i l i n a o m o c c l o r a n t e , citopl/rsrniy tliversas ne;;clasde coloratrtes nuck:ar el cos cronro narania(i t'l vcrde luz y lii eosina.Iiste y \ltlii hct:lrolc lrr,rporciona qrall cromaticidad transI ki, l i l e r e n c i a c i d e l o s f i n o s ,t n - r a r e n c i t , - ' r t t l i t i e n c at a s c r l e t a l l e s i t o l q i c t l s o b r e l o s q u e s c f u n c l a m e n te l

diagnrstit:o. rl P r i rc l < t o l t t r a r i o , n r : i t r l l o q a o r p u t t i : i r u - a s p i r a ll ll c i r n e s p r e fe r i b i e l a < : o l r l r a c i cr eM a y - ( i r i i n l v a l r l q ( i i e m s a l t i n c i r tr 1 t i r 1 ;o t D i f f - Q u i k ,t t ep e r m i t e c -n c c l a o b s o r v a c i r n a s i i l l s l a t t t r e ac l el a m t t e s t r as i n clc necesidacl fijacirn. v d en Mtodos coloracinanatoma de A c l e n l r i e l o s m t t l t l o s e h e m a t o x i l i n a - c o s i n a s e ru P a p a n i c o l a o cto l l l o t r o t : e , l i t n i e n t o t i n a r i < l s n e l l patolgica n ao ;tt c l i a q n s t i < : n a t o m < l 1 lo l g i c oe x i s t e n u n l e r o s a s s d electrostrticat c n i c a s c c o l o r a c i t tttt s l l e c f i c ap a r al a s c l i v e r s a s cle de Enluncin sucapacidad trnin

grupos fundamencuatro se a lostejidos distinguen nettbsicos, cidos, colorantes talesde colorantes: f' ,, trose indiferentes. r r(:;. .\ por fornlaclos molbsicos estrn Loscolorantes gruposcatinicos sonlos clue quecontienen culas globalbsica colorandel cle responsables la carga estructe.l'or estemotivoseutilizan taracolorear principalmente en contenidas cl int+ turascidas, ett celulares formade cidos rior de los ncleos tipodecoloejemplo este de EI nucleicos. principal ranteesla hematoxilina. de a ciclos, la inversa los anterir> Loscolorantes i ;r:'^q' :*9d I y gruposfuertemente aninicos en res,contienen proteicas contenibsicas general tienestructuras del o celulareslasfibras intersdasenloscitoplasmas ms Los basales. ejemplos notaticioy membranas G naranja y fucsina. blcssoneosina, se l-or; Cp]-illc!09-U-tros producenpor la unin y ciclos bsicos salino entrecolorantes ciecarcter y en ersitto un insoluble agua nuy Figura2.{i. 'l-itcin 'ttt'tt:,l..tc.tilito de- hgctdtt formar precipitado un tle rara produt:ida ms dlun paciente leskintxicode hepatocitos El con alcohlica. ejemplo estable disolucin en del aue-rsiuos olcohol. con la mediante por tratamiento frrqacos de es caracterstico Ia tincin Giemsa,

on

patolgica general Anatoma

Figura2.7. Amiloidosis uescukts de seminoles teitlo con rojo Congo[,osdepsitos anilole sesitonlsknnentle. te bojo la nembrano bosalde losrepliegues etiteliales.

Figura 2.8. Ciisa1es r.xuluto un rin terrninaluisde en tosc()nmicrosutpoda.lttz tolonzoda.

e s t r u c t u r a sy c o m p o n e n t e sc e l u l a r e sy t i s u l a r e s logay bioquntica se utilizaparaidentificarsusrany (vase aclicionalmente tabla 1.3). la ciasquimicas determinar significacin los tejiy su en do.sy en las cirrlas. Haliturlmente, ar{enterns el c o l n n a i d e n t i f i c a re s u n a e r r z i m au t i l i z a n d op a r a , Microscopaluzpolarizada de ello cliversassustaltcias(r:romrgenos) que bajo ta accinenzintica transfornan strstancias se ell insoCiertoscomtuestos orgnicostitnenrrn singr:lar l u b l e so p a c a so c o l o r e a d a s i s i l t l e s l m i c r o s c o p i o . v a efectoal ser incididospor un rayo cleluz. Iistassus- Der estemodo pueclen oltjetivarse oxidorreductasas, t a r r c i a si e n e nl o s t o m o sd i s p u e s t o s l et a l l n a n e r a transferasas, t c rliversas hirlrolasas, liasas,isclnerasas q u e a s u t r a v sl o s r a y o s d e l u z n i c i r n e n tp a s a n y sintetasas. e en ciertos planostle vibracin.Deterrninlrkrs clisp<> Descle introdrrccin anticrrerpos la cle para la idensitivos,cornoblprismainventaclo el f rancs Nicol t i l i c a c i n c l em o l c u l a se n l a p r c t i c ad e r u t i n a e n tur en el pasaddisiglo, permitenel pasode luz en un solo anatornapatolgica,los mtrtdoshistoenzimticos plano.De este modo, cuando la luz polarizadaatra- h a n i d o p e r d i e n d ot e r r e l t o e n r e l a c i nc o n l o s cle viesa un cristal de cuarzo,gira el plano clepolariza- b a s e i n m u n o l r g i c ay a q u e h o y c l ae s m s s e u c i l l o , c i n , l o q u c s e u t i l i z ae n a n a t o m a a t o l g i c a a r a determinarla p p rle a rresencia una enzimaatendiendo identificar ciertassustancias que dan un color carac- s u e s t r u c t u r aa n t i g n i c a u e 0 s u a c t i v i d a db i o l g i q t e r s t i c oo b i e n t i e n e nu n n g u l oc a r a c t e r s t i c o e c a . S i ne m b a r g o , a s a p l i c a c r o n es e c u n d a r i a s e l a d l s d extincinde la luz polarizada. h i s t o e n z i m o l o g a a r a c i e n t o s t r a lra e x i s t e n c i a l e p c E l m i c r o s c o p i o e l u z p o l a r i z a d a o n s i s t ee n u n u n a r e a c c i ni n n t u n ep r e v i au t i l i z a n d oa n t i c u e r p o s d c microscopio normalde luz,en el quese interponeuna rnarcaclos especficamente con enzimasconstituye c u a d e c u a r z oy u n c r i s t a ld e N i c o l e n t r e l a f u e n t e l a b a s ec l el a i n m u n o h i s t o r u m i c a c n i c ah o y d a t, de luz y el ojo del observador. e s e n c i a l n a n a t o n r a a t o l r q i c ab i o l o g ac e l u l a re e p , Algunassustancias identificables con el microsco- inmunologa (vaseposteriormente). pio de luz polarizada son la colgena, queratina, susP e s ea t o d o l o e x p u e s t o , a d e t e r r n i n a c i n e l a l d tanciaarniloide, slice,asbesto, cristalesde uratosy activicladenzirntica un ttiido todava conserva cle otras muchas sustanciasespecialmente origen vigenciaeu: cle (figs2.7y 2.8). exgeno 1. La biopsiaclentsculoesqueltico. 2. l,a iclentlficar:iirn r:lrrlas sistemahematode del Histoqumica poytico(iig. 2.9). 3. Realizacin estudiosneurohistolgicos de comLahistoqumica unaciencia combina que es histo- plejos. I

w#k
Figura 2.9. Alfa-naftil-ocetato y esterasa monocilcs suspreen cursores niuelde unaextensin o de mdula sea. La actuidad de. enzimticase plso ntunifiesk' medianteuna sal de diazonio (FastRed) quepor accinde la e.nzino .sobrr:.su substrab se azob transformo un coloran[e en c.od<z coktr rojo brillante. fr*i

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Mtodos microscopa electrnica de

n L o s o b j e t o sm u y p e q u e o s o p t r e i l e ns e r v i s t o s l c o n e l l n i c r o s c o p i o p t i c o p o r s e r t n c t r t o r r lrsu e l a l a o n d a d e I a l u z . [ . a so r t d a sl t t m i n o s a s l o n g i t u dd e m s c o r t a s ,c o m o l a u l t r a v i o l e t al,i e n e n e l i n c o n v e y e a n i e n t eq u e n o s e p t r e d e n n f t t c a r c l t : c u a c l a m e l t t e a r e p r e s e n t a ru n a m e i o r a m u y l i n t i t i t c l a l t n i c r o s c c l r ( p i o p t i c o .E n 1 9 2 i 1 e lr a n c s , o u i st l e B r o g l i e 1 | i 7 5 l f debsttbatrmicas 1960) sospechque las partculas . a n e x i s t i r t a m b i ne n f o r m a t l e o n c l a s N t t e v ea o s construdespus, alemnErnst Ruska(1907-1988) el y e l p r i m e r m i c r o s c o p i o l e c t r t i n i c oq u e p e r r n i t a e , cle El enfocarondas-electrn. perfeccionanlientc la y cle f uentede electrones de las lelttesy la obtenci(rn una cmaraclevaco muy establepor donde -rasan los electronespermite alcanzaraumentosde varias aderns del clccenas milesde veces.Actualmente. de d lr n r i c r o s c o p i o l e c t r n i c o e t r a n s n r i s i r r o,s n t i c r t l s e c o p i o s d e b a r r i d o y e l m i c r o s c o p i oe l e c t r n i c od e e x p l o r a c i np o r t n e l p e r m i t e n a l c a u z a r l m i t e s molcculares. tielectrnic.os Existen dos tipos de microsr:opios l: l e s e n m o r f r p a t o l o g a ) d e t r a n s n i s i n ,m u y t i l para la observacinde las estructurassubcelulares, , y 2 ) d e b a r r i d o o d e " s c a n n i n g " q u e i n f o r n l ad e l a y m d r r r o r f o l o g ie x t e r n a c o m p o s i c i n o l e c u l a r e I a s a t r s n r < : l r a sa n a l i z a d a s . t u perrttite La ttticrutscopa de electrnica transnisi(n a i r r l r : r t av a r i a sd e c e n a s e m i l e sd e v e c e s .l , a p r e r d precisauna ptintafijacin rk: laracirn las muestras y finos,paraperrlcl nraterial cortesextremadamente que prorectar la rnitir el lasodel lrazcleelectrones

en es fijador cleekrt'<:irn el glut;rraldehdo inla(en. I',1 y e t Lt o n t ' t : t t t r a c i o n e s r t r ee l 2 - ' , \ ' X ' tanprt fosfattl el fijaclor, tetr(lxidode tlstnio. colllo segurl(lo de rclatl lenetraci(ln e:stos rle la I)adr cscasacarat se t las f iiitlorcs. tnuttstrtl, esttltiirr cortan en bloel P r l u c sd e I n l r n " . o s t t : r i o r n l c n t c , t c j i t i oi n c l u i d oe n soltrc torkr el Et'tltl812,a baseclc una rcsinaplrstica, A n a r a k l i t ao l a s e t o x i r r e s i n a s . c c l n t i n u a c i s e r e a l i r z a n c o r t e sd e 1 n r m d t : t : s l t e s o c o n e l u l t r a m i c r o l o o t t r n o ,q u e s c s e t i i t c : c r . , ta z t t ld e t o l u i d i n a c t t a l q u i e r a p a r a c o n t r t t l c l el a z o n a c l i l cs e v i y a rltrat(rcnica estudrar. cle Posteriorneltte a la rcalizrcin los corte:scle control r:on el ultrarlticrotomose recorta el bloque l c o n u n a c u c h i l l ap a r a r l e j a r n i c a m e n t ea z o n ad e de uo seada, getteral sulterioral tatnacl un glomr en n c r u l o ,y s c r e a l i z a n o r t o su l t r a f i n o sd e 5 0 - 9 0 r m d e c q u ls e c o n t r a s t a n o n a c e t a t od e u r a n i l oy espesor c i t r a t o r l e ' p l o m oy s e l l l o t l t a ne n r e j i l l a sm e t l i c a s e p a r as u o b s e r v a c i r i le t t e l m i c r o s c o p i o l e c t r n i c o t de transmisirn. electrnicoutilizacomo fuentede El rnicroscotio tle luz un haz de electrones longitudde onda 100.000 y habitualmente obtevecesinferiora la luz empleada de tungsteno, nido a partir de un filantentometlico m e d i a n t ea p l i c a c i nd c u n a c o r r i e n t ee l c t r i c ad e voltios.I'ara que el hazde electrones 200.000-600.000 por el tubo es necesariala realizacitindel discurra e var.:tn su interior,doltclees controladopor un sisgobernay enfoclue tenla de lentesde c<1n.,'ergencia das por ordenador. d n L a p a n t a l l a e o b s e r v a c i e s t f o r m a d ap o r u n a rronectada una cmarafotoa fluoresr:ente: sustancia

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patolgica general Anatoma

grficaen los sistemas y ms antiguos por una cltar a d e T V e n l o sm o d e r n o s r r i t ' r o s c o p i o s . r Los tejidosmuestranuna distribucinirregularcle la materia,que se contrastacon Ia itlprepnacinprev i a c o n o s m i oy p l o m o ,c l ei o r m a c l u ee l h a z c i ee l e c tronesal atravesar objetoquedarretenidopor las el zonasdcrnde existemayor densiclacl por el c{)ntray, rio, pasarlibrementepor las reasrestmtes, hasta i n c i d i r s o b r e l a p a n t a l l ay o r i g i n a rf l u o r e s c e n c i a r e s t e n i v e l .T o d o e l l o d e t e r m i n ac l u ea l o b s r : r v a r l e objeto aparezca juegode sonlbrasy fluoresccncia un v e r d e b r i l l a n t eq u e c o m p o n el a i n i a q e u r r o y e c t a c l a e l f o r m ad e s o m b r ag e o m t r i c a e l t e j i c l o [ ] o r n ol a d . i r n a g e n s o b t e n i d ap u e c l e e r l i g e r a m e n t e l e f e c a s r tuosa,el dia(nsticoo anlisis clefinitivo la rrepade racin se hacea partir de las foto(rafasen blaucoy ( r r e g r of i g . 2 . 1 0 ) . L a m i c r o s c o r a l e c t r n i c a s u n m t o d ol e n t o , e e c a r o y l i m i t a r l oc l cd i a q n r s t i c o n a t o n t o p a t o l ( r d i c o . a Las arlicaciones rnlsinrtortarrtes anatclnta en tato- Figura 2.11, Irnogt,n,tltrnt,slruclurul un he.patocikt tle. lgicason el cstuclio alqultas cle enfenletlarJcs croui- donde ha trlentific:udr se ttt'dionle inmunocitoqunrco crn c a s c l ed e p s i t o , a l o c a l i z a c i n e r l e p ( r s i t o is n u - rtrrcoLr.idal ctntqt:ttoore tlel uirusde Ia hetatitis l d n t el B. i n e se n l a s g l o m e r u l o n e { r i tysl a c l e t e r r n i n a c i n l a Puedc que upreciarso lt ttrt.yor de ocunulocint;irttlocurre elulury se de,tnue,slro Iu pntal nuclet,lt p<tr h i s t o g n e s i d e a l g u u o s u r n o r e s l.. c i s n c o l t v c n i e r r - en t.<:cinrlotl s t i que rle elet. c tes nlsimtortantcs microscoltio clel elcctrrnico son st'rtt:tct torlcLtlcs lnttlens(rs correspontlenoro It tt yt el r:xccsivo tienpo que rcquierela 1-rreparacirin las cr iLl I rle si fodo l),)r f ij ocin rlel anl i cuerto.sr:cri1c, de quere.t:onoce srttrc prttrtrtrict nrurcor t,l sit o! m u e s t r rls ,s d i f i c r l t a r l e ( t < ' n i c a t a r ar e a i i z a lrt r r c - r nrurt'url; a ts ls (nlUrt ). n o s c o r t e sy t i n c i o r r c s l a e s c a s e z l t n t a t e r i a c r r r . t y r l p r r e c l e s t u c l i a r s e l er : a t l ar : a s t t l.l c r : i c n t c m c l l l e t : e c s e s t h na p l i c a n d o c n i c a s n u r r u t o t : i t o q r r n l i c a s r - c a l r r l o o s a n t i < : r r e r rc o n o r o c o l o i c l ao p r o t e n a t i nta l os l A p a r a c o n r l r i n a r a e s p i ' < : i f i c i c l a de lp r o c e c l i n t i e n t o l cl irununer;oncl alrrlisili rrltr;icstrttural las lesir-,rres de ( fi q .2 . 1 ) . l l.a rrtic tsr u t'It,r,trtitt de barridoprcticarnenrr op ica p a t e n { rs c l r a u t i l i z a r l o i r r . r : lr l i a g n i s t i c o .u n q u ep u e A dcn obst:rvarserr,.r.1:; rlucll< mayoressobre el cont o r n o e x t e r i o r l r ' l o s , b j e t o sc u e e r m i t e n i s u a l i < r , p v z;rrla ccrnrposicriixl la.srrlrerficie dc celular(fig.'2"1'2), r s r i l a m e n t rs i r v e l t r t r ; r i l l t r : n e r n f o r n r a c i n o b r e l a : i s e s t n r c t u r a l e l o b j c t o; u l a l i z a d o . s t a l t i n t ai l l f o r m a r E c i n c o n s t i t u y ee l f r r n t l a r n e n t c l el o s e s t u d i o sd e m i c r o a n l i s ils a r c o r ) ( ) ( - tl e r o m p o s i c i n l n i c ad e ac i ) t l a sc i i s t i n t ae s t n r c t u r a s u b c e l u l a r e s . s

Mtodos inmunohis toqumicos

Losntorlos inrnunohistoqumicos comprenden todas paracletectar acluellas tcnic,s sirven clue anti genos r:elrrlares o tisulales, basndose reacclones en antgeno-antir:rrerpo. ['aravisualizar lugar el donde ocurre reaccin lr antgeno-anticuerpo serequiere emplear trazador marcador. marcaje un o puede El IO

Figura 2.10. Ilicroscr.tpa eleclrrtnic'ttde urt iutor tie vr,/ctrthin de lo glndula sctliuar. ostr.'rr reL;rstinietnto ^5'e el tle, cLulas oncocticascon el citoplasnto rt:plt:lo tle nitocr.ndriasy clulaslinfoidesett el cstrotttu I I.JStt (x ).

en \ttoclos patologa 23

lizadosestnel naraniade acridina,el ioduro de p'6para pidio y el bromuro de etidio paraDNA,auramina y fluorescena ficoebaciloscidoalcoholresistentes, para y ritrina para inmunofluorescencia tioflavina'1' amiloide, sustancia de de El estuclio la fluorescencia una preparacin s h i s t o l g i c a e r e a l i z ap o r m e d i o d e u n m i c r o s c o p i o equipadocon una lniparade luz ultravioleta' un Canclo fennlenositnilaral descritoocurre al con Ittzvisibley la liberacitt iluminar una sustancia de de energase procluce forma gradual,prolongnd d o s el a e m i s i nd e l u z d e s p u s e c e s a rl a i l u m t n a recibeel nombre'le fos: cin del objeto,el fenmeno microsut' forescertcia, ntetliunte Figura 2.12. ImogentridimensionoL introfueroL Lastcnicasde inmunofltrorescenci4 pa electrnica barridode una clulatumoralde enferde en i94l y desde y por cluciclas Coonts colaboradores en medadde l{<tdgkin cultiuoctntttttt. e a a e n t o n c e is e h a n u t i l i z a d o r n p l i a m e n tte n t o l l a t ' a l t c o n l o e n i n v e s t i g a c i nr s i c a ' c l i a g i r s t i cc l n i c o o rntco t d c r e a l i z a r s e o n f l u o r o c r o m o s( t c n i ( r a s e i n m u n o - I l s i c a n r e r t t c n s i s t e te l l p o n e rd e m a n i i i e s t o l d q e n o se n l o s t e j i c l o s o r l l t t : t i i o e a n t i c u e r p o sn a r p f l u o r e s c e n c i a )e n z i r n a s( t c n i c a si n m n o e n z i m t i , o con flucrtscetla fitloeritrina. d c a s ) ,i o n e sm e t l i c o se n f o r n t ac o l o i d a l( t t r n i c a e caclos nciu La inn'utnoflttrresce direda es la ms sencillay o i s t o p o s r a d i a c t i v o s .F , l a l t t g e n o innuno-oro) consisteelniltcltllartluranteun cortcrpr:rotanto lor marcajetlirecto del anti- hrllitLtal: puededetectarse lnarcorrespondienl-e ult directas)o utilizanclo nltodode do el telirlo con el artticr-rrlrl)o cuerpo(tcnicas q o f i t o e r i t r i n al;o s t e j i d o s u e o i e , n a r c a i es e c u n d a r i od e l o s c u a l e s x i s t e n n n u m e r a - c r c lc o n i a f l u o r e s c e t l a fluoresr:elltes' soti ftttlrtemente el contierlen antgeno bles procedimientos. tu inrlirec es m(lnos utlilizada, st:enr:ia La ittt rutnrflttcrtt t i e n e n t r l t i l . l l els o s i b i l i d a d e sc o n s i s t ee n aun(lLre l : de la estuciiar prescncia trn anticuerpoo ull antteno Fluorescencia i t i s u l a r p o r m c c l i od e s u c o n j u g a c i nn i c i a l c o o u n anti' con r'ln v no e s u n a f o r m a d e l u n i i n i s c c n c i a anticttcrpo lnarcaclo llrlsteriormente La fluorescencia n q u e s e p r o d u c ea p a r t i r c l eu n a f u e n t ed e e n e r g a o trmica. a a L a f l u o r e s c e n c i p r i m a r i ao a u t o f l u o r c s c e n c ie s cle sustancias forma la que presentandeterminadas p d e s p n t a n e as i n n e c e s i d a d e s e r m o d i f i c a c l a s ;o r , ( fi g ' 2 . 1 3 ) , d l e j e m p l o , a l m i n ae l s t i c a e l a s a r t e r i a s La y lpidos,Iipctfuscina tetraciclinas' idencolgena, por sustancias, tanto,es relativatificacinde dichas q . m e n t es e n c i l l am sa ns i s c t i e n ee n c u e n t a u ec a d a u n a d e e l l a st i e n eu n a c o l o r a c i ne s p e c i a ll., a a u t o puede observarseen cortes de congefluorescencia en lacinposfijados etanolal 95%,sin teir. En aquellostejidos que no son autofluorescentes -fluorescencia secunse puedeinducir fluorescencia con molculas dalb- mediantetincin histoqumica lluorocromoso uniendo denominadas fluorescentes dirigidosfrentea antgea attticuerpos fluorocromos se en nos tisulares; esteltimo itroceclimicnto funclaL m e n t a n l a s t c n i c a sd e i n m u n o l l u o r e s c e n c i a ', o s f l u o r o c r o m o sp r o d u c e n u i r a c o l o r a c i n v e r d o s a ' amarillentao roja sobre la estructuradonde se fijan nrsutifiuorocromos (Fig.2.14). Entrelos colorantes

de omarillrt lasfibrasel(tsFigura2.lll. Autr:fluorcsct:tciu tle tiiasreduplicadns nanerttpatollicaen el cursr'de la artea que miointimol se asocia hiperten:tin hiperplasia rrul.

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general patolgica Anatoma

pueden emComo trazadores cromgeno. denominada la aunque msutitiposdeenzimas, plearse distintos alcalide seguida la fosfatasa es lizacla la peroxida:;a, 2^15 na(figs. y 2.16). para primarios indispensables la Losanticuerpos al reconocen antgeno tcnicas de aplicacin estas y ser problema sobrelostejidos pueden de dostipos y policlonales anticuerpos anticuerpos diferentes: monoclonales. que policlonal, esla nica A travsde la respuesta en fisiolgicas los seres posible bajocircunstartcias de millones vivos,un animales capazde elaborar que de diferentes anticuerpos reaccionan molculas presentes la natuen de conla mayora losantgenos se macromolecular intro un Cuando antgeno raleza. y protluce respuesta proliferala duceen un animal B de clonas linfocitos quereconocen positiuaquedemues- cinde varias Figura 2.14, Inmunofluctrescencia caila unode susdeterminantes especfica de copiloresen ngregodos IgGen uno glonrc- de forma tra depsitos de es El antignicos.resultarlo laproduccin unagran rulonefritis membronop roIiferuli ua. que en de variedad anticuerpos difieren tanlao, se y A carga afinidad. estetipo de respuesta le denopoliclonal. fluorescena.La inmurlofluores- nrina cuerpo marcado con de pr.,t.o,la obtencin de un Desde runto vi-sta de cenciase realizaen cortes de congelacin teiiclo se realizainmunizandoiln no fijado.Estastcnicasson habitualespara el esttt- ntLeUelpf6-pafi-sl9t1g-lc puri[iespecfica con husped urtarnolcula e s c l i od e i n m u n o c o m r l e i oy d e a n t i c u e r p o s l ) l ) i o p - animal el (inmungeno) ll tlttt:seencuerttra antgeelt y (fiq. cou glomerulonefritis 2.14) en lriolr- cada siasrenales !)l anticuerpos. obteuer al si s s i a sd e p i e l c o n e n f e r m e c l a d e ss t r n i c ad e o r i q e n no frcnte cualse prr:tt'nde frente al humoral ttna desarrollar restuesta c i n m u n o l g i c o .M s r e c i e n t e t n e n t e o n s t i t t l y e l rl a aninal que egeno, iencl anticuerpos se pL o irr rnunl rrttcltrc basedel estudiodel contenidtde l)NA irltrantrclear y ei sangras obteniendo retalizarttlo la superficiecleltls lettt:ocitos denrecolectar y de los antgenos'de cle clonas cluprodut:e numerosas El suercl. animal mediantecitometra cleflujo. de es tura cacia clelascuales capaz cie ms importantels la innlu- lasplasmticas, Los inconybnientes diiecon un cle son nofluorescedcia la necesidad ttn microscolio producir atttictierpo tlnaespecificidad presentes el etr parat:acla dt:loseptopos ttno equipadocon una lmparaespecial,la dificultaddt: rer)te que inrnungeno. ya precisadel marcaje, observarla localizacin presentan serie policlonales una anticuerpos [,os es por concepto la tcnica inmunofluorescente tn o diagnsticoteraen que impide visualizaradecuadamen- de inconvenientessrrentpleo procedimiento fondo histolgicosobreel cual se ha producido putico: te el ya deresultados, que de 1) Falta repro<lrrctibilidacl y luminoso, el hechode que nicamente el fenmeno a vara unosindividuos otros de inmune pueden estudiarse muestras de tejido fresco no la respuesta e de la mismaespecie, inclusotambinpara un fijado. en clel dependiendo momento que mismoindivicluo clel la extraccin suero. serealice que limitadas depende 2) Obtencin r:alticiades Inmunohistoqumica inmunizados. dende loslotesde anintales de La lrboriosa. purificacin un 3) Purificacin principios losaos70sehanido introdude Desde con absorcin molcunediante se de de nuevas tcnicas objetivacin la presen- antisuero realiza ciendo para al a afines lasempleadas inmunizar en basadas la posibili- laso clrrlas en ciade antgenos losteiidos, a eliminar losanticuercomoobjetivo a un dadde unir qumicamente anticuerpo un enzi- animal.'fiene no cruzada especfica. posquereaccionan forma de del maqueactacomotrazador rnarcaje. determinantes discriminar antgeno- 4) Incapacidad Porestemotivo,el lugarde la reaccin rara molcudentro unamisma de diferentes al aadiendo finalde la reac- antignicos se anticuerpo visualiza policlonales no Por la o clula. ello,los anticuerpos cin el sustratode la enzimams una sustancia,

L2

en Nftodos patologa 25

s que se r a t n ; l a s i n i n u n o g l o b u l i n a q u e p r o d u c e s o n d e l entrelos antgenos diferenciar se pueden que nismotpo y con Ia mismaespecificidad lascodiclula" de en expresan la membrana unarnisma p l i c a d a s o r e l l i n f o c i i oB . monoclonade Latcnica obtencin anticuerpos de lesfuedesarrollada Khlery MilsteinF,lobjetivo iror c ei era en desu trabajo un principio estucliar mecatiis- E l h b r i d o r e s u i t a n t e l cl a f u s i nd a o r i g e n ,t l e s divisionos.a lln clcrnen el que todos que las de rnoderegulacin losgenes cociifican inmu- pus de v;irirs secretanei ntisttltr celulares los hbridos que k-rconstitrt-ven fusiones Para noglobulinas. ellorealizaron Se es murinos. rnieloma un tipo de tipo de inrnunoglobulina. puededefinir,pues' un LIn mielomas entre conoel productoOaunuscrla plasmticas; por algunos anticuerpomr-noclonal tumorconstituido clulas de secretoras inmunogl<;bulinas' inmunoglobulinasclona de c[Lrlas de de ellossoncapaces producir -mielomas es el secretante.s-. Cuando mieloma secrev L a s p r i r t c i p a l e s e n t a i a sd e l u s o d e a n t i c u e r p o s la un tanteproduce nicotipo de inmunoglobulina, son: frentea los lrlliclonales quelasclulas tumorsonde ori monoclonales del causa elloes de genclonal, decir,rrovienen una rinicaclula de es y 1. El anticuerpomttnoclonales ltomogneo, nr-l rnaliJna. quesufrila transformacin madre illmucon de y una realizaron fusin vara,a diferencia los policlonales, cada En 1975, Khler Milstein al realizatla animal. o y murino losesple- niz;rcin sangra de entrelasclulas un nlieloma purificados 2. No sr: requicrt:ttl uso cleantgenos (linfocitos procedentes bazci) un ralrll del de nocitos de a para las irlrnunizaciones;l)r)sar ello se obtiencn l,ts cle inrnunizado ltenrrtes carnert.'. cttitivos con cle st' de resultantes estafusin denonrinatl anticuerros granPureza. celulares puedenproporciottar irtrnttttoglobu- ll. Los cultivosperrnancrrtes y soncapaces producir de hibridomas tle en quereconocen los antgenos ttnttleaclosla el arrtir:uerpo forma ilinlitarla. a linas irmunizacion. reaccionan los Conroes biert<:onot:irltl, antgenos [,] hibricloma tiene dos propiedades fundanienclLlca stl vez tienen determicon los anticuerilt-rs, tales: s n a n t e sa n t i g ' n i c oq l t e l t l s l e r n t i t e n l o d e r a c t t r a r corl tltros anticuerpara reat:ciottar L Capacidacl crecimientoilimitaiJo, de rroliade conto arttgerl()s de casi ilimitadas; t'atlr:nas fcrtttar (enornade pos; assc prteden las ctuiastumoralesy que proce(kclel y antgenos anticuerpos.lrl marcaiedel ltimo antila clulactelmielomamurirro. tl cr;ntolosfatasaalcalina perocle 2. Capaciclael sntesisy secrecirr inmuno- cuerpocortun t:nzitlia fle dcl globulinas, que poseematerialgen.tico linfo- xidasa,que tenga la prollicrlad de inducir una reacya como la en inoculado al ci(rncolrireada un sllstratodettlrrninado cito B sensibilizadofrente al antr{eno

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neotls dt: 2"I6. Irununafincitt Iosrnelanocitos F'igura especfica el entpl,:ondo anticuerpo nelaru>ma c,x ,t,.n t e HSM1:; .v- i ntoil o de estrep toui d i na'bi oti na-fosfataso Redquedefi:cn dL: ulcalinart:uclr-rLltt la suL tliazonio Fast en ne unacolorocnroitt brilLanft: loslugaresde fijacin del antiurcrpoprirnario.

',i." i

paro cromagrantru r: t:n frlgura 2,15. Inmunotitcin d rt I Itttt: de Langerhans p ancreti co r cuIi'-. t"lrt;e i it ttl,' c I t tt( | tx Io tlt: eslrep tauid i na-bi <ti na'p e rttx i dasa ), reue!qrlrt que prtrdo' (an diantinobencidino de-fine coiarucin una prt' il(Hruz(a e.n los luqaresde fiiacin del antiurerpt:t nnrt.

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patolgica general Anatoma

vroi

BIOTINA

Figura2.17. Esquerna Io reocde por , in de inmunohistoqumica el nttodo La de peroxidasa-ant!perox i rlusa y auidi na-boti na. i

p d i a m i n o b e n c i d i n a ,e r m i t e l a c l e n t i f i c a c i d e l o s n antgenos contenidos las clulasy los tejidos. en Comoya se ha mencionado, enzimaperoxidasa, Ia obtenidadel rbanopicante,es el trazadorenzilntic o m s u t i l i z a d o . u e d ee m p l e a r s e e d i a n t e c n i P m t (tcnicadirectao inrlicascon anticuerros marcados r e c t a c u y o f u n d a m e n t o s s i m i l a ra l d e l a i n m r r n o e f l u o r e s c e n c i a i r e c t a e i n c l i r e c t a )o m u c h o r n s d c o m n m e n t e u t i l i z a n r l o a n li t : r r e r p o ss i n m a r c a r clas [p eroxidasa-antiperoxi a). Esteprocedimiento desarrollarlo ltor Sternber{er y cols.en 1970 utilizacomo trazaclor innunoconrpk> jos formadoB Ia enzimaperoxiciasa alttictuerpos y por especficos frentea ella ell luqarde anticrrerpcls rnar. " c a d o s .A l p o r r e re n r : o n t a c t o i n v i t r o " l o s a n t i c : u e r pos con la peroxidasa fornlancornrleios se antqenoj a n t i c u e r p c(ic o m p l eo p e r o x i d a s a - a n t e r o x i d a s a pi o c o n p l e j o P A P ) t r a v sc l eu n a r e a c < : i rd e p r t , c i p i a rr t a c i n , E s t o s c o n r p l e j o s s t n f o r m a d o sp ( ) r t r e s e mcllculas peroxidasa dos cleanticuerpo y de antiperoxidasa. Paraesteprocedimiento innunotincinse utilide zan secuencialmente reactivosinmunesdiferentres tes(fig.2l7):

3 , C o r n p l e j oP A P ,c l u e c o n t i e n e l a e n z i m a q u e actuarcclmotrazadorde la reaccininmune.

n E s t ep r o c e c l i n i e n t o e i n m u n o l o c a l i z a c i e s d e d 100a l.i)00vecesms efectivoque los mtodosindiq roct{)s iie emplean nticuerpos arcados onfluoa m c r()crt)lTlos I)erox](lrst. o C u a n d ol a t r i p l e r e r r . ' c ii n u n es e h a c o m p l e t a nm de mediante do, se rrocecle revt,laclo la peroxidasa al o dianinobenr:idina cLralquiera otro de los cromgepara estaenzima,ya que al aadir el nos atlecuados sustratonaturalde la penrxiclasa, estecasoei agua en oxigenada per(rxidr.r hidrgeno, o de ms el cromgen o c l i a m i n o b e n c i d i n a . o x q e n on a c i e n t el i b e r a d o erl p o r l a e n z i m a a p a r t i r d e l s u b s t r a t o x i d aa l c r o m o g e n op a r a o r i g i n a rr r np r o d u c l oi n s o l u b l e d e c o l o r y p a r d o( { i g . 2 . 1 5 ) . C u a n d ol o s t e j i r l o ss o n m u y r i c o s e n p e r o x i c i a s a e n d g e n a( c a s o d e l a r n d u l a s e a ) o s e p r e t e n d e m o b t e n e ru n a c o l o r a c i i i n s b r i l l a n t eq u e l a p r o D o r cionadapor el marcajecon peroxidasa posibler-ities Iizar como trazador la losfatasa alcalina. Estariltima es una enzimacapazde hidrolizarlos steresde fosLa fato en un medio alcaliLro. actividado reveladocle esta enzima se realizaemrleando naftol-ASJosfato 1, Anticuerpoprinrariomono (de ratn) o policlo como substratoy salesde diazoniotipo fast red TR o nal (de conejo)frenteal antgeno problema. fast blue BB conlo agentede copulacinpara produ2 . A n t i c u e r p op u e n t eo s e c u n d a r i oq u e r n i r e l cir, como resultaclo la reaccin, coloranteazo! , u de un anticuerpoprimario al complejoPAP(p. ej.,inmuno- co rojo o azul (fig.2.1(;). mtodoms habitualnlenEl g l o b u l i n a e c e r d of r e n t ea c o n e j oo d e c o n e j oa n t i - te empleadoes el anrlogo PAP, d denominadode la al rratn).El anticuerpo puentese aplicaen exceso, de f osfatasaalcalina-antfosfatasaalcalina(FAAFA). i tal formaque uno de los dos lugares posibles unin de Ms recientenentese han introducidootros mtose asocieal anticuerpo primarioy el otro quedelibre dos de deteccinrarainmunohistoqumica denomiparafijarseposteriormente alcomplejoPAP ya que nados supersensitivos, producen gran una

L4

I 1 t r r d oe n p a t o i o g a s

'7

i l n l p l i f i c a c i c l el a s e n a li n r n u n el,o c u a le s h . s i r :s i n o t.n t<tdr.rs mittorls los inr-llrrnot:nzintir:os utique s e c o n s i d e r a u e l o s p r o c e d i n t i c n t om : ;l r a b i t u a l : s l i z a l t r : l l ) r u c e d i n t i r t n t ol e a v i . l i l l a y b i o t i n a p a r a q s r s e r r a c t i c a n o b r et e j i c l o s r r e v i ; r r n e r ri t e i u i c l r lr,;: t ron rir:nrai s nc er iliest o uila rcacciinantgeno-ant icuery d o n c i eo s a n t g e n o a d e n l o s t r a rl r u i r j r r po r:sro.sibkr l s i l)arafina s realjzr nrarcaje el r:onbictina antidel c n q r a r lp a r t e c l e s n a t r l r a l i z a d o s r a r i t t : l li ) r ( ) c e s a - r i r e r l ) o r r i r n l l i r ; t - : c l i c a l i r c c t a( - 1o q u e e s m u c h o du c c ) l, f n r i e n t o i s t o l r g i c o . s t et i p o d e r n l o r i o s l e e l e v r r l a n r s l l ; r b i t r r irll,e l r l l t iltl e r l ) o s c c u t " t d a r i ( t c n i c a h E r o s c n s i b i l i d a s e b a s a ne n l a g r a na f i n i c l a cp r ee r r t r e r r r l i r e c t) L i r i ; r s r ,l i o i r u r t u n o l t i r i cn o r r n a l r i l e r t r ' d rl t s a a f l l ) o s e e na b i o t i n ay l a a v i d i n aq { t n ea n d o u n f u u r t e i r n t l i t ' a p l i c r r r l rt r r i t r i r i r : <o ca v i r l i n r t r a z a c l o r r j l v cnlar:e o inmullc. n ( t l l z l n l i l io t 1 t t , l ' r r r i r i i r sf,o s i a l s rl t a l i t r )r( l u ( . r ) n ( ' i a l . a a r t i d i n a s u n a { l i c o p r o t c n a e a l t o r e s o r o l t , I t ' t t q at t q i r r r . s' .l r r i r lri l t r r ' .rs r r a v i t l i l r a e (l d n l , l l [ ) i l . rr ] u ( r c t r l a rq u e e s t p r e s e n t te l l l a c l a r at l e h u e v r l a b a r : , s f ' l ) r o ( l l l z ( l; irrl t j ; l ti i r r r o l l n ' r ' la n t i c u e r l xr), r ' ltl r r l . r : y s tlria .llrr:ptont,vcr:s j ctr;idirii: este ltinlo caso. ir r i l rl l i u t i nl r i r j i{,r r t r ' t o ( r oe lr : o n r t l t 'a o i d i n ;lr) r i t r l t . r eli li jv r r r o l : < : u e c ' i l t ea d e n o n l i n a c i i rrne e s t r e p t a v i t l i nv rla l l , \ f J () r t , s t r t , l t t a i ' r r l i r r a - i r i o l i n ai- S . 2I.i 1 7 ) l k , e s t r , . li, .A a r( i r r t ' s c r r t a l i . f l i l l vs ' n t a j i r ss o b r t , : a o l t t t l r r i i l tr t , l n r r i ( l ou l { i . u l r r l n t ( , r ( ) l r n o l i r c r r l t l s l t i o t r r t p r , i e j , rl ae a (' I i r r t ' v o , ( ) n t o ( ) n u t a r t : r t c i c l t , r c s i r l r l o si ( o s l r ' ; - r l t r rr r l r r s ri' r ni r r r l r ( r , r [ )i ( ) io . r l et a l f r t n t r r l r r ea s s a ol r .r i r t a l r r l r r s v I ) o s ( ' ( 'u 1 l ) u n t oi s o t ' l r ' t r i t r or , r t r o:.l l r t z i r t l I r z ; r t l r ) t ' r l I t 1 t ( r l ( , t l ) ( ) S J t t \ i r , l t , V a C i a . f , S t r I l t t i t , 't l r ; u n l r r i ( ' a s o si.a l l r o l < ' u e tl i rf o r n t a r l lro r t r r ; t l r r r r l L r c ; rs t . r t s r l l l i r r l lrrlrtl, i ' s t ct i l r tr l c r n c t o t l r s r ' r1 t u v s l s i l l srri r ni t i t l a r l e s r i ei o r r r t a n l J l s tn t ( : l r r ; l i t , r t . i ai r r ; r l t r rv t, L el r ; rt r r r . , l i r r r t i r : r r r , r or i r r t a r i o1 t r - i t ' < 1 a t lt 11'r,l r r nr l l l t r r t ' q i o r r e r i r l r r l r i l t i rr:l ,i u r r i r ll,lr r rl a l r i o - c t t t l l t ' a r srt i L r rt,l l l u i t l r i . o ls r s ,
|ilt;I.

l , ; rl t i r r t j t ( ,isu n i r , ' j l a n r i nr;1 r ' l l l r j o l t , s o t o l t : r ' L r l a r t n 1 o r t , t t t , r r tt.e r r t t '; r l < ' o r r r r l e i1 , ,( r ' i l l r r u i r r ;l r ) r l r r c s t < i l n c u e r r t r a t ' n l a v e r r ; r l t , l r t e v ot s t , t o t t , t q l t i i l i l f i l l Fl l t o ( ' o I t i l n t l ( ' U ( ' r l ) ( )v ( ' i l z t l n i l st r ; i z a l l o r ; r s s : \ t r n r lrr t , i ; t s i n r i q e r r t ' rr r o r fo l r i r l c i i i ; s r l r ro l l j e t i v a s . i s ltot I t q ; r r s tt'l t , f r r n l at ' r i v a l e n t t lc r ( i t , r r lr st r ' r ; r l t : u i r l l o , a s l l i n t e r ; r t ' l ; r t i r r r r tr. l t ' t , l l rs t , l t ; r i ' r , ' es L r l t . i c l i v a r y, s s o t r r r l t o t u l < t t ' r t , s i c l u o s t n n t r x i c i r l o r i l r z t - i r ' ; l l -tti 'i s rl a s ( , r o r r . i r n t os o r n e t i r,i r ; r r r r r i l t i p l t s ' r r o r e s .I r t l r t ' l J t l,a . v t. r r o lt , i r u r s r { l i c o l l r o lt : i r r s , . nt ' s t t , s c l t ti r l o s r ' ( ( ) ll : , r . 1 t ' i r r l t ' i l c i r r c i t n l r l o r r r ; t r o l i r q r t : a r : l u a l e s il l r f a l)ror i t r a r l u r :l ) r . l ( i ( l e l n i r s e l l a s t a 1 i r { i)i o l r r r ' u l ars i ' l r i o ut l u ; i ) ( r l (i { ) n i l t - l A t a l o r r ' r I t i r l a rrl l t ' r l ' i t 0 r o b j e t i v o st l u e t t i n a r u r as o l a r n o l t i c t l t l t ' a r r t r c t r t , r l o . a ( { ) n ( l u r c i r l t ; i l l r t i l a q n t j s t i t ot ' r r r L o A l lartir rielOs l ) o r o t r lD r r t t ,l , v i ti lt r a l l t r e r t , r . o r rlrl i l t i l r s ( ,( . () \ . i - ; r l i s , \ 1 )\.' a u n ( l i l r ,l c n t a l n e r t t es r .] t r ur l o i n c o r l r i r a t t a i . l i I t ' t r t e u r t : n t ta l l u a ( r ; l r v a r i c c l a <r l r l r o t e i n a s .{ l t r . o - r l o l l r r o c c r l i r n i r ' r r t ors i { i t a l e s r l c l t r e d i c i r i nq L l e l / a s . l ) r r t r : r r ay p o i i s a c r i d o s! a l r l r o c o l o i < l ; r lA u u r u e l r ; l (r ' i t l ) ( ) . s i l ) l r 'c;u a l r l i f i r ' r t ' i lrlr r l o l n i l i rt' la n r r n r e i c l r { ' o n l ( )s e l l a c l i c h o ,t a n t o l a a v i c l i r r :to l n o l rl r i o t i l t ; r r { ) s o s t I r ls t l ; t r t ' s . ' L J)Arillrr,,tr: .r l ) u ( t ( l n u n i r s e a a n t i c u e r p o s o l r r o l r . u l ac s r z i r r r i r t i . e | ) c l o r n l i l q r , n I r : L i . r l d O sC : ; l o s l t . 0 r : e c l i n t i c n t O s [ sC ( ' i l s ,e s l a l l i o t i l l a l a c u en o r m a l m r l l t t s e c o n j u r l a( . o n l ; r s a n r r l ; r e L i i l i z ir <r rr i t , , u t ; r l j z l r r l o r els i r r r g e n e s ri r e I o s l l r i r n i t r o sd e l l i r l o a s u p e r u e r i ot a r n a o . ( f i r l . 2 . I 8 ) r r i el r a n s u s t i t L r i c l oo s c r i t t : r i o s n l o r f o l t i q i l

ra Citomet I' citofluoronletra

S I S T E M A EA N A L I S I S E I M A G E N D D

VISLIALIZACION EN TIEMPOREAL

*-*-.'*:-r_* DIGIT,LZACIOAI Y Pfloc:E:-;LMi[-NTO l''lgrrrrr 2.tli. Iirtritctrnie.nto b,isitrrrttlizrttlor t u tlt' tttt dilitol dr.z int(r
{r/lr'\
L._
,.{l:-'

::-

AI tIACENAMII--NTO

28

patolgica general Anatoma

por cossubjetivos parmetros morfomtricos ms lo objetivos, cual,y en conjuncin el continuo con progreso lasciencias y de biomdicas, fsicas de ingeniera, han transformado citologa una nueva la en disciplina conocida comocitometra. puede separada citometra La citometra ser en: que esttica microscopio o digita!, tienecomocaracprincipalel anlisis las imgenes, la y teristica de microfluorimetra flujo (citometra flujo),clonde de de y la imagen obtenida secundaria cuyo procesaes por miento caracteriza su rapidez. se general, citometra Deforma en esttica posible es plantear anlisis lasdiferentes el de en estructuras cuatroplanos diferentes:

L Morfometra. Consiste la descripcin en cuantigeomtricas las tativa de las caractersticas de estructuras existentes. 2. Planimetra. la medida lascaractersticas Es de geonrtricas estructuras dosdimensiones (2-D). de en 3. Estereologa. Hacereferencia conjuntode al que los mtodos matemticos calculan parmetros tridimensionales un cuerpoa partir de la extrapode lacin lasmedidas obtenidas unao dosdimende en siones. de Analiza cantidad materia la 4. Densitometra. existente unaestructura partirdela informacin en a proporcionada la mayoro menorconcentracin por que se de un colorante de formaestequionttrica cleposita sobre misma. la

puede inforrnativo unaimagen El contenido de ser la analizado cuantitativamente mediante medicin fr de la sealprocetlente unacmara vdeo.Esta de de u#ry 1 diqitalizando la rnedidase efectaqeneralmente seal vdeo. de 1fi y l,a operacirn rnuestreo digitalizacin la de de seal vdeoequivale la subdivisin la imagen de a de pxeles. elementales en un tablerode reas llamadas ciaclo nnero nivelde gris, A cadapxelestasr un o qu corre$pclnde la luminosidad punto que a del y por representa esindiviclualizado lascoordenadas * que espaciales le curresponrlen. ffp si rfi que l.a prinera ilrtervenr:in puederealizarse sclbre una image'ntravs un sistema anlisis a de de Figura 2.19. [mogenrligitalizudaen blonut y neerodt' ks automtico la aplicacin determinadcls es de operancleos Qnglomrulo de renul IerTidts hernatoxilina dores crtn "filtros" conque matemtit:<s rlenominados de Mayer. r tribuyena mejorar nlodificar algunos aspectos de por la imagen inicial. c()rno ejemplo mejorar lumila nosidad, resaltar algr-rnas tonalidades grisprovG de y cando realce contraste eliminar su o determinados no contaminantes deseados. [,]concepto segmentacin unainragen de de hace referenciala seleccin componente la misma del a de queva a serobjeto anlisis. la prctica, de En este procedimiento consiste aplicar a la imagen en un por umbral (threshold) discriminacin el cual de todoslos pxeles situados dentrode dichoumbral son considerados comopartedel objetoy el resto sontratados comoruido.Enel fondo, todosereduce los a colocar pixelesseleciionados blanco los y en rechazados negro, lo cualel resultado en finales ror unaimagen binaria dostonos(figs. y 2.20). en 2.19 Aunque parece ms estafasedel procesamiento la Figura 2.20. Imagenumbralizada(segrnentoda), obteniy lo da de Ia.anterior y a partir de Ia cual e,s posible realizar simple, en realidad es,la mayorpartede los pro anno resueltos anlisis imagen en de radirecuento automtico laspartculus de seleccicnades, blernas su morfometroy el clculo de lo densidadptica del DNA canen el proceso segrnentacin. es debidoa de Ello quecontrcnen. que la limitacin experimentan mayorpartede los la

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en Mtodos patologa 29

FOTOT\4ULTIPLIOADOR

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del t;lgura2.21. Esquema canrtl rlt, iltr1otor drtndecirculQttlos de t tslukts un citmt:trr fluic. en

Separacinde Ia muffi sus caractelstt seqn

S.Htutlto

m ( r-le $isfernaspara realizarla seqtnt:lltat'it la iltaqetl n i v e l t l t ' r t ' s o l t l n r i t r v o i r r n r i ' t r i i : a ) s e l c v a d r lr e s es F,sto postptica clsica' to al rlr:la lllicrt$t'oria icos. puralnente automl p()/ pr()cedilTrientns rt:c d qelleral.lil seq- b l e g r a c i a ra l t n e c a n i s m t l t ' f r l r n a c i ( x ld e l a i n t a g e n i y de f<irrna Por el motivo expuesto <:ottfri<"al cle"scanning''. listrr r m e n t a c i ) nd e u t l a i n a g e n p u e d er t : a l i z a r s el e t r t r s en rrlmit'rr$t'rpitt etl a< [:,[ 1'1[u semiaul()nt(t[r'6 LraratliEllta lr-rl lt; rttese refierea la aplit:atlistntas:interat:tiua, l<rrmas y rltl l L m l i < : L t a o p c i n i n t e r a c t i v ap u r a t r l l p l i { ' a a i n l e r ' cirnde !ir:;prrx t'dinrittntos clasificacin anlisis en al rliar{nrstico patologa tle err aulonr;illt'r illtgeltes sobre la imagr:n del crntinua observadrlr vencin cle.screertln s los i,a lo coustiluyttrt sistenta ;rrltotnticos los pmtalla paraseleccitlnar obietosa s{rqulentar Flstos I en l os extenrli< t'trvice'v'a!tt;tltrs citoloqa. a de rtgmentacinautomtica la imaqenstrftttltlamen- Jrar r:otl dtl q r i s q t t e r r : a l t z a sislr:rnas hattrltlsarroll;trll, la finalidad reclu' sr: d t l e n l a s e l e c c i n e l o s n i v e l e sd e y elvolrl a l r i s t e t l a . [ . a s e g m e n t a t : i nr o r p r o < ' t l d i n r i e t t t t l sr : i r e l n n l e r r d e f a i s on e , { a l i v ( ) s r l i s r t t i l t u i r l cle i r n p l i c a l a p o s i b i l i d a d d e d e j a r m+.'n tratrajodel <:itotr'nit'<1. lcmlautonrticos rarapoder ttlerta la intervencindel observadrn t t t t i l r c l u i ra l q u n r sl b i e t r l s l o s t ' l e < 'ttt r t l a r l o s cllmlliar citometriade flujo sob:e basicos Aspectos lutomticamente. ' y a Flnalnrente, partir cle la imagensegmetltacla, rpicltr en de [.acitornetra f lujo consisttl el anlisis a l { O n d e s e t r as e l e c c i o n a d oa p o r c i nd e i a n l t s t l t a rle cleclulasy, por extensitr, partculasbiolgicas ji'tnrllar, es posibleobtener datos nunricos obietidentro ile ttn sisteen derlsidad inrlividualizadas susptlttsirn, que nos informansobre su morfologa, el cla- ma de flujo laminars<brt: rlrteincideun haz de ittz maneraque es Ptsible interna,de f,0mplelidacl acercade sus caracteinformrciirn C t r l a s c l u l a s p o r e l t a m a o ,f o r m a , r e l a c i t i l l que proporr:ittna cl F,l ctlya aplicaciin rsticasfsic+qumicas. instrumentoque relaliza y itoplasma fasescelulares, de flujo,se compone cit(inlctro clenominado carci- anlisis, de es [nntecliata el diagnstico clisplasias, 'ltr situ"y carcinomas un integraclos: sisteirstrumtltrles icacitt de tres sistentas cuantif invasivos; inyecciny manttioclela muestra;un detecy neoplsicas, ma de de dt: lglca loscultivos clulas a c metablicas huesrl t o r f s i c oy p t i c o d e l o s p a r m e t r o s i t o l g i c o s del lco de enfermedades p r n e d i r y u r rs i s t c m ad i g t a l i z a t l o a r a e l p r o c e s od e , de la piel no inflamatorias de se al Enlt rtrrc refiere usode losprocedimiento; l o s d a l o s . y E ! s i s t e m ac l ei n y e c c i r n m a n e j od e l a m u e s t r l y cuantitativa, con (:xcept:cnciaen patologa cl a de dc la citornetra flujoqueseexpone t:onli recilr,: norntrede ctnrrade flujo y consisteen lln tri isiir ms innovadorque en la rctttali- nlcca.rl r ir idrrrrlicop'rt:sr zado donde se ittcor' ttl llclrr, ttttorlo rle l;r a corrrt,'nza ser introducidoen rlitesiroraist:s la .rt.iril stisrt,'ttsirn c:lul;lsa analizarqlle es vel dltl c h a Esta lser confocal. ltimaosulla h i t : u l i z a d a a r : : i u n c o n d t t t : t o a p i l a rs o b r e e l q u e rtica m;t:<plu &,'Rlle un ir.cicle estrechohaz dr: ltrzobtenidaa partir de un (iuo al se biorndica arlica $;,lCnktn cn ia invcstigacin con celulartrs lt{l lserde argtin(iig. 2.21). rlc tlcltll;rrlo estructuras

ffi #0..'
?,

30

patolgica general Anatoma

.6

o +
O O N

grFigura 2.22. Representacin ficadeiciclocelular medtante c.itrme.tra fhtjo.R/ - fa.se GAG , R2 I de = fase de slnfesis;R3 = fase G2mrloss.

El sistemade deteccirirr consla(le: aJ un contador volumtricodt' tiro Coulter para (:elulares quer el recuentode las unidade$ flrrverr ror el capilar; lentesrle b) sistemaptico,forrnadopor diversae anlisis: capa('es recogery trafis c) los fotodetectores de formar la luz refleadaen urarlb,iicrrri,ert'le elr'. trica.

[ . o sr . n s n r p l i a r r r ' ' r tu s a d o ss c i ne l b r o n u r o d e e t i a e rlio v el vorhlrritle'prolidio,qlle se unen a los cidos n t r c l u l c o t ' A { ) \ v \ l { N ) ,y e l n a r a n j a e , r c r i d i n aq u e s d , entreADN nuetleutilizarg(tr el estudiocliferencral i)irl'ii v ARN b..)Flu<;rocrorr(,s l)arameclirel potencialde memrr brana.<:tnullr r|anlina. r'l l-lutnocr,rrll('i sensibles calcio,colno el flo-lJ, al v a l a l$ u o l x ' ( ' r rr 1 l g l 9 1 < : ic o n f o r m es e i n c r e n r ai lo cual son mLlvutilizarnentael ( a rr'rtr ehrlar, tor rrlr dos en la invr':rf irin intracelrrlar.

lil sistemaelectrrnir:o digitalv cleanlisis datos de rr s i cl amplif iira<lores seal,un transconsta clediversos de l , a sa l l i c a r : r r . r r r tr' sn t x r r t a t r t e s el a c i t o m e t r a para corlrertir pulsris d e f l u l oe n p a lo l l q i a s o n formador arialgico-digital Ios e l e c t r n i c c re s i r f o r m a c i r id i g i l a lv r nr l r r l t ' n a r l o r .n n q u e a l m a c e n a a n a l i z a o s r l a t o s . r r o p c i r c i o r i a r r c l o i A r r l i s i st , r r . l i l r i c o i e c ] r r l a s a n r l r r n e a r a r a y i r l s ji r rr t e s f u d i o s s t a d s t i c oy r e p r e s 0 n t ao n q r f r a r J t ,l l s o l a d t , ' t t r r n r i l rj 'r rr' l r , r l r i q e ni n m u n o l r i g i , :y f e n o t i p < r o e s nt.t.rR{)i c l el a sl e u c e u n a r sl i n f o t r r a s . . le n 2 . l d e n t i f j c r c i r i r ra r l t g e n ois t r a t : e t u l a r e sn t r e e, Conxl mtodo de tirrcirillsr rlilirnfluoirx'rornos virales marcad()res d e d o * t i p o s f u n d a m e n t a l { ' r rr l o r l a l a c e sd e t n r r - lr-rs se ar)tgenos s clrre en('u('nlrar) s e a o t r a s s u s t a n c i a p a r a l r a c r r l a "fr u r r e r c e n t e . s ; u m o r a l e s . . . l s t de anticuerp<-ls a tr!'rrk" rurar.nr(rn r:or,i- lJ. Cuanti{icacir.rn DNAy deterninacindel ciclo xr ejemplo, y lenteque no alterasu capacrclarl para lrgarse anti celular,sobre torLrarlicada diagnstico pronsal al g e n ( ) y b ) l o s q u e p o s e e nc a p a c i d a dp a r a u n i r s t : tico de displasias tumores.Flnestesetttido,una de y drrectanlente componentes nrorfolgicas la transformacin a ctlulares. los de F,ntre pri- las caractersticas meros,el ms frecuentemente utilizad<l el isrttio- neoplsicaes el aumentode la densidady del tamaes que cianatode fluorescena (F-ITC), puedecombinar- o de los ncleosde un tejido por aumentode su conse con otros como la ficoeritrina(PE)o los conjuga- t e n i d o e n D N A ,u n h e c h o q u e e s s u s c e p t i b l e e s e r d d o s c o v a l e n t e s e f i c o e r i t r i n ay c i a n i n a s , o m o l a cuantificado d nrerliante citometrade fluio. c y cianoficoeritrina3 (CyPEl)) la cianoficoeritrina5 (CyPE5). La citometracleflujo permitevalorar el contenido queseunenclirectamente total de DNA rle un;rpoblacincelular,y por tanto a Entrelosfluorocromos p a r t i r d e l m i s r l o c o n o c e r s u p l o i d a ,L a s c l u l a s a estructuras deben distinguirse: celulares de tiesomlicas un organismo esamismaespecie de para cidosnucleicos, se nen una cantidad doble de cromosomas(2n), por lo que c) Fluorocromos unenestequiomtricamente cidos a los Estevalor constante de nucleicos. que se denominandiploides.

IB

e Ilitodo-s nI)rtologi

r v ic r l i a g n o s t r , l e u t r otttit i c o s r : o 1 la l l d i l n n u n o h i s t o c h ' : ( c r o m o s o m a s e u p l o i d a )e s t a l t t r a d o c l l i l i i l c h o s rilistrv.I{av'i['rt.ss,Nrrll'\irr k. i988 cl tumores.siendoentonces ntl]lerod{: cr()mosonlas clectron nli(lros}LA. F,rlanclsorr Diagnostictrartsttlission hipoploirklsi cl tlmerrr denorninndose aneuploide, I , . c o r vo f l u t n o t ' s R A v e n ' r e s r ; N e r t ' \ b r k ,1 9 9 4 e a r j e c r o m < l s o r n ae s i t t fr : r i c . r 2 n o h i i t e t r l r l o i ds i l l I r l i n i l s o tlti . , \ , i o s a iJ . A r e t l i s i i ra ] ) l ) r o a c t io t ] t e u s c ' r f s i es cantidacl superior. ( r l e cr o r t l r ri c r o : ; t t t t l l v n r l o t l rl r i l l l c il l a r v c l i a g n o srtt : l a l'alorart:elrtlar La ploicla una ltoblacitirt de [ yl rLtt:tlrl in 1 t : c l t t r i c l t r t : s s u r g i c a l p a t l r r . r l o i A . n J S L r r g ' a t b ' r l c d s e a t r a v sc l e l n c l i c e e I ) N A ,t l e f i l i i c l o t t l n ol a p r r l 11lll5;1(r:21l)'ii0. porcirtcntre el contenidode l)NA cletut;tllol.rlacirt '1.'22.).Citopatologa (tit: yel cerlular ltornttl [urncrral de r,ura xrb]ai:irin o c lir r \ t k i r r s r l l ' A t l l s l l ) i a q r r o s l i C v t o l l a t h o l < ) {i \ ' I 4 . D e t e r m i n a c i n l el a v i a b i l i d a d- vr l r r lq n t d t ti i t c , ri { S ; i i i r l r l r 'ir' " ; I ' l l l ; i r l r : l l r l rI . ) 1 1 2 . r.le ir,:tivar:irnclulasen cultivo. i, { i t sI I i s l < l t i r t l ' ett t:ircttlaltte:i 1it!lgr(1. K o s sI i , , . r , , r r 1 , ,\'f ' r l o r l lt t t l ( l cle 5. Arrlisis reticulocitcts 1 ' l r i l r r l r : l ' l lli9 l,l 2 . a l ' i , t : l r l l l l , , r , , , . ,, f 1 t o 6 . D e t e c c i td e a u t i a t t t i c l l e r l ) c Is] s t t e r ( ) . ,' , ', \i, r ,lli.l.allorattlrio ,' \ iq l r r\l i 7 . C u a n t i f i c a c i c l e lp o t c n c i ad e t t t c r n l r r a n a . n l. . ' r ; , ' i l , ( i r l l l v - l l i lM a t l r, r {,ir,,! i I t . N ' l e r l i r da l ( l ; r ' 'i r r t r a c t ' l t r l a r . \\ \,t l e \ ' , . r , r , t i r r tre c r t l ei i r i ; , . . t l l l /,r,.,, 1 ) I ) r ' l e r r n i r t a < 'rilc lri ll i r r t r a t ' r ' l t r l ; r r r r . r . r , ' s ' 1 1 i1 ' 1 ) 5'. I t ( '9 .{ ' \, ,r' \:. .
P . i lr . rl \i ,r\' l,urrrr r( fl ' - ' rrrr i Inttlu lniti*t' xltttftr l( r t i" t, \, \1, ., .kt'y ii'l' (er,ls).)r,,r, :':, l Il 'r ' j , r , ' . , , r . q\ , , , r r I f[ ' t | S : j . v 1 y \ i i i , ]t r l r ). | ; . r . i \ 1 i r i , r i , r r , l t r l r i r ; r l l r o l , r il \ p r i t c t l (a l ; t r ; t t ' r ' lrl l r 1 r l r l L , l , r . r : \ 5 l l ( l ' l ' r - r ' s :ir' . r i c a r l ol .l J f l ( ] . ( , , 1 11r , 'r l r i \ \ i i , ; r v r r ' l l , , r l i , r r l r l o r ri lt t ti \ t l a l t l t t t l;' li t l o r . r I - t r l; r n l { ' r , t r l ri'r, ' i i r t ; t - \ lf (, r ' ; t i t l l l l . N ' I t l f i , l l. i ) { i l j . 1 ls r i l o r t l t r l t i l r t ; t l i ti t i l i ; l { ! \ r ' i \ \ l i . l . r r ' i l . r 1i l ' r l r j s I \ l l ", . r '.\,1 r r i r , r r r , , l r t s l lo , i . l f \ ' \ l i r ( l ( t Ii ) t ' k k t ' r N r : l v r \,,rt ;\

Autopsia , i l i l l R i l \ ; r r l r , r c , lrin I l r , ' \ , r t i ' l r \ \ \ l r , r 1 , r i ) l . i ( ' 1 f1 i, l r i ( J f l ' l l l l t < l ' r i l i tr l l t t , r t \ ^ 1 , r - 1 r' r1\ r r t ' i r , tr r \ l ; r s s l l l l { l \ K r r r g , S \ 4 r ' r ' l i a \ 1 t \ 1 J< l , r r , ' 1r l r r \ i r 1 , ' 1 r s r t r , I l ' ; r l l rl I r , r lI 1 i 7 . '7 , i . ; I 1 , 1 ' 1 l (5 , L n n t t ' l t ' l r J . ( l r r t ' r t \ 1 \ l \ l f r " r \ 1 r , , t . ' i r r l . l , , , r r rL i t i t r \ t r t l t l t l a i r l t l l s v l l a I r l r ' , t ' r s i I lrl,t ' s 1 , r r , 1 | ' , . ) : \ ] r ' i l 9 f i i { . , i 1 8 :I 2 , 1 1I} l , r 1

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i l ' ; r l l , r ,|l 1 1 1 )ii4 1 : , t 7 l ' l l i l ) K o s s L { i i i l o u t v l o r l l e t r i t ' t r r t r ; r s L l r ( l n t e l l ttr ;1 l ) N , , \ a r l i - l r o l i r t ' r -r ' r ' l l ( ( ) n r l ) ( ) n ( ' t t l is i l t L t l t t tt tt tl l ) l ( l r s :A c r t i l - a l ; r l l l l r ; r i s i li t r n i ' a t h o l l 1 ) l 1 l l:f ) : 5 2 8 - 5 4 8 . . l , r rr { o l ; i r r t l i , \ . l : i o l r ' ( . y t o r r rl i t v l : i r s t l ' r i n r . : i p l e s .W i l c v -

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anal]sis l]vtchilFi.hnage |l 1; : f r n t l r o 1 ) S f i 91 0 1 9 - 1 0 2 I J \\'ied(i{ , []artclsf'lJ.llibbo l\1, l y :f alir i n i 1 L r a r i t i t a l ir :ty t o p a t I I r r l o 1 3 yl h i : ; t o p a t h o l c g y . v : 0 { . ,l l r r l l r ' l r Irtk} . ' l ' h e o ra n dP r a c t i < oe I I i s t o i Press,Nt'w \/ork, l9l'i() lflt 2rrrlcrl. l),atelltt li i i u n rl ' i t l t o t l E qe 0 i 4 9 7 l l a . i \ t ' o o t t r ; in . S p r i r r g al l)l, I ' o l ; i k l \ { .l m a g c n a l y s i is l l J i s t lt'r'lrnica \. t ' I l l A , I t t r l r rr l ,r \ o f It t t t t l , t t t st;t : r t r l l t s t t tis r i t Ir r : ;o
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ilI CAPITULO

molecular Patologa
de Guiu Xavier Ramn Ageras, Matas y Enrique Alava Santiago y Cajal

Introduccin gentica Estructura recombinante de.l Base la tecnoloqa ADN de y del de Aislamiento thtencirin ADN k,jtdos 'le e.n NR o reucci(tn cadena lu yilimerLtso FCR"rnsltu" {R SSCP paro de:tetkw mutarrcxwt Otrosmtodos Tcnicus hibri&xin de Southern y Northan tfnt blot "in Hibridacin situ" "h (tcnica hibridacin ritu" con F'ISH de fl.uoresr:encia; 7' n icasparo prote nas c de molecular patologe <:n Aplicaciones Ia builogtt Diagnstico molecular pobloqatumoral en Anlisis citogentico Tcnicas moleculares especficas Diagnstico mole.cular patoka inferciosa en molecular de )tras aplicociones Ia patologa Bibliogrofta

d t e l d e s a r r o l l o l t l a r t r ' r l i c a s e A D Nr e c o m l i l n a n t e getrecorr !rxla lsetfttrmedades fms' Bsicanltnte. genticos flrse tit'a r r'orrfa<'lort's in<lttrrtttentes t , d e n e s t i l r J i r l u v t l n r ' l e f i u r d o n d el a s r e r s x r t e vas clt' avart( l,ili f llormes. cotnr detia el recierrltrlefil* edtli,r ilt'l rt:vistaTheNeu'f,ntkmd ('()tl ttlr.rltcle ltttnol t,[ M+tdtttne. ol (:)lll[]leo t<:tlit:as de las tra:ars'3 lneas lo qtrelutya tto ruedett t'ulart's i c l cs e r < : i e n c ifac c i l t , cornoreceptorade toclas l.a anatorna iatolrgit'a, v turnr-ralesbiopsiastle los hospitales, las nrrrestras y y t t i t ' n t 'r l u e a s u n l i rt l i t ' h o t r t r t r t s c l i r i g i r c a p i t a l i z a r tarltc de rnoleculares, la lnayor parte dt' los esttlcli,.rs ('ottlo sabientulnorales, n<tunltiralcs enferrledadeg t'l t'nt't'rts ltt enfertnedad Qe-ntica dtr a<lents tue
yJ5 lpqt111ten humtutts

gentica tstrur:lura
q . l , a j n f o r m a c i n e n t i t : l y - t otra n t o e l c o n t r o l l t i r n r e t o d o s l o s I ) r ( ) c ( ' s ( cs l u l a r e sr,a d i c ae n d o s d )e e s r p h e t r a s l e r o l i n u c l e t i d o ( l u ec o n s t i t u y e n l c i d o A I ) N ( fl g . 3 . 1 ) .E l A D N c o n s t a d e s o x i r i b c - n u c l io o c enenrolladas de cledos largascaclenas nuclotidos, tre s. r:on un cdigo de srlo4 bases:las basesprip g . r : r s ,d e n i n a . y u a n i n ay l a s b a s e s i r i m i d n i c a sc,i a l t o s i n a y t i m i n a . D i r : h a s t a s e se s t n l i g a d a sa t t n a y l l e n t o s a( d e s o x i r r i b o s a ) a u n g r u p o f o s f a t o ,q u e sirve de eslabncon Ia otra pentosaadyacentefornlando un enlace5'-3' tliesler.Dicha unin confiere d g r a n e s t a b i l i d a d s t r u c t u r a la l a s c a d e n a s e A I I N . e genticaradica en el de la informrcin Pero la base codigo gentico,que viene implcito en la diferente s e c u e n c i ad e l a s 4 b a s e s rl o l a r g o d e l A D N . P a r a g c o m p r e n d e rc m o s e t r a n s m i t el a i n f o r m a c i n e n n t i c ay s e r o n s e r v ad e g e r n e r a c i e n g e n e r a c i n c es dicha infornlacirn, bsicoel hecho de que las bay ses entre s seancomllementarias que durante la s n t e s i sd e l A D N d e c l o b l ec a d e n al a b a s e a d e n i n a s l o s e a c o p i e c o n t i m i n a y I a c i t o s i n as l o c o n I a

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de Enlosltimos10aosr:lestudio la mayora de con enormemente lasenfermedades haimpulsado se

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il q I . au n i r l a rfl r r r r c i o r rra c l A D Ne s e l C E N , u e e s l a ( l ( . ' , \ l ) N r r c , ; r rc l a ro r i g e na u n a p r o t e n a E n r r . I)rrtc r c i l r o c e s o l e i o n l l r c r r lrrl r l a s p r o t e n a s a y u n a s r : e h qu r i ( , ( l el ) s o st l r i r v n r l ) ( ) r t i i n t e s e e s n e c e s a r i o a i s r l r t ' r r a r a( ' n l e n ( l ( 'n o s r l oc r n of u n c i o n a n o s q ( ) l r r ) s . s i l o t ; r r l i t i ( r r rt l r i n < l e p i l e d e n c o l n e t e r s e " ( ' r r ( ) l ' ( ' sv . i ) o r c o r r s i r r r i t : n tc n f e r m e r l a d ey p x F ' e, s I| c ( , s o sl a t o l a ) q i c ' o s r r i r n e rl i s o s l a t r a n s c r i r e l I t i n o s n t e s i s t . . \ l l \ ( l e e s l a r n o l r : u lq u e v a a d a jil i l l e ' r ' al r i r r f r r r n l r ci1 , ' r r t at r l c ln c l e o l c i t o p l a s a i , , t r r ; lr l r r r r l t ' s r ' \ l n t l' t r ilra sy t r u i e n aF l,n a s r r t e s i s s l ;e I r ft ' l \ R \ s t ' fr i r r r , r r r , , t r l t ' t td l n L rlte t i t l o s o r r ) c
g t i r " t : r ' t r l , t r ! i. ;r { r ' r r r , l r t i t t l 1 . ( ' o l t ( 1 O S l t f t ' f t ' n | t a S f r r l i r r , t r r . i i r. , i . r ; . , r i I r ) l ' ( i l 1 (l o t l s t a r l , t l ; r l t a S e ' i f . t , r , , t I I . r l . r t, r t , , , . r r ( l t , l i l z l i ( i t f f i l l o S it ' n V e z ( r l , , " r . r , r f , f , r , rr | - t t r ' t t t (f,) A S O t Sl tl f r t l r ' t ' l l t t ,, \rr 1rr r 1r . ir I, ir Iult:l tlt: loS filtosoiltill; ;,1 '' r ' r , \ l { N - n t c t t s a j c r os t ' . r c o | 1 . 1 . ' \ , j , r \r . . . ;.i.i, , '. ' l,i \. i ,\ ',,..J, 1\ \, r , , r , , 1 , t r ; , r| , , \ r , I r Lfr!(,Sr)tl(,St'lt,tr'ilt(i'Ati, t ' t J t i ; . 1 Sl r l r ' t u i s t - , Sl t ' t 1

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( : ' i ( t l t t o n s l l U t f l U S 0 f U I t u s t t t t ' \ t t t t ] . l t , t l t i t . , t t t , , : | , t t i , i,,' p ( t I I t t u / ) ( , t l ( ) s dE n l a s n t e s i . ' i r ,. r l 1 \ , ' r r r/ l r / r r r / r \ , , . { . / r / i . r ( t r t \ , ( ) r l e l t z t t k t t d i C i r i fn c l x t t t , . t t , t r t ) i I t i r t o r t t i ' C t l

L l i i l , l a l ) l ( ) ( l U i l l t t( l , l l t , r r ( ' i . t r , .t , t t r , f f t t i t < ' l i l l t J V r,ttr, r, I', i rt t.lt,nilftt;t . r \ \ i l l i ) l + ' t l o n r i r 'a t i a ; r t l l ; \ r r r r l ,| . r , r , , { ! r l r r i l ri l l i ) r ' s l , r , r l r i r U 1 r , 1 r r ; tf r t ' s l ) i l s i , sr l r , \ t l ' \ ( l l t r ' \ r l l ; t n .( ' r ( l { , t r r ' l r r , r l o n r l t ' l , \ R \ r l n s l , l r ' 1 r . l 'r (iirrt.ltrrrrlt,llast,(ltlrr I l f r ' s l r , i s ( ' : \ l ) 1 , rf , l ' f r l i l r , r l l l l s I \ \ r r (' f r ' , : ' r rr ' l l t t l l t ' t r , .) t i ( , ( l r , tr , r r i t t l tl ( r i r s l l t ; r c l , r1 1 r o s r : r " r r l r ' st l r f t . r e n t e s . ' r t n r s t l l ' r

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\1,\

. r ' f c o n l p l e m ( ' t r 1 , r, ' , f , , i , , . . l , r f i e d a d ) S el ll t e l r , r\ . i , ,

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!'r rr1,ilt. .', f ,,t,rrlrlt'l

, i i r ; l v { } r ai t t , l l 0 s l ) U ( , ( l t l l r
( i t s { , ( l i l - 1 1 ( '} l t } i i s ( l { ' , r r , r , r ( l r i i l .L o 5 1 1 n 1 1 ( l ( } s l L l e ; 1"

( e s t i n' n t ' l t ' i l o t l t s r l , r ( ) ni r ( ' o l ) l a ( 1 o s u i a c i o s ; u ; s vq h t r o s r i b o s o r n a s ) o r t t l l l a r r a r lA R N < l et r a n s f e r e r r l o I ( c i a o A I { N - t . i u t:i e } n ct } l as e c u e n ( : ir l e n u c l e r t i r l r r s i a c o r n p l c r n e n t a r (a n t i - r . ' o d a ) a d e l o s c o d o n e s e l i nI d (l A I { Nn r u n s a j t ' r o , e t i r l fo n n a q u e I ) u e d e n ( : r ) p l a r s e a e n t r es e l c o r l r y r ' l a n t i c o d ry p c r r n i t i rq u e l o s t r i a n l i n o i t c i ( l osse v a \ / i l n l i s r o n i e r r d o t r es , c o n f i en q u r a n ( 1 l0 p r o t e n a . a I'.n lerr:tLrra ciirligoqentico, la clcl como en todo lerrg u a j e r ,a v u n a s e r i cr l c r t : r i l a s ]c o n t r o l e s u n d a r n e r r h f posibleserroresclesntesisson enormelnent(r colrn- t a l c s c u er e ( l u i e r e n r n o r r ' l e n x q L l i s i t o a r a e v i t a r r p c p l e j o sy d e g r a n t r a s c e t l e n i : i a . i t n i ol u e r rslr v e r : / r . "!.rr1'or',rs". rle rlir'h{')s C ' tJn0 controleses reqular"curLu l ) n m e r o i r n p o r t a n t e e e n f o r n t r . : d r [rin r : t a l ) a ) j i - t l o " . " r r i l l l o " . V" c u t t t t r rs e c x p r e s au n d e t e r l n i n a d r J " d cs c a s ,t u m o r a l e s , .p u e ( l e n e n e rs r r( ) ii q e nc t ) \ i L r i l -q e l )e t t l : r sr : i : l t t l a s ,t , : ; t r o t e ' s t nl a o x p r e s i n e u n . ( t L c d c i o n e sg e n t i c a s n l a c o n r i t i t l r c i l r l c i s i : a d c n a s g , c n i s l l | l o d e I O Sr r r : c i n i s m o s s f r e c u e n t e s n i a e d f l m e d e l A D N q u e h a c e nq L t es e t r a n s i l i t a L l n ai r ) f o n n l - fornraci(rn progrr.sl(irl tumoresmalignosy otras (le y c i n e r r n e a .E n e l n i r c l e ol a s l a r q a sn ) o i c u i a s e l D a t o i o ! sF i l r r i n r e r r i v e r i ec o n t r o le s l a r e q u l a c i n d l . r
\ , \ ' r r r t o C U a n d O S ' r . o ,, 1 I , l r l ' , 1 (t 0 l l I r . , , 1 o m o C U a n d O S l | r r l , ., , ' . ' r ' . , r , , rl,i l fI ( l ( ' { \ x \ I i r l a s n t e s i . s d e A D N t l t .rr.r.,, , \ r i , r fr r \ ( . ; l t ) r l r I & s d e l m i s m r y c r ( l ilr . r { l l r , l l , l ss r r ' " , t , r l e n ".r. 1 , .: r . l r i i t & q u e l a n u e v a c a ( l e n a t l c , , \ l ) N s e i t c o r l l , ) r 'l r l n t a r i a d e l a a n t e r i o r . l l s t a n i m p o r t a n t e r l u r : r xrstala ntayor "fidelidad" posil)leen la copia y snt e s i s d e i A D N , q u e l o s m e c a n i s r n o sc e h l l a r e sd c c o n trol de la replicaci;n clel uli.srnoy de rel)aracin der

2L

35 molecular Patologa

't() l'igutra 3,2, Trsnscri7(I(itl ' durt in. En el Proceso (1+ttt;tt\ , rr.t,:trt forma ARN ttu'n.trt,''' se ittt't)sttlrktrmenteen l ( tt(){)ttt\ .n s('r'ttirui molde por(r i{t lrtl de rt(tt )n tle l<ts polipllukt' tr

de de la trairscripcin los genes(fiu ll.2) llav dos se(:uencias el ADNque ccntrolanel inicio de la transen Son los pror:ripciny que tienen gran important'ta. l o e l l l l ; i t l ( ' ( ' r s ". , o s m o l ( ) r e sy l r l s l a t t l i l a d o r e s del AD\ qut' estnadvason se<:uencias rromotores y ( t e n t e s l g e n q u e s e v a a t r a n c c r i t r i r ' r : sd o n d e s e a del de los enzimasresgtn.sab{e* la Entesis ,ARN u,rien y la ARN polimerasa otros t tnt'lotes I rrr fctlrtrclt> del rgs $on secuencia$ ADN rituada a <lirtancrdel rlo a transcribir y que [)or tnet &nln](]l{ blrrt cr> f,0{l en f,l$cidos la actualidadtarnblttpuedertrc8uir l (ur l,{r$ ngpresinde diclro gen,l)e hec:hose l)Jenra del AL)Nrle l<lfacillta' en it'oraciones la secttencia .,$nr,es pueden ser responsablestle exprerrfin atre' de de genesdespus la rotura de lof crom{)*(} y de translocaciones

p s b r e s .d e f i t t ai l t g e n i e r a i o q r : n l i c a ' o n b s t c t ) s r a nluchtlsclelos llroyectosd'eterapiagcomprencler lit ,:llll() puecle consegtrir se nica ruehay trttInarcha, v de tocla o r u e x p r e s i n i e t i t g e nh u t t t t ne n b a c t e r i a s e. d i a t e c n o l o q i a e l A D Nr e t : o t t t b i n a n tA u n q u el o s d a r s r bi t l r sr n o l e < ' u l ry e s o q t t l r t l i < ' qiu es a b e m o s o b r el a gerrrlei e..ilru(tura Al )N y el I otrltrrlde la expre.sin h v e z m nr .o t t l r l e o s ,a y m u c l t a sl a g u t i ( a t ( ) r lc a r 1 elr "lre8f qlrt' frr) ( f)llocelnos la actua{)$" t't$ p,unt()t o (lLle ll'Jarj l)ettJelos lnet'anisrrios rigen la activacin 'xl hastallor qu se lrrlulr a prt:r cleseaL,'s (lrnas, qt'lltrs el ncieoy quin en tletr,'rninadrls r.hr rr:gularr (l(' hay mltiples regula.clor(:ri los qettcs. a rr:gula es<is ( ()llo(:elnos respuesta' para las qtl(' I)o cuesll()le$

la que de recordar en la molcula ADN, 'fior ltimo,

y r parte del mism<tno codifica para AR.N no va lugar a protenasy se le llama hoy por hoy ADN Por tanto,se distingueun ADN o no funcional. El o nte v otro no codificante silente. primero

recornbinante del de Base latecnologa ADN

y niolecularclelas enfermeclades,la Irl cliagnstict punal posibilid aclcledetrt-.tar t tlraciones genticas mdicaen Ia tualeshan revolucionacltl investigacin en la aplicabasa y y de nctade exones el segundo intrones clelar- krs ltimos ailos.Dicho avallcese en la d gecuencias se cuyclsigltificado desco- c i n d e l a t e c n o l o g a e l A D N r e c o m b i n a n t e , repetitivas de y en la obtettcin geneso alteracir> que iclentificacili de son Losintrones secuencias nucletidos enfermedades a asociadas las dirersas finalre- nes genticas en a va"n estarrepresentados la protena (fig 3.3). es e de tate, alternancia exones intrones habil,a se recombinante pueden del Al lu oCI mayorpartede los genes. transcribirse ilon a tecnologa ADN los in' nranipulargenesy obtenr:r grandescantidadesde a corresponcliente en AllN,la secuencia descubripor antesde salirdel nrcleo un ADN. La base cle ciichatecnologafue el S|leB$eparada l,o s l l a m a d o s "cortey empalrne".Iinal- m i e n t o c l ct t n o se l l z i m a sb a c t e r i a n o s llamado plcltl:roceso cie quecorresponde a secuencias enzimasclerestriccin,(lue rolnpenel ADN en sitios slo 0l Al{N, que se llaprorlucieniiortltilsfragmentos y sale crxnico, al citoplasmatiene especficos o todtflcuntc . d e r e s t r i c c i n C a d ae n z i m a$ a s e min fragmentos lutraduccln de molecula- conocennsde 200enzirnas restriccin)reconomecanisnlos tlc estos e0lnprersllt

36

general patolgica Anatoma

Amplificacinde la recombinacinde ADN rnedianteclonacin de bacterias

de Figura3.3. Esquema Ia tecnoSe lctgadel ADNre.combinante. un obsena cmotrasccrtar fraqde mentc ADN con determinodas puedeucodeenzinrus restriccin pktrsea la estrut:tura ADNde del Lueqo, dichoplovniun plsmido. ett tluc do se incrtrporo boclerius poslerrtrtrn. se crecen aislundo de cantitlodes plsmite gronde,s dos con el fraEnentode.ADN itr troducido.
! c e u n a s e c u e n c i a r n i c ar i e n u c l e r l l i d t i s ' t ' r r l a l t dena del ADN de forma simtrica (en anlbls t tl+'ns a l a m i s m a a l t u r a ) o d e f o r r n a a s i l t l 'rft c a i . . t l , ' r . t r , / r mas se denominan con el norllbre <le l ttlerta rle l.r q u e p r o c e c l e n ,p o r e i e m p l o [ . ( ( l R I r r l c I r . h r ' l t , h ' r Snta I (de la Serrllttt trttln ?o\ | 'tt | ltiirrl cr-r1r), m e l l t a l e l h e c h o r 1 eq l r c t r a l l f { r l r , i t i r h r l r r r , r d e l A I ) N q u e c l au n b t r d e r u e l t o ( { } r l i f i l { ' r I l e t } l r l (d t'nlnla f..,( lA rrrrsrtra l'rordedel I)NA Cr-rrtarln otr<l xrr es ta t:omllententarieclacl la ltase rlt' la ler lrrrloqiatlel ADN reconbillante, porque I)errl)iteliqr Al )N err lls' midos y cstnidos, dontle, tras rtltnlrt'r el ,{l )N cort los u r i s m o s e n z i t n a s ,s e p u e d e i n t e q r a r l a s r t r t e t t rt . t { t ' t n r r r r . ' n k r s m i s m o s .L o s l l s n i r l r l s\ n t + - ( ( ' f ( ' \ 1 1 t ' l (, \ \ i r \ ' r , , r l a r e s c u e s e u l t i l l t , . r r r i . r rl . 1t t ' r l . t ! rn r ' \ i , ? r ' \ r r r\ r l s g e l l e se n l a s m l \ f l r . r r l r ' r ' r l . r l r l r l l l . r \ l , 1 r . , r r ' t a r f l r ( l O S l e s m e t e l l t t r t rr l r r r ' \ t \ t r f t ( l a t l l ) Se r l 1 ir r ' i { ' r .C u a n ( l 0 f e Z C a n. i l f ( 1 ? 'tr. r l t r l a l ( ) S C f ' t 1 l l r l r ' ) l i c 0 l l O f e C e f na r I t . l l " r i , r r el k ' r ' r l l I n t e S C c r a.l . el 1rlslnido on el gen d(' tlvrllrrr r.t , e \ t a a p r o x i m a c i n b i o q u i r r i r ra ( l u e p e r l n i t e "r! i r r1,rrtf aqmentos de AI)N e introducirlos en microor_ como bacterias, se puede estucliare[ efecto {.tf 1t:ril(,s rle la expresin de dicha .secuenciagnica en las bacterias. Asimismo se puede introducir el ADN control '1rr{.rr i l r x r l , rr r . r r r l e r r ' 1 , ' r r { ) rt n e d i t l d e l a s " l i l l r e .\l)!i {r ixrl,;nr {le AI)N c'txlificante obtetlitltl rr.rl' r1+.1 rix'irn reversa). rt.rrirr rtc R\A In'r \{! r r() xrr tran.s< I r r ill'trxlrs r'!r' !r t, r ililt t.ltgetleiy toda la tecl r r l t i 1 t ar . r r{ r * r } t , r 1 , r . \ 1 , \ f e t < l m l l i n a n t eS e h a t S i t n a f r l t l x . u l o n r r f o r ' r , i l r l l r t t t { r g ( ) . rci o t t e l e s l e c t a r u l ; r f { l ' t ( r t x t n t r r , r , . ' l l F ( n l ( ' A r l t ' l ) ( ' R o t i t ' arnllrh( *r rr-;l r"r'r r1' r ,r le l f)()llmerasa prlr (i Ii. M u l l l r e r l 9 f ( . i r r 1 ,d r r r ( , l e f ' ( R l l o s e f e t l t t i e r e n v v e c l o r e s t l a ( t e n a r r , r r r l a s n t x l ( ) $ s e p t r e d r :a i n p l i t t t f l r ' rtr r r a l u r n e r r r u r . r , f ' ( l e 4 l ) N e r l L l r l r l b t l t l e e n \ t v ( i) ( ) l l t l l t at ' x r l t | \ l l ,\r( ' r ! s l f ) t l l r l a c l

de del v ofr Aislantientr ) it' r r t) n AI) N tej k l o_

i s [ ' a r al a o i r t e n u r rtl]r, ' \ l r Nt l e t n u e s t r rtss t t l a r eh a y r d i f e r e n t e s n t o ( l o s v l t r o t o c o l o s( l t l e l ) i i s i c a m e n t e . d e r c o n s i s t e n n i n t r ( x l l r ( ' ic l f r a g m e n t o e t e j i d o e n u n proteolticos (proteinatampn clelisis,coll t'ltzitnas ar sa K) y luegoen sel)af las protenasclelAIIN de los protocG diferclicias entrelos cliversos l.,as extractos. o Illenorcanlidadde ADNqtte los radicanen la [)ayor dos del se requieraobtenery trnla iureza mismo.F{ay (llre puntos iunclanrent,,rlos ltay que tener en cuenta en la obtencionde A[)Ntlt: los tejidosy que van a cont d s t d i c i o n a rl r sl i f e r c n t t ' s c n i c 4 s i a g n s t i c a q u e s e que se espey los vrn a realizrr p()r trnto resultados clel rt:nobl,encr. [Jnotsel qratlode degradacin ADN. a S i n e c e s i t a n u se s t u r l i a rf r : a g m e n t ols r g o sd e A D N , ( : o r n o o n l a s t c n i c a s l e S o u t h e r n - b l o e,s p r i o r i t a t t c tejidos f rescosrtc incluidosen parafina. rio partir cJe [,os protocolospara l;robtencinde ADN a partir de s a t e j l d o s i n c i u i d o se n l ) a r a f i n a o n s e m e j a n t e s l o s rlescritos rartirrle tcjido fresco, a

(lue en un vectoro comolos plsmidos, setransfecque tanluego lasbacterias, talrnodo trascultivar a de podirnos los masivamente misnras las aislar :lsntignir:a ADNtlLie hala dosy finalmente secuencia rie bamos insertado originalmente, iist ('nriranrcr'o v('z qrie descantidades. el fragmr:nto Si de.,\DN liabianl(rs metido losplsmidos conocido, podenros en era lo utide lizarya comosonda especfica tcnicas hibriclaen cinmolerular. dichofragmento AIJN esceiSi cle no

'23

molecular 37 Patologa

moleculares 3,1. TABLA Tcnicas 1. Anlisis ADN de Southern-blot y PCR variantes "in Hibridacin situ"/FISH 2. Anlisisde ARN Northern-blot RT-PCR Ilibridacin situ" "in 3. Anlisisde protenas Western-blot Inmunohistoqumica

La tcnicaresumidaes as:

mtodos nllevos se Recientemente han propuesto del muy rpidosparala obtencin ADN,especialen con paraestudios PCR, que,trasla incubamente a de cinconel tarnpn lisis el tejidosesomete sose centrifuganlas nicacin en bao caliente, se y muestras el sobrenadante utilizadirectamente por paraelanlisis PCR. en nrs ntoleculares utilizadas la actuaLastcnicas de tantoen el estudio la (vertabla3.1)seirasan liclad gnica. tcnicas Las comode la expresin estructura gnica son para Ia msextendidas estudiar estructura ['ara "in la la PCR, hibridacin situ"y elSouthern-blot. gnica, tantoa nivelde trans" la estudiar expresin rt en comode traduccin protenas en cripcin ARN comoel Norlh*rn' ARN, lticas pueden l{r utilizar rara "insitu" blot,RT{fR e hihri<la<'r,r'r y tcnicas xra 1ln> lik cornoel Wr'lt'rrr rty la inmunohistrxttlntt<'a tenas

i c 1 . R e a l i z a v a r i a ss e c c i o n e s l ep a r a f n a e n e l l r l i r c c r o t o m o ( p u e d e b a s t a r c o r t l - 2 s e c c i o n e s l e5 m i cr a s ) . en 2. l)esparafinizacin xilol (dicho paso es necese sariocrand<l quiereaislarADNrle alto peso ttrolec u l a r) . se de l] l.avar las $ecctorles con al<'ollol 95llt,, sek c a n y l u e g os e i n c u b a t lt ' o n p r o t t : i n a $ a e n u n t a l n pn con un detergente. 4. Posteriormente$r sep{ra el AI)NIXtr exlrx"cl,n $fgnica con fenol y cloro{ormo, qur rtpsre ht lrrt> i'elnasdel ADN y se prectpita el ADN en e,tanol (Xrrr <lt ms rpido es la utilrzat'iful allar (t)r'K"ellffi,todo tfaciones de cloruro s()dicto un rlpntr qwlmte ct> $o el Chelex-Iffi, que atrapa lar pro{e{nm, rtlrln' ftlss delADN que luego re precipile rfl c{rxil

de en o PCR reaccin cadena lapolimerasa

de la rle llasta la ilttroduccitt estatcnica, sntesis de el laboralclrio una forma tediosa ADN se har'aen rio Era v lalxrriosa. tret:esa ' aadirel enzimaADN polirties en nrera$ rrnlralra li7"r 11,'a la temperatura tlr nla rle lichosennra"c la tnayorparte de los orgap ( r r i l l R r x f r g , t 4 ) P e t <lr ; r t ,(t r e s e r o d u z c a l a s n t e s i s eleAl)N e$ nt(e$rlo (]it(''ie separenprimero las hec t "l l l r a t 1 1 n1r fn t o .l < r t t , 'r " ( r ) n s i q u e r u l c a l o r c a l e n a t a n < J < s r n u e $ t r a s l i l i " ( : l u e g oh a v q u e a a d i ru n la g('rti<'a conplementariaal ADN celarkrrr re'urcia que se produce hillridacirt qr querernos sintetizar. ttn y, it:a a temxratrrraespecf (,50-60"C), por tltimo,

de Flgura3.4. Tcnica t{:R. Esta en se tcnicu tosc aadirsecuen' cornplementade Clas nucletidos a rlcs (rrimers o cebadores) kts Oxlremlsdel ADNque se quiere que Hay Qmtlificar. uarias fases, de lncluyenla separacin lqs cq' de el tla donus ADN, acoplamiento y I0$lrltnerso cebadores luegola de tfnt0.$l.s ADNa partir de los pri.se ln$rs,Dic,os po.sos puedenrerecesobtenien' flllsarnumero.$o.s cantidad de dn flnalmente 4,ran lltgtrutrtttts deI ADN

38

patolgica general Aratoma

Figura 3.5. PCRcon trens(:rip(-inint:erso. Lo dett'ct't,'tn tle ciertos RNAsquimricoses e.srecf de cit'rftt.s *trt t iu; mos (tumoresmalignosde diferenciut'trin rnesentutrrtrtl ; tr El esquemamue.stra onLtsis .l lrutstnl,)\ tltu)( el dt' y .i cos (EWS-WTI,EWS-FLLi, I'AX;|J:Kl{lt) (n t tir,,'. ,,): (lult'tit'.sttt,ltlttst'tt t ii ,, mopatolgicos sart:onrus de ( Ias pequeus v redondas, .\ot'(ir'n(t t/r L, rabdotniosarcrtmu alteolar). PurtL cudtt tu,,t', " ;, ' uno imagen Iistolgico (izquit'rdtt) i ,/rr,' i. ,i, " (de.recha) Cornr iut t'tt (t\1r '|;,' , , \. ' crnfrttlprtsif ple lo arnplifi(ctn Qt[trtt ttiitr,t'ttL :"tr 't'1'r de "' , ,lt ttgs1,,,,t,, estu(prcsudoet ttltlus,r{irr /1rlr:

La fijado incluido parafina. principal en do fresco o y desventaja la I'CR su extremada senside es ventaja de bilidacl. Puede detectar secuencia ADNqueesuna una t en unarnninaprororcin el tejido(hasta ep y que i0' clulas) a parciula est un tolalc1e o 10" en problema elr copias delADN tir de hasta slo10-l00 puede relasmuestrs c'lnicas. gran Esta sensibilidad y preserntar su lirnitacin,espor la posia veces grar) por falsos bilitlacl quesecleteclen positivos iontarle n)inaci(in dt' biolgicas, de at'r'iclental lasmuestras (le pcF ahla rnrJrorlanclasr:realizacin controles con y t'rr condiciones tcnicas. sitrvos negatrv(is r'rrtirna.s v es t studiar vimsARN realizar Asimrsnlo xrsrlrlt' o ( udntilrrvu,lt' gnica anlisrs t.xlrresin mediante la r r , t t ' n l r a l el ' ( R , r l i , i r t i r l eA R N q u ec o nl a e n z i n l a ulverrr *r't , rnvierte ADN(fit. 13.5). transcn[)ls;.r en
r . i s l 1 r , , . r (, r r l { ' r r ' r r !l i , r R T - P ( ' R n l L r yL l t i l i z a ( l a n t! n
i ; l a i l r l . l l r i l r ll ; ( i t . " ' q n / , i t ( k lA f e a l i Z a f e s t u ( l i ( ) . S , ; . r r ; 1. r , \r , r , 1 t 1 , ri ' r l ' , ' r U e r ( 1 0C ' r l nl a f l e n S i t l a f iY r ,r r!t i,r trrrrj,1 : ,rI f .l (le electroforesis , "iltl,tl \ , I i . 1 ) ' r i r " ' r lrlr ' l t , r : t

i'\ lt,,l 'r'r,

L , r r q , , r , , ! ' a r r . , . ,". . 1 l t ' s ff r ) l l a r l t i l a t C n l t : a t l t : l ' { X . r , q r t ' r r , f u - r , , r r ( r r rr n t ' S t t s t t l a f e s . S e t a f lr e n z i f l t a .l a , A l ) NJ ) o l l l l t e r a s r . l { r . t r i i , r 1 r } *, r { t t 1 l r r ' r , I t , 1 l r r t . r . t i ' i r c s ' ' r , , r r r i r r t t , rl f a f i l l ay , t f a S l a

( t d o n u t : l e t i t i t l o s l e f o r n l a c o r r u r i e r r r t ' n l a n.a i , r sl r r ' l r r r i ) r r ' I r i r f a rl ( ' t r l l s { 1 i . 4 ' r { ' 1 , , / r { 1 r i\ f l ) l ( x f ' ( ] t ' a r e a l i z a r d e l A I ) N s e p I r a c l ac o l l i c n Z n ( l o , ( i , r r l n r r i i !l ( ) n{ l t s, r l o s c e b a d o r e s .P u e s b : e n , e l r l t ' s tu b n r r r r n t o q t , r n . r i t r a z a t l o p o r M u l l i s y p e r f e c c i ( ) n a r l op o ; ' S a r k rl u t , t ' l u t l l r z r u n a h D N p o l i m e r a s a r e s r s t p n t e, r t o r l ; r sl a s r t t ' [ I rtfr 4 l u r a s , c o m o S o na q u e l l s i u r \ r ' o i r t r t , r t .rili( f l | l {r r r t d f l i s m o s u e f i o b r e \ ' t \ r ' t.tt r r i i t l ( ( r ' i l l r it , l q ,f\.rrr11r <tqUAtiCUS. Ia Utllrr.ru( )tr rlr, \l )\ lxlllnleCOn r a r . i , " r n o e s t a b l et o d o e l p r r r r r l r l r . a r r r r l r f a c i i r n r r l e l \ l r \ D u e d er e a l i z a r s ee n e l r n r s l n ( )l u l x r r l e r . : r s a \r, \ rillo se requiere un aparato () trrrnrx'rclarlor que

\ r\.r Justandotemperatura tubor:iclicamenla del tc esdecir, tienequehaberunafasede desnaturaliacrn delADN 95"C, fase hibridacin los a una de de y cebadores primers otra de sntesis ADN. o de Una vezqueseha sintetizado fragmento detectar el a cli puede pachoADNde doblecadena servirciemolde inuersa. el tumor En ra un nuevociclode amplificaci(ln, lasfases con cle Figura 3.6. l'R con tr(utscripcin y pequeas red<ndas detecton de se y desnaturalizacin, hibridacin sntesis. pro(:e- tle.smaplsico cluhts Este quimrir:os WTl lratscritos I':W'S quese puedenamplifipuede (generaidimiento realizarse numerosas veces La tur enple.andoprinors ttdecuados. figura rnuestra que mente 30-40), tal forma al finalseobtienelnu- lransrritos de estudiados. Todos tuimericcts los5 turnores en merosas copias fragmento ADNdeseaclo, del de paresde bases, :llrs saluoun catienetun tarnttorle 2(iB Latcnica PCR puede de se usarparadetectar iii- so ('t:olle, que tiene un tailrunoonormol de 451pares 1,), gnicas, serciones y rtu- de bases. cionado se:ruenciecion delecciones, translocaciorles y reue[ unainsercit Su paresde buses. puntuales, puede taciones Se realizar partirde teji- de l8.lJ a

25

39 Patoiogarncrlecular'

H i b r i d a c i nn s i t u i
Desnaturalizacin ADN del Sistema e d deteccin

.l Digestin proteasas con

p a r ae x p o n e e l A D N r

'

\
Seccintisular con sospecha de infeicinviral ldenlificacin secuencia dela viralpornrlodos colorimlros porauiorredrogrnft o

de Figrrra 3.7. Esquema Lalctise en ca rir,.SlS[]:f Como obserua el es tlittLr.jo, importantecomprar pael sentpre gende lasmuestras Se ktlrigiltts tejidonormal. recon sr ali;tt i'CRy luegoel proclttclo corrcen un gel de poliacrtlurtt<lu quepernlite seporarlas(utlt ttrtt ltlt' y liet(t, rle.t'!,)l'l nutudtts que, L t r e . t t C i t r iS i n t e n s i r . n q l r t,, r r t , Od t'nl)(so xleculur.

a r los pasoscleamplificar:illen carlena la polinrrrra- S S ( l ' r I ' r i l r r r ' f , r \ r ' ( i r , 1 r l i o a c t i o n - S i n g l e - tS trt r l . {r i r i cle o r i krs los sa, aadienckr trrinre'rr cebadores, nucleriti- I o r r t I a t i rjl-rI ' , I r: t r o r 1 r I s t t)I. s f : , s t rr:r l c t o r . l s t ' l r a s a o t ) t l l . t eI a s c a c i ' e t r as e t t l l l l a s d o s y l a A l ) N r o l i r n c r a sa l o s l ) o r t i l s A l g r r n a s a s a s c a . r , s c : o n r e r c i a l y a t j e n o na l ) a r t ( )d c I ) ( ' Rq L r td i s l l o n t ' n r l c A I ) N ( ' { r I r I l l t a ( i o r r e s l u n t u a l c st t , - l n e n l i f t : r e t t t e es t r d e n t x l u l o s o n a t l a p t a c i ( rp a r a. i o r t a st, r r e r a r t sif ' - r r r o ' , ' i l i < l i r 'rlle c t r o f o r r : t i r ' ;c n t e ) e sd e r o l i a < ' r i l a n r i c l a c rt t r t r n r e r )I o st l i f e r e n t e<i r ' l o s r .l r , n l l ) ( . : i l t u r i r( r si l i l s r i l ( ) s r r r i( l t ' s n ; r l u r ' ; r l r z u r t f i' s .i l 7 j . [ ) i c h a c l i f e l r c r t l le u r , ' i s d l r l i s t at c n i c a i e n t - . r rg r a n n t e r e r x ) r ( j r r ( , p t ' r r n i l tl'i t l a r lv t r r r l r ; i r l a < l a r o r r l t r r r o x i s l i r u n a s c ( ' L l ( - l c i a: l e l u l ' l l r r l l r ^ r ' r t r r ' l r,1 r , r t ' n l r ' '" r r r r l c c r r l r r ' o n f j { u r l c i l n estudiare interpretarla$aileraorxleliotx try{:nilari tl s (l{.r}{rlrJel r fllt'xto ce- t n ( J t r l t ( . r r $ r ( . ) r t ,r r , 1 ' r ' in l o v i l i d a de l e c t r < t f c l trl il t detectarlos nticrorlrgant$rl(ri y tisular de la lesxin r., r e l r r i s 1 { , n } j t ( x i ( , i , \ , t t i i l i l t u e h a v c l i l e r t - ' l t c i a s hrlar

PCR SSCP
Comodeclam{)s. e$tudorr l{'R lx.rnri{t"nntpl,iel ficar y detectar a'quellotene*tft"l<x qur ct)rxxrmri$ su secuencia. Con dicha tcnlcaanlp{tfi{rrx} AJ)N r}t y t e n e m o su n r e s u l t a d o e p o r i l r v o o n e g a t r v ( ) . l u t ' ( d e e e n m u c h a so c a s i o n e r i s s u f i c i e r r l el . i r e i e r n p l { r . n n rnfecritsas, el diagn(rstico enfernledades de lranslor s c a c i o n e se t c .P e r r o a y t a r n t r i r,r r u r : h as t t l a ( l o n ( . b , h dondela alteracingentica punlual.e$ declr.or) es mutacionesque puedenser ml'tiples diferentesa -v gnicav qrlr,('on P(lRse van lo largode la secuencia a amplificaren cualquier(:aso Prireletnplo. dichacircunstanciaes la habitualen el {en srpresor I''", clue t i e n em l t i p l e sm u t a c i o n e s i { e r e n t e y q u e e s l a a l d s t c r a c i no n c o g n i c a s f r e c u e n t e r n u m r l r e sl l u m e t rl1anos. Parasaber si hay mutacinen trn cletermina( l o g e n , e l m t o d o d i a g n s t i c oc r i n c l u y e n t e s l a c secuenciacin dicho Qen, de comparndrio otr<r con qu codny r1u normaldetectando basees la muta, rla.Dicho procedimientoes largoy lallorioso,por lcr (luese han desarrollado unosmtodosde anlisis de , n t u l a c i o n e s s r p i d o sy g e n r i c o sc o m o e l P C R m

! \l{1.\ i .i Aplh:a<'iones llnir:rsrns fre<:uenles dd Sfi(.P

I Mvht"tvtt,svnlolit'rts ,n cattcer

RAS
irt'

I{f} de hereditaries 2 (iene.t enlentedurh'.s Netrrofitrornatosisr I t i r, AI)C) Poliposis col(rricfarrrlirr \\' Sndrome la nrLrjL,r de (gerr N4arlan rlela fibrilina) Sndrome prrri lr Parlisis ridica i rr'rkai(:mica I'umorde Wilrns F i b r o s iq u s t i c a s Hipertriglicerdenria 'fay S a c l r t i p oI s l;'enik:rtonuria Henlofilia Il Itaqr,ritisrno vitanrina clependiente [) (a d R e n i r r i t ps g r n e n t o s q e u e l a r h o d o p s i n a ) ii gen Perirherin-RDS Pelizaeus-Nlcrz:ba<:her L,nfe:medad Polimorfisrnos allicas familiares I v alter;r(ionr:s

40

patolgica general Anatoma

en el ADN, pero que no nos precisaa quir nivel, puede detectaralrededordel90%cletodas las mutaciones puntualesen fragmentosde menos de ll0fl nucletidos y alrededor del B0%en fragmentosmayores de 400nucletidos; decir,cuantornayores el frrqes mento,menor es la sensibilidacl FCil-SS(lP. videl l,a sualizacin las bandaspuederealizarse de r:ontr:nicas autorradioqrficas algunosde lcselementos si de la PCRestabanmarcadoscon azulreo fsfororadiactivoo se puederevelarcon mtoclos radiactino vos, como la tcnicade nitrato rle plata. Las desventaias mtockr del I)CR-SSP(' lrsllson s o s n e g a t i v o s q u e c o n l o h e r n o si n d i c a t l op u e r l e n , ocurrir liastaen un 10% lastx asiones que rlr)n()s dt v permitenestar segurosde rlue lo haya ninqunarnLtacin en los casosnegativt-rs. E s t at c n i c ap u e d eu t i l i z i l r s r[)) a r a l r l i a { n i r s t l r r , d e g r a nn m e r od e e n f e r m e d a ( l t ',s 'r ] r \ r l a l r l j e s , , r mticasltabla ll.2).

y radiactivamente se hibriestudiarsuelenmarcarse d a r ns l o c o n l a s s e c r r e n c i ad e l a s q u e s o n t o t a l s menteconplementarias. requiereque la mutacin Se est presenteen ai menos un 5% de la poblacincel u l a r .E s t em t o d os e u t i l i z ap a r a d e t e c t a rm u t a c i o nes en sitios especficos, como las del oncognRLS (luLl en tunrores humanos. suelelocalizarse los co. en d < r n e s 2 1 . ]y 6 l [ . a ss o r r r l a s s p e c f i c a p a r af r a g i e s d n l n r : n t o s e , \ l ) N q u e e n l l l o l ) rd i c h a m u t a c i nr e c u s r l r r ' e r n r i l o e l \ l ) \ r r u t a r l oy n o e l n o r m a l . E s t e t r r r t r x i o r o , r h s t a n t er r r r *(' l r ) s n c o n v e n i e n t ea ) d e r i s: r a l . x . r t r l r e r r r l' l o1 , sr r u t , rl,r ) n e s e s t u d i a rs e r e q u e r i r r' rn varrsr,tr!( 1r.rr , 'r'tr'<'tar cliversas l{r\ a las variactr i n e st x st b l e s f) ) l r ( | r rr ( r ( ,r n e s e h i b r i d a c i ni e n e n d t ( l t l t , , s l , r n t r rn p l r r l r r . i r l ] )s ,r ? a d as o n ( l a a r a p o a c r r p ,
t i e f e v l l a l t t t r ! rr t r r i l r ' \ 1 , . " l l t ( ' a ( . f R e ( . f ; t r ' ! r l t t r l r ' \ r - r r r r l t l i z l d o e . s t at c n i c a p ; t r a r ' l t , i l rt r . . l l r r l r r , ( 1 , 1 , 1 , l l r , t r t ' s t ( l u t e t t l r o c e s 0 l i l l r e r r r i i , l , r ( i r r \ ( r r r , . , [ l r ) t ' 1 , e ] i Q a . . , d a d O q i t e v lr,r\ sut,len cjetectarse rttu{r't}t lJnr.rtr tr irr\ t r l " l { r o i l r ' \ \ f ^ r f r r r . t t l l ? ' s, r r s , l r ' l t t t m 0 f p f i m i t i V t l y C , l l t l l r . ' i l r i l l r , i l i . t / , r fl , t \ , l : r , I i l l r f ' l t t t , t . l l t l t V t ' f S a S l n U e S irdt l.l\ lrH ilu,llr .t\ r lrer r '. l 1 1 ' rI r / f l r , " ! : l r '

Ottolqelqgt p,qry m i u _de!e$artac()nes

P r c t i c a m e n t et o d o s l o s l l l l r x l o r , r ( t r , l r . a l L r r r r r , rlel ADN amplificado prevlAmert1{, rr l'l l{ 1r

| .r

t v rleter:tar rt'cidilas

A) Tcnlca lrcGE (ek"q'trefrrmte el r rr. m dientedernaturalizante)

[ Prrllr*a'fhro n"iffir"r {t{

dr lnrrgltud de fragmentos de
t l i ' ' ( l e l a 5 I n U t a C i O l ) eS ' S

x I tt t'lt ;ttt'lr lr' r. 'r'

E su t ln r t o t l o u y s e n s i i i l { r r r l t ' l t ' tt , r 1 l.r ,!'rl N ' r 1 t t ' l t l o r , r i , , t r l .l r s l ' m c , 5 l tle lasrnrrtaciones. basaen iliarlir la st.r.rer'i;r t l e r e s l r i e t i i r n l J r ' , s ' , , | r , , s r t r V t t r r t a c i o t r , st.: l Se r rle (i(i lospnmen una cadena nuclerti<krs y lucqore;r- c n z i r t r a n o r e { ' o r ) ( ) ( ' b l r l ) i r r t l ( )d e c r l r t e ry s t , r l r i g i n a r t de r lizar una electroforesis qradill.nte telrrircratrrra. c l i f e r e r t t e s n t l a s n l a si r ' l r r l a r : < n t r < l l . en rle e s ba *'qta Cor tcnica pueclen se separlr rrlrlr'ulas AI)N de ctr! \rr uenciaclifiere una soltrrt t'trf unt.irin en cle F) PCR-aleloespecifi (MisMatch). <:a l a r ' r ' 1 * r ^ c l a d e S d e f U S i nld\e l 1 r\ , ' l r r ' r l ; r s l n r ) \) 1 E s t en l t o r k rs e b a s ac n I a d e t e c c i nd e m u t a c i c I t r r { , t r, t eA D Ns e f u n c l e n r tS r { i r x , t r l l n, r r r ; r t l t l s> nes conocicla.s l o( por mecliantt'amplificacin PCR. Fist;r 'i r I U i l r r t l e f u s i n , u a n d o l c a n z l l r r i< l e l e r m i n a c l a t c n i c a e s t i l p a r a r l c t e c t a r m u t a c i o n e sa l l i c a s C a U r t t ' r l r r r a t u r ao c o n c e n t r a c i n i e s l t a t u r a l i z a n tiea cuandola configuracill c .. normal del otrcaleloesten ternlx'ratura la que fundeun dominioconstituyesu "exceso". parte de oligonucletidos a Se alelo-especfi. 'Irn y dependefundamentalmente la secuencia de de cos para la secuencia nrutaday tiene una gran sensinucletidos.Las Tm de fraEnentosde ADN varian ctr bilidad, pr-rdiendo dt.tectarhasta una clula mr"rtada mo consecuencia cambios de mnimos, pudindose vi- entreun nrilln. sualizarcambiosen [a movilidadelectrofortica las de bandas. requiere aparatoespecial unasconrliSe y un ciones tcnicas difcilaplicacirln frrma de de rutinaria. Tcnicas hibridacin de B) Electroforesis en gel de poliacridanrida para heteroduplex q ASO (Allele-Specifoligonucleotitle trybritl iration) En estatcnicael productoarnplificado ADN es de analizado con hibridacinpor Dot-blot. Las sondasa

blot Iiouthern y Northern-blot

A n l b a st r : n i c a s e l l r s a n n e l a n l i s i sd e l A D N s e (5orrtliern-bioto S-B)o cleARN Qt{orthern-blot N-B) o rneciiante separaciir los mismospor electroforede s i s y p o s t e r i o rh i b r i d a c i t i n o n s o n d a se s p e c f i c a s . c ( l E n e l S - Be I A D N g e n n r i c o e l A D N 6 1 s l l a r ) s e
4t "tf

Patologa molecular 4l

Figrrra3,8. 7'cnica Southernde pasosde Blottinq.Los diferentes e,sk tcnicsestnrepre.sentados correrIss en t:l dibujo.Se requiere preuiomu('strus ADN,cortado de [rznsmenle,en gelesde agarosu, y ferirlas a papel de nitrocelulosa posf eriornenteqqdir lassondas que de.t.[)Nc'tnryle mentarias querenl.sestudi<tr. reuelo Se habuul i mr:. tt,Dormtodos rodiacl tus corta con enzimasde restriccinen varios fragmentos y luegose separaen electroforesis gel de agaen rosa.En el N-8,el RNAcelularse aislay se separatarnbin segn el tamao prlr electrofilresis n qel. e Despus la electroforesis, cidosnucleicos de l<s son transferidosdesdeel ela un filtrrr de paxl de nailon o nitrocelulosaal que se qrxxl"rnftiamenteunidm qtn con la misma distribur:in y rr:para<'in en el gd (fig. 3.8).Posterionnente.el flliro rk nrel m hltrkln con las sondas etpecfficar xrr el AIIN o ARN qur pueclenir marcadas queramosesturliar. Las sonclas (lue radioactivarnente con I' rl bien por sstancias p o r m e d i o sc o l o r i l s r e r m i t a n r r e q o r rv i s u a l i z a c i n (fi. rntricos luminiscentes o 3.9). I l n l a s r e a c c i o r r ed e h r l r r i d ; l c i n a y u n a s e r i ed e s h f t l n fa c t o r e s < : n i t ' orsu e c o r r d i c i o n ae l r e s u l t a d o i n a l y sobre lodo la esre<'if i<:ir'lrrrl la reaccirn. ile Son las aq s l l a m a l u r ' o l r r J i c i o n r< k '+ ' s t r i n q e n c iy . u e c o r r s i s tn d l * n l i l < ' a m e nee a d a l , l a rl a t e m p e r a t u r a e d e s i(rnica la reaccirn, prorrutrvalira<'in. fterza n la cle la r:itosina las sondas, rlr en xrrt'f{xr las basesguarrina la lrn$tud de la sonday la proporcinde formamida (asntequr:lavorecer serar,ici(rn las hebrasde la de icionesy, por tanto, las de Al)N) l,a.s meiores r:onrl con las temperamiyor esptrificidad se'oirtendrn concentraciones de Irrasms altas,con las nlayores la i,inica. formamiday r'<ln nrenorf r-rerza tpica .,ueckr el estudiode preser tjna arlicacin d $ e n c i a< l l a a l n p l i f i c a c i r r e o n c o g n r nu n t e j i d o lfie .| lt))

I'ora Figura 3.9. Souf/rern-blot. reoltzurcl Southernblol primerodigerirel DNAcondiuersos ent,imas cont)iene de restritciny onalizsrlo eLeclrofcrl:cunente getlde en un en agoroso(pane,lizquierdo).El DNAcrntenidr dichogei entonces una metnbrande nilot q le quese a se transfiere (panele.s aplicansondas comple,mentarios radiactiuas <:en. tral y derecho).El e.emplo tnuestre estudiode un tumor el (TDCPR), pequeos redondos y ludesmopl.sico celulas de mor peditricoen el queexisteunafusinenlre losortc('gy pre,sentesen Fel bandas DNA el nesEWS W|. Algunas de de agarosase hibridan tontocon EWSconocon Wl, poIa niendode manifiesto fusinde dichospenes.

Hibridacin situ "in

I-a hibridacin"in situ' es una tcnicahistoqumifragmentos ca que permitevisualizaral mr,croscopio ventajassobre las de ADtl o ARN.Tielle dos r]'rndes que detectan molecular cide otrastcnicas biolog;i cl dos nucleic<ls, Southern$loty el Northern-blot: t p e 1 ) L , a o s i t i v i d a ds e c l e t e c t a n s e c c i o n e si s u l a con res,con lo que puedecorrelacionarse el tipo celular y el contextopatoltico.

1L

A'

patolgica general Anatoma

La tcnica basa la hibridacin secuencias se en de complementariasADNo ARN. condiciones de Las de y fijacin preservacin tejidoson importantes, del recomendndosefijacin paraformaldehdo la en al pueden marcadas 4%.Las sondas ir radiactivamente, por detectndolas aLltorradiografa conbiotio bien nao digoxigenina por cG v visualizarse unareacctrr i (f lorimtricaig.3.1 i). [i marcarlores radiactivos utilizados el ms .son P:i2 foro).S35 re r,fre tiv lazuf ) I'" ioclo; H3tinidina tnada) tn cro dr n<r utrliar sondas radiactivas son nlarcadas digoxigenina, aqunll{s con dalreferlbltr elorut en c&todf r:trrarse sondas marcadas con Figura 3.10. Southern-blot deteL'tttr paro omplifica<'t.ll*r. biotlnahayqu+lfrrer, rr:rjado los problemas con de ( nica.La antplificacion genMYCN N-mycesun la(tol del ) fonrloin*prl:l{k'u I r inu{'hos tejidos, especialmenpronostico sduerso el neurobktsk)no, tuntorperlra en un te hgarfti, b{r*in,,rrr irigena, lo quesi lassont por hay trico de origenneural. intensidud losbandos el wl La de en t{aner{.fui rnlrrlrl*r q trrotina, anticuerpos que los "rr de Ia figurase correlaciona el nntentde crtprus con del ' p*rn genMYCN. el ejenrylode Ia figurae! qenrle 1s En cr/e nrr r{i,Jirsum drlr"r rr r.l productode la hibridarp{ }rr.rl {'1, tinbin conbiotina endgepesadas Ia inmunoglobulta (lUI.). que nun(uolxtrcrt r rxr xra*en de en arnplificado, empleacamocottn\. (uutft.,lxtt 'rrle\ lm rt,*rJtrndofatr se l,os ,r,,.irtrvidad, qnqIiz ado en eI geI tenan neld.sta.s I In()fi |( n& tl+,dw s "in i.s o rJr. ;,r ) I tg l^r.r arlicor:lrNrer hrbridacin situ' se renstico; pacientes y 2, con omplificacndr lll t \ ru sunl.rn l talla.1'l Ios I ert
uieronun cursoclnicomuchonts errcstv)qrc lt'r xt cientes y 1, queno tennn 3 ontplificcrcittn lyn del

uln llSH (tftnln dt hibridncln situ'o

2) l,a tcnicase ruederell.ar rnrtir de tttt t rr, a n e s d e h a s t ac i n c < - l i c r a s , p e n l ) i l t e n d ( p n r t a t ) t o , ) n analizarrnltiples secciones t:on variaclas son<las en pequelias biopsiasy/o lesiones. Por el contrario,para la realizaciQn Southern el Northernse requiedel y re aislarel AQy el ARNdel ticlo, respectivanenre, y en generaldlo se puedenrealizar I o 2 Northernblot a partir clepequeas biopsias,

confluorrrmch)
[ , at c n i c a e l ' l S l is r l r s ae n l a u t i l i z a c i n e s o n d d c l a sc s p e c l i c a s) a r a r l t ' l c r n l i n a d o s r o m o s o m a s c o l s e c u e n c i a s e l o s l n i s u r o s P e r r n i t e s t u d i a r r l t e r a d . e c i o n e sg e n t i c a s o n c o n r i t a n t e m e n ce n l a v i s u a l i c to zacincleIas clulasy eri el contextotisular de la le s i n . E s l e m t o d r - rs e p u e d e u t i l i z a r t a n t o e n cromosomasen metafa.se como en interlase"Obvia-

-'--::,-

Tffid----.Ihbffi"-*: Jairroaa =---Q

----Tl--:-:*-

.asasas'

---ffi;zii;ci

[IEJiqTlJE

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+ J3'iif..,o,.u,,0"
pglEcilamda "6

J ltl8'r"'u" to!fll"t'ou
I= {E mir.,na^ ar migracln gel en scncllas )oliacrilamida r.cadohas 6%

*. figracin en gel

rFF --A

---Q. *arren:r.deos,I-c,
desnar. o"c a

Figurg 3.11. TECNICA HIBRIDE DACION "lN SITU". Esta tcnica permteuisualizqrel ADN en su contexto citolgico e h istolgico. Hay querealizar losmismosposos que en otrastcnicos hibridade cin molecular. productode re" El accinpuedeuisualizarse mpor todo colorimtrico o radiact os. s s iu

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08caoenas

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general patolgica Anatoma

monoclonales, maneroanlogaol Sout. de hern-blot. la figuro unamembranaque rrntlenepnie En nas extradasde trescasosde.tuntordesmoplasict r:, de lulospequeos redondas ha trakdo secuencialmente y se con onticuerpos para EWSy paro WT1 I-{l monoclonale,s presencia bqndos se morcenctn ktsdosanticuer. que de [.osmto<krs tlescrilos anteriormente estn se posponedeque manifiesto en estetumorno slo huvDNA e m p e z a n ca o t i l i z a r j ef o r m a i s t e m t i c a m u lu s en quimrico (fiss..?.5 Jlfi), sr. chos prt-rcesos EWS-WI y RNAquimrico y neoltlrsicos, siendoenormes las no tambienprotenasquimricos EWS-IYTl perspectivas f uturas. crncer es msque un l,l no

Lasposibilidades diagnstico del molecular dependenno slode la disponibilidad/preparacin tcnica y y del laboratorio de la validacin desarrollo sonde para daso primercespecfir:os lasdiversas enfermedaque des, sinotambin tipo de muestra sepretende del y (tabla estudiar analizar 3.5). Como indicaba la se en descripcin losmtodos biologa de que de molecular seemplean habitralmente, unaseriede limitaciohay que por nestcnicas enendadas la "calidad" ADN del y y dela muestra de su grado modode conservacin. Lo idealespartirde tejido"fresco", manipulacio. sin nesni xrsibles degradaciones. obstante, No dadoque no slemprrs,e dismt'{l(' tejidoreciente, hanadap se Flgura 3,12. Western-blot. estatcnicolasprcttt:Irtos, tadomrltiphs En tcnicsliiagnstico ;rl molecular para analizudaselectroforticamente, pue.den se tronsferiro tir de material irx'hkj'' rarafina, esla forrna r'rr rlue hauna membrana, dondese pueden unir selectiuumente bitual (\xl${:rvar tt.ridos o de kr:r enla actualidad. onticuerpos

Dlagns rnolecar elp_ltglqga uI tico !g!g1!_

a estudiar. principales L,os inconvenientes que son no sesabedndese expresa delrtro tejiclo del estudiadoy quemetodolgicamente esunatcnica lay boriosa tediosa. \ i

Aplicaciones biologa dela molecular

enpatologa

I-as aplicaciones diagnstico del molecular la en prctica clnica cada msextensas bsicason vez y rrrente pueden se aplicar 6 grandes grupos en (vertapatologa bla 3.5): tumoral, infecciosa, metablica, 3.5. Aplicacionesdcl diagnstico molecular ascomoen el estudio factores predisponentes TABLA cle a determinadas enfermedades. mismo. diverAsi, con Reordenamiento genartlco procesos en sosmarcadores polimrficos, decir, una muy es con linfoprolif erativos granvariabilidad entrelas diferentes personas, se pueden Estudio alteraciones oncognicas de patrones ADNidentificativos constituir de de cadaindividuo comoautnticas tarjetas identifide Iclentif icacin agenters infecciosos de cacin comoelDNI. patrones Dichos pueden muytilesen patoloser genticas Estudio alteraciones de hereditarias gaforense identificar para criminales, violaciores, para distinguir muestras biopsias de anteconfusiones, ldentificacin "rnuesta" de parareconocer casos enfermedad de injertr_r-contra husped, la queloslinfocitos donante en prolife- 6. Estudio metabolopatas del de ranen el receptor, etc.

gen(:ticas confieren acrmrlo alteraciorrcs cle que "ventajas" crecimiento lasclulas l;rshacen y tle a resistentesloscontrolcs la proliferacin a cle celular tantointernos collrot:xternos. Comose estudiar en el captulorie crtrcinognesis,descubriel y mientode kls tncrtlent:sgencssupresores es paraentender rlesarrollo los tumores. bsico el de La deteccin dicl-ras de alteraciones oncognicas puerle permitirun f{ran lvance sloen el diaqno r:n nstico, sinotambill el establecimiento facde y torespronsticos l;rrosibilidad unaaplicacin de teraputica selectiva. ms Hayya ns cle50onr'rgenes l0 genes y de sipre(ver sores identificados tumores en hunlanos cap-

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Patologa molecular 45

Dichatcnicarequiere crrinica. El modode estudiar mieloide tulo de carcinognesis). dichas leucemia y de oncognicas estar funcin tipo cultivode clulas la preparacin los cr<lmosttalteraciones en del (fig.3.13). de Tiene ladesventaja que de geny de la anomalia, decir, la activacin es si es mas metafase en que por mutacin puntual, translocacin. por a las . . l{ayml- se necesitan aislar ci:lulas estudiar, entren que y la cromosmica tiplesmecanismos moleculares pueden inducir en mitosis rr.re adenrs alteracin "oncognica": activacin translocaciones e insercio- seamuyevidente. que esinconvenientes tiene los nescromosmicas, deleccin ADN, de transversio- Portanto, grandr:s puntuales) missense son:a) la dificulde nes(mutaciones o mutaciones, ta tcnica el estudi,r tumores en 'le Puede aplislidos. mutaciones non-sense alteraciones lasprote- taci cultivar clulas tumores o de de facilidad los procesos a nas, alteraciones con rns delsplicing delARN... Aderns es carse estatcnica ge. y las bsico considerar posibilidad quevariaci<t- hematolgicos,b) s(rlodetecta alteraciones el la de grose"oncognicos" nticas conlleven gnes que nesen lassecuencias estos canibios morfolgicos de y no seanactivantes por tantoseasocien polimor- rosde loscromosomais. al gentico y enortneindividual no al desarrollo tuse fismo El estudio citogentico ha impulsado del de o mor. ailosconla tcnica FISH nemente losltirnos en "in los Con de hibridacin situ"<le cromosomas. csta para qr-re t:spec{icas deterntisondas tcnica, utiliza sc nados cromosomas, rucde: Anlisis citogentico Conla caracterizacin cariotipo lascaracte y pequeas del alteraciones 1) Detectar cromosnticas rsticas morfolgicas los cromosotnas pueden enestudios metafal;e. de en se aneudetectar anomalas los mismos, de de comoesla tpica 2) Detectar incluso secciones parafina en (trisomas, translocacin (cromosoma 9-22 Philadelphia) la ploidia delr:spr...1. en

lli, I r'fril

y Figura 3.13. Anlisiscitogentico moleculartle clulostumorales. et ADNde lasclulosrnlignos puedelnber olEn que estuy por estudkts groseros que teracictnes crcmosmicas se detectan citogenticos, alteracknr'sgenticas pue,den y diarsepor Ia tcnicade Southern-blcttde PCR(amplificocinen cadenade kt po[imeras<t).

qo

patolgica Anatoma [eneral

TABLA 3.6, Aplicacinde la PCRen patologainfecciosa

Coxsackie Citomegalovirus Enterovirus Epstein-Barr HepatitisA,ByC Herpes simple HIV Papilomavirus I H T L Vy I I Sarampin Rubola

pertussis Bordetella Chlamydia irachomatis pilori Helic<;bacter pneurnophila l,egionella leprae Mycobacteriun Mycobacterium tuberculosis Rickettsias Salmonella Vibriocholerae

Candidas Arnebas I listoplasma capsulatum Leisirmanias Pneumocystis carinii 'l'richomonasvaginalist

polymerase Ilistopathol Modificado PanLX,DissTC,Isaacson 1995;26:20I-217 de IrG.'J'he chainreaction histopalfroloql'. in

Tcnicas moleculares especficas

1. Southern-blot. utilizada Muy haceunrs hasta gnicos proaos estuclios reordenamientos en de en linfoicles. utiliza partirrleADNdetejidos cesos Se a que frescos se cortacondeterminados de enzilnas y restriccin luego hibricla lassondas estLlse con a En cliar. el casodelosprocesos linforroliferativos, se puede determinar clonaliclad a partirdelqenclclas pesadas inrnunoglobrrlinas cadenas cle en liufonlas [] 'I'. o de receptores krsantgenos loslinfoms rle en Detectar monoclonaliclarl cuantlo clir:ha alteracill est msdel l-5% clulas la rnuestra. en dc rkt Conlo rnolccLrlar enpatologa severenel qqptulo patologa ile linfoicle, cslurlicr Diagnstico el de monoclon$lidad muy importante paracliferen- infecciosa es procesos ciarenocasioiles reactivos linfoicles procle cesos tumores Iinfoproliferativos, infecciosos, tcniLarnonoclonaliclad Enel cliagnstico agerttes tle las se basar la deteccin un porcentaje en de tanbinunastrrerspectivas determi- casmoleculares tierrc-:n naclo clulas unosreorclenamientos de con sentr.jan- enormes, conforme vayan se delineando secuencias tesde caclenas pesadas inrnunoglobulina nivel especficas los respectivos para de oa mic:roorganismos. de losreceptores T. irnportantes el diagnsPueden especialnrente ser en 2. PCR. revolucionado estudio lostumo- tico de aquellos Ha que el infecciosos crecen de agentes en resmalignos. que Tienen mucha mssensibilidad el cuitivo muylentamerrtr,: Iasmicobacterias, cc)nro honSouthern-blot determinar ya en clonaliclacl,quela de- goso virus. Pero tlospuntos hay muyimportantes en termina menos 0,1% clulas incluso par- lavaloracin last(:cnicas biolosa en del de e de cle molecular a en patologa tir deADNprocedente parafina. de infecciosa: gentica cncer. 3. Estudio predisposicin de del Al menos ya 13alteraciones genticas hay heredital. Laposibilidad falsos de rositivos. riasqueseasocian desarrollo procesos pero infeccioso, no puede al 2. Sedetecta agerite al de maligpredisposicin quc nos.Dicha radica la transmisin concluirse est carrsando enferrnedad. la en de oncgenesen la deleccin genes o de supresores y puede procerientes ia lnea detectarse clulas en Porejemplo, lr,slltimos en aosse estn empecie germinal (linfocitos cualquier clulil.Asmis- zando detectar y o a micobacterias esputos no siemen otra que peros su locali- presu presencia implica dichopaciente estsrr mosi no esconocido todava gen, el puede zacin allica, hacerse abordaje mar- friendo enfermedacl enrelacin dichas una activa con un con polimrficos ADN, cadores Por una muy de tipo microsatlites,micobacterias. tanto, conclusin impor-

gerr un de cercanoscliclro y hacer rbolgenealgico a genticas delinear va de y la clichas alteracriones de Por con transrnisin la enierrnedad. ejemplo, los (ser:ut:ncias que repetitivas ADI\|), nicrosatlites del y sonmuypolimrficos especficos cadaindivi de ia duo,puede estudiarse asociacin los misrnos de concleterminados trunoi"ts. estafornra pudo De se r:n alectos snclrome Lynch detectar familiarer; del de fanliliar asociado poliposis, no cle a o cncer color.l el gerr precoz, al rlr asociarlo cnt:er colonclecomienzo MSH.2,

molecular Patologia

en de cle por mernto tripleteso secuellcias trinucletidos infecciostls de tante en el diagnstico los agentes a s g en e s .D i c h ae x l a n s i n e a s o r : i a I es mtodos moleculares que hay que <:<-rrelaciortar-o s r e s p e c t i v o s d de la transcripcin e los respectivos inactivacin l o s c o n l a c l n i c ad e l e n f e r l n o . de comri qeneso a ull auntentodt:l nivtlde rnetilacin nutanto en las biolsias molecular, En patologa cap.5). puedenutilizarpara detectarnti- cletidoserrclicharegiiin(.r'trr se en las autopsias, En 2, lg:edadcs cardill{.ase!.leleE. este grupo cle las croorganismos tcnicasciehibridacin cidos en erspecialnli:nte la arteriosclerode y de Ia ampliacinen caclena la polime- rle enfernedades, nucleicos nltlcho en el estudiode los geavatizanclo sis,se est. rasa(tabla3.6). lipodel nes que regulanlos nivelt:s alo-lipclproteina, originanla y Ipidosquc secundariamente a DE A) TCNICAS HIBRIDACIN.'l'antopartir de protenas e d L ADN (Southern-blot)como a partir cleARN (Nort- a r t e r i o e s c l e r o s i s .a d e t e t l c i n e a n o m a l a s n d i ' chos genespuedeperniitir la posibilidadclediagnsy h e r n - b l o t )t i e n e n m s s e n s i b i l i d a d e s p e c i f i c i d a d Se que los test inmunolgicos(toltvencionales. pue- tico precoz. nlet :. Edcrrncactes "in seccic de realizarhibriclacin sittt" a nivel de lrs se q u e p u e d ep e r m i t i ra l p a t o l g o ' d e t e c - Clomo ver en el caplrrlu5 hay mltiplesenfermtrn e st i s u l a r e s , mosu en r'er clacles las rlttese t'a conot:ienclo alteracin en tar al microorqanismo un contextoadecuaclo, lii tisulrry lloder cont:lirir leculary por consigr.tienttl aplicacinde las t:cnila relacincon la restuesta r o ra . e q u e d i c h o a g e n t ei n f e c c i o s o s p a t g e n oP o r h i l l r i - c a s c l e s c r i t v s a p e n ' r t i t i e l c l i a g n s t i cp r e c o zd e nlicrotlrganistnos las nrisutas. dacin "in situ" puedendetectarse y virus como el virus de EpsteinIJarr,Citomegalovih r u s ,h e r p e s v i r u s d e l p a p i l o n r a u m a n o . . . , B ) P C R .P u e d ed e t e c t a rc u a l q u i e rm i c r o o r g a t l i s mo, incluiclovirus ARN cotllo cl clela hepatitis C. \'a para ms de 100 Estrucluragnica se han dr:scritoprimersespecficos sc Recicntementtl estt L e w i nB . ( i e n e s O x f o r d , l n q l a n cO x f o r dU n i v e r s i t y diferentes. microorganismos l l: V la desarrollando tcnicade I'CR"in situ" para tletecI'rcss.11193. el Tlte DNA. t a r a n i v e l t i s u l a r a l o s m i c r o t r r g a t t i s l n o sl L l l lc o n - Rosenthal l'clolstlf tht: trlitlc re'conibinant N. l c:ott l y l N c wI i n q l . M e c 1 9 f ) 4l.l l l :l J l l 1 1 1 7 . texto aclecuado toder t:t;rrclrt-iollarlo la resl. R C I 1 i : n r p l e n t oN S . ' l ' h e' o l v r r l c r a s t :h a i n e a c t i o n ) i a g n p u e s t a i s t o p a trrl g i c a . h 1 Mol l'atholi992, :5ti-71] J NI, .ll), Watson Gihnart \\'itkorvski andZollcrM. [lel<:onrl c b i n a n tD N A .N e l v\ t r r k : S t ' i o r l t i f iA n t e r i c a tB o r - i k s ' rn_qlqlqq_ 19 9 2 deIapa!q!off''a Otras aplica_ci_ongs

Pjliiog'glil

que, se Esobviocleducir conforne vallestttdiando Aislamientoy obtencindcl ADi\ de tejidos (ltle genticas subyay conociendo alteraciones las f t l I ) e L e l l i sl A . I I t s i t u h y l l r i t l i z a t i o l le c h n i q u e so r t h e cle las enfermeclades, posibiliclades cenen diversas in applications tttmorpatexlrrerssiolr: of analysis gerrc P,reve- lrology. se molecular van cxtenctienclo. diagnstico 25:580-585. Hunrl'athol19114. tcnicas.ell Ha-vashi PCR-SSCI): of cie la for comentaremosutilidad estas a Illt'thtcl cletection mutamente K. 7 grupos enf cle ermeclades. t i o n s G N A 1 9 9 2 , 9 :l l - l ! ) . . diversos Nluchas erneurodegenerativas. l. Enfermedacles y "neurodegenerativas"hereclitarias son fermedades puecie ser de molecular las misrnas el diagrrstico precoz ia enferde en muy importante la deteccin gealteraciotres y de meclad de los portadores dichas la ya se ha identificado alteraPor nticas. ejemplo, X clel en cingentica el sndrome cromosoma frgil' eli fantili;rr, cierlateral amiotrfica en la esclerosis Ia de de enfermedad Alzheilner. enfernetas formas la niotnicr,atrofia la dadde Huntingtorr,distrofia y de bulbar(enfermedad Kenncdl') de la muscular ende tipo ataxia espinocerebelosa I. Muchas estas o inestable aua se fermedades asocian expansin

of irnalysis raraffirr-elnberlbitllorlirl;rl MiesC.IVlolecular 25:555-560. Patlioll9!)4, I-lunr derltissues. a irrsitu SI{. Wrlman Flu<rescenct: hybridization:newtol ir o l fo r t h e p a t h o l o g i si t . r r tIr' a t h o 1 9 9 4 , 2 5 : 5 8 6 - 5 9 t ) . en de Aplicaciones la biologanolecular patologa f ed ch L o d aM . P o l y r n e r a s e a i l tr e a c t i c l n - b a sm e t h o d so r a n o t h e d e t e c t i o n f n t r l t a t i o uis o n ( l o g e n e sn dt u m o r genes, I'hunI'athol1994,25:564-5i1 suppressor IJJ' DJ IIDG,N'lcCullough, Bruce,Harrison Mak:irinsolli polytnerase chainreaction of The scolre qrrantitative J r n l t s s a yis c l i r l i c am o l c c u l ap a t h o l o g y .C l i nP a t t r o l 81i. 48: 1995; 178-1 lletectionof neoplasia' Pathology. Molecular NaberSP. , r l J N e wE n s l l ! { e t 1 9 9 43 : l 1 1 5 0 8 - 1 5 1 0

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NaberSP. Molecular Pathology. Diagnosis infectious RogersBB. Nucleicacid amplificationand infectious of disease. EnglJ Med1994, New 331:1212-1215 HumPathol1994,25:591-593. disease. NuovoGJ.Lidonnici MacConnell and LaneB. Intra- RowleyJD,Aster JC and SklarJ. The clinical applicaK. P cellular localizationof polymerasechain reation tions of new DNAdiagnostic technologyon the ma(PCR)-amplified p hepatitisC cDNA. Am J SurgPathol n a g e m e no f c a n c e r a t i e n t s . A M A1 9 9 3 , 2 7 0 : 2 3 3 1 t J 1993,7:683690. I 2337. PanLX,DissTC,Isaacson The polymerase PG. Rowley.lD, chain re AsterJCand SklarJ. The impactof new diagaction in histopathology. Histopathol1995; 26:201nostictechnologv the Management cancerpaon of t t. t i e n t sA r c hP a t h oL a bM e d1 9 9 3 . 1 1 7 : 1 1 0 4 1 '1 0 9 . . l

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