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I NOSTRI GENI SU UN MICROCHIP

LESPRESSIONE GENICA
il processo attraverso il quale linformazione contenuta in un gene usata per la sintesi di un prodotto funzionale. Nelle diverse cellule espressa solo una sottopopolazione di tutti i possibili geni e questo conferisce a ciascun tipo cellulare le sue caratteristiche di unicit.

LESPRESSIONE GENICA
regolata in modo da garantire una risposta al variare degli stimoli extra e intra cellulari, mediante interruttori ON-OFF che: 1. Accendono o spengono determinati geni 2. Regolano il livello della loro espressione.

Lanalisi quantitativa e qualitativa dellmRNA permette di capire come una cellula risponde agli stimoli extra e intra cellulari. La tecnologia dei Microarrays permette lidentificazione, la classificazione e lattribuzione della funzione dei vari geni.

CHE COSA E UN MICROARRAY?


I Microarrays di DNA sono dei piccoli supporti solidi (75x25x1mm) sui quali vengono immobilizzati, in posizioni fisse e note migliaia di sequenze di DNA derivate da geni diversi. Le sequenze (DNA, cDNA, oligonucleotidi sintetici) sono disposte secondo uno schema ordinato prefissato per rendere possibile lindividuazione della sequenza genica in un determinato punto.

SU COSA SI BASA IL MICROARRAY?


Il Microarray si basa sullibridazione molecolare fra sequenze nucleotidiche complementari. Quando due sequenze complementari si riconoscono, si formano legami idrogeno fra le basi complementari. Libridazione avviene tra una sequenza bersaglio immobilizzata sul supporto e una sequenza mobile, detta sonda (mRNA, DNA, cDNA), marcata con un fluorocromo. Un computer successivamente legge il vetrino ed in grado di misurare la quantit di sonda legata in ciascuna posizione, generando un profilo di espressione genica.

UN ESPERIMENTO DI MICROARRAY

QUALI SONO LE DIFFERENZE TRA UNA CELLULA NORMALE E UNA TUMORALE?

Come si pu provare a rispondere?

Si potrebbero osservare al microscopio i due tipi di cellule, questo il modo che viene usato dagli

anatomopatologi per il riconoscimento delle neoplasie.


In alcuni casi i due tipi di cellule non presentano

differenze evidenziabili microscopio ottico.

con

losservazione

al

In cosa differisce una cellula normale da una cellula tumorale? Entrambe le cellule contengono gli stessi geni, ci che le fa differire lespressione genica. Conoscere il loro profilo di espressione potrebbe permettere la comprensione del meccanismo della trasformazione neoplastica.

LA PREPARAZIONE DELLARRAY
1. Isolamento dellmRNA da ciascun tipo cellulare; 2. Sintesi del corrispondente cDNA mediante retrotrascrizione con trascrittasi inversa in presenza di opportuni marcatori fluorescenti (verde per la cellula normale, rosso per la cellula tumorale)

LA PREPARAZIONE DELLARRAY
3. Incubazione delle due popolazioni di cDNA marcati,

sul Microarray dove erano stati immobilizzati i geni. Le molecole marcate si legano nel Microarray ai siti che corrispondono ai geni espressi in ciascun tipo cellulare; 4. Dopo libridazione, il Microarray viene posto in un apposito lettore in grado di misurare il colore e lintensit dei diversi spot sul Microarray. I fluorocromi vengono eccitati dal laser e limmagine che deriva viene catturata da una macchina fotografica che genera unimmagine digitale dellarray.

LA LETTURA DELLARRAY
Calcolati i rapporti, lintensit del colore dei singoli spot viene fornita una stima del livello di espressione dei singoli geni nel campione e nel controllo normale.

SPOT ROSSO: include i cDNA relativi alle cellule tumorali, dopo libridazione al DNA target. SPOT VERDE: include i cDNA relativi alle cellule normali, dopo ibridazione al DNA target. SPOT GIALLO (rosso + verde) : entrambi i cDNA hanno ibridato in modo equivalente al DNA target. SPOT NERO: il gene non espresso n nelle cellule normali n nelle cellule tumorali.