Sei sulla pagina 1di 13

ESTRUCTURA DE LA HEMOCIANINA DEL HELIX POMATIA

NDICE

Resumen Desarrollo o o o o o o o Desarrollo del tema Sitio activo Activacin de la hemocianina como fenoloxidasa Hemocianina alfa (D-HpH y N-HpH) Hemocianina beta (-HpH) HpH-d de la hemocianina beta HpH-g de la hemocianina beta

Referencias

Resumen
Las hemocianinas son enormes protenas, que se encuentran disueltas en la hemolinfa de numerosos invertebrados. Su funcin principal es la de transportar oxgeno extracelularmente, la cual puede llevar a cabo debido a los dos tomos de cobre que tienen en su sitio activo. Dichos tomos se unen de forma reversible a una molcula de O2. Esta oxigenacin es la que provoca el color azulado de la hemolinfa de moluscos y artrpodos. Centrndome en el contenido de la monografa, la estructura de la hemocianina del Helix Pomatia o caracol de Borgoa (HpH), el cual es un molusco gasterpodo, cuenta con tres isoformas distintas disueltas en su hemolinfa: dos de tipo alfa (D-HpH y N-HpH) y una de tipo beta (C-HpH). Dichas isoformas estn constituidas por siete u ocho unidades funcionales (FUs) unidas de forma covalente. La presencia de tres isoformas de la hemocianina solo se da en dos especies: el Helix Pomatia y el Helix Lucorum.

Desarrollo del tema


Las hemocianinas son enormes metalo-glicoprotenas, concretamente cromoprotenas no porfirnicas, constituidas por complejos multimricos de protenas que interaccionan de forma no covalente mediante fuerzas electroestticas, puentes de hidrgeno o fuerzas hidrofbicas o por puentes disulfuro. Son protenas con un enorme peso molecular (en el caso del Helix Pomatia, 9x106 Da) y una compleja estructura cuaternaria que acta como transportador de oxgeno en la hemolinfa de numerosas especies de moluscos (cefalpodos y gasterpodos) y artrpodos (crustceos y arcnidos).11 Las hemocianinas de los artrpodos y moluscos revelan numerosas diferencias estructurales, lo que evidencia orgenes evolutivos separados.2 A pesar de las diferentes estructuras terciarias y cuaternarias de las hemocianinas, las cuales reflejan distintas estructuras primarias, los sitios de unin del O2 son bastante similares.1 La hemocianina del Helix Pomatia tiene tres isoformas diferentes: dos de tipo alfa (D-HpH y N-HpH) y una de tipo beta (C-HpH).8 Dichas isoformas estn constituidas por siete u ocho unidades funcionales globulares (FUs) unidas covalentemente. Estas contienen unos 400 residuos de aminocido cada una, pero difieren en sus secuencias y patrones gnicos. Las tres isoformas presentan unos valores de pI, determinados por 2D-electroforesis en gel, de 5,3 (D-HpH), 5,4 (C-HpH) y 7,0 (N-HpH), respectivamente.7 Tanto la alfa como la beta hemocianina tienen un contenido casi idntico de aminocidos. Asimismo, tienen unas caractersticas comunes. Solo presentan un aminocido en el extremo Nterminal: la arginina. No tienen una aminocido identificado en el extremo C-terminal, aunque algunas pruebas apuntan hacia la prolina. Los carbohidratos estn unidos, normalmente, a la asparagina, lo que 2

ha llevado a proponer una secuencia aminoacdica de la zona de unin: -A-N-S-T-G-. Esta secuencia coincide con la zona de glicosilacin de otras de otras glicoprotenas. Estas molculas cuentan con la presencia de complicadas ramificaciones de cadenas de carbohidratos, con la presencia de glucosamina, manosa, fucosa, galactosa, glucosa y xilosa.4 El ensamblado bsico de la molcula nativa de hemocianina en moluscos es un decmero cilndrico hueco. Pero en los gasterpodos, como el Helix Pomatia, presenta ciertas variaciones, la principal es que la molcula est constituida por homodidecmeros formados por la unin de dos homodecmeros.7 14 Estos decmeros se pliegan en cada una de las unidades funcionales. Cada FUs est formada por dos dominios estructurales diferenciados, por un lado el (caracterizado por tener hlices ), y por el otro, el (de hoja plegada ). El dominio se pliega en cuatro hlices , las cuales engloban el sitio activo, mientras que el dominio lo hace en barriles , que forman cadenas antiparalelas entre ellos. 5 Estas unidades funcionales (subunidades formada por cadenas polipeptdicas) son designadas como HpH-a hasta HpH-h sobre el extremo N-terminal.8

Figura 1: Arriba, niveles estructurales de la hemocianina en artrpodos y moluscos.5

El decmero consta de una pared formada por una parte externa hecha por 10 copias de un segmento constituido por las unidades funcionales a-b-c-d-e-f y un complejo en forma de anillo dipentamrico formado por 10 copias de FU-h.5 Esta ltima unidad funcional contiene una cola de 100 aminocidos en el extremo C-terminal que no est presente en las dems FUs, esto es debido a dicha cola acta como elemento de unin del anillo dipentamrico formado por las copias de FU-h.9

Sitio activo
Las hemocianinas son enormes protenas transportadoras de oxgeno. Cada unidad funcional que la forma tiene un sitio activo con dos iones de cobre (Cu2+) acoplados en un sitio tipo 3, centro binuclear, formando la estructura de dos pirmides trigonales opuestas. Estos dos tomos de cobre, denominados CuA y CuB, se enlazan como grupos protticos a las cuatro hlices por tres residuos de histidina cada uno.9 Estos dos iones estn sometidos a un acoplamiento antiferromagntico. Segn la estequiometra, cada par de iones de cobre puede unirse reversiblemente a una molcula de oxgeno. La parte esencial de la oxigenacin puede describirse como: [Cu+]2 + O2 [Cu2+]2 O2 2-. La proximidad de los dos tomos de Cu2+ puede dar lugar a un acoplamiento dipolar entre ellos.3 La unin del oxgeno forma un enlace entre los dos tomos de cobre, dicho oxgeno al unirse se convertira en un perxido y se formara un complejo plano Cu-O2-Cu, esto se ajusta a los datos espectroscpicos de la hemocianina oxigenada.6 Esta oxigenacin provoca un cambio de color, son incoloras cuando estn desoxigenadas y adquieren un tono azul brillante cuando se oxigenan.2 El comportamiento del enlace con el oxgeno se caracteriza por una afinidad baja-moderada, la cual puede ser modulada por numerosos factores.

Activacin de la hemocianina como fenoloxidasa5


Las hemocianinas tienen sitios activos de cobre tipo 3, los cuales se asemejan a los de las fenoloxidasas (comprenden tirosinas y catecol oxidasas). Estas catalizan el inicio, en dos pasos, de la sntesis de la melanina y son necesarias en numerosas funciones biolgicas. Por un lado, las tirosinas catalizan las dos etapas (la hidroxilacin de monofenoles a o-difenoles y su posterior oxidacin a oquinonas) y, por el otro, las catecol oxidasas, solo catalizan el segundo paso. Las hemocianinas pueden ser activadas y convertidas en protenas con actividad fenoloxidasa por proteolisis limitada con agentes desnaturalizantes, como son el SDS y la tripsina, mediante un mecanismo de activacin, que consiste en mover los aminocidos que bloqueen estricamente el acceso al sitio activo de las molculas fenlicas. Por lo que, las hemocianinas realizan un movimiento parecido al que hara un dominio estructural flexible. Esto posibilita la entrada al sitio activo. Dicha entrada hace que un fenol entre con una orientacin determinada, la cual se define por su interaccin con los residuos de histidina organizados en torno al CuB. Esta orientacin del sustrato permite que se den las reacciones individualmente. Ahora, ese fenol se mueve fijando su grupo hidroxilo a un punto de coordinacin del sitio del CuA. Uno de los tomos de la molcula de O2, que se encuentra unida a los dos cobres del sitio activo, ataca el anillo fenlico en su posicin orto, esto tiene como resultado la

formacin de un o-difenol, el cual es inmediatamente oxidado. El otro oxgeno se combina con protones y se produce la formacin de una molcula de agua.

Hemocianina alfa (D-HpH y N-HpH)


Dos de las isoformas que existen de la hemocianina del Helix Pomatia son de tipo alfa. La gran diferencia entre estas dos isoformas es que la D-HpH puede disociarse en sus componentes y la N-HpH no. Las molculas didecamricas de la D son bastantes similares a las de la hemocianina beta.7 La hemocianina alfa es una glicoprotena transportadora de oxgeno. Esta ha sido aislada de la hemolinfa del Helix Pomatia, cuenta con una masa molecular de 9 MDa. Su parte carbohidratada, la cual constituye un 9% de la molcula, est formada por residuos de fucosa, xilosa, 3-O-metilgalactosa, manosa, galactosa, N-acetilgalactosamina y N-acetilglucosamina.10 Los residuos de xilosa se encuentran unidos covalentemente a una cadena carbohidratada ligada a la asparagina.10 Cuando estas dos isoformas de hemocianina, tras ser tratadas con un buffer que modifique el pH del medio, muestran el mismo comportamiento despus de disociarse y reasociarse sus subunidades. Las subunidades disociadas, cuando el pH se estabiliza, se reasocian en decmeros y tbulos de corta longitud. La hemocianina beta tambin puede sufrir esto, pero al reorganizarse forma tbulos de mayor tamao. Esto puede deberse a que fuerte glicosilacin de algunas subunidades.7

Hemocianina beta (-HpH)


La hemocianina beta es una de las tres isoformas de hemocianina que se puede encontrar disuelta libremente en la hemolinfa del Helix Pomatia. Un estudio de dicha molcula ha desvelado numerosas caractersticas de ella: peso molecular, 9,02 x 106 Da; volumen, 14000 nm3; radio de giro, 18,4 nm; radio de las subunidades esfricas, 2,50,2 nm.13 Esta isoprotena, en un medio con un pH 8 (ligeramente bsico), se disocia en sus subunidades. Al realizar una tripsinolisis controlada se obtienen los siguientes fragmentos HpH-abc y HpH-ef y las unidades funcionales HpH-d, HpH-g y HpH-h.8 Tras esta tripsinolisis, se forman largas estructuras tubulares, que parecen ser polmeros lineales de molculas de hemocianina. Estos polmeros tubulares y la protena nativa presentan unas propiedades parecidas, algunas son que ambos se disocian a pH 8 en ausencia de cationes divalentes, muestran un efecto Bohr parecido o la absorbancia (346 nm) es la misma en los dos.12 Asimismo, si se realiza otra tripsinolisis diferente, y a los polmeros obtenidos se les realiza una micrografa electrnica, se puede obtener una reconstruccin en 3D de la molcula. Una posterior 5

difraccin ptica de los polmeros tubulares oxigenados y desoxigenados deja ver una disminucin del dimetro acompaado por un aumento de la longitud en el polmero desoxigenado. Las diferencias entre ambos polmeros pueden deberse a un procedimiento de preparacin por parte de la molcula desoxigenada como forma de exclusin de oxgeno.11 La reasociacin del polmero deja ver que la tripsinolisis no afecta a la forma en la que se determina la interaccin de la protena.12 Posteriormente, una proteolisis limitada de los fragmentos no disociados al completo (HpHabc y HpH-ef) permite la obtencin aislada de cada FUs. Los puentes disulfuro juegan un importante papel en su estabilidad conformacional.8 La cadena polipeptdica de cada FUs est plegada en dos dominios diferenciados, un dominio N-terminal helicoidal (donde est el sitio activo) y otro C-terminal que presenta hoja plegada beta.8 La -HpH contiene un 7% de carbohidratos, estos estn repartidos de forma variable entre las diferentes FUs. Las regiones de glicosilacin se sitan en HpH-d, HpH-e, HpH-g y HpH-h, mientras que HpH-c y HpH-f no cuentan con carbohidratos. De las unidades HpH-a y HpH-b an se desconocen los lugares de unin de glicanos. La mayora de estas FUS son bastante estables, tienen unas temperaturas de desnaturalizacin entre 77-83C.8

HpH-d de la hemocianina beta15


CADENA POLIPEPTDICA 1 61 121 181 241 301 361 davtvashvr vhgmptfpsw dpnpffsgkv wlgghakysf lqpfqdkkln vfagflihnn tdtikqlglk kdldtltage hrlyveqvee agedavttrd ssldytafdp prnitniysr glsadvtvyv vnnaasyqlk ieslrsafld alldhgssva pqpelfnnny vfflhhantd padtfdyrnh cvpsgpkgkn veikavpgtl iqqdhtyeni vpyfdwispi fyeqalyale rlwaiwqelq fhyeydtlel dcnhkagvfs ldphilpdps asfhgkpglc qklpdliska qdnfcdfeiq ryrglpynea nhqtvpqlen vlggelempf iifepgtker qheghkvacc tyynsreqrf fevlhnalhs dcainlmrkp llkrrqeygr tfdrlyklqi

La cadena de la unidad funcional D est formada por un polipptido compuesto por 410 residuos de aminocidos. Tiene una masa de 47 kDa. Presenta una regin delimitada, desde el aminocido 37 al 219, que tambin est presente en tirosinas y se trata de un dominio central muy conservado en estas.

Figura 2: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminocidos de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos tomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color verde los dos aminocidos (Cys-His) que forman el enlace tioter.17

Los aminocidos 44, 55, 71, 175, 179 y 206 corresponden a histidinas (H), que actan como zonas de unin con el cobre, en este caso los residuos 44, 55 y 71 son de unin con el CuA, y los 175, 179 y 206, con el CuB. Se producen varios enlaces Cys-Cys o puentes disulfuro: entre los aminocidos 50 y 59, 165 y 232 y 321 y 332. Este enlace es de tipo covalente fuerte y se produce entre los grupos tiol (-SH) de dos cistenas. Este tipo de enlace es muy importante en la estructura, plegamiento y funcin de la protena. Entre los residuos 60 y 62 se produce un enlace 2-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), tambin llamado enlace tioter (o sulfuro). En el aminocido 253, Asparagina (N), se puede producir una N-glicosilacin, que consiste en una modificacin de la cadena polipeptdica con la adicin de carbohidratos.

Figura 3: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-d. A la izquierda, resaltado en verde el residuo de asparagina (N), en el que se puede dar una N-glicosilacin. A la derecha, resaltado en color verde los dos aminocidos (Cys-His) que forman el enlace tioter.17

La cadena polipeptdica presenta tres regiones conflictivas, en las que hay un tipo de aminocidos que puede convertirse en otro: el aminocido 60, la cistena (C) puede pasar a serina (S), el residuo 62, la histidina (H) puede ser sustituida por serina (S) y el aminocido 165, la cistena (C) puede pasar a cido asprtico (D).
Figura 4: A la derecha, representacin de la estructura secundaria de la HpH-d, en la imagen de la derecha se resaltan en azul y verde los tres residuos que pueden presentar un cambio por otro aminocido.17

El primer residuo y el ltimo de la cadena polipeptdica no son aminocidos terminales, ya que se trata de, en el caso del primero, de cido asprtico (D), y en el del 410, de arginina (R). Con el plegamiento de la cadena

polipeptdica, se forman dos dominios diferentes: uno de hlice alfa y otro de hoja plegada beta.

Figura 5: A la izquierda, representacin de la estructura secundaria de la HpH-d.17

HpH-g de la hemocianina beta16


CADENA POLIPEPTDICA 1 61 121 181 241 301 361 dihttavagv hsvaccihgm fhhgtiynge swtggqspyg pmrpfsdadn faefllhgig hlrpdseyhf gvrkdvtrlt anfpqwhrly ittraprdkl mstleytayd vnpvtrtnsr asadvtfdlc nihivsvngt vsetenlrea vkqwedalta fndpefgkes plfllhhsnv ardvfnydrl dshdhcefag eldshlirsp lrrikadngs qgakigipyw ffyrqvllal drqfaiwqal nyqyddlnfh tfailggple tvqfvpgvkd dgfqsiasfh dwttaftelp eqtdycdfev qkfrglpyns glsiselndv hpwafdrlfk yyek gsppgcehen alvteevdnp qyeishnaih ancaiqllhq lerrkekari ydvtdvfskl

La cadena de la unidad funcional G est formada por un polipptido compuesto por 404 aminocidos. Tiene un peso molecular de 46 kDa. La regin delimitada desde el aminocido 41 al 220, tambin est presentes en tirosinas y se trata de un dominio central muy conservado en ellas. Los residuos 50, 61, 77, 176, 180 y 207 corresponden a histidinas (H), se trata de zonas de unin con un cobre, en este caso los aminocidos 50, 61 y 77 son de unin con el CuA, y los 176, 180 y 207, con el CuB. Se producen tres puentes disulfuro (Cys-Cys): entre los aminocidos 56 y 65, 166 y 233 y 320 y 326.

Figura 6: Dos representaciones de la estructura secundaria de la HpH-g. A la izquierda, resaltado con colores los seis aminocidos de histidina que forman el sitio activo, donde se encuentran los dos tomos de cobre. A la derecha, se resaltan en color azul los dos aminocidos (Cys-His) que forman el enlace tioter.18

Entre los residuos 66 y 68, se produce un enlace 2-(S-cisteinil)-histidina (Cys-His), el cual tambin recibe el nombre de enlace tioter. Hay tres residuos de asparagina (N), aminocidos 38, 60 y 378, en los que se puede producir una N-glicosilacin, que se trata de una modificacin de la cadena polipeptdica con la adicin de carbohidratos.

Figura 7: A la izquierda, representacin de la estructura secundaria de la HpH-g, en la que se resalta en azul y verde los tres residuos de asparagina (N), en los que se puede dar una Nglicosilacin.18

El primer y ltimo residuo de la cadena polipeptdica no son aminocidos terminales, ya que se trata de, en el caso del primero, de cido asprtico (D), y en el del 404, de lisina (K).

Con el plegamiento de la cadena polipeptdica, se forman dos dominios diferentes: uno de hlice alfa y otro de hoja plegada beta. El dominio de hlice alfa est formado por los siguientes aminocidos: 21-37, 43-49, 72-90, 112-114, 152-160, 165-184, 202-224, 236-237, 253257, 261-264, 268-269, 284-295 y 354-360. El dominio de hoja plegada beta est constituido por los siguientes aminocidos: 56-58, 61-63, 124-126, 130-132, 299-308, 313-321, 325334, 343-353, 369-376, 380-382 y 391-395.

Figura 8: A la derecha, representacin de la estructura secundaria de la HpH-g.18

10

Referencias
1. Donald Voet; Judith G. Voet; Charlotte W. Pratt. Fundamentos de Bioqumica: La vida a nivel molecular. 2 Edicin. Editorial Mdica Panamericana. 2007. Pp. 186 2. Richard W. Hill; Gordon A. Wyse; Margaret Anderson. Fisiologa animal. 2 Edicin. Editorial Mdica Panamericana. 2006. Pp. 693 3. Ei-Ichiro Ochiai. Qumica bioinorgnica. 1 Edicin. Editorial Revert, S.A. 1985. Pp. 217220. 4. Jan Dijk. Alpha- and beta-hemocyanin el Helix Pomatia. Editorial Groningen, V.R.B. Offsetdrukkerij, 1971 5. Heinz Decker; Nadja Hellman; Elmar Jaenicke; Bernhard Lieb; Ulrich Meissner; Jrgen Markl. (2007). Minireview: Recent progress in hemocyanin research. Intregative and Comparative Biology, volume 47, pp. 631-641 6. Harry A. Kuiper; Ruurd Torensma; Ernst F.J. van Bruggen. (1976). Binding of Carbon Monoxide to -Hemocyanin and -Hemocyanin from Helix Pomatia. Eur. J. Biochem. 68, 425-430. 7. Ludmila Velkova; Ivan Dimitrov; Heinz Schwarz; Stefan Stevanovic; Wolfgang Voelter; Benedeto Salvato; Pavlina Dolashka-Angelova. (2010). Structure of hemocyanin from garden snail helix Lucorum. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 157, 16-25. 8. Betl T. Yesilyurt; Constant Gielens; Filip Meersman. Thermal stability of homologous functional units of Helix Pomatia does not correlate with carbohydrate content. (2008). The FEBS Journal. Volume 275, Issue 14, pp. 3625-3632. 9. Elmar Jaenicke; Kay Bchler; Jrgen Markl; Heinz Decker; Thomas R.M. Barends. Cupredoxin-like domains in haemocyanins. (2010). Biochem J. 426, 373-378. 10. J. Albert van Kuik; Herman van Halbeek; Johannis P. Kamerling; Johannes F.G. Vliegenthart. Primary structure of the Low-molecular-weight Carbohydrate chains of Helix Pomatia Hemocyanin. (1985). The Journal of Biological Chemistry. Volume 260, N 26. Pp. 1398413988. 11. Jan F.L. van Breemen; Jan H. Ploegman; Ernst F.J. van Bruggen. Structure of helix Pomatia Oxy--hemocyanin and Deoxy--hemocyanin Tubular Polymers. (1979). Eur. J. Biochem. 100, pp. 61-65. 12. Jan F.L. van Breemen; Trijntje Wichertjes; Marijke F.J. Muller; Roel van Driel; Ernst F.J. van Bruggen. Tubular Polymers Derived from Helix Pomatia -hemocyanin. (1975). Eur. J. Biochem. 60, 129-135. 13. Johann Berger; Ingrid Pilz; Raphal Witters; Ren Lontie. Studies by Small-Angle X-Ray Scattering of the Quaternary Structure of the -Haemocyanin of Helix Pomatia. (1977). Eur. J. Biochem. 80, 79-82.

11

14. Miguel del Campo; Sergio Arancibia; Esteban Nova; Fabin Salazar; Andrea Gonzlez; Bruno Moltedo; Pablo de Ioannes; Jorge Ferreira; Augusto Manubens; Mara Ins Becker. Hemocianinas, una herramienta inmunolgica de la biomedicina actual. (2011). Rev. Med. Chile.139:pp.236-246. 15. UniProtKB. http://www.uniprot.org/uniprot/P12031 16. UniProtKB. http://www.uniprot.org/uniprot/P56823 17. SWISS-MODEL Repository. http://swissmodel.expasy.org/repository/?pid=smr03&zid=async 18. SWISS-MODEL Repository. http://swissmodel.expasy.org/repository/smr.php?sptr_ac=P56823&csm=AEF937948AD12E D5

12