Microbiologia 1/3/2010 Prof.

ssa Fusi

VIROLOGIA
Il termine virus deriva dal termine latino veleno. I virus sono oggetto di studio per vari motivi: possono causare delle malattie infettive; alcuni causano il cancro; sono importanti sopratutto perch vengono studiati e utilizzati per produrre vaccini antivirali; negli ultimi anni sono molto utili perch possono essere usati come vettori ( ad esempio vettori di antigeni o di sequenze particolari) nel campo della produzione dei vaccini, della prevenzione e nel campo della terapia genica (terapia che nella medicina moderna adottata per curare malattie rare o malattie che hanno base genetica. I virus vengono utilizzati come vettori di sequenze geniche che possono essere introdotti in un organismo e favorire l'espressione di un gene che nell'individuo ospite era mutato o deficiente). SCOPERTA VIRUS 1892 Ivanovsky scopr il virus del mosaico del tabacco; si accorse che le foglie delle piante di tabacco avevano una forma strana, una malattia strana e si accorse che era dovuta ad un tipo di virus; 1898 fu scoperto che un agente della sindrome mani-piedi (tipo di malattia che colpisce spesso i bambini) era filtrabile, cio attraverso dei sistemi di sterilizzazione artigianali in cui si faceva uso di particolari filtri, si accorsero che l'agente che provocava questa malattia passava attraverso il filtro mentre i batteri rimanevano intrappolati; 1901 virus della febbre gialla (primo virus scoperto); 1915 scoperti i batteriofagi (virus che infettano i batteri, sono molti importanti nella genetica batterica dove presente un meccanismo di trasmissione genetica mediato dai batteriofagi) 1933 fu scoperto il virus dell'influenza (abbastanza dopo la grande pandemia che colpi la popolazione umana nella prima guerra mondiale cio la spagnola).

Virus
Sono parassiti intracellulari obbligati poich vivono e si replicano unicamente nella cellula (un concetto chiave dei virus che questi sono agenti piccoli che si replicano solo nell'ospite e non nel brodo di coltura che il terreno liquido dove crescono i batteri). Il loro genoma costituito solamente o da DNA o da RNA e non da entrambi. Questa caratteristica li rende dei parassiti endocellulari obbligati. All'interno della cellula il genoma si replica e dirige la sintesi di componenti virali sfruttando il sistema cellulare. La traduzione delle proteine avviene al livello del RE, la glicosilazione avviene al livello del Golgi. Il virus non avendo queste strutture nella sua composizione obbligato ad utilizzare quelle della cellula. I virioni (cio la progenie virale) che si formano dopo la replica del virus, sono numerosi e si trovano all'interno della cellula. Vengono poi espulsi da questa avviando un nuovo ciclo infettivo. Dal punto di vista del genoma i virus sono gli agenti biologici che hanno il genoma pi piccolo. Ad esempio i Circovirus sono costituiti soltanto da 1700 paia di basi mentre i batteri hanno circa 4.700.000, il genoma umano raggiunge invece l'ordine dei miliardi. Questo un motivo in pi che spiega il perch un virus possa crescere soltanto all'interno della cellula, in quanto il suo genoma non ha abbastanza codici per sopravvivere senza una cellula. Per quanto riguarda le dimensioni bisogna dire che gi il batterio pi piccolo di un nucleo cellulare. L'ordine di grandezza dei virus nell'ordine dei nanometri (100 nm, 70 nm, ma anche pi piccoli come il Parvovirus 20 nm). La grandezza di una cellula eucariotuica di 10.000 nm.

MORFOLOGIA Al microscopio elettronico si possono osservare questi parassiti poich si raggiungono grandezze nell'ordine dei nanometri mentre questo non possibile al microscopio ottico. I virus hanno una morfologia varia: cilindrica ( ex. Virus del tabacco). L'acido nucleico si trova all'interno di una struttura proteica (sembra essere fatta da tanti fagioli e ogni fagiolo rappresenta una proteina). Quindi le proteine del virus rivestono e proteggono l'acido nucleico;

Icosaedrica (struttura solida costituita da 20 facce triangolari). Costituito da sferule e ognuna rappresenta una proteina Le proteine proteggono e rivestono l'acido nucleico (ex Adenovirus); Isometrica (tondeggiante all'incirca). Ha delle spicole all'esterno (rappresentate dalle glicoproteine) e l'acido nucleico all'interno. Quindi il genoma virale risulta sempre rivestito da proteine. Una morfologia dei batteriofagi (batteriofago T4, quello pi complesso). Ci sono anche batteriofagi costituiti da un filamento genomico rivestito da proteine. Quella del T4 la forma classica e presenta:

1. Testa, rivestita da proteine all'interno della quale si trova l'acido nucleico; 2. Collare; 3. Coda contrattile a cui sono associate delle fibre. Queste fibre servono per attaccarsi ai recettori della parete batterica, in seguito all'attacco con i recettori la coda si contrae come una molla e dalla testa parte, come se fosse sparato, l'acido nucleico che entra dentro il batterio. In laboratorio il virus cresce su colture cellulari e queste crescono in uno strato su vari recipienti di plastica a 37 C (temperatura ottimale per la crescita cellulare). Quando il virus viene cresciuto sulle colture cellulari, nella maggior parte dei casi, d un effetto citopatico (cio un effetto di danneggiamento sulle cellule che permette di evidenziare la presenza di un virus). Un tipo di diagnosi di virologia classica si basa proprio su questo fenomeno cio, il campione biologico viene cresciuto su colture cellulari che giornalmente vengono analizzate al microscopio ottico. Si va a vedere se la morfologia cellulare sempre la stessa o meno. Se la morfologia sempre la stessa si deduce che non vi la presenza di un virus, se inveci si evidenzia un effetto citopatico allora probabile la presenza di un virus. STRUTTURA Il virus presenta proteine, acido nucleico e in alcuni casi envelope. Proteine strutturali: costituiscono la struttura del virus (ad esempio quelle che costituiscono il capside) di membrana: sono proteine che di solito riconoscono il recettore. Il virus non si attacca a tutte le cellule ma solo a quelle che hanno uno specifico recettore. I virus hanno uno spettro d'ospite ben delimitato. Esempio di proteine di memebrana sono le spicole che fuoriescono dal pericapside. enzimi: in particolare quelle proteine che hanno attivit polimerasica utili per la replica e per la trascrizione del virus.

Envelope o pericapside Struttura di natura lipidica di derivazione cellulare. Quando il virus infetta cellula deve poi fuoriuscire e alcuni virus nell'uscire si portano dietro porzioni di membrana. Questa membrana pu derivare dalla: - membrana plasmatica; - membrana nucleare; - membrana del Golgi. CLASSIFICAZIONE Ci sono vari sistemi di classificazione del virus che si possono basare su: natura del genoma del virione (DNA o RNA); simmetria del capside (involucro proteico che ricopre e protegge l'acido nucleico virale); presenza o meno di envelope o pericapside (membrana che contiene proteine e glicoproteine virali che si trova esternamente al capside); dimensioni del virione. Parlando di classificazione virale si deve definire la famiglia, il genere e gruppi del genere mentre in batteriologia si parla di specie. Il pericapside risulta comunque diverso per costituzione di base dalla membrana cellulare perch arricchito di proteine virali. Classificazione virus a DNA: In base al criterio di classificazione si guarda in ordine cronologico: simmetria del capside che nel caso di virus a DNA pu essere icosaedrica oppure molto complessa; presenza o meno di envelope, se manca il pericapside il virus viene definito nudo o naked??? mentre se presente viene detto vestito; architettura genomica, tutti i virus a DNA hanno doppio filamento ad eccezione dei parvovirus (che sono quelli pi piccoli) che hanno genoma a singolo filamento; struttura dell'acido nucleico, il DNA pu essere o circolare o lineare (ad esempio i Coxvirus hanno le estremit del genoma legate covalentemente per cui il genoma risulta circolare). Esiste una classificazione di Baltimore che quella classica. Herpesvirus, Adenovirus, Papillomavirus, Coxvirus, virus dell'epatite b e i parvovirus sono tutti virus a genoma a DNA. Nella classificazione dei virus sono presenti anche delle classi indicative ma la prof ha detto che non importante ricordarsele, limportante sapere se un virus a DNA o a RNA. Classificazione virus a RNA: Sono molti di pi rispetto a quelli a DNA. simmetria del capside che pu essere o icosaedrica o elicoidale; presenza o meno di envelope; architettura genomica, sono tutti a singolo filamento, esiste solo una famiglia con RNA a doppia elica che quella dei Reoviridae; struttura dellacido nucleico, lRNA pu essere o a polarit positiva o negativa. RNA positivo e negativo: LRNA positivo ha la stessa polarit dell'RNA messaggero mentre il negativo sar il suo complementare. Famiglie di virus a RNA a polarit positiva: Picornaviridae, Togaviridae, Retroviridae (retrovirus a cui appartiene anche il virus HIV)

Famiglie di virus a RNA a polarit negativa: Rhabdovirus (virus della rabbia), Orthomyxovirus (virus dell'influenza). Capsomeri: strutture proteiche che vanno a costituire il capside e sono proteine strutturali. Morfologia di alcuni virus: Adenovirus: icosaedrico. Papillomavirus: rotondeggianti, isometrici. Parvovirus: rotondeggianti, isometrici ma molto piccoli. Morbillivirus (virus del morbillo): struttura pleomorfa (cio non ben definita). Toxvirus (quelli del virus vaccinico quello del vaiolo???): struttura complessa e un po' particolare. Nella morfologia icosaedrica si nota che a secondo del punto di osservazione potremmo visualizzare degli assi di rotazione diversi. Ad esempio se si prende in considerazione un vertice avremo 5 assi di simmetria, se si prende in considerazione uno dei lati gli assi di simmetria sono 2, 3 se si prende in considerazione la faccia triangolare. Questo significa che ci sono dei calcoli matematici che permettono di poter valutare gli assi di simmetria dei virioni e dei capsidi e in questo modo calcolare il numero dei capsomeri che costituiscono un capside. Queste proteine sulla superficie del capside possono assumere delle forme diverse; ad esempio le proteine che si trovano al vertice di un icosaedro si possono unire in numero di 5 proteine dello stesso tipo, questa struttura capsumerica si definisce pentone in quanto costituito da 5 proteine/capsomeri uguali. Nel caso delle proteine che rivestono la faccia triangolare, queste si raccolgono in gruppi di 6 e si chiamano esoni. Di solito le proteine che costituiscono il capside sono pochissime , cio sono pochissime unit monomeriche ripetute. Possono essere 2, 3, 4 al massimo e poche di pi nel caso si tratti di virus grandi. Questo si spiega con il fatto che il genoma del virus piccolo, quindi non ha tantissime sequenze disponibili per la codificazione di molte proteine diverse. Bisogna tenere sempre presente che il genoma del virus piuttosto limitato, quindi necessario per il virus adottare una politica di risparmio. Tutto quello che il virus produce fatto per permettere al virus stesso di sopravvivere e replicarsi. Tornando alla simmetria c' anche quella ad elica come nel caso del virus della rabbia (Rhabdovirus), questa simmetria viene detta anche a polie????? perch i capsomeri si ritrovano all'esterno di questa struttura e ricoprono l'acido nucleico che si trova all'interno. Adenovirus (in maniera schematica): Sulla superficie gli esoni vanno a ricoprire la faccia triangolare dell'icosaedro mentre i pentoni si trovano ai vertici. L'adenovirus particolare, presenta delle fibre che sono delle strutture lunghe, assiali, che partono dai vertici (cio dalla base del pentone), necessarie per l'attacco del virus al recettore specifico. Vaxiniavarius: Sarebbe tipo il virus del vaiolo, l'unico che ha una struttura complessa e sembra quasi una cozza con due corpi laterali e un genoma abbastanza grande. Ci sono all'interno del nucleocapside anche degli enzimi virali necessari per la replica del virus e presenta anche una membrana interna e una esterna. PROTEINE AD ATTIVITA ENZIMATICA Alcuni virus hanno enzimi che intervengono nell'interazione virus-cellula ospite (cio o nell'attacco o nel distacco tra virus e cellula ospite). Ad esempio la neuroaminidasi (proteina del virus dell'influenza).

Tra queste proteine bisogna anche ricordare tutti quegli enzimi necessari per la replica del virus: RNA polimerasi DNA-dipendente; RNA polimerasi RNA-dipendente (si trova solo nei virus); trascrittasi inversa ( una DNA polimerasi RNA-dipendente che scrive un filamento di DNA su uno stampo di RNA); enzimi che servono per la replica e il processamento dell'acido nucleico; proteinchinasi che fosforilano altre proteine. enzimi che servono per bloccare alcune attivit specifiche della cellula. COME IL VIRUS INFETTA LA CELLULA Le fasi della replica sono: adsorbimento; penetrazione; uncoating (svestimento, cio la liberazione dall'involucro); trasduzione e traduzione; replica genoma; assemblaggio; rilascio. Adsorbimento Significa attacco del virus alla cellula. Il virus si attacca a recettori specifici tramite le proteine che sono presenti o nel capside (nel caso si tratti di virus nudo) o nel pericapside (nel caso si tratti di un virus rivestito). Quindi ci sono delle glicoproteine o delle proteine virali che si attaccano al recettore specifico. I virus hanno uno spettro d'ospite ben definito, cio si attaccano in maniera specifica ai recettori e non in maniera casuale. Esempi: - Poliovirus della famiglia picornavirus, virus che provoca la poliomelite. Ha una forma che sembra icosaedrica, piccolo, nudo. Le proteine che rivestono il virus hanno la capacit di attaccarsi ad alcuni recettori specifici presenti sulla membrana. Nell'attacco si ha una specie di endocitosi per cui il virus pu essere introdotto all'interno. In dettaglio le proteine VP1, VP2, VP3 che sono delle proteine strutturali del capside virale, interagiscono con il recettore e aprono un varco all'interno della membrana citoplasmatica attraverso cui l'acido nucleico fuoriesce dal virione e entra nel citoplasma. - virus dell'influenza (famiglia orthomyxoviridae) presenta il pericapside. Il virus si attacca ai recettori dell'acido sialico sulla membrana citoplasmatica. In realt i recettori dell'acido sialico sono presenti in moltissime cellule per cui di principio questo virus potrebbe attaccarsi a quasi tutti i tipi cellulari. Il virus entra per coalescenza??? all'interno della cellula e attraverso una fagocitosi entra in un endosoma (membrana citoplasmatica che riveste il virus nel momento in cui entrato, si ha un endocitosi che porta il virus a trovarsi all'interno dell'endosoma). In un ambiente acido la fusione dell'envelope del virus con la membrana citoplasmatica viene favorita per cui il virione si fonde con la membrana citoplasmatica e il genoma all'interno del virus fuoriesce nel citoplasma. - HIV presneta due proteine di membrana dell'envelope, la GP120 e la GP41, implicate nellattacco del virus alla cellula bersaglio e nella penetrazione. La GP120 serve per il riconoscimento del recettore che il CD4 (recettore presente sui linfociti T). Il CD4 riconosce la GP120 grazie anche alla presenza del co-recettore CCR 5. quindi talvolta necessario per il riconoscimento del recettore da parte del virus di un co-recettore. La presenza di un co-recettore serve a rendere ancora pi limitato il campo dello spettro d'ospite. Nel momento in cui la GP120 si attacca al CD4 e riconosce il co-recettore, la proteina GP41 (proteina di fusione) cambia morfologia e favorisce un cambiamento conformazionale per cui la

GP120 si apre e permette il passaggio dell'acido nucleico dall'interno del virus all'interno della cellula. Ricapitolando la GP120 si attacca al recettore mentre la GP41 favorisce il cambiamento conformazionale della GP120 favorendo la fusione dell'envelope virale con la membrana citoplasmatica, questo provoca lapertura di un varco attraverso cui pu passare il genoma virale all'interno della cellula. Alcuni recettori virali: Poliovirus: la cellula bersaglio la cellula epiteliale, i recettori sono proteine appartenenti alla superfamiglia delle immunoglobuline; virus dell'influenza: recettori contenenti acido sialico; HIV: CD4 e co-recettori; Epstein-Barr virus (virus che provoca la mononucleosi infettiva): recettore del complemento CD3 (il complemento un sistema proteico multifattoriale presente nel sangue in circolo che svolge un ruolo importante nella difesa contro le infezioni). Penetrazione Entrata dell'acido nucleico all'interno della cellula. Pu essere attuata in maniera diversa a seconda del virus, in particolare differisce tra virus nudo e virus con envelope. Nel caso di virus nudo si ha un fenomeno di endocitosi, cio invasione del virus dopo che questi si attaccato al recettore. Nel caso di un virus con envelope si ha una fusione tra envelope e membrana citoplasmatica cellulare che favorisce l'entrata del nucleocapside all'interno della cellula. Uncoating Il genoma si deve liberare delle proteine che lo rivestono per potersi replicare. Assemblaggio Consiste nellassemblaggio dei nuovi genomi virali, delle proteine virali neo-formate all'interno della cellula, e nella formazione di tanti virioni. Da un virione si possono ottenere milioni di virioni. Termonato lassemblaggio il virione deve fuoriuscire dalla cellula. Fuoriuscita E differente a seconda che si tratti di un virus nudo o di un virus dotato di pericapside. Se si tratta di un virus nudo di solito si ha lisi cellulare e i virioni fuoriescono dalla cellula. Nel caso di virus con envelope i virioni devono prendere dalla cellula una parte di membrana che pu essere citoplasmatica o nucleare o del Golgi a seconda del virus in questione. Il virione con il capside virale si avvicina a una di queste membrane per un processo opposto all'endocitosi e alla fagocitosi, detto gemmazione. In questo modo il virus fuoriesce acquisendo come envelope la membrana della cellula ospite con le proteine virali. BATTERIOFAGI (alcune nozioni essenziali) Sono virus di batteri. Possono provocare o un ciclo litico o un ciclo lisogeno. Il ciclo litico mediato da un fago detto virulento. Il batteriofago specifico per una cellula batterica la infetta e viene rilasciato in seguito a lisi cellulare. Il batteriofago (in questo caso il T4) si attacca alla cellula batterica (a recettori della parete batterica) attraverso la coda (dotata di fibre), si contrae la coda e l'acido nucleico viene immesso nella cellula batterica. In seguito quando il genoma a DNA del batterio verr trascritto, le proteine fagiche verranno prodotte, si avr l'assemblaggio (cio l'acido nucleico sar rivestito dalle proteine del fago), si

formeranno tanti piccoli fagi all'interno della cellula batterica. Una volta che la cellula si riempita di batteriofagi lisa e i batteriofagi fuoriescono. Il ciclo lisogeno invece mediato da fago temperato (cio pi buono) non lisa immediatamente la cellula ma riesce a sopravvivere all'interno della cellula batterica perch il suo genoma si integra con il genoma cellulare. Questo fago trasporta una parte del suo genoma nella cellula batterica, questo fa si che la cellula batterica puossa produrre delle proteine che non self ma proprie del fago. Il fago integrato nella cellula batterica detto profago. Nel caso in cui abbiamo un fago temperato il fago si attacca e inietta il suo DNA. Questo DNA di solito circolarizza e attraverso un meccanismo di crossing-over si integra all'interno del genoma batterico. Questo fa si che quando la cellula batterica si divide otterr anche il genoma del fago. Quando il fago integrato all'interno della cellula batterica si pu avere la produzione di alcune proteine che caratterizzano la cellula batterica ospite. Il fago temperato detto silente (NON SO SICURO) perch produce delle proteine che fanno tacere l'espressione delle altre proteine del fago che magari indurrebbero il ciclo litico. Quando c' la fase lisogena ci possono essere alcuni elementi dell'ambiente esterno che posso favorire il ciclo litico. Infatti quando una cellula batterica contiene all'interno il profago possibile comunque indurre in questa anche un ciclo litico con particolari meccanismi o con particolari reattivi. REPLICA DI ALCUNI VIRUS A DNA I virus a DNA hanno tutti doppio filamento tranne i Parvovirus. A doppio filamento la replica avviene come quella del DNA di una cellula eucariotica. Lapparato di replicazione necessita di: proteine destabilizzanti che favoriscono l'apertura del doppio filamento; DNA polimerasi DNA-dipendente cellulare che il virus sfrutta per sintetizzare in direzione 5'-3' il DNA; ligasi. Si apre la forcina e la polimerasi inizia ad attaccare ai primer dei nucleotidi complementari al filamento parentale, poi intervengono le ligasi che attaccano i frammenti di okazaki via via sintetizzati. In seguito a vari cicli replicativi si accumulano all'interno della cellula numerosi filamenti genomici a doppio filamento di DNA virale. Nel momento in cui la cellula piena di questi genomi avverr l'assemblaggio con le proteine strutturali e poi la fuoriuscita dei virioni verso l'esterno. In pi questi virus utilizzeranno anche una RNA polimerasi DNA-dipendente per trascrivere RNA necessari per produrre proteine virali. ESEMPI: - nel caso dell'Herpesvirus (classico virus a DNA a doppio filamento lineare) si vedranno espressi dei geni a blocchi cio, prima verranno espressi i geni alfa, poi i beta e poi i gamma. Questo perch il tipo di trascrizione dei messaggeri avverr in tempi diversi: geni alfa produrranno messaggeri e quindi proteine dette precoci (proteine prodotte all'inizio dell'infezione cellulare, sono quelle che saranno necessarie soprattutto per la fase di replica del virus, e poi delle proteine che bloccheranno degli apparati sintetici cellulari). Le proteine alfa che hanno attivit enzimatica tipo polimerasi di acidi nucleici e quindi serviranno a loro volta per trascrivere i geni beta (geni intermedi). Poi ci sono i geni tardivi che sono i gamma e questi trascrivono dei messaggeri che produrranno proteine strutturali. Quindi nel caso dei virus herpetici avremo un tipo di replica genomica a tre tappe (geni alfa, beta , gamma). Parlando invece dei prodotti di questi geni, le diverse proteine verranno dette: immediate early, early, late. - il Papillomavirus a doppio filamento di DNA ma circola. - il Poxvirus (virus del vaiolo) ha struttura complessa e ha le estremit legate covalentemente quindi in forma circolare.