Manual Ene 09

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
BIOQUÍMICA MÉDICA I
MANUAL DE LABORATORIO
SEMESTRE ENERO – JUNIO 2009
ALUMNO: Grupo: 2CM

PROFESORES
TITULAR:
ADJUNTO:
ADJUNTO:
ADJUNTO:
PRÁCTICA AUTORIZACIÓN
1
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11
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA, I.P.N. DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA MÉDICA I
FRANCISCO JAVIER CASTAÑEDA IBARRA
ELIZABETH BARBOSA CABRERA
CLAUDIA CALZADA MENDOZA
LUZ MARÍA CHIRINO CASTILLO
ARTURO DIAZ MARTINEZ
EUNICE DALET FARFÁN GARCÍA
MARIA TERESA LÓPEZ VENEGAS
SANDRA GISSELA MÁRQUEZ RAMÍREZ
JESSICA ELENA MENDIETA WEJEBE
MARÍA DEL ROSARIO LEÓN REYES
ALFREDO MONTIEL MÁRQUEZ
JUAN GUILLERMO ORDORICA VARGAS
MIGUEL ANGEL ORDORICA VARGAS
ARTURO RAMÍREZ CRUZ
LETICIA ARACELI RAMÍREZ DURÁN
MARTHA CECILIA ROSALES HERNÁNDEZ
SANDRA SÁNCHEZ BARBOSA
FELICIANO TAMAY CACH
JOSÉ GUADALUPE TRUJILLO FERRARA
MARÍA DE LA LUZ VELÁZQUEZ MONROY
IO STEPHANIE ZAMUDIO VEGA
Auxiliares de Laboratorio:
Josefina Tinajero Garcilazo
José Luis Martínez Vásquez
Enero de 2009
LABORATORIO DE BIOQUIMICA MÉDICA 1 Página: 2
ÍNDICE
No. TEMA Página:
1 INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO 4
2 SOLUCIONES 8
3 ELECTROLITOS Y pH 14
4 SOLUCIONES REGULADORAS 17
5 PROTEÍNAS 21
6 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS 28
7 CINÉTICA ENZIMÁTICA 35
8 GLÚCIDOS 41
9 OXIDACIONES BIOLÓGICAS 46
10 LÍPIDOS 51
11 ÁCIDOS NUCLEICOS 55

1. INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO
DE BIOQUÍMICA MÉDICA I
Se revisan conceptos y procedimientos de importancia para el trabajo en el laboratorio.
El alumno deberá previamente haber leído, entendido, comprendido, estar de acuerdo con,
y sujetarse al reglamento de la Academia de Bioquímica.
• Las actividades de laboratorio constituyen una parte importante del aprendizaje de la

bioquímica médica y complementan las actividades de la materia impartidas en el aula.
• Es obligación del alumno la asistencia puntual, la participación activa, la recolección de
resultados de los experimentos y la entrega de reportes de los mismos.
• Es de la mayor importancia cumplir meticulosamente con las medidas de seguridad
tanto en comportamiento, uniforme y accesorios como guantes, anteojos de protección
(goggles) o caretas transparentes, cubre bocas, bata larga, y otros como prepipetas.
DISTRIBUCIÓN DE LOS ALUMNOS

EJERCICIO 1
a) Antes de entrar al laboratorio, todos los alumnos deberán portar debidamente abotonada
su bata de laboratorio y tener listo su material de trabajo.
b) Cuando el profesor lo indique, los alumnos colocarán su mochila en el lugar que les sea
asignado.
c) Siguiendo las instrucciones de su profesor, localice su mesa de trabajo e
inmediatamente diríjase a ella.
d) En su mesa, localice las tomas de corriente, desagües, tuberías y sitios donde puede
trabajar.
e) Ubique la posición de su mesa de trabajo con respecto de la mesa de la campana,
instalaciones de seguridad, extintores, zonas de seguridad y rutas de evacuación.
f) Con base en la explicación recibida, identifique el uso de cada una de las tuberías que
encuentre en su mesa de trabajo y márquelas con masking tape. Espere a que su
profesor confirme que su etiquetado es correcto.
g) Localice la posición de las válvulas de seguridad de cada tubería.
1. Dibuje un esquema de su mesa señalando la posición de las tomas de corriente,

desagües y válvulas de flujo.
2. Dibuje un esquema simple del laboratorio e indique en él las zonas de seguridad, la
posición del equipo de seguridad y marque la ruta de evacuación desde su mesa.
3. En el esquema de la mesa de trabajo que elaboró en el ejercicio anterior, marque la
posición de las válvulas de seguridad.
EL VALE DE MATERIAL DE LABORATORIO

EJERCICIO 2
a) Localice en la charola de material de laboratorio el vale, el cual es un documento que
enlista el material que se le confía para la realización de cada práctica. De acuerdo con
esta lista identifique y revise cuidadosamente cada una de las piezas, indicando en el
vale cualquier defecto que encuentre.
b) Rotule cada pieza identificada con una etiqueta de masking tape. Reúna en la charola el
material de nombre y/o empleo desconocidos, o de cuyo estado tenga duda, y pregunte
a su profesor. Espere a que su profesor compruebe que su identificación del material es
correcta.
c) Una vez revisado todo el material, complete los datos solicitados en el vale, (fecha,
grupo, equipo, responsable, etc.) y entréguelo al personal técnico de laboratorio.
1. ¿Cuál es el uso de cada una de las siguientes piezas de material de laboratorio?

Pipeta __________________________________________________________
Bureta __________________________________________________________
Probeta__________________________________________________________
Mortero__________________________________________________________
Tubo de ensayo___________________________________________________
MANEJO DEL MECHERO FISHER

EJERCICIO 3
a) No encienda el mechero hasta que su profesor se lo indique.
b) Si es necesario, conecte el tubo de plástico del mechero a la llave de gas, la que deberá
estar completamente cerrada, con la manija en posición transversal respecto de la salida
del gas. Recuerde que la tubería de gas es de color amarillo.
c) Asegúrese que el tornillo de control de flujo de gas esté abierto más o menos a la mitad
de su capacidad total. El flujo de gas se disminuye girando el tornillo en el sentido de las
manecillas del reloj y se aumenta en sentido contrario.
d) Encienda el mechero aproximando la flama de un cerillo o encendedor al borde de la
parte superior del mechero inmediatamente después de abrir la llave de gas, lo cual
debe hacerse lentamente, avanzándola hasta que esté aproximadamente a 45 grados
con el tubo del gas. Tenga cuidado de no acercar su rostro, pelo u objetos
inflamables al mechero al momento de encenderlo ni cuando esté encendido. Al
usar el mechero no deberá portar guantes clínicos hechos de látex o polietileno,
tenga cuidado, ya que son inflamables.
e) Ajuste la cantidad de aire que entra, usando el arillo de control de flujo de aire, hasta
que la flama tenga una zona central de color azul claro rodeada de otra de color azul
oscuro o violeta. La parte más caliente se encuentra en la punta de la zona interna.
Cuando la combustión es incompleta por falta de oxigeno la flama tiene color amarillo.
f) Deje el mechero encendido para usarlo en el ejercicio siguiente.
1. Elabore un esquema del mechero de FISHER, en el que se indique la posición del

tornillo de control de flujo de gas, el arillo de control de flujo del aire y la entrada del gas.
COMO CALENTAR UN LÍQUIDO EN UN TUBO DE ENSAYO

EJERCICIO 4
a) Todos los miembros del equipo deben usar los anteojos de protección.
b) Llene el tubo de ensayo hasta un 20% de su capacidad con agua de la llave y sujételo
con las pinzas para tubo de ensayo.
c) En caso necesario quitarse los guantes de látex antes de iniciar el calentamiento.

d) Coloque el tubo sobre la flama del mechero, inclinado aproximadamente a 70 grados y

cuidando que la flama caliente la parte superior del líquido. Nunca caliente un tubo de
ensayo en el fondo o en posición vertical porque se puede proyectar su contenido.
e) Mueva el tubo cuidadosamente, sin sacarlo de la flama, para que el líquido se caliente
de manera uniforme
f) Durante el calentamiento dirija la boca del tubo hacia un lugar en que no se
encuentre ninguna persona o material que se pueda dañar.
g) Jamás mire directamente la boca de un tubo de ensayo que se está calentando,
aunque esté fuera de la flama del mechero.
h) Continúe el calentamiento hasta lograr que el agua hierva, sin proyectarse.
i) Nunca caliente solventes orgánicos en tubo de ensayo directamente en la flama
del mechero. Hagalo siempre a baño maría.
1. Elabore un esquema de la forma correcta de calentar un líquido en un tubo de ensayo.
MANEJO DE REACTIVOS LÍQUIDOS

EJERCICIO 5a
a) Para manejar con seguridad los reactivos líquidos se usa siempre la pre-pipeta.
b) Después de abrir un frasco de reactivo, coloque el tapón sobre la mesa en posición
invertida, para evitar contaminación.
c) Para extraer el líquido utilice una pipeta o un gotero limpios. Nunca vierta reactivos
directamente del frasco para evitar escurrimientos.
d) Usando la pipeta de 10 mL, transfiera 5 mL de agua de un vaso de precipitados a un
tubo de ensayo. Repita la maniobra hasta que pueda realizarla con seguridad.
1) Describa la forma como ensambló su pre-pipeta.
EJERCICIO 5b
a) Prepare una serie de 4 tubos de ensayo. Numere los tubos del 1 al 4. Coloque en el
tubo número uno 2.5 mL de agua. En el tubo número dos, 1.25 mL de agua. En tanto
que en el tubo número tres deposite 0.8 mL de agua y en el tubo número cuatro,
deposite 0.6 mL de agua.
b) Utilice para cada tubo de ensayo una pipeta de capacidad adecuada. Repita este
ejercicio hasta que pueda realizarlo con seguridad y precisión.
1. Elabore un esquema que describa este experimento.
EJERCICIO 5c
a) Monte el dispositivo de titulación según indicaciones de su profesor y aprenda a
manejar con soltura y seguridad la llave de su bureta. Familiarícese con el
procedimiento de dejar gotear el líquido de la bureta, en este caso agua, o dejar salir de
la misma cantidades fijas como por ejemplo, de un mL cada vez, de 5 mL cada vez, etc.
Asimismo, deberá aprender a leer con precisión la escala de la bureta.
1. Elabore un esquema del dispositivo de titulación.

MANEJO DE REACTIVOS SÓLIDOS
EJERCICIO 6
a) Prepare una charola de papel usando una hoja de papel limpio, de preferencia
encerado. Esta charola se prepara doblando el papel aproximadamente a un centímetro
de cada borde y colocándolos en ángulo recto para formar una pared en la periferia del
papel. El tamaño de la charola depende de la cantidad de reactivo a pesar.
b) Encienda la balanza y espere a que se estabilice la lectura. Coloque la charola de papel
en el plato de la balanza. Cuando se estabilice, por medio del botón de tarar, tare a
cero la balanza.
c) Abra el recipiente del reactivo y coloque la tapa sobre la mesa, boca arriba, para evitar
la contaminación.
d) Por medio de espátula saque el reactivo del recipiente y colóquelo sobre la charola de
papel. Si se rebasa la cantidad deseada, regrese el exceso de reactivo al respectivo
recipiente usando la espátula. Nunca regrese al recipiente original un reactivo que caiga
fuera de la charola de papel o sobre la mesa.
e) Pese la cantidad de cloruro de sodio que le indique su profesor y colóquela en el sobre
de papel que se le proporciona. Escriba en el sobre el nombre y la cantidad de reactivo
que contiene.
f) Cierre inmediatamente el frasco de reactivo para evitar que se hidrate o contamine.
Asegúrese de que la mesa y la balanza queden limpias.
1. Elabore un diagrama de la balanza, señalando la posición del botón de encendido y

apagado y del botón de tara.
TARAR TUBOS PARA CENTRIFUGAR

EJERCICIO 7
a) En este ejercicio se usará la balanza de dos platillos.
b) Coloque las pesas de medición en la posición de cero. Asegúrese de que la aguja o fiel
de la balanza esté en posición cero. Si no lo está, gire cuidadosamente las pesas de
ajuste en el sentido que sea necesario hasta lograr el equilibrio.
c) Coloque un frasco gerber en cada platillo, cuidando que el más pesado quede del lado
izquierdo.
d) Deslice las pesas de medición de la balanza hasta lograr que el fiel vuelva a la posición
de equilibrio.
e) Coloque en cada frasco una camisa de la centrífuga con un tubo adecuado para
centrifugar dentro.
f) Usando una pipeta, añada agua de la llave entre la camisa y el tubo más ligero hasta
lograr que el fiel de la balanza regrese al equilibrio.
1. Elabore un esquema de la balanza de platillo señalando la posición de las pesas de

ajuste y las de medición.

2. SOLUCIONES
U na solución es un sistema monofásico, (homogéneo), formado por dos o más sustancias

químicas y presenta las mismas propiedades físicoquímicas en todas sus partes.
Soluto es la sustancia que se disuelve o dispersa molecularmente en otra a la cual se le
denomina solvente. Cuando se trata de líquidos miscibles, como alcohol y agua, cualquiera de los
dos puede ser solvente o soluto. Por lo que se acostumbra nombrar solvente al que se encuentra
en mayor cantidad. La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una
solución se llama concentración. Para explicar concentración necesitamos la definición de mol.
Mol. Se define como el peso molecular de una sustancia expresado en gramos, o sea la
masa de una sustancia que contiene el mismo número de átomos o moléculas que hay en 12 g de
12
C. Experimentalmente este número es igual a 6.022 x 1023 (Número de Avogadro). La masa
molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de los
componentes de la sustancia; por ejemplo: PM del ácido sulfúrico (H2SO4): 98 g/mol.
Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso más
frecuente son:
MOLARIDAD (M). Número de moles de soluto en un litro de solución. Un mol es el peso molecular
expresado en gramos.
MOLALIDAD (m). Número de moles de soluto en 1000 g de solvente.
NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución.
FRACCIÓN MOLAR (Xi). Número de moles de una sustancia en una solución entre la suma de
los moles de todos los componentes de la misma.
PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución. Existen diferentes tipos:
Porciento en peso (% p/p). Número de gramos de soluto en 100 g de solución.
Porciento en volumen (% v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mL de solución.
Porciento en peso-volumen (% p/v). Número de gramos de soluto en 100 mL de solución.
PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES

Se pueden dividir en tres categorías: Constitutivas, Aditivas y Coligativas.
Constitutivas: Dependen exclusivamente de la naturaleza de las moléculas que la forman, es
decir, de su constitución química (presencia de grupos funcionales, tipo y disposición de los
átomos, etc.) Son propiedades constitutivas el carácter ácido, básico, oxidante, reductor,
radioactivo, dulce, insípido, colorido, etc.
Aditivas: Dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la
solución, como la concentración, densidad, viscosidad.
Coligativas: Dependen del número de partículas por unidad de volumen. Estas propiedades, muy
importantes para los procesos biológicos son: descenso de la presión de vapor, descenso del
punto de congelación, elevación del punto de ebullición y presión osmótica, así como la constante
crioscópica, constante ebulloscópica, etc.
DIFUSIÓN, ÓSMOSIS,DIÁLISIS.
Las propiedades dinámicas de las soluciones son: Difusión Simple, y Difusión a través de
membranas (Ósmosis, y Diálisis).
Difusión es el proceso físico químico por el cual las moléculas, ya sea en estado de gas o
líquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio de que disponen formando un
medio homogéneo.
En el caso de los gases, la difusión está sujeta a la “Ley General de la Energía”, la cual
establece que la velocidad con que se mueve una partícula es inversamente proporcional a
la raíz cuadrada de su masa.
En los líquidos la velocidad de difusión es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos:
a) Naturaleza de la sustancia que difunde c) Tamaño y concentración de las partículas.

b) Área de difusión d) Temperatura
Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusión y Fick, de acuerdo con los
mismos estableció la siguiente relación:
dm dc
v= = KQ
dt ds
v = velocidad de difusión K = Constante de Difusión dm = cantidad de sustancia que difunde
dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusión dc = concentración de la sustancia que difunde.
ds = espacio que recorre la sustancia al difundir.
Así, la velocidad de difusión es directamente proporcional al gradiente de concentración y al
área de sección. A temperatura, gradiente de concentración y área constantes, cada sustancia
tiene una velocidad de difusión característica con relación al peso molecular por lo que se
incluye una constante K llamada constante de difusión.
DIFUSIÓN SIMPLE (EN LÍQUIDOS)

EXPERIMENTO 1
Llene casi completamente una probeta de 100 mL con agua de la llave y luego
espolvoree, con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie
del agua y observe que ocurre. Anote sus observaciones.
A continuación caliente ligeramente la probeta en cualquier punto y nuevamente observe
que ocurre al agregar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogeneizado el colorante, la
difusión se ha efectuado.
1) ¿Es uniforme el descenso del colorante a través de la columna de agua?

2) ¿Qué sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta?
3) ¿Qué es disolución, convección y difusión?
DIFUSIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANAS
Cuando se interpone en el sistema una membrana dialítica, permeable al agua y a solutos

cristaloides pero no a coloides, la sustancia sigue difundiendo como si la membrana no existiera

dependiendo de los factores ya señalados, pero la naturaleza de la membrana será un factor

adicional. En estos casos, K recibe el nombre de constante de permeabilidad. Esta difusión es
inversamente proporcional a su peso molecular.
ÓSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA
Si dos soluciones de diferente concentración están separadas por una membrana

semipermeable, el solvente de la solución menos concentrada difunde a la de mayor
concentración. Esto se explica termodinámicamente porque la solución diluida tiene una tendencia
de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendencia de escape o presión de vapor es muy
baja cuando la solución está concentrada. Este fenómeno es conocido como ósmosis y ejerce
una presión osmótica, propiedad coligativa de gran importancia fisiológica ya que interviene en la
regulación del volumen de sangre circulante, así como en la eliminación de edemas tisulares, y es
la razón por la cual el paciente diabético elimina frecuentemente grandes cantidades de orina
(poliuria). Esta última está ocasionada por la alta concentración de glucosa en sangre y forma
parte de la triada sintomática clásica del diabético: Polifagia, Polidipsia y Poliuria.
MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

MÉTODO DIRECTO
EXPERIMENTO 2
No existe membrana semipermeable perfecta, pero las
que más se acercan a esto son las de ferrocianuro de cobre y
las de pergamino. Aquí se utilizará una membrana dialítica de
colodión que nos dará una medida aproximada de la presión
osmótica en el dispositivo llamado OSMÓMETRO.
El osmómetro consiste en un compartimiento que

contiene una solución de sacarosa 1M teñida con rojo neutro
y el cual es el cuerpo de una jeringa hipodérmica de 5 mL de
capacidad y la cual presenta una banda de hule inferior que
permite la fijación de una membrana de celofán, humedecida
previamente durante 5 a 10 minutos. Mientras que la banda
superior sirve para sellar el orificio de llenado de la cámara.
Por la parte correspondiente al pivote, se le agrega el trocar
metálico de un catéter el cual se introduce en el extremo de un
capilar de polietileno. El extremo de esta cámara se sumerge
en un vaso de precipitados con agua. Una vez hecho esto se
marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar, leyendo cada
15 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el
proceso. Anote sus resultados en la tabla.
Nota: cualquier error en el montaje del osmómetro se

manifestará por salida de solución coloreada del dispositivo.

Tiempo min. Altura mm Tiempo min. Altura mm

15 75
30 90
45 105
60 120
1) Graficar tiempo en las abscisas (eje x) y altura en milímetros en las ordenadas (eje y).
CÁLCULO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA
La columna de sacarosa ejercerá finalmente una presión que se opone al paso del agua
(Presión Hidrostática). Calculando ésta, se puede conocer la presión osmótica ya que ambas son
iguales.
Esto se hace mediante la fórmula:
π = hρg
h = altura a la que asciende la solución de sacarosa (en metros)

ρ = densidad de la solución de sacarosa (1.088 g/mL) (convertirla a kg/m3)
g = aceleración debida a la gravedad (9.81 m/s2)
Efectuando esta operación encontramos la presión osmótica en Pascales. Para obtener

atmósferas usamos la siguiente equivalencia:
1 Pa
1 atm =
1.013 × 105
1) ¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?
2) ¿Depende sólo de la altura la presión osmótica? Explique.
3) ¿Influye el radio del capilar en la presión osmótica? Explique.
4) ¿La sacarosa y el colorante dializan?
DIÁLISIS
Ejemplo de membranas dialíticas son el celofán (Cellophane) y el colodión.

Se deberá poner particular atención al hecho de que este experimento es la base del
tratamiento de pacientes renales descompensados por medio de dialisis, la cual es útil también
para eliminar sustancias nitrogenadas, medicamentos en exceso o exceso de acidez en sangre.
EXPERIMENTO 3
Humedezca por inmersión en agua destilada durante 10 minutos la sección del tubo de
colodión o celofán de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de diámetro y cierre un extremo
atándolo con hilo de algodón. Llénelo con una mezcla de 1 mL de solución de NaCl al 2%
preparado en el experimento 1b y 10 mL de solución de almidón al 1%.

Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspéndalo en un vaso de precipitados con
agua destilada. Se determinará almidón por medio de la prueba del yodo y cloruros con solución
de nitrato de plata en el líquido del vaso de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la
hora y a las dos horas.
Prepare dos tubos de ensayo, uno ellos con 2 mL de NaCl al 2% y agréguele 5 gotas de
AgNO3 (nitrato de plata), al otro tubo agréguele 2 mL de solución de almidón al 1% y 2 gotas de
solución de Lugol. Rotúlelos como testigo de cloruros y testigo de almidón respectivamente
Pasado este tiempo repita las dos pruebas en el líquido contenido en el saco.
1) ¿Ha dializado el almidón a través de la membrana?
2) ¿Dializó el cloruro de sodio?
3) Explique este fenómeno.
PREPARACION DE SOLUCIONES
EXPERIMENTO 4
Preparación de una solución 0.5M de ácido acético (CH3-COOH). Prepare 100 mL de
una solución de ácido acético 0.5M tomando como base los siguientes datos: El ácido acético
tiene un peso molecular de 60, la pureza del reactivo es de 99.7% y la densidad a 20°C es de 1.06
g/mL. Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimento siguiente.
1) Describa detalladamente los cálculos que hizo para conocer el volumen de ácido acético
concentrado que utilizó para preparar los 100 mL de dicha solución.
R = _________ mL de CH3-COOH.
2) Considerando que la solución es 0.5M calcule las concentraciones siguientes:
% (p/v) =
normalidad =
mmoles/L =
gramos/L =
mEq % =
osmolaridad =
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN POR TITULACIÓN
EXPERIMENTO 5
En este experimento se utilizará la solución de ácido acético (solución problema) que se
preparó en el experimento 4.
En un matraz Erlenmeyer de 250 mL se colocan 10 mL de la solución de ácido acético
problema, midiéndolos con la máxima exactitud posible. Añada 2 gotas de fenolftaleína y titule
utilizando solución de NaOH 0.2N. Recuerde que el punto de titulación se observará cuando
persista por más de un minuto un ligero color rosa.

1) ¿Cuántos mL de NaOH 0.2N gastó para neutralizar los 10 mL de la solución de ácido

acético? R = _____________ mL
2) De acuerdo con los resultados que obtuvo y considerando que la solución de NaOH es
exactamente 0.2N. ¿Cuál es la verdadera normalidad del ácido acético problema?
R = _________ N.
3) Escriba el concepto de titulación ácido-base.

3. ELECTROLITOS y pH
ELECTROLITOS
C
uando una corriente eléctrica circula por una solución acuosa de cloruro de sodio (NaCl),
hay una transferencia de materia, la cual consiste en partículas con carga llamadas iones.
Los iones que se mueven hacia el ánodo (polo positivo) son los aniones, los que migran
hacia el cátodo (polo negativo) son los cationes y hay liberación de hidrógeno y cloro, evidencia
de la descomposición del agua, proceso al cual se le llama electrolisis.
Las sustancias que en solución acuosa permiten el paso de la corriente se conocen como
electrolitos y a los que no manifiestan esta propiedad como no electrolitos. A esta capacidad de
dar paso a la electricidad se le conoce como conductancia.
Los electrolitos de clasifican en fuertes y débiles según su potencia para conducir la
corriente eléctrica.
Los electrólitos fuertes son muy disociables como las sales minerales, los hidróxidos de
metales alcalinos, y los ácidos minerales. En los líquidos del organismo encontramos como
ejemplo de electrolitos fuertes al cloruro de sodio (NaCl), cloruro de potasio (KCl) y cloruro de
calcio (CaCl2), entre otros.
Son electrólitos débiles la mayor parte de los compuestos orgánicos (como los ácidos
láctico, pirúvico, etc.), y los compuestos nitrogenados. En el agua corporal hay muchos ejemplos
de compuestos no electrolitos como glucosa, urea y creatinina.
CONDUCTIVIDAD
La conductividad de las soluciones electrolíticas depende exclusivamente de las moléculas

disociadas, y por lo tanto depende del grado de disociación y de la concentración de los
electrólitos presentes. Entre mayor sea la concentración, mayor será la conductividad, hasta un
límite determinado en el cual se hace constante y luego disminuye, explicándose esto porque
cuando la concentración de cationes y aniones es grande, interfieren entre sí y en tal caso los
cationes tienen una menor libertad para desplazarse debido a la interacción con los aniones
cercanos en la solución y viceversa.
Esta explicación se puede aprovechar para explicar la fuerza iónica de una solución, ya
que al no desplazarse libremente las moléculas en la solución, la “concentración activa” o
“actividad” de las soluciones es menor que la concentración real, por lo tanto:
1
I=
2
∑ Cz 2
La fuerza iónica es la semisuma del producto de la concentración del ión por la

valencia al cuadrado.
Se sabe que las fuerzas de atracción entre iones de carga con signos contrarios disminuye
rápidamente al crecer las distancias. En las soluciones concentradas, en las que los iones se
encuentran más cercanos, se hacen mayores y por lo tanto la actividad se hace menor, en las
soluciones muy diluidas la actividad y la concentración efectiva son equivalentes entre sí.

ELECTRÓLISIS DEL AGUA

EXPERIMENTO 1
Coloque un cristalizador sobre un fondo blanco y agregue 50 mL de solución de NaCl al
10%. Introduzca en la solución electrodos de carbón provenientes de una fuente de energía como
el puente de Wheatstone. Observe la formación de gas y agregue entre los electrodos 3 gotas de
azul de bromofenol como indicador y observe los cambios de coloración en la solución cercana a
los electrodos.
a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos.
b) Esquematice el proceso de la electrólisis del agua.
CONDUCCIÓN DE CORRIENTE EN ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES
EXPERIMENTO 2
Coloque la solución de ácido clorhídrico (HCl) 0.5M en un vaso de precipitados en cantidad
suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud.
Introduzca los electrodos conectados a una fuente de energía y observe el paso de la corriente
eléctrica manifestado por la intensidad de la luz emitida por el foco. Observe también la intensidad
luminosa con relación a la distancia entre los electrodos, sin ponerlos en contacto.
Repita el experimento usando ácido acético (CH3COOH) 0.5M. Anote sus resultados:
Variación con la
Solución Intensidad luminosa
distancia
HCl 0.5M
CH3COOH 0.5M
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE pH CONOCIDO

CON ELECTRÓLITOS FUERTES Y DÉBILES
Los ácidos o las bases se clasifican en débiles o fuertes según su grado de disociación, así
los electrólitos fuertes son los que están más disociados y por lo tanto la concentración molar del
ión hidrógeno o del ión hidroxilo en sus soluciones será igual a la normalidad, lo que simplifica el
cálculo de su pH.
pH = -log [H+] y pOH = -log [OH-]
Además en toda solución acuosa: pH + pOH = 14
Pero en el caso de los ácidos y bases débiles, los cuales están parcialmente disociados,
además de conocer la normalidad del ácido o base, deberá conocerse el grado de disociación de
la sustancia, o sea, la constante de disociación ácida Ka o básica Kb, la cual es diferente para cada
sustancia. En el cálculo del pH se deberá aplicar la fórmula en la que se toman en cuenta la
constante K de disociación respectiva y la molaridad C de la solución.

pH = 1/2pKa – 1/2log C y pOH = 1/2 pKb – 1/2log C
EXPERIMENTO 3
Empleando la fórmula que corresponda, calcule las cantidades adecuadas para preparar
250 mL de cada una de las siguientes soluciones de ácido clorhídrico de pH = 1.3, 1.6 y 2 a partir
de HCl al 37% de pureza y densidad de 1.18 g/mL y 250 mL de cada una de las siguientes
soluciones de ácido acético a pH de 3.02, 3.17 y 3.37 a partir de CH3-COOH al 99.7% de pureza,
densidad de 1.06 g/mL y pKa = 4.74. Prepare el par de soluciones que le indique su profesor y
consérvelas para el siguiente experimento.
ACIDEZ VERDADERA Y ACIDEZ DE TITULACIÓN
EXPERIMENTO 4
Determine con papel indicador el pH de cada una de las soluciones que preparó en el
experimento anterior. A continuación determine el pH potenciométrico de cada una de ellas.
Posteriormente, mida exactamente 20 mL de cada una y colóquelos en matraces Erlenmeyer,
añada 2 gotas de solución de fenolftaleína y titúlelas con NaOH 0.1N.
Anote sus resultados en el siguiente cuadro:
Solució PH Gasto de NaOH 0.1N ml

n teórico potenciométrico colorimétrico teórico experimental concentración
HCl
CH3COOH

4. SOLUCIONES REGULADORAS
L
as soluciones a las cuales se les puede añadir cantidades relativamente grandes de ácidos o
álcalis sin alterar de manera significativa su pH, se les llama soluciones reguladoras,
amortiguadoras, buffer o tampón.
Esta acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un sistema formado por
un ácido o una base débil y sus sales correspondientes.
Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al que
representaremos por HA y su sal, representada por BA los hidrogeniones existentes en ella
procederán únicamente de las moléculas ácidas, que se disocian como sigue:
HA   H++ A-
El equilibrio de la reacción está dado por la siguiente ecuación:
[H+] [A- ]
--------------------- = Ka
[HA]
Donde Ka es la constante de disociación del ácido. De esta ecuación se deduce que la

concentración de hidrogeniones es:
Ka [HA]
+
[H ] = ------------------
[A- ]
La relación entre estas dos constantes es, sin embargo, tan sensiblemente constante en
condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentración de A- es igual a la concentración
de la SAL. Sustituyendo una expresión por otra en la ecuación anterior tenemos:
[Ácido]
+
[H ] = Ka ---------------
[Sal]
Si se toman logaritmos negativos en ambos términos de la ecuación, (manipulación matemática

para manejar numeros pequeños), queda así:
[Ácido]
- log [H+] = - log Ka – log ---------------
[Sal]
Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analogía podemos decir que –log de Ka es igual
a pKa por lo que:
[Ácido]
pH = pKa – log ---------------
[Sal]

Por otra parte por las leyes de los logaritmos, las expresiones –log de ([Ácido]/[Sal]) y
+ log de ([Sal]/[Ácido]) son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que
hechas todas las modificaciones la ecuación queda finalmente como sigue:
[Sal]
pH = pKa + log ----------
[Ácido]
Esta ecuación se conoce con el nombre de Ecuación de Henderson–Hasselbalch y nos

indica que el pH de una solución que contenga un ácido débil y su sal está determinado por el
valor de pKa (constante para cada ácido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la
concentración de la sal entre la concentración del ácido.
Por ejemplo, el valor de la constante de disociación K a del ácido acético es de 1.8 x10-5. El
valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución reguladora que posea iguales
cantidades de ácido acético y acetato de sodio en concentración 0.1N, el pH de esa solución
sería de:
0.1N
pH = 4.74 + log ---------- = 4.74
0.1N
Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las soluciones
reguladoras tienen dentro del organismo un papel de importancia capital que es el de evitar que
aumente o disminuya de manera importante la concentración de iones hidrógeno, ya que la vida
humana es posible en límites muy estrechos de pH, es decir, para la sangre arterial un pH de 7.40
y para sangre venosa y líquidos intersticiales 7.35. Este último es menor por tener mas CO2 y por
lo tanto mas H2CO3 producido metabólicamente. Se sabe que los límites máximos de pH en los
que por algunos minutos puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones son de
7.0 a 7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios sistemas amortiguadores,
como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es amortiguado por todos los sistemas
presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos.
La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores,
constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos
H2PO4-/HPO4= con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal
amortiguador intracelular.
El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales es el sistema
bicarbonato H2CO3/HCO3- con un pKa de 6.1
Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos. En el interior del eritrocito, además
del bicarbonato, el amortiguador de mayor importancia es el de hemoglobina reducida /
oxihemoglobinato (HHb/HbO2)
Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existen excesos de álcali ó
ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las proteínas, la distribución
de otros iones entre las células y el líquido extracelular, la actividad de hormonas y fármacos, etc.
APRECIACIÓN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN

EXPERIMENTO 1
Disponga 3 series de 4 tubos de ensayo cada una. Numere los tubos del 1 al 4. Coloque en
los tubos número 1 de cada serie 5 mL de agua destilada hervida. En los tubos número 2, 5 mL de
solución de cloruro de potasio (KCl) 0.5M en tanto que en los tubos número 3 ponga una mezcla
formada por 2 mL de solución de fosfato diácido de potasio (KH2PO4) ) 0.01M y 3 mL de solución
de fosfato monoácido disódico (Na2HPO4) 0.01M. En los tubos número 4 ponga 2 mL de solución
de KH2PO4 0.1M y 3 mL de solución de Na2HPO4 0.1M. A continuación compruebe en la serie 1
que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello haga uso del método
colorimétrico empleando rojo de fenol (rosa); agregue cinco gotas de indicador a cada uno de los
tubos de la serie y observe el color característico amarillo o rojo (pH 6.8 a 8.2).
A los cuatro tubos de la serie 2 adicione cinco gotas de verde de bromocresol, indicador
de zona ácida. A continuación agregue 10 gotas de HCl 0.01M al tubo número 1 y observe el
cambio de color que se opera (de verde a amarillo). Enseguida vea el número de gotas de la
misma solución de HCl 0.01M que es necesario agregar al tubo 2 de la serie en cuestión para
igualar la coloración (aunque no la intensidad) con el tubo número 1. Ahora, cuente el número de
gotas de solución de HCl 0.1M que es necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la
coloración con el tubo número 1.
A los cuatro tubos de la serie 3, adicione cinco gotas de azul de timol, indicador de zona
alcalina que vira de amarillo a azul fuerte (pH 8.0 a 9.6). A continuación agregue 10 gotas de
solución de NaOH 0.01M al tubo número 1 y observe también el cambio de coloración (de amarillo
a azul).
Determine el número de gotas de la misma solución de NaOH 0.01M que es necesario

agregar al tubo número 2 de esta serie para que adquieran el mismo color del tubo número 1,
(amarillo a azul). A continuación, cuente el número de gotas de solución de NaOH 0.1M que es
necesario agregar a los tubos 3 y 4 para igualar la coloración con el tubo número 1.
1) ¿Qué indica el cambio de color en cada una de las series?

2) ¿Cómo explicaría usted la diferencia en las cantidades de ácido y base que deben
agregarse a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar la coloración
con el tubo 1? Recuerde que cada gota de las soluciones 0.1M equivale a 10 gotas de
las soluciones 0.01M.
CURVAS DE TITULACIÓN
Existen sustancias de mucha importancia en bioquímica como son los aminoácidos y las proteínas
los cuales tienen grupos titulables y que actúan como anfolitos aceptando iones H+ o iones OH-.
En este experimento se determinarán las curvas de titulación de glicina con HCl y con NaOH.
EXPERIMENTO 2
En dos vasos de precipitados de 150 mL coloque 30 mL de solución de glicina 0.1N,
agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, tómeles el pH y titule, como se indica
en la tabla, uno con NaOH 0.1N y el otro con HCl 0.1N.

Agregar HCl 0.1N Glicina 0.1N Agregar NaOH 0.1N Glicina 0.1N
30 ml 30 ml
ml Acumulativo pH ml Acumulativo pH
0 0 0 0
2 2 2 2
3 5 3 5
4 9 4 9
5 14 5 14
5 19 5 19
5 24 5 24
1 25 1 25
1 26 1 26
1 27 1 27
1 28 1 28
0.5 28.5 0.5 28.5
0.5 29 0.5 29
Grafique dando a los valores acumulativos de HCl signo negativo y a los de NaOH signo
positivo, en el eje de las x y el pH en el eje de las y.
1) En su gráfica, identifique los valores de pK1 y pK2.

2) Calcule el punto isoeléctrico sabiendo que:
pK1 + pK 2
pI =
2
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES REGULADORAS
EXPERIMENTO 3
Empleando la fórmula de Henderson Hasselbalch, calcule los volúmenes
necesarios para preparar soluciones amortiguadoras con los valores de pH que le indique su
profesor, empleando fosfato diácido de potasio (KH2PO4) 0.1M y fosfato monoácido de sodio
(Na2HPO4) 0.1M (pK2 = 7.2); posteriormente prepárelas y compruebe sus resultados midiendo
el pH potenciométrico.
1) Explique la coincidencia o no, entre sus resultados y el cálculo teórico.

5. PROTEÍNAS
E
l nombre de proteínas deriva del griego protos que significa “primero”, “primordial” o
fundamental y son los componentes principales del protoplasma y las membranas
celulares, tanto de animales como de vegetales.
Las proteínas contienen en su molécula C, H, O, N y en ocasiones P y S; El nitrógeno
constituye aproximadamente el 16%; poseen además la característica de que por hidrólisis se
desdoblan dando como producto final α aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y
posición en cada proteína. La estructura de una proteína está determinada por cuatro niveles de
organización o niveles estructurales que se designan como estructuras primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria.
La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos que se unen entre sí
por el enlace peptídico (-CO-NH-) covalente.
La estructura secundaria consiste en que la cadena polipeptídica puede enrollarse sobre sí
misma formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformación, estabilizada por puentes
de hidrógeno
La estructura terciaria es una cadena polipeptídica ya enrollada que adopta en el espacio la
conformación más estable, o sea, sufre un súper enrollamiento
La estructura cuaternaria puede estar constituida por más de una cadena polipeptídica y la
asociación de estas cadenas en el espacio adoptan una estructura tridimensional característica
que les da actividad biológica.
Tanto la estructura terciaria como la cuaternaria carecen de enlaces definidos, ya que participan
todos los tipos de enlaces químicos, fuertes o débiles, en estos niveles estructurales.
Existen muchos tipos de proteínas en un organismo, cada una con una función específica;
algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores, hormonas, transportadores de
gases, transportadores de solutos a través de la membrana, transportadores de electrones,
en mecanismos de defensa, mecanismos genéticos, en el mantenimiento del balance
hidroelectrolítico,(presión oncótica), etc.
La actividad de una proteína depende fundamentalmente de su conformación espacial,

mas que de su estructura química. Existe una gran cantidad de agentes físicos y químicos
capaces de modificar la conformación de las proteínas al alterar los diferentes enlaces que
estabilizan las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria.
Estos agentes se denominan agentes desnaturalizantes, algunos de los más comunes son
ácidos o bases, detergentes, metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor,
radiaciones ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas, sales inorgánicas, sustancias
orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc.
Las proteínas tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas; si se modifican
por cualquiera de los agentes anteriores en su conformación, se transforman en proteínas
desnaturalizadas, las cuales generalmente pierden su actividad, modifican su solubilidad y
precipitan

ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS
Muchas de las propiedades fisicoquímicas y biológicas características de las proteínas son

reflejo de los aminoácidos que las constituyen y las reacciones coloridas que se utilizan para su
análisis en realidad detectan la presencia de un aminoácido específico.
REACCIÓN DE MILLÓN
La reacción de Millón es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva
todas las sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y
todas aquellas proteínas que contengan tirosina.
EXPERIMENTO 1
Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno, 2 mL de
una de las soluciones siguientes:
Tubo Proteína (al 2%)
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina
Posteriormente añada 5 gotas del reactivo de Millón. Caliente ligeramente hasta que la
solución hierva. ¡Precaución!. La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de
un precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo. La presencia de sales así como
soluciones muy alcalinas pueden interferir en esta reacción.
1) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.

2) Explique en qué consiste el reactivo de Millón y cuál es el mecanismo que se ha
propuesto para esta reacción.
REACCIÓN DEL BIURET
Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo tanto todas las
proteínas y todos los péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reacción del biuret. El
nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba.
Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre (CuSO4) en
solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta.
El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de
nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y
péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis proteica,
la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa.
EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 1 mL de las
siguientes soluciones:
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

Añada 2 mL de solución de NaOH al 10% ¡Precaución! y 3 a 5 gotas de solución de sulfato

de cobre CuSO4 al 1%. Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La
aparición de una coloración violeta o rosa en no más de 20 minutos debe considerarse como
prueba positiva.

2) ¿Se puede considerar la reacción del biuret como característica para todas las
proteínas? ¿Por qué?
3) Escriba la reacción.
REACCIÓN XANTOPROTÉICA
Esta reacción se debe a la formación de nitro derivados aromáticos por reacción del
ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina,
la tirosina y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan
aminoácidos aromáticos en su molécula.
EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 4 tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una
de las siguientes soluciones:
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina
Añada 1 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado ¡con cuidado!, caliente ligeramente y
observe una coloración amarilla característica. Deje enfriar esta solución y añada cuidadosamente
gotas de hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado, haciéndolas resbalar cuidadosamente por las
paredes del tubo, para estratificar. En la interfase se observará un anillo naranja.
2) ¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?
3) Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3.
REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Las proteínas que contengan los aminoácidos cisteína y cistina cuando se tratan con
álcalis concentrados, desprenden ácido sulfhídrico H2S, el cual se puede reconocer por su olor
fuertemente desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negro de
sulfuro de plomo (PbS).
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de cuatro tubos de ensayo numerados, coloque en cada uno 2 mL de una
de las siguientes soluciones:
1 Peptona
2 Caseína
3 Gelatina
4 Albúmina

Agregue 2 mL de hidróxido de sodio (NaOH) al 10%. ¡Precaución! Caliente ligeramente.

Añada a todos los tubos 0.5 mL de solución de acetato de plomo (Pb(CH3COO)2). Coloque los
tubos en baño maría a ebullición por 5 min. El oscurecimiento de la solución o la formación de un
precipitado negro indica la presencia de aminoácidos azufrados.
2) Escriba la reacción química que se ha efectuado.
3) ¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacción?
REACCIÓN DE NINHIDRINA
Esta es una de las reacciones más sensibles que se conocen para identificar aminoácidos
en general, ya que puede poner de manifiesto una parte de cualquier aminoácido en 1 500 000
partes de agua. Los aminoácidos y muchas aminas primarias dan un color violeta característico.
La prolina da coloración amarilla. Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración
cuantitativa de aminoácidos por colorimetría. La valoración de aminoácidos en orina, por
ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatías,
infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacidemia se ve
acompañada por aminoaciduria paralela. Algunas enfermedades metabólicas congénitas dan
lugar a la eliminación anormal de algunos aminoácidos en la orina (p. ej. fenilcetonuria) .
EXPERIMENTO 5
Se utilizarán cuadros de papel filtro Whatman no. 1 de 2 x 2 cm, sobre los cuales se colocarán
gotas de las siguientes soluciones:
cuadro Sustancia:
1 Glicina
2 Peptona
3 Gelatina
4 Caseína
5 Albúmina
¡Precaución! Use guantes o pinzas para manipular el papel. Anote debajo de cada muestra
el nombre del compuesto y añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al 0.1%.
Coloque el papel en el horno a 110 °C durante 5 minutos.

3) ¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina, además de las proteínas,
péptidos y aminoácidos?
Tabla de resultados de algunas propiedades químicas de las proteínas:
REACCIÓN
AMINOÁCIDOS
SUSTANCIA MILLON BIURET XANTOPROTÉICA NINHIDRINA
AZUFRADOS
GLICINA
GELATINA
PEPTONA
CASEÍNA
ALBÚMINA

ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS
Muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a varias especies
debido a que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que es necesario estudiar sus
propiedades físicas y biológicas si se desea caracterizar una proteína. Las propiedades
fisicoquímicas de las proteínas dependen fundamentalmente del peso molecular, de su carga
eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula.
DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS
Cuando la estructura altamente ordenada de una proteína se somete a la acción de agentes

fisicoquímicos capaces de romper los diferentes enlaces que la estabilizan en sus subestructuras
2ª, 3ª y 4ª, queda reducida al llamado polímero estadístico formado por la cadena de aminoácidos
que además pierde toda actividad biológica.
Estos agentes pueden ser muy diversos y se denominan en general desnaturalizantes. A
continuación se consideran algunos de los más importantes como son los metales pesados, los
ácidos fuertes y el alcohol.
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS
Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico

son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes
proteinatos insolubles. Tomaremos como ejemplo dos proteínas, la peptona y la gelatina y
observaremos su reacción, en forma simultánea frente a los metales pesados : Hierro (Fe), Plata
(Ag), Mercurio (Hg), y Plomo (Pb).
EXPERIMENTO 6
Prepare una serie de 4 tubos de ensayo conteniendo 1 mL de peptona al 2% y rotúlelos
como P1 – P4 (por peptona). Prepare otra serie de 4 tubos, ésta vez con gelatina al 2%. Rotúlelos
como G1 – G4 (por gelatina) y agregue lo que se indica en la tabla. Anote sus observaciones en la
misma, evaluando por medio de cruces (de x a xxx según la turbiedad del precipitado):
Observaciones:
Serie Serie
P G Metal Pesado: Precipitado: Con exceso:
Agregar 2 gotas de Serie Serie Serie Serie
Tubos: solución al 2% de: P G P G
1 1 FeCl3
2 2 AgNO3
3 3 HgCl2
4 4 Pb(CH3COO) 2
1) ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas?
2) ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES
Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de
desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.
EXPERIMENTO 7a
Coloque en 4 tubos de ensayo numerados, 3 mL de las siguientes soluciones: peptona,
gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de ácido tricloroacético
(CCl3COOH) al 5%.
1) Anote sus resultados al final del capítulo.
2) ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y en general
de cualquier ácido?
EXPERIMENTO 7b
Prepare dos tubos de ensayo y márquelos como orina normal y orina de paciente
nefrótico, coloque en ellos 3 mL de la orina correspondiente. Agregue enseguida, resbalando
cuidadosamente por la pared del tubo, para estratificar, 2 mL de la mezcla HNO3 – metanol.
1) Observe lo que ocurre en la interfase y describa

2) ¿Qué explicación le da al fenómeno?
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ALCOHOL
EXPERIMENTO 8
Coloque en tubos de ensayo numerados, 2 mL de las siguientes soluciones: peptona,
caseína, gelatina y albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente, agregue 3 mL de alcohol de
96° (CH3CH2OH) y observe lo que ocurre en la interfase.
1) ¿Observa turbidez en todos los tubos?
2) Anote sus resultados en la tabla:
Agente Ácido tricloroacético Alcohol de 96°

Sustancia (CCl3COOH) al 5% (CH3CH2OH)
Peptona
Albúmina
Gelatina
Caseína
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas al igual que los aminoácidos son moléculas anfotéricas. Es decir, pueden
reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan con los iones
hidrógeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga
negativa. El pH en el cual una proteína no posee carga eléctrica neta se denomina punto
isoeléctrico, a este pH la proteína presenta su mínima solubilidad y generalmente precipita,
teniendo además una viscosidad máxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el
siguiente experimento.

EXPERIMENTO 9
Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la tabla:
Añada primero la caseína, posteriormente el agua y al final el ácido acético. Agite
todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se produce en cada tubo
inmediatamente y después de 15’ y 30’.
1) Anote sus observaciones en la tabla valorando con cruces.
2) Calcule el pH teórico de cada tubo, aplicando la ecuación de Henderson - Hasselbalch y
anótelo en la tabla.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N ml 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Agua destilada ml 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Ácido acético 1N ml - - - - - - - - 1.6
Ácido acético 0.1N ml - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
Ácido acético 0.01N ml 0.6 1.2 - - - - - - -
pH teórico
Observación a los 15 minutos
Observación a los 30 minutos

6. CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS
D
e acuerdo con la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende
de la concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta Ley establece
que: “La magnitud de una reacción es proporcional a la masa activa de las
sustancias reaccionantes presentes en ese momento”.
El término masa activa significa la concentración molecular o sea, la cantidad presente por
unidad de volumen. Si reaccionan:
V1
A + B ←→ C + D
V2
La velocidad V1 con que reaccionan A y B para producir C y D depende de la concentración
de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí, pero como esto se puede
considerar constante, podemos decir que:
V1 = k1[A][B]
La velocidad V2 con que reaccionan C y D para producir A y B depende a su vez, de la
concentración de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir también que:
V2 = k2[C][D]
Cuando se alcanza el equilibrio químico, las dos velocidades son iguales. Es decir:
V1 = V2
Sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:
k1[A][B] = k2[C][D]
k1 [C][D]
---- = ---------
k2 [A][B]
Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante podemos decir que:
[C][D]
keq = ---------
[A][B]
Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y keq se conoce como
Constante de Equilibrio.
COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS
EXPERIMENTO 1
En un vaso de precipitados de 600 mL de capacidad, añada 100 mL de agua destilada, 1
mL de solución de sulfocianuro de amonio (NH4SCN) 0.2M y 1 mL de solución de cloruro férrico
(FeCl3) 0.2M en HCl 0.1N mezclando hasta lograr la homogeneidad. Observará la aparición de
una coloración roja, debida a la formación de sulfocianuro férrico (Fe(SCN)3).

En cuatro vasos de precipitados de 100 mL de capacidad, coloque en cada uno 25 mL de la

mezcla reaccionante anterior, después de haber agitado hasta completa homogeneidad,
enseguida agregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente:
Reactivo FeCl3 0.2M en HCl 0.1N ml NH4SCN 0.2M ml NH4Cl ml

Vaso
1 0.5 0.5 --
2 1.0 1.0 --
3 -- -- 5.0
4 Testigo --

2) Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y de acuerdo a la Ley de Acción
de Masas y al principio de Le Chatelier trate de explicar sus resultados.
VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA

Las reacciones químicas de acuerdo al número de moléculas que toman parte de ellas se
clasifican en: monomoleculares, cuando participa una sola molécula. Ejemplo:
A B
Bimoleculares cuando participan dos moléculas. Ejemplo:
A + B  AB
Trimoleculares cuando participan tres moléculas simultáneamente. Ejemplo:
A + B + C  ABC
Las reacciones trimoleculares son muy raras y reacciones de más de tres reaccionantes no
se conocen.
Cuando se estudia la cinética de una reacción, tiene mas importancia conocer el orden de
la reacción que el tipo. El orden de una reacción nos indica la relación entre la velocidad y la
concentración de los reactivos, por lo que se clasifican en:
Reacciones de orden cero. Su velocidad no es afectada por la concentración. Está
determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de difusión, etc.
Reacciones de primer orden. Su velocidad de reacción es directamente proporcional a la
concentración de una de las sustancias reaccionantes.
Reacciones de segundo orden. Su velocidad de reacción es proporcional a la concentración
de dos sustancias reaccionantes.
Reacciones de tercer orden. Su velocidad de reacción es proporcional a la concentración de
tres sustancias reaccionantes.
La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo
correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente la reacción puede
representarse así:
dc
----- = Ke
dt
dt = tiempo dc = concentración del material Ke = constante específica de velocidad de reacción
Si representamos por a la concentración inicial de material y por x la cantidad que ha

reaccionado en el tiempo t, la expresión a-x significa concentración del material en el tiempo t. La
ecuación anterior puede expresarse en función de a, x y t y al integrarla nos queda:
2.303 a
Ke =------------ x log --------
t (a – x)
Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, la ecuación se
simplifica y queda:
2.303 (log 2)
Ke =-------------------------
t1/2
Donde t1/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se
descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante.
VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL H2O2
EXPERIMENTO 2
Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, 5 mL de una solución problema
de peróxido de hidrógeno (H2O2) y 2 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6). Caliente la mezcla hasta
casi ebullición ¡PRECAUCIÓN! y así en caliente, titule con una solución de permanganato de
potasio (KMnO4) 0.01M. El punto final de la titulación lo observará cuando persista un ligero color
rosa, por exceso de la solución de permanganato. El H2SO4 y el calentamiento tienen por objeto
impedir la formación de MnO2.
Haga esta determinación por duplicado y haga el promedio de las dos determinaciones.
A continuación prepare una mezcla de 50 mL de sangre desfibrinada al 0.06% y 50 mL de
la solución problema de peróxido de hidrógeno. A los 5, 10, 20, 30 y 40 minutos tome alícuotas
de 10 mL y transfiéralos a un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, añada 2 mL de solución
de H2SO4 (1:6) caliente hasta casi ebullición y titule con una solución de permanganato de potasio
(KMnO4) 0.01M en la forma ya explicada.
1) Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.
2) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
Tiempo/s KMnO4 0.01M/mL (a – x) moles/litro log a/(a-x) Ke

0
300
600
1200
1800
2400
Para calcular la Ke a cada tiempo debe utilizar la ecuación:
2.303 a
Ke = ------------ x log --------
t (a – x)
1) Determine el orden de reacción gráficamente.

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA
Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas
reacciones aumenta al aumentar la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa
matemáticamente la forma como la temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual
está dada por la siguiente ecuación:
d(ln K) E
----------- = ----------
dt RT2
La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una
reacción es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por
la constante de los gases. E es la energía de activación. Actualmente se considera que para
que las moléculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una
cantidad de energía E.
Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius:
K2 E (t2 - t1)
log ------- = -------------
K1 2.3 (R t1 t2)
K2 E (t2 - t1)
log ------- = ----------------
K1 2.3 (1.99) (t1 t2)
K2 0.219E (t2 - t1)

log ------- = ----------------------
K1 (t1 t2)
Si consideramos que E = 1200 calorías al aumentar la temperatura de 22°C a 32°C,

tendríamos:
K2 0.219 x 1200 x (305 - 295)
log ------- = --------------------------------------- = 0.29
K1 (295 x 305)
K2
antilog log ------- = antilog 0.29
K1
K2
------- = 2
K1
Esto quiere decir que por cada 10°C de aumento la velocidad de la reacción se duplica.
En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas
límites.

EXPERIMENTO 3
Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad 0.25 g de yoduro de potasio
(KI) y añada 25 mL de solución de H2SO4 1:6. Agite hasta disolución completa y agregue agua
destilada hasta completar 50 mL. Esta solución se denominará Solución de ácido yodhídrico
HI y se utilizará en este experimento y en el siguiente.
Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL y agregue los reactivos según la
tabla que se muestra a continuación:
vaso 1 2 3 4 5
solución
HI ml 5 5 5 5 5
Na2S2O3 0.02N ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Almidón gotas 5 5 5 5 5
Preincubar 5 minutos a: 5 °C 25 °C 40 °C 60 °C 90 °C
H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2
Deberá medir con la mayor precisión posible el tiempo desde el momento de añadir el
H2O2 al 0.2% hasta el momento en que aparece súbitamente un color azul intenso.
1) Escriba las reacciones químicas que se han efectuado.

Temperatura Tiempo de aparición del

°C color azul en segundos:
5
25
40
60
90
3) Trace la gráfica de 1/tiempo de reacción en las ordenadas contra la temperatura en las

abscisas.
EFECTO DE LA [H+] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA
Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio, sobre todo
aquellas en las que participan ácidos. Actualmente se acepta que las moléculas deben ser
activadas antes de que puedan reaccionar. Aparentemente el pH ácido favorece la ionización y el
estado iónico se puede considerar como un estado activado.
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mL de capacidad y numérelos del 1 al

5 y agregue los reactivos según se indica en la tabla siguiente:
Vaso 1 2 3 4 5
Solución
HI ml 5 5 5 5 5
Na2S2O3 0.02N ml 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
Almidón gotas 5 5 5 5 5
H2O destilada ml 5
HCl 0.01N ml 5
HCl 0.1N ml 5
HCl 1N ml 5
HCl 2N ml 5
H2O2 al 0.2% ml 2 2 2 2 2
[H+] Tiempo de reacción

en segundos:
1 x 10-7
1 x 10-2
1 x 10-1
1
2
2) Según sus resultados trace una gráfica con el 1/tiempo en segundos en las ordenadas y
la concentración de H+ en las abscisas.
VELOCIDAD DE REACCIÓN Y CATALIZADORES
La velocidad de una reacción química frecuentemente es afectada por la presencia de

“sustancias extrañas” que permanecen inalteradas al terminar la reacción. Cualquier sustancia que
sea capaz de acelerar una reacción química y que no sea consumida por ellas, se denomina
catalizador y el proceso se conoce con el nombre de catálisis.
La función de un catalizador es disminuir la energía de activación, por lo que las moléculas
son activadas con menor cantidad de energía produciéndose reacciones más rápidas. En un
principio se supuso que los catalizadores actuaban por “presencia”. Es decir, que no intervenían
en los procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente se acepta que el catalizador se
combina con el sustrato formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo.
Supongamos la reacción:
A + B  AB
Esta reacción en condiciones normales se efectúa muy lentamente pero si se añade un
catalizador C apropiado, tenemos:
A + B + C   (AC) + B   AB + C
Estas reacciones son rápidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez. Estas
sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias orgánicas complejas producidas
por las células y son denominadas enzimas.

EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE

LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA
La sacarosa es un disacárido no reductor, pero al hidrolizarse, cada molécula libera una

molécula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. Basándose en esto es posible
visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la concentración de azúcares
reductores con algún reactivo apropiado.
EXPERIMENTO 5
Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de sacarosa al 0.05M.
Un tubo quedará como testigo y al otro se agregarán 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) (1:6). Se
ponen ambos tubos en baño maría a ebullición durante 15 minutos, complete el volumen si es
necesario. Emplearemos el reactivo de Fehling para lo cual el tubo que contiene el H2SO4 se
neutraliza con 1 ml hidróxido de sodio (NaOH) al 10% y posteriormente se añade 2 mL de la
solución “A” y 2 mL de la solución “B” del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente y se
colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del baño y se
dejan enfriar y se observa si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos.
1) ¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador? ¿Por qué?
EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLOGICO (ENZIMA) SOBRE

LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA
Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgánicos y las enzimas es que
los primeros solo son capaces de acelerar un proceso que ya está en marcha, mientras que las
enzimas son capaces de iniciar una nueva reacción.
Para esta práctica emplearemos como enzima la sacarasa, también conocida como
invertasa o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas.
Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa. Así hidroliza la estaquiosa (tetrasacárido),
la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con la sacarosa (disacárido). Se puede
medir la hidrólisis observando el cambio en la rotación óptica o valorando el poder reductor de los
productos obtenidos.
EXPERIMENTO 6
Utilice dos tubos de ensayo y coloque en cada uno 2 mL de solución de sacarosa 0.05M y
1 mL de solución reguladora de acetato de sodio 0.05M a pH de 4.7 Un tubo quedará como
testigo y al otro se le agregan 0.2 mL de la solución de invertasa (solución enzimática). Después
de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en baño maría a 40°C durante 15
minutos; cuando se ha completado el tiempo se les agrega a ambos tubos 2 mL de la solución A y
2 mL de la solución B del reactivo de Fehling, mezclándolos perfectamente. Se colocan en baño
maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar.
Observe si existe un precipitado rojo de óxido cuproso Cu2O en ambos tubos.
1) Compare este experimento con el anterior y explique que sucede.

7. ENZIMAS
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
L
a vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curso y velocidad están
determinados por la presencia de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas:
(del griego en = en, zymo = fermento). La mayor parte de las reacciones biológicas serían
cinéticamente insignificantes si no fuera por las enzimas.
Las enzimas desde el punto de vista químico son compuestos que pertenecen al grupo de
las proteínas (aunque algunas solo funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prostético o
coenzima). Debido a su carácter proteínico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio
físico, químico, o fisicoquímico. Así, cualquier cambio en la temperatura, en el pH, en la fuerza
iónica, la adición de sales, la presencia de agentes oxidantes o reductores, la presencia de
metales pesados, etc., producen modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier
factor que sea capaz de desnaturalizar a las proteínas será capaz de alterar su actividad.
NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS
Estructuralmente todas las enzimas son proteínas simples o complejas. La parte proteínica de las
enzimas se denomina apoenzima, la parte no proteínica puede ser coenzima, si se separa
fácilmente de la proteína. Las coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no actúan como
catalizadores ya que se transforman en la reacción que catalizan y requieren de otra enzima para
regenerar su actividad. La mayor parte de las coenzimas están relacionadas con las vitaminas. Si
la parte no proteínica se encuentra firmemente unida a la proteína por enlace covalente y no es
posible separarla por diálisis, se denomina grupo prostético.
Hay varios factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas.
Algunos de ellos son: temperatura, pH, concentración de sustrato, concentración de enzima e
inhibidores.
Temperatura
La velocidad de las reacciones químicas aumenta al incrementar la temperatura, originando
aumento en la energía cinética y en las velocidades medias de las moléculas con el resultado de
una mayor probabilidad de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y
desnaturalizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura
óptima, en la cual catalizan con una velocidad máxima.
pH
La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH debido a la participación de
iones [H+] o iones [OH+] en las reacciones, además que se afecta la de los grupos funcionales. La
mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo en el cual su actividad es máxima.
Concentración de la enzima
La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración de la
enzima que la cataliza. La interacción enzima – substrato cumple la Ley de Acción de Masas. Se
emplea con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de la enzima
manteniendo fija la concentración de substrato.

Concentración de sustrato
Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de reacción aumenta
incrementando la concentración del sustrato. Con el tiempo se alcanza un máximo y la adición de
más sustrato ya no influye sobre la velocidad, ya que la enzima se saturó.
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La velocidad de cualquier reacción cambia al modificarse la temperatura, debido a los

cambios de energía cinética. Generalmente por cada 10 grados centígrados de aumento en la
temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relación de van´t Hoff, o coeficiente
de temperatura QT10.
Sin embargo, debido a la constitución proteínica de las enzimas, las temperaturas altas
pueden producir desnaturalización y una disminución marcada en la actividad catalítica. Para la
gran mayoría de enzimas de animales homeotermos, la temperatura óptima está alrededor de
37°C; cerca de los 60°C la mayor parte de las enzimas se inactivan, hecho que se aprovecha en la
técnica de pasteurización.
EXPERIMENTO 1
Se prepara una serie de siete tubos como sigue:
Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5 6 7
Sustrato almidón 8 mg/mL mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Solución reguladora de mL --- 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
fosfatos 0.02M, pH = 7
Agua destilada mL 5 3 3 3 3 3 3
Preincubar 5 minutos a 25°C 5°C 25°C 40°C 50°C 60°C 92°C
Enzima (sol. de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Conserve la solución de amilasa en baño de hielo.

Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baños dejándolos
durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, 1 mL del reactivo de ácido 3,5
dinitrosalicílico (este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares
reductores). Se agitan bien y se colocan en baño maría a ebullición por 10 minutos después de lo
cual se enfrían y se leen en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como
blanco.
Con los datos obtenidos haga una gráfica anotando la densidad óptica en las ordenadas y
la temperatura en las abscisas.
EFECTO DE LA TEMPERATURA EN LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA
Tubo Temperatura Absorbancia
1 25 °C
2 5 °C
3 25 °C
4 40 °C
5 50 °C
6 60 °C
7 90 °C
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

El pH es uno de los factores que más afecta la actividad de las enzimas, ya que puede
afectar la estabilidad de la molécula por desnaturalización, o bien afectar su carga eléctrica.
Muchos de los grupos ionizables presentes en la molécula de la enzima pueden ser necesarios
para la catálisis y los cambios de pH afectan el grado de ionización. Para que se realice la unión
en el complejo enzima – sustrato es necesaria una adecuada distribución de cargas en ambas
moléculas. El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada
para asegurar la formación del complejo ES en las mejores condiciones. Además, como ya se
mencionó, los pH extremos provocan desnaturalización de la molécula enzimática y por tanto
inactivación de la misma.
Cada enzima posee un pH óptimo en el cual su actividad es máxima, para la mayoría de las
enzimas la actividad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo existen
excepciones, por ejemplo, para la pepsina del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy
ácido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos cuyo pH es de 9.5.
EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 6 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:
Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5 6
Sustrato (sol de almidón 8 mg/mL) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sol. reguladora al pH indicado 7 5 6 7 8 9
mL 4.5 4 4 4 4 4
Enzima (sol de amilasa) mL --- 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Mezcle e incube a 40°C por 15 minutos
Terminado este lapso todos los tubos se agitan y se les agrega 1 mL de reactivo de ácido
dinitrosalicílico. Caliéntelos en un baño de agua hirviendo por 10 minutos. Este reactivo desarrolla
un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores.
Determine la concentración del azúcar reductor liberado, leyendo la densidad óptica en el
espectrofotómetro a 540 nm (Puede ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con
agua antes de leer).
1) Basándose en sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa?
2) ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis de este polisacárido?
3) Resuma sus resultados en la siguiente tabla y trace con ellos la gráfica correspondiente
(D.O. contra pH)
pH y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
TUBO pH D.O.
1 7
2 5
3 6
4 7
5 8
6 9

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA

VELOCIDAD DE REACCIÓN
Actualmente se acepta que la reacción enzimática se efectúa a través de la formación de un

complejo enzima – sustrato, lo cual puede representarse en forma muy simplificada así:
S + E   [ES]  P + E
Si [E] es la concentración total de enzima y [ES] es la enzima combinada, entonces [E –

ES] es la concentración de enzima libre. Recordando la Ley de Acción de Masas, tenemos:
V1 = K1 – [E – ES] [ES]; V2 = K2 – [ES]; V3 = K3 – [ES]
La velocidad de formación (Vf) del complejo [ES] depende de V1 mientras que la velocidad
de degradación (Vd) depende de V2 + V3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos:
Vf = Vd es decir: V1 = V2 + V3
Sustituyendo sus valores nos queda:
K1[E – ES] [S] = K2[ES] + K3[ES]
Dividiendo ambos miembros entre K1 y [ES] nos queda:
K1[E – ES] [S] (K2 + K3)[ES]

---------------------------- = ------------------------------
K1[ES] K1[ES]
Simplificando:
[E – ES] [S] (K2 + K3)

------------------------ = ---------------------- = Km constante de Michaelis
[ES] K1
La constante de Michaelis – Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la

enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de afinidad. La constante de
Michaelis – Menten (Km) se define como la concentración de sustrato cuando la reacción adquiere
la mitad de su velocidad máxima. Cuando esto sucede:
[E – ES] = [ES]
Y por lo tanto, sustituyendo:

Km = [S]

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO
Si en una reacción enzimática se mantiene constante la concentración de la enzima y todos

los demás factores que pueden modificar la actividad, se observa experimentalmente que al
aumentar la concentración del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de la reacción
hasta llegar a un máximo (velocidad máxima) después del cual ya no se afecta la velocidad
aunque se trabaje a concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa
incluso una disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato.
EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 8 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla:
Tubo
Reactivos 1 2 3 4 5 6 7 8
Sustrato (almidón 8 mg/mL) mL 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.5 7.5
Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7 mL 7.0 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 0.0 0.5
Sol de enzima (amilasa) mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0
Mezcle bien los tubos e incube a 40°C por 15 minutos
Transcurrido este tiempo añada a todos los tubos, con objeto de detener la reacción
enzimática, 1 mL del reactivo del ácido 3,5 dinitrosalicílico; caliente por 10 minutos en baño maría
a ebullición para desarrollar color. Enfríe y lea cada tubo en el espectrofotómetro a 540 nm
empleando el tubo no. 8 como blanco.
Concentración de Absorbancia
sustrato: mg/mL
0.5
1
2
3
4
5
7.5
2) Basándose en sus resultados, trace la gráfica correspondiente: actividad contra

concentración de sustrato en mg.
3) Determine el valor de KM para el sistema almidón/amilasa en estas condiciones.
KM = ---------------- mg de almidón/mL
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA
Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que actuaban por
presencia debido a las concentraciones tan pequeñas y a que podían recuperarse inalterados al
final de la reacción. Sin embargo, se sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a la Ley de

Acción de Masas depende de su concentración de tal manera que la velocidad es directamente

proporcional a la concentración de enzima, lo que se expresa como:
V = K[E]
Así que la gráfica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción en función de la

concentración de enzima es una recta con pendiente positiva.
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de 6 tubos siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla:
Tubo
Reactivo 1 2 3 4 5 6
Sustrato de almidón 8 mg/mL mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Sol reguladora de fosfatos 0.02M pH = 7 mL 1 1 1 1 1 1
Agua mL 5 4.9 4.8 4.6 4.2 3.4
Preincubar a 40°C durante 5 minutos
Sol enzima (amilasa) mL - 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6
Después de mezclar el contenido de los tubos, se colocan a baño maría a 40°C por 15
minutos. Pasado este tiempo añada a cada tubo 1 mL del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se
colocan los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos. Enfríe y lea la intensidad del color
como densidad óptica en el espectrofotómetro a 540 nm, empleando el tubo no. 1 como blanco.
1) Con base en sus resultados trace una gráfica con los valores de Absorbancia en las
ordenadas y la concentración de enzima expresada en mg/mL en las abscisas,
según la siguiente tabla:
Concentración de enzima mg/mL Absorbancia

0
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
2) Interprete la gráfica obtenida.

8. GLÚCIDOS
L
os glúcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehídicos o cetónicos reales o
en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su molécula uno o más carbonos
asimétricos. Estos compuestos se encuentran presentes en todos los seres vivos, en
cantidades variables, desempeñando importantes funciones estructurales y energéticas. Debe
recordarse que todas las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos
funcionales, o sea, grupos alcohol y grupo carbonilo (aldehídico o cetónico).
Los glúcidos se clasifican, según el número de compuestos hidrocarbonados simples que
los constituyen, en 3 grupos; monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
Los monosacáridos no se pueden desdoblar por hidrólisis en compuestos más sencillos. A
su vez se subdividen, según el número de carbonos que contengan, en: triosas, tetrosas,
pentosas, hexosas, etc.
Los oligosacáridos, por hidrólisis, dan pocas moléculas de monosacáridos. En la
naturaleza existen varios disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa etc.) y unos cuantos trisacáridos,
tetrasacáridos y pentasacáridos libres. Se pueden obtener por síntesis química en el laboratorio o
por degradación hidrolítica de polisacáridos. Los oligosacáridos poseen propiedades físicas
similares a las de los monosacáridos.
Los polisacáridos, por hidrólisis dan muchas moléculas de monosacáridos. Desde el punto
de vista fisiológico se dividen en dos grupos; polisacáridos estructurales y polisacáridos de
reserva. Entre los primeros tenemos en vegetales: la celulosa, los ácidos pecticos y las hemi
celulosas. En animales los más importantes son los llamados mucopolisacáridos, tales como el
ácido hialurónico y el condroitin sulfato, abundantes en varios tejidos y líquidos como el cuerpo
vítreo del ojo, el cordón umbilical, el líquido sinovial, tendones, cartílagos, etc.
Entre los polisacáridos nutrientes o de reserva los más importantes son, en vegetales, los
almidones e inulina y en animales, el glucógeno.
PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS GLÚCIDOS
Los glúcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por
tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los mono y oligosacáridos,
ya que los polisacáridos son generalmente insípidos. Otras propiedades que nos permiten
diferenciar glúcidos de bajo peso molecular (monosacáridos y oligosacáridos) de los de elevado
peso molecular (polisacáridos), son su solubilidad en agua y su capacidad para cristalizar.
ESTRUCTURA CRISTALINA
EXPERIMENTO 1
Examine al microscopio los siguientes glúcidos: glucosa, sacarosa, almidón y celulosa y
haga los esquemas respectivos.
1) ¿Cuáles de estos glúcidos tienen estructura cristalina? ¿Por qué?
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS GLÚCIDOS

Las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los
glúcidos poseen en su molécula grupos alcohol y grupos carbonilo, ya sean aldehídicos o
cetónicos. Sin embargo, en algunos glúcidos estos grupos pueden estar bloqueados y por lo tanto,
su reactividad química estará ausente. Una característica química de los aldehídos y cetonas es
su carácter reductor, todos los monosacáridos u oligosacáridos que tengan libre el grupo
aldehídico o cetónico serán reductores, mientras que los polisacáridos y oligosacáridos que
tengan bloqueados estos grupos serán no reductores.
Todos los glúcidos formados por varios azúcares (oligo o polisacáridos) se pueden hidrolizar
por acción enzimática o de ácidos dando como producto final los monosacáridos y liberando los
grupos reductores bloqueados. Existen varias reacciones químicas que se utilizan para la
identificación de los glúcidos, algunas son generales y otras son específicas para determinar tipo o
incluso específicas para cada azúcar. Entre las más utilizadas tenemos:
FORMACIÓN DE OSAZONAS
Esta reacción es una de las de mayor utilidad para la identificación de azúcares por ser
específica para cada azúcar. La dan positiva tanto los monosacáridos como los disacáridos
reductores sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona
correspondiente, la forma cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en frío y los puntos de
fusión.
EXPERIMENTO 2
Se colocan en un tubo de ensayo 0.1 g de un carbohidrato, 0.2 g de clorhidrato de
fenilhidracina, 0.3 g de acetato sódico cristalizado y 4 mL de agua, se agita y se tapa el tubo
con un tapón de papel procurando que no quede muy cerrado y se coloca en baño maría
hirviendo, agitando ocasionalmente y observando el tiempo que tardan en aparecer los
precipitados y si lo hacen en frío o en caliente.
La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa

en frío por lo que después de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego.
1) Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por usted y las preparadas
por sus compañeros de grupo.
2) Haga un esquema de los cristales.
3) ¿Por qué la glucosa, la manosa y la fructosa dan la misma osazona?
4) Escriba la reacción que se efectúa.
REACCIÓN DE MOLISCH – UDRANSKY

Es una reacción general para todos los glúcidos, debido a que el ácido sulfúrico concentrado
que contiene el reactivo hidroliza y deshidrata a los azúcares obteniéndose furfural o hidroximetil
furfural como producto final y estas sustancias son capaces de reaccionar con el alfa naftol
formando un compuesto colorido (violeta): Esta prueba es una de las más sensibles, la dan
positiva soluciones de glucosa al 0.001%. Sin embargo, la reacción no es específica, ya que la
dan positiva los aldehídos, las cetonas, y algunos ácidos orgánicos tales como el fórmico, oxálico,
cítrico, etc.
EXPERIMENTO 3
Coloque en una gradilla 6 tubos de ensayo, ponga en cada uno 3 mL de cada una de las
siguientes soluciones:

Tubo Solución Clasificación resultado

1 Formaldehído
2 Glucosa
3 Fructosa
4 Arabinosa
5 Sacarosa
6 Almidón
Añada a todos los tubos, 2 gotas de reactivo de Molisch (solución de alfa – naftol al 5% en
alcohol). Mezcle bien. Posteriormente añada a todos los tubos, 1 mL de ácido sulfúrico
concentrado, estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el ácido por las paredes). La
reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta.
1) Diga cual de estas soluciones da positiva la reacción.

2) ¿Se puede considerar como una reacción útil para diferenciar un glúcido de otro? ¿Por
qué?
3) ¿Qué utilidad puede tener la reacción de Molisch–Udransky?
4) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DE FEHLING
La mayor parte de las pruebas para el análisis cualitativo y cuantitativo de azúcares se
basan en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea específica de ellos. Se sabe que
los azúcares reductores son capaces de reducir diversos iones metálicos como el cobre, bismuto,
mercurio, plata, etc. , cuando se encuentran estos en solución alcalina.
Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son estables, existe poca
interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse la misma reacción
para un análisis cualitativo o cuantitativo.
EXPERIMENTO 4
En 5 tubos de ensayo se colocan 2 mL de la solución A y 2 mL de la solución B del
reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de cada uno de los siguientes azucares:

1 Glucosa
2 Fructosa
3 Arabinosa
4 Sacarosa
5 Almidón
Se colocan los tubos en baño maría a ebullición y se mantienen por 3 minutos, al cabo de
los cuales se dejan enfriar (no deben enfriarse con agua fría) y se observan.
El mecanismo de reacción se lleva a cabo debido a que algunos compuestos orgánicos que
contienen uno o más grupos alcohólicos en su molécula, en este caso el tartrato de sodio,
reaccionan en solución alcalina con los hidróxidos metálicos, formando un complejo soluble, el
cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que produzcan

las reacciones de coloración. La formación de este complejo es esencial para que se produzca un
precipitado con la mayor parte de los metales pesados.
1) ¿Qué azucares dan positiva la reacción de Fehling?

2) Explique por que algunos azúcares dan negativa la reacción.
3) Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de Fehling y
no sean azúcares.
4) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DE BARFOED
El reactivo de Barfoed es una solución de acetato cúprico en ácido acético y, una vez más,
se determina la capacidad de los azúcares para reducir el ión cúprico a cuproso (Cu2O).
Esta reacción sirve para diferenciar un monosacárido de un disacárido, ya que los primeros
a los tres minutos reducen el reactivo y los disacáridos necesitan mas tiempo para que se lleve a
cabo la reacción de reducción, mas o menos unos 15 minutos.
EXPERIMENTO 5
Se colocan 4 tubos de ensayo y a cada uno se le agregan 3 mL del reactivo de Barfoed y 1
mL de una de las siguientes soluciones de glúcidos:

1 Glucosa
2 Arabinosa
3 Lactosa
4 Maltosa
Se colocan en baño maría observando y anotando el tiempo que tarda en aparecer el

precipitado rojo de óxido cuproso.
REACCIÓN DE BIAL
Esta reacción sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo consiste en una
solución de orcinol en ácido clorhídrico (HCl) concentrado con una pequeñísima cantidad de
cloruro férrico (FeCl3). El fundamento de esta reacción, igual que la reacción de Molisch, la de
Seliwanoff y otras, se basa en la producción de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta
con ácidos concentrados y la reacción de estos con otras sustancias dando productos coloridos,
en este caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o café.
EXPERIMENTO 6
En tubos de ensayo se colocan 3 mL del reactivo de Bial ¡PRECAUCIÓN! Añada 0.2 mL de
las siguientes soluciones:
Tubo Solución Clasificación Resultado
1 Glucosa
2 Arabinosa
3 Agua

Caliente los tubos ligeramente sobre la llama del mechero, hasta que se inicie la ebullición,
retire de la flama, diluya cada tubo con 10 mL de agua destilada y agregue 2 mL de butanol. Agite
los tubos, deje reposar y haga su observación.
1) Explique las diferencias observadas.
REACCIÓN DE SELIWANOFF
Esta reacción sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas reaccionan
rápidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una solución de
resorcinol 0.05% en HCl 1:3 recién preparado. Este compuesto es el que se condensa con el
furfural o sus derivados dando productos coloridos.
EXPERIMENTO 7
En 3 tubos de ensayo se coloca 1 mL de los azúcares que se mencionan abajo y agregue a
cada tubo 0.5 mL del reactivo de Seliwanoff y caliente en baño a ebullición exactamente 60
segundos. Anote sus resultados y continúe calentando observando el cambio de color a intervalos
de 1 minuto durante 5 minutos.
Tubo Solución Clasificación Resultado

1 Glucosa
2 Fructosa
3 Agua
Las cetosas dan una coloración rojo fuego y las aldosas la dan muy débil y muy lentamente
1) ¿Observó alguna diferencia en las soluciones?

REACCIÓN DEL LUGOL

El reactivo de lugol es una solución de yodo en yoduro de potasio. Este reactivo reacciona con
algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas formando un complejo
de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando un color diferente según las
ramificaciones que presenta la molécula.
EXPERIMENTO 8
En un tubo de ensayo se colocan 2 mL de solución de almidón, en otro se colocan 2 mL de
glucógeno. Añada una gota de lugol y anote el color producido en cada uno de los tubos. El tubo
que contiene el almidón se calienta a ebullición y se deja enfriar nuevamente observando lo que
ocurre con la coloración.
1) ¿Por qué el complejo almidón – yodo es termolábil?

2) ¿Se puede considerar la reacción del lugol característica para cualquier polisacárido?

9. OXIDACIONES BIOLÓGICAS
L
a Bioenergética es la manera en que el ser vivo, utiliza y transforma la energía del medio
ambiente. A estos procesos químicos y físicos se les denominaba respiración. Sin embargo
para evitar ambiguedades con el proceso de la entrada y salida de aire de un compartimiento
a otro, se aplica el concepto bioquímico de bioenergética, incluyendo este termino los procesos
fotosintéticos.
Todos los procesos químicos que constituyen la respiración conducen a la oxidación de
sustancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las reacciones
de oxidación son exergónicas, es decir, liberan energía cuando se efectúan; en ocasiones toda la
energía se libera en forma de calor, como cuando se quema u oxida un pedazo de madera. Sin
embargo un organismo viviente no es una máquina térmica y, por tanto, debe poseer un
mecanismo enzimático que le permita capturar y almacenar la energía liberada en los procesos de
oxidación. La utilización o captura de la energía involucra la participación de enzimas específicas
capaces de catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica).
REACCIONES DE OXIDO REDUCCIÓN

Un compuesto químico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidación típica es
aquella en la cual el oxígeno se une a un compuesto (oxigenación). Otra forma de oxidación es
la pérdida de hidrógeno (deshidrogenación). También se oxida un compuesto cuando pierde
electrones o cuando gana valencias positivas.
Ejemplos de oxidaciones
Oxigenación 2Cu + O2  2CuO
Deshidrogenación H2S  S0 + H2
Pérdida de electrones o -1e
ganancia de valencia positiva Fe++  Fe+++
Siempre que se efectúa una oxidación, simultáneamente se efectúa una reducción. Es

decir, cuando un compuesto se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenómenos
que ocurren simultáneamente se denominan fenómenos de óxido reducción o reacciones
REDOX.
OXIDACIÓN POR PÉRDIDA DE ELECTRONES
EXPERIMENTO 1
Coloque en un matraz provisto de tapón con válvula de BUNSEN, 0.5 g de fibra de hierro
(Fe°) y 5 mL de H2SO4 al 10%. Caliente a ebullición y observe la disolución parcial del Fe. Deje
enfriar y diluya el sulfato ferroso (FeSO4) obtenido, con 50 mL de agua destilada.
La válvula deja escapar el hidrógeno, pero impide la entrada de aire evitando así la
oxidación de la sal ferrosa formada mediante la siguiente reacción:

Fe° + H2SO4  FeSO4 + H2 ↑

Para comprobar la presencia de sales ferrosas se coloca en una cápsula de porcelana 1 mL
de solución de sulfato ferroso y unas gotas de ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]). La obtención
de una coloración o precipitado de color azul indicará la presencia de sales ferrosas.
En otra cápsula de porcelana coloque 1 mL de la solución de sulfato ferroso y unas gotas
de sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%. La aparición de un color rojo intenso indicará la
presencia de sales férricas.
A continuación se oxidará la sal ferrosa a sal férrica, para lo cual se colocan en un matraz
erlenmeyer 10 mL de la solución de sulfato ferroso y 3 mL de H2SO4 al 10%, caliente a ebullición y,
en caliente, agregue gota a gota una solución de permanganato de potasio (KMnO4) 0.1M hasta
que persista un color rosa pálido.
Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repita las reacciones con ferricianuro de
potasio K3[Fe(CN)6] al 0.5% y sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%.
Solución K3[Fe(CN)6] KSCN

Sulfato ferroso
Sulfato férrico
2) Escriba las reacciones de identificación que se han efectuado en cada caso.

3) Si el KMnO4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso, ¿Qué compuesto se reduce?.
4) Escriba la reacción de oxido – reducción que se ha efectuado.
OXIDACIÓN POR DESHIDROGENACIÓN

EXPERIMENTO 2
La acción de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma
leucobases (incoloras) cuando actúa sobre colorantes oxidados como el azul de metileno
(indicador de oxido – reducción). El proceso inverso (oxidación por pérdida de hidrógeno) se
puede realizar en diferentes condiciones y determinar el tiempo de reacción.
Prepare una serie de 5 tubos de ensayo y numérelos. Añada a cada uno 5 mL de una
solución diluida de azul de metileno. A todos los tubos agrégueles gota a gota una solución
recién preparada de hidrosulfito de sodio y cuente el número de gotas necesario para decolorar
completamente la solución de azul de metileno.
El tubo número 1 quedará como testigo en reposo, el número 2 se colocará en baño
maría a ebullición y se anotará el tiempo necesario para recuperar su color azul. El tubo número
3 se agitará enérgicamente a temperatura ambiente, hasta que recupere su color. Al tubo
número 4 sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarán gotas de peróxido de hidrógeno
(H2O2) al 0.4% y finalmente al tubo número 5 se le agregarán gotas de cloruro férrico (FeCl3) al
1% contando el número de éstas necesario para reoxidar al azul de metileno.
1) Resuma sus resultados en la siguiente tabla
Tubo 1 testigo 2 calor 3 temp. amb. 4 H2O2 5 FeCl3

Tiempo de reoxidación del azul
de metileno o número de gotas
2) Escriba la reacción química que se ha efectuado en cada caso.

REACCIONES DE OXIDO – REDUCCIÓN BIOLÓGICAS
La mayor parte de la energía que utilizan los seres vivos deriva de los procesos de
oxidación, y en cada oxidación se desprende una determinada cantidad de energía que el
organismo aprovecha para realizar las funciones vitales y para efectuar fenómenos sintéticos
endergónicos.
Todas las oxidaciones biológicas se caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que
se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH generalmente neutro y a bajas
temperaturas. Esto hace pensar que todos estos procesos están catalizados por enzimas.
Warburg fue uno de los primeros investigadores que trató de explicar las oxidaciones
biológicas suponiendo una activación del oxígeno.. Actualmente se sabe que en los tejidos
existe un sistema de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxígeno molecular se
activa y actúa como un agente oxidante.
Wieland Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la
activación del hidrógeno por la acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales
transportan el hidrógeno a diferentes aceptores que pueden ser el oxígeno u otros agentes
oxidantes.
Szent Györgyi concilió las dos teorías al suponer que es necesaria la activación del
hidrógeno y también la del oxígeno. Keilin supuso que interviene como eslabón intermediario
el citocromo.
Sin embargo, las oxidaciones biológicas no son tan sencillas, pues se ha comprobado que
en la oxidación de cada metabolito interviene una gran cantidad de aceptores de hidrógeno.
La glucosa es el más común de los metabolitos debido a que es una molécula altamente
reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrógenos, la liberación de energía de oxidación no se
realiza en forma brusca, sino que intervienen varios transportadores de hidrógeno y se inicia por la
acción de una deshidrogenasa específica que no reacciona directamente con el oxígeno sino que
requiere de intermediarios como el NAD+, flavoproteínas y citocromos.
DESHIDROGENASA SUCCÍNICA (DHS)

La deshidrogenasa succínica cataliza la siguiente reacción:
OBTENCIÓN DE LA FRACCIÓN MITOCONDRIAL

DEL HÍGADO DE RATÓN
EXPERIMENTO 3
Cuando el tejido hepático se dispersa en soluciones isotónicas, el núcleo y las mitocondrias
permanecen relativamente inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugación
diferencial.
Al ratón recién sacrificado se le extrae el hígado y se mantiene en hielo hasta el momento
de utilizarlo. Pese el hígado obtenido y fracciónelo finamente con las tijeras y prepare
cuidadosamente un homogeneizado en un mortero previamente enfriado, añadiendo 6
volúmenes de cloruro de potasio (KCl) 0.15M frío, por cada gramo de hígado. Centrifugue el
homogeneizado en frío a 500 rpm por 15 minutos, separe el sobrenadante y nuevamente
centrifugue éste ahora a 3000 rpm por 15 minutos, separe este segundo sobrenadante y
consérvelo en frío anotando en la etiqueta “SOBRENADANTE DE HÍGADO”. El residuo se
suspende en 6 mL de KCl 0.15M y se conserva también en frío anotando en la etiqueta
correspondiente “SUSPENSIÓN DE HÍGADO”.
Prepare una serie de tubos de ensayo, numérelos y añada los reactivos correspondientes
de acuerdo con las instrucciones de la siguiente tabla.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Reactivo
Azul de metileno 0.002M ml 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
Succinato de sodio 0.1M ml --- 0.5 0.5 --- 0.5 0.5
Malonato de sodio 0.1M ml --- --- 0.5 --- --- 0.5
Agua destilada ml 1.5 1.0 0.5 1.5 1.0 0.5
Suspensión de hígado ml 0.5 0.5 0.5 --- --- ---
Sobrenadante de hígado ml --- --- --- 0.5 0.5 0.5
Mezclar bien el contenido de cada tubo
Vaselina ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Incubar por 30 minutos a 37°C – 40°C
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en baño maría
a 37°C y hacer lecturas en los tiempos señalados, anotando en el siguiente cuadro el grado de
coloración, con cruces (de una a tres).
1) Resultados
Tubo 1 2 3 4 5 6
Tiempo
0 min.
10 min.
20 min.
30 min.
2) ¿En cual de las fracciones de hígado deben encontrarse las mitocondrias y por qué?
3) Describa como actúa el malonato de sodio en esta reacción.
4) Explique sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.
LOCALIZACIÓN Y DEMOSTRACIÓN DE LA
ACTIVIDAD DE LA CITOCROMO - OXIDASA
La citocromo – oxidasa es la última enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de

la “activación del oxígeno” para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo –
oxidasa son metaloproteínas (porfirinas). La citocromo – oxidasa se caracteriza por su elevada
sensibilidad al cianuro (CN) y al monóxido de carbono (CO).
En el año de 1885 Ehrlich reportó la reacción del indofenol. Observó que inyectando alfa
naftol y dimetil-para-fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul
llamada azul de indofenol. La enzima se denominó indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha
podido comprobar que esta enzima sólo oxida al citocromo c, el cual a su vez oxida al indofenol;
por lo cual ahora se le conoce como citocromo – oxidasa.
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de tubos de ensayo y numérelos. Añada a cada uno los reactivos de
acuerdo a las instrucciones de la tabla siguiente:
Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Reactivo
Alfa naftol al 0.15% en etanol al 10% ml 0.5 --- 0.5 0.5 0.5 0.5 --- 0.5 0.5 0.5
Dimetil-para-fenilendiamina al 0.15% ml 0.5 0.5 --- 0.5 0.5 0.5 0.5 --- 0.5 0.5
Agua destilada ml 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5
KCN al 0.01% NO PIPETEAR ml --- --- --- --- 0.5 --- --- --- --- 0.5
0.5 mL = 10 gotas
Sobrenadante de hígado ml 1.0 1.0 1.0 --- 1.0 --- --- --- --- ---
Suspensión de hígado ml --- --- --- --- --- 1.0 1.0 1.0 --- 1.0
Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparición del azul de indofenol y anote sus
resultados en la siguiente tabla:
Tubo
Tiempo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
min.
0
10
20
30
1) Escriba la reacción de formación del azul de indofenol.

2) Explique por qué no se usó vaselina en este experimento.
3) Explique sus resultados sobre la base del análisis del contenido de cada tubo.

10. LÍPIDOS
Este es un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas cuyas propiedades comunes son
su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, éter,
etc. Por lo que este grupo incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser moléculas de
número relativamente alto de átomos de carbono e hidrógeno y bajo en átomos de oxígeno;
ciertos lípidos también poseen átomos de fósforo, nitrógeno y azufre en su molécula.
Cualquier clasificación presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede producir falsas
interpretaciones ya que idéntica terminología ha sido empleada por diferentes autores para
denominar a distintos grupos de lípidos. Los lípidos son los compuestos más recientemente
estudiados por ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc., ya que este tipo de
sustancias hace poco se consideraban complejas y de poco interés. Las funciones de los lípidos
son muy variadas y las más aceptadas actualmente son las siguientes:
1. Función estructural, principalmente en las membranas celulares.
2. Actúan como material energético y de reserva.
3. Intervienen en el transporte de compuestos energéticamente activos.
4. Componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y
vertebrados.
5. Sustancias de gran actividad biológica comovitaminas y hormonas. Las cuales se
consideran como verdaderos reguladores metabólicos.
6. Actúan como aislante térmico y protección alrededor de determinados órganos.
REACCIÓN DE HANUS
El grado de insaturación de los ácidos grasos que forman parte de un lípido es uno de los
factores determinantes de sus propiedades físicas, químicas y fisiológicas. Se ha observado
que aparecen más dobles enlaces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lípidos
estructurales cuando la temperatura ambiente disminuye. Los dobles enlaces disminuyen el
punto de fusión por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir la
cristalización de los lípidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solución de yodo y
bromo que nos permite determinar el grado de insaturación de un lípido midiendo la capacidad
que tiene para fijar halógenos en su molécula.
EXPERIMENTO 1
Coloque en tubos de ensayo limpios y secos 6 mL de soluciones clorofórmicas al 10% de
aceite de algodón, aceite de cártamo y monoestearilglicerol. Añada a cada tubo 5 gotas del
reactivo de Hanus y agite vigorosamente. Anote cada 30 minutos el grado de decoloración de
cada tubo protegiéndolo de la luz.
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Tiempo minutos
Lípido 30 60 90 120
Aceite de algodón
Aceite de Cártamo
Monoestearilglicerol
Aceite de ricino
EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE CEREBRO
EXPERIMENTO 2
Pese 5 g de cerebro y tritúrelos perfectamente en un mortero con 20 mL de una mezcla
200:100:1 de cloroformo - metanol – ácido clorhídrico por 10 minutos. Una vez obtenido el
homogeneizado agregue 2 mL de HCl 1N, mezcle y centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos.
Separe el paquete celular, la fase clorofórmica y la metanólica. Deseche el sedimento. Se
obtienen dos fases:
Clorofórmica, que se usará para la identificación del colesterol, la separación
cromatográfica de fosfolípidos y la formación de membranas.
Metanólica, que servirá para la identificación de cerebrósidos.
IDENTIFICACIÓN DE FOSFOLÍPIDOS DE CEREBRO

POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
Como una aplicación del fenómeno de adsorción, se desarrollará la técnica de
cromatografía en placa fina para separar los diferentes fosfolípidos extraídos del cerebro.
EXPERIMENTO 3
Diluya 1:1 con cloroformo, un volumen pequeño (0.5 o 1 ml) del extracto clorofórmico
obtenido en el experimento no. 2. Utilizando una pipeta Pasteur aplique una gota de esta dilución
en tres puntos equidistantes en una cromatoplaca previamente preparada, aproximadamente a 2
cm de altura de la base.
Permita que el cloroformo se evapore y entonces introduzca la placa en una cubeta de
vidrio que contenga como solvente de elución, una mezcla de cloroformo – metanol – ácido
acético – agua (65:25:8:4). Deje desarrollar el cromatograma hasta el frente del solvente ya
marcado; saque la placa de la cubeta y déjela secar. En esta forma se tendrán 3 cromatogramas
idénticos en la misma placa, los cuales se van a revelar con diferentes reactivos. Esto se puede
hacer cubriendo con una placa de vidrio los cromatogramas que no se deseen revelar.
El cromatograma se revelará con ninhidrina que pondrá de manifiesto a los fosfo
aminolípidos. Esta reacccion se lleva a cabo al calentarse a 100°C por 10 minutos.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS

IDENTIFICACIÓN DE CEREBRÓSIDOS
EXPERIMENTO 4
Utilizando 1 mL del extracto metanólico obtenido en la extracción de lípidos de cerebro,
trate de demostrar la presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de Molisch–Udransky
cuya técnica y fundamento ya han sido descritos anteriormente.
REACCIÓN DE LA ACROLEÍNA
Una de las reacciones más usadas para la identificación de acilglicéridos es la formación de

acroleína o aldehído acrílico, el cual se puede obtener por deshidratación del glicerol o de
cualquier glicérido y se reconoce fácilmente por su fuerte olor acre característico.
EXPERIMENTO 5
Coloque en dos tubos de ensayo secos, un poco de bisulfato de potasio (KHSO4)y añada
de 3 a 5 gotas de glicerina en uno de los tubos y en otro 5 gotas de aceite de algodón, cártamo
o girasol. Caliente cuidadosamente y huela los vapores indirectamente. ¡PRECAUCIÓN!
1) ¿Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido? ¿Por qué?
2) Escriba la reacción que se ha efectuado.
REACCIÓN DE LIEBERMANN – BURCHARDS
El anhídrido acético se puede condensar con los grupos –OH en posición 3 de los
esteroles como en el colesterol y dar los correspondientes ésteres. Si el esterol tiene un doble
enlace en posición 5, se produce además una epimerización y una deshidratación en
presencia de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, dando como resultado una serie de
compuestos de estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al
azul y del azul al verde. Esta reacción es por lo tanto específica para todos los esteroles que
contengan un OH en posición 3 y un doble enlace en posición 5.
EXPERIMENTO 6
Prepare 2 tubos de ensayo. En el tubo no. 1 coloque 3 mL de solución clorofórmica de
colesterol puro y en el tubo no. 2, 3 mL de solución clorofórmica de colesterol obtenido en la
extracción de lípidos de cerebro en el experimento 2. Añada a los 2 tubos, 1 mL de anhídrido
acético y mezcle bien, finalmente añada lentamente, resbalándolo por las paredes del tubo, 1 mL
de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado.
1) Observe y describa los cambios de coloración que se producen.
PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPÍDICA

En este capítulo de lípidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya que hacen
posible la existencia de organismos complejos porque separan las células en el interior de los
tejidos y los organelos celulares dentro de las células, formando compartimientos con propiedades
fisicoquímicas diferentes, lo que permite una diferente organización; y cada compartimiento se
vuelve una parte individual de un conjunto más complejo. Se ha comprobado que las membranas
son complejos lipoprotéicos que contienen de 60% a 75% de proteína y de 25% a 40% de
lípidos.
En este experimento usaremos monocapas lipídicas como modelos de membrana. Al
estratificar butanol sobre agua y agregar un lípido, éste se situará en la interfase, orientandose la
parte polar lipídica a la fase acuosa, y la parte hidrofóbica a la fase orgánica. Si ahora se
coloca un colorante se puede observar la difusión pasiva a través de la membrana.
EXPERIMENTO 7
Preparar 4 tubos de ensayo como se indica en la siguiente tabla colocando las soluciones
con mucho cuidado resbalando por las paredes del tubo para estratificar.
Tubo
Reactivo 1 2 3 4
Agua destilada ml 5 5 5 5
Azul de metileno mas monoestearato de glicerilo en butanol ml 2 --- --- ---
Azul de metileno mas fosfolípidos en butanol * ml --- 2 --- ---
Azul de metileno mas colesterol en butanol ml --- --- 2 ---
Azul de metileno en butanol ml --- --- --- 2
* 2 mL del extracto clorofórmico obtenido en el experimento 2 se evaporan a
sequedad (cuidando que no se queme), al residuo se le re disuelve con 2 mL de azul
de metileno en butanol y se agrega este contenido al tubo no. 2 de la serie.
Deje los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y haga observaciones a las
2, 4, y 24 horas.
1) ¿Observó el paso del colorante en todos los tubos?
2) Explique a qué se debe esa diferencia.

11. ÁCIDOS NUCLEICOS
E
l control de todos los procesos vitales en la forma tan ordenada que realiza una célula,
como son la transformación de energía en sus diferentes formas, la síntesis de moléculas
propias, la degradación de los metabolitos, el transporte de diferentes materiales a través
de sus membranas, la formación de nuevas células, la diferenciación celular, la creación de
nuevos seres, etc.; se puede explicar debido a la existencia de proteínas específicas,
fundamentalmente enzimas. Sin embargo, para la biosíntesis de proteínas las moléculas que
poseen la información necesaria son el ácido desoxirribonucléico (DNA) y el ácido ribonucléico
(RNA). Estas moléculas son los llamados ácidos nucléicos. Rompiendo la máxima bioquímica de
que todas las enzimas son proteínas, se descubrió que algunos RNA pueden funcionar como
catalizadores.
Los ácidos nucléicos reciben este nombre debido a que en el año de 1871 el químico suizo
Friedrich Miescher logró aislar del núcleo celular una sustancia que llamó nucleína, la cual
debido a su carácter ácido se denominó posteriormente ácido nucleico. Sin embargo, existen
otros tipos de ácidos nucléicos. El ácido desoxirribonucléico se encuentra fundamentalmente en el
núcleo y es el que posee la información genética y la transmite al citoplasma y por ser capaz de
replicarse puede transmitir la información de padres a hijos. En la célula, fuera del núcleo,
normalmente existen tres tipos de ácidos ribonucléicos que son: el ácido ribonucléico ribosomal
(RNAr), el ácido ribonucléico mensajero (RNAm), y el ácido ribonucléico soluble o de transferencia
(RNAt). El RNAr se encuentra en los ribosomas y su peso molecular es de 2,000,000. El RNAm
tiene un peso molecular de 300,000, se forma en el núcleo y lleva la información al citoplasma. El
RNAt tiene un peso molecular de 25,000 a 30,000 y se encuentra disuelto en el citoplasma. El
DNA es una de las biomoléculas más grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular
va de 1,000,000 a 1,000,000,000.
Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con proteínas fuertemente básicas
(histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoproteínas. La estructura química es
similar en todos los ácidos nucléicos, todos están constituidos por bases púricas, bases
pirimídicas, pentosa y ácido fosfórico. El DNA tiene como bases púricas adenina y guanina,
como bases pirimídicas, citosina y timina, como pentosa la 2-desoxiribosa y ácido fosfórico
H3PO4. Los ácidos ribonucléicos tienen como bases púricas la adenina y guanina y como bases
pirimídicas uracilo y citosina, como pentosa la D – ribosa y H3PO4.
Los ácidos nucléicos son macromoléculas formadas por la unión de varios nucleótidos. Un
nucleótido se puede considerar como un éster fosfórico de un nucleósido, que es la unión de
una base púrica o pirimídica con una pentosa. Los mononucleótidos se unen entre sí por
medio de un enlace fosfodiester 3’- 5’, formando los polinucleótidos.
OBTENCIÓN DEL DNA DE BAZO
Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos que se
van a utilizar como materia prima. En el caso del DNA esta selección es en especial importante
porque el contenido de DNA es pequeño en la mayor parte de las células. La célula ideal será
aquella que tenga una relación núcleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y células del
tumor ascítico de Ehrlich. Sin embargo, no es fácil obtener este tipo de células por lo que
frecuentemente se usan órganos típicamente linfoides como el timo y el bazo.
El primer paso en la extracción del DNA es la homogeneización del tejido. Este paso
puede degradar en parte la molécula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, la
solución reguladora es de citrato 0.01M y NaCl 0.14M, a pH de 7.2 a 7.4; la fuerza iónica de esta
solución hace insoluble a la desoxirribonucleoproteína. Si se centrifuga este homogeneizado, en
el residuo quedarán los restos celulares y las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el
sobrenadante se encuentran compuestos solubles como la mayor parte de los ácidos
ribonucléicos.
Al homogeneizar el tejido se liberan las enzimas de los lisosomas, entre ellas la DNAasa, la
cual hidroliza el DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima; si
en la solución existe citrato, éste se une al Mg++ e impide la acción de la DNAasa. Otra forma
de evitar la acción hidrolítica de la enzima es trabajar a temperaturas bajas (0°C a 2°C).
El siguiente paso en la purificación está basado en que las desoxirribonucleoproteínas y
el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la mayor parte de las
proteínas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solución de NaCl 2.6M y
se centrifuga, el residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mientras que
el DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adición
selectiva de 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado blanco fibroso, el
cual se puede recoger por rotación de un agitador de vidrio con pequeños salientes.
EXPERIMENTO 1
La muestra de bazo se coloca en un mortero, previamente enfriado y se secciona, lo más
finamente posible con una tijera. Se colocan 450 mL de la solución reguladora de citrato 0.01M –
NaCl 0.14M, a pH de 7.2 fría, en una licuadora cuyo vaso haya sido previamente enfriado. Se
hace funcionar la licuadora a baja velocidad y se van añadiendo los trozos de bazo de todos los
equipos, esperando a que se homogeneice completamente el primero antes de añadir el segundo
y así sucesivamente. Una vez terminada la adición, continúe homogeneizando por 30 – 60
segundos más. Se coloca el homogeneizado en tubos de centrífuga apropiados teniendo cuidado
de tarar perfectamente los tubos opuestos ¡PRECAUCIÓN! (CONSULTE A SU MAESTRO). En
frío se centrifuga por 15 minutos a 5 000 rpm. El sobrenadante se desecha. El residuo insoluble
se lava en el mismo tubo con 15 mL de citrato 0.01M – NaCl 0.14M, pH 7.2, agitando hasta
volver a resuspender con ayuda de una varilla de vidrio, si es necesario. Se vuelve a centrifugar a
5 000 rpm por 5 minutos y el sobrenadante se desecha. Al residuo insoluble que contiene el
DNA y residuos celulares se le añaden 15 mL de NaCl 2.6M frío y se homogeneiza por agitación.
El ácido desoxirribonucléico es soluble en esta solución mientras que la mayor parte de las
proteínas son insolubles. Centrifugue a 8 000 rpm por 30 minutos. El líquido sobrenadante
contiene el DNA en solución y el sedimento, que contiene restos celulares y proteínas
insolubles, se desecha. La solución salina sobrenadante se coloca en un vaso de precipitados y
se añaden lentamente dos volúmenes de alcohol etílico al 95%, procurando que la fase
alcohólica quede en la parte superior. Se deberá observar la formación de un precipitado blanco,
denso, en la interfase. Utilizando un agitador con pequeños salientes, agite esta mezcla
lentamente procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas.
1) Explique por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera.
2) ¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del DNA?
¿Por qué?
3) ¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?
CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL DNA

Existen varios métodos para identificar y cuantificar a los ácidos nucléicos. El método más
utilizado es el espectrofotométrico, el cual está basado en que tanto el DNA como el RNA
absorben a 260 nm. La absorbancia es proporcional a la concentración del ácido, por lo tanto, el
medir la absorbancia es un método cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre
DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras están puras.
Una reacción muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reacción de
Dische, la cual está basada en que el reactivo de difenilamina reacciona específicamente con el
DNA dando una coloración azul cuya intensidad es proporcional a la concentración de DNA.
En realidad, la especificidad de esta reacción no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo
específico para las 2-desoxipentosas en general, pero en condiciones normales la cantidad de
azúcares capaces de interferir es despreciable.
EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 6 tubos de ensayo y numérelos del 1 al 6. Mida con una pipeta
cuidadosamente 2 mL de solución patrón. Esta solución tiene una concentración de DNA de 1
mg/mL. Colóquela en el tubo no.1. Añada a los tubos 2, 3, 4, 5, 2 mL de agua destilada.
Agregue al tubo no.2, 2 mL de la solución patrón; mezcle perfectamente y transfiera 2 mL de
esta mezcla al tubo no. 3; se mezcla el contenido y se transfieren 2 mL al tubo no. 4. De este
tubo se toman 2 mL y se descartan. El tubo no. 5 será el blanco y en el tubo 6 se colocan 2 mL
de la solución de DNA problema. Añada a todos los tubos 4 mL de reactivo de Dische y agite
vigorosamente y coloque los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos. Inmediatamente
después coloque los tubos en baño maría de hielo – agua durante 5 minutos con objeto de
enfriar su contenido rápidamente.
Los tubos con DNA desarrollan una coloración azul característica con un máximo de
absorción a 600 nm. La intensidad de la coloración se puede determinar cuantitativamente en
el espectrofotómetro. Determine la densidad óptica a 600 nm de todos los tubos utilizando el tubo
no. 5 como blanco.
Resuma sus resultados en la siguiente tabla:

Tubo [DNA] mg/mL Densidad Óptica
1 1
2 0.5
3 0.25
4 0.125
5 0
6 Problema
1) Con los datos de la tabla construya la curva tipo (absorbancia contra mg de DNA)
2) Interpolando la absorbancia del tubo no. 6 encuentre la concentración de DNA (mg/mL)
y calcule la cantidad total de DNA en su problema.
CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL RNA
El RNA puede ser cuantificado por espectrofotometría, como ya se explicó. Sin embargo, la
reacción más utilizada para identificar y cuantificar el RNA es la reacción del orcinol, la cual se

caracteriza por dar una coloración verde en presencia de cualquier RNA. La reacción del
orcinol es una modificación de la reacción de Bial para pentosas y es, por tanto, poco específica.
Sin embargo, cuando se trata de muestras razonablemente puras, esta reacción puede ser
utilizada incluso para análisis cuantitativos.
EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de seis tubos y numérelos del 1 al 6. Añada a los tubos 2, 3, 4 y 5, 3 mL
de agua destilada; al tubo no.1, 3 mL de la solución patrón de RNA que contendrá 0.300
mg/mL. Añada 3 mL de la misma solución patrón al tubo no. 2, mezcle bien el contenido y
transfiera 3 mL de esta solución al tubo no. 3, mezcle el contenido del tubo no. 3 y añada 3 mL de
esta solución al tubo no. 4. Mezcle bien el contenido y tome 3 mL de esta solución y deséchelos.
El tubo no. 5 será considerado como blanco y al tubo no. 6 se le añaden 3 mL de solución
problema. Añada a todos los tubos 6 mL del reactivo de orcinol ácido y 0.4 mL del reactivo de
orcinol – alcohol. Se mezcla el contenido y se colocan en baño maría a ebullición por 20 minutos.
Una vez fríos se determina la densidad óptica de cada tubo a 660 nm.
Basándose en sus resultados llene la siguiente tabla:
Tubo [RNA] mg/mL Densidad Óptica

1 0.3
2 0.15
3 0.075
4 0.0375
5 0
6 Problema
1) Con los datos de la tabla anterior trace la curva tipo, absorbancia contra mg de RNA.
2) Interpole los valores de absorbancia de su problema y determine la concentración real
en mg/mL.
DETERMINACIÓN DEL FOSFATO TOTAL

EXPERIMENTO 4
Para efectuar la determinación colorimétrica con el molibdato de amonio se empleará una
muestra que ha sido previamente digerida.
Prepare una serie de seis tubos como se indica en la siguiente tabla:
Tubo
Reactivo mL 1 2 3 4 5 6
Buffer de acetato 0.1M pH 4.0 7 7 7 7 7 7
Reactivo molibdato ( al 2.5%) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Solución de vitamina C al 1% reciente 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada 2
Solución tipo 1 µM/mL 2
Solución tipo 2.5 µM/mL 2
Solución tipo 5 µM/mL 2
Problema DNA 2
Problema RNA 2
Deje los tubos en reposo a temperatura ambiente por 30 minutos y lea la absorbancia a
660 nm tomando como blanco el tubo no. 1.
1) Con los datos obtenidos con las soluciones tipo, construya la curva tipo para fosfato.
(Densidad óptica contra concentración en mol/mL)
2) ¿Cómo afecta el medio ácido al enlace 3’-5´diéster fosfato?
3) ¿Cómo afecta el medio alcalino al enlace 3’-5´diéster fosfato?

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