r

Centrifugucin
(rad/s) rpm
60
2
=
t
e
Sedimentucin en un cumpo
de uItu uceIerucin
Tomoo (moso)
Formo
Densidod
Coeficienfe de
sedimenfocion
S
Cenfrifugocion
diferencioI
Cenfrifugocion
;onoI
Cenfrifugocion
isopcnico
Muesfro homogeneo
Seporocion
sobrenodonfe/
precipifodo
grodienfe de densidod
preformodo
Muesfro encimo
Seporocion en bondos
grodienfe de densidod
oufogenerodo
Muesfro homogeneo
Seporocion en bondos
Seporocion
por S
Seporocion
por fomoo
Seporocion
por densidod
precipifodo
sobrenodonfe
bondos seporodos
bondos seporodos
r
m
f
c
f
u
f
r
Centrifugucin: fundumentos
Rotor de Iu
centrfugu
PurtcuIu que sedimentu
VeIocidod onguIor
(rad/s) rpm
60
2
=
t
e
r m f f f
r m r m f
r m a m f
a c s
s a
c
2
2 2
2
) 1 ( e u
e u e
e
= =
= =
= =
AceIerucin centrfugu
(infensidod deI compo)
Musu de Iu
purtcuIu
fuer;o
cenfrfugo
principio de
Arqumedes
Moso deI soIvenfe
despIo;odo
p
p
s
m m v
v m

u u

1
, /
,
= = =
=
p
es difciI de medir
es odifivo
Densidod deI
medio
voIumen especfico
porcioI de Io porfcuIo
Pesisfencio oI
ovonce ( friccion)
v f f
r
=
Ley de Sfokes
f
m
r
v
S
r
f
m
v
r m v f f f
s r
) 1 (
) 1 (
) 1 ( ,
2
2
2
u
e
e
u
e u

= =

=
= =
Coeficienfe
de friccion
Coeficiente de
sedimentucin
VeIocidod / infensidod deI compo
VeIocidod
ferminoI
Ecuocion de
Svedberg
Coeficiente de Sedimentucin
f
m
r
v
S
) 1 (
2
u
e

= =
I0
-I3
s ~ I Svedberg
PibonucIeoso A (IZ.4 kD)
HemogIobino (o8 kD)
Fibrinogeno (330 kD)
rPMA gronde (I.I MD)
Pibosomo bocferiono
(Z.b MD)
Virus deI mosoico
deI foboco(40 MD)
bocferio
Lisosomo
I
I0
I00
I0
3
I0
4
S
a f = tq 6
rodio de Sfokes
viscosidod
Ley de Sfokes
Tumuo:
m : mos gronde, moyor S
f : mos gronde, moyor f
Formu:
f (o): mos exfendido menor S
Densidud:
: mos denso, menos fIofocion
2
2
2
1
2
1
.
S
S
m
m
aprox =
|
|
.
|

\
|
=
3
3
2
2
2
1
S
S
m
m
b30 kD o9.Z I8.o S
cifocromo A
b30 kD I94.o o.43 S
miosino
M
r
o S
mifocondrio
Usos de Ius tcnicus de centrifugucin
Sedimentucin de precipitudos
Prepurucin de cIuIus y orgnuIos subceIuIures
Determinucin de densidudes /
sepurucin por densidudes
Determinucin de S
Determinucin de M
r
Sedimenfocion en grodienfe de socoroso
EquIibrio de sedimenofcion
Cenfrifugocion diferencioI
Seporocion en grodienfes (socoroso,
FicoII efc)
Pofor onguIor
Pofor boscuIonfe
Cenfrfugo preporofivo
veIocidod fijo
Sepurucin por tumuos {S} Purificocion de DMA, profenos
UIfrocenfrfugo
preporofivo.
Pofor boscuIonfe
UIfrocenfrfugo
onoIfico
UIfrocenfrfugo
onoIfico
Tipo de
centrfugu
Purificocion de DMA, profenos
Cenfrifugocion isopcnico
UIfrocenfrfugo
onoIfico 77777
Sedimenfocion en grodienfe de socoroso
Sedimenfocion en grodienfe (socoroso efc)
Centrifugucin diferenciuI
Lo muesfro ocupo
fodo eI fubo
PorfcuIos grondes
PorfcuIos pequeos
Lus purtcuIus de muyor
S sedimentun en eI fondo
sobrenodonfe
Sedimenfo
(peIIef)
deconfor
Pepefir eI procedimienfo
con eI sobrenodonfe
Cenfrifugocion en
rofor onguIor
Tiempo definido
Pesuspender y
recenfrifugor
poro purificor
constante t r =
2
e
Centrifugucin zonuI o en bundus
{veIocidud de sedimentucin}
0rodienfe de socoroso,
FicoII, PercoII,, efc
preformudo
0,1 M
1, M
menos denso
ms denso
Poror
cenfrifugocion
onfes de que se
oIconce eI fondo
Pecoger Ios
frocciones
S grunde S pequeo
Sepurucin en
funcin de S
cenfrifugocion
o muy oIfo
veIocidod
p

mox
Mo hoy fIofocion

moyor fIofocion,
se refroso

moyor fIofocion,
se odeIonfo
Mr, f (o),
(grodienfe "enfoco" Ios bondos)
Muesfro deposifodo
encimo deI grodienfe
undu
iniciuI
bondos
Centrifugucin isopcnicu
Eperimento de MeseIson y StuhI
Sepurucin de DNA dpIe monohebru y RNA
Sepurucin de tomoismeros
Sepurucin de DNA sutIite
Muesfro disueIfo en CICs
(Z-oM), ~I.7 g/mI
Cenfrifugocion o
oIfo veIocidod,
hosfo eI equiIibrio
(~ 48 h)
Sedimenfocion de CICs
formo grodienfe
min

mox
8ondos por
densidod
difusin
-
d

fIotu
-
d

sedimentu
Sepurucin por densidudes
r
M
k
d
MocromoIecuIos
quedon muy
"enfocodos"
Eperimento de MeseIson y StuhI:
repIicucin semiconservutivu
Murcuge con
1
N
CuItivos bucteriunos sincronizudos
Etruccin de DNA
Centrifugucin en grudiente CsCI
PepIicocion disperso: onoIisis
de DMA de hebro simpIe

Ib
M-DMA
I.7Z4 g/mI
I4
M-DMA
I.7I0 g/mI
perfiI A
Zo0
conservofivo
semi-
conservofivo
semi-
conservofivo
disperso
pH 7
dpIex
pH IZ
monohebro
Eperimentos de Mutthew MeseIson
y FrunkIin StuhI
Proc NutI Acud Sci 44: 71 {19}
Sepurucin de orgnuIos subceIuIures
por centrifugucin diferenciuI
1,000 g
10 min
1,000 g
Z0 min
0,000 g
1 h
10,000 g
3 h
Pibosomos
Iibres
CifopIosmo
soIubIe
microsomos
froccion
mifocondrioI
ncIeos
Mifocondrios
Lisosomos
Peroxisomos
VescuIos heferogeneos:
Membrono pIosmofico
P. endopIosmico
Ap. de 0oIgi
FiIfrocion
(eIimino cmuIos y ogregodos)
Homogeni;ocion
pH
Fuer;o ionico
femperofuro
Sepurucin por
tumuos {S}
Centrifugucin
repetidu
DNA Iuminus
nucIesido-trifosfutusu
SDH
RNA
LDH
'-nucIeotidusu
Fosfutusu uIcuIinu
SIucosu--fosfutusu
NADPH diuforusu
SuIuctosiI-trunsferusu
FucosiI-trunsferusu
munosidusu
Sepurucin de orgnuIos subceIuIures
por centrifugucin en grudiente
0rodienfe
disconfinuo
de socoroso
crecienfe
Froccion mifocondrioI crudo
(me;cIo impuro)
I.000 g
I0 min
Ib.000 g
Z0 min
Cenfrifugocion diferencioI
Cenfrifugocion
Zb.000 g
Ib min
Sepurucin por
densidudes
{isopcnicu}
Lisosomos
I.IZ g/mI
Mifocondrios
I.I8 g/mI
Peroxisomos
I.Z3 g/mI
homogenodo
Sedimenfon
hosfo que

p
y fIofon
CutuIusu
Uruto oidusu
Fosfutusu cidu
-guIuctosidusu
cutepsinus
SDH
Citocromo oidusu
Citocromo c
Tipos de centrfugus
Prepurutivu
Pofor
onguIor
Pofor boscuIonfe (swing-ouf).
Poro grodienfes de densidod
UItrucentrfugu
unuIticu
VeIocidodde sedimenfocion
EquIbrio de sedimenfocion
Cenfrifugocion isopcnico (777
Aqu o orribo77)
8ojos g
Monfiene mejor grodienfes
AIfos 0
muIfiproposifo
De cIuIus
Muy bojos g I-I000
Ley de Lumbert-eer
l A
I
I
= = | C | log
0

c
monocromodor
defecfor
cubefo
0
I I
Coeficienfe de exfincion moIor
(obsorfividod moIor)
20 40 60 80 100
0.5
1.0
1.5
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a
[C], M
l p =

c
A
b
s
o
r
b
o
n
c
i
o
Longifud de ondo
MAD
+
(oxidodo)
MADH
(reducido)
Infensidod Iuminoso
Lu; bIonco,
Especfro de
Iongifudes
de ondo
Lu ubsorbunciu es
proporcionuI u Iu
concentrucin
EI coeficiente de
etincin depende
deI estudo de Iu
moIcuIu y de Iu
Iongitud de ondu
Medidu de Iu Actividud enzimticu
Medir v es unu medidu de E
Lus enzimus son cutuIizudores:
Aumentun Ie veIocidud de reuccin v
S + E ES E + P
| |
3
E k v =
k
Z
k
3
k
I
MichoeIis-Menfen
Aodir
susfrofo
Producfo
se ocumuIo
Incubor duronfe
fiempo medido
t
P
v
dt
P d
dt
S d
v
| |
| | | |
~
= =
Medido de [P]:
Absorbunciu {coIor}
FIuorescenciu
Rudiouctividud
A
b
s
o
r
b
o
n
c
i
o
Longifud de ondo
MAD
+
(oxidodo)
MADH
(reducido)
Me;cIo
en;imofico
S P
MAD
+
MADH
Progreso de Io reoccion
Susfrofos orfificioIes
Peocciones ocopIodos
Medido de
deshidrogenosos
Istopos en bioIogu
Istopos estubIes:
Istopos rudiouctivos:
McIeo inesfobIe
Desinfegrocion esponfoneo
Emision de rodiocion
Cuondo no hoy rodioocfivos
densidod
(seporociones)
JVeIocidod
de reoccion
Z
H
I3
C PMM
Ib
M
I8
O
(defecfodos por MS)
o oo o
| || |

EI mismo eIemento distintos tomos:
distinguir tomos entre si
Rudiuciones muy energticus
FciImente detectubIes
{contur de 1 en 1}
Usos y upIicuciones:
Morcos moIecuIores
Tro;odores mefoboIicos
AnoIisis cuonfifofivo
Deteccin de Iu rudiouctividud: contuge
Medidu cuuntitutivu {contuge}
Confogor 0eiger ( , , ) (ineficienfe)
Confodores de cenfeIIeo Iiquido ( )
Confodores
k
t
k
e N e N N
N k
dt
dN
A
t t k
2
2
1 ln
ln ,
2 1
0 0
= = =
= =
= =

t t
t
Lu uctividud es unu
medidu deI n" de tomos
Vido medio
(semivido)
Mimu sensibiIidud
puru unIisis
I.39 Ib h |,
Z4
Mo
I.7I I4.Z dos |
3Z
P
0.Io7 87 dos |
3b
S
0.Zb4 Iob dos |
4b
Co
0.4o, 0.Z7 4b dos |,
b9
Fe
0.Ibb b b8o oos |
I4
C
0.0I8 IZ.I oos |
3
H
E
mu
(MeV) Semividu Emisin Istopo
Es posibIe disfinguir
dos isofopos y
conforIos por seporodo
Consfonfe
de fiempo
Fototubo
porfcuIo
emifido
Lu;, fofones
emifidos
Lquido de
cenfeIIeo
fIuoroforo
cpm~ efdpm
I Ci ~ I g
ZZo
Po ~ Z.ZZI0
IZ
dpm
I Ci ~ 3.7I0
I0
dps ~ 3.7I0
I0
8q
Eficiencio
deI confodor
Curio
8ecquereIio
oe~ o (dpm)/m (moI)
Deteccin de Iu rudiouctividud:
Autorudiogrufu
Soporfe
inerfe
Muesfro
morcodo
EmuIsion fofogrofico
Emision
rodioocfivo
0ronos
de Ag8r
CuuIitutivu: IocuIizucin
Cuuntitutivu: densitometru
Pecombinocion enfre
cromofidos hermonos
Morcoje con
3
H-fimidino
Segundo division posferior
Morcoje con
3
H fimidino
(cromosomo de E. CoIi)
Lo snfesis de DMA ocurre en Ios horquiIIos
PeveIodo de
eIecfroforesis,
cromofogrofos
efc
Coomosie
Aufo
rodiogrofo
I
n
f
e
n
s
i
d
o
d
,

O
D
disfoncio
Esconer
Confidod de
profeno morcodo
profeno
morcodo